BR112018075667B1 - Métodos para separar um oligonucleotídeo alvo de uma mistura contendo o oligonucleotídeo alvo e uma impureza relacionada com o produto - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se a um método de purificação de oligonucleotídeos utilizando cromatografia de interação hidrofóbica.
Description
[001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito abaixo de 35 U.S.C. § 119 (e), do Pedido Provisório US. No. 62/349,970, depositado em 14 de junho de 2016, e do Pedido Provisório US. No. 62/492,402, depositado em 1° de maio de 2017, cujo conteúdo inteiro é aqui incorporado por referência.
[002] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi enviada eletronicamente no formato ASCII e é incorporada por referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 12 de junho de 2017, é denominada 123429-00120_SL.txt e tem 839 bytes de tamanho.
[003] Os oligonucleotídeos são oligômeros de DNA ou RNA curtos que podem ser sintetizados quimicamente para fins de pesquisa e médicos. Os oligonucleotídeos são tipicamente preparados por uma adição por etapas de resíduos de nucleotídeos para produzir uma sequência específica. Durante a síntese, ineficiências em qualquer uma das etapas são possíveis, resultando em um oligômero ou faltando um nucleosídeo ("a impureza N - 1") ou tendo uma ligação fosfodiéster em vez da ligação fosfotioéster desejada ("a impureza P = O"). Além disso, a exposição a condições oxidativas durante ou após a síntese poderia converter uma ligação P = S em uma ligação P = O para formar uma impureza P = O. Após a conclusão da síntese do oligonucleotídeo da sequência desejada, o oligonucleotídeo alvo é obtido como uma mistura juntamente com todas as sequências com falha e as impure- zas N - 1 e P = O. Estas impurezas precisam então ser separadas do oligonucleotídeo alvo.
[004] Uma técnica de separação comumente usada é a cromato- grafia líquida de alta pressão de fase reversa (rp-HPLC) para purificar oligonucleotídeos, no entanto, a rp-HPLC geralmente não pode efetivamente remover o N - 1, o P = O, o ABasic, o CNEt e/ou as impurezas N + 1. Outra desvantagem da rp-HPLC inclui o uso de uma quantidade significativa de solventes orgânicos, o que cria um problema de descarte e também a necessidade de conduzir a purificação em uma instalação à prova de explosão.
[005] Portanto, são necessários métodos de purificação para oli- gonucleotídeos que possam remover as impurezas N - 1, P = O, ABa- sic, CNEt e/ou N + 1 e que sejam adequados para um processo comercial em larga escala.
[006] A presente invenção descreve um método para purificar um oligonucleotídeo alvo utilizando cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). Em particular, o método aqui descrito inclui aplicar, em uma capacidade de carga dinâmica particular, uma mistura do oligonucleotí- deo alvo e impurezas relacionadas com o produto à resina de croma- tografia de interação hidrofóbica (ou adsorvente hidrofóbico). O método reivindicado resulta em uma separação melhorada das impurezas N - 1 e P = O do oligonucleotídeo alvo, bem como na eliminação da utilização de solventes orgânicos durante o processo de purificação. Em certas modalidades, o método reivindicado também pode remover as impurezas ABasic, CNEt e/ou N + 1.
[007] A Figura 1 é um gráfico representando a relação entre a capacidade de carga dinâmica e a remoção da impureza P = O.
[008] A Figura 2 é um gráfico representando a relação entre a capacidade de carga dinâmica e a remoção da impureza N - 1.
[009] A Figura 3 representa as estruturas exemplificativas de impurezas ABasic, CNEt e P = O.
[0010] A presente invenção refere-se a métodos para separar um oligonucleotídeo de impurezas relacionadas ao produto geradas durante a síntese do oligonucleotídeo. O novo processo foi desenvolvido em que uma mistura de oligonucleotídeos em bruto, que contém não apenas o oligonucleotídeo alvo, mas também várias impurezas relacionadas com o produto, é aplicada a um adsorvente hidrofóbico com uma capacidade de carga dinâmica particular. Este novo método resulta em uma remoção aprimorada de certas impurezas relacionadas ao produto, incluindo a impureza N - 1 e a impureza P = O. Tal melhoria foi surpreendente porque se espera que a hidrofobicidade do oligonu- cleotídeo alvo, em comparação com as suas impurezas N - 1 e P = O, seja similar e estas impurezas não sejam removidas por rp-HPLC em escala de processo, que também se baseia em interações hidrofóbi- cas. Em certas modalidades, o método reivindicado também pode remover as impurezas ABasic, as impurezas CNEt e as impurezas N + 1 que são difíceis de remover por rp-HPLC.
[0011] Uma primeira modalidade da invenção é um método para separar um oligonucleotídeo alvo de uma mistura contendo o oligonu- cleotídeo alvo e uma impureza relacionada com o produto, o método compreendendo as etapas de:
[0012] a) adicionar sal à mistura;
[0013] b) colocar em contato a mistura diluída com um adsorvente hidrofóbico a uma capacidade de carga dinâmica de aproximadamente 32 a aproximadamente 78% da capacidade do adsorvente hidrofóbico;
[0014] c) lavar o adsorvente hidrofóbico com uma solução salina aquosa;
[0015] d) eluir o oligonucleotídeo alvo com uma solução de elui- ção; e
[0016] e) coletar o eluente compreendendo o oligonucleotídeo alvo;
[0017] onde a impureza relacionada com o produto inclui ao menos uma impureza N - 1, separando desse modo o oligonucleotídeo alvo da impureza relacionada com o produto.
[0018] Uma segunda modalidade da invenção é um método para separar um oligonucleotídeo alvo de uma mistura contendo o oligonu- cleotídeo tiolado alvo e uma impureza relacionada com o produto, o método compreendendo as etapas de:
[0019] a) adicionar sal à mistura;
[0020] b) colocar em contato a mistura diluída com um adsorvente hidrofóbico a uma capacidade de carga dinâmica de aproximadamente 40 a aproximadamente 100% da capacidade do adsorvente hidrofóbi- co;
[0021] c) lavar o adsorvente hidrofóbico com uma solução salina aquosa;
[0022] d) eluir o oligonucleotídeo alvo com uma solução de elui- ção; e
[0023] e) coletar o eluente compreendendo o oligonucleotídeo alvo;
[0024] onde a impureza relacionada com o produto inclui ao menos uma impureza P = O, separando desse modo o oligonucleotídeo alvo da impureza relacionada com o produto.
[0025] Como aqui utilizado, uma "impureza relacionada com o produto" refere-se aos subprodutos indesejados gerados durante a síntese do oligonucleotídeo alvo. Em certas modalidades, uma impureza relacionada com o produto é uma i) impureza N - 1; ii) uma impureza P = O; iii) ou uma combinação destas; ou iv) uma mistura de qualquer uma destas três. Como usado aqui, "impureza N - 1" é um oligonucleotídeo que está faltando 1 nucleosídeo em qualquer posição em relação ao oligonucleotídeo alvo devido a uma falha na reação de acoplamento. Como aqui utilizado, "impureza P = O" é um oligonucleo- tídeo que contém uma ligação fosfodiéster em vez de uma ligação fos- forotioato desejada do oligonucleotídeo alvo devido a uma falha na reação de sulfurização ou oxidação não intencional após a síntese. Em certas modalidades, o método como descrito para a primeira modalidade pode ser utilizado para remover a impureza P = O juntamente com a impureza N - 1. Em certas modalidades, o método como descrito para a segunda modalidade pode ser utilizado para remover a impureza N - 1 juntamente com a impureza P = O.
[0026] Em certas modalidades, as impurezas relacionadas com o produto podem também incluir uma impureza ABasic, uma impureza CNEt e/ou N + 1. Como aqui utilizado, uma "impureza N + 1" é um oli- gonucleotídeo que tem 1 nucleosídeo adicional em qualquer posição em relação ao oligonucleotídeo alvo. Como aqui utilizado, uma "impureza ABasic" é um oligonucleotídeo que tem um ou mais nucleosídeos que não têm a nucleobase em comparação com o oligonucleotídeo alvo, onde o nucleosídeo tem a estrutura mostrada abaixo:
[0027] Uma estrutura exemplificativa para uma impureza ABasic é mostrada na Figura 3. Em uma modalidade particular, a nucleobase em falta na impureza ABasic é adenosina e/ou guanina. Como aqui utilizado, uma impureza "CNEt" é um oligonucleotídeo que contém uma nucleobase de timina modificada em lugar da nucleobase de timina não modificada do oligonucleotídeo alvo, onde a nucleobase de timina modificada tem a seguinte estrutura:
[0028] Uma estrutura exemplificativa para a impureza CNEt é mostrada na Figura 3.
[0029] Em certas modalidades, as impurezas relacionadas com o produto incluem uma impureza mais curta. Como aqui utilizado, uma "impureza mais curta" é um oligonucleotídeo que não tem 1, 2, 3, 4 ou mais nucleosídeos em qualquer posição em relação ao oligonucleotí- deo alvo.
[0030] Em certas modalidades, as impurezas relacionadas com o produto incluem uma impureza de eluição precoce (EEI). Como aqui utilizado, a "impureza de eluição precoce" é uma impureza que elui antes do oligonucleotídeo alvo utilizando os métodos de purificação aqui descritos. Em uma modalidade, a EEI inclui uma impureza mais curta, tal como uma impureza N - 1, uma impureza P = O e/ou uma impureza ABasic.
[0031] Em certas modalidades, a impureza relacionada com o produto inclui uma impureza de eluição tardia (LEI). Como aqui utilizado, a "impureza de eluição tardia" é uma impureza que elui após o oligo- nucleotídeo alvo utilizando os métodos de purificação aqui descritos. Em uma modalidade, a LEI inclui a impureza N + 1.
[0032] "Oligonucleotídeo" significa um composto compreendendo uma pluralidade de nucleosídeos ligados. Em certas modalidades, um ou mais da pluralidade de nucleosídeos é modificado. Em certas modalidades, um oligonucleotídeo compreende um ou mais ribonucleosí- deos (RNA) e/ou desoxirribonucleosídeos (DNA). Em certas modalidades, o oligonucleotídeo inclui apenas RNA, apenas DNA ou inclui tanto RNA quanto DNA. Em uma modalidade particular, o oligonucleotídeo alvo é um gapmer. Um "gapmer" significa um composto químico no qual uma região interna tendo uma pluralidade de nucleosídeos que suporta a clivagem da RNase H está posicionada entre regiões externas tendo um ou mais nucleosídeos, onde os nucleosídeos compreendendo a região interna são quimicamente distintos do nucleosídeo ou nucleosídeos compreendendo as regiões externas. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo alvo compreende 10 a 100, 10 a 50, 10 a 25, 15 a 100, 15 a 50 ou 15 a 25 nucleotídeos.
[0033] "Nucleosídeo" significa um composto compreendendo uma nucleobase e uma porção de açúcar. Os nucleosídeos incluem, mas não estão limitados a nucleosídeos de ocorrência natural, nucleosí- deos modificados e nucleosídeos tendo bases miméticas e/ou grupos de açúcar. "Nucleosídeo modificado", um nucleosídeo que compreende ao menos uma modificação em comparação com RNA ou DNA nu- cleosídeos de ocorrência natural. Tal modificação pode ser na porção de açúcar e/ou na nucleobase. Os nucleosídeos podem ser modificados com qualquer um de uma variedade de substituintes ou na nu- cleobase ou na porção de açúcar.
[0034] Um "nucleotídeo" refere-se a um nucleosídeo compreendendo um grupo de ligação, que liga dois nucleosídeos em conjunto como parte do oligonucleotídeo. As duas classes principais de grupos de ligação são definidas pela presença ou ausência de um átomo de fósforo. As ligações contendo fósforo representativas incluem, mas não estão limitadas a fosfodiésteres (P = O), fosfotriésteres, metilfos- fonatos, fosforamidatos e fosforotioatos (P = S). Os grupos de ligação não contendo fósforo representativos incluem, mas não estão limitados a, metilenometilimino (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), tiodiéster (-O-C(O -S-), tionocarbamato (-O-C(O)(NH)-S-); siloxano (-O-Si(H)2-O-); e N,N’- dimetil-hidrazina (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-). Em uma modalidade particular, o grupo de ligação é um fosfodiéster (P = O) ou um fosforotioato (P = S). Em certas modalidades, o oligonucleotídeo alvo dos métodos descritos para a primeira e segunda modalidades inclui apenas fosfo- diéster (P = O), fosforotioatos (P = S) ou uma combinação desses como o grupo de ligação.
[0035] Uma "nucleobase" significa a porção de base heterocíclica de um nucleosídeo. Em certas modalidades, uma nucleobase pode compreender qualquer átomo ou grupo de átomos capaz de ligação de hidrogênio a uma nucleobase de outro ácido nucleico. As nucleobases podem ocorrer naturalmente ou podem ser modificadas. Além de nu- cleobases "não modificadas" ou "naturais", como as nucleobases de purina adenina (A) e guanina (G), e as nucleobases de pirimidina timina (T) (ou 5-metil uracila), citosina (C) e uracila (U), muitas nucleoba- ses modificadas ou miméticos de nucleobases conhecidas pelos versados na técnica são susceptíveis de incorporação nos oligonucleotí- deos alvo como separados ou pelo método descrito na primeira modalidade ou na segunda modalidade, incluindo, por exemplo, hipoxantina, xantina, 7-metil guanina, 5,6-di-hidrouracila, 5-metilcitosina, 7-deaza purina e 5-hidroximetilcitosina. Em certas modalidades, o método é como descrito para a primeira ou a segunda modalidade, e a nucleo- base é selecionada a partir de adenina, guanina, timina (5-metil uraci- la) e 5-metilcitosina.
[0036] "Porção de açúcar" significa um açúcar natural ou modificado ou substituto de açúcar.
[0037] "Açúcar natural" significa uma porção de ribofuranose de DNA (2’-H) ou RNA (2’-OH).
[0038] "Açúcar modificado" significa uma porção de ribofuranose compreendendo ao menos um substituinte que não aquele de um açúcar natural. Tais modificações incluem, sem limitação, a adição de grupos substituintes, ligação de átomos no anel não geminal para formar um ácido nucleico bicíclico (BNA), substituição do átomo de oxigênio do anel ribosil por S, N(R), ou C(R1) (R)2 (R = H, C1-C12 alquila ou um grupo protetor) e combinações destes. Em certas modalidades, o açúcar é modificado na posição 2’ para incluir um substituinte diferente de H ou OH ("2’-modificado" ou "2’-substituído"). Alternativamente, a modificação está na posição 5’ do açúcar. Em certas modalidades, o açúcar é modificado na posição 2’ e na posição 5’ do açúcar.
[0039] Exemplos de modificações de açúcares úteis nesta invenção incluem, mas não estão limitados a compostos compreendendo um grupo substituinte de açúcar selecionado a partir de: OH, F, O- alquila, S-alquila, N-alquila, ou O-alquil-O-alquila, onde a alquila, al- quenila e alquinila podem ser C1 a C10 alquila substituída ou não substituída ou C2 a C10 alquenila e alquinila. Em certas modalidades, tais substituintes são selecionados a partir de: um haleto (incluindo, mas não limitado a F), alila, amino, azido, tio, O-alila, O- C1-C10 alquila, - OCF3, O- (CH2)2 — O — CH3, 2’-O (CH2)2SCH3, O— (CH2)2 — O — N (Rm) (Rn) ou O — CH2-C (=O) —N (Rm) (Rn) , onde cada um de Rm e Rn é independentemente H ou C1-C10 alquila substituída ou não substituída. Em particular, os nucleosídeos modificados adequados para uti-lização nos métodos descritos na primeira e na segunda modalidade são: 2’-metoxietóxi ("MOE" ou "2’-MOE" ou "2’-OCH2CH2OCH3), 2'-O- metil ("2’-OMe" ou 2’-O-CH3) ou 2’-fluoro (2’-F).
[0040] Em certas modalidades, os nucleosídeos modificados tendo um grupo substituinte na posição 2’ selecionados a partir de: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O (CH2)nCH3, O(CH2)nOH2, OCH2C (=O) N(H)CH3 e O(CH2)n[CH2)nCH3]2, onde n e m são independentemente de 1 a aproximadamente 10. Outros grupos substituintes 2’- açúcar incluem: C1 a C10 alquila, alquila substituída, alquenila, alquini- la, alcarila, aralquila, O-alcarila ou O-aralquila, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterociclila e aminoalquilamino.
[0041] Em certas modalidades, os nucleosídeos modificados tendo um grupo substituinte no átomo de oxigênio na posição 5’ selecionados a partir de acetila (Ac); benzoíla (Bz); benzila (Bn); β- metoxietoximetil éter (MEM); dimetoxitritila, [bis-(4-metoxifenil) fenilme- tila] (DMT); metoximetil éter (MOM); metoxitritil [(4-metoxifenil) difenil- metila, MMT); p-metoxibenzil éter (PMB); metiltiometil éter; pivaloíla (Piv); tetra-hidropiranila (THP); tetra-hidrofurano (THF); tritilo (trifenil- metila, Tr); silil éter (incluindo, mas não limitado a trimetilsilil (TMS), ter-butildimetilsilil (TBDMS), tri-iso-propilsililoximetil (TOM), e tri- isopropilsilil (TIPS) éteres); metil éteres, etoxietil éteres (EE), e 5’-O-(α- metil-6-nitropiperoniloxicarbonila) (MeNPOC). Em uma modalidade particular, a posição 5’ é -ODMT.
[0042] Exemplos de nucleosídeos que têm porções de açúcar modificadas incluem, sem limitação, nucleosídeos compreendendo grupos substituintes 5’-vinila’, 5’-metila’, 5’-ODMT, 4’-S, 2’-F, 2’-OCH3 e 2’- O (CH2)2OCH3.
[0043] Em certas modalidades, os grupos substituintes 2’-açúcar estão ou na posição arabino (para cima) ou na posição ribo (para baixo). Em certas de tais modalidades, uma modificação de 2’-arabino é 2’-F arabino (FANA). Podem também ser feitas modificações similares em outras posições no açúcar, particularmente a posição 3’ do açúcar em um nucleosídeo 3’ terminal ou em oligonucleotídeos 2’-5’-ligados e a posição 5’ do nucleotídeo 5’ terminal.
[0044] Como aqui utilizado, o termo "alquila" refere-se a uma porção de hidrocarboneto ramificado ou não ramificado totalmente saturado. De um modo preferencial, a alquila compreende 1 a 20 átomos de carbono, mais preferencialmente, 1 a 16 átomos de carbono, 1 a 10 átomos de carbono, 1 a 6 átomos de carbono, ou 1 a 4 átomos de carbono. Em algumas modalidades, uma alquila compreende de 6 a 20 átomos de carbono. Exemplos representativos de alquila incluem, mas não estão limitados a, metila, etila, n-propila, iso-propila, n-butila, sec- butila, iso-butila, ter-butila, n-pentila, isopentila, neopentila, n-hexila, 3- metil-hexila, 2,2-dimetilpentila, 2,3-dimetilpentila, n-heptila, n-octila, n- nonila ou n-decila.
[0045] "Alquenila" refere-se a um grupo hidrocarboneto insaturado que pode ser linear ou ramificado e tem ao menos uma ligação dupla carbono-carbono. Os grupos alquenila com 2-6 átomos de carbono podem ser preferenciais. O grupo alquenila pode conter 1, 2 ou 3 ligações duplas carbono-carbono, ou mais. Exemplos de grupos alquenila incluem etenila, n-propenila, isopropenila, n-but-2-enila, n-hex-3-enila e similares.
[0046] "Alquinila" refere-se a um grupo hidrocarboneto insaturado que pode ser linear ou ramificado e tem ao menos uma ligação tripla carbono-carbono. Os grupos alquinila com 2-6 átomos de carbono podem ser preferenciais. O grupo alquinila pode conter 1, 2 ou 3 ligações triplas carbono-carbono, ou mais. Exemplos de grupos alquinila incluem etinila, n-propinila, n-but-2-inila, n-hex-3-inila e similares.
[0047] O termo "arila" refere-se a grupos hidrocarboneto aromáticos monocíclicos, bicíclicos ou tricíclicos com 6 a 14 átomos de carbono na porção de anel. Em uma modalidade, o termo arila refere-se a grupos hidrocarboneto aromáticos monocíclicos e bicíclicos com 6 a 10 átomos de carbono. Exemplos representativos de grupos arila incluem fenila, naftila, fluorenila e antracenila. O termo "arila" também se refere a um grupo bicíclico ou tricíclico em que ao menos um anel é aromático e está fundido a um ou dois anéis hidrocarboneto não aromáticos. Exemplos não limitantes incluem tetra-hidronaftaleno, di- hidronaftalenila e indanila. Uma "arilalquila" é um grupo arila ligado através de um ligante alquileno ao restante da molécula. Um "alcarila" é um grupo alquila ligado através de um ligante arileno ao restante da molécula.
[0048] Como aqui utilizado, o termo "heterociclila" refere-se a um sistema de anel monocíclico ou bicíclico saturado ou insaturado (por exemplo, ligado em ponte ou sistemas de anel spiro) que tem de 3 a 7 membros de anel, ou em particular de 3 a 6 membros de anel ou 5 a 7 membros de anel, ao menos um dos quais é um heteroátomo, e até 4 (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) dos quais podem ser heteroátomos, onde os heteroátomos são independentemente selecionados a partir de O, S e N, e onde C pode ser oxidado (por exemplo, C(O)), N pode ser oxidado (por exemplo, N(O)) ou quaternizado, e S pode ser opcionalmente oxidado a sulfóxido e sulfona. Anéis heterocíclicos insaturados incluem anéis heteroarila. Como aqui utilizado, o termo "heteroarila" refere-se a um sistema de anel monocíclico aromático de 5 ou 6 membros, tendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, S e N, e onde N pode ser oxidado (por exemplo, N(O)) ou quaternizado, e S pode ser opcionalmente oxidado em sulfóxido e sulfona. Em uma modalidade, uma heterociclila é um anel monocíclico saturado de 3 a 7 membros ou um anel monocíclico saturado monocí- clico de 3 a 6 membros ou 5 a 7 membros. Em uma modalidade, uma heterociclila é um anel monocíclico de 3 a 7 membros monocíclico ou de 3 a 6 Em outra modalidade, uma heterociclila é um anel bicíclico de 6 ou 7 membros. O grupo heterociclila pode estar ligado a um heteroá- tomo ou um átomo de carbono.
[0049] "Nucleosídeo bicíclico" ou "BNA" significa um nucleosídeo em que a porção de açúcar do nucleosídeo compreende uma ponte ligando dois átomos de carbono do anel de açúcar, formando assim uma porção de açúcar bicíclica. Exemplos de BNAs incluem, sem limitação, nucleosídeos compreendendo uma ponte entre os átomos do anel ribosil 4’ e 2’ ("nucleosídeos 4’-2’ bicíclicos), por exemplo, um anel furanose compreendendo uma ponte ligando dois átomos de carbono do anel furanose para ligar o átomo de carbono 2’ e o átomo de carbono 4’ do anel de açúcar.
[0050] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo alvo inclui um ou mais nucleosídeos de BNA onde a ponte compreende uma das fórmulas: 4‘-β-D-(CH2)—O-2‘ (β-D-LNA); 4‘-(CH2)—S-2; 4‘-α-L-(CH2)— O-2‘ (α-L-LNA); 4‘-(CH2)2—O-2‘ (ENA); 4‘-C(CH3)2—O-2‘ (ver PCT/US2008/068922); 4‘-CH(CH3)—O-2‘ ("cEt") e 4‘-C— H(CH2OCH3)—O-2‘ (ver Pat. US. No. 7.399.845, emitida em 15 de julho de 2008); 4‘-CH2—N(OCH3)-2‘ (ver PCT/US2008/064591); 4‘-CH2— O—N(CH3)-2‘ (ver Pedido de Patente US. Publicado US2004-0171570, publicado em 2 de setembro de 2004); 4‘-CH—N(R)—O-2‘ (ver Pat. US. No. 7.427.672, emitida em 23 de setembro de 2008); 4‘-CH2— C(CH3)-2‘ e 4‘-CH2—C(=CH2)-2‘ (ver PCT/US2008/066154); e onde R é independentemente H, C1-C12 alquila ou um grupo protetor. Em certas modalidades, a presente invenção fornece nucleosídeos modificados compreendendo porções de açúcar modificadas que não são porções de açúcar bicíclicas.
[0051] "Substituto de açúcar" significa uma estrutura diferente de um anel ribofuranose que é capaz de substituir o açúcar de um nu- cleosídeo. Exemplos de substitutos de açúcar incluem, mas não estão limitados a anéis de 6 membros, açúcares em que o oxigénio é substituído, por exemplo, por enxofre ou nitrogênio, para formar, por exemplo, morfolinos e açúcares contendo 4’-tio.
[0052] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo alvo separado pelo método, como descrito na primeira ou na segunda modalidade, é um oligonucleotídeo fosforotioato com uma sequência de (de 5’ a 3’) TCACTTTCATAATGCTGG (SEQ ID NO: 1),
[0053] onde cada ligação internucleosídeo do oligonucleotídeo é uma ligação fosforotioato, cada nucleosídeo do oligonucleotídeo é um 2’-metoxietil nucleosídeo (MOE), e cada citosina é uma 5’- metilcitosina. A SEQ ID NO: 1 também é conhecida como BIIB058, e é descrita em WO2007 / 002390, WO2010 / 148249 e US 8.980.853, os ensinamentos de cada um são aqui incorporados por referência.
[0054] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo alvo separado pelo método como descrito na primeira ou na segunda modalidade é um gapmer MOE 5-10-5, tendo uma sequência de (de 5’ a 3’) CAGGATACATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 2),
[0055] onde cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16-20 são nucleosí- deos modificados com 2'-O-metoxietilribose, e cada um dos nucleosí- deos 6-15 são 2’-desoxinucleosídeos, onde as ligações internucleosí- deo entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as ligações internucleosídeo entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12 , 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e onde cada citosina é uma 5’-metilcitosina. SEQ ID NO: 2 é descrita pela seguinte notação química: mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te; onde,
[0056] A = uma adenina,
[0057] mC = a 5’-metilcitosina,
[0058] G = uma guanina,
[0059] T = uma timina,
[0060] e = um açúcar modificado 2’-O-metoxietilribose,
[0061] d = um açúcar 2’-desoxiribose,
[0062] s = uma ligação internucleosídeo fosforotioato, e
[0063] o = uma ligação internucleosídeo fosfodiéster.
[0064] A SEQ ID NO: 2 é tão conhecida como BIIB067 ou ISIS 666853 e é descrita em WO2015153800, cujos ensinamentos são aqui incorporados por referência.
[0065] O adsorvente hidrofóbico (isto é, "resina hidrofóbica") é qualquer material ao qual o oligonucleotídeo alvo se liga de tal modo que possa ser separado das impurezas relacionadas com o produto no método como descrito na primeira e na segunda modalidade. Por exemplo, o adsorvente hidrofóbico inclui carboidratos hidrofílicos: agarose reticulada e materiais copoliméricos sintéticos. Em particular, o adsorvente hidrofóbico compreende fenila, butila ou hexila. Por exemplo, Hexyl650C é um adsorvente hidrofóbico adequado. Além disso, o adsorvente hidrofóbico é empacotado a uma altura de leito de ao menos 15 cm, por exemplo, ao menos 20 cm, ao menos 25 cm, ou ao menos 30 cm; ou de aproximadamente 15 cm a aproximadamente 30 cm; de aproximadamente 15 cm a 20 cm, de aproximadamente 20 a aproximadamente 25 cm, ou aproximadamente 25 cm a aproximadamente 30 cm.
[0066] A "capacidade de carga dinâmica" é definida como a quantidade de produto (por exemplo, produto de oligonucleotídeo) que se ligará a uma resina de cromatografia sob condições típicas de fluxo e é determinada sob condições específicas de fluxo e concentração de sal de carga, entre outros fatores de carga conhecidos por um versado na técnica. Ela é calculada com base na quantidade que pode ser carregada antes de os níveis do produto serem medidos no fluxo (chamado de o "ponto de ruptura"). Em particular, o material a ser separado é aplicado à resina de um modo fluxível (em oposição à estática feita em um modo descontínuo) a uma taxa de fluxo particular, por exemplo, aproximadamente 100 a aproximadamente 250 cm / h e, em particular, 200 cm / h. Um versado na técnica saberá como selecionar tanto a concentração de sal com base na solubilidade do produto nesse sal e a taxa de fluxo com base no tamanho do grânulo, altura do leito e outras variáveis de tal modo que a pressão de entrada não seja excedida para atingir uma relação de carga dinâmica particular.
[0067] Por exemplo, se a capacidade de um adsorvente hidrofóbi- co para a mistura de oligonucleotídeos for 50 mg / mL (dinâmica), a aplicação de 50 mg / mL da mistura seria a 100% de capacidade de carga dinâmica. Similarmente, para um 50 mg / mL de adsorvente hi- drofóbico, a aplicação de 25 mg / mL da mistura seria a capacidade de carga dinâmica de 50%. Para o método como descrito na primeira modalidade, a capacidade de carga dinâmica é de aproximadamente 32% a aproximadamente 78%, por exemplo, aproximadamente 32% a aproximadamente 45%, aproximadamente 40% a aproximadamente 50%, aproximadamente 45% a aproximadamente 55%, aproximadamente 50% a aproximadamente 60%, aproximadamente 55% a apro-ximadamente 65%, aproximadamente 60 a aproximadamente 70%, aproximadamente 65% a aproximadamente 78%, ou aproximadamente 32% a aproximadamente 50%, aproximadamente 40 a aproximadamente 75% ou aproximadamente % a aproximadamente 78%. Para o método como descrito na segunda modalidade, a capacidade de carga dinâmica é de aproximadamente 40% a aproximadamente 100%, por exemplo, aproximadamente 40% a aproximadamente 50%, aproximadamente 50% a aproximadamente 60%, aproximadamente 60% a aproximadamente 70%, aproximadamente 70% a aproximadamente 80%, aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, aproximadamente 90 a aproximadamente 100%, aproximadamente 40% a aproximadamente 75% ou aproximadamente 40% a aproximadamente 60% ou aproximadamente 40% a aproximadamente 80%. Para o método como descrito na primeira e na segunda modalidade, a capacidade de carga dinâmica é de aproximadamente 40% a aproximadamente 78%, por exemplo, aproximadamente 40% a aproximadamente 45%, aproximadamente 45% a aproximadamente 50%, aproximadamente 50% a aproximadamente 55%, aproximadamente 55% a aproximadamente 60%, aproximadamente 60% a aproximadamente 65%, aproximadamente 65 a aproximadamente 70%, aproximadamente 70% a aproximadamente 75%, ou aproximadamente 40% a aproximadamente 50%, aproximadamente 40 a aproximadamente 75% ou aproxima- damente 50% a aproximadamente 78%.
[0068] Em uma terceira modalidade, o método é como descrito para a primeira ou a segunda modalidade, e sal é adicionado à mistura como solução salina aquosa ou o sal é dissolvido diretamente na mistura. Em particular, o sal inclui qualquer cátion de NH4+, K+ ou Na+ e qualquer ânion constituído de F-, [SO4]-2, [HPO4]-2, acetato ou Cl- ou combinações dos mesmos. Especificamente, o sal é sulfato de amô- nio.
[0069] Em uma quarta modalidade, o método é como descrito para qualquer uma da primeira, segunda ou terceira modalidade, onde a taxa de fluxo da etapa de lavagem é mais lenta do que a taxa de fluxo de carga. Em particular, a taxa de fluxo da etapa de carga é de aproximadamente 150 cm / h a aproximadamente 250 cm / h e a taxa de fluxo da etapa de lavagem é de aproximadamente 50 cm / h a aproximadamente 150 cm / h, por exemplo, a taxa de fluxo da etapa de carga é de aproximadamente 175 cm / h a aproximadamente 225 cm / h e a taxa de fluxo da etapa de lavagem é de aproximadamente 75 cm / h a aproximadamente 125 cm / h. Em particular, a taxa de fluxo da etapa de carga é de aproximadamente 200 cm / h e a taxa de fluxo da etapa de lavagem é de aproximadamente 100 cm / h.
