CN109641928B - 用于寡核苷酸纯化的疏水性相互作用色谱法 - Google Patents
用于寡核苷酸纯化的疏水性相互作用色谱法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109641928B CN109641928B CN201780037028.4A CN201780037028A CN109641928B CN 109641928 B CN109641928 B CN 109641928B CN 201780037028 A CN201780037028 A CN 201780037028A CN 109641928 B CN109641928 B CN 109641928B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- product
- target oligonucleotide
- impurity
- impurities
- eluate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 89
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 title abstract description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 75
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 150
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 42
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical group N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 33
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 33
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 31
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 27
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 26
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 25
- -1 7-deazapurine Chemical compound 0.000 claims description 20
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 claims description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 19
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 18
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 14
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 9
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 claims description 8
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 5
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 5
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 5
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydrouracil Chemical compound O=C1CCNC(=O)N1 OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 4
- 125000004400 (C1-C12) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- AFBXRHFIVUFPES-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O.CC1=CNC(=O)NC1=O AFBXRHFIVUFPES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 claims description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000006413 ring segment Chemical group 0.000 claims description 2
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 claims description 2
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 claims 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 claims 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 44
- 239000000047 product Substances 0.000 description 41
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 36
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 27
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 24
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 17
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 12
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 11
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 9
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 9
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 7
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 7
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 7
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 7
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 6
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 5
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 5
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical group OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002029 aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 description 3
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 3
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical class O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 235000021092 sugar substitutes Nutrition 0.000 description 3
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 3
- CXWXQJXEFPUFDZ-UHFFFAOYSA-N tetralin Chemical compound C1=CC=C2CCCCC2=C1 CXWXQJXEFPUFDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 3
