ES2657679T3 - Modulación del factor de expresión 11 - Google Patents

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ES2657679T3 ES09821293.9T ES09821293T ES2657679T3 ES 2657679 T3 ES2657679 T3 ES 2657679T3 ES 09821293 T ES09821293 T ES 09821293T ES 2657679 T3 ES2657679 T3 ES 2657679T3
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Brett P. Monia
Hong Zhang
Chenguang Zhao
Jeffrey R. Crosby
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Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 18 a 24 nucleósidos unidos y que comprende una secuencia de bases nucleotídicas que comprende una porción de al menos 8 bases nucleotídicas contiguas 100 % complementarias a una porción de igual longitud de bases nucleotídicas 1275 a 1318 de SEQ ID NO: 1, en el que la secuencia de bases nucleotídicas del oligonucleótido modificado es 100 % complementaria a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 11, y en la que el compuesto es capaz de inhibir la expresión del factor 11 humano11.

Description

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Se divulga en el presente documento el uso un inhibidor específico del Factor 11 como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de una complicación tromboembólica como se describe en el presente documento en un paciente al que se administra posteriormente un
5 agente o terapia adicional como se describe en el presente documento.
En el presente documento se divulga un kit para tratar, prevenir o mejorar una complicación tromboembólica como se describe en la presente, en donde el kit comprende:
i) un inhibidor específico de Factor 11 como se describe en el presente documento; y, como alternativa
(ii) un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento.
Un kit de la divulgación puede incluir además instrucciones para usar el kit para tratar, prevenir o mejorar una complicación tromboembólica como se describe en el presente documento mediante terapia de combinación como
15 se describe en el presente documento.
En el presente documento se divulgan compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico del Factor 11 es cualquiera de las secuencias indicadas en el número de acceso en GENBANK NM_000128.3 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 1), número de acceso en GENBANK NT_022792,17, truncado de 19598000 a 19624000, (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 2), número de acceso en GENBANK NM_028066,1 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 6), exones 1-15 número de acceso en GENBANK NM_028066,1 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 274).
25 En el presente documento se describe un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado. El compuesto puede comprender un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos unidos.
El compuesto de la divulgación puede comprender un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de bases nucleotídicas al menos 8 0%, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % complementarias a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. 1El compuesto puede comprender un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de bases nucleotídicas 100% complementaria a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1.
En el presente documento se describe un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende
35 una secuencia de bases nucleotídicas complementaria a al menos una porción de bases nucleotídicas 656 a 676 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18 o 20 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una porción de igual longitud de bases nucleotídicas 656 a 676 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas al menos 8 0%, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % complementarias a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas 100 % complementaria a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede alcanzar al menos un 80 % de inhibición de los niveles de ARNm humano determinados usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).
45 En el presente documento se describe un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de bases nucleotídicas complementaria a al menos una porción de bases nucleotídicas 665 a 687 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18 o 20 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una porción de igual longitud de bases nucleotídicas 665 a 687 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas al menos 8 0%, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % complementarias a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas 100 % complementaria a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede alcanzar
55 al menos un 50 % de inhibición de los niveles de ARNm humano determinados usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3)-
En el presente documento se describe un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de bases nucleotídicas complementaria a al menos una porción de bases nucleotídicas 675 a 704 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18 o 20 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una porción de igual longitud de bases nucleotídicas 675 a 704 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas al menos 8 0%, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % complementarias a una porción de igual longitud de SEQ ID 65 NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas 100 % complementaria a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede alcanzar
10
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imagen10
imagen11
imagen12
imagen13
(i)
un segmento separador que consiste en desoxinucleósidos unidos;
(ii)
un segmento del ala en 5' que consiste en nucleósidos unidos;
(iii) un segmento de ala 3’ que consiste en nucleósidos unidos, en el que el segmento separador está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3’ y en el que cada nucleósido
5 de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado. En algunas de tales realizaciones, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende:
(i)
un segmento separador que consiste en diez desoxinucleósidos unidos;
(ii)
un segmento del ala en 5' que consiste en cinco nucleósidos unidos;
(iii) un segmento de ala 3’ que consiste en cinco nucleósidos unidos, en el que el segmento separador está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3’ y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un 2'-O-metoxietil-azúcar; y en el que cada enlace
15 internucleosídico es un enlace fosforotioato. En algunas de tales realizaciones, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende:
(i)
un segmento separador que consiste en catorce desoxinucleósidos unidos;
(ii)
un segmento del ala en 5' que consiste en tres nucleósidos unidos;
(iii) un segmento de ala 3’ que consiste en tres nucleósidos unidos, en el que el segmento separador está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3’ y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un 2'-O-metoxietil-azúcar; y en el que cada enlace internucleosídico es un
25 enlace fosforotioato. En algunas de tales realizaciones, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5metilcitosina.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende:
(i)
un segmento separador que consiste en trece desoxinucleósidos unidos;
(ii)
un segmento del ala en 5' que consiste en dos nucleósidos unidos;
(iii) un segmento de ala 3’ que consiste en cinco nucleósidos unidos, en el que el segmento separador está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3’ y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un 2'-O-metoxietil-azúcar; y en el que cada enlace
35 internucleosídico es un enlace fosforotioato. En algunas de tales realizaciones, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.
En el presente documento se divulga una composición que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 12 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada entre las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las SEQ ID NO: 15 a 241 o una sal de las mismas y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento se divulga una composición que comprende un oligonucleótido modificado que consiste
45 en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 12 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada entre las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las SEQ ID NO: 15 a 269 o una sal de las mismas y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento se divulga una composición que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 12 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada entre las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las SEQ ID NO: 241 a 269 o una sal de las mismas y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
55 En el presente documento se divulgan métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 8 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada entre las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las SEQ ID NO: 15 a 241.
En el presente documento se divulgan métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 8 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada entre las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las SEQ ID NO: 15 a 269.
65 En el presente documento se divulgan métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto que
16
imagen14
oligomérico puede ser "antisentido" de un ácido nucleico diana, lo que significa que es capaz de sufrir hibridación con un ácido nucleico diana mediante enlaces de hidrógeno.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de bases nucleotídicas que, cuando se
5 escribe en la dirección 5’ a 3', comprende el complementario inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido. En ciertas de estass realizaciones, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de bases nucleotídicas que, cuando se escribe en la dirección 5’ a 3', comprende el complementario inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido.
Un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del Factor 11 puede tener una longitud de 12 a 30 subunidades. En otras palabras, tales compuestos antisentido tienen de 12 a 30 subunidades unidas. El compuesto antisentido puede ser de 8 a 80, de 12 a 50, de 15 a 30, de 18 a 24, de 19 a 22 o 20 subunidades unidas. Los compuestos antisentido pueden ser 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 , 56, 57, 58, 59,
15 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 subunidades unidas de longitud, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores. El compuesto antisentido puede ser un oligonucleótido antisentido y las subunidades unidas pueden ser nucleótidos.
Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 pueden acortarse o truncarse. Por ejemplo, una sola subunidad puede eliminarse del extremo 5’ (truncamiento en 5’), o, alternativamente, del extremo 3’ (truncamiento en 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico del Factor 11 puede tener dos subunidades delecionadas del extremo 5’ o, alternativamente, puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3', del compuesto antisentido. Como alternativa, los nucleósidos delecionados se pueden dispersar por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido
25 delecionado del extremo 5’ y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
Cuando está presente una única subunidad adicional en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede localizarse en el extremo 5’ o 3' del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más subunidades adicionales, las subunidades añadidas pueden estar adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades añadidas al extremo 5’(adición en 5') o, como alternativa, al extremo 3’(adición en 3’), del compuesto antisentido. Como alternativa, las subunidades añadidas se pueden dispersar por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunida añadida al extremo 5’ y una subunidad añadida al extremo 3'.
35 Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases apareadas erróneamente sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se analizó una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 bases nucleotídicas de longitud su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de oocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 bases nucleotídicas de longitud con 8 u 11 apareamientos erróneos de bases cerca de los extremos de los los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor medida que los los oligonucleótidos antisentido que no contenían apareamientos erróneos. De un modo similar, se consiguió una escisión específica de la diana usando oligonucleótidos antisentido de 13 bases nucleotídicas, incluidos aquéllos con 1 o 3 apareamientos erróneos.
45 Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463–471, March 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene una complementariedad del 100 % con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 apareamientos erróneos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión tanto de bcl-2 como de bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) analizaron en una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 bases nucleotídicas en tándem y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 bases nucleotídicas compuesos por la secuencia de dos o trees de los oligonucleótidos antisentido en táncem, respectivamente, su capacidad para detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 bases nucleoitídicas pudo inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los
55 oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 bases nucleotídicas.
Motivos de compuestos antisentido
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 tienen subunidades químicamente modificadas dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como potenciación de la actividad inhibidora, afinidad de unión incrementada por un ácido nucleico diana o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos normalmente contienen al menos una región modificada de modo que
65 confieren un incremento de la resistencia a la degradación por nucleasas, incremento de la captación celular y/o incremento de la afinidad de unión por el ácido nucleico diana y/o una actividad inhibidora incrementada. Una
18
segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como sustrato para la endonucleasa ARNasa H celular, que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.
Los compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un
5 gapmer, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de ARNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmer, el segmento separador generalmente sirve como sustrato para la escisión con endonucleasa, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gapmer se diferencian por los tipos de restos de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden, en algunas realizaciones, incluir β-D-ribonucleósidos, β-Ddesoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2’ (tales nucleósidos modificados en 2’ pueden incluir 2'-MOE y 2'-O-CH3, entre otros), y los nucleósidos modificados con azúcar bicíclico (tales nucleósidos modificados con azúcar bicíclico pueden incluir los que tienen un puente 4'-(CH2) n-O-2', donde n = 1 o n = 2). Preferiblemente, cada región
15 distinta comprende restos de azúcar uniformes. El motivo de ala-separador-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", en el que "X" representa la longitud de la región del ala en 5’, "Y" representa la longitud de la región separadora y "Z" representa la longitud de la región del ala en 3’. Como se usa en el presente documento , un gapmer descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el segmento separador se coloca inmediatamente adyacente a cada uno del segmento de ala en 5’ y el segmento de ala en 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el segmento de ala en 5’ y el segmento separadir o el segmento separador y el segmento de ala en 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en el presente documento puede tener un motivo de gapmer. En algunas realizaciones, X y Z son iguales, en otras realizaciones son diferentes. En una realización preferida, Y está entre 8 y 15 nucleótidos. X, Y o Z pueden ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleótidos. Por lo tanto, los gapmeros de la presente invención incluyen,
25 pero no se limitan a, por ejemplo 5–10–5, 4–8–4, 4–12–3, 4–12–4, 3–14–3, 2–13–5, 2–16–2, 1–18–1, 3–10–3, 2– 10–2, 1–10–1, 2–8–2, 5–8–5, o 6–8–6.
En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido tiene un motivo de "wingmer" que tiene una configuración de alaseparador o separador-ala, es decir, una configuración X-Y o Y-Z como se ha descritito anteriormente para la configuración de gapmer. Por lo tanto, las configuraciones de las alas de la presente invención incluyen, entre otras, por ejemplo 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 5-13, 5-8 o 6-8.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 poseen un motivo gapmer 5-10-5.
35 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 poseen un motivo gapmer 3-14-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 poseen un motivo gapmer 2-13-5.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 poseen un motivo gapmer 5-8-5.
45 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 poseen un motivo gapmer 6-8-6.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del factor 11 tiene un ensanchado por separador.
En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido ensanchado por separador dirigido a un ácido nucleico del Factor 11 tiene un segmento separador de catorce 2'-desoxirribonucleótidos posicionados inmediatamente adyacentes a y entre segmentos de ala de tres nucleósidos modificados químicamente. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende una modificación de 2'-azúcar. En otra realización, la modificación química
55 comprende una modificación de 2'–MOE azúcar.
En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido ensanchado por separador dirigido a un ácido nucleico del Factor 11 tiene un segmento separador de trece 2'-desoxirribonucleótidos posicionados inmediatamente adyacentes a y entre un segmento de ala en 5’ de dos nucleósidos modificados químicamente y un segmento de ala en 3' de cinco nucleósidos químicamente modificados. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende una modificación de 2'-azúcar. En otra realización, la modificación química comprende una modificación de 2'–MOE azúcar.
Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
65 Las secuencias de nucleótidos que codifican el Factor 11 incluyen, sin limitación, las siguientes: N.º de acceso en
19
imagen15
documento y un ácido nucleico del Factor 11. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlaces de Watson-Crick, Hoogsteen o enlaces de hidrógeno invertidos de Hoogsteen) entre bases nucleotídicas complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
5 La hibridación se puede producir en diferentes condiciones. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico a hibridar.
Los métodos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable con un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en el presente documento son específicamente hibridables con un ácido nucleico del Factor 11.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de
15 bases nucleotídicas del compuesto antisentido puede unirse por hidrógeno con las bases nucleotídicas correspondientes del ácido nucleico diana, de modo que se producirá un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico del Factor 11).
Las bases nucleotídicas no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico del Factor 11 se pueden tolerar a condición de que el compuesto antisentido permanezca capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico diana. Además, un compuesto antisentido puede hibridarse sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico del Factor 11 de manera que los segmentos intermedios o adyacentes no están implicados en el acontecimiento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, apareamiento erróneo o estructura en horquilla).
25 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en el presente documento, o una porción específica de los mismos, son, o son al menos, 70 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % complementarios de un ácido nucleico del Factor 11, una región diana, segmento diana, o una porción especificada de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana puede determinarse usando métodos rutinarios. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 bases nucleotídicas del compuesto antisentido son complementarias de una región diana, y, por lo tanto, hibridarán específicamente, representarían un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las bases nucleotídicas no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con bases nucleotídicas complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con bases nucleotídicas complementarias.
35 Como tal, un compuesto antisentido que tiene una longitud de 18 bases nucleotídicas que tiene 4 (cuatro) bases nucleotídicas no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana, tendría un 77,8 % de complementariedad global con el ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad, puede determinarse mediante, por ejemplo, el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), utilizando la configuración predeterminada, que utiliza la algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
45 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en el presente documento, o partes específicas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100 % complementarios) de un ácido nucleico diana, o una parte específica de los mismos. Por ejemplo, el compuesto antisentido puede ser completamente complementario de un ácido nucleico del Factor 11, o una región diana, o un segmento diana o una secuencia diana del mismo. Como se usa en el presente documento, "completamente complementario" significa que cada base nucleotídica de un compuesto antisentido es capaz de aparear bases precisas con las bases nucleotídicas correspondientes de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 bases nucleotídicas es completamente complementario a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 bases nucleotídicas, siempre que haya una porción correspondiente de 20 bases nucleotídicas del ácido nucleico diana que sea completamente complementaria
55 del compuesto antisentido. Completamente complementario también puede usarse en referencia a una porción especificada del primero y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 bases nucleotídicas de un compuesto antisentido de 30 bases nucleotídicas puede ser "completamente complementaria" de una secuencia diana que tiene una longitud de 400 bases nucleotídicas. La porción de 20 bases nucleotídicas del oligonucleótido de 30 bases nucleotídicas es completamente complementaria de la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción de 20 bases nucleotídicas correspondiente en la que cada base nucleotídica es complementaria de la porción de 20 bases nucleotídicas del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 bases nucleotídicas completo puede o no ser completamente complementario de la secuencia diana, dependiendo de si las 10 bases nucleotídicas restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia diana.
65 La ubicación de una base nucleotídica no complementaria puede estar en el extremo 5’o en el extremo 3' del
21
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Tabla 1
15
25
35
45
55
Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos que tienen alas 5–10–5 MOE y separación de desoxi dirigida a la SEQ ID NO: 1
ID del oligo
Sitio de inicio diana Sitio de terminación diana Secuencia % de inhibición SEQ ID NO
412187
38 57 TTCAAACAAGTGACATACAC 21 15
412188
96 115 TGAGAGAATTGCTTGCTTTC 21 16
412189
106 125 AAATATACCTTGAGAGAATT 8 17
412190
116 135 AGTATGTCAGAAATATACCT 24 18
412191
126 145 TTAAAATCTTAGTATGTCAG 14 19
412192
146 165 CAGCATATTTGTGAAAGTCG 44 20
412193
222 241 TGTGTAGGAAATGGTCACTT 38 21
412194
286 305 TGCAATTCTTAATAAGGGTG 80 22
412195
321 340 AAATCATCCTGAAAAGACCT 22 23
412196
331 350 TGATATAAGAAAATCATCCT 25 24
412197
376 395 ACACATTCACCAGAAACTGA 45 25
412198
550 569 TTCAGGACACAAGTAAACCA 21 26
412199
583 602 TTCACTCTTGGCAGTGTTTC 66 27
412200
612 631 AAGAATACCCAGAAATCGCT 59 28
412201
622 641 CATTGCTTGAAAGAATACCC 66 29
412202
