JPH06503356A - ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのクロマトグラフィー分離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのクロマトグラフィー分離 ２月二且庸公団 本発明は一般に合成ホスホロチオエートおよび一ジチオエートオリゴヌクレオチ ドの調製および／または分析に関し、さらに特に、強−陰イオン交換高性能液体 クロマトグラフィ　（ＨＰＬＣ）によって不完全に硫化した欠陥種から完全に硫 化しているホスホロチオエートまたは一ジチオエートオリゴヌクレオチドを分離 するための方法に関するものである。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは種々の病気、特にウィルス性の感染を治療す るために開発されている、例えばマツクラら、プロシーディンゲス・オフ・ザ・ ナショナル・アカデミイ・オフ・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　、第８６巻、４２４４−４４４８頁（１９８９）がある 。アンチセンスオリゴヌクレオチドは長さが通常は約１２ないし３０個のヌクレ オチドの範囲内で変化する合成オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体 であり、そのシーケンスはＲＮＡの予定されたセグメント、新しく転写されたか 、または若干の外来かまたはそうでない不適当に発現させた遺伝子と結合したメ ツセンジャー（ｍＲＮＡ）に相補的である。アンチセンスオリゴヌクレオチドが その標的ＲＮＡにハイブリッド形成するとき、ＲＮＡの翻訳または処理をブロッ クするかまたは酵素分解を受けやすくすると信じられている。このアプローチの もつ問題のひとつは、望ましくない蛋白質、例えばウィルス性酵素、外殻蛋白質 等の合成を妨げるのに有効な十分な濃度と十分な持続時間で、アンチセンスオリ ゴヌクレオチドが標的ＲＮＡになることが困難であることであった。ヌクレアー ゼ消化に対するオリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合の怒受性はこの困難 性の重要な原因であると信しられており、天然のホスホジエステル結合のヌクレ アーゼ耐性１！（Ｉｕ体によって結合した種々のヌクレオシド類似体の開発が試 みられた、例えばミラーら、米国特許第４，５１１゜７１３号およびツオの米国 特許第４，４６９，８６３号（メチル−およびアリールホスホネート）；ミロら 、ヌクレイツク・アシソズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ）　、第１７巻、８２０７−８２１９頁（１９８９）（ホスホロセレノ エート）；プリルら、ジャーナル・オフ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイア ティ（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、）、第１１１巻、２３２１頁（１９ ８９）　（ホスホロジチオエート）；およびマツクラら、ブロソーデインダス・ オフ・ザ・ナソヨナル・アカデミイ・オフ・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　、第８４巻、７７０６−７７１０頁（１９８ ７）、およびジーン（Ｇｅｎｅ）　、第７２巻、３４３−３４７頁（１９８８） 　（ホスホロチオエート）。

ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート類似体は、ヌクレアーゼ耐性が 大きく、天然のオリゴヌクレオチドと同し電荷を有し、有効量で細胞によって吸 収されるので特に有望である。

ホスホロチオエートは水素ホスホネートまたはホスホルアミダイト化学作用を用 いる自動化ＤＮＡシンセサイザーによって合成することができる。前者のアプロ ーチでは、ホスホネート主鎖は合成後の自動化シンセサイザーから単一工程で硫 化することができる。これはホスホネート部分が有機溶媒に溶解した元素硫黄に さらされることによって硫化されるので有利である。硫黄は容易に溶液から析出 するので、オフカラム硫化は硫黄沈澱物によるシンセサイザーのバルブと管の費 用のかかる封鎖を回避する。このホスホロチオエート合成ルートの欠点は、鎖を 伸長する間のカンプリング収率が、一般にホスホルアミダイト化学を用いて得ら れるものよりも低いことである、ガソフニイとジョーンズ、テトラヘドロン・レ ターズ（Ｔｅｔｔ、　Ｌｅｔｔ、）、第２９巻、２６１９−２６２２頁（１９８ ８）。カップリング収率が高い実際の重要性は２８量体の合成によって示され、 一工程につき９９％のカップリング収率は７６％（，９９”）の全収率となるが 、一工程につき９６％の収率は３３％（，９６”）の全収率にしかならない。