- GPAAEZIXSQCCES-UHFFFAOYSA-N 1-methoxy-2-(2-methoxyethoxymethoxymethoxy)ethane Chemical compound COCCOCOCOCCOC GPAAEZIXSQCCES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SDTORDSXCYSNTD-UHFFFAOYSA-N 1-methoxy-4-[(4-methoxyphenyl)methoxymethyl]benzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1COCC1=CC=C(OC)C=C1 SDTORDSXCYSNTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine group Chemical group [C@@H]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC12 OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 125000002178 anthracenyl group Chemical group C1(=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3C=C12)* 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000013400 design of experiment Methods 0.000 description 2
- KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N disiloxane Chemical class [SiH3]O[SiH3] KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 150000002243 furanoses Chemical group 0.000 description 2
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 2
- NSPJNIDYTSSIIY-UHFFFAOYSA-N methoxy(methoxymethoxy)methane Chemical compound COCOCOC NSPJNIDYTSSIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 2
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001412 tetrahydropyranyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000025 triisopropylsilyl group Chemical group C(C)(C)[Si](C(C)C)(C(C)C)* 0.000 description 2
- 229930195735 unsaturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 125000000008 (C1-C10) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- DIIIISSCIXVANO-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dimethylhydrazine Chemical compound CNNC DIIIISSCIXVANO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RRQYJINTUHWNHW-UHFFFAOYSA-N 1-ethoxy-2-(2-ethoxyethoxy)ethane Chemical compound CCOCCOCCOCC RRQYJINTUHWNHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 16-methylheptadecyl 16-methylheptadecanoate Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCCCCCOC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC(C)C ABEXEQSGABRUHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQTCQNIPQMJNTI-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylpropan-1-one Chemical group CC(C)(C)[C]=O YQTCQNIPQMJNTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003660 2,3-dimethylpentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003469 3-methylhexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004172 4-methoxyphenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(OC([H])([H])[H])=C([H])C([H])=C1* 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 241000764238 Isis Species 0.000 description 1
- 229910003849 O-Si Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910003872 O—Si Inorganic materials 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNVMUORYQLCPJZ-UHFFFAOYSA-M Thiocarbamate Chemical compound NC([S-])=O GNVMUORYQLCPJZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005122 aminoalkylamino group Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010960 commercial process Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 125000005046 dihydronaphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- CHNUOJQWGUIOLD-NFZZJPOKSA-N epalrestat Chemical compound C=1C=CC=CC=1\C=C(/C)\C=C1/SC(=S)N(CC(O)=O)C1=O CHNUOJQWGUIOLD-NFZZJPOKSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 1
- 125000003983 fluorenyl group Chemical group C1(=CC=CC=2C3=CC=CC=C3CC12)* 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- UQEAIHBTYFGYIE-UHFFFAOYSA-N hexamethyldisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C UQEAIHBTYFGYIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000005417 image-selected in vivo spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 125000003392 indanyl group Chemical group C1(CCC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 238000012739 integrated shape imaging system Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000555 isopropenyl group Chemical group [H]\C([H])=C(\*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical class CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPZBTYRIGVOOMI-UHFFFAOYSA-N methylsulfanyl(methylsulfanylmethoxy)methane Chemical compound CSCOCSC CPZBTYRIGVOOMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000003136 n-heptyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001280 n-hexyl group Chemical group C(CCCCC)* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001971 neopentyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 125000004219 purine nucleobase group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003003 spiro group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000005987 sulfurization reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- FGTJJHCZWOVVNH-UHFFFAOYSA-N tert-butyl-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-dimethylsilane Chemical compound CC(C)(C)[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C(C)(C)C FGTJJHCZWOVVNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006168 tricyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/30—Partition chromatography
