ES2657679T3 - Modulación del factor de expresión 11 - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 18 a 24 nucleósidos unidos y que comprende una secuencia de bases nucleotídicas que comprende una porción de al menos 8 bases nucleotídicas contiguas 100 % complementarias a una porción de igual longitud de bases nucleotídicas 1275 a 1318 de SEQ ID NO: 1, en el que la secuencia de bases nucleotídicas del oligonucleótido modificado es 100 % complementaria a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 11, y en la que el compuesto es capaz de inhibir la expresión del factor 11 humano11.
Description
Se divulga en el presente documento el uso un inhibidor específico del Factor 11 como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de una complicación tromboembólica como se describe en el presente documento en un paciente al que se administra posteriormente un
5 agente o terapia adicional como se describe en el presente documento.
En el presente documento se divulga un kit para tratar, prevenir o mejorar una complicación tromboembólica como se describe en la presente, en donde el kit comprende:
i) un inhibidor específico de Factor 11 como se describe en el presente documento; y, como alternativa
(ii) un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento.
Un kit de la divulgación puede incluir además instrucciones para usar el kit para tratar, prevenir o mejorar una complicación tromboembólica como se describe en el presente documento mediante terapia de combinación como
15 se describe en el presente documento.
En el presente documento se divulgan compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico del Factor 11 es cualquiera de las secuencias indicadas en el número de acceso en GENBANK NM_000128.3 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 1), número de acceso en GENBANK NT_022792,17, truncado de 19598000 a 19624000, (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 2), número de acceso en GENBANK NM_028066,1 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 6), exones 1-15 número de acceso en GENBANK NM_028066,1 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 274).
25 En el presente documento se describe un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado. El compuesto puede comprender un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos unidos.
El compuesto de la divulgación puede comprender un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de bases nucleotídicas al menos 8 0%, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % complementarias a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. 1El compuesto puede comprender un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de bases nucleotídicas 100% complementaria a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1.
En el presente documento se describe un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende
35 una secuencia de bases nucleotídicas complementaria a al menos una porción de bases nucleotídicas 656 a 676 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18 o 20 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una porción de igual longitud de bases nucleotídicas 656 a 676 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas al menos 8 0%, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % complementarias a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas 100 % complementaria a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede alcanzar al menos un 80 % de inhibición de los niveles de ARNm humano determinados usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
45 En el presente documento se describe un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de bases nucleotídicas complementaria a al menos una porción de bases nucleotídicas 665 a 687 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18 o 20 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una porción de igual longitud de bases nucleotídicas 665 a 687 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas al menos 8 0%, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % complementarias a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas 100 % complementaria a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede alcanzar
55 al menos un 50 % de inhibición de los niveles de ARNm humano determinados usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3)-
En el presente documento se describe un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de bases nucleotídicas complementaria a al menos una porción de bases nucleotídicas 675 a 704 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18 o 20 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una porción de igual longitud de bases nucleotídicas 675 a 704 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas al menos 8 0%, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % complementarias a una porción de igual longitud de SEQ ID 65 NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas 100 % complementaria a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede alcanzar
10
- (i)
- un segmento separador que consiste en desoxinucleósidos unidos;
- (ii)
- un segmento del ala en 5' que consiste en nucleósidos unidos;
(iii) un segmento de ala 3’ que consiste en nucleósidos unidos, en el que el segmento separador está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3’ y en el que cada nucleósido
5 de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado. En algunas de tales realizaciones, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende:
- (i)
- un segmento separador que consiste en diez desoxinucleósidos unidos;
- (ii)
- un segmento del ala en 5' que consiste en cinco nucleósidos unidos;
(iii) un segmento de ala 3’ que consiste en cinco nucleósidos unidos, en el que el segmento separador está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3’ y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un 2'-O-metoxietil-azúcar; y en el que cada enlace
15 internucleosídico es un enlace fosforotioato. En algunas de tales realizaciones, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende:
- (i)
- un segmento separador que consiste en catorce desoxinucleósidos unidos;
- (ii)
- un segmento del ala en 5' que consiste en tres nucleósidos unidos;
(iii) un segmento de ala 3’ que consiste en tres nucleósidos unidos, en el que el segmento separador está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3’ y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un 2'-O-metoxietil-azúcar; y en el que cada enlace internucleosídico es un
25 enlace fosforotioato. En algunas de tales realizaciones, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5metilcitosina.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende:
- (i)
- un segmento separador que consiste en trece desoxinucleósidos unidos;
- (ii)
- un segmento del ala en 5' que consiste en dos nucleósidos unidos;
(iii) un segmento de ala 3’ que consiste en cinco nucleósidos unidos, en el que el segmento separador está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3’ y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un 2'-O-metoxietil-azúcar; y en el que cada enlace
35 internucleosídico es un enlace fosforotioato. En algunas de tales realizaciones, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.
En el presente documento se divulga una composición que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 12 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada entre las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las SEQ ID NO: 15 a 241 o una sal de las mismas y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento se divulga una composición que comprende un oligonucleótido modificado que consiste
45 en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 12 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada entre las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las SEQ ID NO: 15 a 269 o una sal de las mismas y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento se divulga una composición que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 12 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada entre las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las SEQ ID NO: 241 a 269 o una sal de las mismas y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
55 En el presente documento se divulgan métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 8 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada entre las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las SEQ ID NO: 15 a 241.
En el presente documento se divulgan métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 8 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada entre las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las SEQ ID NO: 15 a 269.
65 En el presente documento se divulgan métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto que
16
oligomérico puede ser "antisentido" de un ácido nucleico diana, lo que significa que es capaz de sufrir hibridación con un ácido nucleico diana mediante enlaces de hidrógeno.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de bases nucleotídicas que, cuando se
5 escribe en la dirección 5’ a 3', comprende el complementario inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido. En ciertas de estass realizaciones, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de bases nucleotídicas que, cuando se escribe en la dirección 5’ a 3', comprende el complementario inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido.
Un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del Factor 11 puede tener una longitud de 12 a 30 subunidades. En otras palabras, tales compuestos antisentido tienen de 12 a 30 subunidades unidas. El compuesto antisentido puede ser de 8 a 80, de 12 a 50, de 15 a 30, de 18 a 24, de 19 a 22 o 20 subunidades unidas. Los compuestos antisentido pueden ser 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 , 56, 57, 58, 59,
15 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 subunidades unidas de longitud, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores. El compuesto antisentido puede ser un oligonucleótido antisentido y las subunidades unidas pueden ser nucleótidos.
Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 pueden acortarse o truncarse. Por ejemplo, una sola subunidad puede eliminarse del extremo 5’ (truncamiento en 5’), o, alternativamente, del extremo 3’ (truncamiento en 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico del Factor 11 puede tener dos subunidades delecionadas del extremo 5’ o, alternativamente, puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3', del compuesto antisentido. Como alternativa, los nucleósidos delecionados se pueden dispersar por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido
25 delecionado del extremo 5’ y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
Cuando está presente una única subunidad adicional en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede localizarse en el extremo 5’ o 3' del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más subunidades adicionales, las subunidades añadidas pueden estar adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades añadidas al extremo 5’(adición en 5') o, como alternativa, al extremo 3’(adición en 3’), del compuesto antisentido. Como alternativa, las subunidades añadidas se pueden dispersar por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunida añadida al extremo 5’ y una subunidad añadida al extremo 3'.
35 Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases apareadas erróneamente sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se analizó una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 bases nucleotídicas de longitud su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de oocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 bases nucleotídicas de longitud con 8 u 11 apareamientos erróneos de bases cerca de los extremos de los los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor medida que los los oligonucleótidos antisentido que no contenían apareamientos erróneos. De un modo similar, se consiguió una escisión específica de la diana usando oligonucleótidos antisentido de 13 bases nucleotídicas, incluidos aquéllos con 1 o 3 apareamientos erróneos.
45 Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463–471, March 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene una complementariedad del 100 % con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 apareamientos erróneos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión tanto de bcl-2 como de bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) analizaron en una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 bases nucleotídicas en tándem y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 bases nucleotídicas compuesos por la secuencia de dos o trees de los oligonucleótidos antisentido en táncem, respectivamente, su capacidad para detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 bases nucleoitídicas pudo inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los
55 oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 bases nucleotídicas.
Motivos de compuestos antisentido
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 tienen subunidades químicamente modificadas dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como potenciación de la actividad inhibidora, afinidad de unión incrementada por un ácido nucleico diana o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos normalmente contienen al menos una región modificada de modo que
65 confieren un incremento de la resistencia a la degradación por nucleasas, incremento de la captación celular y/o incremento de la afinidad de unión por el ácido nucleico diana y/o una actividad inhibidora incrementada. Una
18
segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como sustrato para la endonucleasa ARNasa H celular, que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.
Los compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un
5 gapmer, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de ARNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmer, el segmento separador generalmente sirve como sustrato para la escisión con endonucleasa, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gapmer se diferencian por los tipos de restos de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden, en algunas realizaciones, incluir β-D-ribonucleósidos, β-Ddesoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2’ (tales nucleósidos modificados en 2’ pueden incluir 2'-MOE y 2'-O-CH3, entre otros), y los nucleósidos modificados con azúcar bicíclico (tales nucleósidos modificados con azúcar bicíclico pueden incluir los que tienen un puente 4'-(CH2) n-O-2', donde n = 1 o n = 2). Preferiblemente, cada región
15 distinta comprende restos de azúcar uniformes. El motivo de ala-separador-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", en el que "X" representa la longitud de la región del ala en 5’, "Y" representa la longitud de la región separadora y "Z" representa la longitud de la región del ala en 3’. Como se usa en el presente documento , un gapmer descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el segmento separador se coloca inmediatamente adyacente a cada uno del segmento de ala en 5’ y el segmento de ala en 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el segmento de ala en 5’ y el segmento separadir o el segmento separador y el segmento de ala en 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en el presente documento puede tener un motivo de gapmer. En algunas realizaciones, X y Z son iguales, en otras realizaciones son diferentes. En una realización preferida, Y está entre 8 y 15 nucleótidos. X, Y o Z pueden ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleótidos. Por lo tanto, los gapmeros de la presente invención incluyen,
25 pero no se limitan a, por ejemplo 5–10–5, 4–8–4, 4–12–3, 4–12–4, 3–14–3, 2–13–5, 2–16–2, 1–18–1, 3–10–3, 2– 10–2, 1–10–1, 2–8–2, 5–8–5, o 6–8–6.
En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido tiene un motivo de "wingmer" que tiene una configuración de alaseparador o separador-ala, es decir, una configuración X-Y o Y-Z como se ha descritito anteriormente para la configuración de gapmer. Por lo tanto, las configuraciones de las alas de la presente invención incluyen, entre otras, por ejemplo 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 5-13, 5-8 o 6-8.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 poseen un motivo gapmer 5-10-5.
