CN109797150A - 因子11表达的调节 - Google Patents

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Abstract

此处披露了用于在需要的个体中降低因子11以及治疗或预防血栓栓塞性并发症的反义化合物和方法。可以通过将靶向因子11的反义化合物给药而改善的疾病状况的例子包括血栓形成、栓塞以及血栓栓塞，比如如深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞和中风。靶向因子11的反义化合物也可以用作防止个体血栓形成及栓塞风险的预防性治疗。

Description

因子11表达的调节
本申请是申请号为200980150276.5、申请日为2009年10月15日、发明名称为“因子11表达的调节”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2009/060922的国家阶段申请，该国际申请要求申请日分别为2008年10月15日和2009年4月30日，申请号分别为61/105,772和61/174,461的美国临时申请的优先权。
交叉引用相关申请
本申请根据35 U.S.C§119(e)主张2008年10月15日递交的美国临时专利申请第61/105,772号以及2009年4月30日递交的美国临时专利申请第61/174,461号的优先权。每一项上述申请在此被作为参考并且其全部内容被并入本申请。
序列表
本申请与电子格式的序列表一起被递交。提供的序列表是2009年10月15日生成的名称为20091015_BIOL0107WOSEQ.txt，大小为92Kb的文件。电子格式的序列表中的信息在此被作为参考，并且其全部内容被并入本申请。
发明领域
本发明的实施例提供了降低动物中因子11的mRNA和蛋白的表达的方法、化合物以及组合物。这些方法、化合物以及组合物可用于治疗、防止或改善血栓栓塞性并发症。
背景技术
循环系统需要防止失血的机制，以及对抗不当血管内栓塞的机制。通常，凝血包括以可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白凝胶为终点的级联反应。级联反应的步骤涉及非活性酶原向活性酶的转化。然后活性酶再催化级联反应的下一步骤。
凝血级联反应
凝血级联反应可能通过两条支路启动，作为初始通路的组织因子通路(也称为“外源性通路”)，以及接触激活通路(也称为“内源性通路”)。
组织因子通路由细胞表面受体组织因子(TF，也被称为因子III)启动，后者由血管外细胞(周边细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和角质细胞)组成型表达，并且由血管单核细胞和内皮细胞在炎症细胞因子或内毒素的诱导下表达(Drake et al.，Am J Pathol 1989，134：1087-1097)。TF是凝结因子VIIa(一种丝氨酸蛋白酶)的高亲和力细胞受体。缺少TF时，VIIa具有非常低的催化活性，与TF的结合对于通过变构机制赋予VIIa功能是必要的(Drake etal.，Am J Pathol 1989，134：1087-1097)。TF-VIIa复合物将因子X激活为Xa。Xa再与辅因子因子Va结合为凝血酶原酶复合物，后者再将凝血酶原(也被称为因子II或因子2)激活为凝血酶(也被称为因子IIa或因子2a)。凝血酶激活血小板，将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，通过激活因子XIII促进纤维蛋白交联，然后在TF暴露于血管外细胞的位点形成稳定的栓塞。此外，凝血酶通过激活因子V和VIII来增强凝血级联反应。
接触激活通路由因子XII向XIIa的活化所引起。因子XIIa将XI转化为XIa，而XIa将IX转化为IXa。IXa与辅因子VIIIa结合，将X转化为Xa。当因子Xa与因子Va结合而将凝血酶原(因子II)转化为凝血酶(因子IIa)时，两条通路在这一点汇合。
凝血抑制。
至少有三种机制控制凝血级联反应，即活化蛋白C、抗凝血酶和组织因子通路抑制剂的作用。活化蛋白C是一种能降解辅因子Va和VIIIa的丝氨酸蛋白酶。蛋白C由凝血酶和血栓调节蛋白一起激活，行使功能需要辅酶蛋白S。抗凝血酶是一种能抑制凝血酶、Xa、XIIa、XIa和IXa等丝氨酸蛋白酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制剂)。组织因子通路抑制剂抑制Xa和TF-VIIa复合物的作用(Schwartz AL et al.，Trends CardiovascMed.1997；7：234-239.)。
疾病
血栓形成是血栓的病理学发展，当血凝块迁移至个体的另一部分并且干扰器官功能时，栓塞出现。血栓栓塞可能导致如深静脉血栓、肺栓塞、心肌梗塞和中风等状况。很明显，血栓栓塞是发病的一个主要原因，其每年影响超过两百万个美国人(Adcock etal.American Journal of Clinical Pathology.1997；108：434-49)。尽管大部分血栓形成的病例是因为例如手术、癌症以及不动等后天的外在问题，一些病例则是因为遗传易感性，比如抗磷脂综合症和常染色体显性遗传，因子V Leiden(Bertina RM et al.Nature 1994；369：64-67.)。
治疗。
最常用抗凝剂华法林、肝素以及低分子量肝素(LMWH)都有显著的缺点。
华法林通常用于治疗患有心房颤动的病人。药物与包括因子II、VII、IX和X等维生素K依赖的凝结因子相互作用。抗凝剂蛋白C和S也被华法林所抑制。华法林与包括如胺碘酮等心房颤动治疗药物的其他药物相互作用的事实使华法林的药物治疗进一步变得复杂。因为华法林的治疗难以预测，为了检测任何异常出血迹象，必须对病人小心监测。
肝素通过激活对凝血酶和因子X都抑制的抗凝血酶来作用(Bjork I，LindahlU.Mol Cell Biochem.1982 48：161-182.)。肝素治疗可能引起免疫反应，这使血管中血小板聚集而导致血栓形成。这种副作用被称为肝素诱导的血小板减少症(HIT)，需要对病人监测。肝素的延长治疗也可能导致骨质疏松症。LMWH也可以抑制因子2，但程度弱于未分级肝素(UFH)。LMWH与HIT发展有关。
因此，现有的抗凝血药缺少可预测性和特异性，所以需要小心监测病人以防止如出血并发症等不良副作用。目前没有仅针对内源性或外源性通路的抗凝剂。
发明内容
此处提供了调节因子11的mRNA和蛋白的表达的方法、化合物以及组合物。在一些实施例中，因子11特异性抑制剂调节因子11的mRNA和蛋白的表达。在一些实施例中，因子11特异性抑制剂是核酸、蛋白或小分子。
在一些实施例中，调节作用在细胞或组织中发生。在一些实施例中，细胞或组织在动物中。在一些实施例中，所述动物是人。在一些实施例中，因子11的mRNA水平被降低。在一些实施例中，因子11的蛋白水平被降低。这种降低可以时间依赖的方式或剂量依赖的方式发生。
本申请也提供了用于防止、治疗和改善疾病、紊乱和状况的方法、化合物以及组合物。在一些实施例中，这些疾病、紊乱和状况是血栓栓塞性并发症。这种血栓栓塞性并发症包括各类血栓形成、栓塞和血栓栓塞。在一些实施例中，这些血栓栓塞性并发症包括深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞和中风。
这些疾病、紊乱和状况通常具有一个或多个危险因素、原因或结果。血栓栓塞性并发症发展的某些危险因素和原因包括不动、手术(尤其是矫形手术)、恶性肿瘤、怀孕、高龄、使用口服避孕药、心房颤动、先前的血栓栓塞性并发症、慢性炎症疾病和遗传或后天的凝血紊乱。血栓栓塞性并发症发展相关的某些结果包括通过受影响血管的血流降低、组织坏死以及死亡。
在一些实施例中，治疗方法包括将因子11特异性抑制剂给药于需要的个体。
发明的详细说明
在此声明，前面的一般说明和后面的详细说明都仅仅是示例性和说明性的，不限制本发明，这是可以理解的。此处，单数的使用包括复数，除非另有特别指明。如此处所用，使用“或”意味着“和/或”，除非另有特别指明。而且，使用术语“包括”以及如“包括”和“被包括”等其他形式，不是限制性的。如“元素”或“组分”等术语涵盖包括一个单元的元素和组分，也涵盖包括一个以上单元的元素和组分，除非另有特别指明。
此处所用的分段标题仅用于组织的目的，不应被解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文件或文件部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，其在此被套论的部分被作为参考，并且其全部内容被并入本申请。
定义
除非提供特别定义，此处描述的分析化学、合成有机化学和医药化学的相关术语以及其流程和技术是那些本领域所熟知和通用的。在化学合成和化学分析中可使用标准技术。本公开中准许引用的所有专利、申请、已发表的申请和其他出版物、从如国家生物技术信息中心(NCBI)等数据库中获得的GENBANK登录号和相关序列信息以及其他数据，其在此被套论的部分被作为参考，并且这些部分的全部内容被并入本申请。
除非另行指出，下列术语具有下列含义：
“2’-O-甲氧乙基”(也表示为2’-MOE和2’-O(CH2)2-OCH3)指的是呋喃环的2’位置的O-甲氧-乙基修饰。2’-O-甲氧乙基修饰的糖是修饰糖。
“2’-O-甲氧乙基核苷酸”是指包含2’-O-甲氧乙基修饰糖基的核苷酸。
“5-甲基胞嘧啶”是指5’位置连有甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是修饰的核苷碱基。
“活性药剂”是指当给个体给药时能够提供治疗益处的药物组合物中的物质。例如，在一些实施例中，针对因子11的反义寡核苷酸是一种活性药剂。
“活性靶区”或“靶区”是指一个或多个活性反义化合物针对的区域。“活性反义化合物”是指能降低目标核酸水平或蛋白质水平的反义化合物。
“随附给药”是指两种试剂以它们的药理学效果在病人体内同时都显现的任何方式共同给药。随附给药不需要在单一药物组合物中、相同剂型中或以相同给药途径将两种试剂给药。两种试剂的效果不需要同时显现。效果只需要在一段时间重叠，不需要共同延伸。
“给药”是指将一种药剂提供给个体，包括但不限于医学专业人员的给药以及自我给药。
“改善”是指与疾病、紊乱或状况关联的至少一种指标、迹象或症状的减轻。指标的严重程度可以通过本领域普通技术人员已知的主观或客观的测定来确定。
“动物”是指人或非人动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪和非人灵长类，包括但不限于猴和黑猩猩。
“解毒化合物”指的是能降低任何反义介导活性的强度或持续时间的化合物。
“解毒寡核苷酸”是指包括与反义化合物互补且能与之杂交的寡核苷酸的解毒化合物。
“解毒蛋白”是指包括肽的解毒化合物。
“抗体”指的是以通过某种方式与抗原特异性反应为特征的分子，其中抗体和抗原各自根据对方来定义。抗体可能是指完整的抗体分子或其中任何片段或区域，如重链、轻链、Fab区段以及Fc区段。
“反义活性”是指反义化合物与目标核酸相杂交所引起的任何可检测或可测量的活性。在一些实施例中，反义活性是目标核酸或该目标核酸编码的蛋白质的量或表达的减少。
“反义化合物”是指能够通过氢键与目标核酸相杂交的寡聚化合物。
“反义抑制”是指在与目标核酸互补的反义化合物存在时，与没有反义化合物时的目标核酸水平或目标蛋白水平相比，目标核酸水平或目标蛋白水平降低。
“反义寡核苷酸”是指具有能与目标核酸的相应区域或片段杂交的核苷碱基序列的单链寡核苷酸。
“双环糖”是指通过两个非偕式环原子桥接而修饰的呋喃环。双环糖是一种修饰的糖。
“双环核酸”或“BNA”指的是一种核苷或核苷酸，其中核苷或核苷酸的呋喃糖部分包括一个连接呋喃糖环上两个碳原子的桥键，从而形成一个双环系统。
“帽结构”或“末端帽部分”是指包含在反义化合物任一末端的化学修饰。
“化学独特区域”指的是反义化合物中在某些方面在化学上不同于相同反义化合物的另一区域的区域。例如，具有2’-O-甲氧乙基核苷酸的区域在化学上不同于含有无2’-O-甲氧乙基修饰的核苷酸的区域。
“嵌合型反义化合物”是指具有至少两个化学独特区域的反义化合物。
“共同给药”是指将两种或多种药剂给药于一个个体。两种或多种药剂可以在单一药物组合物中，也可能在分开的药物组合物中。两种或多种药剂中的每一种可以通过相同或不同的给药途径给药。共同给药涵盖平行或顺序给药。
“凝结因子”是指凝血级联反应中的因子I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII或TAFI中的任一个。“凝结因子核酸”是指编码凝结因子的任意核酸。例如，在一些实施例中，凝结因子核酸非限制地包括编码凝结因子的DNA序列(包括含内含子和外显子的基因组DNA)、由编码凝结因子的DNA转录的RNA序列以及编码凝结因子的mRNA序列。“凝结因子mRNA”是指编码凝结因子蛋白的mRNA。
“互补性”是指第一核酸与第二核酸的核苷碱基间的配对能力。
“相邻核苷碱基”是指彼此直接相邻的核苷碱基。
“稀释剂”是指组合物中无药理学活性，但药学必需或需要的成分。例如，在注射的组合物中的稀释剂可能是液体，比如盐溶液。
“剂量”是指在单一给药中或规定时间期间内提供的药剂的规定量。在一些实施例中，一个剂量可能通过一份、两份或多份丸药、片剂或注射剂来给药。例如，在一些需要皮下给药的实施例中，所需剂量需要通过一次注射不容易容纳的体积，因此，可以使用两次或多次注射以达到所需剂量。在一些实施例中，药剂是通过在延长的时间期间或连续输液来给药的。剂量可以按小时、日、周或月来规定。
“有效量”是指在需要药剂的个体中足以实现所需生理学结果的活性药剂量。根据待处理个体的健康与生理状况、处理个体的分类群、组合物的剂型、个体医疗状况的评估以及其他有关因素，个体间的有效量可能有变化。
“因子11核酸”、“因子XI核酸”、“F 11核酸”或“F XI核酸”是指编码因子11的任意核酸。例如，在一些实施例中，因子11核酸包括编码因子11的DNA序列、由编码因子11的DNA转录的RNA序列(包括含内含子和外显子的基因组DNA)以及编码因子11的mRNA序列。“因子11mRNA”是指编码因子11蛋白的mRNA。
“因子11特异性抑制剂”指的是能在分子水平上特异性抑制因子11的mRNA和/或因子11蛋白的表达的任何试剂。例如，因子11特异性抑制剂包括能够抑制因子11的mRNA和/或因子11蛋白的表达的核酸(包括反义化合物)、肽、抗体、小分子以及其他试剂。在一些实施例中，通过特异性调节因子11的mRNA表达和/或因子11蛋白的表达，因子11特异性抑制剂可能影响凝血级联反应中的其他组分，包括下游组分。类似地，在一些实施例中，因子11特异性抑制剂可能影响动物中其他分子过程。
“因子11特异性抑制剂解毒剂”是指能降低因子11特异性抑制剂效果的化合物。在一些实施例中，因子11特异性抑制剂解毒剂挑选自：因子11肽；因子11解毒剂寡核苷酸，包括与因子11反义化合物互补的因子11解毒化合物；以及影响内源性或外源性凝结通路的任何化合物或蛋白。
“完全互补”或“100％互补”是指第一核酸的每个核苷碱基在第二核酸中具有一个互补的核苷碱基。在一些实施例中，第一核酸是反义化合物，目标核酸是第二核酸。
“Gapmer”是指一种嵌合型反义化合物，其中，具有多个支持RNase H裂解的核苷的内部区段位于具有一个或多个核苷的外部区段之间，其中，组成内部区段的核苷化学上不同于组成外部区段的核苷。内部区段可被称为“间隙区段”，外部区段可被称为“侧翼区段”。
“间隙扩大的”是指在具有一到六个核苷的5’和3’侧翼区段之间并且与其直接相邻处具有12或更多个连续的2’-脱氧核糖核苷的嵌合型反义化合物。
“杂交”是指互补的核酸分子的退火。在一些实施例中，互补的核酸分子包括反义化合物和目标核酸。
“找出具有血栓栓塞性并发症风险的动物”是指找出已经诊断具有血栓栓塞性并发症的动物，或找出具有发展血栓栓塞性并发症倾向性的动物。具有发展血栓栓塞性并发症倾向性的个体包括那些具有一种或多种血栓栓塞性并发症危险因素的个体，这些因素包括不动、手术(尤其是矫形手术)、恶性肿瘤、怀孕、高龄、使用口服避孕药和遗传或后天的凝血紊乱。这种识别可能通过包括评价个体病史和标准的临床测试或评估的任何方法来完成。
“直接相邻”是指在直接相邻的元素之间没有任何干扰元素。
“个体”是指被挑选用于处理或治疗的人或非人动物。
“核苷内连接”指的是核苷间的化学连接。
“连接的核苷”是指连接在一起的相邻核苷。
“错配”或“非互补核苷碱基”指的是当第一核酸的核苷碱基不能与第二或目标核酸的相应核苷碱基配对时的情形。
“修饰的核苷内连接”指的是天然存在的核苷内连接(也就是磷酸二酯键核苷内键)的替换或任意改变。
“修饰核苷碱基”指的是除了腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之外的任何核苷碱基。“未修饰的核苷碱基”是指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“修饰核苷酸”是指独立具有修饰糖基、修饰核苷内连接或修饰核苷碱基的核苷酸。“修饰核苷”是指独立具有修饰糖基或修饰核苷碱基的核苷。
“修饰寡核苷酸”是指包含修饰核苷内连接、修饰糖或修饰核苷碱基的寡核苷酸。
“修饰糖”指的是从天然糖的替换或改变。
“结构域”是指反义化合物中化学独特区域的模式。
“天然存在的核苷内连接”是指3′至5′磷酸二酯键连接。
“天然糖基”是指在DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)中发现的糖。
“核酸”指的是由单体核苷酸组成的分子。核酸包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)以及微RNA(miRNA)。
“核苷碱基”是指能与另一核酸的碱基配对的杂环基团。
“核苷碱基序列”是指不依赖于任何糖、连接或核苷碱基修饰的连续核苷碱基的顺序。
“核苷”是指连接于糖的核苷碱基。
“模拟核苷”包括用于替代寡聚化合物的一个或多个位点上的糖或糖和碱基且未必是连接的那些结构，例如具有吗啉基、环己烯基、环己基、四氢吡喃基、如非呋喃糖单元的双环或三环模拟糖的模拟核苷。模拟核苷包括用于替代寡聚化合物的一个或多个位点上的核苷和连接的那些结构，例如肽核酸或吗啉(通过-N(H)-C(＝O)-O-或其他非磷酸二酯键连接而连接的吗啉)。糖替代物与稍广义术语模拟核苷有重叠，但仅仅倾向于用于表示糖单元(呋喃糖环)的替代。此处提供的四氢吡喃环是糖替代物例子的展示，其中，呋喃糖基团被四氢吡喃环系统所替代。
“核苷酸”是指具有与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。
“寡聚化合物”或“寡聚物”是指能与核酸分子的至少一个区段杂交的连接的单体亚单位的聚合物。
“寡核苷酸”是连接核苷的聚合物，其中，这些核苷的每一可以是修饰或未修饰，并且彼此独立的。
“肠胃外给药”是指通过注射或输液给药。肠胃外给药包括皮下给药、静脉给药、肌肉给药、动脉给药、腹腔内给药或颅内给药，比如鞘内给药或脑室内给药。
“肽”是指以酰胺键连接至少两个氨基酸形成的分子。肽指多肽和蛋白质。
“药物组合物”是指适于个体给药的物质的混合物。例如，药物组合物可以包含一种或多种活性药剂和无菌水溶液。
“药用可接受盐”是指生理学和药学可接受的反义化合物的盐，也就是保留本体寡核苷酸的需要生物活性，但不另外赋予不需要的毒性效果的盐。
“磷硫酰连接”是指核苷间的连接，其中，一个非桥接氧原子被硫原子替代而修饰磷酸二酯键。磷硫酰连接(P＝S)是修饰的核苷内连接。
“部分”是指核酸中确定数量的连续(也就是连接的)核苷碱基。在一些实施例中，部分是指目标核酸中确定数量的连续核苷碱基。在一些实施例中，部分是反义化合物中确定数量的连续核苷碱基。
“防止”指的是延迟或预防疾病、紊乱或状况的发生或发展几分钟到无限的时间期间。防止也指降低疾病、紊乱或状况发展的风险。
“前体药物”是指以在身体或细胞内由其中的内源酶或其他化学品或条件的作用而转化为活性形式的非活化形式制备的治疗剂。
“副作用”是指由治疗所引起的除了预期效果之外的生理反应。在一些实施例中，副作用包括注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝脏毒性、肾脏毒性、中枢神经系统异常、肌肉疾病以及不适。例如，血清中提高的转氨酶水平可能表明肝脏毒性或肝功能异常。例如，增高的胆红素可能表明肝脏毒性或肝功能异常。
“单链寡核苷酸”是指没有与互补链杂交的寡核苷酸。
“可特异性杂交的”指的是反义化合物在反义寡核苷酸和目标核酸间具有足以诱导期望效果的互补度，而在期望特异性结合的条件下，也就是在体内化验和治疗处理时的生理条件下，表现出对非目标核酸最低影响或无影响。
“靶向”或“被靶向”是指设计和选择与目标核酸特异性杂交并诱导预期效果的反义化合物的过程。
“目标核酸”、“目标RNA”和“目标RNA转录本”都指的是能被反义化合物靶向的核酸。
“目标区段”是指反义化合物靶向的目标核酸的核苷酸的序列。“5’靶向位点”指的是目标区段的最5’端核苷酸。“3’靶向位点”指的是目标区段的最3’端的核苷酸。
“治疗有效量”是指为个体提供治疗益处的药剂的量。
“血栓栓塞性并发症”是指涉及血栓引起的栓塞的任何疾病、紊乱或状况。这些疾病、紊乱或状况的示例包括各类血栓形成、栓塞和血栓栓塞。在一些实施例中，这些疾病、紊乱或状况包括深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞和中风。
“处理”指的是将药物组合物进行给药以影响疾病、紊乱或状况的改变或改善。
“未修饰核苷酸”是指由天然存在的核苷碱基、糖基和核苷内连接所组成的核苷酸。在一些实施例中，未修饰核苷酸是RNA核苷酸(也就是β-D-核糖核苷)或DNA核苷酸(也就是β-D-脱氧核糖核苷)。
一些实施例
本发明的实施例提供了降低因子11的mRNA和蛋白的表达的方法、化合物以及组合物。
本发明的实施例提供了用于治疗、防止或改善需要治疗的个体中与因子11相关的疾病、紊乱和状况的方法、化合物以及组合物。也构思了用于治疗、防止或改善与因子11相关的疾病、紊乱和状况的药剂制备的方法和化合物。与因子11相关的疾病、紊乱和状况包括血栓栓塞性并发症，如血栓形成、栓塞、血栓栓塞、深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞和中风。
本发明的实施例提供了用于治疗、防止或改善因子11相关疾病的因子11特异性抑制剂。在一些实施例中，因子11特异性抑制剂是能够抑制因子11的mRNA和/或因子11蛋白的表达的核酸(包括反义化合物)、肽、抗体、小分子以及其他试剂。
在本发明的一些实施例中，因子11特异性抑制剂是肽或蛋白，比如但不限于JClin Invest 1982，69：844-852中所述的alpha 1蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III、C1抑制剂和alpha 2纤溶酶抑制剂；Thromb Res 1987，48：145-151中所述的alpha 1抗胰蛋白酶(alpha1AT)；USPPN 2008/021998和Blood 1998，92：4198-206中所述的因子11肽抑制剂；ThrombRes 2001，104：451-465中所述的MAP4-RGKWC；Proc Natl Acad Sci 2004，101：3939-44中所述的beta 2GPI；Eur J Biochem 1999，262：915-923中所述的香菇蛋白酶抑制剂；J BiolChem 2004，279：29485-29492中所述的连接蛋白酶2/beta淀粉样蛋白前体Kunitz结构域抑制剂(APPI)和抗凝血酶(AT)；以及J Biol Chem 2005，280：23523-30中所述的抑肽酶。
在本发明的一些实施例中，因子11特异性抑制剂是抗体，比如，但不限于Blood1988，72：1748-54中所述的Winston-Salem(IgG3kappa)和Baltimore(IgG1 kappa)；J BiolChem 1985，260：10714-719中所述的5F4、3C1和1F1；Throm Haemost 1990，63：417-23中所述的单克隆抗体；J Thromb Haem 2006，4：1496-1501中所述的XI-5108；Thromb Res 1986，42：225-34中所述的单克隆抗体4-1；以及USPN 6,566,140中例子19中所述的abcixmab抗体。
在本发明的一些实施例中，因子11特异性抑制剂是小分子，比如，但不限于二丙烯基氟磷酸盐(DFP)；USPPN 2004/0180855中例子1-7中所述的小分子抑制剂；以及JBiolChem 2005，280：23523-30中所述的对氨基苄脒(pAB)。
本发明的实施例提供了因子11特异性抑制剂，如此处所述，可用于治疗、防止或改善血栓栓塞性并发症，如血栓形成、栓塞、血栓栓塞、深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞和中风。
本发明的实施例提供了如此处所述的因子11特异性抑制剂在用于治疗、防止或改善血栓栓塞性并发症，如血栓形成、栓塞、血栓栓塞、深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞和中风的药剂生产中的使用。
本发明的实施例提供了此处所述的因子11特异性抑制剂与此处所述的其他试剂或治疗方法相结合的疗法中的应用，这些疗法用于治疗、防止或改善此处所述的血栓栓塞性并发症。试剂或治疗方法可以共同给药或随附给药。
本发明的实施例提供了此处所述的因子11特异性抑制剂在药剂生产中的应用，该药剂与此处所述的其他试剂或治疗方法相结合的疗法用于治疗、防止或改善此处所述的血栓栓塞性并发症的药剂生产。试剂或治疗方法可以共同给药或随附给药。
本发明的实施例提供了此处所述的因子11特异性抑制剂在用于治疗、防止或改善此处所述的病人体内血栓栓塞性并发症的药剂生产中的应用，该病人后续被给药其他试剂或疗法。
本发明的实施例提供了用于治疗、防止或改善此处所述的血栓栓塞性并发症的试剂盒，其中试剂盒包括：
(i)此处所述的因子11特异性抑制剂；以及作为选择
(ii)此处所述的其他试剂或治疗方法。
本发明的试剂盒可以进一步包括用试剂盒以此处所述的组合治疗方法来治疗、防止或改善此处所述的血栓栓塞性并发症的说明书。
本发明的实施例提供了靶向因子11核酸的反义化合物。在一些实施例中，因子11核酸是下列发布序列中的任一个：GENBANK登录号NM_000128.3(以SEQ ID NO：1并入本申请)，GENBANK登录号NT_022792.17，从19598000至19624000截断(以SEQ ID NO：2并入本申请)，GENBANK登录号NM_028066.1(以SEQ ID NO：6并入本申请)，外显子1-15，GENBANK登录号NW_001118167.1(以SEQ ID NO：274并入本申请)。
在一些实施例中，本发明提供了包含修饰寡核苷酸的化合物。在一些实施例中，本发明的化合物包括由12至30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸。
在一些实施例中，本发明的化合物可以包括含有与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列的修饰寡核苷酸。在一些实施例中，本发明的化合物可以包括含有与SEQ IDNO：1的等长部分至少100％互补的核苷碱基序列的修饰寡核苷酸。
在一些实施例中，本发明提供了包括含有与SEQ ID NO：1的第656位至第676位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列的修饰寡核苷酸的化合物。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ ID NO：1的第656位至第676位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的相同长度部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的相同长度部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少80％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸含有与SEQ ID NO：1的第665位至第687位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ ID NO：1的第665位至第687位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少50％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第675位至第704位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ ID NO：1的第675位至第704位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少50％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第677位至第704位核苷碱基至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ ID NO：1的第677位至第704位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少60％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第678位至第697位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ ID NO：1的第678位至第697位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少70％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第680位至第703位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ ID NO：1的第680位至第703位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少80％的抑制(例如，如例3和例30所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第683位至第702位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ ID NO：1的第683位至第702位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少90％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第738位至第759位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ ID NO：1的第738位至第759位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少80％的抑制(例如，如例3和例30所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第738位至第760位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ ID NO：1的第738位至第760位核苷碱基的等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ IDNO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少60％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第738位至第762位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ ID NO：1的第738位至第762位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少45％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第1018位至第1042位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ IDNO：1的第1018位至第1042位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ IDNO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少80％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第1062位至第1089位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ IDNO：1的第1062位至第1089位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ IDNO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少70％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第1062位至第1090位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ IDNO：1的第1062位至第1090位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ IDNO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少60％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第1062位至第1091位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ IDNO：1的第1062位至第1091位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ IDNO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少20％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第1275位至第1301位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ IDNO：1的第1062位至第1091位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ IDNO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少80％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第1276位至第1301位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可能包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ IDNO：1的第1062位至第1091位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ IDNO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少80％的抑制(例如，如例30所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第1284位至第1308位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ IDNO：1的第1062位至第1091位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ IDNO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少80％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第1291位至第1317位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20个与SEQ IDNO：1的第1062位至第1091位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ IDNO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少80％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，本发明提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸包括与SEQ ID NO：1的第1275位至第1318位核苷碱基的至少部分互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18或20与SEQ ID NO：1的第1275位至第1318位核苷碱基等长部分互补的连续核苷碱基。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ ID NO：1的等长部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补的核苷碱基序列。所述修饰寡核苷酸可以包含与SEQ IDNO：1的等长部分100％互补的核苷碱基序列。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少70％的抑制(例如，如例3所述)。
本发明的实施例提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有核苷碱基序列，该核苷碱基序列包括选自SEQ ID NO：15至241中列举的核苷碱基序列的至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个或20个连续核苷碱基。
本发明的实施例提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有核苷碱基序列，该核苷碱基序列包括选自SEQ ID NO：15至269中列举的核苷碱基序列的至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个或20个连续核苷碱基。
本发明的实施例提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有核苷碱基序列，该核苷碱基序列包括选自SEQ ID NO：242至269中列举的核苷碱基序列的至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个或20个连续核苷碱基。
在一些实施例中，修饰寡核苷酸包括至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个或至少18个选自以下的核苷碱基序列的核苷碱基：ISIS Nos 22、31、32、34、36至38、40、41、43、51至53、55、56、59、60、64、66、71、73、75、96、98至103、105至109、113至117、119、124、127、129、171、172、174、176、178、179、181至197、199至211和213至232。在一些实施例中，修饰寡核苷酸包含选自以下的核苷碱基序列：ISISNos 22、31、32、34、36至38、40、41、43、51至53、55、56、59、60、64、66、71、73、75、96、98至103、105至109、113至117、119、124、127、129、171、172、174、176、178、179、181至197、199至211和213至232。在一些实施例中，修饰寡核苷酸由选自以下的核苷碱基序列所组成：SEQ ID NOs 22、31、32、34、36至38、40、41、43、51至53、55、56、59、60、64、66、71、73、75、96、98至103、105至109、113至117、119、124、127、129、171、172、174、176、178、179、181至197、199至211和213至232。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少70％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，修饰寡核苷酸包括至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个或至少18个选自以下的核苷碱基序列的核苷碱基：ISIS Nos 22、31、34、37、40、43、51至53、60、98、100至102、105至109、114、115、119、171、174、176、179、181、186、188至193、195、196、199至210和213至232。在一些实施例中，修饰寡核苷酸包括选自以下的核苷碱基序列：SEQ ID NOs 22、31、34、37、40、43、51至53、60、98、100至102、105至109、114、115、119、171、174、176、179、181、186、188至193、195、196、199至210和213至232。在一些实施例中，修饰寡核苷酸由选自以下的核苷碱基序列所组成：SEQ ID NOs 22、31、34、37、40、43、51至53、60、98、100至102、105至109、114、115、119、171、174、176、179、181、186、188至193、195、196、199至210和213至232。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少80％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，修饰寡核苷酸包括至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个或至少18个选自以下的核苷碱基序列的核苷碱基：ISIS Nos 31、37、100、105、179、190至193、196、202至207、209、210、214至219、221至224、226、227、229和231。在一些实施例中，修饰寡核苷酸包括选自以下的核苷碱基序列：SEQ ID NOs 31、37、100、105、179、190至193、196、202至207、209、210、214至219、221至224、226、227、229和231。在一些实施例中，修饰寡核苷酸由选自以下的核苷碱基序列所组成：SEQ ID NOs 31、37、100、105、179、190至193、196、202至207、209、210、214至219、221至224、226、227、229和231。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少90％的抑制(例如，如例3所述)。
在一些实施例中，修饰寡核苷酸包括至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个或至少18个选自以下的核苷碱基序列的核苷碱基：SEQ ID NOs 34、52、53、114、115、190至213、232、242至260以及262至266。在一些实施例中，修饰寡核苷酸包括选自以下的核苷碱基序列：SEQ ID NOs 34、52、53、114、115、190、213至232、242至260以及262至266。在一些实施例中，修饰寡核苷酸由选自以下的核苷碱基序列所组成：SEQ ID NOs 34、52、53、114、115、190、213至232、242至260和262至266。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少70％的抑制(例如，如例30所述)。
在一些实施例中，修饰寡核苷酸包括至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个或至少18个选自以下的核苷碱基序列的核苷碱基：SEQ ID NOs 34、52、53、114、115、190、213至216、218至226、243至246、248、249、252至259、264和265。在一些实施例中，修饰寡核苷酸包括选自以下的核苷碱基序列：SEQ ID NOs 34、52、53、114、115、190、213至216、218至226、243至246、248、249、252至259、264和265。在一些实施例中，修饰寡核苷酸由选自以下的核苷碱基序列所组成：SEQ ID NOs 34、52、53、114、115、190、213至216、218至226、243至246、248、249、252至259、264和265。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少80％的抑制(例如，如例30所述)。
在一些实施例中，修饰寡核苷酸包括至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个或至少18个选自以下的核苷碱基序列的核苷碱基：SEQ ID NOs 34、190、215、222、223、226、246和254。在一些实施例中，修饰寡核苷酸包括选自以下的核苷碱基序列：SEQ IDNOs 34、190、215、222、223、226、246和254。在一些实施例中，修饰寡核苷酸由选自以下的核苷碱基序列所组成：SEQ ID NOs 34、190、215、222、223、226、246和254。当在HepG2细胞中，用RT-PCR分析方法测定，所述修饰寡核苷酸可以实现人mRNA水平至少90％的抑制(例如，如示例30所述)。
在一些实施例中，化合物由单链修饰寡核苷酸所组成。
在一些实施例中，修饰寡核苷酸由20个连接核苷所组成。
在一些实施例中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：274的核苷碱基序列100％互补。
在一些实施例中，化合物具有至少一个修饰的核苷内连接。在一些实施例中，核苷内连接是硫代磷酸核苷内连接。
在一些实施例中，化合物具有至少一个包含修饰糖的核苷。在一些实施例中，至少一个修饰糖是双环糖。在一些实施例中，至少一个修饰糖包含2’-O-甲氧乙基。
本发明的实施例提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有核苷碱基序列，该核苷碱基序列包括选自SEQ ID NO：15-241、SEQID NO：15-269或SEQ ID NO：242-269中所列举的核苷碱基序列的至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个或20个连续核苷碱基，其中，至少一个核苷包含修饰糖。
在一些实施例中，所述至少一个修饰糖是双环糖。
在一些实施例中，所述至少一个双环糖包含4’-(CH2)n-O-2’桥联，其中n为1或2。
在一些实施例中，所述至少一个双环糖包含4’-CH(CH3)-O-2’桥联。
在一些实施例中，所述至少一个修饰糖包含2’-O-甲氧乙基基团。
本发明的实施例提供了包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有核苷碱基序列，该核苷碱基序列包括选自SEQ ID NO：15-241、SEQID NO：15-269或SEQ ID NO：242-269中所列举的核苷碱基序列的至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个或20个连续核苷碱基，包含至少一个四氢吡喃修饰核苷，其中，四氢吡喃环取代了呋喃糖环。
在一些实施例中，所述至少一个四氢吡喃修饰核苷具有如下结构：
在一些实施例中，化合物具有至少一个包含修饰的核苷碱基的核苷。在一些实施例中，修饰核苷碱基是5-甲基胞嘧啶。
在一些实施例中，化合物的修饰寡核苷酸包括：
(i)由连接的脱氧核苷组成的间隙区段；
(i)由连接的核苷组成的5’侧翼区段；
(iii)由连接的核苷组成的3’侧翼区段，其中，间隙区段直接相邻于且位于5’侧翼区段和3’侧翼区段之间，其中，每一侧翼区段的每个核苷包含一个修饰糖。在一些这样的实施例中，修饰寡核苷酸中的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一些实施例中，化合物的修饰寡核苷酸包括：
(i)由10个连接脱氧核苷组成的间隙区段；
(i)由5个连接的核苷组成的5’侧翼区段；
(iii)由5个连接的核苷组成的3’侧翼区段，其中，间隙区段直接相邻于且位于5’侧翼区段和3’侧翼区段之间，其中，每一侧翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧乙基糖；其中，每个核苷内连接是磷硫酰连接。在一些这样的实施例中，修饰寡核苷酸中的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一些实施例中，化合物的修饰寡核苷酸包括：
(i)由14个连接脱氧核苷组成的间隙区段；
(ii)由3个连接的核苷组成的5’侧翼区段；
(iii)由3个连接的核苷组成3’侧翼区段，其中，间隙区段直接相邻于且位于5’侧翼区段和3’侧翼区段之间，其中，每一侧翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧乙基糖；其中，每个核苷内连接是磷硫酰连接。在一些这样的实施例中，修饰寡核苷酸中的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一些实施例中，化合物的修饰寡核苷酸包括：
(i)由13个连接脱氧核苷组成的间隙区段；
(i)由2个连接的核苷组成的5’侧翼区段；
(iii)由5个连接的核苷组成的3’侧翼区段，其中，间隙区段直接相邻于且位于5’侧翼区段和3’侧翼区段之间，其中，每一侧翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧乙基糖；其中，每个核苷内连接是磷硫酰连接。在一些这样的实施例中，修饰寡核苷酸中的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
本发明的实施例提供了包括修饰寡核苷酸的组合物，该修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有核苷碱基序列，该核苷碱基序列包括选自SEQ ID NO：15-241所列举的核苷碱基序列的至少12个连续核苷碱基，或其盐以及药用可接受的载体或稀释剂。
本发明的实施例提供了包括修饰寡核苷酸的组合物，该修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有核苷碱基序列，该核苷碱基序列包括选自SEQ ID NO：15-269所列举的核苷碱基序列的至少12个连续核苷碱基，或其盐以及药用可接受的载体或稀释剂。
本发明的实施例提供了包括修饰寡核苷酸的组合物，该修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有核苷碱基序列，该核苷碱基序列包括选自SEQ ID NO：241-269所列举的核苷碱基序列的至少12个连续核苷碱基，或其盐以及药用可接受的载体或稀释剂。
本发明的实施例提供了方法，这些方法包括向动物给药包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有核苷碱基序列，该核苷碱基序列包含选自SEQ ID NO：15-241所列举的核苷碱基序列的至少8个连续核苷碱基。
本发明的实施例提供了方法，这些方法包括向动物给药包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有核苷碱基序列，该核苷碱基序列包含选自SEQ ID NO：15-269所列举的核苷碱基序列的至少8个连续核苷碱基。
本发明的实施例提供了方法，这些方法包括向动物给药包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有核苷碱基序列，该核苷碱基序列包含选自SEQ ID NO：241-269所列举的核苷碱基序列的至少8个连续核苷碱基。
在一些实施例中，动物是人。
在一些实施例中，给药防止了深静脉血栓形成或肺栓塞。
在一些实施例中，所述化合物与从阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、肝素、来匹卢定、噻氯匹啶、华法林、阿哌沙班、利伐沙班和依诺肝素钠中挑选的任一个共同给药。
在一些实施例中，所述化合物与任何因子Xa抑制剂共同给药。
在一些实施例中，因子Xa抑制剂是利伐沙班、LY517717、YM150、阿哌沙班、PRT054021和DU-176b中的任一种。
在一些实施例中，化合物与从阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、肝素、来匹卢定、噻氯匹啶、华法林、阿哌沙班、利伐沙班和依诺肝素钠中挑选的任一个随附给药。
在一些实施例中，给药是肠胃外给药。在一些实施例中，肠胃外给药是皮下注射或静脉注射给药中的任一种。
本发明的实施例提供了方法，包括鉴定有发展血栓栓塞性并发症的风险的动物，以及向该有风险的动物给药治疗有效量的包括修饰寡核苷酸的化合物，该修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，其中，该修饰的寡核苷酸与因子11核酸互补。
在一些实施例中，血栓栓塞性并发症是深静脉血栓形成、肺栓塞或其组合。
本发明的实施例提供了方法，包括通过向动物给药治疗有效量的包括修饰寡核苷酸的化合物识别出有凝血紊乱风险的动物，该修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，其中，修饰的寡核苷酸与因子11核酸互补。
在一些实施例中，化合物与从阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、肝素、来匹卢定、噻氯匹啶、华法林、阿哌沙班、利伐沙班和依诺肝素钠中挑选的任一个共同给药。
在一些实施例中，化合物与从阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、肝素、来匹卢定、噻氯匹啶、华法林、阿哌沙班、利伐沙班和依诺肝素钠中挑选的任一个随附给药。
本发明的实施例提供了方法，该方法包括通过向动物给药治疗有效量的包括修饰寡核苷酸的化合物，降低动物血栓栓塞性并发症的风险，其中，修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，其中，修饰的寡核苷酸与因子11核酸互补。
本发明的实施例提供了方法，包括通过向动物给药治疗有效量的包括修饰寡核苷酸的化合物，治疗动物体内的凝血紊乱，其中，修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，其中，修饰的寡核苷酸与因子11核酸互补。
本发明的实施例提供了方法，包括通过向动物给药治疗有效量的包括修饰寡核苷酸的化合物，抑制动物体内因子11的表达，其中，修饰寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，其中，修饰的寡核苷酸与因子11核酸互补。
在一些实施例中，通过给药修饰寡核苷酸的解毒剂逆转动物体内因子11的抑制。
在一些实施例中，解毒剂是与修饰寡核苷酸互补的寡核苷酸。
反义化合物
寡聚化合物包括，但不限于，寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、反义化合物、反义寡核苷酸以及siRNA。寡聚化合物可以与目标核酸“反义”，是指它能够通过氢键作用与目标核酸相杂交。
在一些实施例中，反义化合物具有核苷碱基序列，当以5’至3’方向表示时，其包含其靶向的目标核酸的目标区段的反式互补序列。在一些这样的实施例中，反义寡核苷酸具有核苷碱基序列，当5’至3’方向表示时，其具有其靶向的目标核酸的目标区段的反式互补序列。
在一些实施例中，靶向因子11核酸的反义化合物的长度为12-30个亚单位。换言之，这样的反义化合物是12到30个连接的亚单位。在其他实施例中，反义化合物是8至80、12至50、15至30、18至24、19至22或20个连接的亚单位。在一些这种实施例中，反义化合物的长度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个连接的亚单位，或是由任意两个上述数值定义的范围。在一些实施例中，反义化合物是反义寡核苷酸，连接的亚单位是核苷酸。
在一些实施例中，靶向因子11核酸的反义寡核苷酸可能被缩短或截短。例如，可以从5’末端(5’截短)或者从3’末端(3’截短)删除单个亚单位。靶向因子11核酸的缩短或截短的反义化合物可能有两个从反义化合物的5’末端删除的亚单位，或者两个从反义化合物的3’末端删除的亚单位。另外，被删除的核苷可能分散在反义化合物的各处，例如，分散在有一个从5’末端删除的亚单位以及一个从3’末端删除的亚单位的反义化合物中。
当加长的反义化合物中存在单个额外的亚单位时，该额外的亚单位可以位于反义化合物的5’或3’末端。当存在两个或多个额外的亚单位时，这些增加的亚单位可能彼此相邻，例如，在有两个亚单位被加到反义化合物的5’末端(5’增加)或者3’末端(3’增加)的反义化合物中。或者，增加的亚单位可以分散在反义化合物的各处，例如，在有一个亚单位被增加到5’末端以及一个亚单位被增加到3’末端的反义化合物中。
增加或降低反义化合物，如反义寡核苷酸，的长度，和/或引入错配碱基而不消除活性是可能的。例如，在Woolf等人的工作中(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7305-7309，1992)，对一系列长度为13-25个核苷碱基的反义寡核苷酸在卵母细胞注射模型中诱导目标RNA裂解的能力进行了测试。靠近反义寡核苷酸末端有8或11个错配碱基且长度为25个核苷碱基的反义寡核苷酸能够引导目标mRNA的特异性裂解，虽然其程度小于不含错配的反义寡核苷酸。类似地，用包括那些有1个或3个错配的13个核苷碱基的反义寡核苷酸实现了目标特异性裂解。
Gautschi等人(J.Natl.Cancer Inst.93：463-471，March 2001)说明了与bcl-2mRNA 100％互补并且与bcl-xL mRNA有3个错配的寡核苷酸在体外和体内对bcl-2和bcl-xL兼有降低表达的能力。而且，这种寡核苷酸在体内表现出有效地抗肿瘤活性。
Maher和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16：3341-3358，1988)分别对一系列14个核苷碱基串联的反义寡核苷酸以及由两个或三个串联反义寡核苷酸构成的28个和42个核苷碱基的反义寡核苷酸测试了它们在兔网织红细胞测试中阻止人DHFR翻译的能力。3条14个核苷碱基的反义寡核苷酸的每一个单独能抑制翻译，虽然水平比28个或42个核苷碱基的反义寡核苷酸的水平要更弱些。
反义化合物结构域
在一些实施例中，靶向因子11核酸的反义化合物具有模式化排列的化学修饰亚单位或结构域，以赋予反义化合物如增强抑制活性、增强对目标核酸的结合力或对体内核酸酶引起的降解的抵抗力等特性。
嵌合型反义化合物通常包含至少一个修饰区域，以便赋予对核酸酶降解的增强的抵抗力、增强的细胞摄入、对目标核酸的增强的结合力和/或增强的抑制活性。嵌合型反义化合物的第二个区域可作为裂解RNA：DNA双螺旋的RNA链的细胞核酸内切酶RNase H的底物。
具有gapmer结构域的反义化合物被视为嵌合型反义化合物。在gapmer中，具有多个支持RNase H裂解的核苷酸的内部区段位于具有多个化学上不同于内部区域核苷的核苷酸的外部区段之间。就具有gapmer结构域的反义寡核苷酸而言，间隙区段通常作为核酸内切酶裂解的底物，而侧翼区段包含修饰的核苷。在一些实施例中，gapmer的区域的差别在于包括每个独特区域的糖基的类型。在一些实施例中，用来区别gapmer区域的糖基类型包括β-D-核糖核苷、β-D-脱氧核糖核苷、2′-修饰的核苷(这些2′-修饰的核苷可以包括2’-MOE和2’-O-CH3等等)和双环糖修饰的核苷(这些双环糖修饰的核苷可以包括那些具有4’-(CH2)n-O-2’桥联的核苷，其中n＝1或n＝2)。优选地，每一独特区域包括统一的糖基。侧翼-间隙-侧翼结构域经常表示为“X-Y-Z”，其中，“X”代表5’侧翼区域的长度，“Y”代表间隙区域的长度，“Z”代表3’侧翼区域的长度。如此处所用，被描述为“X-Y-Z”的gapmer具有间隙区段与5’侧翼区段和3’侧翼区段每个直接相邻的结构。因此，在5’侧翼区段和间隙区段之间或间隙区段与3’侧翼区段之间没有干扰核苷。此处描述的任何反义化合物可以有gapmer结构域。在一些实施例中，X和Z相同，在其他实施例中，它们不同。在优先实施例中，Y介于8个至15个核苷酸之间。X、Y或Z可以是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个或更多个核苷酸。因此，本发明的gapmer包括，但不限于，例如5-10-5、4-8-4、4-12-3、4-12-4、3-14-3、2-13-5、2-16-2、1-18-1、3-10-3、2-10-2、1-10-1、2-8-2、5-8-5或6-8-6。
在一些实施例中，反义化合物具有侧翼-间隙或间隙-侧翼结构的“wingmer”结构域，也就是上面描述的gapmer结构的X-Y或Y-Z结构。因此，本发明的wingmer结构包括，但不限于，例如5-10、8-4、4-12、12-4、3-14、16-2、18-1、10-3、2-10、1-10、8-2、2-13、5-13、5-8或6-8。
在一些实施例中，靶向因子11核酸的反义化合物具有5-10-5 gapmer结构域。
在一些实施例中，靶向因子11核酸的反义化合物具有3-14-3 gapmer结构域。
在一些实施例中，靶向因子11核酸的反义化合物具有2-13-5 gapmer结构域。
在一些实施例中，靶向因子11核酸的反义化合物具有5-8-5 gapmer结构域。
在一些实施例中，靶向因子11核酸的反义化合物具有6-8-6 gapmer结构域。
在一些实施例中，靶向因子11核酸的反义化合物具有间隙扩宽的结构域。
在一些实施例中，靶向因子11核酸的间隙扩宽的反义寡核苷酸具有由14个2’-脱氧核糖核苷构成的间隙区段，其直接相邻并介于由三个化学修饰的核苷构成的侧翼区段之间。在一些实施例中，化学修饰包括2’-糖基修饰。在另一实施例中，化学修饰包括含2’-MOE糖基修饰。
在一些实施例中，靶向因子11核酸的间隙扩宽的反义寡核苷酸具有由13个2’-脱氧核糖核苷构成的间隙区段，其直接相邻并介于由两个化学修饰的核苷构成的5’侧翼区段和由五个化学修饰的核苷构成的3’侧翼区段之间。在一些实施例中，化学修饰包括2’-糖基修饰。在另一实施例中，化学修饰包括2’-MOE糖基修饰。
目标核酸、目标区域和核苷酸序列
编码因子11的核苷酸序列包括，但不限于以下：GENBANK登录号NM_000128.3，1999年3月24日GENBANK首次收录，指定为SEQ ID NO：1；NT_022792.17，从19598000至19624000截断，2000年11月29日GENBANK首次收录，指定为SEQ ID NO：2；GENBANK登录号NM_028066.1，2002年6月2日GENBANK首次收录，指定为SEQ ID NO：6；以及外显子1-15，GENBANK登录号NW_001118167.1，2006年3月28日GENBANK首次收录，指定为SEQ ID NO：274。
可以理解，此处包含的例子中每个SEQ ID NO所对应的序列独立于任何糖基、核苷内连接或核苷碱基的修饰。同样，SEQ ID NO定义的反义化合物可以独立地包含一个或多个糖基、核苷内连接或核苷碱基的修饰。Isis号(Isis No)描述的反义化合物表示核苷碱基序列和结构域的结合。
在一些实施例中，目标区段是目标核酸的结构性定义的区段。例如，目标区段可包含3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、外显子/内含子结合点、编码区域、翻译起始区域、翻译终止区域或其他定义的核酸区域。针对因子11的结构性定义区域可以通过登录号从如NCBI等序列数据库中获得，这些信息在此被作为参考并并入本申请。在一些实施例中，目标区域可包含从目标区域中目标区段的5’目标位点到同样目标区域中另一目标区段的3’目标位点间的序列。
靶向包括确定反义化合物与之杂交以便发生预期效果的至少一个目标区段。在一些实施例中，预期效果是目标核酸mRNA水平的下降。在一些实施例中，预期效果是目标核酸编码的蛋白水平的下降或目标核酸相关的表型变化。
目标区域可包含一个或多个目标区段。目标区域中的多个目标区段可以重叠。或者，它们可以不重叠。在一些实施例中，目标区域中的目标区段被至多约300个核苷酸分开。在一些实施例中，目标区域中的目标区段被目标核酸的大约、至多、至多约250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个核苷酸，或者任意两个前面数值定义的范围的数量的核苷酸分开。在一些实施例中，目标区域中的目标区段被目标核酸的至多或至多约5个核苷酸分开。在一些实施例中，目标区段是连续的。由具有以此处所列的5’目标位点或3’目标位点中任一个为起始核酸的范围所定义的目标区域同样被构思。
合适的目标区段可能在5’UTR、编码区域、3’UTR、内含子、外显子或外显子/内含子结合点中被发现。包含起始密码子或终止密码子的目标区段也是合适的目标区段。合适的目标区段可能特异性地排除如起始密码子或终止密码子等特定结构性定义的区域。
合适的目标区段的确定可包括目标核酸序列与基因组中其他序列的比较。例如，BLAST算法可用于鉴定不同核酸中有相似性的区域。这种比较可以防止挑选出可能与选中的目标核酸之外的序列(也就是非靶向的或脱靶序列)非特异性杂交的反义化合物序列。
反义化合物在活性目标区域中的活性(例如，以目标核酸水平的降低百分比来定义)可能会变化。在一些实施例中，因子11mRNA水平的降低表明了因子11表达的抑制。因子11蛋白水平的降低也表明了对目标mRNA表达的抑制。而且，表型变化表明了因子11表达的抑制。例如，延长的aPTT时间可表明因子11表达的抑制。在另一例子中，延长的aPTT时间连同正常的PT时间可表明因子11表达的抑制。在另一例子中，血小板因子4(PF-4)的减少量可表明因子11表达的抑制。在另一例子中，减少的血栓形成或血栓形成时间增加可表明因子11表达的抑制。
杂交
在一些实施例中，杂交发生在此处披露的反义化合物与因子11核酸之间。杂交最常见的机制涉及核酸分子的互补核苷碱基间的氢键作用(例如Watson-Crick，Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键作用)。
杂交可以在不同条件下发生。严谨条件是序列依赖的，取决于待杂交的核酸分子的特性和组成。
确定序列是否与目标核酸特异性杂交的方法为本领域所熟知。在一些实施例中，此处提供的反义化合物可与因子11的核酸特异性杂交。
互补
当反义化合物的足够数量的核苷碱基与目标核酸的相应核苷碱基发生氢键作用而产生期望效果时(例如，目标核酸，如因子11核酸，的反义抑制)，那么反义化合物与目标核酸彼此互补。
反义化合物和因子11核酸间的非互补核苷碱基是可被容忍说明反义化合物依然能够与目标核酸特异性杂交。而且，反义化合物可与因子11核酸的一个或多个区段杂交，以至于干扰或相邻区段不涉及到杂交事件中(例如，回环结构、错配或发卡结构)。
在一些实施例中，此处提供的反义化合物或其中指定部分与因子11核酸、目标区域、目标区段或其中指定部分有或至少有70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的互补。反义化合物和目标核酸的互补百分比可以用常规方法测定。例如，反义化合物的20个核苷碱基中的18个与目标区域互补并因此特异性杂交的反义化合物展示90％的互补性。在该例中，剩下的非互补核苷碱基可以是聚集的或点缀着互补核苷碱基，不必彼此之间或与互补核苷碱基相连续。同样，长度为18个核苷碱基且具有4(四)个两侧有与目标核酸完全互补的两个区域的非互补核苷碱基的反义化合物即具有与目标核酸77.8％的总的互补性，也落在本发明的范围之内。可以用本领域已知的BLAST程序(基本的局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序(Altschul et al.，J.Mol.Biol.，1990，215，403410；Zhang and Madden，Genome Res.，1997，7，649656)以常规的方法确定反义化合物与目标核酸区域的互补性百分比。同源百分比、序列身份或互补性可以用例如采用默认设置的Gap程序(Wisconsin序列分析软件包，Unix的版本8，遗传学计算机组，Research Park大学，Madison Wis.)来确定，其利用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.，1981，2，482-489)。
在一些实施例中，此处提供的反义化合物或其中指定部分与目标核酸或其中指定部分完全互补(也就是100％互补)。例如，反义化合物可与因子11核酸或目标区域或其中的目标区段或目标序列完全互补。如此处所用，“完全互补”是指反义化合物的每个核苷碱基能够与目标核酸的相应核苷碱基准确碱基配对。例如，只要400个核苷碱基长的目标核酸中有20个核苷碱基部分与反义化合物完全互补，20个核苷碱基反义化合物就与该目标序列完全互补。完全互补也可以用于第一条和/或第二条核酸的指定部分。例如，30个核苷碱基的反义化合物中的20个核苷碱基部分可以与400个核苷碱基长度的目标序列“完全互补”。如果目标序列有相应的20个核苷碱基，其中每个碱基与反义化合物的20个核苷碱基部分互补，那么30个核苷碱基寡核苷酸的20个核苷碱基部分与目标序列完全互补。同时，根据反义化合物剩下10个核苷碱基是否也与目标序列互补，整个30个核苷碱基反义化合物与目标序列可能完全互补或可能不完全互补。
非互补核苷碱基的位置可在反义化合物的5’末端或3’末端。或者，非互补核苷碱基或核苷碱基可在反义化合物的内部位置。当存在两个或多个非互补核苷碱基时，它们可以是连续的(也就是连接的)或非连续的。在一个实施例中，非互补核苷碱基位于gapmer反义寡核苷酸的侧翼区段。
在一些实施例中，相对于如因子11核酸的目标核酸或其中指定部分，长度为或高至12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷碱基的反义化合物包含不多于4、不多于3、不多于2、不多于1个非互补核苷碱基。
在一些实施例中，相对于如因子11核酸的目标核酸或其中指定部分，长度为或高至12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷碱基的反义化合物包含不多于6、不多于5、不多于4、不多于3、不多于2、不多于1个非互补核苷碱基。
此处提供的反义化合物还包括那些与目标核酸的部分互补的化合物。如此处所用，“部分”指的是在目标核酸的区域或区段中确定数量的连续的(也就是连接的)核苷碱基。“部分”也可以指反义化合物中确定数量的连续核苷碱基。在一些实施例中，反义化合物与目标区段的至少8个核苷碱基的部分互补。在一些实施例中，反义化合物与目标区段的至少12个核苷碱基的部分互补。在一些实施例中，反义化合物与目标区段的至少15个核苷碱基的部分互补。与目标区段中至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷碱基或由这些数值中任意两个所定义的范围内的核苷碱基数相互补的反义化合物也被考虑到了。
标识
此处提供的反义化合物也可有与特定核苷酸序列、SEQ ID NO或由特定Isis号代表的化合物或其中部分的相似度百分比。如此处所用，如果具有相同的核苷碱基配对能力，反义化合物就与此处披露的序列相同。例如，由于尿嘧啶和胸腺嘧啶与腺嘌呤都能配对，在披露的DNA序列中包含尿嘧啶替代胸腺嘧啶的RNA被认为与该DNA序列的相同。此处描述的反义化合物的缩短和延长版本以及具有相对于此处提供的反义化合物的非相同碱基的化合物也被考虑了。非相同碱基可彼此相邻或分散在反义化合物中各处。根据相对于被比较序列具有相同碱基配对的碱基数量计算反义化合物的相似度百分比。
在一些实施例中，反义化合物或其中部分与此处公开的一个或多个反义化合物或SEQ ID NOs或其中部分有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的相同。
在一些实施例中，反义化合物的部分与目标核酸的等长部分相比较。在一些实施例中，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷碱基部分与目标核酸的等长部分相比较。
在一些实施例中，反义寡核苷酸的部分与目标核酸的等长部分相比较。在一些实施例中，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷碱基部分与目标核酸的等长部分相比较。
修饰
核苷是碱基-糖组合。核苷的核苷碱基(也被称为碱基)部分通常是一个杂环碱基部分。核苷酸是进一步包括共价偶联在核苷的糖部分的磷酸基的核苷。对于那些包括五呋喃糖的核苷，磷酸基团可被连接在糖的2′、3′或5′羟基上。寡核苷酸是通过彼此相邻的核苷间的共价连接形成，以形成线性多聚寡核苷酸。在寡核苷酸结构中，磷酸基团通常被认为形成寡核苷酸的核苷内连接。
反义化合物的修饰包括核苷内连接、糖基或核苷碱基的取代或改变。因为像例如增强细胞摄入、对核酸目标的增强亲和力、核酸酶存在时的增强稳定性或增强抑制活性等期望特性，相对于天然形式，优选修饰的反义化合物。
化学修饰核苷也可能用来增加缩短或截短的反义寡核苷酸对其目标核酸的结合力。所以，以具有这样化学修饰核苷的更缩的反义化合物，经常可以获得类似的结果。
修饰的核苷内连接
RNA和DNA的天然存在的核苷内连接是3′至5′磷酸二酯键连接。因为像例如增强细胞摄入、对目标核酸的增强亲和力和核酸酶存在时的增强稳定性等期望的特性，相对于天然存在的核苷内连接，优选具有一个或多个修饰的，也就是非天然存在的核苷内连接的反义化合物。
具有修饰的核苷内连接的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷内连接以及没有磷原子的核苷内连接。典型的含有磷原子的核苷内连接包括，但不限于，磷酸二酯、磷酸三酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯以及磷硫酰。制备含磷和不含磷连接的方法是业界习知的。
在一些实施例中，靶向因子11核酸的反义化合物包含一个或多个修饰的核苷内连接。在一些实施例中，修饰的核苷内连接是磷硫酰连接。在一些实施例中，反义化合物的每个核苷内连接是磷硫酰核苷内连接。
修饰的糖基
可选地，本发明的反义化合物可包含一个或多个其中糖基被修饰的核苷。这样的糖修饰的核苷可赋予反义化合物增强的核酸酶稳定性、增强的结合力或一些其他有益的生物学特性。在一些实施例中，核苷包含化学修饰的呋喃核糖环部分。化学修饰的呋喃核糖环的例子非限制地包括加入取代基(包括5′和2′取代基)、形成双环核酸(BNA)的非偕环原子的桥联、以S或N(R)或C(R1)(R)2(R＝H，Cl-C12烷基或保护基团)替代核糖环氧原子，以及其组合。化学修饰糖的例子包括2′-F-5′-甲基取代核苷(见08年8月21日公开的PCT国际申请WO 2008/101157，其是有关其他被披露的5′，2′-双取代核苷)，或者以S取代核糖环氧原子并在2′-位(见2005年6月16日公开的美国专利申请US2005-0130923号)或者在5′-取代BNA(见07年11月22日公开的PCT国际申请WO 2007/134181号，其中LNA被例如5′-甲基或5′-乙烯基所取代)。
具有修饰糖基的核苷的例子非限制地包括含有5′-乙烯基、5′-甲基(R或S)、4′-S、2′-F、2′-OCH3以及2′-O(CH2)2OCH3取代基团的核苷。2’位的取代也可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代的、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)和O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中，Rm和Rn各自独立地是H或取代的或非取代的C1-C10烷基。
双环核酸(BNAs)的例子非限制地包括包含4′和2′核糖环原子间桥联的核苷。在一些实施例中，此处提供的反义化合物包括一个或多个BNA核苷，其中，桥联包括下列分子式之一：4′-(CH2)-O-2′(LNA)；4′-(CH2)-S-2′；4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-C(CH3)2-O-2’(见PCT/US2008/068922)；和(见美国专利7,399,845号，2008年7月15日授权)；4’-CH2-N(OCH3)-2’(见PCT/US2008/064591)；4’-CH2-O-N(CH3)-2’(见已公开的美国专利申请US2004-0171570号，2004年9月2日公开)；4’-CH2-N(R)-O-2’(见美国专利7,427,672号，2008年9月23日公开)；4’-CH2-C(CH3)-2’和(见PCT/US2008/066154)；其中，R独立地是H、C1-C12烷基或保护基团。每一个前面的BNA包含包括例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(见PCT国际申请PCT/DK98/00393号，于1999年3月25日公开为WO 99/14226)的各种立体化学的糖构型。
在一些实施例中，核苷被以糖替代物对核糖环的替代所修饰。这样的修饰非限制地包括以替代环系统(有时指的是DNA类似物)对核糖环的替代，替代环系统如吗啉环、环己烯
基环、环己基环或如具有下列结构式之一的四氢吡喃环：
可用于修饰以包含在反义化合物中的核苷的许多其他双环和三环糖替代环系统也为本领域已知(见例如综述文章：Leumann，J.C，Bioorganic&Medicinal Chemistry，2002，10，841-854)。这种环系统可以承受各种附加替代以增强活性。
制备修饰糖的方法为本领域普通技术人员所熟知。
具有修饰糖基的核苷中，核苷碱基部分(天然的、修饰的或其组合)被保留，用于与合适的核酸目标杂交。
在一些实施例中，靶向因子11核酸的反义化合物包含一个或多个具有修饰的糖部分的核苷酸。在一些实施例中，修饰的糖基是2’-MOE。在一些实施例中，2’-MOE修饰的核苷酸以gapmer结构域排列。
修饰的核苷碱基
核苷碱基(或碱基)修饰或取代与天然存在或合成的未修饰的核苷碱基在结构上可区别，然而在功能上可互换。天然和修饰的核苷碱基都能够参与氢键作用。这样的核苷碱基修饰可能赋予反义化合物核酸酶稳定性、结合力或一些其他有益的生物学特性。修饰的核苷碱基包括像例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)等合成和天然的核苷碱基。包括5-甲基胞嘧啶取代的一些核苷碱基取代对于增强反义化合物与目标核酸的亲和力特别有用。例如，5-甲基胞嘧啶取代已经被证明使核酸双螺旋稳定性增加了0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.and Lebleu，B.，eds.，Antisense Research and Applications，CRC Press，BocaRaton，1993，pp.276-278)。
另外的修饰核苷碱基包括5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、2-硫脲嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-巯基胞嘧啶、5-卤素尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-含氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫脲嘧啶、8-卤素、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤素特别是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤和7-去氮杂腺嘌呤和3-去氮杂鸟嘌呤以及3-去氮杂腺嘌呤。
杂环碱基部分也可包括那些其中的嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环所取代的，例如7-去氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮等。对于增强反义化合物的结合力特别有用的核苷碱基包括5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
在一些实施例中，靶向因子11核酸的反义化合物包含一个或多个修饰的核苷碱基。在一些实施例中，靶向因子11核酸的间隙扩宽的反义寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷碱基。在一些实施例中，修饰核苷碱基是5-甲基胞嘧啶。在一些实施例中，每一个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
配制药物组合物的组分和方法
为制备药物组合物或剂型，反义寡核苷酸可与药用可接受的活性或惰性物质相混合。配制药物组合物的组分和方法取决于一些标准，包括但不限于，给药方式、疾病程度或给药剂量。
通过组合反义化合物和合适的药用可接受的稀释剂或载体，靶向因子11核酸的反义化合物可被用于药物组合物。药用可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲液(PBS)。PBS是一种适合用在非肠道给药的组合物中的稀释剂。因此，在一个实施例中，被此处描述的方法采用的是一种包含靶向因子11核酸的反义化合物以及药用可接受的稀释剂的药物组合物。在一些实施例中，药用可接受的稀释剂是PBS。在一些实施例中，反义化合物是反义寡核苷酸。
含反义化合物的药物组合物涵盖在给包括人的动物给药时能提供(直接或间接)生物活性的代谢物或其残基的任何药用可接受的盐、酯类、或这些酯的盐、或者任何其他寡核苷酸。因此，例如，本披露也指向反义化合物的药用可接受的盐、前体药物、这种前体药物的药用可接受的盐以及其他生物等同物。合适的药用可接受的盐包括但不限于，钠和钾盐。
前体药物可以包括在反义化合物的一个或两个末端添加额外的核苷，其被体内的内源性核酸酶裂解以形成活性反义化合物。
偶联的反义化合物
反义化合物可共价连接至能增强得到的反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄入的一个或多个部分或偶联物。典型的偶联基团包括胆固醇基或脂基。另外的偶联基团包括碳水化合物、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素以及染料。
反义化合物也可以被修饰为具有一个或多个通常连接在反义化合物的一个或两个末端的稳定基团，以增强例如核酸酶稳定性等特性。稳定基团包括帽结构。这些末端修饰能防止具有末端核酸的反义化合物被核酸外切酶降解，并有助于细胞内的传送和/或定位。帽可以存在于5′-末端(5′-帽)，或在3′-末端(3′-帽)，或者在两个末端都存在。帽结构为本领域普通技术人员所熟知，包括，例如，反转的脱氧脱碱基帽。可用于在反义化合物的一个或两个末端形成帽结构以赋予核酸酶稳定性的3′和5′稳定基团还包括2003年1月16日公开的WO 03/004602中所披露的那些基团。
细胞培养和反义化合物处理
可以在各种细胞类型中体外测试反义化合物对因子11核酸水平、活性或表达的影响。用于这种分析的细胞类型可购自商业供应商(例如美国菌种保藏中心，Manassus，VA；Zen-Bio，Inc.，Research Triangle Park，NC；Clonetics Corporation，Walkersville，MD)，根据供应商说明书用商售试剂(例如Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)进行培养。示例性的细胞类型包括但不限于，HepG2细胞、Hep3B细胞以及原代肝细胞。
反义寡核苷酸的体外测试
此处描述的是用反义寡核苷酸处理细胞的方法，这些方法可以被适当修改从而用其他反义化合物来处理。
通常，当细胞达到约60-80％培养克隆率时，用反义寡核苷酸处理细胞。
通常用于将反义寡核苷酸转入培养细胞的试剂包括阳离子脂类转染试剂LIPOFECTIN(Invitrogen，Carlsbad，CA)。将反义寡核苷酸与LIPOFECTIN在OPTI-MEM 1(Invitrogen，Carlsbad，CA)中混合以达到期望的反义寡核苷酸的终浓度以及通常每100nM反义寡核苷酸对应2至12ug/mL范围的LIPOFECTIN浓度。
用于将反义寡核苷酸转入培养细胞的另一种试剂包括LIPOFECTAMINE(Invitrogen，Carlsbad，CA)。将反义寡核苷酸与LIPOFECTAMINE在OPTI-MEM 1减血清培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中混合以达到期望的反义寡核苷酸的浓度以及通常每100nM反义寡核苷酸对应2至12ug/mL范围的LIPOFECTAMINE的浓度。
用于将反义寡核苷酸转入培养细胞的另一种技术包括电穿孔。
细胞用反义寡核苷酸以常规方法处理。细胞通常在反义寡核苷酸处理后16-24小时收获，此时用此处描述的本领域已知的方法测定目标核酸的RNA或蛋白水平。通常，以多份重复进行处理时，以重复处理的平均值作为结果。
采用的反义寡核苷酸的浓度因细胞株而变化。针对特定细胞株确定最佳反义寡核苷酸浓度的方法为本领域所熟知。当用LIPOFECTAMINE转染时，通常在1nM至300nM的浓度范围内使用反义寡核苷酸。当用电穿孔转染时，通常在625至20,000nM的浓度范围内使用反义寡核苷酸。
分离RNA
可对总的细胞RNA或poly(A)+mRNA进行RNA分析。分离RNA的方法为本领域所熟知。用本领域熟知的方法制备RNA，例如，根据制造商推荐的操作规程用TRIZOL试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行。
目标水平或表达的抑制的分析
因子11核酸的水平或表达的抑制可以用本领域已知的各种方法测试。例如，目标核酸水平可以用例如印记杂交分析(Northen blot analysis)、竞争性聚合酶链式反应或定量实时PCR来定量。可对总的细胞RNA或poly(A)+mRNA进行RNA分析。分离RNA的方法为本领域所熟知。印记杂交分析也是本领域的常规方法。定量实时PCR可以根据制造商的说明用加利福尼亚州福斯特市的PE-应用生物系统公司提供的商售ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测系统方便地完成。
目标RNA水平的定量实时PCR分析
目标RNA水平的定量可以根据制造商的说明用ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测系统(PE-应用生物系统公司，福斯特市，加利福尼亚州)的定量实时PCR来完成。定量实时PCR的方法为本领域所熟知。
在实时PCR之前，分离的RNA要进行逆转录酶(RT)反应，以产生随后可用作实时PCR扩增的底物的互补DNA(cDNA)。RT和实时PCR反应在同样的样本孔中顺序进行。RT和实时PCR的试剂从Invitrogen(Carlsbad，CA)获得。RT和实时PCR反应用本领域普通技术人员熟知的方法实现。
用实时PCR获得的基因(或RNA)目标量用如亲环素A等表达恒定的基因的表达水平或用RIBOGREEN(Invitrogen，Inc.Carlsbad，CA)对总RNA的定量来归一化。亲环素A用实时PCR来定量，与目标同时或多通路或分别地运行。总RNA用RIBOGREEN RNA定量试剂(Invetrogen，Inc.Eugene，OR)来定量。RIBOGREEN定量RNA的方法在Jones，L.J等人的工作(Analytical Biochemistry，1998，265，368-374)中讲授。CYTOFLUOR 4000设备(PE应用生物系统公司)用来测定RIBOGREEN荧光。
设计与因子11核酸杂交的探针和引物。设计实时PCR探针和引物的方法为本领域所熟知，可包括使用如PRIMER EXPRESS软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)等软件的使用。
蛋白水平分析
因子11核酸的反义抑制可以通过测定因子11蛋白水平来评估。因子11的蛋白水平可以用本领域熟知的各种方法来评价或定量，比如免疫沉淀反应、Western印记分析(免疫印记)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、定量蛋白质分析、蛋白活性分析(例如，凋亡蛋白酶活性分析)、免疫组织化学、免疫细胞化学或荧光活化细胞分选(FACS)。指向目标的抗体可被识别并从如MSRS抗体目录(Aerie Corporation，Birmingham，MI)等各种来源获得，或可以通过本领域熟知的常规单克隆或多克隆抗体生产技术来制备。对探测小鼠、大鼠、猴和人的因子11有用的抗体可以通过商业途径购买。
反义化合物的体外测试
在动物体内测试了例如反义寡核苷酸的反义化合物，以评价它们抑制因子11表达和产生表型变化的能力，例如，延长的aPTT、与正常PT交汇的延长的aPTT时间、血小板因子4(PF-4)的减少量以及血栓形成减少或血栓形成时间增加。测试可以在正常动物体内或在实验疾病模型中进行。向动物给药的反义寡核苷酸在如磷酸盐缓冲液等药用可接受的稀释剂中配制。给药包括如腹腔注射、静脉注射以及皮下注射等非肠道给药途径。对反义寡核苷酸剂量和给药频率的计算在本领域普通技术人员的能力范围之内，取决于如给药方式和动物体重等因素。以反义寡核苷酸的处理一段期间之后，从肝脏组织中分离RNA，测定因子11核酸表达的改变。还用凝血酶生成试验测定了因子11蛋白水平的改变。另外，用已处理动物的血浆测定对例如PT和aPTT等凝结时间的影响。
耐受性
在一些实施例中，此处提供的化合物表现最低的副作用。副作用包括通常与因子11靶向无关的对反义化合物的给药的反应，比如在动物中的炎症反应。在一些实施例中，化合物被动物很好地耐受。增强的耐受性取决于一些因素，包括但不限于反义化合物的核苷酸序列、核苷酸的化学修饰、反义化合物中未修饰或修饰核苷的特定结构域，或其组合。耐受性取决于许多因素。这些因素包括体重、器官重量、肝功能、肾功能、血小板数、白细胞数。
在一些实施例中，此处提供的化合物表现出对器官重量的最低影响。在一些实施例中，化合物表现出脾脏和/或肝脏重量的低于7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍或没有明显的增加。
在一些实施例中，此处提供的化合物表现出对肝功能的最小影响。评价肝功能的因素包括ALT水平、AST水平、血浆胆红素水平以及血浆白蛋白水平。在一些实施例中，此处提供的化合物表现出ALT或AST的低于7倍、低于6倍、低于5倍、低于4倍、低于3倍、低于2倍或没有明显的增加。在一些实施例中，此处提供的化合物表现出血浆胆红素水平的低于3倍、低于2倍或没有明显的增加。
在一些实施例中，此处提供的化合物表现出对肾功能的最低影响。在一些实施例中，此处提供的化合物表现出血浆血液尿素氮(BUN)浓度的低于3倍、至少2倍或没有明显的增加。在一些实施例中，此处提供的化合物表现出尿蛋白与肌酐比值的低于6倍、5倍、4倍、3倍、2倍或没有明显的增加。
在一些实施例中，此处提供的化合物表现出对血液指标的最低影响。在一些实施例中，此处提供的化合物表现出血小板数的低于60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％的减少。在一些实施例中，此处提供的化合物表现出单核细胞数的低于4倍、低于3倍、低于2倍或没有明显的增加。
在一些实施例中，化合物进一步表现出有利的药物动力学。在一些实施例中，反义化合物在相关生物体液或组织中显示出相对高的半衰期。
在一些实施例中，化合物或组合物进一步表现出有利的粘度。在一些实施例中，化合物或组合物在165-185mg/mL浓度时的粘度仅为40cP。
在其他实施例中，化合物表现出上述特征的组合，在动物模型中高效地降低因子11mRNA的表达。
一些适应症
在一些实施例中，本发明提供了治疗个体的方法，包括给药本发明的一种或多种药物组合物。在一些实施例中，个体具有血栓栓塞性并发症。在一些实施例中，个体具有血液凝结紊乱的风险，包括但不限于，梗塞、血栓形成、栓塞以及血栓栓塞，比如如深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞和中风。这包括个体具有引起血栓形成风险的后天问题、疾病或紊乱，例如手术、癌症、不动、败血症、动脉粥样硬化、心房颤动等，以及例如抗磷脂综合症和常染色体显性遗传的因子V Leiden突变等遗传倾向性。在一些实施例中，个体被鉴定为需要抗凝治疗。这样的个体的例子包括但不限于，那些经受大型矫形手术(例如，髋骨/膝关节置换术或髋骨骨折手术)的人以及如那些经历心房颤动需防止中风等需要长期治疗的病人。在一些实施例中，本发明提供了预防性地降低个体内因子11表达的方法。一些实施例包括通过向需要治疗的个体给药治疗有效量的靶向因子11核酸的反义化合物。
在一个实施例中，给药治疗有效量的靶向因子11核酸的反义化合物的同时，伴随着监测个体血清中的因子11的水平，以确定个体对于反义化合物给药的反应。个体对于反义化合物给药的反应被内科医师用来确定治疗干预的用量及持续时间。
在一些实施例中，靶向因子11核酸的反义化合物的给药导致因子11的表达至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99％，或者这些数值中任意两个所定义的范围的降低。在一些实施例中，靶向因子11核酸的反义化合物的给药导致用标准测试测量的血液凝结的测量值的改变，例如但不限于，活化部分凝血活酶时间(aPTT)测试、凝血酶原时间(PT)测试、凝血酶时间(TCT)、出血时间或D-二聚体。在一些实施例中，因子11的反义化合物的给药至少增加了测量值15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99％或者这些数值中任意两个所定义的范围。在一些实施例中，因子11的反义化合物的给药至少降低了测量值15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99％或者这些数值中任意两个所定义的范围。
在一些实施例中，包含靶向因子11的反义化合物的药物组合物被用于用来治疗遭受或易患血栓栓塞性并发症的病人的药剂生产。
一些联合治疗
在一些实施例中，本发明的一种或多种药物组合物与一种或多种其他药剂共同给药。在一些实施例中，这样的一种或多种其他药剂被设计成用于治疗本发明的一种或多种药物组合物所治疗的相同的疾病、紊乱或状况。在一些实施例中，这样的一种或多种其他药剂被设计成用于治疗不同于本发明的一种或多种药物组合物所治疗的疾病、紊乱或状况。在一些实施例中，这样的一种或多种其他药剂被设计成用于治疗本发明的一种或多种药物组合物的不希望的副作用。在一些实施例中，本发明的一种或多种药物组分与另一种药剂共同给药以治疗其他药剂的副作用。在一些实施例中，本发明的一种或多种药物组合物与另一种药剂共同给药以产生联合效果。在一些实施例中，本发明的一种或多种药物组合物与另一种药剂共同给药以产生协同效应。
在一些实施例中，本发明的一种或多种药物组合物与一种或多种其他药剂同时给药。在一些实施例中，本发明的一种或多种药物组合物与一种或多种其他药剂在不同时间给药。在一些实施例中，本发明的一种或多种药物组合物与一种或多种其他药剂一起制备成单一制剂。在一些实施例中，本发明的一种或多种药物组合物与一种或多种其他药剂分别制备。
在一些实施例中，可与本发明的药物组分共同给药的药剂包括抗凝剂或抗血小板剂。在一些实施例中，可与本发明的药物组分共同给药的药剂包括NSAID/环氧酶抑制剂，比如阿司匹林。在一些实施例中，可与本发明的药物组分共同给药的药剂包括二磷酸腺苷(ADP)受体抑制剂，比如氯吡格雷(波立维)和噻氯匹啶(TICLID)。在一些实施例中，可与本发明的药物组分共同给药的药剂包括磷酸二酯酶抑制剂，比如西洛他唑(PLETAL)。在一些实施例中，可与本发明的药物组合物共同给药的药剂包括糖蛋白IIB/IIIA抑制剂，比如阿昔单抗(REOPRO)、埃替非巴肽(INTEGRILIN)、替罗非班(AGGRASTAT)以及去纤苷。在一些实施例中，可与本发明的药物组合物共同给药的药剂包括腺苷再摄取抑制剂，比如双嘧达莫(PERSANTINE)。在一些实施例中，可与本发明的药物组合物共同给药的药剂包括但不限于，华法林(和相关香豆素)、肝素、直接凝血酶抑制剂(比如来匹卢定、比伐卢定)、阿哌沙班、依诺肝素钠以及直接干扰特定凝结因子的小分子化合物(例如，干扰因子Xa的利伐沙班)。在一些实施例中，可与本发明的因子11特异性抑制剂共同给药的药剂包括但不限于，其他因子11抑制剂。在一些实施例中，抗凝剂或抗血小板剂在本发明的药物组合物给药之前给药。在一些实施例中，抗凝剂或抗血小板剂在本发明的药物组合物给药之后给药。在一些实施例中，抗凝剂或抗血小板剂在本发明的药物组合物给药同时给药。在一些实施例中，共同给药的抗凝剂或抗血小板剂的剂量与该抗凝剂或抗血小板剂单独给药时的给药剂量相同。在一些实施例中，共同给药的抗凝剂或抗血小板剂的剂量低于该抗凝剂或抗血小板剂单独给药时的给药剂量。在一些实施例中，共同给药的抗凝剂或抗血小板剂的剂量高于该抗凝剂或抗血小板剂单独给药时的给药剂量。
在一些实施例中，第二个化合物的共同给药增强了第一个化合物的抗凝效果，以至于化合物的共同给药会导致高于第一个化合物单独给药时的抗凝效果。在其他实施例中，相对于单独给药化合物，共同给药导致了增加的抗凝效果。在一些实施例中，相对于单独给药化合物，共同给药导致了超量增加的抗凝效果。在一些实施例中，第二个化合物的共同给药会增加抗血栓形成的活性，同时不增加出血风险。在一些实施例中，第一个化合物是反义化合物。在一些实施例中，第二个化合物是反义化合物。
在一些实施例中，解毒剂在因子11特异性抑制剂给药后的任意时间给药。在一些实施例中，解毒剂在靶向因子11的反义寡核苷酸给药后的任意时间给药。在一些实施例中，解毒剂在靶向因子11的反义化合物给药的几分钟、几小时、几天、几周或几月后给药。在一些实施例中，解毒剂与靶向因子11的反义化合物互补(例如，同义链)。在一些实施例中，解毒剂是因子7、因子7a、因子11或因子11a蛋白。在一些实施例中，因子7、因子7a、因子11或因子11a蛋白是人因子7、人因子7a、人因子11或人因子11a蛋白。在一些实施例中，因子7蛋白是NOVOSEVEN。
一些共同给药的抗血小板治疗
在一些实施例中，因子11抑制剂与抗血小板治疗联用。在一些实施例中，相比于单独抗血小板治疗，与抗血小板治疗联用的因子11抑制剂的给药导致出血风险的少量至没有可觉察或可检测的增加。在一些实施例中，风险概况或风险指标与单独抗血小板治疗相比没有改变。
抗血小板和抗凝血疗法联用在临床实践中最频繁使用于被诊断具有例如血栓栓塞、心房颤动、心瓣膜紊乱、瓣膜性心脏病、中风、CAD的病人以及有机械阀的病人。双重疗法的益处有关对血小板和凝结因子活性兼有抑制的可能的累加效应。双重疗法的风险是增加出血的可能性(Dowd，M.Plenary Sessions/Thrombosis Research 123(2008))。
相比于抗凝血或抗血小板单独治疗，以前的抗血小板和抗凝血疗法联用已经表现出出血风险的增加。这样的联用包括Fxa抑制剂(例如阿匹西班和利伐沙班)与ADP受体/P2Y12抑制剂(噻吩并吡啶类，比如氯吡格雷也被称为PLAVIX)以及NSAIDs(例如阿司匹林和萘普生)(Kubitza，D.et al.，Br.J.Clin.Pharmacol.63：4(2006)；Wong，P.C.etal.Journal of Thrombosis and Haemostasis 6(2008)；新药申请的FDA咨询委员会简报文件22-406(2009))。例如，Wong报道增加特定剂量的阿哌沙班至阿司匹林和至阿司匹林与氯吡格雷中，相比于单用阿司匹林和阿司匹林与氯吡格雷会显著增加出血时间。Kubitza报道利伐沙班和萘普生联合给药相比于单用萘普生会显著增加出血时间。
本发明还包括以下实施例：
实施例1.一种化合物，包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸，并且所述修饰寡核苷酸包含包括SEQ ID NO：223的至少12个连续核苷碱基的核苷碱基序列。
实施例2.如实施例1所述的化合物，由单链修饰寡核苷酸构成。
实施例3.如实施例2所述的化合物，其中，所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：1的核苷碱基序列100％互补。
实施例4.如实施例2所述的化合物，其中，至少一个核苷内连接是修饰的核苷内连接。
实施例5.如实施例4所述的化合物，其中，每一个核苷内连接是磷硫酰核苷内连接。
实施例6.如实施例1所述的化合物，其中，至少一个核苷包含修饰糖。
实施例7.如实施例6所述的化合物，其中，至少一个修饰糖是双环糖。
实施例8.如实施例7所述的化合物，其中，所述至少一个双环糖的每一个包含4’-(CH2)n-O-2’桥联，其中n为1或2。
实施例9.如实施例7所述的化合物，其中，所述至少一个双环糖的每一个包含4’-CH(CH3)-O-2’桥联。
实施例10.如实施例6所述的化合物，其中，至少一个修饰糖包含2’-O-甲氧乙基基团。
实施例11.如实施例1所述的化合物，包含至少一个四氢吡喃修饰的核苷，其中，四氢吡喃环取代了呋喃环。
实施例12.如实施例11所述的化合物，其中，所述至少一个四氢吡喃修饰的核苷中的每一个包含如下结构：
其中，Bx是可选择地被保护的杂环碱基。
实施例13.如实施例2所述的化合物，其中，至少一个核苷包含修饰核苷碱基。
实施例14.如实施例13所述的化合物，其中，所述修饰核苷碱基是5-甲基胞嘧啶。
实施例15.如实施例1所述的化合物，其中，所述修饰寡核苷酸包含：
由连接的脱氧核苷组成的间隙区段；
由连接的核苷组成的5’侧翼区段；
由连接的核苷组成的3’侧翼区段；
其中，所述间隙区段直接相邻于且位于5’侧翼区段和3’侧翼区段之间，其中，每一侧翼区段的每个核苷包含修饰糖。
实施例16.如实施例15所述的化合物，其中，所述修饰寡核苷酸包含：
由10个连接的脱氧核苷组成的间隙区段；
由5个连接的核苷组成的5’侧翼区段；
由5个连接的核苷组成的3’侧翼区段；
其中，所述间隙区段直接相邻于且位于5’侧翼区段和3’侧翼区段之间，其中，每一侧翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧乙基糖；其中，每一个核苷内连接是磷硫酰连接。
实施例17.如实施例16所述的化合物，其中，每一个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
实施例18.如实施例2或17所述的化合物，其中，所述修饰寡核苷酸由20个连接的核苷所组成。
实施例19.一种如实施例1至18中的任一项的用于治疗血栓栓塞性并发症的化合物。
实施例20.如实施例19所述的化合物，其中，所述动物是人。
实施例21.如实施例20所述的化合物，用于预防深静脉血栓形成。
实施例22.如实施例20所述的化合物，用于预防肺栓塞。
实施例23.如实施例19所述的中化合物，用于与选自阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、肝素、来匹卢定、噻氯匹啶、华法林、阿哌沙班、利伐沙班、依诺肝素钠和因子Xa抑制剂的任意组共同给药。
实施例24.如实施例19所述的化合物，用于与选自阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、肝素、来匹卢定、噻氯匹啶、华法林、阿哌沙班、利伐沙班、依诺肝素钠和因子Xa抑制剂的任意组随附给药。
实施例25.如实施例23所述的化合物，用于非消化道给药。
实施例26.如实施例24所述的化合物，用于非消化道给药。
实施例27.如实施例25所述的化合物，用于皮下或静脉给药。
实施例28.如实施例26所述的化合物，用于皮下或静脉给药。
实施例29.一种化合物，包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸，其中，所述修饰寡核苷酸与因子11核酸互补，用于治疗凝血紊乱。
实施例30.如实施例1至18中任一项所述的化合物与选自阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、肝素、来匹卢定、噻氯匹啶、华法林、阿哌沙班、利伐沙班和依诺肝素钠的任意组，在用于治疗血栓栓塞性并发症的药剂生产中的用途。
实施例31.一种组合物，包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸，并且该修饰寡核苷酸包含包括SEQ ID NO：223的至少12个连续核苷碱基的核苷碱基序列，或其盐以及药用可接受的载体或稀释剂。
实施例32.如实施例31所述的组合物，由单链寡核苷酸组成。
实施例33.如实施例32所述的组合物，其中，所述修饰寡核苷酸由20个连接的核苷所组成。
实施例34.一种方法，包括鉴定具有血栓栓塞性并发症风险的动物；以及
将治疗有效量的包含由12至30个连接的核苷所组成的修饰寡核苷酸的化合物给药于所述有风险的动物，其中，所述修饰的寡核苷酸与因子11核酸互补。
实施例35.如实施例34所述的方法，其中，血栓栓塞性并发症是深静脉血栓形成、肺栓塞或其组合。
实施例36.一种方法，包括鉴定患有凝血紊乱的动物；以及
将治疗有效量的包含由12至30个连接的核苷所组成的修饰寡核苷酸的化合物给药于该动物，其中，所述修饰的寡核苷酸与因子11核酸互补。
实施例37.如实施例36所述的方法，包括将化合物与选自阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、肝素、来匹卢定、噻氯匹啶、华法林、阿哌沙班、利伐沙班、依诺肝素钠和因子Xa抑制剂的任意组共同给药。
实施例38.一种方法，包括降低动物中血栓栓塞性并发症的风险；以及
将治疗有效量的包含由12至30个连接的核苷所组成的修饰寡核苷酸的化合物给药于该动物，其中，所述修饰的寡核苷酸与因子11核酸互补。
实施例39.一种方法，包括治疗治疗动物中凝血紊乱；以及
将治疗有效量的包含由12至30个连接的核苷所组成的修饰寡核苷酸的化合物给药于该动物，其中，所述修饰的寡核苷酸与因子11核酸互补。
实施例40.如实施例39所述的方法，包括通过将修饰寡核苷酸的解毒剂给药以逆转所述动物体内因子11的抑制。
实施例41.如实施例39所述的方法，其中，所述解毒剂是与所述修饰寡核苷酸互补的寡核苷酸。
实施例42.如实施例40所述的方法，包括通过给药选自因子7、因子7a、因子11或因子11a蛋白的任意组，以逆转所述动物体内因子11的抑制。
实施例43.一种方法，包括鉴定具有血栓栓塞性并发症风险的动物；以及
向所述有风险的动物给药治疗有效量的因子11特异性抑制剂与抗血小板治疗药物。
实施例44.一种方法，包括鉴定患有凝血紊乱的动物；以及
向所述动物给药治疗有效量的因子11特异性抑制剂与抗血小板治疗药物。
实施例45.一种方法，包括降低动物体内血栓栓塞性并发症的风险；以及
向所述动物给药治疗有效量的因子11特异性抑制剂与抗血小板治疗药物。
实施例46.一种方法，包括治疗动物体内凝血紊乱；以及
向所述动物给药治疗有效量的因子11特异性抑制剂与抗血小板治疗药物。
实施例47.如实施例43至46中任一项所述的方法，其中，所述抗血小板治疗药物选自ADP受体抑制剂、NSAID、磷酸二酯酶抑制剂、糖蛋白IIB/IIIA抑制剂或腺苷重摄取抑制剂或其组合。
实施例48.如实施例47所述的方法，其中，NSAID是阿司匹林、萘普生或二者的组合。
实施例49.如实施例47所述的化合物，其中，ADP受体/P2Y12抑制剂是噻吩吡啶。
实施例50.一种化合物，包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸，并且该修饰寡核苷酸包含包括与SEQ ID NO：1的核苷碱基738至762的等长部分互补的至少8个连续核苷碱基部分的核苷碱基序列；其中，所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：1至少90％互补。
实施例51.一种化合物，包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸，并且该修饰寡核苷酸包含包括与SEQ ID NO：1的核苷碱基656至704的等长部分互补的至少8个连续核苷碱基部分的核苷碱基序列；其中，所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：1至少90％互补。
实施例52.一种化合物，包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸，并且该修饰寡核苷酸包含包括与SEQ ID NO：1的核苷碱基1018至1042的等长部分互补的至少8个连续核苷碱基部分的核苷碱基序列；其中，所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ IDNO：1至少90％互补。
实施例53.一种化合物，包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸，并且该修饰寡核苷酸包含包括与SEQ ID NO：1的核苷碱基1062至1091的等长部分互补的至少8个连续核苷碱基部分的核苷碱基序列；其中，所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ IDNO：1至少90％互补。
实施例54.一种化合物，包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸，并且该修饰寡核苷酸包含包括与SEQ ID NO：1的核苷碱基1275至1318的等长部分互补的至少8个连续核苷碱基部分的核苷碱基序列；其中，所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ IDNO：1至少90％互补。
例子
非限制性披露及通过参考并入文献
尽管此处所述的一些化合物、组合物和方法已经依照某些实施例进行了具体描述，下面的例子仅仅用于说明此处所述的化合物，而非限制。本申请列举的每个参考文献都在此被参考并且其全文被并入本申请中。
例1：对HepG2细胞中人因子11的反义抑制
在体外测试靶向因子11核酸的反义寡核苷酸对因子11的mRNA的影响。用含75nM反义寡核苷酸的脂质体试剂转染密度为每孔10,000个细胞的培养的HepG2细胞。在处理约24小时后，从细胞中分离RNA，以定量实时PCR测定因子11的mRNA水平。根据RIBOGREEN测定的总的RNA量对因子11的mRNA水平进行校正。结果以相对于未处理的对照细胞的因子11的抑制百分比来表示。
表1和2中的嵌合型反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE gapmer。gapmer长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由10个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含5个核苷酸的侧翼。5’侧翼区段中的每个核苷酸和3’侧翼区段中的每个核苷酸有2’-MOE修饰。每条gapmer中的核苷内连接是磷硫酰(P＝S)连接。每条gapmer中的所有胞嘧啶核苷都是5-甲基胞嘧啶核苷。“目标起始位点”是指gapmer靶向的最5’端的核苷酸。“目标终止位点”是指gapmer靶向的最3’端的核苷酸。表1中所列的每条gapmer靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)，表2中所列的每条gapmer靶向SEQ ID NO：2(GENBANK登录号NT_022792.17，19598000至19624000缺失)。
表1
具有靶向SEQ ID NO：1的5-10-5MOE侧翼和脱氧间隙的嵌合型反义寡核苷酸对人因子11mRNA水平的抑制
表2
具有靶向SEQ ID NO：2的5-10-5MOE侧翼和脱氧间隙的嵌合型反义寡核苷酸对人因子11mRNA水平的抑制
例2：对HepG2细胞中人因子11的剂量依赖的反义抑制
在HepG2细胞中，在不同剂量下测试12条对人因子11表现出84％或更高的体外抑制的gapmer。细胞以每孔10,000个细胞铺板，按照表3，用含有9.375nM、18.75nM、37.5nM、75nM和150nM浓度的反义寡核苷酸的脂质体试剂转染。处理约16小时后，从细胞中分离RNA，以定量实时PCR测定因子11的mRNA水平。人因子11引物探针组RTS 2966(前向序列：CAGCCTGGAGCATCGTAACA，以SEQ ID NO：3并入本申请；反向序列：CAGCCTGGAGCATCGTAACA，以SEQ ID NO：4并入本申请；探针序列：CAGCCTGGAGCATCGTAACA，以SEQ ID NO：5并入本申请)被用于测定mRNA水平。根据RIBOGREEN测定的总的RNA量对因子11的mRNA水平进行校正。结果以相对于未处理的对照细胞的因子11的抑制百分比来表示。如表3所示，在经反义寡核苷酸处理的细胞中，因子11的mRNA水平以剂量依赖的方式降低了。
表3
对HepG2细胞中人因子11的剂量依赖的反义抑制
例3：微步(microwalk)设计的寡核苷酸对HepG2细胞中人因子11的反义抑制
根据表3所列的gapmer设计了其他gapmer。通过向表3的原始gapmer的上游和下游略微移动(即“微步”)产生gapmer而设计这些gapmer。Gapmer也用如5-10-5MOE、3-14-3MOE和2-13-5MOE等不同的结构域来产生。在体外测试了这些gapmer。用含有75nM反义寡核苷酸的脂质体试剂转染密度为每孔10,000个细胞的培养的HepG2细胞。处理约24小时后，从细胞中分离RNA，以定量实时PCR测定因子11的mRNA水平。根据RIBOGREEN测定的总的RNA量对因子11的mRNA水平进行校正。以相对于未处理的对照细胞的因子11的抑制百分比来表示结果。
然后将微步设计的gapmer的体外抑制数据与表3的gapmer的体外抑制数据进行比较，如表4、5、6、7和8所示。根据寡核苷酸映射的人mRNA(GENBANK登录号NM_000128.3)上的区域来显示寡核苷酸。
表4中的嵌合型反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE、3-14-3MOE和2-13-5MOEgapmer。在表4中首先列出的gapmer是用来通过微步设计剩下的gapmer的原始gapmer(见表3)，用星号指定。5-10-5gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由10个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含5个核苷酸的侧翼。3-14-3gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由14个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含3个核苷酸的侧翼。2-13-5gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由13个2’-脱氧核苷酸组成。中央间隙的5’末端有包含2个核苷酸的侧翼，3’末端有包含5个核苷酸的侧翼。对于每一个结构域(5-10-5、3-14-3和2-13-5)，5’侧翼区段中的每个核苷酸和3’侧翼区段中的每个核苷酸有2’-MOE修饰。每个gapmer中的核苷内连接是磷硫酰(P＝S)连接。每条gapmer中的所有胞嘧啶核苷残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。“目标起始位点”是指gapmer靶向的最5’端的核苷酸。“目标终止位点”是指gapmer靶向的最3’端的核苷酸。表4中所列的每条gapmer靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)。
如表4所示，所有靶向SEQ ID NO：1的从目标起始位点656开始，在目标终止位点704终止(也就是核苷碱基656-704)的目标区域的5-10-5MOE gapmer、3-14-3MOE gapmer和2-13-5MOE gapmer对因子11的mRNA都表现出至少20％的抑制。许多gapmer表现出至少60％的抑制。一些gapmer表现出至少80％的抑制，包括ISIS编号：416806、416809、416811、416814、416821、416825、416826、416827、416828、416868、416869、416878、416879、416881、416883、416890、416891、416892、416893、416894、416895、416896、416945、416946、416969、416970、416971、416972、416973、412203、413467、413468和413469。下列ISIS编号表现出至少90％的抑制：412203、413467、416825、416826、416827、416868、416878、416879、416892、416893、416895、416896、416945、416972和416973。下列ISIS编号表现出至少95％的抑制：416878、416892、416895和416896。
表4
靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)的第656位-第704位核苷碱基的嵌合型反义寡核苷酸对人因子11mRNA水平的抑制
表5中的嵌合型反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE、3-14-3MOE和2-13-5MOEgapmer。在表5中首先列出的gapmer是用来通过微步设计剩下的gapmer的原始gapmer(见表3)，用星号指定。5-10-5gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由10个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含5个核苷酸的侧翼。3-14-3gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由14个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含3个核苷酸的侧翼。2-13-5gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由13个2’-脱氧核苷酸组成。中央间隙的5’末端有包含2个核苷酸的侧翼，3’末端有包含5个核苷酸的侧翼。对于每一个结构域(5-10-5、3-14-3和2-13-5)，5’侧翼区段中的每个核苷酸和3’侧翼区段中的每个核苷酸有2’-MOE修饰。每个gapmer中的核苷内连接是磷硫酰(P＝S)连接。每条gapmer中的所有胞嘧啶核苷残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。“目标起始位点”是指gapmer靶向的最5’端的核苷酸。“目标终止位点”是指gapmer靶向的最3’端的核苷酸。表5中所列的每条gapmer靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)。
如表5所示，所有靶向SEQ ID NO：1的从目标起始位点738开始，在目标终止位点762终止(也就是核苷碱基738-762)的目标区域的5-10-5MOE gapmer、3-14-3MOE gapmer和2-13-5MOE gapmer对因子11的mRNA都表现出至少45％的抑制。大部分gapmer表现出至少60％的抑制。一些gapmer表现出至少80％的抑制，包括ISIS编号：412206、416830、416831、416898、416899、416900、416903、416975、416976、416977和416980。下列ISIS编号表现出至少90％的抑制：412206、416831和416900。
表5
靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)的第738位-第762位核苷碱基的嵌合型反义寡核苷酸对人因子11mRNA水平的抑制
表6中的嵌合型反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE、3-14-3MOE和2-13-5MOEgapmer。在表6中首先列出的gapmer是用来通过微步设计其余gapmer的原始gapmer(见表3)，用星号指定。5-10-5gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由10个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含5个核苷酸的侧翼。3-14-3gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由14个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含3个核苷酸的侧翼。2-13-5gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由13个2’-脱氧核苷酸组成。中央间隙的5’末端有包含2个核苷酸的侧翼，3’末端有包含5个核苷酸的侧翼。对于每一个结构域(5-10-5、3-14-3和2-13-5)，5’侧翼区段中的每个核苷酸和3’侧翼区段中的每个核苷酸有2’-MOE修饰。每个gapmer中的核苷内连接是磷硫酰(P＝S)连接。每条gapmer中的所有胞嘧啶核苷残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。“目标起始位点”是指gapmer靶向的最5’端的核苷酸。“目标终止位点”是指gapmer靶向的最3’端的核苷酸。表6中所列的每条gapmer靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)。
如表6所示，所有靶向SEQ ID NO：1的从目标起始位点1018开始、在目标终止位点1042终止(也就是核苷碱基1018-1042)的目标区域的5-10-5MOE gapmer、3-14-3MOEgapmer和2-13-5MOE gapmer对因子11的mRNA都表现出至少20％的抑制。下列ISIS编号表现出至少90％的抑制：413474、416837、416838、416904、416907和416908。
表6
靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)的第1018位-第1042位核苷碱基的嵌合型反义寡核苷酸对人因子11mRNA水平的抑制
表7中的嵌合型反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE、3-14-3MOE和2-13-5MOEgapmer。在表7中首先列出的gapmer是用来通过微步设计其余gapmer的原始gapmer(见表3)，用星号指定。5-10-5gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由10个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含5个核苷酸的侧翼。3-14-3gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由14个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含3个核苷酸的侧翼。2-13-5gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由13个2’-脱氧核苷酸组成。中央间隙的5’末端有包含2个核苷酸的侧翼，3’末端有包含5个核苷酸的侧翼。对于每一个结构域(5-10-5、3-14-3和2-13-5)，5’侧翼区段中的每个核苷酸和3’侧翼区段中的每个核苷酸有2’-MOE修饰。每个gapmer中的核苷内连接是磷硫酰(P＝S)连接。每条gapmer中的所有胞嘧啶核苷残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。“目标起始位点”是指gapmer靶向的最5’端的核苷酸。“目标终止位点”是指gapmer靶向的最3’端的核苷酸。表7中所列的每条gapmer靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)。
如表7所示，靶向SEQ ID NO：1的从目标起始位点1062开始，在目标终止位点1091终止(也就是核苷碱基1062-1091)的目标区域的所有5-10-5MOE gapmer、3-14-3MOEgapmer和2-13-5MOE gapmer对因子11的mRNA都表现出至少20％的抑制。许多gapmer表现出至少50％的抑制，包括：412215、413476、413476、416839、416840、416841、416842、416843、416844、416845、416846、416847、416909、416910、416911、416912、416913、416914、416915、416916、416917、416918、416986、416987、416988、416989、416990、416991、416992、416993、416994、416995。下列ISIS编号表现出至少80％的抑制：412215、413476、413476、416839、416840、416841、416842、416843、416844、416845、416910、416911、416912、416913、416914、416916、416917、416986、416987、416989、416991、416992、416993和416994。下列ISIS编号表现出至少90％的抑制：413476、413476、416842、416844、416910、416911、416912、416913、416916、416917和416993。
表7
靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)的第1062位-第1091位核苷碱基的嵌合型反义寡核苷酸对人因子11mRNA水平的抑制
表8中的嵌合型反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE、3-14-3MOE和2-13-5MOEgapmer。在表8中首先列出的gapmer是用来通过微步设计其余gapmer的原始gapmer(见表3)，用星号指定。5-10-5gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由10个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含5个核苷酸的侧翼。3-14-3gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由14个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含3个核苷酸的侧翼。2-13-5gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由13个2’-脱氧核苷酸组成。中央间隙的5’末端有包含2个核苷酸的侧翼，3’末端有包含5个核苷酸的侧翼。对于每一个结构域(5-10-5、3-14-3和2-13-5)，5’侧翼区段中的每个核苷酸和3’侧翼区段中的每个核苷酸有2’-MOE修饰。每个gapmer中的核苷内连接是磷硫酰(P＝S)连接。每条gapmer中的所有胞嘧啶核苷残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。“目标起始位点”是指gapmer靶向的最5’端的核苷酸。“目标终止位点”是指gapmer靶向的最3’端的核苷酸。表8中所列的每条gapmer靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)。
如表8所示，靶向SEQ ID NO：1的从目标起始位点1275开始，在目标终止位点1318终止(也就是核苷碱基1275-1318)的目标区域的所有5-10-5MOE gapmer、3-14-3MOEgapmer和2-13-5MOE gapmer对因子11的mRNA都表现出至少70％的抑制。许多gapmer表现出至少80％的抑制，包括：412223、412224、412225、413482、416848、416849、416850、416851、416852、416853、416854、416855、416856、416857、416858、416859、416860、416861、416862、416863、416864、416865、416866、416867、416920、416921、416922、416923、416924、416925、416926、416927、416928、416929、416930、416931、416932、416933、416934、416935、416936、416937、416938、416939、416940、416941、416942、416943、416944、416997、416998、416999、417000、417001、417002、417003、417004、417006、417007、417008、417009、417010、417011、417013、417014、417015、417016、417017、417018、417019和417020。下列ISIS编号表现出至少90％的抑制：412224、416850、416853、416856、416857、416858、416861、416862、416864、416922、416923、416924、416925、416926、416928、416931、416932、416933、416934、416935、416937、416938、416940、416941、416943、416999、417002、416854和416859。
表8
靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)的第1275位-第1318位核苷碱基的嵌合型反义寡核苷酸对人因子11mRNA水平的抑制
例4：对HepG2细胞中人因子11的剂量依赖的反义抑制
在HepG2细胞中，在不同剂量下测试了例3中(见表4、5、6、7和8)对人因子11表现出体外抑制的gapmer。细胞以每孔10,000个细胞铺板，如表9所列，用含9.375nM、18.75nM、37.5nM和75nM浓度的反义寡核苷酸的脂质体试剂转染。处理约16小时后，从细胞中分离RNA，以定量实时PCR测定因子11的mRNA水平。人因子11的引物探针组RTS 2966用于测定mRNA水平。根据RIBOGREEN测定的总的RNA量对因子11的mRNA水平进行校正。以相对于未处理的对照细胞的因子11的抑制百分比来表示结果。如表9所示，在经反义寡核苷酸处理的细胞中，因子11的mRNA水平以剂量依赖的方式降低了。
表9
通过用脂质体转染寡核苷酸对HepG2细胞中人因子11的剂量依赖的反义抑制
也通过电穿孔转染gapmer，并测定了它们对人因子11mRNA的剂量依赖的抑制。细胞以每孔20,000个细胞铺板，并如表10所列，用浓度为0.7nM、2.2nM、6.7nM和20nM的反义寡核苷酸以电穿孔转染。处理约16小时后，从细胞中分离RNA，以定量实时PCR测定因子11的mRNA水平。人因子11的引物探针组RTS 2966用于测定mRNA水平。根据RIBOGREEN测定的总的RNA量对因子11的mRNA水平进行校正。以相对于未处理的对照细胞的因子11的抑制百分比来表示结果。如表10所示，在经反义寡核苷酸处理的细胞中，因子11的mRNA水平以剂量依赖的方式降低了。
表10
通过用电穿孔转染寡核苷酸对HepG2细胞中人因子11的剂量依赖的反义抑制
例5：对HepG2细胞中人因子11的有效的剂量依赖的反义抑制的选择和确认
挑选了例4中表现出对人因子11的明显的剂量依赖抑制的gapmer，在HepG2细胞中在不同剂量下对其进行测试。细胞以每孔10,000个细胞铺板，如表11所列，用含有浓度为2.34nM、4.69nM、9.375nM、18.75nM、37.5nM和75nM的反义寡核苷酸的脂质体试剂转染。处理约16小时后，从细胞中分离RNA，以定量实时PCR测定因子11的mRNA水平。人因子11的引物探针组RTS 2966用于测定mRNA水平。根据RIBOGREEN测定的总的RNA量，对因子11的mRNA水平进行校正。以相对于未处理的对照细胞的人因子11的抑制百分比来表示结果。如表11所示，与对照相比，在经反义寡核苷酸处理的细胞中因子11的mRNA水平以剂量依赖的方式降低了。
表11
通过用脂质体转染寡核苷酸对HepG2细胞中人因子11的剂量依赖的反义抑制
还通过电穿孔转染gapmer，测定它们对人因子11的mRNA的剂量依赖的抑制。以每孔20,000个细胞的浓度铺板细胞，按照表12，以625nM、1250nM、2500nM、5,000nM、10,000nM和20,000nM浓度的反义寡核苷酸通过电穿孔转染细胞。处理约16小时后，从细胞中分离RNA，以定量实时PCR测定因子11的mRNA水平。人因子11的引物探针组RTS 2966用于测定mRNA水平。根据RIBOGREE测定的总的RNA量对因子11的mRNA水平进行校正。结果以相对于未处理的对照细胞的人因子11的抑制百分比来表示。如表12所示，与对照相比，经反义寡核苷酸处理的细胞中，因子11的mRNA水平以剂量依赖的方式降低了。
表12
通过用电穿孔转染寡核苷酸的HepG2细胞中人因子11的剂量依赖的反义抑制
例6：对冻存(cyano)的原代肝细胞中人因子11的有效的剂量依赖的反义抑制的选择和确认
在冻存原代肝细胞中，也在不同剂量下测试了例4中表现出对人因子11有明显的剂量依赖抑制的gapmer。细胞以每孔35,000个细胞铺板，按照表13，以0.74nM、2.2nM、6.7nM、20nM、60nM和180nM浓度的反义寡核苷酸通过电穿孔转染细胞。处理约16小时后，从细胞中分离RNA，以定量实时PCR测定因子11的mRNA水平。人因子11的引物探针组RTS 2966用于测定mRNA水平。根据RIBOGREEN测定的总的RNA量对因子11的mRNA水平进行校正。以相对于未处理的对照细胞的人因子11的抑制百分比来表示结果。如表13所示，与对照相比，经反义寡核苷酸处理的细胞中，因子11的mRNA水平以剂量依赖的方式降低了。
表13
对冻存原代肝细胞中人因子11的剂量依赖的反义抑制
例7：gapmer对HepB3细胞中人因子11的有效的剂量依赖的反义抑制的选择和确认
在人HepB3细胞中，在不同剂量下测试例4中表现出对人因子11有体外抑制的gapmer。细胞以每孔4,000个细胞铺板，按照表14，用具有以下浓度的反义寡核苷酸的脂质体试剂转染细胞：2.3nM、4.7nM、9.4nM、18.75nM、37.5nM和75nM。处理约16小时后，从细胞中分离RNA，以定量实时PCR测定因子11的mRNA水平。人因子11的引物探针组RTS 2966用于测定mRNA水平。根据RIBOGREEN测定的总的RNA量对因子11的mRNA水平进行校正。以相对于未处理的对照细胞的因子11的抑制百分比来表示结果。如表14所示，与对照相比，在反义寡核苷酸处理的细胞中因子11的mRNA水平以剂量依赖的方式降低了。
表14
HepB3细胞中人因子11的剂量依赖的反义抑制
也通过电穿孔转染gapmer，测定它们对人因子11的mRNA的剂量依赖的抑制。细胞以每孔20,000个细胞铺板，按照表15，以41.15nM、123.457nM、370.37nM、1111.11nM、3333.33nM和10,000nM浓度的反义寡核苷酸通过电穿孔转染细胞。处理约16小时后，从细胞中分离RNA，以定量实时PCR测定因子11的mRNA水平。人因子11的引物探针组RTS 2966用于测定mRNA水平。根据RIBOGREEN测定的总的RNA量对因子11的mRNA水平进行校正。以相对于未处理的对照细胞的人因子11的抑制百分比来表示结果。如表15所示，与对照相比，在经反义寡核苷酸处理的细胞中，因子11的mRNA水平以剂量依赖的方式降低了。
表15
HepB3细胞中人因子11的剂量依赖的反义抑制
例8：原代小鼠肝细胞中小鼠因子11的反义抑制
靶向小鼠因子11的嵌合型反义寡核苷酸被设计为靶向小鼠因子11的5-10-5MOEgapmer(GENBANK登录号NM_028066.1，以SEQ ID NO：6并入本申请)。gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由10个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含5个核苷酸的侧翼。每个侧翼区段中的每一核苷酸都有2’-MOE修饰。每条gapmer中的核苷内连接是磷硫酰(P＝S)连接。每条gapmer中的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。在原代小鼠肝细胞中，针对降低小鼠因子11mRNA的能力，对这些反义寡核苷酸进行了评估。
以6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM和200nM的反义寡核苷酸处理原代小鼠肝细胞约24小时。从细胞中分离RNA，以定量实时PCR测定小鼠因子11的mRNA水平。小鼠因子11的引物探针组RTS 2898(正向序列ACATGACAGGCGCGATCTCT，以SEQ ID NO：7并入本申请；反向序列TCTAGGTTCACGTACACATCTTTGC，以SEQ ID NO：8并入本申请；探针序列TTCCTTCAAGCAATGCCCTCAGCAATX，以SEQ ID NO：9并入本申请)用于测定mRNA水平。根据RIBOGREEN测定的总的RNA量对因子11的mRNA水平进行校正。一些小鼠反义寡核苷酸以剂量依赖的方式降低了因子11的mRNA水平。
例9：原代小鼠肝细胞中小鼠因子11的交叉反应性反义抑制
体外测试了靶向小鼠因子11核酸的反义寡核苷酸对因子11的mRNA的影响。以100nM反义寡核苷酸处理密度为每孔10,000个细胞的培养的原代小鼠肝细胞。处理约24小时后，从细胞中分离RNA，以定量实时PCR测定小鼠因子11的mRNA水平。根据RIBOGREEN测定的总的RNA量对因子11的mRNA水平进行校正。以相对于未处理的对照细胞的因子11的抑制百分比来表示结果。
表16中的嵌合型反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE gapmer。gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央的间隙区段由10个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含5个核苷酸的侧翼。5’侧翼区段中的每个核苷酸和3’侧翼区段中的每个核苷酸有2’-MOE修饰。每个gapmer中的核苷内连接是磷硫酰(P＝S)连接。每条gapmer中的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“小鼠目标起始位点”是指gapmer靶向的最5’端的核苷酸。“小鼠目标终止位点”是指gapmer靶向的最3’端的核苷酸。所有列出的小鼠寡核苷酸都显示在小鼠因子11mRNA(GENBANK登录号NM_028066.1)，以SEQ ID NO：6并入本申请，和人因子11mRNA(GENBANK登录号NM_000128.3)，以SEQ ID NO：1并入本申请，之间有交叉反应性。“人目标起始位点”是指反义寡核苷酸靶向的人mRNA(GENBANK登录号NM_000128.3)的最5’端的核苷酸。“人目标终止位点”是指反义寡核苷酸靶向的人mRNA(GENBANK登录号NM_000128.3)的最3’端的核苷酸。“错配数”是指在小鼠寡核苷酸和人mRNA序列间的错配。
表16
具有5-10-5MOE侧翼和脱氧间隙的靶向SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6的嵌合型反义寡核苷酸对小鼠因子11mRNA水平的抑制
例10：小鼠因子11的体内反义抑制
对显示明显的剂量依赖抑制的一些靶向小鼠因子11mRNA的反义寡核苷酸(GENBANK登录号NM_028066.1，以SEQ ID NO：6并入本申请)进行了体内评估。以ISIS404057(TCCTGGCATTCTCGAGCATT，目标起始位点487，以SEQ ID NO：10并入本申请)和ISIS404071(TGGTAATCCACTTTCAGAGG，目标起始位点869，以SEQ ID NO：11并入本申请)处理BALB/c小鼠。
治疗
向BALB/c小鼠注射5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg或50mg/kg的ISIS 404057或ISIS404071，一周两次，共3周。向对照组小鼠注射磷酸盐缓冲液，一周两次，共3周。在接受最后一次剂量后5天处死小鼠。收获完整肝脏进行RNA分析，收集血浆进行凝血分析(PT和aPTT)和蛋白分析。
RNA分析
从肝脏组织中抽提RNA用于因子11的实时PCR分析。如表17所示，与PBS对照相比，反义寡核苷酸对小鼠因子11实现了剂量依赖的降低。以相对于对照的因子11的抑制百分比来表示结果。
表17
BALB/c小鼠中小鼠因子11mRNA的剂量依赖的反义抑制
mg/kg ％抑制
404057 5 40
10 64
25 85
50 95
404071 5 72
10 82
25 93
50 96
PT和aPTT试验
用ISIS 404057和ISIS 404071处理过的小鼠的贫血小板血浆(PPP)测定凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)。表18提供的PT和aPTT值以国际标准化比值(INR)来显示。将每一实验组的PT或aPTT值(也就是5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg和50mg/kgISIS 404057或ISIS 404071处理的)除以PBS处理组的PT或aPTT，来确定PT或aPTT的INR值。将该比值以采用的组织因子的国际敏感度指数(ISI)进行加幂。如表18所示，在经ISIS404057或ISIS 404071处理的小鼠中，PT没有明显延长。然而，在经ISIS404057和ISIS404071处理的小鼠中，aPTT以剂量依赖方式延长。这些数据表明因子11的反义减少影响了接触激活通路，但没有影响血液凝结的外源性通路。
表18
ISIS 404071和404057对BALB/c小鼠中PT和aPTT的影响
蛋白分析
用基于凝血时间的F11分析测定经ISIS 404071处理的小鼠的血浆中的因子11酶原。用ST4半自动凝结装置(Diagnostica Stago，NJ)，以两轮相同的实验测定凝血时间。将30μl柠檬酸钠作为防凝结剂的样本血浆用含BSA的HEPES-NaCl缓冲液以1/20稀释，稀释液与30μl aPTT试剂(血小板因子3试剂和微粒活化剂)以及30μl缺乏因子11的有柠檬酸钠作为防凝结剂的血浆(人先天性的，George King生物医学公司)在37℃下孵育以启动凝血。结果插入梯度稀释的以柠檬酸钠作为防凝结剂的对照小鼠血浆的标准曲线上。
如表19所示，以ISIS 404071处理导致因子11蛋白质的明显地剂量依赖地减少。结果以相对于PBS对照的因子11的抑制百分比来表示。
表19
BALB/c小鼠中小鼠因子11蛋白的剂量依赖的抑制
例11：与华法林相比，在FeCl3诱导的静脉血栓形成(VT)模型中小鼠因子11的反义抑制的体内影响
处理
在FeCl3诱导的VT小鼠模型中评估了ISIS 404071和华法林(COUMADIN)。以1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg的ISIS 404071处理六组BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共3周。在接受最后一次剂量的ISIS 404071后2天，将150mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪混合后通过腹腔内注射使小鼠麻醉。以0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg和5mg/kg华法林处理另外6组BALB/c小鼠，腹腔内给药，每天一次，共6天。华法林的最后一次剂量后4小时，将150mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪混合后通过腹腔内注射使小鼠麻醉。以PBS处理两个对照组BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共3周。PBS的最后一次剂量2天后，将150mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪混合后通过腹腔内注射使小鼠麻醉。除第一对照组外的所有组的小鼠中，以FeCl3诱导血栓形成。
在经受FeCl3处理的小鼠中，把以10％FeCl3溶液预先饱和的滤纸(2x4mm)直接置于腔静脉上从而诱导血栓形成。暴露3分钟后，将滤纸拿走。应用滤纸后30分钟，切出固定长度的含有血栓的静脉用以血小板分析。收集肝脏用以RNA分析。
RNA分析
从肝脏组织中抽提RNA用以因子11的实时PCR分析。结果以相对于PBS对照的因子11的抑制百分比来表示。如表20所示，相比于PBS对照，ISIS 404071处理导致因子11的mRNA的明显的剂量依赖的减少。相反，相比于PBS对照，华法林处理没有导致因子11的明显减少。
表20
在FeCl3诱导的静脉血栓形成模型中因子11的mRNA剂量依赖的降低
血小板组分的定量
用血小板因子-4(PF-4)的实时PCR定量方法来定量腔静脉中的血小板，从而测定血栓形成。用与两个以PBS处理的对照组的PF-4相比的，经ISIS 404071或华法林处理的小鼠体内的PF-4的百分比来表示结果。如表21所示，相比于PBS对照，5mg/kg和更高剂量的ISIS 404071处理导致PF-4的剂量依赖的降低。相比于PBS对照，2mg/kg和更高剂量的华法林处理导致PF-4的降低。因此，由此处提供的化合物引起的因子11的降低可用于抑制血栓和凝结形成。
表21
在FeCl3诱导的静脉血栓形成模型中以PF-4的实时PCR定量分析血栓形成
例12：与华法林相比，在尾巴失血试验中小鼠因子11的反义抑制的体内影响
处理
测定尾巴失血以观察ISIS 404071或华法林处理是否导致小鼠内出血。在尾巴失血试验中评估了ISIS 404071和华法林(COUMADIN)。以1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg的ISIS 404071处理六组BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共3周。以0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg和5mg/kg华法林处理另外6组BALB/c小鼠，腹腔内给药，每天一次，共6天。以PBS处理一个单独对照组的BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共3周。
尾巴失血试验
ISIS 404071、华法林或PBS最后处理后两天，将小鼠置于尾巴失血室中。小鼠在异氟烷室中麻醉，用无菌剪刀割下小段尾巴(离尖端约4mm)。割下的尾巴立刻置于装有约10mL加热至37℃的0.9％NaCl缓冲溶液的15mL的Falcon管中。40分钟后收集血液。在放血前后将装有盐溶液的管进行称重。结果在表22中提供。
与PBS处理的小鼠相比，ISIS 404071处理没有影响出血。然而，与PBS对照相比，华法林确实增加了出血。华法林剂量的增加与失血增加正相关。这些数据表明此处提供的化合物导致出血的可能性低，尤其与华法林相比。由例11所提供的结果获得的这些数据表明用此处所述化合物抑制因子11对提供抗血栓形成活性有用，并且无失血风险。
表22
在FeCl3诱导的静脉血栓形成模型中的尾巴失血试验
例13：与华法林相比，小鼠因子11的反义抑制对PT和aPTT的体内影响
处理
用来自经ISIS 404071或华法林处理的小鼠的PPP测定PT和aPTT。以1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg的ISIS 404071处理六组BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共3周。以0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg和5mg/kg华法林处理另外6组BALB/c小鼠，腹腔内给药，每天一次，共6天。在对照组中，以PBS处理BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共3周。在最后剂量给药两天后，收集PPP，进行PT和aPTT试验。
PT和aPTT试验
表16提供的PT和aPTT值以国际标准化比值(INR)来表示。把每一实验组的PT或aPTT值(也就是以5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg和50mg/kg ISIS 404071处理)除以PBS处理的组的PT或aPTT，即测定了PT或aPTT的INR值。将该比值以采用的组织因子的国际敏感度指数(ISI)进行加幂。如表23所示，经华法林处理小鼠的PT在每个剂量都被明显延长。华法林处理小鼠的aPTT延长了，尤其在1mg/kg和更高剂量时。ISIS 404071没有明显影响PT，但延长了aPTT；但没有经华法林处理小鼠那么明显。这些结果表明ISIS 404071影响了接触激活通路，但没有影响血液凝结的外源性途径，然而，华法林对血液凝结的接触激活通路和外源性通路都有影响。
表23
BALB/c小鼠中ISIS 404071和华法林对PT和aPTT的影响
例14：与阿哌沙班相比，在FeCl3诱导的静脉血栓形成(VT)模型中小鼠因子11的反义抑制的体内影响
处理
在FeCl3诱导的VT小鼠模型中评估了ISIS 404071和阿哌沙班。以1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg的ISIS 404071处理六组BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共3周。在接受ISIS 404071的最后一次剂量后2天，将150mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪混合后通过腹腔内注射使小鼠麻醉。以0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg和5mg/kg阿哌沙班处理另外6组BALB/c小鼠，一次皮下给药。接受阿哌沙班后20分钟，将150mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪混合后通过腹腔内注射使小鼠麻醉。以PBS处理两个对照组BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共3周。PBS的最后一次剂量后2天，将150mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪混合后通过腹腔内注射使小鼠麻醉。除第一对照组外的所有小鼠以FeCl3诱导血栓形成。
在进行FeCl3处理的小鼠中，把以10％FeCl3溶液预先饱和的滤纸(2x 4mm)直接置于腔静脉上，从而诱导血栓形成。暴露3分钟后，将滤纸拿走。应用滤纸后30分钟，切出固定长度的含有血栓的静脉用以血小板分析。收集肝脏用以RNA分析。
RNA分析
从肝脏组织中抽提RNA用以因子11的实时PCR分析。结果以相对于PBS对照的因子11的抑制百分比来表示。如表24所示，相比于PBS对照，ISIS 404071处理导致因子11的mRNA的明显剂量依赖的降低。相反，相比于PBS对照，阿哌沙班处理没有导致因子11的明显降低。
表24
在FeCl3诱导的静脉血栓形成模型中因子11的mRNA剂量依赖的降低
血小板成分的定量
用血小板因子-4(PF-4)的实时PCR定量方法来定量腔静脉中的血小板，从而测定血栓形成。如表25所示，相比于PBS对照，ISIS 404071处理导致了PF-4的减少。相比于PBS对照，阿哌沙班处理也导致了PF-4的减少。用与两个以PBS处理的对照组相比的，经ISIS404071或阿哌沙班处理的小鼠的PF-4百分比来表示结果。
表25
在FeCl3诱导的静脉血栓形成模型中以PF-4的实时PCR定量方法分析血栓形成
例15：在尾巴失血试验中，小鼠因子11的反义抑制的体内效果与阿哌沙班的比较
处理
测定尾巴失血以观察ISIS 404071或华法林处理是否导致小鼠内出血。在尾巴失血模型中评估了ISIS 404071和阿哌沙班。以1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg的ISIS 404071处理六组BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共3周。以0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg和5mg/kg阿哌沙班处理另外6组BALB/c小鼠，一次单一皮下剂量给药。以PBS处理一个单独对照组的BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共3周。
尾巴失血试验
ISIS 404071、阿哌沙班或PBS最后处理后两天，将小鼠置于尾巴失血室中。小鼠在室中麻醉，用无菌剪刀割下小段尾巴(离尖端约4mm)。割下的尾巴立刻置于装有约10mL加热至37℃的0.9％NaCl缓冲溶液的15mLFalcon管中。40分钟后收集血液。在放血前后将装有盐溶液的管进行称重。
如表26所示，与PBS处理的小鼠相比，ISIS 404071处理没有影响出血。然而，与PBS对照相比，阿哌沙班确实增加了出血。阿哌沙班剂量的增加与失血增加正相关。这些数据表明此处提供的化合物导致出血的可能性低，尤其是与阿哌沙班相比。由例14中提供的结果获得的这些数据表明用此处所述化合物抑制因子11对抗血栓形成有用，并且无失血风险。
表26
BABL/c小鼠的尾巴失血试验
mg/kg 血液(g)
PBS 0 0.06
阿哌沙班 0.5 0.03
2 0.34
5 0.37
10 0.40
20 0.52
ISIS 404071 1.25 0.00
2.5 0.03
5 0.00
10 0.04
25 0.01
50 0.01
例16：与依诺肝素钠结合的小鼠因子11的反义抑制的间接体内效果
处理
以10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg ISIS 404071处理三组BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共3周。以PBS处理对照组小鼠，一周两次给药，共3周。最后剂量后五天，处死小鼠并收集血浆。以0g/ml、2.5g/ml、5.0g/ml和7.5g/ml不同剂量的低分子量(LMW)肝素，依诺肝素钠间接体内给药至血浆。依诺肝素钠给药后20分钟测定PT和aPTT。
PT和aPTT试验
如表27所示，依诺肝素钠处理以剂量依赖的方式提高了PT。ISIS 404071处理没有明显提高PT。PT没有被ISIS 404071处理明显影响。在ISIS 404071和依诺肝素钠处理血浆中，没有显示出对PT的组合影响。
表27
ISIS 404071和依诺肝素钠组合对小鼠血浆中PTINR的影响
如表28所示，依诺肝素钠处理以剂量依赖的方式提高了aPTT。ISIS 404071处理也以剂量依赖的方式提高了aPTT。而且，ISIS 404071和依诺肝素钠组合处理似乎对aPTT有协同效应。
表28
ISIS 404071和依诺肝素钠组合对小鼠血浆中PT INR的影响
n.d.＝没有数据
例17：在FeCl3诱导的静脉血栓形成(VT)模型中，小鼠因子11的反义抑制与依诺肝素钠联用的体内影响
处理
在FeCl3诱导的VT小鼠模型中评估了ISIS 404071和依诺肝素钠组合。以15mg/kg、30mg/kg、45mg/kg或60mg/kg依诺肝素钠处理四组BALB/c小鼠，皮下给药，一天一次，共3天。以20mg/kg ISIS 404071处理另外四组BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共3周。ISIS404071的最后剂量后，以15mg/kg、30mg/kg、45mg/kg或60mg/kg依诺肝素钠处理小鼠，皮下给药，一天一次，共3天。以PBS处理两个对照组BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共3周。除第一对照组外的所有小鼠以FeCl3诱导血栓形成。将150mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪混合后通过腹腔内注射使所有小鼠麻醉。
在经受FeCl3处理的小鼠中，把以10％FeCl3溶液预先饱和的滤纸(2x4mm)直接置于腔静脉上，从而诱导血栓形成。暴露3分钟后，将滤纸拿走。应用滤纸后30分钟，切出固定长度的含有血栓的静脉用以血小板分析。
血小板成分的定量
用PF-4的实时PCR定量来定量腔静脉中的血小板，作为衡量血栓形成的指标。如表29所示，相比于PBS对照，依诺肝素钠处理导致了PF-4的降低。相比于单独依诺肝素钠，依诺肝素钠与ISIS 404071组合处理导致PF-4更高的降低。
表29
在FeCl3诱导的静脉血栓形成模型中以PF-4的实时PCR定量分析血栓形成
例18：小鼠因子11的反义抑制与依诺肝素钠的组合对体内失血的影响
处理
测定尾巴失血以观察ISIS 404071和依诺肝素钠处理是否导致小鼠内出血。以20mg/kg剂量的ISIS 404071皮下给药于四组BALB/c小鼠，一周两次，共3周，在ISIS 404071处理的最后三天将15mg/kg、30mg/kg、45mg/kg和60mg/kg不同剂量的依诺肝素钠以每天一次皮下给药。在第五组中，将20mg/kg剂量的ISIS 404071皮下给药于BALB/c小鼠，一周两次，共3周。在第六组中，将PBS皮下给药于BALB/c小鼠，一周两次，共三周，作为对照。
尾巴失血试验
最后处理后两天，将小鼠置于尾巴失血室中。小鼠在异氟烷室中麻醉，用无菌剪刀割下小段尾巴(离尖端约4mm)。割下的尾巴立刻置于装有约10mL加热至37℃的0.9％NaCl缓冲溶液的15mL Falcon管中。40分钟后收集血液。在出血前后对充有盐溶液的管进行称重。
如表30所示，与PBS处理的小鼠相比，依诺肝素钠处理增加了小鼠出血。依诺肝素钠剂量的增加与失血增加正相关。ISIS 404071和依诺肝素钠组合处理所导致的失血增加没有明显地超过仅以依诺肝素钠处理的失血增加。
表30
比较诺肝素钠与依诺肝素钠和ISIS 404071联用的尾巴失血试验
例19：小鼠因子11的反义抑制与依诺肝素钠组合对PT和aPTT的体内影响
处理
用来自经ISIS 404071和依诺肝素钠组合处理的小鼠的PPP测定PT和aPTT。在第一群中，将25mg/kg剂量的ISIS 404071皮下给药于BALB/c小鼠，一周两次，共3周。在接受最后剂量的ISIS 404071后5天收集这些小鼠的血浆。在第二群中，将20mg/kg剂量的依诺肝素钠皮下给药于BALB/c小鼠，一天一次，共3天。在接受最后剂量的依诺肝素钠后4小时收集这些小鼠的血浆。第三群中，将20mg/kg剂量的ISIS 404071皮下给药于BALB/c小鼠，一周两次，共3周，在接受最后剂量的ISIS 404071后2天，将20mg/kg剂量的依诺肝素钠一天一次皮下给药。在最后剂量的依诺肝素钠后4小时收集这些小鼠的血浆。在第四组中，将PBS皮下给药，一周两次，共三周，作为对照。在最后剂量后5天收集这些小鼠的血浆。
PT和aPTT试验
表31提供的PT和aPTT值以国际标准化比值(INR)来显示。如表31所示，ISIS404071或依诺肝素钠处理或ISIS 404071联合依诺肝素钠处理，没有明显地影响PT。这些数据表明ISIS 404071联合依诺肝素钠对PT没有联合影响。也如表31所示，依诺肝素钠处理以及ISIS 404071联合依诺肝素钠处理提高了aPTT。这些数据表明ISIS 404071和依诺肝素钠联合处理对aPTT有累加作用。
表31
ISIS 404071和依诺肝素钠组合对小鼠血浆中PT和aPTT的影响
例20：小鼠因子11的反义抑制与阿哌沙班的组合对PT和aPTT的体内影响
处理
用来自经ISIS 404071和阿哌沙班联合处理的小鼠的PPP测定PT和aPTT。在第一群中，将25mg/kg剂量的ISIS 404071皮下给药于BALB/c小鼠，一周两次，共3周。在接受最后剂量的ISIS 404071后5天收集这些小鼠的血浆。在第二群中，将6mg/kg剂量的阿哌沙班皮下给药于BALB/c小鼠，一天一次，共3天。在接受最后剂量的阿哌沙班后20分钟收集这些小鼠的血浆。第三群中，将20mg/kg剂量的ISIS 404071皮下给药于BALB/c小鼠，一周两次，共3周，在ISIS 404071处理的最后三天，将6mg/kg剂量的阿哌沙班一天两次皮下给药。在接受最后剂量的阿哌沙班后20分钟收集这些小鼠的血浆。在第四组中，将PBS皮下给药，一周两次，共三周，作为对照。在最后剂量的PBS后5天收集血浆。
PT和aPTT试验
表32提供的PT和aPTT值以国际标准化比值(INR)来显示。如表32所示，ISIS404071处理没有明显影响PT。然而阿哌沙班以及阿哌沙班和ISIS 404071联用提高了PT。也如表32所示，阿哌沙班、ISIS 404071以及ISIS 404071和阿哌沙班的组合提高了aPTT。
表32
ISIS 404071和阿哌沙班联用对小鼠血浆中PT和aPTT的影响
例21：小鼠因子11的反义抑制与华法林的组合对PT和aPTT的体内影响
处理
用来自经ISIS 404071和华法林联合处理的小鼠的PPP测定PT和aPTT。以25mg/kg或者50mg/kg ISIS 404071处理两组BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共3周。在最后剂量后5天收集每组的血浆。在第三组中，将20mg/kg剂量的华法林处理BALB/c小鼠，一天一次，共5天。在最后剂量的华法林给药后6小时收集血浆。将25mg/kg或50mg/kg的ISIS 404071皮下给药于另外两组BALB/c小鼠，一周两次，共3周，在ISIS 404071处理的最后5天，将2mg/kg剂量的华法林一天一次皮下给药。在最后华法林处理后6小时收集每组的血浆。在最后一组BALB/c小鼠中，将PBS皮下给药，一周两次，共三周，作为对照。在最后PBS处理后5天收集血浆。
PT和aPTT试验
表33提供的PT和aPTT值以国际标准化比值(INR)来显示。如表33所示，在任一剂量下PBS或ISIS 404071处理都没有影响PT。然而，2mg/kg华法林、25mg/kg ISIS 404071与2mg/kg华法林联用以及50mg/kg ISIS 404071和2mg/kg华法林联用提高了PT。这些数据表明ISIS 404071和华法林联合处理对PT有累加作用。也如表33所示，ISIS 404071和华法林处理影响了aPTT。ISIS 404071和华法林联用比两种药物单独使用表现出更大的aPTT提高。这些数据表明ISIS 404071和华法林联合处理对aPTT有累加作用。
表33
ISIS 404071和华法林联用对小鼠血浆中PT和aPTT的影响
例22：小鼠因子11的反义抑制对小鼠肠系膜静脉血栓形成的体内抗血栓形成作用
处理
第一群中，将50mg/kg剂量的ISIS 404071皮下给药于C57BL/6小鼠，一周两次，共3周。第二组中，将50mg/kg剂量的对照寡核苷酸ISIS 405277(AAGGACCTACACTATGGAAT；因子2的反义寡核苷酸，以SEQ ID NO：12并入本申请)皮下给药于C57BL/6小鼠，一周两次，共3周。
血小板制备
用穿刺法从天然C57BL/6小鼠的后眼窝静脉丛收集血液，收集在含有300μl肝素(30U/ml)的聚丙烯管中。以1000rpm离心5分钟获取富血小板血浆(PRP)。将PRP转移至含有2μl前列腺素I2(PGI2)(2μg/ml)的新试管中，在37℃下孵育5分钟。以2600rpm离心后，沉淀块重悬于含2μl PGI2的1ml经改良的Tyrode’s-HEPES缓冲液(137mM NaCl，0.3mM Na2HPO4，2mMKCl，12mM NaHCO3，5mM HEPES，5mM glucose，0.35％BSA，pH 7.2)中，并在37℃下孵育5分钟。将悬浮的团粒以2600rpm离心5分钟。为了去除PGI2，洗涤步骤重复两次，血小板以2.5μg/mL钙黄绿素AM(Molecular Probes，Eugene，OR)在室温下荧光标记10分钟。
血栓形成的活体显微观察
将荧光标记的血小板静脉注射至经ISIS 404071处理和经对照寡核苷酸处理的C57BL/6小鼠中。以2.5％阿佛丁麻醉小鼠，以约150s-1的剪切速率切开腹腔壁以暴露250-300μm直径的肠系膜静脉。在实验过程中通过用温(37℃)PBS周期性灌流使暴露的肠系膜保持湿润。肠系膜以12V、100W DC稳定电源穿腔。静脉以连接至SVHS录像机(AG-6730；松下，东京，日本)的Zeiss(德国)Axiovert 135倒置显微镜(物镜32X)及CCD摄像机(滨松光学系统公司，滨松市，日本)进行成像。用光学多普勒测速仪(微循环研究所，德克萨斯A&M医学院，大学城，德克萨斯)测量中心线红细胞流速(Vrbc)。根据牛顿流体的泊肃叶定律，τ＝8(Vmean/Dv)，计算小静脉剪切速率(τ)，其中Dv是小静脉的直径，用经验公式Vmean＝Vrbc/1.6由测量获得的Vrbc估计出Vmean。
结果分析
在最后一次反义寡核苷酸注射两天后进行肠系膜静脉血栓形成。把在10％FeCl3溶液中吸收5分钟的Whatman纸置于肠系膜静脉上而诱导血栓形成。监测静脉40分钟或直至闭塞。观察了首次形成直径为30-50μm的血栓前所经过的时间以及血液停流30秒前所经过的时间。
在经ISIS 404071处理的小鼠中血栓形成(直径为30μm)发生在14.8±1.7分钟。在对照小鼠中血栓形成(直径为30μm)发生在8.9±0.6分钟。在对照小鼠中，在19.3±0.8分钟形成了闭塞的血栓并且所有损伤的静脉都闭塞了。相反，在经ISIS 404071处理的小鼠中，当损伤后40分钟停止观察时以及那些静脉显示闭塞时，大部分静脉没有闭塞。在经ISIS404071处理的小鼠中，显示闭塞的唯一静脉在29.5分钟时闭塞，5分钟后重新开放，发生在研究结束之前。
例23：用于BALB/c小鼠体内反义抑制小鼠因子11的同义寡核苷酸解毒剂
处理
在BALB/c小鼠中测试了ISIS 404071的特异性同义寡核苷酸作为解毒剂的作用。第一群中，将40mg/kg剂量的ISIS 404071皮下给药于BALB/c小鼠，一周两次，共3周。第二组中，将40mg/kg剂量的ISIS 404057皮下给药于BALB/c小鼠，一周两次，共3周。在ISIS404071或404057最后处理后48小时，将ISIS 404071特异性解毒剂ISIS 418026(CCTCTGAAAGTGGATTACCA；与ISIS 404071互补，以SEQ ID NO：13并入本申请)以90mg/kg的单一注射量皮下给药于两群小鼠。第三群中，将40mg/kg剂量的ISIS 404071皮下给药于BALB/c小鼠，一周两次，共3周。在ISIS 404071最后处理后，对小鼠皮下注射PBS。在第四群中，将40mg/kg剂量的ISIS 404057皮下给药于BALB/c小鼠，一周两次，共三周。在ISIS404057最后处理后，对小鼠皮下注射PBS。在解毒剂给药后12小时、1天、2天、3天、7天和14天时，将每群中一组4只小鼠处死。收集完整肝脏进行RNA分析，收集PPP用于aPTT分析。
RNA分析
从肝脏组织中抽提RNA用以因子11的实时PCR分析。结果以相对于PBS对照的因子11的抑制百分比来表示。如表34所示，在14天的观察周期，经ISIS 404071处理但未经解毒剂处理的小鼠表现出抑制的逐渐降低。然而，与未经解毒剂处理的小鼠相比，在14天的观察周期，经ISIS 404071和解毒剂处理的小鼠表现出抑制的加速降低。也如表34所示，在经ISIS 404057处理的小鼠中，ISIS 418026处理对于因子11的mRNA表达的抑制没有影响。
表34
与PBS对照相比，小鼠因子11mRNA的抑制百分比
n.d.＝没有数据
aPTT分析
如表35所示，在14天的观察周期中，相比于经ISIS 404071处理但未经解毒剂处理的小鼠，经ISIS 404071和解毒剂(ISIS 418026)处理的小鼠表现出aPTT的逐渐降低。
表35
解毒剂处理对aPTT INR的影响
例24：用于体内反义抑制BALB/c小鼠中小鼠因子11的因子7a蛋白解毒剂
处理
在BALB/c小鼠中测试了人因子7a(因子VIIa)蛋白作为ISIS 404071的解毒剂的作用。以20mg/kg ISIS 404071处理两个实验组的BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共3周。以PBS处理两个对照组BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共3周。除第一对照组外的所有小鼠以FeCl3诱导血栓形成。在FeCl3处理前15分钟，以5μg/kg人因子7a蛋白解毒剂(产品号407act，American Diagnostica Inc.)处理第一实验组。在最后一次剂量后2天，将150mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪混合后通过腹腔内注射麻醉所有小鼠。
在经受FeCl3处理的小鼠中，把以10％FeCl3溶液预先饱和的滤纸(2x4mm)直接置于腔静脉上，从而诱导血栓形成。暴露3分钟后，将滤纸拿走。应用滤纸后30分钟，切出固定长度的含有血栓的静脉用以血小板分析。
血小板组成的定量
用血小板因子-4(PF-4)的实时PCR定量来定量腔静脉中的血小板，作为血栓形成的指标。结果表示为经解毒剂处理和未处理小鼠相比于两组PBS处理的对照组的PF-4的百分比。如表36所示，相比于以ISIS 404071单独处理的动物，经人因子7a蛋白解毒剂处理的动物表达了更多的PF-4。这些数据显示人因子7a成功地回救了反义寡核苷酸的抑制作用。
表36
在FeCl3诱导的静脉血栓形成模型中，通过PF-4的实时PCR定量分析血栓形成
处理 PF-4
PBS-FeCl<sub>3</sub> 0
PBS+FeCl<sub>3</sub> 100
ISIS 404071 18
ISIS 404071+hFV7a 68
例25：在胶原酶诱导脑出血模型中小鼠因子11的体内反义抑制
处理
在胶原酶诱导脑出血模型中检测了ISIS 404071和华法林(COUMADIN)。第一群中，将40mg/kg剂量的ISIS 404071皮下给药于BALB/c小鼠，一周两次，共两周。第二组中，将2mg/kg剂量的华法林腹腔给药于小鼠，一周两次，共两周。在第三群中，将40mg/kg剂量的ISIS 421208(TCGGAAGCGACTCTTATATG，与小鼠因子118个错配，以SEQ ID NO：14并入本申请)皮下给药于BALB/c小鼠，一周两次，共两周。在第四群中，将PBS给药于BALB/c小鼠，一周两次，共两周。
最后剂量处理后两天，将所有群的所有小鼠用5μg/g阿佛丁麻醉。然后，用含0.075U胶原酶(150U/mL)的10μL的Hamilton注射器从前顶平颅骨的-1mm AP、1mm R ML和-4mm DV处注射小鼠。胶原酶在5分钟内注完，针头在该处多保持5分钟以防止逆流。然后分析小鼠的出血规模、神经功能评分以及死亡率。
表37提供了经胶原酶处理后在小鼠中检测到的出血体积。表38提供了小鼠的神经功能评分，表39提供了小鼠的死亡率。以标准评分体系测算神经缺陷，其中，无缺陷为0，严重缺陷为5。总体而言，数据表明对ISIS 404071对小鼠的出血规模、神经功能评分或死亡率没有明显影响。因此，与华法林处理的小鼠相比，ISIS 404071处理的小鼠脑内出血的风险(华法林处理个体的危险系数)显著降低。
表37
胶原酶处理后的出血体积
表38
胶原酶处理后的神经功能评分
分值
PBS 2.4
ISIS 421208 2.0
ISIS 404071 3.8
表39
胶原酶处理后的死亡率
例26：在FeCl3诱导的静脉血栓形成(VT)模型中小鼠因子11的反义抑制与波立维(PLAVIX)组合的体内作用
处理
在FeCl3诱导的VT小鼠模型中评估了ISIS 404071和波立维的联用。以6.25mg/kg、12.50mg/kg、25.00mg/kg或50.00mg/kg波立维处理四组8只每只重约25g的BALB/c小鼠。手术前两小时，小鼠在第一天给药两个剂量的波立维，第二天给药一个剂量的波立维。
以20mg/kg ISIS 404071处理另外四组8只每只重约25g的BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共三周。在ISIS 404071的最后剂量后，以6.25mg/kg、12.50mg/kg、25.00mg/kg或50.00mg/kg波立维处理小鼠。手术前两小时，小鼠在第一天给药两个剂量的波立维，第二天给药一个剂量的波立维。
两个对照组共8只，每只重约25g的BALB/c小鼠不用ISIS 404071或波立维处理。不用波立维处理而用20mg/kg ISIS 404071处理另外两个对照组共8只，每只重约25g的BALB/c小鼠，皮下给药，一周两次，共三周。除第一和第三对照组外的所有小鼠以FeCl3诱导血栓形成。将150mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪混合后通过腹腔内注射使所有小鼠麻醉。
在经受FeCl3处理的小鼠中，把以10％FeCl3溶液预先饱和的滤纸(2x4mm)直接置于下腔静脉上，从而诱导血栓形成。暴露3分钟后，将滤纸拿走。应用滤纸后30分钟，切出固定长度的含有血栓的静脉用以血小板分析。
血小板组成的定量
用PF-4的实时PCR定量来定量腔静脉中的血小板，作为血栓形成的指标。如表40所示，相比于PBS对照，波立维处理导致了PF-4的减少。相比于单独以波立维处理，波立维与ISIS 404071组合处理导致PF-4更高地降低。因此，抗血小板治疗和因子11ASO联用增强了抗血栓形成活性。结果表示为相对于PBS+FeCl3对照的PF-4mRNA百分比。
表40
在FeCl3诱导的静脉血栓形成模型中通过PF-4的实时PCR定量分析血栓形成
例27：小鼠因子11的反义抑制与波立维的组合在体内对失血的影响
处理
测定尾巴失血以观察ISIS 404071和波立维联用是否导致出血倾向的增加。将20mg/kg剂量的ISIS 404071皮下给药于五组8只BALB/c小鼠，一周两次，共3周。ISIS404071的最后剂量后，以0mg/kg、6.25mg/kg、12.50mg/kg、25.00mg/kg或50.00mg/kg波立维处理小鼠。放血前两小时，小鼠在第一天给药两个剂量的波立维，第二天给药一个剂量的波立维。
除了不注射ISIS 404071外，另外5组8只BALB/c小鼠同样处理。
尾巴失血试验
最后处理后两小时，将小鼠置于尾巴失血室中。小鼠在异氟烷室中麻醉，用无菌剪刀割下小段尾巴(离尖端约4mm)。割下的尾巴立刻置于装有约10mL加热至37℃的0.9％NaCl缓冲溶液的15mL Falcon管中。收集血液40分钟。在放血前后将装有盐溶液的管进行称重。
结合例26提供的结果，这些数据表明抗血小板治疗与因子11ASO联用增强了抗血栓形成活性，同时没有增加失血风险。
表41
比较波立维以及波立维和ISIS 404071联用的尾巴失血试验
例28：因子Xa小分子抑制剂与波立维联用对失血的体内影响
处理
测定尾巴失血以观察因子10a和波立维联合处理是否导致出血倾向的增加。以0mg/kg、6.25mg/kg、12.50mg/kg、25.00mg/kg或50.00mg/kg波立维处理五组每组8只BALB/c小鼠。放血前两小时，小鼠在第一天给药两个剂量的波立维，第二天给药一个剂量的波立维。
以0mg/kg、6.25mg/kg、12.50mg/kg、25.00mg/kg或50.00mg/kg波立维处理另外五组每组8只BALB/c小鼠。放血前两小时，小鼠在第一天给予两个剂量的波立维，第二天给予一个剂量的波立维。放血前20分钟，还用0.5mg/kg阿哌沙班，一种小分子因子10a抑制剂，一次腹腔给药于这些小鼠。
尾巴失血试验
最后处理后两小时，将小鼠置于尾巴失血室中。小鼠在异氟烷室中麻醉，用无菌剪刀割下小段尾巴(离尖端约4mm)。割下的尾巴立刻置于装有约10mL加热至37℃的0.9％NaCl缓冲溶液的15mL Falcon管中。收集血液40分钟。在放血前后将装有盐溶液的管进行称重。
如下面表42中所示，这些数据表明抗血小板治疗与如阿哌沙班等小分子因子10a抑制剂联用增加了出血风险。因此，相比于抗血小板治疗与小分子因子10a抑制剂联用的安全性，抗血小板治疗与因子11ASO联用提供了更好的安全性。
表42
比较波立维、阿哌沙班以及波立维和阿哌沙班联用的尾巴失血试验
例29：血液中体内小鼠因子11的反义介导的降低和相应抗凝作用的时间进程
处理
观察了BALB/c小鼠中小鼠因子11mRNA的反义介导的降低的时间进程。将一个50mg/kg剂量的ISIS 404071皮下给药于BALB/c小鼠。在ISIS 404071给药后12小时、1天、2天、3天、4天、7天、14天、28天和56天时，将小鼠处死。收集完整肝脏用于RNA分析，收集PPP用于aPTT分析。对照组小鼠用一个皮下给药剂量的PBS处理。
RNA分析
从肝脏组织中抽提RNA用于因子11的实时PCR分析。结果以相对于PBS对照来表示。以ISIS 404071处理的小鼠在第一天表现出明显的因子11mRNA的下调。小鼠在第14天重新获得因子11mRNA的表达。小鼠在第28天重新获得了因子11mRNA的完全表达，第56天的结果表明因子的mRNA维持在处理前的水平。因此，ISIS 404071处理的小鼠没有反弹效应。
反弹效应以前在抗体介导的因子11的降低中观察到过(血液，第一版论文，2008年10月22日在线提前出版；通过抑制因子XI预防血管移植物闭塞以及血栓相关的凝血发生)。因为因子11的过表达可以通过导致凝结增强而发生损害，这些数据表明反义介导的因子11抑制比抗体介导的因子11的抑制更安全，因为反义介导的因子11的抑制不会反弹。
aPTT分析
表43提供的aPTT值是以国际标准化比值(INR)来表示。把以ISIS 404071处理的小鼠的aPTT值除以用PBS处理组的小鼠的aPTT而确定aPTT的INR值。将该比值以采用的组织因子的国际敏感度指数(ISI)进行加幂。如表43所示，以ISIS 404071处理的小鼠到第4天为止表现出aPTT的逐渐减少，然后从第7天到第28天逐渐地增加至处理前的水平。
表43
ISIS 404071处理对aPTT INR的影响*
*表43中的数值是近似的
例30：微步设计的寡核苷酸对HepG2细胞中人因子11的反义抑制
根据ISIS 416850和ISIS 416858(见上面表8)设计了额外的gapmer。这些gapmer向ISIS 416850和ISIS 416858上游和下游略微移动(也就是“微步”)。微步gapmer是用5-8-5MOE或者6-8-6MOE结构域来设计的。
体外测试了这些微步gapmer。以将8,000nM反义寡核苷酸，用电穿孔转染密度为每孔20,000个细胞的培养的HepG2细胞。处理约24小时后，从细胞中分离RNA，以定量实时PCR测定因子11的mRNA水平。根据RIBOGREEN测定的总的RNA量对因子11的mRNA水平进行校正。结果表示为相对于未处理的对照细胞的因子11的抑制百分比。
ISIS 416850和ISIS 416858，以及从表1和8挑选的gapmer(也就是ISIS 412206、ISIS 412223、ISIS 412224、ISIS 412225、ISIS 413481、ISIS 413482、ISIS 416825、ISIS416848、ISIS 416849、ISIS 416850、ISIS 416851、ISIS 416852、ISIS 416853、ISIS416854、ISIS 416855、ISIS 416856、ISIS 416857、ISIS 416858、ISIS 416859、ISIS416860、ISIS 416861、ISIS 416862、ISIS 416863、ISIS 416864、ISIS 416865、ISIS416866和ISIS 416867)和微步gapmer一起在上述同样的条件下重新测试。
表44中的嵌合型反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE、5-8-5和6-8-6MOE gapmer。在表44中列出的前两条gapmer是用来通过微步设计ISIS 445493-445543的原始gapmer(ISIS416850和ISIS 416858)，用星号指定。5-10-5gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央间隙区段由10个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含5个核苷酸的侧翼。5-8-5gapmer的长度为18个核苷酸，其中，中央间隙区段由8个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含5个核苷酸的侧翼。6-8-6gapmer的长度为20个核苷酸，其中，中央间隙区段由8个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含6个核苷酸的侧翼。对于这些结构域(5-10-5、5-8-5和6-8-6)的每一个，5’侧翼区段中的每个核苷酸和3’侧翼区段中的每个核苷酸有2’-MOE修饰。每个gapmer中的核苷内连接是磷硫酰(P＝S)连接。每条gapmer中的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。“人目标起始位点”是指人序列中gapmer靶向的最5’端的核苷酸。“人目标终止位点”是指人序列中gapmer靶向的最3’端的核苷酸。表44中所列的每条gapmer靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)。表44中的每条gapmer也与此处标为SEQ ID NO：274的猕猴因子11基因序列可完全交叉反应(外显子1-15GENBANK登录号NW_001118167.1)。“猕猴起始位点”是指猕猴序列中gapmer靶向的最5’端的核苷酸。“猕猴终止位点”是指猕猴序列中gapmer靶向的最3’端的核苷酸。
如表44所示，所有微步设计的靶向SEQ ID NO：1的从目标起始位点1275开始，在目标终止位点1317终止(也就是核苷碱基1275-1317)的目标区域的gapmer对因子11的mRNA都表现出至少60％的抑制。同样，来自表1和8的所有重新测试的gapmer也表现出至少60％的抑制。
一些gapmer表现出至少70％的抑制，包括ISIS编号：ISIS 412206、412224、412225、413481、413482、416825、416848、416849、416850、416851、416852、416853、416854、416855、416856、416857、416858、416859、416860、416861、416862、416863、416864、416865、416866、416867、445494、445495、445496、445497、445498、445499、445500、445501、445502、445503、445504、445505、445506、445507、445508、445509、445510、445511、445512、445513、445514、445515、445516、445517、445518、445519、445520、445521、445522、445523、445524、445525、445526、445527、445528、445529、445530、445531、445532、445533、445534、445535、445536、445537、455538、445539、445540、445541、445542和445543。
一些gapmer表现出至少80％的抑制，包括ISIS编号：ISIS 412206、412224、412225、413481、413482、416825、416848、416849、416850、416851、416852、416853、416854、416855、416856、416857、416858、416859、416860、416861、416862、416863、416864、416865、416866、416867、445494、445495、445496、445497、445498、445500、445501、445502、445503、445504、445505、445506、445507、445508、445509、445510、445513、445514、445519、445520、445521、445522、445525、445526、445529、445530、445531、445532、445533、445534、445535、445536、455538、445541和445542。
一些gapmer表现出至少90％的抑制，包括ISIS编号：ISIS 412206、416825、416850、416857、416858、416861、445522和445531。
表44
靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)的嵌合型反义寡核苷酸对人因子11mRNA水平的抑制
例31：HepG2细胞中人因子11的剂量依赖的反义抑制
在HepG2细胞中，在不同剂量下测试了例30中表现出对人因子11有体外抑制的gapmer。细胞以每孔20,000个细胞铺板，以123.46nM、370.37nM、1,111.11nM和3,333.33nM浓度的反义寡核苷酸，用电穿孔转染，如表45所示。处理约16小时后，从细胞中分离RNA，以定量实时PCR测定因子11的mRNA水平。人因子11的引物探针组RTS 2966用于测定mRNA水平。根据RIBOGREEN测定的总的RNA量对因子11的mRNA水平进行校正。结果表示为相对于未处理的对照细胞的因子11的抑制百分比。如表45所示，在经反义寡核苷酸处理的细胞中，因子11的mRNA水平以剂量依赖的方式降低。
通过绘制所采用的反义寡核苷酸浓度和每个浓度所获得的因子11mRNA表达的抑制百分比的图，并且记录相对于PBS对照因子11mRNA表达的抑制为50％时的反义寡核苷酸的浓度，计算出每条寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。IC50值如表45中所示。
表45
HepG2细胞中以寡核苷酸通过用电穿孔转染对人因子11的剂量依赖的反义抑制
n.d.＝没有数据
例32：微步设计的寡核苷酸对HepG2细胞中人因子11的剂量依赖的反义抑制
根据ISIS 416850和ISIS 416858(见上面表8)设计了其他gapmer。这些gapmer向ISIS 416850和ISIS 416858上游和下游略微移动(也就是“微步”)。微步设计的gapmer具有3-8-3MOE、4-8-4MOE、2-10-2MOE、3-10-3MOE或4-10-4MOE结构域。
在HepG2细胞中，在不同剂量下测试了这些gapmer。细胞以每孔20,000个细胞铺板，以375nM、750nM、1,500nM、3,000nM、6,000nM和12,000nM浓度的反义寡核苷酸用电穿孔转染。处理约16小时后，从细胞中分离RNA，以定量实时PCR测定因子11的mRNA水平。人因子11的引物探针组RTS 2966用于测定mRNA水平。根据RIBOGREEN测定的总的RNA量对因子11的mRNA水平进行校正。结果表示为相对于未处理的对照细胞的因子11的抑制百分比。
ISIS 416850、ISIS 416858、ISIS 445522以及ISIS 445531(见上面表45)和微步gapmer一起在上述同样的条件下在体外重新测试。
表46中的嵌合型反义寡核苷酸被设计为3-8-3MOE、4-8-4MOE、2-10-2MOE、3-10-3MOE或4-10-4MOE gapmer。3-8-3gapmer的长度为14个核苷酸，其中，中央间隙区段由8个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含3个核苷酸的侧翼。4-8-4gapmer的长度为16个核苷酸，其中，中央间隙区段由8个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含4个核苷酸的侧翼。2-10-2gapmer的长度为14个核苷酸，其中，中央间隙区段由10个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含2个核苷酸的侧翼。3-10-3gapmer的长度为16个核苷酸，其中，中央间隙区段由10个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含3个核苷酸的侧翼。4-10-4gapmer的长度为18个核苷酸，其中，中央间隙区段由10个2’-脱氧核苷酸组成，两边(在5’和3’方向)为各包含4个核苷酸的侧翼。对于每一个结构域(3-8-3、4-8-4、2-10-2、3-10-3和4-10-4)，5’侧翼区段中的每个核苷酸和3’侧翼区段中的每个核苷酸有2’-MOE修饰。每个gapmer中的核苷内连接是磷硫酰(P＝S)连接。每条gapmer中的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。“人目标起始位点”是指人序列中gapmer靶向的最5’端的核苷酸。“人目标终止位点”是指人序列中gapmer靶向的最3’端的核苷酸。表46中所列的每条gapmer靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)。表46中的每条gapmer还可与此处标为SEQ ID NO：274的猕猴因子11基因序列完全交叉反应(外显子1-15GENBANK登录号NW_001118167.1)。“猕猴起始位点”是指猕猴序列中gapmer靶向的最5’端的核苷酸。“猕猴终止位点”是指猕猴序列中gapmer靶向的最3’端的核苷酸。
表46
靶向SEQ ID NO：1(GENBANK登录号NM_000128.3)且通过ISIS 416850和ISIS416858的微步设计的嵌合型反义寡核苷酸
剂量反应抑制数据在表47中给出。如表47所示，在以反义寡核苷酸处理的细胞中，因子11的mRNA水平以剂量依赖的方式降低了。每条反义寡核苷酸的IC50也被计算出并在表47中列出。在表47中列出的前两条gapmer是用来通过微步设计剩下的gapmer的原始gapmer(ISIS 416850和ISIS 416858)，用星号指定。
表47
HepG2细胞中通过用电穿孔转染寡核苷酸对人因子11的剂量依赖的反义抑制
n.d.＝没有数据
例33：靶向人因子11的反义寡核苷酸在CD1小鼠中的耐受性
以靶向人因子11的ISIS反义寡核苷酸处理CD1小鼠，并评估多种代谢指标水平的变化。
处理
按组向每组5只的CD1小鼠皮下注射50mg/kg的ISIS 416825、ISIS 416826、ISIS416838、ISIS 416850、ISIS 416858、ISIS 416864、ISIS 416892、ISIS 416925、ISIS416999、ISIS 417002或ISIS 417003，一周两次，2、4或6周。5只小鼠的一组对照组以PBS皮下注射2周。将所有实验组(也就是在ASO处理2、4、6周的小鼠)与对照组(也就是PBS，2周)相比较。
所有组最后剂量给药后三天处死小鼠。测量器官重量，收集血液用于进一步分析。
器官重量
在研究结束时测量肝脏、脾脏和肾脏的重量，以体重归一化，以PBS对照的百分比表示在表48、49和50中。挑选那些使肝脏和脾脏重量比PBS对照影响不超过六倍增加的反义寡核苷酸用于下一步分析。
表48
反义寡核苷酸处理后的CD1小鼠的肝脏重量的百分比变化
表49
反义寡核苷酸处理后的CD1小鼠的脾脏重量的百分比变化
表50
反义寡核苷酸处理后的CD1小鼠的肾脏重量的百分比变化
肝功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测量血浆转氨酶浓度。丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的测量用IU/L表示，结果在表51和52中提供。血浆胆红素和白蛋白水平也用同样的临床化学分析仪测试，用mg/dL表示。结果在表53和54中提供。挑选那些不影响ALT/AST水平相对于对照水平的七倍以上的提高的反义寡核苷酸用以下一步分析。挑选那些使胆红素水平增加不超过对照水平的两倍的反义寡核苷酸用于下一步分析。
表51
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对ALT(IU/L)的影响
n.d.＝没有数据
表52
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对AST(IU/L)的影响
2周： 4周： 6周：
PBS 68 n.d. n.d.
ISIS 416825 82 239 301
ISIS 416826 274 156 1411
ISIS 416838 106 73 107
ISIS 416850 72 88 97
ISIS 416858 236 108 178
ISIS 416864 58 46 101
ISIS 416925 144 206 712
ISIS 416999 113 130 671
ISIS 417002 96 87 1166
ISIS 416892 121 1347 1443
ISIS 417003 152 249 839
n.d.＝没有数据
表53
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对胆红素(mg/dL)的影响
n.d.＝没有数据
表54
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对白蛋白(mg/dL)的影响
2周： 4周： 6周：
PBS 3.7 n.d. n.d.
ISIS 416825 3.6 3.4 3.5
ISIS 416826 3.3 3.4 3.4
ISIS 416838 3.5 3.8 3.6
ISIS 416850 3.6 3.5 3.1
ISIS 416858 3.4 3.5 2.8
ISIS 416864 3.5 3.6 3.5
ISIS 416925 3.5 3.5 3.2
ISIS 416999 3.4 3.3 3.2
ISIS 417002 3.2 3.4 3.4
ISIS 416892 3.2 4.0 4.4
ISIS 417003 3.4 3.4 3.2
n.d.＝没有数据
肾功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测量血浆血液尿素氮(BUN)和肌酐浓度。结果以mg/dL表示，在表55和56中提供。挑选那些对BUN水平提高比PBS对照不超过两倍的反义寡核苷酸用以下一步分析。
表55
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对BUN(mg/dL)的影响
n.d.＝没有数据
表56
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对肌酐(mg/dL)的影响
2周： 4周： 6周：
PBS 0.14 n.d. n.d.
ISIS 416825 0.14 0.21 0.17
ISIS 416826 0.15 0.20 0.15
ISIS 416838 0.09 0.27 0.14
ISIS 416850 0.13 0.22 0.19
ISIS 416858 0.13 0.23 0.10
ISIS 416864 0.11 0.22 0.16
ISIS 416925 0.12 0.25 0.13
ISIS 416999 0.07 0.18 0.13
ISIS 417002 0.06 0.16 0.10
ISIS 416892 0.11 0.20 0.17
ISIS 417003 0.17 0.24 0.18
n.d.＝没有数据
血液学分析
从所有小鼠分组获得的血液被送去Antech Diagnostics进行血细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)的测定和分析，以及如WBC(中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)、RBC和血小板等各种血细胞以及总血红蛋白含量的测定。结果在表57-67中提供。表中给出的百分数表示占血细胞总数的百分比。挑选那些对血小板数降低不超过50％和/或单核细胞数提高不超过三倍的反义寡核苷酸用以进一步分析。
表57
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对HCT(％)的影响
n.d.＝没有数据
表58
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对MCV(fL)的影响
2周： 4周： 6周：
PBS 61 n.d. n.d.
ISIS 416825 58 53 51
ISIS 416826 56 52 53
ISIS 416838 56 54 48
ISIS 416850 57 51 50
ISIS 416858 59 51 50
ISIS 416864 57 52 51
ISIS 416925 61 52 47
ISIS 416999 60 49 48
ISIS 417002 61 50 52
ISIS 416892 59 49 53
ISIS 417003 60 48 45
n.d.＝没有数据
表59
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对MCH(pg)的影响
n.d.＝没有数据
表60
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对MCHC(％)的影响
2周： 4周： 6周：
PBS 30 n.d. n.d.
ISIS 416825 29 31 31
ISIS 416826 29 31 30
ISIS 416838 30 31 32
ISIS 416850 30 31 31
ISIS 416858 30 32 31
ISIS 416864 31 31 31
ISIS 416925 30 32 32
ISIS 416999 27 32 31
ISIS 417002 29 32 31
ISIS 416892 30 32 30
ISIS 417003 29 32 33
n.d.＝没有数据
表61
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对WBC数(细胞数/nL)的影响
2周： 4周： 6周：
PBS 6 n.d. n.d.
ISIS 416825 8 8 6
ISIS 416826 5 6 8
ISIS 416838 4 6 5
ISIS 416850 4 5 5
ISIS 416858 6 7 4
ISIS 416864 7 6 5
ISIS 416925 6 6 11
ISIS 416999 4 9 7
ISIS 417002 8 8 16
ISIS 416892 5 8 9
ISIS 417003 7 9 10
n.d.＝没有数据
表62
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对RBC数(细胞数/pL)的影响
2周： 4周： 6周：
PBS 8 n.d. n.d.
ISIS 416825 9 9 8
ISIS 416826 8 8 7
ISIS 416838 8 8 8
ISIS 416850 8 9 8
ISIS 416858 9 9 9
ISIS 416864 9 9 8
ISIS 416925 9 9 10
ISIS 416999 9 9 8
ISIS 417002 9 9 10
ISIS 416892 7 9 9
ISIS 417003 8 9 10
n.d.＝没有数据
表63
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对中性粒细胞数(％)的影响
2周： 4周： 6周：
PBS 16 n.d. n.d.
ISIS 416825 15 43 23
ISIS 416826 26 33 23
ISIS 416838 19 33 31
ISIS 416850 15 21 16
ISIS 416858 14 24 27
ISIS 416864 13 27 20
ISIS 416925 12 39 33
ISIS 416999 12 25 22
ISIS 417002 14 31 36
ISIS 416892 19 43 28
ISIS 417003 10 39 24
n.d.＝没有数据
表64
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对淋巴细胞数(％)的影响
n.d.＝没有数据
表65
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对单核细胞数(％)的影响
2周： 4周： 6周：
PBS 3 n.d. n.d.
ISIS 416825 2 5 4
ISIS 416826 3 5 8
ISIS 416838 2 2 6
ISIS 416850 3 6 6
ISIS 416858 2 3 7
ISIS 416864 2 2 5
ISIS 416925 2 4 8
ISIS 416999 2 4 8
ISIS 417002 3 4 12
ISIS 416892 3 6 7
ISIS 417003 2 6 8
n.d.＝没有数据
表66
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对血小板数(细胞数/nL)的影响
n.d.＝没有数据
表67
CD1小鼠中反义寡核苷酸处理对血红蛋白含量(g/dL)的影响
2周： 4周： 6周：
PBS 15.1 n.d. n.d.
ISIS 416825 14.5 14.1 12.1
ISIS 416826 13.4 12.8 11.0
ISIS 416838 12.4 13.6 12.6
ISIS 416850 13.1 13.5 11.6
ISIS 416858 14.8 14.2 14.1
ISIS 416864 15.2 13.9 13.0
ISIS 416925 14.9 14.8 15.3
ISIS 416999 14.2 13.3 12.8
ISIS 417002 14.7 14.0 15.7
ISIS 416892 13.0 13.5 13.1
ISIS 417003 13.7 13.4 14.0
n.d.＝没有数据
例34：CD1小鼠肝脏中反义寡核苷酸的半衰期的测定
以靶向人因子11的ISIS反义寡核苷酸处理CD1小鼠，并评估了寡核苷酸的半衰期以及寡核苷酸降解和从肝脏消除所花的时间。
处理
按组向每组15只CD1小鼠皮下注射50mg/kg的ISIS 416825、ISIS 416826、ISIS416838、ISIS 416850、ISIS 416858、ISIS 416864、ISIS 416892、ISIS 416925、ISIS416999、ISIS 417002或ISIS 417003，一周两次，共2周。在最后剂量后3天、28天和56天分别将每组中的5只小鼠处死。收取肝脏进行分析。
寡核苷酸浓度的测定
测定全长寡核苷酸浓度以及总的寡核苷酸浓度(包括降解形式)。采用的方法是以前发表方法(Leeds et al.，1996；Geary et al.，1999)的改良方法，其包括苯酚-氯仿(液体-液体)提取以及之后的固相提取。在提取前加入内标物(ISIS 355868，27单体的2’-O-甲氧乙基修饰的硫代磷酸寡核苷酸，GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT，此处标为SEQ ID NO：270)。以定量下限(LLOQ)约为1.14μg/g的校正曲线计算组织样本浓度。然后用WinNonlin软件(PHARSIGHT)计算半衰期。
结果以μg/g肝脏组织在表68和69中提供。每条寡核苷酸的半衰期在表70中提供。
表68
CD1小鼠肝脏中的全长寡核苷酸浓度(μg/g)
ISIS No. 结构域 第3天： 第28天： 第56天：
416825 5-10-5 151 52 7
416826 5-10-5 186 48 8
416838 5-10-5 170 46 10
416850 5-10-5 238 93 51
416858 5-10-5 199 102 18
416864 5-10-5 146 38 25
416999 2-13-5 175 26 0
417002 2-13-5 119 24 1
417003 2-13-5 245 42 4
416925 3-14-3 167 39 5
416892 3-14-3 135 31 6
表69
CD1小鼠肝脏中的总的寡核苷酸浓度(μg/g)
ISIS No. 结构域 第3天： 第28天： 第56天：
416825 5-10-5 187 90 39
416826 5-10-5 212 61 12
416838 5-10-5 216 98 56
416850 5-10-5 295 157 143
416858 5-10-5 273 185 56
416864 5-10-5 216 86 112
416999 2-13-5 232 51 0
417002 2-13-5 206 36 1
417003 2-13-5 353 74 4
416925 3-14-3 280 72 8
416892 3-14-3 195 54 6
表70
CD1小鼠肝脏中反义寡核苷酸的半衰期
例35：Sprague-Dawley大鼠中靶向人因子11的反义寡核苷酸的耐受性
以靶向人因子11的ISIS反义寡核苷酸处理Sprague-Dawley大鼠，并评估多种代谢指标水平的变化。
处理
按组向每组4只Sprague Dawley大鼠皮下注射50mg/kg的ISIS 416825、ISIS416826、ISIS 416838、ISIS 416850、ISIS 416858、ISIS 416848、ISIS 416864、ISIS416892、ISIS 416925、ISIS 416999、ISIS 417002或ISIS 417003，每周两次，共6周。向一个由4只Sprague Dawley大鼠组成的对照组皮下注射PBS，每周两次，共6周。在处理周期之前和期间测定体重。在处理开始之前采集尿液样本。最后剂量后三天，采集尿液样本并处死大鼠。测量器官重量，收集血液用以进一步分析。
体重和器官重量
在研究开始时以及随后每周两次测定大鼠体重。体重在表71中提供，表示为占研究开始时重量的百分比变化。在研究结束时测定肝脏、脾脏和肾脏的重量，以盐溶液对照的百分比在表71中提供，以体重归一化。挑选那些对肝脏和脾脏重量比PBS对照影响不超过六倍增加的反义寡核苷酸用于进一步研究。
表71
反义寡核苷酸处理后的Sprague Dawley大鼠的器官重量的百分比变化
肝功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测量血浆转氨酶浓度。丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的测量用IU/L表示，结果在表72中提供。挑选那些没有使ALT/AST水平提高超过对照水平七倍的反义寡核苷酸用以下一步分析。血浆胆红素和白蛋白水平也用同样的临床化学分析仪测定，结果用mg/dL在表72中提供。挑选那些没有使胆红素水平提高超过两倍对照水平的反义寡核苷酸用以进一步研究。
表72
反义寡核苷酸处理对Sprague-Dawley大鼠肝脏中代谢指标的影响
肾功能
为了评价肾功能的影响，用自动化临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400e，Melville，NY)测量血浆血液尿素氮(BUN)和肌酐浓度。结果以mg/dL在表73中提供。挑选那些相比于PBS对照，没有使BUN水平提高超过两倍的反义寡核苷酸用以下一步分析。在反义寡核苷酸处理之前和之后还计算总的尿液样本中尿蛋白与肌酐的比值，结果在表74中提供。挑选那些没有使尿蛋白/肌酐的比值相比于PBS对照提高超过五倍的反义寡核苷酸用于下一步研究。
表73
反义寡核苷酸处理对Sprague-Dawley大鼠肾脏中代谢指标的影响
BUN 肌酐
PBS 4 8
ISIS 416825 7 17
ISIS 416826 25 6
ISIS 416838 4 5
ISIS 416850 5 7
ISIS 416858 8 4
ISIS 416864 5 6
ISIS 416925 7 5
ISIS 416999 2 4
ISIS 417002 11 1
ISIS 416892 188 1
ISIS 417003 9 9
表74
反义寡核苷酸处理对Sprague-Dawley大鼠肝脏中尿蛋白/肌酐比值的影响
血液学分析
从所有大鼠分组获得的血液被送去Antech Diagnostics进行血细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)的测定和分析，以及如WBC(中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)、RBC和血小板等各种血细胞以及血红蛋白含量的测定。结果在表75和76中提供。挑选那些没有使血小板数降低超过50％和没有使单核细胞数提高超过三倍的反义寡核苷酸用于进一步研究。
表75
Sprague-Dawley大鼠中反义寡核苷酸处理对血细胞数的影响
表76
Sprague-Dawley大鼠中反义寡核苷酸处理对血液学因子(％对照)的影响
例36：Sprague-Dawley大鼠的肝脏和肾脏中反义寡核苷酸的半衰期的测定
以靶向人因子11的ISIS反义寡核苷酸处理Sprague Dawley大鼠，并评估了寡核苷酸的半衰期以及寡核苷酸降解和从肝脏和肾脏消除所花的时间。
处理
按组分别向每组4只Sprague Dawley大鼠皮下注射20mg/kg的ISIS416825、ISIS416826、ISIS 416838、ISIS 416850、ISIS 416858、ISIS 416864、ISIS 416892、ISIS416925、ISIS 416999、ISIS 417002或ISIS 417003，一周两次，共2周。在最后剂量后3天，处死大鼠，
收集肝脏和肾脏用于分析。
寡核苷酸浓度的测定
测定全长寡核苷酸浓度以及总的寡核苷酸浓度(包括降解形式)。方法采用以前发表方法(Leeds et al.，1996；Geary et al.，1999)的改良方法，其包括苯酚-氯仿(液体-液体)提取以及之后的固相提取。在提取前加入内标物(ISIS 355868，27单体的2’-O-甲氧乙基修饰的磷硫酰寡核苷酸，GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT，此处标为SEQ ID NO：270)。以约为1.14μg/g的定量下限(LLOQ)，用校正曲线计算组织样本浓度。结果以μg/g肝脏或肾脏组织在表77和78中提供。然后用WinNonlin软件(PHARSIGHT)计算半衰期。
表77
Sprague Dawley大鼠的肝脏和肾脏中的全长寡核苷酸浓度(μg/g)
表78
Sprague Dawley大鼠的肝脏和肾脏中的总的寡核苷酸浓度(μg/g)
表79
Sprague Dawley大鼠的肝脏和肾脏中的ISIS寡核苷酸的半衰期(天)
例37：靶向人因子11的反义寡核苷酸在CD1小鼠中的耐受性
以靶向人因子11的ISIS反义寡核苷酸处理CD1小鼠，评估各种代谢指标水平的变化。
处理
按组分别向每组5只CD1小鼠皮下注射50mg/kg的ISIS 412223、ISIS 412224、ISIS412225、ISIS 413481、ISIS 413482、ISIS 416848、ISIS 416849、ISIS 416850、ISIS416851、ISIS 416852、ISIS 416853、ISIS 416854、ISIS 416855、ISIS 416856、ISIS416857、ISIS 416858、ISIS 416859、ISIS 416860、ISIS 416861、ISIS 416862、ISIS416863、ISIS 416864、ISIS 416865、ISIS 416866或ISIS 416867，一周两次，共6周。向10只CD1小鼠的对照组皮下注射PBS，每周两次，共六周。在处理周期之前和期间测定体重。最后剂量后三天，处死小鼠，测定器官重量，并收集血液用于进一步分析。
体重和器官重量
在研究开始时以及随后每周两次测定体重。小鼠体重在表80中提供，表示为与研究开始前PBS对照重量的克数增加。在研究结束时测定肝脏、脾脏和肾脏的重量，以占体重的百分比在表80中提供。挑选那些没有使肝脏和脾脏重量提高超过PBS对照的六倍的反义寡核苷酸用于下一步分析。
表80
反义寡核苷酸处理后的CD1小鼠的身体和器官重量的变化
肝功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测量血浆转氨酶浓度。丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的测量用IU/L表示，结果在表81中提供。挑选那些没有使ALT/AST水平提高超过对照水平的七倍的反义寡核苷酸用以下一步分析。血浆胆红素、胆固醇和白蛋白水平也用同样的临床化学分析仪测定，用mg/dL表示在表81中提供。挑选那些没有使胆红素水平提高超过对照水平的两倍的反义寡核苷酸用以进一步研究。
表81
反义寡核苷酸处理对CD1小鼠肝脏中代谢指标的影响
肾功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测定血浆血液尿素氮(BUN)浓度，结果以mg/dL表示在表82中提供。挑选那些没有使BUN水平相比于PBS对照提高超过两倍的反义寡核苷酸用以下一步分析。
表82
反义寡核苷酸处理对CD1小鼠肾脏中BUN水平(mg/dL)的影响
血液学分析
从所有小鼠分组获得的血液被送去Antech Diagnostics进行血细胞比容(HCT)以及如WBC(中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)、RBC和血小板等各种血细胞的测定以及总血红蛋白含量的分析。结果在表83和84中提供。挑选那些没有使血小板数降低超过50％和没有使单核细胞数提高超过三倍的反义寡核苷酸用于进一步研究。
表83
反义寡核苷酸处理对CD1小鼠中血液因子的影响
表84
反义寡核苷酸处理对CD1小鼠中血细胞数的影响
例38：CD1小鼠肝脏中反义寡核苷酸的半衰期的测定
进一步评估了已经在CD1小鼠(例37)中被评估过的15条反义寡核苷酸。以ISIS反义寡核苷酸处理CD1小鼠，评估寡核苷酸的半衰期以及寡核苷酸降解和从肝脏中消除所花的时间。
处理
按组分别向每组15只CD1小鼠皮下注射50mg/kg的ISIS 412223、ISIS 412225、ISIS 413481、ISIS 413482、ISIS 416851、ISIS 416852、ISIS 416856、ISIS 416860、ISIS416861、ISIS 416863、ISIS 416866、ISIS 416867、ISIS 412224、ISIS 416848或ISIS416859，每周两次，共2周。分别在最后剂量后3天、28天和56天从每组选出5只小鼠处死，收集肝脏用于分析。
寡核苷酸浓度的测定
测定全长寡核苷酸的浓度。方法采用以前发表的方法(Leeds et al.，1996；Gearyet al.，1999)的改良方法，其包括苯酚-氯仿(液体-液体)提取和之后的固相提取。在提取前加入内标物(ISIS 355868，27单体的2’-O-甲氧乙基修饰的磷硫酰寡核苷酸，GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT，此处标为SEQ ID NO：270)。以约为1.14μg/g的定量下限(LLOQ)，用校正曲线计算组织样本浓度。结果以μg/g肝脏组织表示，在表85中提供。每条寡核苷酸的半衰期也在表85中提供。
表85
全长寡核苷酸CD1在小鼠肝脏中的浓度和半衰期
例39：靶向人因子11的反义寡核苷酸在Sprague-Dawley大鼠中的耐受性
针对各种代谢指标水平的变化，进一步在Sprague-Dawley大鼠中评估了已经在CD1小鼠(例37)中评估过的15条反义寡核苷酸。
处理
按组向每组4只Sprague Dawley大鼠皮下注射50mg/kg的ISIS 412223、ISIS412224、ISIS 412225、ISIS 413481、ISIS 413482、ISIS 416848、ISIS 416851、ISIS416852、ISIS 416856、ISIS 416859、ISIS 416860、ISIS 416861、ISIS 416863、ISIS416866或ISIS 416867，每周两次，共6周。向4只Sprague Dawley大鼠的对照组皮下注射PBS，每周两次，共6周。在处理周期之前和期间测定体重。最后剂量后三天，收集尿液样本，然后处死大鼠，测定器官重量，并收集血液用于进一步分析。
体重和器官重量
在研究开始时以及随后每周两次测定大鼠体重。体重在表86中提供，用与研究开始前PBS对照的体重相比增加的克数来表示。在研究结束时测定肝脏、脾脏和肾脏的重量，以占体重的百分比表示，并在表86中提供。挑选那些没有使肝脏和脾脏重量增加超过PBS对照的六倍的反义寡核苷酸用于下一步分析。
表86
反义寡核苷酸处理后的Sprague Dawley大鼠的体重和器官重量的变化
肝功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测量血浆转氨酶浓度。丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的测量用IU/L表示，结果在表87中提供。挑选那些没有使ALT/AST水平提高超过对照水平七倍以的反义寡核苷酸用以下一步分析。血浆胆红素和白蛋白的水平也用同样的临床化学分析仪测定，结果用mg/dL表示，在表87中提供。挑选那些没有使胆红素水平提高超过对照水平两倍的反义寡核苷酸用以进一步研究。
表87
反义寡核苷酸处理对Sprague-Dawley大鼠肝脏中代谢指标的影响
肾功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测量血浆血液尿素氮(BUN)和肌酐的浓度。结果以mg/dL表示，在表88中提供。挑选那些没有使BUN水平相比PBS对照提升超过两倍的反义寡核苷酸用以下一步分析。计算出在反义寡核苷酸处理之后总的尿液样本中总的尿蛋白和尿蛋白与肌酐的比值，在表88中提供。挑选那些没有使尿蛋白/肌酐的比值相比于PBS对照提升超过五倍的反义寡核苷酸用于进一步研究。
表88
反义寡核苷酸处理对Sprague-Dawley大鼠肾脏中代谢指标的影响
血液学分析
从所有大鼠组获得的血液被送去Antech Diagnostics进行血细胞比容(HCT)测定以及如WBC(中性粒细胞和淋巴细胞)、RBC和血小板等各种血细胞以及总血红蛋白含量的测定。结果在表89和90中提供。挑选那些没有使血小板数降低超过50％并且没有使单核细胞数提升超过三倍的反义寡核苷酸用以进一步研究。
表89
反义寡核苷酸处理对Sprague-Dawley大鼠中血液因子的影响
表90
Sprague-Dawley大鼠中反义寡核苷酸处理对血细胞数的影响
例40：反义寡核苷酸在Sprague-Dawley大鼠的肝脏和肾脏中的半衰期的测定
以靶向人因子11的ISIS反义寡核苷酸处理Sprague Dawley大鼠，评估了寡核苷酸的半衰期以及寡核苷酸降解和从肝脏和肾脏消除所花的时间。
处理
按组向每组4只Sprague Dawley大鼠皮下注射20mg/kg的ISIS 412223、ISIS412224、ISIS 412225、ISIS 413481、ISIS 413482、ISIS 416848、ISIS 416851、ISIS416852、ISIS 416856、ISIS 416859、ISIS 416860、ISIS 416861、ISIS 416863、ISIS416866或ISIS 416867，每周两次，共2周。最后剂量后三天，处死大鼠并收集肝脏和肾脏。
寡核苷酸浓度的测定
测定全长寡核苷酸浓度以及总的寡核苷酸浓度(包括降解形式)。方法采用以前发表方法(Leeds et al.，1996；Geary et al.，1999)的改良方法，其包括苯酚-氯仿(液体-液体)提取和后续的固相提取。在提取前加入内标物(ISIS 355868，27单体的2’-O-甲氧乙基修饰的磷硫酰寡核苷酸，GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT，此处被指定为SEQ ID NO：270)。以约为1.14μg/g的定量下限(LLOQ)，用校正曲线计算组织样本浓度。结果以μg/g肝脏或肾脏组织表示，在表91和92中提供。然后用WinNonlin软件(PHARSIGHT)计算半衰期。
表91
Sprague Dawley大鼠的肝脏和肾脏中的全长寡核苷酸浓度(μg/g)
ISIS No. 结构域 肾脏 肝脏
412223 5-10-5 551 97
412224 5-10-5 487 107
412225 5-10-5 202 119
413481 5-10-5 594 135
413482 5-10-5 241 95
416848 5-10-5 488 130
416851 5-10-5 264 193
416852 5-10-5 399 108
416856 5-10-5 378 84
416859 5-10-5 253 1 17
416860 5-10-5 247 94
416861 5-10-5 187 159
416863 5-10-5 239 82
416866 5-10-5 210 98
416867 5-10-5 201 112
表92
Sprague Dawley大鼠的肝脏和肾脏中的总的寡核苷酸浓度(μg/g)
表93
Sprague Dawley大鼠的肝脏和肾脏中的ISIS寡核苷酸的半衰期(天)
ISIS No. 结构域 半衰期
412223 5-10-5 22
412224 5-10-5 17
412225 5-10-5 21
413481 5-10-5 21
413482 5-10-5 20
416848 5-10-5 24
416851 5-10-5 24
416852 5-10-5 28
416856 5-10-5 19
416859 5-10-5 19
416860 5-10-5 21
416861 5-10-5 25
416863 5-10-5 20
416866 5-10-5 16
416867 5-10-5 19
例41：靶向人因子11的反义寡核苷酸在CD1小鼠中的耐受性
向CD1小鼠给药靶向人因子11且具有6-8-6MOE和5-8-5MOE结构域的ISIS反义寡核苷酸，评估多种代谢指标水平的变化。
处理
按组向每组5只CD1小鼠皮下注射50mg/kg的ISIS 416850、ISIS 445498、ISIS445503、ISIS 445504、ISIS 445505、ISIS 445509、ISIS 445513、ISIS 445522、ISIS445530、ISIS 445531或ISIS 445532，每周两次，共6周。向5只CD1小鼠的对照组皮下注射PBS，每周两次，共6周。在处理周期之前和结束时测定体重。最后剂量后三天，处死小鼠，测定器官重量，并收集血液用于进一步分析。
体重和器官重量
小鼠体重的变化在表94中提供，表示为相对于处理开始前PBS对照重量的克数增加。在研究结束时测定肝脏、脾脏和肾脏的重量，以占体重的百分比表示，在表94中提供。挑选那些没有使肝脏和脾脏重量提高超过PBS对照六倍的反义寡核苷酸用以下一步分析。
表94
反义寡核苷酸处理后的CD1小鼠的体重和器官重量的变化
肝功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测量血浆转氨酶浓度。丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的测量用IU/L表示，结果在表95中提供。挑选那些没有使ALT/AST水平提升超过对照水平七倍以上的反义寡核苷酸用以下一步分析。还测定了血浆胆红素和白蛋白水平，结果用mg/dL表示，在表95中提供。挑选那些没有使胆红素水平提高超过对照水平两倍的反义寡核苷酸用以进一步研究。
表95
反义寡核苷酸处理对CD1小鼠肝脏中代谢指标的影响
肾功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测定血浆血液尿素氮(BUN)浓度。结果以mg/dL表示，在表96中提供。挑选那些没有使BUN水平相比PBS对照提升超过两倍的反义寡核苷酸用以下一步分析。
表96
反义寡核苷酸处理对CD1小鼠肾脏中BUN水平(mg/dL)的影响
BUN
PBS 29
ISIS 416850 28
ISIS 445498 28
ISIS 445503 29
ISIS 445504 29
ISIS 445505 29
ISIS 445509 29
ISIS 445513 27
ISIS 445522 28
ISIS 445530 26
ISIS 445531 27
ISIS 445532 23
血液学分析
从所有小鼠分组获得的血液被送去Antech Diagnostics进行血细胞比容(HCT)测定以及如WBC(中性粒细胞和淋巴细胞)、RBC和血小板等各种血细胞以及总血红蛋白含量的测定。结果在表97和98中提供。挑选那些没有使血小板降低超过50％并且没有使单核细胞数提高超过三倍的反义寡核苷酸用以进一步研究。
表97
反义寡核苷酸处理对CD1小鼠中血液因子的影响
表98
反义寡核苷酸处理对CD1小鼠中血细胞数的影响
例42：靶向人因子11的反义寡核苷酸在Sprague-Dawley大鼠中的耐受性
就各种代谢指标水平的变化进一步在Sprague-Dawley大鼠中评估了已经在CD1小鼠(例41)中评估过的8条反义寡核苷酸。
处理
按组向每组4只Sprague Dawley大鼠皮下注射50mg/kg的ISIS 445498、ISIS445504、ISIS 445505、ISIS 445509、ISIS 445513、ISIS 445522、ISIS 445530或ISIS445531，每周两次，共6周。向Sprague Dawley大鼠的对照组皮下注射PBS，每周两次，共6周。在处理之前和期间测定体重。最后剂量后三天，收集尿液样本，然后处死大鼠，测定器官重量，并收集血液用于进一步分析。
体重和器官重量
在研究开始时以及随后每周两次测定大鼠体重。体重在表99中提供，表示为相对研究开始前PBS对照体重的增加百分比。在研究结束时测定肝脏、脾脏和肾脏的重量，以占体重的百分比表示，也在表99中提供。挑选那些没有使肝脏和脾脏重量提升超过PBS对照六倍以上的反义寡核苷酸用于下一步分析。
表99
反义寡核苷酸处理后的Sprague Dawley大鼠的体重和器官重量的变化(％)
体重 肝脏 脾脏 肾脏
ISIS 445498 -17 +26 +107 -10
ISIS 445504 -15 +22 +1 16 +6
ISIS 445505 -21 +12 +146 +2
ISIS 445509 -17 +16 +252 +3
ISIS 445513 -13 +25 +194 +15
ISIS 445522 -13 +26 +184 +19
ISIS 445530 -7 +24 +99 +4
ISIS 445531 -10 +17 +89 +4
肝功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测量血浆转氨酶浓度。测定血浆ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)浓度，结果用IU/L表示，在表100中提供。挑选那些没有使ALT/AST水平提升超过对照水平七倍的反义寡核苷酸用以下一步研究。血浆胆红素和白蛋白水平也用同样的临床化学分析仪测定；结果用mg/dL表示，在表100中提供。挑选那些没有使胆红素水平提升超过对照水平两倍以上的反义寡核苷酸用于进一步研究。
表100
反义寡核苷酸处理对Sprague-Dawley大鼠肝脏中代谢指标的影响
肾功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测量血浆血液尿素氮(BUN)和肌酐浓度。结果以mg/dL表示，在表101中提供。挑选那些没有使BUN水平相比PBS对照提升超过两倍的反义寡核苷酸用以下一步分析。在反义寡核苷酸处理之后，计算出总的尿液样本中总的尿蛋白和尿蛋白与肌酐的比值，也在表101中提供。挑选那些没有使尿蛋白/肌酐的比值相比PBS对照提升超过五倍的反义寡核苷酸用于进一步研究。
表101
反义寡核苷酸处理对Sprague-Dawley大鼠肾脏中代谢指标的影响
血液学分析
从所有大鼠组获得的血液被送去Antech Diagnostics进行血细胞比容(HCT)测定以及如WBC(中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)、RBC和血小板等各种血细胞以及总血红蛋白含量的测定。结果在表102和103中提供。挑选那些没有使血小板数降低超过50％并且没有使单核细胞数提升超过三倍的反义寡核苷酸用以进一步研究。
表102
反义寡核苷酸处理对Sprague-Dawley大鼠中血液因子的影响
表103
Sprague-Dawley大鼠中反义寡核苷酸处理对血细胞数的影响
例43：靶向人因子11的反义寡核苷酸在CD1小鼠中的耐受性
以靶向人因子11且具有4-8-4MOE、3-8-3MOE、2-10-2MOE、3-10-3MOE和4-10-4MOE结构域的ISIS反义寡核苷酸给药于CD1小鼠，评估多种代谢指标水平的变化。
处理
按组向每组5只CD1小鼠皮下注射50mg/kg的ISIS 449707、ISIS 449708、ISIS449409、ISIS 449710或ISIS 449711，每周两次，共6周。向5只CD1小鼠的对照组皮下注射PBS，每周两次，共6周。在处理之前和结束时测定体重。最后剂量后三天，处死小鼠，测定器官重量，并收集血液用于进一步分析。
体重和器官重量
研究结束时测得的小鼠体重以克表示，在表104中提供。在研究结束时也测定肝脏、脾脏和肾脏的重量，以占体重的百分比表示，在表104中提供。挑选那些没有使肝脏和脾脏重量相比PBS对照提升超过六倍的反义寡核苷酸用以下一步分析。
表104
反义寡核苷酸处理后的CD1小鼠的体重和器官重量的变化
肝功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测量血浆转氨酶浓度。血浆测定ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)浓度，结果用IU/L表示，在表105中提供。挑选那些没有使ALT/AST水平提升超过对照水平七倍的反义寡核苷酸用以下一步研究。血浆胆红素和白蛋白水平也用同样的临床化学分析仪测定，结果用mg/dL表示，在表105中提供。挑选那些没有使胆红素水平提升超过对照水平两倍的反义寡核苷酸用以进一步研究。
表105
反义寡核苷酸处理对CD1小鼠肝脏中代谢指标的影响
肾功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测量血浆血液尿素氮(BUN)和肌酐浓度。结果以mg/dL表示，在表106中提供。挑选那些没有使BUN水平相比PBS对照提升超过两倍的反义寡核苷酸用于下一步分析。
表106
反义寡核苷酸处理对CD1小鼠肾脏中代谢指标(mg/dL)的影响
BUN 肌酐
PBS 28 0.3
ISIS 449707 27 0.2
ISIS 449708 28 0.2
ISIS 449709 34 0.3
ISIS 449710 29 0.2
ISIS 449711 26 0.2
血液学分析
从所有小鼠组中获得的血液被送去Antech Diagnostics进行血细胞比容(HCT)测定以及如WBC(中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)、RBC和血小板等各种血细胞以及总血红蛋白含量的测定。结果在表107和108中提供。挑选那些没有使血小板数下降超过50％并且没有使单核细胞数提升超过三倍的反义寡核苷酸用以进一步研究。
表107
反义寡核苷酸处理对CD1小鼠中血液因子的影响
表108
反义寡核苷酸处理对CD1小鼠中血细胞数的影响
例44：靶向人因子11的反义寡核苷酸在Sprague-Dawley大鼠中的耐受性
就各种代谢指标水平的变化进一步在Sprague-Dawley大鼠中评估已经在CD1小鼠(例43)中评估过的5条反义寡核苷酸。
处理
按组向每组4只Sprague-Dawley大鼠皮下注射50mg/kg的ISIS 449707、ISIS449708、ISIS 449409、ISIS 449710或ISIS 449709，每周两次，共6周。向4只Sprague-Dawley大鼠的对照组皮下注射PBS，每周两次，共6周。在处理之前和期间测定体重。最后剂量后三天，收集尿液样本，然后处死大鼠，测定器官重量，并收集血液用于进一步分析。
体重和器官重量
在研究开始时以及研究结束时测定大鼠体重。体重变化在表109中提供，表示为相比研究开始前PBS对照重量的克数增加。在研究结束时测定肝脏、脾脏和肾脏的重量，以占体重的百分比表示，在表109中提供。挑选那些没有使肝脏和脾脏重量提升超过PBS对照六倍的反义寡核苷酸用以下一步分析。
表109
反义寡核苷酸处理后的Sprague Dawley大鼠的体重和器官重量的变化
肝功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测定血浆ALT和AST浓度。测定血浆丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)浓度，结果用IU/L表示，在表110中提供。挑选那些没有使ALT/AST提升超过对照水平七倍的反义寡核苷酸用于下一步研究。还测定血浆胆红素和白蛋白水平，结果用mg/dL表示，在表110中提供。挑选那些没有使胆红素水平提升超过对照水平两倍的反义寡核苷酸用以进一步研究。
表110
反义寡核苷酸处理对Sprague-Dawley大鼠肝脏中代谢指标的影响
肾功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测定血浆BUN和肌酐浓度。结果以mg/dL表示，在表111中提供。挑选那些没有使BUN水平相比PBS对照提升超过两倍的反义寡核苷酸用以下一步分析。在反义寡核苷酸处理之后，计算出总的尿液样本中总的尿蛋白和尿蛋白与肌酐的比值，也在表111中提供。挑选那些没有使尿蛋白/肌酐的比值相比PBS对照提升超过五倍的反义寡核苷酸用于进一步研究。
表111
反义寡核苷酸处理对Sprague-Dawley大鼠肾脏中代谢指标的影响
血液学分析
从所有大鼠组获得的血液被送去Antech Diagnostics进行血细胞比容(HCT)测定以及如WBC(中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)、RBC和血小板等各种血细胞以及总血红蛋白含量的测定。结果在表112和113中提供。挑选那些没有使血小板数降低超过50％并且没有使单核细胞数提升超过三倍的反义寡核苷酸用以进一步研究。
表112
反义寡核苷酸处理对Sprague-Dawley大鼠中血液因子的影响
表113
反义寡核苷酸处理对Sprague-Dawley大鼠中血细胞数的影响
例45：靶向人因子11的反义寡核苷酸在猕猴中剂量依赖的药理学效应
在猕猴中测试了一些反义寡核苷酸以确定寡核苷酸对于因子11活性、抗凝和失血时间、肝脏和肾脏分布以及耐受性的药理学效应。本研究使用的所有寡核苷酸都靶向人因子11的mRNA，也与猕猴的基因序列可完全交叉反应(见表44)。期望猕猴的ISIS寡核苷酸同样与猕猴的基因序列可完全交叉反应。在研究开始时，在国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中没有猕猴的基因组序列；因此，无法确定与猕猴基因序列的交叉反应性。
处理
以逐步上升的剂量，按组向每组两只雄性猴和三只雌性猴皮下注射ISIS 416838、ISIS 416850、ISIS 416858、ISIS 416864或ISIS 417002。在第1周，以5mg/kg的剂量向猴子给药三次反义寡核苷酸；在第2和第3周，以5mg/kg的剂量每周给药两次；在第4周，以10mg/kg的剂量每周给药三次；在第5和第6周，以10mg/kg的剂量每周给药两次；在第7周，以25mg/kg的剂量每周给药三次；在第8、9、10、11和12周，以25mg/kg的剂量每周给药两次。根据相同的给药方案，向包括两只雄性猴和三只雌性猴的对照组皮下注射PBS。以长期的低剂量的给药方案，向包括两只雄性猴和三只雌性猴的额外实验组皮下注射ISIS 416850。在第1周，以5mg/kg的剂量向猴子给药反义寡核苷酸，每周三次；在第2和第3周，以5mg/kg的剂量给药，每周两次；在第4周，以10mg/kg的剂量给药，每周三次；在第5至第12周，以10mg/kg的剂量给药，每周两次。每周测量体重。在处理开始前14天和5天以及随后每周一次采集血液样本，用于血浆中因子11蛋白活性分析、纤维蛋白原测定、PT和aPTT测定、失血时间以及各种血液指标的测定。在第85天，当猕猴处于深度麻醉时用放血法实施安乐死，收集器官用于进一步分析。
RNA分析
在第85天，从肝脏组织中提取RNA，用于使用引物探针组LTS00301(正向引物序列ACACGCATTAAAAAGAGCAAAGC，此处指定为SEQ ID NO 271；反向引物序列CAGTGTCATGGTAAAATGAAGAATGG，此处指定为SEQ ID NO：272；以及探针序列TGCAGGCACAGCATCCCAGTGTTCTX，此处指定为SEQ ID NO.273)的因子11的实时PCR分析。结果表示为相对于PBS对照的因子11的抑制百分比。如表114所示，相比于PBS对照，ISIS寡核苷酸处理导致因子11的mRNA的明显减少。
表114
猕猴肝脏中因子11mRNA相对于PBS对照的抑制
蛋白分析
以亲和纯化的抗因子11的多克隆抗体为俘获抗体，以过氧化物酶结合的抗因子11的多克隆抗体为检测抗体，用三明治式ELISA测试法(AffinityBiologicals Inc.)分析所有猕猴组在不同天采集的血浆样本。猴血浆以1∶50稀释用于试验。过氧化物酶活性通过与底物邻苯二胺孵育来表达。产生的颜色用490nm酶标仪定量，被认为与样本中因子11的浓度成正比。
结果在表115中提供，表示为相对于PBS对照的抑制百分比。ISIS 416850和ISIS416858处理导致蛋白水平时间依赖地降低。
表115
猕猴肝脏中因子11蛋白质相对于PBS对照的抑制
PT和aPTT试验
血液样本收集在含柠檬酸钠的试管中。用ACL 9000凝结装置(InstrumentationLaboratory，Italy)重复两次测定PT和aPTT。结果插入以柠檬酸钠为抗凝结剂的被测对照猕猴血浆的梯度稀释的标准曲线上，以产生正常百分比形式的结果。
用来自经ISIS寡核苷酸处理的猴的贫血小板血浆(PPP)测定凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)。PT和aPTT值在表116和117中给出，以国际标准化比(INR)值来表示。将每一实验组的PT或aPTT值除以PBS处理的组的PT或aPTT，即测定了PT或aPTT的INR值。将该比值以采用的组织因子的国际敏感度指数(ISI)进行加幂。使用长期给药方案的ISIS寡核苷酸，ISIS 416850，用星号与其他寡核苷酸相区别。
如表116所示，PT在用ISIS寡核苷酸用逐步上升的给药方案或长期给药方案处理的猴中都没有明显延长。然而，如表117所示，aPTT剂量依赖地延长。这些数据表明因子11的反义减少影响了接触激活通路，但没有影响血液凝结的外源性途径。因此，因子11的反义减少对于由异常血管壁而非组织损伤造成的血栓或凝结形成的抑制有用。
表116
ISIS反义寡核苷酸在猕猴中对PT比值的影响
n.d.＝没有数据
表117
ISIS反义寡核苷酸在猕猴中对aPTT比值的影响
n.d.＝没有数据
蛋自活性分析
在各个时间点采集血液样本，用基于凝结时间的F11测试测定因子11酶原。用ST4半自动凝结装置(Diagnostica Stago，NJ)重复两次测定凝血时间。将30μl以含BSA的HEPES-NaCl缓冲液以1/20稀释的以柠檬酸钠作为抗凝结剂的样本血浆与30μl aPTT试剂(自动化aPTT，Organon Technika，NC)以及30μl缺乏因子11的以柠檬酸钠为抗凝结剂的血浆(George King生物医学公司)在37℃下孵育5分钟，随后加入30μl 25mM CaCl2以启动凝血。结果插入梯度稀释的以柠檬酸钠为抗凝结剂的对照血浆的标准曲线上。
结果以相对于PBS对照的因子11的抑制百分比表示，在表118中提供。使用长期给药方案的ISIS寡核苷酸，ISIS 416850，用星号与其他寡核苷酸相区别。
表118
以逐步增加剂量/长期给药方案给药于猕猴的ISIS反义寡核苷酸对因子11蛋白的抑制
n.d.＝没有数据
纤维蛋白原测定
收集9份新鲜猕猴血浆至1份柠檬酸三钠中。用ACL 9000凝结装置(Instrumentation Laboratory，Italy)测定样本的纤维蛋白原含量。结果以mg/dL表示，在表119中提供。使用长期给药方案的ISIS寡核苷酸，ISIS 416850，用星号与其他寡核苷酸相区别。
表119
ISIS反义寡核苷酸在猕猴中对纤维蛋白原水平的影响
n.d.＝没有数据
失血试验
在处理周期的不同日，用Surgicutt Jr.装置(ITC，New Jersey)进行失血试验。将猴置于猴椅，猴臂置于稳定支架中。将猴臂轻柔剃毛，血压计置于其上臂上。将血压计臂带膨胀至40mm Hg，整个过程始终保持该压力。上臂上待切开的区域用消毒棉签清洁，用Surgicutt Jr装置在前臂的侧面掌底表面、平行于肘前皱并位于其下方5cm处产生一个切口。在产生切口的同时，开始秒表计时。每隔30秒，用吸水纸不直接接触切口地将切口的血液吸除，以便不干扰血小板栓的形成。每隔30秒吸除血液，直到血液不再染红纸张。然后停止秒表计时，测定失血时间。将血压计从动物臂拿走，切口位点以消毒棉签消毒，使用伤口密封条。结果以秒表示，在表X中提供。结果在表120中提供。使用长期给药方案的ISIS寡核苷酸，ISIS 416850，用星号与其他寡核苷酸相区别。
这些数据表明此处提供的化合物导致出血的可能性低。
表120
猕猴失血试验
血小板聚集试验
将1mmol/LADP和/或3μg胶原(根据采集时间，如表121所述)加入血浆样本，以启动血小板凝聚，进行10分钟。通过记录血小板形态改变后的电阻或阻抗改变以及凝聚的起始斜率的改变，来表征积聚。在每个采集日，对每份样本进行两次凝聚测试，取平均值。使用长期给药方案的ISIS寡核苷酸，ISIS 416850，用星号标记以区别于其他寡核苷酸。
表121
ISIS反义寡核苷酸在猕猴中对血小板聚集的影响(欧姆)
n.d.＝没有数据
体重和器官重量
在给药方案始终测定体重。每组的测量值以克表示，在表122中提供。结果表明反义寡核苷酸处理不会导致动物健康的任何不良变化，健康的不良变化会导致体重相比于PBS对照的显著改变。动物安乐死后测定器官重量，收取肝脏、肾脏和脾脏并称重。结果在表123中提供，除脾脏重量增加的ISIS 416858外，没有显示出重量上相比于PBS对照的任何显著改变。使用长期给药方案的ISIS寡核苷酸，ISIS 416850，用星号与其他寡核苷酸相区别。
表122
猕猴体重(g)的每周测量值
n.d.＝没有数据
表123
反义寡核苷酸处理后猕猴的器官重量(g)
肝功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测量血浆转氨酶浓度。测定血浆ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)浓度，结果用IU/L表示，在表124和125中提供。挑选那些没有使ALT/AST水平提升超过对照水平七倍的反义寡核苷酸用以下一步研究。还测定了血浆胆红素水平，结果用mg/dL表示，在表126中提供。挑选那些没有使胆红素水平提升超过对照水平两倍的反义寡核苷酸用以进一步研究。使用长期给药方案的ISIS寡核苷酸，ISIS 416850，用星号与其他寡核苷酸相区别。
表124
反义寡核苷酸处理对猕猴肝脏中ALT(IU/L)的影响
n.d.＝没有数据
表125
反义寡核苷酸处理对猕猴肝脏中AST(IU/L)的影响
n.d.＝没有数据
表126
反义寡核苷酸处理对猕猴肝脏中胆红素(IU/L)的影响
n.d.＝没有数据
肾功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，采集尿液样本。计算出在反义寡核苷酸处理之后液样本中尿蛋白与肌酐的比值，结果在表127中提供。挑选那些没有使尿蛋白/肌酐的比值相比PBS对照提升超过五倍的反义寡核苷酸用于进一步研究。
表127
反义寡核苷酸处理对猕猴的尿蛋白/肌酐比值的影响
第80天： 第84天：
PBS 0.09 0.10
ISIS 416838 0.13 0.13
ISIS 416850 0.09 0.12
ISIS 416858 0.10 0.07
ISIS 416864 0.36 0.34
ISIS 417002 0.18 0.24
寡核苷酸浓度的测定
评估全长寡核苷酸浓度以及寡核苷酸降解和从肝脏和肾脏消除所花的时间。方法采用以前发表方法(Leeds et al.，1996；Geary et al.，1999)的改良方法，其包括苯酚-氯仿(液体-液体)提取及随后的固相提取。在提取前加入内标物(ISIS 355868，27单体的2’-O-甲氧乙基修饰的磷硫酰寡核苷酸，GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT，此处指定为SEQ IDNO：270)。以约为1.14μg/g的定量下限(LLOQ)用校正曲线计算组织样本浓度。然后用WinNonlin软件(PHARSIGHT)计算半衰期。结果以μg/g肝脏或肾脏组织表示，在表128和129中提供。
表128
猕猴的肝脏和肾脏中的全长寡核苷酸浓度(μg/g)
ISIS No. 肾脏 肝脏
416838 1339 1087
416850 2845 1225
416858 1772 1061
416864 2093 1275
417002 2162 1248
表129
猕猴的肝脏和肾脏中的总的寡核苷酸浓度(μg/g)
ISIS No. 肾脏 肝脏
416838 1980 1544
416850 3988 1558
416858 2483 1504
416864 3522 1967
417002 3462 1757
血液学分析
从所有猴分组获得的血液被送去韩国毒理学研究所(KIT)进行HCT、MCV、MCH和MCHC分析以及如WBC(中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和网织红细胞)、RBC和血小板等各种血细胞以及总血红蛋白含量的测定。结果在表130-143中提供。挑选那些没有使血小板数提升超过50％并且没有使单核细胞数提升超过三倍的反义寡核苷酸用以进一步研究。使用长期给药方案的ISIS寡核苷酸，ISIS 416850，用星号标记以区别于其他寡核苷酸。
表130
反义寡核苷酸处理对猕猴中WBC数(x103/μL)的影响
n.d.＝没有数据
表131
反义寡核苷酸处理对猕猴中RBC数(x106/μL)的影响
n.d.＝没有数据
表132
反义寡核苷酸处理对猕猴中血红蛋白(g/dL)的影响
n.d.＝没有数据
表133
反义寡核苷酸处理对猕猴体内血细胞比容(g/dL)的影响
n.d.＝没有数据
表134
反义寡核苷酸处理对猕猴体内MCV(fL)的影响
n.d.＝没有数据
表135
反义寡核苷酸处理对猕猴体内MCH(pg)的影响
n.d.＝没有数据
表136
反义寡核苷酸处理对猕猴体内MCHC(g/dL)的影响
n.d.＝没有数据
表137
反义寡核苷酸处理对猕猴体内血小板数(x103/μL)的影响
n.d.＝没有数据
表138
反义寡核苷酸处理对猕猴体内网织红细胞(％)的影响
n.d.＝没有数据
表139
反义寡核苷酸处理对猕猴体内中性粒细胞(％)的影响
n.d.＝没有数据
表140
反义寡核苷酸处理对猕猴体内淋巴细胞(％)的影响
n.d.＝没有数据
表141
反义寡核苷酸处理对猕猴体内嗜酸性细胞(％)的影响
n.d.＝没有数据
表142
反义寡核苷酸处理对猕猴体内单核细胞(％)的影响
n.d.＝没有数据
表143
反义寡核苷酸处理对猕猴中嗜碱性细胞(％)的影响
n.d.＝没有数据
细胞因子和趋化因子分析
以逐步增加剂量的给药方案，用PBS、ISIS 416850和ISIS 416858处理猴分组，把从这些猴获得的血液样本送至Pierce Biotechnology(Woburn，MA)测定细胞因子和趋化因子水平。用各自的灵长类抗体测定IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平，用各自的交叉反应的人抗体测定IL-8、MIP-1α、MCP-1、MIP-1β和RANTES的水平。在处理开始前14天以及第85天，当猴被执行安乐死时，进行测定。结果在表144和145中提供。
表144
反义寡核苷酸处理在第-14天对猕猴中细胞因子/趋化因子水平(pg/mL)的影响
表145
反义寡核苷酸处理在第85天对猕猴中细胞因子/趋化因子水平(pg/mL)的影响
例46：靶向人因子11的反义寡核苷酸在猕猴体内的药理作用
在猕猴体内测试一些从啮齿类耐受性研究(例41-44)中挑选的反义寡核苷酸以测定在猕猴模型中它们对于因子11活性和耐受性的药理作用和相对效力。还把这些反义寡核苷酸与在前面所述猕猴研究(例45)中选出的ISIS 416850和ISIS 416858进行了比较。本研究所采用的所有寡核苷酸都靶向人因子11的mRNA，并且与猕猴的基因序列可完全交叉反应(见表44和46)。期望猕猴的ISIS寡核苷酸同样与猕猴的基因序列可完全交叉反应。在研究开始时，在国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中没有猕猴的基因组序列；因此，没有确认与猕猴基因序列的交叉反应性。
处理
按组向每组两只雄性猴和两只雌性猴皮下注射25mg/kg的ISIS 416850、ISIS449709、ISIS 445522、ISIS 449710、ISIS 449707、ISIS 449711、ISIS 449708、416858和ISIS 445531。反义寡核苷酸以5mg/kg的剂量在第1周每周三次给药于弥猴；以25mg/kg的剂量在第2至第8周每周两次给药。向两只雄性猴和两只雌性猴的对照组以相同给药方案皮下注射PBS。在处理开始前14天和7天以及在整个处理周期内每周一次测定体重。在处理开始前14天和5天以及随后给药方案期间数次采集血液样本，用于PT和aPTT测定以及各种血液因子的测定。在第55天，当猕猴处于深度麻醉时用放血法实施安乐死，收集器官用于进一步分析。
RNA分析
在第55天，从肝脏组织中抽提RNA用于用引物探针组LTS00301对因子11的实时PCR分析。结果表示为相对于PBS对照的因子11的抑制百分比。如表146所示，相比于PBS对照，ISIS 416850、ISIS 449709、ISIS 445522、ISIS 449710、ISIS 449707、ISIS 449708、ISIS416858和ISIS 445531处理导致因子11的mRNA明显减少。
表146
猕猴肝脏中因子11mRNA相对于PBS对照的抑制
蛋白分析
以亲和纯化的抗因子11的多克隆抗体为俘获抗体，以过氧化物酶结合的抗因子11的多克隆抗体为检测抗体，用三明治式ELISA测试法(Affinity Biologicals Inc.)分析在不同日从所有猕猴组采集的血浆样本。猴血浆以1∶50稀释用于试验。过氧化物酶活性通过与底物邻苯二胺孵育来表达。产生的颜色用490nm酶标仪定量，其被认为与样本中因子11的浓度成正比。
结果在表147中提供，表示为相对于PBS对照的抑制百分比。ISIS 416850、ISIS449709、ISIS 445522和ISIS 416858处理导致蛋白水平时间依赖的降低。
表147
相对于PBS对照，猕猴肝脏中因子11蛋白质的抑制
PT和aPTT试验
用来自经ISIS寡核苷酸处理的小鼠的贫血小板血浆(PPP)测定PT和aPTT。PT和aPTT值在表148和149中给出，以国际标准化比值(INR)来表示。将每一实验组的PT或aPTT值除以PBS处理的组的PT或aPTT值，获得PT或aPTT的INR值。将该比值以采用的组织因子的国际敏感度指数(ISI)进行加幂。如表148所示，PT在经ISIS寡核苷酸处理的小鼠中没有明显延长。然而，如表149所示，在经ISIS 416850、ISIS 445522和ISIS 416858处理的组中，aPTT明显延长了。这些数据表明因子11的反义减少影响了接触激活通路，但没有影响血液凝结的外源性途径。因此，以这些ISIS寡核苷酸反义减少因子11对由异常血管壁而非组织损伤造成的血栓和凝结形成的抑制有用。
表148
ISIS反义寡核苷酸处理对猕猴体内PT比值的影响
表149
反义寡核苷酸处理对猕猴体内aPTT比值的影响
体重和器官重量
每组的体重以克表示，在表150中提供。结果表明反义寡核苷酸处理不会导致动物健康的任何不良变化，健康的不良变化会导致体重相比于PBS对照显著改变。在第55天动物安乐死后测定器官重量，收取肝脏、肾脏和脾脏。结果以占体重的百分比表示，在表150中提供，除导致脾脏重量增加的ISIS 449711外，也没有显示出重量上相比于PBS对照的任何显著改变。
表150
猕猴体重(g)的每周测量值
表151
反义寡核苷酸处理后猕猴的器官重量(g)
肝功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，用自动化临床化学分析仪(HitachiOlympus AU400e，Melville，NY)测定血浆ALT和AST浓度。测定血浆丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)浓度，结果用IU/L表示，在表152和153中提供。还测定了血浆胆红素水平，用mg/dL表示，在表154中提供。如表152-154，还观察到在反义寡核苷酸处理后任何肝脏代谢指标都没有明显增加。
表152
反义寡核苷酸处理对猕猴肝脏中ALT(IU/L)的影响
表153
反义寡核苷酸处理对猕猴肝脏中AST(IU/L)的影响
表154
反义寡核苷酸处理对猕猴肝脏中胆红素(mg/dL)的影响
肾功能
为了评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，在不同日采集尿液样本。用自动化临床化学分析仪(Hitachi Olympus AU400e，Melville，NY)测定不同时间点的BUN水平，结果在表155中提供。还计算出反义寡核苷酸处理后第49天的尿液样本中尿蛋白与肌酐的比值，结果在表156中提供。如表155和156中所观察到的，在反义寡核苷酸处理后任何肾脏代谢指标都没有明显增加。
表155
反义寡核苷酸处理对猕猴体内BUN水平(mg/dL)的影响
表156
反义寡核苷酸处理对猕猴的尿蛋白/肌酐比值的影响
血液学分析
在不同日从所有组猴获得的血液被送去韩国毒理学研究所(KIT)进行HCT、MCV、MCH和MCHC的测定以及如WBC(中性粒细胞和单核细胞)、RBC和血小板等各种血细胞以及总血红蛋白含量的测定。结果在表157-166中提供。
表157
反义寡核苷酸处理对猕猴体内HCT(％)的影响
表158
反义寡核苷酸处理对猕猴体内血小板数(x 100/μL)的影响
表159
反义寡核苷酸处理对猕猴体内中性粒细胞(％)的影响
表160
反义寡核苷酸处理对猕猴体内单核细胞(％)的影响
表161
反义寡核苷酸处理对猕猴体内血红蛋白含量(g/dL)的影响
表162
反义寡核苷酸处理对猕猴体内WBC数(x103/μL)的影响
表163
反义寡核苷酸处理对猕猴体内RBC数(x106/μL)的影响
表164
反义寡核苷酸处理对猕猴体内MCV(fL)的影响
表165
反义寡核苷酸处理对猕猴体内MCH(pg)的影响
表166
反义寡核苷酸处理对猕猴体内MCHC(g/dL)的影响
细胞因子和趋化因子分析
把从所有组猴获得的血液样本送至Pierce Biotechnology(Woburn，MA)测定细胞因子和趋化因子水平。用各自的灵长类抗体测定IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平，用各自的交叉反应的人抗体测定IL-8、MIP-1α、MCP-1、MIP-1β和RANTES的水平。在处理开始前14天以及第55天，猴被执行安乐死时，进行测定。结果在表167和168中提供。
表167
反义寡核苷酸处理在第-14天对猕猴体内细胞因子/趋化因子水平(pg/mL)的影响
表168
反义寡核苷酸处理在第55天对猕猴体内细胞因子/趋化因子水平(pg/mL)的影响
例47：靶向人因子11的ISIS反义寡核苷酸的粘度的测定
测定靶向人因子11的ISIS反义寡核苷酸的粘度，目的在于筛选出在165-185mg/mL浓度时具有超过40cP粘度的反义寡核苷酸。
将ISIS寡核苷酸(32-35mg)称重至玻璃瓶中，加入120μL水，50℃加热玻璃瓶使反义寡核苷酸溶入溶液。将部分(75μL)预热样本移至微粘度计(剑桥)中。微粘度计的温度设至25℃，测定样本的粘度。将另一部分(20μL)预热样本移至10mL水中，在260nM和85℃下进行紫外读数(Cary紫外装置)。结果在表169中提供。
表169
靶向人因子11的ISIS反义寡核苷酸的粘度和浓度
序列表
<110> IONIS制药公司
S.M.弗赖尔
B.P.莫尼亚
张宏
赵臣广
J.R.克罗斯比
A.M.斯夫科夫斯基
<120> 因子11表达的调节
<130> BIOL0107WO
<150> 61/105,772
<151> 2008-10-15
<150> 61/174,461
<151> 2009-04-30
<160> 274
<170> 针对Windows4.0版本的FastSEQ
<210> 1
<211> 3278
<212> DNA
<213> 智人属
<400> 1
aggcacacag gcaaaatcaa gttctacatc tgtccctgtg tatgtcactt gtttgaatac 60
gaaataaaat taaaaaaata aattcagtgt attgagaaag caagcaattc tctcaaggta 120
tatttctgac atactaagat tttaacgact ttcacaaata tgctgtactg agagagaatg 180
ttacataaca ttgagaacta gtacaagtaa atattaaagt gaagtgacca tttcctacac 240
aagctcattc agaggaggat gaagaccatt ttggaggaag aaaagcaccc ttattaagaa 300
ttgcagcaag taagccaaca aggtcttttc aggatgattt tcttatatca agtggtacat 360
ttcattttat ttacttcagt ttctggtgaa tgtgtgactc agttgttgaa ggacacctgc 420
tttgaaggag gggacattac tacggtcttc acaccaagcg ccaagtactg ccaggtagtc 480
tgcacttacc acccaagatg tttactcttc actttcacgg cggaatcacc atctgaggat 540
cccacccgat ggtttacttg tgtcctgaaa gacagtgtta cagaaacact gccaagagtg 600
aataggacag cagcgatttc tgggtattct ttcaagcaat gctcacacca aataagcgct 660
tgcaacaaag acatttatgt ggacctagac atgaagggca taaactataa cagctcagtt 720
gccaagagtg ctcaagaatg ccaagaaaga tgcacggatg acgtccactg ccactttttc 780
acgtacgcca caaggcagtt tcccagcctg gagcatcgta acatttgtct actgaagcac 840
acccaaacag ggacaccaac cagaataacg aagctcgata aagtggtgtc tggattttca 900
ctgaaatcct gtgcactttc taatctggct tgtattaggg acattttccc taatacggtg 960
tttgcagaca gcaacatcga cagtgtcatg gctcccgatg cttttgtctg tggccgaatc 1020
tgcactcatc atcccggttg cttgtttttt accttctttt cccaggaatg gcccaaagaa 1080
tctcaaagaa atctttgtct ccttaaaaca tctgagagtg gattgcccag tacacgcatt 1140
aaaaagagca aagctctttc tggtttcagt ctacaaagct gcaggcacag catcccagtg 1200
ttctgccatt cttcatttta ccatgacact gatttcttgg gagaagaact ggatattgtt 1260
gctgcaaaaa gtcacgaggc ctgccagaaa ctgtgcacca atgccgtccg ctgccagttt 1320
tttacctata ccccagccca agcatcctgc aacgaaggga agggcaagtg ttacttaaag 1380
ctttcttcaa acggatctcc aactaaaata cttcacggga gaggaggcat ctctggatac 1440
acattaaggt tgtgtaaaat ggataatgag tgtaccacca aaatcaagcc caggatcgtt 1500
ggaggaactg cgtctgttcg tggtgagtgg ccgtggcagg tgaccctgca cacaacctca 1560
cccactcaga gacacctgtg tggaggctcc atcattggaa accagtggat attaacagcc 1620
gctcactgtt tctatggggt agagtcacct aagattttgc gtgtctacag tggcatttta 1680
aatcaatctg aaataaaaga ggacacatct ttctttgggg ttcaagaaat aataatccat 1740
gatcagtata aaatggcaga aagcgggtat gatattgcct tgttgaaact ggaaaccaca 1800
gtgaattaca cagattctca acgacccata tgcctgcctt ccaaaggaga tagaaatgta 1860
atatacactg attgctgggt gactggatgg gggtacagaa aactaagaga caaaatacaa 1920
aatactctcc agaaagccaa gataccctta gtgaccaacg aagagtgcca gaagagatac 1980
agaggacata aaataaccca taagatgatc tgtgccggct acagggaagg agggaaggac 2040
gcttgcaagg gagattcggg aggccctctg tcctgcaaac acaatgaggt ctggcatctg 2100
gtaggcatca cgagctgggg cgaaggctgt gctcaaaggg agcggccagg tgtttacacc 2160
aacgtggtcg agtacgtgga ctggattctg gagaaaactc aagcagtgtg aatgggttcc 2220
caggggccat tggagtccct gaaggaccca ggatttgctg ggagagggtg ttgagttcac 2280
tgtgccagca tgcttcctcc acagtaacac gctgaagggg cttggtgttt gtaagaaaat 2340
gctagaagaa aacaaactgt cacaagttgt tatgtccaaa actcccgttc tatgatcgtt 2400
gtagtttgtt tgagcattca gtctctttgt ttttgatcac gcttctatgg agtccaagaa 2460
ttaccataag gcaatatttc tgaagattac tatataggca gatatagcag aaaataacca 2520
agtagtggca gtggggatca ggcagaagaa ctggtaaaag aagccaccat aaatagattt 2580
gttcgatgaa agatgaaaac tggaagaaag gagaacaaag acagtcttca ccattttgca 2640
ggaatctaca ctctgcctat gtgaacacat ttcttttgta aagaaagaaa ttgattgcat 2700
ttaatggcag attttcagaa tagtcaggaa ttcttgtcat ttccatttta aaatatatat 2760
taaaaaaaat cagttcgagt agacacgagc taagagtgaa tgtgaagata acagaatttc 2820
tgtgtggaag aggattacaa gcagcaattt acctggaagt gataccttag gggcaatctt 2880
gaagatacac tttcctgaaa aatgatttgt gatggattgt atatttattt aaaatatctt 2940
gggaggggag gctgatggag atagggagca tgctcaaacc tccctaagac aagctgctgc 3000
tgtgactatg ggctcccaaa gagctagatc gtatatttat ttgacaaaaa tcaccataga 3060
ctgcatccat actacagaga aaaaacaatt agggcgcaaa tggatagtta cagtaaagtc 3120
ttcagcaagc agctgcctgt attctaagca ctgggatttt ctgtttcgtg caaatattta 3180
tctcattatt gttgtgatct agttcaataa cctagaattt gaattgtcac cacatagctt 3240
tcaatctgtg ccaacaacta tacaattcat caagtgtg 3278
<210> 2
<211> 26001
<212> DNA
<213> 智人属
<400> 2
atgccctcca taggctttca gaccttcttc aaggccaaag ggaaggcctt catggaaata 60
taattatgtg aaacacccca gaattttttc acaaactttc ctgcctataa acgccaggtc 120
ctaccactgt ccagtgtccc acttcccact gtccagtggg aagactccct ccaggacaaa 180
accacccttt ccttcaggga tgtgacgtgc tgtgctttcg ttgacagtca tgcagctgct 240
agacatgtca cttcctagct ctccattcgg gtctgtgtcc caggacctaa agaaagctaa 300
aagaagccgg gcgtggtggc tcatgcctgt catcccagca ttttgggagg ctgaggctgg 360
cggatcactg gagatcagga gtttgagacc agtctgacca gcatggtgaa accctgtctc 420
tactaaaaat acaaaaaaag aaaagaaaaa agaaaaaaaa ataagctggg cgtggtggcg 480
cgggcctgta gtcccagcta ctccggaggc ggaggcagga caatcacttg aacctggaag 540
gcggaggttg cagtgagctg agatcgcgtc attgcactcc agcctgtgcg acgagagact 600
ctgtctcaaa agaaagaaag aaagagagaa agaaagaaag aaagaaaaga aagaaagaaa 660
gaagaaagaa agaaaagaaa gaaagtaaga agcaagcaag ctgaaatagc ttatttttct 720
gttttaaaaa atagactttt agtgttcaca agtaagaata aaaaaaaaaa aagcttggcc 780
ttaggaggaa tcctatctgc ttaggcctct gagaggcagc gtcacctgaa gggaaactga 840
ctgggcaaga gccaggctct taggagctgt ctgtactttg cttcccatcc gtccgctctc 900
ccccagcagc caaagtctcc tccctccatt atattgcaaa tcaatgaatc cattagactt 960
tccatgtttt ctttttagac tttgagattc aaggtcagct agaattaatg gttaacagct 1020
gacaggtgaa agtgtggtta aatgcagctt tggctagcag gcacacaggc aaaatcaagt 1080
tctacatctg tccctgtgta tgtcacttgt ttgaatacga aataaaatta aaaaaataaa 1140
ttcagtgtat tgagaaagca agcaattctc tcaaggtata tttctgacat actaagattt 1200
taacgacttt cacaaatatg ctgtactgag agagaatgtt acataacatt gagaactagt 1260
acaagtaaat attaaagtga agtgaccatt tcctacacaa gctcattcag aggaggatga 1320
agaccatttt ggaggaagaa aagcaccctt attaagaatt gcagcaagta agccaacaag 1380
gtcttttcag gtacagtttc agaacttact atttaacatt cctctcaagc aaatacgcct 1440
tgaaatgctt tttttaaatc ataggaattt aaaaacactt tacaatagag aatgattgat 1500
ttttaaaatg tgtctgattt agctttgtag agatgttccg ctaatatcca taactaatct 1560
gagaggaaat gtggaacaac agaagagtaa cagtgtctac tcagtaacaa gcgttttacg 1620
agttaaaaag acatccaaat gcagtactga aaaatcagaa gtcttgattt gtctcactga 1680
tgactccgtt tttcctagag cagtctgttt aatgcttact ggagataaat agatttatag 1740
gtgaccaaga caatcgatta atgtatcagc cacagacttt tttaaataga aaattttcta 1800
agtaggaaat cattcatagc tctttgaaag atatagggag aggcctcaag gaaagaaaga 1860
aaggaaaaaa attgggaaag gaaacaaaga tgaaaaattg gggtggggag agcggtcaga 1920
tggtggccat gagaaggatc tgaacacaga gagcggcggg gccggcgggg aaggagggag 1980
gaggggagag cgctgcttcc ctgtgggttc cggcttctgc agagctgtaa gagttgaatg 2040
ccacacacag tcacactaag gaatgctcca ggattgggaa agaaaattca acattataat 2100
gagaacactg tgaatgctat tgaattaact actcccctct ctccctattt cttgtaagtc 2160
ttagtgtcag taaactaatt ataaatttac attttatgtt ctaaaagcat gcaccttttt 2220
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ctggtggtaa gtagagtgtt atcttaacta tgggctggga gagggaaatc acactgcaat 2340
ctccacacat gtgggagaat cccacaccat ttatgccggg aaggaaataa aatgttttta 2400
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attgtttgta ctggtaggaa tctgtgtcta tatgtgtacc atatctacat ccatgcctac 2520
atacatcatt catttaaatg atatttaaaa gcaatattaa aaagaagaaa tcttgatttg 2580
cctcactaat tagttggttt ttcataaagc agtcagttca atggaacata cacacacaca 2640
taaaatagga attttgtact gaaaaatgtt atgtaactat tcatacacag tttatgcatt 2700
tcaataattt aactaccctg ttaattctcc accctatgtc acatctgcta aatttgttta 2760
taaattactt agccaatatt aagtaggata tatcagtaca ggtattgttt agttccatga 2820
ccattcttta tttaaaatga aagctgaagc attcctttag aaaaatagct tatgtctaca 2880
tgttatattt aatttctgat actattgcta gcattttaag catagtaaat tctttttgct 2940
ggcctatgtg aaaaaaggca aacctaggtg aagatattaa aagtaaattc cacttaatat 3000
attaaattac acagctcata atttcaattt tctctgtgac aagactactg ctcaggttat 3060
aatattcctt tgttataatt atctggaaat tgtattgtta tttcattgat aaatatgtca 3120
gcgctaaata atttgatata ttttgaacac tggacccaat aactacataa acaattgacc 3180
ctgaatcagg ggttccacat ccatggattt aaacaacatt gaagtgaaat tttttaaaaa 3240
aaattatatc tgcactcaac atgtgcagag ttttttcttg tcattattcc cgaaacaaca 3300
cagtataaca acaatttgca tagtatttac attgtactag gtattataag taatctagag 3360
atgatttaaa gtacacagga ggctgtgagt aggttatatg taaatactat gccattttct 3420
atcagggact tgagcgttca tggattttgg tatctgcagg aggtctggca gccaatccct 3480
catagatatc aaggaatgat agtgtacata tttaggtcct ttatacatgc acatggaaca 3540
tttacaaata ttgaccacac acaagcctct gaaacaaggc tcaacaaatt ttaaggggtt 3600
aaaattatac tgatcatgtt attcaatcac cgtgaatggg agctagaata ataataaaaa 3660
gggaattgaa aatctgcaaa cgtttgaaaa ttgagtattt ataatcaccg tgaatgggag 3720
ctagaataat aataaaaagg gaattgaaaa tctgcaaatg tttgaaaatt gagtatttat 3780
acctttttag attaagatga atcagagatg aaatcacaat ggtaattaga aaaggaattg 3840
tacaataatg aaagtacagt atatcaaaac tttgagatgt aaccgaatca gtgttgagat 3900
caaatgtata gatttacatg tatacattag aatacagaaa agggaaaaat taatgatata 3960
agatgacaag aagatagaga atagcaactt aagtgctaag aaattagaag gcagaaagaa 4020
gaaatcgcag aaattaatta aatggaagac acacatattt gagaggtcaa cataacccct 4080
ttctagccca ttttataagg tcagggtaat cttgacacca aaatctgata ggaaaattct 4140
gaggaaaaaa agtcacaggt cttttatctt atgaacatat gtacaaatgt cctaaacaaa 4200
atattatcca acttaaccca gtagattgtt aaaaaaatta aaggatgatt acattgtgat 4260
attgtgacaa agttgggttt attccaggaa tgaaaagttg atttaacatt caaaaatcaa 4320
tagatgtgtg acttcggggt acataccgaa aaaaaagaag ggaaagcagg aactcacaca 4380
gatatacttg tacacccatc tcatagcagc attattcaca ctaacccaaa ggtggaagca 4440
gcccatgtgt ttatcaacag gtgactggat aaagtgtggt acatacatac aaaggaatat 4500
tactcaaccc taaaaagaaa ggaaattctg acacatgcta tgacatggat gaaccttgag 4560
gacattacgc taagtgaaat aagccagtca caaaagaaca aatactgtgg gatctcactg 4620
ataggaggta cttagggtag tcaatttcat caagacggaa attagaacag aggttgccag 4680
gggccgaggg gccaggggaa gggctgaggg ttggtgttta atgggcacag agcatcagct 4740
ggcgaagttg aaaagttctg gaggtggatg gtgctgatgg ttgcacagca atgtaaatac 4800
ccttagtgcc acagaactgt acactcaaga tggctacatg gcacatggta tgctatctgt 4860
cataataaaa aataaaaata attttaaatg ttaatatgtg ccgaaaaatg cttgctaaaa 4920
ttctattaat gatcaaaact ttaaataaac tggaaatgga agagaacttt catcagctat 4980
taaacgatat tttaaacaaa agcaaacaaa aatccaaacc aaaaatcttc aagaaacata 5040
atacgtaata gcggaatatt gaaagctttc ccaagggatt gagaatagga caagaatact 5100
tcccattatt tccatttact cttgactgga ggtactcgtt ggtgcggtaa ggaagggaaa 5160
taaaaggaaa acgattagga ggaacataag ctctcgtttt tcacagatga tgtgattgag 5220
tacctagaaa aatccaaaat taaccatcac ataaattatt tgagccaatt aattaaatga 5280
gtaagaagtc tcgatacaac gtcaatatac aacagcaagc acttgctcgt tcgcaaaagc 5340
agatgaacta gtttttactg acactagaag cagcatgtgt tccatgtgtt ccacatccat 5400
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gcagagtttt tttccaaaat tgttttccaa aaatttttaa atgtttatat gtttaggggg 5520
tgtaagtgca gatttcttac atacatatat tatgcggcgg tgaagtgccg gcttttggtg 5580
tacccatcac ccaagtagtg aacacagcct ccaacaggta atttttcaac gctcacccca 5640
ctcccatcct cccatctagt ggcatattga aaatcaattt gtcttgtaaa attaaataat 5700
ccaattagga gggggatata ttctaaggaa attagtgcat gatgcacaca cacacacaca 5760
cacagaacac gtgtgtgcgc atgtgcacat gagagagagt gagagagaaa ctgggtcttg 5820
ctctgtcgcc caggctggat tgcagtggta aaatcacagc tcactgcagc ctcaaactcc 5880
caggctcagg agatcctcct acctcagcct cccgagtagc tgggattaca ggtggaaaca 5940
accatgccca gctagtattt tttttttttt ttgtattttt tatagagaca gggtcttgcc 6000
atgttgccca ggctggtctt gaactcctca gctcaagcaa tctacctacc ttagcctccc 6060
aaagtgctgg gattacacgc atgagccact gcgcccactc cgcattatta aatatagaac 6120
atttatttga ttcatcagtt aatattcttc ttaaaagtac tattttaatg tagcaagatt 6180
gctttccacc aaaaggtggg gtttccacgg tggggtttcc aaattattct caatggggtg 6240
aggatgtgtg ttatcacacc cccgagccat cagatgctgt cagaaagtga tcactctgaa 6300
gtctttgttt caaataagca cagggtttgg ataaagagac gcaattagga aaggaaaaag 6360
cagaaggctc gttccagacc tggatgagat cctaaaaagc agcagctttt gccagtaaag 6420
atccttgaaa tgattcaatt accctcaaag cactccttgt ctccaagaca atcactcata 6480
agcacaattc cattgaagcc aacgtaccat tttgtgattt tcgtttccac ctgaggctgt 6540
tcattcaata aactcacata aaagtgttta ttgccttgat ttccaaattc aggcgtattt 6600
cctggtaagt agagctactt gccttgcctt tatgagatta ccacctaact agatgtatgc 6660
ccagtaaaat ccaacataac gcatgccatg tactacatca cagaatgtgt gactcagttg 6720
ttgaaggaca cctgctttga aggaggggac attactacgg tcttcacacc aagcgccaag 6780
tactgccagg tagtctgcac ttaccaccca agatgtttac tcttcacttt cacggcggaa 6840
tcaccatctg aggatcccac ccgatggtaa atgcttatgt ttctacatcg aggagacaga 6900
tttttaaagg gagattgcta ttcttaacac atttccatct aacattttat aaaatttaac 6960
attaacaact ggaagataaa ttgtctttca gttgaaatat tgttacagaa agaagtgatg 7020
gtgtttacgc aatttagaaa agaataaata tgcctccaag tgtagacttt ccagcctctc 7080
ctatagtctc atattaatgg tatgtttctt ctgtttgtct caatttttac acttcttaaa 7140
catttcacac tttgcttttc tatcgattat taatttttgt cgtgcttctc aacaaactgg 7200
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agcaatatac aatatacaat acctatattt gtatacatgt ttaaccgttt gaaataattt 7380
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cgaaatttaa caagaattcc tttatattat ttcagttttc cctcaaatat aatttatagt 7500
aattaaccag aatcttacca agagtcactc actgcattgg gtggtttgtc aggtttaaaa 7560
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agcctttctg tagaattaag ttttcaacat ctttattatt gctacattca caggcattta 7680
tgtagcaccc agaacttata aaatttacta ttccagaacc tagagcaggg attggcaaat 7740
gtcttcttaa taacgcagag taaatatgtt aggctttgtg ggcaaaaccc acagtaaagc 7800
caaggatatt atttaagtat ttatgtcacc acttaaaatg taacaatttg aaaatataaa 7860
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caacaggtcc tagttgacac attcctgttt gttcctatta gaaaggagta ttacatgcag 7980
tctcttaagt gtagggatat tgaagtaaaa aacaaactca gaatcttgct aagaaaatat 8040
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tttaagatcc attattttaa aaacataaat tcctattcat taatatgtat tttttaaaaa 8160
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tgttctcaga atcaacaaat accagctgtg atgtacacat atcgccacat cggatgtggt 8340
tttaaggcta tgaaatgaaa cactgctatg tggaaataaa cccccttaat gaagttcttt 8400
cagtgtagag tataaactag tatacataca tgcctgccct ccaacacact gtaaaaacct 8460
ctttacctca tagaaagaca tatcttacta cctcacttcc catcatttat ttatattctt 8520
tctatttccc agcctaaaat cttaaatgaa agtctttttt tttttgagac agggtctcac 8580
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caagaataag aattttgcag attaatataa cgaaagacct ctgaggaaag gtgggtgaaa 9120
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catttctata atagtactcc tagttttctt catgaaaaat acacttaaag cctaatttgg 9540
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ggtatgattg tcagtgccct tcccagtcta aaaaatgtta cagtctaaca gaataaaaat 9720
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taaggattta aaaattatct gatctctaat aaccaaatct gtgttctcat ctttaaaaat 9900
ttactaggga aatagattat taatttgtat attcagaaat atttgagatg atttagattt 9960
tcatagtaaa ctgcatttat ctggaatcaa cagaaaagtg aaaaacattc aaattactaa 10020
tacttgcgtt ttaacattgg attttaacat tctgctctcc acattcacaa agaggagtga 10080
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ttgtgacatg attttttttt ctttcttttc ctttggctat gtacccagta gtgggattgc 12540
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gtttataccg ttttgtttcc aactgcaggg gcaagtgtta cttaaagctt tcttcaaacg 15600
gatctccaac taaaatactt cacgggagag gaggcatctc tggatacaca ttaaggttgt 15660
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cgaaaaatct taggataaaa tcactttttt ctacctaaat gtccatcatt ggcagaaaat 20640
attagtaata attaaacagc cacacacttc acaatgtctg ggaattattt ttagtaaagg 20700
aaatttcttt ccctctgttg tttgctcctt agggtagagt cacctaagat tttgcgtgtc 20760
tacagtggca ttttaaatca atctgaaata aaagaggaca catctttctt tggggttcaa 20820
gaaataataa tccatgatca gtataaaatg gcagaaagcg ggtatgatat tgccttgttg 20880
aaactggaaa ccacagtgaa ttacacaggt acggagaatt ttatccggaa agttgtctcc 20940
aatggtgaac tggataaaat gtttaacact actagactta cggcctgacc ctgccaatct 21000
ctccatgcgt tatcatcatg aaagggagag ggcctggaat gctagtcatt cactctgcta 21060
aggctgacac actttcctgg ctattgaaac ttattttggg aatgtgggta aagagatacg 21120
ttttcctgag tcttcttcag gtgcatagaa tgacataatt tcataatact ttggaatagt 21180
aaagataatt tagtctaaag ataatttatt aaagataatt tagggatgaa ggattgaagg 21240
ttagaacaat taagcaactt gtgcaggatc aaagtgagtt ggatgaggag ttagcggtga 21300
gggtgaggct tgtctctctc tcgccctctc atcctggcac atgtgcgata tcgtgctgaa 21360
cctgagggag gaaaatacac gacaacaagg caaaaaatga atatagtaaa caaagaaaac 21420
acagataatg tacagtggaa gaagagtctc ttctggaaaa gaggatatat tttgcgtctc 21480
atatttaaac cacgattttt taaatttaga ttctcaacga cccatatgcc tgccttccaa 21540
aggagataga aatgtaatat acactgattg ctgggtgact ggatgggggt acagaaaact 21600
aagaggtaaa aatgatgttg ttatatgtgc tccatcctag aaatgaagag cggaaccttt 21660
tctgccctgt caagtcatgt agctgaagca caactcgagt cacactactc agttgcagga 21720
agcggattaa taaagatgga gaggcaaaaa tcacccaagt gaggctggtg cctcatatgt 21780
ttgattggaa attttaaatg tgactaaatc tctttaaaga ctaattatat ttaatgaagt 21840
ttaatgtgaa gcctagcact tttcagtaaa tgttctagcc tgctatccaa ttactttctt 21900
gggaagtcat tccagttaga gtcataatta atttttgaac ttaattaaca ttaacaaaat 21960
ggtacacgca atagtgggaa taatgtcttc ttcatacttg taattataaa aggtctgtga 22020
agtaaatcta acattttttc cttctagatt tttatataga catgagtttt gtgttgttgt 22080
tgttttgaga tggactctcg ctctgtcgcc caggctggag tgcagtggca cgatctcggc 22140
tcactgttac ctccacctcc cgggttcaag tgattctcct gcctcagcct cccgagtagc 22200
tgggattata ggtacccaac caccacccca agctaatttt ttgtattttt agtagagacg 22260
gggtttcatc atgttagcca ggatggtctc aatctcctga cctcgtgatc cacctgcctc 22320
ggccttccaa agtgctggaa ttacaggcgt gagcccccac acccgtccat gatttttatt 22380
ttaaatatat gtggcccagc accactggtg gctcacgcct gtaatcccag cactttggga 22440
ggccaagatg ggtggatcac ttgaggtcag gagttcaaga ctggcctggc caacatggtg 22500
aaaccctgtc tctactaaaa atacaaaaat tagctgggca tggtggtgtg tgcctgtaat 22560
cccagctact cgggaggctg aggcaagata atcgcttgaa cttgggaggt ggaggtagca 22620
gtgagctgag attgcaccac tgcactccag cctgggcgac agaaagagac tccgtctcaa 22680
ttaaaaatat atatatatat atatttatat gtatgcatat atgtttatgt gtattgtgta 22740
tggttattct acaaacgaac caaaaaaatt tttttcagac aaaatacaaa atactctcca 22800
gaaagccaag atacccttag tgaccaacga agagtgccag aagagataca gaggacataa 22860
aataacccat aagatgatct gtgccggcta cagggaagga gggaaggacg cttgcaaggt 22920
aacagagtgt tcttagccaa tggaatatat gcaaattgga atgcttaatg cgttggggtt 22980
tttttgtttg ttttgttttt tttgtttgtt tttttttgag acagagtctc gctctgttgc 23040
ccaggctgga gtgcagtggc tcgatctcag ctcactgcaa gctctgcctc ccaggttcac 23100
gccattctcc tgcctcagcc tcccaaatag ctgggactac aggcgccagc taccaagccc 23160
agctagcgtc tttttttttt ttagttttag tagagacggg gtttcaccat gttggccagg 23220
atggtctcga tctcctgacc tcatgatctg cctgcctggg cctcccaaag tgctgggatt 23280
acaggcgtga gccaccgcgc cgggccgctt aatgcatttt aaaaagcagt cttctgccaa 23340
tgagcaggga acacagtgta tttgtttgac ttagactgaa atcaaaagca aggagattga 23400
ctggatgaac gcaagcaccc aggttctctg cagtatatta aggggccaag acaacatttt 23460
aggcaaaatc agcctgagca agatgtgctg aagatgggaa gcgtctgagt tgatctgtgc 23520
accttttctt gtctcccctc gttctaggga gattcgggag gccctctgtc ctgcaaacac 23580
aatgaggtct ggcatctggt aggcatcacg agctggggcg aaggctgtgc tcaaagggag 23640
cggccaggtg tttacaccaa cgtggtcgag tacgtggact ggattctgga gaaaactcaa 23700
gcagtgtgaa tgggttccca ggggccattg gagtccctga aggacccagg atttgctggg 23760
agagggtgtt gagttcactg tgccagcatg cttcctccac agtaacacgc tgaaggggct 23820
tggtgtttgt aagaaaatgc tagaagaaaa caaactgtca caagttgtta tgtccaaaac 23880
tcccgttcta tgatcgttgt agtttgtttg agcattcagt ctctttgttt ttgatcacgc 23940
ttctatggag tccaagaatt accataaggc aatatttctg aagattacta tataggcaga 24000
tatagcagaa aataaccaag tagtggcagt ggggatcagg cagaagaact ggtaaaagaa 24060
gccaccataa atagatttgt tcgatgaaag atgaaaactg gaagaaagga gaacaaagac 24120
agtcttcacc attttgcagg aatctacact ctgcctatgt gaacacattt cttttgtaaa 24180
gaaagaaatt gattgcattt aatggcagat tttcagaata gtcaggaatt cttgtcattt 24240
ccattttaaa atatatatta aaaaaaatca gttcgagtag acacgagcta agagtgaatg 24300
tgaagataac agaatttctg tgtggaagag gattacaagc agcaatttac ctggaagtga 24360
taccttaggg gcaatcttga agatacactt tcctgaaaaa tgatttgtga tggattgtat 24420
atttatttaa aatatcttgg gaggggaggc tgatggagat agggagcatg ctcaaacctc 24480
cctaagacaa gctgctgctg tgactatggg ctcccaaaga gctagatcgt atatttattt 24540
gacaaaaatc accatagact gcatccatac tacagagaaa aaacaattag ggcgcaaatg 24600
gatagttaca gtaaagtctt cagcaagcag ctgcctgtat tctaagcact gggattttct 24660
gtttcgtgca aatatttatc tcattattgt tgtgatctag ttcaataacc tagaatttga 24720
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tttttttttt tttttgagat gaagtctcac cctgttgccc aagctggagt gcagtggtgt 24840
gatctcggct cactgtaaac tctacctcct ggattcaagc gattgtcctg cctcagtctc 24900
ccaagtagct gagattacag gcacatgcca ccatgcccgg ctaatttttg tatttttagt 24960
agagacgggg tttcactatg ttggccaggc tggtcttgaa ctcctgacct cgtgatctgc 25020
ccacctcggc ctctcaaagt gctgggatta caggtgtgag tcactgcgtc tggccatgga 25080
aaatatttat tgagcacaat tatgtgagag catcatgctg agctttgaag atacagtggt 25140
gagcaaacat atatcctggc ttcatgaaga ttatactcta gttaacatga gcaacaaaat 25200
aaaataatca cacaaaatat ataggttcaa gctgaaatga gtggctgcac cagattctat 25260
gagataagaa aggaagaagg acatttttca ccaagttcaa agactgggat acaaaggaat 25320
ttgtcctgac aaaggcaaaa caaaaacaac aacaaacaaa aaacccaaaa gagcaaaatg 25380
acagtagaac ataacggggc cagatcaaaa atgctgacag gttcccaaaa gaataaaatg 25440
acggtaggac atgacggggc cagatccaaa atgctgacag gttcaaacaa aattggaatt 25500
gaaaatcaga gtgcgttcaa gagtatcaaa caatactatc ttgttacttg cttattacct 25560
tagtagactg gaagcaacac ttcacacaaa aaaagggttt ggatgtaatt tcggataaga 25620
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tgtttttagt atttcacttt gtataatgtc ttaatttttg aagagctggt atattcctat 25740
gattcattaa tgaaagttct ataagatata aaatatacaa tgaggagatc tcctcttctg 25800
taccagaaga gtgcacattc tacacactgc gtagcacctt tctcacttac gttctgtctg 25860
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ccgagagagc ttcctctatc ttgggttatt tctgatgcgt agagaagggc tgcctctgtc 25980
cattatggaa ggctggtgtt c 26001
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
cagcctggag catcgtaaca 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
tttatcgagc ttcgttattc tggtt 25
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 5
ttgtctactg aagcacaccc aaacaggga 29
<210> 6
<211> 2246
<212> DNA
<213> 小鼠属
<400> 6
ggataccggc tcacgtagaa aaaggacaag actataggaa agaaagcaaa cactccgccg 60
aggactacag caaagacaga aagtatctgc aggatgacct cattacatca ggtgttatat 120
tttatctttt ttgcctcagt ttctagtgaa tgcgttacta aggtcttcaa agacatcagc 180
tttcaaggag gtgacctgag tactgttttc acaccgagcg ccacatactg ccgcttggtc 240
tgcactcacc acccacggtg cttgctcttc acgttcatgg ctgagtcatc ttcggatgat 300
cctaccaaat ggtttgcctg catcctgaag gacagcgtca cagaaatatt gccaatggta 360
aacatgacag gcgcgatctc tggatattcc ttcaagcaat gccctcagca attaagtact 420
tgcagcaaag atgtgtacgt gaacctagac atgaagggca tgaactataa cagctctgtc 480
gtgaagaatg ctcgagaatg ccaggagaga tgcacagacg atgcccactg ccagtttttc 540
acatacgcaa cagggtattt tcccagtgtg gaccatcgta aaatgtgtct tttgaagtac 600
acccgaacgg ggacgccaac cacaataacg aagctcaatg gcgtggtatc tggattttca 660
ctgaagtcct gtggactttc aaacttggct tgtatcaggg acattttccc taacacggtg 720
ctggcagacc ttaacattga cagcgtggtg gccccagatg cttttgtctg tcgtcgcatc 780
tgcacgcatc accccacttg tttgttcttc acattctttt cccaagcatg gccgaaagaa 840
tctcagagac atctttgtct ccttaaaacc tctgaaagtg gattaccaag cacacgcatt 900
acaaagagcc acgccctttc gggcttcagt ctccagcact gcaggcacag tgtcccagta 960
ttctgccatc cgtcctttta caacgacact gatttcttgg gagaagagct ggacatcgtc 1020
gatgtgaaag gccaagaaac ctgtcagaaa acgtgtacca ataacgcccg ctgccagttc 1080
tttacctact atccatcgca cagactgtgc aatgagagga accgcagggg cagatgttac 1140
ctaaagcttt cctccaatgg atctccaacg agaatacttc atgggagggg aggcatctct 1200
ggatactcac tgaggctgtg caaaatggat aatgtgtgca caactaaaat caaccccaga 1260
gtggtaggag gagctgcgtc tgttcacggt gagtggccat ggcaggtgac tctgcacatc 1320
agccagggac acctgtgtgg aggctccatc attggaaacc aatggatact gacagcagct 1380
cattgtttct ctgggataga gacacctaaa aagctgcgtg tctacggtgg cattgtaaat 1440
caatcagaaa taaatgaagg gactgctttc ttcagggttc aagaaatgat aattcatgat 1500
cagtatacga cagcagaaag tgggtatgat attgccctgt taaaactgga atcagccatg 1560
aattacacag attttcagcg gccaatatgc ctgccttcca aaggagatag aaacgcagtg 1620
cacacagaat gctgggtgac tggatggggg tacacagcac taagaggtga agtacaaagt 1680
actcttcaga aagccaaggt tccattggtg tcaaatgaag aatgtcagac aagatacaga 1740
agacacaaaa taaccaataa gatgatctgt gcaggctaca aagaaggagg gaaggatacg 1800
tgcaagggag attctggagg gcccctgtcc tgcaaataca atggggtctg gcacttggtg 1860
ggcatcacaa gctggggtga aggctgtggt cagaaggaga gaccgggggt ctacacgaac 1920
gtggccaagt acgtggactg gattctggag aaaactcaaa cagtctgaaa gagttcaact 1980
ggtatcactt tgtggccctg gaagattatt ccatagaaat gagcttgacg tctctgatga 2040
agacactggg atactgactc ttccactgta accaattgaa tggccttgat gtacgtaaga 2100
acacccagaa agaaaactat tattttcaga attcctgatc tgggagaacc actggttgtt 2160
ttctgcatcc agctactact caaggaaaca aatacagcaa ggagatttta aaaataaaaa 2220
cacatcagat atataaggaa aatatc 2246
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
acatgacagg cgcgatctct 20
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
tctaggttca cgtacacatc tttgc 25
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 9
ttccttcaag caatgccctc agcaat 26
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 10
tcctggcatt ctcgagcatt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 11
tggtaatcca ctttcagagg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 12
aaggacctac actatggaat 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 13
cctctgaaag tggattacca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 14
tcggaagcga ctcttatatg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 15
ttcaaacaag tgacatacac 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 16
tgagagaatt gcttgctttc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 17
aaatatacct tgagagaatt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 18
agtatgtcag aaatatacct 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 19
ttaaaatctt agtatgtcag 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 20
cagcatattt gtgaaagtcg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 21
tgtgtaggaa atggtcactt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 22
tgcaattctt aataagggtg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 23
aaatcatcct gaaaagacct 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 24
tgatataaga aaatcatcct 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 25
acacattcac cagaaactga 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 26
ttcaggacac aagtaaacca 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 27
ttcactcttg gcagtgtttc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 28
aagaataccc agaaatcgct 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 29
cattgcttga aagaataccc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 30
ttggtgtgag cattgcttga 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 31
aatgtctttg ttgcaagcgc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 32
ttcatgtcta ggtccacata 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 33
gtttatgccc ttcatgtcta 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 34
ccgtgcatct ttcttggcat 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 35
cgtgaaaaag tggcagtgga 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 36
agacaaatgt tacgatgctc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 37
gtgcttcagt agacaaatgt 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 38
tgcacaggat ttcagtgaaa 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 39
gattagaaag tgcacaggat 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 40
ccgggatgat gagtgcagat 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 41
aaacaagcaa ccgggatgat 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 42
tcctgggaaa agaaggtaaa 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 43
attctttggg ccattcctgg 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 44
aaagatttct ttgagattct 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 45
aatccactct cagatgtttt 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 46
aaccagaaag agctttgctc 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 47
ggcagaacac tgggatgctg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 48
tggtaaaatg aagaatggca 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 49
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<223> 合成的寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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gcagagtgta gattcctgca 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 132
atcatttttc aggaaagtgt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<212> DNA
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atacctagta caatgtaaat 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 137
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 138
tgggaaagct ttcaatattc 20
<210> 139
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 139
atggaattgt gcttatgagt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 140
tttcaagctc aggatgggaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 141
gttggtaaaa tgcaaccaaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 142
tcaggacaca agtaaacctg 20
<210> 143
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 143
tgcaagctgg aaataaaagc 20
<210> 144
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 144
tgccaattta aaagtgtagc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 145
atatttcaaa atccagtatg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 146
ttctgaatat acaaattaat 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 147
tttactatga aaatctaaat 20
<210> 148
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 148
ggtatcctga gtgagatcta 20
<210> 149
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 149
ccagctatca ggaaaattcc 20
<210> 150
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 150
aaagctattg gagactcaga 20
<210> 151
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 151
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<210> 152
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 152
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 153
gctctgagag ttccaattca 20
<210> 154
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 154
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 170
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 171
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 172
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 174
cataaatgtc tttgttgcaa 20
<210> 175
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 187
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<210> 188
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 188
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 199
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 200
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<210> 202
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<212> DNA
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<220>
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<400> 202
caaccgggat gatgagtgca 20
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 204
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 205
agattctttg ggccattcct 20
<210> 206
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 206
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 207
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<212> DNA
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<220>
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<400> 208
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<212> DNA
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<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 210
tctttgagat tctttgggcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 211
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 212
tttctttgag attctttggg 20
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<212> DNA
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<220>
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cacagtttct ggcaggcctc 20
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<212> DNA
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<220>
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<400> 214
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 215
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<212> DNA
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<220>
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<400> 216
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 217
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<400> 219
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<210> 220
<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<400> 220
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 221
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<400> 222
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<212> DNA
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<220>
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<400> 224
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 225
cggacggcat tggtgcacag 20
<210> 226
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 226
gcggacggca ttggtgcaca 20
<210> 227
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 227
agcggacggc attggtgcac 20
<210> 228
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 228
cagcggacgg cattggtgca 20
<210> 229
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 229
ggcagcggac ggcattggtg 20
<210> 230
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 230
tggcagcgga cggcattggt 20
<210> 231
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 231
ctggcagcgg acggcattgg 20
<210> 232
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 232
actggcagcg gacggcattg 20
<210> 233
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 233
tgcttgaagg aatatccaga 20
<210> 234
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 234
tagttcatgc ccttcatgtc 20
<210> 235
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 235
tgttatagtt catgcccttc 20
<210> 236
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 236
aatgtccctg atacaagcca 20
<210> 237
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 237
gggaaaatgt ccctgataca 20
<210> 238
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 238
tgtgcagagt cacctgccat 20
<210> 239
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 239
ttcttgaacc ctgaagaaag 20
<210> 240
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 240
tgaattatca tttcttgaac 20
<210> 241
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 241
tgatcatgaa ttatcatttc 20
<210> 242
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 242
agtttctggc aggcctcg 18
<210> 243
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 243
cagtttctgg caggcctc 18
<210> 244
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 244
acagtttctg gcaggcct 18
<210> 245
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 245
cacagtttct ggcaggcc 18
<210> 246
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 246
gcacagtttc tggcaggc 18
<210> 247
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 247
gtgcacagtt tctggcag 18
<210> 248
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 248
ggtgcacagt ttctggca 18
<210> 249
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 249
tggtgcacag tttctggc 18
<210> 250
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 250
ttggtgcaca gtttctgg 18
<210> 251
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 251
attggtgcac agtttctg 18
<210> 252
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 252
cattggtgca cagtttct 18
<210> 253
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 253
gcattggtgc acagtttc 18
<210> 254
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 254
ggcattggtg cacagttt 18
<210> 255
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 255
cggcattggt gcacagtt 18
<210> 256
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 256
acggcattgg tgcacagt 18
<210> 257
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 257
gacggcattg gtgcacag 18
<210> 258
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 258
ggacggcatt ggtgcaca 18
<210> 259
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 259
cggacggcat tggtgcac 18
<210> 260
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 260
gcggacggca ttggtgca 18
<210> 261
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 261
agcggacggc attggtgc 18
<210> 262
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 262
cagcggacgg cattggtg 18
<210> 263
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 263
gcagcggacg gcattggt 18
<210> 264
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 264
ggcagcggac ggcattgg 18
<210> 265
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 265
tggcagcgga cggcattg 18
<210> 266
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 266
ctggcagcgg acggcatt 18
<210> 267
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 267
tgcacagttt ctggcagg 18
<210> 268
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 268
cacagtttct ggcagg 16
<210> 269
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 269
acagtttctg gcag 14
<210> 270
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 270
gcgtttgctc ttcttcttgc gtttttt 27
<210> 271
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 271
acacgcatta aaaagagcaa agc 23
<210> 272
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 272
cagtgtcatg gtaaaatgaa gaatgg 26
<210> 273
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 273
tgcaggcaca gcatcccagt gttct 25
<210> 274
<211> 3275
<212> DNA
<213> 猕猴属
<220>
<221> 混杂特征
<222> (1)...(3275)
<223> n = A,T,C or G
<400> 274
aggcacacag acaaaatcaa gctctacagc tgtctgtgtg tatgtcactt gtttgaatat 60
gaattaaaat taaaatataa attcaatgta ttgagaaagc aagcaattct ctcaaggtat 120
atttctgaca tactaagatt ttaacgactt tcacaaatat gctgcaccga gagacaatgt 180
tacacaacac tgagaaccag tacaagtaaa tattaaagtt aagtgaccat ttcctacaca 240
cgctcattca gaggaggatg aggatcaatt tggaagaaga aaaacaccct tattaagaat 300
tgcagcaaat aagcaaacga ggtcttttca ggatgatttt cttatatcaa atggtacatt 360
tcattctatt tacgtcagtt tctggtgaat gtgtgactcg gttgttcaag gacatccact 420
ttgaaggagg ggacattgct acggttttca caccaagcgc caagcactgc caggtggtct 480
gcactcacca cccacgatgt ctgctcttca ctttcacggg ggaatctgca tctgaggatc 540
ctacccagtg gtttacttgt gtcctgaagg acagtgttac agaaacactg ccaagagtga 600
ataggacagg agcgatttct gggtattctt tcaagcaatg ctcacaccaa ataagcgctt 660
gcaacaaaga catttatgtg gacctagaca tgaagggcat aaactataac agctcacttg 720
ccaagagtgc tcaagaatgc caagaaagat gcacggatga catccactgc cactttttca 780
cgtatgccac aaggcagttt cccagtctgg agcatcgtaa catttgtcta ctgaagcaca 840
cccaaacggg gacaccaacc ggaataatga agctcgataa agtggtgact ggattttcac 900
tgaaatcctg tgcactttct aatctggctt gtatcaggga cgttttcccc aacacggtgt 960
ttgcggacag caacatcgat agtgtcatgg ctccagatgc ctttgtctgt cgccggatct 1020
gcactcatca tcccggttgc ttgtttttta ccttcttttc ccaggaatgg cccaaagaat 1080
ctcaaagaaa tctttgtctc cttaaaacat ctgagagtgg attacccagt acacgcatta 1140
aaaagagcaa agctctttct ggtttcagtc tccaaagctg caggcacagc atcccagtgt 1200
tctgccattc ttcattttac catgacactg atttcttggg agaagaactg gatattgttg 1260
ctgtgaaagg tcacgaggcc tgccagaaac tgtgcaccaa tgccgtccgc tgccagtttt 1320
ttacctatgc cccagctcaa gcatcttgca acgaagggaa gggcaaatgt tacttaaagc 1380
tttcttcaaa tggatctcca actaaaatac ttcgcgggac aggaggcatc tctggataca 1440
cattaaggct gtgtaaaatg gataatgagt gtaccaccaa aatcaagccc aggatcgttg 1500
gaggaactgc atctgttcgt ggtgagtggc catggcaggt gactctgcac accacctcac 1560
ccactcagag acacctgtgt ggaggctcca tcattggaaa ccagtggata ttaacggccg 1620
ctcactgttt ctatggggta gagtcaccta agattttgcg tgtctacatt ggcattttaa 1680
atcaatctga aataaaagag gatacatctt tctttggggt tcaagaaata ataatccatg 1740
atcaatataa aatggcagaa agtgggtatg atattgcctt gttgaaactg gaaaccacag 1800
tgaattacac agattctcaa cgacccatat gcctgccttc aaaaggagat agaaatgtga 1860
tatacactga ctgctgggtg actggatggg ggtacagaaa attaagagac aaaatacaga 1920
atactctcca gaaagccaag atacccttag tgaccaatga cgagtgccag aagagataca 1980
gaggacataa aataacccat aagatgatct gtgccggcta cagggaagga gggaaggatg 2040
cttgcaagnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 2100
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 2160
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 2220
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 2280
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnggc ttggtgctgg taggaaaatg 2340
ccagaagaaa acaaactgtc acaagctgtt atgtccaaag ctcccgttct atgatcattg 2400
tagtttgttt cagcatccag tgtctttgtt tctgatcacg cttctaagga gtccaagaat 2460
taccataagg caatatttct gatgattact atataggcag atatatcaga aaataaccaa 2520
gtagtggcag cagggatcag gtagaagaac tgataaaaga aaccaccata aatagatttg 2580
ttcaatgaaa aatgaaaact ggaagaaagg ataacaaaga cagtcttcac cattttgcag 2640
gaatctacac tctgcctgtg tgaacacatt tctttgtaaa gaaagaattt gattgcattt 2700
actggcagat tttcagaata gtcaggaatt catgttattt ccattttaaa acatgtttaa 2760
aaaaatcagt ttgagtagac acaagctaag agtgaatgtg aaggtaccag aatttctgta 2820
tggaagaggg tgacaagcag caatgtacct ggaagtggta ccttaggacc aatcttaaag 2880
atacactttc ctgaaaaatg atttgtgatg gatcgtatat ttatttaaaa tatcttggga 2940
gggagaggct gatggcgata gggaggcaag ctgaagcctc cataagacaa gctgctactg 3000
cgactgtggc ccccaaagag ctacaccgca tatttatttg acaaaagtca ccattgacta 3060
catccgtact acagagaaaa aacaatttgg gcacaaatgg atggttacag taaagtcttc 3120
agcaagcagc tccctgtatt ctaagtactg ggcttttctg tttggtgcaa atatttatct 3180
cattattgct gtgatctagt ccagtaacct agaatttgat ttgtcaccac atagctttca 3240
acctgtgcca acaattatac aattcatcaa gtgtg 3275

Claims (10)

1.一种化合物，包含由12至30个连接的核苷组成的修饰寡核苷酸，并且所述修饰寡核苷酸包含包括SEQ ID NO：223的至少12个连续核苷碱基的核苷碱基序列。
2.如权利要求1所述的化合物，由单链修饰寡核苷酸构成。
3.如权利要求2所述的化合物，其中，所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：1的核苷碱基序列100％互补。
4.如权利要求2所述的化合物，其中，至少一个核苷内连接是修饰的核苷内连接。
5.如权利要求4所述的化合物，其中，每一个核苷内连接是磷硫酰核苷内连接。
6.如权利要求1所述的化合物，其中，至少一个核苷包含修饰糖。
7.如权利要求6所述的化合物，其中，至少一个修饰糖是双环糖。
8.如权利要求7所述的化合物，其中，所述至少一个双环糖的每一个包含4’-(CH2)n-O-2’桥联，其中n为1或2。
9.如权利要求7所述的化合物，其中，所述至少一个双环糖的每一个包含4’-CH(CH3)-O-2’桥联。
10.如权利要求6所述的化合物，其中，至少一个修饰糖包含2’-O-甲氧乙基基团。
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