- B01D15/305—Hydrophilic interaction chromatography [HILIC]
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/32—Bonded phase chromatography
- B01D15/325—Reversed phase
- B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
- B01D15/424—Elution mode
- B01D15/426—Specific type of solvent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及一种使用疏水相互作用色谱法纯化寡核苷酸的方法。
Description
相关申请的引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2016年6月14日提交的美国临时申请No.62/349,970和2017年5月1日提交的美国临时申请No.62/492,402的申请日的权益,所述美国临时申请各自的全部内容以引用方式并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且以全文引用方式并入本文中的序列表。所述ASCII副本创建于2017年6月12日,命名为123429-00120_SL.txt并且大小为839字节。
发明背景
寡核苷酸是可以化学合成以用于研究和医学目的的短DNA或RNA寡聚体。寡核苷酸通常通过以下方式制备:逐步添加核苷酸残基以产生特定序列。在合成过程中,任何步骤的低效都是可能的,导致寡聚体缺失核苷(“N-1杂质”)或具有磷酸二酯键而不是所需的硫代磷酸酯键(“P=O杂质”)。另外,在合成期间或之后暴露于氧化条件可以将P=S键转化为P=O键以形成P=O杂质。完成所需序列的寡核苷酸的合成后,目标寡核苷酸被作为与所有失败的序列和N-1杂质和P=O杂质的混合物获得。然后需要将这些杂质与目标寡核苷酸分离。
一种常用的分离技术是使用反相高压液相色谱(rp-HPLC)来纯化寡核苷酸,然而,rp-HPLC通常不能有效去除N-1杂质、P=O杂质、ABasic杂质、CNEt杂质和/或N+1杂质。rp-HPLC的另一个缺点包括使用大量有机溶剂,这产生了处置问题以及需要在防爆设施中进行纯化。
因此,需要能够去除N-1杂质、P=O杂质,ABasic杂质、CNEt杂质和/或N+1杂质并且适用于大规模商业过程的寡核苷酸纯化方法。
发明内容
本发明在此描述了使用疏水相互作用色谱法(HIC)纯化目标寡核苷酸的方法。具体地,本文所述的方法包括以特定的动态加载容量将目标寡核苷酸与产物相关杂质的混合物施加到疏水相互作用色谱树脂(或疏水性吸附剂)。所要求保护的方法引起N-1杂质和P=O杂质与目标寡核苷酸的分离得到改善,并且消除了纯化过程中有机溶剂的使用。在某些实施方案中,所要求保护的方法还可以去除ABasic杂质、CNEt杂质和/或N+1杂质。
附图说明
图1是描绘动态加载容量与P=O杂质去除之间的关系的图。
图2是描绘动态加载容量与N-1杂质去除之间的关系的图。
图3描绘了ABasic杂质、CNEt杂质和P=O杂质的示例性结构。
具体实施方式
本发明涉及用于将寡核苷酸与合成所述寡核苷酸期间产生的产物相关杂质分离的方法。开发了新的方法,在所述方法中以特定的动态加载容量将粗寡核苷酸混合物施加到疏水性吸附剂,所述粗寡核苷酸混合物不仅含有目标寡核苷酸,还含有各种产物相关杂质。这种新方法引起包括N-1杂质和P=O杂质在内的某些产物相关杂质的去除得到改善。这种改善是令人惊讶的,因为预期目标寡核苷酸与其N-1杂质和P=O杂质的疏水性是相似的,并且这些杂质无法通过工艺规模的rp-HPLC去除,所述工艺规模的rp-HPLC也依赖于疏水相互作用。在某些实施方案中,所要求保护的方法还可以去除难以通过rp-HPLC去除的ABasic杂质、CNEt杂质和N+1杂质。
本发明的第一实施方案是一种用于从含有目标寡核苷酸和产物相关杂质的混合物中分离目标寡核苷酸的方法,所述方法包括以下步骤:
a)将盐加入所述混合物中;
b)以动态加载容量使稀释的混合物与疏水性吸附剂接触,所述动态加载容量为所述疏水性吸附剂容量的约32%至约78%;
c)用盐水溶液洗涤所述疏水性吸附剂;
d)用洗脱溶液洗脱所述目标寡核苷酸;以及
e)收集包含所述目标寡核苷酸的所述洗脱液;
其中产物相关杂质包括至少一种N-1杂质,从而将目标寡核苷酸与产物相关杂质分离。
本发明的第二实施方案是一种用于从含有目标硫醇化寡核苷酸和产物相关杂质的混合物中分离目标寡核苷酸的方法,所述方法包括以下步骤:
a)将盐加入所述混合物中;
b)以动态加载容量使稀释的混合物与疏水性吸附剂接触,所述动态加载容量为所述疏水性吸附剂容量的约40%至约100%;
c)用盐水溶液洗涤所述疏水性吸附剂;
d)用洗脱溶液洗脱所述目标寡核苷酸;以及
e)收集包含所述目标寡核苷酸的所述洗脱液;
其中产物相关杂质包括至少一种P=O杂质,从而将目标寡核苷酸与产物相关杂质分离。
如本文所用,“产物相关杂质”是指在合成目标寡核苷酸期间产生的不需要的副产物。在某些实施方案中,产物相关杂质是i)N-1杂质;ii)P=O杂质;iii)或它们的组合;或iv)这三者中的任何者的混合物。如本文所用,“N-1杂质”是由于偶联反应失败而相对于目标寡核苷酸在任何位置缺失1个核苷的寡核苷酸。如本文所用,“P=O杂质”是由于合成后硫化反应失败或无意氧化而含有磷酸二酯键代替目标寡核苷酸的所需硫代磷酸酯键的寡核苷酸。在某些实施方案中,如对于第一实施方案所述的方法可用于去除P=O杂质和N-1杂质。在某些实施方案中,如对于第二实施方案所述的方法可用于去除N-1杂质以及P=O杂质。
在某些实施方案中,产物相关杂质还可包括ABasic杂质、CNEt杂质和/或N+1杂质。如本文所用,“N+1杂质”是相对于目标寡核苷酸在任何位置具有1个额外核苷的寡核苷酸。如本文所用,“ABasic杂质”是与目标寡核苷酸相比具有一个或多个缺失核碱基的核苷的寡核苷酸,其中所述核苷具有如下所示的结构:
图3中示出了ABasic杂质的示例性结构。在一个具体实施方案中,ABasic杂质中缺失的核碱基是腺苷和/或鸟嘌呤。如本文所用,“CNEt”杂质是含有经修饰的胸腺嘧啶核碱基代替目标寡核苷酸的未修饰的胸腺嘧啶核碱基的寡核苷酸,其中所述经修饰的胸腺嘧啶核碱基具有以下结构:
CNEt杂质的示例性结构在图3中示出。
在某些实施方案中,产物相关杂质包括短聚物(shortmer)杂质。如本文所用,“短聚物杂质”是相对于目标寡核苷酸在任何位置缺失1个、2个、3个、4个或更多个核苷的寡核苷酸。
在某些实施方案中,产物相关杂质包括早洗脱杂质(EEI)。如本文所用,“早洗脱杂质”是使用本文所述的纯化方法在目标寡核苷酸之前洗脱的杂质。在一个实施方案中,EEI包括短聚物杂质,诸如N-1杂质、P=O杂质和/或ABasic杂质。
在某些实施方案中,产物相关杂质包括晚洗脱杂质(LEI)。如本文所用,“晚洗脱杂质”是使用本文所述的纯化方法在目标寡核苷酸之后洗脱的杂质。在一个实施方案中,LEI包括N+1杂质。
“寡核苷酸”意指包含多个连接的核苷的化合物。在某些实施方案中,多个核苷中的一个或多个核苷被修饰。在某些实施方案中,寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷(DNA)。在某些实施方案中,寡核苷酸仅包括RNA、仅包括DNA或包括RNA和DNA两者。在一个具体实施方案中,目标寡核苷酸是缺口聚体(gapmer)。“缺口聚体”是指嵌合化合物,在所述嵌合化合物中具有多个支持核糖核酸酶H切割的核苷的内部区域位于具有一个或多个核苷的外部区域之间,其中构成内部区域的核苷在化学上不同于构成外部区域的一个或多个核苷。在某些实施方案中,目标寡核苷酸包含10至100个、10至50个、10至25个、15至100个、15至50个、或15至25个核苷酸。
“核苷”意指包含核碱基部分和糖部分的化合物。核苷包括但不限于天然存在的核苷、经修饰的核苷、以及具有模拟碱基和/或糖基的核苷。“经修饰的核苷”与天然存在的RNA或DNA核苷相比包含至少一个修饰的核苷。这种修饰可以在糖部分和/或核碱基处。核苷可以用核碱基或糖部分上的多种取代基中的任何取代基进行修饰。
“核苷酸”是指包含连接基团的核苷,所述连接基团将两个核苷连接在一起作为寡核苷酸的一部分。通过磷原子的存在或不存在来定义两大类连接基团。代表性含磷键联包括但不限于磷酸二酯(P=O)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯以及硫代磷酸酯(P=S)。代表性的不含磷的连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫代二酯(-O-C(O)-S-)、硫代氨基甲酸酯(-O-C(O)(NH)-S-);硅氧烷(-O-Si(H)2-O-);以及N,N'-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。在一个具体实施方案中,连接基团是磷酸二酯(P=O)或硫代磷酸酯(P=S)。在某些实施方案中,对于第一实施方案和第二实施方案所述的方法的目标寡核苷酸仅包含磷酸二酯(P=O)、硫代磷酸酯(P=S)或它们的组合作为连接基团。