35 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 poseen un motivo gapmer 3-14-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 poseen un motivo gapmer 2-13-5.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 poseen un motivo gapmer 5-8-5.
45 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 poseen un motivo gapmer 6-8-6.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del factor 11 tiene un ensanchado por separador.
En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido ensanchado por separador dirigido a un ácido nucleico del Factor 11 tiene un segmento separador de catorce 2'-desoxirribonucleótidos posicionados inmediatamente adyacentes a y entre segmentos de ala de tres nucleósidos modificados químicamente. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende una modificación de 2'-azúcar. En otra realización, la modificación química
55 comprende una modificación de 2'–MOE azúcar.
En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido ensanchado por separador dirigido a un ácido nucleico del Factor 11 tiene un segmento separador de trece 2'-desoxirribonucleótidos posicionados inmediatamente adyacentes a y entre un segmento de ala en 5’ de dos nucleósidos modificados químicamente y un segmento de ala en 3' de cinco nucleósidos químicamente modificados. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende una modificación de 2'-azúcar. En otra realización, la modificación química comprende una modificación de 2'–MOE azúcar.
Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
65 Las secuencias de nucleótidos que codifican el Factor 11 incluyen, sin limitación, las siguientes: N.º de acceso en
19
documento y un ácido nucleico del Factor 11. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlaces de Watson-Crick, Hoogsteen o enlaces de hidrógeno invertidos de Hoogsteen) entre bases nucleotídicas complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
5 La hibridación se puede producir en diferentes condiciones. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico a hibridar.
Los métodos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable con un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en el presente documento son específicamente hibridables con un ácido nucleico del Factor 11.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de
15 bases nucleotídicas del compuesto antisentido puede unirse por hidrógeno con las bases nucleotídicas correspondientes del ácido nucleico diana, de modo que se producirá un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico del Factor 11).
Las bases nucleotídicas no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico del Factor 11 se pueden tolerar a condición de que el compuesto antisentido permanezca capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico diana. Además, un compuesto antisentido puede hibridarse sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico del Factor 11 de manera que los segmentos intermedios o adyacentes no están implicados en el acontecimiento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, apareamiento erróneo o estructura en horquilla).
25 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en el presente documento, o una porción específica de los mismos, son, o son al menos, 70 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % complementarios de un ácido nucleico del Factor 11, una región diana, segmento diana, o una porción especificada de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana puede determinarse usando métodos rutinarios. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 bases nucleotídicas del compuesto antisentido son complementarias de una región diana, y, por lo tanto, hibridarán específicamente, representarían un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las bases nucleotídicas no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con bases nucleotídicas complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con bases nucleotídicas complementarias.
35 Como tal, un compuesto antisentido que tiene una longitud de 18 bases nucleotídicas que tiene 4 (cuatro) bases nucleotídicas no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana, tendría un 77,8 % de complementariedad global con el ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad, puede determinarse mediante, por ejemplo, el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), utilizando la configuración predeterminada, que utiliza la algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
45 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en el presente documento, o partes específicas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100 % complementarios) de un ácido nucleico diana, o una parte específica de los mismos. Por ejemplo, el compuesto antisentido puede ser completamente complementario de un ácido nucleico del Factor 11, o una región diana, o un segmento diana o una secuencia diana del mismo. Como se usa en el presente documento, "completamente complementario" significa que cada base nucleotídica de un compuesto antisentido es capaz de aparear bases precisas con las bases nucleotídicas correspondientes de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 bases nucleotídicas es completamente complementario a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 bases nucleotídicas, siempre que haya una porción correspondiente de 20 bases nucleotídicas del ácido nucleico diana que sea completamente complementaria
55 del compuesto antisentido. Completamente complementario también puede usarse en referencia a una porción especificada del primero y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 bases nucleotídicas de un compuesto antisentido de 30 bases nucleotídicas puede ser "completamente complementaria" de una secuencia diana que tiene una longitud de 400 bases nucleotídicas. La porción de 20 bases nucleotídicas del oligonucleótido de 30 bases nucleotídicas es completamente complementaria de la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción de 20 bases nucleotídicas correspondiente en la que cada base nucleotídica es complementaria de la porción de 20 bases nucleotídicas del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 bases nucleotídicas completo puede o no ser completamente complementario de la secuencia diana, dependiendo de si las 10 bases nucleotídicas restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia diana.
65 La ubicación de una base nucleotídica no complementaria puede estar en el extremo 5’o en el extremo 3' del
21
Tabla 1
15
25
35
45
55
- Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos que tienen alas 5–10–5 MOE y separación de desoxi dirigida a la SEQ ID NO: 1
- ID del oligo
- Sitio de inicio diana Sitio de terminación diana Secuencia % de inhibición SEQ ID NO
- 412187
- 38 57 TTCAAACAAGTGACATACAC 21 15
- 412188
- 96 115 TGAGAGAATTGCTTGCTTTC 21 16
- 412189
- 106 125 AAATATACCTTGAGAGAATT 8 17
- 412190
- 116 135 AGTATGTCAGAAATATACCT 24 18
- 412191
- 126 145 TTAAAATCTTAGTATGTCAG 14 19
- 412192
- 146 165 CAGCATATTTGTGAAAGTCG 44 20
- 412193
- 222 241 TGTGTAGGAAATGGTCACTT 38 21
- 412194
- 286 305 TGCAATTCTTAATAAGGGTG 80 22
- 412195
- 321 340 AAATCATCCTGAAAAGACCT 22 23
- 412196
- 331 350 TGATATAAGAAAATCATCCT 25 24
- 412197
- 376 395 ACACATTCACCAGAAACTGA 45 25
- 412198
- 550 569 TTCAGGACACAAGTAAACCA 21 26
- 412199
- 583 602 TTCACTCTTGGCAGTGTTTC 66 27
- 412200
- 612 631 AAGAATACCCAGAAATCGCT 59 28
- 412201
- 622 641 CATTGCTTGAAAGAATACCC 66 29
- 412202
- 632 651 TTGGTGTGAGCATTGCTTGA 65 30
- 412203
- 656 675 AATGTCTTTGTTGCAAGCGC 91 31
- 412204
- 676 695 TTCATGTCTAGGTCCACATA 74 32
- 412205
- 686 705 GTTTATGCCCTTCATGTCTA 69 33
- 412206
- 738 757 CCGTGCATCTTTCTTGGCAT 87 34
- 412207
- 764 783 CGTGAAAAAGTGGCAGTGGA 64 35
- 412208
- 811 830 AGACAAATGTTACGATGCTC 73 36
- 412209
- 821 840 GTGCTTCAGTAGACAAATGT 91 37
- 412210
- 896 915 TGCACAGGATTTCAGTGAAA 73 38
- 412211
- 906 925 GATTAGAAAGTGCACAGGAT 64 39
- 412212
- 1018 1037 CCGGGATGATGAGTGCAGAT 88 40
- 412213
- 1028 1047 AAACAAGCAACCGGGATGAT 71 41
