RS60707B1 - Kompozicije za modulaciju ekspresije sod-1 - Google Patents

Kompozicije za modulaciju ekspresije sod-1

Info

Publication number
RS60707B1
RS60707B1 RS20201004A RSP20201004A RS60707B1 RS 60707 B1 RS60707 B1 RS 60707B1 RS 20201004 A RS20201004 A RS 20201004A RS P20201004 A RSP20201004 A RS P20201004A RS 60707 B1 RS60707 B1 RS 60707B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sod
isis
antisense compound
nucleosides
modified
Prior art date
Application number
RS20201004A
Other languages
English (en)
Inventor
Eric E Swayze
Tracy Cole
Holly Kordasiewicz
Susan M Freier
Thomas P Condon
Edward Wancewicz
Trisha Lockhart
Timothy Vickers
Priyam Singh
Original Assignee
Biogen Ma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Ma Inc filed Critical Biogen Ma Inc
Publication of RS60707B1 publication Critical patent/RS60707B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y115/00—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C12Y115/01—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15) with NAD or NADP as acceptor (1.15.1)
    • C12Y115/01001—Superoxide dismutase (1.15.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Otkrivene su kompozicije i postupci za redukciju ekspresije superoksid dismutaze 1, rastvorljive iRNK (SOD-1) i proteina kod životinje. Takvi postupci su korisni za lečenje, prevenciju ili poboljšanje neurodegenerativnih bolesti, uključujući amiotrofnu lateralnu sklerozu (ALS) inhibicijom ekspresije SOD-1 kod životinje.
Osnova pronalaska
[0002] Rastvorljivi SOD-1 enzim (takođe poznat kao Cu/Zn superoksid dismutaza) je jedna od superoksid dismutaza koja obezbeđuje odbranu od oksidativnog oštećenja biomolekula katalizom dismutacije superoksida vodonik peroksidom (H2O2) (Fridovich, Annu. Rev. Biochem., 1995, 64, 97-112). Superoksidni anjon (O2-) je potencijalno štetan ćelijski sporedni proozvod proizveden primarno greškama u oksidativnoj fosforilaciji u mitohondrijama (Turrens, J. Physiol.2003, 552, 335-344)
[0003] Mutacije u genu za SOD-1 su povezane sa dominantno nasleđenim oblikom amiotrofne lateralne skleroze (ALS, takođe poznata kao Lou Gehrig-ova bolest) poremećajem okarakterisanim selektivnom degeneracijom gornjih i donjih motornih neurona (Rowland, N. Engl. J. Med. 2001, 344, 1688-1700). Postoji uska genetska veza između porodične ALS i „missense“ mutacija u genu za SOD1 (Rosen, Nature, 1993, 362, 59-62). Veruje se da toksičnost mutantnog SOD1 nastaje od početnog pogrešnog savijanja u 3D strukturu (dobitak funkcije) redukujući zaštitu jedra od aktivnog enzima (gubitak funkcije u jedru), proces koji može biti uključen u patogenezu ALS (Sau, Hum. Mol. Genet.2007, 16, 1604-1618).
[0004] ALS je devastirajuća progresivna neurodegenerativna bolest koja pogađa 30,000 Amerikanaca u bilo koje dato vreme. Progresivna degeneracija motornih neurona kod ALS konačno dovodi do njihove smrti. Posle smrti motornih neurona, sposobnost mozga da započne i kontroliše kretanje mišića je izgubljeno. Sa progresivno pogođenom dobrovoljnom aktivnošću mišića, pacijenti u kasnijim stadijumima bolesti mogu da postanu potpuno paralizovani.
[0005] Trenutno nedostaju prihvatljive opcije za lečenje takvih neurodegenerativnih bolesti. Prema tome, ovde je cilj obezbediti jedinjenja i kompozicije za upotrebu u lečenju takvih bolesti.
[0006] WO 2009/102427 se odnosi na modifikovane konstrukte RNK sa optimalnom biološkom aktivnošću, toksičnošću, stabilnošću i ciljnom genskom specifičnošću i njihovom upotrebom.
[0007] WO 2006/066203 se odnosi na molekule dvolančane male interferirajuće RNK (siRNK) za modulaciju gena za SOD kod subjekata sa neurološkim poremećajima.
[0008] US 2009/130195 se odnosi na postupke za lečenje kancera prostate upotrebom jedinjenja koja sadrže molekule male siRNK za inhibiciju ekspresije PKC.
Kratak opis pronalaska
[0009] Predmetni pronalazak daje antisens jedinjenje prema sledećoj formuli: mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te (nukleobazna sekvenca od SEQ ID NO: 725)
gde,
A = adenin,
mC = 5-metilcitozin,
G = guanin,
T = timin,
e = 2'-O-metoksietilribozom modifikovani šećer,
d = 2'-deoksiriboza šećer,
s = fosforotioatna internukleozidna veza i
o = fosfodiestarska internukleozidna veza;
ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so.
[0010] Pronalazak takođe daje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antisens jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so prema pronalasku i najmanje jedan od farmaceutski prihvatljivog nosača ili razblaživača.
[0011] Pronalazak dalje daje antisens jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku, za upotrebu u terapiji humanog subjekta.
[0012] Pronalazak takođe daje antisens jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku, za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povezane sa SOD-1.
Kratak opis otkrića
[0013] Ovde su opisani postupci, jedinjenja i kompozicije za modulaciju ekspresije superoksid dismutaze 1, rastvorljive iRNK (SOD-1) i proteina. U određenim slučajevima, jedinjenja korisna za modulaciju ekspresije iRNK SOD-1 i proteina su antisens jedinjenja. U određenim slučajevima, antisens jedinjenja su modifikovani oligonukleotidi.
[0014] U određenim slučajevima, modulacija može da se javi u ćeliji ili tkivu. U određenim slučajevima, ćelija ili tkivo je u životinji. U određenim slučajevima, životinja je čovek. U određenim slučajevima, nivoi iRNK SOD-1 su smanjeni. U određenim slučajevima, nivoi SOD-1 proteina su smanjeni. Takvo smanjenje može da se javi na način zavisan od vremena ili na način zavisan od doze.
[0015] Takođe su opisani postupci, jedinjenja i kompozicije korisni za prevenciju, lečenje i ublažavanje bolesti, poremećaja i stanja. U određenim slučajevima, takve bolesti, poremećaji i stanja povezani sa SOD-1 su neurodegenerativne bolesti. U određenim slučajevima, takve neurodegenerativne bolesti, poremećaji i stanja obuhvataju amiotrofnu lateralnu sklerozu (ALS).
[0016] Takve bolesti, poremećaji i stanja mogu da imaju jedan ili više zajedničkih faktora rizika, uzroka ili ishoda. Određeni faktori rizika i uzroci za razvoj ALS obuhvataju starenje, ličnu ili porodičnu istoriju ili genetičku predispoziciju. Međutim, većina ALS slučajeva su sporadični i nisu poznati faktori rizika. Određeni simptomi i ishodi povezani sa razvojem ALS obuhvataju, ali bez ograničenja na: fascikulacije, grčeve, zategnute i ukočene mišiće (spastičnost), slabost mišića koja pogađa ruku ili nogu, nerazgovetan i nazalni govor, teškoće pri hodu, teškoće pri žvakanju ili gutanju (disfagija), teškoće pri govoru ili formiranju reči (disartrija), slabost ili atrofija, spastičnost, preterane reflekse (hiper-refleksija) i prisustvo Babinski-ovog znaka. Kako ALS napreduje, simptomi i ishodi obuhvataju slabljenje drugih udova, što je možda praćeno trzanjem, mišićnim grčevima i prekomernim, bržim refleksima; probleme sa žvakanjem, gutanjem i disanjem; može da se javi balavljenje; konačno paraliza; i smrt.
[0017] U određenim slučajevima, postupci za lečenje obuhvataju primenu SOD-1 antisens jedinjenja na individuu kod koje postoji potreba za njim. U određenim slučajevima, postupci za lečenje obuhvataju primenu SOD-1 modifikovanog oligonukleotida na individuu kod koje postoji potreba za njim.
Detaljan opis
[0018] Potrebno je razumeti da su gore navedeni opšti opis i sledeći detaljan opis samo ilustrativni i eksplanatorni i nisu ograničavajući za pronalazak, kako je navedeno u patentnim zahtevima. Ovde, upotreba jednine obuhvata množinu, osim ukoliko nije specifično drugačije naznačeno. Kao što je ovde korišćeno, upotreba "ili" označava "i/ili" osim ukoliko je navedeno drugačije. Dodatno, kao što je ovde korišćeno, upotreba "i" označava "i/ili" osim ukoliko je navedeno drugačije. Pored toga, upotreba termina "uključujući" kao i drugi oblici, kao što su "obuhvata" i "obuhvaćen", nije ograničavajuća. Takođe, termini kao što su "element" ili "komponenta" obuhvataju oba elementa i komponente koje sadrže jednu jedinicu i elemente i komponente koji sadrže više od jedne podjedinice, osim ukoliko je specifično navedeno drugačije. Takođe, sve sekvence opisane ovde su navedene 5' do 3', osim ukoliko je drugačije navedeno.
[0019] Podnaslovi delova prijave koji su ovde korišćeni su dati samo iz svrhe organizacije i ne bi ih trebalo tumačiti kao ograničavajuće za opisani predmet zaštite.
Definicije
[0020] Osim ukoliko su specifične definicije ovde obezbeđene, nomenklatura korišćena u vezi sa i postupci i tehnike, analitičke hemije, sintetičke organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije opisane ovde je ona dobro poznata i uobičajeno korišćena u stanju tehnike. Standardne tehnike mogu biti korišćene za hemijsku sintezu i hemijsku analizu.
[0021] Osim ukoliko je drugačije naznačeno, sledeći termini imaju sledeća značenja: "2'-deoksinukleozid" (takođe 2'-deoksiribonukleozid) označava nukleozid koji sadrži 2'-H furanozil šećernu grupu, kao što se nalazi u prirodnim deoksiribonukleozidima (DNK). U određenim slučajevima, 2'-deoksinukleozid može da sadrži modifikovanu nukleobazu ili može da sadrži nukleobazu RNK (npr., uracil).
"2'-deoksiriboza šećer" označava 2'-H furanozil šećernu grupu, kao što se nalazi u prirodnim deoksiribonukleinskim kiselinama (DNK).
"2'-O-metoksietil" (takođe 2'-MOE i 2'-OCH2CH2-OCH3i MOE i 2'-O-metoksietilriboza) označava O-metoksi-etil modifikaciju 2' položaja furanoznog prstena. 2'-O-metoksietilriboza modifikovani šećer je modifikovani šećer.
"2'-O-metoksietilriboza modifikovani nukleozid" (takođe 2'-MOE nukleozid) označava nukleozid koji sadrži 2'-MOE modifikovanu šećernu grupu.
"2'-supstituisani nukleozid" označava nukleozid koji sadrži supstituent na 2'-položaju furanoznog prstena osim H ili OH. U određenim slučajevima, 2' supstituisani nukleozidi obuhvataju nukleozide sa bicikličnim šećernim modifikacijama.
"5-metilcitozin" označava citozin modifikovan sa metil grupom vezanom za 5 položaj. 5-metilcitozin je modifikovana nukleobaza.
[0022] "Oko" označava unutar ±10% vrednosti. Na primer, ako je navedeno, "jedinjenja su postigla najmanje oko 50% inhibicije SOD-1", time je implicirano da su nivoi SOD-1 inhibirani unutar opsega od 45% i 55%. "Primenjen istovremeno" označava ko-primenu dva farmaceutska sredstva na bilo koji način u kojoj su farmakološki efekti oba istovremeno manifestovana u pacijentu. Istovremena primena ne zahteva da se oba farmaceutska sredstva primene u jednoj farmaceutskoj kompoziciji, u istom obliku doze, ili istim putem primene. Efekti oba farmaceutska sredstva ne moraju da se manifestuju sami po sebi istovremeno. Samo je potrebno da se efekti preklapaju tokom određenog vremenskog perioda i ne moraju da budu istovremeni.
[0023] "Primena" označava obezbeđivanje farmaceutskog sredstva životinji i obuhvata, ali bez ograničenja primenu od strane medicinskog radnika i auto-primenu.
[0024] "Ublažavanje" označava smanjenje, usporavanje, zaustavljanje ili reverziju najmanje jednog indikatora težine stanja ili bolesti. Težina indikatora može biti određena subjektivnim ili objektivnim merama, koje su poznate stručnjaku iz date oblasti tehnike.
[0025] "Životinja" označava čoveka ili ne-humanu životinju, uključujući, ali bez ograničenja na, miševe, pacove, zečeve, pse, mačke, svinje i nehumane primate, uključujući, ali bez ograničenja na majmune i šimpanze.
[0026] "Antitelo" označava molekul okarakterisan specifičnom reakcijom sa antigenom na neki način, gde su antitelo i antigen svaki definisani u odnosu na onog drugog. Antitelo može da označava kompletan molekul antitela ili bilo koji njegov fragment ili region, kao što je težak lanac, laki lanac, Fab region i Fc region.
[0027] "Antisens aktivnost" označava svu detektabilnu ili merljivu aktivnosti koja se može pripisati hibridizaciji antisens jedinjenja za svoju ciljnu nukleinsku kiselinu. U određenim slučajevima, antisens aktivnost je smanjenje u količini ili ekspresiji ciljne nukleinske kiseline ili proteina kodiranog takvom ciljnom nukleinskom kiselinom.
[0028] "Antisens jedinjenje" označava oligomerno jedinjenje koje je sposobno da se podvrgne hibridizaciji za ciljnu nukleinsku kiselinu preko vodonične veze. Primeri antisens jedinjenja obuhvataju jednolančana i dvolančana jedinjenja, kao što su, antisens oligonukleotidi, siRNK, shRNK, ssRNK i jedinjenja na bazi zauzetosti.
[0029] "Antisens inhibicija" označava smanjenje nivoa ciljne nukleinske kiseline u prisustvu antisens jedinjenja komplementarne ciljnoj nukleinskoj kiselini u poređenju sa nivoima ciljne nukleinske kiseline ili u odsustvu antisens jedinjenja.
[0030] "Antisens mehanizmi" su svi oni mehanizmi koji uključuju hibridizaciju jedinjenja sa ciljnom nukleinskom kiselinom, pri čemu je ishod ili efekat hibridizacije ciljna razgradnja ili ciljna zauzetost sa istovremenim zaustavljanjem ćelijske mašinerije uključujući, na primer, transkripciju ili splajsing.
[0031] "Antisens oligonukleotid" označava jednolančani oligonukleotid koji ima nuklobaznu sekvencu koja dozvoljava hibridizaciju za odgovarajući segment ciljne nukleinske kiseline.
[0032] "Komplementarnost baza" označava kapacitet za precizno bazno sparivanje nukleobaza oligonukleotida sa odgovarajućim nukleobazama u ciljnoj nukleinskoj kiselini (tj., hibridizaciju) i posredovana je preko Watson-Crick, Hoogsteen ili obrnutog Hoogsteen vodoničnog vezivanja između odgovarajućih nukleobaza.
[0033] "Bicikličan šećer" označava furanozni prsten modifikovan premošćavanjem dva atoma. Bicikličan šećer je modifikovani šećer.
[0034] "Biciklična nukleinska kiselina" ili "BNK" označava nukleozid ili nukleotid gde furanozni deo nukleozida ili nukleotida obuhvata most koji povezuje dva atoma ugljenika na furanoznom prstenu, na taj način formirajući bicikličan sistem prstena.
[0035] "Struktura kape" ili "terminalna grupa kape" označava hemijske modifikacije, koje su ugrađene na bilo kom terminusu antisens jedinjenja.
[0036] "cEt" ili "ograničeni etil" ili "cEt modifikovani šećer" označava biciklični nukleozid koji ima šećernu grupu koja sadrži most koji povezuje 4'-ugljenik i 2'-ugljenik, pri čemu most ima formulu: 4'-CH(CH3)-O-2'. cEt modifikovani šećer je modifikovani šećer.
[0037] "cEt modifikovani nukleozid" označava biciklični nukleozid koji ima šećernu grupu koja sadrži most koji povezuje 4'-ugljenik i 2'-ugljenik, pri čemu most ima formulu: 4'-CH(CH3)-O-2'. cEt modifikovani šećer je modifikovani šećer.
[0038] "Hemijski poseban region" označava region antisens jedinjenja koje je na neki način hemijski različit od drugog regiona istog antisens jedinjenja. Na primer, region koji ima 2'-O-metoksietil nukleozide je hemijski različit od regiona koji ima nukleozide bez 2'-O-metoksietil modifikacija.
[0039] "Himerno antisens jedinjenje" označava antisens jedinjenje koje ima najmanje dva hemijski posebna regiona, pri čemu svaki položaj ima veći broj podjedinica.
[0040] "Ko-primena" označava primenu dva ili više farmaceutskih sredstava na individuu. Dva ili više farmaceutskih sredstava mogu biti u jednoj farmaceutskoj kompoziciji ili mogu biti u posebnim farmaceutskim kompozicijama. Svako od dva ili više farmaceutskih sredstava mogu biti primenjivani preko istog ili različitih puteva primene. Ko-oprimena obuhvata paralelnu ili sekvencijalnu primenu.
[0041] "Komplementarnost" označava kapacitet za sparivanje između nukleobaza prve nukleinske kiseline i druge nukleinske kiseline.
[0042] "Sadrže," "sadrži," i "koji sadrži" razumeće se da impliciraju uključenje navedenog koraka ili elementa ili grupe koraka ili elemenata, ali ne isključenje bilo kog drugog koraka ili elementa ili grupe koraka ili elemenata.
[0043] "Uzastopne nukleobaze" označavaju nukleobaze koje su susedne. "Dizajniranje" ili "dizajniran za" označava postupak dizajniranja oligomernog jedinjenja koje se specifično hibridizuje sa izabranim molekulom nukleinske kiseline.
[0044] "Razblaživač" označava sastojak u kompoziciji kome nedostaje farmakološka aktivnost, ali je farmaceutski neophodan ili poželjan. Na primer, u lekovima koji su injektirani, razblaživač može biti tečnost, npr. fiziološki rastvor.
[0045] "Doza" označava naznačenu količinu farmaceutskog sredstva obezbeđenu u jednoj primeni ili u naznačenom vremenskom periodu. U određenim slučajevima, doza se može primenjivati u jednoj, dve ili više bolusa, tableta ili injekcija. Na primer, u određenim slučajevima gde je poželjna potkožna primena, željena doza zahteva zapreminu koja se ne smešta lako u jednu injekciju, prema tome, sve ili više injekcija se mogu koristiti za postizanje željene doze. U određenim slučajevima, farmakološko sredstvo je primenjivano infuzijom kontinuirano tokom produženog vremenskog perioda. Doze mogu biti navedene kao količina farmaceutskog sredstva na čas, dan, nedelju ili mesec.
[0046] "Efikasna količina" u kontekstu modulacije aktivnosti ili lečenja ili prevencije stanja označava primenu te količine farmaceutskog sredstva na subjekta kod koga postoji potreba za takvom modulacijom, lečenjem ili profilaksom, u jednoj dozi ili kao deo serije, koja je efikasna za modulaciju tog efekta, ili za lečenje ili profilaksu ili poboljšanje tog stanja. Efikasna količina može da varira među individuama u zavisnosti od zdravstvenog i fizičkog stanja individue koja se leči, taksonomske grupe individua koje se leče, formulacije kompozicije, procene medicinskog stanja individue i drugih relevantnih faktora.
[0047] "Efikasnost" označava sposobnost za proizvodnju željenog efekta.
[0048] "Ekspresija" obuhvata sve funkcije pomoću kojih se informacija koja je genski kodirana prevodi u strukture koje su prisutne i koje operišu u ćeliji. Takve strukture obuhvataju, ali bez ograničenja na proizvode transkripcije i transplantacije.
[0049] "Potpuno komplementarno" ili "100% komplementarno" označava da svaka nukleobaza prve nukleinske kiseline ima komplementarnu nukleobazu u drugoj nukleinskoj kiselini. U određenim slučajevima, prva nukleinska kiselina je antisens jedinjenje i ciljna nukleinska kiselina je druga nukleinska kiselina.
[0050] "Gapmer" označava himerno antisens jedinjenje u kome je unutrašnji region koji ima više nukleozida koji podržavaju cepanje RNazom H, pozicioniran između spoljašnjih regiona koji imaju jedan ili više nukleozida, pri čemu su nukleozidi koji sadrže unutrašnji region hemijski različiti od jednog ili više nukleozida koji sadrže spoljašnje regione. Unutrašnji region može biti označen kao "gap (praznina)" i spoljašnji regioni mogu biti označeni kao "krila."
[0051] "Suženo prazninom" označava himerno antisens jedinjenje koje ima segment praznine od 9 ili manje kontinuiranih 2'-deoksiribonukleozida pozicioniran između i neposredno pored 5' i 3' krilnih segmenata koji imaju od 1 do 6 nukleozida.
[0052] "Prošireno prazninom" označava himerno antisens jedinjenje koje ima segment praznine od 12 ili više kontinuiranih 2'-deoksiribonukleozida pozicioniran između i neposredno pored 5' i 3' krilnih segmenata koji imaju od 1 do 6 nukleozida.
[0053] "Hibridizacija" označava spajanje komplementarnih molekula nukleinske kiseline. U određenim slučajevima, komplementarni molekuli nukleinske kiseline obuhvataju, ali bez ograničenja na, antisens jedinjenje i ciljnu nukleinsku kiselinu. U određenim slučajevima, komplementarni molekuli nukleinske kiseline obuhvataju, ali bez ograničenja na, oligonukleotid i ciljno mesto nukleinske kiseline.
[0054] "Identifikacija životinje koja ima bolest povezanu sa SOD-1" označava identifikaciju životinje kojoj je postavljena dijagnoza bolesti povezane sa SOD-1 ili koja ima predispoziciju za razvoj bolesti povezane sa SOD-1. Individue sa predispozicijom za razvoj bolesti povezane sa SOD-1 obuhvataju one koje imaju jedan ili više faktora rizika za razvoj bolesti povezane sa SOD-1, uključujući, starost, ličnu ili porodičnu istoriju ili genetičku predispoziciju za jednu ili više bolesti povezanih sa SOD-1. Takva identifikacija se može postići pomoću bilo kog postupka uključujući procenu medicinske istorije individue i standardne kliničke testove ili procene, kao što je genetičko testiranje.
1
[0055] "Neposredno pored" označava da tu nema elemenata između elemanata koji su neposredno jedan pored drugog.
[0056] "Individua" označava čoveka ili nehumanu životinju izabranu za lečenje ili terapiju.
[0057] "Inhibicija SOD-1" označava smanjenje nivoa ili ekspresije iRNK SOD-1 i/ili proteina. U određenim slučajevima, iRNK SOD-1 i/ili nivoi proteina su inhibirani u prisustvu antisens jedinjenja koje ciljno deluje na SOD-1, uključujući modifikovani oligonukleotid koji ciljno deluje na SOD-1, u poređenju sa ekspresijom iRNK SOD-1 i/ili nivoima proteina u odsustvu SOD-1 antisens jedinjenja, kao što je modifikovani oligonukleotid.
[0058] "Inhibicija ekspresije ili aktivnosti" označava smanjenje ili blokadu ekspresije ili aktivnosti i ne ukazuje neophodno na ukupnu eliminaciju ekspresije ili aktivnosti.
[0059] "Internukleozidna veza" označava hemijsku vezu između nukleozida. "Vezani nukleozidi" označavaju susedne nukleozide vezane zajedno internukleozidnom vezom.
[0060] "Nepoklapanje" ili "nekomplementarna nukleobaza" označava slučaj kada nukleobaza prve nukleinske kiseline nije sposobna da se spari sa odgovarajućom nukleobazom druge ili ciljne nukleinske kiseline.
[0061] "Mešani osnovni lanac" označava obrazac internukleozidnih veza uključujući najmanje dve različite internukleozidne veze. Na primer, oligonukleotid sa mešanim osnovnim lancem može da obuhvata najmanje jednu fosfodiestarsku vezu i najmanje jednu fosforotioatnu vezu.
[0062] "Modifikovana internukleozidna veza" označava supstituciju ili bilo koju promenu od prirodne internukleozidne veze (tj., fosfodiestarsku internukleozidnu vezu).
[0063] "Modifikovana nukleobaza" označava bilo koju nukleobazu osim adenina, citozina, guanina, timidina ili uracila. "Nemodifikovana nukleobaza" označava purinske baze adenin (A) i guanin (G), i pirimidinske baze timin (T), citozin (C) i uracil (U).
[0064] "Modifikovani nukleozid" označava nukleozid koji ima, nezavisno, modifikovanu šećernu grupu i/ili modifikovanu nukleobazu.
[0065] "Modifikovani nukleotid" označava nukleotid koji ima, nezavisno, modifikovanu šećernu grupu, modifikovanu internukleozidnu vezu i/ili modifikovanu nukleobazu.
[0066] "Modifikovani oligonukleotid" označava oligonukleotid koji sadrži najmanje jednu modifikovanu internukleozidnu vezu, modifikovani šećer i/ili modifikovanu nukleobazu.
[0067] "Modifikovani šećer" označava supstituciju i/ili svaku promenu od prirodne šećerne grupe.
[0068] "Monomer" označava jednu jedinicu oligomera. Monomeri obuhvataju, ali bez ograničenja na, nukleozide i nukleotide, bilo prirodne ili modifikovane.
[0069] "Motiv" označava obrazac nemodifikovanih i modifikovanih nukleozida u antisens jedinjenju.
[0070] "Prirodna šećerna grupa" označava šećernu grupu koja se nalazi u DNK (2'-H) ili RNK (2'-OH).
[0071] "Prirodna internukleozidna veza" označava 3' do 5' fosfodieatarsku vezu.
[0072] "Nekomplementarna nukleobaza" označava par nukleobaza koje međusobno ne formiraju vodonične veze ili na drugi način podržavaju hibridizaciju.
[0073] "Nukleinska kiselina" označava molekule sastavljene od monomernih nukleotida. Nukleinska kiselina obuhvata, ali bez ograničenja na, ribonukleinske kiseline (RNK), deoksiribonukleinske kiseline (DNK), jednolančane nukleinske kiseline, dvolančane nukleinske kiseline, male interferirajuće ribonukleinske kiseline (siRNK) i mikroRNK (miRNK).
[0074] "Nukleobaza" označava heterocikličnu grupu sposobnu za sparivanje sa bazom druge nukleinske kiseline.
[0075] "Komplementarnost nukleobaze" označava nukleobazu koja je sposobna za bazno sparivanje sa drugom nukleobazom. Na primer, u DNK, adenin (A) je komplementaran timinu (T). Na primer, u RNK, adenin (A) je komplementaran uracilu (U). U određenim slučajevima, komplementarna nukleobaza označava nukleobazu antisens jedinjenja koja je sposobna za bazno sparivanje sa nukleobazom svoje ciljne nukleinske kiseline. Na primer, ako je nukleobaza na određenom položaju antisens jedinjenja sposobna za vodonično vezivanje sa nukleobazom na određenom položaju ciljne nukleinske kiseline, tada se položaj vodonične veze između oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline smatra komplementarnim na tom nukleobaznom paru.
[0076] "Nukleobazna sekvenca" označava redosled kontinuiranih nukleobaza nezavisan od bilo kog šećera, veze i/ili nukleobazne modifikacije.