“核碱基”是指核苷的杂环碱基部分。在某些实施方案中,核碱基可包含能够与另一核酸的核碱基氢键合的任何原子或任何一组原子。核碱基可为天然存在的或可为修饰的。除了“未修饰的”或“天然的”核碱基(诸如嘌呤核碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G),以及嘧啶核碱基胸腺嘧啶(T)(或5-甲基尿嘧啶)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))之外,本领域技术人员已知的许多经修饰的核碱基或核碱基模拟物也可以掺入如通过第一实施方案或第二实施方案中所述的方法分离的目标寡核苷酸,所述经修饰的核碱基或核碱基模拟物包括例如次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、7-脱氮嘌呤和5-羟甲基胞嘧啶。在某些实施方案中,该方法如第一实施方案或第二实施方案所述,并且核碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶(5-甲基尿嘧啶)和5-甲基胞嘧啶。
“糖部分”是指天然或经修饰的糖或糖替代物。
“天然糖”是指DNA(2'-H)或RNA(2'-OH)的呋喃核糖部分。
“经修饰的糖”是指包含至少一个与天然糖的基团不同的取代基的呋喃核糖部分。此类修饰包括但不限于添加取代基,桥接非偕位环原子以形成双环核酸(BNA),用S、N(R)或C(R1)(R)2(R=H、C1-C12烷基或保护基团)替代核糖环氧原子,以及这些修饰的组合。在某些实施方案中,糖在2'位被修饰以包括除H或OH以外的取代基(“2'修饰的”或“2'取代的”)。或者,修饰位于糖的5'位。在某些实施方案中,糖在其2'位和5'位处被修饰。
可用于本发明的糖修饰的实例包括但不限于包含选自以下的糖取代基的化合物:OH、F、O-烷基、S-烷基、N-烷基或O-烷基-O-烷基,其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。在某些实施方案中,此类取代基选自:卤离子(包括但不限于F)、烯丙基、氨基、叠氮基、硫代基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn),或O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn),其中每个Rm和Rn独立地为H或取代或未取代的C1-C10烷基。具体地,适用于第一实施方案和第二实施方案中所述方法的经修饰核苷是:2'-甲氧基乙氧基(“MOE”或“2'-MOE”或“2'-OCH2CH2OCH3”)、2'-O-甲基(“2'-OMe”或2'-O-CH3)、或2'-氟(2'-F)。
在某些实施方案中,经修饰的核苷在2'位具有选自以下的取代基:O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、OCH2C(=O)N(H)CH3和O(CH2)nON[CH2)nCH3]2,其中n和m独立地为1至约10。其他2'-糖取代基包括:C1至C10烷基、取代的烷基、烯基、炔基,烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环基、以及氨基烷基氨基。
在某些实施方案中,经修饰的核苷在5'位的氧原子上具有选自以下的取代基:乙酰基(Ac);苯甲酰(Bz);苄基(Bn);β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM);二甲氧基三苯甲基、[双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基](DMT);甲氧基甲基醚(MOM);甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基,MMT);对甲氧基苄醚(PMB);甲硫基甲醚;新戊酰(Piv);四氢吡喃基(THP);四氢呋喃(THF);三苯甲基(Tr);甲硅烷基醚(包括但不限于三甲基甲硅烷基(TMS)醚、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)醚、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)醚和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚);甲基醚、乙氧基乙基醚(EE)和5'-O-(α-甲基-6-硝基胡椒基氧基羰基)(MeNPOC)。在一个具体实施方案中,5'位置是–ODMT。
具有修饰的糖部分的核苷的实例包括但不限于包含5'-乙烯基、5'-甲基、5'-ODMT、4'-S、2'-F、2'-OCH3和2'-O(CH2)2OCH3取代基的核苷。
在某些实施方案中,2'-糖取代基位于阿拉伯糖(上)位或核糖(下)位。在某些此类实施方案中,2'-阿拉伯糖修饰是2'-F阿拉伯糖(FANA)。也可以在糖上的其他位置进行类似的修饰,特别是在3'末端核苷上或2'-5'连接的寡核苷酸中的糖的3'位和5'末端核苷酸的5'位。
如本文所用,术语“烷基”是指完全饱和的支链或非支链烃部分。优选地,烷基包含1至20个碳原子,更优选1至16个碳原子、1至10个碳原子、1至6个碳原子、或1至4个碳原子。在一些实施方案中,烷基包含6至20个碳原子。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基,正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基或正癸基。
“烯基”是指这样的不饱和烃基,所述不饱和烃基可以是直链或支链的并且具有至少一个碳-碳双键。具有2-6个碳原子的烯基可以是优选的。烯基可含有1个、2个或3个碳-碳双键,或更多个碳-碳双键。烯基的示例包括乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁-2-烯基、正己-3-烯基等。
“炔基”是指这样的不饱和烃基,所述不饱和烃基可以是直链或支链的并且具有至少一个碳-碳三键。具有2-6个碳原子的炔基是优选的。炔基可含有1个、2个或3个碳-碳三键或更多个碳-碳三键。炔基的实例包括乙炔基、正丙炔基、正丁-2-炔基、正己-3-炔基等。
术语“芳基”是指在环部分中具有6至14个碳原子的单环、双环或三环芳族烃基。在一个实施方案中,术语芳基是指具有6至10个碳原子的单环和双环芳族烃基。芳基的代表性实例包括苯基、萘基、芴基和蒽基(anthracenyl)。术语“芳基”还指这样的双环或三环基团,在所述双环或三环基团中至少一个环是芳环并且与一个或两个非芳族烃环稠合。非限制性实例包括四氢化萘、二氢萘基和茚满基。“芳烷基”是经由亚烷基连接基连接到分子的其余部分的芳基。“烷芳基”是经由亚芳基连接基连接到分子的其余部分的烷基。
如本文所用,术语“杂环基”是指饱和或不饱和的单环或双环(例如,桥环或螺环环系)环系,所述环系具有3至7个环成员,或特别地3至6个环成员或5至7个环成员,所述环成员中至少一个环成员是杂原子,并且所述环成员中的至多4个(例如,1个、2个、3个或4个)环成员可以是杂原子,其中所述杂原子独立地选自O、S和N,并且其中C可以被氧化(例如,C(O)),N可以被氧化(例如,N(O))或季铵化,并且S可以任选地被氧化成亚砜和砜。不饱和杂环包括杂芳基环。如本文所用,术语“杂芳基”是指芳族5或6元单环环系,所述环系具有1至4个独立地选自O、S和N的杂原子,并且其中N可被氧化(例如,N(O))或季铵化,并且S可任选地被氧化成亚砜和砜。在一个实施方案中,杂环基是3至7元饱和单环或3至6元饱和单环或5至7元饱和单环。在一个实施方案中,杂环基是3至7元单环或3至6元单环或5至7元单环。在另一实施方案中,杂环基是6或7元双环。杂环基可以附接在杂原子或碳原子处。
“双环核苷”或“BNA”是指这样的核苷,其中所述核苷的糖部分包含连接糖环的两个碳原子的桥,从而形成双环糖部分。BNA的实例包括但不限于在4'核糖基环原子与2'核糖基环原子之间包含桥的核苷(“4'-2'双环核苷”),例如呋喃糖环包含连接所述呋喃糖环的两个碳原子的桥以连接所述糖环的2'碳原子和4'碳原子。
在某些实施方案中,目标寡核苷酸包含一个或多个BNA核苷,其中桥包含以下化学式中的一个化学式:4’-β-D-(CH2)-O-2’(β-D-LNA);4’-(CH2)-S-2;4’-α-L-(CH2)-O-2’(α-L-LNA);4’-(CH2)2-O-2’(ENA);4’-C(CH3)2-O-2’(参见PCT/US2008/068922);4’-CH(CH3)-O-2’(“cEt”)和4’-C-H(CH2OCH3)-O-2’(参见2008年7月15日发布的美国专利No.7,399,845);4’-CH2-N(OCH3)-2’(参见PCT/US2008/064591);4’-CH2-O-N(CH3)-2’(参见2004年9月2日公开的美国专利申请US2004-0171570);4’-CH2-N(R)-O-2’(参见2008年9月23日发布的美国专利No.7,427,672);4'-CH2-C(CH3)-2'和4'-CH2-C(=CH2)-2'(参见PCT/US2008/066154);并且其中R独立地为H、C1-C12烷基或保护基团。在某些实施方案中,本发明提供了经修饰的核苷,所述经修饰的核苷包含不是双环糖部分的经修饰的糖部分。
“糖替代物”是指除了呋喃核糖环以外能够替代核苷的糖的结构。糖替代物的实例包括但不限于6元环糖中的氧被例如硫或氮替代以形成例如吗啉代糖和含4'-硫代的糖。
在某些实施方案中,通过第一实施方案或第二实施方案中所述的方法分离的目标寡核苷酸是具有以下序列(从5’至3’)的硫代磷酸酯寡核苷酸:
TCACTTTCATAATGCTGG(SEQ ID NO:1),
其中所述寡核苷酸的每个核苷间键是硫代磷酸酯键,所述寡核苷酸的每个核苷是2'-甲氧基乙基(MOE)核苷,并且每个胞嘧啶是5'-甲基胞嘧啶。SEQ ID NO:1也被称为BIIB058,并描述于WO2007/002390、WO2010/148249和US8,980,853中,所述专利的教导以引用方式并入本文。
在某些实施方案中,通过如第一实施方案或第二实施方案中所述的方法分离的目标寡核苷酸是具有以下序列(从5'至3')的5-10-5MOE缺口聚体:
CAGGATACATTTCTACAGCT(SEQ ID NO:2),
