JP2012505660A - 第１１因子発現の調節 - Google Patents

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Abstract

本明細書に開示するのは、第11因子を減少させて血栓塞栓合併症を治療又は予防することを必要とする個体においてそれをするためのアンチセンス化合物と方法である。第11因子へ標的指向されるアンチセンス化合物の投与で改善し得る疾患状態の例には、深在性静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、及び卒中のような、血栓症、塞栓症、及び血栓塞栓症が含まれる。第11因子に標的指向するアンチセンス化合物は、血栓症及び塞栓症のリスク状態にある個体を予防するための予防治療薬としても使用することができる。
【選択図】 なし

Description

関連出願への相互参照
本出願は、35 U.S.C.§119（e）の下で、米国仮特許出願番号61/105,772（2008年10月15日出願）及び米国仮特許出願番号61/174,461（2009年4月30日出願）に対する優先権を主張する。上記出願のいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列一覧表
本出願は、配列一覧表と共に電子フォーマットで出願されている。配列一覧表は、2009年10月15日に創出されて、サイズが92 Kbである、20091015_BIOL0107WOSEQ.txtと題するファイルとして提供される。配列一覧表の電子フォーマット中の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明の態様は、動物において第11因子のmRNA及びタンパク質の発現を低下させるための方法、化合物、及び組成物を提供する。そのような方法、化合物、及び組成物は、血栓塞栓合併症を治療、予防、又は改善するのに有用である。
循環系は、血液損失を防ぐ機序、並びに不適正な血管内閉塞に対抗する機序を必要とする。一般に、凝固は、可溶性フィブリノーゲンの不溶性フィブリンゲルへの変換へ行き着く反応のカスケードを含む。このカスケードの工程は、不活性な酵素源の活性化酵素への変換を伴う。次いで、この活性酵素は、このカスケードにおける次の工程を触媒する。
凝固カスケード
凝固カスケードは、主要な経路である組織因子経路（又は「外因系経路」）と接触活性化経路（又は「内因系経路」）という、2つの岐路を通して始動され得る。
組織因子経路は、血管外の細胞（周皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、及び角化細胞）によって構成的に発現されて、炎症性サイトカイン又はエンドトキシンによる誘導時に血管単球及び内皮細胞によって発現される、細胞表面受容体の組織因子（TF、第III因子とも呼ばれる）によって始動される（Drake et al., Am J Pathol 1989, 134:1087-1097）。TFは、凝固第VIIa因子、セリンプロテアーゼへ高親和性の細胞受容体である。TFの非存在時には、VIIaは、きわめて低い触媒活性を有して、VIIaがアロステリック機序を介して機能的になるには、TFへ結合することが必要である（Drake et al., Am J Pathol 1989, 134:1087-1097）。TF-VIIa複合体は、第X因子を第Xa因子へ活性化する。次に、Xaは、その補因子である第Va因子と会合してプロトロンビナーゼ複合体となり、これが次にプロトロンビン（第II因子又は第2因子としても知られる）をトロンビン（第IIa因子又は第2a因子としても知られる）へ活性化する。トロンビンは、血小板を活性化し、フィブリノーゲンをフィブリンへ変換して、第XIII因子を活性化することによってフィブリン架橋結合を促進し、それにより、TFが血管外細胞上で曝露される部位で、安定した血栓（plug）を形成する。その上に、トロンビンは、第V因子及び第VIII因子を活性化することによって、凝固カスケード反応を強化する。
接触活性化経路は、第XII因子の第XIIa因子への活性化が引き金になる。第XIIa因子は、XIをXIaへ変換して、XIaはIXをIXaへ変換する。IXaは、その補因子のVIIIaと会合して、XをXaへ変換する。上記2つの経路は、第Xa因子が第Va因子と会合してプロトロンビン（第II因子）をトロンビン（第IIa因子）へ活性化するので、この点で集束する。
凝固の阻害
少なくとも3つの機序が凝固カスケードを抑制する、即ち、活性化プロテインC、アンチトロンビン、及び組織因子経路阻害剤の作用である。活性化プロテインCは、補因子のVa及びVIIIaを分解するセリンプロテアーゼである。プロテインCは、トロンボモジュリンを伴うトロンビンによって活性化されて、機能するには補酵素のプロテインSを必要とする。アンチトロンビンは、セリンプロテアーゼ：トロンビン、Xa、XIIa、XIa、及びIXaを阻害する、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）である。組織因子経路阻害剤は、Xaの作用とTF-VIIa複合体を阻害する（Schwartz AL et al., Trends Cardiovasc Med. 1997; 7:234-239）。
疾患
血栓症は、血塊の病的発展であり、血塊が身体の別の部分へ移動して臓器機能に干渉するときに、塞栓症が生じる。血栓塞栓症は、深在性静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、及び卒中のような病気を引き起こす場合がある。重要にも、血栓塞栓症は、毎年200万を超すアメリカ人に影響を及ぼす罹病の主因である（Adcock et al. American Journal of Clinical Pathology. 1997;108:434-49）。血栓症のほとんどの症例は、後天的な外因性の問題、例えば、外科手術、癌、不動性状態によるが、遺伝的素因による症例もある。例えば、抗リン脂質抗体症候群、常染色体優性状態、第V因子ライデンである（Bertina RM et al. Nature 1994; 369: 64-67）。
治療
最も一般的に使用されている抗凝固薬である、ワルファリン、ヘパリン、及び低分子量ヘパリン（LMWH）は、いずれも重大な欠点を保有する。
ワルファリンは、典型的には、心房細動に罹患する患者を治療するために使用される。この薬物は、第II因子、第VII因子、第IX因子、及び第X因子が含まれる、ビタミンK依存的な凝固因子と相互作用する。抗凝固性ののプロテインC及びSも、ワルファリンによって阻害されてしまう。ワルファリンを使用する薬物療法は、アミオダロンのような、心房細動を治療するために使用される薬物が含まれる他の医薬品とワルファリンが相互作用するという事実によってさらに複雑になる。ワルファリンでの治療は、予測することが難しいので、異常な出血の徴候を検知するために、患者を注意深く監視しなければならない。
ヘパリンは、トロンビンと第X因子をともに阻害するアンチトロンビンを活性化することによって機能する（Bjork I, Lindahl U. Mol Cell Biochem. 1982 48: 161-182）。ヘパリンでの治療は、血栓症につながる可能性がある、血小板を血管内で凝集させる免疫学的反応を引き起こす場合がある。この副作用は、ヘパリン誘発性血小板減少症（HIT）として知られていて、患者の監視が求められる。ヘパリンでの長期治療は、骨粗鬆症をもたらす場合もある。LMWHも、第2因子を阻害し得るが、未分画ヘパリン（UFH）より低い度合いである。LMWHは、HITの発症との関連が示唆されている。
このように、現行の抗凝固剤は、予測可能性と特異性が不足しているので、出血合併症のような有害な副作用を防ぐために、注意深い患者モニタリングが求められる。現行では、内因系経路又は外因系経路だけに標的指向する抗凝固薬はない。
Drake et al., Am J Pathol 1989, 134:1087-1097 Schwartz AL et al., Trends Cardiovasc Med. 1997; 7:234-239 Adcock et al. American Journal of Clinical Pathology. 1997;108:434-49 Bertina RM et al. Nature 1994; 369: 64-67 Bjork I, Lindahl U. Mol Cell Biochem. 1982 48: 161-182
本明細書に提供するのは、第11因子のmRNA及びタンパク質の発現を調節するための方法、化合物、及び組成物である。ある態様において、第11因子特異的阻害剤は、第11因子のmRNA及びタンパク質の発現を調節する。ある態様において、第11因子特異的阻害剤は、核酸、タンパク質、又は低分子である。
ある態様において、調節は、細胞又は組織において起こり得る。ある態様において、細胞又は組織は、動物にある。ある態様において、動物は、ヒトである。ある態様では、第11因子mRNAレベルが低下される。ある態様では、第11因子タンパク質レベルが低下される。そのような低下は、時間依存的なやり方で、又は用量依存的なやり方で起こり得る。
また提供するのは、疾患、障害、及び状態を予防、治療、及び改善するのに有用な方法、化合物、及び組成物である。ある態様において、そのような疾患、障害、及び状態は、血栓塞栓合併症である。そのような血栓塞栓合併症には、血栓症、塞栓症、及び血栓塞栓症のカテゴリーが含まれる。ある態様において、そのような血栓塞栓合併症には、深在性静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、及び卒中が含まれる。
そのような疾患、障害、及び状態は、1以上の危険因子、原因、又はアウトカムを共有する可能性がある。血栓塞栓合併症の発症への確かな危険因子及び原因には、不動性状態、外科手術（特に、整形外科手術）、悪性腫瘍、妊娠、高齢、経口避妊薬の使用、心房細動、既往の血栓塞栓合併症、慢性炎症性疾患、及び先天的又は後天的な血栓形成促進性の凝固障害が含まれる。血栓塞栓合併症の進展に関連した確かなアウトカムには、血管の罹患による血流の減少、組織の死、及び死亡が含まれる。
ある態様において、治療の方法には、第11因子特異的阻害剤を必要とする個体へそれを投与することが含まれる。
上述の一般的な記載と以下の詳細な記載は、いずれも単に例示的で説明的なものであり、特許請求される本発明を制限するものではないと理解されたい。本明細書において、単数形の使用には、他に特に述べなければ、複数形が含まれる。本明細書に使用するように、「又は」の使用は、他に述べなければ、「及び／又は」を意味する。さらに、「〜を含めて（including）」という用語の使用は、「〜が含まれる（includes）」及び「〜が含まれている（included）」といった他の形式と同様に、限定的なものではない。また、「要素」又は「成分」のような用語には、他に特に述べなければ、1つのユニットを含んでなる要素及び成分と、1より多いサブユニットを含む要素及び成分がともに含まれる。
本明細書に使用するセクション見出しは、文書構成（organizational）の目的にすぎず、記載の主題を限定するものと解釈してはならない。限定されないが、特許、特許出願、記事、書籍、及び約定が含まれる、本出願に引用するすべての文書、又は文書の一部は、その全体だけでなく、本明細書において考察される文書のその部分についても、参照により本明細書に明白に組み込まれる。
定義
特殊な定義を提供しなければ、本明細書に記載する、分析化学、合成有機化学、並びに医化学及び薬化学に関連して利用される命名法とその手順及び技術は、当該技術分野においてよく知られていて、一般的に使用されるものである。化学合成と化学分析では、標準技術を使用してよい。許容される場合、すべての特許、特許出願、公開出願と他の公開公報、米国立生物工学情報センター（NCBI）のようなデータベースより入手可能なGENBANK登録番号と関連配列情報、並びに、本明細書の開示を通して言及される他のデータは、その全体だけでなく、本明細書において考察される文書のその部分についても、参照により本明細書に組み込まれる。
他に示さなければ、以下の用語は、以下の意味を有する：
「2'-O-メトキシエチル」（又は、2'-MOE及び2'-O（CH2）2-OCH3）は、フロシル環の2'位のO-メトキシ-エチル修飾を意味する。2'-O-メトキシエチル修飾された糖は、修飾糖である。
「2'-O-メトキシエチルヌクレオチド」は、2'-O-メトキシエチル修飾糖部分を含んでなるヌクレオチドを意味する。
「5-メチルシトシン」は、メチル基が5'位へ付いて修飾されたシトシンを意味する。5-メチルシトシンは、修飾ヌクレオ塩基である。
「活性薬剤」は、個体へ投与されるときに治療利益を提供する、医薬組成物中の単数又は複数の物質を意味する。例えば、ある態様において、第11因子へ標的指向されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、活性薬剤である。
「活性標的領域」又は「標的領域」は、1以上の活性アンチセンス化合物が標的指向される領域を意味する。「活性アンチセンス化合物」は、標的核酸レベル又はタンパク質レベルを低下させるアンチセンス化合物を意味する。
「同時に投与される」は、2つの薬剤のあらゆるやり方での同時投与に言及して、ここでは両剤の薬理効果が患者において同時に顕在化される。同時投与では、両剤が単一の医薬組成物において、同じ剤形において、又は同じ投与経路によって投与されることを求めない。両剤の効果は、同時に顕現されるに及ばない。その効果は、ある時間帯の間だけ重なればよいのであって、共存するに及ばない。
「投与すること」は、薬剤を個体へ提供することを意味して、限定されないが、医療専門家が投与することと自ら投与することが含まれる。
「改善」は、関連する疾患、障害、又は状態の少なくとも1つの指標、徴候、又は症状の軽減に言及する。指標の重症度は、当業者に知られている、主観的又は客観的な尺度によって決定してよい。
「動物」は、ヒト又は非ヒト動物に言及して、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、及び非ヒト霊長動物（限定されないが、サル及びチンパンジーが含まれる）が含まれる。
「解毒化合物」は、あらゆるアンチセンス媒介活性の強度又は期間を減少させることが可能な化合物に言及する。
「解毒オリゴヌクレオチド」は、アンチセンス化合物に相補的でそれとハイブリダイズすることが可能であるオリゴヌクレオチドを含んでなる解毒化合物を意味する。
「解毒タンパク質」は、ペプチドを含んでなる解毒化合物を意味する。
「抗体」は、抗原と何らかのやり方で特異的に反応することを特徴とする分子に言及して、ここで抗体と抗原は、他方に関してそれぞれ定義される。抗体は、完全抗体分子、又は、重鎖、軽鎖、Fab領域、及びFc領域のような、そのあらゆる断片又は領域に言及する場合がある。
「アンチセンス活性」は、アンチセンス化合物のその標的核酸へのハイブリダイゼーションに起因する、あらゆる検出可能又は測定可能な活性を意味する。ある態様において、アンチセンス活性は、標的核酸又はそのような標的核酸によりコードされるタンパク質の量又は発現における減少である。
「アンチセンス化合物」は、標的核酸への水素結合によるハイブリダイゼーションを起こすことが可能であるオリゴマー化合物を意味する。
「アンチセンス阻害」は、標的核酸に相補的なアンチセンス化合物の存在下での標的核酸レベル又は標的タンパク質レベルの、そのアンチセンス化合物の非存在下での標的核酸レベル又は標的タンパク質レベルと比較した低下を意味する。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸の対応する領域又はセグメントへのハイブリダイゼーションを許容するヌクレオ塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
「二環糖」は、2つの非ジェミナル環原子の架橋によって修飾されるフロシル環を意味する。二環糖は、修飾糖である。
「二環式核酸」又は「BNA」は、ヌクレオシド又はヌクレオチドのフラノース部分に、フラノース環上の2つの原子を連結する架橋が含まれることによって二環式環系が形成される、ヌクレオシド又はヌクレオチドに言及する。
「キャップ（Cap）構造」又は「末端キャップ部分」は、アンチセンス化合物のいずれの末端でも取り込まれた化学修飾を意味する。
「化学的に異なる領域」は、同じアンチセンス化合物の別の領域とは何らかのやり方で化学的に異なる、アンチセンス化合物の領域に言及する。例えば、2'-O-メトキシエチルヌクレオチドを有する領域は、2'-O-メトキシエチル修飾のないヌクレオチドを有する領域とは化学的に異なる。
「キメラアンチセンス化合物」は、少なくとも2つの化学的に異なる領域を有するアンチセンス化合物を意味する。
「同時投与」は、2以上の薬剤の個体への投与を意味する。2以上の薬剤は、単一の医薬組成物にあっても、別々の医薬組成物にあってもよい。2以上の薬剤のそれぞれは、同じ又は異なる投与経路を介して投与してよい。同時投与には、並行又は連続の投与が含まれる。
「凝固因子」は、血液凝固カスケード中の第I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、又はTAFI因子のいずれも意味する。「凝固因子核酸」は、凝固因子をコードするあらゆる核酸を意味する。例えば、ある態様において、凝固因子核酸には、制限なしに、凝固因子をコードするDNA配列（イントロン及びエクソンを含んでなるゲノムDNAが含まれる）、凝固因子をコードするDNAより転写されたRNA配列、及び凝固因子をコードするmRNA配列が含まれる。「凝固因子mRNA」は、凝固因子タンパク質をコードするmRNAを意味する。
「相補性」は、第一核酸のヌクレオ塩基と第二核酸のヌクレオ塩基の間で対合する能力を意味する。
「連続ヌクレオ塩基」は、互いにすぐ隣りにあるヌクレオ塩基を意味する。
「希釈剤」は、薬理活性を欠くが、製剤的に必要であるか又は望ましい、組成物中の成分を意味する。例えば、注射用組成物中の希釈剤は、液剤、例えば、生理食塩水溶液であり得る。
「用量」は、単一の投与において、又は特定の時間帯において提供される薬剤の特定量を意味する。ある態様において、用量は、1、2、又はより多くのボーラス、錠剤、又は注射剤で投与してよい。例えば、皮下投与が所望される態様において、所望される用量は、単一の注射剤によっては容易に提供されない容量が求められるので、2以上の注射剤を使用して、所望の用量を達成してよい。ある態様において、薬剤は、注入によって、延長された時間帯にわたるか又は連続的に投与される。用量は、1時間、1日、1週、又は1月あたりの薬剤の量として述べられる場合がある。
「有効量」は、活性薬剤を必要とする個体において所望の生理学的アウトカムを産出するのに十分なその薬剤の量を意味する。有効量は、治療される個体の健康及び身体状態、治療される個体の分類学的な群、組成物の製剤、個体の医学的状態の評価、及び他の関連要因に依存して、個体間で変動する場合がある。
「第11因子核酸」又は「第XI因子核酸」又は「F11核酸」又は「FXI核酸」は、第11因子をコードするあらゆる核酸を意味する。例えば、ある態様において、第11因子核酸には、第11因子をコードするDNA配列、第11因子をコードするDNA（イントロン及びエクソンを含んでなるゲノムDNAが含まれる）より転写されたRNA配列、及び第11因子をコードするmRNA配列が含まれる。「第11因子mRNA」は、第11因子タンパク質をコードするmRNAを意味する。
「第11因子特異的阻害剤」は、第11因子mRNA及び／又は第11因子タンパク質の分子レベルでの発現を特異的に阻害することが可能なあらゆる薬剤に言及する。例えば、第11因子特異的阻害剤には、第11因子mRNA及び／又は第11因子タンパク質の発現を阻害することが可能な核酸（アンチセンス化合物が含まれる）、ペプチド、抗体、低分子、及び他の薬剤が含まれる。ある態様において、第11因子mRNA発現及び／又は第11因子タンパク質発現を特異的に調節することによって、第11因子特異的阻害剤は、下流成分が含まれる、凝固カスケードの他の成分に影響を及ぼす場合がある。同様に、ある態様において、第11因子特異的阻害剤は、動物中の他の分子プロセスに影響を及ぼす場合がある。
「第11因子特異的阻害剤解毒薬」は、第11因子特異的阻害剤の効果を減少させることが可能な化合物を意味する。ある態様において、第11因子特異的阻害剤解毒薬は、第11因子ペプチド；第11因子解毒オリゴヌクレオチド（第11因子アンチセンス化合物に相補的な第11因子解毒化合物が含まれる）；及び内因系又は外因系の凝固経路に影響を及ぼすあらゆる化合物又はタンパク質より選択される。
「完全に相補的」又は「100％相補的」は、第一核酸の各ヌクレオ塩基が第二核酸において相補的なヌクレオ塩基を有することを意味する。ある態様では、第一核酸がアンチセンス化合物であって、標的核酸が第二核酸である。
「ギャップマー」は、RNアーゼH切断を支援する複数のヌクレオシドを有する内部領域が1以上のヌクレオシドを有する外部領域の間に位置するキメラアンチセンス化合物を意味して、ここで内部領域を含んでなるヌクレオシドは、外部領域を含んでなる単数又は複数のヌクレオシドとは化学的に異なる。内部領域は、「ギャップセグメント」と呼ばれる場合があり、外部領域は、「ウィングセグメント」と呼ばれる場合がある。
「ギャップ拡張」は、12以上の連続した2'-デオキシリボヌクレオシドのギャップセグメントが、1〜6のヌクレオシドを有する5'及び3'ウィングセグメントの間に、そしてそのすぐ隣りに位置するキメラアンチセンス化合物を意味する。
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸分子のアニーリングを意味する。ある態様において、相補的な核酸分子には、アンチセンス化合物と標的核酸が含まれる。
「血栓塞栓合併症のリスク状態にある動物を同定すること」は、血栓塞栓合併症と診断された動物を同定すること、又は血栓塞栓合併症を発症する素因がある動物を同定することを意味する。血栓塞栓合併症を発症する素因がある個体には、不動性状態、外科手術（特に、整形外科手術）、悪性腫瘍、妊娠、高齢、経口避妊薬の使用、及び先天的又は後天的な血栓形成促進性の凝固障害が含まれる、血栓塞栓合併症の1以上の危険因子を有するものが含まれる。そのような同定は、個体の病歴を評価することと標準的な臨床検査又は評価が含まれる、どの方法によっても達成してよい。
「すぐ隣り」は、すぐ隣りの要素の間に介在する要素がないことを意味する。
「個体」は、治療又は療法のために選択されるヒト又は非ヒト動物を意味する。
「ヌクレオシド間連結」は、ヌクレオシド間の化学結合に言及する。
「連結ヌクレオシド」は、互いに結合している隣接ヌクレオシドを意味する。
「ミスマッチ」又は「非相補的なヌクレオ塩基」は、第一核酸のヌクレオ塩基が第二又は標的核酸の対応するヌクレオ塩基と対合することが可能でない場合に言及する。
「修飾ヌクレオシド間連結」は、天然に存在するヌクレオシド間結合（即ち、ホスホジエステルヌクレオシド間結合）からの置換又はあらゆる変化に言及する。
「修飾ヌクレオ塩基」は、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、又はウラシル以外のあらゆるヌクレオ塩基に言及する。「非修飾ヌクレオ塩基」は、プリン塩基のアデニン（A）及びグアニン（G）と、ピリミジン塩基のチミン（T）、シトシン（C）、及びウラシル（U）を意味する。
「修飾ヌクレオチド」は、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間連結、又は修飾ヌクレオ塩基を独立的に有するヌクレオチドを意味する。「修飾ヌクレオシド」は、修飾糖部分又は修飾ヌクレオ塩基を独立的に有するヌクレオシドを意味する。
「修飾オリゴヌクレオチド」は、修飾ヌクレオシド間連結、修飾糖、又は修飾ヌクレオ塩基を含んでなるオリゴヌクレオチドを意味する。
「修飾糖」は、天然糖からの置換又は変化に言及する。
「モチーフ」は、アンチセンス化合物中の化学的に異なる領域のパターンを意味する。
「天然に存在するヌクレオシド間連結」は、3'から5'へのホスホジエステル連結を意味する。
「天然糖部分」は、DNA（2'-H）又はRNA（2'-OH）に見出される糖を意味する。
「核酸」は、モノマーヌクレオチドより構成される分子に言及する。核酸には、リボ核酸（RNA）、デオキシリボ核酸（DNA）、一本鎖核酸、二本鎖核酸、低分子干渉リボ核酸（siRNA）、及びミクロRNA（miRNA）が含まれる。
「ヌクレオ塩基」は、別の核酸の塩基と対合することが可能な複素環式部分を意味する。
「ヌクレオ塩基配列」は、どの糖、連結、又はヌクレオ塩基の修飾とも無関係な、連続ヌクレオ塩基の順序を意味する。
「ヌクレオシド」は、糖へ連結したヌクレオ塩基を意味する。
「ヌクレオシド模倣体」には、例えば、モルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、二環若しくは三環糖模倣体（例、非フラノース糖単位）を有するヌクレオシド模倣体のように、オリゴマー化合物の1以上の位置で、その糖、又はその糖と塩基、そして（必ずではないが）連結を置き換えるために使用される構造が含まれる。ヌクレオチド模倣体には、例えば、ペプチド核酸又はモルホリノ（-N（H）-C（＝O）-O-又は他の非ホスホジエステル連結によって連結されるモルホリノ）のように、オリゴマー化合物の1以上の位置で、そのヌクレオシドとその連結を置き換えるために使用される構造が含まれる。糖代用物は、やや広義では、ヌクレオシド模倣体と重なるが、糖単位（フラノース環）の置き換えだけを示すものとする。本明細書に提供されるテトラヒドロピラニル環は、フラノース糖基がテトラヒドロピラニル環系で置き換えられた糖代用物の1例の例示である。
「ヌクレオチド」は、リン酸基がヌクレオシドの糖部分へ共有結合したヌクレオシドを意味する。
「オリゴマー化合物」又は「オリゴマー」は、核酸分子の少なくとも1つの領域へハイブリダイズすることが可能である、連結したモノマーサブユニットのポリマーを意味する。
「オリゴヌクレオチド」は、そのそれぞれが互いに独立して修飾又は非修飾であり得る、連結ヌクレオシドのポリマーを意味する。
「非経口投与」は、注射又は注入による投与を意味する。非経口投与には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は頭蓋内投与（例、鞘内又は脳室内投与）が含まれる。
「ペプチド」は、少なくとも2つのアミノ酸をアミド結合によって連結することによって形成される分子を意味する。ペプチドは、ポリペプチド及びタンパク質に言及する。
「医薬組成物」は、個体へ投与するのに適した物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は、1以上の活性薬剤と無菌の水溶液剤を含む場合がある。
「医薬的に許容される塩」は、アンチセンス化合物の生理学的及び医薬的に許容される塩、即ち、元のオリゴヌクレオチドの所望される生理活性を保持して、望まれない毒性効果をそれへ付与しない塩を意味する。
「ホスホロチオエート連結」は、非架橋酸素原子の1つをイオウ原子で置き換えることによってホスホジエステル結合が修飾される、ヌクレオシド間の連結を意味する。ホスホロチオエート連結（P＝S）は、修飾ヌクレオシド間連結である。
「部分」は、核酸の一定数の連続（即ち、連結）ヌクレオ塩基を意味する。ある態様において、「部分」は、標的核酸の一定数の連続ヌクレオ塩基である。ある態様において、「部分」は、アンチセンス化合物の一定数の連続ヌクレオ塩基である。
「予防する」は、疾患、障害、又は状態の発現又は発症を数分〜無期限の時間帯の間遅らせるか又は牽制することに言及する。「予防する」は、疾患、障害、又は状態を発症するリスクを低下させることも意味する。
「プロドラッグ」は、不活性型で製造されて、内因性の酵素又は他の化学品又は条件の作用によって身体又はその細胞の内部で活性型へ変換される治療薬剤を意味する。
「副作用」は、治療薬に起因する、望まれる効果以外の生理学的反応を意味する。ある態様において、副作用には、注射部位での反応、肝機能検査異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系の異常、ミオパシー、及び倦怠感が含まれる。例えば、血清アミノトランスフェラーゼレベルの増加は、肝毒性又は肝機能異常を示す場合がある。例えば、ビリルビンの増加は、肝毒性又は肝機能異常を示す場合がある。
「一本鎖オリゴヌクレオチド」は、相補鎖へハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドを意味する。
「特異的にハイブリダイズし得る」は、所望の効果を引き起こすのに十分な度合いの相補性をアンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸の間に有する一方で、特異結合が所望される条件の下で（即ち、in vivo アッセイや療法的治療の場合の生理学的条件の下で）、非標的核酸に対してはほとんど又は全く効果を示さないアンチセンス化合物に言及する。
「標的指向する」又は「標的指向される」は、標的核酸へ特異的にハイブリダイズして、所望の効果を引き起こすアンチセンス化合物の設計及び選択の方法を意味する。
「標的核酸」、「標的RNA」、及び「標的RNA転写物」は、いずれも、アンチセンス化合物によって標的指向されることが可能な核酸に言及する。
「標的セグメント」は、アンチセンス化合物が標的指向される、標的核酸のヌクレオチドの配列を意味する。「5'標的部位」は、標的セグメントの5'端ヌクレオチドに言及する。「3'標的部位」は、標的セグメントの3'端ヌクレオチドに言及する。
「治療有効量」は、個体へ治療利益をもたらす薬剤の量を意味する。
「血栓塞栓合併症」は、血栓に起因する塞栓症を伴うあらゆる疾患、障害、又は状態を意味する。そのような疾患、障害、及び状態の例には、血栓症、塞栓症、及び血栓塞栓症のカテゴリーが含まれる。ある態様において、そのような疾患、障害、及び状態には、深在性静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、及び卒中が含まれる。
「治療する」は、疾患、障害、又は状態の変化又は改善をもたらすために医薬組成物を投与することに言及する。
「非修飾ヌクレオチド」は、天然に存在するヌクレオ塩基、糖部分、及びヌクレオシド間連結より構成されるヌクレオチドを意味する。ある態様において、非修飾ヌクレオチドは、RNAヌクレオチド（即ち、β-D-リボヌクレオシド）又はDNAヌクレオチド（即ち、β-D-デオキシリボヌクレオシド）である。
諸態様
本発明の態様は、第11因子mRNA及びタンパク質の発現を減少させるための方法、化合物、及び組成物を提供する。
本発明の態様は、第11因子に関連した疾患、障害、及び状態の治療、予防、又は改善を必要とする個体においてそれをするための方法、化合物、及び組成物を提供する。また考慮されるのは、第11因子に関連した疾患、障害、又は状態の治療、予防、又は改善のための医薬品の製造のための方法及び化合物である。第11因子関連の疾患、障害、及び状態には、血栓症、塞栓症、血栓塞栓症、深在性静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、及び卒中のような血栓塞栓合併症が含まれる。
本発明の態様は、第11因子特異的阻害剤を、第11因子関連疾患を治療すること、予防すること、又は改善することにおける使用に提供する。ある態様において、第11因子特異的阻害剤は、第11因子mRNA及び／又は第11因子タンパク質の発現を阻害することが可能な、核酸（アンチセンス化合物が含まれる）、ペプチド、抗体、低分子、及び他の薬剤である。
本発明のある態様において、第11因子特異的阻害剤は、限定されないが、J Clin Invest 1982, 69:844-852 に記載のようなα1プロテアーゼ阻害剤、アンチトロンビンIII、C1阻害剤、及びα2プラスミン阻害剤；Thromb Res 1987, 48:145-151 に記載のようなα1アンチトリプシン（α1AT）；USPPN 2008/021998 及び Blood 1998, 92: 4198-206 に記載のような第11因子ペプチド阻害剤；Thromb Res 2001, 104: 451-465 に記載のようなMAP4-RGKWC；Proc Natl Acad Sci 2004, 101: 3939-44 に記載のようなβ2GPI；Eur J Biochem 1999, 262: 915-923 に記載のようなレンチナス（Lentinus）プロテイナーゼ阻害剤；J Biol Chem 2004, 279: 29485-29492 に記載のようなプロテアーゼネキシン-2／アミロイドβタンパク質前駆体クニッツ（Kunitz）ドメイン阻害剤（APPI）及びアンチトロンビン（AT）；及び、J Biol Chem 2005, 280: 23523-30 に記載のようなアプロチニンといった、ペプチド又はタンパク質である。
本発明のある態様において、第11因子特異的阻害剤は、限定されないが、Blood 1988, 72: 1748-54 に記載のようなウィンストン-セーラム（Winston-Salem）（IgG3κ）及びボルチモア（Baltimore）（IgG1κ）；J Biol Chem 1985, 260 10714-719 に記載のような5F4、3C1、及び1F1；Throm Haemost 1990, 63: 417-23 に記載のようなモノクローナル抗体；J Thromb Haem 2006, 4: 1496-1501 に記載のようなXI-5108；Thromb Res 1986, 42:225-34 に記載のようなモノクローナル抗体4-1；及び、USPN6,566,140の実施例19に記載のようなアブシキシマブ抗体といった、抗体である。
本発明のある態様において、第11因子特異的阻害剤は、限定されないが、フルオロリン酸ジイソプロピル（DFP）；USPPN2004/0180855 の実施例1〜7に記載のような低分子阻害剤；及び、J Biol Chem 2005, 280: 23523-30 に記載のようなp-アミノベンズアミジン（pAB）といった、低分子である。
本発明の態様は、本明細書に記載のような第11因子特異的阻害剤を、血栓症、塞栓症、血栓塞栓症、深在性静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、及び卒中のような血栓塞栓合併症を治療、予防、又は改善することにおける使用に提供する。
本発明の態様は、本明細書に記載のような第11因子特異的阻害剤の、血栓症、塞栓症、血栓塞栓症、深在性静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、及び卒中のような血栓塞栓合併症を治療、改善、又は予防するための医薬品の製造における使用を提供する。
本発明の態様は、本明細書に記載のような第11因子特異的阻害剤を、本明細書に記載のような血栓塞栓合併症を本明細書に記載のような追加の薬剤又は療法との組合せ療法によって治療、予防、又は改善することにおける使用に提供する。薬剤又は療法は、同時投与しても、併用的に投与してもよい。
本発明の態様は、本明細書に記載のような第11因子特異的阻害剤の、本明細書に記載のような血栓塞栓合併症を本明細書に記載のような追加の薬剤又は療法との組合せ療法によって治療、予防、又は改善するための医薬品の製造における使用を提供する。薬剤又は療法は、同時投与しても、併用的に投与してもよい。
本発明の態様は、本明細書に記載のような第11因子特異的阻害剤の、本明細書に記載のような血栓塞栓合併症を、本明細書に記載のような追加の薬剤又は療法を後に投与される患者において治療、予防、又は改善するための医薬品の製造における使用を提供する。
本発明の態様は、本明細書に記載のような血栓塞栓合併症を治療、予防、又は改善するためのキットを提供し、ここで該キットは：
（i）本明細書に記載のような第11因子特異的阻害剤；及び、代替的に
（ii）本明細書に記載のような追加の薬剤又は療法を含む。
本発明のキットには、本明細書に記載のような血栓塞栓合併症を本明細書に記載のような組合せ療法によって治療、予防、又は改善するキットを使用するための説明書をさらに含めてよい。
本発明の態様は、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物を提供する。ある態様において、第11因子核酸は、GENBANK登録番号NM_000128.3（本明細書では、SEQ ID NO: 1として取り込む）、GENBANK登録番号NT_022792.17［19598000〜19624000が切断された］（本明細書では、SEQ ID NO: 2として取り込む）、GENBANK登録番号NM_028066.1（本明細書では、SEQ ID NO: 6として取り込む）、エクソン1〜15 GENBANK登録番号NW_001118167.1（本明細書では、SEQ ID NO: 274として取り込む）に示される配列のいずれでもよい。
ある態様において、本発明は、修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。ある態様において、本発明の化合物は、12〜30の連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。