[0077] "Nukleozid" označava nukleobazu vezanu za šećer.
[0078] "Nukleozidni mimetik" obuhvata one strukture korišćene za zamenu šećera ili šećera i baze, a ne neophodno vezu na jednom ili više položaja oligomernog jedinjenja kao što su na primer nukleozidni mimetici koji imaju morfolino, cikloheksenil, cikloheksil, tetrahidropiranil, biciklo ili triciklo šećerne mimetike, npr., ne-furanozne šećerne jedinice. Nukleotidni mimetik obuhvata one strukture korišćene za zamenu nukleozida i veze na jednom ili više položaja oligomernog jedinjenja kao što su na primer peptidne nukleinske kiseline ili morfolino (morfolino vezani preko -N(H)-C(=O)-O- ili druge ne-fosfodiestarske veze). Šečerni surogat se preklapa sa neznatno širim terminom nukleozidni mimetik, ali je nameravano da označava samo zamenu šećerne jedinice (furanozni pristen). Tetrahidropiranil prstenovi obezbeđeni ovde su ilustrativni za primer šećernog surogata u kome je furanozna šećerna grupa zamenjena tetrahidropiranil sistemom prstena. "Mimetik" označava grupe koje su supstituisane za šećer, nukleobazu i/ili internukleozidnu vezu. Generalno, mimetik je korišćen umesto šećera ili kombinacije šećera-internukleozidne veze i nukleobaza je održavana za hibridizaciju za izabrano ciljno mesto.
[0079] "Nukleotid" označava nukleozid koji ima fosfatnu grupu kovalentno vezanu za šećerni deo nukleozida.
1
[0080] "Efekat van cilja" označava neželjeni ili štetan biološki efekat povezan sa modulacijom RNK ili proteinskom ekspresijom gena osim nameravane ciljne nukleinske kiseline.
[0081] "Oligomerno jedinjenje" ili "oligomer" označava polimer vezanih monomernih podjedinica koji je sposoban za hibridizaciju za najmanje jedan region molekula nukleinske kiseline.
[0082] "Oligonukleotid" označava polimer vezanih nukleozida od kojih svaki može biti modifikovan ili nemodifikovan, međusobno nezavisno.
[0083] "Parenteralna primena" označava primenu preko injekcije (npr., bolus injekcije) ili infuzije. Parenteralna primena obuhvata subkutanu primenu, intravensku primenu, intramuskularnu primenu, intraarterijsku primenu, intraperitonealnu primenu, ili intrakranijalnu primenu, npr., intratekalnu ili intracerebroventrikularnu primenu.
[0084] "Peptid" označava molekul formiran vezivanjem najmanje dve aminokiseline amidnim vezama. Bez ograničenja, kao što je ovde korišćen, peptid označava polipeptide i proteine.
[0085] "Farmaceutsko sredstvo" označava supstancu koja obezbeđuje terapeutsku korist kada se primeni na individuu. Na primer, u određenim slučajevima, modifikovani oligonukleotid usmeren ka SOD-1 je farmaceutsko sredstvo.
[0086] "Farmaceutska kompozicija" označava smešu supstanci pogodnu za primenu na subjekta. Na primer, farmaceutska kompozicija može da sadrži modifikovani oligonukleotid i sterilni vodeni rastvor.
[0087] "Farmaceutski prihvatljiv derivat" obuhvata farmaceutski prihvatljive soli, konjugate, prolekove ili izomere jedinjenja koja su ovde opisana.
[0088] "Farmaceutski prihvatljive soli" označavaju fiziološki i farmaceutski prihvatljive soli antisens jedinjenja, tj., soli koje zadržavaju željenu biološku aktivnost ishodnog oligonukleotida i ne pružaju neželjene toksikološke efekte.
[0089] "Fosforotioatna veza" označava vezu između nukleozida gde je fosfodiestarska veza modifikovana zamenom jednog od nepremošćujućih atoma kiseonika atomom sumpora. Fosforotioatna veza je modifikovana internukleozidna veza.
[0090] "Deo" označava definisani broj uzastopnih (tj., vezanih) nukleobaza nukleinske kiseline. U određenim slučajevima, deo je definisani broj uzastopnih nukleobaza ciljne nukleinske kiseline. U određenom slučaju, deo je definisani broj uzastopnih nukleobaza antisens jedinjenja.
[0091] "Sprečiti" ili "prevencija" označava odlaganje ili zadržavanje početka ili razvoja bolesti, poremećaja ili stanja tokom vremenskog perioda od više minuta do više dana, nedelja do meseci, li neograničeno.
[0092] "Prolek" označava terapeutsko sredstvo koje je pripremljeno u neaktivnom obliku koji je preveden u aktivni oblik (tj., lek) unutar tela ili njegovih ćelija preko aktivnosti endogenih enzima ili drugih hemikalija i/ili uslova.
[0093] "Profilaktički efikasna količina" označava količinu farmaceutskog sredstva koja obezbeđuje profilaktičku ili preventivnu korist životinji.
[0094] "Region" je definisan kao deo ciljne nukleinske kiseline koja ima najmanje jednu strukturu, funkciju ili karakteristiku koja se može identifikovati.
[0095] "Ribonukleotid" označava nukleotid koji ima hidroksi na 2' položaju šećernog dela nukleotida. Ribonukleotidi mogu biti modifikovani sa bilo kojim od različitih supstituenata.
[0096] "Soli" označavaju fiziološki i farmaceutski prihvatljive soli antisens jedinjenja, tj., soli koje zadržavaju željenu biološku aktivnost ishodnog oligonukleotida i ne pružaju neželjene toksikološke efekte.
[0097] "Segmenti" su definisani kao manji ili pod-delovi regiona unutar ciljne nukleinske kiseline.
[0098] "Skraćene" ili "odsečene" verzije oligonukleotida SOD-1ght ovde imaju jedan, dva ili više deletiranih nukleozida.
1
[0099] "Sporedni efekti" označavaju fiziološke odgovore koji se mogu pripisati lečenju osim željenih efekata. U određenim slučajevima, sporedni efekti obuhvataju, bez ograničenja, reakcije na mestu injekcije, test abnormalnosti funkcije jetre, abnormalnosti bubrežne funkcije, toksičnost za jetru, toksičnost za bubrege, abnormalnosti centralnog nervnog sistema i miopatije.
[0100] "Jednolančani oligonukleotid" označava oligonukleotid koji nije hibridizovan za komplementaran lanac.
[0101] "Mesta," kao što su ovde korišćena, su definisana kao jedinstveni položaju nukleobaza unutar ciljne nukleinske kiseline. "Sporo napredovanje" označava smanjenje u razvoju bolesti.
[0102] "SOD-1" označava sisarski gen za superoksid dismutazu 1, rastvorljivi (SOD-1), uključujući humani gen za superoksid dismutazu 1, rastvorljivi (SOD-1).
[0103] "Bolest povezana sa SOD-1" označava svaku bolest povezanu sa bilo kojom nukleinskom kiselinom za SOD-1 ili njenim ekspresionim proizvodom. Takve bolesti mogu da obuhvataju neurodegenerativnu bolest. Takve neurodegenerativne bolesti mogu da obuhvataju amiotrofnu lateralnu sklerozu (ALS).
[0104] "iRNK SOD-1" označava svaki proizvod ekspresije informacione RNK, DNK sekvence koja kodira SOD-1.
[0105] "Nukleinska kiselina SOD-1" označava svaku nukleinsku kiselinu koja kodira SOD-1. Na primer, u određenim slučajevima, nukleinska kiselina SOD-1 obuhvata DNK sekvencu koja kodira SOD-1, RNK sekvencu transkribovanu iz DNK koja kodira SOD-1 (uključujući genomsku DNK koja sadrži introne i egzone) i iRNK sekvencu koja kodira SOD-1. "iRNK SOD-1" označava iRNK koja kodira SOD-1 protein.
[0106] "SOD-1 protein" označava polipeptidni proizvod ekspresije nukleinske kiseline SOD-1.
[0107] "Specifično hibridizujući" označava antisens jedinjenje koje ima dovoljan stepen komplementarnosti između oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline za indukciju željenog
1
efekta, uz ispoljavanje minimalnih efekata ili nikakvih efekata na ne-ciljne nukleinske kiseline pod uslovima u kojima je željeno specifično vezivanje, tj., pod fiziološkim uslovima u slučaju in vivo analiza i terapeutskih tretmana.
[0108] "Stringentni uslovi hibridizacije" ili "stringenti uslovi" označavaju uslove pod kojima će oligomerno jedinjenje da se hibridizuje za njegovu ciljnu sekvencu, ali za minimaln broj drugih sekvenci.
[0109] "Subjekat" označava čoveka ili nehumanu životinju izabranu za lečenje ili terapiju.
[0110] "Šećerni hemijski motiv" označava obrazac šećernih modifikacija uključujući najmanje dve različite šećerne modifikacije. Na primer, oligonukleotid sa mešanim osnovnim lancem može da obuhvata najmanje jedan 2'-O-metoksietil modifikovani nukleozid i/ili jedan nukleozid sa modifikovanim cEt i/ili jedan 2'-deoksinukleozid.
[0111] "Ciljni/ciljno mesto" označava protein, čija modulacija je željena.
[0112] "Ciljni gen" označava gen koji kodira ciljno mesto.
[0113] "Ciljno delovanje/usmeravanje" ili "na koji se ciljno deluje/usmeren" označava postupak dizajniranja ili selekcije antisens jedinjenja koje će specifično da se hibridizuje za ciljnu nukleinsku kiselinu i indukuje željeni efekat.
[0114] "Ciljna nukleinska kiselina," "ciljna RNK," i "ciljni RNK transkript" i "ciljna nukleinska kiselina" svi označavaju nukleinsku kiselinu koja je sposobna da na nju ciljno deluju antisens jedinjenja.
[0115] "Ciljni region" označava deo ciljne nukleinske kiseline na koji ciljno deluju jedan ili više antisens jedinjenja.
[0116] "Ciljni segment" označava sekvencu nukleotida ciljne nukleinske kiseline na koju ciljno deluje antisens jedinjenje. "5' ciljno mesto" označava 5'-krajnji nukleotid ciljnog segmenta. "3' ciljno mesto" označava 3'-krajnji nukleotid ciljnog segmenta.
1
[0117] "Terapeutski efikasna količina" označava količinu farmaceutskog sredstva koja obezbeđuje terapeutsku korist individui.
[0118] "Lečiti" ili "lečenje" ili "tretman" označava primenu kompozicije za postizanje promene ili poboljšanja bolesti ili stanja.
[0119] "Nemodifikovane nukleobaze" označavaju purinske baze adenin (A) i guanin (G), i pirimidinske baze timin (T), citozin (C) i uracil (U).
[0120] "Nemodifikovani nukleotid" označava nukleotid sastavljen od prirodnih nukleobaza, šećernih grupa i internukleozidnih veza. U određenim slučajevima, nemodifikovani nukleotid je RNK nukleotid (tj. β-D-ribonukleozidi) ili DNK nukleotid (tj. β-D-deoksiribonukleozid).
[0121] "Krilni segment" označava više nukleozida modifikovanih tako da pruže oligonukleotidu osobine kao što su pojačana inhibitorna aktivnost, povećani afinitet vezivanja za ciljnu nukleinsku kiselinu ili rezistencija na razgradnju pomoću in vivo nukleaza.
Određeni slučajevi
[0122] Određeni slučajevi ovde su postupci, jedinjenja i kompozicije za inhibiciju iRNK SOD-1 i ekspresije proteina. Određeni slučajevi ovde su postupci, jedinjenja i kompozicije za smanjenje nivoaiRNK SOD-1 i proteina.
[0123] Određeni slučajevi su antisens jedinjenja koja ciljno deluju na nukleinsku kiselinu SOD-1. U određenim slučajevima, nukleinska kiselina SOD-1 je sekvenca navedena u GENBANK pristupni br. NM_000454.4 (obuhvaćena ovde kao SEQ ID NO: 1), GENBANK Pristupni br. NT_011512.10 skraćena od nukleotida 18693000 do 18704000 (obuhvaćena ovde kao SEQ ID NO: 2) i komplement GENBANK Pristupni br. NW_001114168.1 skraćena od nukleotida 2258000 do 2271000 (obuhvaćena ovde kao SEQ ID NO: 3).
[0124] Određeni slučajevi su postupci za lečenje, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja i stanja povezanih sa SOD-1 kod individue kod koje postoji potreba za tim. Takođe su razmatrani postupci za pripremu leka za lečenje, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja povezanog sa SOD-1. Bolesti, poremećaji i stanja povezani sa SOD-1
1
obuhvataju neurodegenerativne bolesti. U određenim slučajevima, bolesti povezane sa SOD-1 obuhvataju amiotrofnu lateralnu sklerozu (ALS).
[0125] Primer slučaja je jedinjenje koje se sastoji od modifikovanog oligonukleotida prema sledećoj formuli:
[0126] Primer slučaja je prema tome jedinjenje koje se sastoji od modifikovanog oligonukleotida prema sledećoj formuli: mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te; u kojoj,
A = adenin,
mC = 5-metilcitozin,
G = guanin,
T = timin,
e = 2'-O-metoksietilriboza modifikovani šećer,
d = 2'-deoksiriboza šećer,
s = fosforotioatna internukleozidna veza i
o = fosfodiestarska internukleozidna veza.
1
[0127] Sledeći ilustrativni slučaj je kompozicija koja sadrži jedinjenje ili njegovu so i najmanje jedan od farmaceutski prihvatljivog nosača ili razblaživača. Sledeći ilustrativni slučaj je upotreba jedinjenja ili kompozicije za proizvodnju leka za lečenje neurodegenerativne bolesti. Ilustrativan slučaj je prema tome upotreba jedinjenja ili kompozicije za proizvodnju leka za lečenje ALS.
Antisens jedinjenja
[0128] Oligomerna jedinjenja obuhvataju, ali bez ograničenja na, oligonukleotide, oligonukleozide, oligonukleotidne analoge, oligonukleotidne mimetike, antisens jedinjenja, antisens oligonukleotide, modifikovane oligonukleotide i siRNK. Oligomerno jedinjenje može biti "antisens" za ciljnu nukleinsku kiselinu, što znači da je sposobno da se podvrgne hibridizaciji za ciljnu nukleinsku kiselinu preko vodonične veze.
[0129] U određenim slučajevima, antisens jedinjenje ima nukleobaznu sekvencu koja, kada jenapisana u 5' prema 3' smeru, sadrži reverzni komplement ciljnog segmenta ciljne nukleinske kiseline na koju ciljno deluje. U određenim takvim slučajevima, oligonukleotid ima nukleobaznu sekvencu koja, kada je napisana u 5' prema 3' smeru, sadrži reverzni komplement ciljnog segmenta ciljne nukleinske kiseline na koju ciljno deluje.
[0130] U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na nukleinsku kiselinu SOD-1 je dužine 12 do 30 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 12 do 25 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na nukleinsku kiselinu SOD-1 je dužine 12 do 22 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 14 do 20 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 15 do 25 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 18 do 22 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 19 do 21 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje je dužine 8 do 80, 12 do 50, 13 do 30, 13 do 50, 14 do 30, 14 do 50, 15 do 30, 15 do 50, 16 do 30, 16 do 50, 17 do 30, 17 do 50, 18 do 30, 18 do 50, 19 do 30, 19 do 50 ili 20 do 30 vezanih podjedinica.
[0131] U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 12 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je
2
dužine 13 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 14 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 15 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 16 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 17 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 18 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 19 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 20 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 21 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 22 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 23 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 24 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 25 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 26 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 27 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 28 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 29 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 je dužine 30 podjedinica. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje koje ciljno deluje na nukleinsku kiselinu SOD-1 je dužine 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ili 80 vezanih podjedinica, ili u opsegu definisanom sa bilo koje dve od gore navedenih vrednosti. U određenim slučajevima antisens jedinjenje je modifikovani oligonukleotid i vezane podjedinice su nukleozidi.
[0132] U određenim slučajevima, oligonukleotidi koji ciljno deluju na nukleinsku kiselinu SOD-1 mogu biti skraćeni ili isečeni. Na primer, jedna podjedinica može biti deletirana sa 5' kraja (5' skraćenje), ili alternativno sa 3' kraja (3' skraćenje). Skraćeno ili isečeno antisens jedinjenje koje ciljno deluje na nukelinsku kiselinu SOD-1 može imati dve podjedinice deletirane sa 5' kraja, ili alternativno može imati dve podjedinice deletirane sa 3' kraja, antisens jedinjenja. Alternativno, deletirani nukleozidi mogu biti dispergovani u antisens jedinjenju, na primer, u antisens jedinjenju koje ima jedan nukleozid deletiran sa 5' kraja i jedan nukleozid deletiran sa 3' kraja.
[0133] Kada je jedna dodatna podjedinica prisutna u produženom antisens jedinjenju, dodatna podjedinica može biti locirana na 5' ili 3' kraju antisens jedinjenja. Kada su pristne dve ili više dodatnih podjedinica, dodate podjedinice mogu biti međusobno susedne, na primer, u antisens jedinjenju koje ima dve podjedinice dodate na 5' kraj (5' adicija), ili alternativno na 3' kraj (3' adicija), antisens jedinjenja. Alternativno, dodate podjedinice mogu biti dispergovane u antisens jedinjenju, na primer, u antisens jedinjenju koje ima podjedinicu dodatu na 5' kraj i jednu podjedinicu dodatu na 3' kraj.
[0134] Moguće je povećati ili smanjiti dužinu antisens jedinjenja, kao što je modifikovani oligonukleotid i/ili uneti nepoklapajuće baze bez eliminacije aktivnosti. Na primer, u Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), serija oligonukleotida dužine 13-25 nukleobaza je testirana za njiovu sposobnost za indukciju cepanja ciljne RNK u modelu injekcije oocite. Oligonukleotidi dužine 25 nukleobaza sa 8 ili 11 nepoklapajućih baza blizu krajeva oligonukleotida bili su sposobni da usmere specifično cepanje ciljne iRNK, iako u manjem stepenu od oligonukleotida koji nisu sadržali nepoklapanja. Slično, ciljno specifično cepanje je postignuto upotrebom oligonukleotida od 13 nukleobaza, uključujući one sa 1 ili 3 nepoklapanja.
[0135] Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001) su pokazali sposobnost oligonukleotida koji ima 100% komplementarnost sa iRNK bcl-2 i koji ima 3 nepoklapanja sa iRNK bcl-xL da smanje ekspresiju oba bcl-2 i bcl-xL in vitro i in vivo. Pored toga, ovaj oligonukleotid je pokazao snažnu anti-tumorsku aktivnost in vivo.
[0136] Maher i Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) testirali su seriju tandem oligonukleotida od 14 nukleobaza i oligonukleotida od 28 i 42 nukleobaza koji se sastoje od sekvence od dva ili tri tandem oligonukleotida, respektivno, za njihovu sposobnost da zaustave translaciju humanog DHFR u analizi zečjih retikulocita. Svaki od tri oligonukelotida od 14 nukleobaza pojedinačno bio je sposoban da inhibira translaciju, iako na skromnijem nivou od oligonukleotida od 28 ili 42 nukleobaza.
Motivi antisens jedinjenja
[0137] U određenim slučajevima, antisens jedinjenja koja ciljno deluju na nukleinsku kiselinu SOD-1 imaju hemijski modifikovane podjedinice raspoređene u obrascima, ili motivima, za pružanje antisens jedinjenjima osobina kao što su pojačana inhibitorna aktivnost, povećani afinitet vezivanja za ciljnu nukleinsku kiselinu ili rezistencija na razlaganje in vivo nukleazama.
[0138] Himerna antisens jedinjenja sadrže najmanje jedan region modifikovan tako da pruži povećanu rezistenciju na razlaganje nukleazom, povećani ćelijski unos, povećani afinitet vezivanja za ciljnu nukleinsku kiselinu i/ili povećanu inhibitornu aktivnost. Drugi region himernog antisens jedinjenja može izborno da služi kao supstrat za ćelijsku endonukleazu RNazu H, koja cepa RNK lanac RNK:DNK dupleksa.
[0139] Antisens jedinjenja koja imaju gapmer motiv smatraju se himernim antisens jedinjenjima. U gapmeru unutrašnji region koji ima množinu nukleozida koji podržavaju cepanje RNazom H postavljen je između spoljašnjih regiona koji imaju množinu nukleotida koji su hemijski različiti od nukleozida unutrašnjeg regiona. U slučaju oligonukleotida koji ima gapmer motiv, segment praznine generalno služi kao supstrat za cepanje endonukleazom, dok krilni segmenti sadrže modifikovane nukleozide. U određenim slučajevima, regioni gapmera su diferencirani preko tipova šećernih grupa koje sadrže svaki poseban region. Tipovi šećernih grupa koje se koriste za diferencijaciju regiona gapmera mogu u nekim slučajevima da obuhvataju β-D-ribonukleozide, β-D-deoksiribonukleozide, 2'-modifikovane nukleozide (takvi 2'-modifikovani nukleozidi mogu da obuhvataju 2'-MOE i 2'-O-CH3, pored ostalih), i biciklične šećerne modifikovane nukleozide (takvi biciklični nukleozidi sa modifikovanim šećerom mogu da obuhvataju one koji imaju 4'-(CH2)n-O-2' most, gde je n=1 ili n=2 i 4'-CH2-O-CH2-2'). U određenim slučajevima, krila mogu da obuhvataju nekoliko modifikovanih šećernih grupa, uključujući, na primer 2'-MOE. U određenim slučajevima, krila mogu da obuhvataju nekoliko modifikovanih i nemodifikovanih šećernih grupa. U određenim slučajevima, krila mogu da obuhvataju različite kombinacije 2'-MOE nukleozida i 2'-deoksinukleozida.
[0140] Svaki poseban region može da sadrži ujednačene šećerne grupe, varijante ili naizmenične šećerne grupe. Motiv krilo-praznina-krilo je često opisan kao "X-Y-Z", gde "X" predstavlja dužinu 5' krila, "Y" predstavlja dužinu praznine i "Z" predstavlja dužinu 3' krila. "X" i "Z" mogu da sadrže ujednačene, varijante ili naizmenične šećerne grupe. U određenim slučajevima, "X" i "Y" mogu da obuhvataju jedan ili više 2'-deoksinukleozida. "Y" može da sadrži 2'-deoksinukleozide. Kao što je ovde opisan, gapmer opisan kao "X-Y-Z" ima konfiguraciju tako da je praznina postavljena neposredno pored svakog od 5' krila i 3' krila. Na taj način, ne postoje nukleotidi između 5' krila i praznine ili praznine i 3' krila. Bilo koje
2
od antisens jedinjenja opisanih ovde može imati gapmer motiv. U određenim slučajevima, "X" i "Z" su isti; u drugim slučajevima oni su različiti.
[0141] U određenim slučajevima, gapmeri opisani ovde obuhvataju, na primer 20-mere koji imaju motiv od 5-10-5.
[0142] U određenim slučajevima, gapmeri opisani ovde obuhvataju, na primer 19-mere koji imaju motiv 5-9-5.
[0143] U određenim slučajevima, gapmeri opisani ovde obuhvataju, na primer 18-mere koji imaju motiv od 5-8-5.
[0144] U određenim slučajevima, gapmeri opisani ovde obuhvataju, na primer 18-mere koji imaju motiv od 4-8-5.
[0145] U određenim slučajevima, gapmeri opisani ovde obuhvataju, na primer 18-mere koji imaju motiv od 5-8-7.
[0146] U određenim slučajevima, gapmeri opisani ovde obuhvataju, na primer 18-mere koji imaju motiv od 6-8-6.
[0147] U određenim slučajevima, gapmeri opisani ovde obuhvataju, na primer 18-mere koji imaju motiv od 6-8-5.
[0148] U određenim slučajevima, modifikovani oligonukleotid sadrži najmanje jedan 2'-O-metoksietil modifikovani nukleozid, najmanje jedan nukleozid sa modifikovanim cEt i najmanje jedan 2'-deoksinukleozid. U određenim slučajevima, modifikovani oligonukleotid ima šećerni hemijski motiv bilo koji od sledećih:
ekddddddddekekee
kekeddddddddekek
eeeedddddddddkkee
eeeeddddddddekeke
eeeeddddddddkekee
eeeeddddddddkkeee
eeeeeddddddddkkee
eeeekddddddddkeee
eeeekdddddddkeeee
eeekddddddddkeeee
eeekkdddddddkkeee
eekkdddddddddkkee
eekkddddddddeeeee
eekkddddddddkkeee
ekekddddddddeeeee
ekekddddddddkekee
kekeddddddddeeeee, gde
e = 2'-O-metoksietilriboza modifikovani šećer,
k = cEt modifikovani šećer,
d = 2'-deoksiriboza šećer,
Ciljne nukleinske kiseline, ciljni regioni i nukleotidne sekvence
[0149] Nukleotidne sekvence koje kodiraju SOD-1 obuhvataju, bez ograničenja, sledeće: GENBANK Pristupni br. NM_000454.4 (obuhvaćen ovde kao SEQ ID NO: 1), GENBANK Pristupni br. NT_011512.10 skraćen od nukleotida 18693000 do 18704000 (obuhvaćen ovde kao SEQ ID NO: 2) i komplement GENBANK Pristupni br. NW_001114168.1 skraćen od nukleotida 2258000 do 2271000 (obuhvaćen ovde kao SEQ ID NO: 3).
[0150] Razume se da je sekvenca navedena u svakoj SEQ ID NO u primerima sadržanim ovde nezavisna od bilo koje modifikacije šećerne grupe, internukleozidne veze ili nukleobaze. Kao takva, antisens jedinjenja definisana sa SEQ ID NO mogu da sadrže, nezavisno, jednu ili više modifikacija šećerne grupe, internukleozidne veze ili nukleobaze. Antisens jedinjenja opisana preko Isis broja (ISIS br.) pokazuju kombinaciju sekvence nuklobaze i motiva.
[0151] U određenim slučajevima, ciljni region je strukturno definisan region ciljne nukleinske kiseline. Na primer, ciljni region može da obuhvata 3' UTR, 5' UTR, egzon, intron, egzon/intron spoj, kodirajući region, translacioni inicijacioni region, translacioni terminacioni region ili drugi definisani nukleinsko kiselinski region. Strukturno definisani regioni za SOD-1 mogu biti dobijeni preko pristupnog broja iz baze podataka sekvenci kao što je NCBI. U određenim slučajevima, ciljni region može da obuhvata sekvencu od 5' ciljnog mesta jednog
2
ciljnog segmenta unutar ciljnog regiona do 3' ciljnog mesta drugog ciljnog segmenta unutar istog ciljnog regiona.
[0152] Ciljno delovanje obuhvata određivanje najmanje jednog ciljnog segmenta sa kojim se antisens jedinjenje hibridizuje, tako da se javlja željeni efekat. U određenim slučajevima, željeni efekat je smanjenje u nivoima iRNK ciljne nukleinske kiseline. U određenim slučajevima, željeni efekat je smanjenje nivoa proteina kodiranog ciljnom nukleinskom kiselinom ili fenotipska promena povezana sa ciljnom nukleinskom kiselinom.
[0153] Ciljni region može da sadrži jedan ili više ciljnih segmenata. Višestruki ciljni segmenti unutar ciljnog regiona mogu da se preklapaju. Alternativno, oni mogu biti nepreklapajući. U određenim slučajevima, ciljni segmenti unutar ciljnog regiona su odvojeni sa ne više od oko 300 nukleotida. U određenim slučajevima, ciljni segmenti unutar ciljnog regiona su odvojeni određenim brojem nukleotida to jest, to je oko, ne više od, ne više od oko, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ili 10 nukleotida na ciljnoj nukleinskoj kiselini ili je opseg definisan sa bilo koje dve od prethodnih vrednosti. U određenim slučajevima, ciljni segmenti unutar ciljnog regiona su odvojeni sa ne više od, ili ne više od oko, 5 nukleotida na ciljnoj nukleinskoj kiselini. U određenim slučajevima, ciljni segmenti su kontinuirani. Razmatrani su ciljni regioni definisani opsegom koji ima početnu nukleinsku kiselinu koja je bilo koja od 5' ciljnih mesta ili 3' ciljnih mesta navedenih ovde.
[0154] Pogodni ciljni segmenti se mogu naći unutar 5' UTR, kodirajućeg regiona, 3' UTR, introna, egzona ili egzon/intron spoja. Ciljni segmenti koji sadrže start kodon ili stop kodon su takođe pogodni ciljni segmenti. Pogodan ciljni segment može specifično da obuhvata određeni strukturno definisani region kao što je start kodon ili stop kodon.
[0155] Određivanje pogodnih ciljnih segmenata može da obuhvata poređenje sekvence ciljne nukleinske kiseline sa drugim sekvencama u genomu. Na primer, BLAST algoritam može biti korišćen za identifikaciju regiona sličnosti među različitim nukleinskim kiselinama. Ovo poređenje može da spreči selekciju sekvenci antisens jedinjenja koje mogu da se hibridizuju na nespecifičan način sa sekvencama osim izabrane ciljne nukleinske kiseline (tj., neciljnim ili vanciljnim sekvencama).
[0156] Može postojati varijacija u aktivnosti (npr., kao što je definisana preko procenta smanjenja nivoa ciljne nukleinske kiseline) antisens jedinjenja unutar aktivnog ciljnog
2
regiona. U određenim slučajevima, smanjenja u nivoima iRNK SOD-1 su indikativna za inhibiciju ekspresije SOD-1. Smanjenja u nivoima SOD-1 proteina su takođe indikativna za inhibiciju ekspresije ciljne iRNK. Fenotipske promene su indikativne za inhibiciju ekspresije SOD-1. Poboljšanje u neurološkoj funkciji je indikativno za inhibiciju ekspresije SOD-1. Poboljšana motorna funkcija je indikativna za inhibiciju ekspresije SOD-1.
Hibridizacija
[0157] U nekim slučajevima, hibridizacija se javlja između antisens jedinjenja otkrivenog ovde i nukleinske kiseline SOD-1. Najčešći mehanizam hibridizacije obuhvata vodoničnu vezu (npr., Watson-Crick, Hoogsteen ili reverznu Hoogsteen vodoničnu vezu) između komplementarnih nukleobaza molekula nukleinske kiseline.
[0158] Hibridizacija može da se javi pod različitim uslovima. Stringentni uslovi su zavisni od sekvence i određeni su prirodnom i sastavom molekula nukleinske kiseline koji će se hibridizovati.
[0159] Postupci za određivanje da li se sekvenca može specifično hibridizovati sa ciljnom nukleinskom kiselinom su dobro poznati u stanju tehnike. U određenim slučajevima, antisens jedinjenja opisana ovde se specifično mogu hibridizovati sa nukleinskom kiselinom SOD-1.
Komplementarnost
[0160] Antisens jedinjenje i ciljna nukleinska kiselina su međusobno komplementarni kada dovoljan broj nukleobaza antisens jedinjenja može da se veže vodoničnom vezom sa odgovarajućim nukleobazama ciljne nukleinske kiseline, tako da se javi željeni efekat (npr., antisens inhibicija ciljne nukleinske kiseline, kao što je nukleinska kiselina SOD-1).
[0161] Nekomplementarne nukleobaze između antisens jedinjenja i nukleinske kiseline SOD-1 mogu biti tolerisane uz uslov da antisens jedinjenje ostaje sposobno da se specifično hibridizuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom. Pored toga, antisens jedinjenje može da se hibridizuje preko jednog ili više segmenata nukleinske kiseline SOD-1 tako da segmenti koji su između ili segmenti koji su susedni nisu uključeni u hibridizaciono događaj (npr., strukturu petlje, nepoklapanje ili strukturu ukosnice).
2
[0162] U određenim slučajevima, antisens jedinjenja koja su ovde opisana ili njihov naznačeni deo, su, ili su najmanje, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% komplementarna sa nukleinskom kiselinom SOD-1, ciljnim regionom, ciljnim segmentom ili njihovim naznačenim delom. Procenat komplementarnosti antisens jedinjenja sa ciljnom nukleinskom kiselinom može biti određen upotrebom rutinskih postupaka.
[0163] Na primer, antisens jedinjenje u kome su 18 od 20 nukleobaza antisens jedinjenja komplementarne sa ciljnim regionom, i prema tome bi se specifično hibridizovale, predstavljalo bi 90 procenata komplementarnosti. U ovom primeru, preostale nekomplementarne nukleobaze mogu biti grupisane ili isprekidane komplementarnim nukleobazama i ne moraju biti međusobno ili sa komplementarnim bazama kontinuirane. Kao takvo, antisens jedinjenje koje je dužine 18 nuokleobaza koje ima 4 (četiri) nekomplementarne nukleobaze koje se preklapaju sa dva regiona kompletne komplementarnosti sa ciljnom nukleinskom kiselinom imalo bi 77.8% ukupne komplementarnosti sa ciljnom nukleinskom kiselinom i prema tome bi bilo unutar obima predmetnog pronalaska. Procenat komplementarnosti antisens jedinjenja sa regionom ciljne nukleinske kiseline može biti određen rutinski upotrebom BLAST programa (alati za pretraživanje osnovnog lokalnog poravnanja) i PowerBLAST programa poznatih u stanju tehnike (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Procenat homologije, identičnosti ili komplementarnosti sekvenci, može biti određen preko, na primer, Gap programa (Wisconsin Sekvenca Analysis Package, verzija 8 za Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), upotrebom zadatih podešavanja, koji koristi algoritam od Smith-a i Waterman-a (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482489).
[0164] U određenim slučajevima, antisens jedinjenja opisana ovde ili njihovi naznačeni delovi su potpuno komplementarni (tj., 100% komplementarni) sa ciljnom nukleinskom kiselinom ili njenim naznačenim delom. Na primer, antisens jedinjenje može biti potpuno komplementarno sa nukleinskom kiselinom SOD-1 ili ciljnim regionom, ili ciljnim segmentom ili njihovom ciljnom sekvencom. Kao što je ovde korišćeno, "poptuno komplementaran" označava svaku nukleobazu antisens jedinjenja koja je sposobna za precizno sparivanje baza sa odgovarajućim nukleobazama ciljne nukleinske kiseline. Na primer, antisens jedinjenje od 20 nukleobaza je potpuno komplementarno sa ciljnom sekvencom koja je dužine 400 nukleobaza, sve dok postoji odgovarajući deo od 20 nukleobaza ciljne nukleinske kiseline koji je potpuno
2
komplementaran sa antisens jedinjenjem. Potpuna komplementarnost se takođe može koristiti u vezi sa naznačenim delom prve i/ili druge nukleinske kiseline. Na primer, deo od 20 nukleobaza antisense jedinjenja od 30 nukleobaza može biti "potpuno komplementaran" sa ciljnom sekvencom koja je dužine 400 nukleobaza. Deo od 20 nukleobaza od oligonukleotida od 30 nukleobaza je potpuno komplementaran sa ciljnom sekvencom ako ciljna sekvenca ima odgovarajući deo od 20 nukleobaza gde je svaka nukleobaza komplementarna sa delom od 20 nukleobaza antisens jedinjenja. Istovremeno, celo antisens jedinjenje od 30 nukleobaza može ili ne mora biti potpuno komplementarno sa ciljnom sekvencom, u zavisnosti od toga da li su preostalih 10 nukleobaza antisens jedinjenja takođe komplementarne sa ciljnom sekvencom.
[0165] Lokacija nekomplementarne nukleobaze može biti na 5' kraju ili 3' kraju antisens jedinjenja. Alternativno, nekomplementarna nukleobaza ili nukleobaze mogu biti na unutrašnjem položaju antisens jedinjenja. Kada su prisutne dve ili više nekomplementarnih nukleobaza, one mogu biti kontinuirane (tj., vezane) ili nekontinuirane. U jednom slučaju, nekomplementarna nukleobaza se nalazi u krilnom segmentu gapmer oligonukleotida.
[0166] U određenim slučajevima, antisens jedinjenja koja su ili su do 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 nukleobaza u dužinu sadrže ne više od 4, ne više od 3, ne više od 2, ili ne više od 1 nekomplementarne nukleobaze u odnosu na ciljnu nukleinsku kiselinu, kao što je nukleinska kiselina SOD-1 ili njen naznačeni deo.
[0167] U određenim slučajevima, antisens jedinjenja koja su, ili su do 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 nukleobaza u dužinu sadrže ne više od 6, ne više od 5, ne više od 4, ne više od 3, ne više od 2, ili ne više od 1 nekomplementarnih nukleobaza u odnosu na ciljnu nukleinsku kiselinu, kao što je nukleinska kiselina SOD-1 ili njen naznačeni deo.
[0168] Antisens jedinjenja opisana ovde takođe obuhvataju ona koja su komplementarna delu ciljne nukleinske kiseline. Kao što je ovde korišćen, "deo" označava definisani broj uzastopnih (tj. vezanih) nukleobaza unutar regiona ili segmenta ciljne nukleinske kiseline. "Deo" takođe može da se odnosi na definisani broj kontinuiranih nukleobaza antisens jedinjenja. U određenim slučajevima, antisens jedinjenja su komplementarna sa delom od najmanje 8 nukleobaza ciljnog segmenta. U određenim slučajevima, antisens jedinjenja su komplementarna sa delom od najmanje 9 nukleobaza ciljnog segmenta. U određenim slučajevima, antisens jedinjenja su komplementarna sa delom od najmanje 10 nukleobaza
2
ciljnog segmenta. U određenim slučajevima, antisens jedinjenja su komplementarna sa delom od najmanje 11 nukleobaza ciljnog segmenta. U određenim slučajevima, antisens jedinjenja su komplementarna sa delom od najmanje 12 nukleobaza ciljnog segmenta. U određenim slučajevima, antisens jedinjenja su komplementarna sa delom od najmanje 13 nukleobaza ciljnog segmenta. U određenim slučajevima, antisens jedinjenja su komplementarna sa delom od najmanje 14 nukleobaza ciljnog segmenta. U određenim slučajevima, antisens jedinjenja su komplementarna sa delom od najmanje 15 nukleobaza ciljnog segmenta. Takođe su razmatrana antisens jedinjenja koja su komplementarna sa delom od najmanje 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili više nukleobaza ciljnog segmenta, ili opsegom definisanim sa bilo koje dve od ovih vrednosti.
Identičnost
[0169] Antisens jedinjenja opisana ovde takođe mogu imati definisani procenat identičnosti sa određenom nukleotidnom sekvencom, SEQ ID NO ili jedinjenjem predstavljenim specifičnim Isis brojem, ili njegovim delom. Kao što je ovde korišćeno, antisens jedinjenje je identično sa sekvencom koja je ovde otkrivena ako ima istu sposobnost sparivanja nukleobaza. Na primer, RNK koja sadrži uracil umesto timidina u otkrivenoj DNK sekvenci smatrala bi se identičnom sa DNK sekvencom s obzirom na to da se i uracil i timidin sparuju sa adeninom. Takođe su razmatrane skraćene i produžene verzije antisens jedinjenja opisanih ovde kao i jedinjenja koja imaju neidentične baze u odnosu na antisens jedinjenja opisana ovde. Neidentične baze mogu biti međusobno susedne ili dispergovane u antisens jedinjenju. Procenat identičnosti antisens jedinjenja je izračunat prema broju baza koje imaju identično sparivanja baza u odnosu na sekvencu sa kojom se poredi.
[0170] U određenim slučajevima, antisens jedinjenja ili njihovi delovi, su najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identični sa jednim ili više od antisens jedinjenja ili SEQ ID NOs, ili njihovim delom, koji su ovde otkriveni.
[0171] U određenim slučajevima, deo antisens jedinjenja je upoređivan sa delom iste dužine ciljne nukleinske kiseline. U određenim slučajevima, deo od 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 nukleobaza je upoređivan sa delom iste dužine ciljne nukleinske ksieline.
[0172] U određenim slučajevima, deo oligonukleotida je upoređivan sa delom iste dužine ciljne nukleinske kiseline. U određenim slučajevima, deo od 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 nukleobaza je upoređivan sa delom iste dužine ciljne nukleinske kiseline.
Modifikacije
[0173] Nukleozid je kombinacija baze-šećera. Nukleobazni (takođe poznat kao bazni) deo nukleozida je normalno heterociklična bazna grupa. Nukleotidi su nukleozidi koji dodatno obuhvataju fosfatnu grupu kovalentno vezanu za šećerni deo nukleozida. Za one nukleozide koji obuhvataju pentofuranozil šećer, fosfatna grupa može biti vezana za 2', 3' ili 5' hidroksi grupu šećera. Oligonukleotidi su formirani preko kovalentne međusobne veze susednih nukleozida, da bi se formirao linearni polimerni oligonukleotid. Unutar strukture oligonukleotida, fosfatne grupe su uobičajene označene tako da formiraju internukleozidne veze za oligonukleotid.
[0174] Modifikacije antisens jedinjenja obuhvataju supstitucije ili promene internukleozidnih veza, šećernih grupa ili nukleobaza. Modifikovana antisens jedinjenja su često poželjno u odnosu na nativne oblike zbog poželjnih osobina kao što su, na primer, pojačani ćelijski unos, pojačani afinitet za ciljnu nukleinsku kiselinu, povećanu stabilnost u prisustvu nukleaza ili povećanu inhibitornu aktivnost.
[0175] Hemijski modifikovani nukleozidi mogu takođe da se koriste za povećanje vezujućeg afiniteta skraćenog ili odcepljenog oligonukleotida za njegovu ciljnu nukleinsku kiselinu. Posledično, slični rezultati mogu često biti dobijeni sa kraćim antisens jedinjenjima koja imaju takve hemijski modifikovane nukleozide.
Modifikovane internukleozidne veze
[0176] Prirodna internukleozidna veza RNK i DNK je 3' do 5' fosfodiestarska veza. Antisens jedinjenja koja imaju jednu ili više modifikovanih, tj. neprirodnih, internukleozidnih veza su često izabrana u odnosu na antisens jedinjenja koja imaju prirodne internukleozidne veze zbog poželjnih osobina kao što su, na primer, pojačani ćelijski unos, pojačani afinitet za ciljne nukleinske kiseline i povećana stabilnost u prisustvu nukleaza.
1
[0177] Oligonukleotidi koji imaju modifikovane internukleozidne veze obuhvataju internukleozidne veze koje zadržavaju atom fosfora kao i internukleozidne veze koje nemaju atom fosfora. Reprezentativne internukleozidne veze koje sadrže fosfor obuhvataju, ali bez ograničenja na, fosfodiestre, fosfortriestre, metilfosfonate, fosforamidat i fosforotioate. Dobro su poznati postupci za pripremu veza koje sadrže fosfor i koje ne sadrže fosfor.
[0178] U određenim slučajevima, modifikovani oligonukleoidi koji ciljno deluju na nukleinsku kiselinu SOD-1 sadrže jednu ili više modifikovanih internukleozidnih veza. U određenim slučajevima, modifikovane internukleozidne veze su razbacane po antisens jedinjenju. U određenim slučajevima, modifikovane internukleozidne veze su fosforotioatne veze. U određenim slučajevima, svaka internukleozidna veza modifikovanog oligonukleotida je fosforotioatna internukleozidna veza.
[0179] U određenim slučajevima, modifikovani oligonukleotidi usmereni ka nukleinskoj kiselini SOD-1 sadrže jednu ili više fosfodiestarskih internukleozidnih veza. U određenim slučajevima, modifikovani oligonukleotidi usmereni ka nukleinskoj kiselini SOD-1 sadrže najmanje jednu fosforotioatnu internukleozidnu vezu i najmanje jednu fosfodiestarsku internukleozidnu vezu. U određenim slučajevima, modifikovani oligonukleotid ima mešani motiv osnovnog lanca od sledećih:
sossssssssoooss,
sooossssssssoss,
sooosssssssssoss,
soosssssssssooss,
sooossssssssooss,
sooosssssssssooss,
sooossssssssssooss,
sooosssssssssssooos,
soooossssssssssooss,
sooosssssssssssooss,
sososssssssssssosos, i
sooossssssssssoooss, gde
s = fosforotioatna internukleozidna veza i
o = fosfodiestarska internukleozidna veza.
Modifikovane šećerne grupe
2
[0180] Antisens jedinjenja reprema pronalasku mogu izborno da sadrže jedan ili više nukleozida gde je šećerna grupa modifikovana. Takvi šećerni modifikovani nukleozidi mogu da pruže pojačanu stabilnost nukleaze, povećani afinitet vezivanja ili neku drugu korisnu biološku osobinu antisens jedinjenjima. U određenim slučajevima, nukleozidi sadrže hemijski modifikovane grupe ribofuranoznog prstena. Primeri hemijski modifikovanih ribofuranoznih prstenova obuhvataju bez ograničenja, dodavanje supstituišućih grupa (uključujući 5' i 2' supstituišuće grupe, premošćujući ne-geminalne atome prstena da bi se formirale biciklične nukleinske kiseline (BNK), zamena atoma kiseonika ribozil prstena sa S, N(R) ili C(R1)(R2) (R, R1i R2su svaki nezavisno H, C1-C12alkil ili zaštitna grupa) i njihove kombinacije. Primeri hemijski modifikovanih šećera obuhvataju 2'-F-5'-metil supstituisani nukleozid (videti PCT međunarodnu prijavu WO 2008/101157 objavljenu dana 8/21/08 za druge otkrivene 5',2'-bis supstituisane nukleozide) ili zamenu atoma kiseonika u ribozil prstenu sa S sa dodatnom supstitucijom na 2'-položaju (videti objavljenu SAD patentnu prijavu US2005-0130923, objavljenu 16.6.2005.) ili alternativno 5'-supstituciju BNK (videti PCT međunarodnu prijavu WO 2007/134181 objavljenu 11/22/07 gde je LNA supstituisan sa na primer 5'-metil ili 5'-vinil grupom).
[0181] Primeri nukleozida koji imaju modifikovane šećerne grupe obuhvataju bez ograničenja nuleozide koji sadrže 5'-vinil, 5'-metil (R ili S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2'-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F i 2'-O(CH2)2OCH3supstituišuće grupe. Supstituent na 2' položaju takođe može biti izabran od alil, amino, azido, tio, O-alil, O-C1-C10alkil, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) i O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn), gde je svaki R1, Rmi Rn, nezavisno, H ili supstituisan ili nesupstituisan C1-C20alkil.
[0182] Kao što je ovde korišćeno, "biciklični nuleozidi" označavaju modifikovane nukleozide koji sadrže bicikličnu šećernu grupu. Primeri bicikličnih nukleinskih kiselina (BNK) obuhvataju bez ograničenja nukleozide koji sadrže most između 4' i 2' atoma ribozil prstena. U određenim slučajevima, antisens jedinjenja opisana ovde obuhvataju jedan ili više BNK nukleozida gde most sadrži jednu od formula: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' i 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (i njihove analoge, videti SAD patent 7,399,845, objavljen 15.7.2008.); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (i njegove analoge, videti PCT/US2008/068922 objavljen kao WO/2009/006478, objavljen 8.1.2009.); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (i njegove analoge, videti PCT/US2008/064591 objavljen kao WO/2008/150729, objavljen 11.12.2008.); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (videti objavljenu SAD patentnu prijavu US2004-0171570, objavljena 2.9.2004.); 4'-CH2-N(R)-O-2', gde je R jednako H, C1-C12alkil, ili zaštitna grupa (videti SAD patent 7,427,672, objavljen 23.9.2008.); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (videti Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); i 4'-CH2-C(=CH2)-2' (i njihove analoge, videti PCT/US2008/066154 objavljen kao WO 2008/154401, objavljen 8.12.2008.).
[0183] Dodatni biciklični nukleozidi su objavljeni u objavljenoj literaturi (videti na primer: Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; SAD patenti br.: 7,399,845; 7,053,207; 7,034,133; 6,794,499; 6,770,748; 6,670,461; 6,525,191; 6,268,490; SAD patentne objave br.: US2008-0039618; US2007-0287831; US2004-0171570; SAD patent ne prijave, serijski br.: 12/129,154; 61/099,844; 61/097,787; 61/086,231; 61/056,564; 61/026,998; 61/026,995; 60/98 9,574; međunarodne prijave WO 2007/134181; WO 2005/021570; WO 2004/106356; WO 94/14226; i PCT međunarodne prijave br.: PCT/US2008/068922; PCT/US2008/066154; i PCT/US2008/064591). Svaki od gore navedenih bicikličnih nukleozida može biti pripremljen tako da ima jednu ili više stereohemijskih šećernih konfiguracija uključujući na primer α-L-ribofuranozu i β-D-ribofuranozu (videti PCT međuarodnu prijavu PCT/DK98/00393, objavljenu 25.3.1999. kao WO 99/14226).
[0184] Kao što je ovde korišćeno, "monociklični nuleozidi" označavaju nukleozide koji sadrže modifikovane šećerne grupe koje nisu biciklične šećerne grupe. U određenim slučajevima, šećerna grupa ili analog šećerne grupe nukleozida može biti modifikovana/modifikovan ili supstituiana/supstituisan na bilo kom položaju.
[0185] Kao što je ovde korišćen, "4'-2' biciklični nukleozid" ili "4' do 2' biciklični nukleozid" označava biciklični nukleozid koji sadrži furanozni prsten koji sadrži most koji povezuje dva atoma ugljenika furanoznog prstena povezuje 2' atom ugljenika i 4' atom ugljenika šećernog prstena.
4
[0186] U određenim slučajevima, biciklične šećerne grupe BNK nukleozida obuhvataju, ali bez ograničenja na, jedinjenja koja imaju najmanje jedan most između 4' i 2' atoma ugljenika pentofuranozil šećerne grupe uključujući bez ograničenja, mostove koji sadrže 1 ili od 1 do 4 vezanih grupa nezavisno izabranih od -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x- i -N(Ra)-; gde: x je 0, 1 ili 2; n je 1, 2, 3 ili 4; svaki Rai Rbje, nezavisno, H, zaštitna grupa, hidroksil, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C5-C20aril, supstituisani C5-C20aril, heterocikličan radikal, supstituisani heterociklični radikal, heteroaril, supstituisani heteroaril, C5-C7aliciklični radikal, supstituisani C5-C7aliciklični radikal, halogen, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acil (C(=O)-H), supstituisani acil, CN, sulfonil (S(=O)2-J1) ili sulfoksil (S(=O)-J1); i
svaki J1i J2je, nezavisno, H, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C5-C20aril, supstituisani C5-C20aril, acil (C(=O)-H), supstituisani acil, heterociklični radikal, supstituisani heterociklični radikal, C1-C12aminoalkil, supstituisani C1-C12aminoalkil ili zaštitna grupa.
[0187] U određenim slučajevima, most biciklične šećerne grupe je, -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- ili -C(RaRb)-O-N(R)-. U određenim slučajevima, most je 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' i 4'-CH2-N(R)-O-2'- gde je svako R, nezavisno, H, zaštitna grupa ili C1-C12alkil.
[0188] U određenim slučajevima, biciklični nukleozidi su dalje definisani izomernom konfiguracijom. Na primer, nukleozid koji sadrži 4'-(CH2)-O-2' most, može biti u α-L konfiguraciji ili u β-D konfiguraciji. Prethodno, α-L-metilenoksi (4'-CH2-O-2') BNK su ugrađeni u antisens oligonukleotide koji su pokazali antisens aktivnost (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
[0189] U određenim slučajevima, biciklični nukleozidi obuhvataju one koji imaju 4' do 2' most gde takvi mostovi obuhvataju bez ograničenja, α-L-4'-(CH2)-O-2', β-D-4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2', 4'-CH2-N(R)-O-2', 4'-CH(CH3)-O-2', 4'-CH2-S-2', 4'-CH2-N(R)-2', 4'-CH2-CH(CH3)-2' i 4'-(CH2)3-2', gde R je H, zaštitna grupa ili C1-C12alkil.
[0190] U određenom slučaju, biciklični nukleozidi imaju formulu:
gde:
Bx je heterociklična bazna grupa;
-Qa-Qb-Qc- je -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- ili -N(Rc)-O-CH2;
Rcje C1-C12alkil ili amino zaštitna grupa; i
Tai Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksil zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforna grupa ili kovalentna veza za podržavanje medijuma.
[0191] U određenim slučajevima, biciklični nukleozidi imaju formulu:
gde:
Bx je heterociklična bazna grupa;
Tai Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksil zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforna grupa ili kovalentna veza za podržavanje medijuma;
Zaje C1-C6alkil, C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisani C1-C6alkil, supstituisani C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkinil, acil, supstituisani acil, supstituisani amid, tiol ili supstituisani tiol.
[0192] U jednom slučaju, svaka od supstituisanih grupa, je, nezavisno, mono ili poli supstituisana sa supstituišućim grupama nezavisno izabranim od halogena, okso, hidroksila, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, i NJeC(=X)NJcJd, gde je svaki Jc, Jdi Je, nezavisno, H, C1-C6alkil ili supstituisani C1-C6alkil i X je O ili NJc.
[0193] U određenim slučajevima, biciklični nukleozidi imaju formulu:
gde:
Bx je heterociklična bazna grupa;
Tai Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksil zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforna grupa ili kovalentna veza za podržavanja medijuma;
Zbje C1-C6alkil, C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisani C1-C6alkil, supstituisani C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkinil ili supstituisani acil (C(=O)-).
[0194] U određenim slučajevima, biciklični nukleozidi imaju formulu:
gde:
Bx je heterociklična bazna grupa;
Tai Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksil zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforna grupa ili kovalentna veza za podržavanje medijuma;
Rdje C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil;
svaki qa, qb, qci qdje, nezavisno, H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil, C1-C6alkoksil, supstituisani C1-C6alkoksil, acil, supstituisani acil, C1-C6aminoalkil ili supstituisani C1-C6aminoalkil;
[0195] U određenim slučajevima, biciklični nuklezoidi imaju formulu:
gde:
Bx je heterociklična bazna grupa;
Tai Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksil zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforna grupa ili kovalentna veza za podržavanje medijuma;
qa, qb, qei qfsu svaki, nezavisno, vodonik, halogen, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C1-C12alkoksi, supstituisani C1-C12alkoksi, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJkili N(H)C(=S)NJjJk;
ili qei qfzajedno su =C(qg)(qh);
qgi qhsu svaki, nezavisno, H, halogen, C1-C12alkil ili supstituisani C1-C12alkil.
[0196] Opisani su sinteza i priprema adenin, citozin, guanin, 5-metil-citozin, timin i uracil bicikličnih nukleozida koji imaju 4'-CH2-O-2' most, zajedno sa njihovom oligomerizacijom, i osobine prepoznavanja nukleinske kiseline (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Sinteza bicikličnih nukleozida je takođe opisana u WO 98/39352 i WO 99/14226.