其中核苷1-5和16-20中的每一者是2'-O-甲氧基乙基核糖修饰的核苷,并且核苷6-15中的每一者是2'-脱氧核苷,其中核苷2至3、4至5、16至17和18至19之间的核苷间键是磷酸二酯键,并且核苷1至2、3至4、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16、17至18和19至20之间的核苷间键是硫代磷酸酯键,并且其中每个胞嘧啶是5'-甲基胞嘧啶。SEQ ID NO:2通过以下化学符号描述:mCes Aeo Ges Geo AesTds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te;其中,
A=腺嘌呤,
mC=5'-甲基胞嘧啶
G=鸟嘌呤,
T=胸腺嘧啶,
e=2'-O-甲氧基乙基核糖修饰的糖,
d=2'-脱氧核糖,
s=硫代磷酸酯核苷间键,和
o=磷酸二酯核苷间键。
SEQ ID NO:2也被称为BIIB067或ISIS 666853,并且描述于WO2015153800中,该专利的教导以引用方式并入本文。
疏水性吸附剂(即,“疏水性树脂”)是这样的任何材料,目标寡核苷酸将结合所述材料,以使得所述目标寡核苷酸可以在如第一实施方案和第二实施方案中所述的方法中与产物相关的杂质分离。例如,疏水性吸附剂包括亲水性碳水化合物:交联琼脂糖和合成共聚物材料。具体地,疏水性吸附剂包含苯基、丁基或己基。例如,Hexyl650C是合适的疏水性吸附剂。此外,疏水性吸附剂在至少15cm、例如至少20cm、至少25cm、或至少30cm;或从约15cm至约30cm;从约15cm至约20cm、从约20至约25cm、或约25cm至约30cm的床高度处填充。
“动态加载容量”被定义为在典型的流动条件下将与色谱树脂结合的产物(例如,寡核苷酸产物)的量,并且是在特定流动条件和加载盐浓度以及本领域技术人员已知的其它加载因子下测定的。动态加载容量是基于在贯流(flow through)(称为“穿透点”)中测量产物水平之前可以加载的量计算的。具体地,将待分离的材料以特定的流速(例如,约100至约250cm/h,以及特别地200cm/h)施加到处于流动模式(与以间歇分批模式进行的静态相反)下的树脂上。本领域的技术人员将知道如何基于产物在盐中的溶解度来选择盐浓度和如何基于珠粒尺寸、床高度和其他变量来选择流速,使得不超过入口压力以实现特定的动态加载比。
例如,如果疏水性吸附剂对寡核苷酸混合物的容量为50mg/mL(动态),则施加50mg/mL的所述混合物将为100%动态加载容量。类似地,对于50mg/mL疏水性吸附剂,施加25mg/mL混合物将为50%的动态加载容量。对于如第一实施方案中所述的方法,动态加载容量为约32%至约78%,例如约32%至约45%、约40%至约50%、约45%至约55%、约50%至约60%、约55%至约65%、约60%至约70%、约65%至约78%,或约32%至约50%、约40%至约75%,或约50%至约78%。对于如第二实施方案中所述的方法,动态加载容量为约40%至约100%,例如约40%至约50%、约50%至约60%、约60%至约70%、约70%至约80%、约80%至约90%、约90%至约100%、约40%至约75%,或约40%至约60%,或约40%至约80%。对于如第一实施方案和第二实施方案两者中所述的方法,动态加载容量为约40%至约78%,例如约40%至约45%、约45%至约50%、约50%至约55%、约55%至约60%、约60%至约65%、约65%至约70%、约70%至约75%,或约40%至约50%、约40%至约75%,或约50%至约78%。
在第三实施方案中,该方法如第一实施方案或第二实施方案所述,并且将盐作为盐水溶液加入混合物中,或将盐直接溶解在混合物中。具体地,盐包括NH4 +、K+或Na+中的任何阳离子,和包括F-、[SO4]-2、[HPO4]-2、醋酸根或Cl-的任何阴离子,或它们的组合。特别地,盐是硫酸铵。
在第四实施方案中,该方法如第一实施方案、第二实施方案或第三实施方案中任一项所述,其中洗涤步骤的流速慢于加载流速。具体地,加载步骤的流速为约150cm/h至约250cm/h,并且洗涤步骤的流速为约50cm/h至约150cm/h,例如,加载步骤的流速为约175cm/h至约225cm/h,并且洗涤步骤的流速为约75cm/h至约125cm/h。具体地,加载步骤的流速为约200cm/h,并且洗涤步骤的流速为约100cm/h。
在第五实施方案中,该方法如第一实施方案、第二实施方案、第三实施方案或第四实施方案中的任一项所述,洗脱溶液选自水、盐水溶液、乙二醇或丙二醇或它们的混合物。具体地,盐包括NH4 +、K+或Na+中的任何阳离子,和包括F-、[SO4]-2、[HPO4]-2、醋酸根或Cl-的任何阴离子,或它们的组合。特别地,盐是硫酸铵。
在第六实施方案中,该方法如第一实施方案、第二实施方案、第三实施方案、第四实施方案或第五实施方案中的任一项所述,其中延迟洗脱物收集,以使得收集的洗脱物不包括产物洗脱峰的前2-25%、前2-10%、前2-8%、前4-6%、前5-10%或前10-25%。在一个更具体的实施方案中,延迟收集,以使得所述收集的洗脱物不包括产物洗脱峰的前5%。具体地,将洗脱物收集在各级分中,并调节级分大小以在单独级分中将目标寡核苷酸与产物相关杂质分离。级分大小可部分地取决于寡核苷酸与产物相关杂质之间的洗脱时间差异、含有目标寡核苷酸和待分离的产物相关杂质的粗产物的量等,而由本领域的技术人员容易地确定。
此外在第六实施方案中,该方法如第一实施方案、第二实施方案、第三实施方案、第四实施方案或第五实施方案中任一项所述,其中收集的洗脱物不包括产物洗脱峰的前2-25%和最后2-25%。更具体地说,收集的洗脱物不包括产物洗脱峰的前2-10%和最后2-10%,前2-8%和最后2-8%,前4-6%和最后4-6%,前5-10%和最后5-10%,或者前10-25%和最后10-25%。在另一个具体实施方案中,收集的洗脱物不包括产物洗脱峰的前5%和最后5%。
在一个实施方案中,洗涤溶液在洗涤步骤期间保持恒定,称为等度洗涤模式(isocratic wash mode)。或者,在洗涤步骤期间改变洗涤溶液,称为梯度洗涤模式。在梯度洗涤中,洗涤溶液可以从高离子强度或极性到低离子强度或极性。极性或离子强度的降低可以通过以下方式实现:降低水溶液的盐浓度,或增大极性更大的溶剂(例如,水或其他极性溶剂,例如乙烯或丙二醇)与较高盐溶液的体积比。或者,洗涤溶液可以从低极性或高离子强度到高极性或低离子强度。在另一替代方案中,梯度洗涤步骤之后可以进行等度洗涤步骤,或反之亦然。
在一个实施方案中,洗脱溶液在洗脱期间保持恒定,称为等度洗脱模式。或者,洗脱溶液在洗脱期间变化,称为梯度洗脱模式。在梯度洗脱中,洗脱溶液可以从高离子强度或低极性到低离子强度或高极性。极性的增加或离子强度的降低可以通过以下方式实现:降低水溶液的盐浓度,或增加极性更大的溶剂(例如,水或其他极性溶剂,例如乙烯或丙二醇)与较高盐溶液的体积比。或者,洗脱溶液可以从低极性或高离子强度到高极性或低离子强度。在另一个替代方案中,梯度洗脱之后可以进行等度洗脱,或反之亦然。
在一个实施方案中,本文所述的本发明的方法还可以去除EEI和/或LEI。在另一个实施方案中,本文所述的本发明方法可以去除选自以下的至少一种产物相关杂质:短聚物杂质、N+1杂质、ABasic杂质、CNEt杂质和P=O杂质。在另一个实施方案中,本文所述的本发明方法可以去除N-1杂质、P=O杂质以及选自以下的至少一种产物相关杂质:除N-1杂质之外的短聚物杂质、N+1杂质、ABasic杂质和CNEt杂质。在另一个实施方案中,本文所述的本发明方法可以去除N-1杂质、P=O杂质、除N-1杂质之外的短聚物杂质、N+1杂质、ABasic杂质和CNEt杂质。
“从含有目标寡核苷酸和产物相关杂质的混合物分离目标寡核苷酸”或“去除产物相关杂质”是指从混合物中去除本文所述的产物相关杂质中的一种或多种产物相关杂质的至少15%,例如20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%或60%,所述一种或多种产物相关杂质为例如N-1杂质、P=O杂质、ABasic杂质、CNEt杂质或N+1杂质。
实施例
实施例1去除N-1或P=O杂质
材料:
柱:6.84mL苯基琼脂糖快速流动高分辨率(Phenyl Sepharose Fast Flow HighSub)
床高:20cm
产物稀释缓冲液:850mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5
平衡缓冲液:800mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5
粗产物加载:765mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5
洗涤缓冲液:440mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5
洗脱缓冲液:40mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5
解吸:去离子水
原位清洗:1N氢氧化钠
储存:0.1N氢氧化钠
紫外线监测器:295nm
方法:
-样品制备:用稀释缓冲液将样品(SEQ ID NO:2)稀释10倍(最终硫酸铵浓度为765mM)
-循环方法:将柱用4倍柱体积(CV)的800mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5以200cm/h平衡。以三种不同的动态加载容量以200cm/h的速率加载样品:
对于跑柱(run)1:以8.8%的动态加载容量加载。
对于跑柱2:以47%的动态加载容量加载。
对于跑柱3:以100%的动态加载容量加载。
将柱用7倍CV的440mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5以100cm/h洗涤。将柱用6倍CV的40mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5以200cm/h洗脱。将柱用2倍CV的去离子水以200cm/h解吸。将柱用3倍CV的1N氢氧化钠以200cm/h清洗,并以200cm/h储存在3倍CV的0.1N氢氧化钠中。
