KR102461234B1 - 올리고뉴클레오타이드의 정제를 위한 소수성 상호 작용 크로마토그래피 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 올리고뉴클레오타이드 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 정제하는 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2016년 6월 14일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/349,970호, 및 2017년 5월 1일 출원된 미국 가특허 출원 제62/492,402호에 대하여 35 U.S.C. 119(e) 하의 우선권을 주장하며, 이들 각 출원의 내용 전문은 본 출원에 참조 문헌으로 편입된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포멧으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전문은 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 편입된다. 2017년 6월 12일에 만들어진 전술한 ASCII 복사체는 123429-00120_SL.txt 로 명명되며, 크기는 839 바이트이다.
올리고뉴클레오타이드는 연구 및 의학적 목적을 위해 화학적으로 합성될 수 있는 짧은 DNA 또는 RNA 올리고머이다. 올리고뉴클레오타이드는 특정 서열을 제조하기 위해 일반적으로 뉴클레오타이드 잔기를 단계적인 첨가에 의해 제조된다. 합성 중에, 임의의 단계에서 비효율적일 수 있으며, 뉴클레오사이드가 결손되거나 ("N-1 불순물") 또는 원하는 포스포싸이오에스터 결합 대신에 포스포다이에스터 결합을 가지는 ("P=O 불순물") 올리고머를 생성한다. 또한, 합성 전 또는 후에 산화 조건에 노출되면 P=S 결합을 P=O 결합으로 전환시켜 P=O 불순물을 형성할 수 있다. 원하는 서열의 올리고뉴클레오타이드의 합성을 완료한 후, 표적 올리고뉴클레오타이드는 실패한 서열 그리고 N-1 및 P=O 불순물 모두와 함께 혼합물로서 수득된다. 이러한 불순물은 표적 올리고뉴클레오타이드로부터 분리될 필요가 있다.
흔히 사용되는 하나의 분리 기법은 역상 고압 액체 크로마토그래피 (rp-HPLC)이며, 이는 올리고뉴클레오타이드를 정제하기 위해 사용되지만, rp-HPLC는 일반적으로 N-1, P=O, 무염기성(ABasic), CNEt 및/또는 N+1 불순물을 효과적으로 제거하지 못한다. Rp-HPLC의 또 다른 단점은, 상당한 양의 유기 용매를 사용하여 폐기 문제를 야기하는 것뿐만 아니라, 방폭 시설에서 정제를 수행해야 하는 필요성을 포함한다.
그러므로, N-1, P=O, 무염기성(ABasic), CNEt 및/또는 N+1 불순물을 제거할 수 있으며 대규모 상업적 공정에 적합한 올리고뉴클레오타이드의 정제 방법이 필요하다.
본 명세서는 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC)를 사용하여 표적 올리고뉴클레오타이드를 정제하는 방법을 기재한다. 특히, 본 명세서에 기재된 방법은, 특정 동적 로딩 용량의, 표적 올리고뉴클레오타이드 및 생성물 관련 불순물의 혼합물을 소수성 상호 작용 크로마토그래피 수지 (또는 소수성 흡착제)에 적용하는 단계를 포함한다. 청구되는 방법은 표적 올리고뉴클레오타이드로부터 N-1 및 P=O 불순물의 분리를 개선할 뿐만 아니라, 정제 공정 동안 유기 용매의 사용을 제거한다. 특정 구체예에서, 청구되는 방법은 무염기성(ABasic), CNEt 및/또는 N+1 불순물을 또한 제거할 수 있다.
도 1은 동적 로딩 용량과 P=O 불순물의 제거 사이의 관계를 도시하는 플롯이다.
도 2는 동적 로딩 용량과 N-1 불순물의 제거 사이의 관계를 도시하는 플롯이다.
도 3은 무염기성(ABasic), CNEt 및 P=O 불순물의 예시적인 구조를 도시한다.
도 2는 동적 로딩 용량과 N-1 불순물의 제거 사이의 관계를 도시하는 플롯이다.
도 3은 무염기성(ABasic), CNEt 및 P=O 불순물의 예시적인 구조를 도시한다.
본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 합성 중에 생성된 생성물 관련 불순물로부터 올리고뉴클레오타이드를 분리하는 방법에 관한 것이다. 표적 올리고뉴클레오타이드, 뿐만 아니라, 다양한 생성물 관련 불순물을 포함하는 미정제 올리고뉴클레오타이드 혼합물이 특정 동적 로딩 용량(dynamic loading capacity)으로 소수성 흡착제에 적용되는 새로운 공정이 개발되었다. 이러한 새로운 방법은 N-1 불순물 및 P=O 불순물을 포함하는 특정 생성물 관련 불순물의 제거를 개선한다. 표적 올리고뉴클레오타이드의 소수성이 이의 N-1 및 P=O 불순물과 비교하여 유사할 것으로 예측되며, 이러한 불순물이 소수성 상호 작용에 또한 의존하는 공정-규모의 rp-HPLC에 의해서는 제거되지 않음에 따라, 이러한 개선은 놀라운 일이다. 특정 구체예에서, 청구되는 방법은 rp-HPLC에 의해 제거되기 어려운 무염기성 불순물, CNEt 불순물 및 N+1 불순물을 또한 제거할 수 있다.
본 발명의 제1 구체예는 표적 올리고뉴클레오타이드 및 생성물 관련 불순물을 포함하는 혼합물로부터 표적 올리고뉴클레오타이드를 분리하는 방법이며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 염을 혼합물에 첨가하는 단계;
b) 희석된 혼합물과 소수성 흡착제를 소수성 흡착제 용량의 약 32 내지 약 78%의 동적 로딩 용량으로 접촉시키는 단계;
c) 염 수용액을 사용하여 소수성 흡착제를 세척하는 단계;
d) 용리액으로 표적 올리고뉴클레오타이드를 용리시키는 단계; 및
e) 표적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 용리제를 수집하는 단계;
여기서 생성물 관련 불순물은 적어도 하나의 N-1 불순물을 포함하여, 생성물 관련 불순물로부터 표적 올리고뉴클레오타이드를 분리함.
본 발명의 제2 구체예는 표적 싸이올화 올리고뉴클레오타이드 및 생성물 관련 불순물을 포함하는 혼합물로부터 표적 올리고뉴클레오타이드를 분리하는 방법이며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 염을 혼합물에 첨가하는 단계;
b) 희석된 혼합물과 소수성 흡착제를 소수성 흡착제 용량의 약 40 내지 약 100%의 동적 로딩 용량으로 접촉시키는 단계;
c) 염 수용액을 사용하여 소수성 흡착제를 세척하는 단계;
d) 용리액으로 표적 올리고뉴클레오타이드를 용리시키는 단계; 및
e) 표적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 용리제를 수집하는 단계;
여기서 생성물 관련 불순물은 적어도 하나의 P=O 불순물을 포함하여, 생성물 관련 불순물로부터 표적 올리고뉴클레오타이드를 분리함.
본 명세서에서 사용 시, "생성물 관련 불순물(product-related impurity)"은 표적 올리고뉴클레오타이드의 합성 중에 생성된 원치 않는 부산물을 지칭한다. 특정 구체예에서, 생성물 관련 불순물은 i) N-1 불순물; ii) P=O 불순물; iii) 또는 이의 조합; 또는 iv) 상기 3 가지 중 임의의 혼합물이다. 본 명세서에서 사용 시, "N-1 불순물"은 커플링 반응의 실패로 인해 표적 올리고뉴클레오타이드에 대해 임의의 위치에서 1개의 뉴클레오사이드가 결손된 올리고뉴클레오타이드이다. 본 명세서에서 사용 시, "P=O 불순물"은, 합성 이후 실패한 황화 반응 또는 의도치 않은 산화 반응으로 인해, 표적 올리고뉴클레오타이드의 원하는 포스포로싸이오에이트 연결부 대신에 포스포다이에스터 연결부를 포함하는 올리고뉴클레오타이드이다.
특정 구체예에서, 제1 구체예에 기재된 방법은 P=O 불순물과 함께 N-1 불순물을 제거하도록 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 제2 구체예에 기재된 방법은 N-1 불순물과 함께 P=O 불순물을 제거하도록 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 생성물 관련 불순물은 또한 무염기성 불순물, CNEt 및/또는 N+1 불순물을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용 시, "N+1 불순물"은 표적 올리고뉴클레오타이드에 대해 임의의 위치에서 1개의 추가 뉴클레오사이드를 가지는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 명세서에서 사용 시, "무염기성 불순물"은 표적 올리고뉴클레오타이드와 비교하여 핵염기가 결손된 하나 이상의 뉴클레오사이드를 가지는 올리고뉴클레오타이드이며, 이러한 뉴클레오사이드는 하기에 나타낸 구조를 가진다:
염기성 불순물의 올리고뉴클레오타이드가 도 3에 나타난다. 특정 구체예에서, 무염기성 불순물 내 결손 핵염기는 아데노신 및/또는 구아닌이다. 본 명세서에서 사용 시, "CNEt" 불순물은 표적 올리고뉴클레오타이드의 비변형된 타이민 핵염기를 대신하여 변형된 타이민 핵염기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드이며, 이러한 변형된 타이민 핵염기는 다음의 구조를 가진다:
CNEt 불순물에 대한 예시적인 구조가 도 3에 나타난다.
특정 구체예에서, 생성물 관련 불순물은 쇼트머 불순물을 포함한다. 본 명세서에서 사용 시, "쇼트머 불순물(shortmer impurity)"은 표적 올리고뉴클레오타이드에 대해 임의의 위치에서 1, 2, 3, 4개 이상 뉴클레오사이드가 결손된 올리고뉴클레오타이드이다.
특정 구체예에서, 생성물 관련 불순물은 조기 용리성 불순물 (EEI, earlier-eluting impurity)을 포함한다. 본 명세서에서 사용 시, "조기 용리 불순물"은 본 명세서에 기재된 정제 방법을 사용하여 표적 올리고뉴클레오타이드 전에 용리되는 불순물이다. 하나의 구체예에서, EEI는 쇼트머 불순물, 예컨대 N-1 불순물, P=O 불순물, 및/또는 무염기성 불순물을 포함한다.
특정 구체예에서, 생성물 관련 불순물은 후기 용리성 불순물 (LEI, later-eluting impurity)을 포함한다. 본 명세서에서 사용 시, "후기 용리 불순물"은 본 명세서에 기재된 정제 방법을 사용하여 표적 올리고뉴클레오타이드 이후에 용리되는 불순물이다. 하나의 구체예에서, LEI는 N+1 불순물을 포함한다.
"올리고뉴클레오타이드"는 복수의 연결된 뉴클레오사이드를 포함하는 화합물을 의미한다. 특정 구체예에서, 복수의 뉴클레오사이드 중 하나 이상은 변형된다. 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 리보뉴클레오사이드 (RNA) 및/또는 이독시리보뉴클레오사이드 (DNA)를 포함한다. 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 오직 RNA, 오직 DNA를 포함하거나, RNA 및 DNA 둘 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 표적 올리고뉴클레오타이드는 갭머이다. “갭머(Gapmer)”는 RNase H 절단을 보조하는 복수의 뉴클레오사이드를 가지는 내부 영역이 하나 이상의 뉴클레오사이드를 가지는 외부 영역 사이에 위치되어 있는 키메릭 화합물을 의미하며, 이러한 내부 영역을 포함하는 뉴클레오사이드는 외부 영역을 포함하는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드들과 화학적으로 구별된다. 특정 구체예에서, 표적 올리고뉴클레오타이드는 10 내지 100, 10 내지 50, 10 내지 25, 15 내지 100, 15 내지 50, 또는 15 내지 25개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
"뉴클레오사이드"는 핵염기 및 당 모이어티를 포함하는 화합물을 의미한다. 뉴클레오사이드로는 천연 존재의 뉴클레오사이드, 변형된 뉴클레오사이드, 및 유사 염기 및/또는 당 그룹을 가지는 뉴클레오사이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "변형된 뉴클레오사이드"는 천연 존재의 RNA 또는 DNA 뉴클레오사이드와 비교하여 적어도 하나의 변형을 포함하는 뉴클레오사이드이다. 이러한 변형은 당 모이어티 및/또는 핵염기에 있을 수 있다. 뉴클레오사이드는 핵염기 또는 당 모이어티에서 임의의 다양한 치환체로 변형될 수 있다.
"뉴클레오타이드"는 두 개의 뉴클레오사이드를 올리고뉴클레오타이드의 일부로서 함께 연결시키는 연결 그룹을 포함하는 뉴클레오사이드를 지칭한다. 두 종류의 주된 부류의 연결 그룹은 인 원자의 존재 또는 부재에 의해 정의된다. 예시적인 인 함유 연결부로는, 포스포다이에스터 (P=O), 포스포트라이에스터, 메틸포스포네이트, 포스포아미데이트, 및 포스포로싸이오에이트 (P=S)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 인 비함유 연결 그룹으로는, 메틸렌메틸이미노 (―CH2-N(CH3)-O―CH2-), 싸이오다이에스터 (―O―C(O)―S―), 싸이오노카바메이트 (―O― C(O)(NH)―S―); 실록세인 (―O―Si(H)2-O―); 및 N,N'-다이메틸하이드라진 (―CH2-N(CH3)-N(CH3)-)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, 이러한 연결 그룹은 포스포다이에스터 (P=O) 또는 포스포로싸이오에이트 (P=S)이다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 구체예에 기재된 방법의 표적 올리고뉴클레오타이드는 연결 그룹으로서 오직 포스포다이에스터 (P=O), 포스포로싸이오에이트 (P=S), 또는 이의 조합을 포함한다.
"핵염기"는 뉴클레오사이드의 헤테로사이클릭 염기 부분을 의미한다. 특정 구체예에서, 핵염기는 또 다른 핵산의 핵염기와 수소 결합을 할 수 있는 임의의 원자 또는 원자 그룹을 포함할 수 있다. 핵염기는 천연 존재할 수 있거나, 변형될 수 있다. 또한 "비변형된" 또는 "천연" 핵염기, 예컨대 퓨린 핵염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 핵염기 타이민 (T) (또는 5-메틸 우라실), 사이토신 (C) 및 우라실 (U), 당업자에게 공지된 다수의 변형된 핵염기 또는 핵염기 유사체는, 제1 또는 제2 구체예에 기재된 방법에 의해 분리되는 바와 같이 표적 올리고뉴클레오타이드 내로 혼입되기 쉬우며, 예를 들어, 하이포잔틴, 잔틴, 7-메틸 구아닌, 5,6-다이하이드로우라실, 5-메틸사이토신, 7-디아자 퓨린 및 5-하이드록시메틸사이토신을 포함한다. 특정 구체예에서, 이러한 방법은 제1 또는 제2 구체예에 기재된 바와 같으며, 핵염기는 아데닌, 구아닌, 타이민 (5-메틸 우라실), 및 5-메틸사이토신으로부터 선택된다.
"당 모이어티"는 천연 또는 변형된 당 또는 당 대용체를 의미한다.
"천연 당"은 DNA (2'-H) 또는 RNA (2'-OH) 중 리보퓨라노스 모이어티를 의미한다.
"변형된 당"은 천연 당의 모이어티 이외의 적어도 하나의 치환체를 포함하는 리보퓨라노스 모이어티를 의미한다. 이러한 변형으로는, 치환체 그룹의 첨가, 바이사이클릭 핵산 (BNA)을 형성하기 위한 비-제미날(non-geminal) 고리 원자의 가교, 리보실 고리 산소 원자의 S, N(R), 또는 C(R1)(R2) (R=H, C1-C12 알킬 또는 보호 그룹)로의 치환 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, 당은 2'-위치에서 변형되어 ("2'-변형된" 또는 "2'-치환된") H 또는 OH 이외의 치환체를 포함한다. 택일적으로, 당의 5'-위치에서 변형된다. 특정 구체예에서, 당은 2'-위치 및 5'-위치에서 변형된다.
본 발명에 유용한 당 변형의 예로는 다음으로부터 선택되는 당 치환체 그룹을 포함하는 화합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: OH, F, O-알킬, S-알킬, N-알킬, 또는 O-알킬-O-알킬, 여기서 알킬, 알켄일 및 알카인일은 치환된 또는 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알켄일 및 알카인일일 수 있다. 특정 구체예에서, 이러한 치환체는 다음으로부터 선택된다: 할라이드 (F를 포함하지만, 이에 제한되지 않음), 알릴, 아미노, 아지도, 싸이오, O-알릴, O―C1-C10 알킬, ―OCF3, O―(CH2)2―O―CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O―(CH2)2―O―N(Rm)(Rn), 또는 O―CH2-C(=O)―N(Rm)(Rn), 여기서 각각의 Rm 및 Rn는, 독립적으로, H 또는 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬이다. 특히, 제1 또는 제2 구체예에 기재된 방법에 사용하기 적합한 변형된 뉴클레오사이드는 다음과 같다: 2'-메톡시에톡시 ("MOE" 또는 "2'-MOE" 또는 "2'-OCH2CH2OCH3), 2'-O-메틸 ("2'-OMe" 또는 2'-O―CH3), 또는 2'-플루오로 (2'-F).
특정 구체예에서, 2'-위치에 다음으로부터 선택되는 치환체 그룹을 가지는 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3, 및 O(CH2)nON[CH2)nCH3]2, 여기서 n 및 m은 독립적으로 1 내지 약 10이다. 다른 2'-당 치환체 그룹은 다음을 포함한다: C1 내지 C10 알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 알카인일, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클릴, 및 아미노알킬아미노.
특정 구체예에서, 5'-위치의 산소 원자에 다음으로부터 선택된 치환체 그룹을 가지는 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다: 아세틸렌 (Ac); 벤조일 (Bz); 벤질 (Bn); β-메톡시에톡시메틸 에터 (MEM); 다이메톡시트라이틸, [비스-(4-메톡시페닐)페닐메틸] (DMT); 메톡시메틸 에터 (MOM); 메톡시트라이틸 [(4-메톡시페닐)다이페닐메틸, MMT); p-메톡시벤질 에터 (PMB); 메틸싸이오메틸 에터; 피발론일 (Piv); 테트라하이드로피란일 (THP); 테트라하이드로퓨란 (THF); 트라이틸 (트라이페닐메틸, Tr); 실릴 에터 (트라이메틸실릴 (TMS), tert-뷰틸다이메틸실릴 (TBDMS), 트라이-아이소-프로필실릴옥시메틸 (TOM), 및 트라이아이소프로필실릴 (TIPS) 에터를 포함하지만 이에 제한되지 않음); 메틸 에터, 에톡시에틸 에터 (EE), 및 5'O-(α-메틸-6-나이트로피페론일옥시카보닐) (MeNPOC). 특정 구체예에서, 5' 위치는 -ODMT이다.
변형된 당 모이어티를 가지는 뉴클레오사이드의 예로는 5'-바이닐, 5'-메틸, 5'-ODMT, 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3 및 2'-O(CH2)2OCH3 치환체 그룹을 포함하는 뉴클레오사이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 구체예에서, 2'-당 치환체 그룹은 아라비노 (위) 위치 또는 리보 (아래) 위치에 있다. 이러한 특정 구체예에서, 2'-아라비노 변형은 2'-F 아라비노 (FANA)이다. 유사한 변형은 또한 당의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오사이드의 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오타이드 상의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, 용어 "알킬"은 완전 포화 분지형 또는 비분지형 탄화수소 모이어티를 지칭한다. 바람직하게 알킬은 1 내지 20개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게 1 내지 16개의 탄소 원자, 1 내지 10개의 탄소 원자, 1 내지 6개의 탄소 원자, 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함한다. 일부 구체예에서, 알킬은 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함한다. 알킬의 예시적인 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소-프로필, n-뷰틸, sec-뷰틸, 아이소-뷰틸, tert-뷰틸, n-펜틸, 아이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 3-메틸헥실, 2,2-다이메틸펜틸, 2,3-다이메틸펜틸, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, 또는 n-데실을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"알켄일"은 선형 또는 분지형일 수 있으며 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 가지는 불포화 탄화수소 그룹을 지칭한다. 2-6개의 탄소 원자를 가지는 알켄일 그룹이 바람직할 수 있다. 알켄일 그룹은 1, 2 또는 3 탄소-탄소 이중 결합, 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 알켄일 그룹의 예로는 에텐일, n-프로펜일, 아이소펜텐일, n-뷰트-2-엔일, n-헥스-3-엔일 등을 포함한다.
"알카인일"은 선형 또는 분지형일 수 있으며 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 가지는 불포화 탄화수소 그룹을 지칭한다. 2-6개의 탄소 원자를 가지는 알카인일 그룹이 바람직할 수 있다. 알카인일 그룹은 1, 2 또는 3 탄소-탄소 이중 결합, 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 알카인일 그룹의 예로는 에타인일, n-프로파인일, n-뷰트-2-인일, n-헥스-3-인일 등을 포함한다.
용어 "아릴"은 고리 부분에 6 내지 14개의 탄소 원자를 가지는 모노사이클릭, 바이사이클릭 또는 트라이사이클릭 방향족 탄화수소 그룹을 지칭한다. 하나의 구체예에서, 용어 아릴은 6 내지 10개의 탄소 원자를 가지는 모노사이클릭 및 바이사이클릭 방향족 탄화수소 그룹을 지칭한다. 아릴 그룹의 예시적인 예로는 페닐, 나프틸, 플루오렌일, 및 안트라센일을 포함한다. 용어 "아릴"은 또한 적어도 하나의 고리가 방향족이며, 하나 또는 두 개의 비-방향족 탄화수소 고리(들)에 접합된 바이사이클릭 또는 트라이사이클릭 그룹을 지칭한다. 비제한적인 예로는 테트라하이드로나프탈렌, 다이하이드로나프탈렌일 및 인단일을 포함한다. "아릴알킬"은 알킬렌 링커를 통해 분자의 나머지에 연결되는 아릴 그룹이다. "알카릴"은 아릴렌 링커를 통해 분자의 나머지에 연결되는 알킬 그룹이다.
본 명세서에서 사용 시, 용어 "헤테로사이클릴"은 3- 내지 7-고리 원, 또는 특히 3- 내지 6- 고리 원 또는 5- 내지 7- 고리 원을 가지고, 이 중 적어도 하나는 헤테로원자이며, 이 중 최대 4개 (예컨대, 1, 2, 3, 또는 4개)가 헤테로원자일 수 있는 포화 또는 불포화, 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 (예컨대, 가교된 또는 스파이로 고리 시스템) 고리 시스템을 지칭하며, 여기서 헤테로원자는 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택되고, C는 산화될 수 있고 (예컨대, C(O)), N은 산화 (예컨대, N(O)) 또는 4차화될 수 있고, S는 선택적으로 설폭사이드 및 설폰으로 산화될 수 있다. 불포화 헤테로사이클릭 고리는 헤테로아릴 고리를 포함한다. 본 명세서에서 사용 시, 용어 "헤테로아릴"은 1 내지 4개의 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 헤테로원자를 가지는 방향족 5 또는 6 원 모노사이클릭 고리 시스템을 지칭하며, 여기서 N은 산화 (예컨대, N(O)) 또는 4차화될 수 있고, S는 선택적으로 설폭사이드 및 설폰으로 산화될 수 있다. 하나의 구체예에서, 헤테로사이클릴은 3- 내지 7-원 포화 모노사이클릭 또는 3- 내지 6-원 포화 모노사이클릭 또는 5- 내지 7-원 포화 모노사이클릭 고리이다. 하나의 구체예에서, 헤테로사이클릴은 3- 내지 7-원 모노사이클릭 또는 3- 내지 6-원 모노사이클릭 또는 5- 내지 7-원 모노사이클릭 고리이다. 또 다른 구체예에서, 헤테로사이클릴은 6 또는-7-원 바이사이클릭 고리이다. 헤테로사이클릴 그룹은 헤테로원자 또는 탄소 원자에 부착될 수 있다.
"바이사이클릭 뉴클레오사이드" 또는 "BNA"는 뉴클레오사이드의 당 모이어티가 당 고리의 2개의 탄소 원자를 연결하는 가교를 포함하여, 바이사이클릭 당 모이어티를 형성하는 뉴클레오사이드를 의미한다. BNA의 예로는 4' 및 2' 리보실 고리 원자 사이에 가교를 포함하는 뉴클레오사이드 ("4'-2' 바이사이클릭 뉴클레오사이드"), 예를 들어, 퓨라노스 고리의 2 개의 탄소 원자를 연결하여 당 고리의 2' 탄소 원자 및 4' 탄소 원자를 연결하는 가교를 포함하는 퓨라노스 고리를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 구체예에서, 표적 올리고뉴클레오타이드는 가교가 다음의 화학식 중 하나를 포함하는 하나 이상의 BNA 뉴클레오사이드를 포함한다: 4'-β-D-(CH2)―O-2' (β-D -LNA); 4'-(CH2)―S-2; 4'-α-L-(CH2)―O-2' (α-L-LNA); 4'-(CH2)2―O-2' (ENA); 4'- C(CH3)2―O-2' (PCT/US2008/068922 참조); 4'-CH(CH3)―O-2' ("cEt") 및 4'-C― H(CH2OCH3)―O-2' (2008년 7월 15일 자, 미국 가특허 출원 제7,399,845호 참조); 4'-CH2―N(OCH3)-2' (PCT/US2008/064591 참조); 4'-CH2―O―N(CH3)-2' (2004년 9월 2일에 공개된, 미국 공개 특허 출원 US2004-0171570 참조); 4'-CH2―N(R)―O-2' (2008년 9월 23일자, 미국 가특허 출원 제7,427,672호 참조); 4'-CH2―C(CH3)-2' 및 4'-CH2―C(=CH2)-2' (PCT/US2008/066154 참조); 여기서 R은, 독립적으로, H, C1-C12 알킬, 또는 보호 그룹임. 특정 구체예에서, 본 발명은 바이사이클릭 당 모이어티가 아닌 변형된 당 모이어티를 포함하는 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다.
"당 대용체"는 뉴클레오사이드의 당에 치환할 수 있는 리보퓨라노스 고리 이외의 구조를 의미한다. 당 대용체의 예로는, 산소가, 예를 들어, 황 또는 질소로 대체되어, 예를 들어, 모폴리노를 형성하는 6-원 고리의 당 및 4'-싸이오-함유 당을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 구체예에서, 제1 또는 제2 구체예에 기재된 방법에 의해 분리된 표적 올리고뉴클레오타이드는 (5'에서부터 3'으로) 다음의 서열을 가지는 포스포로싸이오에이트 올리고뉴클레오타이드이며:
TCACTTTCATAATGCTGG (서열 번호 1),
이러한 올리고뉴클레오타이드의 각 뉴클레오사이드 간 연결부는 포스포로싸이오에이트 연결부이고, 올리고뉴클레오타이드의 각 뉴클레오사이드는 2'-메톡시에틸 (MOE) 뉴클레오사이드이고, 각 사이토신은 5'-메틸사이토신이다. 서열 번호 1은 또한 BIIB058로서 공지되어 있으며, WO2007/002390, WO2010/148249, 및 US8,980,853에 기재되어 있고, 상기 특허 각각의 교시는 본 명세서에 참조 문헌으로 편입된다.
특정 구체예에서, 제1 또는 제2 구체예에 기재된 방법에 의해 분리된 표적 올리고뉴클레오타이드는 (5'에서 3') 다음의 서열을 가지는 5-10-5 MOE 갭머이며:
CAGGATACATTTCTACAGCT (서열 번호 2),
여기서 뉴클레오사이드 1-5 및 16-20 각각은 2'-O-메톡시에틸리보스 변형된 뉴클레오사이드이며, 뉴클레오사이드 6-15 각각은 2'-디옥시뉴클레오사이드이고, 여기서 뉴클레오사이드 2 내지 3, 4 내지 5, 16 내지 17, 및 18 내지 19 사이의 뉴클레오사이드 간 연결부는 포스포다이에스터 연결부이며, 뉴클레오사이드 1 내지 2, 3 내지 4, 5 내지 6, 6 내지 7, 7 내지 8, 8 내지 9, 9 내지 10, 10 내지 11, 11 내지 12, 12 내지 13, 13 내지 14, 14 내지 15, 15 내지 16, 17 내지 18, 및 19 내지 20 사이의 뉴클레오사이드 간 연결부는 포스포로싸이오에이트 연결부이고, 각 사이토신은 5'-메틸사이토신이다. 서열 번호 2는 다음의 화학적 표기법으로 기재된다: mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te;
여기서,
A = 아데닌,
mC = 5'-메틸사이토신
G = 구아닌,
T = 타이민,
e = 2'-O-메톡시에틸리보스 변형된 당,
d = 2'-디옥시리보스 당,
s = 포스포로싸이오에이트 뉴클레오사이드 간 연결부, 및
o = 포스포다이에스터 뉴클레오사이드 간 연결부.
서열 번호 2는 BIIB067 또는 ISIS 666853로서 공지되어 있으며, WO2015153800에 기재되어 있고, 상기 특허의 교시는 본 명세서에 참조 문헌으로 편입된다.
소수성 흡착제 (즉, "소수성 수지")는 표적 올리고뉴클레오타이드가 이에 결합하여 제1 또는 제2 구체예에 기재된 방법에서 생성물 관련 불순물로부터 분리될 수 있는 임의의 물질이다. 예를 들어, 소수성 흡착제로는 친수성 탄수화물: 가교된 아가로스 및 합성 공중합체 물질을 포함한다. 특히, 소수성 흡착제는 페닐, 뷰틸 또는 헥실을 포함한다. 예를 들어, Hexyl65OC은 적합한 소수성 흡착제이다. 게다가, 소수성 흡착제는 적어도 15 cm의 층 높이(bed height), 예를 들어 적어도 20 cm, 적어도 25 cm, 또는 적어도 30 cm; 또는 약 15 cm 내지 약 30 cm; 약 15 cm 내지 20 cm, 약 20 내지 약 25 cm, 또는 약 25 cm 내지 약 30 cm로 충전된다.
"동적 로딩 용량"은 일반적인 유동 조건하에서 크로마토그래피 수지에 결합하는 생성물 (예컨대, 올리고뉴클레오타이드 생성물)의 양으로 정의되며, 당업자에게 공지된 다른 로딩 요인 가운데 특정 유동 조건 및 로딩 염 농도 하에서 결정된다. 생성물 수준이 플로우 스루 ("파과점(breakthrough point)"으로 지칭)에서 측정되기 전 로딩될 수 있는 양에 기초하여 측정된다. 특히, 분리될 물질은 (배치 모드에서 수행되는 정적과 대조적으로) 유동 방식으로 특정 유동 속도, 예를 들어, 약 100 내지 약 250 cm/hr, 특히, 200 cm/hr로 수지에 적용된다. 당업자는, 염에서의 생성물의 용해도에 기초한 염 농도 및 비드 크기, 층 높이 및 다른 변수에 기초한 유동 속도 둘 모두를 선택하여, 유입구 압력이 초과되지 않고, 특정 동적 로딩 속도를 달성하는 방법을 알 것이다.
예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 혼합물에 대한 소수성 흡착제의 용량이 50 mg/mL인 경우 (동적), 50 mg/mL의 혼합물을 적용하면 100 % 동적 로딩 용량일 것이다. 유사하게, 50 mg/mL 소수성 흡착제의 경우, 25 mg/mL의 혼합물을 적용하면 50 % 동적 로딩 용량일 것이다. 제1 구체예에 기재된 방법의 경우, 동적 로딩 용량은 약 32 % 내지 약 78 %, 예를 들어, 약 32 % 내지 약 45%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45 % 내지 약 55%, 약 50% 내지 약 60%, 약 55 % 내지 약 65 %, 약 60 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 78%, 또는 약 32% 내지 약 50 %, 약 40 내지 약 75%, 또는 약 50% 내지 약 78%이다. 제2 구체예에 기재된 방법의 경우, 동적 로딩 용량은 약 40 % 내지 약 100 %, 예를 들어, 약 40 % 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60 % 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80 % 내지 약 90 %, 약 90 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 75%, 또는 약 40% 내지 약 60 %, 또는 약 40% 내지 약 80%이다. 제1 또는 제2 구체예 모두에 기재된 방법의 경우, 동적 로딩 용량은 약 40 % 내지 약 78 %, 예를 들어, 약 40 % 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 50%, 약 50 % 내지 약 55%, 약 55% 내지 약 60%, 약 60 % 내지 약 65 %, 약 65 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 75%, 또는 약 40% 내지 약 50 %, 약 40 내지 약 75%, 또는 약 50% 내지 약 78%이다.
제3 구체예에서, 방법은 제1 또는 제2 구체예에 기재된 방법과 같고, 염은 염 수용액으로서 혼합물에 첨가되거나, 염이 혼합물 내로 직접 용해된다.
특히, 염은 NH4 +, K+ 또는 Na+ 중 임의의 양이온 및 F-, [SO4]-2, [HPO4]-2, 아세테이트 또는 Cl- 또는 이의 조합을 포함하는 음이온 중 임의의 음이온을 포함한다. 구체적으로, 염은 암모늄 설페이트이다.
제4 구체예에서, 제1, 제2, 또는 제3 구체예에 기재된 방법 중 임의의 방법과 같고, 여기서 세척 단계의 유동 속도는 로딩 유동 속도보다 느리다. 특히, 로딩 단계의 유동 속도는 약 150 cm/hr 내지 약 250 cm/hr이며 세척 단계의 유동 속도는 약 50 cm/hr 내지 약 150 cm/hr이고, 예를 들어, 로딩 단계의 유동 속도는 약 175 cm/hr 내지 약 225 cm/hr이고 세척 단계의 유동 속도는 약 75 cm/hr 내지 약 125 cm/hr이다. 특히, 로딩 단계의 유동 속도는 약 200 cm/hr이고 세척 단계의 유동 속도는 약 100 cm/hr이다.
제5 구체예에서, 방법은 제1, 제2, 제3, 또는 제4 구체예에 기재된 방법 중 임의의 방법과 같고, 용리액은 물, 염 수용액, 에틸렌 글리콜, 또는 프로필렌 글리콜 또는 이의 혼합물로부터 선택된다. 특히, 염은 NH4 +, K+ 또는 Na+ 중 임의의 양이온 및 F-, [SO4]-2, [HPO4]-2, 아세테이트 또는 Cl- 또는 이의 조합을 포함하는 음이온 중 임의의 음이온을 포함한다.
구체적으로, 염은 암모늄 설페이트이다.
제6 구체예에서, 방법은 제1, 제2, 제3, 제4, 또는 제5 구체예에 기재된 방법 중 임의의 방법과 같고, 여기서 생성물 용리 피크의 처음 2-25%, 처음 2-10%, 처음 2-8%, 처음 4-6%, 처음 5-10% 또는 처음 10-25%를 포함하지 않도록 용리 수집이 지연된다. 더욱 구체적인 구체예에서, 생성물 용리 피크의 처음 5%를 포함하지 않도록 수집이 지연된다. 특히, 용리제는 분획으로 수집되며, 분획 크기는 개별 분획에서 생성물 관련 불순물로부터 표적 올리고뉴클레오타이드를 분리하도록 조정된다. 분획 크기는, 부분적으로, 올리고뉴클레오타이드와 생성물 관련 불순물 사이의 용리 시간의 차이, 표적 올리고뉴클레오타이드 및 분리되어야 하는 생성물 관련 불순물을 포함하는 미정제 생성물의 양, 등에 따라, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 제6 구체예에서, 방법은 제1, 제2, 제3, 제4, 또는 제5 구체예에 기재된 방법 중 임의의 방법과 같고, 용리 수집은 생성물 용리 피크의 처음 및 마지막 2-25%를 포함하지 않는다. 보다 구체적으로, 용리 수집은 생성물 용리 피크의 처음 및 마지막 2-10%, 처음 및 마지막 2-8%, 처음 및 마지막 4-6%, 처음 및 마지막 5-10% 또는 처음 및 마지막 10-25 %를 포함하지 않는다. 또 다른 특정 구체예에서, 용리 수집은 생성물 용리 피크의 처음 및 마지막 5%를 포함하지 않는다.
하나의 구체예에서, 세척 용액은 세척 단계 동안 일정하게 유지되며, 이는 등용매 세척 방식으로 공지되어 있다. 택일적으로, 세척 용액은 세척 단계 동안 변경되며, 이는 구배 세척 방식으로 공지되어 있다. 구배 세척에서, 세척 용액은 높은 이온 강도 또는 극성에서부터 낮은 이온 강도 또는 극성으로 변경될 수 있다. 극성 또는 이온 강도의 감소는, 수용액의 염 농도를 감소시키거나, 극성 또는 이온 강도가 높은 염 용액에 대해, 더욱 극성인 용매, 예컨대, 물, 또는 다른 극성 용매, 예컨대, 에틸렌 또는 프로필렌 글리콜의 부피 비율을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 택일적으로, 세척 용액은 낮은 극성 또는 높은 이온 강도에서부터 높은 극성 또는 낮은 이온 강도로 변경될 수 있다. 또 다른 택일의 구체예에서, 구배 세척 단계 이후 등용매 세척 단계를 수행하거나, 또는 그 반대일 수 있다.
하나의 구체예에서, 용리액은 용리 중에 일정하게 유지되며, 이는 등용매 용리 방식으로 공지되어 있다. 택일적으로, 용리액은 용리 중에 변경되며, 구배 용리 방식으로 공지되어 있다. 구배 용리에서, 용리액은 높은 이온 강도 또는 낮은 극성에서부터 낮은 이온 강도 또는 높은 극성으로 변경될 수 있다. 극성의 증가 또는 이온 강도의 감소는, 수용액의 염 농도를 감소시키거나, 극성 또는 이온 강도가 높은 염 용액에 대해, 더욱 극성인 용매, 예컨대, 물, 또는 다른 극성 용매, 예컨대, 에틸렌 또는 프로필렌 글리콜의 부피 비율을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 택일적으로, 용리 용액은 낮은 극성 또는 높은 이온 강도에서부터 높은 극성 또는 낮은 이온 강도로 변경될 수 있다. 또 다른 택일의 구체예에서, 구배 용리 단계 이후 등용매 용리 단계를 수행하거나, 또는 그 반대일 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법은 EEI 및/또는 LEI를 또한 제거할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법은 쇼트머 불순물, N+1 불순물, 무염기성 불순물, CNEt 불순물, 및 P=O 불순물로부터 선택되는 적어도 하나의 생성물 관련 불순물을 제거할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법은 N-1 불순물, N+1 불순물, 무염기성 불순물, 및 CNEt 불순물 이외의, N-1 불순물, P=O 불순물, 및 쇼트머 불순물로부터 선택되는 적어도 하나의 생성물 관련 불순물을 제거할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법은 N-1 불순물, N+1 불순물, 무염기성 불순물, 및 CNEt 불순물 이외의, N-1 불순물, P=O 불순물, 쇼트머 불순물을 제거할 수 있다.
"표적 올리고뉴클레오타이드 및 생성물 관련 불순물을 포함하는 혼합물로부터 표적 올리고뉴클레오타이드의 분리" 또는 "생성물 관련 불순물 제거"는, 혼합물로부터 본 명세서에 기재된 생성물 관련 불순물, 예를 들어 N-1 불순물, P=O 불순물, 무염기성 불순물, CNEt 불순물 또는 N+1 불순물 중 하나 이상의 적어도 15%, 예를 들어, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 또는 60%를 제거하는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1.
N-1 또는 P=O 불순물의 제거
재료:
컬럼: 6.84mL 페닐 세파로스 패스트 플로우 하이 서브(Phenyl Sepharose Fast Flow High Sub)
층 높이: 20 cm
생성물 희석 완충액: 850mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5
평형 완충액: 800mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5
미정제 생성물 로딩: 765 mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5
세척 완충액: 440mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5
용리 완충액: 40mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5
스트립: 탈이온수
제자리 세정: 1N 소듐 하이드록사이드
저장: 0.1N 소듐 하이드록사이드
UV 모니터: 295nm
방법:
-샘플 제조: 샘플 (서열 번호 2)를 희석 완충액을 사용하여 10 배로 희석하였다 (최종 암모늄 설페이트 농도는 765mM)
-사이클 방법: 컬럼을 800mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5의 4배의 컬럼 부피(CV)를 사용하여 200 cm/hr으로 평형화시켰다. 샘플을 다음의 3가지 상이한 동적 로딩 용량으로 200 cm/hr의 속도로 로딩하였다:
실행 1: 8.8%의 동적 로딩 용량으로 로딩.
실행 2: 47%의 동적 로딩 용량으로 로딩.
실행 3: 100%의 동적 로딩 용량으로 로딩.
컬럼을 440mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5의 7배의 CV를 사용하여 100 cm/hr으로 세척하였다. 컬럼을 40mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5의 6배의 CV를 사용하여 200 cm/hr으로 용리시켰다. 컬럼을 2 CV의 탈이온수를 사용하여 200 cm/hr으로 스트리핑하였다. 컬럼을 3배의 CV 1N 소듐 하이드록사이드를 사용하여 200 cm/hr로 세정하고, 3배의 CV 0.1N 소듐 하이드록사이드에 200 cm/hr로 저장하였다.
결과:
N-1 및 P=O 불순물의 상대적인 제거량이 하기 표 1 및 2에 각각 제공된다.
표 1 - N-1 불순물의 제거
표 2- P=O 불순물의 제거
표 1 및 2에 기재된 결과에 기초하여, N-1 및 P=O 불순물을 제거하기 위해 적절한 동적 로딩 용량을 사용할 필요가 있다.
실시예 2.
동적 로딩 용량과 P=O 불순물 제거 사이의 관계
P=O 생성물 관련 불순물의 제거에 대한 동적 로딩 용량의 영향은 Design of Experiment (DesignExpert™ v9) 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 통계 설계 유형은 중심 복합 설계이었다. 연구 유형은 반응 표면이었다. 20 cm 층 높이 및 45 mg/mL 동적 결합 용량의 페닐 세파로스 컬럼을 사용하여 50회의 실행을 수행하였다. 세척 완충액은 440mM 암모늄 설페이트이었고, 용리 완충액은 40 mM 암모늄 설페이트이었다. 각각, 7배 및 6배 컬럼 부피의 세척 및 용리 완충액을 사용하였다. 상기 실시예 1에 기재된 바와 동일한 조건을 사용하여, 올리고뉴클레오타이드로서 서열 번호 2를 사용하였다.
분석 결과는, P=O 불순물에 대하여 42%-100%의 로딩 용량의 경우에 (즉, 도 1의 차트상의 19 mg/mL- 45 mg/mL) P=O 불순물의 제거가 개선되었음을 입증한다.
실시예 3.
동적 로딩 용량과 N-1 불순물 제거 사이의 관계
N-1 생성물 관련 불순물의 제거에 대한 동적 로딩 용량의 영향의 평가가 도 2에 나타난다. 5회의 실행을 도 2에 플로팅하였으며, 이는 45 mg/mL 소수성 흡착제의 9, 24, 47, 69 및 100%의 로딩 용량에 해당한다. N-1 제거 백분율은 미정제물 내 시작 N-1 수준으로부터 계산하였다. 분석 결과, N-1 제거에 있어서 로딩 비율이 중요한 유일한 요인으로 결론지었다. 그러므로, 다른 변수는 통계 분석에 따라 N-1 제거에 제거에 중요하지 않다.
재료:
컬럼: 6.84mL 페닐 세파로스 패스트 플로우 하이 서브 (Ge Healthcare Life Sciences, P/C: 17-0973-05)
층 높이: 20 cm
층 높이: 20 cm
생성물 희석 완충액: 850mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5
평형 완충액: 800mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5
미정제 생성물 로딩: 765 mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5
세척 완충액: 440mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5 400mM
암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5
용리 완충액: 40mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5
10mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5
스트립: 탈이온수
제자리 세정: 1N 소듐 하이드록사이드
저장: 0.1N 소듐 하이드록사이드
UV 모니터: 295nm
방법:
-샘플 제조: 샘플 (서열 번호 2)를 희석 완충액을 사용하여 10 배로 희석하였다 (최종 암모늄 설페이트 농도는 765mM)
-사이클 방법: 컬럼을 800mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5의 4배의 컬럼 부피(CV)를 사용하여 200 cm/hr으로 평형화시켰다. 샘플을 표 3에 나타난 5가지 상이한 로딩 용량으로 200 cm/hr의 속도로 로딩하였다:
표 3- 실행 로딩 양을 기준으로 N-1 제거에 대한 DoE 변수
컬럼을 표 3에 명시된 세척 완충액 및 CV를 사용하여 100 cm/hr로 세척하였다. 컬럼을 표 3에 명시된 세척 완충액 및 CV를 사용하여 200 cm/hr로 용리시켰다. 컬럼을 2 CV의 탈이온수를 사용하여 200 cm/hr으로 스트리핑하였다. 컬럼을 3배의 CV 1N 소듐 하이드록사이드를 사용하여 200 cm/hr로 세정하고, 3배의 CV 0.1N 소듐 하이드록사이드에 200 cm/hr로 저장하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 40% 내지 78%의 로딩 용량의 경우에 N-1 불순물의 제거가 개선되었다.
실시예 4.
무염기성(ABasic), CNEt 또는 N+1 불순물의 제거
재료:
컬럼: 81 mL 페닐 세파로스 패스트 플로우 하이 서브로 패킹
층 높이: 15 cm; 층 직경(bed diameter): 2.6 cm
층 높이: 15 cm; 층 직경(bed diameter): 2.6 cm
생성물 희석 완충액: 575mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5
평형 완충액: 500mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5
미정제 생성물 로딩: 500 mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5
세척 완충액: 250mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5
용리 완충액: l0mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5
스트립: 물
제자리 세정: 1N 소듐 하이드록사이드
저장: 0.1N 소듐 하이드록사이드
UV 모니터: 295nm
방법:
-샘플 제조: 미정제 샘플 (서열 번호 1)을 생성물 희석 완충액을 사용하여 7.7 배로 희석하였다 (최종 암모늄 설페이트 농도는 500mM).
-크로마토그래피 컬럼 방법: 컬럼을 500mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5의 5배의 컬럼 부피(CV)를 사용하여 150 cm/hr으로 평형화시켰다. 희석된 미정제 샘플을 47%의 동적 로딩 용량 (26.5 mg 생성물/mL 수지)으로 150 cm/hr의 유동 속도로 로딩하였다.
컬럼을 250mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5의 7배의 CV를 사용하여 75 cm/hr으로 세척하였다. 컬럼을 10mM 암모늄 설페이트, 50mM 트리스, pH 8.5의 9배의 CV를 사용하여 150 cm/hr으로 용리시키고, 피크를 수집하였다. 컬럼을 3 CV의 탈이온수를 사용하여 150 cm/hr으로 스트리핑하였다. 컬럼을 3배의 CV 1N 소듐 하이드록사이드를 사용하여 150 cm/hr로 세정하고, 3배의 CV 0.1N 소듐 하이드록사이드에 150 cm/hr로 저장하였다.
결과:
미정제물 내 양에 대한 무염기성(ABasic), CNEt 및 N+1 불순물의 상대적인 제거량이 하기 표 4, 5 및 6에 각각 제공된다.
표 4- 무염기성 불순물의 제거
표 5- CNEt 불순물의 제거
표 6- N+1 불순물의 제거
표 4, 5 및 6에 기재된 결과에 기초하여, 동적 결합 용량의 중심에 HIC 컬럼을 로딩하면 무염기성(ABasic), CNEt 및 N+ 1 불순물을 제거할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> BIOGEN MA INC.
<120> HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY FOR PURIFICATION OF
OLIGONUCLEOTIDES
<130> 123429-00120
<140>
<141>
<150> 62/492,402
<151> 2017-05-01
<150> 62/349,970
<151> 2016-06-14
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 1
tcactttcat aatgctgg 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 2
caggatacat ttctacagct 20
Claims (33)
- 표적 올리고뉴클레오타이드 및 생성물 관련 불순물을 포함하는 혼합물로부터 표적 올리고뉴클레오타이드를 분리하는 방법이며,
a) 염을 혼합물에 첨가하는 단계이며, 상기 염은 암모늄 설페이트인 단계,
b) 희석된 혼합물과 소수성 흡착제를 소수성 흡착제 용량의 32 내지 78%의 동적 로딩 용량으로 접촉시키는 단계이며, 상기 소수성 흡착제는 페닐 또는 헥실을 포함하는 것인 단계,
c) 염 수용액을 사용하여 소수성 흡착제를 세척하는 단계,
d) 용리액으로 표적 올리고뉴클레오타이드를 용리시키는 단계, 및
e) 표적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 용리제(eluent)를 수집하는 단계
를 포함하고, 여기서 생성물 관련 불순물은 적어도 하나의 N-1 불순물을 포함함으로써 생성물 관련 불순물로부터 표적 올리고뉴클레오타이드를 분리하는 것인 방법. - 표적 싸이올화 올리고뉴클레오타이드 및 생성물 관련 불순물을 포함하는 혼합물로부터 표적 올리고뉴클레오타이드를 분리하는 방법이며,
a) 염을 혼합물에 첨가하는 단계이며, 상기 염은 암모늄 설페이트인 단계,
b) 희석된 혼합물과 소수성 흡착제를 소수성 흡착제 용량의 40 내지 100%의 동적 로딩 용량으로 접촉시키는 단계이며, 상기 소수성 흡착제는 페닐 또는 헥실을 포함하는 것인 단계,
c) 염 수용액을 사용하여 소수성 흡착제를 세척하는 단계,
d) 용리액으로 표적 올리고뉴클레오타이드를 용리시키는 단계, 및
e) 표적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 용리제를 수집하는 단계
를 포함하고, 여기서 생성물 관련 불순물은 적어도 하나의 P=O 불순물을 포함함으로써 생성물 관련 불순물로부터 표적 올리고뉴클레오타이드를 분리하는 것인 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
염이 염 수용액으로서 혼합물에 첨가되거나, 혼합물 내로 직접 용해되고,
세척 단계의 유동 속도가 로딩 유동 속도보다 느린 것인 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 용리액이 물, 염 수용액, 에틸렌 글리콜, 또는 프로필렌 글리콜 또는 이의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 용리제 수집을 지연시켜 생성물 용리 피크의 처음 1-25%, 10-25% 또는 5-10%, 또는 생성물 용리 피크의 마지막 1-25%, 5-10% 또는 10-25%는 포함되지 않도록 하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
소수성 흡착제가 적어도 15 cm의 층 높이(bed height)로 패킹되는 것인 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 올리고뉴클레오타이드가 15 내지 25개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 올리고뉴클레오타이드가 아데닌, 구아닌, 타이민 (5-메틸 우라실), 사이토신, 하이포잔틴, 잔틴, 7-메틸 구아닌, 5,6-다이하이드로우라실, 5-메틸사이토신, 7-디아자 퓨린 및 5-하이드록시메틸사이토신으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 핵염기를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 올리고뉴클레오타이드가,
선택적으로 치환되거나,
두 개의 비-제미날(non-geminal) 고리 원자가 가교되어 바이사이클릭 핵산 (BNA)을 형성하거나, 또는
당의 고리 산소 원자가 S 또는 N(R)로 치환된
당, 또는 이들 조합인 당을 포함하며, 여기서 R은 H 또는 C1-C12 알킬인 방법. - 제9항에 있어서,
당이 2' 위치에서 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3 또는 O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2로 치환되며, 여기서 n 및 m은 독립적으로 1 내지 10이거나, 또는
당이 2' 위치에서 O(CH2)2OCH3으로 치환된 것인 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 올리고뉴클레오타이드가 오직 RNA, 오직 DNA, RNA 및 DNA의 조합, 또는 갭머(gapmer)를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 올리고뉴클레오타이드가 포스포다이에스터 (P=O), 포스포로싸이오에이트 (P=S), 또는 이의 조합을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 올리고뉴클레오타이드의 서열이 서열 번호 1 또는 서열 번호 2인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 올리고뉴클레오타이드가 4,4'-다이메톡시트라이틸 (DMT)을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 생성물 관련 불순물이 적어도 하나의 P=O 불순물을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 생성물 관련 불순물이 적어도 하나의 N-1 불순물을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 생성물 관련 불순물이 적어도 하나의 ABasic 불순물, 적어도 하나의 CNEt 불순물 또는 적어도 하나의 N+1 불순물을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
- 삭제
- 삭제
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201662349970P | 2016-06-14 | 2016-06-14 | |
| US62/349,970 | 2016-06-14 | ||
| US201762492402P | 2017-05-01 | 2017-05-01 | |
| US62/492,402 | 2017-05-01 | ||
| PCT/US2017/037126 WO2017218454A1 (en) | 2016-06-14 | 2017-06-13 | Hydrophobic interaction chromatography for purification of oligonucleotides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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