[0197] Analozi različitih bicikličnih nukleozida koji imaju 4' do 2' premošćujuće grupe kao što su 4'-CH2-O-2' i 4'-CH2-S-2', takođe su pripremljeni (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Takođe je opisana priprema oligodeoksiribonukleotidnih depleksa koji sadrže biciklične nukleozide za upotrebu kao supstrati za polimeraze nukleinskih kiselina (Wengel et al., WO 99/14226). Pored toga, u stanju tehnike je opisana sinteza 2'-amino-BNK, novog konformaciono ograničenog oligonukleoida visokog afiniteta (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Pored toga, 2'-amino- i 2'-metilamino-BNK su pripremljene i termalna stabilnost njihovih dupleksa sa komplementarnim lancima RNK i DNK je prethodno objavljena.
[0198] U određenim slučajevima, biciklični nukleozidi imaju formulu:
gde:
Bx je heterociklična bazna grupa;
Tai Tbsu svaki, nezavisno H, hidroksil zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforna grupa ili kovalentna veza za podržavanje medijuma;
svaki qi, qj, qki q1je, nezavisno, H, halogen, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C1-C12alkoksil, supstituisani C1-C12alkoksil, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJkili N(H)C(=S)NJjJk; i
qii qjili q1i qkzajedno su =C(qg)(qh), gde su qgi qhsvaki, nezavisno, H, halogen, C1-C12alkil ili supstituisani C1-C12alkil.
[0199] Opisani su jedan karbocikličan bicikličan nukleozid koji ima 4'-(CH2)3-2' most i alkenil analog most 4'-CH=CH-CH2-2' (Frier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 i Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). Takođe su opisani sinteza i priprema karbociklilnih bicikličnih nukleozida zajedno sa njihovom oligomerizacijom i biohemijskim ispitivanjima (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc.2007,129(26), 8362-8379).
[0200] U određenim slučajevima, biciklični nukleozidi obuhvataju, ali bez ograničenja na, (A) α-L-metilenoksi (4'-CH2-O-2') BNK, (B) β-D-metilenoksi (4'-CH2-O-2') BNK, (C) etilenoksi (4'-(CH2)2-O-2') BNK, (D) aminooksi (4'-CH2-O-N(R)-2') BNK, (E) oksiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNK, (F) metil(metilenoksi) (4'-CH(CH3)-O-2') BNK (takođe označen kao ograničeni etil ili cEt), (G) metilen-tio (4'-CH2-S-2') BNK, (H) metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNK, (I) metil karboksilnu (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNK, (J) propilen karboksilnu (4'-(CH2)3-2') BNK i (K) vinil BNK kao što je prikazano u daljem tekstu.
gde je Bx bazna grupa i R je, nezavisno, H, zaštitna grupa, C1-C6alkil ili C1-C6alkoksi.
[0201] Kao što je ove korišćen, termin "modifikovani tetrahidropiran nukleozid" ili "modifikovani THP nukleozid" označava nukleozid koji ima šesto-člani tetrahidropiran "šećer" supstituisan za pentofuranozil ostatak u normalnim nukleozidima i može biti označen kao šećerni surogat. Modifikovani THP nukleozidi obuhvataju, ali bez ograničenja na, ono šta je u stanju tehnike označeno kao heksitol nukleinska kiselina (HNA), anitol nukleinska kiselina (ANA), manitol nukleinska kiselina (MNA) (videti Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) ili fluoro HNA (F-HNA) koji ima tetrahidropiranil sistem prstena kao što je ilustrovano niže.
[0202] U određenom slučaju, izabrani su šećerni surogati koji imaju formulu:
gde:
Bx je heterociklična bazna grupa;
T3i T4su svaki, nezavisno, internukleozidna vezujuća grupa koja vezuje tetrahidropiran nukleozidni analog za oligomerno jedinjenje ili jedan od T3i T4je internukleozidna vezujuća grupa koja vezuje tetrahidropiran nukleozidni analog za oligomerno jedinjenje ili oligonukleotid i drugi od T3i T4je H, hidroksil zaštitna grupa, vezana konjugatna grupa ili 5' ili 3'-terminalna grupa;
q1, q2, q3, q4, q5, q6i q7su svaki nezavisno, H, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil ili supstituisani C2-C6alkinil; i jedan od R1i R2je vodonik i drugi je izabran od halogena, supstituisanog ili nesupstituisanog alkoksi, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2i CN, gde X je O, S ili NJ1i svaki J1, J2i J3je, nezavisno, H ili C1-C6alkil.
[0203] U određenim slučajevima, q1, q2, q3, q4, q5, q6i q7su svaki H. U određenim slučajevima, najmanje jedan od q1, q2, q3, q4, q5, q6i q7se razlikuje od H. U određenim slučajevima, najmanje jedan od q1, q2, q3, q4, q5, q6i q7je metil. U određenim slučajevima, obezbeđeni su THP nukleozidi gde je jedan od R1i R2jednak F. U određenim slučajevima, R1je fluoro i R2je H; R1je metoksi i R2je H, i R1je metoksietoksi i R2je H.
[0204] U određenim slučajevima, šećerni surogati sadrže prstenove koji imaju više od 5 atoma i više od jednog heteroatoma. Na primer objavljeni su nukleozidi koji sadrže morfolino šećerne grupe i njihova upotreba u oligomernim jedinjenjima (videti na primer: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; i SAD patenti 5,698,685; 5,166,315; 5,185,444;
4
i 5,034,506). Kao što je ovde korišćen, termin "morfolino" označava šećerni surogat koji ima sledeću formulu:
[0205] U određenim slučajevima, morfolino mogu biti modifikovani, na primer dodavanjem ili promenom različitih supstituišućih grupa iz gornje morfolino strukture. Takvi šećerni surogati su ovde označeni kao "modifikovani morfolino."
[0206] Kombinacije modifikacija su takođe obezbeđene bez ograničenja, kao što su 2'-F-5'-metil supstituisani nukleozidi (videti PCT međunarodnu prijavu WO 2008/101157 objavljenu 8/21/08 za druge otkrivene 5', 2'-bis supstituisane nukleozide) i zamena atoma kiseonika u robozil prstenu sa S i dodatna supstitucija na 2'-položaju (videti objavljenu SAD patentnu prijavu US2005-0130923, objavljenu 16.6.2005.) ili alternativno 5'-supstitucija biciklične nukleinske kiseline (videti PCT međunarodnu prijavu WO 2007/134181, objavljenu 11/22/07 gde je 4'-CH2-O-2' biciklični nukleozid dalje supstituisan na 5' položaju sa 5'-metil ili 5'-vinil grupom). Sinteza priprema karboksilnih bicikličnih nukleozida zajedno sa njihovom oligomerizacijom i biohemijskim ispitivanjima takođe su opisani (videti, npr., Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc.2007,129(26), 8362-8379).
[0207] U određenim slučajevima, antisens jedinjenja sadrže jedan ili više modifikovanih cikloheksenil nukleozida, koji je nukleozid koji ima šesto-člani cikloheksenil umesto pentofuranozil ostatka u prirodnim nukleozidima. Modifikovani cikloheksenil nukleozidi obuhvataju, ali bez ograničenja na one opisane u stanju tehnike (videti na primer zajedničku, objavljenu PCT prijavu WO 2010/036696, objavljenu 10.4.2010., Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(6), 1979-1984; Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(30), 9340-9348; Gu et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am.
Chem., 2000, 122, 8595-8602; objavljena PCT prijava, WO 06/047842; i objavljena PCT prijava WO 01/049687). Određeni modifikovani cikloheksenil nukleozidi imaju formulu X.
gde nezavisno za svaki od navedenih najmanje jednog cikloheksenil nukleozidnog analoga formule X:
Bx je heterociklična bazna grupa;
T3i T4su svaki, nezavisno, internukleozidna vezujuća grupa koja vezuje cikloheksenil nukleozidni analog za antisens jedinjenje ili jedan od T3i T4je internukleozidna vezujuća grupa koja vezuje tetrahidropiran nukleozidni analog za antisens jedinjenje i drugi od T3i T4je H, hidroksil zaštitna grupa, vezana konjugatna grupa ili 5'- ili 3'-terminalna grupa; i q1, q2, q3, q4, q5, q6, q7, q8i q9su svaki, nezavisno, H, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisani C2-C6alkinil ili druga šećerna supstituišuća grupa.
[0208] Mnogi drugi monociklični, biciklični ili triciklični sistemi prstena su poznati u stanju tehnike i pogodni su kao šećerni surogati koji se mogu koristiti za modifikaciju nukleozida za ugradnju u oligomerna jedinjenja kao što su ovde obezbeđena (videti na primer prikaz rada: Leumann, Christian J. Bioorg. & Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Takvi sistemi prstenova mogu da se podvrgnu različite dodatne supstitucije za dodatno pojačanje njihove aktivnosti.
[0209] Kao što je ovde korišćen, "2'-modifikovani šećer" označava furanozil šećer modifikovan na 2' položaju. U određenim slučajevima, takve modifikacije obuhvataju supstituente izabrane od: halogenida, uključujući, ali bez ograničenja na supstituisani i nesupstituisani alkoksi, supstituisani i nesupstituisani tioalkil, supstituisani i nesupstituisani amino alkil, supstituisani i nesupstituisani alkil, supstituisani i nesupstituisani alil i supstituisani i nesupstituisani alkinil. U određenim slučajevima, 2' modifikacije su izabrane od supstituenata uključujući, ali bez ograničenja na: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3i O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, gde su n i m od 1 do oko 10. Ostale 2'- supstiuišuće grupe takođe mogu biti izabrane od: C1-C12alkila, supstituisanog alkila, alkenila, alkinila, alkarila, aralkila, O-alkarila ili O-aralkila, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocikloalkila, heterocikloalkarila, aminoalkilamino, polialkilamino, supstituisanog silila, grupe za cepanje RNK, reporter grupe, interkalatora, grupe za poboljšanje farmakokinetičkih osobina ili grupe za poboljšanje farmakodinamičkih osobina antisens jedinjenja, i drugih supstituenata koji imaju slične osobine. U određenim slučajevima, modifikovani nukleozidi sadrže 2'-MOE bočni lanac (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Takva 2'-MOE supstutucija je opisana kao da ima poboljšani afinitet vezivanja u poređenju sa nemodifikovanim nukleozidima i sa drugim modifikovanim nukleozidima, kao što je 2'- O-metil, O-propil i O-aminopropil. Takođe je pokazano da su oligonukleotidi koji imaju 2'-MOE supstituent antisens inhibitori genske ekspresije sa obećavajućim karakteristikama za in vivo upotrebu (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; i Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
[0210] Kao što je ovde korišćen, "2'-modifikovani" ili "2'-supstituisani" označava nukleozid koji sadrži šećer koji sadrži supstituent na 2' položaju koji se razlikuje od H ili OH. 2'-modifikovani nukleozidi, obuhvataju, ali bez ograničenja na, biciklične nukleozide u kojima most koji povezuje dva atoma ugljenika šečernog prstena povezuje 2' ugljenik i drugi ugljenik šećernog prstena; i nukleozide sa nepremošćujućim 2' supstituentima, kao što su alil, amino, azido, tio, O-alil, O-C1-C10alkil, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) ili O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), gde je svaki Rmi Rn, nezavisno, H ili supstituisan ili nesupstituisan C1-C10alkil. 2'-modifikovani nukleozidi mogu dalje da sadrže ostale modifikacije, na primer na ostalim položajima šećera i/ili na nukleobazi.
[0211] Kao što je ovde korišćen, "2'-F" označava nukleozid koji sadrži šećer koji sadrži fluoro grupu na 2' položaju šećerog prstena.
[0212] Kao što je ovde korišćen, "2'-OMe" ili "2'-OCH3", "2'-O-metil" ili "2'-metoksi" svaki se odnosi na nukleozid koji sadrži šećer koji sadrži -OCH3grupu na 2' položaju šećernog prstena.
[0213] Kao što je ovde korišćen, "MOE" ili "2'-MOE" ili "2'-OCH2CH2OCH3" ili "2'-O-metoksietil" svaki se odnosi na nukleozid koji sadrži šećer koji sadrži -OCH2CH2OCH3grupu na 2' položaju šećernog prstena.
4
[0214] Postupci za pripreme modifikovanih šećera su dobro poznati stručnjacima iz date oblasti tehnike. Neki reprezentativni SAD patenti koji opisuju pripremu takvih modifikovanih šećera obuhvataju bez ograničenja, SAD: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,670,633; 5,700,920; 5,792,847 i 6,600,032 i međunarodnu prijavu PCT/US2005/019219, podnetu 2.6.2005, i objavljenu kao WO 2005/12137122.12.2005.
[0215] Kao što je ovde korišćen, "oligonukleotid" označava jedinjenje koje sadrži množinu vezanih nukleozida. U određenim slučajevima, jedan ili više od množine nukleozida je modifikovan. U određenim slučajevima, oligonukleotid sadrži jedan ili više ribonukleozida (RNA) i/ili deoksiribonukleozida (DNK).
[0216] U nukleotidima koji imaju modifikovane šećerne grupe, nukleobazne grupe (prirodne, modifikovane ili njihova kombinacija) su održavane za hibridizaciju sa odgovarajućom ciljnom nukleinskom kiselinom.
[0217] U određenim slučajevima, antisens jedinjenja sadrže jedan ili više nukleozida koji imaju modifikovane šećerne grupe. U određenim slučajevima, modifikovana šećerna grupa je 2'-MOE. U određenim slučajevima, 2'-MOE modifikovani nukleozidi su uređeni u motivu gapmera. U određenim slučajevima, modifikovana šećerna grupa je bicikličan nukleozid koji ima (4'-CH(CH3)-O-2') premošćujuću hgrupu. U određenim slučajevima, (4'-CH(CH3)-O-2') modifikovani nukleozidi su uređeni u krilima motiva gapmera.
Kompozicije i postupci za formulaciju farmaceutskih kompozicija
[0218] Oligonukleotidi mogu biti mešani sa farmaceutski prihvatljivim aktivnim ili inertnim supstancama za pripremu farmaceutskih kompozicija ili formulacija. Kompozicije i postupci za formulaciju farmaceutskih kompozicija su zavisni od broja kriterijuma, uključujući, ali bez ograničenja na, put primene, težinu bolesti ili dozu koja se primenjuje.
[0219] Antisens jedinjenje usmereno ka nukleinskoj kiselini SOD-1 može biti korišćeno u farmaceutskim kompozicijama kombinovanjem antisens jedinjenja sa pogodnim farmaceutski prihvatljivim razblaživačem ili nosačem. Farmaceutski prihvatljiv razblaživač obuhvata fosfatno-puferisani fiziološki rastvor (PBS). PBS je razblaživač pogodan za upotrebu u kompozicijamam za parenteralnu isporuku. Prema tome, u jednom slučaju, u postupcima opisanim ovde korišćena je farmaceutska kompozicija koja sadrži antisens jedinjenje usmereno ka nukleinskoj kiselini SOD-1 i farmaceutski prihvatljiv razblaživač. U određenim slučajevima, farmaceutski prihvatljiv razblaživač je PBS. U određenim slučajevima, antisens jedinjenje je modifikovani oligonukleotid.
[0220] Farmaceutske kompozicije koje sadrže antisens jedinjenja obuhvataju bilo koje farmaceutski prihvatljive soli, estre ili soli takvih estara, ili bilo koji drugi oligonukleotid koji, je posle primene na životinju, uključujući čoveka, sposoban da obezbedi (direktno ili indirektno) svoj biološki aktivni metabolit ili ostatak. Prema tome, na primer, otkrivene su farmaceutski prihvatljive soli antisens jedinjenja, prolekovi, farmaceutski prihvatljive soli takvih prolekova i drugi bioekvivalenti. Pogodne farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju, ali bez ograničenja na soli natrijuma i kalijuma.
[0221] Prolek može da obuhvata ugradnju dodatnih nukleozida na jednom ili oba kraja antisens jedinjenja koji su skraćeni pomoću endogenih nukleaza unutar tela, da bi se formiralo akivno antisens jedinjenje.
Konjugovana antisens jedinjenja
[0222] Antisens jedinjenja mogu biti kovalentno vezana za jednu ili više grupa ili konjugata koji pojačavaju aktivnost, ćelijsku raspodelu ili ćelijski unos rezultujućih oligonukleotida. Tipične konjugatne grupe obuhvataju grupe holesterola i lipidne grupe. Dodatne konjugatne grupe obuhvataju ugljene hidrate, fosolipide, biotin, fenazin, folat, fenantridin, antrakvinon, akridin, fluoresceine, rodamine, kumarine i boje.
[0223] Antisens jedinjenja mogu takođe biti modifikovana tako da imaju jednu ili više stabilizujućih grupa koje su generalno vezane za jedan ili oba terminusa antisens jedinjenja da bi se pojačale osobine kao što je, na primer, stabilnost na nukleazu. Uključene u stabilizujuće grupe su strukture u obliku kape. Ove terminalne modifikacije štite antisens jedinjenje koje ima terminalnu nukleinsku kiselinu iz razlaganja egzonukleazom, i mogu da pomognu u isporuci i/ili lokalizaciji unutar ćelije. Kapa može biti prisutna na 5'-terminusu (5'-kapa), ili na 3'-terminusu (3'-kapa), ili može biti prisutna na oba terminusa. Strukture kape su dobro poznate u stanju tehnike i obuhvataju, na primer, invertovane deoksi abazne kape. Dodatne 3' i 5'-stabilizuje grupe koje se mogu koristiti kao kapa na jednom ili oba kraja antisens
4
jedinjenja za pružanje stabilnosti na nukleazu obuhvataju one otkrivene u WO 03/004602 objavljenom 16.1.2003.
Ćelijska kultura i tretman antisens jedinjenjima
[0224] Efekti antisens jedinjenja na nivo, aktivnost ili ekspresiju nukleinskih kiselina SOD-1 mogu biti testirani in vitro u različitim ćelijskim tipovima. Ćelijski tipovi korišćeni za takve analize su dostupni od komercijalnih nabavljača (npr. American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) i kultivisani su prema upustvima nabavljača upotrebom komercijalno dostupnih reagenasa (npr. Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Ilustrativni ćelijski tipovi obuhvataju, ali bez ograničenja na, HepG2 ćelije, Hep3B ćelije, primarne hepatocite, A431 ćelije i SH-SY5Y ćelije.
In vitro testiranje oligonukleotida
[0225] Ovde su opisani postupci za tretman ćelija oligonukleotidima, koji mogu biti odgovarajuće modifikovani za tretman drugim antisens jedinjenjima.
[0226] Ćelije mogu biti tretirane oligonukleotidima kada ćelije dostignu približno 60-80% konfluence u kulturi.
[0227] Jedan reagens uobičajeno korišćen za uvođenje oligonukleotida u kultivisane ćelije obuhvata katjonski lipidni transfekcioni reagens LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Oligonukleotidi mogu biti mešani sa LIPOFECTIN u OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) da bi se postigla željena finalna koncentracija oligonukleotida i koncentracija LIPOFECTIN-a koja može biti u opsegu od 2 do 12 ug/mL na 100 nM oligonukleotida.
[0228] Sledeći reagens korišćen za uvođenje oligonukleotida u kultivisane ćeije obuhvata LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, CA). Oligonukleotid je mešan sa LIPOFECTAMINE u OPTI-MEM 1 medijumu redukovanog seruma (Invitrogen, Carlsbad, CA) da bi se postigla željena koncentracija oligonukleotida i koncentracija LIPOFECTAMINE-a koja može biti u opsegu od 2 do 12 ug/mL na 100 nM oligonukleotida.
4
[0229] Sledeća tehnika korišćena za uvođenje oligonukleotida u kultivisane ćelije obuhvata elektroporaciju.
[0230] Ćelije su tretirane oligonukleotidima pomoću rutinskih postupaka. Ćelije mogu biti sakupljene 16-24 časova posle tretmana oligonukleotidom, kada su nivoi RNK ili proteina ciljnih nukleinskih kiselina mereni pomoću postupaka poznatih u stanju tehnike i opisanih ovde. Uopšteno, kada su tretmani izvedeni u višestrukim ponavljanjima, podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ponovljenih tretmana.
[0231] Koncentracija korišćenih oligonukleotida varira od ćelijske linije do ćelijske linije. Postupci za određivanje optimalne koncentracije oligonukleoida za određenu ćelijsku liniju su dobro poznati u stanju tehnike. Oligonukleotidi su tipično korišćeni u koncentracijama u opsegu od 1 nM do 300 nM kada su transficirani sa LIPOFECTAMINE. Oligonukleotidi su korišćeni u višim koncentracijama u opsegu od 625 do 20,000 nM kada su transficirani upotrebom elektroporacije.
Izolacija RNK
[0232] Analiza RNK može biti izvedena na ukupnoj ćelijskoj RNK ili poli(A)+ iRNK. Postupci izolacije RNK su dobro poznati u stanju tehnike. RNK je pripremljena upotrebom postupaka koji su dobro poznati u stanju tehnike, na primer, upotrebom TRIZOL reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA) prema protokolima preporučenim od strane proizvođača.
Analiza inhibicije ciljnih nivoa ili ekspresije
[0233] Inhibicija nivoa ili ekspresije nukleinske kiseline SOD-1 može biti analizirana na različite načine poznate u stanju tehnike. Na primer, nivoi ciljne nukleinske kiseline mogu biti kvantitativno određeni pomoću, npr., „Northern blot“ analize, kompetitivne reakcije lančane polimeraze (PCR) ili kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Analiza RNK može biti izvedena na ukupnoj ćelijskoj RNK ili poli(A)+ iRNK. Postupci za izolaciju RNK su dobro poznati u stanju tehnike. „Northern blot“ analiza je takođe rutinska u stanju tehnike. Kvantitativan PCR u realnom vremenu može biti pogodno postignut upotrebom komercijalno dostupnog ABI PRISM 7600, 7700 ili 7900 sistema za detekciju sekvence, dostupnog iz PE-Applied Biosystems, Foster City, CA i korišćen prema uputstvima proizvođača.
4
Kvantitativna PCR analiza u realnom vremenu nivoa ciljne RNK
[0234] Kvantitativno određivanje nivoa ciljne RNK može se postići pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu upotrebom ABI PRISM 7600, 7700 ili 7900 sistema za detekciju sekvence (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) prema uputstvima proizvođača. Postupci za kvantitativan PCR u realnom vremenu su dobro poznati u stanju tehnike.
[0235] Pre PCR-a u realnom vremenu, izolovana RNK je podvrgnuta reakciji reverzne transkriptaze (RT), koja proizvodi komplementarnu DNK (cDNK) koja se zatim koristi kao supstrat za PCR amplifikaciju u realnom vremenu. Reakcije RT i PCR-a u realnom vremenu izvedene su uzastopno u istom bunarčiću sa uzorkom. Regansi za RT i PCR u realnom vremenu mogu se dobiti iz Invitrogen (Carlsbad, CA). Reakcije RT i PCR-a u realnom vremenu su izvedene pomoću postupaka koji su dobro poznati stručnjacima iz date oblasti tehnike.
[0236] Ciljne količine gena (ili RNK) dobijene pomoću PCR-a u realnom vremenu su normalizovane upotrebom ekspresionog nivoa gena čija ekspresija je konstantna, kao što je ciklofilin A ili kvantitativnim određivanjem ukupne RNK upotrebom RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). Ekspresija ciklofilina A je kvantitativno određena pomoću PCR-a u realnom vremenu, ispitivanjem istovremeno sa ciljnim mestom, multipleksiranjem ili odvojeno. Ukupna RNK je kvantitativno određena upotrebom RIBOGREEN reagensa za kvantitativno određivanje RNK (Invetrogen, Inc. Eugene, OR). Postupci za kvantitativno određivanje RNK pomoću RIBOGREEN su SOD-1ght u Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). CYTOFLUOR 4000 instrument (PE Applied Biosystems) je korišćen za merenje RIBOGREEN fluorescencije.
[0237] Probe i prajmeri su dizjanirani za hibridizaciju nukleinske kiseline SOD-1. Postupci za dizajniranje PCR proba i prajmera u realnom vremenu su dobro poznati u stanju tehnike i mogu da obuhvataju upotrebu softvera kao što je PRIMER EXPRESS softver (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Analiza nivoa proteina
[0238] Antisens inhibicija nukleinskih kiselina SOD-1 može se proceniti merenjem nivoa SOD-1 proteina. Nivoi proteina SOD-1 mogu biti procenjivani ili kvantitativno određivani na
4
različite načine koji su dobro poznati u stanju tehnike, kao što je imunoprecipitacija, Western blot analiza (imunoblotting), enzimski-vezana imunosorbent analiza (ELISA), kvantitativne analize proteina, analize aktivnosti proteina (na primer, analize aktivnosti kaspaze), imunohistohemija, imunocitohemija ili fluorescencijom-aktivirano ćelijsko sortiranje (FACS). Antitela usmerena ka ciljnom mestu mogu biti identifikovana i dobijena iz različitih izvora, kao što je MSRS katalog antitela (Aerie Corporation, Birmingham, MI) ili mogu biti pripremljena preko konvencionalnih postupaka pripreme monoklonskih ili poliklonskih antitela koji su dobro poznati u stanju tehnike. U određenim slučajevima, jedinjenja ovde obezbeđuju poboljšanu redukciju u nivoima proteina.
In vivo testiranje antisens jedinjenja
[0239] Antisens jedinjenja, na primer, modifikovani oligonukleotidi, su testirana kod životinja da bi se procenila njihova sposobnost da inhibiraju ekspresiju SOD-1 i proizvode fenotipske promene, kao što su, poboljšana motorna funkcija. U određenim slučajevima, motorna funkcija je merena analizom početka hoda, rotarod testom, snagom hvatanja, penjanjem uz šipku, učinkom na otvorenom polju, držanjem ravnoteže na gredi, testiranjem otiska zadnje šape kod životinje. Testiranje se može izvesti kod normalnih životinja ili u eksperimentalnim modelima bolesti. Za primenu na životinje, oligonukleotidi su formulisani u farmaceutski prihvatljivom razblaživaču, kao što je fosfatno-puferisani fiziološki rastvor. Primena obuhvata parenteralne puteve primene, kao što du intraperitonealni, intravenski i subkutani. Doza i učestalost doziranja oligonukleotida zavise od višestrukih faktora kao što su, ali bez ograničenja na, put primene i telesna težina životinje. Posle perioda tretmana oligonukleotidima, RNK je izolovana iz tkiva CNS-a ili CSF i merene su promene u ekspresiji nukleinske kiseline SOD-1.
Određene indikacije
[0240] U određenim slučajevima, ovde su opisani postupci, jedinjenja i kompozicije za lečenje individue koji sadrže primenu jedne ili više farmaceutskih kompozicija koje su ovde opisane. U određenim slučajevima, individua ima neurodegenerativnu bolest. U određenim slučajevima, individua je u riziku od razvoja neurodegenerativne bolesti, uključujući, ali bez ograničenja na, amiotrofnu lateralnu sklerozu (ALS). U određenim slučajevima, individua je identifikovana tako da ima bolest povezanu sa SOD-1. U određenim slučajevima, ovde su opisani postupci za profilaktično smanjanje ekspresije SOD-1 u individui. Određeni slučajevi
4
obuhvataju lečenje individue kod koje postoji potreba za tim primenom na individuu terapeutski efikasne količine antisens jedinjenja koje ciljno deluje na nukleinsku kiselinu SOD-1.
[0241] U jednom slučaju, primena terapeutski efikasne količine antisens jedinjenja koje ciljno deluje na SOD-1 je praćena monitoringom nivoa SOD-1 u invidui, da bi se odredio odgovor individue na primenu antisens jedinjenja. Odgovor individue na primenu antisens jedinjenja može biti korišćen od strane lekara da bi se odredila količina i trajanje terapeutske intervencije.
[0242] U određenim slučajevima, primena antisens jedinjenja koje ciljno deluje na nukleinsku kiselinu SOD-1 rezultuje u smanjenju ekspresije SOD-1 za najmanje 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100%, ili u opsegu definisanom sa bilo koje dve od ovih vrednosti. U određenim slučajevima, primena antisens jedinjenja koje ciljno deluje na nukleinsku kiselinu SOD-1 rezultuje u poboljšanoj motornoj funkciji kod životinje. U određenim slučajevima, primena SOD-1 antisens jedinjenja poboljšava motornu funkciju za najmanje 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100%, ili za opseg definisan sa bilo koje dve od ovih vrednosti.
[0243] U određenim slučajevima, farmaceutske kompozicije koje sadrže antisens jedinjenje koje ciljno deluje na SOD-1 su korišćene za pripremu leka za lečenje pacijenta koji pati od ili je podložan neurodegenerativnoj bolesti uključujući amiotrofnu lateralnu sklerozu (ALS).
Određene uporedne kompozicije
[0244] Antisens oligonukleotidi koji ciljno deluju na humani SOD-1 opisani su u ranijoj objavi (videti WO 2005/040180). Nekoliko oligonukleotida (ISIS 333611, ISIS 146144, ISIS 146145, ISIS 150437, ISIS 150441, ISIS 150443, ISIS 150444, ISIS 150445, ISIS 150446, ISIS 150447, ISIS 150448, ISIS 150449, ISIS 150452, ISIS 150454, ISIS 150458, ISIS 150460, ISIS 150462-150467, ISIS 150470, ISIS 150472, ISIS 150474, ISIS 150475, ISIS 150476, ISIS 150479-150483, ISIS 150488, ISIS 150489, ISIS 150490, ISIS 150491-150493, ISIS 150495-150498, ISIS 150511, ISIS 333605, ISIS 333606, ISIS 333609-333617, ISIS 333619, ISIS 333620-333636, ISIS 333638 i ISIS 333640) opisanih ovde, su korišćeni kao uporedna jedinjenja u izabranim skrininzima za nova antisens jedinjenja koja su ovde opisana.
[0245] U određenim slučajevima, ISIS 333611, 5-10-5 MOE gapmer, koji ima sekvencu od (od 5' do 3') CCGTCGCCCTTCAGCACGCA (obuhvaćena ovde kao SEQ ID NO: 21), pri čemu je svaka internukleozidna veza fosforotioatna veza, svaki citozin je 5-metilcitozin, i svaki od nukleozida 1-5 i 16-20 (od 5' do 3') sadrži 2'-O-metoksietil grupu, je korišćen kao uporedno jedinjenje. ISIS 333611 je izabran kao uporedno jedinjenje zbog toga što je ispoljio visoke nivoe inhibiciju zavisnu od doze u različitim studijama kao što je opisano u WO 2005/040180. Pored toga, humana klinička ispitivanja faze 1 su završena upotrebom ISIS 333611. Videti, MILLER et al., "An antisense oligonucleotide against SOD1 delivered intrathecally for patients with SOD1 familial amyotrophic lateral sclerosis: a phase 1, randomised, first-in-man study" Lancet Neurol. (2013) 12(5): 435-442. Na taj način, ISIS 333611 se smatra visoko efikasnim i potentnim jedinjenjem sa prihvatljivim profilom bezbednosti (tako da je testirano kod humanih pacijenata).
[0246] U određenim slučajevima, jedinjenja opisana ovde imaju koristi od jedne ili više poboljšanih osobina u odnosu na antisens jedinjenja opisana u WO 2005/040180. Neke od poboljšanih osobina su pokazane u primerima koji su ovde obezbeđeni. U određenim slučajevima, jedinjenja koja su ovde opisana su efikasnija, potentnija i/ili tolerabilnija u različitim in vitro i in vivo studijama od uporednih jedinjenja opisanih ovde, uključujući ISIS 333611. U određenim slučajevima, ISIS 666853, ISIS 666859, ISIS 666919, ISIS 666921, ISIS 666922, ISIS 666869, ISIS 666870 i ISIS 666867 su efikasniji i/ili potentniji u različitim in vitro i in vivo studijama od uporednih jedinjenja koja su ovde opisana, uključujući ISIS 333611. U određenim slučajevima, ISIS 666853, ISIS 666859, ISIS 666919, ISIS 666921, ISIS 666922, ISIS 666869, ISIS 666870 i ISIS 666867 su tolerabilnija u jednoj ili više analiza tolerabilnosti kod životinja od uporednih jedinjenja koja su ovde opisana, uključujući ISIS 333611. Ovo je uprkos tome što je 333611 dovoljno dobro tolerisano da bi napredovalo do humanih kliničkih ispitivanja.
[0247] U određenim slučajevima, određena jedinjenja koja su ovde opisana su efikasnija od uporednih jedinjenja zbog in vitro IC50 od manje od 2 µM, manje od 1.9 µM, manje od 1.8 µM, manje od 1.7 µM, manje od 1.6 µM, manje od 1.5 µM, manje od 1.4 µM, manje od 1.3 µM, manje od 1.2 µM, manje od 1.1 µM, manje od 1 µM, manje od 0.9 µM, manje od 0.8 µM, manje od 0.7 µM, manje od 0.6 µM, ili manje od 0.5 µM manje od 0.4 µM, manje od 0.3
1
µM, manje od 0.2 µM, manje od 0.1 µM, kada su testirana u humanim ćelijama, na primer, u HepG2 A431 ili SH-SY5Y ćelijskim linijama (Na primer, videti Primere 6-11).
[0248] U određenim slučajevima, određena jedinjenja opisana ovde su efikasnija od uporednih jedinjenja zbog njihove sposobnosti da inhibiraju ekspresiju SOD-1 in vivo. U određenim slučajevima, jedinjenja inhibiraju SOD-1 u lumbalnom delu kičmene moždine i cervikalnom delu kičmene moždine za najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% u, na primer, transgenom životinjskom modelu.
[0249] U određenim slučajevima, određena jedinjenja opisana ovde su tolerabilnija od uporednih jedinjenja na osnovu smanjenih nivoa mikroglijalnog markera (npr., IBA1), smanjenih nivoa astrocitnog markera (npr., GFAP) i/ili FOB skorova kod pacova, miševa i/ili majmuna. Videti, na primer, Primere 14, 15, 18 i 19.
ISIS 666853
[0250] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 12 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666853 je postigao 81% inhibicije u lumbalnom delu kičmene moždine i 74% u cervikalnom delu kičmene moždine transgenog pacovskog modela SOD-1 kada je doziran sa 30 µL 16.67 mg/ml rastvora oligonukleotida razblaženog u PBS (500 µg finalna doza), dok je ISIS 333611 postigao 51% inhibicije u lumbalnom delu kičmene moždine i 47% inhibicije u cervikalnom delu kičmene moždine.
[0251] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 14 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666853 je postigao FOB skor od 0, dok je ISIS 333611 postigao FOB skor od 4 kod Sprague-Dawley pacova posle 3 čada kada su tretirani sa 3 mg oligonukleotida. Nivoi mikroglijalnog markera (IBA1) i nivoi astrocitnog markera (GFAP) su takođe smanjeni kod pacova tretiranih sa ISIS 666853 u poređenju sa pacovima tretiranim sa ISIS 333611.
[0252] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 15 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666853 je postigao ED50od 81.3 i 242.6 u lumbalnom tkivu i cervikalnom tkivu (respektivno) kod SOD-1 transgenih pacova kada su tretirani intratekalno sa 10, 30, 100, 300 ili 3000 µg oligonukleotida. ED50u lumbalnim i cervikalnim tkivima ne bi mogao biti izračunat kod
2
transgenih pacova tretiranih sa ISIS 333611 zbog toga što najviša testirana koncentracija (3000 µg) nije uspela da inhibira humanu iRNK SOD-1 više od 55-65%.
[0253] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 16 (ovde u daljem tekstu), u dozama od 1 mg i 3 mg ISIS 666853 postigao je posle 3 časa FOB skorove od 0.0 i 0.5 (respektivno), dok je ISIS 333611 postigao FOB skorove od 3.0 i 4.9 (respektivno). U dozama od 1 mg i 3 mg ISIS 666853 postigao je posle 8 nedelja FOB skorove od 0.0 i 0.0 (respektivno), dok je ISIS 333611 postigao FOB skorove od 0.0 i 1.2 (respektivno).
[0254] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 17 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666853 je postigao ED50od 136 i 188 u lumbalnom tkivu i tkivu korteksa (respektivno), dok je ISIS 333611 postigao ED50od 401 i 786 u lumbalnom tkivu i tkivu korteksa (respektivno) kod SOD-1 transgenih miševa kada su tretirani intracerebralnim ventrikularnim bolusom od 10, 30, 100, 300 ili 700 µg oligonukleotida.
[0255] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 18 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666853 je postigao FOB skor od 1.25, dok je ISIS 333611 postigao FOB skor od 6.5 kod C57bl6 miševa posle 3 časa kada su tretirani sa 700 µg oligonuleotida. Nivoi mikroglijalnog markera (IBA1) i nivoi astrocitnog markera (GFAP) su takođe sniženi kod miševa tretiranih sa ISIS 666853 u poređenju sa miševima tretiranim sa ISIS 333611.
ISIS 666859
[0256] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 12 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666859 je postigao 79% inhibicije u lumbalnom delu kičmene moždine i 64% inhibicije u cervikalnom delu kičmene moždine SOD-1 transgenog pacovskog modela kada su dozirani sa 30 µL 16.67 mg/ml rastvora oligonukleotida razblaženog u PBS (500 µg finalna doza), dok je ISIS 333611 postigao 51% inhibicije u lumbalnom delu kičmene moždine i 47% inhibicije u cervikalnom delu kičmene moždine.
[0257] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 14 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666859 je postigao FOB skor od 1, dok je ISIS 333611 postigao FOB skor od 4 kod Sprague-Dawley pacova posle 3 čada su tretirani sa 3 mg oligonukleotida. Nivoi mikroglijalnog markera (IBA1) i nivoi astrocitnog markera (GFAP) su takođe smanjeni kod pacova tretiranih sa ISIS 666859 u poređenju sa pacovima tretiranim sa ISIS 333611.
[0258] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 15 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666859 je postigao ED50od 74.0 i 358.8 u lumbalnom tkivu i cervikalnom tkivu (respektivno) kod SOD-1 transgenih pacova kada su tretirani intratekalno sa 10, 30, 100, 300 ili 3000 µg oligonukleotida. ED50u lumblanim ili cervikalnim tkivima ne bi mogao biti izračunat kod transgenih pacova tretiranih sa ISIS 333611 zbog toga što najviša testirana koncentracija (3000 µg) nije uspela da inhibira humanu iRNK SOD-1 više od 55-65%.
[0259] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 16 (ovde u daljem tekstu), u dozama od 1 mg i 3 mg ISIS 666859 postigao je posle 3 časa FOB skorove od 0.0 i 2.1 (respektivno), dok je ISIS 333611 postigao FOB skorove od 3.0 i 4.9 (respektivno). U dozama od 1 mg i 3 mg ISIS 666859 postigao je posle 8 nedelja FOB skorove od 0.0 i 0.3 (respektivno), dok je ISIS 333611 postigao FOB skorove od 0.0 i 1.2 (respektivno).
[0260] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 17 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666859 je postigao ED50od 106 i 206 u lumbalnom tkivu i tkivu korteksa (respektivno), dok je ISIS 333611 postigao ED50od 401 i 786 u lumbalnom tkivu i tkivu kortesa (respektivno) kod SOD-1 transgenih miševa kada su tretirani intracerebralnim ventrikularnim bolusom od 10, 30, 100, 300 ili 700 µg oligonukleotida.
[0261] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 18 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666859 je postigao FOB skor od 1.75, dok je ISIS 333611 postigao FOB skor od 6.5 kod C57bl6 miševa posle 3 časa kada su tretirani sa 700 µg oligonukleotida. Nivoi mikroglijalnog markera (IBA1) i nivoi astrocitnog markera (GFAP) su takođe smanjeni kod miševa tretiranih ISIS 666859 u poređenju sa miševima tretiranim sa ISIS 333611.
ISIS 666919
[0262] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 12 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666919 je postigao 76% inhibicije u lumbalnom delu kičmene moždine i 68% u cervikalnom delu kičmene moždine SOD-1 transgenog pacovskog modela kada su dozirani sa 30 µL 16.67 mg/ml rastvora oligonukleotida razblaženog u PBS (500 µg finalna doza), dok je ISIS 333611 postigao 51% inhibicije u lumbalnom delu kičmene moždine i 47% inhibicije u cervikalnom delu kičmene moždine.
4
[0263] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 14 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666919 je postigao FOB skor od 2, dok je ISIS 333611 postigao FOB skor od 4 kod Sprague-Dawley pacova posle 3 časa kada su tretirani sa 3 mg oligonukleotida. Nivoi mikroglijalnog markera (IBA1) i nivoi astrocitnog markera (GFAP) su takođe smanjeni kod pacova tretiranih sa ISIS 666919 u poređenju sa pacovima tretiranim ISIS 333611.
[0264] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 15 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666919 je postigao ED50od 104.1 i 613.5 u lumbalnom tkivu i cervikalnom tkivu (respektivno) kod SOD-1 transgenih pacova kada su tretirani intratekalno sa 10, 30, 100, 300 ili 3000 µg oligonukleotida. ED50u lumbalnim i cervikalnim tkivima ne bi mogao da se izračuna kod transgenih pacova tretiranih sa ISIS 333611 zbog toga najviša testirana koncentracija (3000 µg) nije uspela da inhibira humanu iRNK SOD-1 više od 55-65%.
[0265] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 16 (ovde u daljem tekstu), u dozama od 1 mg i 3 mg ISIS 666919 postigao je posle 3 časa FOB skorove od 1.3 i 3.5 (respektivno), dok je ISIS 333611 postigao FOB skorove od 3.0 i 4.9 (respektivno). U dozama od 1 mg i 3 mg ISIS 666919 je postigao posle 8 nedelja FOB skorove od 0.0 i 0.1 (respektivno), dok je ISIS 333611 postigao FOB skorove od 0.0 i 1.2 (respektivno).
[0266] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 17 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666919 je postigao ED50od 168 u lumbalnom tkivu, dok je ISIS 333611 postigao ED50od 401 u lumbalnom tkivu kod SOD-1 transgenih miševa kada su tretirani intracerebralnim ventrikularnim bolusom od 10, 30, 100, 300 ili 700 µg oligonukleotida.
[0267] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 18 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666919 je postigao FOB skor od 0.0, dok je ISIS 333611 postigao FOB skor od 6.5 kod C57bl6 miševa posle 3 časa kada su tretirani sa 700 µg oligonukleotida. Nivoi mikroglijalnog markera (IBA1) i nivoi astrocitnog markera (GFAP) su takođe smanjeni kod miševa tretiranih sa ISIS 666919 u poređenju sa miševima tretiranim sa ISIS 333611.
ISIS 666921
[0268] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 12 (ovde u daljem tekstu), ISIS 66621 je postigao 71% inhibicije u lumbalnom delu kičmene moždine i 65% u cervikalnom delu kičmene moždine SOD-1 transgenog pacovskog modela kada su dozirani sa 30 µL 16.67 mg/ml rastvora oligonukleotida razblaženog u PBS (500 µg finalna doza), dok je ISIS 333611 postigao 51% inhibicije u lumbalnom delu kičmene moždine i 47% inhibicije u cervikalnom delu kičmene moždine.
[0269] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 14 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666921 je postigao FOB skor 2, dok je ISIS 333611 postigao FOB skor od 4 kod Sprague-Dawley pacova posle 3 časa kada su tretirani sa 3 mg oligonukleotida. Nivoi mikroglijalnog markera (IBA1) i nivoi astrocitnog markera (GFAP) su takođe smanjeni kod pacova tretiranih sa ISIS 666919 u poređenju sa pacovima tretiranim sa ISIS 333611.
ISIS 666922
[0270] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 12 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666922 je postigao 67% inhibicije u lumbalnom delu kičmene moždine i 62% u cervikalnom delu kičmene moždine SOD-1 transgenog pacovskog modela kada su dozirani sa 30 µL 16.67 mg/ml rastvora oligonukleotida razblaženog u PBS (500 µg finalna doza), dok je ISIS 333611 postigao 51% inhibicije u lumbalnom delu kičmene moždine i 47% inhibicije u cervikalnom delu kičmene moždine.
[0271] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 14 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666922 je postigao FOB skor od 3, dok je ISIS 333611 postigao FOB skor od 4 kod Sprague-Dawley pacova posle 3 časa kada su tretirani sa 3 mg oligonukleotida. Nivoi mikroglijalnog markera (IBA1) i nivoi astrocitnog markera (GFAP) su takođe smanjeni kod pacova tretiranih sa ISIS 666919 u poređenju sa pacovima tretiranim sa ISIS 333611.
ISIS 666869
[0272] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 12 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666869 je postigao 82% inhibicije u lumbalnom delu kičmene moždine i 81% u cervikalnom delu kičmene moždine SOD-1 transgenog pacovskog modela doziranog sa 30 µL 16.67 mg/ml rastvora oligonukleotida razblaženog u PBS (500 µg finalna doza), dok je ISIS 333611 postigao 51% inhibicije u lumbalnom delu kičmene moždine i 47% inhibicije u cervikalnom delu kičmene moždine.
ISIS 666870
[0273] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 12 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666870 je postigao 76% inhibicije u lumbalnom delu kičmene moždine i 68% u cervikalnom delu kičmene moždine SOD-1 transgenog pacovskog modela kada su dozirani sa 30 µL 16.67 mg/ml rastvora oligonukleotida razblaženog u PBS (500 µg finalna doza), dok je ISIS 333611 postigao 51% inhibicije u lumbalnom delu kičmene moždine i 47% inhibicije u cervikalnom delu kičmene moždine.
[0274] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 15 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666870 je postigao ED50od 139.4 i 1111 u lumbalnom tkivu i cervikalnom tkivu (respektivno) kod SOD-1 transgenih pacova kada su tretirani intratekalno sa 10, 30, 100, 300 ili 3000 µg oligonukleotida. ED50u lumbalnim i cervikalnim tkivima ne bi mogao da se izračuna kod transgenih pacova tretiranih sa ISIS 333611 zbog toga što najviša testirana koncentracija (3000 µg) nije uspela da inhibira humanu iRNK SOD-1 više od 55-65%.
[0275] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 17 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666870 je postigao ED50od 148 i 409 u lumbalnom tkivu i tkivu korteksa (respektivno) dok je ISIS 333611 postigao ED50od 401 i 786 u lumbalnom tkivu i tkivu korteksa (rsspektivno) kod SOD-1 transgenih miševa kada su tretirani intracerebralnim ventrikularnim bolusom od 10, 30, 100, 300 ili 700 µg oligonukleotida.
[0276] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 18 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666870 je postigao FOB skor od 4.75, dok je ISIS 333611 postigao FOB skor od 6.5 kod C57bl6 miševa posle 3 časa kada tretman izveden sa 700 µg oligonukleotida.
ISIS 666867
[0277] Na primer, kao što je obezbeđeno u Primeru 12 (ovde u daljem tekstu), ISIS 666867 je postigao 59% inhibicije u lumbalnom delu kičmene moždine i 48% u cervikalnom delu kičmene moždine modela SOD-1 transgenog pacova kada je doziran sa 30 µL rastvora 16.67 mg/ml oligonukleotida razblaženog u PBS (500 µg finalne doze), dok je ISIS 333611 postigao 51% inhibicije u lumbalnom delu kičmene moždine i 47% inhibicije u cervikalnom delu kičmene moždine.
Određene kompozicije
1. ISIS 666853
[0278] U određenim slučajevima, ISIS 666853 je okarakterisan kao 5-10-5 MOE gapmer, koji ima sekvencu (od 5' do 3') CAGGATACATTTCTACAGCT (obuhvaćena ovde kao SEQ ID NO: 725), gde su svaki od nukleozida 1-5 i 16-20 nukleozidi sa modifikovanom 2'-O-metoksietilribozom i svaki od nukleozida 6-15 su 2'-deoksinukleozidi, pri čemu su internukleozidi između nuklezoda 2 do 3, 4 do 5, 16 do 17 i 18 do 19 fosfodiestarske veze i internukleozidne veze između nukleozida 1 do 2, 3 do 4, 5 do 6, 6 do 7, 7 do 8, 8 do 9, 9 do 10, 10 do 11, 11 do 12, 12 do 13, 13 do 14, 14 do 15, 15 do 16, 17 do 18 i 19 do 20 su fosforitoatne veze i pri čemu svaki citozin je 5-metilcitozin.
[0279] U određenim slučajevima, ISIS 666853 je opisan sledećim hemijskim oznakama: mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te; u kojima,
A = adenin,
mC = 5-metilcitozin
G = guanin,
T = timin,
e = 2'-O-metoksietilriboza modifikovani šećer,
d = 2'-deoksiriboza šećer,
s = fosforotioatna internukleozidna veza i
o = fosfodiestarska internukleozidna veza.
[0280] U određenim slučajevima, ISIS 666853 je opisan sledećom hemijskom strukturom:
Struktura 1. ISIS 666853
2. ISIS 666859
[0281] U određenim slučajevima, ISIS 666859 je okarakterisan kao modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu (od 5' do 3') TTAATGTTTATCAGGAT (ugrađena ovde kao SEQ ID NO: 1351), koja se sastoji od sedamnaest nukleozida, pri čemu su svaki od nukleozida 1-4 i 15-17 nukleozidi 2'-O-metoksietilriboze, pri čemu su svaki od nukleozida 13 i 14 nukleozidi sa modifikovanim cEt, pri čemu su svaki od nukleozida 5-122'-deoksiribonukleozidi, pri čemu su internukleozidne veze između nukleozida 2 do 3, 3 do 4, 13 do 14, 14 do 15 fosfodiestarske veze i internukleozidne veze između nukleozida 1 do 2, 4 do 5, 5 do 6, 6 do 7, 7 do 8, 8 do 9, 9 do 10, 10 do 11, 11 do 12, 12 do 13, 15 do 16 i 16 do 17 su fosfortioatne veze i pri čemu svaki citozin je 5-metilcitozin.
[0282] U određenim slučajevima, ISIS 666859 je opisan sledećim hemijskim oznakama: Tes Teo Aeo Aes Tds Gds Tds Tds Tds Ads Tds mCds Ako Gko Ges Aes Te; u kojima,
A = adenin,
mC = 5-metilcitozin
G = guanin,
T = timin,
e = 2'-O-metoksietilriboza modifikovani šećer,
k = cEt modifikovani šećer,
d = 2'-deoksiriboza šećer,
s = fosforotioatna internukleozidna veza i
o = fosfodiestarska internukleozidna veza.
[0283] U određenim slučajevima, ISIS 666859 je opisan sledećom hemijskom strukturom:
Struktura 2. ISIS 666859
3. ISIS 666919
[0284] U određenim slučajevima, ISIS 666919 je okarakterisan kao modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu (od 5' do 3') GGATACATTTCTACAGC (obuhvaćen ovde kao SEQ ID NO: 1342), koji se sastoji od sedamnaest nukleozida, pri čemu su svaki od nukleozida 1-4 i 16-17 nukleozidi sa modifikovanom 2'-O-metoksietilribozom, pri čemu su svaki od nukleozida 14 i 15 nukleozidi sa modifikovanim cEt, pri čemu su svaki od nukleozida 5-13 2'-deoksiribonukleozidi, pri čemu su internukleozidne veze između nukleozida 2 do 3, 3 do 4, 4 do 5 i 14 do 15 fosfodiestarske veze i internukleozidne veze između nukleozida 1 do 2, 5 do 6, 6 do 7, 7 do 8, 8 do 9, 9 do 10, 10 do 11, 11 do 12, 12 do 13, 13 do 14, 15 do 16 i 16 do 17 su fosforotiatne veze i pri čemu je svaki citozin 5-metilcitozin.
[0285] U određenim slučajevima, ISIS 666919 je opisan sledećom hemijskom oznakom: Ges Geo Aeo Teo Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCko Aks Ges mCe; u kojoj, A = adenin,
mC = 5-metilcitozin
G = guanin,
T = timin,
e = 2'-O-metoksietilriboza modifikovani šećer,
k = cEt modifikovani šećer,
d = 2'-deoksiriboza šećer,
s = fosforotioatna internukleozidna veza i
o = fosfodiestarska internukleozidna veza.
[0286] U određenim slučajevima, ISIS 666919 je opisan sledećom hemijskom strukturom:
Struktura 3. ISIS 666919
1
4. ISIS 666921
[0287] U određenim slučajevima, ISIS 666921 je okarakterisan kao modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu (od 5' do 3') GGATACATTTCTACAGC (obuhvaćena ovde kao SEQ ID NO: 1342), koja se sastoji od sedamnaest nukleozida, pri čemu su svaki od nukleozida 1-5 i 16-17 nukleozidi sa modifikovanom 2'-O-metoksietilribozom, pri čemu su svaki od nukleozida 14-15 nukleozidi sa modifikovanim cEt, pri čemu su svaki od nukleozida 6-13 2'-deoksiribonukleozidi, pri čemu su internukleozidne veze između nukleozida 2 do 3, 3 do 4, 4 do 5 i 14 do 15 fosfordiestarske veze i internukleozidne veze između nukleozida 1 do 2, 5 do 6, 6 do 7, 7 do 8, 8 do 9, 9 do 10, 10 do 11, 11 do 12, 12 do 13, 13 do 14, 15 do 16 i 16 do 17 fosforotioatne veze i pri čemu je svaki citozin 5-metilcitozin.
[0288] U određenim slučajevima, ISIS 666921 je opisan sledećim hemijskim oznakama: Ges Geo Aeo Teo Aes mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCko Aks Ges mCe; u kojima, A = adenin,
mC = 5-metilcitozin
G = guanin,
T = timin,
e = 2'-O-metoksietilriboza modifikovani šećer,
k = cEt modifikovani šećer,
d = 2'-deoksiriboza šećer,
s = fosforotioatna internukleozidna veza i
o = fosfodiestarska internukleozidna veza.
[0289] U određenim slučajevima, ISIS 666921 je opisan sledećoj hemijskom strukturom:
2
Struktura 4. ISIS 666921
5. ISIS 666922
[0290] U određenim slučajevima, ISIS 666922 je okarakterisan kao modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu (od 5' do 3') GGATACATTTCTACAGC (obuhvaćena ovde kao SEQ ID NO: 1342), koja se sastoji od sedamnaest nukleozida, pri čemu su svaki od nukleozida 1-4 i 15-17 nukleozidi sa modifikovanom 2'-O-metoksietilribozom, pri čemu su svaki od nukleozida 5 i 14 nukleozidi sa modifikovanim cEt, pri čemu su svaki od nukleozida 6-13 2'-deoksiribonukleozidi, pri čemu su internukleozidne veze između nukleozida 2 do 3, 3 do 4, 4 do 5 i 14 do 15 fosfodiesatarske veze i internukleozidne veze između nukleozida 1 do 2, 5 do 6, 6 do 7, 7 do 8, 8 do 9, 9 do 10, 10 do 11, 11 do 12, 12 do 13, 13 do 14, 15 do 16 i 16 do 17 fosforotioatne veze i pri čemu svaki citozin je 5-metilcitozin.
[0291] U određenim slučajevima, ISIS 666922 je opisan sledećim hemijskim oznakama: Ges Geo Aeo Teo Aks mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCko Aes Ges mCe; u kojima, A = adenin,
mC = 5-metilcitozin
G = guanin,
T = timin,
e = 2'-O-metoksietilriboza modifikovani šećer,
k = cEt modifikovani šećer,
d = 2'-deoksiriboza šećer,
s = fosforotioatna internukleozidna veza i
o = fosfodiestarska internukleozidna veza.
[0292] U određenim slučajevima, ISIS 666922 je opisan sledećom hemijskom strukturom:
Struktura 5. ISIS 666922
6. ISIS 666869
[0293] U određenim slučajevima, ISIS 666869 je okarakterisan kao modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu (od 5' do 3') AGTGTTTAATGTTTATC (obuhvaćena ovde kao SEQ ID NO: 1173), koja se sastoji od sedamnaest nukleozida, pri čemu su svaki od nukleozida 1, 3, 14 i 16-17 nukleozidi sa modifikovanom 2'-O-metoksietilribozom, pri čemu su svaki od nukleozida 2, 4, 13 i 15 nukleozidi sa modifikovanim cEt, pri čemu su svaki od nukleozida 5-12 2'-deoksiribonukleozidi u kojima internukleozidne veze između nukleozida 2 do 3, 3 do 4, 13 do 14 i 14 do 15 su fosfodiestarske veze i internukleozidne veze između nukleozida 1 do 2, 4 do 5, 5 do 6, 6 do 7,
4
7 do 8, 8 do 9, 9 do 10, 10 do 11, 11 do 12, 12 do 13, 15 do 16 i 16 do 17 su fosforotioatne veze i pri čemu, svaki citozin je 5-metilcitozin.
[0294] U određenim slučajevima, ISIS 666869 je opisan sledećim hemijskim oznakama: Aes Gko Teo Gks Tds Tds Tds Ads Ads Tds Gds Tds Tko Teo Aks Tes mCe; u kojima,
A = adenin,
mC = 5-metilcitozin
G = guanin,
T = timin,
e = 2'-O-metoksietilriboza modifikovani šećer,
k = cEt modifikovani šećer,
d = 2'-deoksiriboza šećer,
s = fosforotioatna internukleozidna veza i
o = fosfodiestarska internukleozidna veza.
[0295] U određenim slučajevima, ISIS 666869 je opisan sledećom hemijskom strukturom:
Struktura 6. ISIS 666869
7. ISIS 666870
[0296] U određenim slučajevima, ISIS 666870 je okarakterisan kao modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu (od 5' do 3') AGTGTTTAATGTTTATC (obuhvaćena ovde kao SEQ ID NO: 1173), koja se sastoji od sedamnaest nukleozida, pri čemus u svaki od nukleozida 1, 3, 13-17 nukleozidi sa modifikovanom 2'-O-metoksietilribozom, pri čemu su svaki od nukleozida 2 i 4 nukleozidi sa modifikovanim cEt, pri čemu su svaki od nukleozida 5-12 2'-deoksiribonukleozidi, pri čemu su internukleozidne veze između nukleozida 2 do 3, 3 do 4, 13 do 14, i 14 do 15 fosfodiestarske veze i internukleozidne veze između nukleozida 1 do 2, 4 do 5, 5 do 6, 6 do 7, 7 do 8, 8 do 9, 9 do 10, 10 do 11, 11 do 12, 12 do 13, 15 do 16 i 16 do 17 su fosforotioatne veze, i pri čemu je svaki citozin 5-metilcitozin.
[0297] U određenim slučajevima, ISIS 666870 je opisan sledećim hemijskim oznakama: Aes Gko Teo Gks Tds Tds Tds Ads Ads Tds Gds Tds Teo Teo Aes Tes mCe; u kome,
A = adenin,
mC = 5-metilcitozin
G = guanin,
T = timin,
e = 2'-O-metoksietilriboza modifikovani šećer,
k = cEt modifikovani šećer,
d = 2'-deoksiriboza šećer,
s = fosforotioatna internukleozidna veza i
o = fosfodiestarska internukleozidna veza.
[0298] U određenim slučajevima, ISIS 666870 je opisan sledećom hemijskom strukturom:
Struktura 7. ISIS 666870
8. ISIS 666867
[0299] U određenim slučajevima, ISIS 666867 je okarakterisan kao modifikovani oligonukleotid koji ima nukleobaznu sekvencu (od 5' do 3') AGTGTTTAATGTTTATC (obuhvaćena ovde kao SEQ ID NO: 1173), koja se sastoji od sedamnaest nukleozida, pri čemu su svaki od nukleozida nukleozidi sa modifikovanom 1-2 i 13-17 2'-O-metoksietilribozom, pri čemu su svaki od nukleozida 3 i 4 nukleozidi sa modifikovanim cEt, pri čemu su svaki od nukleozida 5-12 2'-deoksiribonukleozidi, pri čemu su internukleozidne veze između nukleozida 2 do 3, 3 do 4, 13 do 14 i 14 do 15 su fosfodiestarske veze i internukleozidne veze između nukleozida 1 do 2, 4 do 5, 5 do 6, 6 do 7, 7 do 8, 8 do 9, 9 do 10, 10 do 11, 11 do 12, 12 do 13, 15 do 16 i 16 do 17 su fosforotioatne veze, i pri čemu je svaki citozin 5-metilcitozin.
[0300] U određenim slučajevima, ISIS 666867 je opisan sledećim hemijskim oznakama: Aes Geo Tko Gks Tds Tds Tds Ads Ads Tds Gds Tds Teo Teo Aes Tes mCe; gde,
A = adenin,
mC = 5-metilcitozin
G = guanin,
T = timin,
e = 2'-O-metoksietilriboza modifikovani šećer,
k = cEt modifikovani šećer,
d = 2'-deoksiriboza šećer,
s = fosforotioatna internukleozidna veza i
o = fosfodiestarska internukleozidna veza.
[0301] U određenim slučajevima, ISIS 666867 je opisan sledećom hemijskom strukturom:
Struktura 8. ISIS 666867
PRIMERI
Neograničavajuće otkriće i uključenje preko reference
[0302] Dok su određena jedinjenja, kompozicije i postupci opisani ovde opisani specifično u skladu sa određenim slučajevima, sledeći primeri služe samo za ilustraciju jedinjenja opisanih ovde i nisu namenjena da ograniče isti.
Primer 1: Inhibicija humane superoksid dismutaze 1, rastvorljive (SOD-1) u HepG2 ćelijama pomoću MOE gapmera
[0303] Modifikovani oligonukleotidi su dizajnirani za ciljno delovanje na superoksid dismutazu 1, rastvorljivu nukleinsku kiselinu (SOD-1) i testirani su za njihove efekte na iRNK SOD-1 in vitro. ISIS 146144, ISIS 146145, ISIS 150437, ISIS 150441, ISIS 150443, ISIS 150444, ISIS 150445, ISIS 150446, ISIS 150447, ISIS 150448, ISIS 150449, ISIS 150452, ISIS 150454, ISIS 150458, ISIS 150460, ISIS 150462-150467, ISIS 150470, ISIS 150472, ISIS 150474, ISIS 150475, ISIS 150476, ISIS 150479-150483, ISIS 150488, ISIS 150489, ISIS 150490, ISIS 150491-150493, ISIS 150495-150498, ISIS 150511, ISIS 333605, ISIS 333606, ISIS 333609-333617, ISIS 333619, ISIS 333620-333636, ISIS 333638 i ISIS 333640, prethodno otkriveni u WO 2005/040180, su takođe uključeni u ovu analizu. ISIS 333611, prethodno otkriven u WO 2005/040180, je takođe označen kao standardni ili uporedni oligonukleotid. ISIS 333611 je nedavno testiran u humanim kliničkim ispitivanjima. Videti, MILLER et al., "An antisense oligonucleotide against SOD1 delivered intrathecally for patients with SOD1 familial amyotrophic lateral sclerosis: a phase 1, randomised, first-inman study" Lancet Neurol. (2013) 12(5): 435-442.
[0304] Modifikovani oligonukleotidi su testirani u seriji eksperimenata koji su imali slične uslove kulture. Rezultati za svaki eksperiment su predstavljeni u posebnim tabelama prikazanim niže. Kultivisane HepG2 ćelije u gustini od 20,000 ćelija po bunarčiću su transficirane upotrebom elektroporacije sa 7,000 nM modifikovanog oligonukleotida. Posle perioda tretmana od približno 24 časa, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi iRNK SOD-1 su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu.
[0305] Set humane prajmer probe RTS3898 („forward“ sekvenca CTCTCAGGAGACCATTGCATCA, označena ovde kao SEQ ID NO: 11; reverzna sekvenca TCCTGTCTTTGTACTTTCTTCATTTCC; označena ove kao SEQ ID NO: 12; sekvenca probe CCGCACACTGGTGGTCCATGAAAA, označena ovde kao SEQ ID NO: 13) je korišćena za merenje nivoa iRNK. U slučajevima gde se oligonukleotid preklapa sa amplikonom seta prajmerske probe, alternativan set prajmerske probe, HTS90 („forward“ sekvenca CGTGGCCTAGCGAGTTATGG, označena ovde kao SEQ ID NO: 14; reverzna sekvenca GAAATTGATGATGCCCTGCA; označena ovde kao SEQ ID NO: 15; sekvenca probe ACGAAGGCCGTGTGCGTGCTGX, označena ovde kao SEQ ID NO: 16), korišćen je za merenje nivoa iRNK. Nivoi iRNK SOD-1 su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su prikazani kao procenat inhibicije SOD-1, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije. 'n.d.' označava da nivoi inhibicije nisu mereni upotrebom određenog seta prajmerske probe.
[0306] Novo dizajnirani modifikovani oligonukleotidi u Tabelama u daljem tekstu dizajnirani su kao 5-10-5 MOE gapmeri. 5-10-5 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, gde se centralni segment praznine sastoji od deset 2'-deoksiribonukleozida i preklapa se krilnim segmentima u 5' smeru i 3' smeru koji sadrže po pet nukleozida. Svaki nukleozid u 5' krilnom segmentu i svaki nukleozid u 3' krilnom segmentu ima 2'-MOE modifikaciju. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosforotioatne veze. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-metilcitozini. "Mesto početka" označava 5'-krajni nukleozid prema kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. "Mesto kraja" označava 3'-krajnji nukleozid prema kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer naveden u Tabelama niže je usmeren kao humanoj iRNK SOD-1, označenoj ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK Pristupni br. NM_000454.4) ili humanoj genomskoj sekvenci SOD-1, označenoj ovde kao SEQ ID NO: 2 (GENBANK Pristupni br. NT_011512.10 skraćenoj od nukleotida 18693000 do 18704000). 'n/a' označava da modifikovani oligonukleotid nije usmeren ka određenoj genskoj sekvenci sa 100% komplementarnosti.
Tabela 1
1
2
4
Tabela 2
Tabela 3
1
Tabela 4
2
4
Tabela 5
Tabela 6
1
Tabela 7
2
4
Tabela 8
Tabela 9
1
11
12
1
14 Tabela 10
1
1
1
Primer 2: Inhibicija humanog SOD-1 u HepG2 ćelijama pomoću MOE gapmera
[0307] Modifikovani oligonukleotidi dizajnirani su tako da ciljno deluju na superoksid dismutazu 1, rastvorljivu (SOD-1) nukleinsku kiselinu i testirani su za njihove efekte na iRNK SOD-1 in vitro. ISIS 146143, ISIS 150438-150440, ISIS 150442, ISIS 150450, ISIS 150455-150457, ISIS 150459, ISIS 150461, ISIS 150469, ISIS 150473, ISIS 150478, ISIS 150484, ISIS 150486, ISIS 150494, ISIS 150508-150510, ISIS 333607, ISIS 333608, ISIS 333611, ISIS 333618, prethodno otkriveni u WO 2005/040180, takođe su obuhvaćeni ovom analizom. Modifikovani oligonukleotidi su testirani u seriji eksperimenata koji su imali slične uslove kulture. Rezultati svakog eksperimenta predstavljeni su u odvojenim tabelama koje su prikazane u nastavku. Kultivisane HepG2 ćelije sa gustinom od 20000 ćelija po bunarčiću su transfiricirane korišćenjem elektroporacije sa 5000 nM modifikovanim oligonukleotidom. Posle perioda tretmana od otprilike 24 sata, izolovana je RNK iz ćelija i mereni su nivoi iRNK SOD-1 kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu.
[0308] Set humane prajmer probe RTS3898 je korišćen za merenje nivoa iRNK. U slučajevima gde se oligonukleotid preklapa sa amplikonom seta prajmer probe, alternativan set prajmer probe, HTS90, je korišćen zamerenje nivoa iRNK. Nivoi iRNK SOD-1 su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije SOD-1, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije. 'n.d.' označava da nivoi inhibicije nisu mereni upotrebom određenog seta prajmer probe.
[0309] Novo dizajnirani modifikovani oligonukleotidi u donjim tabelama dizajnirani su kao 5-10-5 MOE gapmeri. Gapmeri 5-10-5 MOE imaju dužinu od 20 nukleozida, pri čemu se segment centralne praznine sastoji od deset 2'-deoksiribonukleozida, a flankiran je krilnim
1
segmentima u smeru 5 'i 3' smerovima koji sadrže pet nukleozida svaki. Svaki nukleozid u segmentu krila 5' i svaki nukleozid u segmentu krila 3' ima modifikaciju 2'-MOE. Internukleozidne veze kroz svaki gapmer su fosforotioatne veze. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-metilcitozini. "Mesto početka" označava 5'-krajnji nukleozid na koji je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. "Mesto kraja" označava 3'-krajnji nukleozid na koji je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer naveden u donjim tabelama usmeren je na humanu iRNK SOD-1, koja je ovde označena kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni broj NM_000454.4), ili na humanu SOD-1 genomsku sekvencu, koja je ovde označena kao SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_011512.10 skraćena od nukleotida 18693000 do 18704000). 'n/a' ukazuje da modifikovani oligonukleotid ne deluje ciljno na tu određenu gensku sekvencu sa 100% komplementarnosti.
Tabela 11
1
11
Tabela 12
11
11
11
11
Primer 3: Inhibicija humanog SOD-1 u HepG2 ćelijama pomoću deoksi, MOE i cEt gapmera
11
[0310] Modifikovani oligonukleotidi dizajnirani su tako da ciljno deluju na superoksid dismutazu 1, rastvorljivu (SOD-1) nukleinsku kiselinu i testiraju se za njihove efekte na iRNK SOD-1 in vitro. ISIS 333611, koji je prethodno opisan u WO 2005/040180, uključen je kao standard. ISIS 590067, ISIS 590074, ISIS 590082, ISIS 590130, ISIS 590138 i ISIS 590146, koji su 5-10-5 MOE gapmeri kao što je gore opisano u Primeru 1, takođe su uključeni u ovu analizu. ISIS 590512, koji ima sličnu sekvencu kao ISIS 333611, ali sa modifikacijama deoksi, MOE i cEt šećera, takođe je uključen u ovo istraživanje.
[0311] Modifikovani oligonukleotidi su testirani u seriji eksperimenata koji su imali slične uslove kulture. Rezultati svakog eksperimenta predstavljeni su u odvojenim tabelama koje su prikazane u nastavku. Kultivisane HepG2 ćelije sa gustinom od 20000 ćelija po bunarčiću su transficirane korišćenjem elektroporacije sa 3000 nM modifikovanim oligonukleotidom. Posle perioda tretmana od otprilike 24 sata, izolovana je RNK iz ćelija, a nivoi iRNK SOD-1 su mereni kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu.
[0312] Set humane prajmer probe RTS3898 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi iRNK SOD-1 su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije SOD-1, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije. 'n.d.' označava da nivoi inhibicije nisu mereni.
[0313] Novo dizajnirani modifikovani oligonukleotidi u donjim tabelama dizajnirani su kao deoksi, MOE i cEt gapmeri. Gapmeri su nukleozidi dužine 17 nukleozida gde svaki nukleozid ima MOE šećernu modifikaciju, cEt šećernu modifikaciju ili deoksi grupu. Hemijski sastav šećera svakog oligonukleotida je označen kao u koloni Hemijski sastav, gde 'k' označava cEt modifikovani šećer; 'd' označava 2'-deoksiribozu; i 'e' označava 2'-MOE modifikovani šećer. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosforotioatne veze. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-metilcitozini. "Mesto početka" označava 5'-krajnji nukleozid ka kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. "Mesto kraja" označava 3'-krajnji nukleozid ka kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer naveden u tabelama u donjem tekstu je usmeren ka humanoj iRNK SOD-1, označenoj ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni broj. NM_000454.4) ili humanoj SOD-1 genomskoj sekvenci, označenoj ovde kao SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni broj. NT_011512.10 skraćen od nukleotida 18693000 do 18704000). 'n/a' označava da modifikovani oligonukleotid ne deluje ciljno na tu određenu gensku sekvencu sa 100% komplementarnošću.
Tabela 13
11
12
12
12
12
12
12
Tabela 14
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
Tabela 15
1
14
14
14
14
14
14
Tabela 16
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
Tabela 17
1
1
11
12
1
Primer 4: Inhibicija humanog SOD-1 u HepG2 ćelijama pomoću deoksi, MOE i cEt gapmera
[0314] Modifikovani oligonukleotidi su dizajnirani tako da ciljno deluju na superoksid dismutazu 1, rastvorljivu (SOD-1) nukleinsku kiselinu i testirani su za njihove efekte na iRNK SOD-1 in vitro. ISIS 333611, 5-10-5 MOE gapmer koji je prethodno opisan u WO 2005/040180, uključen je kao merilo.
1 4
[0315] Modifikovani oligonukleotidi su testirani u seriji eksperimenata koji su imali slične uslove kulture. Rezultati svakog eksperimenta predstavljeni su u odvojenim tabelama koje su prikazane u nastavku. Kultivisane ćelije HepG2 na gustini od 20000 ćelija po bunarčiću su transficirane koristeći elektroporaciju sa 4.000 nM modifikovanog oligonukleotida. Posle perioda tretmana od približno 24 sata, izolovana je RNK iz ćelija i mereni su nivoi iRNK SOD-1 su kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu.
[0316] Set humane prajmer probe RTS3898 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi iRNK SOD-1 su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije SOD-1, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije. 'n.d.' označava da nivoi inhibicije nisu mereni.
[0317] Novo-dizajnirani modifikovani oligonukleotidi u tabelama niže su dizajnirani kao deoksi, MOE i cEt gapmeri ili 5-10-5 gapmeri. 5-10-5 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu se segment centralne praznine sastoji od deset 2'-deoksiribonukleozida i preklopljen je krilnim segmentima u 5' smeru i 3' smeru koji sadrže po pet nukleozida. Svaki nukleozid u 5' krilnom segmentu i svaki nukleozid u 3' krilnom segmentu ima 2'-MOE modifikaciju. Deoksi, MOE i cEt oligonukleotidi su dužine 17 nukleozida, pri čemu nukleozid ima MOE šećernu modifikaciju, cEt šećernu modifikaciju ili deoksi grupu. Hemijski sastav šećera svakog oligonukleotida označen je kao u koloni pod nazivom Hemijski sastav, gde 'k' označava cEt modifikovani šećer; 'd' označava 2'-deoksiribozu; i 'e' označava 2'-MOE modifikovani šećer. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosforotioatne veze. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-metilcitozini. "Mesto početka" označava 5'-krajnji nukleozid prema kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer naveden u tabelama niže je usmeren na humanu iRNK SOD-1, označena ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_000454.4) ili humanu SOD-1 genomsku sekvencu, ovde označenu kao SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_011512.10 skraćen od nukleotida 18693000 do 18704000). 'n/a' označava da modifikovani oligonukleotid ne deluje ciljno na određenu gensku sekvencu sa 100% komplementarnosti.
Tabela 18
1
1
1
Tabela 19
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
Tabela 20
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
Primer 5: Inhibicija humanog SOD-1 u HepG2 ćelijama pomoću deoksi, MOE i cEt gapmera
[0318] Modifikovani oligonukleotidi koji ciljno deluju na SOD-1 nukleinsku kiselinu su dizajnirani i testirani za njihove efekte na iRNK SOD-1 in vitro. ISIS 333611, 5-10-5 MOE gapmer, koji je prethodno opisan u WO 2005/040180, je uključen kao merilo.
1
[0319] Modifikovani oligonukleotidi su testirani u seriji eksperimenata koji su imali slične uslove kultivisanja. Rezultati za svaki eksperiment su predstavljeni u posebnim tabelama prikazanim niže. Kultivisane HepG2 ćelije u gustini od 20000 ćelija po bunarčiću su transficirane upotrebom elektroporacije sa 5000 nM modifikovanim oligonukleotidom. Posle perioda tretmana od približno 24 časa, RNK je izolovan iz ćelija i nivoi iRNK SOD-1 su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu.
[0320] Set humane prajmer probe RTS3898 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi iRNK SOD-1 su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN®. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije SOD-1, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije. 'n.d.' označava da nivoi inhibicije nisu mereni.
[0321] Novo-dizajnirani modifikovani oligonukleotidi u Tabelama niže dizajnirani su kao deoksi, MOE i cEt gapmeri. Gapmeri su dužine od 17 nukleozida pri čemu svaki nukleozid ima MOE šećernu modifikaciju, cEt šećernu modifikaciju ili deoksi grupu. Hemijski sastav šećera svakog oligonukleotida je označen kao u koloni označenoj pod nazivom Hemijski sastav, gde 'k' označava cEt modifikovani šećer; 'd' označava 2'-deoksiroibozu; i 'e' označava 2'-MOE modifikovani šećer. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosforotioatne veze. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-metilcitozini. "Mesto početka" označava 5'-krajnji nukleozid prema kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer naveden u tabelama niže je usmeren ka humanoj iRNK SOD-1, označena ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_000454.4) ili humanoj SOD-1 genomskoj sekvenci, označenoj ovde kao SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_011512.10 skraćena iz nukleotida 18693000 do 18704000). 'n/a' označava da modifikovani oligonukleotid ne deluje ciljno na određenu gensku sekvencu sa 100% komplementarnošću.
Tabela 21
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
Tabela 22
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
Tabela 23
2
21
21
21
21
21
21
Primer 6: Inhibicija humanog SOD-1 zavisna od doze sa modifikovanim oligonukleotidima u HepG2 ćelijama
[0322] Gapmeri iz studija opisanih u prethodnom tekstu koji ispoljavaju značajnu in vitro inhibiciju iRNK SOD-1 su izabrani i testirani u različitim dozama u HepG2 ćelijama. Takođe su testirani standardno jedinjenje ISIS 333611 i druga jedinjenja prethodno otkrivena
21
u WO 2005/040180, uključujući ISIS 146144, 146145, 150445, 150446, 150447, 150454, 150463, 150465, 333606, 333609 i 333611.
[0323] Modifikovani oligonukleotidi su testirani u seriji eksperimenata koji su imali slične uslove kultivisanja. Rezultati za svaki eksperiment su predstavljeni u posebnim tabelama prikazanim niže. Ćelije su sipane u ploču pri gustini od 20000 ćelija po bunarčiću i transficirane upotrebom elektroporacije sa 0.813 µM, 1.625 µM, 3.250 µM, 6.500 µM i 13.000 µM koncentracija modifikovanog oligonukleotida, kao što je naznačeno u Tabelama niže. Posle perioda tretmana od približno 16 časova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi iRNK SOD-1 su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set humane prajmer probe RTS3898 je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi iRNK SOD-1 su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN<®>. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije SOD-1, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0324] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe predstavljena. Nivoi iRNK SOD-1 su značajno smanjeni na način zavisan od doze u ćelijama tretiranim modifikovanim oligonukleotidom.
Tabela 24
Tabela 25
22
Tabela 26
Tabela 27
Inhibicija iRNK SOD-1 zavisna od doze
Primer 7: Inhibicija humanog SOD-1 zavisna od doze sa modifikovanim oligonukleotidima u HepG2 ćelijama
[0325] Gapmeri iz studija opisanih u prethodnom tekstu koji ispoljavaju značajnu in vitro inhibiciju iRNK SOD-1 su selektovani i testirani na različitim dozama u HepG2 ćelijama. Takođe su testirani jedinjenje standard, ISIS 333611 i ISIS 333625, od kojih su oba prethodno otkrivena u WO 2005/040180.
[0326] Modifikovani oligonukleotidi su testirani u seriji eksperimenata koji su imali slične uslove kulture. Rezultati za svaki eksperiment su predstavljeni u posebnim tabelama prikazanim niže. Ćelije su sipane u ploču u gustini od 20 000 ćelija po bunarčiću i transficirane upotrebom elektroporacije sa 0.148 µM, 0.444 µM, 1.330 µM, 4.000 µM i 12.000 µM koncentracijama modifikovanog oligonukleotida, kao što je naznačeno u Tabelama niže. Posle perioda tretmana od približno 16 časova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi iRNK SOD-1 su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Setovi humane prajmer probe RTS3898 ili HTS90 su korišćeni za merenje nivoa iRNK. Nivoi iRNK SOD-1 su podešavani prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN<®>. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije SOD-1, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0327] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe predstavljena. Nivoi iRNK SOD-1 su značajno smanjeni na način zavisan od doze u ćelijama tretiranim modifikovanim oligonukleotidom.
Tabela 28
Tabela 29
22
Primer 8: Inhibicija humanog SOD-1 zavisna od doze sa modifikovanim oligonukleotidima u HepG2 ćelijama
[0328] Gapmeri iz studija opisanih u prethodnom tekstu koji ispoljavaju značajnu in vitro inhibiciju iRNK SOD-1 su selektovani i testirani na različitim dozama u HepG2 ćelijama. Takođe su testirani jedinjenje standard, ISIS 333611 i dodatna jedinjenja uključujući, ISIS 146143, 150442, 195753, 333607 i 333608, koja su prethodno otkrivena u WO 2005/040180.
[0329] Modifikovani oligonukleotidi su testirani u seriji eksperimenata koji su imali slične uslove kulture. Rezultati za svaki eksperiment su predstavljeni u posebnim tabelama prikazanim niže. Ćelije su sipane u ploču u gustini od 20 000 ćelija po bunarčiću i transficirane upotrebom elektroporacije sa 0.1875 µM, 0.7500 µM, 3.0000 µM, i 12.0000 µM koncentracijama modifikovanog oligonukleotida, kao što je naznačeno u Tabelama niže. Posle perioda tretmana od približno 16 časova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi iRNK SOD-1 su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Setovi humane prajmer probe RTS3898 su korišćeni za merenje nivoa iRNK. Nivoi iRNK SOD-1 su podešavani prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN<®>. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije SOD-1, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0330] Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe predstavljena. Nivoi iRNK SOD-1 su značajno smanjeni na način zavisan od doze u ćelijama tretiranim modifikovanim oligonukleotidom.
Tabela 30
Tabela 31
22
Tabela 32
22 Tabela 33
Tabela 34
22
Primer 9: Inhibicija humanog SOD-1 zavisna od doze u HepG2 ćelijama pomoću gapmera sa mešanim hemijskim sastavom osnovnog lanca
[0331] Dodatni gapmeri su dizajnirani na bazi sekvenci oligonukleotida otkrivenih u studijama opisanih u prethodnom tekstu. Oligonukleotidi su dizajnirani kao 5-10-5 MOE, 5-8-5 MOE, i deoksi, MOE i cEt oligonukleotidi. 5-10-5 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu se segment centralne praznine sastoji od deset 2'-deoksiribonukleozida i preklopljen je krilnim segmentima u 5' smeru i 3' smeru koji sadrže po pet nukleozida. 5-8-5 MOE gapmeri su dužine 18 nukleozida, pri čemu se segment centralne praznine sastoji od osam 2'-deoksiribonukleozida i preklopljen je krilnim segmentima u 5' smeru i 3' smeru koji sadrže po pet nukleozida. Svaki nukleozid u 5' krilnom segmentu i svaki nukleozid u 3' krilnom segmentu ima 2'-MOE modifikaciju. Deoksi, MOE i cEt oligonukleotidi su dužine 16 ili 17 nukleozida pri čemu svaki nukleozid ima MOE šećernu modifikaciju, cEt šećernu modifikaciju ili deoksi grupu. Hemijski sastav šećera svakog oligonukleotida je označen kao u koloni pod nazivom Hemijski sastav, gde 'k' označava cEt modifikovani šećer; 'd' označava 2'-deoksiribozu; i 'e' označava 2'-MOE modifikovani šećer. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosfodiestarske ili fosforotioatne veze. Internukleozidne veze svakog oligonukleotida su označene u koloni hemije osnovnog lanca, gde 'o' označava fosfodiestarsku vezu i 's' označava fosforotioatnu vezu. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-
22
metilcitozini. "Mesto početka" označava 5'-krajnji nukleozid prema kome je usmeren gapmer u humanoj genskoj sekvenci. "Mesto kraja" označava 3'-krajnji nukleozid prema kome je usmeren gapmer u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer naveden u tabelama niže je usmeren prema humanoj iRNK SOD-1, označenoj ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_000454.4) ili humanoj SOD-1 genomskoj sekvenci, označenoj ovde kao SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_011512.10 skraćenoj od nukleotida 18693000 do 18704000).
22
35 la abeT
[0332] Novo-dizajnirani oligonukleotidi su testirani u različitim dozama u HepG2 ćelijama. Modifikovani oligonukleotidi su testirani u seriji eksperimenata koji su imali slične uslove kulture. Rezultati za svaki eksperiment su predstavljeni u posebnim tabelama prikazanim niže. Ćelije su sipane u ploču u gustini od 20000 ćelija po bunarčiću i transficirane upotrebom elektroporacije sa 0.222 µM, 0.667 µM, 2.000 µM i 6.000 µM koncentracijama modifikovanog oligonukleotida, kao što je naznačeno u Tabelama niže. Posle perioda tretmana od približno 16 časova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi iRNK SOD-1 su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Setovi humane prajmer probe RTS3898 su korišćeni za merenje nivoa iRNK. Nivoi iRNK SOD-1 su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN<®>. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije SOD-1, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
[0333] Takođe je predstavljena polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida. Nivoi iRNK SOD-1 su značajno smanjeni na način zavisan od doze u ćelijama tretiranim modifikovanim oligonukleotidom.
Tabela 36
24
Tabela 37
Tabela 38
Tabela 39
24 Primer 10: Inhibicija humanog SOD-1 zavisna od doze pomoću gapmera sa mešanim hemijskim sastavom osnovnog lanca
[0334] Dodatni gapmeri su dizajnirani na bazi sekvenci oligonukleotida otkrivenih u studijama opisanih u prethodnom tekstu. Oligonukleotidi su dizajnirani kao deoksi, MOE i cEt oligonukleotidi. Deoksi, MOE i cEt oligonukleotidi su dužine 16 ili 17 nukleozida pri čemu svaki nukleozid ima MOE šećernu modifikaciju, cEt šećernu modifikaciju ili deoksi grupu. Hemijski sastav šećera svakog oligonukleotida je označen kao u koloni pod nazivom Hemijski sastav, gde 'k' označava cEt modifikovani šećer; 'd' označava 2'-deoksiribozu; i 'e' označava 2'-MOE modifikovani šećer. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosfodiestarske ili fosforotioatne veze. Internukleozidne veze svakog oligonukleotida su označene u koloni Hemijski sastav osnovnog lanca, gde 'o' označava fosfodiestarsku vezu i 's' označava fosforotioatnu vezu. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-metilcitozini. "Mesto početka" označava 5'-krajnji nukleozid prema kome je usmeren gapmer u humanoj genskoj sekvenci. "Mesto kraja" označava 3'-krajnji nukleozid prema kome je usmeren gapmer u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer naveden u tabelama niže je usmeren prema humanoj iRNK SOD-1, označenoj ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_000454.4) ili humanoj SOD-1 genomskoj sekvenci, označenoj ovde kao SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_011512.10 skraćenoj od nukleotida 18693000 do 18704000).
24
40 la abeT
[0335] Novo dizajnirani oligonukleotidi su testirani u različitim dozama u A431 ćelijama. Modifikovani oligonukleotidi su testirani u seriji eksperimenata koji su imali slične uslove kulture. Rezultati za svaki eksperiment su predstavljeni u posebnim tabelama prikazanim niže. Ćelije su sipane u ploču u gustini od 5000 ćelija po bunarčiću i modifikovani oligonukleotidi su dodati u medijum u 0.12 µM, 0.60 µM, 3.00 µM, i 15.00 µM koncentracijama modifikovanog oligonukleotida, za slobodan unos od strane ćelija, kao što je naznačeno u Tabelama niže. Posle perioda tretmana od približno 16 časova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi iRNK SOD-1 su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Setovi humane prajmer probe RTS3898 su korišćeni za merenje nivoa iRNK. Nivoi iRNK SOD-1 su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN<®>. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije SOD-1, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
Tabela 41
2
Tabela 42
Tabela 43
21
Tabela 44
22
Primer 11: Inhibicija humanog SOD-1 zavisna od doze pomoću gapmera sa mešanim hemijskim sastavom osnovnog lanca
[0336] Dodatni gapmeri su dizajnirani na osnovu sekvenci oligonukleotida otkrivenih u studijama opisanim u prethodnom tekstu. Oligonukleotidi su dizajnirani kao 5-10-5 MOE gapmeri, 4-8-5 MOE gapmeri, 5-8-5 MOE gapmeri, 5-8-7 MOE gapmeri, 6-8-6 MOE gapmeri, 6-9-5 MOE gapmeri ili deoksi, MOE i cEt oligonukleotidi.
[0337] 5-10-5 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu se segment centralne praznine sastoji od deset 2'-deoksinukleltida i preklapa se sa krilnim segmentima u 5' smeru i 3' smeru koji sadrže po pet nukleozida. 4-8-5 MOE gapmeri su dužine 17 nukleozida, pri čemu se segment centralne praznine sastoji od osam 2'-deoksiribonukleozida i preklapa se sa krilnim segmentima u 5' smeru i 3' smeru koji sadrže četiti i pet nukleozida respektivno.5-8-5 MOE gapmeri su dužine 18 nukleozida, pri čemu se segment centralne praznine sastoji od osam 2'-deoksinukleozida i preklapa se sa krilnim segmentima u 5' smeru i 3' smeru koji sadrže po pet nukleozida.5-8-7 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu se segment centralne praznine sastoji od osam 2'-deoksinukleozida i preklapa se sa krilnim segmentima u 5' smeru i 3' smeru koji sadrže pet i sedam nukleozida respektivno. 6-8-6 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu se segment centralne praznine sastoji od osam 2'-deoksinukleozida i preklapa se sa krilnim segmentima u 5' smeru i 3' smeru koji sadrže po šest nukleozida. 6-9-5 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu se segment centralne praznine sastoji od devet 2'-deoksinukleozida i preklapa se sa krilnim segmentima u 5' smeru i 3' smeru koji sadrže šest i pet nukleozida respektivno. Svaki nukleozid u 5' krilnom segmentu i svaki nukleozid u 3' krilnom segmentu ima 2'-MOE modifikaciju.
[0338] Deoksi, MOE i cEt oligonukleotidi su dužine 17 nukleozida pri čemu svaki nukleozid ima MOE šećernu modifikaciju, cEt šećernu modifikaciju, ili deoksi grupu. Hemijski sastav šećera svakog oligonukleotida je označen kao u koloni pod nazivom Hemijski sastav, gde 'k' označava cEt modifikovani šećer; 'd' označava 2'-deoksiribozu; i 'e' označava 2'-MOE modifikovani šećer.
2
[0339] Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosforodiestarske ili fosforotioatne veze. Internukleozidne veze svakog oligonukleotida su označene u koloni pod nazivom Hemijski sastav osnovnog lanca, gde 'o' označava fosfodiestarsku vezu i 's' označava fosforotioatnu vezu. Svi citozinski ostaci u svakom gapmeru su 5-metilcitozini. "Mesto početka" označava 5'-krajnji nukleozid prema kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. "Mesto kraja" označava 3'-krajnji nukleozid prema kome je usmerena humana genska sekvenca. Svaki gapmer naveden u tabelama niže je usmeren prema humanoj iRNK SOD-1, označenoj ovde kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_000454.4) ili humanoj SOD-1 genomskoj sekvenci, označenoj ovde kao SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_011512.10 skraćena od nukleotida 18693000 do 18704000).
2 4
45 a abel T
[0340] Novo-dizajnirani oligonukleotidi testirani su u različitim dozama u A431 ćelijama. Modifikovani oligonukleotidi su testirani u seriji eksperimenata koji su imali slične uslove kulture. Rezultati za svaki eksperiment su predstavljeni u posebnim tabelama prikazanim niže. Ćelije su sipane u ploču u gustini od 5000 ćelija po bunarčiću i modifikovani oligonukleotidi su dodati u medijum u 0.062 µM, 0.185 µM, 0.556 µM, 1.667 µM, 5.000 µM i 15.000 µM koncentracijama modifikovanog oligonukleotida, za slobodan unos od strane ćelija, kao što je naznačeno u Tabelama niže. Posle perioda tretmana od približno 16 časova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi iRNK SOD-1 su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Setovi humane prajmer probe RTS3898 su korišćeni za merenje nivoa iRNK. Nivoi iRNK SOD-1 su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN<®>. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije SOD-1, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
Tabela 46
Tabela 47
2
[0341] Novo dizajnirani oligonukleotidi takođe su testirani u različitim dozama u SH-SY5Y ćelijama. Modifikovani oligonukleotidi su testirani u seriji eksperimenata koji su imali slične uslove kulture. Rezultati za svaki eksperiment su predstavljeni u posebnim tabelama prikazanim niže. Ćelije su sipane u ploču u gustini od 20000 ćelija po bunarčiću i modifikovani oligonukleotidi su dodati u medijum u 0.062 µM, 0.185 µM, 0.556 µM, 1.667 µM, 5.000 µM i 15.000 µM koncentracijama modifikovanog oligonukleotida, kao što je naznačeno u Tabelama u daljem tekstu. Posle perioda tretmana od približno 16 časova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi iRNK SOD-1 su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Setovi humane prajmer probe RTS3898 su korišćeni za merenje nivoa iRNK. Nivoi iRNK SOD-1 su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN<®>. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije SOD-1, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.
Tabela 48
2 1
Tabela 49
Primer 12: Inhibicija humanog SOD-1 u modelu transgenog pacova
[0342] Gapmeri iz studija opisanih niže, uključujući standardno jedinjenje ISIS 333611, koje je prethodno otkriveno u WO 2005/040180, testirani su u modelu SOD-1 transgenog pacova (Taconic, kat# 2148-F i 2148-M). Ovi hemizogotni pacovi eksprimiraju humani SOD-1 u kičmenoj moždini.
[0343] Dodatni gapmeri su dizajnirani na bazi sekvenci oligonukleotida otkrivenih u studijama opisanih u prethodnom tekstu. Oligonukleotidi su dizajnirani kao 5-9-5 MOE
2 2
gapmeri, 5-10-5 MOE gapmeri ili deoksi, MOE i cEt oligonukleotidi. 5-9-5 MOE gapmeri su dužine 19 nukleozida, pri čemu se segment centralne praznine sastoji od devet 2'-deoksiribonukleozida i preklopljen je krilnim segmentima u 5' smeru i 3' smeru koji sadrže po pet nukleozida.5-10-5 MOE gapmeri su dužine 20 nukleozida, pri čemu se segment centralne praznine sastoji od deset 2'-deoksiribonukleozida i preklopljen je krilnim segmentima u 5' smeru i 3' smeru koji sadrže po pet nukleozida. Svaki nukleozid u 5' krilnom segmentu i svaki nukleozid u 3' krilnom segmentu ima 2'-MOE modifikaciju. Deoksi, MOE i cEt oligonukleotidi su dužine 17 nukleozida pri čemu svaki nukleozid ima MOE šećernu modifikaciju, cEt šećernu modifikaciju ili deoksi grupu. Hemijski sastav šećera svakog oligonukleotida je označen kao u koloni pod nazivom Hemijski sastav, gde 'k' označava cEt modifikovani šećer; 'd' označava 2'-deoksiribozu; i 'e' označava 2'-MOE modifikovani šećer. Internukleozidne veze u svakom gapmeru su fosfodiestarske veze ili fosforotioatne veze. Internukleozidne veze svakog oligonukleotida su označene u koloni pod nazivom Hemijski sastav osnovnog lanca, gde 'o' označava fosfodiestarsku vezu i 's' označava fosforotioatnu vezu. Svi citozinski ostaci u svakom oligonukleotidu su 5-metilcitozini. "Mesto početka" označava 5'-krajnji nukleozid prema kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. "Mesto kraja" označava 3'-krajnji nukleozid prema kome je gapmer usmeren u humanoj genskoj sekvenci. Svaki gapmer naveden u Tabeli niže je usmeren prema humanoj iRNK SOD-1, ovde označenoj kao SEQ ID NO: 1 (GENBANK pristupni br. NM_000454.4) ili humanoj SOD-1 genomskoj sekvenci, označenoj ovde kao SEQ ID NO: 2 (GENBANK pristupni br. NT_011512.10 skraćenoj od nukleotida 18693000 do 18704000).
2
50 a abel T
[0344] Modifikovani oligonukleotidi su testirani u seriji eksperimenata koji su imali slične uslove. Rezultati za svaki eksperiment su predstavljeni u posebnim tabelama prikazanim niže. Pacovima je intratekalno injektirano 30µL 16.67mg/ml rastvora modifikovanog oligonukleotida razblaženog u PBS (500 µg finalna doza). Kontrolnoj grupi pacova intratekalno je injektiran PBS. Procenjivani su nivoi inhibicije SOD-1 u lumbalnoj kičmenoj moždini, torakalnoj kičmenoj moždini i cervikalnoj kičmenoj moždini. Podaci su predstavljeni niže i pokazuju da je nekoliko modifikovanih oligonukleotida inhibiralo nivoe humanog SOD-1 u ovom modelu.
Tabela 51
Tabela 52
2 2
Tabela 53
2
Tabela 54
24
Tabela 55
2
Tabela 56
2
Tabela 57
Tabela 58
2
Tabela 59
2
Tabela 60
Tabela 61
2
Primer 13: Inhibicija humanog SOD-1 zavisna od doze sa modifikovanim oligonukleotidima u LLC-MK2 ćelijama
[0345] Gapmeri iz studija opisanih u prethodnom tekstu, uključujući standardno jedinjenje ISIS 333611, koje ispoljava značajnu in vitro inhibiciju iRNK SOD-1 selektovani su i testirani u različitim dozama u LLC-MK2 ćelijama. Unakrsna reaktivnost humanih modifikovanih oligonukleotida testiranih u ovoj studiji sa genomskom sekvencom rezus majmuna (komplement od GENBANK pristupni br. NW_001114168.1 skraćen od nukleotida 2258000 do 2271000, označen ovde kao SEQ ID NO: 3) je prikazana u Tabeli niže.
Tabela 62
2
[0346] Ćelije su sipane u ploču u gustini od 20000 ćelija po bunarčiću i transficirane upotrebom elektroporacije sa 0.078 µM, 0.156 µM, 0.313 µM, 0.625 µM, 1.25 µM, 2.50 µM, 5.00 µM i 10.000 µM koncentracijama modifikovanog oligonukleotida, kao što je naznačeno u Tabelama niže. Posle perioda tretmana od približno 16 časova, RNK je izolovana iz ćelija i nivoi iRNK SOD-1 su mereni pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu. Set prajmer probe RTS3121 („forward“ sekvenca TGGAGATAATACACAAGGCTGTACCA, označena ovde kao SEQ ID NO: 17; reverzna sekvenca CAACATGCCTCTCTTCATCCTTT, označena ovde kao SEQ ID NO: 18; sekvenca probe ATCCTCTATCCAGACAACACGGTGGGC, označena ovde kao SEQ ID NO: 19) je korišćen za merenje nivoa iRNK. Nivoi iRNK SOD-1 su podešeni prema ukupnom sadržaju RNK, kao što je mereno pomoću RIBOGREEN<®>. Rezultati su predstavljeni kao procenat inhibicije SOD-1, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije. Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) svakog oligonukleotida je takođe predstavljena. Kao što je predstavljena u Tabeli, nekoliko od novo-dizajniranih oligonukleotida su potentniji od standarda, ISIS 336611.
Tabela 63
2 1
Primer 14: Tolerabilnost SOD-1 modifikovanih oligonukleotida u modelu pacova
[0347] Gapmeri iz studija opisanih u prethodnom tekstu, uključujući standardno jedinjenje ISIS 333611, koje je prethodno otkriveno u WO 2005/040180, testirani su za tolerabilnost kod Sprague-Dawley pacova.
[0348] Modifikovani oligonukleotidi su testirani u seriji eksprimenata koji su imali slične uslove. Pacovima je intratekalno injektirano 3 mg jedne doze ISIS oligonukleotida. Kontrolnoj grupi pacova intratekalno je injektiran PBS. Akutna tolerabilnost je procenjivana 3 časa posle doze upotrebom funkcionalne opservacione baterije (FOB). Ovaj skor je korišćen za procenu akutne tolerabilnosti jedinjenja sa nižim skorovoima koji označavaju bolje tolerisana jedinjenja. Kontrolne životinje obično imaju skor od '0' ili '1'. 3 časa posle injekcije, pacovi su posmatrani postavljanjem svakog pacova na vrh kaveza i procenom određenih funkcija, dodeljujući broj od '0' ili '1' u zavisnosti od toga da li pacov ispoljava normalnu funkciju u regionu od interesa (0) ili ne (1) za svaku funkciju, i zatim dodajući ukupne skorove. Sedam regiona je procenjivano, uključujući rep, zadnje šape, zadnje noge, zadnji kraj, prednji kraj, prednje šape i glavu. Rezultati ocenjivanja su predstavljeni u Tabeli niže. Kao što je predstavljeno u Tabeli, nekoliko novo dizajniranih oligonukleotida pokazalo je veću akutnu tolerabilnost u poređenju sa standardom, ISIS 333611.
Tabela 64
2 2
2
24
2
2
2
2
2
[0349] Tolerabilnost je takođe procenjivana 8 nedelja posle doze merenjem nivoa IBA1, mikroglijalnog markera i GFAP, astrocitnog markera, u lumbalnom regionu kičmene moždine. Oba IBA1 i GFAP su markeri inflamacije CNS-a (Frank, MG, Brain Behav.
2
Immun. 2007, 21, 47-59), stoga što je viši nivo bilo kog markera, to je manja tolerabilnost antisens oligonukleotida u ovom modelu pacova.
[0350] Nivoi iRNK IBA1 su mereni sa setom prajmer probe rAIF1_LTS00219 („forward“ sekvenca AGGAGAAAAACAAAGAACACCAGAA, označena ovde kao SEQ ID NO: 5; reverzna sekvenca CAATTAGGGCAACTCAGAAATAGCT, označena ovde kao SEQ ID NO: 6; sekvenca probe CCAACTGGTCCCCCAGCCAAGA, označena ovde kao SEQ ID NO: 7). Nivoi iRNK GFAP su mereni sa setom prajmer probe mGFAP_LTS00370 („forward“ sekvenca GAAACCAGCCTGGACACCAA, označena ovde kao SEQ ID NO: 8; reverzna sekvenca TCCACAGTCTTTACCACGATGTTC, označena ovde kao SEQ ID NO: 9; sekvenca probe TCCGTGTCAGAAGGCCACCTCAAGA, označena ovde kao SEQ ID NO: 10).
[0351] Rezultati su predstavljeni u Tabeli niže. Kao što je predstavljeno u Tabeli, nekoliko novo dizajniranih oligonukleotida su bili tolerabilniji u poređenju sa standardom, ISIS 333611.
Tabela 65
2 1
22
2
Primer 15: Inhibicija humanog SOD-1 zavisna od doze u transgenom modelu pacova
[0352] Gapmeri iz studija opisanih u prethodnom tekstu, uključujući standardno jedinjenje ISIS 333611, testirani su u SOD-1 transgenom pacovskom modelu (Taconic, kat.# 2148-F i 2148-M). Ovi hemizogotni pacovi eksprimiraju mutantni humani SOD-1 u kičmenoj moždini, mnogim regionima mozga i perifernim organima.
[0353] Pacovima je intratekalno injektirano 10, 30, 100, 300, 1000 ili 3000 µg gapmera navedenog u Tabeli niže ili samo PBS. Dve nedelje kasnije, životinje su žrtvovane. Inhibicija iRNK SOD-1 u lumbalnoj kičmenoj moždini, cervikalnoj kičmenoj moždini, rostralnom korteksu i kaudalnom korteksu procenjivana je pomoću RT-PCR upotrebom seta prajmer probe RTS3898, opisanog u primeru 1. Podaci su predstavljeni niže kao ED50vrednosti i pokazuju da su oligonukleotidi inhibirali iRNK SOD1 u višestrukim tkivima CNS-a potentnije od Isis 333611. Zaista, ED50vrednosti za ISIS br. 333611 čak nisu mogle biti izračunate, kao što je pokazano unosom "n/a," zbog toga što čak najviša testirana koncentracija (3000 µg) nije inhibirala iRNK SOD-1 više od 55-65%. "n.d." označava da nema dostupnih podataka za naznačeni uzorak.
Tabela 66
Primer 16: Tolerabilnost SOD-1 modifikovanih oligonukleotida kod pacova
2 4
[0354] Gapmeri iz studija opisanih u prethodnom tekstu, uključujući standardno jedinjenje ISIS 333611, testirani su za tolerabilnost kod Sprague-Dawley pacova. Grupe od 4 do 6 pacova su injektirane intratekalno sa 1 mg ili 3 mg jedne doze ISIS oligonukleotida. Kontrolnoj grupi pacova je intratekalno injektiran PBS. Akutna tolerabilnost je procenjivana 3 časa posle doze, kao što je opisano u primeru 14. Rezultati za dozu od 1 mg su srednje vrednosti za svaku grupu posle jednog eksperimenta. Rezultati za dozu od 3 mg su srednje vrednosti za svaku grupu u dva ponovljena eksperimenta. Rezultati studije, predstavljeni u Tabeli niže, pokazuju da su nekoliko novo-dizajniranih oligonukleotida bili tolerabilniji od standarda, ISIS 333611.
Tabela 67
Primer 17: Inhibicija humanog SOD-1 zavisna od doze u transgenom mišjem modelu
[0355] U cilju potvrde rezultata dobijenih kod transgenih pacova kod drugih vrsta, gapmeri iz studija opisanih u prethodnom tekstu su testirani u transgenom mišjem modelu SOD-1 koji eksprimira isti G93A humani mutantni SOD1 gen koji eksprimira transgeni pacov (videti Primere 12 i 15).
[0356] Miševi su primili intracerebralni ventrikularni bolus (ICVB) od 10, 30, 100, 300 ili 700 µg gapmera navedenog u Tabeli niže ili PBS. Dve nedelje kasnije, životinje su žrtvovane. Inhibicija iRNK SOD-1 u lumbalnoj kičmenoj moždini i kortekstu procenjivana je pomoću RT-PCR upotrebom seta prajmer probe RTS3898, opisanog u Primeru 1. Podaci su predstavljeni niže kao ED50vrednosti, i pokazuju da su oligonukleotidi inhibirali iRNK SOD1 potentnije od Isis 333611 i kod pacova i kod miševa.
2
Tabela 68
Primer 18: Tolerabilnost SOD-1 modifikovanih oligonukleotida kod miševa
[0357] Gapmeri iz studija opisanih u prethodnom tekstu, uključujući standardno jedinjenje ISIS 333611, testirani su za tolerabilnost kod C57bl6 miševa. Miševima je stereotaksično injektirano u cerebralne ventrikule 700ug jedne doze ISIS oligonukleotida. Kontrolna grupa miševa je injektirana u cerebralnu ventrikulu sa PBS. Akutna tolerabilnost je procenjivana na 3 časa posle injekcije upotrebom funkcionalne opservacione baterije (FOB) različite od opne koja je korišćena za pacove. Svaki miš je procenjivan prema 7 različitih kriterijuma. 7 kriterijuma su (1) miš je bio bistar, oprezan i responsivan; (2) miš je stajao ili pogrbljen bez stimulusa; (3) miš pokazuje svako kretanje vez stimulusa (4) miš pokazuje kretanje unapred pošto je podignut; (5) miš pokazuje svaki pokret pošto je podignut; (6) miš ima odgovor kada je rep uštinut; (7) pravilno disanje. Za svaki od 7 različitih kriterijuma, svaki miš je dobio subskor od 0 ako je ispunio kriterijum ili 1 ako nije. Pošto su procenivani svih 7 kriterijuma, the sub-skorovi su rezimirani za svakog miša i zatim je određena srednja vrednost za svaku grupu. Na primer, ako je miš bio bistar, oprezan i responsivan 3 časa posle 700 µg ICV doze, i ispunjavaio sve druge kriterijume, on bi dobio zbirni skor od 0. Ako drugi miš nije bio bistar, oprezan i responsivan 3 časa posle 700 µg ICV doze, ali je ispunjavao sve druge kriterijume, on bi primio skor od 1. Miševi tretirani fiziološkim rastvorom generalno su primali skor od 0. Skor na vršnom kraju opsega bi sugerisao akutnu toksičnost.
[0358] Telesna težina je merena tokom studije i prikazana je niže kao procenat promene 8 nedelja od početka. Dugotrajna tolerabilnost je procenjivana 8 nedelja posle doze merenjem nivoa IBA1 i GFAP, kao što je opisano u primeru 14. Nivoi iRNK IBA1 i GFAP su prikazani u odnosu na životinje tretirane sa PBS. Rezultati studije, predstavljeni u tabelama niže, pokazuju da su nekoliko novo-dizajniranih oligonukleotida bili tolerabilniji, kod pacova i miševa, u poređenju sa standardom, ISIS 333611.
2
Tabela 69
Tabela 70
Primer 19: Inhibicija majmunskog SOD-1 zavisna od doze kod makaki majmuna
[0359] ISIS br. 666853 je testiran kod makaki majmuna. Postojalo je jedno nepoklapanje između ISIS br. 666853 i SOD-1 makaki majmuna, i ima 17 kontinuiranih baza u ISIS br.
666853 koje su 100% komplementarne sa SOD-1 makaki majmuna.
[0360] Grupe od 6-10 mužjaka i ženki majmuna primile su intratekalni lumbalni bolus od PBS ili 4, 12 ili 35 mg ISIS br. 666853 na dane 1, 14, 28, 56 i 84 studije. Svaka grupa je primila istu dozu svakog od pet dana doziranja. Na dan 91, životinje su žrtvovane. Inhibicija iRNK SOD-1 u lumbalnom, torakalnom i cervikalnom delu kimčmene moždine i frontalnom korteksu, motornom korteksu, hipokampusu, ponsu i cerebelumu procenjivano je pomoću RT-PCR upotrebom seta prajmer probe RTS3898. Podaci su predstavljeni niže kao srednja vrednost procenta inhibicije za svaku grupu tretmana, u odnosu na grupu tretiranu sa PBS. Rezultati pokazuju da je ISIS br. 666853 inhibirao iRNK SOD-1 u višestrukim ciljnim tkivima kod makaki majmuna.
2
[0361] Tretman sa 666853 je dobro tolerisan tokom studije u trajanju od 13 nedelja i nije bilo kliničkih zapažanja štetnih reakcija kod majmuna.
Tabela 71
2
2
�
�
�
�
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
41
41
41
41
41
41
41
42
42
42
42
42
42
42
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
44
44
44
44
44
44
44
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4

Claims (10)

Patentni zahtevi
1. Antisens jedinjenje prema sledećoj formuli:
mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te (nukleobazna sekvenca SEQ ID NO: 725) naznačeno time, što je
A = adenin,
mC = 5-metilcitozin,
G = guanin,
T = timin,
e = 2'-O-metoksietilribozom modifikovani šećer,
d = 2'-deoksiriboza šećer,
s = fosforotioatna internukleozidna veza, i
o = fosfodiestarska internukleozidna veza;
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
2. Antisens jedinjenje prema patentnom zahtevu 1.
3. Farmaceutski prihvatljiva so antisens jedinjenja prema patentnom zahtevu 1.
4. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antisens jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so prema patentnom zahtevu 1, antisens jedinjenje prema patentnom zahtevu 2 ili farmaceutski prihvatljivu so prema patentnom zahtevu 3, i najmanje jedan od farmaceutski prihvatljivog nosača ili razblaživača.
5. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 4, naznačena time, što je farmaceutski prihvatljiv razblaživač fosfatno-puferisani fiziološki rastvor.
6. Antisens jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema patentnom zahtevu 1, antisens jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, farmaceutski prihvatljiva so prema patentnom zahtevu 3, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 4 ili 5, za upotrebu u terapiji humanog subjekta.
7. Antisens jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema patentnom zahtevu 1, antisens jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, farmaceutski prihvatljiva so prema patentnom
4
zahtevu 3, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 4 ili 5, za upotrebu u lečenju bolesti povezane sa SOD-1.
8. Antisens jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema patentnom zahtevu 1, antisens jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, farmaceutski prihvatljiva so prema patentnom zahtevu 3, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 4 ili 5, za upotrebu u prevenciji bolesti povezane sa SOD-1.
9. Antisens jedinjenje, farmaceutski prihvatljiva so, ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili 8, naznačeni time, što je bolest povezana sa SOD-1 neurodegenerativni poremećaj.
10. Antisens jedinjenje, farmaceutski prihvatljiva so, ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili 8, naznačeni time, što je bolest povezana sa SOD-1 amiotrofna lateralna skleroza.
Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5
4
RS20201004A 2014-04-01 2015-04-01 Kompozicije za modulaciju ekspresije sod-1 RS60707B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461973803P 2014-04-01 2014-04-01
EP15773965.7A EP3126499B1 (en) 2014-04-01 2015-04-01 Compositions for modulating sod-1 expression
PCT/US2015/023934 WO2015153800A2 (en) 2014-04-01 2015-04-01 Compositions for modulating sod-1 expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60707B1 true RS60707B1 (sr) 2020-09-30

Family

ID=54241435

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220767A RS63487B1 (sr) 2014-04-01 2015-04-01 Kompozicije za modulaciju ekspresije sod-1
RS20201004A RS60707B1 (sr) 2014-04-01 2015-04-01 Kompozicije za modulaciju ekspresije sod-1

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220767A RS63487B1 (sr) 2014-04-01 2015-04-01 Kompozicije za modulaciju ekspresije sod-1

Country Status (30)

Country Link
US (3) US10385341B2 (sr)
EP (3) EP4137573A3 (sr)
JP (6) JP6622214B2 (sr)
KR (6) KR20230085222A (sr)
CN (2) CN111440798A (sr)
AU (4) AU2015240761B2 (sr)
BR (1) BR112016021848B1 (sr)
CA (1) CA2942394A1 (sr)
CL (3) CL2016002509A1 (sr)
CY (1) CY1123288T1 (sr)
DK (2) DK3126499T3 (sr)
ES (2) ES2926869T3 (sr)
FI (1) FIC20240035I1 (sr)
FR (1) FR24C1039I2 (sr)
HR (2) HRP20220798T1 (sr)
HU (3) HUE050704T2 (sr)
IL (2) IL247714B (sr)
LT (3) LT3757214T (sr)
MX (2) MX373908B (sr)
MY (2) MY175665A (sr)
NL (1) NL301293I2 (sr)
NZ (1) NZ724100A (sr)
PL (2) PL3126499T3 (sr)
PT (2) PT3126499T (sr)
RS (2) RS63487B1 (sr)
RU (1) RU2704619C2 (sr)
SG (3) SG10201906520RA (sr)
SI (2) SI3757214T1 (sr)
SM (2) SMT202200479T1 (sr)
WO (1) WO2015153800A2 (sr)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI3757214T1 (sl) 2014-04-01 2022-08-31 Biogen Ma Inc. Sestave za moduliranje izražanja SOD-1
CA2955285C (en) * 2014-07-31 2023-09-26 Association Institut De Myologie Treatment of amyotrophic lateral sclerosis
RU2020108189A (ru) 2014-11-14 2020-03-11 Вояджер Терапьютикс, Инк. Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (als)
MX2017006217A (es) 2014-11-14 2018-05-02 Voyager Therapeutics Inc Polinucleotidos moduladores.
AU2017267665C1 (en) 2016-05-18 2023-10-05 Voyager Therapeutics, Inc. Modulatory polynucleotides
BR112018075667B1 (pt) 2016-06-14 2024-02-20 Biogen Ma, Inc Métodos para separar um oligonucleotídeo alvo de uma mistura contendo o oligonucleotídeo alvo e uma impureza relacionada com o produto
ES2999138T3 (en) 2016-06-24 2025-02-24 Biogen Ma Inc Synthesis of thiolated oligonucleotides without a capping step
CA3061652A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
US20210172963A1 (en) * 2017-05-26 2021-06-10 University Of Miami Determining onset of amyotrophic lateral sclerosis
CN111479924B (zh) 2017-10-16 2024-06-14 沃雅戈治疗公司 肌萎缩性侧索硬化症(als)的治疗
US20200237799A1 (en) 2017-10-16 2020-07-30 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
AU2019211446B2 (en) 2018-01-25 2025-07-03 Biogen Ma Inc. Methods of treating spinal muscular atrophy
TWI833770B (zh) * 2018-06-27 2024-03-01 美商Ionis製藥公司 用於減少 lrrk2 表現之化合物及方法
EP3884053A4 (en) * 2018-11-21 2023-02-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. COMPOUNDS AND METHODS FOR REDUCING PRION EXPRESSION
MA54383A (fr) * 2018-12-06 2021-10-13 Biogen Ma Inc Protéine neurofilamenteuse pour guider une intervention thérapeutique dans la sclérose laterale amyotrophique
TWI906204B (zh) * 2018-12-14 2025-12-01 美商百健Ｍａ公司 用於治療及預防肌肉萎縮性脊髓側索硬化症之組合物及方法
CA3134683A1 (en) * 2019-03-26 2020-10-01 Rutgers, The State University Of New Jersey Compositions and methods for treating neurodegenerative disorders
US20220315930A1 (en) * 2019-05-01 2022-10-06 Black Swan Pharmaceuticals, Inc. Treatment for sod1 associated disease
EP3966328A4 (en) 2019-05-06 2023-10-18 University Of Massachusetts Anti-c9orf72 oligonucleotides and related methods
AU2020268415A1 (en) 2019-05-08 2021-12-23 Biogen Ma Inc. Convergent liquid phase syntheses of oligonucleotides
US20220243203A1 (en) * 2019-05-28 2022-08-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing fus expression
EP4291654A2 (en) 2021-02-12 2023-12-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Superoxide dismutase 1 (sod1) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing superoxide dismutase 1- (sod1-) associated neurodegenerative diseases
EP4314294A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Biogen MA Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis
CN117337168A (zh) 2021-04-01 2024-01-02 渤健马萨诸塞州股份有限公司 向中枢神经系统的核酸递送
US20230193281A1 (en) * 2021-11-08 2023-06-22 University Of Massachusetts Oligonucleotides for sod1 modulation
CN114369130B (zh) * 2021-12-28 2023-10-03 杭州天龙药业有限公司 修饰的硫代寡核苷酸及其应用
CN119730859A (zh) 2022-06-15 2025-03-28 箭头药业股份有限公司 用于抑制超氧化物歧化酶1(SOD1)表达的RNAi剂、其组合物及使用方法
KR20240038469A (ko) 2022-09-16 2024-03-25 김정훈 사용자 콘텐츠 기반 홍보 서비스 제공 장치 및 방법
CN120202298A (zh) * 2023-08-29 2025-06-24 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 一种抑制sod1基因表达的dsRNA分子及其应用
WO2025126158A2 (en) * 2023-12-15 2025-06-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods comprising small nuclear rna (snrna) targeting sod1
KR102893298B1 (ko) * 2024-12-19 2025-12-04 주식회사 에이비파트너스 항산화 효능을 가지는 리포좀 기반의 mRNA 전달 시스템 및 이의 용도

Family Cites Families (221)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US5132418A (en) 1980-02-29 1992-07-21 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
DE3329892A1 (de) 1983-08-18 1985-03-07 Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
USRE34036E (en) 1984-06-06 1992-08-18 National Research Development Corporation Data transmission using a transparent tone-in band system
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
EP0260032B1 (en) 1986-09-08 1994-01-26 Ajinomoto Co., Inc. Compounds for the cleavage at a specific position of RNA, oligomers employed for the formation of said compounds, and starting materials for the synthesis of said oligomers
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
EP0366685B1 (en) 1987-06-24 1994-10-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
ATE151467T1 (de) 1987-11-30 1997-04-15 Univ Iowa Res Found Durch modifikationen an der 3'-terminalen phosphodiesterbindung stabilisierte dna moleküle, ihre verwendung als nukleinsäuresonden sowie als therapeutische mittel zur hemmung der expression spezifischer zielgene
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
WO1990005181A1 (de) 1988-11-07 1990-05-17 Cl-Pharma Aktiengesellschaft REINIGUNG VON Cu/Zn-SUPEROXIDDISMUTASE
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5721218A (en) 1989-10-23 1998-02-24 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides with inverted polarity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
EP0497875B1 (en) 1989-10-24 2000-03-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2' modified oligonucleotides
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US6005087A (en) 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5457191A (en) 1990-01-11 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5859221A (en) 1990-01-11 1999-01-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US7101993B1 (en) 1990-01-11 2006-09-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides containing 2′-O-modified purines
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5536638A (en) 1990-04-18 1996-07-16 N.V. Innogenetics S.A. Hybridization probes derived from the spacer region between the 16S and 23S rRNA genes for the detection of Neisseria gonorrhoeae
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
DE69032425T2 (de) 1990-05-11 1998-11-26 Microprobe Corp., Bothell, Wash. Teststreifen zum Eintauchen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Oligonucleotiden
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5223618A (en) 1990-08-13 1993-06-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
EP0544824B1 (en) 1990-07-27 1997-06-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
ES2083593T3 (es) 1990-08-03 1996-04-16 Sterling Winthrop Inc Compuestos y metodos para inhibir la expresion de genes.
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US5948903A (en) 1991-01-11 1999-09-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of 3-deazapurines
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
ES2103918T3 (es) 1991-10-17 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios.
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
AU3222793A (en) 1991-11-26 1993-06-28 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US6784290B1 (en) 1992-10-05 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of ras
EP0673559A1 (en) 1992-12-14 1995-09-27 Honeywell Inc. Motor system with individually controlled redundant windings
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US5843641A (en) * 1993-02-26 1998-12-01 Massachusetts Institute Of Technology Methods for the daignosis, of familial amyotrophic lateral sclerosis
GB9304620D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Compounds
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
AU6449394A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
AU6412794A (en) 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
PT733059E (pt) 1993-12-09 2001-03-30 Univ Jefferson Compostos e metodos para mutacoes dirigidas ao local em celulas eucarioticas
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5877021A (en) 1995-07-07 1999-03-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. B7-1 targeted ribozymes
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
JP2000501414A (ja) 1995-11-22 2000-02-08 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー 生体分子の細胞取り込みを高めるリガンド
AU1430097A (en) 1996-01-16 1997-08-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of methoxy nucleosides and enzymatic nucleic acid molecules
WO1997031012A1 (en) 1996-02-22 1997-08-28 The Regents Of The University Of Michigan Gene specific universal mammalian sequence-tagged sites
US6077833A (en) 1996-12-31 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
USRE44779E1 (en) 1997-03-07 2014-02-25 Santaris Pharma A/S Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogues
US6352829B1 (en) 1997-05-21 2002-03-05 Clontech Laboratories, Inc. Methods of assaying differential expression
US5994076A (en) 1997-05-21 1999-11-30 Clontech Laboratories, Inc. Methods of assaying differential expression
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
DE69829760T3 (de) 1997-09-12 2016-04-14 Exiqon A/S Bi- und tri-zyklische - nukleosid, nukleotid und oligonukleotid-analoga
US20030228597A1 (en) 1998-04-13 2003-12-11 Cowsert Lex M. Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
KR100573231B1 (ko) 1999-02-12 2006-04-24 상꾜 가부시키가이샤 신규 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드 유사체
US5998148A (en) 1999-04-08 1999-12-07 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of microtubule-associated protein 4 expression
AU776362B2 (en) 1999-05-04 2004-09-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S L-ribo-LNA analogues
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US9029523B2 (en) 2000-04-26 2015-05-12 Ceres, Inc. Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof
JP4151751B2 (ja) 1999-07-22 2008-09-17 第一三共株式会社 新規ビシクロヌクレオシド類縁体
EP1244667B1 (en) 1999-12-30 2006-04-05 K.U. Leuven Research & Development Cyclohexene nucleic acids
US6303374B1 (en) 2000-01-18 2001-10-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of caspase 3 expression
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
AU2001250572A1 (en) 2000-04-07 2001-10-23 Epigenomics Ag Detection of single nucleotide polymorphisms (snp's) and cytosine-methylations
US20020106348A1 (en) 2000-07-12 2002-08-08 Peng Huang Cancer therapeutics involving the administration of 2-methoxyestradiol and an agent that increases intracellular superoxide anion
AU2001282522A1 (en) 2000-08-29 2002-03-13 Takeshi Imanishi Novel nucleoside analogs and oligonucleotide derivatives containing these analogs
IL155450A0 (en) 2000-10-20 2003-11-23 Expression Diagnostics Inc Leukocyte expression profiling
US6426220B1 (en) 2000-10-30 2002-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of calreticulin expression
WO2002040498A2 (en) 2000-11-14 2002-05-23 University Of Iowa Research Foundation Reduction of antioxidant enzyme levels in tumor cells using antisense oligonucleotides
WO2002043771A2 (en) 2000-12-01 2002-06-06 Cell Works Inc. Conjugates of glycosylated/galactosylated peptide
KR100909681B1 (ko) 2000-12-01 2009-07-29 막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우. Ｒｎａ 간섭을 매개하는 작은 ｒｎａ 분자
US20050019915A1 (en) 2001-06-21 2005-01-27 Bennett C. Frank Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
CA2451643C (en) 2001-06-21 2012-11-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
US20030158403A1 (en) 2001-07-03 2003-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US20030175906A1 (en) 2001-07-03 2003-09-18 Muthiah Manoharan Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
CA2452458A1 (en) 2001-07-03 2003-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
CA2459347C (en) 2001-09-04 2012-10-09 Exiqon A/S Locked nucleic acid (lna) compositions and uses thereof
JP2003319198A (ja) 2002-04-19 2003-11-07 Orion Denki Kk Ｘ線プロテクタ装置
EP1567539B1 (en) * 2002-11-04 2009-09-23 University of Massachusetts Allele-specific rna interference
AU2003295387A1 (en) 2002-11-05 2004-06-03 Isis Parmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
EP1562971B1 (en) 2002-11-05 2014-02-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US8090542B2 (en) 2002-11-14 2012-01-03 Dharmacon Inc. Functional and hyperfunctional siRNA
US7655785B1 (en) 2002-11-14 2010-02-02 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory oligonucleotides and uses thereof
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
US7723509B2 (en) 2003-04-17 2010-05-25 Alnylam Pharmaceuticals IRNA agents with biocleavable tethers
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
WO2005013901A2 (en) * 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
US7888497B2 (en) 2003-08-13 2011-02-15 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory oligonucleotides and uses thereof
DK1661905T3 (da) 2003-08-28 2012-07-23 Takeshi Imanishi Hidtil ukendte syntetiske nukleinsyrer af N-O-krydsbindingstype
AU2004274021B2 (en) 2003-09-18 2009-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-thionucleosides and oligomeric compounds
US20050118625A1 (en) 2003-10-02 2005-06-02 Mounts William M. Nucleic acid arrays for detecting gene expression associated with human osteoarthritis and human proteases
US20050244851A1 (en) 2004-01-13 2005-11-03 Affymetrix, Inc. Methods of analysis of alternative splicing in human
CA2569419A1 (en) 2004-06-03 2005-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
US20080261905A1 (en) 2004-11-08 2008-10-23 K.U. Leuven Research And Development Modified Nucleosides for Rna Interference
WO2006066203A2 (en) 2004-12-16 2006-06-22 Alsgen, Llc Small interfering rna (sirna) molecules for modulating superoxide dismutase (sod)
US20060148740A1 (en) 2005-01-05 2006-07-06 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
AU2007210034A1 (en) 2006-01-26 2007-08-09 University Of Massachusetts RNA silencing agents for use in therapy and nanotransporters for efficient delivery of same
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
CA2640171C (en) 2006-01-27 2014-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
JP5441688B2 (ja) 2006-05-11 2014-03-12 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ５’修飾二環式核酸類似体
DK2092065T4 (da) 2006-10-18 2019-10-21 Ionis Pharmaceuticals Inc Antisense-forbindelser
WO2008101157A1 (en) 2007-02-15 2008-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted-2'-f modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP2170917B1 (en) 2007-05-30 2012-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
ES2386492T3 (es) 2007-06-08 2012-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos carbocíclicos
CN101796062B (zh) 2007-07-05 2014-07-30 Isis制药公司 6-双取代双环核酸类似物
JP5572090B2 (ja) 2007-08-15 2014-08-13 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド テトラヒドロピラン核酸類似体
US20090130195A1 (en) 2007-10-17 2009-05-21 Mildred Acevedo-Duncan Prostate carcinogenesis predictor
WO2009067647A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic alpha-l-bicyclic nucleic acid analogs
CA2910760C (en) 2007-12-04 2019-07-09 Muthiah Manoharan Targeting lipids
EP2265627A2 (en) 2008-02-07 2010-12-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs
US10131904B2 (en) * 2008-02-11 2018-11-20 Rxi Pharmaceuticals Corporation Modified RNAi polynucleotides and uses thereof
WO2009126933A2 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
DK2356129T3 (da) 2008-09-24 2013-05-13 Isis Pharmaceuticals Inc Substituerede alpha-L-bicykliske nukleosider
DK2361256T3 (da) 2008-09-24 2013-07-01 Isis Pharmaceuticals Inc Cyclohexenyl-nukleinsyreanaloger
WO2011017521A2 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
US9102938B2 (en) 2010-04-01 2015-08-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 2′ and 5′ modified monomers and oligonucleotides
JP2013527148A (ja) 2010-04-07 2013-06-27 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｃｅｔｐ発現の調節
US10913767B2 (en) 2010-04-22 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
US9725479B2 (en) * 2010-04-22 2017-08-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5′-end derivatives
AU2011302152B2 (en) 2010-09-15 2015-06-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified iRNA agents
EP3467109A1 (en) 2011-02-08 2019-04-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
MX347253B (es) * 2011-04-21 2017-04-20 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulación de la expresión del virus de hepatitis b (vhb).
US10023861B2 (en) 2011-08-29 2018-07-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
WO2013159108A2 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
US20150141320A1 (en) 2012-05-16 2015-05-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating gene expression
EP2906699A4 (en) 2012-10-11 2016-06-08 Ionis Pharmaceuticals Inc OLIGOMER COMPOUNDS WITH BICYCLIC NUCLEOSIDES AND USES THEREOF
JP6452614B2 (ja) 2012-11-15 2019-01-16 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス オリゴヌクレオチドコンジュゲート
PE20152002A1 (es) 2013-05-01 2016-01-21 Isis Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para modular la expresion de ttr y vhb
LT3702466T (lt) 2013-08-27 2023-02-27 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Produktai ir būdai, skirti šoninės amiotrofinės sklerozės gydymui
US9344563B2 (en) 2013-09-19 2016-05-17 Verizon Patent And Licensing Inc. System for and method of recycling numbers seamlessly
SI3757214T1 (sl) 2014-04-01 2022-08-31 Biogen Ma Inc. Sestave za moduliranje izražanja SOD-1
HUE052709T2 (hu) * 2014-05-01 2021-05-28 Ionis Pharmaceuticals Inc Módosított antiszensz oligonukleotidok konjugátumai és azok alkalmazása PKK expressziójának módosítására
CA2955285C (en) 2014-07-31 2023-09-26 Association Institut De Myologie Treatment of amyotrophic lateral sclerosis
RU2020108189A (ru) 2014-11-14 2020-03-11 Вояджер Терапьютикс, Инк. Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (als)
KR20180026739A (ko) 2015-07-06 2018-03-13 알엑스아이 파마슈티칼스 코포레이션 슈퍼옥시드 디스뮤타제 1 (sod1)을 표적화하는 핵산 분자
US10808247B2 (en) 2015-07-06 2020-10-20 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treating neurological disorders using a synergistic small molecule and nucleic acids therapeutic approach
CA3061652A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
CA3106986A1 (en) * 2018-07-25 2020-01-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing atxn2 expression

Also Published As

Publication number Publication date
JP7198298B2 (ja) 2022-12-28
US20170037410A1 (en) 2017-02-09
SG10201906520RA (en) 2019-09-27
IL247714B (en) 2020-04-30
EP3126499B1 (en) 2020-06-24
CN106459972A (zh) 2017-02-22
PL3126499T3 (pl) 2020-11-30
JP2019201664A (ja) 2019-11-28
IL273404B (en) 2021-12-01
NL301293I2 (nl) 2024-11-26
EP3757214B1 (en) 2022-06-15
AU2022200002A1 (en) 2022-02-03
FIC20240035I1 (fi) 2024-10-24
RU2016142532A (ru) 2018-05-10
JP2023027299A (ja) 2023-03-01
WO2015153800A3 (en) 2015-12-03
KR20230085222A (ko) 2023-06-13
SI3757214T1 (sl) 2022-08-31
SG11201608109TA (en) 2016-10-28
PT3126499T (pt) 2020-08-31
KR102285629B1 (ko) 2021-08-06
US10385341B2 (en) 2019-08-20
AU2024202423A1 (en) 2024-07-04
AU2015240761A1 (en) 2016-09-22
AU2015240761B2 (en) 2019-09-12
DK3757214T3 (da) 2022-07-04
LT3757214T (lt) 2022-07-25
IL273404A (en) 2020-05-31
FR24C1039I1 (fr) 2024-12-06
HRP20220798T1 (hr) 2022-10-14
RS63487B1 (sr) 2022-09-30
HRP20201078T1 (hr) 2020-10-30
RU2704619C2 (ru) 2019-10-30
MX373908B (es) 2020-07-09
LT3126499T (lt) 2020-07-27
US20200040342A1 (en) 2020-02-06
SMT202000456T1 (it) 2020-09-10
KR20250113519A (ko) 2025-07-25
US10968453B2 (en) 2021-04-06
MY192634A (en) 2022-08-29
MX2016012922A (es) 2017-01-26
HUS2400035I1 (hu) 2024-11-28
US20200354723A1 (en) 2020-11-12
KR20220077933A (ko) 2022-06-09
WO2015153800A2 (en) 2015-10-08
CN106459972B (zh) 2020-05-08
PL3757214T3 (pl) 2022-09-12
JP2021072840A (ja) 2021-05-13
CL2019002535A1 (es) 2020-02-14
MX2020007166A (es) 2020-10-14
EP4137573A2 (en) 2023-02-22
JP2017513469A (ja) 2017-06-01
PT3757214T (pt) 2022-08-26
LTPA2024531I1 (sr) 2024-11-25
EP3757214A1 (en) 2020-12-30
EP4137573A3 (en) 2023-05-03
JP2026035746A (ja) 2026-03-04
DK3126499T3 (da) 2020-07-20
FR24C1039I2 (fr) 2025-09-26
JP2024105714A (ja) 2024-08-06
NZ724100A (en) 2022-12-23
IL247714A0 (en) 2016-11-30
SMT202200479T1 (it) 2023-01-13
CL2016002509A1 (es) 2017-06-09
SI3126499T1 (sl) 2020-09-30
ES2926869T3 (es) 2022-10-31
CL2018001897A1 (es) 2018-11-16
CN111440798A (zh) 2020-07-24
ES2818236T3 (es) 2021-04-09
HUE050704T2 (hu) 2020-12-28
AU2019268063A1 (en) 2019-12-12
MY175665A (en) 2020-07-03
EP3126499A4 (en) 2017-11-08
BR112016021848A2 (pt) 2017-10-03
KR20210097225A (ko) 2021-08-06
JP6622214B2 (ja) 2019-12-18
RU2016142532A3 (sr) 2018-12-03
HUE059109T2 (hu) 2022-10-28
KR20240111010A (ko) 2024-07-16
CA2942394A1 (en) 2015-10-08
EP3126499A2 (en) 2017-02-08
KR20170012207A (ko) 2017-02-02
SG10201910844SA (en) 2020-01-30
BR112016021848B1 (pt) 2023-05-02
US10669546B2 (en) 2020-06-02
CY1123288T1 (el) 2021-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7198298B2 (ja) Ｓｏｄ－１発現を調節するための組成物
US10815483B2 (en) Compositions for modulating C9ORF72 expression
AU2014331652B2 (en) Compositions for modulating C9ORF72 expression
CA2918600C (en) Compositions for modulating tau expression
RS62526B1 (sr) Kompozicije za modulaciju ekspresije ataksina 2
US20180036335A1 (en) Compositions for modulating mecp2 expression
US20180044673A1 (en) Methods for modulating mecp2 expression
HK40088775A (en) Compositions for modulating sod-1 expression
HK40042535B (en) Compositions for modulating sod-1 expression
HK40042535A (en) Compositions for modulating sod-1 expression
HK40039446A (en) Compositions for modulating c9orf72 expression
HK1233301A1 (en) Compositions for modulating sod-1 expression
HK1233301B (en) Compositions for modulating sod-1 expression
HK1250255B (en) Compositions for modulating c9orf72 expression