结果:
n-1和P=O杂质的相对去除量分别在下表1和下表2中提供。
表1 -N-1杂质的去除
表2 -P=O杂质的去除
基于表1和表2中描述的结果,需要使用适当的动态加载容量来去除n-1杂质和P=O杂质。
实施例2动态加载容量与P=O杂质去除之间的关系
使用实验设计(DesignExpertTM v9)软件来完成对动态加载容量对P=O产物相关杂质去除的影响的评估。统计设计类型是中心组合设计。研究类型是响应面。用20cm床高和45mg/mL动态结合容量的苯基琼脂糖柱(Phenyl Sepharose column)进行50次跑柱。洗涤缓冲液是440mM硫酸铵,并且洗脱缓冲液是40mM硫酸铵。分别使用七倍柱体积的洗涤缓冲液和六倍柱体积的洗脱缓冲液。使用与上文实施例1中所述相同的条件,使用SEQ ID NO:2作为寡核苷酸。
分析结果表明,对于P=O杂质,当加载容量为42%-100%(即,图1中的图表上的19mg/mL-45mg/mL)时,P=O杂质的去除有所改善。
实施例3动态加载容量与N-1杂质去除之间的关系
对动态加载容量对N-1产物相关杂质去除的影响的评估示出于图2中。五次跑柱的绘制在图2中,并且对应于45mg/mL疏水性吸附剂的9%、24%、47%、69%和100%的加载容量。根据粗制品中的起始N-1水平计算N-1减少的百分比。分析得出结论,加载率是N-1减少中的唯一显著因素。因此,根据统计分析,其他变量对于N-1减少是不显著的。
材料:
柱:6.84mL苯基琼脂糖快速流动高分辨率(Ge Healthcare Life Sciences,P/C:17-0973-05)
床高:20cm
产物稀释缓冲液:850mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5
平衡缓冲液:800mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5
粗产物加载:765mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5
洗涤缓冲液:440mM硫酸铵,50mM Tris,pH 8.5
400mM硫酸铵,50mM Tris,pH 8.5
洗脱缓冲液:40mM硫酸铵,50mM Tris,pH 8.5
10mM硫酸铵,50mM Tris,pH 8.5
解吸:去离子水
原位清洗:1N氢氧化钠
储存:0.1N氢氧化钠
紫外线监测器:295nm
方法:
-样品制备:用稀释缓冲液将样品(SEQ ID NO:2)稀释10倍(最终硫酸铵浓度为765mM)。
-循环方法:将柱用4倍柱体积(CV)的800mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5以200cm/h平衡。以表3中可见的五种不同加载率以200cm/h的速率加载样品:
表3-基于跑柱加载量的关于N-1减少的DoE变量
将柱用表3中指定的洗涤缓冲液和CV以100cm/h洗涤。将柱用表3中指定的洗脱缓冲液和CV以200cm/h洗脱。将柱用2倍CV的去离子水以200cm/h解吸。将柱用3倍CV的1N氢氧化钠以200cm/h清洗,并以200cm/h储存在3倍CV的0.1N氢氧化钠中。
如图2所示,当加载容量为40%至78%时,N-1杂质的去除有所改善。
实施例4.ABasic杂质、CNEt杂质或N+1杂质的去除
材料:
柱:81mL苯基琼脂糖填充快速流动高分辨率
床高:15cm;床直径:2.6cm
产物稀释缓冲液:575mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5
平衡缓冲液:500mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5
粗产物加载:500mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5
洗涤缓冲液:250mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5
洗脱缓冲液:10mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5
解吸:水
原位清洗:1N氢氧化钠
储存:0.1N氢氧化钠
紫外线监测器:295nm
方法:
-样品制备:用产物稀释缓冲液将粗制样品(SEQ ID NO:1)稀释7.7倍(最终硫酸铵浓度为500mM)
-色谱柱方法:将柱用5倍柱体积(CV)的500mM硫酸铵,50mM tris,pH8.5以150cm/h平衡。以47%(26.5mg产物/mL树脂)的动态加载容量,将稀释的粗制样品以150cm/h的流速加载。
将柱用7倍CV的250mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5以75cm/h洗涤。将柱用9倍CV的10mM硫酸铵,50mM tris,pH 8.5以150cm/h洗脱,并收集峰。将柱用3倍CV的去离子水以150cm/h解吸。将柱用3倍CV的1N氢氧化钠以150cm/h清洗,并以150cm/h储存在3倍CV的0.1N氢氧化钠中。
结果:
ABasic杂质、CNEt杂质和N+1杂质的相对去除量相对于在粗制品中的量分别在下表4、下表5和下表6中提供。
表4 -ABasic杂质的去除
表5 -CNEt杂质的去除
表6 -N+1杂质的去除
基于表4、表5和表6中所述的结果,将HIC柱加载到其动态结合容量的中心允许去除ABasic杂质、CNEt杂质和N+1杂质。
Claims (30)
1.一种用于从含有目标寡核苷酸和产物相关杂质的混合物中分离所述目标寡核苷酸的方法,所述方法包括以下步骤:
a)将盐加入所述混合物中,其中所述盐是硫酸铵;
b)以动态加载容量使稀释的混合物与疏水性吸附剂接触,所述动态加载容量为所述疏水性吸附剂容量的32%至78%,其中所述疏水性吸附剂包含苯基或己基;
c)用盐水溶液洗涤所述疏水性吸附剂;
d)用洗脱溶液洗脱所述目标寡核苷酸;以及
e)收集包含所述目标寡核苷酸的洗脱液;
其中所述产物相关杂质包含至少一种n-1杂质,从而将所述目标寡核苷酸与所述产物相关杂质分离。
2.一种用于从含有目标硫醇化寡核苷酸和产物相关杂质的混合物中分离所述目标寡核苷酸的方法,所述方法包括以下步骤:
a)将盐加入所述混合物中,其中所述盐是硫酸铵;
b)以动态加载容量使稀释的混合物与疏水性吸附剂接触,所述动态加载容量为所述疏水性吸附剂容量的40%至100%,其中所述疏水性吸附剂包含苯基或己基;
c)用盐水溶液洗涤所述疏水性吸附剂;
d)用洗脱溶液洗脱所述目标寡核苷酸;以及
e)收集包含所述目标寡核苷酸的洗脱液;
其中所述产物相关杂质包含至少一种P=O杂质,从而将所述目标寡核苷酸与所述产物相关杂质分离。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中将所述盐作为盐水溶液加入所述混合物中,或将所述盐直接溶解到所述混合物中。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述洗涤步骤的流速慢于所述加载流速。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述洗脱溶液选自水、盐水溶液、乙二醇或丙二醇或它们的混合物。
6.根据权利要求5所述的方法,其中延迟所述洗脱物收集,以使得收集的洗脱物不包括产物洗脱峰的前1-25%。
7.根据权利要求6所述的方法,其中延迟所述洗脱物收集,以使得收集的洗脱物不包括所述产物洗脱峰的前10-25%。
8.根据权利要求6所述的方法,其中延迟所述洗脱物收集,以使得收集的洗脱物不包括所述产物洗脱峰的前5-10%。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述收集的洗脱物不包括所述产物洗脱峰的最后1-25%。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述收集的洗脱物不包括所述产物洗脱峰的最后5-10%。
11.根据权利要求9所述的方法,其中所述收集的洗脱物不包括所述产物洗脱峰的最后10-25%。
12.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述疏水性吸附剂在至少15cm的床高处填充。
13.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述目标寡核苷酸包含15至25个核苷酸。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述目标寡核苷酸包含独立地选自由以下项组成的组的核碱基:腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶(5-甲基尿嘧啶)、胞嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、7-脱氮嘌呤和5-羟甲基胞嘧啶。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述目标寡核苷酸包含独立地选自由以下项组成的组的核碱基:腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶(5-甲基尿嘧啶)和5-甲基胞嘧啶。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述目标寡核苷酸包含任选被取代的糖;将两个非偕位环原子桥接以形成双环核酸(BNA);或者将所述糖的环氧原子用S、N(R)或C(R)2替代,其中R为H或C1-C12烷基,以及它们的组合。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述糖在2'位被O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、OCH2C(═O)N(H)CH3和O(CH2)nON[CH2)nCH3]2取代,其中n和m独立地为1至10。
18.根据权利要求16所述的方法,其中所述糖在2'处被O(CH2)2OCH3取代。