[0070] Em uma quinta modalidade, o método é como descrito para qualquer uma da primeira, segunda, terceira ou quarta modalidade, a solução de eluição é selecionada a partir de água, uma solução salina aquosa, etileno glicol ou propileno glicol ou misturas dos mesmos. Em particular, o sal inclui qualquer cátion de NH4+, K+ ou Na+ e qualquer ânion constituído de F-, [SO4]-2, [HPO4]-2, acetato ou Cl- ou combinações dos mesmos. Especificamente, o sal é sulfato de amônio.
[0071] Em uma sexta modalidade, o método é como descrito para qualquer uma da primeira, segunda, terceira, quarta ou quinta modalidade, onde a coleta de eluição é atrasada de tal modo que não inclui os primeiros 2-25%, os primeiros 2-10 %, os primeiros 2-8%, os primeiros 4-6%, os primeiros 5-10% ou os primeiros 10 - 25% do pico de eluição do produto. Em uma modalidade mais específica, a coleta é atrasada de modo a não incluir os primeiros 5% do pico de eluição do produto. Em particular, o eluente é coletado em frações e o tamanho da fração é ajustado para separar o oligonucleotídeo alvo das impurezas relacionadas com o produto em frações separadas. O tamanho da fração pode ser facilmente determinado por um versado na técnica, dependendo em parte da diferença no tempo de eluição entre o oligo- nucleotídeo e a impureza relacionada com o produto, a quantidade do produto cru contendo o oligonucleotídeo alvo e as impurezas relacionadas com o produto a serem separadas, etc.
[0072] Também na sexta modalidade, o método é como descrito para qualquer uma da primeira, segunda, terceira, quarta ou quinta modalidades, onde a coleta de eluição não inclui os primeiros e os últimos 2-25% do pico de eluição do produto. Mais especificamente, a coleta de eluição não inclui os primeiros e os últimos 2-10%, os primeiros e os últimos 2-8%, os primeiros e os últimos 4-6%, os primeiros e os últimos 5-10% ou os primeiros e os últimos 10-25% do pico de elui- ção do produto. Em uma outra modalidade específica, a coleta de elui- ção não inclui os primeiros e os últimos 5% do pico de eluição do produto.
[0073] Em uma modalidade, a solução de lavagem é mantida constante durante a etapa de lavagem, conhecida como modo de lavagem isocrática. Alternativamente, a solução de lavagem varia durante a etapa de lavagem, conhecida como modo de lavagem com gradiente. Na lavagem com gradiente, a solução de lavagem pode ser variada de alta força iônica ou polaridade à baixa força iônica ou polaridade. A diminuição da polaridade ou força iônica pode ser obtida diminuindo a concentração de sal da solução aquosa ou aumentando a relação de volume do solvente mais polar, por exemplo, água, ou outros solventes polares, por exemplo, etileno ou propileno glicol para a solução salina de concentração mais alta. Alternativamente, a solução de lavagem pode ser variada de baixa polaridade ou alta força iônica a alta polaridade ou baixa força iônica. Em outra alternativa, uma etapa de lavagem com gradiente pode ser seguida por uma etapa de lavagem isocrática, ou vice-versa.
[0074] Em uma modalidade, a solução de eluição é mantida constante durante a eluição, conhecida como modo de eluição isocrática. Alternativamente, a solução de eluição é variada durante a eluição, conhecida como modo de eluição com gradiente. Na eluição com gradiente, a solução de eluição pode variar de alta força iônica ou baixa polaridade a baixa força iônica ou alta polaridade. O aumento na polaridade ou diminuição na força iônica pode ser obtido diminuindo a con-centração de sal da solução aquosa ou aumentando a relação de volume do solvente mais polar, por exemplo, água, ou outro solvente polar, por exemplo, etileno ou propileno glicol para solução salina de mais alta concentração. Alternativamente, a solução de eluição pode ser variada de baixa polaridade ou alta força iônica a alta polaridade ou baixa força iônica. Em outra alternativa, uma eluição com gradiente pode ser seguida por uma eluição isocrática, ou vice-versa.
[0075] Em uma modalidade, o método da presente invenção aqui descrito também pode remover EEI e/ou LEI. Em outra modalidade, o método da presente invenção aqui descrito pode remover ao menos uma impureza relacionada com o produto selecionada a partir de uma impureza mais curta, uma impureza N + 1, uma impureza ABasic, uma impureza CNEt e uma impureza P = O. Em outra modalidade, o método da presente invenção aqui descrito pode remover uma impureza N - 1, uma impureza P = O e ao menos uma impureza relacionada com o produto selecionada a partir de uma impureza mais curta diferente de uma impureza N - 1, uma impureza N + 1, uma impureza ABasic e uma impureza CNEt. Em outra modalidade, o método da presente invenção aqui descrito pode remover uma impureza N - 1, uma impureza P = O e ao menos uma impureza relacionada com o produto selecionada a partir de uma impureza mais curta diferente da impureza N - 1, uma impureza N + 1, uma impureza ABasic e uma impureza CNEt. Em outra modalidade, o método da presente invenção aqui descrito pode remover uma impureza N - 1, uma impureza P = O, uma impureza mais curta diferente da impureza N - 1, uma impureza N + 1, uma impureza ABasic e uma impureza CNEt.
[0076] "Separar um oligonucleotídeo alvo de uma mistura contendo o oligonucleotídeo alvo e uma impureza relacionada com o produto" ou "remover uma impureza relacionada com o produto" significa remover ao menos 15%, por exemplo, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% ou 60% de uma ou mais das impurezas relacionadas com o produto aqui descritas, por exemplo, a impureza N - 1, a impureza P = O, a impureza ABasic, a impureza CNEt ou a impureza N + 1 da mistura.
[0077] Coluna: 6,84 mL Phenyl Sepharose Fast Flow High Sub
[0078] Altura do leito: 20 cm
[0079] Tampão de diluição de produto: Sulfato de amônio a 850 mM, tris a 50mM, pH 8,5
[0080] Tampão de equilíbrio: Sulfato de amônio a 800 mM, tris a 50 mM, pH 8,5
[0081] Carregamento do produto cru: Sulfato de amônio a 765 mM, tris a 50 mM, pH 8,5
[0082] Tampão de lavagem: Sulfato de amônio a 440 mM, tris a 50 mM, pH 8,5
[0083] Tampão de eluição: Sulfato de amônio a 40 mM, tris a 50 mM, pH 8,5
[0084] Tira: água desionizada
[0085] Limpeza no local: Hidróxido de sódio a 1N
[0086] Armazenamento: Hidróxido de sódio a 0,1N
[0087] Monitor UV: 295 nm
[0088] - Preparação da Amostra: A amostra (SEQ ID NO: 2) foi diluída 10 vezes com tampão de diluição (a concentração final de sulfato de amônio é de 765 mM).
[0089] - Método de ciclo: A coluna foi equilibrada com 4 volumes de coluna (CV) de sulfato de amônio a 800 mM, tris a 50 mM, pH 8,5 a 200 cm / h. A amostra foi carregada a uma taxa de 200 cm / h em três diferentes capacidades dinâmicas de carga:
[0090] Para a corrida 1: carregado a uma capacidade de carga dinâmica de 8,8%.
[0091] Para a corrida 2: carregada a uma capacidade de carga dinâmica de 47%.
[0092] Para a corrida 3: carregada a uma capacidade de carga dinâmica de 100%.
[0093] A coluna foi lavada com 7 CVs de sulfato de amônio a 440 mM, tris a 50 mM, pH 8,5 a 100 cm / h. A coluna foi eluída com 6 CVs de sulfato de amônio a 40 mM, tris a 50 mM, pH 8,5 a 200 cm / h. A coluna foi removida com 2 CVs de água desionizada a 200 cm / h. A coluna da coluna foi limpa com 3 CVs de hidróxido de sódio a 1N a 200 cm / h e armazenada em 3 CVs de hidróxido de sódio a 0,1 N a 200 cm / h.
[0094] A quantidade relativa de remoção de impurezas N - 1 e P = O é fornecida abaixo nas Tabelas 1 e 2, respectivamente. Tabela 1- Remoção da impureza N – 1 Tabela 2 - Remoção da impureza P = O
[0095] Com base nos resultados descritos nas Tabelas 1 e 2, é necessária a utilização da capacidade de carga dinâmica apropriada para remover as impurezas N - 1 e P = O.
[0096] A avaliação do efeito da capacidade de carga dinâmica na remoção da impureza P = O foi concluída usando o software Design of Experiment (DesignExpert™ v9). O tipo de desenho estatístico foi um composto central. O tipo de estudo foi superfície de resposta. 50 corridas foram realizadas com uma coluna de Phenyl Sepharose de 20 cm de altura do leito e uma capacidade de ligação dinâmica de 45 mg / mL. O tampão de lavagem foi sulfato de amônio a 440 mM e o tampão de eluição foi sulfato de amônio a 40 mM. Sete e seis volumes de coluna de lavagem e de tampão de eluição foram utilizados, respectivamente. A SEQ ID NO: 2 foi utilizada como o oligonucleotídeo, utilizando as mesmas condições descritas acima no Exemplo 1.
[0097] Os resultados da análise demonstram que, para a impureza P = O, há uma melhora na remoção da impureza P = O quando há uma capacidade de carga de 42% a 100% (isto é, 19 mg / mL a 45 mg / mL no gráfico na figura 1).
[0098] A avaliação do efeito da capacidade de carga dinâmica na remoção da impureza relacionada com o produto N - 1 mostrada na Figura 2. Cinco corridas são representadas na Figura 2 e correspondem a uma capacidade de carga de 9, 24, 47, 69 e 100% de um ad- sorvente hidrofóbico de 45 mg/ml. A percentagem de redução de N - 1 foi calculada a partir dos níveis iniciais de N - 1 no produto cru. A análise concluiu que a razão de carga é o único fator que é significativo na redução de N - 1. Portanto, outras variáveis são insignificantes para a redução de N - 1, de acordo com a análise estatística.
[0099] Coluna: 6,84 mL de Phenyl Sepharose Fast Flow High Sub (Ge Healthcare Life Sciences, P / C: 17-0973-05)
[00100] Altura do leito: 20 cm
[00101] Tampão de diluição de produto: Sulfato de amônio a 850 mM, tris a 50 mM, pH 8,5
[00102] Tampão de equilíbrio: Sulfato de amônio a 800 mM, tris a 50 mM, pH 8,5
[00103] Carregamento do produto bruto: Sulfato de amônio a 765 mM, tris a 50 mM, pH 8,5
[00104] Tampões de lavagem: Sulfato de amônio a 440 mM, Tris a 50 mM, pH 8,5
[00105] Sulfato de amônio a 400 mM, Tris a 50 mM, pH 8,5
[00106] Tampão de eluição: Sulfato de amônio a 40 mM, Tris a 50 mM, pH 8,5
[00107] Sulfato de amônio a 10 mM, Tris a 50 mM, pH 8,5
[00108] Tira: água deionizada
[00109] Limpeza no local: Hidróxido de sódio a 1N
[00110] Armazenamento: Hidróxido de sódio a 0.1N
[00111] Monitor UV: 295 nm
[00112] - Preparação da amostra: A amostra (SEQ ID NO: 2) foi di luída 10 vezes com tampão de diluição (a concentração final de sulfato de amônio é 765 mM).
[00113] - Método de ciclo: A coluna foi equilibrada com 4 volumes de coluna (CVs) de sulfato de amônio a 800 mM, tris a 50 mM, pH 8,5 a 200 cm / h. A amostra foi carregada a uma taxa de 200 cm / h em cinco razões de carga diferentes, observadas na Tabela 3. Tabela 3 - Variáveis DoE para redução de N - 1 com base em corridas de carga de quantidade
[00114] A coluna foi lavada a 100 cm / h com o tampão de lavagem especificado e CVs na Tabela 3. A coluna foi eluída a 200 cm / h com o tampão de eluição especificado e CVs na Tabela 3. A coluna foi removida com 2 CVs de água desionizada a 200 cm / h. A coluna foi limpa com 3 CVs de hidróxido de sódio a 1N a 200 cm / h e armazenada em 3 CVs de hidróxido de sódio a 0,1 N a 200 cm / h.
[00115] Como mostrado na Figura 2, há uma melhora na remoção da impureza N - 1 quando a capacidade de carga é de 40% a 78%.
[00116] Coluna: 81 mL empacotados com Phenyl Sepharose Fast Flow High Sub
[00117] Altura do leito: 15 cm; Diâmetro do leito: 2,6 cm
[00118] Tampão de diluição de produto: sulfato de amônio a 575 mM, tris a 50mM, pH 8,5
[00119] Tampão de equilíbrio: Sulfato de amônio a 500 mM, tris a 50 mM, pH 8,5
[00120] Carregamento do produto bruto: Sulfato de amônio a 500 mM, tris a 50 mM, pH 8,5
[00121] Tampão de lavagem: Sulfato de amônio a 250 mM, tris a 50 mM, pH 8,5
[00122] Tampão de eluição: Sulfato de amônio a 10 mM, tris a 50 mM, pH 8,5
[00123] Tira: água
[00124] Limpeza no local: Hidróxido de sódio a 1N
[00125] Armazenamento: Hidróxido de sódio a 0,1N
[00126] Monitor UV: 295 nm
[00127] - Preparação da Amostra: A amostra crua (SEQ ID NO: 1) foi diluída 7,7 vezes com o tampão de diluição do produto (a concentração final de sulfato de amônio é 500 mM).
[00128] - Método de coluna de Cromatografia: A coluna foi equili brada com 5 volumes de coluna (CVs) de sulfato de amônio a 500 mM, tris a 50 mM, pH 8,5 a 150 cm/h. A amostra crua diluída foi carregada a uma taxa de fluxo de 150 cm/h a uma capacidade de carga dinâmica de 47% (26,5 mg de produto/ml de resina).
[00129] A coluna foi lavada com 7 CVs de sulfato de amônio a 250 mM, tris a 50 mM, pH 8,5 a 75 cm / h. A coluna foi eluída com 9 CVs de sulfato de amônio a 10 mM, tris a 50 mM, pH 8,5 a 150 cm / h e o pico foi coletado. A coluna foi removida com 3 CVs de água desioniza- da a 150 cm / h. A coluna em coluna foi limpa com 3 CVs de hidróxido de sódio a 1 N a 150 cm / h e armazenada em 3 CVs de hidróxido de sódio 0,1 N a 150 cm / h.
[00130] A quantidade relativa de remoção de impurezas ABasic, CNEt e N + 1 em relação à quantidade no produto cru é fornecida abaixo nas Tabelas 4, 5 e 6, respectivamente. Tabela 4 - Remoção da impureza ABasic Tabela 5 - Remoção da impureza CNEt Tabela 6 - Remoção da impureza N + 1
[00131] Com base nos resultados descritos nas Tabelas 4, 5 e 6, o carregamento da coluna de HIC no centro da sua capacidade de ligação dinâmica permite a remoção das impurezas ABasic, CNEt e N + 1.
Claims (16)
1. Método para separar um oligonucleotídeo alvo de uma mistura contendo o oligonucleotídeo alvo e uma impureza relacionada com o produto, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) adicionar um sal à mistura, sendo que o sal é sulfato de amônio; b) colocar em contato a mistura diluída com um adsorvente hidrofóbico a uma capacidade de carga dinâmica de aproximadamente 32 a aproximadamente 78% da capacidade do adsorvente hidrofóbico, sendo que o adsorvente hidrofóbico compreende fenila ou hexila; c) lavar o adsorvente hidrofóbico com uma solução salina aquosa; d) eluir o oligonucleotídeo alvo com uma solução de elui- ção; e e) coletar o eluente compreendendo o oligonucleotídeo alvo; sendo que a impureza relacionada com o produto compreende pelo menos uma impureza N - 1, separando assim o oligonucleo- tídeo alvo da impureza relacionada com o produto.
2. Método para separar um oligonucleotídeo alvo de uma mistura contendo o oligonucleotídeo tiolado alvo e uma impureza relacionada com o produto, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) adicionar sal à mistura, sendo que o sal é sulfato de amônio; b) colocar em contato a mistura diluída com um adsorvente hidrofóbico a uma capacidade de carga dinâmica de aproximadamente 40 a aproximadamente 100% da capacidade do adsorvente hidrofóbi- co, sendo que o adsorvente hidrofóbico compreende fenila ou hexila; c) lavar o adsorvente hidrofóbico com uma solução salina aquosa; d) eluir o oligonucleotídeo alvo com uma solução de elui- ção; e e) coletar o eluente compreendendo o oligonucleotídeo alvo; sendo que a impureza relacionada com o produto compreende pelo menos uma impureza P = O, separando assim o oligonucle- otídeo alvo da impureza relacionada com o produto.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o sal é adicionado à mistura como solução salina aquosa ou o sal é dissolvido diretamente na mistura e, em que a taxa de fluxo da etapa de lavagem é mais lenta que a taxa de fluxo de carregamento.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a solução de eluição é selecionada a partir de água, uma solução salina aquosa, etileno glicol ou propi- leno glicol ou misturas dos mesmos.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a coleta de eluição é atrasada de tal modo que não inclui os primeiros 1 a 25%, 10 a 25% ou 5 a 10% do pico de eluição do produto, ou pelo menos 1 a 25 %, 5 a 10% ou 10 a 25% do pico de eluição do produto.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o adsorvente hidrofóbico é embalado a uma altura do leito de pelo menos 15 cm.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo alvo compreende 15 a 25 nucleotídeos.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo alvo compreende nucleobases independentemente selecionadas a partir do grupo que consiste de adenina, guanina, timina (5-metil uracila), citosina, hi- poxantina, xantina, 7-metilguanina, 5,6-di-hidrouracila, 5-metilcitosina, 7-deaza purina e 5-hidroximetilcitosina.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o açúcar é substituído na posição 2’ por O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3, e O(CH2)nON[CH2)nCH3]2, onde n e m são independentemente de 1 a aproximadamente 10 ou o açúcar é substituído em 2’ por O(CH2)2OCH3.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo alvo compreende apenas RNA, apenas DNA ou uma combinação de RNA e DNA ou um gapmer.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo alvo inclui fosfodiésteres (P = O), fosforotioatos (P = S) ou uma combinação dos mesmos.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a sequência do oligonucle- otídeo alvo é (SEQ ID NO: 1) ou (SEQ ID NO: 2).
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo alvo compreende 4,4’-dimetoxitritila (DMT).
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a impureza relacionada com o produto compreende ainda pelo menos uma impureza P = O.
15. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a impureza relacionada com o produto compreende ainda pelo menos uma impureza n - 1.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a impureza relacionada com o produto inclui ainda pelo menos uma impureza ABasic, ou pelo menos uma impureza CNEt, ou pelo menos uma impureza N + 1.
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