- 412214
- 1048 1067 TCCTGGGAAAAGAAGGTAAA 58 42
- 412215
- 1062 1081 ATTCTTTGGGCCATTCCTGG 81 43
- 412216
- 1077 1096 AAAGATTTCTTTGAGATTCT 43 44
- 412217
- 1105 1124 AATCCACTCTCAGATGTTTT 47 45
- 412218
- 1146 1165 AACCAGAAAGAGCTTTGCTC 27 46
- 412219
- 1188 1207 GGCAGAACACTGGGATGCTG 56 47
- 412220
- 1204 1223 TGGTAAAATGAAGAATGGCA 58 48
- 412221
- 1214 1233 ATCAGTGTCATGGTAAAATG 48 49
- 412222
- 1241 1263 AACAATATCCAGTTCTTCTC 5 50
- 412223
- 1275 1294 ACAGTTTCTGGCAGGCCTCG 84 51
- 412224
- 1285 1304 GCATTGGTGCACAGTTTCTG 87 52
- 412225
- 1295 1314 GCAGCGGACGGCATTGGTGC 86 53
- 412226
- 1371 1390 TTGAAGAAAGCTTTAAGTAA 17 54
- 412227
- 1391 1410 AGTATTTTAGTTGGAGATCC 75 55
- 412228
- 1425 1444 ATGTGTATCCAGAGATGCCT 71 56
- 412229
- 1456 1475 GTACACTCATTATCCATTTT 64 57
- 412230
- 1466 1485 GATTTTGGTGGTACACTCAT 52 58
- 412231
- 1476 1495 TCCTGGGCTTGATTTTGGTG 74 59
- 412232
- 1513 1532 GGCCACTCACCACGAACAGA 80 60
- 412233
- 1555 1574 TGTCTCTGAGTGGGTGAGGT 64 61
- 412234
- 1583 1602 GTTTCCAATGATGGAGCCTC 60 62
- 412235
- 1593 1612 ATATCCACTGGTTTCCAATG 57 63
- 412236
- 1618 1637 CCATAGAAACAGTGAGCGGC 72 64
- 412237
- 1628 1647 TGACTCTACCCCATAGAAAC 48 65
- 412238
- 1642 1661 CGCAAAATCTTAGGTGACTC 71 66
- 412239
- 1673 1692 TTCAGATTGATTTAAAATGC 43 67
- 412240
- 1705 1724 TGAACCCCAAAGAAAGATGT 32 68
- 412241
- 1715 1734 TATTATTTCTTGAACCCCAA 41 69
- 412242
- 1765 1784 AACAAGGCAATATCATACCC 49 70
- 412243
- 1775 1794 TTCCAGTTTCAACAAGGCAA 70 71
31
(continúa)
15
25
35
45
55
- 412244
- 1822 1841 GAAGGCAGGCATATGGGTCG 53 72
- 412245
- 1936 1955 GTCACTAAGGGTATCTTGGC 75 73
- 412246
- 1992 2011 AGATCATCTTATGGGTTATT 68 74
- 412247
- 2002 2021 TAGCCGGCACAGATCATCTT 75 75
- 412248
- 2082 2101 CCAGATGCCAGACCTCATTG 53 76
- 412249
- 2195 2214 CATTCACACTGCTTGAGTTT 55 77
- 412250
- 2268 2287 TGGCACAGTGAACTCAACAC 63 78
- 412251
- 2326 2345 CTAGCATTTTCTTACAAACA 58 79
- 412252
- 2450 2469 TTATGGTAATTCTTGGACTC 39 80
- 412253
- 2460 2479 AAATATTGCCTTATGGTAAT 20 81
- 412254
- 2485 2504 TATCTGCCTATATAGTAATC 16 82
- 412255
- 2510 2529 GCCACTACTTGGTTATTTTC 38 83
- 412256
- 2564 2583 AACAAATCTATTTATGGTGG 39 84
- 412257
- 2622 2641 CTGCAAAATGGTGAAGACTG 57 85
- 412258
- 2632 2651 GTGTAGATTCCTGCAAAATG 44 86
- 412259
- 2882 2901 TTTTCAGGAAAGTGTATCTT 37 87
- 412260
- 2892 2911 CACAAATCATTTTTCAGGAA 27 88
- 412261
- 2925 2944 TCCCAAGATATTTTAAATAA 3 89
- 412262
- 3168 3187 AATGAGATAAATATTTGCAC 34 90
- 412263
- 3224 3243 TGAAAGCTATGTGGTGACAA 33 91
- 412264
- 3259 3278 CACACTTGATGAATTGTATA 27 92
- 413460
- 101 120 TACCTTGAGAGAATTGCTTG 40 93
- 413461
- 111 130 GTCAGAAATATACCTTGAGA 39 94
- 413462
- 121 140 ATCTTAGTATGTCAGAAATA 12 95
- 413463
- 381 400 GAGTCACACATTCACCAGAA 74 96
- 413464
- 627 646 GTGAGCATTGCTTGAAAGAA 42 97
- 413465
- 637 656 CTTATTTGGTGTGAGCATTG 80 98
- 413466
- 661 680 ACATAAATGTCTTTGTTGCA 79 99
- 413467
- 666 685 GGTCCACATAAATGTCTTTG 91 100
- 413468
- 671 690 GTCTAGGTCCACATAAATGT 84 101
- 413469
- 681 700 TGCCCTTCATGTCTAGGTCC 84 102
- 413470
- 692 711 GTTATAGTTTATGCCCTTCA 72 103
- 413471
- 816 835 TCAGTAGACAAATGTTACGA 67 104
- 413472
- 826 845 TGGGTGTGCTTCAGTAGACA 99 105
- 413473
- 911 930 AGCCAGATTAGAAAGTGCAC 80 106
- 413474
- 1023 1042 AGCAACCGGGATGATGAGTG 84 107
- 413475
- 1053 1072 GCCATTCCTGGGAAAAGAAG 80 108
- 413476
- 1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 88 109
- 413477
- 1151 1170 ACTGAAACCAGAAAGAGCTT 54 110
- 413478
- 1193 1212 AGAATGGCAGAACACTGGGA 53 111
- 413479
- 1209 1228 TGTCATGGTAAAATGAAGAA 40 112
- 413480
- 1219 1238 AAGAAATCAGTGTCATGGTA 71 113
- 413481
- 1280 1299 GGTGCACAGTTTCTGGCAGG 86 114
- 413482
- 1290 1309 GGACGGCATTGGTGCACAGT 85 115
- 413483
- 1300 1319 AACTGGCAGCGGACGGCATT 78 116
- 413484
- 1430 1449 CCTTAATGTGTATCCAGAGA 74 117
- 413485
- 1461 1480 TGGTGGTACACTCATTATCC 68 118
- 413486
- 1471 1490 GGCTTGATTTTGGTGGTACA 83 119
- 413487
- 1481 1500 AACGATCCTGGGCTTGATTT 57 120
- 413488
- 1560 1579 ACAGGTGTCTCTGAGTGGGT 49 121
- 413489
- 1588 1607 CACTGGTTTCCAATGATGGA 68 122
- 413490
- 1623 1642 CTACCCCATAGAAACAGTGA 57 123
- 413491
- 1633 1652 TTAGGTGACTCTACCCCATA 73 124
- 413492
- 1647 1666 AGACACGCAAAATCTTAGGT 68 125
- 413493
- 1710 1729 TTTCTTGAACCCCAAAGAAA 65 126
- 413494
- 1780 1799 GTGGTTTCCAGTTTCAACAA 70 127
- 413495
- 1921 1940 TTGGCTTTCTGGAGAGTATT 58 128
- 413496
- 1997 2016 GGCACAGATCATCTTATGGG 72 129
- 413497
- 2627 2646 GATTCCTGCAAAATGGTGAA 39 130
- 413498
- 2637 2656 GCAGAGTGTAGATTCCTGCA 60 131
- 413499
- 2887 2906 ATCATTTTTCAGGAAAGTGT 52 132
32
Tabla 2
5
15
25
35
45
- Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos que tienen alas 5–10–5 MOE y separación de desoxi dirigida a la SEQ ID NO: 2
- ID del oligo
- Sitio de inicio diana Sitio de terminación diana Secuencia % de inhibición SEQ ID NO
- 413500
- 1658 1677 GTGAGACAAATCAAGACTTC 15 133
- 413501
- 2159 2178 TTAGTTTACTGACACTAAGA 23 134
- 413502
- 2593 2612 CTGCTTTATGAAAAACCAAC 22 135
- 413503
- 3325 3344 ATACCTAGTACAATGTAAAT 29 136
- 413504
- 3548 3567 GGCTTGTGTGTGGTCAATAT 54 137
- 413505
- 5054 5073 TGGGAAAGCTTTCAATATTC 57 138
- 413506
- 6474 6493 ATGGAATTGTGCTTATGAGT 57 139
- 413507
- 7590 7609 TTTCAAGCTCAGGATGGGAA 55 140
- 413508
- 7905 7924 GTTGGTAAAATGCAACCAAA 64 141
- 413509
- 8163 8182 TCAGGACACAAGTAAACCTG 66 142
- 413510
- 9197 9216 TGCAAGCTGGAAATAAAAGC 17 143
- 413511
- 9621 9640 TGCCAATTTAAAAGTGTAGC 43 144
- 413512
- 9800 9819 ATATTTCAAAATCCAGTATG 39 145
- 413513
- 9919 9938 TTCTGAATATACAAATTAAT 27 146
- 413514
- 9951 9970 TTTACTATGAAAATCTAAAT 5 147
- 413515
- 11049 11068 GGTATCCTGAGTGAGATCTA 36 148
- 413516
- 11269 11288 CCAGCTATCAGGAAAATTCC 50 149
- 413517
- 12165 12184 AAAGCTATTGGAGACTCAGA 51 150
- 413518
- 12584 12603 ATGGAATCTCTTCATTTCAT 49 151
- 413519
- 12728 12747 ATGGAGACATTCATTTCCAC 59 152
- 413520
- 13284 13303 GCTCTGAGAGTTCCAATTCA 52 153
- 413521
- 14504 14523 CTGGGAAGGTGAATTTTTAG 62 154
- 413522
- 14771 14790 TCAAGAGTCTTCATGCTACC 42 155
- 413523
- 15206 15225 TCAGTTTACCTGGGATGCTG 61 156
- 413524
- 15670 15689 GACATTATACTCACCATTAT 7 157
- 413525
- 15905 15924 GTATAAATGTGTCAAATTAA 43 158
- 413526
- 16482 16501 GTAAAGTTTTACCTTAACCT 47 159
- 413527
- 17298 17317 CCATAATGAAGAAGGAAGGG 52 160
- 413528
- 17757 17776 TTAAGTTACATTGTAGACCA 48 161
- 413529
- 18204 18223 TGTGTGGGTCCTGAAATTCT 52 162
- 413530
- 18981 19000 ATCTTGTAATTACACACCCC 27 163
- 413531
- 19174 19193 GTACACTCTGCAACAGAAGC 47 164
- 413532
- 19604 19623 AGGGAATAACATGAAGGCCC 32 165
- 413533
- 20936 20955 ATCCAGTTCACCATTGGAGA 48 166
- 413534
- 21441 21460 TTTTCCAGAAGAGACTCTTC 31 167
- 413535
- 21785 21804 GTCACATTTAAAATTTCCAA 41 168
- 413536
- 23422 23441 TTAATATACTGCAGAGAACC 37 169
- 413537
- 25893 25912 AGAAATATCCCCAGACAGAG 16 170
Example 2: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del factor 11 humano en células HepG2
Doce gapmer, exhibiendo más del 84 por ciento o más de inhibición in vitro del factor 11 humano se analizaron a diversas dosis en célu+las HepG2 Las células se sembraron a una densidad de 10.000 células por pocillo y se transfectaron usando reactivo de lipofectina con 9.375 nM, 18,75 nM, 37,5 nM, 75 nM, y concentraciones 150 nM de
55 oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 3. Conjunto de sonda de cebador de Factor 11 humano RTS 2966 (secuencia directa: CAGCCTGGAGCATCGTAACA, incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 3; secuencia inversa: TTTATCGAGCTTCGTTATTCTGGTT, incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 4; secuencia de la sonda: TTGTCTACTGAAGCACACCCAAACAGGGAX, , incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 5) se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm del factor 11 se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición del factor 11 respecto a las células control sin tratar. Como se ilustra en la Tabla 3, los niveles de A.RNm del Factor 11 se redujeron de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
65
33
Tabla 4
15
25
35
45
55
- Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 656 a 704 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
- Nº ISIS
- Target Start Site Target Stop Site Sequence (5' to 3') % inhibition Motif SEQ ID No.
- *412203
- 656 675 AATGTCTTTGTTGCAAGCGC 97 5–10–5 31
- *413467
- 666 685 GGTCCACATAAATGTCTTTG 92 5–10–5 100
- *413468
- 671 690 GTCTAGGTCCACATAAATGT 83 5–10–5 101
- *413469
- 681 700 TGCCCTTCATGTCTAGGTCC 86 5–10–5 102
- 416868
- 656 675 AATGTCTTTGTTGCAAGCGC 93 3–14–3 31
- 416945
- 656 675 AATGTCTTTGTTGCAAGCGC 94 2–13–5 31
- 416806
- 657 676 AAATGTCTTTGTTGCAAGCG 86 5–10–5 171
- 416869
- 657 676 AAATGTCTTTGTTGCAAGCG 81 3–14–3 171
- 416946
- 657 676 AAATGTCTTTGTTGCAAGCG 86 2–13–5 171
- 416807
- 658 677 TAAATGTCTTTGTTGCAAGC 51 5–10–5 172
- 416870
- 658 677 TAAATGTCTTTGTTGCAAGC 76 3–14–3 172
- 416947
- 658 677 TAAATGTCTTTGTTGCAAGC 62 2–13–5 172
- 416808
- 659 678 ATAAATGTCTTTGTTGCAAG 55 5–10–5 173
- 416871
- 659 678 ATAAATGTCTTTGTTGCAAG 28 3–14–3 173
- 416948
- 659 678 ATAAATGTCTTTGTTGCAAG 62 2–13–5 173
- 416809
- 660 679 CATAAATGTCTTTGTTGCAA 86 5–10–5 174
- 416872
- 660 679 CATAAATGTCTTTGTTGCAA 20 3–14–3 174
- 416949
- 660 679 CATAAATGTCTTTGTTGCAA 64 2–13–5 174
- 416873
- 661 680 ACATAAATGTCTTTGTTGCA 51 3–14–3 99
- 416950
- 661 680 ACATAAATGTCTTTGTTGCA 71 2–13–5 99
- 416810
- 662 681 CACATAAATGTCTTTGTTGC 68 5–10–5 175
- 416874
- 662 681 CACATAAATGTCTTTGTTGC 49 3–14–3 175
- 416951
- 662 681 CACATAAATGTCTTTGTTGC 48 2–13–5 175
- 416811
- 663 682 CCACATAAATGTCTTTGTTG 84 5–10–5 176
- 416875
- 663 682 CCACATAAATGTCTTTGTTG 75 3–14–3 176
- 416952
- 663 682 CCACATAAATGTCTTTGTTG 51 2–13–5 176
- 416812
- 664 68 TCCACATAAATGTCTTTGTT 59 5–10–5 177
- 416876
- 664 683 TCCACATAAATGTCTTTGTT 37 3–14–3 177
- 416953
- 664 683 TCCACATAAATGTCTTTGTT 45 2–13–5 177
- 416813
- 665 684 GTCCACATAAATGTCTTTGT 70 5–10–5 178
- 416877
- 665 684 GTCCACATAAATGTCTTTGT 51 3–14–3 178
- 416954
- 665 684 GTCCACATAAATGTCTTTGT 61 2–13–5 178
- 416878
- 666 685 GGTCCACATAAATGTCTTTG 95 3–14–3 100
- 416955
- 666 685 GGTCCACATAAATGTCTTTG 75 2–13–5 100
- 416814
- 667 686 AGGTCCACATAAATGTCTTT 83 5–10–5 179
- 416879
- 667 686 AGGTCCACATAAATGTCTTT 92 3–14–3 179
- 416956
- 667 686 AGGTCCACATAAATGTCTTT 61 2–13–5 179
- 416815
- 668 687 TAGGTCCACATAAATGTCTT 63 5–10–5 180
- 416880
- 668 687 TAGGTCCACATAAATGTCTT 66 3–14–3 180
- 416957
- 668 687 TAGGTCCACATAAATGTCTT 59 2–13–5 180
- 416816
- 669 688 CTAGGTCCACATAAATGTCT 79 5–10–5 181
- 416881
- 669 688 CTAGGTCCACATAAATGTCT 81 3–14–3 181
- 416958
- 669 688 CTAGGTCCACATAAATGTCT 43 2–13–5 181
- 416817
- 670 689 TCTAGGTCCACATAAATGTC 74 5–10–5 182
- 416882
- 670 689 TCTAGGTCCACATAAATGTC 60 3–14–3 182
- 416959
- 670 689 TCTAGGTCCACATAAATGTC 25 2–13–5 182
- 416883
- 671 690 GTCTAGGTCCACATAAATGT 82 3–14–3 101
- 416960
- 671 690 GTCTAGGTCCACATAAATGT 60 2–13–5 101
- 416818
- 672 691 TGTCTAGGTCCACATAAATG 76 5–10–5 183
- 416884
- 672 691 TGTCTAGGTCCACATAAATG 69 3–14–3 183
- 416961
- 672 691 TGTCTAGGTCCACATAAATG 40 2–13–5 183
- 416819
- 673 692 ATGTCTAGGTCCACATAAAT 56 5–10–5 184
- 416885
- 673 692 ATGTCTAGGTCCACATAAAT 67 3–14–3 184
- 416962
- 673 692 ATGTCTAGGTCCACATAAAT 77 2–13–5 184
- 416820
- 674 693 CATGTCTAGGTCCACATAAA 77 5–10–5 185
- 416886
- 674 693 CATGTCTAGGTCCACATAAA 74 3–14–3 185
- 416963
- 674 693 CATGTCTAGGTCCACATAAA 48 2–13–5 185
35
(continúa)
5
15
25
35
- 416821
- 675 694 TCATGTCTAGGTCCACATAA 84 5–10–5 186
- 416964
- 675 694 TCATGTCTAGGTCCACATAA 69 2–13–5 186
- 412204
- 676 695 TTCATGTCTAGGTCCACATA 76 5–10–5 32
- 416888
- 676 695 TTCATGTCTAGGTCCACATA 76 3–14–3 32
- 416965
- 676 695 TTCATGTCTAGGTCCACATA 53 2–13–5 32
- 416822
- 677 696 CTTCATGTCTAGGTCCACAT 76 5–10–5 187
- 416889
- 677 696 CTTCATGTCTAGGTCCACAT 60 3–14–3 187
- 416966
- 677 696 CTTCATGTCTAGGTCCACAT 64 2–13–5 187
- 416823
- 678 697 CCTTCATGTCTAGGTCCACA 77 5–10–5 188
- 416890
- 678 697 CCTTCATGTCTAGGTCCACA 87 3–14–3 188
- 416967
- 678 697 CCTTCATGTCTAGGTCCACA 75 2–13–5 188
- 416824
- 679 698 CCCTTCATGTCTAGGTCCAC 64 5–10–5 189
- 416891
- 679 698 CCCTTCATGTCTAGGTCCAC 81 3–14–3 189
- 416968
- 679 698 CCCTTCATGTCTAGGTCCAC 73 2–13–5 189
- 416825
- 680 699 GCCCTTCATGTCTAGGTCCA 92 5–10–5 190
- 416892
- 680 699 GCCCTTCATGTCTAGGTCCA 100 3–14–3 190
- 416969
- 680 699 GCCCTTCATGTCTAGGTCCA 80 2–13–5 190
- 416893
- 681 700 TGCCCTTCATGTCTAGGTCC 90 3–14–3 102
- 416970
- 681 700 TGCCCTTCATGTCTAGGTCC 88 2–13–5 102
- 416826
- 682 701 ATGCCCTTCATGTCTAGGTC 94 5–10–5 191
- 416894
- 682 701 ATGCCCTTCATGTCTAGGTC 85 3–14–3 191
- 416971
- 682 701 ATGCCCTTCATGTCTAGGTC 83 2–13–5 191
- 416827
- 683 702 TATGCCCTTCATGTCTAGGT 93 5–10–5 192
- 416895
- 683 702 TATGCCCTTCATGTCTAGGT 95 3–14–3 192
- 416972
- 683 702 TATGCCCTTCATGTCTAGGT 90 2–13–5 192
- 416828
- 684 703 TTATGCCCTTCATGTCTAGG 87 5–10–5 193
- 416896
- 684 703 TTATGCCCTTCATGTCTAGG 95 3–14–3 193
- 416973
- 684 703 TTATGCCCTTCATGTCTAGG 92 2–13–5 193
- 416829
- 685 704 TTTATGCCCTTCATGTCTAG 72 5–10–5 194
- 416897
- 685 704 TTTATGCCCTTCATGTCTAG 66 3–14–3 194
- 416974
- 685 704 TTTATGCCCTTCATGTCTAG 73 2–13–5 194
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 5 se diseñaron como gapmeros 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE y 2-13-5 MOE. El primer gapmer enumerado en la Tabla 5 es el gapmer original (véase la Tabla 3) a partir del cual los gapmeros restantes se diseñaron a través de microwalk y se designa con un asterisco. Los gapmeros 5-10-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 10 2'desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Los gapmeros 3-14-3 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 14 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 3 nucleótidos cada una. Los gapmeros 2-13-5 tienen una longitud de 20
45 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 13 2'-desoxinucleótidos. El separador central está flanqueado en el extremo 5’con un ala que comprende 2 nucleótidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucleótidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 3-14-3 y 2-13-5), cada nucleótido en el segmento de ala en 5’ y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citidina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitidinas. El "sitio de inicio diana" indica el nucleótido más 5’al al que se dirige el gapmer.. El "sitio de terminación diana" indica el nucleótido más 3’al al que se dirige el gapmer.. Cada gapmer enumerado en la Tabla 5 está dirigido a la SEQ ID NO: 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
Como se muestra en la Tabla 5, todos los gapmeros 5-10-5 MOE, los gapmeros 3-14-3 MOE y los gapmeros 2-13-5
55 MOE dirigidos a la región diana que comienza en el sitio de inicio diana 738 y termina en la parada diana. el sitio 762 (es decir, las bases nucleotídicas 738-762) de la SEQ ID NO: muestra al menos un 45 % de inhibición del ARNm del Factor 11. La mayoría de los gapmeros exhiben al menos 60 % de inhibición. Varios de los gapmer exhiben al menos 80 % de inhibición, incluyendo números ISIS: 412206, 416830, 416831, 416898, 416899, 416900, 416903, 416975, 416976, 416977 y 416980. Los siguientes números de ISIS exhibieron al menos 90 % de inhibición: 412206, 416831 y 416900.
65
36
Tabla 5
5
15
25
- Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 738 a 762 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
- Nº ISIS
- Sitio de inicio diana Sitio de terminación diana Secuencia (5’ a 3’) % de inhibición Motivo SEQ ID No.
- *412206
- 738 757 CCGTGCATCTTTCTTGGCAT 93 5–10–5 34
- 416898
- 738 757 CCGTGCATCTTTCTTGGCAT 88 3–14–3 34
- 416975
- 738 757 CCGTGCATCTTTCTTGGCAT 87 2–13–5 34
- 416830
- 739 758 TCCGTGCATCTTTCTTGGCA 81 5–10–5 195
- 416899
- 739 758 TCCGTGCATCTTTCTTGGCA 86 3–14–3 195
- 416976
- 739 758 TCCGTGCATCTTTCTTGGCA 83 2–13–5 195
- 416831
- 740 759 ATCCGTGCATCTTTCTTGGC 91 5–10–5 196
- 416900
- 740 759 ATCCGTGCATCTTTCTTGGC 90 3–14–3 196
- 416977
- 740 759 ATCCGTGCATCTTTCTTGGC 82 2–13–5 196
- 416832
- 741 760 CATCCGTGCATCTTTCTTGG 79 5–10–5 197
- 416901
- 741 760 CATCCGTGCATCTTTCTTGG 65 3–14–3 197
- 416978
- 741 760 CATCCGTGCATCTTTCTTGG 76 2–13–5 197
- 416833
- 742 761 TCATCCGTGCATCTTTCTTG 65 5–10–5 198
- 416902
- 742 761 TCATCCGTGCATCTTTCTTG 46 3–14–3 198
- 416979
- 742 761 TCATCCGTGCATCTTTCTTG 63 2–13–5 198
- 416834
- 743 762 GTCATCCGTGCATCTTTCTT 58 5–10–5 199
- 416903
- 743 762 GTCATCCGTGCATCTTTCTT 88 3–14–3 199
- 416980
- 743 762 GTCATCCGTGCATCTTTCTT 87 2–13–5 199
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 6 se diseñaron como gapmeros 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE y 2-13-5 MOE. Los primeros gapmeros enumerados en la Tabla 6 son los gapmeros originales (véase la Tabla 3) a partir de los cuales los gapmeros restantes se diseñaron a través de microwalk y se designaron con un asterisco. Los gapmeros 5-10-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 10 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Los gapmeros 3-14-3 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el
35 segmento separador central está compuesto por 14 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 3 nucleótidos cada una. Los gapmeros 2-13-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 13 2'-desoxinucleótidos. El separador central está flanqueado en el extremo 5’con un ala que comprende 2 nucleótidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucleótidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 3-14-3 y 2-13-5), cada nucleótido en el segmento de ala en 5’ y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citidina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitidinas. El "sitio de inicio diana" indica el nucleótido más 5’al al que se dirige el gapmer.. El "sitio de terminación diana" indica el nucleótido más 3’al al que se dirige el gapmer.. Cada gapmer enumerado en la Tabla 6 está dirigido a la SEQ ID NO: 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
45 Como se muestra en la Tabla 6, todos los gapmeros 5-10-5 MOE, los gapmeros 3-14-3 MOE y los gapmeros 2-13-5 MOE dirigidos a la región diana que comienza en el sitio de inicio diana 1018 y termina en la parada diana. el sitio 1042 (es decir, las bases nucleotídicas 1018-1042) de la SEQ ID NO: muestra al menos un 80 % de inhibición del ARNm del Factor 11. Los siguientes números de ISIS exhibieron al menos 90 % de inhibición: 413474, 416837, 416838, 416904, 416907 y 416908.
55
37
Tabla 6
5
15
25
35
- Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 1018 a 1042 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
- Nº ISIS
- Sitio de inicio diana Sitio de terminación diana Secuencia (5’ a 3’) % % de inhibición Motivo SEQ ID No.
- *41221 2
- 1018 1037 89 5–10–5 40
- 416904
- 1018 1037 90 3–14–3 40
- 416981
-
1018
1037
imagen26 87 2–13–5 40
- 416835
- 1019 1038 83 5–10–5 200
- 416905
- 1019 1038 85 3–14–3 200
- 416982
- 1019 1038 84 2–13–5 200
- 416836
- 1020 1039 89 5–10–5 201
- 416906
- 1020 1039 88 3–14–3 201
- 416983
-
1020
1039
imagen27 86 2–13–5 201
- 416837
- 1021 1040 90 5–10–5 202
- 416907
- 1021 1040 90 3–14–3 202
- 416984
- 1021 1040 89 2–13–5 202
- 416838
- 1022 1041 94 5–10–5 203
- 416908
- 1022 1041 98 3–14–3 203
- 416985
- 1022 1041 88 2–13–5 203
- 413474
- 1023 1042 93 5–10–5 107
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 7 se diseñaron como gapmeros 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE y 2-13-5 MOE. El primer gapmer enumerado en la Tabla 7 es el gapmer original (véase la Tabla 3) a partir del cual los gapmeros restantes se diseñaron a través de microwalk y se designa con un asterisco. Los gapmeros 5-10-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 10 2'45 desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Los gapmeros 3-14-3 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 14 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 3 nucleótidos cada una. Los gapmeros 2-13-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 13 2'-desoxinucleótidos. El separador central está flanqueado en el extremo 5’con un ala que comprende 2 nucleótidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucleótidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 3-14-3 y 2-13-5), cada nucleótido en el segmento de ala en 5’ y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citidina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitidinas. El "sitio de inicio diana" indica el nucleótido más 5’al al que se dirige el
55 gapmer.. El "sitio de terminación diana" indica el nucleótido más 3’al al que se dirige el gapmer.. Cada gapmer enumerado en la Tabla 7 está dirigido a la SEQ ID NO: 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
Como se muestra en la Tabla 7, todos los gapmeros 5-10-5 MOE, los gapmeros 3-14-3 MOE y los gapmeros 2-13-5 MOE dirigidos a la región diana que comienza en el sitio de inicio diana 1062 y termina en la parada diana. el sitio 1091 (es decir, las bases nucleotídicas 1062-1091) de la SEQ ID NO: muestra al menos un 20 % de inhibición del ARNm del Factor 11. Muchos de los gapmeros exhiben al menos 50 % de inhibición, inlcuyendo: 412215, 413476, 413476, 416839, 416840, 416841, 416842, 416843, 416844, 416845, 416846, 416847, 416909, 416910, 416911, 416912, 416913, 416914, 416915, 416916, 416917, 416918, 416986, 416987, 416988, 416989, 416990, 416991, 416992, 416993, 416994, 416995. Los siguientes números de ISIS exhibieron al menos 80 % de inhibición: 412215, 65 413476, 413476, 416839, 416840, 416841, 416842, 416843, 416844, 416845, 416910, 416911, 416912, 416913, 416914, 416916, 416917, 416986, 416987, 416989, 416991, 416992, 416993, and 416994. Los siguientes números
38
de ISIS exhibieron al menos 90 % de inhibición: 413476, 413476, 416842, 416844, 416910, 416911, 416912, 416913, 416916, 416917 y 416993.
Tabla 7
15
25
35
45
- Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 1062 a 1091 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
- Nº ISIS
- Sitio de inicio diana Sitio de terminación diana Secuencia (5’ a 3’) % de inhibición Motivo SEQ ID No.
- *413476
- 1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 93 5–10–5 109
- 412215
- 1062 1081 ATTCTTTGGGCCATTCCTGG 82 5–10–5 43
- 416909
- 1062 1081 ATTCTTTGGGCCATTCCTGG 78 3–14–3 43
- 416986
- 1062 1081 ATTCTTTGGGCCATTCCTGG 88 2–13–5 43
- 416839
- 1063 1082 GATTCTTTGGGCCATTCCTG 89 5–10–5 204
- 416910
- 1063 1082 GATTCTTTGGGCCATTCCTG 90 3–14–3 204
- 416987
- 1063 1082 GATTCTTTGGGCCATTCCTG 80 2–13–5 204
- 416840
- 1064 1083 AGATTCTTTGGGCCATTCCT 85 5–10–5 205
- 416911
- 1064 1083 AGATTCTTTGGGCCATTCCT 90 3–14–3 205
- 416988
- 1064 1083 AGATTCTTTGGGCCATTCCT 76 2–13–5 205
- 416841
- 1065 1084 GAGATTCTTTGGGCCATTCC 87 5–10–5 206
- 416912
- 1065 1084 GAGATTCTTTGGGCCATTCC 92 3–14–3 206
- 416989
- 1065 1084 GAGATTCTTTGGGCCATTCC 88 2–13–5 206
- 416842
- 1066 1085 TGAGATTCTTTGGGCCATTC 94 5–10–5 207
- 416913
- 1066 1085 TGAGATTCTTTGGGCCATTC 93 3–14–3 207
- 416990
- 1066 1085 TGAGATTCTTTGGGCCATTC 76 2–13–5 207
- 413476
- 1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 93 5–10–5 109
- 416914
- 1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 87 3–14–3 109
- 416991
- 1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 87 2–13–5 109
- 416843
- 1068 1087 TTTGAGATTCTTTGGGCCAT 89 5–10–5 208
- 416915
- 1068 1087 TTTGAGATTCTTTGGGCCAT 79 3–14–3 208
- 416992
- 1068 1087 TTTGAGATTCTTTGGGCCAT 84 2–13–5 208
- 416844
- 1069 1088 CTTTGAGATTCTTTGGGCCA 90 5–10–5 209
- 416916
- 1069 1088 CTTTGAGATTCTTTGGGCCA 91 3–14–3 209
- 416993
- 1069 1088 CTTTGAGATTCTTTGGGCCA 91 2–13–5 209
- 416845
- 1070 1089 TCTTTGAGATTCTTTGGGCC 86 5–10–5 210
- 416917
- 1070 1089 TCTTTGAGATTCTTTGGGCC 92 3–14–3 210
- 416994
- 1070 1089 TCTTTGAGATTCTTTGGGCC 83 2–13–5 210
- 416846
- 1071 1090 TTCTTTGAGATTCTTTGGGC 72 5–10–5 211
- 416918
- 1071 1090 TTCTTTGAGATTCTTTGGGC 63 3–14–3 211
- 416995
- 1071 1090 TTCTTTGAGATTCTTTGGGC 64 2–13–5 211
- 416847
- 1072 1091 TTTCTTTGAGATTCTTTGGG 50 5–10–5 212
- 416919
- 1072 1091 TTTCTTTGAGATTCTTTGGG 27 3–14–3 212
- 416996
- 1072 1091 TTTCTTTGAGATTCTTTGGG 22 2–13–5 212
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 8 se diseñaron como gapmeros 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE y 2-13-5 MOE. Los primeros gapmeros enumerados en la Tabla 8 son los gapmeros originales (véase la Tabla 3) a partir de los cuales los gapmeros restantes se diseñaron a través de microwalk y se designaron con un asterisco. Los gapmeros 5-10-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 10 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Los gapmeros 3-14-3 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el
55 segmento separador central está compuesto por 14 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 3 nucleótidos cada una. Los gapmeros 2-13-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 13 2'-desoxinucleótidos. El separador central está flanqueado en el extremo 5’con un ala que comprende 2 nucleótidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucleótidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 3-14-3 y 2-13-5), cada nucleótido en el segmento de ala en 5’ y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citidina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitidinas. El "sitio de inicio diana" indica el nucleótido más 5’al al que se dirige el gapmer.. El "sitio de terminación diana" indica el nucleótido más 3’al al que se dirige el gapmer.. Cada gapmer enumerado en la Tabla 8 está dirigido a la SEQ ID NO: 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
65 Como se muestra en la Tabla 8, todos los gapmeros 5-10-5 MOE, los gapmeros 3-14-3 MOE y los gapmeros 2-13-5
39
MOE dirigidos a la región diana que comienza en el sitio de inicio diana 1275 y termina en la parada diana. el sitio 1318 (es decir, las bases nucleotídicas 1275-1318) de la SEQ ID NO: muestra al menos un 70 % de inhibición del ARNm del Factor 11. Muchos de los gapmeros exhiben al menos 80 % de inhibición, inlcuyendo: 412223, 412224, 412225, 413482, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 5 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 416920, 416921, 416922, 416923, 416924, 416925, 416926, 416927, 416928, 416929, 416930, 416931, 416932, 416933, 416934, 416935, 416936, 416937, 416938, 416939, 416940, 416941, 416942, 416943, 416944, 416997, 416998, 416999, 417000, 417001, 417002, 417003, 417004, 417006, 417007, 417008, 417009, 417010, 417011, 417013, 417014, 417015, 417016, 417017, 417018, 417019, y 417020. The Los siguientes números de ISIS exhibieron al menos 90 % de inhibición: : 412224, 416850, 416853, 416856, 416857, 416858, 416861, 416862, 416864, 416922, 416923, 416924, 416925, 416926, 416928, 416931, 416932, 416933, 416934, 416935, 416937, 416938, 416940, 416941, 416943, 416999, 417002, 416854, y 416859.
15 Tabla 8
25
35
45
55
- Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 1275 a 1318 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
- Nº ISIS
- Sitio de inicio diana Sitio de terminación diana Secuencia (5’ a 3’) % de inhibición Motivo SEQ ID No.
- *412223
- 1275 1294 ACAGTTTCTGGCAGGCCTCG 85 5–10–5 51
- *412224
- 1285 1304 GCATTGGTGCACAGTTTCTG 93 5–10–5 52
- *413482
- 1290 1309 GGACGGCATTGGTGCACAGT 89 5–10–5 115
- *412225
- 1295 1314 GCAGCGGACGGCATTGGTGC 86 5–10–5 53
- 416920
- 1275 1294 ACAGTTTCTGGCAGGCCTCG 88 3–14–3 51
- 416997
- 1275 1294 ACAGTTTCTGGCAGGCCTCG 84 2–13–5 51
- 416848
- 1276 1295 CACAGTTTCTGGCAGGCCTC 86 5–10–5 213
- 416921
- 1276 1295 CACAGTTTCTGGCAGGCCTC 88 3–14–3 213
- 416998
- 1276 1295 CACAGTTTCTGGCAGGCCTC 88 2–13–5 213
- 416849
- 1277 1296 GCACAGTTTCTGGCAGGCCT 88 5–10–5 214
- 416922
- 1277 1294 GCACAGTTTCTGGCAGGCCT 94 3–14–3 214
- 416999
- 1277 1296 GCACAGTTTCTGGCAGGCCT 92 2–13–5 214
- 416850
- 1278 1297 TGCACAGTTTCTGGCAGGCC 93 5–10–5 215
- 416923
- 1278 1297 TGCACAGTTTCTGGCAGGCC 96 3–14–3 215
- 417000
- 1278 1297 TGCACAGTTTCTGGCAGGCC 89 2–13–5 215
- 416851
- 1279 1298 GTGCACAGTTTCTGGCAGGC 88 5–10–5 216
- 416924
- 1279 1298 GTGCACAGTTTCTGGCAGGC 96 3–14–3 216
- 417001
- 1279 1298 GTGCACAGTTTCTGGCAGGC 83 2–13–5 216
- 416925
- 1280 1299 GGTGCACAGTTTCTGGCAGG 98 3–14–3 114
- 417002
- 1280 1299 GGTGCACAGTTTCTGGCAGG 92 2–13–5 114
- 416852
- 1281 1300 TGGTGCACAGTTTCTGGCAG 84 5–10–5 217
- 416926
- 1281 1300 TGGTGCACAGTTTCTGGCAG 93 3–14–3 217
- 417003
- 1281 1300 TGGTGCACAGTTTCTGGCAG 89 2–13–5 217
- 416853
- 1282 1301 TTGGTGCACAGTTTCTGGCA 91 5–10–5 218
- 416927
- 1282 1301 TTGGTGCACAGTTTCTGGCA 87 3–14–3 218
- 417004
- 1282 1301 TTGGTGCACAGTTTCTGGCA 86 2–13–5 218
- 416854
- 1283 1302 ATTGGTGCACAGTTTCTGGC 90 5–10–5 219
- 416928
- 1283 1302 ATTGGTGCACAGTTTCTGGC 91 3–14–3 219
- 417005
- 1283 1302 ATTGGTGCACAGTTTCTGGC 79 2–13–5 219
- 416855
- 1284 1303 CATTGGTGCACAGTTTCTGG 87 5–10–5 220
- 416929
- 1284 1303 CATTGGTGCACAGTTTCTGG 83 3–14–3 220
- 417006
- 1284 1303 CATTGGTGCACAGTTTCTGG 81 2–13–5 220
- 416930
- 1285 1304 GCATTGGTGCACAGTTTCTG 87 3–14–3 52
- 417007
- 1285 1304 GCATTGGTGCACAGTTTCTG 82 2–13–5 52
- 416856
- 1286 1305 GGCATTGGTGCACAGTTTCT 95 5–10–5 221
- 416931
- 1286 1305 GGCATTGGTGCACAGTTTCT 96 3–14–3 221
- 417008
- 1286 1305 GGCATTGGTGCACAGTTTCT 82 2–13–5 221
- 416857
- 1287 1306 CGGCATTGGTGCACAGTTTC 92 5–10–5 222
- 416932
- 1287 1306 CGGCATTGGTGCACAGTTTC 92 3–14–3 222
- 417009
- 1287 1306 CGGCATTGGTGCACAGTTTC 85 2–13–5 222
40
(continúa)
5
15
25
35
- 416858
- 1288 1307 ACGGCATTGGTGCACAGTTT 93 5–10–5 223
- 416933
- 1288 1307 ACGGCATTGGTGCACAGTTT 92 3–14–3 223
- 417010
- 1288 1307 ACGGCATTGGTGCACAGTTT 81 2–13–5 223
- 416859
- 1289 1308 GACGGCATTGGTGCACAGTT 90 5–10–5 224
- 416934
- 1289 1308 GACGGCATTGGTGCACAGTT 90 3–14–3 224
- 417011
- 1289 1308 GACGGCATTGGTGCACAGTT 86 2–13–5 224
- 416935
- 1290 1309 GGACGGCATTGGTGCACAGT 92 3–14–3 115
- 417012
- 1290 1309 GGACGGCATTGGTGCACAGT 72 2–13–5 115
- 416860
- 1291 1310 CGGACGGCATTGGTGCACAG 88 5–10–5 225
- 416936
- 1291 1310 CGGACGGCATTGGTGCACAG 89 3–14–3 225
- 417013
- 1291 1310 CGGACGGCATTGGTGCACAG 86 2–13–5 225
- 416861
- 1292 1311 GCGGACGGCATTGGTGCACA 92 5–10–5 226
- 416937
- 1292 1311 GCGGACGGCATTGGTGCACA 93 3–14–3 226
- 417014
- 1292 1311 GCGGACGGCATTGGTGCACA 87 2–13–5 226
- 416862
- 1293 1312 AGCGGACGGCATTGGTGCAC 90 5–10–5 227
- 416938
- 1293 1312 AGCGGACGGCATTGGTGCAC 90 3–14–3 227
- 417015
- 1293 1312 AGCGGACGGCATTGGTGCAC 87 2–13–5 227
- 416863
- 1294 1313 CAGCGGACGGCATTGGTGCA 83 5–10–5 228
- 416939
- 1294 1313 CAGCGGACGGCATTGGTGCA 88 3–14–3 228
- 417016
- 1294 1313 CAGCGGACGGCATTGGTGCA 85 2–13–5 228
- 416940
- 1295 1314 GCAGCGGACGGCATTGGTGC 92 3–14–3 53
- 417017
- 1295 1314 GCAGCGGACGGCATTGGTGC 82 2–13–5 53
- 416864
- 1296 1315 GGCAGCGGACGGCATTGGTG 93 5–10–5 229
- 416941
- 1296 1315 GGCAGCGGACGGCATTGGTG 95 3–14–3 229
- 417018
- 1296 1315 GGCAGCGGACGGCATTGGTG 82 2–13–5 229
- 416865
- 1297 1316 TGGCAGCGGACGGCATTGGT 88 5–10–5 230
- 416942
- 1297 1316 TGGCAGCGGACGGCATTGGT 85 3–14–3 230
- 417019
- 1297 1316 TGGCAGCGGACGGCATTGGT 84 2–13–5 230
- 416866
- 1298 1317 CTGGCAGCGGACGGCATTGG 88 5–10–5 231
- 416943
- 1298 1317 CTGGCAGCGGACGGCATTGG 92 3–14–3 231
- 417020
- 1298 1317 CTGGCAGCGGACGGCATTGG 84 2–13–5 231
- 416867
- 1299 1318 ACTGGCAGCGGACGGCATTG 83 5–10–5 232
- 416944
- 1299 1318 ACTGGCAGCGGACGGCATTG 83 3–14–3 232
- 417021
- 1299 1318 ACTGGCAGCGGACGGCATTG 74 2–13–5 232
Example 4: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del factor 11 humano en células HepG2
Gapmeros del Ejemplo 3 (véanse las Tablas 4, 5, 6, 7 y 8), que exhiben inhibición in vitro del factor 11 humano, se analizaron a diversas dosis en células HepG2. Las células se sembraron a una densidad de 10.000 células por
45 pocillo y se transfectaron usando reactivo de lipofectina con concentraciones de 9,375 nM, 18,75 nM, 37,5 nM y 75 nM del oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 9. El conjunto de sonda de cebador Factor 11 humano, RTS 2966, se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm del factor 11 se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición del factor 11 respecto a las células control sin tratar. Como se ilustra en la Tabla 9, los niveles de A.RNm del Factor 11 se redujeron de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
55
41
Tabla 9
5
15
25
35
- Inhibición antisentido dependiente de la dosis del factor 11 humano en células HepG2 a través de la transfección de oligonucleótidos con lipofectin
- 9,375 nM
- 18,75 nM 37,5 nM 75 nM Motif IC50 (nM) SEQ ID No.
- 412203
- 33 40 62 74 5–10–5 24 31
- 412206
- 24 47 69 86 5–10–5 21 34
- 413467
- 35 51 62 69 5–10–5 20 100
- 413474
- 29 44 57 67 5–10–5 28 107
- 413476
- 24 58 62 77 5–10–5 21 109
- 416825
- 23 52 73 92 5–10–5 20 190
- 416826
- 8 36 58 84 5–10–5 29 191
- 416827
- 31 42 62 77 5–10–5 23 192
- 416838
- 31 51 64 86 5–10–5 19 203
- 416842
- 18 33 62 71 5–10–5 31 207
- 416850
- 4 30 67 84 5–10–5 29 215
- 416856
- 21 45 58 74 5–10–5 27 221
- 416858
- 0 28 54 82 5–10–5 33 223
- 416864
- 18 43 62 78 5–10–5 26 229
- 416878
- 22 34 60 82 5–10–5 27 100
- 416892
- 16 50 70 85 3–14–3 23 190
- 416895
- 39 57 66 71 3–14–3 15 192
- 416896
- 22 39 57 81 3–14–3 27 193
- 416908
- 36 57 67 76 3–14–3 16 203
- 416922
- 14 25 49 75 3–14–3 36 214
- 416923
- 36 47 60 67 3–14–3 23 215
- 416924
- 25 38 56 59 3–14–3 36 216
- 416925
- 13 38 59 75 3–14–3 30 114
- 416926
- 31 43 63 82 3–14–3 22 217
- 416931
- 44 39 57 71 3–14–3 22 221
- 416941
- 33 54 63 78 3–14–3 19 229
- 416945
- 34 45 62 65 2–13–5 24 31
- 416969
- 17 39 61 76 2–13–5 28 190
- 416972
- 32 40 60 69 2–13–5 26 192
- 416973
- 60 75 85 87 2–13–5 3 193
- 416984
- 26 50 62 81 2–13–5 22 202
- 416985
- 17 30 47 57 2–13–5 49 203
- 416989
- 18 41 62 83 2–13–5 26 206
- 416993
- 15 37 50 68 2–13–5 36 209
- 416999
- 24 37 55 73 2–13–5 30 214
- 417000
- 35 47 58 70 2–13–5 23 215
- 417002
- 35 52 67 70 2–13–5 19 114
- 417003
- 26 44 60 56 2–13–5 33 217
45 Los gapmeros también se transfectaron mediante electroporación y se midió su inhibición dependiente de la dosis del ARNm del Factor 11 humano. Las células se sembraron a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron mediante electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,7 μM, 2,2 μM, 6,7 μM y 20 μM, como se especifica en la Tabla 10. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN aislado de las células y los niveles de ARNm del Factor 11 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador Factor 11 humano, RTS 2966, se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm del factor 11 se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición del factor 11 respecto a las células control sin tratar. Como se ilustra en la Tabla 10, los niveles de A.RNm del Factor 11 se redujeron de una manera
55 dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
42
Tabla 10
5
15
25
35
45
- Inhibición antisentido dependiente de la dosis del factor 11 humano en células HepG2 a través de la transfección de oligonucleótidos con electroporación
- 0,7 µM
- 2,2 µM 6,7 µM 20 µM CI50 (µM SEQ ID No.
- 412203
- 11 60 70 91 2,7 31
- 412206
- 22 39 81 94 2,7 34
- 413467
- 5 31 65 89 4,2 100
- 413474
- 0 5 52 81 6,9 107
- 413476
- 40 69 88 93 0,9 109
- 416825
- 27 74 92 98 1,3 190
- 416826
- 2 47 86 82 3,2 191
- 416827
- 37 68 87 92 1,1 192
- 416838
- 5 30 55 83 5,1 203
- 416842
- 0 10 66 92 5,0 207
- 416850
- 14 25 81 91 3,4 215
- 416856
- 0 29 47 93 5,1 221
- 416858
- 5 20 56 86 5,3 223
- 416864
- 32 65 78 90 1,4 229
- 416878
- 1 26 75 85 4,3 100
- 416892
- 14 52 82 92 2,5 190
- 416895
- 0 62 70 91 3,0 192
- 416896
- 12 35 81 89 3,2 193
- 416908
- 7 58 74 89 2,8 203
- 416922
- 35 51 77 91 1,7 214
- 416923
- 15 30 60 90 4,0 215
- 416924
- 22 40 63 70 4,1 216
- 416925
- 0 40 76 80 3,9 114
- 416926
- 47 71 91 94 0,6 217
- 416931
- 7 24 60 82 5,1 221
- 416941
- 16 38 79 89 3,0 229
- 416945
- 48 70 81 88 0,6 31
- 416969
- 25 34 86 92 2,5 190
- 416972
- 25 30 48 88 4,3 192
- 416973
- 20 48 86 93 2,3 193
- 416984
- 43 54 88 90 1,1 202
- 416985
- 12 48 45 69 5,8 203
- 416989
- 32 65 88 94 1,3 206
- 416993
- 22 48 87 92 2,2 209
- 416999
- 20 42 77 88 2,8 214
- 417000
- 46 73 76 89 0,6 215
- 417002
- 32 38 82 91 2,2 114
- 417003
- 0 34 75 89 3,9 217
Ejemplo 5: Selección y confirmación de la inhibición de antisentido dependiente de la dosis eficaz del Factor 11 humano en células HepG2
Se seleccionaron gapmeros que exhibían una inhibición significativa dependiente de la dosis del Factor 11 humano en el Ejemplo 4 y se analizaron a diversas dosis en células HepG2. Las células se sembraron a una densidad de
10.000 células por pocillo y se transfectaron usando reactivo de lipofectin con concentraciones de 9,34 nM, 4,69 nM, 9,375 nM, 18,75 nM, 37,5 nM, y 75 nM del oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 11. Después 55 de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de ARNm del Factor 11 humano se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador Factor 11 humano, RTS 2966, se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm del factor 11 se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición del factor 11 humano respecto a las células control sin tratar. Como se ilustra en la Tabla 11, los niveles de A.RNm del Factor 11 se redujeron de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido en comparación con el control.
65
43
comienza en el sitio de inicio 1275 diana y termina en el sitio de detención diana 1317 (es decir, bases nucleotídicas 1275-1317) de SEQ ID NO: 1 exhibieron al menos 60 % inhibición del ARNm del Factor 11. De manera similar, todos los gapmeros re-evaluados de las Tablas 1 y 8 exhibieron al menos 60 % de inhibición.
Varios de los gapmeros exhiben al menos 70 % de inhibición, incluyendo números ISIS: ISIS 412206, 412224, 412225, 413481, 413482, 416825, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 445494, 445495, 445496, 445497, 445498, 445499, 445500, 445501, 445502, 445503, 445504, 445505, 445506, 445507, 445508, 445509, 445510, 445511, 445512, 445513, 445514, 445515, 445516, 445517, 445518, 445519, 445520, 445521, 445522, 445523, 445524, 445525, 445526, 445527, 445528, 445529, 445530, 445531, 445532, 445533, 445534, 445535, 445536, 445537, 455538, 445539, 445540, 445541, 445542, y 445543.
Varios de los gapmeros exhiben al menos 80 % de inhibición, incluyendo números ISIS: ISIS 412206, 412224, 412225, 413481, 413482, 416825, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 445494, 445495, 445496, 445497, 445498, 445500, 445501, 445502, 445503, 445504, 445505, 445506, 445507, 445508, 445509, 445510, 445513, 445514, 445519, 445520, 445521, 445522, 445525, 445526, 445529, 445530, 445531, 445532, 445533, 445534, 445535, 445536, 455538, 445541, y 445542.
Varios de los gapmeros exhiben al menos 90 % de inhibición, incluyendo números ISIS: ISIS 412206, 416825, 416850, 416857, 416858, 416861, 445522 y 445531.
Tabla 44
- Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 1018 a 1042 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
- Nº ISIS
- Sitio de inicio humano Sitio de terminación humano Secuencia (5' a 3') Porcentaje de inhibición Motivo SEC Nº ID Sitio de inicio en mono rhesus Sitio de terminación en mono rhesus
- *416850
- 1278 1297 91 5–10– 5 215 1277 1296
- *416858
- 1288 1307 90 5–10– 5 223 1287 1306
- 416825
- 680 699 90 5–10– 5 190 679 698
- 412206
- 738 757 91 5–10– 5 34 737 756
- 412223
- 1275 1294 62 5–10– 5 51 1274 1293
- 445493
- 1275 1294 69 6–8–6 51 1274 1293
- 445518
-
1275
1292
imagen48 75 5–8–5 242 1274 1291
- 416848
- 1276 1295 87 5–10– 5 213 1275 1294
- 445494
- 1276 1295 85 6–8–6 213 1275 1294
- 445519
- 1276 1293 81 5–8–5 243 1275 1292
- 416849
- 1277 1296 88 5–10– 5 214 1276 1295
- 445495
-
1277
1296
imagen49 89 6–8–6 214 1276 1295
- 445520
- 1277 1294 82 5–8–5 244 1276 1293
- 445496
- 1278 1297 87 6–8–6 215 1277 1296
- 445521
- 1278 1295 87 5–8–5 245 1277 1294
64 (continúa)
- 416851
- 1279 1298 89 5–10–5 216 1278 1297
- 445497
- 1279 1298 81 6–8–6 216 1278 1297
- 445522
- 1279 1296 91 5–8–5 246 1278 1295
- 413481
- 1280 1299 82 5–10–5 114 1279 1298
- 445498
- 1280 1299 83 6–8–6 114 1279 1298
- 445523
- 1280 1297 73 5–8–5 267 1279 1296
- 416852
- 1281 1300 87 5–10–5 217 1280 1299
- 445499
- 1281 1300 75 6–8–6 217 1280 1299
- 445524
- 1281 1298 75 5–8–5 247 1280 1297
- 416853
- 1282 1301 84 5–10–5 218 1281 1300
- 445500
- 1282 1301 81 6–8–6 218 1281 1300
- 445525
- 1282 1299 85 5–8–5 248 1281 1298
- 416854
- 1283 1302 86 5–10–5 219 1282 1301
- 445501
- 1283 1302 83 6–8–6 219 1282 1301
- 445526
- 1283 1300 81 5–8–5 249 1282 1299
- 416855
- 1284 1303 85 5–10–5 220 1283 1302
- 445502
- 1284 1303 83 6–8–6 220 1283 1302
- 445527
- 1284 1301 70 5–8–5 250 1283 1300
- 412224
- 1285 1304 84 5–10–5 52 1284 1303
- 445503
- 1285 1304 89 6–8–6 52 1284 1303
- 445528
- 1285 1302 73 5–8–5 251 1284 1301
- 416856
- 1286 1305 84 5–10–5 221 1285 1304
- 445504
- 1286 1305 87 6–8–6 221 1285 1304
- 445529
- 1286 1303 85 5–8–5 252 1285 1302
- 416857
- 1287 1306 91 5–10–5 222 1286 1305
- 445505
- 1287 1306 89 6–8–6 222 1286 1305
- 445530
- 1287 1304 83 5–8–5 253 1286 1303
- 445506
- 1288 1307 86 6–8–6 223 1287 1306
65 (continúa)
- 445531
- 1288 1305 90 5–8–5 254 1287 1304
- 416859
- 1289 1308 85 5–10–5 224 1288 1307
- 445507
- 1289 1308 85 6–8–6 224 1288 1307
- 445532
- 1289 1306 89 5–8–5 255 1288 1305
- 413482
- 1290 1309 88 5–10–5 115 1289 1308
- 445508
- 1290 1309 81 6–8–6 115 1289 1308
- 445533
- 1290 1307 87 5–8–5 256 1289 1306
- 416860
- 1291 1310 89 5–10–5 225 1290 1309
- 445509
- 1291 1310 84 6–8–6 225 1290 1309
- 445534
- 1291 1308 82 5–8–5 257 1290 1307
- 416861
- 1292 1311 90 5–10–5 226 1291 1310
- 445510
- 1292 1311 88 6–8–6 226 1291 1310
- 445535
- 1292 1309 83 5–8–5 258 1291 1308
- 416862
- 1293 1312 89 5–10–5 227 1292 1311
- 445511
- 1293 1312 77 6–8–6 227 1292 1311
- 445536
- 1293 1310 82 5–8–5 259 1292 1309
- 416863
- 1294 1313 86 5–10–5 228 1293 1312
- 445512
- 1294 1313 79 6–8–6 228 1293 1312
- 445537
- 1294 1311 78 5–8–5 260 1293 1310
- 412225
- 1295 1314 86 5–10–5 53 1294 1313
- 445513
- 1295 1314 85 6–8–6 53 1294 1313
- 445538
- 1295 1312 80 5–8–5 261 1294 1311
- 416864
- 1296 1315 88 5–10–5 229 1295 1314
- 445514
- 1296 1315 81 6–8–6 229 1295 1314
- 445539
-
1296
1313
imagen50 79 5–8–5 262 1295 1312
- 416865
- 1297 1316 86 5–10–5 230 1296 1315
- 445515
- 1297 1316 75 6–8–6 230 1296 1315
- 445540
- 1297 1314 74 5–8–5 263 1296 1313
66
Tabla 80
- Cambio en el peso corporal y de los órganos de ratones CD1 después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido
- Hígado (%)
- Riñón (%) Bazo (%) Peso corporal (g)
- PBS
- 5 1,5 0,3 7
- ISIS 416850
- 6 1,6 0,4 12
- ISIS 416858
- 7 1,6 0,6 12
- ISIS 416864
- 5 1,6 0,3 12
- ISIS 412223
- 6 1,5 0,4 12
- ISIS 412224
- 6 1,6 0,5 10
- ISIS 412225
- 6 1,5 0,4 10
- ISIS 413481
- 6 1,5 0,5 9
- ISIS 413482
- 6 1,6 0,5 11
- ISIS 416848
- 6 1,5 0,4 11
- ISIS 416849
- 8 1,5 0,4 8
- ISIS 416851
- 7 1,5 0,5 11
- ISIS 416852
- 6 1,5 0,4 10
- ISIS 416853
- 8 1,5 0,7 13
- ISIS 416854
- 7 1,2 0,4 13
- ISIS 416855
- 8 1,4 0,6 12
- ISIS 416856
- 6 1,4 0,4 10
- ISIS 416857
- 7 1,6 0,5 10
- ISIS 416859
- 6 1,5 0,4 10
- ISIS 416860
- 6 1,4 0,4 10
- ISIS 416861
- 5 1,3 0,4 9
- ISIS 416862
- 6 1,5 0,4 10
- ISIS 416863
- 5 1,5 0,4 9
- ISIS 416865
- 6 1,5 0,4 8
- ISIS 416866
- 5 1,6 0,4 10
- ISIS 416867
- 5 1,4 0,4 9
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron las concentraciones plasmáticas de transaminasas usando un analizador automático de química clínica (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de alanina transaminasa (ALT) y aspartato transaminasa (AST) se expresan en UI/l y los resultados se presentan en la Tabla 81. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron un aumento en los niveles de ALT/AST por encima de siete veces de control fueron seleccionado para más estudios. Los niveles plasmáticos de bilirrubina, colesterol y albúmina también se midieron usando el mismo analizador químico clínico y se presentan en la Tabla 81 expresados en mg/dl. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron un aumento en los niveles de bilirrubina más del doble de los niveles de control por tratamiento con oligonucleótidos antisentido se seleccionaron para estudios adicionales.
Tabla 81
- Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre marcadores metabólicos en el hígado de ratones CD1
- ALT (UI/l)
- AST (UI/l) Bilirrubina (mg/dl) Albúmina (mg/dl) Colesterol (mg/dl)
- PBS
- 32 68 0,25 3,7 135
- ISIS 416850
- 75 99 0,21 3,5 142
- ISIS 416858
- 640 547 0,28 4,4 181
- ISIS 416864
- 36 67 0,19 2,6 152
- ISIS 412223
- 60 125 0,20 3,0 117
- ISIS 412224
- 214 183 0,19 3,4 114
- ISIS 412225
- 40 69 0,23 3,3 128
- ISIS 413481
- 85 143 0,18 3,2 153
- ISIS 413482
- 54 77 0,24 3,0 138
- ISIS 416848
- 153 153 0,19 3,1 151
- ISIS 416849
- 1056 582 0,22 2,5 109
- ISIS 416851
- 47 76 0,19 3,1 106
- ISIS 416852
- 49 91 0,16 4,9 125
82
% y un aumento en el recuento de monocitos de más de tres veces se seleccionaron para estudios adicionales.
Tabla 83
- Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre factores hematológicos en ratones CD1
- RBC (106/µl)
- Hemoglobina (g/dl) HCT ( %) WBC (103/µl)
- PBS
- 10 15 51 7
- ISIS 416850
- 10 15 49 5
- ISIS 416858
- 9 14 50 8
- ISIS 416864
- 10 15 52 5
- ISIS 412223
- 9 15 48 7
- ISIS 412224
- 10 15 50 9
- ISIS 412225
- 9 15 50 7
- ISIS 413481
- 9 13 45 7
- ISIS 413482
- 10 15 50 8
- ISIS 416848
- 9 14 47 7
- ISIS 416849
- 9 14 48 9
- ISIS 416851
- 9 14 47 6
- ISIS 416852
- 9 14 49 5
- ISIS 416853
- 11 17 56 8
- ISIS 416854
- 9 13 43 12
- ISIS 416855
- 9 14 50 6
- ISIS 416856
- 9 14 47 5
- ISIS 416857
- 10 15 53 6
- ISIS 416859
- 10 15 49 6
- ISIS 416860
- 10 15 51 7
- ISIS 416861
- 9 14 48 7
- ISIS 416862
- 9 14 49 6
- ISIS 416863
- 9 14 48 7
- ISIS 416865
- 9 14 50 7
- ISIS 416866
- 9 15 51 6
- ISIS 416867
- 10 14 47 8
Tabla 84
- Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre el recuento de células sanguíneas ratones CD1
- Neutrófilos (células/μl)
- Linfocitos (células/μl) Monocitos (células/μl) Plaquetas (103/µl)
- PBS
- 1023 6082 205 940
- ISIS 416850
- 1144 4004 156 916
- ISIS 416858
- 2229 5480 248 782
- ISIS 416864
- 973 3921 141 750
- ISIS 412223
- 1756 4599 200 862
- ISIS 412224
- 2107 6284 195 647
- ISIS 412225
- 1547 4969 293 574
- ISIS 413481
- 1904 4329 204 841
- ISIS 413482
- 1958 5584 275 818
- ISIS 416848
- 1264 5268 180 953
- ISIS 416849
- 1522 6967 253 744
- ISIS 416851
- 1619 4162 194 984
- ISIS 416852
- 1241 3646 189 903
- ISIS 416853
- 2040 5184 225 801
- ISIS 416854
- 2082 9375 455 1060
- ISIS 416855
- 1443 4236 263 784
- ISIS 416856
- 1292 3622 151 753
- ISIS 416857
- 1334 3697 215 603
- ISIS 416859
- 1561 4363 229 826
- ISIS 416860
- 1291 4889 161 937
- ISIS 416861
- 1122 5119 219 836
- ISIS 416862
- 1118 4445 174 1007
- ISIS 416863
- 1330 5617 226 1131
- ISIS 416865
- 1227 5148 315 872
- ISIS 416866
- 1201 4621 211 1045
- ISIS 416867
- 1404 6078 188 1006
84
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron las concentraciones plasmáticas de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina usando un analizador automático de química clínica (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 88, expresados en mg/dl. Esos oligonucleótidos antisentido que no afectaron más de dos veces el aumento en los niveles de BUN en comparación con el control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores. La proteína urinaria total y la proporción de proteína urinaria a creatinina en muestras totales de orina después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se calculó y también se presenta en la Tabla 88. Esos oligonucleótidos antisentido que no afectaron más de cinco veces el aumento de las proporciones proteína/creatinina en la orina al control PBS fueron seleccionados para estudios adicionales.
Tabla 88
- Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre marcadores metabólicos en el riñón de ratas Sprague-Dawley
- BUN (mg/dl)
- Creatinina (mg/dl) Proteína total en orina (mg/dl) Relación proteína en orina/creatinina
- PBS
- 19 38 60 1,7
- ISIS 412223
- 24 46 224 4,6
- ISIS 412224
- 24 44 171 3,8
- ISIS 412225
- 23 58 209 4,0
- ISIS 413481
- 26 45 148 3,6
- ISIS 413482
- 23 34 157 4,8
- ISIS 416848
- 26 64 231 3,9
- ISIS 416851
- 24 70 286 4,0
- ISIS 416852
- 25 60 189 3,0
- ISIS 416856
- 23 48 128 2,7
- ISIS 416859
- 24 44 144 3,3
- ISIS 416860
- 23 58 242 4,6
- ISIS 416861
- 22 39 205 5,1
- ISIS 416863
- 29 73 269 3,8
- ISIS 416866
- 22 85 486 6,2
- ISIS 416867
- 22 70 217 3,1
Ensayos hematológicos
La sangre obtenida de todos los grupos de ratas se envió a Antech Diagnostics para mediciones de hematocrito (HCT), así como mediciones de varias células sanguíneas, como WBC (neutrófilos y linfocitos), glóbulos rojos y plaquetas, y el contenido total de hemoglobina. Los resultados se presentan en las Tablas 89 y 90. Esos oligonucleótidos antisentido que no afectaron a una disminución en el recuento de plaquetas de más del 50 % y un aumento en el recuento de monocitos de más de tres veces se seleccionaron para estudios adicionales.
87
Tabla 168
- Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los niveles de citocinas/quimiocinas (pg/ml) en monos cynomolgus el día 55
- IL–1β
- IL–6 IFN–γ TNF–α IL–8 MIP–1α MCP–1 MIP–1β RANTES
- PBS
- 453 3 232 191 68 21 237 34 775
- ISIS 416850
- 106 1 19 16 620 17 887 50 27503
- ISIS 449409
- 181 0 25 8 254 17 507 47 8958
- ISIS 445522
- 341 2 83 18 100 22 592 63 16154
- ISIS 449710
- 286 2 176 26 348 27 474 53 22656
- ISIS 449707
- 97 1 24 16 48 12 264 49 1193
- ISIS 449711
- 146 7 22 31 110 17 469 91 3029
- ISIS 449708
- 131 0 18 17 85 23 409 128 4561
- ISIS 416858
- 28 1 9 15 167 11 512 47 5925
- ISIS 445531
- 155 1 15 16 293 12 339 84 5935
Ejemplo 47: Determinación de la viscosidad de los oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos al Factor 11 humano
5 La viscosidad de los oligonucleótidos antisentido dirigidos al factor 11 humano se midió con el objetivo de seleccionar oligonucleótidos antisentido que tienen una viscosidad superior a 40 cP a una concentración de 165-185 mg/ml.
10 Se pesaron oligonucleótidos de ISIS (32 -35 mg) en un vial de vidrio, se añadieron 120 \ mu l de agua y el oligonucleótido antisentido se disolvió en solución calentando el vial a 50ºC. Parte de (75 μL) la muestra precalentada se pipeteó a un micro-viscosímetro (Cambridge). La temperatura del microcomponedor se ajustó a 250ºC y se midió la viscosidad de la muestra. Otra parte (20 μL) de la muestra precalentada se pipeteó en 10 mL de agua para lectura UV a 260 nM a 850C (instrumento Cary UV). Los resultados se presentan en la Tabla 169.
15
Tabla 169
- Viscosidad y concentración de los oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos al Factor 11 humano
- Nº ISIS
- Viscosidad (cP) Concentración (mg/ml)
- 412223
- 8 163
- 412224
- 98 186
- 412225
- > 100 162
- 413481
- 23 144
- 413482
- 16. 172
- 416848
- 6 158
- 416850
- 67 152
- 416851
- 26 187
- 416852
- 29 169
- 416856
- 18 175
- 416858
- 10 166
- 416859
- 10 161
- 416860
- > 100 154
- 416861
- 14 110
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