19.根据权利要求13所述的方法,其中所述目标寡核苷酸仅包含RNA、仅包含DNA、或包含RNA和DNA的组合。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述目标寡核苷酸是缺口聚体。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述目标寡核苷酸包含磷酸二酯(P=O)、硫代磷酸酯(P=S)或它们的组合。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述目标寡核苷酸的序列是(SEQ ID NO:1)。
23.根据权利要求21所述的方法,其中所述目标寡核苷酸的序列是(SEQ ID NO:2)。
24.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述目标寡核苷酸包含4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)。
25.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述目标寡核苷酸不包含4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)。
26.根据权利要求1所述的方法,其中所述产物相关杂质还包含至少一种P=O杂质。
27.根据权利要求2所述的方法,其中所述产物相关杂质还包含至少一种n-1杂质。
28.根据权利要求26或27所述的方法,其中所述产物相关杂质还包含至少一种ABasic杂质。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述产物相关杂质还包含至少一种CNEt杂质。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述产物相关杂质还包含至少一种N+1杂质。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662349970P | 2016-06-14 | 2016-06-14 | |
US62/349,970 | 2016-06-14 | ||
US201762492402P | 2017-05-01 | 2017-05-01 | |
US62/492,402 | 2017-05-01 | ||
PCT/US2017/037126 WO2017218454A1 (en) | 2016-06-14 | 2017-06-13 | Hydrophobic interaction chromatography for purification of oligonucleotides |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109641928A CN109641928A (zh) | 2019-04-16 |
CN109641928B true CN109641928B (zh) | 2022-08-30 |
Family
ID=59216016
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201780037028.4A Active CN109641928B (zh) | 2016-06-14 | 2017-06-13 | 用于寡核苷酸纯化的疏水性相互作用色谱法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10947262B2 (zh) |
EP (1) | EP3468981B1 (zh) |
JP (1) | JP7075359B2 (zh) |
KR (1) | KR102461234B1 (zh) |
CN (1) | CN109641928B (zh) |
AU (1) | AU2017284202B2 (zh) |
BR (1) | BR112018075667B1 (zh) |
CA (1) | CA3027288A1 (zh) |
IL (1) | IL263639B (zh) |
MX (1) | MX2018015654A (zh) |
WO (1) | WO2017218454A1 (zh) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016040748A1 (en) | 2014-09-12 | 2016-03-17 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for detection of smn protein in a subject and treatment of a subject |
BR112019000872A2 (pt) | 2016-08-16 | 2019-04-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | métodos para quantificar anticorpos individuais de uma mistura |
CA3039788A1 (en) | 2016-10-25 | 2018-05-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and systems for chromatography data analysis |
WO2019060062A1 (en) | 2017-09-19 | 2019-03-28 | Regeneron Pharmaceuticals Inc. | METHODS OF REDUCING PARTICLE FORMATION AND COMPOSITIONS FORMED THEREFROM |
TW202005694A (zh) | 2018-07-02 | 2020-02-01 | 美商里珍納龍藥品有限公司 | 自混合物製備多肽之系統及方法 |
WO2020072062A1 (en) * | 2018-10-04 | 2020-04-09 | Gsw Creative Corporation | Portable charging case |
CN110066789B (zh) * | 2019-05-17 | 2021-04-20 | 通用生物系统(安徽)有限公司 | 一种长链dna引物的hplc纯化改进的方法 |
BR112022016238A2 (pt) | 2020-02-28 | 2022-10-11 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Compostos e métodos para modular smn2 |
EP4301766A1 (en) * | 2021-03-02 | 2024-01-10 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Purification methods for oligomeric compounds |
WO2024053578A1 (ja) * | 2022-09-07 | 2024-03-14 | 株式会社日本触媒 | 核酸の製造方法、不純物の除去方法及び不純物が少ない核酸 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1155887A (zh) * | 1994-07-05 | 1997-07-30 | 海布里顿公司 | 用deae-5pw阴离子-离子交换色谱和疏水作用色谱纯化硫代磷酸寡脱氧核苷酸 |
US6087491A (en) * | 1993-01-08 | 2000-07-11 | Hybridon, Inc. | Extremely high purity oligonucleotides and methods of synthesizing them using dimer blocks |
WO2004020449A1 (en) * | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Quiatech Ab | Process for separating and deprotecting oligonucleotides |
CN101006170A (zh) * | 2004-04-19 | 2007-07-25 | 森特利昂公司 | 纯化质粒dna的方法 |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60104097A (ja) * | 1983-11-08 | 1985-06-08 | Sagami Chem Res Center | Dνaの精製方法 |
DE3433649A1 (de) * | 1984-09-13 | 1986-03-20 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig | Verfahren zur aufreinigung synthetischer oligonucleotide |
AU2952395A (en) | 1994-07-05 | 1996-01-25 | Hybridon, Inc. | Purification of oligodeoxynucleotide phosphorothioates using deae 5pw anion ion-exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography |
EP0979233A4 (en) * | 1997-04-21 | 2001-03-21 | Proligo L L C | METHOD FOR SYNTHESIS OF OLIGONUCLEOTIDES IN SOLUTION |
JP2000035423A (ja) | 1998-05-11 | 2000-02-02 | Tosoh Corp | 液体クロマトグラフィ―による核酸の分離法 |