632 651 TTGGTGTGAGCATTGCTTGA 65 30
412203
656 675 AATGTCTTTGTTGCAAGCGC 91 31
412204
676 695 TTCATGTCTAGGTCCACATA 74 32
412205
686 705 GTTTATGCCCTTCATGTCTA 69 33
412206
738 757 CCGTGCATCTTTCTTGGCAT 87 34
412207
764 783 CGTGAAAAAGTGGCAGTGGA 64 35
412208
811 830 AGACAAATGTTACGATGCTC 73 36
412209
821 840 GTGCTTCAGTAGACAAATGT 91 37
412210
896 915 TGCACAGGATTTCAGTGAAA 73 38
412211
906 925 GATTAGAAAGTGCACAGGAT 64 39
412212
1018 1037 CCGGGATGATGAGTGCAGAT 88 40
412213
1028 1047 AAACAAGCAACCGGGATGAT 71 41
412214
1048 1067 TCCTGGGAAAAGAAGGTAAA 58 42
412215
1062 1081 ATTCTTTGGGCCATTCCTGG 81 43
412216
1077 1096 AAAGATTTCTTTGAGATTCT 43 44
412217
1105 1124 AATCCACTCTCAGATGTTTT 47 45
412218
1146 1165 AACCAGAAAGAGCTTTGCTC 27 46
412219
1188 1207 GGCAGAACACTGGGATGCTG 56 47
412220
1204 1223 TGGTAAAATGAAGAATGGCA 58 48
412221
1214 1233 ATCAGTGTCATGGTAAAATG 48 49
412222
1241 1263 AACAATATCCAGTTCTTCTC 5 50
412223
1275 1294 ACAGTTTCTGGCAGGCCTCG 84 51
412224
1285 1304 GCATTGGTGCACAGTTTCTG 87 52
412225
1295 1314 GCAGCGGACGGCATTGGTGC 86 53
412226
1371 1390 TTGAAGAAAGCTTTAAGTAA 17 54
412227
1391 1410 AGTATTTTAGTTGGAGATCC 75 55
412228
1425 1444 ATGTGTATCCAGAGATGCCT 71 56
412229
1456 1475 GTACACTCATTATCCATTTT 64 57
412230
1466 1485 GATTTTGGTGGTACACTCAT 52 58
412231
1476 1495 TCCTGGGCTTGATTTTGGTG 74 59
412232
1513 1532 GGCCACTCACCACGAACAGA 80 60
412233
1555 1574 TGTCTCTGAGTGGGTGAGGT 64 61
412234
1583 1602 GTTTCCAATGATGGAGCCTC 60 62
412235
1593 1612 ATATCCACTGGTTTCCAATG 57 63
412236
1618 1637 CCATAGAAACAGTGAGCGGC 72 64
412237
1628 1647 TGACTCTACCCCATAGAAAC 48 65
412238
1642 1661 CGCAAAATCTTAGGTGACTC 71 66
412239
1673 1692 TTCAGATTGATTTAAAATGC 43 67
412240
1705 1724 TGAACCCCAAAGAAAGATGT 32 68
412241
1715 1734 TATTATTTCTTGAACCCCAA 41 69
412242
1765 1784 AACAAGGCAATATCATACCC 49 70
412243
1775 1794 TTCCAGTTTCAACAAGGCAA 70 71
31
(continúa)
15
25
35
45
55
412244
1822 1841 GAAGGCAGGCATATGGGTCG 53 72
412245
1936 1955 GTCACTAAGGGTATCTTGGC 75 73
412246
1992 2011 AGATCATCTTATGGGTTATT 68 74
412247
2002 2021 TAGCCGGCACAGATCATCTT 75 75
412248
2082 2101 CCAGATGCCAGACCTCATTG 53 76
412249
2195 2214 CATTCACACTGCTTGAGTTT 55 77
412250
2268 2287 TGGCACAGTGAACTCAACAC 63 78
412251
2326 2345 CTAGCATTTTCTTACAAACA 58 79
412252
2450 2469 TTATGGTAATTCTTGGACTC 39 80
412253
2460 2479 AAATATTGCCTTATGGTAAT 20 81
412254
2485 2504 TATCTGCCTATATAGTAATC 16 82
412255
2510 2529 GCCACTACTTGGTTATTTTC 38 83
412256
2564 2583 AACAAATCTATTTATGGTGG 39 84
412257
2622 2641 CTGCAAAATGGTGAAGACTG 57 85
412258
2632 2651 GTGTAGATTCCTGCAAAATG 44 86
412259
2882 2901 TTTTCAGGAAAGTGTATCTT 37 87
412260
2892 2911 CACAAATCATTTTTCAGGAA 27 88
412261
2925 2944 TCCCAAGATATTTTAAATAA 3 89
412262
3168 3187 AATGAGATAAATATTTGCAC 34 90
412263
3224 3243 TGAAAGCTATGTGGTGACAA 33 91
412264
3259 3278 CACACTTGATGAATTGTATA 27 92
413460
101 120 TACCTTGAGAGAATTGCTTG 40 93
413461
111 130 GTCAGAAATATACCTTGAGA 39 94
413462
121 140 ATCTTAGTATGTCAGAAATA 12 95
413463
381 400 GAGTCACACATTCACCAGAA 74 96
413464
627 646 GTGAGCATTGCTTGAAAGAA 42 97
413465
637 656 CTTATTTGGTGTGAGCATTG 80 98
413466
661 680 ACATAAATGTCTTTGTTGCA 79 99
413467
666 685 GGTCCACATAAATGTCTTTG 91 100
413468
671 690 GTCTAGGTCCACATAAATGT 84 101
413469
681 700 TGCCCTTCATGTCTAGGTCC 84 102
413470
692 711 GTTATAGTTTATGCCCTTCA 72 103
413471
816 835 TCAGTAGACAAATGTTACGA 67 104
413472
826 845 TGGGTGTGCTTCAGTAGACA 99 105
413473
911 930 AGCCAGATTAGAAAGTGCAC 80 106
413474
1023 1042 AGCAACCGGGATGATGAGTG 84 107
413475
1053 1072 GCCATTCCTGGGAAAAGAAG 80 108
413476
1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 88 109
413477
1151 1170 ACTGAAACCAGAAAGAGCTT 54 110
413478
1193 1212 AGAATGGCAGAACACTGGGA 53 111
413479
1209 1228 TGTCATGGTAAAATGAAGAA 40 112
413480
1219 1238 AAGAAATCAGTGTCATGGTA 71 113
413481
1280 1299 GGTGCACAGTTTCTGGCAGG 86 114
413482
1290 1309 GGACGGCATTGGTGCACAGT 85 115
413483
1300 1319 AACTGGCAGCGGACGGCATT 78 116
413484
1430 1449 CCTTAATGTGTATCCAGAGA 74 117
413485
1461 1480 TGGTGGTACACTCATTATCC 68 118
413486
1471 1490 GGCTTGATTTTGGTGGTACA 83 119
413487
1481 1500 AACGATCCTGGGCTTGATTT 57 120
413488
1560 1579 ACAGGTGTCTCTGAGTGGGT 49 121
413489
1588 1607 CACTGGTTTCCAATGATGGA 68 122
413490
1623 1642 CTACCCCATAGAAACAGTGA 57 123
413491
1633 1652 TTAGGTGACTCTACCCCATA 73 124
413492
1647 1666 AGACACGCAAAATCTTAGGT 68 125
413493
1710 1729 TTTCTTGAACCCCAAAGAAA 65 126
413494
1780 1799 GTGGTTTCCAGTTTCAACAA 70 127
413495
1921 1940 TTGGCTTTCTGGAGAGTATT 58 128
413496
1997 2016 GGCACAGATCATCTTATGGG 72 129
413497
2627 2646 GATTCCTGCAAAATGGTGAA 39 130
413498
2637 2656 GCAGAGTGTAGATTCCTGCA 60 131
413499
2887 2906 ATCATTTTTCAGGAAAGTGT 52 132
32
Tabla 2
5
15
25
35
45
Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos que tienen alas 5–10–5 MOE y separación de desoxi dirigida a la SEQ ID NO: 2
ID del oligo
Sitio de inicio diana Sitio de terminación diana Secuencia % de inhibición SEQ ID NO
413500
1658 1677 GTGAGACAAATCAAGACTTC 15 133
413501
2159 2178 TTAGTTTACTGACACTAAGA 23 134
413502
2593 2612 CTGCTTTATGAAAAACCAAC 22 135
413503
3325 3344 ATACCTAGTACAATGTAAAT 29 136
413504
3548 3567 GGCTTGTGTGTGGTCAATAT 54 137
413505
5054 5073 TGGGAAAGCTTTCAATATTC 57 138
413506
6474 6493 ATGGAATTGTGCTTATGAGT 57 139
413507
7590 7609 TTTCAAGCTCAGGATGGGAA 55 140
413508
7905 7924 GTTGGTAAAATGCAACCAAA 64 141
413509
8163 8182 TCAGGACACAAGTAAACCTG 66 142
413510
9197 9216 TGCAAGCTGGAAATAAAAGC 17 143
413511
9621 9640 TGCCAATTTAAAAGTGTAGC 43 144
413512
9800 9819 ATATTTCAAAATCCAGTATG 39 145
413513
9919 9938 TTCTGAATATACAAATTAAT 27 146
413514
9951 9970 TTTACTATGAAAATCTAAAT 5 147
413515
11049 11068 GGTATCCTGAGTGAGATCTA 36 148
413516
11269 11288 CCAGCTATCAGGAAAATTCC 50 149
413517
12165 12184 AAAGCTATTGGAGACTCAGA 51 150
413518
12584 12603 ATGGAATCTCTTCATTTCAT 49 151
413519
12728 12747 ATGGAGACATTCATTTCCAC 59 152
413520
13284 13303 GCTCTGAGAGTTCCAATTCA 52 153
413521
14504 14523 CTGGGAAGGTGAATTTTTAG 62 154
413522
14771 14790 TCAAGAGTCTTCATGCTACC 42 155
413523
15206 15225 TCAGTTTACCTGGGATGCTG 61 156
413524
15670 15689 GACATTATACTCACCATTAT 7 157
413525
15905 15924 GTATAAATGTGTCAAATTAA 43 158
413526
16482 16501 GTAAAGTTTTACCTTAACCT 47 159
413527
17298 17317 CCATAATGAAGAAGGAAGGG 52 160
413528
17757 17776 TTAAGTTACATTGTAGACCA 48 161
413529
18204 18223 TGTGTGGGTCCTGAAATTCT 52 162
413530
18981 19000 ATCTTGTAATTACACACCCC 27 163
413531
19174 19193 GTACACTCTGCAACAGAAGC 47 164
413532
19604 19623 AGGGAATAACATGAAGGCCC 32 165
413533
20936 20955 ATCCAGTTCACCATTGGAGA 48 166
413534
21441 21460 TTTTCCAGAAGAGACTCTTC 31 167
413535
21785 21804 GTCACATTTAAAATTTCCAA 41 168
413536
23422 23441 TTAATATACTGCAGAGAACC 37 169
413537
25893 25912 AGAAATATCCCCAGACAGAG 16 170
Example 2: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del factor 11 humano en células HepG2
Doce gapmer, exhibiendo más del 84 por ciento o más de inhibición in vitro del factor 11 humano se analizaron a diversas dosis en célu+las HepG2 Las células se sembraron a una densidad de 10.000 células por pocillo y se transfectaron usando reactivo de lipofectina con 9.375 nM, 18,75 nM, 37,5 nM, 75 nM, y concentraciones 150 nM de
55 oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 3. Conjunto de sonda de cebador de Factor 11 humano RTS 2966 (secuencia directa: CAGCCTGGAGCATCGTAACA, incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 3; secuencia inversa: TTTATCGAGCTTCGTTATTCTGGTT, incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 4; secuencia de la sonda: TTGTCTACTGAAGCACACCCAAACAGGGAX, , incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 5) se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm del factor 11 se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición del factor 11 respecto a las células control sin tratar. Como se ilustra en la Tabla 3, los niveles de A.RNm del Factor 11 se redujeron de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
65
33
imagen25
Tabla 4
15
25
35
45
55
Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 656 a 704 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
Nº ISIS
Target Start Site Target Stop Site Sequence (5' to 3') % inhibition Motif SEQ ID No.
*412203
656 675 AATGTCTTTGTTGCAAGCGC 97 5–10–5 31
*413467
666 685 GGTCCACATAAATGTCTTTG 92 5–10–5 100
*413468
671 690 GTCTAGGTCCACATAAATGT 83 5–10–5 101
*413469
681 700 TGCCCTTCATGTCTAGGTCC 86 5–10–5 102
416868
656 675 AATGTCTTTGTTGCAAGCGC 93 3–14–3 31
416945
656 675 AATGTCTTTGTTGCAAGCGC 94 2–13–5 31
416806
657 676 AAATGTCTTTGTTGCAAGCG 86 5–10–5 171
416869
657 676 AAATGTCTTTGTTGCAAGCG 81 3–14–3 171
416946
657 676 AAATGTCTTTGTTGCAAGCG 86 2–13–5 171
416807
658 677 TAAATGTCTTTGTTGCAAGC 51 5–10–5 172
416870
658 677 TAAATGTCTTTGTTGCAAGC 76 3–14–3 172
416947
658 677 TAAATGTCTTTGTTGCAAGC 62 2–13–5 172
416808
659 678 ATAAATGTCTTTGTTGCAAG 55 5–10–5 173
416871
659 678 ATAAATGTCTTTGTTGCAAG 28 3–14–3 173
416948
659 678 ATAAATGTCTTTGTTGCAAG 62 2–13–5 173
416809
660 679 CATAAATGTCTTTGTTGCAA 86 5–10–5 174
416872
660 679 CATAAATGTCTTTGTTGCAA 20 3–14–3 174
416949
660 679 CATAAATGTCTTTGTTGCAA 64 2–13–5 174
416873
661 680 ACATAAATGTCTTTGTTGCA 51 3–14–3 99
416950
661 680 ACATAAATGTCTTTGTTGCA 71 2–13–5 99
416810
662 681 CACATAAATGTCTTTGTTGC 68 5–10–5 175
416874
662 681 CACATAAATGTCTTTGTTGC 49 3–14–3 175
416951
662 681 CACATAAATGTCTTTGTTGC 48 2–13–5 175
416811
663 682 CCACATAAATGTCTTTGTTG 84 5–10–5 176
416875
663 682 CCACATAAATGTCTTTGTTG 75 3–14–3 176
416952
663 682 CCACATAAATGTCTTTGTTG 51 2–13–5 176
416812
664 68 TCCACATAAATGTCTTTGTT 59 5–10–5 177
416876
664 683 TCCACATAAATGTCTTTGTT 37 3–14–3 177
416953
664 683 TCCACATAAATGTCTTTGTT 45 2–13–5 177
416813
665 684 GTCCACATAAATGTCTTTGT 70 5–10–5 178
416877
665 684 GTCCACATAAATGTCTTTGT 51 3–14–3 178
416954
665 684 GTCCACATAAATGTCTTTGT 61 2–13–5 178
416878
666 685 GGTCCACATAAATGTCTTTG 95 3–14–3 100
416955
666 685 GGTCCACATAAATGTCTTTG 75 2–13–5 100
416814
667 686 AGGTCCACATAAATGTCTTT 83 5–10–5 179
416879
667 686 AGGTCCACATAAATGTCTTT 92 3–14–3 179
416956
667 686 AGGTCCACATAAATGTCTTT 61 2–13–5 179
416815
668 687 TAGGTCCACATAAATGTCTT 63 5–10–5 180
416880
668 687 TAGGTCCACATAAATGTCTT 66 3–14–3 180
416957
668 687 TAGGTCCACATAAATGTCTT 59 2–13–5 180
416816
669 688 CTAGGTCCACATAAATGTCT 79 5–10–5 181
416881
669 688 CTAGGTCCACATAAATGTCT 81 3–14–3 181
416958
669 688 CTAGGTCCACATAAATGTCT 43 2–13–5 181
416817
670 689 TCTAGGTCCACATAAATGTC 74 5–10–5 182
416882
670 689 TCTAGGTCCACATAAATGTC 60 3–14–3 182
416959
670 689 TCTAGGTCCACATAAATGTC 25 2–13–5 182
416883
671 690 GTCTAGGTCCACATAAATGT 82 3–14–3 101
416960
671 690 GTCTAGGTCCACATAAATGT 60 2–13–5 101
416818
672 691 TGTCTAGGTCCACATAAATG 76 5–10–5 183
416884
672 691 TGTCTAGGTCCACATAAATG 69 3–14–3 183
416961
672 691 TGTCTAGGTCCACATAAATG 40 2–13–5 183
416819
673 692 ATGTCTAGGTCCACATAAAT 56 5–10–5 184
416885
673 692 ATGTCTAGGTCCACATAAAT 67 3–14–3 184
416962
673 692 ATGTCTAGGTCCACATAAAT 77 2–13–5 184
416820
674 693 CATGTCTAGGTCCACATAAA 77 5–10–5 185
416886
674 693 CATGTCTAGGTCCACATAAA 74 3–14–3 185
416963
674 693 CATGTCTAGGTCCACATAAA 48 2–13–5 185
35
(continúa)
5
15
25
35
416821
675 694 TCATGTCTAGGTCCACATAA 84 5–10–5 186
416964
675 694 TCATGTCTAGGTCCACATAA 69 2–13–5 186
412204
676 695 TTCATGTCTAGGTCCACATA 76 5–10–5 32
416888
676 695 TTCATGTCTAGGTCCACATA 76 3–14–3 32
416965
676 695 TTCATGTCTAGGTCCACATA 53 2–13–5 32
416822
677 696 CTTCATGTCTAGGTCCACAT 76 5–10–5 187
416889
677 696 CTTCATGTCTAGGTCCACAT 60 3–14–3 187
416966
677 696 CTTCATGTCTAGGTCCACAT 64 2–13–5 187
416823
678 697 CCTTCATGTCTAGGTCCACA 77 5–10–5 188
416890
678 697 CCTTCATGTCTAGGTCCACA 87 3–14–3 188
416967
678 697 CCTTCATGTCTAGGTCCACA 75 2–13–5 188
416824
679 698 CCCTTCATGTCTAGGTCCAC 64 5–10–5 189
416891
679 698 CCCTTCATGTCTAGGTCCAC 81 3–14–3 189
416968
679 698 CCCTTCATGTCTAGGTCCAC 73 2–13–5 189
416825
680 699 GCCCTTCATGTCTAGGTCCA 92 5–10–5 190
416892
680 699 GCCCTTCATGTCTAGGTCCA 100 3–14–3 190
416969
680 699 GCCCTTCATGTCTAGGTCCA 80 2–13–5 190
416893
681 700 TGCCCTTCATGTCTAGGTCC 90 3–14–3 102
416970
681 700 TGCCCTTCATGTCTAGGTCC 88 2–13–5 102
416826
682 701 ATGCCCTTCATGTCTAGGTC 94 5–10–5 191
416894
682 701 ATGCCCTTCATGTCTAGGTC 85 3–14–3 191
416971
682 701 ATGCCCTTCATGTCTAGGTC 83 2–13–5 191
416827
683 702 TATGCCCTTCATGTCTAGGT 93 5–10–5 192
416895
683 702 TATGCCCTTCATGTCTAGGT 95 3–14–3 192
416972
683 702 TATGCCCTTCATGTCTAGGT 90 2–13–5 192
416828
684 703 TTATGCCCTTCATGTCTAGG 87 5–10–5 193
416896
684 703 TTATGCCCTTCATGTCTAGG 95 3–14–3 193
416973
684 703 TTATGCCCTTCATGTCTAGG 92 2–13–5 193
416829
685 704 TTTATGCCCTTCATGTCTAG 72 5–10–5 194
416897
685 704 TTTATGCCCTTCATGTCTAG 66 3–14–3 194
416974
685 704 TTTATGCCCTTCATGTCTAG 73 2–13–5 194
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 5 se diseñaron como gapmeros 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE y 2-13-5 MOE. El primer gapmer enumerado en la Tabla 5 es el gapmer original (véase la Tabla 3) a partir del cual los gapmeros restantes se diseñaron a través de microwalk y se designa con un asterisco. Los gapmeros 5-10-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 10 2'desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Los gapmeros 3-14-3 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 14 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 3 nucleótidos cada una. Los gapmeros 2-13-5 tienen una longitud de 20
45 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 13 2'-desoxinucleótidos. El separador central está flanqueado en el extremo 5’con un ala que comprende 2 nucleótidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucleótidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 3-14-3 y 2-13-5), cada nucleótido en el segmento de ala en 5’ y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citidina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitidinas. El "sitio de inicio diana" indica el nucleótido más 5’al al que se dirige el gapmer.. El "sitio de terminación diana" indica el nucleótido más 3’al al que se dirige el gapmer.. Cada gapmer enumerado en la Tabla 5 está dirigido a la SEQ ID NO: 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
Como se muestra en la Tabla 5, todos los gapmeros 5-10-5 MOE, los gapmeros 3-14-3 MOE y los gapmeros 2-13-5
55 MOE dirigidos a la región diana que comienza en el sitio de inicio diana 738 y termina en la parada diana. el sitio 762 (es decir, las bases nucleotídicas 738-762) de la SEQ ID NO: muestra al menos un 45 % de inhibición del ARNm del Factor 11. La mayoría de los gapmeros exhiben al menos 60 % de inhibición. Varios de los gapmer exhiben al menos 80 % de inhibición, incluyendo números ISIS: 412206, 416830, 416831, 416898, 416899, 416900, 416903, 416975, 416976, 416977 y 416980. Los siguientes números de ISIS exhibieron al menos 90 % de inhibición: 412206, 416831 y 416900.
65
36
Tabla 5
5
15
25
Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 738 a 762 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
Nº ISIS
Sitio de inicio diana Sitio de terminación diana Secuencia (5’ a 3’) % de inhibición Motivo SEQ ID No.
*412206
738 757 CCGTGCATCTTTCTTGGCAT 93 5–10–5 34
416898
738 757 CCGTGCATCTTTCTTGGCAT 88 3–14–3 34
416975
738 757 CCGTGCATCTTTCTTGGCAT 87 2–13–5 34
416830
739 758 TCCGTGCATCTTTCTTGGCA 81 5–10–5 195
416899
739 758 TCCGTGCATCTTTCTTGGCA 86 3–14–3 195
416976
739 758 TCCGTGCATCTTTCTTGGCA 83 2–13–5 195
416831
740 759 ATCCGTGCATCTTTCTTGGC 91 5–10–5 196
416900
740 759 ATCCGTGCATCTTTCTTGGC 90 3–14–3 196
416977
740 759 ATCCGTGCATCTTTCTTGGC 82 2–13–5 196
416832
741 760 CATCCGTGCATCTTTCTTGG 79 5–10–5 197
416901
741 760 CATCCGTGCATCTTTCTTGG 65 3–14–3 197
416978
741 760 CATCCGTGCATCTTTCTTGG 76 2–13–5 197
416833
742 761 TCATCCGTGCATCTTTCTTG 65 5–10–5 198
416902
742 761 TCATCCGTGCATCTTTCTTG 46 3–14–3 198
416979
742 761 TCATCCGTGCATCTTTCTTG 63 2–13–5 198
416834
743 762 GTCATCCGTGCATCTTTCTT 58 5–10–5 199
416903
743 762 GTCATCCGTGCATCTTTCTT 88 3–14–3 199
416980
743 762 GTCATCCGTGCATCTTTCTT 87 2–13–5 199
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 6 se diseñaron como gapmeros 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE y 2-13-5 MOE. Los primeros gapmeros enumerados en la Tabla 6 son los gapmeros originales (véase la Tabla 3) a partir de los cuales los gapmeros restantes se diseñaron a través de microwalk y se designaron con un asterisco. Los gapmeros 5-10-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 10 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Los gapmeros 3-14-3 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el
35 segmento separador central está compuesto por 14 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 3 nucleótidos cada una. Los gapmeros 2-13-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 13 2'-desoxinucleótidos. El separador central está flanqueado en el extremo 5’con un ala que comprende 2 nucleótidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucleótidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 3-14-3 y 2-13-5), cada nucleótido en el segmento de ala en 5’ y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citidina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitidinas. El "sitio de inicio diana" indica el nucleótido más 5’al al que se dirige el gapmer.. El "sitio de terminación diana" indica el nucleótido más 3’al al que se dirige el gapmer.. Cada gapmer enumerado en la Tabla 6 está dirigido a la SEQ ID NO: 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
45 Como se muestra en la Tabla 6, todos los gapmeros 5-10-5 MOE, los gapmeros 3-14-3 MOE y los gapmeros 2-13-5 MOE dirigidos a la región diana que comienza en el sitio de inicio diana 1018 y termina en la parada diana. el sitio 1042 (es decir, las bases nucleotídicas 1018-1042) de la SEQ ID NO: muestra al menos un 80 % de inhibición del ARNm del Factor 11. Los siguientes números de ISIS exhibieron al menos 90 % de inhibición: 413474, 416837, 416838, 416904, 416907 y 416908.
55
37
Tabla 6
5
15
25
35
Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 1018 a 1042 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
Nº ISIS
Sitio de inicio diana Sitio de terminación diana Secuencia (5’ a 3’) % % de inhibición Motivo SEQ ID No.
*41221 2
1018 1037 89 5–10–5 40
416904
1018 1037 90 3–14–3 40
416981
1018 1037 imagen26 87 2–13–5 40
416835
1019 1038 83 5–10–5 200
416905
1019 1038 85 3–14–3 200
416982
1019 1038 84 2–13–5 200
416836
1020 1039 89 5–10–5 201
416906
1020 1039 88 3–14–3 201
416983
1020 1039 imagen27 86 2–13–5 201
416837
1021 1040 90 5–10–5 202
416907
1021 1040 90 3–14–3 202
416984
1021 1040 89 2–13–5 202
416838
1022 1041 94 5–10–5 203
416908
1022 1041 98 3–14–3 203
416985
1022 1041 88 2–13–5 203
413474
1023 1042 93 5–10–5 107
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 7 se diseñaron como gapmeros 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE y 2-13-5 MOE. El primer gapmer enumerado en la Tabla 7 es el gapmer original (véase la Tabla 3) a partir del cual los gapmeros restantes se diseñaron a través de microwalk y se designa con un asterisco. Los gapmeros 5-10-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 10 2'45 desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Los gapmeros 3-14-3 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 14 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 3 nucleótidos cada una. Los gapmeros 2-13-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 13 2'-desoxinucleótidos. El separador central está flanqueado en el extremo 5’con un ala que comprende 2 nucleótidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucleótidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 3-14-3 y 2-13-5), cada nucleótido en el segmento de ala en 5’ y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citidina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitidinas. El "sitio de inicio diana" indica el nucleótido más 5’al al que se dirige el
55 gapmer.. El "sitio de terminación diana" indica el nucleótido más 3’al al que se dirige el gapmer.. Cada gapmer enumerado en la Tabla 7 está dirigido a la SEQ ID NO: 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
Como se muestra en la Tabla 7, todos los gapmeros 5-10-5 MOE, los gapmeros 3-14-3 MOE y los gapmeros 2-13-5 MOE dirigidos a la región diana que comienza en el sitio de inicio diana 1062 y termina en la parada diana. el sitio 1091 (es decir, las bases nucleotídicas 1062-1091) de la SEQ ID NO: muestra al menos un 20 % de inhibición del ARNm del Factor 11. Muchos de los gapmeros exhiben al menos 50 % de inhibición, inlcuyendo: 412215, 413476, 413476, 416839, 416840, 416841, 416842, 416843, 416844, 416845, 416846, 416847, 416909, 416910, 416911, 416912, 416913, 416914, 416915, 416916, 416917, 416918, 416986, 416987, 416988, 416989, 416990, 416991, 416992, 416993, 416994, 416995. Los siguientes números de ISIS exhibieron al menos 80 % de inhibición: 412215, 65 413476, 413476, 416839, 416840, 416841, 416842, 416843, 416844, 416845, 416910, 416911, 416912, 416913, 416914, 416916, 416917, 416986, 416987, 416989, 416991, 416992, 416993, and 416994. Los siguientes números
38
de ISIS exhibieron al menos 90 % de inhibición: 413476, 413476, 416842, 416844, 416910, 416911, 416912, 416913, 416916, 416917 y 416993.
Tabla 7
15
25
35
45
Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 1062 a 1091 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
Nº ISIS
Sitio de inicio diana Sitio de terminación diana Secuencia (5’ a 3’) % de inhibición Motivo SEQ ID No.
*413476
1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 93 5–10–5 109
412215
1062 1081 ATTCTTTGGGCCATTCCTGG 82 5–10–5 43
416909
1062 1081 ATTCTTTGGGCCATTCCTGG 78 3–14–3 43
416986
1062 1081 ATTCTTTGGGCCATTCCTGG 88 2–13–5 43
416839
1063 1082 GATTCTTTGGGCCATTCCTG 89 5–10–5 204
416910
1063 1082 GATTCTTTGGGCCATTCCTG 90 3–14–3 204
416987
1063 1082 GATTCTTTGGGCCATTCCTG 80 2–13–5 204
416840
1064 1083 AGATTCTTTGGGCCATTCCT 85 5–10–5 205
416911
1064 1083 AGATTCTTTGGGCCATTCCT 90 3–14–3 205
416988
1064 1083 AGATTCTTTGGGCCATTCCT 76 2–13–5 205
416841
1065 1084 GAGATTCTTTGGGCCATTCC 87 5–10–5 206
416912
1065 1084 GAGATTCTTTGGGCCATTCC 92 3–14–3 206
416989
1065 1084 GAGATTCTTTGGGCCATTCC 88 2–13–5 206
416842
1066 1085 TGAGATTCTTTGGGCCATTC 94 5–10–5 207
416913
1066 1085 TGAGATTCTTTGGGCCATTC 93 3–14–3 207
416990
1066 1085 TGAGATTCTTTGGGCCATTC 76 2–13–5 207
413476
1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 93 5–10–5 109
416914
1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 87 3–14–3 109
416991
1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 87 2–13–5 109
416843
1068 1087 TTTGAGATTCTTTGGGCCAT 89 5–10–5 208
416915
1068 1087 TTTGAGATTCTTTGGGCCAT 79 3–14–3 208
416992
1068 1087 TTTGAGATTCTTTGGGCCAT 84 2–13–5 208
416844
1069 1088 CTTTGAGATTCTTTGGGCCA 90 5–10–5 209
416916
1069 1088 CTTTGAGATTCTTTGGGCCA 91 3–14–3 209
416993
1069 1088 CTTTGAGATTCTTTGGGCCA 91 2–13–5 209
416845
1070 1089 TCTTTGAGATTCTTTGGGCC 86 5–10–5 210
416917
1070 1089 TCTTTGAGATTCTTTGGGCC 92 3–14–3 210
416994
1070 1089 TCTTTGAGATTCTTTGGGCC 83 2–13–5 210
416846
1071 1090 TTCTTTGAGATTCTTTGGGC 72 5–10–5 211
416918
1071 1090 TTCTTTGAGATTCTTTGGGC 63 3–14–3 211
416995
1071 1090 TTCTTTGAGATTCTTTGGGC 64 2–13–5 211
416847
1072 1091 TTTCTTTGAGATTCTTTGGG 50 5–10–5 212
416919
1072 1091 TTTCTTTGAGATTCTTTGGG 27 3–14–3 212
416996
1072 1091 TTTCTTTGAGATTCTTTGGG 22 2–13–5 212
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 8 se diseñaron como gapmeros 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE y 2-13-5 MOE. Los primeros gapmeros enumerados en la Tabla 8 son los gapmeros originales (véase la Tabla 3) a partir de los cuales los gapmeros restantes se diseñaron a través de microwalk y se designaron con un asterisco. Los gapmeros 5-10-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 10 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Los gapmeros 3-14-3 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el
55 segmento separador central está compuesto por 14 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 3 nucleótidos cada una. Los gapmeros 2-13-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 13 2'-desoxinucleótidos. El separador central está flanqueado en el extremo 5’con un ala que comprende 2 nucleótidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucleótidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 3-14-3 y 2-13-5), cada nucleótido en el segmento de ala en 5’ y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citidina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitidinas. El "sitio de inicio diana" indica el nucleótido más 5’al al que se dirige el gapmer.. El "sitio de terminación diana" indica el nucleótido más 3’al al que se dirige el gapmer.. Cada gapmer enumerado en la Tabla 8 está dirigido a la SEQ ID NO: 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
65 Como se muestra en la Tabla 8, todos los gapmeros 5-10-5 MOE, los gapmeros 3-14-3 MOE y los gapmeros 2-13-5
39
MOE dirigidos a la región diana que comienza en el sitio de inicio diana 1275 y termina en la parada diana. el sitio 1318 (es decir, las bases nucleotídicas 1275-1318) de la SEQ ID NO: muestra al menos un 70 % de inhibición del ARNm del Factor 11. Muchos de los gapmeros exhiben al menos 80 % de inhibición, inlcuyendo: 412223, 412224, 412225, 413482, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 5 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 416920, 416921, 416922, 416923, 416924, 416925, 416926, 416927, 416928, 416929, 416930, 416931, 416932, 416933, 416934, 416935, 416936, 416937, 416938, 416939, 416940, 416941, 416942, 416943, 416944, 416997, 416998, 416999, 417000, 417001, 417002, 417003, 417004, 417006, 417007, 417008, 417009, 417010, 417011, 417013, 417014, 417015, 417016, 417017, 417018, 417019, y 417020. The Los siguientes números de ISIS exhibieron al menos 90 % de inhibición: : 412224, 416850, 416853, 416856, 416857, 416858, 416861, 416862, 416864, 416922, 416923, 416924, 416925, 416926, 416928, 416931, 416932, 416933, 416934, 416935, 416937, 416938, 416940, 416941, 416943, 416999, 417002, 416854, y 416859.
15 Tabla 8
25
35
45
55
Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 1275 a 1318 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
Nº ISIS
Sitio de inicio diana Sitio de terminación diana Secuencia (5’ a 3’) % de inhibición Motivo SEQ ID No.
*412223
1275 1294 ACAGTTTCTGGCAGGCCTCG 85 5–10–5 51
*412224
1285 1304 GCATTGGTGCACAGTTTCTG 93 5–10–5 52
*413482
1290 1309 GGACGGCATTGGTGCACAGT 89 5–10–5 115
*412225
1295 1314 GCAGCGGACGGCATTGGTGC 86 5–10–5 53
416920
1275 1294 ACAGTTTCTGGCAGGCCTCG 88 3–14–3 51
416997
1275 1294 ACAGTTTCTGGCAGGCCTCG 84 2–13–5 51
416848
1276 1295 CACAGTTTCTGGCAGGCCTC 86 5–10–5 213
416921
1276 1295 CACAGTTTCTGGCAGGCCTC 88 3–14–3 213
416998
1276 1295 CACAGTTTCTGGCAGGCCTC 88 2–13–5 213
416849
1277 1296 GCACAGTTTCTGGCAGGCCT 88 5–10–5 214
416922
1277 1294 GCACAGTTTCTGGCAGGCCT 94 3–14–3 214
416999
1277 1296 GCACAGTTTCTGGCAGGCCT 92 2–13–5 214
416850
1278 1297 TGCACAGTTTCTGGCAGGCC 93 5–10–5 215
416923
1278 1297 TGCACAGTTTCTGGCAGGCC 96 3–14–3 215
417000
1278 1297 TGCACAGTTTCTGGCAGGCC 89 2–13–5 215
416851
1279 1298 GTGCACAGTTTCTGGCAGGC 88 5–10–5 216
416924
1279 1298 GTGCACAGTTTCTGGCAGGC 96 3–14–3 216
417001
1279 1298 GTGCACAGTTTCTGGCAGGC 83 2–13–5 216
416925
1280 1299 GGTGCACAGTTTCTGGCAGG 98 3–14–3 114
417002
1280 1299 GGTGCACAGTTTCTGGCAGG 92 2–13–5 114
416852
1281 1300 TGGTGCACAGTTTCTGGCAG 84 5–10–5 217
416926
1281 1300 TGGTGCACAGTTTCTGGCAG 93 3–14–3 217
417003
1281 1300 TGGTGCACAGTTTCTGGCAG 89 2–13–5 217
416853
1282 1301 TTGGTGCACAGTTTCTGGCA 91 5–10–5 218
416927
1282 1301 TTGGTGCACAGTTTCTGGCA 87 3–14–3 218
417004
1282 1301 TTGGTGCACAGTTTCTGGCA 86 2–13–5 218
416854
1283 1302 ATTGGTGCACAGTTTCTGGC 90 5–10–5 219
416928
1283 1302 ATTGGTGCACAGTTTCTGGC 91 3–14–3 219
417005
1283 1302 ATTGGTGCACAGTTTCTGGC 79 2–13–5 219
416855
1284 1303 CATTGGTGCACAGTTTCTGG 87 5–10–5 220
416929
1284 1303 CATTGGTGCACAGTTTCTGG 83 3–14–3 220
417006
1284 1303 CATTGGTGCACAGTTTCTGG 81 2–13–5 220
416930
1285 1304 GCATTGGTGCACAGTTTCTG 87 3–14–3 52
417007
1285 1304 GCATTGGTGCACAGTTTCTG 82 2–13–5 52
416856
1286 1305 GGCATTGGTGCACAGTTTCT 95 5–10–5 221
416931
1286 1305 GGCATTGGTGCACAGTTTCT 96 3–14–3 221
417008
1286 1305 GGCATTGGTGCACAGTTTCT 82 2–13–5 221
416857
1287 1306 CGGCATTGGTGCACAGTTTC 92 5–10–5 222
416932
1287 1306 CGGCATTGGTGCACAGTTTC 92 3–14–3 222
417009
1287 1306 CGGCATTGGTGCACAGTTTC 85 2–13–5 222
40
(continúa)
5
15
25
35
416858
1288 1307 ACGGCATTGGTGCACAGTTT 93 5–10–5 223
416933
1288 1307 ACGGCATTGGTGCACAGTTT 92 3–14–3 223
417010
1288 1307 ACGGCATTGGTGCACAGTTT 81 2–13–5 223
416859
1289 1308 GACGGCATTGGTGCACAGTT 90 5–10–5 224
416934
1289 1308 GACGGCATTGGTGCACAGTT 90 3–14–3 224
417011
1289 1308 GACGGCATTGGTGCACAGTT 86 2–13–5 224
416935
1290 1309 GGACGGCATTGGTGCACAGT 92 3–14–3 115
417012
1290 1309 GGACGGCATTGGTGCACAGT 72 2–13–5 115
416860
1291 1310 CGGACGGCATTGGTGCACAG 88 5–10–5 225
416936
1291 1310 CGGACGGCATTGGTGCACAG 89 3–14–3 225
417013
1291 1310 CGGACGGCATTGGTGCACAG 86 2–13–5 225
416861
1292 1311 GCGGACGGCATTGGTGCACA 92 5–10–5 226
416937
1292 1311 GCGGACGGCATTGGTGCACA 93 3–14–3 226
417014
1292 1311 GCGGACGGCATTGGTGCACA 87 2–13–5 226
416862
1293 1312 AGCGGACGGCATTGGTGCAC 90 5–10–5 227
416938
1293 1312 AGCGGACGGCATTGGTGCAC 90 3–14–3 227
417015
1293 1312 AGCGGACGGCATTGGTGCAC 87 2–13–5 227
416863
1294 1313 CAGCGGACGGCATTGGTGCA 83 5–10–5 228
416939
1294 1313 CAGCGGACGGCATTGGTGCA 88 3–14–3 228
417016
1294 1313 CAGCGGACGGCATTGGTGCA 85 2–13–5 228
416940
1295 1314 GCAGCGGACGGCATTGGTGC 92 3–14–3 53
417017
1295 1314 GCAGCGGACGGCATTGGTGC 82 2–13–5 53
416864
1296 1315 GGCAGCGGACGGCATTGGTG 93 5–10–5 229
416941
1296 1315 GGCAGCGGACGGCATTGGTG 95 3–14–3 229
417018
1296 1315 GGCAGCGGACGGCATTGGTG 82 2–13–5 229
416865
1297 1316 TGGCAGCGGACGGCATTGGT 88 5–10–5 230
416942
1297 1316 TGGCAGCGGACGGCATTGGT 85 3–14–3 230
417019
1297 1316 TGGCAGCGGACGGCATTGGT 84 2–13–5 230
416866
1298 1317 CTGGCAGCGGACGGCATTGG 88 5–10–5 231
416943
1298 1317 CTGGCAGCGGACGGCATTGG 92 3–14–3 231
417020
1298 1317 CTGGCAGCGGACGGCATTGG 84 2–13–5 231
416867
1299 1318 ACTGGCAGCGGACGGCATTG 83 5–10–5 232
416944
1299 1318 ACTGGCAGCGGACGGCATTG 83 3–14–3 232
417021
1299 1318 ACTGGCAGCGGACGGCATTG 74 2–13–5 232
Example 4: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del factor 11 humano en células HepG2
Gapmeros del Ejemplo 3 (véanse las Tablas 4, 5, 6, 7 y 8), que exhiben inhibición in vitro del factor 11 humano, se analizaron a diversas dosis en células HepG2. Las células se sembraron a una densidad de 10.000 células por
45 pocillo y se transfectaron usando reactivo de lipofectina con concentraciones de 9,375 nM, 18,75 nM, 37,5 nM y 75 nM del oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 9. El conjunto de sonda de cebador Factor 11 humano, RTS 2966, se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm del factor 11 se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición del factor 11 respecto a las células control sin tratar. Como se ilustra en la Tabla 9, los niveles de A.RNm del Factor 11 se redujeron de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
55
41
Tabla 9
5
15
25
35
Inhibición antisentido dependiente de la dosis del factor 11 humano en células HepG2 a través de la transfección de oligonucleótidos con lipofectin
9,375 nM
18,75 nM 37,5 nM 75 nM Motif IC50 (nM) SEQ ID No.
412203
33 40 62 74 5–10–5 24 31
412206
24 47 69 86 5–10–5 21 34
413467
35 51 62 69 5–10–5 20 100
413474
29 44 57 67 5–10–5 28 107
413476
24 58 62 77 5–10–5 21 109
416825
23 52 73 92 5–10–5 20 190
416826
8 36 58 84 5–10–5 29 191
416827
31 42 62 77 5–10–5 23 192
416838
31 51 64 86 5–10–5 19 203
416842
18 33 62 71 5–10–5 31 207
416850
4 30 67 84 5–10–5 29 215
416856
21 45 58 74 5–10–5 27 221
416858
0 28 54 82 5–10–5 33 223
416864
18 43 62 78 5–10–5 26 229
416878
22 34 60 82 5–10–5 27 100
416892
16 50 70 85 3–14–3 23 190
416895
39 57 66 71 3–14–3 15 192
416896
22 39 57 81 3–14–3 27 193
416908
36 57 67 76 3–14–3 16 203
416922
14 25 49 75 3–14–3 36 214
416923
36 47 60 67 3–14–3 23 215
416924
25 38 56 59 3–14–3 36 216
416925
13 38 59 75 3–14–3 30 114
416926
31 43 63 82 3–14–3 22 217
416931
44 39 57 71 3–14–3 22 221
416941
33 54 63 78 3–14–3 19 229
416945
34 45 62 65 2–13–5 24 31
416969
17 39 61 76 2–13–5 28 190
416972
32 40 60 69 2–13–5 26 192
416973
60 75 85 87 2–13–5 3 193
416984
26 50 62 81 2–13–5 22 202
416985
17 30 47 57 2–13–5 49 203
416989
18 41 62 83 2–13–5 26 206
416993
15 37 50 68 2–13–5 36 209
416999
24 37 55 73 2–13–5 30 214
417000
35 47 58 70 2–13–5 23 215
417002
35 52 67 70 2–13–5 19 114
417003
26 44 60 56 2–13–5 33 217
45 Los gapmeros también se transfectaron mediante electroporación y se midió su inhibición dependiente de la dosis del ARNm del Factor 11 humano. Las células se sembraron a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron mediante electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,7 μM, 2,2 μM, 6,7 μM y 20 μM, como se especifica en la Tabla 10. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN aislado de las células y los niveles de ARNm del Factor 11 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador Factor 11 humano, RTS 2966, se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm del factor 11 se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición del factor 11 respecto a las células control sin tratar. Como se ilustra en la Tabla 10, los niveles de A.RNm del Factor 11 se redujeron de una manera
55 dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
42
Tabla 10
5
15
25
35
45
Inhibición antisentido dependiente de la dosis del factor 11 humano en células HepG2 a través de la transfección de oligonucleótidos con electroporación
0,7 µM
2,2 µM 6,7 µM 20 µM CI50 (µM SEQ ID No.
412203
11 60 70 91 2,7 31
412206
22 39 81 94 2,7 34
413467
5 31 65 89 4,2 100
413474
0 5 52 81 6,9 107
413476
40 69 88 93 0,9 109
416825
27 74 92 98 1,3 190
416826
2 47 86 82 3,2 191
416827
37 68 87 92 1,1 192
416838
5 30 55 83 5,1 203
416842
0 10 66 92 5,0 207
416850
14 25 81 91 3,4 215
416856
0 29 47 93 5,1 221
416858
5 20 56 86 5,3 223
416864
32 65 78 90 1,4 229
416878
1 26 75 85 4,3 100
416892
14 52 82 92 2,5 190
416895
0 62 70 91 3,0 192
416896
12 35 81 89 3,2 193
416908
7 58 74 89 2,8 203
416922
35 51 77 91 1,7 214
416923
15 30 60 90 4,0 215
416924
22 40 63 70 4,1 216
416925
0 40 76 80 3,9 114
416926
47 71 91 94 0,6 217
416931
7 24 60 82 5,1 221
416941
16 38 79 89 3,0 229
416945
48 70 81 88 0,6 31
416969
25 34 86 92 2,5 190
416972
25 30 48 88 4,3 192
416973
20 48 86 93 2,3 193
416984
43 54 88 90 1,1 202
416985
12 48 45 69 5,8 203
416989
32 65 88 94 1,3 206
416993
22 48 87 92 2,2 209
416999
20 42 77 88 2,8 214
417000
46 73 76 89 0,6 215
417002
32 38 82 91 2,2 114
417003
0 34 75 89 3,9 217
Ejemplo 5: Selección y confirmación de la inhibición de antisentido dependiente de la dosis eficaz del Factor 11 humano en células HepG2
Se seleccionaron gapmeros que exhibían una inhibición significativa dependiente de la dosis del Factor 11 humano en el Ejemplo 4 y se analizaron a diversas dosis en células HepG2. Las células se sembraron a una densidad de
10.000 células por pocillo y se transfectaron usando reactivo de lipofectin con concentraciones de 9,34 nM, 4,69 nM, 9,375 nM, 18,75 nM, 37,5 nM, y 75 nM del oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 11. Después 55 de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de ARNm del Factor 11 humano se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador Factor 11 humano, RTS 2966, se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm del factor 11 se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición del factor 11 humano respecto a las células control sin tratar. Como se ilustra en la Tabla 11, los niveles de A.RNm del Factor 11 se redujeron de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido en comparación con el control.
65
43
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imagen47
comienza en el sitio de inicio 1275 diana y termina en el sitio de detención diana 1317 (es decir, bases nucleotídicas 1275-1317) de SEQ ID NO: 1 exhibieron al menos 60 % inhibición del ARNm del Factor 11. De manera similar, todos los gapmeros re-evaluados de las Tablas 1 y 8 exhibieron al menos 60 % de inhibición.
Varios de los gapmeros exhiben al menos 70 % de inhibición, incluyendo números ISIS: ISIS 412206, 412224, 412225, 413481, 413482, 416825, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 445494, 445495, 445496, 445497, 445498, 445499, 445500, 445501, 445502, 445503, 445504, 445505, 445506, 445507, 445508, 445509, 445510, 445511, 445512, 445513, 445514, 445515, 445516, 445517, 445518, 445519, 445520, 445521, 445522, 445523, 445524, 445525, 445526, 445527, 445528, 445529, 445530, 445531, 445532, 445533, 445534, 445535, 445536, 445537, 455538, 445539, 445540, 445541, 445542, y 445543.
Varios de los gapmeros exhiben al menos 80 % de inhibición, incluyendo números ISIS: ISIS 412206, 412224, 412225, 413481, 413482, 416825, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 445494, 445495, 445496, 445497, 445498, 445500, 445501, 445502, 445503, 445504, 445505, 445506, 445507, 445508, 445509, 445510, 445513, 445514, 445519, 445520, 445521, 445522, 445525, 445526, 445529, 445530, 445531, 445532, 445533, 445534, 445535, 445536, 455538, 445541, y 445542.
Varios de los gapmeros exhiben al menos 90 % de inhibición, incluyendo números ISIS: ISIS 412206, 416825, 416850, 416857, 416858, 416861, 445522 y 445531.
Tabla 44
Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 1018 a 1042 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).
Nº ISIS
Sitio de inicio humano Sitio de terminación humano Secuencia (5' a 3') Porcentaje de inhibición Motivo SEC Nº ID Sitio de inicio en mono rhesus Sitio de terminación en mono rhesus
*416850
1278 1297 91 5–10– 5 215 1277 1296
*416858
1288 1307 90 5–10– 5 223 1287 1306
416825
680 699 90 5–10– 5 190 679 698
412206
738 757 91 5–10– 5 34 737 756
412223
1275 1294 62 5–10– 5 51 1274 1293
445493
1275 1294 69 6–8–6 51 1274 1293
445518
1275 1292 imagen48 75 5–8–5 242 1274 1291
416848
1276 1295 87 5–10– 5 213 1275 1294
445494
1276 1295 85 6–8–6 213 1275 1294
445519
1276 1293 81 5–8–5 243 1275 1292
416849
1277 1296 88 5–10– 5 214 1276 1295
445495
1277 1296 imagen49 89 6–8–6 214 1276 1295
445520
1277 1294 82 5–8–5 244 1276 1293
445496
1278 1297 87 6–8–6 215 1277 1296
445521
1278 1295 87 5–8–5 245 1277 1294
64 (continúa)
416851
1279 1298 89 5–10–5 216 1278 1297
445497
1279 1298 81 6–8–6 216 1278 1297
445522
1279 1296 91 5–8–5 246 1278 1295
413481
1280 1299 82 5–10–5 114 1279 1298
445498
1280 1299 83 6–8–6 114 1279 1298
445523
1280 1297 73 5–8–5 267 1279 1296
416852
1281 1300 87 5–10–5 217 1280 1299
445499
1281 1300 75 6–8–6 217 1280 1299
445524
1281 1298 75 5–8–5 247 1280 1297
416853
1282 1301 84 5–10–5 218 1281 1300
445500
1282 1301 81 6–8–6 218 1281 1300
445525
1282 1299 85 5–8–5 248 1281 1298
416854
1283 1302 86 5–10–5 219 1282 1301
445501
1283 1302 83 6–8–6 219 1282 1301
445526
1283 1300 81 5–8–5 249 1282 1299
416855
1284 1303 85 5–10–5 220 1283 1302
445502
1284 1303 83 6–8–6 220 1283 1302
445527
1284 1301 70 5–8–5 250 1283 1300
412224
1285 1304 84 5–10–5 52 1284 1303
445503
1285 1304 89 6–8–6 52 1284 1303
445528
1285 1302 73 5–8–5 251 1284 1301
416856
1286 1305 84 5–10–5 221 1285 1304
445504
1286 1305 87 6–8–6 221 1285 1304
445529
1286 1303 85 5–8–5 252 1285 1302
416857
1287 1306 91 5–10–5 222 1286 1305
445505
1287 1306 89 6–8–6 222 1286 1305
445530
1287 1304 83 5–8–5 253 1286 1303
445506
1288 1307 86 6–8–6 223 1287 1306
65 (continúa)
445531
1288 1305 90 5–8–5 254 1287 1304
416859
1289 1308 85 5–10–5 224 1288 1307
445507
1289 1308 85 6–8–6 224 1288 1307
445532
1289 1306 89 5–8–5 255 1288 1305
413482
1290 1309 88 5–10–5 115 1289 1308
445508
1290 1309 81 6–8–6 115 1289 1308
445533
1290 1307 87 5–8–5 256 1289 1306
416860
1291 1310 89 5–10–5 225 1290 1309
445509
1291 1310 84 6–8–6 225 1290 1309
445534
1291 1308 82 5–8–5 257 1290 1307
416861
1292 1311 90 5–10–5 226 1291 1310
445510
1292 1311 88 6–8–6 226 1291 1310
445535
1292 1309 83 5–8–5 258 1291 1308
416862
1293 1312 89 5–10–5 227 1292 1311
445511
1293 1312 77 6–8–6 227 1292 1311
445536
1293 1310 82 5–8–5 259 1292 1309
416863
1294 1313 86 5–10–5 228 1293 1312
445512
1294 1313 79 6–8–6 228 1293 1312
445537
1294 1311 78 5–8–5 260 1293 1310
412225
1295 1314 86 5–10–5 53 1294 1313
445513
1295 1314 85 6–8–6 53 1294 1313
445538
1295 1312 80 5–8–5 261 1294 1311
416864
1296 1315 88 5–10–5 229 1295 1314
445514
1296 1315 81 6–8–6 229 1295 1314
445539
1296 1313 imagen50 79 5–8–5 262 1295 1312
416865
1297 1316 86 5–10–5 230 1296 1315
445515
1297 1316 75 6–8–6 230 1296 1315
445540
1297 1314 74 5–8–5 263 1296 1313
66
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imagen65
Tabla 80
Cambio en el peso corporal y de los órganos de ratones CD1 después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido
Hígado (%)
Riñón (%) Bazo (%) Peso corporal (g)
PBS
5 1,5 0,3 7
ISIS 416850
6 1,6 0,4 12
ISIS 416858
7 1,6 0,6 12
ISIS 416864
5 1,6 0,3 12
ISIS 412223
6 1,5 0,4 12
ISIS 412224
6 1,6 0,5 10
ISIS 412225
6 1,5 0,4 10
ISIS 413481
6 1,5 0,5 9
ISIS 413482
6 1,6 0,5 11
ISIS 416848
6 1,5 0,4 11
ISIS 416849
8 1,5 0,4 8
ISIS 416851
7 1,5 0,5 11
ISIS 416852
6 1,5 0,4 10
ISIS 416853
8 1,5 0,7 13
ISIS 416854
7 1,2 0,4 13
ISIS 416855
8 1,4 0,6 12
ISIS 416856
6 1,4 0,4 10
ISIS 416857
7 1,6 0,5 10
ISIS 416859
6 1,5 0,4 10
ISIS 416860
6 1,4 0,4 10
ISIS 416861
5 1,3 0,4 9
ISIS 416862
6 1,5 0,4 10
ISIS 416863
5 1,5 0,4 9
ISIS 416865
6 1,5 0,4 8
ISIS 416866
5 1,6 0,4 10
ISIS 416867
5 1,4 0,4 9
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron las concentraciones plasmáticas de transaminasas usando un analizador automático de química clínica (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de alanina transaminasa (ALT) y aspartato transaminasa (AST) se expresan en UI/l y los resultados se presentan en la Tabla 81. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron un aumento en los niveles de ALT/AST por encima de siete veces de control fueron seleccionado para más estudios. Los niveles plasmáticos de bilirrubina, colesterol y albúmina también se midieron usando el mismo analizador químico clínico y se presentan en la Tabla 81 expresados en mg/dl. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron un aumento en los niveles de bilirrubina más del doble de los niveles de control por tratamiento con oligonucleótidos antisentido se seleccionaron para estudios adicionales.