ある態様において、本発明の化合物は、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含み得る。ある態様において、本発明の化合物は、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含み得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基656〜676の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基656〜676の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも80％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基665〜687の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基665〜687の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも50％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基675〜704の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基675〜704の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも50％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基677〜704の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基677〜704の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも60％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基678〜697の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基678〜697の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも70％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基680〜703の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基680〜703の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3及び実施例30に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも80％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基683〜702の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基683〜702の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも90％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基738〜759の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基738〜759の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3及び実施例30に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも80％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基738〜760の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基738〜760の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも60％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基738〜762の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基738〜762の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも45％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1018〜1042の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1018〜1042の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも80％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1062〜1089の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1062〜1089の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも70％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1062〜1090の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1062〜1090の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも60％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1062〜1091の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1062〜1091の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも20％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1275〜1301の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1275〜1301の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも80％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1276〜1301の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1276〜1301の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも80％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1284〜1308の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1284〜1308の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも80％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1291〜1317の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1291〜1317の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも80％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1275〜1318の少なくとも一部分に相補的なヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1275〜1318の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18又は20の連続ヌクレオ塩基を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、又は少なくとも99％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1の等しい長さ部分に100％相補的なヌクレオ塩基配列を含み得る。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも70％の阻害を達成し得る。
本発明の態様は、12〜30の連結ヌクレオシドからなり、SEQ ID NO: 15〜241に引用されるヌクレオ塩基配列の間より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、又は20の連続ヌクレオ塩基を含んでなるヌクレオ塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。
本発明の態様は、12〜30の連結ヌクレオシドからなり、SEQ ID NO: 15〜269に引用されるヌクレオ塩基配列の間より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、又は20の連続ヌクレオ塩基を含んでなるヌクレオ塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。
本発明の態様は、12〜30の連結ヌクレオシドからなり、SEQ ID NO: 242〜269に引用されるヌクレオ塩基配列の間より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、又は20の連続ヌクレオ塩基を含んでなるヌクレオ塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。
ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、ISIS番号22、31、32、34、36〜38、40、41、43、51〜53、55、56、59、60、64、66、71、73、75、96、98〜103、105〜109、113〜117、119、124、127、129、171、172、174、176、178、179、181〜197、199〜211、及び213〜232より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、又は少なくとも18のヌクレオ塩基を含む。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 22、31、32、34、36〜38、40、41、43、51〜53、55、56、59、60、64、66、71、73、75、96、98〜103、105〜109、113〜117、119、124、127、129、171、172、174、176、178、179、181〜197、199〜211、及び213〜232より選択されるヌクレオ塩基配列を含む。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 22、31、32、34、36〜38、40、41、43、51〜53、55、56、59、60、64、66、71、73、75、96、98〜103、105〜109、113〜117、119、124、127、129、171、172、174、176、178、179、181〜197、199〜211、及び213〜232より選択されるヌクレオ塩基配列からなる。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも70％の阻害を達成し得る。
ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、ISIS番号22、31、34、37、40、43、51〜53、60、98、100〜102、105〜109、114、115、119、171、174、176、179、181、186、188〜193、195、196、199〜210、及び213〜232より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、又は少なくとも18のヌクレオ塩基を含む。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 22、31、34、37、40、43、51〜53、60、98、100〜102、105〜109、114、115、119、171、174、176、179、181、186、188〜193、195、196、199〜210、及び213〜232より選択されるヌクレオ塩基配列を含む。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 22、31、34、37、40、43、51〜53、60、98、100〜102、105〜109、114、115、119、171、174、176、179、181、186、188〜193、195、196、199〜210、及び213〜232より選択されるヌクレオ塩基配列からなる。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも80％の阻害を達成し得る。
ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、ISIS番号31、37、100、105、179、190〜193、196、202〜207、209、210、214〜219、221〜224、226、227、229、及び231より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、又は少なくとも18のヌクレオ塩基を含む。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 31、37、100、105、179、190〜193、196、202〜207、209、210、214〜219、221〜224、226、227、229、及び231より選択されるヌクレオ塩基配列を含む。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 31、37、100、105、179、190〜193、196、202〜207、209、210、214〜219、221〜224、226、227、229、及び231より選択されるヌクレオ塩基配列からなる。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例3に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも90％の阻害を達成し得る。
ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 34、52、53、114、115、190、213〜232、242〜260、及び262〜266より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、又は少なくとも18のヌクレオ塩基を含む。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 34、52、53、114、115、190、213〜232、242〜260、及び262〜266より選択されるヌクレオ塩基配列を含む。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 34、52、53、114、115、190、213〜232、242〜260、及び262〜266より選択されるヌクレオ塩基配列からなる。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例30に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも70％の阻害を達成し得る。
ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 34、52、53、114、115、190、213〜216、218〜226、243〜246、248、249、252〜259、264、及び265より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、又は少なくとも18のヌクレオ塩基を含む。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 34、52、53、114、115、190、213〜216、218〜226、243〜246、248、249、252〜259、264、及び265より選択されるヌクレオ塩基配列を含む。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 34、52、53、114、115、190、213〜216、218〜226、243〜246、248、249、252〜259、264、及び265より選択されるヌクレオ塩基配列からなる。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例30に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも80％の阻害を達成し得る。
ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 34、190、215、222、223、226、246、及び254より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、又は少なくとも18のヌクレオ塩基を含む。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 34、190、215、222、223、226、246、及び254より選択されるヌクレオ塩基配列を含む。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 34、190、215、222、223、226、246、及び254より選択されるヌクレオ塩基配列からなる。前記修飾オリゴヌクレオチドは、RT-PCRアッセイ法を（例えば、実施例30に記載のように）任意選択的にHepG2細胞で使用して定量されるように、ヒトmRNAレベルの少なくとも90％の阻害を達成し得る。
ある態様において、本化合物は、一本鎖修飾オリゴヌクレオチドからなる。
ある態様において、その修飾オリゴヌクレオチドは、20の連結ヌクレオシドからなる。
ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオ塩基配列は、SEQ ID NO: 1又はSEQ ID NO: 2又はSEQ ID NO: 6又はSEQ ID NO: 274のヌクレオ塩基配列に100％相補的である。
ある態様において、本化合物は、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間連結を有する。ある態様において、そのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。
ある態様において、本化合物は、修飾糖を含んでなる少なくとも1つのヌクレオシドを有する。ある態様において、少なくとも1つの修飾糖は、二環糖である。ある態様において、少なくとも1つの修飾糖は、2'-O-メトキシエチルを含む。
本発明の態様は、12〜30の連結ヌクレオシドからなり、SEQ ID NO: 15〜241、SEQ ID NO: 15〜269、又はSEQ ID NO: 242〜269に引用されるヌクレオ塩基配列の間より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、又は20の連続ヌクレオ塩基を含んでなるヌクレオ塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供し、ここで少なくとも1つのヌクレオシドは、修飾糖を含む。
ある態様において、前記少なくとも1つの修飾糖は、二環糖である。
ある態様において、前記少なくとも1つの二環糖は、4'-（CH2）n-O-2'架橋（ここでnは、1又は2である）を含む。
ある態様において、前記少なくとも1つの二環糖は、4'-CH（CH3）-O-2'架橋を含む。
ある態様において、前記少なくとも1つの修飾糖は、2'-O-メトキシエチル基を含む。
本発明の態様は、12〜30の連結ヌクレオシドからなり、SEQ ID NO: 15〜241、SEQ ID NO: 15〜269、又はSEQ ID NO: 242〜269に引用されるヌクレオ塩基配列の間より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、又は20の連続ヌクレオ塩基を含んでなるヌクレオ塩基配列を有して、少なくとも1つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシド（ここでは、テトラヒドロピラン環がフラノース環に置き換わっている）を含んでなる、修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供する。
ある態様において、前記少なくとも1つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドは、構造：
Figure 2012505660
を有する。
ある態様において、本化合物は、修飾ヌクレオ塩基を含んでなる、少なくとも1つのヌクレオシドを有する。ある態様において、修飾ヌクレオ塩基は、5-メチルシトシンである。
ある態様において、本化合物の修飾オリゴヌクレオチドは：
（i）連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
（ii）連結ヌクレオシドからなる5'ウィングセグメント；
（iii）連結ヌクレオシドからなる3'ウィングセグメントを含み、ここでギャップセグメントは、5'ウィングセグメントと3'ウィングセグメントのすぐ隣りでその間に位置して、そしてここでそれぞれのウィングセグメントのそれぞれのヌクレオシドは、修飾糖を含む。いくつかのそのような態様において、修飾オリゴヌクレオチド中のそれぞれのシトシンは、5-メチルシトシンである。
ある態様において、本化合物の修飾オリゴヌクレオチドは：
（i）10の連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
（ii）5の連結ヌクレオシドからなる5'ウィングセグメント；
（iii）5の連結ヌクレオシドからなる3'ウィングセグメントを含み、ここでギャップセグメントは、5'ウィングセグメントと3'ウィングセグメントのすぐ隣りでその間に位置して、そしてここでそれぞれのウィングセグメントのそれぞれのヌクレオシドは、2'-O-メトキシエチル糖を含み；そしてここでそれぞれのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート連結である。いくつかのそのような態様において、修飾オリゴヌクレオチド中のそれぞれのシトシンは、5-メチルシトシンである。
ある態様において、本化合物の修飾オリゴヌクレオチドは：
（i）14の連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
（ii）3の連結ヌクレオシドからなる5'ウィングセグメント；
（iii）3の連結ヌクレオシドからなる3'ウィングセグメントを含み、ここでギャップセグメントは、5'ウィングセグメントと3'ウィングセグメントのすぐ隣りでその間に位置して、そしてここでそれぞれのウィングセグメントのそれぞれのヌクレオシドは、2'-O-メトキシエチル糖を含み；そしてここでそれぞれのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート連結である。いくつかのそのような態様において、修飾オリゴヌクレオチド中のそれぞれのシトシンは、5-メチルシトシンである。
ある態様において、本化合物の修飾オリゴヌクレオチドは：
（i）13の連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
（ii）2の連結ヌクレオシドからなる5'ウィングセグメント；
（iii）5の連結ヌクレオシドからなる3'ウィングセグメントを含み、ここでギャップセグメントは、5'ウィングセグメントと3'ウィングセグメントのすぐ隣りでその間に位置して、そしてここでそれぞれのウィングセグメントのそれぞれのヌクレオシドは、2'-O-メトキシエチル糖を含み；そしてここでそれぞれのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート連結である。いくつかのそのような態様において、修飾オリゴヌクレオチド中のそれぞれのシトシンは、5-メチルシトシンである。
本発明の態様は、12〜30の連結ヌクレオシドからなり、SEQ ID NO: 15〜241に引用されるヌクレオ塩基配列の間より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも12の連続ヌクレオ塩基を含んでなるヌクレオ塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチド又はその塩と医薬的に許容される担体又は希釈剤を含んでなる組成物を提供する。
本発明の態様は、12〜30の連結ヌクレオシドからなり、SEQ ID NO: 15〜269に引用されるヌクレオ塩基配列の間より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも12の連続ヌクレオ塩基を含んでなるヌクレオ塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチド又はその塩と医薬的に許容される担体又は希釈剤を含んでなる組成物を提供する。
本発明の態様は、12〜30の連結ヌクレオシドからなり、SEQ ID NO: 241〜269に引用されるヌクレオ塩基配列の間より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも12の連続ヌクレオ塩基を含んでなるヌクレオ塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチド又はその塩と医薬的に許容される担体又は希釈剤を含んでなる組成物を提供する。
本発明の態様は、12〜30の連結ヌクレオシドからなり、SEQ ID NO: 15〜241に引用されるヌクレオ塩基配列の間より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも8の連続ヌクレオ塩基を含んでなるヌクレオ塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を動物へ投与することを含んでなる方法を提供する。
本発明の態様は、12〜30の連結ヌクレオシドからなり、SEQ ID NO: 15〜269に引用されるヌクレオ塩基配列の間より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも8の連続ヌクレオ塩基を含んでなるヌクレオ塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を動物へ投与することを含んでなる方法を提供する。
本発明の態様は、12〜30の連結ヌクレオシドからなり、SEQ ID NO: 241〜269に引用されるヌクレオ塩基配列の間より選択されるヌクレオ塩基配列の少なくとも8の連続ヌクレオ塩基を含んでなるヌクレオ塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を動物へ投与することを含んでなる方法を提供する。
ある態様において、動物は、ヒトである。
ある態様において、「投与すること」は、深在性静脈血栓症又は肺塞栓症を予防する。
ある態様において、本化合物は、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、ヘパリン、レピルジン、チクロピジン、ワルファリン、アピキサバン、リバロキサバン、及びLOVENOX（ロベノックス）より選択される群のいずれとも同時投与される。
ある態様において、本化合物は、どの第Xa因子阻害剤とも同時投与される。
ある態様において、第Xa因子阻害剤は、リバロキサバン（Rivaroxaban）、LY517717、YM150、アピキサバン、PRT054021、及びDU-176bのいずれでもよい。
ある態様において、本化合物は、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、ヘパリン、レピルジン、チクロピジン、ワルファリン、アピキサバン、リバロキサバン、及びLOVENOXより選択される群のいずれとも併用投与される。
ある態様において、「投与すること」は、非経口投与である。ある態様において、非経口投与は、皮下又は静脈内投与のいずれでもある。
本発明の態様は、血栓塞栓合併症を発症するリスク状態にある動物を同定すること、及び12〜30の連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物の治療有効量をそのリスク状態の動物へ投与することを含んでなる方法を提供し、ここで修飾オリゴヌクレオチドは、第11因子核酸に相補的である。
ある態様において、血栓塞栓合併症は、深在性静脈血栓症、肺塞栓症、又はそれらの組合せである。
本発明の態様は、凝固障害を有する動物を同定すること、及び12〜30の連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物の治療有効量をその動物へ投与することを含んでなる方法を提供し、ここで修飾オリゴヌクレオチドは、第11因子核酸に相補的である。
ある態様において、本化合物は、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、ヘパリン、レピルジン、チクロピジン、ワルファリン、アピキサバン、リバロキサバン、及びLOVENOXより選択される群のいずれとも同時投与される。
ある態様において、本化合物は、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、ヘパリン、レピルジン、チクロピジン、ワルファリン、アピキサバン、リバロキサバン、及びLOVENOXより選択される群のいずれとも併用投与される。
本発明の態様は、12〜30の連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物の治療有効量を動物へ投与することによって、その動物において血栓塞栓合併症のリスクを低下させることを含んでなる方法を提供し、ここで修飾オリゴヌクレオチドは、第11因子核酸に相補的である。
本発明の態様は、12〜30の連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物の治療有効量を動物へ投与することによって、その動物において凝固障害を治療することを含んでなる方法を提供し、ここで修飾オリゴヌクレオチドは、第11因子核酸に相補的である。
本発明の態様は、12〜30の連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物の治療有効量を動物へ投与することによって、その動物において第11因子発現を阻害することを含んでなる方法を提供し、ここで修飾オリゴヌクレオチドは、第11因子核酸に相補的である。
ある態様において、動物における第11因子阻害は、修飾オリゴヌクレオチドへの解毒薬を投与することによって逆転される。
ある態様において、解毒薬は、修飾オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドである。
アンチセンス化合物
オリゴマー化合物には、限定されないが、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びsiRNAが含まれる。オリゴマー化合物は、標的核酸に対して「アンチセンス」で有り得て、それが水素結合により標的核酸へのハイブリダイゼーションを起こすことが可能であることを意味する。
ある態様において、アンチセンス化合物は、5'から3'の方向で書かれるときに、それが標的指向される標的核酸の標的セグメントの逆相補体（reverse complement）を含むヌクレオ塩基配列を有する。あるそのような態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、5'から3'の方向で書かれるときに、それが標的指向される標的核酸の標的セグメントの逆相補体を含むヌクレオ塩基配列を有する。
ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物は、長さが12〜30のサブユニットである。言い換えると、そのようなアンチセンス化合物は、12〜30の連結サブユニットである。他の態様において、アンチセンス化合物は、8〜80、12〜50、15〜30、18〜24、19〜22、又は20の連結サブユニットである。あるそのような態様において、アンチセンス化合物は、長さが8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、又は80の連結サブユニット、又は上記数値の任意の2つによって画定される範囲である。いくつかの態様において、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、そして連結サブユニットは、ヌクレオチドである。
ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、短縮又は先端切断されてよい。例えば、単一のサブユニットは、5'端より欠失（5'先端切断）しても、あるいは3'端より欠失（3'先端切断）してもよい。第11因子核酸へ標的指向される、短縮又は先端切断されたアンチセンス化合物は、そのアンチセンス化合物の5'端より2つのサブユニットが欠失しても、あるいはその3'端より2つのサブユニットが欠失してもよい。あるいは、欠失したヌクレオシドは、アンチセンス化合物全体に分散してよく、例えば、あるアンチセンス化合物では、1つのヌクレオシドが5'端より欠失して、1つのヌクレオシドが3'端より欠失している。
延長されたアンチセンス化合物中に単一の付加サブユニットが存在するとき、付加サブユニットは、アンチセンス化合物の5'又は3'端に位置してよい。2以上の付加サブユニットが存在するとき、この付加サブユニットは、互いに隣接してよく、例えば、あるアンチセンス化合物では、2つのサブユニットがそのアンチセンス化合物の5'端へ付加（5'付加）しても、あるいは、3'端へ付加（3'付加）してもよい。あるいは、付加サブユニットは、アンチセンス化合物全体に分散してよく、例えば、あるアンチセンス化合物では、1つのサブユニットが5'端へ付加して、1つのサブユニットが3'端へ付加している。
活性を消失させること無く、アンチセンスオリゴヌクレオチドのようなアンチセンス化合物の長さを増加させるか又は減少させること、及び／又はミスマッチ塩基を導入することが可能である。例えば、Woolf et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7305-7309, 1992）では、長さが13〜25ヌクレオ塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドの系列について、卵母細胞注入モデルにおいて標的RNAの切断を誘導するその能力が試験された。アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端付近に8又は11のミスマッチ塩基がある、長さが25ヌクレオ塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチを含有しないアンチセンスオリゴヌクレオチドより低い程度であったが、標的mRNAの特異的な切断を指令することができた。同様に、1又は3のミスマッチがあるものが含まれる、13ヌクレオ塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、標的特異的な切断が達成された。
Gautschi et al（J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001）は、bcl-2 mRNAへの100％相補性を有して、bcl-xL mRNAに対して3つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドがbcl-2とbcl-xLの両方の発現を in vitro と in vivo で低下させる能力を実証した。さらに、このオリゴヌクレオチドは、強力な抗腫瘍活性を in vivo で明示した。
Maher and Dolnick（Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358, 1988）は、タンデム14ヌクレオ塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドの系列と、このタンデムアンチセンスオリゴヌクレオチドの2又は3の配列より構成される、それぞれ28及び42のヌクレオ塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、ウサギ網状赤血球アッセイにおいてヒトDHFRの翻訳を阻止するその能力を試験した。3つの14ヌクレオ塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれは、28又は42のヌクレオ塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドより控え目なレベルであるものの、単独で翻訳を阻害することができた。
アンチセンス化合物モチーフ
ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物は、阻害活性の増強、標的核酸への結合親和性の増加、又は in vivo ヌクレアーゼによる分解への抵抗性といった特性をそのアンチセンス化合物へ付与する、パターン配置された化学修飾サブユニット、又はモチーフを有する。
キメラアンチセンス化合物は、典型的には、ヌクレアーゼ分解への抵抗性増加、細胞取込み増加、標的核酸への結合親和性の増加、及び／又は阻害活性の増加を付与するように修飾された、少なくとも1つの領域を含有する。キメラアンチセンス化合物の第二領域は、RNA：DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼRNアーゼHの基質として役立ってもよい。
ギャップマーモチーフを有するアンチセンス化合物は、キメラアンチセンス化合物とみなされる。ギャップマーでは、RNアーゼH切断を支援する複数のヌクレオチドを有する内部領域が、内部領域のヌクレオシドとは化学的に異なる複数のヌクレオチドを有する外部領域の間に位置する。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ウィングセグメントが修飾ヌクレオシドを含むのに対し、ギャップセグメントは、エンドヌクレアーゼ切断の基質として概して役立つ。ある態様において、ギャップマーの領域は、それぞれ異なる領域を含んでなる糖部分の種類によって区別される。ギャップマーの領域を区別するために使用される糖部分の種類には、いくつかの態様において、β-D-リボヌクレオシド、β-D-デオキシリボヌクレオシド、2'-修飾ヌクレオシド（そのような2'-修飾ヌクレオシドには、中でも、2'-MOE、及び2'-O-CH3が含まれ得る）、及び二環糖修飾ヌクレオシド（そのような二環糖修飾ヌクレオシドには、4'-（CH2）n-O-2'架橋を有するものが含まれ得る、ここでn＝1又はn＝2）が含まれ得る。好ましくは、それぞれの異なる領域が均一の糖部分を含む。このウィング-ギャップ-ウィングモチーフは、「X-Y-Z」としばしば記載されて、ここで「X」は5'ウィング領域の長さを表し、「Y」はギャップ領域の長さを表し、そして「Z」は3'ウィング領域の長さを表す。本明細書に使用するように、「X-Y-Z」と記載されるギャップマーは、5'ウィングセグメントと3'ウィングセグメントのそれぞれのすぐ隣りにギャップセグメントが位置するような配置を有する。従って、5'ウィングセグメントとギャップセグメントの間に、又はギャップセグメントと3'ウィングセグメントの間に介在ヌクレオチドは存在しない。本明細書に記載するアンチセンス化合物のいずれも、ギャップマーモチーフを有する可能性がある。いくつかの態様において、XとZは同じであり、他の態様において、それらは異なる。好ましい態様において、Yは、8と15の間のヌクレオチドである。X、Y、又はZは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、又はより多いヌクレオチドのいずれでもあり得る。このように、本発明のギャップマーには、限定されないが、例えば、5-10-5、4-8-4、4-12-3、4-12-4、3-14-3、2-13-5、2-16-2、1-18-1、3-10-3、2-10-2、1-10-1、2-8-2、5-8-5、又は6-8-6が含まれる。
ある態様において、アンチセンス化合物は、ウィング-ギャップ又はギャップ-ウィングの配置、即ち、ギャップマー配置について上記に記載のようなX-Y又はY-Z配置を有する、「ウィングマー」モチーフを有する。このように、本発明のウィングマー配置には、限定されないが、例えば、5-10、8-4、4-12、12-4、3-14、16-2、18-1、10-3、2-10、1-10、8-2、2-13、5-13、5-8、又は6-8が含まれる。
ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物は、5-10-5ギャップマーモチーフを保有する。
ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物は、3-14-3ギャップマーモチーフを保有する。
ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物は、2-13-5ギャップマーモチーフを保有する。
ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物は、5-8-5ギャップマーモチーフを保有する。
ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物は、6-8-6ギャップマーモチーフを保有する。
ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物は、ギャップ拡張モチーフを有する。
ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるギャップ拡張アンチセンスオリゴヌクレオチドは、3つの化学修飾ヌクレオシドのウィングセグメントのすぐ隣りでその間に位置する、14の2'-デオキシリボヌクレオチドのギャップセグメントを有する。ある態様において、化学修飾は、2'-糖修飾を含む。別の態様において、化学修飾は、2'-MOE糖修飾を含む。
ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるギャップ拡張アンチセンスオリゴヌクレオチドは、2つの化学修飾ヌクレオシドの5'ウィングセグメントと5つの化学修飾ヌクレオシドの3'ウィングセグメントのすぐ隣りでその間に位置する、13の2'-デオキシリボヌクレオチドのギャップセグメントを有する。ある態様において、化学修飾は、2'-糖修飾を含む。別の態様において、化学修飾は、2'-MOE糖修飾を含む。
標的核酸、標的領域、及びヌクレオチド配列
第11因子をコードするヌクレオチド配列には、制限なしに、以下が含まれる：GENBANK登録番号NM_000128.3（1999年3月24日にGENBANKに初めて寄託、本明細書では、SEQ ID NO: 1として取り込む）；NT_022792.17［19598000〜19624000が切断された］（2000年11月29日にGENBANKに初めて寄託、本明細書では、SEQ ID NO: 2として取り込む）；GENBANK登録番号NM_028066.1（2002年6月2日にGENBANKに初めて寄託、本明細書では、SEQ ID NO: 6として取り込む）；及び、エクソン1-15 GENBANK登録番号NW_001118167.1（2006年3月28日にGENBANKに初めて寄託、本明細書では、SEQ ID NO: 274として取り込む）。
本明細書に含まれる「実施例」の各SEQ ID NO: に示される配列は、糖部分、ヌクレオシド間連結、又はヌクレオ塩基に対するどの修飾とも無関係であると理解される。それ故に、SEQ ID NO: によって定義されるアンチセンス化合物は、糖部分、ヌクレオシド間連結、又はヌクレオ塩基に対する1以上の修飾を独立的に含んでよい。Isis番号（Isis No）によって記載されるアンチセンス化合物は、ヌクレオ塩基配列とモチーフの組合せを示す。
ある態様において、標的領域は、標的核酸の構造的に規定される領域である。例えば、標的領域には、3'UTR、5'UTR、エクソン、イントロン、エクソン／イントロン接続部分、コーディング領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、又は他の規定核酸領域が含まれ得る。第11因子の構造的に規定される領域は、NCBIのような配列データベースからの登録番号によって入手し得て、そのような情報が参照により本明細書に組み込まれる。ある態様において、標的領域には、標的領域内の1つの標的セグメントの5'標的部位から同じ標的領域内の別の標的セグメントの3'標的部位までの配列が含まれ得る。
標的指向することには、所望の効果が生じるようにアンチセンス化合物がハイブリダイズする、少なくとも1つの標的セグメントの決定が含まれる。ある態様において、所望の効果は、mRNA標的核酸レベルの低下である。ある態様において、所望の効果は、標的核酸によってコードされるタンパク質のレベルの低下、又は標的核酸に関連した表現型の変化である。
標的領域は、1以上の標的セグメントを含有し得る。標的領域内の多数の標的セグメントは、重複してよい。あるいは、それらは、非重複であってよい。ある態様において、標的領域内の標的セグメントは、約300以下のヌクレオチドによって分離している。ある態様において、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上の一定数（即ち、約250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、又は10である、それ以下である、又は先行値の任意の2つによって規定される範囲である）のヌクレオチドによって分離している。ある態様において、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上の5以下、又は約5以下のヌクレオチドによって分離している。ある態様において、標的セグメントは、連続している。考慮されるのは、本明細書に収載される5'標的部位又は3'標的部位のいずれかである開始核酸を有する範囲によって規定される標的領域である。
好適な標的セグメントは、5'UTR、コーディング領域、3'UTR、イントロン、エクソン、又はエクソン／イントロン接続部分の内側に見出し得る。開始コドン又は終止コドンを含有する標的セグメントも、好適な標的セグメントである。好適な標的セグメントには、開始コドン又は終止コドンのような、ある構造的に規定される領域が特異的に排除されてよい。
好適な標的セグメントの決定には、標的核酸の配列を他の配列とゲノム全体で比較することを含めてよい。例えば、BLASTアルゴリズムを使用して、異なる核酸の間で類似した領域を同定することができる。この比較により、選択される標的核酸以外の配列（即ち、非標的又は標的外配列）へ非特異的なやり方でハイブリダイズし得るアンチセンス化合物配列の選択を防ぐことができる。
アンチセンス化合物の活性（例えば、標的核酸レベルの低下パーセントによって明確化されるような）には、活性標的領域の内部で変動があり得る。ある態様において、第11因子mRNAレベルの低下は、第11因子発現の阻害の指標となる。第11因子タンパク質のレベルの低下も、標的mRNA発現の阻害の指標となる。さらに、表現型の変化が、第11因子発現の阻害の指標となる。例えば、aPTT時間の延長は、第11因子発現の阻害の指標となり得る。別の例において、正常なPT時間と連動したaPTT時間の延長は、第11因子発現の阻害の指標となり得る。別の例において、血小板第4因子（PF-4）の量の減少は、第11因子発現の阻害の指標となり得る。別の例において、血栓形成の低下、又は血栓形成時間の増加は、第11因子発現の阻害の指標となり得る。
ハイブリダイゼーション
いくつかの態様では、本明細書に開示のアンチセンス化合物と第11因子核酸の間でハイブリダイゼーションが起こる。最も一般的なハイブリダイゼーションの機序は、核酸分子の相補的なヌクレオ塩基の間での水素結合（例、ワトソン-クリック、フーグスティーン、又は逆フーグスティーン水素結合）を伴う。
ハイブリダイゼーションは、多様な条件の下で起こり得る。ストリンジェント条件は、配列依存的であり、ハイブリダイズされる核酸分子の性質及び組成によって決定される。
ある配列が標的核酸へ特異的にハイブリダイズ可能であるかどうかを判定する方法は、当該技術分野でよく知られている。ある態様において、本明細書に提供するアンチセンス化合物は、第11因子核酸と特異的にハイブリダイズ可能である。
相補性
アンチセンス化合物と標的核酸は、アンチセンス化合物の十分な数のヌクレオ塩基が、所望の効果（例、第11因子核酸のような標的核酸のアンチセンス阻害）が生じるように、標的核酸の対応するヌクレオ塩基と水素結合することができるとき、互いに相補的である。
アンチセンス化合物と第11因子核酸の間の非相補的なヌクレオ塩基は、アンチセンス化合物が標的核酸へ特異的にハイブリダイズすることが可能なままであれば、忍容される場合がある。さらに、アンチセンス化合物は、介在又は隣接セグメント（例、ループ構造、ミスマッチ、又はヘアピン構造）がハイブリダイゼーションイベントに関与しないように、第11因子核酸の1以上のセグメントにわたってハイブリダイズしてよい。
ある態様において、本明細書に提供するアンチセンス化合物又はその特定部分は、第11因子核酸、標的領域、標的セグメント、又はそれらの特定部分に対して、（少なくとも）70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％相補的である。アンチセンス化合物の標的核酸との相補性パーセントは、常法を使用して定量することができる。
例えば、アンチセンス化合物の20ヌクレオ塩基のうち18が標的領域に相補的であり、それ故に特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、90パーセントの相補性を表すだろう。この例において、残る非相補的なヌクレオ塩基は、密集していても、相補的なヌクレオ塩基で分散されてもよく、互いに、又は相補的な配列に連続している必要はない。このように、長さが18のヌクレオ塩基であり、標的核酸との完全な相補性の2つの領域によって隣接されている4つの非相補的なヌクレオ塩基を有するアンチセンス化合物は、標的核酸と77.8％の全体相補性を有するので、本発明の範囲に入るだろう。標的核酸の領域とアンチセンス化合物の相補性パーセントは、当該技術分野で知られたBLAST（基本ローカルアライメント検索ツール）プログラム及びPowerBLASTプログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656）を使用して、常法により定量することができる。相同性パーセント、配列同一性、又は相補性は、例えば、Smith 及び Waterman のアルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489）を用いたデフォルト設定を使用するギャッププログラム（ウィスコンシン配列解析パッケージ、バージョン8、Unix（登録商標）用、Genetics Computer Group, University Research Park, ウィスコンシン州マジソン）によって定量することができる。
ある態様において、本明細書に提供するアンチセンス化合物又はその特定部分は、標的核酸又はその特定部分に完全に相補的（即ち、100％相補的）である。例えば、アンチセンス化合物は、第11因子核酸、又は標的領域、又は標的セグメント、又はその標的配列へ完全に相補的であり得る。本明細書に使用するように、「完全に相補的」は、アンチセンス化合物のそれぞれのヌクレオ塩基が標的核酸の対応するヌクレオ塩基と正確に塩基対合することが可能であることを意味する。例えば、20ヌクレオ塩基のアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物に完全に相補的である、標的核酸の対応する20ヌクレオ塩基部分がある限りは、400ヌクレオ塩基の長さである標的配列に完全に相補的である。「完全に相補的」はまた、第一及び／又は第二核酸の特定部分に関連して使用することができる。例えば、30ヌクレオ塩基アンチセンス化合物の20ヌクレオ塩基部分は、400ヌクレオ塩基の長さである標的配列に「完全に相補的」であり得る。30ヌクレオ塩基オリゴヌクレオチドの20ヌクレオ塩基部分は、標的配列が対応する20ヌクレオ塩基部分を有するならば、標的配列に完全に相補的である（ここでは、それぞれのヌクレオ塩基がアンチセンス化合物の20ヌクレオ塩基部分に相補的である）。同時に、全体で30ヌクレオ塩基のアンチセンス化合物は、そのアンチセンス化合物の残る10ヌクレオ塩基も標的配列に相補的であるかどうかに依存して、標的配列に完全に相補的であり得るか、又は有り得ない。
非相補的なヌクレオ塩基の位置は、アンチセンス化合物の5'端又は3'端であり得る。あるいは、非相補的な単数又は複数のヌクレオ塩基は、アンチセンス化合物の内部位置にあってよい。2以上の非相補的なヌクレオ塩基が存在するとき、それらは、連続（即ち、連結）であっても非連続であってもよい。1つの態様において、非相補的なヌクレオ塩基は、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウィングセグメントに位置する。
ある態様において、長さが12、13、14、15、16、17、18、19、又は20ヌクレオ塩基であるか又はそれ以下であるアンチセンス化合物は、第11因子核酸又はその特定部分のような標的核酸に関連して、4以下、3以下、2以下、又は1以下の非相補的なヌクレオ塩基（複数）を含む。
ある態様において、長さが12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30ヌクレオ塩基であるか又はそれ以下であるアンチセンス化合物は、第11因子核酸又はその特定部分のような標的核酸に対して、6以下、5以下、4以下、3以下、2以下、又は1以下の非相補的なヌクレオ塩基（複数）を含む。
本明細書に提供するアンチセンス化合物には、標的核酸の一部分に相補的であるものも含まれる。本明細書に使用するように、「部分」は、標的核酸の領域又はセグメント内にある一定数の連続（即ち、連結）ヌクレオ塩基に言及する。「部分」は、アンチセンス化合物の一定数の連続ヌクレオ塩基にも言及し得る。ある態様において、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも8のヌクレオ塩基部分に相補的である。ある態様において、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも12のヌクレオ塩基部分に相補的である。ある態様において、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも15のヌクレオ塩基部分に相補的である。また考慮されるのは、標的セグメントの少なくとも9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20以上、又は上記数値の任意の2つによって画定される範囲のヌクレオ塩基部分に相補的である、アンチセンス化合物である。
同一性
本明細書に提供するアンチセンス化合物はまた、特別なヌクレオチド配列、SEQ ID NO: 、又は特定のIsis番号によって表される化合物、又はその部分に対して一定の同一性パーセントを有し得る。本明細書に使用するように、アンチセンス化合物は、それが同一のヌクレオ塩基対合能力を有するならば、本明細書に開示される配列と同一である。例えば、開示されるDNA配列においてチミジンの代わりにウラシルを含有するRNAは、ウラシルとチミジンがともにアデニンと対合するので、そのDNA配列と同一であるとみなされよう。本明細書に記載するアンチセンス化合物の短縮又は延長バージョン、並びに本明細書に提供するアンチセンス化合物に対して非同一の塩基を有する化合物も考慮される。この非同一の塩基は、互いに隣接していても、アンチセンス化合物全体に分散していてもよい。アンチセンス化合物の同一性パーセントは、比較される配列に対する、同一の塩基対合を有する塩基の数に従って計算される。
ある態様において、アンチセンス化合物又はその部分は、本明細書に開示されるアンチセンス化合物又はSEQ ID NO: 、又はその部分の1以上に対して、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一である。
ある態様では、アンチセンス化合物の一部分を標的核酸の等しい長さ部分に比較する。ある態様では、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25ヌクレオ塩基の部分を標的核酸の等しい長さ部分に比較する。
ある態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの一部分を標的核酸の等しい長さ部分に比較する。ある態様では、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25ヌクレオ塩基の部分を標的核酸の等しい長さ部分に比較する。
修飾
ヌクレオシドは、塩基-糖の組合せである。ヌクレオシドのヌクレオ塩基（塩基としても知られる）部分は、通常、複素環式塩基部分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分へ共有結合したリン酸基がさらに含まれるヌクレオシドである。ペントフラノシル糖が含まれるヌクレオシドでは、リン酸基は、糖の2'、3'又は5'ヒドロキシル部分へ連結することができる。オリゴヌクレオチドは、隣接ヌクレオシドが互いに共有結合することにより形成されて、線状のポリマーオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド構造の内部で、リン酸基は、一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結を形成するものとして言及される。
アンチセンス化合物への修飾には、ヌクレオシド間連結、糖部分、又はヌクレオ塩基への置換又は変更が含まれる。修飾アンチセンス化合物は、しばしば、例えば、細胞取込みの増強、核酸標的への親和性の増強、ヌクレアーゼの存在下での安定性の増加、又は阻害活性の増加のような望ましい特性のために、ネイティブ型に優って好ましい。
化学修飾ヌクレオシドはまた、短縮又は先端切断アンチセンスオリゴヌクレオチドのその標的核酸への結合親和性を増加させるために利用し得る。結果として、そのような化学修飾ヌクレオシドを有する、より短いアンチセンス化合物では、同等の結果をしばしば得ることができる。
修飾ヌクレオシド間連結
RNA及びDNAの天然に存在するヌクレオシド間連結は、3'から5'へのホスホジエステル連結である。1以上の修飾された、即ち、天然に存在しないヌクレオシド間連結を有するアンチセンス化合物は、しばしば、例えば、細胞取込みの増強、核酸標的への親和性の増強、及びヌクレアーゼの存在下での安定性の増加のような望ましい特性のために、天然に存在するヌクレオシド間連結を有するアンチセンス化合物に優って選択される。
修飾ヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を保持するヌクレオシド間連結、並びにリン原子を有さないヌクレオシド間連結が含まれる。代表的なリン含有ヌクレオシド間連結には、限定されないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、及びホスホロチオエートが含まれる。リン含有及び非リン含有の連結の製造の方法は、よく知られている。
ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物は、1以上の修飾ヌクレオシド間連結を含む。ある態様において、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート連結である。ある態様において、アンチセンス化合物のそれぞれのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートのヌクレオシド間連結である。
修飾糖部分
本発明のアンチセンス化合物は、糖基が修飾された1以上のヌクレオシドを含有してもよい。そのような糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の増強、結合親和性の増加、又は他の何らかの有益な生物学的特性をアンチセンス化合物へ付与する場合がある。ある態様において、ヌクレオシドは、化学修飾リボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例には、制限なしに、置換基（5'及び2'置換基が含まれる）の付加、ノンジェミナル環原子の架橋形成による二環式核酸（BNA）の形成、リボシル環酸素原子のS、N（R）、又はC（R1）（R）2（R＝H、C1〜C12アルキル、又は保護基）での置き換え、及びこれらの組合せが含まれる。化学修飾糖の例には、2'-F-5'-メチル置換ヌクレオシド（他の開示された5',2'-ビス置換ヌクレオシドについてのPCT国際出願WO2008/101157、2008年8月21日公開、を参照のこと）、又はリボシル環酸素原子のSでの置き換えと2'位でのさらなる置換（公開の米国特許出願US2005-0130923、2005年6月16日公開、を参照のこと）、またあるいは、BNAの5'置換（PCT国際出願WO2007/134181、2007年11月22日公開、を参照のこと。ここでLNAは、例えば5'-メチル又は5'-ビニル基で置換される）が含まれる。
修飾糖部分を有するヌクレオシドの例には、制限なしに、5'-ビニル、5'-メチル（R又はS）、4'-S、2'-F、2'-OCH3、及び2'-O（CH2）2OCH3置換基を含んでなるヌクレオシドが含まれる。2'位での置換基はまた、アリル、アミノ、アジド、チオ、O-アリル、O-C1-C10アルキル、OCF3、O（CH2）2SCH3、O（CH2）2-O-N（Rm）（Rn）、及びO-CH2-C（＝O）-N（Rm）（Rn）より選択され得る（ここでそれぞれのRm及びRnは、独立して、H、又は置換若しくは未置換C1-C10アルキルである）。
二環式核酸（BNA）の例には、制限なしに、4'リボシル環原子と2'リボシル環原子の間の架橋を含んでなるヌクレオシドが含まれる。ある態様において、本明細書に提供するアンチセンス化合物には、架橋が以下の式：4'-（CH2）-O-2'（LNA）；4'-（CH2）-S-2'；4'-（CH2）-O-2'（LNA）；4'-（CH2）2-O-2'（ENA）；4'-C（CH3）2-O-2'（PCT/US2008/068922を参照のこと）；4'-CH（CH3）-O-2'及び4'-CH（CH2OCH3）-O-2'（米国特許第7,399,845号、2008年7月15日発行、を参照のこと）；4'-CH2-N（OCH3）-2'（PCT/US2008/064591を参照のこと）；4'-CH2-O-N（CH3）-2'（公開米国特許出願US2004-0171570、2004年9月2日公開、を参照のこと）；4'-CH2-N（R）-O-2'（米国特許第7,427,672号、2008年9月23日発行、を参照のこと）；4'-CH2-C（CH3）-2'及び4'-CH2-C（＝CH2）-2'（PCT/US2008/066154を参照のこと）の1つを含む1以上のBNAヌクレオシドが含まれ、そしてここでRは、独立して、H、C1-C12アルキル、又は保護基である。先述のBNAのそれぞれには、例えば、α-L-リボフラノースとβ-D-リボフラノースが含まれる、様々な立体化学の糖配置が含まれる（PCT国際出願PCT/DK98/00393、WO99/14226として1999年3月25日に公開、を参照のこと）。
ある態様において、ヌクレオシドは、リボシル環の糖代用物での置き換えによって修飾される。そのような修飾には、制限なしに、以下の式の1つを有するような、モルホリノ環、シクロヘキセニル環、シクロヘキシル環、又はテトラヒドロピラニル環のような代用環系（DNA類似体と呼ばれる場合もある）でのリボシル環の置き換えが含まれる：
Figure 2012505660
当該技術分野では、アンチセンス化合物への取込み用にヌクレオシドを修飾するために使用し得る、多くの他の二環及び三環糖代用環系も知られている（例えば、総説：Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854 を参照のこと）。そのような環系は、活性を高めるために、様々な追加の置換を受けることができる。
当業者には、修飾糖の製造の方法がよく知られている。
修飾糖部分を有するヌクレオチドにおいて、ヌクレオ塩基部分（天然、修飾又はそれらの組合せ）は、適正な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持される。
ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物は、修飾糖部分を有する1以上のヌクレオチドを含む。ある態様において、修飾糖部分は、2'-MOEである。ある態様において、2'-MOE修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフにおいて配置される。
修飾ヌクレオ塩基
ヌクレオ塩基（又は塩基）の修飾又は置換は、天然に存在するか又は合成の非修飾ヌクレオ塩基より構造的に識別可能であるが、機能的には、それと交換可能である。天然のヌクレオ塩基と修飾ヌクレオ塩基は、ともに水素結合に参画することが可能である。そのようなヌクレオ塩基修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性、又は他の何らかの有益な生物学的特性をアンチセンス化合物へ付与することができる。修飾ヌクレオ塩基には、例えば、5-メチルシトシン（5-me-C）のような、合成及び天然のヌクレオ塩基が含まれる。5-メチルシトシン置換が含まれる、あるヌクレオ塩基置換は、アンチセンス化合物の標的核酸への結合親和性を高めるのに特に有用である。例えば、5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6〜1.2℃だけ高めることが示された（Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B.（監修）、「アンチセンスの研究及び応用（Antisense Research and Applications）」CRCプレス、ボカラトン（1993）、276-278 頁）。
追加の修飾ヌクレオ塩基には、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル誘導体と他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル誘導体と他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニル（-C≡C-CH3）ウラシル及びシトシンとピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、シトシン、及びチミン、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル、及び他の8-置換アデニン及びグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチル、及び他の5-置換ウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン及び7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニン及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン及び7-デアザアデニン及び3-デアザグアニン及び3-デアザアデニンが含まれる。
複素環式塩基部分には、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環、例えば、7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジン、及び2-ピリドンで置き換えられたものも含まれ得る。アンチセンス化合物の結合親和性を高めるのに特に有用であるヌクレオ塩基には、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、及びN-2、N-6、及びO-6置換プリン（2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、及び5-プロピニルシトシンが含まれる）が含まれる。
ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物は、1以上の修飾ヌクレオ塩基を含む。ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるギャップ拡張アンチセンスオリゴヌクレオチドは、1以上の修飾ヌクレオ塩基を含む。ある態様において、修飾ヌクレオ塩基は、5-メチルシトシンである。ある態様において、それぞれのシトシンは、5-メチルシトシンである。
組成物と、医薬組成物を製剤化するための方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物又は製剤の製造のための医薬的に許容される活性又は不活性物質と混合してよい。組成物と、医薬組成物の製剤化のための方法は、限定されないが、投与の経路、疾患の程度、投与すべき用量が含まれるいくつかの判断基準に依存している。
第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物は、好適な医薬的に許容される希釈剤又は担体とそのアンチセンス化合物を組み合わせることによって、医薬組成物において利用することができる。医薬的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）が含まれる。PBSは、非経口的に送達される組成物での使用に適した希釈剤である。従って、1つの態様において、本明細書に記載の方法に利用されるのは、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物と医薬的に許容される希釈剤を含んでなる医薬組成物である。ある態様において、医薬的に許容される希釈剤は、PBSである。ある態様において、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンス化合物を含んでなる医薬組成物には、医薬的に許容される塩、エステル、又はそのようなエステルの塩、又は他のあらゆるオリゴヌクレオチドが含まれ、それらは、ヒトが含まれる動物への投与時に、生理活性のある代謝物又はその残基を（直接的及び間接的に）提供することが可能である。従って、例えば、本開示はまた、アンチセンス化合物の医薬的に許容される塩、プロドラッグ、そのようなプロドラッグの医薬的に許容される塩、及び他の生物学的同等物へ引用される。好適な医薬的に許容される塩には、限定されないが、ナトリウム塩とカリウム塩が含まれる。
プロドラッグには、アンチセンス化合物の一端又は両端での追加ヌクレオシドの取込みを含めることができる。これは、身体内で内因性ヌクレアーゼによって切断されて、活性のあるアンチセンス化合物を生成する。
コンジュゲートしたアンチセンス化合物
アンチセンス化合物は、生じるアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞取込みを高める、1以上の部分又はコンジュゲートへ共有的に連結させることができる。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール部分と脂質部分が含まれる。追加のコンジュゲート基には、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が含まれる。
アンチセンス化合物はまた、例えば、ヌクレアーゼ安定性のような特性を高めるために、一般的にはアンチセンス化合物の一端又は両端へ付ける、1以上の安定化基を有するように修飾することができる。安定化基に含まれるのは、キャップ構造である。これらの末端修飾は、末端核酸を有するアンチセンス化合物をエクソヌクレアーゼ分解から保護して、細胞内での送達及び／又は局在化に役立てることができる。キャップは、5'-末端（5'-キャップ）又は3'-末端（3'-キャップ）に存在し得るか、又は両方の末端に存在し得る。キャップ構造は、当該技術分野でよく知られていて、例えば、逆位デオキシ脱塩基キャップが含まれる。さらに、ヌクレアーゼ安定性を付与するためにアンチセンス化合物の一端又は両端をキャップするのに使用し得るさらなる3'及び5'-安定化基には、WO03/004602（2003年1月16日公開）に開示されるものが含まれる。
細胞培養とアンチセンス化合物処置
第11因子核酸のレベル、活性、又は発現に対するアンチセンス化合物の効果について、多様な細胞種において in vitro で試験することができる。そのような分析に使用する細胞種は、市販ベンダー（例、American Type Culture Collection、バージニア州マナッサス；Zen-Bio 社、ノースカロライナ州リサーチトライアングルパーク；Clonetics Corporation、メリーランド州ウォーカーズビル）より入手可能であり、ベンダーの説明書に従って、市販の試薬（例、Invitrogen Life Technologies、カリフォルニア州カールスバッド）を使用して培養される。例示の細胞種には、限定されないが、HepG2細胞、Hep3B細胞、及び初代培養肝細胞が含まれる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの in vitro 試験
本明細書に記載するのは、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの細胞の処置についての方法であって、これは、他のアンチセンス化合物での処置のために適宜修飾することができる。
一般には、細胞が培養中にほぼ60〜80％の集密度に達したときに、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞の中へ導入するのに通常使用される1つの試薬には、カチオン性脂質トランスフェクション試薬、LIPOFECTIN（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをOPTI-MEM1（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）中のLIPOFECTINと混合して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の最終濃度と、典型的には100 nMアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき2〜12μg/mLの範囲に及ぶLIPOFECTIN濃度を達成する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中へ導入するために使用する別の試薬には、LIPOFECTAMINE（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをOPTI-MEM1血清使用量低減培地（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）中のLIPOFECTAMINEと混合して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の濃度と、典型的には100 nMアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき2〜12μg/mLの範囲に及ぶLIPOFECTAMINE濃度を達成する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中へ導入するために使用する別の技術には、エレクトロポレーションが含まれる。
常法によって、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置する。典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後16〜24時間で細胞を採取して、この時点で、当該技術分野で知られて本明細書に記載する方法によって、標的核酸のRNA又はタンパク質レベルを測定する。一般に、処置を多数の反復物で実施するとき。データは、その反復処置の平均として提示する。
使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞系ごとに変動する。特別な細胞系に最適なアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を決定する方法は、当該技術分野でよく知られている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、LIPOFECTAMINEでトランスフェクトするとき、典型的には、1 nM〜300 nMに及ぶ濃度で使用する。エレクトロポレーションを使用してトランスフェクトするときは、625〜20,000 nMに及ぶ、より高い濃度でアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する。
RNA単離
RNA分析は、全細胞RNA又はポリ（A）＋mRNAで実施することができる。RNA単離の方法は、当該技術分野でよく知られている。RNAは、当該技術分野でよく知られた方法を使用して、例えば、製造業者の推奨プロトコールに従って、TRIZOL試薬（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）を使用して調製する。
標的レベル又は発現の阻害の分析
第11因子核酸のレベル又は発現の阻害は、当該技術分野で知られた多様な方法でアッセイすることができる。例えば、標的核酸レベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、又は定量的リアルタイムPCRによって定量することができる。RNA分析は、全細胞RNA又はポリ（A）＋mRNAで実施することができる。RNA単離の方法は、当該技術分野でよく知られている。ノーザンブロット分析も、当該技術分野では、常法である。定量的リアルタイムPCRは、簡便には、市販のABI PRISM 7600、7700、又は7900配列検出システム（PE-Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティより入手可能）を使用して、そして製造業者の説明書に従って使用して達成することができる。
標的RNAレベルの定量的リアルタイムPCR分析
標的RNAレベルの定量は、ABI PRISM 7600、7700、又は7900配列検出システム（PE-Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ）を製造業者の説明書に従って使用する、定量的リアルタイムPCRによって達成することができる。定量的リアルタイムPCRの方法は、当該技術分野でよく知られている。
リアルタイムPCRに先立って、単離したRNAを逆転写酵素（RT）反応へ処して、相補的DNA（cDNA）を産生してから、これをリアルタイムPCR増幅の基質として使用する。RT反応とリアルタイムPCR反応は、同一の試料ウェルにおいて連続的に実施する。RT及びリアルタイムPCRの試薬は、Invitrogen（カリフォルニア州カールスバッド）より入手される。RTリアルタイム-PCR反応は、当業者によく知られた方法によって行う。
リアルタイムPCRによって得られる遺伝子（又はRNA）標的の量は、シクロフィリンAのような、その発現が一定である遺伝子の発現レベルを使用して、又はRIBOGREEN（Invitrogen 社、カリフォルニア州カールスバッド）を使用して全RNAを定量することによって、正規化する。シクロフィリンAの発現は、標的と同時に、又は別々に実施して多重化することによって、リアルタイムPCRによって定量する。全RNAは、RIBOGREEN RNA定量試薬（Invetrogen 社、オレゴン州ユージーン）を使用して定量する。RIBOGREENによるRNA定量の方法は、Jones, L. J., et al,（Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374）に教示されている。CYTOFLUOR 4000機器（PE Applied Biosystems）を使用して、RIBOGREEN蛍光を測定する。
第11因子核酸とハイブリダイズするようにプローブとプライマーを設計する。リアルタイムPCRのプローブ及びプライマーを設計する方法は、当該技術分野でよく知られていて、PRIMER EXPRESS Software（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ）のようなソフトウェアの使用を含めてよい。
タンパク質レベルの分析
第11因子タンパク質レベルを測定することによって、第11因子核酸のアンチセンス阻害を評価することができる。第11因子のタンパク質レベルは、免疫沈降、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、酵素結合免疫吸着法（ELISA）、定量的タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ（例えば、カスパーゼ活性アッセイ）、免疫組織化学、免疫細胞化学又は蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）のような、当該技術分野でよく知られた様々なやり方で評価又は定量することができる。標的へ指向される抗体は、抗体のMSRSカタログ（Aerie Corporation、ミシガン州バーミンガム）のような多様な供給源より同定して入手するか、又は当該技術分野でよく知られた慣用のモノクローナル又はポリクローナル抗体作製法により製造することができる。マウス、ラット、サル、及びヒトの第11因子の検出に有用な抗体が市販されている。
アンチセンス化合物の in vivo 試験
アンチセンス化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて、第11因子の発現を阻害して、aPTTの延長、正常なPTと連動したaPTT時間の延長、血小板第4因子（PF-4）の量の減少、並びに血栓形成の低下又は血栓形成時間の増加といった表現型の変化をもたらすその能力を評価するために、動物で試験する。試験は、正常な動物において、又は実験的な疾患モデルにおいて実施してよい。動物への投与のために、リン酸緩衝化生理食塩水のような医薬的に許容される希釈剤でアンチセンスオリゴヌクレオチドを製剤化する。投与には、腹腔内、静脈内、及び皮下のような非経口の投与経路が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量及び投薬頻度の計算は、当業者の能力内にあり、投与経路や動物体重のような要因に依存する。アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置の期間に続いて、肝臓組織よりRNAを単離して、第11因子核酸発現の変化を測定する。トロンビン産生アッセイを使用して、第11因子タンパク質レベルの変化も測定する。その上に、処置動物からの血漿を使用して、凝固時間（例、PT及びaPTT）に対する効果を判定する。
忍容性
ある態様において、本明細書に提供する化合物は、ごくわずかな副作用を示す。副作用には、典型的には第11因子の標的化とは無関係である、動物中での炎症反応のような、アンチセンス化合物の投与に対する応答が含まれる。ある態様において、化合物は、動物により十分忍容される。忍容性の増加は、限定されないが、アンチセンス化合物のヌクレオチド配列、ヌクレオチドへの化学修飾、アンチセンス化合物中の非修飾及び修飾ヌクレオシドの特別なモチーフ、又はこれらの組合せが含まれる、いくつかの要因に依存する可能性がある。忍容性は、いくつかの要因によって決定される場合がある。そのような要因には、体重、臓器重量、肝機能、腎機能、血小板数、白血球数が含まれる。
ある態様において、本明細書に提供する化合物は、臓器重量に対してごくわずかな効果を示す。ある態様において、該化合物は、脾臓及び／又は肝臓重量の7倍未満、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍の増加を示すか又は有意な増加を示さない。
ある態様において、本明細書に提供する化合物は、肝機能に対してごくわずかな効果を示す。肝機能の評価用の因子には、ALTレベル、ASTレベル、血漿ビリルビンレベル、及び血漿アルブミンレベルが含まれる。ある態様において、本明細書に提供する化合物は、ALT又はASTの7倍未満、6倍未満、5倍未満、4倍未満、3倍未満、又は2倍未満の増加を示すか又は有意な増加を示さない。ある態様において、本明細書に提供する化合物は、血漿ビリルビンレベルの3倍未満、2倍未満の増加を示すか又は有意な増加を示さない。
ある態様において、本明細書に提供する化合物は、腎機能に対してごくわずかな効果を示す。ある態様において、本明細書に提供する化合物は、血中尿素窒素（BUN）の血漿濃度の3倍未満、2倍未満の増加を示すか又は有意な増加を示さない。ある態様において、本明細書に提供する化合物は、尿タンパク質／クレアチニン比の6倍未満、5倍、4倍、3倍、2倍の増加を示すか又は有意な増加を示さない。
ある態様において、本明細書に提供する化合物は、血液学的因子に対してごくわずかな効果を示す。ある態様において、本明細書に提供する化合物は、血小板数の60％未満、50％、40％、30％、20％、10％、又は5％の減少を示す。ある態様において、本明細書に提供する化合物は、単球数の4倍未満、3倍未満、2倍未満の増加を示すか又は有意な増加を示さない。
ある態様において、本化合物は、好ましい薬物動態をさらに示す。ある態様において、アンチセンス化合物は、関連の生体液又は組織において相対的に高い半減期を明示する。
ある態様において、本化合物又は組成物は、好ましい粘度をさらに示す。ある態様において、該化合物又は組成物の粘度は、165〜185 mg/mLの濃度で40 cP以下である。
他の態様において、本化合物は、上記の特徴の組合せを示して、動物モデルにおける第11因子mRNA発現を高い効率で低下させる。
特定の適応症
ある態様において、本発明は、本発明の1以上の医薬組成物を投与することを含んでなる、個体を治療する方法を提供する。ある態様において、個体は、血栓塞栓合併症を有する。ある態様において、個体は、限定されないが、深在性静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、及び卒中のような、梗塞、血栓症、塞栓症、血栓塞栓症が含まれる血液凝固障害へのリスク状態にある。これには、血栓症のリスクをもたらす後天的な問題、疾患、又は障害（例えば、外科手術、癌、不動性状態、敗血症、アテローム性動脈硬化症、心房細動）、並びに遺伝的素因（例えば、抗リン脂質抗体症候群と常染色体優性状態、第V因子ライデン）のある個体が含まれる。ある態様において、個体は、抗凝固療法を必要とすると確認されている。そのような個体の例には、限定されないが、重大な整形外科手術（例、股関節／膝置換又は股関節骨折の手術）を受けている個体、並びに卒中を予防するために慢性治療の必要がある患者（心房細動に罹患している患者のような）が含まれる。ある態様において、本発明は、第11因子発現を個体において予防的に低下させるための方法を提供する。ある態様には、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物の治療有効量を個体へ投与することによって、それを必要とする個体を治療することが含まれる。
1つの態様において、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物の治療有効量の投与には、個体の血清中の第11因子レベルを監視して、アンチセンス化合物の投与に対する個体の応答を判定することを伴う。医師は、アンチセンス化合物の投与に対する個体の応答を使用して、治療介入の量及び期間を決定する。
ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物の投与は、第11因子発現の、少なくとも15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は99％、又は上記数値の任意の2つによって画定される範囲だけの低下をもたらす。ある態様において、第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンス化合物の投与は、標準試験、例えば、限定されないが、活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）検査、プロトロンビン時間（PT）検査、トロンビン時間（TCT）、出血時間、又はD-二量体によって測定されるような血液凝固の測定値の変化をもたらす。ある態様において、第11因子アンチセンス化合物の投与は、その測定値を少なくとも15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は99％、又は上記数値の任意の2つによって画定される範囲だけ増加させる。いくつかの態様において、第11因子アンチセンス化合物の投与は、その測定値を少なくとも15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は99％、又は上記数値の任意の2つによって画定される範囲だけ減少させる。
ある態様では、第11因子へ標的指向されるアンチセンス化合物を含んでなる医薬組成物を、血栓塞栓合併症に罹患しているか又は罹患しやすい患者を治療するための医薬品の製造に使用する。
特定の組合せ療法
ある態様では、本発明の1以上の医薬組成物を1以上の他の薬剤と同時投与する。ある態様において、そのような1以上の他の薬剤は、本発明の1以上の医薬組成物と同じ疾患、障害、又は状態を治療するように設計される。ある態様において、そのような1以上の他の薬剤は、本発明の1以上の医薬組成物とは異なる疾患、障害、又は状態を治療するように設計される。ある態様において、そのような1以上の他の薬剤は、本発明の1以上の医薬組成物の望まれない副作用を処置するように設計される。ある態様では、本発明の1以上の医薬組成物を別の薬剤と同時投与して、他の薬剤の望まれない効果を処置する。ある態様では、本発明の1以上の医薬組成物を別の薬剤と同時投与して、組合せの効果をもたらす。ある態様では、本発明の1以上の医薬組成物を別の薬剤と同時投与して、相乗効果をもたらす。
ある態様では、本発明の1以上の医薬組成物と1以上の他の薬剤を同時に投与する。ある態様では、本発明の1以上の医薬組成物と1以上の他の薬剤を異なる時間で投与する。ある態様では、本発明の1以上の医薬組成物と1以上の他の薬剤を単一の製剤において一緒に調製する。ある態様では、本発明の1以上の医薬組成物と1以上の他の薬剤を別々に調製する。
ある態様において、本発明の医薬組成物と同時投与され得る薬剤には、抗凝固薬又は抗血小板剤が含まれる。ある態様において、本発明の医薬組成物と同時投与され得る薬剤には、アスピリンのような、NSAID／シクロオキシゲナーゼ阻害剤が含まれる。ある態様において、本発明の医薬組成物と同時投与され得る薬剤には、クロピドグレル（PLAVIX）及びチクロピジン（TICLID）のような、アデノシン二リン酸（ADP）受容体阻害剤が含まれる。ある態様において、本発明の医薬組成物と同時投与され得る薬剤には、シロスタゾール（PLETAL）のようなホスホジエステラーゼ阻害剤が含まれる。ある態様において、本発明の医薬組成物と同時投与され得る薬剤には、アブシキシマブ（REOPRO）、エプチフィバチド（INTEGRILIN）、チロフィバン（AGGRASTAT）、及びデフィロチドのような、糖タンパク質IIB/IIIA阻害剤が含まれる。ある態様において、本発明の医薬組成物と同時投与され得る薬剤には、ジピリダモール（PERSANTINE）のようなアデノシン再取込み阻害剤が含まれる。ある態様において、本発明の医薬組成物と同時投与され得る薬剤には、限定されないが、ワルファリン（と関連クマリン類）、ヘパリン、直接的なトロンビン阻害剤（レピルジン、ビバリルジンのような）、アピキサバン、LOVENOX、及び、特別な凝固因子の酵素作用に直接的に干渉する低分子化合物（例、第Xa因子に干渉するリバロキサバン）が含まれる。ある態様において、本発明の第11因子特異的阻害剤と同時投与され得る薬剤には、限定されないが、追加の第11因子阻害剤が含まれる。ある態様において、抗凝固薬又は抗血小板剤は、本発明の医薬組成物の投与に先立って投与される。ある態様において、抗凝固薬又は抗血小板剤は、本発明の医薬組成物の投与に続いて投与される。ある態様において、抗凝固薬又は抗血小板剤は、本発明の医薬組成物と同時に投与される。ある態様において、同時投与される抗凝固薬又は抗血小板剤の用量は、抗凝固薬又は抗血小板剤が単独で投与される場合に投与されるはずの用量と同じである。ある態様において、同時投与される抗凝固薬又は抗血小板剤の用量は、抗凝固薬又は抗血小板剤が単独で投与される場合に投与されるはずの用量より低い。ある態様において、同時投与される抗凝固薬又は抗血小板剤の用量は、抗凝固薬又は抗血小板剤が単独で投与される場合に投与されるはずの用量より高い。
ある態様において、第二化合物の同時投与は、その化合物の同時投与により、第一化合物を単独で投与する効果より大きい抗凝固効果をもたらすように、第一化合物の抗凝固効果を増強する。他の態様において、同時投与は、化合物が単独で投与されるときの効果の相加的である抗凝固効果をもたらす。ある態様において、同時投与は、化合物が単独で投与されるときの効果の超相加的である抗凝固効果をもたらす。ある態様において、第二化合物の同時投与は、出血リスクを高めることなく、抗血栓活性を増加させる。ある態様において、第一化合物は、アンチセンス化合物である。ある態様において、第二化合物は、アンチセンス化合物である。
ある態様では、第11因子特異的阻害剤の投与後いつでも解毒薬を投与する。ある態様では、第11因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後いつでも解毒薬を投与する。ある態様では、第11因子に標的指向するアンチセンス化合物の投与から数分、数時間、数日、数週、又は数ヶ月後に解毒薬を投与する。ある態様において、解毒薬は、第11因子に標的指向するアンチセンス化合物に相補的である（例、センス鎖）。ある態様において、解毒薬は、第7因子、第7a因子、第11因子、又は第11a因子のタンパク質である。ある態様において、第7因子、第7a因子、第11因子、又は第11a因子のタンパク質は、ヒト第7因子、ヒト第7a因子、ヒト第11因子、又はヒト第11a因子のタンパク質である。ある態様において、第7因子タンパク質は、NOVOSEVENである。
特定の同時投与抗血小板療法
ある態様では、第11因子阻害剤を抗血小板療法と組み合わせる。ある態様において、抗血小板療法と組み合わせた第11因子阻害剤の投与は、抗血小板療法単独と比較した、出血のリスクの明瞭又は検出可能な増加をほとんど又はまったくもたらさない。ある態様において、このリスクプロフィール又はリスク徴候は、抗血小板療法単独と変わらない。
抗血小板及び抗凝固療法の組合せは、例えば、血栓塞栓症、心房細動、心臓弁障害、心臓弁膜症、卒中、CADと診断された患者において、そして人工弁を有する患者において最も頻繁に臨床現場で使用される。二元療法の利益は、血小板と凝固因子の活性をともに抑制する、有り得べき相加効果に関する。二元療法のリスクは、出血増加の潜在可能性である（Dowd, M. Plenary Sessions/Thrombosis Research 123 (2008)）。
抗血小板及び抗凝固薬療法の従来の組合せは、抗凝固療法又は抗血小板療法単独と比較して、出血のリスクを高めると示されてきた。そのような組合せには、ADP受容体／P2Y12阻害剤（PLAVIXとしても知られるクロピドグレルのようなチエノピリジン類）及びNSAID（例、アスピリンとナプロキセン）とFXa阻害剤（例、アピキシバンとリバロキサバン）が含まれる（Kubitza, D. et al., Br. J. Clin. Pharmacol. 63: 4 (2006)；Wong, P. C. et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis 6 (2008)；新薬承認申請に関するFDA諮問委員会ブリーフィング資料 22-406 (2009)）。例えば、Wong は、アスピリンとアスピリン＋クロピドグレルへある量のアピキサバンを加えると、アスピリン単独とアスピリン＋クロピドグレルと比較して、出血時間の有意な増加をもたらしたと報告している。Kubitza は、リバロキサバン及びナプロキセンの組合せ投与により、ナプロキセン単独に対して出血時間が有意に増加したと報告している。
非限定的な開示と参照による組込み
本明細書に記載するある化合物、組成物、及び方法について、ある態様に準拠して特定して記載してきたが、以下の実施例は、本明細書に記載する化合物について例解するためにのみ役立つのであって、それを限定することを企図しない。本出願に引用する参考文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
実施例1：HepG2細胞におけるヒト第11因子のアンチセンス阻害
第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、第11因子mRNAに対するその効果を in vitro で試験した。リポフェクチン試薬を75 nMアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに使用して、10,000個の細胞／ウェルの密度の培養HepG2細胞にトランスフェクトした。ほぼ24時間の処置期間の後で、この細胞よりRNAを単離して、定量的リアルタイムPCRによって第11因子mRNAレベルを測定した。第11因子mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定される全RNA含量に従って補正した。未処置対照細胞に対する第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。
表1及び2のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5-10-5MOEギャップマーとして設計した。このギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、10の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ5ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。5'ウィングセグメントの各ヌクレオチドと3'ウィングセグメントの各ヌクレオチドは、2'-MOE修飾を有する。それぞれのギャップマー全体のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート（P＝S）連結である。それぞれのギャップマー全体のすべてのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。「標的開始部位」は、ギャップマーが標的指向される5'末端ヌクレオチドを示す。「標的終結部位」は、ギャップマーが標的指向される3'末端ヌクレオチドを示す。表1に収載するそれぞれのギャップマーは、SEQ ID NO: 1（GENBANK登録番号NM_000128.3）へ標的指向されて、表2に収載するそれぞれのギャップマーは、SEQ ID NO: 2（GENBANK登録番号NT_022792.17［19598000〜19624000が切断された］）へ標的指向されている。
Figure 2012505660
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実施例2：HepG2細胞におけるヒト第11因子の用量依存的なアンチセンス阻害
ヒト第11因子の84パーセント以上の in vitro 阻害を明示する12のギャップマーについて、HepG2細胞において様々な用量で試験した。細胞を10,000個の細胞／ウェルの密度でプレート培養して、表3に特定されるように、9.375 nM、18.75 nM、37.5 nM、75 nM、及び150 nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドとともにリポフェクチン試薬を使用してトランスフェクトした。ほぼ16時間の処置期間の後で、この細胞よりRNAを単離して、定量的リアルタイムPCRによって第11因子mRNAレベルを測定した。ヒト第11因子プライマープローブセット：RTS2966（フォワード配列：CAGCCTGGAGCATCGTAACA、本明細書ではSEQ ID NO: 3として取り込む；リバース配列：TTTATCGAGCTTCGTTATTCTGGTT、本明細書ではSEQ ID NO: 4として取り込む；プローブ配列：TTGTCTACTGAAGCACACCCAAACAGGGAX、本明細書ではSEQ ID NO: 5として取り込む）を使用して、mRNAレベルを測定した。第11因子mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定される全RNA含量に従って補正した。未処置対照細胞に対する第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。表3に例証されるように、第11因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞において用量依存的なやり方で低下した。
Figure 2012505660
実施例3：マイクロウォーク（microwalk）によって設計したオリゴヌクレオチドによる、HepG2細胞におけるヒト第11因子のアンチセンス阻害
表3に提示するギャップマーに基づいて、追加のギャップマーを設計した。これらのギャップマーは、表3からの元のギャップマーのやや上流及び下流にシフトした（即ち、「マイクロウォーク」）ギャップマーを創出することによって設計した。ギャップマーは、様々なモチーフ、例、5-10-5MOE、3-14-3MOE、及び2-13-5MOEでも創出した。これらのギャップマーについて in vitro で試験した。75 nMアンチセンスオリゴヌクレオチドとともにリポフェクチン試薬を使用して、10,000個の細胞／ウェルの密度の培養HepG2細胞にトランスフェクトした。ほぼ24時間の処置期間の後で、この細胞よりRNAを単離して、定量的リアルタイムPCRによって第11因子mRNAレベルを測定した。第11因子mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定される全RNA含量に従って補正した。未処置対照細胞に対する第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。
次いで、表4、5、6、7、及び8に示すように、マイクロウォークによって設計したギャップマーの in vitro 阻害データを表3からのギャップマーの in vitro 阻害データと比較した。上記のオリゴヌクレオチドは、それらがマップされる、ヒトmRNA（GENBANK登録番号NM_000128.3）上の領域に従って表示される。
表4のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5-10-5MOE、3-14-3MOE、及び2-13-5MOEギャップマーとして設計した。表4で最初に収載したギャップマーは、元のギャップマー（表3を参照のこと）であり、これよりマイクロウォークによって残りのギャップマーを設計して、アステリスクにより表記する。5-10-5ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、10の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ5ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。3-14-3ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、14の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ3ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。2-13-5ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、13の2'-デオキシヌクレオチドより構成される。中央のギャップは、5'端に2のヌクレオチドを含んでなるウィング、そして3'端に5のヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。このモチーフ（5-10-5、3-14-3、及び2-13-5）のそれぞれで、5'ウィングセグメントの各ヌクレオチドと3'ウィングセグメントの各ヌクレオチドは、2'-MOE修飾を有する。それぞれのギャップマー全体のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート（P＝S）連結である。それぞれのギャップマー全体のすべてのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。「標的開始部位」は、ギャップマーが標的指向される5'末端ヌクレオチドを示す。「標的終結部位」は、ギャップマーが標的指向される3'末端ヌクレオチドを示す。表4に収載するそれぞれのギャップマーは、SEQ ID NO: 1（GENBANK登録番号NM_000128.3）へ標的指向される。
表4に示すように、SEQ ID NO: 1の標的開始部位656に始まって、標的終結部位704で終わる標的領域（即ち、ヌクレオ塩基656〜704）へ標的指向される、5-10-5MOEギャップマー、3-14-3MOEギャップマー、及び2-13-5MOEギャップマーのいずれも、第11因子mRNAの少なくとも20％の阻害を示す。このギャップマーの多くは、少なくとも60％の阻害を示す。ISIS番号：416806、416809、416811、416814、416821、416825、416826、416827、416828、416868、416869、416878、416879、416881、416883、416890、416891、416892、416893、416894、416895、416896、416945、416946、416969、416970、416971、416972、416973、412203、413467、413468、及び413469が含まれる、このギャップマーのいくつかは、少なくとも80％の阻害を示す。以下のISIS番号は、少なくとも90％の阻害を示した：412203、413467、416825、416826、416827、416868、416878、416879、416892、416893、416895、416896、416945、416972、及び416973。以下のISIS番号は、少なくとも95％の阻害を示した：416878、416892、416895、及び416896。
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表5のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5-10-5MOE、3-14-3MOE、及び2-13-5MOEギャップマーとして設計した。表5で最初に収載したギャップマーは、元のギャップマー（表3を参照のこと）であり、これよりマイクロウォークによって残りのギャップマーを設計して、アステリスクにより表記する。5-10-5ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、10の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ5ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。3-14-3ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、14の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ3ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。2-13-5ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、13の2'-デオキシヌクレオチドより構成される。中央のギャップは、5'端に2のヌクレオチドを含んでなるウィング、そして3'端に5のヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。このモチーフ（5-10-5、3-14-3、及び2-13-5）のそれぞれで、5'ウィングセグメントの各ヌクレオチドと3'ウィングセグメントの各ヌクレオチドは、2'-MOE修飾を有する。それぞれのギャップマー全体のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート（P＝S）連結である。それぞれのギャップマー全体のすべてのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。「標的開始部位」は、ギャップマーが標的指向される5'末端ヌクレオチドを示す。「標的終結部位」は、ギャップマーが標的指向される3'末端ヌクレオチドを示す。表5に収載するそれぞれのギャップマーは、SEQ ID NO: 1（GENBANK登録番号NM_000128.3）へ標的指向される。
表5に示すように、SEQ ID NO: 1の標的開始部位738に始まって、標的終結部位762で終わる標的領域（即ち、ヌクレオ塩基738〜762）へ標的指向される、5-10-5MOEギャップマー、3-14-3MOEギャップマー、及び2-13-5MOEギャップマーのいずれも、第11因子mRNAの少なくとも45％の阻害を示す。このギャップマーのほとんどは、少なくとも60％の阻害を示す。ISIS番号：412206、416830、416831、416898、416899、416900、416903、416975、416976、416977、及び416980が含まれる、このギャップマーのいくつかは、少なくとも80％の阻害を示す。以下のISIS番号は、少なくとも90％の阻害を示した：412206、416831、及び416900。
Figure 2012505660
表6のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5-10-5MOE、3-14-3MOE、及び2-13-5MOEギャップマーとして設計した。表6で最初に収載したギャップマーは、元のギャップマー（表3を参照のこと）であり、これよりマイクロウォークによって残りのギャップマーを設計して、アステリスクにより表記する。5-10-5ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、10の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ5ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。3-14-3ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、14の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ3ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。2-13-5ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、13の2'-デオキシヌクレオチドより構成される。中央のギャップは、5'端に2のヌクレオチドを含んでなるウィング、そして3'端に5のヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。このモチーフ（5-10-5、3-14-3、及び2-13-5）のそれぞれで、5'ウィングセグメントの各ヌクレオチドと3'ウィングセグメントの各ヌクレオチドは、2'-MOE修飾を有する。それぞれのギャップマー全体のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート（P＝S）連結である。それぞれのギャップマー全体のすべてのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。「標的開始部位」は、ギャップマーが標的指向される5'末端ヌクレオチドを示す。「標的終結部位」は、ギャップマーが標的指向される3'末端ヌクレオチドを示す。表6に収載するそれぞれのギャップマーは、SEQ ID NO: 1（GENBANK登録番号NM_000128.3）へ標的指向される。
表6に示すように、SEQ ID NO: 1の標的開始部位1018に始まって、標的終結部位1042で終わる標的領域（即ち、ヌクレオ塩基1018〜1042）へ標的指向される、5-10-5MOEギャップマー、3-14-3MOEギャップマー、及び2-13-5MOEギャップマーのいずれも、第11因子mRNAの少なくとも80％の阻害を示す。以下のISIS番号は、少なくとも90％阻害を示した：413474、416837、416838、416904、416907、及び416908。
Figure 2012505660
表7のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5-10-5MOE、3-14-3MOE、及び2-13-5MOEギャップマーとして設計した。表7で最初に収載したギャップマーは、元のギャップマー（表3を参照のこと）であり、これよりマイクロウォークによって残りのギャップマーを設計して、アステリスクにより表記する。5-10-5ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、10の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ5ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。3-14-3ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、14の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ3ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。2-13-5ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、13の2'-デオキシヌクレオチドより構成される。中央のギャップは、5'端に2のヌクレオチドを含んでなるウィング、そして3'端に5のヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。このモチーフ（5-10-5、3-14-3、及び2-13-5）のそれぞれで、5'ウィングセグメントの各ヌクレオチドと3'ウィングセグメントの各ヌクレオチドは、2'-MOE修飾を有する。それぞれのギャップマー全体のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート（P＝S）連結である。それぞれのギャップマー全体のすべてのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。「標的開始部位」は、ギャップマーが標的指向される5'末端ヌクレオチドを示す。「標的終結部位」は、ギャップマーが標的指向される3'末端ヌクレオチドを示す。表4に収載するそれぞれのギャップマーは、SEQ ID NO: 1（GENBANK登録番号NM_000128.3）へ標的指向される。
表7に示すように、SEQ ID NO: 1の標的開始部位1062に始まって、標的終結部位1091で終わる標的領域（即ち、ヌクレオ塩基1062〜1091）へ標的指向される、5-10-5MOEギャップマー、3-14-3MOEギャップマー、及び2-13-5MOEギャップマーのいずれも、第11因子mRNAの少なくとも20％の阻害を示す。ISIS番号：412215、413476、413476、416839、416840、416841、416842、416843、416844、416845、416846、416847、416909、416910、416911、416912、416913、416914、416915、416916、416917、416918、416986、416987、416988、416989、416990、416991、416992、416993、416994、416995が含まれる、このギャップマーの多くは、少なくとも50％の阻害を示す。以下のISIS番号は、少なくとも80％の阻害を示した：412215、413476、413476、416839、416840、416841、416842、416843、416844、416845、416910、416911、416912、416913、416914、416916、416917、416986、416987、416989、416991、416992、416993、及び416994。以下のISIS番号は、少なくとも90％の阻害を示した：413476、413476、416842、416844、416910、416911、416912、416913、416916、416917、及び416993。
Figure 2012505660
表8のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5-10-5MOE、3-14-3MOE、及び2-13-5MOEギャップマーとして設計した。表8で最初に収載したギャップマーは、元のギャップマー（表3を参照のこと）であり、これよりマイクロウォークによって残りのギャップマーを設計して、アステリスクにより表記する。5-10-5ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、10の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ5ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。3-14-3ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、14の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ3ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。2-13-5ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、13の2'-デオキシヌクレオチドより構成される。中央のギャップは、5'端に2のヌクレオチドを含んでなるウィング、そして3'端に5のヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。このモチーフ（5-10-5、3-14-3、及び2-13-5）のそれぞれで、5'ウィングセグメントの各ヌクレオチドと3'ウィングセグメントの各ヌクレオチドは、2'-MOE修飾を有する。それぞれのギャップマー全体のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート（P＝S）連結である。それぞれのギャップマー全体のすべてのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。「標的開始部位」は、ギャップマーが標的指向される5'末端ヌクレオチドを示す。「標的終結部位」は、ギャップマーが標的指向される3'末端ヌクレオチドを示す。表8に収載するそれぞれのギャップマーは、SEQ ID NO: 1（GENBANK登録番号NM_000128.3）へ標的指向される。
表8に示すように、SEQ ID NO: 1の標的開始部位1275に始まって、標的終結部位1318で終わる標的領域（即ち、ヌクレオ塩基1275〜1318）へ標的指向される、5-10-5MOEギャップマー、3-14-3MOEギャップマー、及び2-13-5MOEギャップマーのいずれも、第11因子mRNAの少なくとも70％の阻害を示す。ISIS番号：412223、412224、412225、413482、416848、416849、416850、416851、416852、416853、416854、416855、416856、416857、416858、416859、416860、416861、416862、416863、416864、416865、416866、416867、416920、416921、416922、416923、416924、416925、416926、416927、416928、416929、416930、416931、416932、416933、416934、416935、416936、416937、416938、416939、416940、416941、416942、416943、416944、416997、416998、416999、417000、417001、417002、417003、417004、417006、417007、417008、417009、417010、417011、417013、417014、417015、417016、417017、417018、417019、及び417020が含まれる、このギャップマーの多くは、少なくとも80％の阻害を示す。以下のISIS番号は、少なくとも90％の阻害を示した：412224、416850、416853、416856、416857、416858、416861、416862、416864、416922、416923、416924、416925、416926、416928、416931、416932、416933、416934、416935、416937、416938、416940、416941、416943、416999、417002、416854、及び416859。
Figure 2012505660
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実施例4：HepG2細胞におけるヒト第11因子の用量依存的なアンチセンス阻害
ヒト第11因子の in vitro 阻害を明示する、実施例3からのギャップマー（表4、5、6、7、及び8を参照のこと）について、HepG2細胞において様々な用量で試験した。細胞を10,000個の細胞／ウェルの密度でプレート培養して、表9に特定されるように、9.375 nM、18.75 nM、37.5 nM、及び75 nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドとともにリポフェクチン試薬を使用してトランスフェクトした。ほぼ16時間の処置期間の後で、この細胞よりRNAを単離して、定量的リアルタイムPCRによって第11因子mRNAレベルを測定した。ヒト第11因子プライマープローブセット：RTS2966を使用して、mRNAレベルを測定した。第11因子mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定される全RNA含量に従って補正した。未処置対照細胞に対する第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。表9に例証されるように、第11因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞において用量依存的なやり方で低下した。
Figure 2012505660
このギャップマーは、エレクトロポレーションによってもトランスフェクトして、ヒト第11因子mRNAへのその用量依存的な阻害を測定した。細胞を20,000個の細胞／ウェルの密度でプレート培養して、表10に特定されるように、エレクトロポレーションにより、0.7μM、2.2μM、6.7μM、及び20μM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。ほぼ16時間の処置期間の後で、この細胞よりRNAを単離して、定量的リアルタイムPCRによって第11因子mRNAレベルを測定した。ヒト第11因子プライマープローブセット：RTS2966を使用して、mRNAレベルを測定した。第11因子mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定される全RNA含量に従って補正した。未処置対照細胞に対する第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。表10に例証されるように、第11因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞において用量依存的なやり方で低下した。
Figure 2012505660
実施例5：HepG2細胞におけるヒト第11因子の有効な用量依存的アンチセンス阻害の選択及び確認
実施例4においてヒト第11因子の有意な用量依存的阻害を明示するギャップマーについて選択して、HepG2細胞において様々な用量で試験した。細胞を10,000個の細胞／ウェルの密度でプレート培養して、表11に特定されるように、2.34 nM、4.69 nM、9.375 nM、18.75 nM、37.5 nM、及び75 nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドとともにリポフェクションを使用してトランスフェクトした。ほぼ16時間の処置期間の後で、この細胞よりRNAを単離して、定量的リアルタイムPCRによってヒト第11因子mRNAレベルを測定した。ヒト第11因子プライマープローブセット：RTS2966を使用して、mRNAレベルを測定した。第11因子mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定される全RNA含量に従って補正した。未処置対照細胞に対するヒト第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。表11に例証されるように、第11因子mRNAレベルは、対照と比較して、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞において用量依存的なやり方で低下した。
Figure 2012505660
このギャップマーは、エレクトロポレーションによってもトランスフェクトして、ヒト第11因子mRNAへのその用量依存的な阻害を測定した。細胞を20,000個の細胞／ウェルの密度でプレート培養して、表12に特定されるように、エレクトロポレーションにより、625 nM、1250 nM、2500 nM、5,000 nM、10,000 nM、及び20,000 nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。ほぼ16時間の処置期間の後で、この細胞よりRNAを単離して、定量的リアルタイムPCRによってヒト第11因子mRNAレベルを測定した。ヒト第11因子プライマープローブセット：RTS2966を使用して、mRNAレベルを測定した。第11因子mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定される全RNA含量に従って補正した。未処置対照細胞に対するヒト第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。表12に例証されるように、第11因子mRNAレベルは、対照と比較して、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞において用量依存的なやり方で低下した。
Figure 2012505660
実施例6：シアノ（cyano）初代培養肝細胞におけるヒト第11因子の有効な用量依存的アンチセンス阻害の選択及び確認
ヒト第11因子の有意な用量依存的 in vitro 阻害を明示する実施例4からのギャップマーについて、シアノ初代培養肝細胞においても様々な用量で試験した。細胞を35,000個の細胞／ウェルの密度でプレート培養して、表13に特定されるように、エレクトロポレーションにより、0.74 nM、2.2 nM、6.7 nM、20 nM、60 nM、及び180 nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。ほぼ16時間の処置期間の後で、この細胞よりRNAを単離して、定量的リアルタイムPCRによってヒト第11因子mRNAレベルを測定した。ヒト第11因子プライマープローブセット：RTS2966を使用して、mRNAレベルを測定した。第11因子mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定される全RNA含量に従って補正した。未処置対照細胞に対するヒト第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。表13に例証されるように、第11因子mRNAレベルは、対照と比較して、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞において用量依存的なやり方で低下した。
Figure 2012505660
実施例7：ギャップマーによる、HepB3細胞におけるヒト第11因子の有効な用量依存的アンチセンス阻害の選択及び確認
実施例4においてヒト第11因子の in vitro 阻害を明示するギャップマーについて、HepB3細胞において様々な用量で試験した。細胞を4,000個の細胞／ウェルの密度でプレート培養して、表14に特定されるように、2.3 nM、4.7 nM、9.4 nM、18.75 nM、37.5 nM、及び75 nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドとともにリポフェクチン試薬を使用してトランスフェクトした。ほぼ16時間の処置期間の後で、この細胞よりRNAを単離して、定量的リアルタイムPCRによってヒト第11因子mRNAレベルを測定した。ヒト第11因子プライマープローブセット：RTS2966を使用して、mRNAレベルを測定した。第11因子mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定される全RNA含量に従って補正した。未処置対照細胞に対する第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。表14に例証されるように、第11因子mRNAレベルは、対照と比較して、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞において用量依存的なやり方で低下した。
Figure 2012505660
このギャップマーは、エレクトロポレーションによってもトランスフェクトして、ヒト第11因子mRNAへのその用量依存的な阻害を測定した。細胞を20,000個の細胞／ウェルの密度でプレート培養して、表15に特定されるように、エレクトロポレーションにより、41.15 nM、123.457 nM、370.37 nM、1111.11 nM、3333.33 nM、及び10,000 nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。ほぼ16時間の処置期間の後で、この細胞よりRNAを単離して、定量的リアルタイムPCRによってヒト第11因子mRNAレベルを測定した。ヒト第11因子プライマープローブセット：RTS2966を使用して、mRNAレベルを測定した。第11因子mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定される全RNA含量に従って補正した。未処置対照細胞に対するヒト第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。表15に例証されるように、第11因子mRNAレベルは、対照と比較して、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞において用量依存的なやり方で低下した。
Figure 2012505660
実施例8：マウス初代培養肝細胞におけるマウス第11因子のアンチセンス阻害
マウス第11因子に標的指向するキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを、マウス第11因子（GENBANK登録番号NM_028066.1、本明細書ではSEQ ID NO: 6として取り込む）に標的指向する5-10-5MOEギャップマーとして設計した。このギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、10の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ5ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。それぞれのウィングセグメント中の各ヌクレオチドは、2'-MOE修飾を有する。それぞれのギャップマー全体のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート（P＝S）連結である。それぞれのギャップマー全体のすべてのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。このアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、マウス初代培養肝細胞においてマウス第11因子mRNAを低下させるその能力を評価した。
マウス初代培養肝細胞を6.25 nM、12.5 nM、25 nM、50 nM、100 nM、及び200 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドでほぼ24時間の間処置した。この細胞よりRNAを単離して、定量的リアルタイムPCRによってマウス第11因子mRNAレベルを測定した。マウス第11因子プライマープローブセット：RTS2898（フォワード配列：ACATGACAGGCGCGATCTCT、本明細書ではSEQ ID NO: 7として取り込む；リバース配列：TCTAGGTTCACGTACACATCTTTGC、本明細書ではSEQ ID NO: 8として取り込む；プローブ配列：TTCCTTCAAGCAATGCCCTCAGCAATX、本明細書ではSEQ ID NO: 9として取り込む）を使用して、mRNAレベルを測定した。第11因子mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定される全RNA含量に従って補正した。このマウスアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかは、第11因子mRNAレベルを用量依存的なやり方で低下させた。
実施例9：マウス初代培養肝細胞におけるマウス第11因子の交差反応性アンチセンス阻害
マウス第11因子核酸へ標的指向されるアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、第11因子mRNAに対するその効果を in vitro で試験した。10,000細胞／ウェルの密度で培養したマウス初代培養肝細胞を100 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した。ほぼ24時間の処置期間の後で、この細胞よりRNAを単離して、定量的リアルタイムPCRによってマウス第11因子mRNAレベルを測定した。第11因子mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定される全RNA含量に従って補正した。未処置対照細胞に対する第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。
表16のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5-10-5MOEギャップマーとして設計した。このギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、10の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ5ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。5'ウィングセグメントの各ヌクレオチドと3'ウィングセグメントの各ヌクレオチドは、2'-MOE修飾を有する。それぞれのギャップマー全体のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート（P＝S）連結である。それぞれのギャップマー全体のすべてのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。「マウス標的開始部位」は、ギャップマーが標的指向される5'末端ヌクレオチドを示す。「マウス標的終結部位」は、ギャップマーが標的指向される3'末端ヌクレオチドを示す。収載したすべてのマウスオリゴヌクレオチドは、本明細書ではSEQ ID NO: 6として取り込むマウス第11因子mRNA（GENBANK登録番号NM_028066.1）と本明細書ではSEQ ID NO: 1として取り込むヒト第11因子mRNA（GENBANK登録番号NM_000128.3）の間で交差反応性を示す。「ヒト標的開始部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的指向される、ヒトmRNA（GENBANK登録番号NM_000128.3）中の5'末端ヌクレオチドを示す。「ヒト標的終結部位」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的指向される、ヒトmRNA（GENBANK登録番号NM_000128.3）中の3'末端ヌクレオチドを示す。「ミスマッチ数」は、マウスオリゴヌクレオチドとヒトmRNA配列の間のミスマッチを示す。
Figure 2012505660
実施例10：マウス第11因子の in vivo アンチセンス阻害
統計学的に有意な用量依存的阻害を示す、マウス第11因子mRNA（GENBANK登録番号NM_028066.1、本明細書ではSEQ ID NO: 6として取り込む）へ標的指向されるいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、in vivo で評価した。BALB/cマウスをISIS404057（TCCTGGCATTCTCGAGCATT、標的開始部位487、本明細書ではSEQ ID NO: 10として取り込む）とISIS404071（TGGTAATCCACTTTCAGAGG、標的開始部位869、本明細書ではSEQ ID NO: 11として取り込む）で処置した。
処置
BALB/cマウスに、5 mg/kg、10 mg/kg、25 mg/kg、又は50 mg/kgのISIS404057又はISIS404071を週2回、3週間注射した。対照群のマウスには、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）を週2回、3週間注射した。最後の投薬を受けてから5日後にマウスを犠牲にした。RNA分析のために肝臓全体を回収して、凝固分析（PT及びaPTT）とタンパク質分析のために血漿を採取した。
RNA分析
第11因子のリアルタイムPCR分析のために肝臓組織よりRNAを抽出した。表17に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、PBS対照に優って、マウス第11因子の用量依存的な低下をもたらした。未処置対照細胞に対するヒト第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。
Figure 2012505660
PT及びaPTTアッセイ
ISIS404057及びISIS404071で処置したマウスからの血小板欠乏血漿（PPP）を使用して、プロトロンビン時間（PT）と活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）を測定した。表18に提供するPT及びaPTT値は、国際標準化比（INR）の数値として報告する。PT及びaPTTのINR値は、各実験群（即ち、ISIS404057又はISIS404071で、5 mg/kg、10 mg/kg、25 mg/kg、及び50 mg/kgの処置）のPT又はaPTT値をPBS処置群のPT又はaPTTで割ることによって定量した。次いで、使用する組織因子の国際感度指数（ISI）の冪数だけこの比を掛け合わせた。表18に示すように、ISIS404057又はISIS404071で処置したマウスにおいて、PTは、有意には延長しなかった。しかしながら、ISIS404057及びISIS404071で処置したマウスにおいて、aPTTは、用量依存的なやり方で延長した。これらのデータは、第11因子のアンチセンス低下が血液凝固の接触活性化経路には影響を及ぼすが、その外因性経路には影響を及ぼさないことを示唆する。
Figure 2012505660
タンパク質分析
凝固時間に基づいたF11アッセイを使用して、ISIS404071で処置したマウスの血漿からの第11因子プロ酵素を測定した。凝固時間は、ST4半自動化凝固測定機器（Diagnostica Stago、ニュージャージー州）を用いて、同一2検体で定量した。BSA入りHEPES-NaCl緩衝液で20倍希釈した30μlのクエン酸添加試料血漿を30μlのaPTT試薬（血小板第3因子試薬＋粒子状アクチベータ）と30μlの第11因子欠乏クエン酸添加血漿（ヒト先天性、George King Bio-Medical 社）とともに37℃でインキュベートして、凝固を開始させた。系列希釈したクエン酸添加対照マウス血漿の標準曲線で結果を内挿した。
表19に示すように、ISIS404071での処置は、第11因子タンパク質の有意な用量依存的低下をもたらした。PBS対照に対する第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。
Figure 2012505660
実施例11：ワルファリンと比較した、FeCl3誘導性静脈血栓症（VT）モデルにおけるマウス第11因子のアンチセンス阻害の in vivo 効果
処置
ISIS404071とワルファリン（COUMADIN）をFeCl3誘導性VTマウスモデルにおいて評価した。1.25 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、又は40 mg/kgのISIS404071を週2回、3週間皮下投与して、6群のBALB/cマウスを処置した。最後のISIS404071の投薬を受けてから2日後に、10 mg/kgのキシラジンと混合した150 mg/kgのケタミンを腹腔内注射により投与して、マウスを麻酔した。0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、及び5 mg/kgのワルファリンを毎日6日間腹腔内投与して、追加の6群のBALB/cマウスを処置した。最後のワルファリンの投薬から4時間後に、10 mg/kgのキシラジンと混合した150 mg/kgのケタミンを腹腔内注射により投与して、マウスを麻酔した。PBSを週2回、3週間皮下投与して、2つの対照群のBALB/cマウスを処置した。最後のPBSの投薬から2日後に、10 mg/kgのキシラジンと混合した150 mg/kgのケタミンを腹腔内注射により投与して、両群のマウスを麻酔した。第一の対照群を除く全群のマウスにおいて、FeCl3で血栓形成を誘導した。
FeCl3処置を受けたマウスにおいて、10％FeCl3溶液で予め飽和させた濾紙片（2×4 mm）を大静脈に直接当てることによって、血栓形成を誘導した。曝露の3分後に、濾紙を除去した。濾紙当てから30分後、その血栓を含有する静脈の一定の長さを血小板分析用に切り出した。肝臓をRNA分析用に採取した。
RNA分析
第11因子のリアルタイムPCR分析用に、RNAを肝臓組織より抽出した。PBS対照に対する第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。表20に示すように、ISIS404071での処置は、PBS対照と比較して、第11因子mRNAの有意な用量依存的低下をもたらした。逆に、ワルファリンでの処置は、PBS対照と比較して、第11因子mRNAの有意な低下をもたらさなかった。
Figure 2012505660
血小板組成の定量
血小板第4因子（PF-4）のリアルタイムPCR定量を使用して、血栓形成の尺度として大静脈中の血小板を定量した。2つのPBS処置対照群に比較した、ISIS404071又はワルファリン処置マウスにおけるPF-4の百分率として結果を提示する。表21に示すように、ISIS404071での処置は、5 mg/kg以上の投与量で、PBS対照と比較して、PF-4の用量依存的な低下をもたらした。ワルファリンでの処置は、2 mg/kg以上の投与量で、PBS対照と比較して、PF-4の低下をもたらした。故に、本明細書に提供する化合物による第11因子の低下は、血栓及び血塊形成を阻害するのに有用である。
Figure 2012505660
実施例12：尾出血（tail bleeding）アッセイにおける、ワルファリンと比較したマウス第11因子のアンチセンス阻害の in vivo 効果
処置
尾出血を測定して、ISIS404071又はワルファリンでの処置がマウスにおいて内出血を引き起こすかどうかを観察した。ISIS404071とワルファリン（COUMADIN）を尾出血アッセイにおいて評価した。1.25 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、又は40 mg/kgのISIS404071を週2回、3週間皮下投与して、6群のBALB/cマウスを処置した。0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、及び5 mg/kgのワルファリンを毎日6日間腹腔内投与して、追加の6群のBALB/cマウスを処置した。PBSを週2回、3週間皮下投与して、別の対照群のBALB/cマウスを処置した。
尾出血アッセイ
ISIS404071、ワルファリン、又はPBSでの最後の処置から2日後、マウスを尾出血チャンバに入れた。このチャンバにおいてマウスをイソフルランで麻酔して、尾の小片（先端からほぼ4 mm）を無菌の鋏で切断した。切断した尾を、ほぼ10 mLの0.9％NaCl緩衝液で満たして37℃へ温めた15 mLファルコン管にすぐに入れた。40分の経過にわたり血液を採取した。この生理食塩水を満たした試験管を出血の前と後で秤量した。この結果を表22に提供する。
ISIS404071での処置は、PBS処置マウスに比較して、出血に影響を及ぼさなかった。しかしながら、ワルファリンは、PBS対照に比較して、マウスでの出血を実際に増加させた。ワルファリンの用量の増加は、血液損失の増加と正の相関を示した。これらのデータは、本明細書に提供する化合物の出血ポテンシャルが特にワルファリンとの比較において低いことを示唆する。これらのデータは、実施例11で得られた結果とともに、本明細書に記載する化合物での第11因子の阻害が関連した出血リスクを伴わずに抗血栓活性をもたらすのに有用であることを示唆する。
Figure 2012505660
実施例13：ワルファリンと比較した、マウス第11因子のアンチセンス阻害のPT及びaPTTに対する in vivo 効果
処置
1.25 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、又は40 mg/kgのISIS404071を週2回、3週間皮下投与して、6群のBALB/cマウスを処置した。0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、及び5 mg/kgのワルファリンを毎日6日間腹腔内投与して、追加の6群のBALB/cマウスを処置した。対照群では、PBSを週2回、3週間皮下投与して、BALB/cマウスを処置した。最後の用量を投与してから2日後に、PPPを採取して、PT及びaPTTアッセイを実施した。
PT及びaPTTアッセイ
表16に提供したPT及びaPTTの数値は、国際標準化比（INR）の値として報告する。PT及びaPTTのINR値は、各実験群（即ち、ISIS404071で、5 mg/kg、10 mg/kg、25 mg/kg、及び50 mg/kgの処置）のPT又はaPTT値をPBS処置群のPT又はaPTTで割ることによって定量した。次いで、使用する組織因子の国際感度指数（ISI）の冪数だけこの比を掛け合わせた。表23に示すように、ワルファリン処置マウスのPTは、どの投与量でも有意に延長している。ワルファリン処置マウスのaPTTは、特に1 mg/kg以上の投与量で延長した。ISIS404071は、PTに有意には影響を及ぼさなかったが、aPTTは、延長させた；しかしながら、ワルファリン処置マウスほど有意ではなかった。これらのデータは、ワルファリンが血液凝固の接触活性化経路と外因性経路の両方に影響を及ぼす一方で、ISIS404071は、血液凝固の接触活性化経路には影響を及ぼすが、その外因性経路には影響を及ぼさないことを示唆する。
Figure 2012505660
実施例14：アピキサバンと比較した、FeCl3誘導性静脈血栓症（VT）モデルにおけるマウス第11因子のアンチセンス阻害の in vivo 効果
処置
ISIS404071とアピキサバンをFeCl3誘導性VTマウスモデルにおいて評価した。1.25 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、又は40 mg/kgのISIS404071を週2回、3週間皮下投与して、6群のBALB/cマウスを処置した。最後のISIS404071の投薬を受けてから2日後に、10 mg/kgのキシラジンと混合した150 mg/kgのケタミンを腹腔内注射により投与して、マウスを麻酔した。0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、及び5 mg/kgのアピキサバンを1回皮下投与して、追加の6群のBALB/cマウスを処置した。アピキサバンを受けてから20分後に、10 mg/kgのキシラジンと混合した150 mg/kgのケタミンを腹腔内注射により投与して、マウスを麻酔した。PBSを週2回、3週間皮下投与して、2つの対照群のBALB/cマウスを処置した。最後のPBSの投薬から2日後に、10 mg/kgのキシラジンと混合した150 mg/kgのケタミンを腹腔内注射により投与して、両群のマウスを麻酔した。第一の対照群を除くすべてのマウスにおいて、FeCl3で血栓形成を誘導した。
FeCl3処置を受けたマウスにおいて、10％FeCl3溶液で予め飽和させた濾紙片（2×4 mm）を大静脈に直接当てることによって、血栓形成を誘導した。曝露の3分後に、濾紙を除去した。濾紙当てから30分後、その血栓を含有する静脈の一定の長さを血小板分析用に切り出した。肝臓をRNA分析用に採取した。
RNA分析
第11因子のリアルタイムPCR分析用に、RNAを肝臓組織より抽出した。PBS対照に対する第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。表24に示すように、ISIS404071での処置は、PBS対照と比較して、第11因子mRNAの有意な用量依存的低下をもたらした。逆に、アピキサバンでの処置は、PBS対照と比較して、第11因子mRNAの有意な低下をもたらさなかった。
Figure 2012505660
血小板組成の定量
血小板第4因子（PF-4）のリアルタイムPCR定量を使用して、血栓形成の尺度として大静脈中の血小板を定量した。表25に示すように、ISIS404071での処置は、PBS対照と比較して、PF-4の低下をもたらした。アピキサバンでの処置も、PBS対照と比較して、PF-4の低下をもたらした。2つのPBS処置対照群と比較した、ISIS404071又はアピキサバン処置マウスにおけるPF-4の百分率として結果を提示する。
Figure 2012505660
実施例15：尾出血アッセイにおける、アピキサバンと比較したマウス第11因子のアンチセンス阻害の in vivo 効果
処置
尾出血を測定して、ISIS404071又はアピキサバンでの処置がマウスにおいて内出血を引き起こすかどうかを観察した。ISIS404071とアピキサバンを尾出血モデルにおいて評価した。1.25 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、又は40 mg/kgのISIS404071を週2回、3週間皮下投与して、6群のBALB/cマウスを処置した。0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、及び5 mg/kgのアピキサバンを単回皮下用量で投与して、追加の6群のBALB/cマウスを処置した。PBSを週2回、3週間皮下投与して、別の対照群のBALB/cマウスを処置した。
尾出血アッセイ
ISIS404071、アピキサバン、又はPBSでの最後の処置から2日後、マウスを尾出血チャンバに入れた。このチャンバにおいてマウスを麻酔して、尾の小片（先端からほぼ4 mm）を無菌の鋏で切断した。切断した尾を、ほぼ10 mLの0.9％NaCl緩衝液で満たして37℃へ温めた15 mLファルコン管にすぐに入れた。40分の経過にわたり血液を採取した。この生理食塩水を満たした試験管を出血の前と後で秤量した。
表26に示すように、ISIS404071での処置は、PBS処置マウスに比較して、出血に影響を及ぼさなかった。しかしながら、アピキサバンは、PBS対照に比較して、マウスでの出血を実際に増加させた。アピキサバンの用量の増加は、血液損失の増加と正の相関を示した。これらのデータは、本明細書に提供する化合物の出血ポテンシャルが特にアピキサバンとの比較において低いことを示唆する。これらのデータは、実施例14で得られた結果とともに、本明細書に記載する化合物での第11因子の阻害が関連した出血リスクを伴わずに抗血栓活性をもたらすのに有用であることを示唆する。
Figure 2012505660
実施例16：LOVENOXとの組合せにおける、マウス第11因子のアンチセンス阻害の ex vivo 効果
処置
10 mg/kg、20 mg/kg、又は40 mg/kgのISIS404071を週2回、3週間皮下投与して、3群のBALB/cマウスを処置した。PBSを週2回、3週間投与して、対照群のマウスを処置した。最後の投薬から5日後、マウスを犠牲にして、血漿を採取した。低分子量（LMW）ヘパリン、LOVENOXを、0μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、及び7.5μg/mlの様々な濃度で血漿へ ex vivo（生体外）投与した。LOVENOXを投与して20分後にPTとaPTTを測定した。
PT及びaPTTアッセイ
表27に示すように、LOVENOXでの処置は、PTを用量依存的なやり方で増加させる。ISIS404071での処置は、PTを有意には増加させない。PTは、ISIS404071での処置によって有意には影響を受けない。ISIS404071及びLOVENOXで処置した血漿において、PTに対する組合せ効果の証拠はない。
Figure 2012505660
表28に示すように、LOVENOXでの処置は、aPTTを用量依存的なやり方で増加させる。ISIS404071での処置も、aPTTを用量依存的なやり方で増加させる。さらに、ISIS404071及びLOVENOXの組合せ処置は、aPTTに対して相乗効果を有するように見える。
Figure 2012505660
実施例17：FeCl3誘導性静脈血栓症（VT）モデルにおける、LOVENOXと組み合わせたマウス第11因子のアンチセンス阻害の in vivo 効果
処置
ISIS404071及びLOVENOXの組合せをFeCl3誘導性VTマウスモデルにおいて評価した。15 mg/kg、30 mg/kg、45 mg/kg、又は60 mg/kgのLOVENOXを1日1回、3日間皮下投与して、4群のBALB/cマウスを処置した。20 mg/kgのISIS404071を週2回、3週間皮下投与して、追加の4群のBALB/cマウスを処置した。最後のISIS404071の投薬後、15 mg/kg、30 mg/kg、45 mg/kg、又は60 mg/kgのLOVENOXを1日1回、3日間皮下投与して、マウスを処置した。PBSを週2回、3週間皮下投与して、2つの対照群のBALB/cマウスを処置した。第一の対照群を除くすべてのマウスにおいて、FeCl3で血栓形成を誘導した。10 mg/kgのキシラジンと混合した150 mg/kgのケタミンを腹腔内注射により投与して、すべてのマウスを麻酔した。
FeCl3処置を受けたマウスにおいて、10％FeCl3溶液で予め飽和させた濾紙片（2×4 mm）を大静脈に直接当てることによって、血栓形成を誘導した。曝露の3分後に、濾紙を除去した。濾紙当てから30分後、その血栓を含有する静脈の一定の長さを血小板分析用に切り出した。
血小板組成の定量
PF-4のリアルタイムPCR定量を使用して、血栓形成の尺度として大静脈中の血小板を定量した。表29に示すように、LOVENOXでの処置は、PBS対照と比較して、PF-4の低下をもたらした。ISIS404071と組み合わせたLOVENOXでの処置は、LOVENOX単独と比較して、PF-4のより大きな低下をもたらした。
Figure 2012505660
実施例18：LOVENOXと組み合わせたマウス第11因子のアンチセンス阻害の、出血に対する in vivo 効果
処置
尾出血を測定して、ISIS404071及びLOVENOXでの処置がマウスにおいて内出血を引き起こすかどうかを観察した。4群のBALB/cマウスへISIS404071を20 mg/kgの投与量で週2回、3週間皮下投与して、ISIS404071処置の最後の3日間に、LOVENOXを15 mg/kg、30 mg/kg、45 mg/kg、及び60 mg/kgの様々な投与量で1日1回皮下投与した。第五群では、BALB/cマウスへISIS404071を20 mg/kgの投与量で週2回、3週間皮下投与した。第六群では、対照として、BALB/cマウスへPBSを週2回、3週間皮下投与した。
尾出血アッセイ
最後の処置を受けてから2日後、マウスを尾出血チャンバに入れた。このチャンバにおいてマウスをイソフルランで麻酔して、尾の小片（先端からほぼ4 mm）を無菌の鋏で切断した。切断した尾を、ほぼ10 mLの0.9％NaCl緩衝液で満たして37℃へ温めた15 mLファルコン管にすぐに入れた。40分の経過にわたり血液を採取した。この生理食塩水を満たした試験管を出血の前と後で秤量した。
表30に示すように、LOVENOXは、PBS処置マウスに比較して、マウスでの出血を増加させた。LOVENOXの用量の増加は、血液損失の増加と正の相関を示した。LOVENOXと組み合わせたISIS404071は、LOVENOX単独処置マウスで示される血液損失の増加以上に出血を有意には増加させなかった。
Figure 2012505660
実施例19：LOVENOXと組み合わせたマウス第11因子のアンチセンス阻害の、
PT及びaPTTに対する in vivo 効果
処置
LOVENOXと組み合わせたISIS404071で処置したマウスからのPPPを使用して、PT及びaPTTを測定した。第一コホートでは、BALB/cマウスへISIS404071を25 mg/kgの投与量で週2回、3週間皮下投与した。これらのマウスより、ISIS404071の最終投薬を受けてから5日後に血漿を採取した。第二コホートでは、BALB/cマウスへLOVENOXを20 mg/kgの投与量で1日1回、3日間皮下投与した。これらのマウスより、LOVENOXの最終投薬を受けてから4時間後に血漿を採取した。第三コホートでは、BALB/cマウスへISIS404071を20 mg/kgの投与量で週2回、3週間皮下投与して、ISIS404071の最終投薬を受けてから2日後に、LOVENOXを20 mg/kgの投与量で1日1回皮下投与した。これらのマウスより、LOVENOXの最終投薬の4時間後に血漿を採取した。第四コホートでは、対照として、PBSを週2回、3週間皮下投与した。これらのマウスより、最終投薬の5日後に血漿を採取した。
PT及びaPTTアッセイ
表31に提供するPT及びaPTT値は、国際標準化比（INR）の数値として報告する。表31に示すように、PTは、ISIS40471、LOVENOXでの処置によっても、LOVENOXと組み合わせたISIS40471での処置によっても有意に影響を受けない。これらのデータは、LOVENOXと組み合わせたISIS404071による、PTに対する組合せの効果はないことを示唆する。また表31に示されるように、LOVENOXでの処置と、LOVENOXと組み合わせたISIS404071での処置は、aPTTを増加させる。これらのデータは、ISIS404071及びLOVENOXの組合せの処置がaPTTに対して相加効果を有することを示唆する。
Figure 2012505660
実施例20：アピキサバンと組み合わせたマウス第11因子のアンチセンス阻害の、
PT及びaPTTに対する in vivo 効果
処置
アピキサバンと組み合わせたISIS404071で処置したマウスからのPPPを使用して、PT及びaPTTを測定した。第一コホートでは、BALB/cマウスへISIS404071を25 mg/kgの投与量で週2回、3週間皮下投与した。これらのマウスより、ISIS404071の最終投薬を受けてから5日後に血漿を採取した。第二コホートでは、BALB/cマウスへアピキサバンを6 mg/kgの投与量で1日2回、3日間皮下投与した。これらのマウスより、アピキサバンの最終投薬を受けてから20分後に血漿を採取した。第三コホートでは、BALB/cマウスへISIS404071を20 mg/kgの投与量で週2回、3週間皮下投与して、ISIS404071処置の最後の3日間に、アピキサバンを6 mg/kgの投与量で1日2回皮下投与した。これらのマウスより、アピキサバンの最終投薬を受けてから20分後に血漿を採取した。第四コホートでは、対照として、PBSを週2回、3週間皮下投与した。PBSの最終投薬の5日後に血漿を採取した。
PT及びaPTTアッセイ
表32に提供するPT及びaPTT値は、国際標準化比（INR）の数値として報告する。表32に示すように、PTは、ISIS40471での処置によって有意には影響を受けない。しかしながら、アピキサバンと、ISIS404071と組み合わせたアピキサバンは、PTを増加させた。また表32に示されるように、アピキサバン、ISIS404071、アピキサバンと組み合わせたISIS404071は、aPTTを増加させる。
Figure 2012505660
実施例21：ワルファリンと組み合わせたマウス第11因子のアンチセンス阻害の、
PT及びaPTTに対する in vivo 効果
処置
ワルファリンと組み合わせたISIS404071で処置したマウスからのPPPを使用して、PT及びaPTTを測定した。25 mg/kg又は50 mg/kgのいずれかのISIS404071を週2回、3週間皮下投与して、2群のBALB/cマウスを処置した。各群より、最終用量を投与してから5日後に血漿を採取した。第3群では、BALB/cマウスを2 mg/kgのワルファリンで、1日1回、5日間処置した。ワルファリンの最終用量を投与してから6時間後に血漿を採取した。25 mg/kg又は50 mg/kgのいずれかのISIS404071を週2回、3週間皮下投与し、ISIS404071処置の最後の5日間にワルファリンを2 mg/kgの投与量で1日1回皮下投与して、2つの追加群のBALB/cマウスを処置した。各群より、最後のワルファリン処置の6時間後に血漿を採取した。BALB/cマウスの最後の群では、対照として、PBSを週2回、3週間皮下投与した。最後のPBS処置の5日後に血漿を採取した。
PT及びaPTTアッセイ
表33に提供するPT及びaPTT値は、国際標準化比（INR）の数値として報告する。表33に示すように、PTは、PBS又はISIS40471での処置により、いずれの投与量でも影響を受けない。しかしながら、2 mg/kgのワルファリン、2 mg/kgワルファリンと組み合わせた25 mg/kgのISIS404071、そして2 mg/kgのワルファリンと組み合わせた50 mg/kgのISIS404071での処置は、PTを増加させる。これらのデータは、ISIS404071及びワルファリンの組合せの処置がPTに対して相加効果を有することを示唆する。また表33に示されるように、aPTTは、ISIS404071とワルファリンでの処置によって影響を受ける。ISIS404071及びワルファリンの組合せは、それぞれの薬物単独より大きいaPTTの増加を示す。これらのデータは、ISIS404071及びワルファリンの組合せの処置がaPTTに対して相乗効果を有することを示唆する。
Figure 2012505660
実施例22：マウスの腸間膜静脈血栓症に対する、マウス第11因子のアンチセンス阻害の in vivo 抗血栓効果
処置
第一コホートでは、C57BL／6マウスへISIS404071を50 mg/kgの用量で週2回、3週間皮下投与した。第二コホートでは、C57Bl／6マウスへ対照オリゴヌクレオチド、ISIS405277（AAGGACCTACACTATGGAAT；第2因子のアンチセンスオリゴヌクレオチド、本明細書では、SEQ ID NO: 12として取り込む）を50 mg/kgの用量で週2回、3週間皮下投与した。
血小板調製
純系C57BL／6マウスの後眼窩静脈より、穿刺によって血液を採取して、300μlのヘパリン（30 U/ml）を含有するポリプロピレン管に採取した。1000 rpmで5分間の遠心分離によって、血小板濃厚血漿（PRP）を入手した。このPRPを、2μlのプロスタグランジンI2（PGI2）（2μg/ml）を含有する新鮮な試験管へ移して、37℃で5分間インキュベートした。2600 rpmでの遠心分離後、2μlのPGI2を含有する1 mlの改良タイロード（Tyrode）-HEPES緩衝液（137 mM NaCl、0.3 mM Na2HPO4、2 mM KCl、12 mM NaHCO3、5 mM HEPES、5 mMグルコース、0.35％ BSA、pH7.2）にペレットを再懸濁させて、37℃で5分間インキュベートした。懸濁したペレットを2600 rpmで5分間遠心分離させた。PGI2を除去するために、洗浄工程を2回繰り返して、血小板をカルセインAM 2.5μg/mL（Molecular Probe,オレゴン州ユージーン）で、室温で10分間、蛍光標識した。
血栓症への生体内顕微鏡法
蛍光標識した血小板をISIS404071処置及び対照オリゴヌクレオチド処置のC57BL／6マウスに静脈内注射した。このマウスを2.5％アバチンで麻酔して、腹壁を貫いて切開を施して、直径250〜300μmで、ほぼ150 s-1のずり速度（shear rate）を有する腸間膜静脈を曝露した。この曝露した腸間膜は、加温（37℃）PBSでの周期的な表面灌流によって、実験を通して湿った状態にした。この腸間膜を、12 V、100 W、DC安定化電源でトランス蛍光化（transluminated）した。CCDビデオカメラ（浜松ホトニックス、浜松市、日本）を使用するSVHSビデオレコーダー（AG-6730；パナソニック、東京、日本）へ接続した Zeiss（ドイツ）Axiovert 135倒立顕微鏡（対物レンズ32倍）を使用して、静脈を可視化した。光学式ドップラー速度計（Microcirculation Research Institute、テキサスA＆M医科大学、テキサス州カレッジステーション）を使用して、中心線赤血球速度（Vrbc）を測定した。ニュートン流体についてのポアズイユの法則：τ＝8（V平均／Dv）［ここでDvは、細静脈の直径であり、V平均は、測定したVrbcより、経験的相関性：V平均＝Vrbc／1.6を使用して推定する］に基づいて、細静脈ずり速度を計算した。
結果分析
最後のアンチセンスオリゴヌクレオチド注射の2日後に、腸間膜静脈の血栓形成（thrombosis）を実施した。10％FeCl3溶液に浸した Whatman 濾紙を腸間膜静脈上に5分間当てることによって、血栓症を誘導した。この静脈を40分間、又は閉塞までモニタリングした。直径30〜50μmの最初の血栓前の経過時間と、血液の流れが30秒間止まる前の経過時間を観測した。
ISIS404071で処置したマウスでは、血栓形成（直径30μm）が14.8±1.7分で生じた。対照マウスでは、血栓形成（直径30μm）が8.9±0.6分で生じた。対照マウスでは、閉塞性の血栓が19.3±0.8分で生成して、すべての損傷した細静脈が閉塞した。対照的に、ISIS404071処置マウスの静脈の大多数は、損傷後40分、そして静脈が閉塞を示して観測を止めるときに、閉塞しなかった。ISIS404071処置マウスにおいて閉塞を示した唯一の静脈は、29.5分で閉塞して、その5分後、試験の終了に先立って、再び開いた。
実施例23：BALB/cマウスにおけるマウス第11因子のアンチセンス阻害への in vivo センス-オリゴヌクレオチド解毒薬
処置
BALB/cマウスにおいて、ISIS404071に対する特異的センスオリゴヌクレオチドの解毒薬としての効果を試験した。第一コホートでは、BALB/cマウスへISIS404071を40 mg/kgの用量で週2回、3週間皮下投与した。第二コホートでは、BALB/cマウスへISIS404057を40 mg/kgの用量で週2回、3週間皮下投与した。両方のコホートへISIS404071の特異的解毒薬、ISIS418026（CCTCTGAAAGTGGATTACCA；ISIS404071へ相補的、本明細書では、SEQ ID NO: 13として取り込む）を、ISIS404071又は404057の最終処置から48時間後に、90 mg/kgの単回注射で皮下投与した。第三コホートでは、BALB/cマウスへISIS404071を40 mg/kgの用量で週2回、3週間皮下投与した。ISIS404071の最終処置に続いて、マウスにPBSを皮下注射した。第四コホートでは、BALB/cマウスへISIS404057を40 mg/kgの用量で週2回、3週間皮下投与した。ISIS404057の最終処置に続いて、マウスにPBSを皮下注射した。解毒薬投与に続く12時間、1日、2日、3日、7日、及び14日の時点で各コホートより4匹のマウスのセットを犠牲にした。全肝臓をRNA分析用に採取して、aPTT分析用にPPPを採取した。
RNA分析
第11因子のリアルタイムPCR分析のために肝臓組織よりRNAを抽出した。PBS対照に対する第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。表34に示すように、解毒薬なしのISIS404071で処置したマウスは、14日の観察期間にわたって阻害の漸進的な減少を示した。しかしながら、ISIS404071及び解毒薬で処置したマウスは、解毒薬を受けなかったマウスと比較して、14日の観察期間にわたって、加速的な減少を示した。また表34に示されるように、ISIS418026での処置は、ISIS404057処置マウスにおける第11因子mRNA発現の阻害に影響を及ぼさなかった。
Figure 2012505660
aPTTアッセイ
表35に示すように、ISIS404071及び解毒薬（ISIS418026）で処置したマウスは、解毒薬なしのISIS404071で処置したマウスと比較して、14日の観察期間にわたり、aPTTの漸進的な減少を示した。
Figure 2012505660
実施例24：BALB/cマウスにおける、マウス第11因子のアンチセンス阻害への in vivo 第7a因子タンパク質-解毒薬
処置
BALB/cマウスにおいて、ヒト第7a因子（第VIIa因子）タンパク質のISIS404071への解毒薬としての効果について試験した。20 mg/kgのISIS404071を週2回、3週間皮下投与して、2つの実験群のBALB/cマウスを処置した。PBSを週2回、3週間皮下投与して、2つの対照群のBALB/cマウスを処置した。第一の対照群を除くすべてのマウスにおいて、FeCl3で血栓形成を誘導した。FeCl3処置の15分前に、第一の実験群を5μg/kgのヒト第7a因子タンパク質解毒薬（製品番号：407act、American Diagnostica 社）で処置した。その最終投薬の2日後に、10 mg/kgのキシラジンと混合した150 mg/kgのケタミンを腹腔内注射により投与して、すべてのマウスを麻酔した。
FeCl3処置を受けたマウスにおいて、10％FeCl3溶液で予め飽和させた濾紙片（2×4 mm）を大静脈に直接当てることによって、血栓形成を誘導した。曝露の3分後に、濾紙を除去した。濾紙当てから30分後、その血栓を含有する静脈の一定の長さを血小板分析用に切り出した。
血小板組成の定量
血小板第4因子（PF-4）のリアルタイムPCR定量を使用して、血栓形成の尺度として大静脈中の血小板を定量した。2つのPBS処置対照群と比較した、解毒薬処置及び非処置マウスにおけるPF-4の百分率として結果を提示する。表36に示すように、ヒト7a因子タンパク質解毒薬で処置した動物は、ISIS404071単独で処置した動物との比較において、より多くのPF-4を発現した。これらのデータは、ヒト7a因子がアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害の効果から救出することに成功することを示す。
Figure 2012505660
実施例25：コラゲナーゼ誘導性脳内出血モデルにおけるマウス第11因子の in vivo アンチセンス阻害
処置
コラゲナーゼ誘導性脳内出血モデルにおいて、ISIS404071とワルファリン（COUMADIN）を試験した。第一コホートでは、BALB/cマウスへISIS404071を40 mg/kgの用量で週2回、2週間皮下投与した。第二コホートでは、マウスへワルファリンを2 mg/kgの用量で週2回、2週間腹腔内投与した。第三コホートでは、BALB/cマウスへISIS421208（TCGGAAGCGACTCTTATATG、マウス第11因子に対して8つのミスマッチ、本明細書では、SEQ ID NO: 14として取り込む）を40 mg/kgの用量で週2回、2週間皮下投与した。第四コホートでは、BALB/cマウスへPBSを週2回、2週間皮下投与した。
その最終投薬を受けてから2日後、すべてのコホートの全マウスを5μg/gのアバチンで麻酔した。次に、0.075 Uコラゲナーゼ（150 U/mL）を含有する10μLのハミルトン（Hamilton）シリンジで、ブレグマ扁平頭蓋（bregma flat skull）より-1 mm AP、1 mm R ML、-4 mm DVの所でマウスに注射した。コラゲナーゼを5分にわたり送達して、注射針をさらに5分間適所に保って、逆流を防いだ。次いで、このマウスについて、出血量、神経脱落スコア、及び死亡率を分析した。
表37は、コラゲナーゼ処置後のマウスで検出された出血量を提示する。表38は、マウスの神経脱落スコアを提示して、表39は、マウスの死亡率を提示する。神経脱落は、脱落なしを0として、重篤な脱落を5とする標準スコアリングシステムによって測定する。まとめると、上記のデータは、ISIS404071がマウスの出血量、神経脱落スコア、及び死亡率に有意な影響を及ぼさなかったことを示唆する。従って、ISIS404071処置マウスでは、ワルファリン処置マウスに比較して、脳内出血のリスク（ワルファリン処置個体にとっての危険因子）が有意に低下する。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
Figure 2012505660
実施例26：FeCl3誘導性静脈血栓症（VT）モデルにおける、PLAVIXと組み合わせたマウス第11因子のアンチセンス阻害の in vivo 効果
処置
ISIS404071及びPLAVIXの組合せをFeCl3誘導性VTマウスモデルにおいて評価した。それぞれほぼ25 gの体重である、4群の8匹のBALB/cマウスを6.25 mg/kg、12.50 mg/kg、25.00 mg/kg、又は50.00 mg/kgのPLAVIXで処置した。このマウスには、1日目に2用量のPLAVIX、そして2日目、外科手術の2時間前に1用量のPLAVIXを与えた。
20 mg/kgのISIS404071を週2回、3週間皮下投与して、それぞれほぼ25 gの体重である、追加の4群の8匹のBALB/cマウスを処置した。ISIS404071の最終投薬の後で、マウスを6.25 mg/kg、12.50 mg/kg、25.00 mg/kg、又は50.00 mg/kgのPLAVIXで処置した。このマウスには、1日目に2用量のPLAVIX、そして2日目、外科手術の2時間前に1用量のPLAVIXを与えた。
それぞれほぼ25 gの体重である、2つの対照群の8匹のBALB/cマウスは、ISIS404071でもPLAVIXでも処置しなかった。それぞれほぼ25 gの体重である、2つの追加対照群の8匹のBALB/cマウスは、20 mg/kgのISIS404071を週2回、3週間皮下投与して処置したが、PLAVIXでは処置しなかった。第一及び第三の対照群を除くすべてのマウスにおいて、FeCl3で血栓形成を誘導した。10 mg/kgのキシラジンと混合した150 mg/kgのケタミンを腹腔内注射により投与して、すべてのマウスを麻酔した。
FeCl3処置を受けたマウスにおいて、10％FeCl3溶液で予め飽和させた濾紙片（2×4 mm）を下大静脈に直接当てることによって、血栓形成を誘導した。曝露の3分後に、濾紙を除去した。濾紙当てから30分後、その血栓を含有する静脈の一定の長さを血小板分析用に切り出した。
血小板組成の定量
PF-4のリアルタイムPCR定量を使用して、血栓形成の尺度として大静脈中の血小板を定量した。表40に示すように、PLAVIXでの処置は、PBS対照と比較して、PF-4の低下をもたらした。ISIS404071と組み合わせたPLAVIXでの処置は、PLAVIX単独と比較して、PF-4のより大きい低下をもたらした。故に、第11因子ASO（アンチセンスオリゴヌクレオチド）と抗血小板療法の組合せは、抗血栓活性を増加させる。データは、PBS＋FeCl3対照と比較した、PF-4 mRNAのパーセントとして提示する。
Figure 2012505660
実施例27：PLAVIXと組み合わせたマウス第11因子のアンチセンス阻害の出血に対する in vivo 効果
処置
尾出血を測定して、PLAVIXと組み合わせたISIS404071での処置が出血傾向の増加を引き起こすかどうかを観測した。5群の8匹のBALB/cマウスへISIS404071を20 mg/kgの投与量で週2回、3週間皮下投与した。ISIS404071の最終投薬の後で、マウスを0 mg/kg、6.25 mg/kg、12.50 mg/kg、25.00 mg/kg、又は50.00 mg/kgのPLAVIXで処置した。このマウスには、1日目に2用量のPLAVIX、そして2日目、出血の2時間前に1用量のPLAVIXを投与した。
5つの追加群の8匹のBABL/cマウスについて、ISIS404071注射を与えないこと以外は、同様に処置した。
尾出血アッセイ
その最後の処置を与えてから2時間後、マウスを尾出血チャンバに入れた。このチャンバにおいてマウスをイソフルランで麻酔して、尾の小片（先端からほぼ4 mm）を無菌の鋏で切断した。切断した尾を、ほぼ10 mLの0.9％NaCl緩衝液で満たして37℃へ温めた15 mLファルコン管にすぐに入れた。40分の経過にわたり血液を採取した。この生理食塩水を満たした試験管を出血の前と後で秤量した。
実施例26の結果と合わせると、これらのデータは、第11因子ASOと抗血小板療法の組合せが、出血リスクの増加を伴うことなく抗血栓活性を増加させることを示す。
Figure 2012505660
実施例28：PLAVIXと組み合わせた第Xa因子低分子阻害剤の出血に対する in vivo 効果
処置
尾出血を測定して、PLAVIXと組み合わせた第10a因子低分子での処置が出血傾向の増加を引き起こすかどうかを観測した。5群の8匹のBALB/cマウスを0 mg/kg、6.25 mg/kg、12.50 mg/kg、25.00 mg/kg、又は50.00 mg/kgのPLAVIXで処置した。マウスには、1日目に2用量のPLAVIX、そして2日目、出血の2時間前に1用量のPLAVIXを与えた。
5つの追加群の8匹のBABL/cマウスを0 mg/kg、6.25 mg/kg、12.50 mg/kg、25.00 mg/kg、又は50.00 mg/kgのPLAVIXで処置した。マウスには、1日目に2用量のPLAVIX、そして2日目、出血の2時間前に1用量のPLAVIXを与えた。これらのマウスは、出血の20分前に、腹腔内に1回、0.5 mg/kgのアピキサバン（低分子第10a因子阻害剤）でも処置した。
尾出血アッセイ
その最後の処置を与えてから2時間後、マウスを尾出血チャンバに入れた。このチャンバにおいてマウスをイソフルランで麻酔して、尾の小片（先端からほぼ4 mm）を無菌の鋏で切断した。切断した尾を、ほぼ10 mLの0.9％NaCl緩衝液で満たして37℃へ温めた15 mLファルコン管にすぐに入れた。40分の経過にわたり血液を採取した。この生理食塩水を満たした試験管を出血の前と後で秤量した。
表42に示すように、これらのデータは、アピキサバンのような低分子第10a因子阻害剤と抗血小板療法の組合せが、出血リスクを増加させることを示す。故に、第11因子ASOと抗血小板療法の組合せでの処置は、低分子第10a因子阻害剤と抗血小板療法の組合せの安全性プロフィールに比較して、よりよい安全性プロフィールを提供する。
Figure 2012505660
実施例29：マウス第11因子の in vivo でのアンチセンス媒介性の低下と対応する血中での抗凝固の経時変化
処置
BALB/cマウスにおいて、マウス第11因子mRNAのアンチセンス媒介性低下の経時変化を観測した。BALB/cマウスへ1回用量の50 mg/kg ISIS404071を皮下投与した。ISIS404071投与に続いて、マウスを12時間、1日、2日、3日、4日、7日、14日、28日、及び56日で犠牲にした。全肝臓をRNA分析用に採取して、aPTT分析用にPPPを採取した。対照群のマウスを1回の皮下用量のPBSで処置した。
RNA分析
第11因子のリアルタイムPCR分析のために肝臓組織よりRNAを抽出した。PBS対照に対する結果を提示する。ISIS404071で処置したマウスは、有意な第11因子mRNAダウンレギュレーションを1日目までに示した。マウスは、第11因子mRNA発現の回復を14目までに始めた。マウスは、完全な第11因子mRNA発現を28日目までに回復して、56日目からの結果は、第11因子mRNAが処置前のレベルに維持されたことを示す。故に、ISIS404071処置マウスは、リバウンド効果を経験しなかった。
リバウンド効果は、第11因子の抗体媒介性の低下ではすでに観測されている（Blood, 初版論文、プレ公表オンライン、2008年10月22日；「Prevention of vascular graft occulsion and thrombus-associated thrombin generation by inhibition of factor XI（第XI因子の阻害による、血管移植片閉塞及び血栓関連トロンビン産生の予防）」。第11因子の過剰発現は、凝固の増加をもたらすことによって傷害性であり得るので、これらのデータは、第11因子のアンチセンス媒介性阻害がリバウンドしないので、第11因子のアンチセンス媒介性阻害は、第11因子の抗体媒介性阻害より安全であることを示唆する。
aPTTアッセイ
表43に提供するaPTT値は、国際標準化比（INR）の数値として報告する。aPTTのINR値は、ISIS404071処置マウスのaPTT値をPBS処置群のaPTTで割ることによって定量した。次いで、使用する組織因子の国際感度指数（ISI）の冪数だけこの比を掛け合わせた。表43に示すように、ISIS404071で処置したマウスは、aPTTの漸進的な減少を4日目まで示してから、処置前レベルへの漸進的な増加を7日目から28日目に示した。
Figure 2012505660
実施例30：マイクロウォークによって設計したオリゴヌクレオチドによる、HepG2細胞におけるヒト第11因子のアンチセンス阻害
ISIS416850及びISIS416858に基づいて、追加のギャップマーを設計した（上記の表8を参照のこと）。これらのギャップマーは、ISIS416850及びISIS416858の上流及び下流でややシフトさせた（即ち、「マイクロウォーク」）。このマイクロウォークギャップマーは、5-8-5MOE又は6-8-6MOEモチーフのいずれかで設計した。
これらのマイクロウォークギャップマーについて in vitro で試験した。エレクトロポレーションを8,000 nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに使用して、20,000個の細胞／ウェルの密度の培養HepG2細胞にトランスフェクトした。ほぼ24時間の処置期間の後で、この細胞よりRNAを単離して、定量的リアルタイムPCRによって第11因子mRNAレベルを測定した。第11因子mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定される全RNA含量に従って補正した。未処置対照細胞に対する第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。
ISIS416850とISIS416858、並びに表1及び8より選択されるギャップマー（即ち、ISIS412206、ISIS412223、ISIS412224、ISIS412225、ISIS413481、ISIS413482、ISIS416825、ISIS416848、ISIS416849、ISIS416850、ISIS416851、ISIS416852、ISIS416853、ISIS416854、ISIS416855、ISIS416856、ISIS416857、ISIS416858、ISIS416859、ISIS416860、ISIS416861、ISIS416862、ISIS416863、ISIS416864、ISIS416865、ISIS416866、及びISIS416867）について、上記の記載と同じ条件の下で、マイクロウォークギャップマーとともに in vitro で再試験した。
表44のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、5-10-5MOE、5-8-5、及び6-8-6MOEギャップマーとして設計した。表44で最初に収載した2つのギャップマーは、元のギャップマー（ISIS416850及びISIS416858）であり、これよりマイクロウォークによってISIS445493〜445543を設計して、アステリスクにより表記する。5-10-5ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、10の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ5ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。5-8-5ギャップマーは、18ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、8の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ5ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。6-8-6ギャップマーは、20ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、8の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ6ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。このモチーフ（5-10-5、5-8-5、及び6-8-6）のそれぞれで、5'ウィングセグメントの各ヌクレオチドと3'ウィングセグメントの各ヌクレオチドは、2'-MOE修飾を有する。それぞれのギャップマー全体のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート（P＝S）連結である。それぞれのギャップマー全体のすべてのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。「ヒト標的開始部位」は、ギャップマーがヒト配列において標的指向される5'末端ヌクレオチドを示す。「ヒト標的終結部位」は、ギャップマーがヒト配列において標的指向される3'末端ヌクレオチドを示す。表44に収載するそれぞれのギャップマーは、SEQ ID NO: 1（GENBANK登録番号NM_000128.3）へ標的指向される。表44のそれぞれのギャップマーはまた、本明細書においてSEQ ID NO: 274（エクソン1〜15 GENBANK登録番号NW_001118167.1）と表記される、アカゲザル第11因子遺伝子配列と完全に交差反応性である。「アカゲザル開始部位」は、ギャップマーがアカゲザル配列において標的指向される5'末端ヌクレオチドを示す。「アカゲザル終結部位」は、ギャップマーがアカゲザル配列へ標的指向される3'末端ヌクレオチドを示す。
表44に示すように、SEQ ID NO: 1の標的開始部位1275に始まって、標的終結部位1317で終わる標的領域（即ち、ヌクレオ塩基1275〜1317）へ標的指向される、マイクロウォーク設計ギャップマーのいずれも、第11因子mRNAの少なくとも60％の阻害を示した。同様に、表1及び8からの再試験ギャップマーのいずれも、少なくとも60％の阻害を示した。
ISIS番号：ISIS412206、412224、412225、413481、413482、416825、416848、416849、416850、416851、416852、416853、416854、416855、416856、416857、416858、416859、416860、416861、416862、416863、416864、416865、416866、416867、445494、445495、445496、445497、445498、445499、445500、445501、445502、445503、445504、445505、445506、445507、445508、445509、445510、445511、445512、445513、445514、445515、445516、445517、445518、445519、445520、445521、445522、445523、445524、445525、445526、445527、445528、445529、445530、445531、445532、445533、445534、445535、445536、445537、455538、445539、445540、445541、445542、及び445543が含まれる、ギャップマーのいくつかは、少なくとも70％の阻害を示した。
ISIS番号：ISIS412206、412224、412225、413481、413482、416825、416848、416849、416850、416851、416852、416853、416854、416855、416856、416857、416858、416859、416860、416861、416862、416863、416864、416865、416866、416867、445494、445495、445496、445497、445498、445500、445501、445502、445503、445504、445505、445506、445507、445508、445509、445510、445513、445514、445519、445520、445521、445522、445525、445526、445529、445530、445531、445532、445533、445534、445535、445536、455538、445541、及び445542が含まれる、ギャップマーのいくつかは、少なくとも80％の阻害を示した。
ISIS番号：ISIS412206、416825、416850、416857、416858、416861、445522、及び445531が含まれる、ギャップマーのいくつかは、少なくとも90％の阻害を示した。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
Figure 2012505660
実施例31：HepG2細胞におけるヒト第11因子の用量依存的なアンチセンス阻害
ヒト第11因子の in vitro 阻害を示す、実施例30からのギャップマーについて、HepG2細胞において様々な用量で試験した。細胞を20,000個の細胞／ウェルの密度でプレート培養して、表45に特定されるように、エレクトロポレーションを使用して、123.46 nM、370.37 nM、1,111.11 nM、3,333.33 nM、及び10,000 nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。ほぼ16時間の処置期間の後で、この細胞よりRNAを単離して、定量的リアルタイムPCRによって第11因子mRNAレベルを測定した。ヒト第11因子プライマープローブセット：RTS2966を使用して、mRNAレベルを測定した。第11因子mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定される全RNA含量に従って補正した。未処置対照細胞に対する第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。表45に例証されるように、第11因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞において用量依存的なやり方で低下した。
使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度をそれぞれの濃度で達成される第11因子mRNA発現の阻害パーセントに対してプロットすることによって、それぞれのオリゴヌクレオチドの半数阻害濃度（IC50）を計算して、PBS対照と比較して、第11因子mRNA発現の50％阻害が達成されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度に注目した。IC50値を表45に提示する。
Figure 2012505660
実施例32：マイクロウォークによって設計したオリゴヌクレオチドによる、HepG2細胞におけるヒト第11因子の用量依存的なアンチセンス阻害
ISIS416850及びISIS416858に基づいて、追加のギャップマーを設計した（上記の表8を参照のこと）。これらのギャップマーは、ISIS416850及びISIS416858の上流及び下流でややシフトさせる（即ち、「マイクロウォーク」）。マイクロウォークによって設計したギャップマーは、3-8-3MOE、4-8-4MOE、2-10-2MOE、3-10-3MOE、又は4-10-4MOEのモチーフを有する。
これらのギャップマーについて、HepG2細胞において様々な用量で試験した。細胞を20,000個の細胞／ウェルの密度でプレート培養して、表47に特定されるように、エレクトロポレーションを使用して、375 nM、750 nM、1,500 nM、3,000 nM、6,000 nM、及び12,000 nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。ほぼ16時間の処置期間の後で、この細胞よりRNAを単離して、定量的リアルタイムPCRによって第11因子mRNAレベルを測定した。ヒト第11因子プライマープローブセット：RTS2966を使用して、mRNAレベルを測定した。第11因子mRNAレベルは、RIBOGREENによって測定される全RNA含量に従って補正した。未処置対照細胞に対する第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。
ISIS416850、ISIS416858、ISIS445522、及びISIS445531（上記の表45を参照のこと）について、上記の記載と同じ条件の下で、マイクロウォークギャップマーとともに in vitro で再試験した。
表46のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、3-8-3MOE、4-8-4MOE、2-10-2MOE、3-10-3MOE、又は4-10-4MOEギャップマーとして設計した。3-8-3ギャップマーは、14ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、8の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ3ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。4-8-4ギャップマーは、16ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、8の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ4ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。2-10-2ギャップマーは、14ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、10の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ2ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。3-10-3ギャップマーは、16ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、10の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ3ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。4-10-4ギャップマーは、18ヌクレオチドの長さであり、ここで中央のギャップセグメントは、10の2'-デオキシヌクレオチドより構成されて、両端に（5'及び3'方向に）それぞれ4ヌクレオチドを含んでなるウィングが隣接する。このモチーフ（3-8-3、4-8-4、2-10-2、3-10-3、及び4-10-4）のそれぞれで、5'ウィングセグメントの各ヌクレオチドと3'ウィングセグメントの各ヌクレオチドは、2'-MOE修飾を有する。それぞれのギャップマー全体のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート（P＝S）連結である。それぞれのギャップマー全体のすべてのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。「ヒト標的開始部位」は、ギャップマーがヒト配列において標的指向される5'末端ヌクレオチドを示す。「ヒト標的終結部位」は、ギャップマーがヒト配列において標的指向される3'末端ヌクレオチドを示す。表46に収載するそれぞれのギャップマーは、SEQ ID NO: 1（GENBANK登録番号NM_000128.3）へ標的指向される。表46のそれぞれのギャップマーはまた、本明細書においてSEQ ID NO: 274（エクソン1〜15 GENBANK登録番号NW_001118167.1）と表記される、アカゲザル第11因子遺伝子配列と完全に交差反応性である。「アカゲザル開始部位」は、ギャップマーがアカゲザル配列において標的指向される5'末端ヌクレオチドを示す。「アカゲザル終結部位」は、ギャップマーがアカゲザル配列へ標的指向される3'末端ヌクレオチドを示す。
Figure 2012505660
用量-応答阻害データを表47に示す。表47に例証されるように、第11因子mRNAレベルは、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞において用量依存的なやり方で低下した。それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドのIC50も計算して、表47に提示した。表47で最初に収載した2つのギャップマーは、元のギャップマー（ISIS416850及びISIS416858）であり、これよりマイクロウォークによって残りのギャップマーを設計して、アステリスクにより表記する。
Figure 2012505660
実施例33：ヒト第11因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドのCD1マウスにおける忍容性
ヒト第11因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドでCD1マウスを処置して、様々な代謝マーカーのレベルの変化を評価した。
処置
数群の5匹のCD1マウスのそれぞれに、週2回、2、4、又は6週の間、50 mg/kgのISIS416825、ISIS416826、ISIS416838、ISIS416850、ISIS416858、ISIS416864、ISIS416892、ISIS416925、ISIS416999、ISIS417002、又はISIS417003を皮下注射した。対照群の5匹のマウスには、2週間、PBSを皮下注射した。すべての実験群（即ち、2、4、6週間、ASO処置したマウス）を対照群（即ち、PBS、2週間）と比較した。
すべての群へ最終用量を投与してから3日後に、マウスを犠牲にした。臓器重量を測定して、さらなる分析のために血液を採取した。
臓器重量
肝臓、脾臓、及び腎臓の重量を試験の最後に測定して、体重へ正規化したPBS対照のパーセントとして、表48、49、及び50に提示する。肝臓及び脾臓の重量がPBS対照の6倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
Figure 2012505660
肝機能
肝機能に対するISISオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、トランスアミナーゼの血漿濃度を測定した。アラニントランスアミナーゼ（ALT）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）の測定値をIU/Lで表して、その結果を表51及び52に提示する。ビリルビン及びアルブミンの血漿レベルも同じ臨床化学分析機を使用して測定して、mg/dLで表した。この結果を表53及び54に提示する。ALT/ASTレベルが対照レベルの7倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。ビリルビンのレベルを対照レベルの2倍より多く増加させなかったアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
Figure 2012505660
Figure 2012505660
腎機能
腎機能に対するISISオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、血中尿素窒素（BUN）及びクレアチニンの血漿濃度を測定した。結果をmg/dLで表して、表55及び56に提示する。BUNレベルがPBS対照に比較して2倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
血液学アッセイ
すべてのマウス群より入手した血液をヘマトクリット（HCT）、平均赤血球容積（MCV）、平均赤血球ヘモグロビン量（MCH）、及び平均赤血球ヘモグロビン濃度（MCHC）の測定及び分析、並びにWBC（好中球、リンパ球、及び単球）、RBC、血小板のような様々な血球と全ヘモグロビン含量の測定のために Antech Diagnostics へ送った。この結果を表57〜67に提示する。表に示す百分率は、全血球数のパーセントを示す。50％より多い血小板数の減少、及び／又は3倍より多い単球数の増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
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Figure 2012505660
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Figure 2012505660
Figure 2012505660
実施例34：CD1マウス肝臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの半減期の測定
ヒト第11因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドでCD1マウスを処置して、このオリゴヌクレオチドの半減期、並びにオリゴヌクレオチドの分解と肝臓からの消失の経過時間について評価した。
処置
数群の15匹のCD1マウスのそれぞれに、週2回、2週間、50 mg/kgのISIS416825、ISIS416826、ISIS416838、ISIS416850、ISIS416858、ISIS416864、ISIS416892、ISIS416925、ISIS416999、ISIS417002、又はISIS417003を皮下注射した。各群より5匹のマウスを、最終投薬に続く3日目、28日目、及び56日目に犠牲にした。肝臓を分析用に回収した。
オリゴヌクレオチド濃度の測定
全長オリゴヌクレオチドの濃度、並びにオリゴヌクレオチド全体（分解型が含まれる）の濃度を測定した。使用した方法は、フェノール-クロロホルム（液体-液体）抽出に続く固相抽出からなる、すでに公表された方法（Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999）の改良法である。抽出に先立って、内部標準（ISIS355868、27マー2'-O-メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT、本明細書ではSEQ ID NO: 270と表記する）を加えた。定量下限濃度（LLOQ）がほぼ1.14μg/gである検量線を使用して、組織試料濃度を計算した。次いで、WinNonlin ソフトウェア（PHARSIGHT）を使用して、半減期を計算した。
この結果をμg/g（肝臓組織）として表して、表68及び69に提示する。各オリゴヌクレオチドの半減期を表70に提示する。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
Figure 2012505660
実施例35：ヒト第11因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドのスプラーグ・ドーリーラットにおける忍容性
ヒト第11因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドでスプラーグ・ドーリーラットを処置して、様々な代謝マーカーのレベルの変化を評価した。
処置
数群の4匹のスプラーグ・ドーリーラットのそれぞれに、週2回、6週間、50 mg/kgのISIS416825、ISIS416826、ISIS416838、ISIS416850、ISIS416858、ISIS416848、ISIS416864、ISIS416892、ISIS416925、ISIS416999、ISIS417002、又はISIS417003を皮下注射した。対照群の4匹のスプラーグ・ドーリーラットには、週2回、6週間、PBSを皮下注射した。体重測定を処置期間の前とそれを通して行なった。尿試料を処置の開始前に採取した。最終投薬から3日後に、尿試料を採取して、ラットを犠牲にした。臓器重量を測定して、さらなる分析のために血液を採取した。
体重と臓器重量
ラットの体重を試験の開始時に、そしてその後、週2回測定した。体重を表71に提示して、試験の開始時に記録した重量に対する変化パーセントとして表す。肝臓、脾臓、及び腎臓の重量を試験の最後に測定して、体重へ正規化した生理食塩水対照のパーセントとして表71に提示する。肝臓及び脾臓の重量がPBS対照の6倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
肝機能
肝機能に対するISISオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、トランスアミナーゼの血漿濃度を測定した。アラニントランスアミナーゼ（ALT）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）の測定値をIU/Lで表して、その結果を表72に提示する。ALT/ASTレベルが対照レベルの7倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。ビリルビン及びアルブミンの血漿レベルも同じ臨床化学分析機で測定して、その結果もmg/dLで表して、表72に提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置による、ビリルビンのレベルの対照レベルの2倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
腎機能
腎機能への影響を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、血中尿素窒素（BUN）及びクレアチニンの血漿濃度を測定した。結果をmg/dLで表して、表73に提示する。BUNレベルがPBS対照に比較して2倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。全尿試料における尿タンパク質対クレアチニンの比もアンチセンスオリゴヌクレオチド処置の前と後で計算して、表74に提示する。尿タンパク質／クレアチニンの比がPBS対照に比較して5倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
血液学アッセイ
すべてのラット群より入手した血液をヘマトクリット（HCT）、平均赤血球容積（MCV）、平均赤血球ヘモグロビン量（MCH）、及び平均赤血球ヘモグロビン濃度（MCHC）の測定及び分析、並びにWBC（好中球、リンパ球、及び単球）、RBC、及び血小板のような様々な血球とヘモグロビン含量の測定のために Antech Diagnostics へ送った。この結果を表75及び76に提示する。50％より多い血小板数の減少と3倍より多い単球数の増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
実施例36：スプラーグ・ドーリーラットの肝臓及び腎臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの半減期の測定
ヒト第11因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドでスプラーグ・ドーリーラットを処置して、このオリゴヌクレオチドの半減期、並びにオリゴヌクレオチドの分解と肝臓及び腎臓からの消失の経過時間について評価した。
処置
数群の4匹のスプラーグ・ドーリーラットのそれぞれに、週2回、2週間、20 mg/kgのISIS416825、ISIS416826、ISIS416838、ISIS416850、ISIS416858、ISIS416864、ISIS416892、ISIS416925、ISIS416999、ISIS417002、又はISIS417003を皮下注射した。最終投薬から3日後、ラットを犠牲にして、肝臓と腎臓を分析用に回収した。
オリゴヌクレオチド濃度の測定
全長オリゴヌクレオチドの濃度、並びにオリゴヌクレオチド全体（分解型が含まれる）の濃度を測定した。使用した方法は、フェノール-クロロホルム（液体-液体）抽出に続く固相抽出からなる、すでに公表された方法（Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999）の改良法である。抽出に先立って、内部標準（ISIS355868、27マー2'-O-メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT、本明細書ではSEQ ID NO: 270と表記する）を加えた。定量下限濃度（LLOQ）がほぼ1.14μg/gである検量線を使用して、組織試料濃度を計算した。この結果をμg/g（肝臓又は腎臓の組織）として表して、表77及び78に提示する。次いで、WinNonlin ソフトウェア（PHARSIGHT）を使用して、半減期を計算した。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
Figure 2012505660
実施例37：ヒト第11因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドのCD1マウスにおける忍容性
ヒト第11因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドでCD1マウスを処置して、様々な代謝マーカーのレベルの変化を評価した。
処置
数群の5匹のCD1マウスのそれぞれに、週2回、6週間、50 mg/kgのISIS412223、ISIS412224、ISIS412225、ISIS413481、ISIS413482、ISIS416848、ISIS416849、ISIS416850、ISIS416851、ISIS416852、ISIS416853、ISIS416854、ISIS416855、ISIS416856、ISIS416857、ISIS416858、ISIS416859、ISIS416860、ISIS416861、ISIS416862、ISIS416863、ISIS416864、ISIS416865、ISIS416866、又はISIS416867を皮下注射した。対照群の10匹のCD1マウスには、週2回、6週間、PBSを皮下注射した。体重測定を処置期間の前とそれを通して行なった。最終投薬から3日後に、尿試料を採取して、マウスを犠牲にし、臓器重量を測定して、さらなる分析のために血液を採取した。
体重と臓器重量
体重を試験の開始時に、そしてその後、週2回測定した。マウスの体重を表80に提示して、処置の開始時に記録したPBS対照体重に優るグラム数で増加を表す。肝臓、脾臓、及び腎臓の重量を試験の最後に測定して、体重の百分率として表80にまた提示する。肝臓及び脾臓の重量がPBS対照の6倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
肝機能
肝機能に対するISISオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、トランスアミナーゼの血漿濃度を測定した。アラニントランスアミナーゼ（ALT）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）の測定値をIU/Lで表して、その結果を表81に提示する。ALT/ASTレベルが対照レベルの7倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。ビリルビン、コレステロール、及びアルブミンの血漿レベルも同じ臨床化学分析機を使用して測定し、mg/dLで表して、表81に提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置による、ビリルビンのレベルの対照レベルの2倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
腎機能
腎機能に対するISISオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動化臨床化学分析機を使用して、血中尿素窒素（BUN）の血漿濃度を測定し、結果をmg/dLで表して、表82に提示する。BUNレベルがPBS対照に比較して2倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
血液学アッセイ
すべてのマウス群より入手した血液をヘマトクリット（HCT）測定、並びにWBC（好中球、リンパ球、及び単球）、RBC、及び血小板のような様々な血球と全ヘモグロビン含量分析の測定のために Antech Diagnostics へ送った。この結果を表83及び84に提示する。50％より多い血小板数の減少と3倍より多い単球数の増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
実施例38：CD1マウス肝臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの半減期の測定
CD1マウスにおいてすでに評価した15種のアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例37）についてさらに評価した。CD1マウスをISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置して、このオリゴヌクレオチドの半減期、並びに肝臓におけるオリゴヌクレオチドの分解及び消失の経過時間について評価した。
処置
数群の15匹のCD1マウスのそれぞれに、週2回、2週間、50 mg/kgのISIS412223、ISIS412225、ISIS413481、ISIS413482、ISIS416851、ISIS416852、ISIS416856、ISIS416860、ISIS416861、ISIS416863、ISIS416866、ISIS416867、ISIS412224、ISIS416848、又はISIS416859を皮下注射した。各群より5匹のマウスを、最終投薬後の3日目、28日目、及び56日目に犠牲にして、肝臓を分析用に回収した。
オリゴヌクレオチド濃度の測定
全長オリゴヌクレオチドの濃度を測定した。使用した方法は、フェノール-クロロホルム（液体-液体）抽出に続く固相抽出からなる、すでに公表された方法（Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999）の改良法である。抽出に先立って、内部標準（ISIS355868、27マー2'-O-メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT、本明細書ではSEQ ID NO: 270と表記する）を加えた。定量下限濃度（LLOQ）がほぼ1.14μg/gである検量線を使用して、組織試料濃度を計算した。この結果をμg/g（肝臓組織）として表して、表85に提示する。各オリゴヌクレオチドの半減期も、表85に提示した。
Figure 2012505660
実施例39：ヒト第11因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドのスプラーグ・ドーリーラットにおける忍容性
CD1マウスにおいてすでに評価した15種のアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例37）について、スプラーグ・ドーリーラットにおいて様々な代謝マーカーのレベルの変化をさらに評価した。
処置
数群の4匹のスプラーグ・ドーリーラットのそれぞれに、週2回、6週間、50 mg/kgのISIS412223、ISIS412224、ISIS412225、ISIS413481、ISIS413482、ISIS416848、ISIS416851、ISIS416852、ISIS416856、ISIS416859、ISIS416860、ISIS416861、ISIS416863、ISIS416866、又はISIS416867を皮下注射した。対照群の4匹のスプラーグ・ドーリーラットには、週2回、6週間、PBSを皮下注射した。体重測定を処置期間の前とそれを通して行なった。最終投薬から3日後に、尿試料を採取してから、ラットを犠牲にし、臓器重量を測定して、さらなる分析のために血液を採取した。
体重と臓器重量
ラットの体重を試験の開始時に、そしてその後、週2回測定した。体重を表86に提示して、処置の開始時に記録したPBS対照体重に優るグラム数の増加として表す。肝臓、脾臓、及び腎臓の重量を試験の最後に測定して、体重の百分率として表86にまた提示する。肝臓及び脾臓の重量がPBS対照の6倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
肝機能
肝機能に対するISISオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、トランスアミナーゼの血漿濃度を測定した。アラニントランスアミナーゼ（ALT）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）の測定値をIU/Lで表して、その結果を表87に提示する。ALT/ASTレベルが対照レベルの7倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。ビリルビン及びアルブミンの血漿レベルも同じ臨床化学分析機を使用して測定して、その結果をmg/dLで表して、表87に提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置による、ビリルビンのレベルの対照レベルの2倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
腎機能
腎機能に対するISISオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、血中尿素窒素（BUN）及びクレアチニンの血漿濃度を測定した。結果をmg/dLで表して、表88に提示する。BUNレベルがPBS対照に比較して2倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。全尿試料における全尿タンパク質と尿タンパク質対クレアチニンの比をアンチセンスオリゴヌクレオチド処置の後で計算して、表88にまた提示する。尿タンパク質／クレアチニンの比がPBS対照に比較して5倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
血液学アッセイ
すべてのラット群より入手した血液をヘマトクリット（HCT）測定、並びにWBC（好中球及びリンパ球）、RBC、及び血小板のような様々な血球と全ヘモグロビン含量の測定のために Antech Diagnostics へ送った。この結果を表89及び90に提示する。50％より多い血小板数の減少と3倍より多い単球数の増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
実施例40：スプラーグ・ドーリーラットの肝臓及び腎臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの半減期の測定
ヒト第11因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドでスプラーグ・ドーリーラットを処置して、このオリゴヌクレオチドの半減期、並びにオリゴヌクレオチドの分解と肝臓及び腎臓からの消失の経過時間について評価した。
処置
数群の4匹のスプラーグ・ドーリーラットのそれぞれに、週2回、2週間、20 mg/kgのISIS412223、ISIS412224、ISIS412225、ISIS413481、ISIS413482、ISIS416848、ISIS416851、ISIS416852、ISIS416856、ISIS416859、ISIS416860、ISIS416861、ISIS416863、ISIS416866、又はISIS416867を皮下注射した。最終投薬から3日後、ラットを犠牲にして、肝臓と腎臓を回収した。
オリゴヌクレオチド濃度の測定
全長オリゴヌクレオチドの濃度、並びにオリゴヌクレオチド全体（分解型が含まれる）の濃度を測定した。使用した方法は、フェノール-クロロホルム（液体-液体）抽出に続く固相抽出からなる、すでに公表された方法（Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999）の改良法である。抽出に先立って、内部標準（ISIS355868、27マー2'-O-メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT、本明細書ではSEQ ID NO: 270と表記する）を加えた。定量下限濃度（LLOQ）がほぼ1.14μg/gである検量線を使用して、組織試料濃度を計算した。この結果をμg/g（肝臓又は腎臓の組織）として表して、表91及び92に提示する。次いで、WinNonlin ソフトウェア（PHARSIGHT）を使用して、半減期を計算した。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
Figure 2012505660
実施例41：ヒト第11因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドのCD1マウスにおける忍容性
ヒト第11因子に標的指向する、6-8-6MOE及び5-8-5MOEモチーフのISISオリゴヌクレオチドをCD1マウスに投与して、様々な代謝マーカーのレベルの変化を評価した。
処置
数群の5匹のCD1マウスのそれぞれに、週2回、6週間、50 mg/kgのISIS416850、ISIS445498、ISIS445503、ISIS445504、ISIS445505、ISIS445509、ISIS445513、ISIS445522、ISIS445530、ISIS445531、又はISIS445532を皮下注射した。対照群の5匹のマウスには、週2回、6週間、PBSを皮下注射した。体重測定を処置期間の前と最後に行った。最終投薬から3日後に、マウスを犠牲にし、臓器重量を測定して、さらなる分析のために血液を採取した。
体重と臓器重量
マウスの体重変化を表94に提示して、試験の開始時に記録したPBS対照体重に優るグラム数で増加を表す。肝臓、脾臓、及び腎臓の重量を試験の最後に測定して、体重の百分率として表94にまた提示する。肝臓及び脾臓の重量がPBS対照の6倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
肝機能
肝機能に対するISISオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、トランスアミナーゼの血漿濃度を測定した。アラニントランスアミナーゼ（ALT）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）の測定値をIU/Lで表して、その結果を表95に提示する。ALT/ASTレベルが対照レベルの7倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。ビリルビン及びアルブミンの血漿レベルも測定して、結果をmg/dLで表して、表95にまた提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置による、ビリルビンのレベルの対照レベルの2倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
腎機能
腎機能に対するISISオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、血中尿素窒素（BUN）の血漿濃度を測定した。結果をmg/dLで表して、表96に提示する。BUNレベルがPBS対照に比較して2倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
血液学アッセイ
すべてのマウス群より入手した血液をヘマトクリット（HCT）測定、並びにWBC（好中球及びリンパ球）、RBC、及び血小板のような様々な血球と全ヘモグロビン含量の測定のために Antech Diagnostics へ送った。この結果を表97及び98に提示する。50％より多い血小板数の減少と3倍より多い単球数の増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
実施例42：ヒト第11因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドのスプラーグ・ドーリーラットにおける忍容性
CD1マウスにおいてすでに評価した8種のアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例41）について、スプラーグ・ドーリーラットにおいて様々な代謝マーカーのレベルの変化をさらに評価した。
処置
数群の4匹のスプラーグ・ドーリーラットのそれぞれに、週2回、6週間、50 mg/kgのISIS445498、ISIS445504、ISIS445505、ISIS445509、ISIS445513、ISIS445522、ISIS445530、又はISIS445531を皮下注射した。対照群のスプラーグ・ドーリーラットには、週2回、6週間、PBSを皮下注射した。体重測定を処置期間の前とそれを通して行なった。最終投薬から3日後に、尿試料を採取してから、ラットを犠牲にし、臓器重量を測定して、さらなる分析のために血液を採取した。
体重と臓器重量
ラットの体重を試験の開始時に、そしてその後、週2回測定した。体重を表99に提示して、処置の開始時に記録したPBS対照重量に対する増加パーセントとして表す。肝臓、脾臓、及び腎臓の重量を試験の最後に測定して、体重の百分率として表99にまた提示する。肝臓及び脾臓の重量がPBS対照の6倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
肝機能
肝機能に対するISISオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、トランスアミナーゼの血漿濃度を測定した。ALT（アラニントランスアミナーゼ）及びAST（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）の血漿濃度を測定して、結果をIU/Lで表して、表100に提示する。ALT/ASTレベルが対照レベルの7倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。ビリルビン及びアルブミンの血漿レベルも同じ臨床化学分析機を使用して測定して、その結果をmg/dLで表して、表100に提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置による、ビリルビンのレベルの対照レベルの2倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
腎機能
腎機能に対するISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、血中尿素窒素（BUN）及びクレアチニンの血漿濃度を測定した。結果をmg/dLで表して、表101に提示する。BUNレベルがPBS対照に比較して2倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。全尿試料における全尿タンパク質と尿タンパク質対クレアチニンの比をアンチセンスオリゴヌクレオチド処置の後で計算して、表101にまた提示する。尿タンパク質／クレアチニンの比がPBS対照に比較して5倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
血液学アッセイ
すべてのラット群より入手した血液をヘマトクリット（HCT）測定、並びにWBC（好中球、リンパ球、及び単球）、RBC、及び血小板のような様々な血球と全ヘモグロビン含量の測定のために Antech Diagnostics へ送った。この結果を表102及び103に提示する。50％より多い血小板数の減少と3倍より多い単球数の増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
実施例43：ヒト第11因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドのCD1マウスにおける忍容性
ヒト第11因子に標的指向する、4-8-4MOE、3-8-3MOE、2-10-2MOE、3-10-3MOE、及び4-10-4MOEモチーフのISISオリゴヌクレオチドをCD1マウスに投与して、様々な代謝マーカーのレベルの変化を評価した。
処置
数群の5匹のCD1マウスのそれぞれに、週2回、6週間、50 mg/kgのISIS449707、ISIS449708、ISIS449409、ISIS449710、又はISIS449711を皮下注射した。対照群の5匹のCD1マウスには、週2回、6週間、PBSを皮下注射した。体重測定を処置期間の前と最後に行なった。最終投薬から3日後に、マウスを犠牲にし、臓器重量を測定して、さらなる分析のために血液を採取した。
体重と臓器重量
試験の最後に記録したマウスの体重をグラム数で表して、表104に提示する。肝臓、脾臓、及び腎臓の重量も試験の最後に測定して、体重の百分率として表104にまた提示する。肝臓及び脾臓の重量がPBS対照の6倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
肝機能
肝機能に対するISISオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、トランスアミナーゼの血漿濃度を測定した。ALT（アラニントランスアミナーゼ）及びAST（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）の血漿濃度を測定して、結果をIU/Lで表して、表105に提示する。ALT/ASTレベルが対照レベルの7倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。ビリルビン及びアルブミンの血漿レベルも同じ臨床化学分析機を使用して測定して、その結果をmg/dLで表して、表105に提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置による、ビリルビンのレベルの対照レベルの2倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
腎機能
腎機能に対するISISオリゴヌクレオチドの効果を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、血中尿素窒素（BUN）及びクレアチニンの血漿濃度を測定した。結果をmg/dLで表して、表106に提示する。BUNレベルがPBS対照に比較して2倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
血液学アッセイ
すべてのマウス群より入手した血液をヘマトクリット（HCT）測定、並びにWBC（好中球、リンパ球、及び単球）、RBC、及び血小板のような様々な血球と全ヘモグロビン含量の測定のために Antech Diagnostics へ送った。この結果を表107及び108に提示する。50％より多い血小板数の減少と3倍より多い単球数の増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
実施例44：ヒト第11因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドのスプラーグ・ドーリーラットにおける忍容性
CD1マウスにおいてすでに評価した5種のアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例43）について、スプラーグ・ドーリーラットにおいて様々な代謝マーカーのレベルの変化をさらに評価した。
処置
数群の4匹のスプラーグ・ドーリーラットのそれぞれに、週2回、6週間、50 mg/kgのISIS449707、ISIS449708、ISIS449709、ISIS449710、又はISIS449711を皮下注射した。対照群の4匹のスプラーグ・ドーリーラットには、週2回、6週間、PBSを皮下注射した。体重測定を処置期間の前とそれを通して行なった。最終投薬から3日後に、尿試料を採取してから、ラットを犠牲にし、臓器重量を測定して、さらなる分析のために血液を採取した。
体重と臓器重量
ラットの体重を試験の開始時と試験の終了時に測定した。体重の変化を表109に提示して、処置の開始時に記録したPBS対照重量に優る増加としてグラム数で表す。肝臓、脾臓、及び腎臓の重量を試験の最後に測定して、体重の百分率として表109にまた提示する。肝臓及び脾臓の重量がPBS対照の6倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
肝機能
肝機能に対するISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、ALT及びASTの血漿濃度を測定した。アラニントランスアミナーゼ（ALT）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）の血漿濃度を測定して、その結果をIU/Lで表して、表110に提示する。ALT/ASTレベルが対照レベルの7倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。ビリルビン及びアルブミンの血漿レベルも測定して、結果をmg/dLで表して、表110に提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置による、ビリルビンのレベルの対照レベルの2倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
腎機能
腎機能に対するISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、BUN及びクレアチニンの血漿濃度を測定した。結果をmg/dLで表して、表111に提示する。BUNレベルがPBS対照に比較して2倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。全尿試料における全尿タンパク質と尿タンパク質対クレアチニンの比をアンチセンスオリゴヌクレオチド処置の後で計算して、表111にまた提示する。尿タンパク質／クレアチニンの比がPBS対照に比較して5倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
血液学アッセイ
すべてのラット群より入手した血液をヘマトクリット（HCT）測定、並びにWBC（好中球、リンパ球、及び単球）、RBC、及び血小板のような様々な血球と全ヘモグロビン含量の測定のために Antech Diagnostics へ送った。この結果を表112及び113に提示する。50％より多い血小板数の減少と3倍より多い単球数の増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
実施例45：カニクイザルにおける、ヒト第11因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの用量依存的な薬理効果
いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドをカニクイザルにおいて試験して、第11因子活性、抗凝固及び出血の時間、肝臓及び腎臓での分布、及び忍容性に対する、このオリゴヌクレオチドの薬理効果を判定した。この試験に使用したすべてのISISオリゴヌクレオチドは、標的ヒト第11因子mRNAに標的指向して、アカゲザルの遺伝子配列とも完全に交差反応性である（表44を参照のこと）。アカゲザルのISISオリゴヌクレオチドは、カニクイザルの遺伝子配列とも完全に交差反応性であると予測される。本試験を行った時点で、カニクイザルのゲノム配列は、米国立生物工学情報センター（NCBI）のデータベースで入手可能でなかった；故に、カニクイザルの遺伝子配列との交差反応性を確かめることはできなかった。
処置
2匹の雄ザルと3匹の雌ザルからそれぞれなる数群のサルに、ISIS416838、ISIS416850、ISIS416858、ISIS416864、又はISIS417002を上昇用量で皮下注射した。そのサルへアンチセンスオリゴヌクレオチドを5 mg/kgで週3回、1週間；5 mg/kgで週2回、2及び3週間；10 mg/kgで週3回、4週間；10 mg/kgで週2回、5及び6週間；25 mg/kgで週3回、7週間；及び、25 mg/kgで週2回、8、9、10、11、及び12週間投与した。2匹の雄ザルと3匹の雌ザルからなる1つの対照群に、同じ投薬レジメンに従って、PBSを皮下投与した。2匹の雄ザルと3匹の雌ザルからなる追加の実験群に、慢性的でより低い用量レジメンでISIS416850を皮下注射した。そのサルへアンチセンスオリゴヌクレオチドを5 mg/kgで週3回、1週間；5 mg/kgで週2回、2及び3週間；10 mg/kgで週3回、4週間；及び、10 mg/kgで週2回、5〜12週間投与した。体重を毎週測定した。血漿中の第11因子タンパク質活性分析、フィブリノーゲン測定、PT及びaPTT測定、出血時間、及び様々な血液学的因子の測定のために、血液試料を処置の開始の14日前と5日前に、そしてその後は週1回採取した。85日目、このサルを、深い麻酔下の間に瀉血により安楽死させて、臓器をさらなる分析用に回収した。
RNA分析
85日目に、プライマープローブセット：LTS00301（フォワードプライマー配列：ACACGCATTAAAAAGAGCAAAGC、本明細書においてSEQ ID NO: 271として表記する；リバースプライマー配列：CAGTGTCATGGTAAAATGAAGAATGG、本明細書においてSEQ ID NO: 272として表記する；及び、プローブ配列：TGCAGGCACAGCATCCCAGTGTTCTX、本明細書においてSEQ ID NO: 273として表記する）を使用する第11因子のリアルタイムPCR分析のために肝臓組織よりRNAを抽出した。PBS対照に対する第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。表114に示すように、ISISオリゴヌクレオチドでの処置は、PBS対照と比較して、第11因子mRNAの有意な低下をもたらした。
Figure 2012505660
タンパク質分析
全群のサルより異なる日に採取した血漿試料を、アフィニティー精製ポリクローナル抗第11因子抗体を捕捉抗体として、そしてペルオキシダーゼ共役ポリクローナル抗第11因子抗体を検出抗体として使用するサンドイッチ式ELISAアッセイ（Affinity Biologicals 社）によって分析した。サルの血漿をアッセイ用に50倍希釈した。ペルオキシダーゼ活性を、基質：o-フェニレンジアミンとのインキュベーションによって発現させた。発現された色は、マイクロプレートリーダーを490 nmで使用して定量して、試料中の第11因子の濃度に比例するとみなされた。
この結果を、PBS対照のそれに対する百分率の低下として表して、表115に提示する。ISIS416850及びISIS416858での処置は、タンパク質レベルの時間依存的な減少をもたらした。
Figure 2012505660
PT及びaPTTアッセイ
クエン酸ナトリウムを含有する試験管に血液試料を採取した。PT及びaPTTは、ACL9000凝固機器（Instrumentation Laboratory、イタリア）を用いて、同一2検体で定量した。試験した系列希釈クエン酸添加対照サル血漿の標準曲線で結果を内挿して、報告結果を正常値パーセントで示した。
ISISオリゴヌクレオチドで処置したサルからの血小板欠乏血漿（PPP）を使用して、プロトロンビン時間（PT）と活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）を測定した。PT及びaPTTの数値を表116及び117に提供して、国際標準化比（INR）値として報告する。PT及びaPTTのINR値は、各実験群のPT又はaPTT値をPBS処置群のPT又はaPTTで割ることによって定量した。次いで、使用する組織因子の国際感度指数（ISI）の冪数だけこの比を掛け合わせた。慢性用量レジメンで投与したISISオリゴヌクレオチドのISIS416850を他のオリゴヌクレオチドからアステリスク（＊）で識別する。
表116に示すように、PTは、ISISオリゴヌクレオチドで処置したサルにおいて、上昇用量レジメン又は慢性用量レジメンのいずれでも、有意には延長しなかった。しかしながら、aPTTは、表117に提示するように、用量依存的なやり方で延長した。これらのデータは、第11因子のアンチセンス低下が血液凝固の接触活性化経路には影響を及ぼすが、その外因性経路には影響を及ぼさないことを示唆する。故に、第11因子のアンチセンス低下は、組織損傷への応答ではなく、異常な血管壁に応答した血栓又は血塊の形成を阻害するのに有用である。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
タンパク質活性分析
血液試料を様々な時点で採取して、凝固時間に基づいたF11アッセイを使用して、第11因子プロ酵素を測定した。凝固時間は、ST4半自動化凝固測定機器（Diagnostica Stago、ニュージャージー州）を用いて、同一2検体で定量した。BSA入りHEPES-NaCl緩衝液で20倍希釈した30μlのクエン酸添加試料血漿を30μlのaPTT試薬（自動化aPTT、Organon Technika、ノースカロライナ州）と30μlの第11因子欠乏クエン酸添加血漿（George King Bio-Medical 社）とともに37℃で5分間インキュベートして、30μlの25 mM CaCl2の添加を続けて、凝固を開始させた。系列希釈したクエン酸添加対照血漿の標準曲線で結果を内挿した。
結果を、PBS対照に対する第11因子活性の阻害パーセントとして表118に提示する。慢性用量レジメンで投与したISISオリゴヌクレオチドのISIS416850を他のオリゴヌクレオチドからアステリスク（＊）で識別する。
Figure 2012505660
フィブリノーゲンアッセイ
9分量の新鮮なサル血漿を1分量のクエン酸三ナトリウムへ採取した。この試料について、ACL9000凝固機器（Instrumentation Laboratory、イタリア）を使用して、フィブリノーゲン含量を評価した。結果をmg/dLで表して、表119に提示する。慢性用量レジメンで投与したISISオリゴヌクレオチドのISIS416850を他のオリゴヌクレオチドからアステリスク（＊）で識別する。
Figure 2012505660
出血アッセイ
処置期間の間の異なる日に、Surgicutt Jr. デバイス（ITC、ニュージャージー州）を使用して、出血アッセイを実施した。サルを、その腕を安定支持具に入れた状態で、モンキーチェアに入れた。この腕を軽く剃毛して、血圧計を上腕に装着した。血圧計のカフ（cuff）を40 mmHgへ上昇させて、この手順を通してこの圧力を維持した。切開する上腕の領域を防腐スワブで清潔にして、Surgicutt Jr. デバイスを使用して、肘前皮線（antecubital crease）に平行した、その5 cm下の側面部、前腕の掌側表面上を切開した。切開を行った瞬間に、ストップウォッチを始動させた。30秒ごとに、切開部からの血液を、血栓の形成が妨害されないように、切開部に直に触ることなく、吸取紙を使用して拭った。血液がもはや吸取紙を汚さなくなるまで、血液を30秒ごとに拭った。このときにストップウォッチを止めて、出血時間を決定した。血圧計を動物の腕から外し、切開部位を防腐的に綿棒処理して、創傷閉鎖ストリップを当てた。この結果を秒数で表して、表Xに提供する。この結果を表120に提供する。慢性用量レジメンで投与したISISオリゴヌクレオチドのISIS416850を他のオリゴヌクレオチドからアステリスク（＊）で識別する。
これらのデータは、本明細書に提供する化合物の出血ポテンシャルが低いことを示唆する。
Figure 2012505660
血小板凝集アッセイ
血漿試料へ1ミリモル／L ADP及び／又は3μgコラーゲン（表121に概括するように、採取日に依る）を加えることによって、血小板凝集を開始させて、そのまま10分間進行させた。電気抵抗又はインピーダンスの変化と血小板形状変化後の凝集の初期傾斜（initial slope）の変化を記録することによって、凝集を特性決定した。この凝集試験は、それぞれの採取日に、試料につき2回実施して、その平均値を取った。慢性用量レジメンで投与したISISオリゴヌクレオチドのISIS416850を他のオリゴヌクレオチドからアステリスク（＊）で識別する。
Figure 2012505660
体重と臓器重量
投薬レジメンを通して週1回、体重を記録した。各群の測定値をグラム数で表して、表122に示す。この結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置が、PBS対照に比較して体重の有意な変化をもたらす可能性がある、動物の健康における有害な変化を引き起こさなかったことを示している。動物を安楽死させた後で臓器重量を記録して、肝臓、腎臓、及び脾臓を採取して秤量した。この結果を表123に提示すると、脾臓重量の増加を示すISIS416858以外は、PBS対照に比較して重量の有意な変化も示さない。慢性用量レジメンで投与したISISオリゴヌクレオチドのISIS416850を他のオリゴヌクレオチドからアステリスク（＊）で識別する。
Figure 2012505660
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肝機能
肝機能に対するISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、トランスアミナーゼの血漿濃度を測定した。ALT（アラニントランスアミナーゼ）及びAST（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）の血漿濃度を測定して、その結果をIU/Lで表して、表124及び125に提示する。ALT/ASTレベルが対照レベルの7倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらなる試験のために選択した。ビリルビンの血漿濃度も測定して、結果をmg/dLで表して、表126に提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置による、ビリルビンのレベルの対照レベルの2倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。慢性用量レジメンで投与したISISオリゴヌクレオチドのISIS416850を他のオリゴヌクレオチドからアステリスク（＊）で識別する。
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腎機能
腎機能に対するISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、尿試料を採取した。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後の尿試料中の尿タンパク質対クレアチニンの比を計算して、表127に提示する。尿タンパク質／クレアチニン比がPBS対照に比較して5倍より多い増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。
Figure 2012505660
オリゴヌクレオチド濃度の測定
全長オリゴヌクレオチドの濃度、並びにオリゴヌクレオチドの分解と肝臓及び腎臓からの消失の経過時間を評価した。使用した方法は、フェノール-クロロホルム（液体-液体）抽出に続く固相抽出からなる、すでに公表された方法（Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999）の改良法である。抽出に先立って、内部標準（ISIS355868、27マー2'-O-メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT、本明細書ではSEQ ID NO: 270と表記する）を加えた。定量下限濃度（LLOQ）がほぼ1.14μg/gである検量線を使用して、組織試料濃度を計算した。次いで、WinNonlin ソフトウェア（PHARSIGHT）を使用して、半減期を計算した。この結果をμg/g（肝臓又は腎臓の組織）として表して、表128及び129に提示する。
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血液学アッセイ
全群のサルより入手した血液を、HCT、MCV、MCH、及びMCHC分析、並びにWBC（好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、網状赤血球）、RBC、血小板のような様々な血球と全ヘモグロビン含量の測定のために韓国安全性評価研究所（KIT）へ送った。この結果を表130〜143に提示する。50％より多い血小板数の減少と3倍より多い単球数の増加に影響しないアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらなる試験のために選択した。慢性用量レジメンで投与したISISオリゴヌクレオチドのISIS416850を他のオリゴヌクレオチドからアステリスク（＊）で識別する。
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サイトカイン及びケモカインのアッセイ
上昇する用量レジメンで投与するPBS、ISIS416850、及びISIS416858で処置したサルの群より入手した血液試料を、ケモカイン及びサイトカインのレベルの測定のために Pierce Biotechnology（マサチューセッツ州ウォバーン）へ送った。それぞれの霊長動物の抗体を使用してIL-1β、IL-6、IFN-γ、及びTNF-αのレベルを測定して、それぞれの交差反応ヒト抗体を使用してIL-8、MIP-1α、MCP-1、MIP-1β、及びRANTESのレベルを測定した。処置の開始の14日前と、サルを安楽死させた85日目に測定値を取った。この結果を表144及び145に提示する。
Figure 2012505660
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実施例46：カニクイザルにおける、ヒト第11因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬理効果
齧歯動物の忍容性試験（実施例41〜44）より選択したいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドをカニクイザルにおいて試験して、カニクイザルモデルにおけるその薬理効果、第11因子活性に対する相対効力、及び忍容性を判定した。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、先に記載のサル試験（実施例45）より選択したISIS416850及びISIS416858とも比較した。この試験に使用したすべてのISISオリゴヌクレオチドは、ヒト第11因子mRNAに標的指向して、アカゲザルの遺伝子配列とも完全に交差反応性である（表44及び46を参照のこと）。アカゲザルのISISオリゴヌクレオチドは、カニクイザルの遺伝子配列とも完全に交差反応性であると予測される。本試験を行った時点で、カニクイザルのゲノム配列は、米国立生物工学情報センター（NCBI）のデータベースで入手可能でなかった；故に、カニクイザルの遺伝子配列との交差反応性を確かめることはできなかった。
処置
2匹の雄ザルと2匹の雌ザルからそれぞれなる数群のサルに、25 mg/kgのISIS416850、ISIS449709、ISIS445522、ISIS449710、ISIS449707、ISIS449711、ISIS449708、416858、及びISIS445531を皮下注射した。そのサルへアンチセンスオリゴヌクレオチドを25 mg/kgで週3回、1週間、そして25 mg/kgで週2回、2〜8週間投与した。2匹の雄ザルと2匹の雌ザルからなる対照群に、同じ投薬レジメンに従って、PBSを皮下投与した。体重を処置の開始の14日前と7日前に記録して、その後は処置期間を通して毎週測定した。血液試料は、PT及びaPTT測定と様々な血液学的因子の測定のために、処置の開始の14日前と5日前に、そしてその後は投薬レジメンの間に数回採取した。55日目、このサルを、深い麻酔下の間に瀉血により安楽死させて、臓器をさらなる分析用に回収した。
RNA分析
55日目に、プライマープローブセット：LTS00301を使用する第11因子のリアルタイムPCR分析のために肝臓組織よりRNAを抽出した。PBS対照に対する第11因子の阻害パーセントとして結果を提示する。表146に示すように、ISIS416850、ISIS449709、ISIS445522、ISIS449710、ISIS449707、ISIS449708、ISIS416858、及びISIS445531での処置は、PBS対照と比較して、第11因子mRNAの有意な低下をもたらした。
Figure 2012505660
タンパク質分析
全群のサルより異なる日に採取した血漿試料を、アフィニティー精製ポリクローナル抗第11因子抗体を捕捉抗体として、そしてペルオキシダーゼ共役ポリクローナル抗第11因子抗体を検出抗体として使用するサンドイッチ式ELISAアッセイ（Affinity Biologicals 社）によって分析した。サルの血漿をアッセイ用に50倍希釈した。ペルオキシダーゼ活性を、基質：o-フェニレンジアミンとのインキュベーションによって発現させた。発現された色は、マイクロプレートリーダーを490 nmで使用して定量して、試料中の第11因子の濃度に比例するとみなされた。
この結果を、PBS対照のそれに対する百分率の低下として表して、表147に提示する。ISIS416850、ISIS449709、ISIS445522、及びISIS416858での処置は、タンパク質レベルの時間依存的な減少をもたらした。
Figure 2012505660
PT及びaPTTアッセイ
ISISオリゴヌクレオチドで処置したサルからの血小板欠乏血漿（PPP）を使用して、PTとaPTTを測定した。PT及びaPTTの数値を表148及び149に提供して、国際標準化比（INR）値として報告する。PT及びaPTTのINR値は、各実験群のPT又はaPTT値をPBS処置群のPT又はaPTTで割ることによって定量した。次いで、使用する組織因子の国際感度指数（ISI）の冪数だけこの比を掛け合わせた。表148に示すように、PTは、ISISオリゴヌクレオチドで処置したサルにおいて、有意には延長しなかった。しかしながら、aPTTは、表148に提示するように、ISIS416850、ISIS445522、及びISIS416858で処置した群において、有意に延長した。これらのデータは、第11因子のアンチセンス低下が血液凝固の接触活性化経路には影響を及ぼすが、その外因性経路には影響を及ぼさないことを示唆する。故に、これらのISISオリゴヌクレオチドでの第11因子のアンチセンス低下は、組織損傷への応答ではなく、異常な血管壁に応答した血栓又は血塊の形成を阻害するのに有用である。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
体重と臓器重量
各群の体重をグラム数で表して、表150に示す。この結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置が、PBS対照に比較して体重の有意な変化をもたらす可能性がある、動物の健康における有害な変化を引き起こさなかったことを示している。55日目に動物を安楽死させた後で臓器重量を記録して、肝臓、腎臓、及び脾臓を採取した。この結果を体重の百分率として表して表150に提示すると、脾臓重量の増加を引き起こしたISIS449711以外は、PBS対照に比較して重量の有意な変化も示さない。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
肝機能
肝機能に対するISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、ALT及びASTの血漿濃度を測定した。アラニントランスアミナーゼ（ALT）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）の血漿濃度を測定して、その結果をIU/Lで表して、表152及び153に提示する。ビリルビンの血漿濃度も測定して、結果をmg/dLで表して、表154に提示する。表152〜154に観測されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後、肝臓代謝マーカーのいずれにも有意な増加がなかった。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
Figure 2012505660
腎機能
腎機能に対するISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、尿試料を異なる日に採取した。自動化臨床化学分析機（日立オリンパス、AU400e、ニューヨーク州メルヴィル）を使用して、BUNレベルを様々な時点で測定して、その結果を表155に提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後の尿試料における尿タンパク質対クレアチニンの比も49日目に計算して、結果を表156に提示する。表155及び156に観測されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置後、腎臓代謝マーカーのいずれにも有意な増加がなかった。
Figure 2012505660
Figure 2012505660
血液学アッセイ
全群のサルより異なる日に入手した血液を、HCT、MCV、MCH、及びMCHC測定、並びにWBC（好中球と単球）、RBC、及び血小板のような様々な血球と全ヘモグロビン含量の測定のために韓国安全性評価研究所（KIT）へ送った。この結果を表157〜166に提示する。
Figure 2012505660
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サイトカイン及びケモカインのアッセイ
全群のサルより入手した血液試料を、ケモカイン及びサイトカインレベルの測定のためにPierce Biotechnology（マサチューセッツ州ウォバーン）へ送った。それぞれの霊長動物の抗体を使用してIL-1β、IL-6、IFN-γ、及びTNF-αのレベルを測定して、それぞれの交差反応ヒト抗体を使用してIL-8、MIP-1α、MCP-1、MIP-1β、及びRANTESのレベルを測定した。処置の開始の14日前と、サルを安楽死させた55日目に測定値を取った。この結果を表167及び168に提示する。
Figure 2012505660
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実施例47：ヒト第11因子に標的指向するISISアンチセンスオリゴヌクレオチドの粘度の測定
165〜185 mg/mLの濃度で40 cPより高い粘度を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを篩い落とす目的で、ヒト第11因子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの粘度を測定した。
ISISオリゴヌクレオチド（32〜35 mg）をガラスバイアルに秤量して、120μlの水を加えて、そのバイアルを50℃で加熱することによって、アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液に溶かした。予熱した試料の一部（75μL）をミクロ粘度計（Cambridge）へピペット注入した。ミクロ粘度計の温度を25℃へ設定して、試料の粘度を測定した。予熱試料の別分量（20μL）を、260 nM、85℃でのUV読み取り（Cary UV 機器）のために、10 mLの水へピペット注入した。この結果を表169に提示する。
Figure 2012505660

Claims (54)

12〜30の連結ヌクレオシドからなり、そしてSEQ ID NO: 223の少なくとも12の連続ヌクレオ塩基を含んでなるヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物。
一本鎖の修飾オリゴヌクレオチドからなる、請求項1の化合物。
修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオ塩基配列がSEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基配列に100％相補的である、請求項2の化合物。
少なくとも1つのヌクレオシド間連結が修飾ヌクレオシド間連結である、請求項2の化合物。
それぞれのヌクレオシド間連結がホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、請求項4の化合物。
少なくとも1つのヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項1の化合物。
少なくとも1つの修飾糖が二環糖である、請求項6の化合物。
少なくとも1つの二環糖のそれぞれが4'-（CH2）n-O-2'架橋を含み、ここでnは1又は2である、請求項7の化合物。
少なくとも1つの二環糖のそれぞれが4'-CH（CH3）-O-2'架橋を含む、請求項7の化合物。
少なくとも1つの修飾糖が2'-O-メトキシエチル基を含む、請求項6の化合物。
テトラヒドロピラン環がフラノース環に置き換わっている、少なくとも1つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドを含んでなる、請求項1の化合物。
少なくとも1つのテトラヒドロピラン修飾ヌクレオシドのそれぞれが構造：
Figure 2012505660
 ［式中、Bxは、保護されていてもよい複素環式塩基部分である］を有する、請求項11の化合物。
少なくとも1つのヌクレオシドが修飾ヌクレオ塩基を含む、請求項2の化合物。
修飾ヌクレオ塩基が5-メチルシトシンである、請求項13の化合物。
修飾オリゴヌクレオチドが：
連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
連結ヌクレオシドからなる5'ウィングセグメント；
連結ヌクレオシドからなる3'ウィングセグメントを含み、
ここでギャップセグメントは、5'ウィングセグメントと3'ウィングセグメントのすぐ隣りでその間に位置して、そしてここでそれぞれのウィングセグメントのそれぞれのヌクレオシドは、修飾糖を含む、請求項1の化合物。
修飾オリゴヌクレオチドが：
10の連結デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
5の連結ヌクレオシドからなる5'ウィングセグメント；
5の連結ヌクレオシドからなる3'ウィングセグメントを含み、
ここでギャップセグメントは、5'ウィングセグメントと3'ウィングセグメントのすぐ隣りでその間に位置して、ここでそれぞれのウィングセグメントのそれぞれのヌクレオシドは、2'-O-メトキシエチル糖を含み；そしてここでそれぞれのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート連結である、請求項15の化合物。
それぞれのシトシンが5-メチルシトシンである、請求項16の化合物。
修飾オリゴヌクレオチドが20の連結ヌクレオシドからなる、請求項2又は17の化合物。
血栓塞栓合併症を治療するための、請求項1〜18のいずれか1項に記載の化合物。
動物がヒトである、請求項19の化合物。
深在性静脈血栓症を予防するための、請求項20の化合物。
肺塞栓症を予防するための、請求項20のいずれか1つの化合物。
アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、ヘパリン、レピルジン、チクロピジン、ワルファリン、アピキサバン、リバロキサバン、LOVENOX、及び第Xa因子阻害剤より選択される群のいずれとも同時投与するための、請求項19のいずれか1つの化合物。
アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、ヘパリン、レピルジン、チクロピジン、ワルファリン、アピキサバン、リバロキサバン、LOVENOX、及び第Xa因子阻害剤より選択される群のいずれとも併用投与するための、請求項19のいずれか1つの化合物。
非経口投与のための、請求項23の化合物。
非経口投与のための、請求項24の化合物。
皮下又は静脈内投与のための、請求項25の化合物。
皮下又は静脈内投与のための、請求項26の化合物。
12〜30の連結ヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物であって、ここで修飾オリゴヌクレオチドは、第11因子の核酸に相補的である、凝固障害を治療するための前記化合物。
血栓塞栓合併症を治療するための医薬品の製造のための、請求項1〜18のいずれか1項の化合物の、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、ヘパリン、レピルジン、チクロピジン、ワルファリン、アピキサバン、リバロキサバン、及びLOVENOXより選択される群のいずれかとの使用。
12〜30の連結ヌクレオシドからなり、そしてSEQ ID NO: 223の少なくとも12の連続ヌクレオ塩基を含んでなるヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチド又はその塩と、医薬的に許容される担体又は希釈剤を含んでなる組成物。
一本鎖オリゴヌクレオチドからなる、請求項31の組成物。
修飾オリゴヌクレオチドが20の連結ヌクレオシドからなる、請求項32の組成物。
血栓塞栓合併症のリスク状態にある動物を同定すること；及び
12〜30の連結ヌクレオシドからなり、第11因子の核酸に相補的である修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物の治療有効量をそのリスク状態の動物へ投与することを含んでなる、方法。
血栓塞栓合併症が、深在性静脈血栓症、肺塞栓症、又はその組合せである、請求項34の方法。
凝固障害を有する動物を同定すること；及び
12〜30の連結ヌクレオシドからなり、第11因子の核酸に相補的である修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物の治療有効量を該動物へ投与することを含んでなる、方法。
該化合物と、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、ヘパリン、レピルジン、チクロピジン、ワルファリン、アピキサバン、リバロキサバン、LOVENOX、及び第Xa因子阻害剤より選択される群のいずれとも同時投与することを含んでなる、請求項36の方法。
動物において血栓塞栓合併症のリスクを低下させること；及び
12〜30の連結ヌクレオシドからなり、第11因子の核酸に相補的である修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物の治療有効量を該動物へ投与することを含んでなる、方法。
動物において凝固障害を治療すること；及び
12〜30の連結ヌクレオシドからなり、第11因子の核酸に相補的である修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物の治療有効量を該動物へ投与することを含んでなる、方法。
修飾オリゴヌクレオチドに対する解毒薬を投与することによって、動物において第11因子阻害を逆転させることを含んでなる、請求項39の方法。
解毒薬が修飾オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項39の方法。
第7因子、第7a因子、第11因子、又は第11a因子のタンパク質より選択される群のいずれも投与することによって動物において第11因子阻害を逆転させることを含んでなる、請求項40の方法。
血栓塞栓合併症のリスク状態にある動物を同定すること；及び
第11因子特異的阻害剤及び抗血小板療法薬の治療有効量をそのリスク状態の動物へ投与することを含んでなる、方法。
凝固障害を有する動物を同定すること；及び
第11因子特異的阻害剤及び抗血小板療法薬の治療有効量を該動物へ投与することを含んでなる、方法。
動物において血栓塞栓合併症のリスクを低下させること；及び
第11因子特異的阻害剤及び抗血小板療法薬の治療有効量を該動物へ投与することを含んでなる、方法。
動物において凝固障害を治療すること；及び
第11因子特異的阻害剤及び抗血小板療法薬の治療有効量を該動物へ投与することを含んでなる、方法。
抗血小板療法薬が、ADP受容体阻害剤、NSAID、ホスホジエステラーゼ阻害剤、糖タンパク質IIB/IIIA阻害剤、又はアデノシン再取込み阻害剤、又はこれらの組合せより選択される、請求項43〜46のいずれかの方法。
NSAIDが、アスピリン、ナプロキセン、又は両方の組合せである、請求項47の方法。
ADP受容体／P2Y12阻害剤がチエノピリジンである、請求項47の方法。
12〜30の連結ヌクレオシドからなり、そしてSEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基738〜762の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8の連続ヌクレオ塩基の部分を含んでなるヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物であって；そしてここで修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオ塩基配列は、SEQ ID NO: 1に少なくとも90％相補的である、前記化合物。
12〜30の連結ヌクレオシドからなり、そしてSEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基656〜704の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8の連続ヌクレオ塩基の部分を含んでなるヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物であって；そしてここで修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオ塩基配列は、SEQ ID NO: 1に少なくとも90％相補的である、前記化合物。
12〜30の連結ヌクレオシドからなり、そしてSEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1018〜1042の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8の連続ヌクレオ塩基の部分を含んでなるヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物であって；そしてここで修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオ塩基配列は、SEQ ID NO: 1に少なくとも90％相補的である、前記化合物。
12〜30の連結ヌクレオシドからなり、そしてSEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1062〜1091の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8の連続ヌクレオ塩基の部分を含んでなるヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物であって；そしてここで修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオ塩基配列は、SEQ ID NO: 1に少なくとも90％相補的である、前記化合物。
12〜30の連結ヌクレオシドからなり、そしてSEQ ID NO: 1のヌクレオ塩基1275〜1318の等しい長さ部分に相補的な少なくとも8の連続ヌクレオ塩基の部分を含んでなるヌクレオ塩基配列を含んでなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物であって；そしてここで修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオ塩基配列は、SEQ ID NO: 1に少なくとも90％相補的である、前記化合物。
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