ES2328008T5 (es) * | 1999-05-28 | 2013-02-25 | Lonza Biologics Inc. | Procedimientos de purificación de ADN |
PT102491B (pt) | 2000-07-10 | 2003-02-28 | Inst Superior Tecnico | Processo para producao e purificacao de dna plasmidico |
AU2003291753B2 (en) | 2002-11-05 | 2010-07-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation |
US20050019951A1 (en) * | 2003-07-14 | 2005-01-27 | Gjerde Douglas T. | Method and device for extracting an analyte |
US7427672B2 (en) | 2003-08-28 | 2008-09-23 | Takeshi Imanishi | Artificial nucleic acids of n-o bond crosslinkage type |
SI2548560T1 (sl) | 2005-06-23 | 2015-12-31 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sestavki in postopki za moduliranje izrezovanja smn2 |
AU2007211080B9 (en) | 2006-01-27 | 2012-05-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 6-modified bicyclic nucleic acid analogs |
US20110020924A1 (en) * | 2008-04-30 | 2011-01-27 | Gradalis, Inc. | Highly pure plasmid dna preparations |
HUE046966T2 (hu) | 2009-06-17 | 2020-04-28 | Biogen Ma Inc | Készítmények és módszerek az SMN2 splicing egy alanynál történõ modulálására |
EP4137573A3 (en) | 2014-04-01 | 2023-05-03 | Biogen MA Inc. | Compositions for modulating sod-1 expression |
-
2017
- 2017-06-13 AU AU2017284202A patent/AU2017284202B2/en active Active
- 2017-06-13 MX MX2018015654A patent/MX2018015654A/es unknown
- 2017-06-13 BR BR112018075667-9A patent/BR112018075667B1/pt active IP Right Grant
- 2017-06-13 JP JP2018565677A patent/JP7075359B2/ja active Active
- 2017-06-13 CN CN201780037028.4A patent/CN109641928B/zh active Active
- 2017-06-13 KR KR1020197000396A patent/KR102461234B1/ko active IP Right Grant
- 2017-06-13 US US16/309,622 patent/US10947262B2/en active Active
- 2017-06-13 WO PCT/US2017/037126 patent/WO2017218454A1/en unknown
- 2017-06-13 EP EP17733243.4A patent/EP3468981B1/en active Active
- 2017-06-13 CA CA3027288A patent/CA3027288A1/en active Pending
-
2018
- 2018-12-11 IL IL263639A patent/IL263639B/en unknown
-
2021
- 2021-03-12 US US17/199,921 patent/US20210269467A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6087491A (en) * | 1993-01-08 | 2000-07-11 | Hybridon, Inc. | Extremely high purity oligonucleotides and methods of synthesizing them using dimer blocks |
CN1155887A (zh) * | 1994-07-05 | 1997-07-30 | 海布里顿公司 | 用deae-5pw阴离子-离子交换色谱和疏水作用色谱纯化硫代磷酸寡脱氧核苷酸 |
WO2004020449A1 (en) * | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Quiatech Ab | Process for separating and deprotecting oligonucleotides |
CN101006170A (zh) * | 2004-04-19 | 2007-07-25 | 森特利昂公司 | 纯化质粒dna的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Hydrophobic interaction chromatography of homo-oligonucleotides on derivatized Sepharose CL-6B Using and relating two different models for describing the effect of salt and temperature on retention;M.M. Diogo et al.;《Journal of Chromatography A》;20031231;第137-148页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US10947262B2 (en) | 2021-03-16 |
WO2017218454A1 (en) | 2017-12-21 |
IL263639B (en) | 2021-09-30 |
BR112018075667A2 (pt) | 2019-04-09 |
MX2018015654A (es) | 2019-06-10 |
JP2019518759A (ja) | 2019-07-04 |
KR102461234B1 (ko) | 2022-10-28 |
US20210269467A1 (en) | 2021-09-02 |
EP3468981B1 (en) | 2024-07-24 |
AU2017284202B2 (en) | 2021-11-04 |
IL263639A (en) | 2019-01-31 |
EP3468981A1 (en) | 2019-04-17 |
CA3027288A1 (en) | 2017-12-21 |
CN109641928A (zh) | 2019-04-16 |
KR20190018467A (ko) | 2019-02-22 |
JP7075359B2 (ja) | 2022-05-25 |
AU2017284202A1 (en) | 2019-01-17 |
BR112018075667B1 (pt) | 2024-02-20 |
US20190248823A1 (en) | 2019-08-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109641928B (zh) | 用于寡核苷酸纯化的疏水性相互作用色谱法 | |
KR102185779B1 (ko) | 5-위치 변경된 피리미딘 및 그것의 용도 | |
US5811538A (en) | Process for the purification of oligomers | |
CA3110524A1 (en) | Purification methods for guanine-rich oligonucleotides | |
EP2951191A2 (en) | Method of preparing oligomeric compounds using modified coupling protocols | |
JP2005520547A (ja) | オリゴヌクレオチド及びその類似体のための精製方法 | |
JP2024525501A (ja) | 分離媒体及びそれを用いたヌクレオチド及びヌクレオチド成分の精製方法 | |
JPH06503356A (ja) | ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのクロマトグラフィー分離 | |
US20220363711A1 (en) | Purification methods for carbohydrate-linked oligonucleotides | |
EA040914B1 (ru) | Хроматография гидрофобного взаимодействия для очистки олигонуклеотидов | |
US12049620B2 (en) | Purification methods for guanine-rich oligonucleotides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |