CN106459972B - 用于调节sod-1表达的组合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于降低SOD‑1 mRNA和蛋白质表达的反义化合物和方法。此类方法、化合物和组合物适用于治疗、预防或改善SOD‑1相关疾病、病症和病状。此类SOD‑1相关的疾病包括肌萎缩性硬化(ALS)。

Description

用于调节SOD-1表达的组合物
序列表
本申请连同序列表一起以电子格式提交。序列表提供为在2015年3月30日创建的名称为BIOL0240WOSEQ_ST25.pdf的文件，所述文件的大小为320Kb。电子格式的序列表中的信息以引用的方式整体并入本文。
领域
提供用于降低动物中可溶的超氧化物歧化酶1(SOD-1)mRNA和蛋白质的表达的组合物和方法。此类方法适用于通过抑制动物中SOD-1的表达来治疗、预防或改善神经退行性疾病，包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
背景
可溶的SOD-1酶(也称为Cu/Zn超氧化物歧化酶)是通过催化超氧化物歧化为过氧化氢(H2O2)提供针对生物分子的氧化损伤的防御的超氧化物歧化酶之一(Fridovich,Annu.Rev.Biochem.,1995,64,97-112)。超氧阴离子(O2-)是主要由线粒体中氧化磷酸化的错误产生的潜在的有害细胞副产物(Turrens,J.Physiol.2003,552,335-344)。
SOD-1基因突变与肌萎缩性侧索硬化(ALS，也称作卢伽雷氏病(Lou Gehrig’sdisease))的显性遗传形式有关，是特征为上下运动神经元的选择性退化的病症(Rowland,N.Engl.J.Med.2001,344,1688-1700)。在家族性ALS和SOD1基因的错义突变之间有紧密的遗传连锁(Rosen,Nature,1993,362,59-62)。据信突变SOD1的毒性是从减少免受活性酶的核保护(在细胞核中的功能损失)的初始错误折叠(功能增加)中产生，是可能涉及ALS的发病机制的过程(Sau,Hum.Mol.Genet.2007,16,1604-1618)。
ALS是在任何给定时间影响多达三万美国人的破坏性的进行性神经退行性疾病。ALS中运动神经元的进行性退化，最终导致死亡。当运动神经元死亡时，大脑发起和控制肌肉运动的能力丧失。随着自主肌肉动作逐渐受到影响，患者在疾病的后期阶段可能变成完全瘫痪。
目前缺乏的是用于治疗此类神经退行性疾病的可以接受的选择。因此本文的目的在于提供用于治疗此类疾病的方法。
概述
本文提供用于调节可溶的超氧化物歧化酶1(SOD-1)mRNA和蛋白质的表达的方法、化合物和组合物。在某些实施方案中，可用于调节SOD-1 mRNA和蛋白质的表达的化合物为反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物为修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，可在细胞或组织中进行调节。在某些实施方案中，细胞或组织处于动物体内。在某些实施方案中，动物为人。在某些实施方案中，SOD-1 mRNA水平降低。在某些实施方案中，SOD-1蛋白质水平降低。此类降低可以时间依赖性方式或以剂量依赖性方式出现。
还提供适用于预防、治疗和改善疾病、病症和病状的方法、化合物和组合物。在某些实施方案中，此类SOD-1相关疾病、病症和病状为神经退行性疾病。在某些实施方案中，此类神经退行性疾病、病症和病状包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
此类疾病、病症和病状可共同具有一个或多个风险因素、成因或结果。产生ALS的某些风险因素和成因包括逐渐变老、有个人或家族病史或遗传易感性。然而，大多数的ALS病例是散发性的，并且已知没有已知的危险因素。与ALS的产生相关的某些症状和结果包括但不限于：肌束震颤、绞痛、紧张和僵硬的肌肉(痉挛)、影响手臂或腿的肌无力、口齿不清和鼻腔讲话、行走困难、咀嚼或吞咽困难(吞咽困难)、说话或形成语句困难(构音困难)、无力或萎缩、痉挛、过度反射(反射亢进)和巴彬斯奇征(Babinski’s sign)的出现。随着ALS进展，包括其他肢体的无力的症状和结果，可能伴有颤搐、肌肉绞痛和过度和更快的反射，可能出现咀嚼、吞咽、呼吸和流涎的问题，最终瘫痪和死亡。
在某些实施方案中，治疗方法包括向有需要的个体施用SOD-1反义化合物。在某些实施方案中，治疗方法包括向有需要的个体施用SOD-1修饰寡核苷酸。
详述
应理解，以上概述和以下详述二者都仅为示例性和解释性的，并且不限制要求保护的本发明。在本文中，除非另外确切说明，否则单数的使用包括复数。如本文所使用，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。除非另外说明，否则本文所用的“和”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。另外，除非另外确切说明，否则术语如“元件”或“组分”既涵盖包含一个单元的元件和组分，又涵盖包含多于一个子单元的元件和组分。另外，除非另外说明，否则本文描述的所有序列从5’至3’列出。
本文所用的章节标题仅出于组织目的，并且不应解释为限制所述主题。本公开中引用的所有文件或文件部分，包括但不限于专利、专利申请、公开的专利申请、文章、书籍、论文和GENBANK登录号和可通过数据库如国家生物技术信息中心(NCBI)获得的相关序列信息和在本公开通篇所涉及的其他数据针对本文中所论述的文件部分以及其全部内容以引用的方式在此明确并入。
定义
除非提供具体定义，否则关于本文所述的分析化学、合成有机化学和医学和药物化学所用的命名以及本文所述的分析化学、合成有机化学和医学和药物化学的工序和技术为本领域中熟知且常用的。标准技术可用于化学合成和化学分析。
除非另外指出，否则以下术语具有以下含义：
“2'-脱氧核苷”(又为2'-脱氧核糖核苷)意指包含2'-H呋喃糖部分的核苷，如在天然存在的脱氧核糖核苷(DNA)中发现。在某些实施方案中，2’-脱氧核苷可包含修饰的核碱基或可包含RNA核碱基(例如，尿嘧啶)。
“2’-脱氧核糖”意指2'-H呋喃糖部分，如在天然存在的脱氧核糖核苷(DNA)中发现。
“2’-O-甲氧基乙基”(又为2’-MOE和2’-OCH2CH2-OCH3和MOE和2’-O-甲氧基乙基核糖)是指呋喃糖环的2'位的O-甲氧基-乙基修饰。2’-O-甲氧基乙基核糖修饰的糖为修饰的糖。
“2’-O-甲氧基乙基核糖修饰核苷”(又为2'-MOE核苷)意指包含2'-MOE修饰的糖部分的核苷。
“2'-取代的核苷”意指在呋喃糖环的2'位上包含除H或OH以外的取代基的核苷。在某些实施方案中，2'-取代的核苷包括具有双环糖修饰的核苷。
“5-甲基胞嘧啶”意指用连接至5位的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是修饰的核碱基。
“约”意指在值的±10％以内。例如，如果指出“化合物影响SOD-1至少约50％的抑制”，那么表示45％至55％范围内的SOD-1水平被抑制。“伴随施用”是指在相同时间以任何方式对两种药剂同时施用，其中两种药剂的药理作用均在患者中显现。伴随施用不需要在单一药物组合物中、以相同剂型或通过相同施用途经对两种药剂进行施用。两种药剂的作用不需要在相同时间显现。所述作用仅需要重叠一段时间但不需要同延。
“施用”意指向动物提供药剂，且包括但不限于由医学专业人员施用和自行施用。
“改善”是指减轻、减缓、停止或逆转病状或疾病严重性的至少一个指标。指标的严重性可通过本领域的技术人员已知的主观或客观度量来确定。
“动物”是指人类或非人类动物，包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、狗、猫、猪，和非人灵长类，包括但不限于猴子和猩猩。
“抗体”是指特征在于与抗原以某种方式特异性反应的分子，其中抗体与抗原各自利用另一者来定义。抗体可指的是完全抗体分子或其任何片段或区域，如重链、轻链、Fab区和Fc区。
“反义活性”意指可归因于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何可检测或可测量的活性。在某些实施方案中，反义活性为靶核酸或由此靶核酸所编码的蛋白质的量或表达的减少。
“反义化合物”意指能够经历通过氢键合与靶核酸进行杂交的低聚化合物。反义化合物的实例包括单链和双链化合物，诸如反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、ssRNA和占位型化合物。
“反义抑制”意指在不存在与靶核酸互补的反义化合物的情况下的靶核酸水平相比，在存在反义化合物的情况下靶核酸水平的降低。
“反义机制”为所有涉及化合物与靶核酸的杂交的机制，其中杂交的结果或效果为靶降解或靶占位，伴随阻碍涉及例如转录或剪接的细胞机构。
“反义寡核苷酸”意指具有允许与靶核酸的对应片段杂交的核碱基序列的单链寡核苷酸。
“碱基互补性”是指寡核苷酸的核碱基与靶核酸中的相应核碱基进行准确碱基配对(即杂交)的能力，且由相应核碱基之间的沃森-克里克(Watson-Crick)、霍氏(Hoogsteen)或反霍氏氢键结合介导。
“双环糖”意指由两个原子桥连修饰的呋喃糖环。双环糖是修饰的糖。
“双环核酸”或“BNA”是指其中核苷或核苷酸的呋喃糖部分包括连接呋喃糖环上的两个碳原子的桥联从而形成双环系统的核苷或核苷酸。
“帽结构”或“端帽部分”意指已在反义化合物的任一末端并入的化学修饰。
“cEt”或“限制性乙基”或“cEt修饰糖”意指具有包含连接4'-碳与2'-碳的桥的双环糖部分的双环核苷，其中所述桥具有下式：4’-CH(CH3)-O-2’。cEt修饰糖为修饰的糖。
“cEt修饰核苷”意指具有包含连接4'-碳与2'-碳的桥的双环糖部分的双环核苷，其中所述桥具有下式：4’-CH(CH3)-O-2’。cEt修饰糖为修饰的糖。
“化学上不同的区域”是指以某种方式化学上不同于同一反义化合物的另一区域的反义化合物的区域。例如，具有2’-O-甲氧基乙基核苷的区化学上不同于具有无2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷的区。
“嵌合反义化合物”意指具有至少2个化学上不同的区的反义化合物，每一位置具有多个亚单位。
“共同施用”意指向个体施用两种或更多种药剂。两种或更多种药剂可在单个药物组合物中，或可在单独的药物组合物中。所述两种或更多种药剂可各自经由相同或不同的施用途径来施用。共同施用包括平行或相继施用。
“互补性”意指第一核酸与第二核酸的核碱基之间配对的能力。
“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应理解为意指包括所述步骤或要素或步骤或要素的群组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素的群组。
“连续核碱基”意指彼此紧邻的核碱基。
“设计”或“被设计来”是指设计与所选核酸分子特异性杂交的低聚化合物的方法。
“稀释剂”是指组合物中缺乏药理活性但在药学上是必需的或期望的成分。举例来说，在注射的药物中，稀释剂可为液体，例如生理盐水溶液。
“剂量”意指在单个施用中或在指定时间内提供的指定量的药剂。在某些实施方案中，剂量可以以一个、两个或更多个大丸剂、片剂或注射剂来施用。例如，在某些实施方案中，当期望皮下施用时，所需剂量需要不易由单次注射调节的体积，因此，两个或更多个注射可用于实现所需剂量。在某些实施方案中，药剂通过在延长的时段内或连续地输注来施用。剂量可被规定为每小时、每天、每周或每个月的药剂的量。
“有效量”在调节活性或治疗或预防病状的情况下意指向需要此调节、治疗或防治的受试者以单次剂量或一系列剂量的一部分形式施用有效调节所述效应，或治疗或防治或改善所述病状的药剂的量。有效量可在个体间变化，取决于待治疗个体的健康和身体条件、待治疗个体的分类群、组合物的制剂、个体的医疗条件的评价和其他相关因素。
“功效”意指产生所需效果的能力。
“表达”包括基因密码信息借以转化成细胞中存在且起作用的结构的所有功能。此结构包括但不限于转录和转译的产物。
“完全互补”或“100％互补”意指第一核酸的每个核碱基在第二核酸中皆具有互补核碱基。在某些实施方案中，第一核酸是反义化合物且靶核酸是第二核酸。
“缺口聚物(Gapmer)”意指其中具有多个支持RNA酶H裂解的核苷的内部区域位于具有一个或多个核苷的外部区域之间的嵌合反义化合物，其中包含内部区域的核苷化学上不同于包含外部区域的核苷。内部区域可称为“缺口区”且外部区域可称为“翼区”。
“缺口变窄的”意指具有定位于具有1至6个核苷的5’和3’翼区段之间且与所述5’和3’翼区段紧邻的9个或更少个连续2’-脱氧核糖核苷的缺口区段的嵌合反义化合物。
“缺口加宽的”意指具有定位于具有1至6个核苷的5’和3’翼区段之间且与所述5’和3’翼区段紧邻的12或更多个连续2’-脱氧核糖核苷的缺口区段的嵌合反义化合物。
“杂交”意指互补核酸分子的退火。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于反义化合物与靶核酸。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于寡核苷酸与核酸靶。
“鉴定患有SOD-1相关的疾病的动物”意指鉴定已被诊断为SOD-1相关的疾病的动物或鉴定易发展SOD-1相关的疾病的动物。易发展SOD-1相关的疾病的个体包括那些具有发展SOD-1相关的疾病的一种或多种风险因素的个体，所述风险因素包括逐渐变老、有个人或家族病史或一种或多种SOD-1相关的疾病的遗传易感性。此鉴定可通过包括评估个体的医疗史和标准临床测试或评估(诸如基因测试)的任何方法来实现。
“紧邻”意指在紧邻的要素之间没有插入要素。
“个体”意指选用于治疗或疗法的人或非人动物。
“抑制SOD-1”意指降低SOD-1 mRNA和/或蛋白质的水平或表达。在某些实施方案中，相较于在不存在SOD-1反义化合物(诸如修饰寡核苷酸)下SOD-1 mRNA和/或蛋白质的表达水平，SOD-1 mRNA和/或蛋白质的水平在靶向SOD-1的反义化合物(包括靶向SOD-1的修饰寡核苷酸)存在下得到抑制。
“抑制表达或活性”是指降低、阻断表达或活性且不一定指示完全消除表达或活性。
“核苷间键联”是指核苷之间的化学键。
“连接的核苷”意指由核苷间键联连接在一起的相邻核苷。
“错配”或“非互补核碱基”是指当第一核酸的核碱基不能与第二或靶核酸的对应核碱基配对的情况。
“混合主链”意指包括至少两个不同的核苷间键联的核苷间键联的形态。例如，具有混合主链的寡核苷酸可能包括至少一个磷酸二酯键联和至少一个硫代磷酸酯键联。
“修饰的核苷间键联”是指来自天然存在核苷间键(即，磷酸二酯核苷间键)的取代或任何变化。
“修饰的核碱基”意指任何除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶以外的核碱基。“未修饰的核碱基”意指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“修饰的核苷”意指独立地具有修饰的糖部分和/或修饰的核碱基的核苷。
“修饰的核苷酸”意指独立地具有修饰的糖部分、修饰的核苷间键联和/或修饰的核碱基的核苷酸。
“修饰寡核苷酸”意指包含至少一个修饰的核苷间键、修饰的糖和/或修饰的核碱基的寡核苷酸。
“修饰的糖”意指来自天然糖部分的取代和/或任何变化。
“单体”意指寡聚物的单个单元。单体包括但不限于天然存在或修饰的核苷和核苷酸。
“基序”意指反义化合物中未修饰的和修饰的核苷的型态。
“天然糖部分”意指见于DNA(2'-H)或RNA(2'-OH)中的糖部分。
“天然存在的核苷间键联”意指3'至5'磷酸二酯键联。
“非互补核碱基”是指一对彼此不形成氢键或以其他方式支持杂交的核碱基。
“核酸”是指由单体核苷酸组成的分子。核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)和微小RNA(miRNA)。
“核碱基”意指能够与另一核酸的碱基配对的杂环部分。
“核碱基互补性”是指能够与另一核碱基进行碱基配对的核碱基。例如，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)互补。例如，在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)互补。在某些实施方案中，互补核碱基是指反义化合物中能够与其靶核酸的核碱基进行碱基配对的核碱基。例如，如果反义化合物的某个位置上的核碱基能够与靶核酸的某个位置上的核碱基氢键合，那么寡核苷酸与靶核酸之间的氢键合的位置被认为在所述核碱基对上是互补的。
“核碱基序列”意指连续核碱基的次序，而与任何糖、键和/或核碱基修饰无关。
“核苷”意指连接至糖的核碱基。
“核苷模拟物”包括用于在低聚化合物的一个或多个位置处置换糖或糖和碱基且不一定要置换键联的那些结构：例如像具有吗啉代、环己烯基、环己基、四氢吡喃基、双环或三环糖模拟物例如非呋喃糖单元的核苷模拟物。核苷酸模拟物包括用于在低聚化合物的一个或多个位置处置换核苷和键联的那些结构，如肽核酸或N-吗啉基(由-N(H)-C(＝O)-O-或其他非磷酸二酯键连接的N-吗啉基)。糖替代物与稍微更广泛的术语核苷模拟物重叠，但仅意在指示置换糖单位(呋喃糖环)。本文提供的四氢吡喃基环说明糖替代物的一个实例，其中呋喃糖糖基已被四氢吡喃基环系统置换。“模拟物”是指替代糖、核碱基和/或核苷间键的基团。一般而言，使用模拟物替代糖或糖-核苷间键组合，且维持核碱基以便与所选靶杂交。
“核苷酸”意指具有共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。
“脱靶效应”是指与调节除预定靶核酸以外的基因的RNA或蛋白质表达有关的不必要或有害的生物效应。
“低聚化合物”或“寡聚物”意指具有连接的单体亚单位且能够与核酸分子的至少一个区杂交的聚合物。
“寡核苷酸”意指连接核苷的聚合物，每个核苷可被修饰或未修饰，彼此无关。
“肠胃外施用”意指通过注射(例如快速注射)或输注来施用。肠胃外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或颅内施用，例如鞘内或脑室内施用。
“肽”意指通过由酰胺键连接至少两个氨基酸而形成的分子。在无限制的情况下，本文所用的肽是指多肽和蛋白质。
“药剂”意指当施用给个体时提供治疗益处的物质。例如，在某些实施方案中，靶向SOD-1的反义寡核苷酸为药剂。
“药物组合物”意指适用于对受试者施用的物质的混合物。例如，药物组合物可包含修饰寡核苷酸和无菌水溶液。
“药学上可接受的衍生物”涵盖本文所述的化合物的药学上可接受的盐、缀合物、前药或异构体。
“药学上可接受的盐”意指反义化合物的生理上和药学上可接受的盐，即，保留母体化合物的所需生物活性且不会赋予不希望的毒理学效应的盐。
“硫代磷酸酯键联”意指核苷之间的键联，其中磷酸二酯键通过用硫原子置换非桥联氧原子之一而被修饰。硫代磷酸酯键联为修饰的核苷间键联。
“部分”意指核酸中确定数目的连续(即连接的)核碱基。在某些实施方案中，部分是靶核酸的限定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，部分是反义化合物的限定数目的连续核碱基。
“预防(prevent)”或“预防(preventing)”是指延迟或防止疾病、病症或病状的发作或发展达几分钟到几天、几周到几月或无限期的时间段。
“前药”意指以非活性形式制备且在身体或其细胞内通过内源酶或其他化学物质和/或条件的作用转化成活性形式(即药物)的治疗剂。
“防治有效量”是指向动物提供防治或预防益处的药剂的量。
“区”被定义为靶核酸中具有至少一个可鉴别的结构、功能或特征的部分。
“核糖核苷酸”意指在核苷酸的糖部分的2'位上具有羟基的核苷酸。核糖核苷酸可被多种取代基中的任一种修饰。
“盐”意指反义化合物的生理上和药学上可接受的盐，即，保留母体化合物的所需生物活性且不会赋予不希望的毒理学效应的盐。
“区段”被定义为靶核酸内的区的较小部分或子部分。
本文所教导的寡核苷酸SOD-1ght的“缩短”或“截短”型式有一个、两个或更多个核苷缺失。
“副作用”意指可归因于治疗的非所需作用的生理反应。在某些实施方案中，副作用包括不限于注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常和肌病。
“单链寡核苷酸”意指未与互补链杂交的寡核苷酸。
本文所用的“位点”被定义为靶核酸内的独特核碱基位置。
“减慢进展”意指减慢疾病的发展。
“SOD-1”意指哺乳动物的可溶的超氧化物歧化酶1(SOD-1)基因，包括人的可溶的超氧化物歧化酶1(SOD-1)基因。
“SOD-1相关的疾病”意指与任何SOD-1核酸或其表达产物相关的任何疾病。此类疾病可包括神经退行性疾病。此类神经退行性疾病可包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
“SOD-1 mRNA”意指编码SOD-1的DNA序列的任何信使RNA表达产物。
“SOD-1核酸”意指编码SOD-1的任何核酸。例如，在某些实施方案中，SOD-1核酸包括编码SOD-1的DNA序列、从编码SOD-1的DNA(包括含有内含子和外显子的基因组DNA)转录的RNA序列，和编码SOD-1的mRNA序列。“SOD-1 mRNA”意指编码SOD-1蛋白质的mRNA。
“SOD-1蛋白质”意指SOD-1核酸的多肽表达产物。
“可特异性杂交的”是指在寡核苷酸与靶核酸之间具有足够程度的互补性以诱导所需效应，同时在体内测定和治疗学处理的情况下在需要特异性结合的条件下，即，在生理条件下对非靶核酸表现出极小的作用或无作用的反义化合物。
“严格杂交条件”或“严格条件”是指低聚化合物与其靶序列杂交，但与极少数目的其他序列杂交的条件。
“受试者”意指选用于治疗或疗法的人或非人动物。
“糖化学基序”意指包括至少两种不同的糖修饰的糖修饰形态。例如，具有混合主链的寡核苷酸可能包括至少一个2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，和/或一个cEt修饰的核苷，和/或一个2’-脱氧核苷。
“靶”是指需要调节的蛋白质。
“靶基因”是指编码靶的基因。
“靶向”或“靶向的”意指将与靶核酸特异性杂交并诱导所需效应的反义化合物的设计和选择的过程。
“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录物”和“核酸靶”都意指能够由反义化合物靶向的核酸。
“靶区”意指靶核酸中由一种或多种反义化合物所靶向的部分。
“靶区段”意指反义化合物所靶向的靶核酸的核苷酸的序列。“5’靶位点”是指靶区段的最5’核苷酸。“3’靶位点”是指靶区段的最3’核苷酸。
“治疗有效量”意指向个体提供治疗益处的药剂的量。
“治疗(Treat)”或“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指施用组合物以实现疾病或病状的改变或改善。
“未修饰的核碱基”意指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“未修饰的核苷酸”意指由天然存在的核碱基、糖部分和核苷间键构成的核苷酸。在某些实施方案中，未修饰的核苷酸为RNA核苷酸(即，β-D-核糖核苷)或DNA核苷酸(即，β-D-脱氧核糖核苷)。
“翼区段”意指被修饰来赋予寡核苷酸以如抑制活性增强、对靶核酸的结合亲和力增强或对由体内核酸酶引起的降解具抗性的性质的多个核苷。
某些实施方案
某些实施方案提供用于抑制SOD-1 mRNA表达的方法、化合物和组合物。某些实施方案提供用于降低SOD-1 mRNA表达的方法、化合物和组合物。
某些实施方案提供靶向SOD-1核酸的反义化合物。在某些实施方案中，SOD-1核酸为GENBANK登录号NM_000454.4(以SEQ ID NO:1形式并入本文)、从核苷酸18693000至18704000截短的GENBANK登录号NT_011512.10(以SEQ ID NO:2形式并入本文)和从核苷酸2258000至2271000截短的GENBANK登录号NW_001114168.1的互补序列(以SEQ ID NO:3形式并入本文)中所列的序列。
某些实施方案提供用于在有此需要的个体中治疗、预防或改善与SOD-1相关的疾病、病症和病状的方法。还涵盖用于制备供治疗、预防或改善与SOD-1相关的疾病、病症和病状的药物的方法。SOD-1相关的疾病、病症和病状包括神经退行性疾病。在某些实施方案中，SOD-1相关的疾病包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)。
实施方案1.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO:118-1461的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
实施方案2.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO:15、21、23、47、54和67中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基，其中至少一个核苷间键联为磷酸二酯键联。
实施方案3.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有混合主链。
实施方案4.如实施方案3所述的化合物，其中所述混合主链基序是以下任一个：
sossssssssoooss、
sooossssssssoss、
sooosssssssssoss、
soosssssssssooss、
sooossssssssooss、
sooosssssssssooss、
sooossssssssssooss、
sooosssssssssssooos、
soooossssssssssooss、
sooosssssssssssooss、
sososssssssssssosos和
sooossssssssssoooss，其中
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案5.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有以下任一个糖化学基序：
ekddddddddekekee、
kekeddddddddekek、
eeeedddddddddkkee、
eeeeddddddddekeke、
eeeeddddddddkekee、
eeeeddddddddkkeee、
eeeeeddddddddkkee、
eeeekddddddddkeee、
eeeekdddddddkeeee、
eeekddddddddkeeee、
eeekkdddddddkkeee、
eekkdddddddddkkee、
eekkddddddddeeeee、
eekkddddddddkkeee、
ekekddddddddeeeee、
ekekddddddddkekee和
kekeddddddddeeeee，其中
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
k＝cEt修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖。
实施方案6.如任一前述实施方案所述的化合物，其中修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％互补。
实施方案7.如任一前述实施方案所述的化合物，其由单链的修饰寡核苷酸组成。
实施方案8.如任一前述实施方案所述的化合物，其中至少一个核苷间键联是修饰的核苷间键联。
实施方案9.如实施方案8所述的化合物，其中至少一个修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
实施方案10.如实施方案9所述的化合物，其中每个修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
实施方案11.如任一前述实施方案所述的化合物，其中至少一个核苷间键联是磷酸二酯核苷间键联。
实施方案12.如任一前述实施方案所述的化合物，其中至少一个核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且至少一个核苷间键联是磷酸二酯键联。
实施方案13.如任一前述实施方案所述的化合物，其中至少一个核苷包含修饰的核碱基。
实施方案14.如实施方案13所述的化合物，其中所述修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。
实施方案15.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸中的至少一个核苷包含修饰的糖。
实施方案16.如实施方案15所述的化合物，其中所述至少一个修饰的糖是双环糖。
实施方案17.如实施方案16所述的化合物，其中所述双环糖包含在糖4’-CH2-N(R)-O-2’桥的2'位和4'位之间的化学键，其中R独立地为H、C1-C12烷基或保护基。
实施方案18.如实施方案17所述的化合物，其中所述双环糖包含4’-CH2-N(R)-O-2’桥，其中R独立地为H、C1-C12烷基或保护基。
实施方案19.如实施方案15所述的化合物，其中至少一个修饰的糖包含2’-O-甲氧基乙基。
实施方案20.如实施方案15所述的化合物，其中所述修饰的糖包含2’-O(CH2)2-OCH3基团。
实施方案21.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由10个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由5个连接核苷组成的5’翼区段；和
由5个连接核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
实施方案22.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由9个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由5个连接核苷组成的5’翼区段；和
3’翼段，其由5个连接的核苷组成；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
实施方案23.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由8个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由5个连接核苷组成的5’翼区段；和
3’翼段，其由5个连接的核苷组成；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
实施方案24.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由8个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由4个连接核苷组成的5’翼区段；和
由5个连接核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
实施方案25.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由8个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由5个连接核苷组成的5’翼区段；和
由7个连接核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
实施方案26.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由8个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由6个连接核苷组成的5’翼区段；和
由6个连接核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
实施方案27.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由9个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由6个连接核苷组成的5’翼区段；和
由5个连接核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
实施方案28.如任一前述实施方案所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由12、13、14、15、16、17、18、19或20个连接核苷组成。
实施方案29.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：
Figure BDA0001148942550000231
实施方案30.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：
Figure BDA0001148942550000232
实施方案31.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：
Figure BDA0001148942550000241
实施方案32.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：
Figure BDA0001148942550000242
实施方案33.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：
Figure BDA0001148942550000251
实施方案34.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：
Figure BDA0001148942550000252
实施方案35.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：
Figure BDA0001148942550000261
实施方案36.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：
Figure BDA0001148942550000262
实施方案37.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：mCes Aeo Ges Geo AesTds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖。
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案38.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：Tes Teo Aeo Aes TdsGds Tds Tds Tds Ads Tds mCds Ako Gko Ges Aes Te；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
k＝cEt修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案39.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：Ges Geo Aeo Teo AdsmCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCko Aks Ges mCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
k＝cEt修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案40.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：Ges Geo Aeo Teo AesmCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCko Aks Ges mCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
k＝cEt修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案41.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：Ges Geo Aeo Teo AksmCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCko Aes Ges mCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
k＝cEt修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案42.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：Aes Gko Teo Gks TdsTds Tds Ads Ads Tds Gds Tds Tko Teo Aks Tes mCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
k＝cEt修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案43.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：Aes Gko Teo Gks TdsTds Tds Ads Ads Tds Gds Tds Teo Teo Aes Tes mCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
k＝cEt修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案44.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：Aes Geo Tko Gks TdsTds Tds Ads Ads Tds Gds Tds Teo Teo Aes Tes mCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
k＝cEt修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案45.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：mCes mCeo Geo TeomCeo Gds mCds mCds mCds Tds Tds mCds Ads Gds mCds Aeo mCeo Ges mCes Ae，其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案46.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：mCes mCeo Geo TeomCes Gds mCds mCds mCds Tds Tds mCds Ads Ges mCeo Aeo mCeo Ges mCes Ae，其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案47.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：mCes mCeo Geo TeomCes Gds mCds mCds mCds Tds Tds mCds Ads Gds mCds Aeo mCeo Geo mCes Ae，其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案48.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：Aes mCeo Aeo mCeomCes Tds Tds mCds Ads mCds Tds Gds Gds Tds mCds mCeo Aeo Teo Tes Ae，其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案49.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：Ges Geo mCeo Geo AesTds mCds mCds mCds Ads Ads Tds Tds Ads mCds Aeo mCeo mCeo Aes mCe，其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案50.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：Ges Geo mCeo Geo AesTes mCds mCds mCds Ads Ads Tds Tds Ads mCeo Aeo mCeo mCes Aes mCe，其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案51.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：Ges Geo mCeo Geo AesTds mCds mCds mCds Ads Ads Tds Tds Aes mCeo Aeo mCeo mCes Aes mCe，其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案52.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：Ges Geo mCeo Geo AeoTes mCds mCds mCds Ads Ads Tds Tds Ads mCds Aeo mCeo mCes Aes mCe，其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案53.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：Ges Teo mCeo Geo mCesmCds mCds Tds Tds mCds Ads Gds mCds Ads mCds Geo mCeo Aeo mCes Ae，其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案54.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：Tes mCeo Geo mCeomCes mCds Tds Tds mCds Ads Gds mCds Ads mCds Gds mCeo Aeo mCeo Aes mCe，其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
实施方案55.由根据下式的修饰寡核苷酸组成的化合物：Ges Aes Aes Aes TesTds Gds Ads Tds Gds Ads Tds Gds mCds mCds mCes Tes Ges mCes Ae，其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，并且
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
实施方案56.一种组合物，其包含如任一前述实施方案中的化合物或其盐，和药学上可接受的载体或稀释剂中的至少一种。
实施方案57.一种方法，其包括向动物施用如任一前述实施方案中的化合物或组合物。
实施方案58.如实施方案57所述的方法，其中所述动物为人。
实施方案59.如实施方案57所述的方法，其中施用所述化合物预防、治疗、改善SOD-1相关的疾病或减慢其进展。
实施方案60.如实施方案59所述的方法，其中所述SOD-1相关的疾病为神经退行性疾病。
实施方案61.如实施方案60所述的方法，其中所述SOD-1相关的疾病为ALS。
实施方案62.如任一前述实施方案所述的化合物或组合物用于制造用于治疗神经退行性病症的药物的用途。
实施方案63.如任一前述实施方案所述的化合物或组合物用于制造用于ALS的药物的用途。
实施方案64.如任一前述实施方案所述的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸不具有SEQ ID NO:21的核碱基序列。
实施方案65.如任一前述实施方案所述的化合物或组合物，其中所述修饰寡核苷酸不具有SEQ ID NO:21-118中任一个的核碱基序列。
实施方案66.一种包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有核碱基序列，其中所述核碱基序列包含与SEQ ID NO:1的核苷酸665至684的等数量核碱基互补的至少12个连续核碱基部分，其中所述修饰寡核苷酸与SEQ IDNO:1至少80％互补。
实施方案67.如实施方案66所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与SEQ ID NO:1100％互补。
实施方案68.如实施方案66所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸为单链修饰寡核苷酸。
实施方案69.如实施方案66-68所述的化合物，其中至少一个核苷间键联为修饰的核苷间键联。
实施方案70.如实施方案69所述的化合物，其中至少一个修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
实施方案71.如实施方案70所述的化合物，其中每个修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
实施方案72.如实施方案66-69所述的化合物，其中至少一个核苷间键联为磷酸二酯键联。
实施方案73.如实施方案66-71和72-73所述的化合物，其中至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯键联，并且至少一个核苷间键联为磷酸二酯键联。
实施方案74.如实施方案66-73所述的化合物，其中至少一个核苷包含修饰的核碱基。
实施方案75.如实施方案74所述的化合物，其中所述修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。
实施方案76.如实施方案66-75所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸中的至少一个核苷包含修饰的糖。
实施方案77.如实施方案76所述的化合物，其中所述至少一个修饰的糖为双环糖。
实施方案78.如实施方案77所述的化合物，其中所述双环糖包含4’-CH(R)-O-2’桥，其中R独立地为H、C1-C12烷基或保护基。
实施方案79.如实施方案78所述的化合物，其中R为甲基。
实施方案80.如实施方案78所述的化合物，其中R为H。
实施方案81.如实施方案76所述的化合物，其中至少一个修饰的糖包含2’-O-甲氧基乙基。
反义化合物
低聚化合物包括但不限于寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、反义化合物、反义寡核苷酸、修饰寡核苷酸和siRNA。低聚化合物可为靶核酸的“反义序列”，意味着其能够与靶核酸经由氢键合进行杂交。
在某些实施方案中，反义化合物具有在按5'至3'方向书写时包含其所靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列的核碱基序列。在某些所述实施方案中，寡核苷酸具有在按5'至3'方向书写时包含其所靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列的核碱基序列。
在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为12至30个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为12至25个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为12至22个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为14至20个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为15至25个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为18至22个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为19至21个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为8至80个、12至50个、13至30个、13至50个、14至30个、14至50个、15至30个、15至50个、16至30个、16至50个、17至30个、17至50个、18至30个、18至50个、19至30个、19至50个或20至30个连接的亚单位。
在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为12个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为13个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为14个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为15个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为16个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为17个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为18个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为19个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为20个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为21个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为22个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为23个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为24个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为25个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为26个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为27个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为28个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为29个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为30个亚单位。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物的长度为31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个或80个连接的亚单位，或处于由上述任何两个值所界定的范围内。在某些实施方案中，反义化合物为反义寡核苷酸，并且连接的亚单位为核苷。
在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的寡核苷酸可为缩短或截短的反义寡核苷酸。例如，单个亚单位可自5'端缺失(5'截短)，或者自3'端缺失(3'截短)。靶向SOD-1核酸的缩短或截短的反义化合物可有两个亚单位自反义化合物的5'端缺失，或者可有两个亚单位自反义化合物的3'端缺失。或者，缺失的核苷可散布于整个反义化合物中，例如在5'端有一个核苷缺失和3'端有一个核苷缺失的反义化合物中。
当单个额外亚单位存在于延长的反义化合物中时，所述额外亚单位可位于反义化合物的5'端或3'端处。当存在两个或更多个额外亚单位时，所添加的亚单位可彼此邻近，例如在反义化合物的5'端上添加有两个亚单位(5'添加)或3'端上添加有两个亚单位(3'添加)的反义化合物中。或者，所添加的亚单位可散布于整个反义化合物中，例如在5'端上添加有一个亚单位和3'端上添加有一个亚单位的反义化合物中。
有可能增加或减少反义化合物(诸如修饰寡核苷酸)的长度和/或引入错配碱基而不消除活性。例如，在Woolf等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7305-7309,1992)中，测试长度为13-25个核碱基的一系列寡核苷酸在卵母细胞注射模型中诱导靶RNA裂解的能力。长度为25个核碱基且在接近寡核苷酸的末端处具有8或11个错配碱基的寡核苷酸能够导引靶mRNA特异性裂解，但程度低于不含错配的反义寡核苷酸。类似地，靶特异性裂解可使用具有13个核碱基的寡核苷酸(包括具有1或3个错配者)达成。
Gautschi等(J.Natl.Cancer Inst.93:463-471,2001年三月)表明与bcl-2mRNA具有100％互补性且与bcl-xL mRNA具有3个错配的寡核苷酸在体外和体内减少bcl-2和bcl-xL两者的表达的能力。此外，这个寡核苷酸展现了有效的体内抗肿瘤活性。
Maher和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16:3341-3358,1988)分别测试一系列具有14个核碱基的串联寡核苷酸以及包含所述串联寡核苷酸中的两个或三个的序列的具有28个和42个核碱基的寡核苷酸在家兔网状红血球测定中阻止人DHFR转译的能力。3个具有14个核碱基的寡核苷酸能够各自单独抑制转译，但程度相较于具有28个或42个核碱基的反义寡核苷酸而言更适中。
反义化合物基序
在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的反义化合物具有排列成一定型态或基序的化学上修饰的亚单位，以赋予反义化合物以诸如抑制活性增强、对靶核酸的结合亲和力增强或对由体内核酸酶引起的降解具抗性的性质。
嵌合反义化合物通常含有至少一个修饰的以赋予增强的核酸酶降解抗性、增加的细胞吸收、增强的对靶核酸的结合亲和力和/或增强的抑制活性的区。嵌合反义化合物的第二区可任选用作细胞核酸内切酶核糖核酸酶H的底物，所述酶裂解RNA:DNA双螺旋体的RNA链。
具有缺口聚物基序的反义化合物被认为是嵌合反义化合物。在缺口聚物中，具有多个支持核糖核酸酶H裂解的核苷酸的内部区位于具有多个在化学上与内部区的核苷不同的核苷酸的外部区之间。在具有缺口聚物基序的寡核苷酸的状况下，缺口区段一般用作核酸内切酶裂解的底物，而翼区段包含修饰的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的每个区由构成每个相异区的糖部分的类型来区分。用于区分缺口聚物的每个区的糖部分的类型在一些实施方案中可包括β-D-核糖核苷、β-D-脱氧核糖核苷、2'-修饰的核苷(此2'-修饰的核苷可尤其包括2'-MOE和2’-O-CH3)，以及双环糖修饰的核苷(此双环糖修饰的核苷可包括具有4’-(CH2)n-O-2’和4’-CH2-O-CH2-2’桥的核苷，其中n＝1或n＝2)。在某些实施方案中，翼可包括若干修饰的糖部分(包括例如2’-MOE)。在某些实施方案中，翼可包括若干修饰的和未修饰的糖部分。在某些实施方案中，翼可包括2’-MOE核苷和2’-脱氧核苷的各种组合。
每个相异区可包含均一糖部分、变化或交替的糖部分。翼-缺口-翼基序常被描述为“X-Y-Z”，其中“X”表示5'翼的长度，“Y”表示缺口的长度，且“Z”表示3'翼的长度。“X”和“Z”可包含均一、变化或交替的糖部分。在某些实施方案中，“X”和“Y”可包含一个或多个2'-脱氧核苷。“Y”可包含2'-脱氧核苷。本文所用的描述为“X-Y-Z”的缺口聚物具有一定构型以使缺口紧邻5'翼及3'翼中的每一个而定位。因此，在5'翼与缺口之间，或缺口与3'翼之间不存在介入的核苷酸。本文所述的任何反义化合物均可具有缺口聚物基序。在某些实施方案中，“X”与“Z”相同；在其他实施方案中，它们不同。
在某些实施方案中，本文提供的缺口聚物包括，例如具有5-10-5基序的20聚体。
在某些实施方案中，本文提供的缺口聚物包括，例如具有5-9-5基序的19聚体。
在某些实施方案中，本文提供的缺口聚物包括，例如具有5-8-5基序的18聚体。
在某些实施方案中，本文提供的缺口聚物包括，例如具有4-8-5基序的18聚体。
在某些实施方案中，本文提供的缺口聚物包括，例如具有5-8-7基序的18聚体。
在某些实施方案中，本文提供的缺口聚物包括，例如具有6-8-6基序的18聚体。
在某些实施方案中，本文提供的缺口聚物包括，例如具有6-8-5基序的18聚体。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸含有至少一个2’-O-甲氧基乙基修饰核苷、至少一个cEt修饰核苷和至少一个2’-脱氧核苷。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有以下任一个糖化学基序：
ekddddddddekekee
kekeddddddddekek
eeeedddddddddkkee
eeeeddddddddekeke
eeeeddddddddkekee
eeeeddddddddkkeee
eeeeeddddddddkkee
eeeekddddddddkeee
eeeekdddddddkeeee
eeekddddddddkeeee
eeekkdddddddkkeee
eekkdddddddddkkee
eekkddddddddeeeee
eekkddddddddkkeee
ekekddddddddeeeee
ekekddddddddkekee
kekeddddddddeeeee，其中
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
k＝cEt修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖。
靶核酸、靶区和核苷酸序列
编码SOD-1的核苷酸序列包括但不限于以下：GENBANK登录号NM_000454.4(以SEQID NO:1形式并入本文)、从核苷酸18693000至18704000截短的GENBANK登录号NT_011512.10(以SEQ ID NO:2形式并入本文)和从核苷酸2258000至2271000截短的GENBANK登录号NW_001114168.1的互补序列(以SEQ ID NO:3形式并入本文)中所列的序列。
应了解，本文中所含的实例中的每个SEQ ID NO中所列的序列与糖部分、核苷间键联或核碱基的任何修饰无关。因而，由SEQ ID NO定义的反义化合物可独立地包含糖部分、核苷间键联或核碱基的一个或多个修饰。由Isis编号(Isis No)所述的反义化合物指示核碱基序列与基序的组合。
在某些实施方案中，靶区为靶核酸的结构明确的区。例如，靶区可包含3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、外显子/内含子接合区、编码区、转译起始区、转译终止区，或其他所定义的核酸区域。关于SOD-1的结构上定义的区域可通过登录号从序列数据库如NCBI获得并且所述信息以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，靶区可涵盖从靶区内一个靶区段的5’靶位点到同一靶区内另一靶区段的3’靶位点的序列。
靶向包括确定至少一个与反义化合物杂交，从而出现所需作用的靶区段。在某些实施方案中，所需作用为靶核酸mRNA水平降低。在某些实施方案中，所需作用为由靶核酸编码的蛋白质水平的降低或与靶核酸有关的表型改变。
靶区可含有一个或多个靶区段。靶区内的多个靶区段可重叠。或者，它们可不相重叠。在某些实施方案中，靶区内的靶区段相隔至多约300个核苷酸。在某些实施方案中，靶区内的靶区段相隔靶核酸上一定数目的核苷酸，所述数目为、为约、为至多、为至多约250个、200个、150个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、20个或10个核苷酸，或为由前述任何两个值所界定的范围。在某些实施方案中，靶区内的靶区段相隔靶核酸上的至多或至多约5个核苷酸。在某些实施方案中，靶区段为连续的。涵盖由具有为本文所列的5'靶位点或3'靶位点中的任一个的起始核酸的范围所界定的靶区。
适合的靶区段可见于5'UTR、编码区、3'UTR、内含子、外显子或外显子/内含子接合区内。含有起始密码子或终止密码子的靶区段也为适合的靶区段。适合的靶区段可尤其排除某一结构明确的区，诸如起始密码子或终止密码子。
确定适合的靶区段可包括将靶核酸的序列与整个基因组中的其他序列相比较。例如，可使用BLAST算法来鉴别不同核酸当中具相似性的区域。这个比较可防止选择可能以非特异性方式与除所选靶核酸以外的序列(即非靶或脱靶序列)杂交的反义化合物序列。
反义化合物在活性靶区内的活性(例如如由靶核酸水平的降低百分比所定义)可能不同。在某些实施方案中，SOD-1 mRNA水平的降低指示对SOD-1表达的抑制。SOD-1蛋白质水平的降低也指示对靶mRNA表达的抑制。表型改变指示对SOD-1表达的抑制。神经功能的改善指示对SOD-1表达的抑制。运动功能的改善指示对SOD-1表达的抑制。
杂交
在一些实施方案中，在本文公开的反义化合物与SOD-1核酸之间进行杂交。杂交的最常见机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键合(例如沃森-克里克、霍氏或反霍氏氢键合)。
杂交可在不同条件下进行。严格条件具序列依赖性且由待杂交的核酸分子的性质和组成决定。
确定序列是否可与靶核酸特异性杂交的方法在本领域中是熟知的。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物可与SOD-1核酸特异性杂交。
互补性
当反义化合物中足够数目的核碱基可与靶核酸中的相应核碱基进行氢键合，从而出现所需作用(例如对靶核酸(诸如SOD-1核酸)的反义抑制)时，反义化合物与靶核酸彼此互补。
可容忍反义化合物与SOD-1核酸之间的非互补性核碱基，前提是所述反义化合物仍能够与靶核酸特异性杂交。此外，反义化合物可在SOD-1核酸的一个或多个区段上杂交，以使得介入或相邻区段不参与杂交事件(例如环结构、错配或发夹结构)。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与SOD-1核酸、靶区、靶区段或其指定部分具有或具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补性。反义化合物与靶核酸的互补性百分比可使用常规方法测定。
举例来说，反义化合物中反义化合物的20个核碱基中有18个核碱基与靶区互补且因此特异性杂交将表示90％互补性。在这个实施例中，其余非互补核碱基可与互补核碱基丛集或交替并且不需要彼此相邻或与互补核碱基相邻。因此，长18个核苷酸并且具有4(四)个非互补核碱基且所述非互补核碱基侧接有两个与靶核酸完全互补的区的反义化合物将与靶核酸具有77.8％总体互补性且因此将处于本发明的范围内。反义化合物与靶核酸的区的互补性百分比可常规地使用本领域中已知的BLAST程序(基本局部比对搜寻工具(basiclocal alignment search tool))和PowerBLAST程序来测定(Altschul等，J.Mol.Biol.,1990,215,403 410；Zhang和Madden，Genome Res.,1997,7,649 656)。同源性、序列同一性或互补性的百分比可通过例如使用Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.,1981,2,482 489)的算法的Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)使用默认设置来测定。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与靶核酸或其指定部分完全互补(即100％互补)。例如，反义化合物可与SOD-1核酸或其靶区或靶区段或靶序列完全互补。本文所用的“完全互补”意指反义化合物的每个核碱基皆能够与靶核酸的相应核碱基进行准确碱基配对。举例来说，具有20个核碱基的反义化合物与长度为400个核碱基的靶序列完全互补，只要靶核酸中有具有20个核碱基的相应部分与反义化合物完全互补即可。完全互补还可对于第一和/或第二核酸的指定部分来使用。例如，具有30个核碱基的反义化合物中的20个核碱基的部分可与长度为400个核碱基的靶序列“完全互补”。具有30个核碱基的寡核苷酸中的20个核碱基的部分在靶序列具有含20个核碱基且每个核碱基与反义化合物中的所述20个核碱基的部分互补的相应部分的情况下与靶序列完全互补。同时，整个具有30个核碱基的反义化合物与靶序列可能完全互补或可能不是完全互补，这取决于反义化合物的其余10个核碱基是否也与靶序列互补。
非互补核碱基的位置可处于反义化合物的5'端或3'端处。或者，一个或多个非互补核碱基可处于反义化合物的内部位置处。当存在两个或更多个非互补核碱基时，它们可为连续(即连接的)或不连续的。在一个实施方案中，非互补核碱基位于缺口聚物寡核苷酸的翼区段中。
在某些实施方案中，长度为或为多达11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核碱基的反义化合物相对于靶核酸(诸如SOD-1核酸)或其指定部分包含至多4个、至多3个、至多2个或至多1个非互补核碱基。
在某些实施方案中，长度为或为多达11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核碱基的反义化合物相对于靶核酸(诸如SOD-1核酸)或其指定部分包含至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个非互补核碱基。
本文提供的反义化合物还包括与靶核酸的一部分互补的反义化合物。本文所用的“部分”是指靶核酸的区或区段内确定数目的连续(即连接的)核碱基。“部分”还可指反义化合物中确定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少8个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少9个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少10个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少11个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少12个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少13个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少14个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少15个核碱基的部分互补。还涵盖与靶区段中具有至少9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个(或由这些值中的任何两个所界定的范围)核碱基的部分互补的反义化合物。
同一性
本文提供的反义化合物还可与特定核苷酸序列SEQ ID NO或由特定Isis编号表示的化合物或其部分具有确定的同一性百分比。如本文所用，如果反义化合物具有相同的核碱基配对能力，那么其与本文公开的序列同一。举例来说，在所公开的DNA序列中含有尿嘧啶代替胸苷的RNA将被视作与DNA序列同一，因为尿嘧啶和胸苷皆与腺嘌呤配对。还涵盖本文所述的反义化合物的缩短及延长型式以及相对于本文提供的反义化合物具有非同一碱基的化合物。非同一碱基可彼此相邻或散布于整个反义化合物中。反义化合物的同一性百分比是根据相对于与其比较的序列具有同一碱基配对的碱基的数目来计算的。
在某些实施方案中，反义化合物或其部分与本文公开的一种或多种反义化合物或SEQ ID NO或其部分具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在某些实施方案中，将反义化合物的一部分与靶核酸的等长部分相比较。在某些实施方案中，将具有8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核碱基的部分与靶核酸的等长部分相比较。
在某些实施方案中，将反义寡核苷酸的一部分与靶核酸的等长部分相比较。在某些实施方案中，将具有8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核碱基的部分与靶核酸的等长部分相比较。
修饰
核苷为碱基-糖组合。核苷的核碱基(又称为碱基)部分通常为杂环碱基部分。核苷酸为还包括共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。对于包括呋喃戊糖基糖的那些核苷，磷酸酯基可连接至糖的2'、3'或5'羟基部分。寡核苷酸是经由相邻核苷彼此共价键联形成线性聚合寡核苷酸而形成的。在寡核苷酸结构内，磷酸酯基通常被视作形成寡核苷酸的核苷间键联。
反义化合物的修饰涵盖核苷间键联、糖部分或核碱基的取代或改变。修饰的反义化合物常因具有如以下的所需性质而优于原生形式：细胞吸收增强、对核酸靶的亲和力增强、在核酸酶存在下的稳定性增强或抑制活性增强。
化学上修饰的核苷还可用于增强缩短或截短型反义寡核苷酸对其靶核酸的结合亲和力。因此，常可以具有所述化学上修饰的核苷的较短反义化合物获得类似结果。
修饰的核苷间键联
RNA和DNA的天然存在的核苷间键联为3'至5'磷酸二酯键联。相较于具有天然存在的核苷间键联的反义化合物，具有一个或多个修饰的(即非天然存在)的核苷间键联的反义化合物常会因具有所需性质(例如像细胞吸收增强、对靶核酸的亲和力增强及在核酸酶存在下的稳定性增强)而被优先选择。
具有修饰的核苷间键联的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间键联以及不具磷原子的核苷间键联。代表性含磷的核苷间键联包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯及硫代磷酸酯。制备含磷键联和不含磷键联的方法是熟知的。
在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的修饰寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷间键联散布于整个反义化合物中。在某些实施方案中，修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的修饰寡核苷酸包含一个或多个磷酸二酯核苷间键联。在某些实施方案中，靶向SOD-1核酸的修饰寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键联和至少一个磷酸二酯核苷间键联。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有以下混合主链基序：
sossssssssoooss、
sooossssssssoss、
sooosssssssssoss、
soosssssssssooss、
sooossssssssooss、
sooosssssssssooss、
sooossssssssssooss、
sooosssssssssssooos、
soooossssssssssooss、
sooosssssssssssooss、
sososssssssssssosos和
sooossssssssssoooss，其中
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
修饰的糖部分
本发明的反义化合物可任选含有其中糖基已被修饰的一个或多个核苷。所述糖修饰的核苷可赋予反义化合物以增强的核酸酶稳定性、增强的结合亲和力或某种其他有利生物性质。在某些实施方案中，核苷包含化学上修饰的呋喃核糖环部分。化学上修饰的呋喃核糖环的实例包括不限于添加取代基(包括5'及2'取代基)；非偕位环原子桥连形成双环核酸(BNA)；核糖基环氧原子用S、N(R)或C(R1)(R2)(R、R1和R2各自独立地为H、C1-C12烷基或保护基)置换；及其组合。化学上修饰的糖的实例包括2'-F-5'-甲基取代的核苷(关于其他所公开的5',2'-双取代的核苷，参见08年8月21日公开的PCT国际申请WO2008/101157)或核糖基环氧原子被S置换且2'位上被进一步取代(参见2005年6月16日公开的公开美国专利申请US2005-0130923)；或者BNA的5'-取代(参见07年11月22日公开的PCT国际申请WO2007/134181，其中LNA被例如5'-甲基或5'-乙烯基取代)。
具有修饰的糖部分的核苷的实例包括不限于包含5'-乙烯基、5'-甲基(R或S)、4'-S、2'-F、2'-OCH3、2’-OCH2CH3、2’-OCH2CH2F和2'-O(CH2)2OCH3取代基的核苷。2’位置处的取代基还可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、巯基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、OCH2F、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)以及O-CH2-C(＝O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)，其中Rl、Rm以及Rn各自独立地为H或取代的或未取代的C1-C10烷基。
本文所用的“双环核苷”是指包含双环糖部分的修饰的核苷。双环核酸(BNA)的实例包括不限于在4'与2'核糖基环原子之间包含桥的核苷。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物包括一个或多个BNA，其中桥包含下式的一种：4'-(CH2)-O-2'(LNA)、4'-(CH2)-S-2'、4'-(CH2)2-O-2'(ENA)、4'-CH(CH3)-O-2'和4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(以及其类似物，参见2008年7月15日颁发的美国专利7,399,845)、4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(以及其类似物，参见2009年1月8日公布的以WO 2009/006478公布的PCT/US2008/068922)、4'-CH2-N(OCH3)-2'(以及其类似物，参见2008年12月11日公布的以WO/2008/150729公布的PCT/US2008/064591)、4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见2004年9月2日公布的已公布的美国专利申请US2004-0171570)、4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R为H、C1-C12烷基、或保护基(参见2008年9月23日颁发的美国专利7,427,672)、4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见Chattopadhyaya等，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)和4'-CH2-C(＝CH2)-2'(以及其类似物，参见2008年12月8日公布的以WO 2008/154401公布的PCT/US2008/066154)。
另外的双环核苷被报道在已公开的文献中(参见，例如：Srivastava等,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362-8379；Frieden等,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372；Elayadi等,Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等,Chem.Biol.,2001,8,1-7；Orum等,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；Wahlestedt等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Singh等,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Kumar等,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；美国专利号：7,399,845；7,053,207；7,034,133；6,794,499；6,770,748；6,670,461；6,525,191；6,268,490；美国专利申请号：US2008-0039618；US2007-0287831；US2004-0171570；美国专利申请序列号：12/129,154；61/099,844；61/097,787；61/086,231；61/056,564；61/026,998；61/026,995；60/989,574；国际申请：WO 2007/134181；WO 2005/021570；WO 2004/106356；WO 94/14226；PCT国际申请：PCT/US2008/068922；PCT/US2008/066154和PCT/US2008/064591)。上述各双环核苷可被制备而具有一种或多种立体化学糖构型，包括例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见1999年3月25日公开为WO 99/14226的PCT国际申请PCT/DK98/00393)。
本文所用的“单环核苷”是指包含不为双环糖部分的修饰的糖部分的核苷。在某些实施方案中，核苷的糖部分或糖部分类似物可在任何位置上被修饰或取代。
本文所用的“4'-2'双环核苷”或“4'至2'双环核苷”是指包含含连接2'碳原子与4'碳原子的桥的呋喃糖环的双环核苷。
在某些实施方案中，BNA核苷的双环糖部分包括但不限于在呋喃戊糖基糖部分的4'位与2'位之间具有至少一个桥的化合物，其中所述桥包含1个或1至4个独立地选自以下的连接基团：-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-和-N(Ra)-；其中：x为0、1或2；n为1、2、3或4；Ra和Rb各自独立地为H、保护基、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚硫酸基(S(＝O)-J1)；并且
J1和J2各自独立地为H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
在某些实施方案中，双环糖部分的桥为-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或–C(RaRb)-O-N(R)-。在某些实施方案中，桥为4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'和4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中每个R独立地为H、保护基或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，双环核苷进一步由异构构型定义。例如，包含4'-(CH2)-O-2'桥联的核苷可呈α-L构型或呈β-D构型。α-L-亚甲氧基(4'-CH2-O-2')BNA先前已并入展示反义活性的反义寡核苷酸中(Frieden等,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。
在某些实施方案中，双环核苷包括具有4'至2'桥联的那些，其中此类桥联包括但不限于α-L-4'-(CH2)-O-2'、β-D-4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'、4'-CH2-N(R)-O-2'、4'-CH(CH3)-O-2'、4'-CH2-S-2'、4'-CH2-N(R)-2'、4'-CH2-CH(CH3)-2'和4'-(CH2)3-2'，其中R为H、保护基或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
Figure BDA0001148942550000571
其中：
Bx为杂环碱基部分；
-Qa-Qb-Qc-为-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(＝O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-或-N(Rc)-O-CH2；
Rc为C1-C12烷基或氨基保护基；并且
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
Figure BDA0001148942550000572
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Za为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、巯基或取代的巯基。
在一个实施方案中，每个取代的基团独立地被独立地选自以下的取代基单取代或多取代：卤素、氧代基、羟基、OJc、NJcJd、SJc、N3、OC(＝X)Jc和NJeC(＝X)NJcJd，其中每个Jc、Jd和Je独立地为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基且X为O或NJc。
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
Figure BDA0001148942550000581
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Zb为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基或取代的酰基(C(＝O)-)。
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
Figure BDA0001148942550000582
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Rd为C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
qa、qb、qc和qd各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-C6氨基烷基或取代的C1-C6氨基烷基；
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
Figure BDA0001148942550000591
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
qa、qb、qe和qf各自独立地为氢、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；
或qe连同qf一起为＝C(qg)(qh)；
qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基；
已描述了具有4'-CH2-O-2'桥联的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶双环核苷的合成和制备连同其低聚化以及核酸识别性质(Koshkin等,Tetrahedron,1998,54,3607-3630)。双环核苷的合成也描述于WO 98/39352和WO 99/14226中。
还已制备具有4'至2'桥连基团诸如4'-CH2-O-2'和4'-CH2-S-2'的各种双环核苷的类似物(Kumar等,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。包含双环核苷作为核酸聚合酶的底物的寡脱氧核糖核苷酸双螺旋体的制备也已有所描述(Wengel等,WO 99/14226)。此外，2'-氨基-BNA(一种新颖的构形受限的高亲和力寡核苷酸类似物)的合成在本领域中已有所描述(Singh等,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)。另外，2'-氨基-BNA及2'-甲基氨基-BNA已被制备且它们与互补的RNA及DNA链的双螺旋体的热稳定性先前已有所报导。
在某些实施方案中，双环核苷具有式：
Figure BDA0001148942550000601
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合物基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
qi、qj、qk和ql各自独立地为氢、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；并且
qi和qj或ql和qk一起为＝C(qg)(qh)，其中qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基。
一种具有4'-(CH2)3-2'桥和烯基类似物桥4'-CH＝CH-CH2-2'的碳环双环核苷已有所描述(Freier等，Nucleic Acids Research,1997,25(22),4429-4443和Albaek等，J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740)。碳环双环核苷的合成和制备连同其低聚化和生物化学研究也已有所描述(Srivastava等,J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
在某些实施方案中，双环核苷包括但不限于(A)α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(B)β-D-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(C)亚乙氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA；(D)氨氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA；(E)氧氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA；(F)甲基(亚甲氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA(也称为约束乙基或cEt)；(G)亚甲基-硫基(4’-CH2-S-2’)BNA；(H)亚甲基-氨基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA；(I)甲基碳环(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA；(J)丙烯碳环(4’-(CH2)3-2’)BNA和(K)乙烯基BNA，如下文所描绘。
Figure BDA0001148942550000621
其中Bx为碱基部分且R独立地为H、保护基、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基。
本文所用的“修饰的四氢吡喃核苷”或“修饰的THP核苷”意指具有取代普通核苷中的呋喃戊糖基残基的6元四氢吡喃“糖”的核苷并且也可以称为糖替代物。修饰的THP核苷包括但不限于在本领域中称为己糖醇核酸(HNA)、anitol核酸(ANA)、甘露醇核酸(MNA)(参见Leumann,Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841-854)或具有如下所示的四氢呋喃环系统的氟HNA(F-HNA)的核苷。
Figure BDA0001148942550000622
在某些实施方案中，选择具有下式的糖替代物：
Figure BDA0001148942550000623
其中：
Bx为杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地为将四氢吡喃核苷类似物连接至低聚化合物的核苷间连接基团，或者T3和T4中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接至低聚化合物或寡核苷酸的核苷间连接基团，且T3和T4中的另一个为H、羟基保护基、连接的缀合物基团或5'或3'-端基；
q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；并且
R1及R2中的一个为氢且另一个选自卤素、取代或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中X为O、S或NJ1，且J1、J2及J3各自独立地为H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中至少一个不为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中至少一个为甲基。在某些实施方案中，提供THP核苷其中R1和R2中的一个为F。在某些实施方案中，R1为氟并且R2为H；R1为甲氧基并且R2为H，以及R1为甲氧基乙氧基并且R2为H。
在某些实施方案中，糖替代物包含具有多于5个原子和多于一个杂原子的环。例如包含吗啉代糖部分的核苷以及它们在低聚化合物中的用途已有所报告(参见例如：Braasch等,Biochemistry,2002,41,4503-4510；和美国专利5,698,685；5,166,315；5,185,444以及5,034,506)。如在此所使用，术语“吗啉代”意指具有以下式的糖替代物：
Figure BDA0001148942550000641
在某些实施方案中，可例如通过添加或改变来自以上吗啉代结构的各种取代基来修饰吗啉代。所述糖替代物在本文中称为“修饰的吗啉代”。
还提供了修饰的组合，不限于如2'-F-5'-甲基取代的核苷(对于其他公开的5',2'-双取代核苷，参见8/21/08公布的PCT国际申请WO 2008/101157)和用S替代核糖基环氧原子以及在2'-位上的进一步取代(参见2005年6月16日公布的已公布的美国专利申请US2005-0130923)或替代地双环核酸的5'-取代(参见11/22/07公布的PCT国际申请WO2007/134181，其中4'-CH2-O-2'双环核苷在5'位上被5'-甲基或5'-乙烯基进一步取代)。碳环双环核苷的合成和制备连同其低聚化和生物化学研究也已有所描述(参见，例如，Srivastava等,J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个修饰的环己烯基核苷，其为用六元环己烯基替代天然存在的核苷中的呋喃戊糖基残基的核苷。修饰的环己烯基核苷包括但不限于本领域中描述的那些(参见例如共同拥有的已公布的2010年4月10日公布的PCT申请WO 2010/036696，Robeyns等,J.Am.Chem.Soc.,2008,130(6),1979-1984；Horváth等,Tetrahedron Letters,2007,48,3621-3623；Nauwelaerts等,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(30),9340-9348；Gu等,Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2005,24(5-7),993-998；Nauwelaerts等,Nucleic Acids Research,2005,33(8),2452-2463；Robeyns等,ActaCrystallographica,Section F:Structural Biology and CrystallizationCommunications,2005,F61(6),585-586；Gu等,Tetrahedron,2004,60(9),2111-2123；Gu等,Oligonucleotides,2003,13(6),479-489；Wang等,J.Org.Chem.,2003,68,4499-4505；Verbeure等,Nucleic Acids Research,2001,29(24),4941-4947；Wang等,J.Org.Chem.,2001,66,8478-82；Wang等,Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2001,20(4-7),785-788；Wang等,J.Am.Chem.,2000,122,8595-8602；已公布的PCT申请WO 06/047842以及已公布的PCT申请WO 01/049687；每项申请的内容以引用的方式整体并入本文)。某些修饰的环己烯基核苷具有式X。
Figure BDA0001148942550000651
其中独立地对于所述至少一种式X的环己烯基核苷类似物中的每一个：
Bx为杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地为将环己烯基核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团，或者T3和T4中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团且T3和T4中的另一个为H、羟基保护基、连接的缀合物基团或5'或3'-端基；并且
q1、q2、q3、q4、q5、q6、q7、q8和q9各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基或其他糖取代基团。
许多其他单环、双环和三环的环系统为本领域中已知的并且适合作为可用来修饰用于并入本文所提供的低聚化合物中的核苷的糖替代物(参见，例如，综述文章：Leumann,Christian J.Bioorg.&Med.Chem.,2002,10,841-854)。可对所述环系统进行各种其他的取代以进一步增强活性。
本文所用的“2'-修饰的糖”意指在2'位上修饰的呋喃糖基糖。在某些实施方案中，所述修饰包括选自以下的取代基：包括但不限于卤基、取代和未取代的烷氧基、取代和未取代的硫烷基、取代和未取代的氨基烷基、取代和未取代的烷基、取代和未取代的烯丙基以及取代和未取代的炔基。在某些实施方案中，2’修饰选自包括但不限于以下的取代基：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nF、O(CH2)nONH2、OCH2C(＝O)N(H)CH3和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1至约10。其他2'取代基还可选自：C1-C12烷基、取代的烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、F、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷氨基、聚烷氨基、取代的硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入剂、改进药物动力学性质的基团、或改进反义化合物的药效学性质的基团，以及其他具有类似性质的取代基。在某些实施方案中，修饰的核苷包含2'-MOE侧链(Baker等,J.Biol.Chem.,1997,272,11944-12000)。所述2'-MOE取代已被描述为相较于未修饰的核苷及其他修饰的核苷(如2'-O-甲基、O-丙基及O-氨基丙基)具有改善的结合亲和力。具有2'-MOE取代基的寡核苷酸还被示为在体内使用中具有良好特征的基因表达的反义抑制剂(Martin,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504；Altmann等,Chimia,1996,50,168-176；Altmann等,Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637；和Altmann等.,Nucleosides Nucleotides,1997,16,917-926)。
本文所用的“2'-修饰的核苷”或“2'-取代的核苷”是指包含在2'位上包含除H或OH以外的取代基的糖的核苷。2'-修饰的核苷包括但不限于其中连接糖环的两个碳原子的桥连接糖环的2'碳与另一个碳的双环核苷以及具有如以下的非桥连2'取代基的核苷：烯丙基、氨基、叠氮基、硫基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中Rm和Rn各自独立地为H或取代或未取代的C1-C10烷基。2'-修饰的核苷可进一步例如在糖的其他位置上和/或在核碱基上包含其他修饰。
本文所用的“2’-F”是指包括在糖环的2'位上包含氟基的糖的核苷。
本文所用的“2’-OMe”或“2’-OCH3”、“2’-O-甲基”或“2’-甲氧基”各自是指包含在糖环的2'位上包含-OCH3基团的糖的核苷。
本文所用的“MOE”或“2’-MOE”或“2’-OCH2CH2OCH3”或“2’-O-甲氧基乙基”各自是指包含在糖环的2'位上包含-OCH2CH2OCH3基团的糖的核苷。
用于制备修饰的糖的方法为本领域技术人员所熟知。教导此类修饰的糖的制备的一些代表性美国专利包括但不限于U.S.4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,670,633、5,700,920、5,792,847以及6,600,032以及2005年6月2日提交且2005年12月22日公布为WO 2005/121371的国际申请PCT/US2005/019219，并且每篇所述专利以引用的方式整体并入本文。
本文所用的“寡核苷酸”是指包含多个连接的核苷的化合物。在某些实施方案中，多个核苷中的一或多个是修饰的。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷(DNA)。
在具有修饰的糖部分的核苷酸中，核碱基部分(天然、修饰的或其组合)被维持以便与适当核酸靶杂交。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个具有修饰的糖部分的核苷酸。在某些实施方案中，修饰的糖部分为2'-MOE。在某些实施方案中，2'-MOE修饰的核苷酸排列于缺口聚物基序中。在某些实施方案中，修饰的糖部分是具有(4’-CH(CH3)-O-2’)桥接基团的双环核苷。在某些实施方案中，(4’-CH(CH3)-O-2’)修饰的核苷布置在整个缺口聚物基序的翼中。
用于配制药物组合物的组合物和方法
寡核苷酸可与药学上可接受的活性或惰性物质混合以制备药物组合物或制剂。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或所施用的剂量。
靶向SOD-1核酸的反义化合物可通过将反义化合物与适合的药学上可接受的稀释剂或载体组合而用于药物组合物中。药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)。PBS是适用于以肠胃外方式递送的组合物中的稀释剂。因此，在一个实施方案中，在本文所述的方法中使用包含靶向SOD-1核酸的反义化合物及药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施方案中，药学上可接受的稀释剂为PBS。在某些实施方案中，反义化合物为修饰寡核苷酸。
包含反义化合物的药物组合物涵盖在动物(包括人)施用时能够提供(直接或间接)其生物活性代谢物或残余物的任何药学上可接受的盐、酯或所述酯的盐，或任何其他寡核苷酸。因此，例如，本公开还涉及反义化合物的药学上可接受的盐、前药、所述前药的药学上可接受的盐以及其他生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。
前药可包括在反义化合物的一端或两端上并入可由体内内源性核酸酶裂解而形成活性反义化合物的额外核苷。
缀合的反义化合物
反义化合物可共价连接至一个或多个增强所得寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞吸收的部分或缀合物。典型缀合物基团包括胆固醇部分和脂质部分。额外的缀合物基团包括碳水化合物、磷脂、生物素、啡嗪、叶酸盐、啡啶、蒽醌、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素和染料。
反义化合物还可被修饰以具有一个或多个稳定化基团，所述一个或多个稳定化基团一般连接至反义化合物的一端或两端以增强如核酸酶稳定性的性质。在稳定化基团中包括帽结构。这些末端修饰保护具有末端核酸的反义化合物免遭核酸外切酶降解，且可有助于递送和/或定位于细胞内。帽可存在于5'端(5'帽)或3'端(3'帽)上，或可存在于这两端上。帽结构在本领域中为熟知的且包括例如反向脱氧无碱基帽。其他可用于对反义化合物的一端或两端进行封端以赋予核酸酶稳定性的3'和5'-稳定化基团包括2003年1月16日公布的WO 03/004602中所公开的那些基团。
细胞培养和反义化合物处理
可在多种细胞类型中体外测试反义化合物对SOD-1核酸的水平、活性或表达的作用。用于所述分析的细胞类型可获自商业供货商(例如American Type CultureCollection,Manassus,VA；Zen-Bio,Inc.,Research Triangle Park,NC；CloneticsCorporation,Walkersville,MD)且根据供货商的说明书使用商购的试剂(例如InvitrogenLife Technologies,Carlsbad,CA)培养细胞。例示性细胞类型包括但不限于HepG2细胞、Hep3B细胞、原代肝细胞、A431细胞和SH-SY5Y细胞。
体外测试寡核苷酸
本文描述用寡核苷酸处理细胞的方法，所述方法可被适当修改以用于用其他反义化合物进行的处理。
可当细胞在培养中达到约60％至80％汇合度时，用寡核苷酸处理细胞。
一种常用于将寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括阳离子型脂质转染试剂LIPOFECTIN(Invitrogen,Carlsbad,CA)。可将寡核苷酸与LIPOFECTIN在OPTI-MEM 1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达成寡核苷酸的所需最终浓度及可在每100nM寡核苷酸2至12ug/mL范围内的LIPOFECTIN浓度。
另一种用于将寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括LIPOFECTAMINE(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将寡核苷酸与LIPOFECTAMINE在OPTI-MEM 1血清减少型培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达成寡核苷酸的所需浓度及可在每100nM寡核苷酸2至12ug/mL范围内的LIPOFECTAMINE浓度。
另一种用于将寡核苷酸引入培养细胞中的技术包括电穿孔。
通过常规方法用寡核苷酸处理细胞。可在寡核苷酸处理后16-24小时收获细胞，此时通过本领域中已知及本文所述的方法测量靶核酸的RNA或蛋白质水平。一般来说，当在多次重复实验中进行处理时，数据呈现为重复处理的平均值。
所用的寡核苷酸浓度在细胞系之间有所不同。确定用于特定细胞系的最佳寡核苷酸浓度的方法在本领域中是熟知的。当用LIPOFECTAMINE转染时，通常使用浓度在1nM至300nM范围内的寡核苷酸。当使用电穿孔进行转染时，使用625nM至20,000nM范围内的较高浓度的寡核苷酸。
RNA分离
可对总细胞RNA或聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离方法在本领域中是熟知的。RNA是使用本领域中熟知的方法，例如使用TRIZOL试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)，根据制造商推荐的方案来制备。
分析对靶水平或表达的抑制
对SOD-1核酸的水平或表达的抑制可以用本领域中已知的多种方式来测定。举例来说，靶核酸水平可通过例如RNA印迹分析、竞争性聚合酶链反应(PCR)或定量实时PCR来定量。可对总细胞RNA或聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离方法在本领域中是熟知的。RNA印迹分析在本领域中也是常规的。定量实时PCR宜使用商购的ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测系统(可获自PE-Applied Biosystems,Foster City,CA且根据制造商说明书来使用)完成。
对靶RNA水平的定量实时PCR分析
可通过定量实时PCR，使用ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测系统(PE-Applied Biosystems,Foster City,CA)根据制造商说明书来对靶RNA水平进行定量。定量实时PCR的方法在本领域中为熟知的。
在实时PCR之前，使分离的RNA经历逆转录酶(RT)反应，产生互补的DNA(cDNA)，其接着用作实时PCR扩增的底物。在同一样品孔中依序进行RT和实时PCR反应。RT和实时PCR试剂可获自Invitrogen(Carlsbad,CA)。RT实时PCR反应通过本领域技术人员熟知的方法进行。
通过实时PCR获得的基因(或RNA)目标量是使用表达恒定的基因(如亲环素A(cyclophilin A))的表达水平或通过使用RIBOGREEN(Invitrogen,Inc.Carlsbad,CA)定量总RNA来标准化。亲环素A表达是通过实时PCR，通过与目标同时操作、复合操作或分开操作来定量。总RNA使用RIBOGREEN RNA定量试剂(Invetrogen,Inc.Eugene,OR)来定量。通过RIBOGREEN定量RNA的方法是教导于Jones,L.J.等(Analytical Biochemistry,1998,265,368-374)中。使用CYTOFLUOR4000仪器(PE Applied Biosystems)来测量RIBOGREEN荧光。
探针及引物被设计来与SOD-1核酸杂交。用于设计实时PCR探针和引物的方法在本领域中是熟知的，且可包括使用软件，如PRIMER EXPRESS软件(Applied Biosystems,Foster City,CA)。
分析蛋白质水平
对SOD-1核酸的反义抑制可通过测量SOD-1蛋白质水平来评估。SOD-1的蛋白质水平可以本领域中熟知的多种方式来评价或定量，如免疫沈淀法、蛋白质印迹分析(免疫印迹法)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量蛋白质测定、蛋白质活性测定(例如卡斯蛋白酶活性测定)、免疫组织化学、免疫细胞化学或荧光活化细胞分选法(FACS)。针对靶的抗体可被识别且获自多种来源，如MSRS抗体目录(Aerie Corporation,Birmingham,MI)，或可经由本领域中熟知的常规单克隆或多克隆抗体生成方法来制备。在某些实施方案中，本文的化合物提供了改善的蛋白质水平的减少。
体内测试反义化合物
在动物体内测试反义化合物(例如修饰寡核苷酸)以评估它们抑制SOD-1表达和产生表型改变(诸如改善的运动功能)的能力。在某些实施方案中，运动功能在动物中通过行走启动分析、疲劳转棒(rotarod)、握力、爬杆、开放现场性能、平衡木、后肢足迹测试测量。可在正常动物或实验疾病模型中进行测试。为了向动物施用，在药学上可接受的稀释剂(如磷酸盐缓冲的生理盐水)中配制寡核苷酸。施用包括胃肠外的施用途径，诸如腹膜内、静脉内和皮下。寡核苷酸剂量和给药频率取决于许多因素，诸如但不限于施用途径和动物体重。在用寡核苷酸处理一段时间后，自CNS组织或CSF分离RNA，并且测量SOD-1核酸表达的改变。
某些适应症
在某些实施方案中，本发明提供治疗个体的方法、化合物及组合物，其包括施用本文所述的一种或多种药物组合物。在某些实施方案中，个体具有神经退行性疾病。在某些实施方案中，个体处于发展神经退行性疾病(包括但不限于肌萎缩性侧索硬化(ALS))的风险中。在某些实施方案中，个体已经鉴定具有SOD-1相关的疾病。在某些实施方案中，本发明提供防治性减少个体的表达的方法。某些实施方案包括通过向个体施用治疗有效量的靶向SOD-1核酸的反义化合物来治疗有此需要的个体。
在一个实施方案中，施用治疗有效量的靶向SOD-1核酸的反义化合物同时伴随监测个体中SOD-1水平以测定个体对施用反义化合物的反应。个体对施用反义化合物的反应可由医师用于确定治疗性干预的量及持续时间。
在某些实施方案中，施用靶向SOD-1核酸的反义化合物会导致SOD-1的表达减少至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，或处于由这些值的任何两个所界定的范围内。在某些实施方案中，在动物中施用靶向SOD-1核酸的反义化合物会导致改善的运动功能。在某些实施方案中，施用SOD-1反义化合物会改善运动功能至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，或处于由这些值的任何两个所界定的范围内。
在某些实施方案中，包含靶向SOD-1的反义化合物的药物组合物被用于制备用于治疗患有或容易患有神经退行性疾病(包括肌萎缩性侧索硬化(ALS))的患者的药物。
某些比较组合物
靶向人类SOD-1的反义寡核苷酸描述在早期的出版物中(参见WO 2005/040180，以引用的方式整体并入本文)。本文描述的若干寡核苷酸(ISIS 333611、ISIS 146144、ISIS146145、ISIS 150437、ISIS 150441、ISIS 150443、ISIS 150444、ISIS 150445、ISIS150446、ISIS 150447、ISIS 150448、ISIS 150449、ISIS 150452、ISIS 150454、ISIS150458、ISIS 150460、ISIS 150462-150467、ISIS 150470、ISIS 150472、ISIS 150474、ISIS 150475、ISIS 150476、ISIS 150479-150483、ISIS 150488、ISIS 150489、ISIS150490、ISIS 150491-150493、ISIS 150495-150498、ISIS 150511、ISIS 333605、ISIS333606、ISIS 333609-333617、ISIS 333619、ISIS 333620-333636、ISIS 333638和ISIS333640)在本文描述的新反义化合物整个选择筛选中用作对比化合物。
在某些实施方案中，具有序列CCGTCGCCCTTCAGCACGCA(以SEQ ID NO:21形式并入本文)的5-10-5MOE缺口聚物ISIS 333611被用作对比化合物，其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联，每个胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶，核苷1-5和16-20(从5’至3’)的每个包含2’-O-甲氧基乙基。ISIS 333611被选作对比化合物，是因为它如WO 2005/040180所述在各种研究中展现出高水平的剂量依赖性抑制。此外，1期人类临床试验使用ISIS 333611完成。参见MILLER等，“An antisense oligonucleotide against SOD1delivered intrathecallyfor patients with SOD1familial amyotrophic lateral sclerosis:a phase 1,randomised,first-in-man study”Lancet Neurol.(2013)12(5):435-442。因此，ISIS333611被视为具有可接受的安全特性(以使其在人类患者中测试)的高度有效和高度有力的化合物。
在某些实施方案中，本文描述的化合物从相对于在WO 2005/040180中描述的反义化合物的一种或多种改进的性质中受益。改进的性质中的一些在本文所提供的实施例中证明。在某些实施方案中，本文所述的化合物在各种体外和体内研究中比本文所述的对比化合物(包括ISIS 333611)更有效、更有利和/或更耐受。在某些实施方案中，ISIS 666853、ISIS 666859、ISIS 666919、ISIS 666921、ISIS 666922、ISIS 666869、ISIS 666870和ISIS666867在各种体外和体内研究中比本文所述的对比化合物(包括ISIS 333611)更有效和/或更有利。在某些实施方案中，ISIS 666853、ISIS 666859、ISIS 666919、ISIS 666921、ISIS 666922、ISIS 666869、ISIS 666870和ISIS 666867在动物一种或多种耐受性测定中比本文所述的对比化合物(包括ISIS 333611)更耐受。尽管333611可以充分良好的耐受以进展至人临床试验。
在某些实施方案中，本文所述的化合物比对比化合物更有效，由于当在人细胞(例如HepG2A431或SH-SY5Y细胞系)中测试时，其体外IC50小于2μM、小于1.9μM、小于1.8μM、小于1.7μM、小于1.6μM、小于1.5μM、小于1.4μM、小于1.3μM、小于1.2μM、小于1.1μM、小于1μM、小于0.9μM、小于0.8μM、小于0.7μM、小于0.6μM、小于0.5μM、小于0.4μM、小于0.3μM、小于0.2μM、小于0.1μM(例如，参见实施例6-11)。
在某些实施方案中，本文所述的某些化合物比对比化合物更有效，由于它们在体内抑制SOD-1表达的能力。在某些实施方案中，所述化合物，例如，在转基因动物模型中，抑制腰椎脊髓和颈椎脊髓中的SOD-1至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
在某些实施方案中，本文所述的某些化合物基于在大鼠、小鼠和/或猴子中降低的小胶质细胞标志物水平(例如，IBA1)、降低的星形细胞标志物水平(例如，GFAP)和/或FOB分数比比较化合物更耐受。参见，例如，实施例14、15、18和19。
ISIS 666853
例如，如实施例12(下文)中提供，在SOD-1转基因大鼠模型中，当给药30μL16.67mg/ml稀释在PBS中的寡核苷酸溶液(500μg的终剂量)时，ISIS 666853在腰椎脊髓中达成81％的抑制并且在颈椎脊髓中达成74％的抑制，然而ISIS 333611在腰椎脊髓中达成51％的抑制并且在颈椎脊髓中达成47％的抑制。
例如，如实施例14(下文)中提供，当在Sprague-Dawley大鼠中用3mg寡核苷酸处理3小时后，ISIS 666853达成了0的FOB分数，然而ISIS 333611达成了4的FOB分数。与ISIS333611处理的大鼠相比，ISIS 666853处理的大鼠的小胶质细胞标志物(IBA1)水平和星形细胞标志物(GFAP)水平也降低。
例如，如实施例15(下文)中提供，当使用10、30、100、300或3000μg寡核苷酸鞘内处理时，ISIS 666853在SOD-1转基因大鼠的腰椎组织和颈椎组织中分别达成81.3和242.6的ED50。腰椎组织和颈椎组织中的ED50不可以在ISIS 333611处理的转基因大鼠中计算，因为提交的抑制人SOD-1 mRNA的最高测试浓度(3000μg)大于55-65％。
例如，如实施例16(下文)中提供，剂量为1mg至3mg的ISI S666853分别达成了0.0和0.5的3小时FOB分数，然而ISIS 333611分别达成了3.0和4.9的FOB分数。剂量为1mg至3mg的ISI S666853分别达成了0.0和0.0的8周FOB分数，然而ISIS 333611分别达成了0.0和1.2的FOB分数。
例如，如实施例17(下文)中提供，在SOD-1转基因小鼠中，当使用脑室内推注10、30、100、300或700μg寡核苷酸处理时，ISIS 666853在腰椎脊髓和皮层组织中分别达成136和188的ED50，然而ISIS 333611在腰椎脊髓和皮层组织中分别达成401和786的ED50。
例如，如实施例18(下文)中提供，当在C57bl6小鼠中用700μg寡核苷酸处理3小时后，ISIS 666853达成了1.25的FOB分数，然而ISIS 333611达成了6.5的FOB分数。与ISIS333611处理的小鼠相比，ISIS 666853处理的小鼠的小胶质细胞标志物(IBA1)水平和星形细胞标志物(GFAP)水平也降低。
ISIS 666859
例如，如实施例12(下文)中提供，在SOD-1转基因大鼠模型中，当给药30μL16.67mg/ml稀释在PBS中的寡核苷酸溶液(500μg的终剂量)时，ISIS 666859在腰椎脊髓中达成79％的抑制并且在颈椎脊髓中达成64％的抑制，然而ISIS 333611在腰椎脊髓中达成51％的抑制并且在颈椎脊髓中达成47％的抑制。
例如，如实施例14(下文)中提供，当在Sprague-Dawley大鼠中用3mg寡核苷酸处理3小时后，ISIS 666859达成了1的FOB分数，然而ISIS 333611达成了4的FOB分数。与ISIS333611处理的大鼠相比，ISIS 666859处理的大鼠的小胶质细胞标志物(IBA1)水平和星形细胞标志物(GFAP)水平也降低。
例如，如实施例15(下文)中提供，当使用10、30、100、300或3000μg寡核苷酸鞘内处理时，ISIS 666859在SOD-1转基因大鼠的腰椎组织和颈椎组织中分别达成74.0和358.8的ED50。腰椎组织和颈椎组织中的ED50不可以在ISIS 333611处理的转基因大鼠中计算，因为提交的抑制人SOD-1 mRNA的最高测试浓度(3000μg)大于55-65％。
例如，如实施例16(下文)中提供，剂量为1mg至3mg的ISIS 666859分别达成了0.0和2.1的3小时FOB分数，然而ISIS 333611分别达成了3.0和4.9的FOB分数。剂量为1mg至3mg的ISI S666859分别达成了0.0和0.3的8周FOB分数，然而ISIS 333611分别达成了0.0和1.2的FOB分数。
例如，如实施例17(下文)中提供，在SOD-1转基因小鼠中，当使用脑室内推注10、30、100、300或700μg寡核苷酸处理时，ISIS 666859在腰椎脊髓和皮层组织中分别达成106和206的ED50，然而ISIS 333611在腰椎脊髓和皮层组织中分别达成401和786的ED50。
例如，如实施例18(下文)中提供，当在C57bl6小鼠中用700μg寡核苷酸处理3小时后，ISIS 666859达成了1.75的FOB分数，然而ISIS 333611达成了6.5的FOB分数。与ISIS333611处理的小鼠相比，ISIS 666859处理的小鼠的小胶质细胞标志物(IBA1)水平和星形细胞标志物(GFAP)水平也降低。
ISIS 666919
例如，如实施例12(下文)中提供，在SOD-1转基因大鼠模型中，当给药30μL16.67mg/ml稀释在PBS中的寡核苷酸溶液(500μg的终剂量)时，ISIS 666919在腰椎脊髓中达成76％的抑制并且在颈椎脊髓中达成68％的抑制，然而ISIS 333611在腰椎脊髓中达成51％的抑制并且在颈椎脊髓中达成47％的抑制。
例如，如实施例14(下文)中提供，当在Sprague-Dawley大鼠中用3mg寡核苷酸处理3小时后，ISIS 666919达成了2的FOB分数，然而ISIS 333611达成了4的FOB分数。与ISIS333611处理的大鼠相比，ISIS 666919处理的大鼠的小胶质细胞标志物(IBA1)水平和星形细胞标志物(GFAP)水平也降低。
例如，如实施例15(下文)中提供，当使用10、30、100、300或3000μg寡核苷酸鞘内处理时，ISIS 666919在SOD-1转基因大鼠的腰椎组织和颈椎组织中分别达成104.1和613.5的ED50。腰椎组织和颈椎组织中的ED50不可以在ISIS 333611处理的转基因大鼠中计算，因为提交的抑制人SOD-1 mRNA的最高测试浓度(3000μg)大于55-65％。
例如，如实施例16(下文)中提供，剂量为1mg至3mg的ISI 666919分别达成了1.3和3.5的3小时FOB分数，然而ISIS 333611分别达成了3.0和4.9的FOB分数。剂量为1mg至3mg的ISI S666919分别达成了0.0和0.1的8周FOB分数，然而ISIS 333611分别达成了0.0和1.2的FOB分数。
例如，如实施例17(下文)中提供，在SOD-1转基因小鼠中，当使用脑室内推注10、30、100、300或700μg寡核苷酸处理时，ISIS 666919在腰椎脊髓中达成168的ED50，然而ISIS333611在腰椎脊髓中分别达成401的ED50。
例如，如实施例18(下文)中提供，当在C57bl6小鼠中用700μg寡核苷酸处理3小时后，ISIS 666919达成了0.0的FOB分数，然而ISIS 333611达成了6.5的FOB分数。与ISIS333611处理的小鼠相比，ISIS 666919处理的小鼠的小胶质细胞标志物(IBA1)水平和星形细胞标志物(GFAP)水平也降低。
ISIS 666921
例如，如实施例12(下文)中提供，在SOD-1转基因大鼠模型中，当给药30μL16.67mg/ml稀释在PBS中的寡核苷酸溶液(500μg的终剂量)时，ISIS 66621在腰椎脊髓中达成71％的抑制并且在颈椎脊髓中达成65％的抑制，然而ISIS 333611在腰椎脊髓中达成51％的抑制并且在颈椎脊髓中达成47％的抑制。
例如，如实施例14(下文)中提供，当在Sprague-Dawley大鼠中用3mg寡核苷酸处理3小时后，ISIS 666921达成了2的FOB分数，然而ISIS 333611达成了4的FOB分数。与ISIS333611处理的大鼠相比，ISIS 666919处理的大鼠的小胶质细胞标志物(IBA1)水平和星形细胞标志物(GFAP)水平也降低。
ISIS 666922
例如，如实施例12(下文)中提供，在SOD-1转基因大鼠模型中，当给药30μL16.67mg/ml稀释在PBS中的寡核苷酸溶液(500μg的终剂量)时，ISIS 666922在腰椎脊髓中达成67％的抑制并且在颈椎脊髓中达成62％的抑制，然而ISIS 333611在腰椎脊髓中达成51％的抑制并且在颈椎脊髓中达成47％的抑制。
例如，如实施例14(下文)中提供，当在Sprague-Dawley大鼠中用3mg寡核苷酸处理3小时后，ISIS 666922达成了3的FOB分数，然而ISIS 333611达成了4的FOB分数。与ISIS333611处理的大鼠相比，ISIS 666919处理的大鼠的小胶质细胞标志物(IBA1)水平和星形细胞标志物(GFAP)水平也降低。
ISIS 666869
例如，如实施例12(下文)中提供，在SOD-1转基因大鼠模型中，当给药30μL16.67mg/ml稀释在PBS中的寡核苷酸溶液(500μg的终剂量)时，ISIS 666869在腰椎脊髓中达成82％的抑制并且在颈椎脊髓中达成81％的抑制，然而ISIS 333611在腰椎脊髓中达成51％的抑制并且在颈椎脊髓中达成47％的抑制。
ISIS 666870
例如，如实施例12(下文)中提供，在SOD-1转基因大鼠模型中，当给药30μL16.67mg/ml稀释在PBS中的寡核苷酸溶液(500μg的终剂量)时，ISIS 666870在腰椎脊髓中达成76％的抑制并且在颈椎脊髓中达成68％的抑制，然而ISIS 333611在腰椎脊髓中达成51％的抑制并且在颈椎脊髓中达成47％的抑制。
例如，如实施例15(下文)中提供，当使用10、30、100、300或3000μg寡核苷酸鞘内处理时，ISIS 666870在SOD-1转基因大鼠的腰椎组织和颈椎组织中分别达成139.4和1111的ED50。腰椎组织和颈椎组织中的ED50不可以在ISIS 333611处理的转基因大鼠中计算，因为提交的抑制人SOD-1 mRNA的最高测试浓度(3000μg)大于55-65％。
例如，如实施例17(下文)中提供，在SOD-1转基因小鼠中，当使用脑室内推注10、30、100、300或700μg寡核苷酸处理时，ISIS 666870在腰椎脊髓和皮层组织中分别达成148和409的ED50，然而ISIS 333611在腰椎脊髓和皮层组织中分别达成401和786的ED50。
例如，如实施例18(下文)中提供，当在C57bl6小鼠中用700μg寡核苷酸处理3小时后，ISIS 666870达成了4.75的FOB分数，然而ISIS 333611达成了6.5的FOB分数。
ISIS 666867
例如，如实施例12(下文)中提供，在SOD-1转基因大鼠模型中，当给药30μL16.67mg/ml稀释在PBS中的寡核苷酸溶液(500μg的终剂量)时，ISIS 666867在腰椎脊髓中达成59％的抑制并且在颈椎脊髓中达成48％的抑制，然而ISIS 333611在腰椎脊髓中达成51％的抑制并且在颈椎脊髓中达成47％的抑制。
某些组合物
1.ISIS 666853
在某些实施方案中，ISIS 666853被表征为5-10-5MOE缺口聚物，其具有CAGGATACATTTCTACAGCT的序列(从5’至3’)(以SEQ ID NO:725形式并入本文)，其中1-5和16-20核苷中的每个为2’-O-甲氧基乙基核糖修饰核苷，并且6-15核苷中的每个为2’-脱氧核苷，其中在2至3、4至5、16至17和18至19核苷之间的核苷间键联为磷酸二酯键联，并且在1至2、3至4、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16、17至18和19至20核苷之间的核苷间键联为硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶为5’-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，通过以下化学符号描述ISIS 666853：mCes Aeo Ges Geo AesTds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 666853：
Figure BDA0001148942550000821
结构1.ISIS 666853
2.ISIS 666859
在某些实施方案中，ISIS 666859被表征为修饰寡核苷酸，其具有TTAATGTTTATCAGGAT的序列(从5’至3’)(以SEQ ID NO:1351形式并入本文)并由17个核苷组成，其中1-4和15-17核苷中的每个为2’-O-甲氧基乙基核糖核苷，其中13和14核苷为cEt修饰的核苷，其中5-12核苷中的每个为2’-脱氧核糖核苷，其中在2至3、3至4、13至14和14至15核苷之间的核苷间键联为磷酸二酯键联，并且在1至2、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、15至16和16至17核苷之间的核苷间键联为硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶为5’-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，通过以下化学符号描述ISIS 666859：Tes Teo Aeo Aes TdsGds Tds Tds Tds Ads Tds mCds Ako Gko Ges Aes Te；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
k＝cEt修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 666859：
Figure BDA0001148942550000841
结构2.ISIS 666859
3.ISIS 666919
在某些实施方案中，ISIS 666919被表征为修饰寡核苷酸，其具有GGATACATTTCTACAGC的序列(从5’至3’)(以SEQ ID NO:1342形式并入本文)并由17个核苷组成，其中1-4和16-17核苷中的每个为2’-O-甲氧基乙基核糖修饰核苷，其中14和15核苷为cEt修饰的核苷，其中5-13核苷中的每个为2’-脱氧核糖核苷，其中在2至3、3至4、4至5和14至15核苷之间的核苷间键联为磷酸二酯键联，并且在1至2、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、15至16和16至17核苷之间的核苷间键联为硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶为5’-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，通过以下化学符号描述ISIS 666919：Ges Geo Aeo Teo AdsmCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCko Aks Ges mCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
k＝cEt修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 666919：
Figure BDA0001148942550000851
结构3.ISIS 666919
4.ISIS 666921
在某些实施方案中，ISIS 666921被表征为修饰寡核苷酸，其具有GGATACATTTCTACAGC的序列(从5’至3’)(以SEQ ID NO:1342形式并入本文)并由17个核苷组成，其中1-5和16-17核苷中的每个为2’-O-甲氧基乙基核糖修饰核苷，其中14-15核苷为cEt修饰的核苷，其中6-13核苷中的每个为2’-脱氧核糖核苷，其中在2至3、3至4、4至5和14至15核苷之间的核苷间键联为磷酸二酯键联，并且在1至2、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、15至16和16至17核苷之间的核苷间键联为硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶为5’-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，通过以下化学符号描述ISIS 666921：Ges Geo Aeo Teo AesmCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCko Aks Ges mCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
k＝cEt修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 666921：
Figure BDA0001148942550000871
结构4.ISIS 666921
5.ISIS 666922
在某些实施方案中，ISIS 666922被表征为修饰寡核苷酸，其具有GGATACATTTCTACAGC的序列(从5’至3’)(以SEQ ID NO:1342形式并入本文)并由17个核苷组成，其中1-4和15-17核苷中的每个为2’-O-甲氧基乙基核糖修饰核苷，其中5和14核苷为cEt修饰的核苷，其中6-13核苷中的每个为2’-脱氧核糖核苷，其中在2至3、3至4、4至5和14至15核苷之间的核苷间键联为磷酸二酯键联，并且在1至2、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、15至16和16至17核苷之间的核苷间键联为硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶为5’-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，通过以下化学符号描述ISIS 666922：Ges Geo Aeo Teo AksmCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCko Aes Ges mCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
k＝cEt修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 666922：
Figure BDA0001148942550000881
结构5.ISIS 666922
6.ISIS 666869
在某些实施方案中，ISIS 666869被表征为修饰寡核苷酸，其具有AGTGTTTAATGTTTATC的序列(从5’至3’)(以SEQ ID NO:1173形式并入本文)并由17个核苷组成，其中1、3、14和16-17核苷中的每个为2’-O-甲氧基乙基核糖修饰核苷，其中2、4、13和15核苷为cEt修饰的核苷，其中5-12核苷中的每个为2’-脱氧核糖核苷，其中在2至3、3至4、13至14和14至15核苷之间的核苷间键联为磷酸二酯键联，并且在1至2、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、15至16和16至17核苷之间的核苷间键联为硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶为5’-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，通过以下化学符号描述ISIS 666869：Aes Gko Teo Gks TdsTds Tds Ads Ads Tds Gds Tds Tko Teo Aks Tes mCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
k＝cEt修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 666869：
Figure BDA0001148942550000901
结构6.ISIS 666869
7.ISIS 666870
在某些实施方案中，ISIS 666870被表征为修饰寡核苷酸，其具有AGTGTTTAATGTTTATC的序列(从5’至3’)(以SEQ ID NO:1173形式并入本文)并由17个核苷组成，其中1、3、13-17核苷中的每个为2’-O-甲氧基乙基核糖修饰核苷，其中2和4核苷为cEt修饰的核苷，其中5-12核苷中的每个为2’-脱氧核糖核苷，其中在2至3、3至4、13至14和14至15核苷之间的核苷间键联为磷酸二酯键联，并且在1至2、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、15至16和16至17核苷之间的核苷间键联为硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶为5’-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，通过以下化学符号描述ISIS 666870：Aes Gko Teo Gks TdsTds Tds Ads Ads Tds Gds Tds Teo Teo Aes Tes mCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
k＝cEt修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 666870：
Figure BDA0001148942550000911
结构7.ISIS 666870
8.ISIS 666867
在某些实施方案中，ISIS 666867被表征为修饰寡核苷酸，其具有AGTGTTTAATGTTTATC的序列(从5’至3’)(以SEQ ID NO:1173形式并入本文)并由17个核苷组成，其中1-2和13-17核苷中的每个为2’-O-甲氧基乙基核糖修饰核苷，其中3和4核苷为cEt修饰的核苷，其中5-12核苷中的每个为2’-脱氧核糖核苷，其中在2至3、3至4、13至14和14至15核苷之间的核苷间键联为磷酸二酯键联，并且在1至2、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、15至16和16至17核苷之间的核苷间键联为硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶为5’-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，通过以下化学符号描述ISIS 666867：Aes Geo Tko Gks TdsTds Tds Ads Ads Tds Gds Tds Teo Teo Aes Tes mCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
k＝cEt修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联。
在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 666867：
Figure BDA0001148942550000931
结构8.ISIS 666867
实施例
非限制性公开且以引用方式并入
虽然已根据某些实施方案具体描述了本文所述的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用以说明本文所述的化合物并且不意图限制所述化合物。本申请中所述的各参考文献以引用的方式整体并入本文。
实施例1：在HepG2中通过MOE缺口聚物对人可溶性超氧化物歧化酶1(SOD-1)的抑制
设计靶向可溶性超氧化物歧化酶1(SOD-1)核酸的修饰寡核苷酸且测试其在体外对SOD-1 mRNA的作用。先前在WO 2005/040180中公开的ISIS 146144、ISIS 146145、ISIS150437、ISIS 150441、ISIS 150443、ISIS 150444、ISIS 150445、ISIS 150446、ISIS150447、ISIS 150448、ISIS 150449、ISIS 150452、ISIS 150454、ISIS 150458、ISIS150460、ISIS 150462-150467、ISIS 150470、ISIS 150472、ISIS 150474、ISIS 150475、ISIS 150476、ISIS 150479-150483、ISIS 150488、ISIS 150489、ISIS 150490、ISIS150491-150493、ISIS 150495-150498、ISIS 150511、ISIS 333605、ISIS 333606、ISIS333609-333617、ISIS 333619、ISIS 333620-333636、ISIS 333638和ISIS 333640也包括在本测定中。先前公开在WO 2005/040180中的ISIS 333611也被指定为基准或对比寡核苷酸。ISIS 333611最近在人临床试验中被测试。参见MILLER等，“An antisenseoligonucleotide against SOD1delivered intrathecally for patients withSOD1familial amyotrophic lateral sclerosis:a phase 1,randomised,first-in-manstudy”Lancet Neurol.(2013)12(5):435-442。
在具有类似培养条件的一系列实验中测试修饰寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。使用电穿孔以7,000nM修饰寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的HepG2细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量SOD-1 mRNA水平。
使用人类引物探针集RTS3898(正向序列CTCTCAGGAGACCAT TGCATCA，在本文中指定为SEQ ID NO:11；反向序列TCCTGTC TTTGTACTTTCTTCATTTCC，在本文中指定为SEQ IDNO:12；探针序列CCGCACACTGGTGGTCCATGAAAA，在本文中指定为SEQ ID NO:13)测量mRNA水平。在寡核苷酸与引物探针组的扩增子重叠的情况下，使用替代的人类引物探针集HTS90(正向序列CGTGGC CTAGCGAGTTATGG，在本文中指定为SEQ ID NO:14；反向序列GAAATTGATGATGCCCTGCA，在本文中指定为SEQ ID NO:15；探针序列ACGAAGGCCGTGTGCGTGCTGX，在本文中指定为SEQ ID NO:16)测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0001148942550000941
所测量的总R NA含量调整SOD-1 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的SOD-1的抑制百分比。‘n.d.’表示使用特定的引物探针集没有测量到抑制水平。
以下表中新设计的修饰寡核苷酸被设计为5-10-5MOE缺口聚物。5-10-5MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核糖核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1(GENBANK登录号NM_000454.4)的人SOD-1mRNA或在本文中指定为SEQ ID NO:2(GENBANK登录号NT_011512.10，从18693000至18704000截短的核苷酸)的人SOD-1基因组序列。‘n/a’表示修饰寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表1
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的5-10-5MOE缺口聚物对SOD-1 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001148942550000951
Figure BDA0001148942550000961
Figure BDA0001148942550000971
Figure BDA0001148942550000981
Figure BDA0001148942550000991
表2
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的5-10-5MOE缺口聚物对SOD-1 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001148942550000992
Figure BDA0001148942550001001
Figure BDA0001148942550001011
Figure BDA0001148942550001021
表3
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的5-10-5MOE缺口聚物对SOD-1 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001148942550001031
Figure BDA0001148942550001041
Figure BDA0001148942550001051
Figure BDA0001148942550001061
表4
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的5-10-5MOE缺口聚物对SOD-1 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001148942550001062
Figure BDA0001148942550001071
Figure BDA0001148942550001081
Figure BDA0001148942550001091
Figure BDA0001148942550001101
Figure BDA0001148942550001111
表5
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的5-10-5MOE缺口聚物对SOD-1 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001148942550001112
Figure BDA0001148942550001121
Figure BDA0001148942550001131
Figure BDA0001148942550001141
Figure BDA0001148942550001151
表6
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的5-10-5MOE缺口聚物对SOD-1 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001148942550001152
Figure BDA0001148942550001161
Figure BDA0001148942550001171
Figure BDA0001148942550001181
表7
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的5-10-5MOE缺口聚物对SOD-1 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001148942550001191
Figure BDA0001148942550001201
Figure BDA0001148942550001211
Figure BDA0001148942550001221
表8
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的5-10-5MOE缺口聚物对SOD-1 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001148942550001222
Figure BDA0001148942550001231
Figure BDA0001148942550001241
Figure BDA0001148942550001251
Figure BDA0001148942550001261
表9
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的5-10-5MOE缺口聚物对SOD-1 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001148942550001262
Figure BDA0001148942550001271
Figure BDA0001148942550001281
Figure BDA0001148942550001291
Figure BDA0001148942550001301
表10
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的5-10-5MOE缺口聚物对SOD-1 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001148942550001302
Figure BDA0001148942550001311
Figure BDA0001148942550001321
Figure BDA0001148942550001331
Figure BDA0001148942550001341
实施例2：在HepG2中通过MOE缺口聚物对人SOD-1的抑制
设计靶向可溶性超氧化物歧化酶1(SOD-1)核酸的修饰寡核苷酸且测试其在体外对SOD-1 mRNA的作用。先前在WO 2005/040180中公开的ISIS 146143、ISIS 150438-150440、ISIS 150442、ISIS 150450、ISIS 150455-150457、ISIS 150459、ISIS 150461、ISIS 150469、ISIS 150473、ISIS 150478、ISIS 150484、ISIS 150486、ISIS 150494、ISIS150508-150510、ISIS 333607、ISIS 333608、ISIS 333611、ISIS 333618也包括在本测定中。在具有类似培养条件的一系列实验中测试修饰寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。使用电穿孔以5,000nM修饰寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的HepG2细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量SOD-1mRNA水平。
使用人引物探针集RTS3898测量mRNA水平。在寡核苷酸与引物探针组的扩增子重叠的情况下，使用替代的人类引物探针集HTS90测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0001148942550001342
所测量的总RNA含量调整SOD-1 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的SOD-1的抑制百分比。‘n.d.’表示使用特定的引物探针集没有测量到抑制水平。
以下表中新设计的修饰寡核苷酸被设计为5-10-5MOE缺口聚物。5-10-5MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核糖核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1(GENBANK登录号NM_000454.4)的人SOD-1mRNA或在本文中指定为SEQ ID NO:2(GENBANK登录号NT_011512.10，从18693000至18704000截短的核苷酸)的人SOD-1基因组序列。‘n/a’表示修饰寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表11
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的5-10-5MOE缺口聚物对SOD-1 RNA的抑制百分比
Figure BDA0001148942550001351
Figure BDA0001148942550001361
Figure BDA0001148942550001371
Figure BDA0001148942550001381
表12
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的5-10-5MOE缺口聚物对SOD-1 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001148942550001391
Figure BDA0001148942550001401
Figure BDA0001148942550001411
Figure BDA0001148942550001421
实施例3：在HepG2中通过脱氧、MOE和cEt缺口聚物对人SOD-1的抑制
设计靶向可溶性超氧化物歧化酶1(SOD-1)核酸的修饰寡核苷酸且测试其在体外对SOD-1 mRNA的作用。先前公开在WO 2005/040180中的ISIS 333611被包括作为基准。如上实施例1所述的5-10-5MOE缺口聚物ISIS 590067、ISIS 590074、ISIS 590082、ISIS590130、ISIS 590138和ISIS 590146也被包括在测定中。具有与ISIS 333611相似的序列但具有脱氧、MOE和cEt糖修饰的ISIS 590512也被包括在本研究中。
在具有类似培养条件的一系列实验中测试修饰寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。使用电穿孔以3,000nM修饰寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的HepG2细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量SOD-1 mRNA水平。
使用人引物探针集RTS3898测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0001148942550001431
所测量的总RNA含量调整SOD-1 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的SOD-1的抑制百分比。‘n.d.’表示未检测到抑制水平。
以下表中新设计的修饰寡核苷酸被设计为脱氧、MOE和cEt缺口聚物。缺口聚物的长度为17个核苷，其中核苷具有MOE糖修饰、cEt糖修饰或脱氧部分。每个寡核苷酸的糖化学以化学列来表示，其中‘k’表示cEt修饰糖，‘d’表示2’-脱氧核糖，并且‘e’表示2’-MOE修饰糖。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1(GENBANK登录号NM_000454.4)的人SOD-1 mRNA或在本文中指定为SEQ ID NO:2(GENBANK登录号NT_011512.10，从18693000至18704000截短的核苷酸)的人SOD-1基因组序列。‘n/a’表示修饰寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表13
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的脱氧、MOE和cEt缺口聚物对SOD-1mRNA的抑制
Figure BDA0001148942550001441
Figure BDA0001148942550001451
Figure BDA0001148942550001461
Figure BDA0001148942550001471
表14
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的脱氧、MOE和cEt缺口聚物对SOD-1mRNA的抑制
Figure BDA0001148942550001472
Figure BDA0001148942550001481
Figure BDA0001148942550001491
Figure BDA0001148942550001501
表15
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的脱氧、MOE和cEt缺口聚物对SOD-1mRNA的抑制
Figure BDA0001148942550001511
Figure BDA0001148942550001521
Figure BDA0001148942550001531
Figure BDA0001148942550001541
表16
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的脱氧、MOE和cEt缺口聚物对SOD-1mRNA的抑制
Figure BDA0001148942550001542
Figure BDA0001148942550001551
Figure BDA0001148942550001561
Figure BDA0001148942550001571
Figure BDA0001148942550001581
表17
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的脱氧、MOE和cEt缺口聚物对SOD-1mRNA的抑制
Figure BDA0001148942550001582
Figure BDA0001148942550001591
Figure BDA0001148942550001601
实施例4：在HepG2中通过脱氧、MOE和cEt缺口聚物对人SOD-1的抑制
设计靶向可溶性超氧化物歧化酶1(SOD-1)核酸的修饰寡核苷酸且测试其在体外对SOD-1 mRNA的作用。先前公开在WO 2005/040180中的5-10-5MOE缺口聚物ISIS 333611被包括作为基准。
在具有类似培养条件的一系列实验中测试修饰寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。使用电穿孔以4,000nM修饰寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的HepG2细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量SOD-1 mRNA水平。
使用人引物探针集RTS3898测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0001148942550001611
所测量的总RNA含量调整SOD-1 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的SOD-1的抑制百分比。‘n.d.’表示未检测到抑制水平。
以下表中新设计的修饰寡核苷酸被设计为脱氧、MOE和cEt缺口聚物或5-10-5缺口聚物。5-10-5MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核糖核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。脱氧、MOE和cEt寡核苷酸的长度为17个核苷，其中核苷具有MOE糖修饰、cEt糖修饰或脱氧部分。每个寡核苷酸的糖化学以化学列来表示，其中‘k’表示cEt修饰糖，‘d’表示2’-脱氧核糖，并且‘e’表示2’-MOE修饰糖。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1(GENBANK登录号NM_000454.4)的人SOD-1mRNA或在本文中指定为SEQ ID NO:2(GENBANK登录号NT_011512.10，从18693000至18704000截短的核苷酸)的人SOD-1基因组序列。‘n/a’表示修饰寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表18
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的5-10-5MOE缺口聚物对SOD-1 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001148942550001621
Figure BDA0001148942550001631
Figure BDA0001148942550001641
Figure BDA0001148942550001651
表19
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的脱氧、MOE和cEt缺口聚物对SOD-1mRNA的抑制
Figure BDA0001148942550001652
Figure BDA0001148942550001661
Figure BDA0001148942550001671
Figure BDA0001148942550001681
Figure BDA0001148942550001691
表20
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的脱氧、MOE和cEt缺口聚物对SOD-1mRNA的抑制
Figure BDA0001148942550001701
Figure BDA0001148942550001711
Figure BDA0001148942550001721
Figure BDA0001148942550001731
Figure BDA0001148942550001741
Figure BDA0001148942550001751
实施例5：在HepG2中通过脱氧、MOE和cEt缺口聚物对人SOD-1的抑制
设计靶向SOD-1核酸的修饰寡核苷酸且测试其在体外对SOD-1mRNA的作用。先前公开在WO 2005/040180中的5-10-5MOE缺口聚物ISIS 333611被包括作为基准。
在具有类似培养条件的一系列实验中测试修饰寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。使用电穿孔以5,000nM修饰寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的HepG2细胞。在约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量SOD-1 mRNA水平。
使用人引物探针集RTS3898测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0001148942550001761
所测量的总RNA含量调整SOD-1 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的SOD-1的抑制百分比。‘n.d.’表示未检测到抑制水平。
以下表中新设计的修饰寡核苷酸被设计为脱氧、MOE和cEt缺口聚物。缺口聚物的长度为17个核苷，其中核苷具有MOE糖修饰、cEt糖修饰或脱氧部分。每个寡核苷酸的糖化学以化学列来表示，其中‘k’表示cEt修饰糖，‘d’表示2’-脱氧核糖，并且‘e’表示2’-MOE修饰糖。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1(GENBANK登录号NM_000454.4)的人SOD-1 mRNA或在本文中指定为SEQ ID NO:2(GENBANK登录号NT_011512.10，从18693000至18704000截短的核苷酸)的人SOD-1基因组序列。‘n/a’表示修饰寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表21
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的脱氧、MOE和cEt缺口聚物对SOD-1mRNA的抑制
Figure BDA0001148942550001771
Figure BDA0001148942550001781
Figure BDA0001148942550001791
Figure BDA0001148942550001801
Figure BDA0001148942550001811
表22
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的脱氧、MOE和cEt缺口聚物对SOD-1mRNA的抑制
Figure BDA0001148942550001812
Figure BDA0001148942550001821
Figure BDA0001148942550001831
Figure BDA0001148942550001841
Figure BDA0001148942550001851
表23
由靶向SEQ ID NO:1和/或2的脱氧、MOE和cEt缺口聚物对SOD-1mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001148942550001852
Figure BDA0001148942550001861
Figure BDA0001148942550001871
Figure BDA0001148942550001881
Figure BDA0001148942550001891
实施例6：在HepG2细胞中由修饰寡核苷酸对人SOD-1的剂量依赖性抑制
选择来自以上所述的研究且对SOD-1 mRNA展现体外显著抑制的缺口聚物且在HepG2细胞中以各种剂量测试。基准化合物ISIS 333611和先前公开在WO 2005/040180中的其他化合物，包括ISIS 146144、146145、150445、150446、150447、150454、150463、150465、333606、333609和333611也被测试。
在具有类似培养条件的一系列实验中测试修饰寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。将细胞以20,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.813μM、1.625μM、3.250μM、6.500μM以及13.000μM浓度的修饰寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量SOD-1 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3898测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0001148942550001903
所测量的总RNA含量调整SOD-1 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的SOD-1的抑制百分比。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在寡核苷酸处理的细胞中，SOD-1 mRNA水平以剂量依赖性显著降低。
表24
SOD-1 mRNA的剂量依赖性抑制
Figure BDA0001148942550001901
表25
SOD-1 mRNA的剂量依赖性抑制
Figure BDA0001148942550001902
Figure BDA0001148942550001911
表26
SOD-1 mRNA的剂量依赖性抑制
Figure BDA0001148942550001912
表27
SOD-1 mRNA的剂量依赖性抑制
Figure BDA0001148942550001913
Figure BDA0001148942550001921
实施例7：在HepG2细胞中由修饰寡核苷酸对人SOD-1的剂量依赖性抑制
选择来自以上所述的研究且对SOD-1 mRNA展现体外显著抑制的缺口聚物且在HepG2细胞中以各种剂量测试。先前都公开于WO 2005/040180中的基准化合物ISIS 333611和ISIS 333625也被测试。
在具有类似培养条件的一系列实验中测试修饰寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。将细胞以20,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.148μM、0.444μM、1.330μM、4.000μM以及12.000μM浓度的修饰寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量SOD-1 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3898或HTS90测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0001148942550001923
所测量的总RNA含量调整SOD-1 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的SOD-1的抑制百分比。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在寡核苷酸处理的细胞中，SOD-1 mRNA水平以剂量依赖性显著降低。
表28
使用引物探针集RTS3898的剂量反应测定
Figure BDA0001148942550001922
Figure BDA0001148942550001931
表29
使用引物探针集HTS90的剂量反应测定
Figure BDA0001148942550001932
实施例8：在HepG2细胞中由修饰寡核苷酸对人SOD-1的剂量依赖性抑制
选择来自以上所述的研究且对SOD-1 mRNA展现体外显著抑制的缺口聚物且在HepG2细胞中以各种剂量测试。先前都公开于WO 2005/040180中的基准化合物ISIS 333611和额外的化合物包括ISIS 146143、150442、195753、333607和333608也被测试。
在具有类似培养条件的一系列实验中测试修饰寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。将细胞以20,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.1875μM、0.7500μM、3.000μM以及12.0000μM浓度的修饰寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量SOD-1mRNA水平。使用人引物探针集RTS3898测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0001148942550001942
所测量的总RNA含量调整SOD-1 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的SOD-1的抑制百分比。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在寡核苷酸处理的细胞中，SOD-1 mRNA水平以剂量依赖性显著降低。
表30
SOD-1 mRNA的剂量依赖性抑制
Figure BDA0001148942550001941
表31
SOD-1 mRNA的剂量依赖性抑制
Figure BDA0001148942550001951
表32
SOD-1 mRNA的剂量依赖性抑制
Figure BDA0001148942550001952
Figure BDA0001148942550001961
表33
SOD-1 mRNA的剂量依赖性抑制
Figure BDA0001148942550001962
表34
SOD-1 mRNA的剂量依赖性抑制
Figure BDA0001148942550001963
Figure BDA0001148942550001971
实施例9：HepG2细胞中具有混合主链化学的缺口聚物对人SOD-1的剂量依赖性抑制
基于以上所述研究中公开的寡核苷酸的序列设计额外的缺口聚物。寡核苷酸被设计为5-10-5MOE、5-8-5MOE和脱氧、MOE和cEt寡核苷酸。5-10-5MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核糖核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5-8-5MOE缺口聚物的长度为18个核苷，其中，中心缺口区段包含八个2’-脱氧核糖核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。脱氧、MOE和cEt寡核苷酸的长度为16或17个核苷，其中每个核苷具有MOE糖修饰、cEt糖修饰或脱氧部分。每个寡核苷酸的糖化学以化学列来表示，其中‘k’表示cEt修饰糖，‘d’表示2’-脱氧核糖，并且‘e’表示2’-MOE修饰糖。每个缺口聚物整个的核苷间键联为磷酸二酯键联或硫代磷酸酯键联。每个寡核苷酸的核苷间键联以主链化学列来表示，其中‘o’指示磷酸二酯键联，并且‘s’指示硫代磷酸酯键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1(GENBANK登录号NM_000454.4)的人SOD-1 mRNA或在本文中指定为SEQ ID NO:2(GENBANK登录号NT_011512.10，从18693000至18704000截短的核苷酸)的人SOD-1基因组序列。
表35
靶向人SOD-1的具有混合主链化学的修饰寡核苷酸
Figure BDA0001148942550001981
Figure BDA0001148942550001991
Figure BDA0001148942550002001
Figure BDA0001148942550002011
Figure BDA0001148942550002021
新设计的寡核苷酸在HepG2细胞中以各种剂量测试。在具有类似培养条件的一系列实验中测试修饰寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。将细胞以20,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.222μM、0.667μM、2.000μM以及6.000μM浓度的修饰寡核苷酸进行转染。在约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量SOD-1 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3898测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0001148942550002023
所测量的总RNA含量调整SOD-1 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的SOD-1的抑制百分比。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在寡核苷酸处理的细胞中，SOD-1 mRNA水平以剂量依赖性显著降低。
表36
剂量反应测定
Figure BDA0001148942550002022
Figure BDA0001148942550002031
表37
剂量反应测定
Figure BDA0001148942550002032
表38
剂量反应测定
Figure BDA0001148942550002041
表39
剂量反应测定
Figure BDA0001148942550002042
实施例10：具有混合主链化学的缺口聚物对人SOD-1的剂量依赖性抑制
基于以上所述研究中公开的寡核苷酸的序列设计额外的缺口聚物。寡核苷酸被设计为脱氧、MOE和cEt寡核苷酸。脱氧、MOE和cEt寡核苷酸的长度为16或17个核苷，其中每个核苷具有MOE糖修饰、cEt糖修饰或脱氧部分。每个寡核苷酸的糖化学以化学列来表示，其中‘k’表示cEt修饰糖，‘d’表示2’-脱氧核糖，并且‘e’表示2’-MOE修饰糖。每个缺口聚物整个的核苷间键联为磷酸二酯键联或硫代磷酸酯键联。每个寡核苷酸的核苷间键联以主链化学列来表示，其中‘o’指示磷酸二酯键联，并且‘s’指示硫代磷酸酯键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1(GENBANK登录号NM_000454.4)的人SOD-1mRNA或在本文中指定为SEQ ID NO:2(GENBANK登录号NT_011512.10，从18693000至18704000截短的核苷酸)的人SOD-1基因组序列。
表40
靶向人SOD-1的具有混合主链化学的修饰寡核苷酸
Figure BDA0001148942550002051
Figure BDA0001148942550002061
新设计的寡核苷酸在A431细胞中以各种剂量测试。在具有类似培养条件的一系列实验中测试修饰寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。将细胞以5,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.12μM、0.60μM、3.00μM以及15.00μM浓度的修饰寡核苷酸向培养基中加入修饰寡核苷酸用于细胞的自由摄取。在约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量SOD-1 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3898测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0001148942550002062
所测量的总RNA含量调整SOD-1 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的SOD-1的抑制百分比。
表41
剂量反应测定
Figure BDA0001148942550002071
表42
剂量反应测定
Figure BDA0001148942550002072
Figure BDA0001148942550002081
表43
剂量反应测定
Figure BDA0001148942550002082
表44
剂量反应测定
Figure BDA0001148942550002083
Figure BDA0001148942550002091
实施例11：具有混合主链化学的缺口聚物对人SOD-1的剂量依赖性抑制
基于以上所述研究中公开的寡核苷酸的序列设计额外的缺口聚物。寡核苷酸被设计为5-10-5MOE缺口聚物、4-8-5MOE缺口聚物、5-8-5MOE缺口聚物、5-8-7MOE缺口聚物、6-8-6MOE缺口聚物、6-9-5MOE缺口聚物、或脱氧、MOE和cEt寡核苷酸。
5-10-5MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。4-8-5MOE缺口聚物的长度为17个核苷，其中，中心缺口区段包含八个2’-脱氧核糖核苷并且在5’方向和3’方向上分别侧接包含四和五个核苷的翼区段。5-8-5MOE缺口聚物的长度为18个核苷，其中，中心缺口区段包含八个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5-8-7MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含八个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上分别侧接包含五和七个核苷的翼区段。6-8-6MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含八个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含六个核苷的翼区段。6-9-5MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含九个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上分别侧接包含六和五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。
脱氧、MOE和cEt寡核苷酸的长度为17个核苷，其中每个核苷具有MOE糖修饰、cEt糖修饰或脱氧部分。每个寡核苷酸的糖化学以化学列来表示，其中‘k’表示cEt修饰糖，‘d’表示2’-脱氧核糖，并且‘e’表示2’-MOE修饰糖。
每个缺口聚物整个的核苷间键联为磷酸二酯键联或硫代磷酸酯键联。每个寡核苷酸的核苷间键联以主链化学列来表示，其中‘o’指示磷酸二酯键联，并且‘s’指示硫代磷酸酯键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1(GENBANK登录号NM_000454.4)的人SOD-1mRNA或在本文中指定为SEQ ID NO:2(GENBANK登录号NT_011512.10，从18693000至18704000截短的核苷酸)的人SOD-1基因组序列。
表45
靶向人SOD-1的具有混合主链化学的修饰寡核苷酸
Figure BDA0001148942550002101
Figure BDA0001148942550002111
Figure BDA0001148942550002121
新设计的寡核苷酸在A431细胞中以各种剂量测试。在具有类似培养条件的一系列实验中测试修饰寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。将细胞以5,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.062μM、0.185μM、0.556μM、1.667μM、5.000μM以及15.000μM浓度的修饰寡核苷酸向培养基中加入修饰寡核苷酸用于细胞的自由摄取。在约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量SOD-1 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3898测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0001148942550002122
所测量的总RNA含量调整SOD-1 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的SOD-1的抑制百分比。
表46
剂量反应测定
Figure BDA0001148942550002131
表47
剂量反应测定
Figure BDA0001148942550002132
新设计的寡核苷酸也在SH-SY5Y细胞中以各种剂量测试。在具有类似培养条件的一系列实验中测试修饰寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。将细胞以20,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.062μM、0.185μM、0.556μM、1.667μM、5.000μM以及15.000μM浓度的修饰寡核苷酸进行修饰寡核苷酸转染。在约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量SOD-1 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3898测量mRNA水平。根据如由
Figure BDA0001148942550002133
所测量的总RNA含量调整SOD-1 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的SOD-1的抑制百分比。
表48
剂量反应测定
Figure BDA0001148942550002141
表49
剂量反应测定
Figure BDA0001148942550002142
实施例12：在转基因大鼠模型中人SOD-1的抑制
上述研究中的缺口聚物，包括先前在WO 2005/040180公开的基准化合物ISIS333611，在SOD-1转基因大鼠模型中测试(Taconic，Cat#2148-F和2148-M)。这些半合子大鼠在脊髓中表达突变的人SOD-1。
基于以上所述研究中公开的寡核苷酸的序列设计额外的缺口聚物。寡核苷酸被设计为5-9-5MOE缺口聚物、5-10-5MOE缺口聚物和脱氧、MOE和cEt寡核苷酸。5-9-5MOE缺口聚物的长度为19个核苷，其中，中心缺口区段包含九个2’-脱氧核糖核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5-10-5MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核糖核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-MOE修饰。脱氧、MOE和cEt寡核苷酸的长度为17个核苷，其中每个核苷具有MOE糖修饰、cEt糖修饰或脱氧部分。每个寡核苷酸的糖化学以化学符号列来表示，其中‘k’指示cEt修饰糖；‘d’指示2'-脱氧核糖；并且‘e’指示2'-MOE修饰的糖。每个缺口聚物整个的核苷间键联为磷酸二酯键联或硫代磷酸酯键联。每个寡核苷酸的核苷间键联以主链化学列来表示，其中‘o’指示磷酸二酯键联，并且‘s’指示硫代磷酸酯键联。整个各寡核苷酸当中的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ IDNO:1(GENBANK登录号NM_000454.4)的人SOD-1 mRNA或在本文中指定为SEQ ID NO:2(GENBANK登录号NT_011512.10，从18693000至18704000截短的核苷酸)的人SOD-1基因组序列。
表50
靶向人SOD-1的具有混合主链化学的修饰寡核苷酸
Figure BDA0001148942550002161
Figure BDA0001148942550002171
Figure BDA0001148942550002181
Figure BDA0001148942550002191
在具有类似条件的一系列实验中测试修饰寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。向大鼠鞘内注射30μL 16.67mg/ml稀释在PBS中的修饰寡核苷酸的溶液(500μg终剂量)。向对照组大鼠鞘内注射PBS。评估腰椎脊髓、腰椎脊髓和颈椎脊髓中SOD-1的抑制水平。数据在以下呈现，并且指示若干修饰寡核苷酸在此模型中抑制人SOD-1水平。
表51
在转基因大鼠脊髓区域中对人SOD-1的抑制百分比
Figure BDA0001148942550002192
表52
在转基因大鼠脊髓区域中对人SOD-1的抑制百分比
Figure BDA0001148942550002193
Figure BDA0001148942550002201
表53
在转基因大鼠脊髓区域中对人SOD-1的抑制百分比
Figure BDA0001148942550002202
表54
在转基因大鼠脊髓区域中对人SOD-1的抑制百分比
Figure BDA0001148942550002211
表55
在转基因大鼠脊髓区域中对人SOD-1的抑制百分比
Figure BDA0001148942550002212
表56
在转基因大鼠脊髓区域中对人SOD-1的抑制百分比
Figure BDA0001148942550002213
Figure BDA0001148942550002221
表57
在转基因大鼠脊髓区域中对人SOD-1的抑制百分比
Figure BDA0001148942550002222
表58
在转基因大鼠脊髓区域中对人SOD-1的抑制百分比
Figure BDA0001148942550002223
Figure BDA0001148942550002231
表59
在转基因大鼠脊髓区域中对人SOD-1的抑制百分比
Figure BDA0001148942550002232
表60
在转基因大鼠脊髓区域中对人SOD-1的抑制百分比
Figure BDA0001148942550002241
表61
在转基因大鼠脊髓区域中对人SOD-1的抑制百分比
Figure BDA0001148942550002242
Figure BDA0001148942550002251
实施例13：在LLC-MK2细胞中由修饰寡核苷酸对人SOD-1的剂量依赖性抑制
选择来自以上所述的研究(包括基准化合物ISIS 333611)且对SOD-1 mRNA展现体外显著抑制的缺口聚物且在LLC-MK2细胞中以各种剂量测试。本研究所测试的人反义寡核苷酸与恒河猴基因组序列(从核苷酸2258000至2271000截短的GENBANK登录号NW_001114168.1，在本文中命名为SEQ ID NO:3)的交叉反应显示在下表中。
表62
靶向人SOD1的反义寡核苷酸与SEQ ID NO:3的交叉反应
Figure BDA0001148942550002252
将细胞以20,000个细胞/孔的密度铺板并且使用电穿孔，以下表中规定的0.078μM、0.156μM、0.313μM、0.625μM、1.25μM、2.50μM、5.00μM或10.000μM浓度的修饰寡核苷酸进行转染。在处理后大约16小时，从细胞中分离RNA并且使用定量实时PCR引物探针集RTS3121(正向序列TGGAGATAATACACAAGGCTGTACCA，在本文中指定为SEQ ID NO:17；反向序列CAACATGCCTCTCTTCATCCTTT，在本文中指定为SEQ ID NO:18；探针序列ATCCTCTATCCAGACAACACGGTGGGC，在本文中指定为SEQ ID NO:19)测量SOD-1 mRNA水平。根据如由
Figure BDA0001148942550002262
所测量的总RNA含量调整SOD-1 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的SOD-1的抑制百分比。也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。如表中呈现，若干新设计的寡核苷酸比基准ISIS 336611更有力。
表63
恒河猴SOD-1 mRNA的剂量依赖性抑制
Figure BDA0001148942550002261
实施例14：修饰寡核苷酸在大鼠模型中SOD-1的耐受性
上述研究中的缺口聚物，包括先前在WO 2005/040180公开的基准化合物ISIS333611，在Sprague-Dawley大鼠中测试耐受性。
在具有类似条件的一系列实验中测试修饰寡核苷酸。向大鼠鞘内注射3mg单一剂量的ISIS寡核苷酸。向对照组大鼠鞘内注射PBS。给药3小时后使用功能性观察试验组合(FOB)评估急性耐受性。所述分数用来评价具有较低分数的化合物表示耐受性更好的化合物。对照动物通常具有‘0’或‘1’的分数。注射3小时后，通过将每个大鼠放置在笼顶部并且评价某些功能、根据大鼠在感兴趣区域是(0)否(1)表现出正常的功能来分配数字‘0’或‘1’，然后加上总分数，来观察大鼠。评估包括尾部、后爪、后肢、后肢末端、前肢姿势、前爪和头的7个区域。分数的结果在下表中呈现。如表中呈现，若干新设计的寡核苷酸与基准ISIS333611相比展现了更急性的耐受性。
表64
Sprague-Dawley大鼠中的FOB分数
Figure BDA0001148942550002271
Figure BDA0001148942550002281
Figure BDA0001148942550002291
Figure BDA0001148942550002301
Figure BDA0001148942550002311
Figure BDA0001148942550002321
给药8周后，通过测量腰椎脊髓中小胶质细胞标志物IBA1和星形细胞标志物GFAP的水平来评估耐受性。IBA1和GFAP二者都是CNS炎症标志物(Frank,MG,BrainBehav.Immun.2007,21,47-59)，因此任一个标志物的水平越高，此大鼠模型中的反义寡核苷酸耐受性被认为是更差。
IBA1 mRNA水平通过引物探针集rAIF1_LTS00219(正向序列AGGAGAAAAACAAAGAACACCAGAA，在本文中指定为SEQ ID NO:5；反向序列CAATTAGGGCAACTCAGAAATAGCT，在本文中指定为SEQ ID NO:6；探针序列CCAACTGGTCCCCCAGCCAAGA，在本文中指定为SEQ ID NO:7)测量。GFAP mRNA水平通过引物探针集mGFAP_LTS00370(正向序列GAAACCAGCCTGGACACCAA，在本文中指定为SEQ ID NO:8；反向序列TCCACAGTCTTTACCACGATGTTC，在本文中指定为SEQ ID NO:9；探针序列TCCGTGTCAGAAGGCCACCTCAAGA，在本文中指定为SEQ ID NO:10)测量。
结果在下表中呈现。如表中呈现，若干新设计的寡核苷酸与基准ISIS 333611相比更耐受。
表65
Sprague-Dawley大鼠腰椎区域IBA1和GFAP mRNA水平(％对照)
Figure BDA0001148942550002331
Figure BDA0001148942550002341
Figure BDA0001148942550002351
实施例15：在转基因大鼠模型中人SOD-1的剂量依赖性抑制
上述研究中的缺口聚物，包括基准化合物ISIS 333611，在SOD-1转基因大鼠模型中测试(Taconic，Cat#2148-F和2148-M)。这些半合子大鼠在脊髓、大部分脑区域和外周器官中表达突变的人SOD-1。
向大鼠鞘内注射10、30、100、300、1000或3000μg下表所列的缺口聚物或者仅注射PBS。两周后，处死动物。如实施例1所述，通过RT-PCR使用引物探针集RTS3898评估腰椎脊髓、颈椎脊髓、嘴侧皮质和尾侧皮质中的SOD-1 mRNA的抑制。数据在下面以ED50来呈现，并且指示寡核苷酸在多种CNS组织中抑制SOD1mRNA比Isis33611更有力。事实上，Isis 333611的ED50值甚至不能被计算，通过“n/a”指示，因为即使最高测试浓度(3000μg)也不能抑制人SOD-1mRNA的大于55-65％。“n.d.”指示没有针对指示样品的数据可获得。
表66
在转基因大鼠中人SOD1的抑制
Figure BDA0001148942550002352
Figure BDA0001148942550002361
实施例16：SOD-1修饰寡核苷酸在大鼠中的耐受性
上述研究中的缺口聚物，包括基准化合物ISIS 333611，在Sprague-Dawley大鼠中测试耐受性。向各组4至6只大鼠鞘内注射1mg或3mg单一剂量的ISIS寡核苷酸。向对照组大鼠鞘内注射PBS。如实施例14所述，给药3小时后后评估急性耐受性。1mg剂量的结果是一个实验之后每组的平均值。3mg剂量的结果是经过两个重复实验每组的平均值。呈现在下表中的本研究的结果指示，若干新设计的寡核苷酸比基准ISIS 333611更耐受。
表67
FOB值
Figure BDA0001148942550002362
实施例17：在转基因小鼠模型中人SOD-1的剂量依赖性抑制
为了在另一物种中确认从转基因大鼠中获得的结果，在表达相同的在转基因大鼠中的表达G93A人突变SOD1基因的SOD-1转基因小鼠模型中测试上述的研究中的缺口聚物(参见实施例12和15)。
向小鼠脑室内推注(ICVB)10、30、100、300或700μg下表所列的缺口聚物或者仅注射PBS。两周后，处死动物。如实施例1所述，通过RT-PCR使用引物探针集RTS3898评估腰椎脊髓和皮质中的SOD-1 mRNA的抑制。数据在下面以ED50值来呈现，并且指示在大鼠和小鼠二者中寡核苷酸抑制SOD1mRNA都比Isis 33611更有力。
表68
在转基因小鼠中人SOD1的抑制
Isis No. 腰椎ED<sub>50</sub>(μg) 皮质ED<sub>50</sub>(μg)
333611 401 786
666853 136 188
666859 106 206
666870 148 409
666919 168 1211
实施例18：SOD-1修饰寡核苷酸在小鼠中的耐受性
上述研究中的缺口聚物，包括基准化合物ISIS 333611，在C57bl6小鼠中测试耐受性。向小鼠立体定位注射到脑室内700ug单一剂量的ISIS寡核苷酸。向对照组小鼠脑室内注射PBS。使用与大鼠中使用的不同的功能性观察试验组合(FOB)在注射3小时后评估急性耐受性。每只小鼠根据7个不同的标准评价。所述7个标准是(1)小鼠是欢快的、警觉的和敏感的；(2)在无刺激时小鼠是站立的团着身子的；(3)在无刺激时小鼠表现出任何运动；(4)解禁后小鼠展现出向前的运动；(5)解禁后小鼠展现出任何运动；(6)小鼠对尾部夹痛有反应；(7)均匀呼吸。对于7个不同标准中的每一个，每只小鼠如果满足标准则给予其0的分项分数，如果不满足，则给予其1的分项分数。评价了所有7个标准之后，对每只小鼠的分项分数求和，然后对每个组求平均。例如，如果小鼠在700μg ICV给药3小时后是欢快的、警觉的和敏感的，并且满足所有其他标准，它将得到0的总和分数。例如，如果小鼠在700μg ICV给药3小时后不是欢快的、警觉的和敏感的，但满足所有其他标准，它将得到1的分数。盐水处理的小鼠通常得到0的分数。在范围顶端的分数将表明有急性毒性。
在整个研究中测量体重，并且在以下以在第8周相对于基准的变化百分比来报告。如实施例14所述，在给药后第8周通过测量IBA1和GFAP评估长期耐受性。相对于PBS处理的动物报告IBA1和GFAP mRNA水平。呈现在下表中的本研究的结果指示，若干新设计的寡核苷酸在大鼠和小鼠中比基准ISIS 333611更耐受。
表69
FOB值和体重变化
Isis No. 3小时FOB 体重(变化％)
333611 6.5 3.8
666853 1.25 8.0
666859 1.75 14.0
666870 4.75 7.3
666919 0.0 5.2
表70
炎症标志物
Figure BDA0001148942550002381
实施例19：食蟹猴中猴SOD-1的剂量依赖性抑制
在食蟹猴中测试Isis No.666853。在Isis No.666853和食蟹猴SOD-1之间有一个错配，并且在Isis No.666853中有17个连续碱基与食蟹猴SOD-1 100％互补。
在本研究的第1、14、28、56和84天，向每组6-10只雄性和雌性猴子中鞘内腰椎推注PBS或者4、12或35mg的Isis No.666853。每组在所有五个给药天接受相同剂量。在第91天，处死动物。通过RT-PCR使用引物探针集RTS3898评估腰椎、胸椎和颈椎脊髓和额叶皮质、运动皮质、海马体、脑桥和小脑中的SOD-1 mRNA抑制。数据以每个处理组相对于PBS处理组的平均抑制百分比在下面呈现。结果指示Isis No.666853在食蟹猴多个靶组织中抑制SOD-1mRNA。
用666853处理在13周研究的持续时间内耐受良好，并且在猴子中没有不良反应的临床观察。
表71
在猴子中SOD-1 mRNA的抑制
Figure BDA0001148942550002391
序列表
<110> IONIS制药公司
<120> 用于调节SOD-1表达的组合物
<130> BIOL0240WO
<150> 61/973,803
<151> 2014-04-01
<160> 1461
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
gtttggggcc agagtgggcg aggcgcggag gtctggccta taaagtagtc gcggagacgg 60
ggtgctggtt tgcgtcgtag tctcctgcag cgtctggggt ttccgttgca gtcctcggaa 120
ccaggacctc ggcgtggcct agcgagttat ggcgacgaag gccgtgtgcg tgctgaaggg 180
cgacggccca gtgcagggca tcatcaattt cgagcagaag gaaagtaatg gaccagtgaa 240
ggtgtgggga agcattaaag gactgactga aggcctgcat ggattccatg ttcatgagtt 300
tggagataat acagcaggct gtaccagtgc aggtcctcac tttaatcctc tatccagaaa 360
acacggtggg ccaaaggatg aagagaggca tgttggagac ttgggcaatg tgactgctga 420
caaagatggt gtggccgatg tgtctattga agattctgtg atctcactct caggagacca 480
ttgcatcatt ggccgcacac tggtggtcca tgaaaaagca gatgacttgg gcaaaggtgg 540
aaatgaagaa agtacaaaga caggaaacgc tggaagtcgt ttggcttgtg gtgtaattgg 600
gatcgcccaa taaacattcc cttggatgta gtctgaggcc ccttaactca tctgttatcc 660
tgctagctgt agaaatgtat cctgataaac attaaacact gtaatcttaa aagtgtaatt 720
gtgtgacttt ttcagagttg ctttaaagta cctgtagtga gaaactgatt tatgatcact 780
tggaagattt gtatagtttt ataaaactca gttaaaatgt ctgtttcaat gacctgtatt 840
ttgccagact taaatcacag atgggtatta aacttgtcag aatttctttg tcattcaagc 900
ctgtgaataa aaaccctgta tggcacttat tatgaggcta ttaaaagaat ccaaattcaa 960
actaaaaaaa aaaaaaaaaa a 981
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<212> DNA
<213> 智人
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cactgcactc cagcctgggt gacagagcga gaccctgtct caaaaatcaa acaaacaacc 60
ccctcgcccc ggacaaaagt agtttgcact attttctcat ttcacaatat gtttttgaaa 120
tatttccctt gaaaggtaag tcatatttat cattcctgtt gtatggaggc atcataaatt 180
atttcaccat tctaccctcc ttgagtgttg tggcctttag gccagacaaa aacgcaggtg 240
atgcctagaa gccaactagt tgccgtttgg ttatctgtag ggttgtggcc ttgccaaaca 300
ggaaaaatat aaaaagaata ccgaattctg ccaaccaaat aagaaactct atactaagga 360
ctaagaaaat tgcaggggaa gaaaaggtaa gtcccgggat tgaggtgtag cgactttcta 420
taccctcaga aaactaaaaa acaagacaaa aaaatgaaaa ctacaaaagc atccatcttg 480
gggcgtccca attgctgagt aacaaatgag acgctgtggc caaactcagt cataactaat 540
gacatttcta gacaaagtga cttcagattt tcaaagcgta ccctgtttac atcattttgc 600
caatttcgcg tactgcaacc ggcgggccac gcccccgtga aaagaaggtt gttttctcca 660
catttcgggg ttctggacgt ttcccggctg cggggcgggg ggagtctccg gcgcacgcgg 720
ccccttggcc ccgcccccag tcattcccgg ccactcgcga cccgaggctg ccgcaggggg 780
cgggctgagc gcgtgcgagg cgattggttt ggggccagag tgggcgaggc gcggaggtct 840
ggcctataaa gtagtcgcgg agacggggtg ctggtttgcg tcgtagtctc ctgcagcgtc 900
tggggtttcc gttgcagtcc tcggaaccag gacctcggcg tggcctagcg agttatggcg 960
acgaaggccg tgtgcgtgct gaagggcgac ggcccagtgc agggcatcat caatttcgag 1020
cagaaggcaa gggctgggac ggaggcttgt ttgcgaggcc gctcccaccc gctcgtcccc 1080
ccgcgcacct ttgctaggag cgggtcgccc gccaggcctc ggggccgccc tggtccagcg 1140
cccggtcccg gcccgtgccg cccggtcggt gccttcgccc ccagcggtgc ggtgcccaag 1200
tgctgagtca ccgggcgggc ccgggcgcgg ggcgtgggac cgaggccgcc gcggggctgg 1260
gcctgcgcgt ggcgggagcg cggggaggga ttgccgcggg ccggggaggg gcgggggcgg 1320
gcgtgctgcc ctctgtggtc cttgggccgc cgccgcgggt ctgtcgtggt gcctggagcg 1380
gctgtgctcg tcccttgctt ggccgtgttc tcgttcctga gggtcccgcg gacaccgagt 1440
ggcgcagtgc caggcccagc ccggggatgg cgactgcgcc tgggcccgcc tggtgtcttc 1500
gcatccctct ccgctttccg gcttcagcgc tctaggtcag ggagtcttcg cttttgtaca 1560
gctctaaggc taggaatggt ttttatattt ttaaaaggct ttggaaaaca aaaatacgca 1620
acagagaccg tttgtgtgac actttgcagg gaagtttgct ggcctctgtt ctaggtcatg 1680
attgggctgc aagggcagag aaggtagcct tgaacagagg tccttttcct cctcctaagc 1740
tccgggagcc agaggtttaa ctgacccttt tggggatttt tgagggcagt gatcttaact 1800
ttgggtgcac agttagctta tttgaagatc ttactaaaaa tacaccagag cccaacctcc 1860
gaccaattac atcaaaacct gtcctagtgc agggtgagta ttgctgtttt ttgaaagttt 1920
ccaaaagtga ttttgatgtg cacctacgat tgagaactgt cgtttgagga cagtgggtgg 1980
agtttcgtat ttggaaatta gaagacctgg agtttccatt acaccgaatt ggcacttaat 2040
aactgttgtc ggagcatttc ttaagccaca ttttcgtaaa gtggctttaa aattgctctg 2100
ccagtaggca ggttgctaag atggtcagag acaaacttct gaacgactct tgtaaaatat 2160
acagaaatat tttcagaact tttatcagta aaattacaaa acgtgttgca aggaaggtgc 2220
ttgtgataac actgtcccca gaaccttagt gaagttacca actggtggaa aattttctct 2280
tgcactcggc ttaaaaatca tgagggaata tttactatac gaatgagatt cagtctttaa 2340
aggggtttac agaaacgtga gaggacagga acagttagtc tgtgtaaatg tctgaaatat 2400
atgtgaggga gataatgagt ttagcctttt tctttaatag gtctccagat tttctggaaa 2460
aggttctttg gcatttgact ccattttgct gtttcatttg tcagacttct ttttgtccct 2520
ctttacttct ccccacataa ttcaccagta ctagtgtttt gtttttcaga ccaagtctcg 2580
ctctgtcgcc caggctggag tgcagtggcg cgatctcagc tcactgcaac ctccgcctcc 2640
caggttcaag caattctcct gcctcagcct cccgggtagc tgggactaca ggcgcgcgcc 2700
gccacgcctg gctaattttt tatattttag tagagacggc gtttcaccat gttggccagg 2760
atggtctcga tctgttgacg tcgtgatcca cccgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt 2820
acaggcgtga gccaccccgc ccggccacca gtgctattct taagacgcct ctgaggaatc 2880
ccttctccct ggccattgag aatccatgca tgaacccagg ttttccacct tccctgagca 2940
gcttgcatag ttccttcttt taagcgcctg acttcgtttt gtttggtgcc cgttgtacct 3000
gagaatgagc cttggatagt ggagcattcc agctttccag atatgcagag ataatacatt 3060
ggctatcagc tacttggctt ggcctattcc gtgtttaaaa tcttggactc tttgctagtt 3120
tttacagatc agaatttttc acgtattaat ccagttttcc tagcttctct tgaagaattt 3180
ttggagatct cttcatactg agccttcatt agcccaggac agtactgctg tagcagttca 3240
tatatttttt cgcttcccag gcctgtgtta ttcacttaag ttcatagcct ggtccctgca 3300
gggttgtacc cgagcacagc tacttagatg tcctgaatgt attaccggtt aaatggaggt 3360
ttcaaagaac ctgctgtttt tggccctgtg ctcttgataa cagagtgttt gagggacaac 3420
tttcacattt gagtttttcc aaaattaaag gttgtagaag agtcacagta tctattgtca 3480
aaaagaaaag aatttaaaaa ggcagcaatt gccaggatac ttcatttgag caatgatatt 3540
ttccagtgga aagtcacatc ttaagggtta atgcccctta actgttggcc gtatttgaaa 3600
acaaaccaag ctaaaaacaa gagacactga catgttgtat gacggtgtgg tgtggatgtt 3660
gtgtttattt tagtcctgag atctagttgt aacttccttg atttctgtat gtagccacgg 3720
agcaccatta cctgtcacca ttacctgaat ggctatactg cttgctttca ttttggtaga 3780
gtggaaaggt tacctaggtt tcagtgcttg aaaagatttc agaaagcagt agtacgtctg 3840
gttagactag aatcagtcct ctcctggggg cagtggaata taatattttc tgactgctaa 3900
ttaaaaatac ctgtgatagc cgggcgtggt ggcttacgcc tgtaatccca gcactttggg 3960
aggccgagac gggtggatca cgaggtcagc agatggagac catcctggct aacacggtga 4020
aaccccgtct ctactaaaaa tgcaaaaaaa ttagccgggt gtggtggtgg gcgcctgtag 4080
tcccagctac tcaggaggct gaggcaggag aatggcatga acctgggagg cggagcttgc 4140
agtgagccga gatcatgtca ctgcactcca gcctgggcga cagagcgaga ctcgtctcaa 4200
aaaaaaaaag aaaaaaactt atgatggaca cttaaaaaca ctcactgagt ggggagtgga 4260
gagcaggggt cccagggtag cctgttggac atttccaggg cgactttttc tttttttttt 4320
tttaaagtca agtgagtatg ccatatggaa aagggtgtgc gtggagaaaa agcaaggggc 4380
tccagagtgt aggatgagac atacaccttt tgggttaaaa aggctgaggc aggagaatgg 4440
cgtgaacccg ggaggcggag cttgcagtga gctgagatca tgccactgca ctccagcctg 4500
ggcgacagag cgagactctt gtctcaaaat aaaaaacgtt tacatgtaca tgtatattca 4560
acatgtacaa atataaccta ttcaaaagta tttactacat aaataggtac ttacattacc 4620
tatttactgt aatagtcaaa gcctatgaag tatctaacac tgatgtgtag gtactcactt 4680
tgcttgccac tctattaggt gctttttatg ttatttaatc atgaagcctg gccacagggt 4740
gcttgtgcat tgagtgtggg aacaagatta ccatctccct tttgaggaca caggcctaga 4800
gcagttaagc agcttgctgg aggttcactg gctagaaagt ggtcagcctg ggatttggac 4860
acagattttt ccactcccaa gtctggctgc tttttacttc actgtgaggg gtaaaggtaa 4920
atcagctgtt ttctttgttc agaaactctc tccaactttg cacttttctt aaaggaaagt 4980
aatggaccag tgaaggtgtg gggaagcatt aaaggactga ctgaaggcct gcatggattc 5040
catgttcatg agtttggaga taatacagca ggtgggtgtt gtgctgtgct ggtgacccat 5100
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ttgtttttgt ttttgagaaa gggtcttgct ctgtcgctca ggctggagtg cagtggcgct 5220
gtgcgatcat ggctgacctt agccttgacc tcccaggctc cattgatcct catgccttgg 5280
cccgtagctg ggactacagg tacacaccac cacgcctggc taatttttgt atttttttct 5340
agaggtgggg tttcatcatg ttgcccaggc tggtcttgaa ctgctgggct caagtggtct 5400
atcctcctcg acctcccaaa gtgctgggat tacatgtgtg agccactgtg cctgggaaaa 5460
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gaaggcaaat aggaaataaa aacttgggct cttaactttt gtaatgatcc caggtgtttg 6180
agctgggggt tgagggtggg tgcctcgagc aaaggggctg catttatttg cataatgcca 6240
tgtaagagta gctctacacc ccaaacacag gcttcttagt gggaccaaag tatgatacaa 6300
actgaagatg gaatgcagag gattattggt actttggaat atgcttaaaa aaaatttttt 6360
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aattttattt tcttaatttg ggattggaag caagttaaca gaagtttatg agttaagttg 6480
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tcttaaatta actttattca tcttgctaat ttagtttcaa atagtgattt gtaatgatca 6600
gatttgatcc atttctgtaa ttgctgaaat tcccccgagt tgctttttgg ctttaccgcc 6660
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gcttttactt cctgggctta aaggaattga caaatgggga cacttaaaac gatttggttt 7920
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ttctgtagat aaaaaaaaaa attgatactg aaaactagtc gagactccat ttatatgtgt 8100
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ggccttggga catagctttg ttagctatgc cagtaattaa caggcataac tcagtaactg 8220
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tagtgtgtag acgtgaagcc ttgtttgaag agctgtattt agaatgccta gctacttgtt 8340
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actctcagga gaccattgca tcattggccg cacactggtg gtaagttttc ataaaaggat 8580
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gtttctaaag atccagataa actgtacttg cagttcaaat taggaaaagc aattttattg 8700
gacaattacg gtgaaaatga attattttat ctaggtcagt taagaacact gttctgctaa 8760
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ggtttttctt gagccatagt tgtaaagcag aaaaatcatt tataaaggtt tgttgaacaa 9180
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gtgacaggcc cggcccgggg tggcgactgc gcctgggccc ggctggtgtc ttagcatccc 2100
tctccgcgtt ccggcttcag cgctctgggt cagggagtct ccgcttttgt acagctctaa 2160
ggctaagtat ggtttttata tttttaaaag gctttggtaa acaaaaatac gcaacagaga 2220
ccgtttgtgt gacactttgc aggagtttgt tggcctctgt tctaggtcat ggttgggctg 2280
caagggcaga gaaggtagcc ttggatagag gtccttttcc tcctcctaag ctccgagagc 2340
cagagtttta actgaccgtt ttggggactt tcgagggcaa tgattcttaa ctttgggtgc 2400
acaattagct tatttgaaga tcttactaaa aatacaccag agcccaacct cagaccaatt 2460
acatcaaaac ctgtcccagc gcaggtgatt attgctgttt tttaagtttc caaatgtgat 2520
tttgatgtgc acctacgatt gaggactgtt gtttgaggac agtgggtggg gtttggaatt 2580
tggaaattgg gaagacctga agtttccatt acacggaatt ggtacttagt aactcttgtc 2640
ggagcatttc ttaagccaca ttttctgtga agtggcttta aaattgctct gccagtaggc 2700
aggttgctaa gatggtcaga gacaaacttc tgaacgactc ttgtaaaatg tagtacagaa 2760
atattttcat aactattatc agtaaaattg caaaacgtct tgcaaggaag gtgcttgtga 2820
taacactgtc cccagagcct tagtgaagtt accaactggt ggaaaattgt ctggtactcg 2880
gcttaaaagt catgagagaa tatttatcat atgaatgaga ttcagtcttt aaaggggttt 2940
acagaaaggt gagaggacag gaacagttag tctgtgcaag tgtctgaaat gtgtatgagg 3000
gagatacgag tttagctttt ttctttaata cgtctccaga ttttctggaa aaggttcttt 3060
ggcatttgac tccattttgc tatttcattt gtcagacttc gttttgtccc tctttactta 3120
ttcccacata attcactagt actagtgctg tgttttgttt ctgagaccga gtcttgctct 3180
cttgcccagg ctggagtgca gtggcgcgat ctcggctcac tgcaacctcc gcttcctggg 3240
ttcaagcaat tctcctgcct caggctcccg ggtagctggg attacaggcg cgtgccacca 3300
cgcccagcta attttttgta ttttagtagg gaccgggttt caccatgttg gccaggatgg 3360
tcacgatctc ttgacctggt gatccacccg cctcggcttc ccagagtggt gggattacag 3420
gcgtgagcca ccgcgcccgg ccaccagtac tagtcttaag acgcctctgt ggaattcctt 3480
ctccctggcc tttgagaatc catgcatgaa cccaggtttc tgtcattttc caccttccct 3540
gagcagcgag catagttcct tcttttaagc gcctgacttc gttttggttg gtgccccttg 3600
tacctgagaa agagccttgg atagtggagc attccagctt tccagatatg cagagataat 3660
aaattggcta taaactacct ggcgtggcct attccgtgtt taaaatctta gactcgtggc 3720
tagtttttac aaatcagaat ctttcaccta atagtccagt tttcctagct tctcttgaag 3780
aattgttgga gatctcttca tactgagcct tcattagccc aggacagtac tgctggagct 3840
ttccaggcct gtgttactca cttgagttca cagcctggtc cctgtagggt tgtacctaag 3900
cacaactact tacatgttcc caatgtatta cccgttaaat ggaggtttga aagaacctcc 3960
tctttttggc cctgtgctct tgataacaca gcatatttga gggacaactt tcacatttga 4020
gtttttccaa aattagaggt tgtagaagag tcacagtgtc tattctgaaa aagaaaagaa 4080
tttttaaaag gccgcaattg ccagaatcct tcgtttgagc agtggtattt tccagtggaa 4140
agtcatgtct taagggttaa tgccccttaa ctgttgtccc tatttgaaaa ccaagctaaa 4200
aacaagagac acaaacatgt atgacggtgt ggtgtggatg atgtgtttat tttagtcctg 4260
agatctactc gtaacgtcct tgatttctgt atgtagccac ggagcaccat tacctgtcac 4320
cattgcctga atggcgatac tgcttgcttt ctttttggta gagtggaaag gttatctagg 4380
tttcagtgct tgaaaagatt tcagaaaaca gtagtacctc tggttagact agaatcagtc 4440
ctctcctgag ggcagtgaaa taggatattt tctgactgct aattaaaaat acctatgata 4500
gccggacgtg gtggctcacg cctgtaatcc cagcagtttg ggaggcggaa ggggcggatc 4560
acgaggtcat gagatcgaga ccatcctggc taacacggtg aaaccccgtc tctgctaaaa 4620
atacaaaaaa ttaactgggc ttggtggtgg ttggcgcttg tagtcccagc tactcaggag 4680
gctgagggag gagaatggca tgaacctggg aggcggagct tgcagtgagc cgagatcatg 4740
ccactgctct tcagcctggg cgacagagct agactccatc tcaaaaaaaa aaaaaaaaca 4800
aaaaaacttt gatggaaact taaaaacaca cactgagtgg ggagtggaga gcaggggtcc 4860
tagggtagcc tgttggacgt ctccagggtg cctttttctt tgttttaaag tgtgtatgct 4920
gtatggaaga gtgtctatat ggagaagcag caaggggcta aagagcatat gatgagacat 4980
acaccttttg ggttaaaaag gctgaggcag gagaatggcg tgaacccggg aggtggagct 5040
tgcagtgagc cgagatcgcg ccactgccct ccagcctggg tgacagagcg agactctgtc 5100
tcaaaacaaa ccaaaaaggt ttacgtgtac atgtatattc aacatgtaca aatatgacct 5160
attcaagtgt ctactaaata ggtacttata ttacatattt actgtaatag tcaaacccta 5220
tgaagtatct aactctgatg tgtaggtact cactttgctt accactctat ttggtgcttt 5280
ttatgtttaa tcacgaagcc tggccacagg gcgcttgtgc attgagtgtg ggaacaagat 5340
taccatctcc cttttgagga cacaggccta gagcagttaa gcagcttgct ggaggtaccc 5400
tggctagaaa gtggtcggcc tgggatttgg acacagattt ttccactccc gagtctggct 5460
tctttttact ttactctgag gggtaaaggt aaatcagctg ttttctttgt tcagaaactc 5520
tctccaactt tgcacttttc tttgattaaa ggaaagtaat ggaccagtga aggtgtgggg 5580
aagcattaca ggattgactg aaggcctgca tggattccat gttcatcagt ttggagataa 5640
tacacaaggt gggtgttgtg ctgtgctggt gacccatact tgttcaacct agttagataa 5700
acagtagagt agcccctaaa tgttaaaact cctcaacttg gttttgtttt tgagacaggg 5760
tcttgctctg tcacccaggc tggagtgcag tggtgctgtg cgatcatggc tcaccttagc 5820
ctcgacctcc caggctccag ttatcctcat gccttggcct gtagctggga ctacaggcat 5880
acgccaccac acctggctac tttctgtatt tttttctagc cgtggggttt catgttgtcc 5940
aggctagtct tgaactgctg ggctcaagtg gtttatcctc ctgcacctcc caaagtgctg 6000
ggattacagg tgtgagccac tgtgcctggc aaaaccctca acttttcttt taaaaaaaga 6060
ggtcaacttt attgtataaa cactgtgcta aaatggcaga aactaggacc atatcttggt 6120
ttttgtaata atgccagcag agtatacaca agaagaaaag taactgcact agattgtgaa 6180
gactggggtg gacctgcttc ttaatgccca gtgccctttg tcttaagatt tggtgtagta 6240
tatctttaga aaccaaaaaa aaaaaaaaag tgaagttaaa ataactttga agatcaacct 6300
taagattagc cacaaaactg gtttttgtca cctaggtgtg gaaaagaaag ggaaagagtt 6360
gatgtttttt gtcttatggc atcattgtag aagaggattt tttttttttt tttggagaca 6420
agtcttactc tgtcgcccag gctggagcgc agtggcgcca tcttggctcg ctgcaagctg 6480
tgcctcctgg gttcacgcca ttctcttgcc tcagcctcct gagtagctgg gactacaggc 6540
gccgccacca cgcctggtta atttttttgt ttttttagta gagatggggt ttcactgtgt 6600
tagccaagat ggtcttgatc tcctgacctc gtgatccacc catctcggcc tcccaaagtg 6660
ctgggattac aggcatgagc cactgtgccc agccagaaga aagtgttttt taaagaaggc 6720
aataggaaat aacttgggtt cttaactttt gtaatgatcc caggtgtttg agctgggggt 6780
tgagggtggg tgcctcaagc gaaggggctg cattcgtttg cataatgtca tgtaagagta 6840
gctccacacc gcaaacacag gctccttagt gggacaaaag taggatacaa cctggagatg 6900
gaatgcagag gatcactggt actttggaat atgcttaaaa aattttttta gtatttttaa 6960
aaaatcaggc agcccctgaa cctgagtagg ttcagagaaa ctgccaagtt ttatattctt 7020
aatttgggat tggaagcaag ttaacaaaag tttatgagtt aaattgcatt tagtggtctt 7080
ttgccatatt tgagttatct gaattttttg tttataggtt tcttcttaaa ttaacttcat 7140
tcatcttgct aatttagttt caaatagtga tttgtagtga tcagatttga tccatttctg 7200
taattgctga aattccccaa gttgcttttt ggcttcccgc ctctggtttg ggaggtgatt 7260
gcgctgctgc ttcctgtaac ttgcctgcct ttctccccgt gtgggactcc tgggggtgag 7320
aggacttgtt acgaaggcag ccgtgttacg aaagggcctc ctgtgccgtc gaggttgtgc 7380
tctgtgaatg tcatcccctg gcccacagga gcaccttcta cacagggtac agtcggaatg 7440
ccgccccctg gagttgtgta aggcagcagc cttggccctt gcacataaga tgctgttgaa 7500
tattctgcct gcaccaagta aagggcacag gtagaactgc ttggcagtat gttgctgggg 7560
agatgagttt tttgtagtta aagtgtacta cattcttaca aatttggatc ttaaccatgg 7620
gattttaatg atagaaaaac tgttgaagat gagtctggtc ccttattgta cagtgaagca 7680
gcagaagccc cgaggaaggg tgttgacttt acgagtgtca gatagtagtt agaacttgct 7740
tttttttttg agacgcagcc ttgctctgtt gcctaggctg gagtacagtg gtgcaatctc 7800
agcttactgc aatctctgcc tcccaggttc aagcgattct cctgcctctg cctatcaggt 7860
agctgggact acacgtgcac accaccatgc ctagctaatt tttgtatttt tcagtagaga 7920
cagggtttcg ccatgttggc caggctggtc tcaaactcct gacctcagat gattcaccca 7980
cctcagcttc ccaaagtgct gggattccag gtgttagcca ccatgcccgg ccatagactt 8040
gtttctgttc ccttctcacc atgcctggac caaggtgttg cttatcccag aagttgtgat 8100
gcaggtccct gctctctcca tgggaagttt tagcaatgtt tctttttaga atgtatttgg 8160
gaactttaat tcataattta gctttttttt tttttctttt tcttgtaaat aggctgtacc 8220
agtgcaggtc ctcactttaa tcctctatcc agacaacacg gtgggccaaa ggatgaagag 8280
aggtaacaag atgcttaact cttgtaataa tggcgatagc tttctggagt tcatatggta 8340
tactacttgt aaatatgtgc taagataatt ccgtgttctc ccccaccttt gtttttgaac 8400
ttgctgactc atctaaaccc ctgctcccaa atgctggaat gcttttactt cctgggctta 8460
aaggaattga caaatgggga cacttaaaac gatttggttt tgtagcattt attgaatata 8520
gaactaatac aggtgccaaa ggggaactta tacaggaaat gtcatgagta acagtactgt 8580
caaccactag cagaatcaat catcgtgaaa cataggaagc gtctgtagat aaaaaaaaaa 8640
ttgatattga aaactagtcg agactccatt tgtatgtgta tgttttctga aagcctttca 8700
ggaaaatact aaatctaagg acaagatttt tatatcagag gcctcgggac atagctttgt 8760
tagctatgcc aataattaac aggcataact cagtaactga gagtctaccc tttggtactt 8820
ctgaaatgag gtgcaccccc atctttcttc ccagagcatg agtttgtaga cttgaagcct 8880
tgtttgaaga gctgtgttta gaatgcccag ctacttgttt gcaaatttgt gtttgctcag 8940
tcaagtttta atttagctca tgaactacct tgatgttcag tggagtcagc cctaatccat 9000
ctgatgcttt tccattatta ggcatgttgg agacctgggc aatgtgactg ctggcaaaga 9060
tggtgtggcc aaggtgtctt tcgaagattc tgtgatctcg ctctcaggag accattccat 9120
cattggccgc acattggtgg tgagttttca taaaaggatc tacataaaac ttcgtctaac 9180
atacagtcat gtatctcttc actttatgat tgttagtcgt ggtttctaaa gatccagata 9240
aattatactt gcagttcaaa ttaggaaaag caattttatt ggacaattat ggtgaaaatc 9300
aattatttta tctgggtcag tcaagaacac tgttctgcta agatgcagta gaaagcaggt 9360
tacatttgac catattagat ctgagtttgg aaaacagagt agtctttagt tttaaaatgg 9420
ccagattttc ttgccaggat tgggtttctc acttgtgaaa cagaacattt tgttaagttt 9480
aaaacctggg atggacttca gtattcatgt tcatccagga ctgcaggtta tcatgacttg 9540
tttaacttgt gggaagctgt tgccccaagt tattctgggg aatgcatctg gttcatgcaa 9600
aacaccaggt agactggctc tcttttacct ccctttgagg gcattaacat tcattagtca 9660
cttccactca gttaaccctt ttatttttaa ggttttcttg agccatagtt gtaaagcaga 9720
aaaattgttt acaaaggttt gttgaacaaa attcaaaata ctgttgctaa agtattaagg 9780
ttttttagga ttatgtctta tttataggcc tgtcattcat ttggtatgaa attttgagcg 9840
ttactcactt tcactttcct ttttttccaa agcaattaaa ttgccaaaga gtgactgctg 9900
aactacagtt actgtaactt atcatggagg actaagggta gtgtgtggtg gtctacaaca 9960
tagttatttg ggtttttagt atttcattta gagatagcaa cacttaccta atgtttaaag 10020
gtaatgtctt tgcaacacca agaaaaagct ttgaatagta gtttttactt ttaaactact 10080
aagtattagt atatctacta ggattaatgt tatttttcta atattatgag gttcttaaac 10140
tatcttttgg gtattgttgg gaggaggtag tgattacttg acagcccaaa gttatcttct 10200
tacaattttt tacaggtcca tgaaaaagca gatgacttgg gcaaaggtgg aaatgaagaa 10260
agtaaaaaga caggaaacgc tggaggtcgt ctggcttgtg gtgtaattgg gatcgcccaa 10320
taaacattcc cttggatgta gtctgaggcc cattaactca tctgttatcc tgctagctgt 10380
agaaatgtat cttgataaac attaaacact gtaatcttaa gagtgtaatt gtgtgacgtt 10440
tgcttagtac ctgtaatgag aaactggttg atgatcactt ggaagatttg tatagtttta 10500
taaaactcaa ttaaaatgtc tgtttcaatg acctgtattt tgccagactt aatcacagat 10560
gggtattaaa cttgtcagaa tttcttcaat tctcattcaa gcctgtgaat aaaaaccctg 10620
tatggcactc attttgagtc tattaaaaga atccaagttc aaactaaatt agctctgata 10680
cttatttata taaacagctt cagtggaaca gatttagtaa tgctaacagt gatagcattt 10740
tactttgaaa gtgttttgag atcatcaaaa tgcatacttt taaaacagca ggtcttttag 10800
ctaatacgaa cacaactctg cttagacaac aggctgtcct ttgaaagctt tagggaaatg 10860
ttcttgctta gtcattttag cattttgatt cataaagtac ctcattttaa aaagacgtta 10920
tcgtgtaaga gagccatttg ataacttagt gagtttaaaa ggcaagttac agcctcagct 10980
agctaataag attatctacc tgccagaatg gcacaaattg tacattcaag ggtggacgtt 11040
ggcacaacct acttaacaga ttagcccttt aaagaaatct atagcattgg aagatagaac 11100
caaggaaatg tttgactgtg ggttctggct gtttattaat ttacacaccg aattagtgaa 11160
atgagtcact ttcaatgtat ttacgtacct gagagagagt gcttttaaat gttattgact 11220
attcaattgg aaattgtaaa ttgtagaata tttctgataa accatgaata agtgacaatc 11280
tgttcataaa tacgtacttt atcaaatgta ggagaggaaa agctaaattg ggaagacaaa 11340
tctgtagtgt ttccaaagtt ttaaaattat gttaaagaac aatatgctta cagtaagtgg 11400
ttaaaaccac cattctttaa atctcggtaa tgtttaaaaa acactattta acccatttcc 11460
ctgatgtagt ttgttgccta tgtggaatta gagactcacg cctttcaaac ttcaaatata 11520
atcatgctac cagttaggag tagtcatttc atgtgcatat aggatgctct taagttggaa 11580
atacaggctg taagtccttc aagtctggat gttgagtaat cacgttttct tccagaagcc 11640
atttgttagg actttttttt gggccagtgt aaaattaagg acaagtttta taatttaaat 11700
ttacagatac aacaattttc tctcattttc taaaggcagg aatataagga cattgcccta 11760
gatatattct ccccatcaaa ccaaaggcct tgctgctgag tattatttaa aaaccagagt 11820
aataaagcag ctttgcctga ggatgacggc aaagacaaag ttaactgcta agcatactga 11880
aaccaagagt ttaaaaaagt aattcaaaac aacttgaagg ccataaatat ttggatagtg 11940
tgacatcagg tcttggcact ggatttcctg caatttcaga taaaggcttg acttggcttt 12000
ggatgtcttc atgtaattct tggataacct acaacaattt ttcctagtta acccaccaac 12060
tttaagcaaa agaaaaaaag tgtatgtggg ggaaaagttc agtttacctc tgcccagcag 12120
gggaattaaa aaactggtaa agaaaggcaa taggcaaggc ttatataagg aaacaataat 12180
aggttgcact gaagtcctca aacacaacaa aaagctttta gattgcaaat gttaaccttg 12240
attcttttac ccttttgaag aattcagtgg gatggttgga aaaaaaaaaa caacacacac 12300
acacatgcaa ccttctaacg taatacccac gcagtcagat aatttatagt acaacatgta 12360
acactggaat taacttttcc cccagcaaaa tcttacaaat taattagggc aacatatacc 12420
acaaagccaa tggggaaaaa aaaaaacctc gattgaattg caaacacagc ttttcaattg 12480
acattaaaac aactaacctt taccttatga ctgaaacact aaaattcaaa agtattacat 12540
atgaaagtga gaataactac ataaaatgtc tattttcatc aaataagtct aatttagact 12600
ccaatacagt attaacagct caaactttga tggtgaacaa tccttttcca ccttaatgca 12660
gtgtaggaag aatagcacac attaaagttt gttacgaaaa tagagtttat taaaaacatc 12720
cctattgttt tgaggagctt tcaccgttac cttgtcttaa attaaaaaaa aaaaaaaata 12780
gagagcactt ctaattacga tttgtaaact ttttaaagtc aaaactttta aaaagttaca 12840
gcaaaaaggg taatatttat tcatattttc agtatttttt gttattttgt ggctattttt 12900
aaatagaagg gaagcaatca aattgcttac agttccccac cagctggcgc ggggctgcag 12960
tacagcggga gcggatataa tacagcatct gtacacctca a 13001
<210> 4
<400> 4
000
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
aggagaaaaa caaagaacac cagaa 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
caattagggc aactcagaaa tagct 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 7
ccaactggtc ccccagccaa ga 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
gaaaccagcc tggacaccaa 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
tccacagtct ttaccacgat gttc 24
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 10
tccgtgtcag aaggccacct caaga 25
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
ctctcaggag accattgcat ca 22
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
tcctgtcttt gtactttctt catttcc 27
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 13
ccgcacactg gtggtccatg aaaa 24
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
cgtggcctag cgagttatgg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
gaaattgatg atgccctgca 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 16
acgaaggccg tgtgcgtgct g 21
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
tggagataat acacaaggct gtacca 26
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
caacatgcct ctcttcatcc ttt 23
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 19
atcctctatc cagacaacac ggtgggc 27
<210> 20
<400> 20
000
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 21
ccgtcgccct tcagcacgca 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 22
cactggtcca ttactttcct 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 23
acaccttcac tggtccatta 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 24
ccacaccttc actggtccat 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 25
caacatgcct ctcttcatcc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 26
ccaacatgcc tctcttcatc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 27
tccaacatgc ctctcttcat 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 28
ctccaacatg cctctcttca 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 29
tctccaacat gcctctcttc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 30
gtctccaaca tgcctctctt 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 31
cacctttgcc caagtcatct 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 32
ccacctttgc ccaagtcatc 20
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 33
tccacctttg cccaagtcat 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 34
ttccaccttt gcccaagtca 20
<210> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 35
tttccacctt tgcccaagtc 20
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 36
atttccacct ttgcccaagt 20
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 37
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 38
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<220>
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<400> 39
ttcatttcca cctttgccca 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 40
cttcatttcc acctttgccc 20
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<212> DNA
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<220>
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<400> 41
tcttcatttc cacctttgcc 20
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<212> DNA
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<220>
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<400> 42
ttcttcattt ccacctttgc 20
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<212> DNA
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<220>
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<400> 43
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<212> DNA
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actttcttca tttccacctt 20
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<212> DNA
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tactttcttc atttccacct 20
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<400> 50
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<212> DNA
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<220>
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<400> 51
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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acacatcggc cacaccatct 20
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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ctttgtactt tcttcatttc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<400> 90
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 97
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<212> DNA
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<220>
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<400> 98
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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<400> 100
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 101
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 102
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<212> DNA
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<220>
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<400> 103
catcggccac accatctttg 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 104
tagacacatc ggccacacca 20
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<212> DNA
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<220>
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<400> 105
ctcctgagag tgagatcaca 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 106
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 107
taggccagac ctccgcgcct 20
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 108
actttatagg ccagacctcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 109
gacgcaaacc agcaccccgt 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 110
ggttccgagg actgcaacgg 20
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 111
tcctggttcc gaggactgca 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 112
gaggtcctgg ttccgaggac 20
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 113
gtcgccataa ctcgctaggc 20
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 114
tcagcacgca cacggccttc 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 115
cttcagcacg cacacggcct 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 116
cccttcagca cgcacacggc 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 117
cgcccttcag cacgcacacg 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 118
cgcccactct ggccccaaac 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 119
ccgcgactac tttataggcc 20
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 120
ccttctgctc gaaattgatg 20
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 121
tccttctgct cgaaattgat 20
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 122
ttccttctgc tcgaaattga 20
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 123
tttccttctg ctcgaaattg 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 124
ctttccttct gctcgaaatt 20
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 125
actttccttc tgctcgaaat 20
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 126
tactttcctt ctgctcgaaa 20
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 127
ttactttcct tctgctcgaa 20
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 128
attactttcc ttctgctcga 20
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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ctgctttttc atggaccacc 20
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 209
tctgcttttt catggaccac 20
<210> 210
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 210
atctgctttt tcatggacca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 211
catctgcttt ttcatggacc 20
<210> 212
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 212
tcatctgctt tttcatggac 20
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 213
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<210> 214
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 214
agtcatctgc tttttcatgg 20
<210> 215
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 215
aagtcatctg ctttttcatg 20
<210> 216
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 216
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 217
ccaagtcatc tgctttttca 20
<210> 218
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 218
cccaagtcat ctgctttttc 20
<210> 219
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 219
gcccaagtca tctgcttttt 20
<210> 220
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 220
tgcccaagtc atctgctttt 20
<210> 221
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 221
ttgcccaagt catctgcttt 20
<210> 222
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 222
tttgcccaag tcatctgctt 20
<210> 223
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 223
ctttgcccaa gtcatctgct 20
<210> 224
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 224
cctttgccca agtcatctgc 20
<210> 225
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 225
acctttgccc aagtcatctg 20
<210> 226
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 226
cccaattaca ccacaagcca 20
<210> 227
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 227
tcccaattac accacaagcc 20
<210> 228
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 228
atcccaatta caccacaagc 20
<210> 229
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 229
gatcccaatt acaccacaag 20
<210> 230
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 230
cgatcccaat tacaccacaa 20
<210> 231
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 231
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<210> 232
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 232
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<210> 233
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 233
tgggcgatcc caattacacc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 234
ttgggcgatc ccaattacac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 235
attgggcgat cccaattaca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 236
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 240
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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catccaaggg aatgtttatt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 247
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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ctacatccaa gggaatgttt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 250
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<210> 251
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 251
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<210> 252
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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agactacatc caagggaatg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 253
cagactacat ccaagggaat 20
<210> 254
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 254
tcagactaca tccaagggaa 20
<210> 255
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 260
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<400> 265
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 266
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 267
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 272
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 276
tacatttcta cagctagcag 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 277
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 278
gatacatttc tacagctagc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 282
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<212> DNA
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<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 284
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<210> 285
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 285
aagattacag tgtttaatgt 20
<210> 286
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 286
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 287
ttaagattac agtgtttaat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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taaaactata caaatcttcc 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 299
tataaaacta tacaaatctt 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 301
tttataaaac tatacaaatc 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<210> 308
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 308
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 309
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 310
caggtcattg aaacagacat 20
<210> 311
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 311
acaggtcatt gaaacagaca 20
<210> 312
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 312
tacaggtcat tgaaacagac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 313
aatacaggtc attgaaacag 20
<210> 314
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 314
aaatacaggt cattgaaaca 20
<210> 315
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 315
aaaatacagg tcattgaaac 20
<210> 316
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 316
caaaatacag gtcattgaaa 20
<210> 317
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 317
ccttgccttc tgctcgaaat 20
<210> 318
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 318
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<210> 319
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 319
ctctgatata aaaatcttgt 20
<210> 320
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 320
gccccgcggc ggcctcggtc 20
<210> 321
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 321
gctatcgcca ttattacaag 20
<210> 322
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 322
ctcaaatgtg aaagttgtcc 20
<210> 323
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 323
gttctatatt caataaatgc 20
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<211> 20
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<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<210> 415
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<212> DNA
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<220>
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<211> 20
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 421
ttgttcccac actcaatgca 20
<210> 422
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 422
tcaccagcac agcacaacac 20
<210> 423
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 423
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<210> 424
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 424
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<400> 427
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 442
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<211> 20
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 509
ttccaccagt tggtaacttc 20
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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taagatcttc aaataagcta 20
<210> 513
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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atcaactctt tccctttctt 20
<210> 514
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 514
tgtgtcctca aaagggagat 20
<210> 515
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 515
tacctcctcc caacaatacc 20
<210> 516
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 516
ttctgcttta caactatggc 20
<210> 517
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 517
gtacatgttg aatatacatg 20
<210> 518
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 518
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 598
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 599
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 600
cgtcgccata actcgctagg 20
<210> 601
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 601
cagcacgcac acggccttcg 20
<210> 602
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<220>
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 609
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 610
tgatgccctg cactgggccg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 611
gatgatgccc tgcactgggc 20
<210> 612
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 612
ttgatgatgc cctgcactgg 20
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<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 613
ggcgatccca attacacc 18
<210> 614
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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tcgaaattga tgatgccctg 20
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 709
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1000
ccacaccttc actggtc 17
<210> 1001
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1001
cccacacctt cactggt 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1002
ccccacacct tcactgg 17
<210> 1003
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1004
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<211> 17
<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1007
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1008
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<220>
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<210> 1087
<211> 17
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1088
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1089
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1090
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<210> 1091
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1091
agtcatctgc tttttca 17
<210> 1092
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1092
aagtcatctg ctttttc 17
<210> 1093
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1093
caagtcatct gcttttt 17
<210> 1094
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1094
ccaagtcatc tgctttt 17
<210> 1095
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1095
cccaagtcat ctgcttt 17
<210> 1096
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1096
gcccaagtca tctgctt 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1097
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1098
ttgcccaagt catctgc 17
<210> 1099
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1099
ccacctttgc ccaagtc 17
<210> 1100
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1100
tccacctttg cccaagt 17
<210> 1101
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1101
ttccaccttt gcccaag 17
<210> 1102
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1102
tttccacctt tgcccaa 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1103
atttccacct ttgccca 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1104
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1105
tcatttccac ctttgcc 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1106
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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caagggaatg tttattg 17
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<220>
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1143
agactacatc caaggga 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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tcagactaca tccaagg 17
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<211> 17
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1147
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1148
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
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<400> 1153
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
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<220>
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
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<211> 17
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<220>
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<400> 1160
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
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<211> 17
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
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<211> 17
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<220>
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<211> 17
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<223> 合成寡核苷酸
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catttctaca gctagca 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1170
atacatttct acagcta 17
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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gatacatttc tacagct 17
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
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<220>
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<211> 17
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<211> 17
<212> DNA
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<211> 17
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<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1199
cattgaaaca gacattt 17
<210> 1200
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1200
tcattgaaac agacatt 17
<210> 1201
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1201
gtcattgaaa cagacat 17
<210> 1202
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1202
ggtcattgaa acagaca 17
<210> 1203
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1203
aggtcattga aacagac 17
<210> 1204
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1204
caggtcattg aaacaga 17
<210> 1205
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1205
acaggtcatt gaaacag 17
<210> 1206
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1206
tacaggtcat tgaaaca 17
<210> 1207
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1207
atacaggtca ttgaaac 17
<210> 1208
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1208
aatacaggtc attgaaa 17
<210> 1209
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1209
aaatacaggt cattgaa 17
<210> 1210
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1210
aaaatacagg tcattga 17
<210> 1211
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1211
caaaatacag gtcattg 17
<210> 1212
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1212
gcaaaataca ggtcatt 17
<210> 1213
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1213
ggcaaaatac aggtcat 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1214
tggcaaaata caggtca 17
<210> 1215
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1215
ctggcaaaat acaggtc 17
<210> 1216
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1216
tctggcaaaa tacaggt 17
<210> 1217
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1217
gtctggcaaa atacagg 17
<210> 1218
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1218
agtctggcaa aatacag 17
<210> 1219
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1219
aagtctggca aaataca 17
<210> 1220
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1220
taagtctggc aaaatac 17
<210> 1221
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1221
ttaagtctgg caaaata 17
<210> 1222
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1222
aatacccatc tgtgatt 17
<210> 1223
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1223
taatacccat ctgtgat 17
<210> 1224
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1224
ttaataccca tctgtga 17
<210> 1225
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1225
tttaataccc atctgtg 17
<210> 1226
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1226
gtttaatacc catctgt 17
<210> 1227
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1227
agtttaatac ccatctg 17
<210> 1228
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1228
aagtttaata cccatct 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1229
caagtttaat acccatc 17
<210> 1230
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1230
acaagtttaa tacccat 17
<210> 1231
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1231
gacaagttta ataccca 17
<210> 1232
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1232
tgacaagttt aataccc 17
<210> 1233
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1233
ctgacaagtt taatacc 17
<210> 1234
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1234
tctgacaagt ttaatac 17
<210> 1235
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1235
ttctgacaag tttaata 17
<210> 1236
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1236
attctgacaa gtttaat 17
<210> 1237
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1237
aattctgaca agtttaa 17
<210> 1238
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1238
aaattctgac aagttta 17
<210> 1239
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1239
gaaattctga caagttt 17
<210> 1240
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1240
agaaattctg acaagtt 17
<210> 1241
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1241
aagaaattct gacaagt 17
<210> 1242
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1242
ttcacaggct tgaatga 17
<210> 1243
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1243
attcacaggc ttgaatg 17
<210> 1244
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1244
tattcacagg cttgaat 17
<210> 1245
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1245
ttattcacag gcttgaa 17
<210> 1246
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1246
tttattcaca ggcttga 17
<210> 1247
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1247
ttttattcac aggcttg 17
<210> 1248
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1248
tttttattca caggctt 17
<210> 1249
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1249
gtttttattc acaggct 17
<210> 1250
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1250
ggtttttatt cacaggc 17
<210> 1251
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1251
gggtttttat tcacagg 17
<210> 1252
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1252
agggttttta ttcacag 17
<210> 1253
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1253
cagggttttt attcaca 17
<210> 1254
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1254
acagggtttt tattcac 17
<210> 1255
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1255
tacagggttt ttattca 17
<210> 1256
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1256
atacagggtt tttattc 17
<210> 1257
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1257
catacagggt ttttatt 17
<210> 1258
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1258
ccatacaggg tttttat 17
<210> 1259
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1259
gccatacagg gttttta 17
<210> 1260
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1260
tgccatacag ggttttt 17
<210> 1261
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1261
gtgccataca gggtttt 17
<210> 1262
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1262
agtgccatac agggttt 17
<210> 1263
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1263
ttggattctt ttaatag 17
<210> 1264
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1264
ttttagtttg aatttgg 17
<210> 1265
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1265
ctcgcccact ctggccccaa 20
<210> 1266
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1266
gcctcgccca ctctggcccc 20
<210> 1267
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1267
gcgcctcgcc cactctggcc 20
<210> 1268
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1268
ccgcgcctcg cccactctgg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1269
ctccgcgcct cgcccactct 20
<210> 1270
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1270
acctccgcgc ctcgcccact 20
<210> 1271
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1271
agacctccgc gcctcgccca 20
<210> 1272
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1272
ccagacctcc gcgcctcgcc 20
<210> 1273
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1273
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<210> 1274
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1274
tataggccag acctccgcgc 20
<210> 1275
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1275
tttataggcc agacctccgc 20
<210> 1276
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1276
gactacttta taggccagac 20
<210> 1277
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1277
gcgactactt tataggccag 20
<210> 1278
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1278
ctccgcgact actttatagg 20
<210> 1279
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1279
gtctccgcga ctactttata 20
<210> 1280
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1280
ccgtctccgc gactacttta 20
<210> 1281
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1281
ccccgtctcc gcgactactt 20
<210> 1282
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1282
caccccgtct ccgcgactac 20
<210> 1283
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1283
agcaccccgt ctccgcgact 20
<210> 1284
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1284
ccagcacccc gtctccgcga 20
<210> 1285
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1285
aaccagcacc ccgtctccgc 20
<210> 1286
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1286
caaaccagca ccccgtctcc 20
<210> 1287
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1287
cgcaaaccag caccccgtct 20
<210> 1288
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1288
acgacgcaaa ccagcacccc 20
<210> 1289
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1289
ctacgacgca aaccagcacc 20
<210> 1290
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1290
gactacgacg caaaccagca 20
<210> 1291
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1291
gagactacga cgcaaaccag 20
<210> 1292
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1292
aggagactac gacgcaaacc 20
<210> 1293
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1293
gcaggagact acgacgcaaa 20
<210> 1294
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1294
ctgcaggaga ctacgacgca 20
<210> 1295
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1295
cgctgcagga gactacgacg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1296
tgcaacggaa accccagacg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<220>
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<220>
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1344
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<220>
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<223> 合成寡核苷酸
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<211> 17
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<223> 合成寡核苷酸
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<210> 1362
<211> 17
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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tcactacagg tacttta 17
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<211> 17
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
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<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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ttctcactac aggtact 17
<210> 1367
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1367
tttctcacta caggtac 17
<210> 1368
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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cagtttctca ctacagg 17
<210> 1371
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1371
tcagtttctc actacag 17
<210> 1372
<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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atcagtttct cactaca 17
<210> 1373
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 17
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<210> 1375
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 17
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<220>
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<220>
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<220>
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<211> 17
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 17
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<210> 1382
<211> 17
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<210> 1383
<211> 17
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1383
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<210> 1384
<211> 17
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 17
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<220>
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<210> 1386
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1387
tgtgatttaa gtctggc 17
<210> 1388
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<220>
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<400> 1391
catctgtgat ttaagtc 17
<210> 1392
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1392
ccatctgtga tttaagt 17
<210> 1393
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1393
cccatctgtg atttaag 17
<210> 1394
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1394
acccatctgt gatttaa 17
<210> 1395
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1395
tacccatctg tgattta 17
<210> 1396
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1396
gcttgaatga caaagaa 17
<210> 1397
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1397
ggcttgaatg acaaaga 17
<210> 1398
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1398
cacaggcttg aatgaca 17
<210> 1399
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1399
tcacaggctt gaatgac 17
<210> 1400
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1400
aagtgccata cagggtt 17
<210> 1401
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1401
taagtgccat acagggt 17
<210> 1402
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1402
ataagtgcca tacaggg 17
<210> 1403
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1403
aataagtgcc atacagg 17
<210> 1404
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1404
taataagtgc catacag 17
<210> 1405
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1405
ataataagtg ccataca 17
<210> 1406
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1406
cataataagt gccatac 17
<210> 1407
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1407
tcataataag tgccata 17
<210> 1408
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1408
ctcataataa gtgccat 17
<210> 1409
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1409
cctcataata agtgcca 17
<210> 1410
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1410
gcctcataat aagtgcc 17
<210> 1411
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1411
agcctcataa taagtgc 17
<210> 1412
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1412
tagcctcata ataagtg 17
<210> 1413
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1413
atagcctcat aataagt 17
<210> 1414
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1414
aatagcctca taataag 17
<210> 1415
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1415
cttttaatag cctcata 17
<210> 1416
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1416
tcttttaata gcctcat 17
<210> 1417
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1417
ggattctttt aatagcc 17
<210> 1418
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1418
ttagtttgaa tttggat 17
<210> 1419
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1419
gtcgcccttc agcacgca 18
<210> 1420
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1420
cccacacctt cactgg 16
<210> 1421
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1421
ttccccacac cttcactg 18
<210> 1422
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1422
ccccacacct tcactg 16
<210> 1423
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1423
cttccccaca ccttcact 18
<210> 1424
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1424
tccccacacc ttcact 16
<210> 1425
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1425
gcttccccac accttcac 18
<210> 1426
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1426
ttccccacac cttcac 16
<210> 1427
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1427
cttccccaca ccttca 16
<210> 1428
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1428
aggatacatt tctacagct 19
<210> 1429
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1429
atacatttct acagctag 18
<210> 1430
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1430
gatacatttc tacagcta 18
<210> 1431
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1431
tacatttcta cagcta 16
<210> 1432
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1432
ggatacattt ctacagct 18
<210> 1433
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1433
atacatttct acagct 16
<210> 1434
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1434
aggatacatt tctacagc 18
<210> 1435
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1435
gatacatttc tacagc 16
<210> 1436
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1436
caggatacat ttctacag 18
<210> 1437
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1437
atgtttatca ggatac 16
<210> 1438
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1438
ttaatgttta tcaggata 18
<210> 1439
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1439
tttaatgttt atcaggat 18
<210> 1440
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1440
gtttaatgtt tatcagga 18
<210> 1441
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1441
ttaatgttta tcagga 16
<210> 1442
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1442
tgtttaatgt ttatcagg 18
<210> 1443
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1443
tttaatgttt atcagg 16
<210> 1444
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1444
gtgtttaatg tttatcag 18
<210> 1445
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1445
gtttaatgtt tatcag 16
<210> 1446
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1446
agtgtttaat gtttatca 18
<210> 1447
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1447
tgtttaatgt ttatca 16
<210> 1448
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1448
cagtgtttaa tgtttatc 18
<210> 1449
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1449
gtgtttaatg tttatc 16
<210> 1450
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1450
acagtgttta atgtttat 18
<210> 1451
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1451
tacagtgttt aatgttta 18
<210> 1452
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1452
cagtgtttaa tgttta 16
<210> 1453
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1453
ttacagtgtt taatgttt 18
<210> 1454
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1454
acagtgttta atgttt 16
<210> 1455
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1455
ggatacattt ctacag 16
<210> 1456
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1456
taatgtttat caggat 16
<210> 1457
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1457
agtgtttaat gtttat 16
<210> 1458
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1458
catttctaca gctagc 16
<210> 1459
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1459
acatttctac agctag 16
<210> 1460
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1460
aatgtttatc aggata 16
<210> 1461
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1461
caggatacat ttctacagc 19

Claims (8)

1.一种反义化合物的盐，其中所述反义化合物的阴离子由下式组成：
Figure FDA0002231050050000011
2.一种根据下式的反义化合物：
mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo AesGeo mCes Te(SEQ ID NO:725)；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰糖，
d＝2’-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
o＝磷酸二酯核苷间键联；
或其药学上可接受的盐。
3.如权利要求2所述的反义化合物。
4.如权利要求2所述的反义化合物的药学上可接受的盐。
5.一种药学组合物，其包含如权利要求1或4所述的药学上可接受的盐、如权利要求2所述的反义化合物或药学上可接受的盐、或如权利要求3所述的反义化合物和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
6.如权利要求5所述的药学组合物，其中所述药学上可接受的稀释剂是磷酸缓冲的生理盐水(PBS)。
7.如权利要求1或4所述的药学上可接受的盐、如权利要求2所述的反义化合物或药学上可接受的盐、如权利要求3所述的反义化合物或如权利要求5或6所述的药学组合物在制造用于治疗SOD-1突变相关的肌萎缩性硬化(ALS)的药物的用途。
8.如权利要求1或4所述的药学上可接受的盐、如权利要求2所述的反义化合物或药学上可接受的盐、如权利要求3所述的反义化合物或如权利要求5或6所述的药学组合物在制造用于预防SOD-1突变相关的ALS的药物的用途。
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