Tabla 81
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre marcadores metabólicos en el hígado de ratones CD1
ALT (UI/l)
AST (UI/l) Bilirrubina (mg/dl) Albúmina (mg/dl) Colesterol (mg/dl)
PBS
32 68 0,25 3,7 135
ISIS 416850
75 99 0,21 3,5 142
ISIS 416858
640 547 0,28 4,4 181
ISIS 416864
36 67 0,19 2,6 152
ISIS 412223
60 125 0,20 3,0 117
ISIS 412224
214 183 0,19 3,4 114
ISIS 412225
40 69 0,23 3,3 128
ISIS 413481
85 143 0,18 3,2 153
ISIS 413482
54 77 0,24 3,0 138
ISIS 416848
153 153 0,19 3,1 151
ISIS 416849
1056 582 0,22 2,5 109
ISIS 416851
47 76 0,19 3,1 106
ISIS 416852
49 91 0,16 4,9 125
82
imagen66
% y un aumento en el recuento de monocitos de más de tres veces se seleccionaron para estudios adicionales.
Tabla 83
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre factores hematológicos en ratones CD1
RBC (106/µl)
Hemoglobina (g/dl) HCT ( %) WBC (103/µl)
PBS
10 15 51 7
ISIS 416850
10 15 49 5
ISIS 416858
9 14 50 8
ISIS 416864
10 15 52 5
ISIS 412223
9 15 48 7
ISIS 412224
10 15 50 9
ISIS 412225
9 15 50 7
ISIS 413481
9 13 45 7
ISIS 413482
10 15 50 8
ISIS 416848
9 14 47 7
ISIS 416849
9 14 48 9
ISIS 416851
9 14 47 6
ISIS 416852
9 14 49 5
ISIS 416853
11 17 56 8
ISIS 416854
9 13 43 12
ISIS 416855
9 14 50 6
ISIS 416856
9 14 47 5
ISIS 416857
10 15 53 6
ISIS 416859
10 15 49 6
ISIS 416860
10 15 51 7
ISIS 416861
9 14 48 7
ISIS 416862
9 14 49 6
ISIS 416863
9 14 48 7
ISIS 416865
9 14 50 7
ISIS 416866
9 15 51 6
ISIS 416867
10 14 47 8
Tabla 84
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre el recuento de células sanguíneas ratones CD1
Neutrófilos (células/μl)
Linfocitos (células/μl) Monocitos (células/μl) Plaquetas (103/µl)
PBS
1023 6082 205 940
ISIS 416850
1144 4004 156 916
ISIS 416858
2229 5480 248 782
ISIS 416864
973 3921 141 750
ISIS 412223
1756 4599 200 862
ISIS 412224
2107 6284 195 647
ISIS 412225
1547 4969 293 574
ISIS 413481
1904 4329 204 841
ISIS 413482
1958 5584 275 818
ISIS 416848
1264 5268 180 953
ISIS 416849
1522 6967 253 744
ISIS 416851
1619 4162 194 984
ISIS 416852
1241 3646 189 903
ISIS 416853
2040 5184 225 801
ISIS 416854
2082 9375 455 1060
ISIS 416855
1443 4236 263 784
ISIS 416856
1292 3622 151 753
ISIS 416857
1334 3697 215 603
ISIS 416859
1561 4363 229 826
ISIS 416860
1291 4889 161 937
ISIS 416861
1122 5119 219 836
ISIS 416862
1118 4445 174 1007
ISIS 416863
1330 5617 226 1131
ISIS 416865
1227 5148 315 872
ISIS 416866
1201 4621 211 1045
ISIS 416867
1404 6078 188 1006
84
imagen67
imagen68
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron las concentraciones plasmáticas de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina usando un analizador automático de química clínica (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 88, expresados en mg/dl. Esos oligonucleótidos antisentido que no afectaron más de dos veces el aumento en los niveles de BUN en comparación con el control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores. La proteína urinaria total y la proporción de proteína urinaria a creatinina en muestras totales de orina después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se calculó y también se presenta en la Tabla 88. Esos oligonucleótidos antisentido que no afectaron más de cinco veces el aumento de las proporciones proteína/creatinina en la orina al control PBS fueron seleccionados para estudios adicionales.
Tabla 88
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre marcadores metabólicos en el riñón de ratas Sprague-Dawley
BUN (mg/dl)
Creatinina (mg/dl) Proteína total en orina (mg/dl) Relación proteína en orina/creatinina
PBS
19 38 60 1,7
ISIS 412223
24 46 224 4,6
ISIS 412224
24 44 171 3,8
ISIS 412225
23 58 209 4,0
ISIS 413481
26 45 148 3,6
ISIS 413482
23 34 157 4,8
ISIS 416848
26 64 231 3,9
ISIS 416851
24 70 286 4,0
ISIS 416852
25 60 189 3,0
ISIS 416856
23 48 128 2,7
ISIS 416859
24 44 144 3,3
ISIS 416860
23 58 242 4,6
ISIS 416861
22 39 205 5,1
ISIS 416863
29 73 269 3,8
ISIS 416866
22 85 486 6,2
ISIS 416867
22 70 217 3,1
Ensayos hematológicos
La sangre obtenida de todos los grupos de ratas se envió a Antech Diagnostics para mediciones de hematocrito (HCT), así como mediciones de varias células sanguíneas, como WBC (neutrófilos y linfocitos), glóbulos rojos y plaquetas, y el contenido total de hemoglobina. Los resultados se presentan en las Tablas 89 y 90. Esos oligonucleótidos antisentido que no afectaron a una disminución en el recuento de plaquetas de más del 50 % y un aumento en el recuento de monocitos de más de tres veces se seleccionaron para estudios adicionales.
87
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Tabla 168
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los niveles de citocinas/quimiocinas (pg/ml) en monos cynomolgus el día 55
IL–1β
IL–6 IFN–γ TNF–α IL–8 MIP–1α MCP–1 MIP–1β RANTES
PBS
453 3 232 191 68 21 237 34 775
ISIS 416850
106 1 19 16 620 17 887 50 27503
ISIS 449409
181 0 25 8 254 17 507 47 8958
ISIS 445522
341 2 83 18 100 22 592 63 16154
ISIS 449710
286 2 176 26 348 27 474 53 22656
ISIS 449707
97 1 24 16 48 12 264 49 1193
ISIS 449711
146 7 22 31 110 17 469 91 3029
ISIS 449708
131 0 18 17 85 23 409 128 4561
ISIS 416858
28 1 9 15 167 11 512 47 5925
ISIS 445531
155 1 15 16 293 12 339 84 5935

Ejemplo 47: Determinación de la viscosidad de los oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos al Factor 11 humano
5 La viscosidad de los oligonucleótidos antisentido dirigidos al factor 11 humano se midió con el objetivo de seleccionar oligonucleótidos antisentido que tienen una viscosidad superior a 40 cP a una concentración de 165-185 mg/ml.
10 Se pesaron oligonucleótidos de ISIS (32 -35 mg) en un vial de vidrio, se añadieron 120 \ mu l de agua y el oligonucleótido antisentido se disolvió en solución calentando el vial a 50ºC. Parte de (75 μL) la muestra precalentada se pipeteó a un micro-viscosímetro (Cambridge). La temperatura del microcomponedor se ajustó a 250ºC y se midió la viscosidad de la muestra. Otra parte (20 μL) de la muestra precalentada se pipeteó en 10 mL de agua para lectura UV a 260 nM a 850C (instrumento Cary UV). Los resultados se presentan en la Tabla 169.
15
Tabla 169
Viscosidad y concentración de los oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos al Factor 11 humano
Nº ISIS
Viscosidad (cP) Concentración (mg/ml)
412223
8 163
412224
98 186
412225
> 100 162
413481
23 144
413482
16. 172
416848
6 158
416850
67 152
416851
26 187
416852
29 169
416856
18 175
416858
10 166
416859
10 161
416860
> 100 154
416861
14 110
416863
9 165
416866
> 100 166
416867
8 168
445498
21 157
445504
20 139
445505
9 155
445509
> 100 167
445513
34 167
445522
63 173
445522
58 174
445530
25 177
445531
15 155
445531
20 179
449707
7 166
449708
9 188
449709
65 171
449710
7 186
118

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