代表的には９９％よりも大きいカップリング収率をもつホスホロアミダイト化学 は、現在ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート合成への一層望ましい アプローチである。しかしながら、硫化されるホスファイト中間体は反応サイク ルの脱トリチル化工程の条件下に不安定である。従って、ホスファイト結合は各 カップリング工程後に硫化されなければならない。これは種々の硫化剤を用いて 行うことができる、例えばマツクラら、ジーン（Ｇｅｎｅ＋上記引用）（元素硫 黄）；ライアーら、ジャーナル・オフ°オーガニック・ケミストリイ（Ｊ、　Ｏ ｒｇ、　Ｃｈｅｗ、）、第５５巻、４６９３−４６９９頁（１９９０）　（チオ スルホネート硫化剤）；ヒルシュベイン、ＰＣＴ出１ｉ１ＵＳ９１１０１００８ 　（チウラムジスルフィドおよびポリスルフィド硫化剤）；およびステフクら、 米国特許第５，１５１．５１０号（チオホスホラス硫化剤）。不幸にも、これら の薬剤は１００％硫化するものがない。各硫化工程では、少量の両分のホスファ イト前駆体は硫化される代りに酸化される。これはホスホジエステル主鎖に沿っ た酸素の数と分布に関してホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのコンプレッ クス混合物の合成に導かれる。所定数の酸素を含有する生成物の両分は二項式分 布に従う。例えば、硫化収率が各工程で９９％である２０量体のホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドの合成では、例えば、硫化の代りに１及び２の酸素化が 行われた生成物の両分はそれぞれ第２及び第３の項、（，９９＋、Ｏ１）”、ま たは（テ）（，９９）１ｇ（、ＯＩ）　＝、１６５および（５°）（，９９）” （，０１）”＝、０１６の二項分布によって、それぞれ与えられる。従って、一 様に適度な大きさのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの比較的大きい両分 は不完全に硫化し、完全に硫化した化合物と不完全に硫化した化合物の物理化学 的類似性のために、２つの種の物質の分離および／または分析は、通常ＮＭＲ分 析または類似の方法を必要とするので、不便であることがわかった。

製薬学的化合物としてオリゴヌクレオチドのホスホロチオエートおよびホスホロ ジチオエート類似体を使用したいという希望を考慮すると、部分的に硫化した物 質から完全に硫化した物質を分離することができ、特にホスホルアミダイトおよ び／またはホスホルチオアミダイト化学に関連して完全に硫化した８４以体の収 率をモニターする簡便で安価な方法を可能にする、硫化生成物の調製と分析のた めの可能な方法をもつことが有利である。

又里■皿丞 本発明は、完全に硫化したホスホロチオエートおよび／または一ジチオエートオ リゴヌクレオチドを、不完全に硫化した物質から陰イオン交換高性能液体クロマ トグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）によって分離するための方法である。この方法は （１）完全に硫化したおよび不完全に硫化したホスホロチオエートまたはホスホ ロジチオエートオリゴヌクレオチドの混合物を用いて陰イオン交Ｉｌｌを含浸さ せ、（２）緩衝液が出発濃度から試料脱着濃度まで時間と共に単調に増加するソ フトベースカウンターイオンの濃度から成る陰イオン交換体にこの緩衝液を通過 させ、そして（３）完全に硫化したホスホロチオエートまたはホスホロジチオエ ートオリゴヌクレオチドを含有する工程（２）からの溶出液を回収する各工程か ら成る。本発明はまた、他の容易に入手できる技術よりもはるかに少ない試料を 用いるホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエートオリゴヌクレオ チドの硫化度を分析するための迅速で手軽な方法のための基礎を形成する。

ここで用いられる“ソフトベースカウンターイオン”の語は陰イオン交換体上の 陽イオン基からホスホロチオエート部分を置換するために適しているベースを意 味し、さらに特に、低い電気陰性度と高い極性に特徴があり、試薬や緩衝溶液の ｐＨに化学的に安定であるカウンターイオン性ベースと呼ばれる。好ましくは、 Ｕ■吸収によって分離したオリゴヌクレオチドを手軽に検出できるように２５０ 〜２８０ｎｍの範囲内で無視できる吸収をもつ。ソフトベースを選択するための ガイドはピアソンによって与えられている、ジャーナル・オフ・ザ・アメリカン ・ケミカル・ソサイアティ（Ｊ、　Ａｍ、　ＣｈｅＩｌ、　Ｓｏｃ、）、第８５ 巻、３５３３−３５３９頁（１９６３）　；ピアソン、ジャーナル・オフ゛・ケ ミカル・エデュケーション（Ｊ、Ｃｈｅｗ。

Ｅｄ、）、第４５巻、５８１−５８７頁と６４３−６４８頁（１９６Ｂ）　；ピ アソンら、ジャーナル・オフ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイアテイ　（Ｊ 。

Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、）、第８９巻、１８２７−１８３６頁（１９６７ ）　；およびホ、ケミカル・レビューズ（Ｃｈｅｗ、　Ｒｅｖ、）　、第７５巻 、１−２０頁（１９７５）。例示的なソフトベースカウンターイオンは臭化物、 チオシアネート、ヨウ化物、アジ化物、シアネート、チオサルフェート、無機硫 化物、および一般式Ｒ３−の無機硫化物（式中、Ｒは６ないし１０個の炭素原子 をもつアリール、または１ないし６個の炭素原子をもつアルキルである）を含む 。さらに好ましくは、Ｒはフェニル、メチルまたはエチルである。さらに好まし くは、ソフトベースは臭化物およびチオシアネートから成る群から選ばれる。

ソフトベースカウンターイオンに関してここで用いられる“試料膜ｒ１１度”の 語は、陰イオン交換体から完全に硫化したボスボロチオエートまたはジチオエー トオリゴヌクレオチドをン容出するために十分であるソフトベースカウンターイ オンの濃度を意味する。この１度はソフトベースカウンターイオンのタイプ、交 換体上の陽イオン基のタイプ、用いた有機改質剤、ｐＨ１試料中のボスホロチオ エートまたはジチオエートオリゴヌクレオチドの長さ、および他の同様のパラメ ーターに依存する。試料吸着濃度は日常の実験によって特定の具体化のための事 項に対して容易に決定される。

ソフトベースカウンターイオンに関してここで用いられる“出発濃度”の語はグ ラジェントのスタートでＯ２０から０．６　Ｍまでの範囲のソフトベースカウン ターイオンの濃度、そしてさらに好ましくは、グラジェントのスタートで０．３ から０．５　Ｍまでの範囲の濃度を意味する。

ここで用いられる“オリゴヌクレオチド”の語は、天然または改質したヌクレオ シドまたはホスホジエステル結合によって結合した非ヌクレオシド類似体の線形 オリゴマー、または大きさの範囲が数単量体の単位、例えば２〜３がら数十の単 量体単位、例えば３０〜５０の単量体単位までのそれらの類似体を含む。特に、 この用語はｆ４（＋　Ｉ　［）の前駆体が硫化の影響を受けやすい燐含有結合を 有する非天然オリゴマーを含む、例えばタケシタら、ジャーナル・オフ・バイオ ロジカル・ケミストリイ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、）　、第２８２巻、 １０１７１４０１７９頁（１９８７）　；　オヨびイーヒエニスら、２２５−２ ３０頁、プルチクおよびステク編、バイオホスフェートとそれ゛の里生二二金底 、告、゛、びゞ　（エルセピア−、アムステルダム、１９８６）。

ホスホロチオエートまたはジチオエートオリゴヌクレオチドに関して、：こで用 いられる“不完全に硫化した”の語は、１またはそれ以上のホスホジエステル結 合の１またはそれ以上の非架橋酸素が硫黄と置換されていないことを意味する。

逆に、ボスボロチオエートまたはジチオエートオリゴヌクレオチドに関して“完 全に硫化した”の語は、各ホスホジエステル結合の非架橋酸素の１方（チオエー トフまたは両方（ジチオエート）が硫黄と置換されていることを意味する。

本発明の方法に使用するため完全に硫化した、および不完全に硫化したホスホロ チオエートまたはホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドの混合物は、ホスホ ロチオエートおよびボスホロジチオエートオリゴヌクレオチドを合成する全ての 最近の利用できる方法から生成することができる。オリゴヌクレオチド合成のホ スホルアミダイド、ホスホルチオアミダイド、および水素ボスボネート方法のた めの詳細な手順は次の参考文献に記載されており、これらは参考文献としてここ に組み込まれる：カルーサースら、米国特許４，４５８．０６６および４，５０ ０．７０７　；コニスターら、米国特許４．７２５．６７７　；マフテウチら、 ジャーナル・オフ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（Ｊ、＾ｔｓｅｒ 、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、）、第１０３巻、３１８５−３１９１頁（１９８１） 　ｉカルーサースら、ジェネティ、り・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅ ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、第４巻、１−１７頁（１９８１）　；ジョーンズ、２ 章、およびアキンソンら、３章、ディト編、主ユゴヌクレオチド人　：ＵΩヱ１ 三ユ±（ＩＲＬプレス、ワシントン、Ｄ、Ｃ，，１９８４）　；フレーラーら、 テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第２ ７巻、４６９−４７２頁（１９８６）　、ガレソゲら、テトラヘドロン・レター ズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第２７巻、４０５１−４０５ ４頁および４０５５−４０５８真（１９８６）　；アンドルスら、米国特許第４ ，８１６，５７１号；プリルら、ジャーナル・オフ・ザ・アメリカン・ケミカル ・ソサイアティ（Ｊ、　Ａｍｅｒ、　ＣｈｅＩＩｌ、　Ｓｏｃ、）、第１ＩＩ巻 、２３２１−頁（１９８９）　、カルーサースら、ＰＣＴ出願ＵＳ８９１０２２ ９３；ステツら、欧州出願第９２３０１９５０．９号；およびフレーラーら、ヌ クレイツク・アンノズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ）、第１４巻、５３９９−５４０７頁（１９８６）。種々の硫化方法は、マ ツクラらのジーン（Ｇｅｎｅ、上記に引用）；ライヤーら、ジャーナル・オフ電 オーガニック・ケミストリイ（Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｌｌ、）、第５５巻、４ ６９３−４６９９頁（１９９０）　；　ヒルシュベイン、ＰＣＴ出１ｉＪＩＵｓ ９１１０１００８　；ボウタイプら、米国特許第５．００３．０９７号；および ステツら、米国特許第５．１５１．５１０号によって開示されている。

好ましくは、本発明の方法は高性能、または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰ 　Ｌ　Ｃ）によって実行される。特定の設計パラメーター、例えばカラム寸法、 流速、陰イオン交換体（マトリックスおよび共有結合した陽イオン基の両方）等 を選択するための詳細にわたる手引きは、液体クロマトグラフィーに関する多く のテキストのいずれかを利用できる。例えば、スナイダーおよびキルグランド、 最新の液体クロマトグラフィーの紹介（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏ　Ｍｏｄ ｅｒｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）　、第２Ｗ、（ウイリ イ・インターサイエンス、ニューヨーク、１９７９）。

種々の陰イオン交換体を使用することができるが、好ましくは交換体マトリ、ク スまたは樹脂はＨＰＬＣに使用するために適していなければならない。例えば、 それは機械的に硬く、通常の操作圧で安定であり、使用する溶媒に対して不活性 であり、用いられるｐＨ範囲で安定でなければならない等である。好ましくは、 陰イオン交換体マトリックスはアガロース、シリカゲル、メタクリルホリマー、 および高度に架橋したスチレンージビニルヘンゼンマトリックスを含み、後者が 最も好ましい。好ましくはマトリックスは閘イオン交換官能価、特に第三または 第四アルキルアンモニウム陽イオン、例えばトリエチルアミノエチル、ジエチル アミノエチル、ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル、第四アミ ノエチル、第四アミン等を用いて誘導される。好ましくは、マトリックスは第四 アミンを用いて誘導される。

粒径は、クロマトグラフィーによる工程でピークを分離するように、完全および 不完全ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、どの位良く分割されるかを決 定する際に重要なファクターである。好ましくは、粒径は直径が約１５μｍ以下 であり、さらに好ましくは、粒径は約８〜１０μｍの範囲である。イオン交換樹 脂の多孔度は重要ではない。６０ないし１０００オングストロームの範囲内の孔 径が適当である。

工程の温度の考察は他の陰イオン交換工程のそれに類似している。従って適当な 操作温度はカラム中の交換体の容量、粒径、表面積および他の類似の変数に依存 し、日常の実験によって容易に決定することができる。約１４℃から約３５℃ま で、好ましくは約１７℃から約３０℃まで、そして最も好ましくは約２０℃ない し約２８℃の範囲内の温度で操作することが最も便利である。

緩衝溶液は、カウンターイオンが調整された濃度とｐＨで吸着試料に供給される 液体媒体である。任意には、緩衝溶液は脱着工程において補助となる１種または それ以上の有機改質剤を含むことができる。好ましくは、有機改質剤は緩衝溶液 に含まれ、（１）試料中のオリゴヌクレオチドが一本鎖で残るように確保し、そ し、て（２）オリゴヌクレオチドと支持マトリックスとの間の疎水性相互作用を 中和する。さらに優先して、溶出したオリゴヌクレオチドの検出を妨害しないよ うに、有機改質剤はＵＶ波長範囲内の例えば２５０〜２８０ｎａ＋の光に対して 透過しなければならない。好ましい有機改質剤はアセトニトリル、ホルムアミド 、尿素等の溶媒を含む、最も好ましくは、アセトニトルを有機改質剤として使用 する。

ｐＨは特定のソフトベースカウンターイオンに対して最適にすることができる。

同様に、ソフトベースカウンターイオンの濃度勾配は関数形態、時間経過等を含 めて、分離を最適にするように選択され、カラム寸法、流速、吸着試料の分量等 を考慮して日常の実験によって容易に決定することができる。ある場合には陰イ オン交換体マトリックスの選択はｐＨ範囲の選択に影響を及ぼすことができる。

例えばシリカゲルマトリックスはアルカリ性の条件、例えばｐＨ＞７．５で支持 体の溶解による約２〜７の範囲内のｐＨをもつ緩衝液に制限される。一般に、緩 衝液ｐＨは臨界の変数ではなく、６〜１４の範囲にすることができる。好ましく はソフトベースカウンターイオンの濃度は、試料脱着濃度に達するまで単調に増 加し、その後、完全に硫化したホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを実質的 に全て除去するように充分長い時間をかけて濃度をほぼ一定に保持する。さらに 好ましくは、ソフトベースカウンターイオンの濃度は、直線的に、そして最も好 ましくは、１分間につき約１〜２パーセントの範囲内の速度で増加する。溶出後 、分離カラムは出発値まで濃度を戻して再循環させることができる。

交換体床を通過するための緩衝溶液の容量と流速は最適な分離を行うように選択 され、前記のように、日常の実験によって決定することができる。

本発明の方法を分析に使用するとき、完全にあるいは部分的に硫化された化合物 の両分はクロマトグラムのピーク領域を全ピーク下の全領域と比較することによ って容易に決定される。

失意Ａ± この実施例では４種のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成して、完全 に硫化した成分および不完全に硫化した成分を本発明に従って分離した。完全に 硫化した成分と不完全に硫化した成分の画分をＮＭＲ分析によって［Ｗした。次 のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、標準のプロトコルを用いるアプラ イド・バイオシステムズ・モデル３８０Ｂまたは３９０Ｚ自動化ＤＮＡシンセサ イザーでホスホルアミダイト化学によって合成した、例えば上記の引用文献およ びエフカビノチ、シュレシンガー編、高分子シーケンシングおよび合成（Ｍａｃ ｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓ） の２２１頁：選択された方法と応用（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄ 　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）　（アラン・アール・リス、ニューヨーク、１９ ８８）　：　５−ｄ（Ｃ＋ｚＧｓＴ＋。）（±）　、５−ｄ（ＡｓＣ１ＧｔＴＪ 　（２）　、５−ｄ（Ａ＋Ｃ５ＧｚＴ、）（主）、および５−ｄ（ＣＩ３ＧＩＴ ＆）　（１）、式中（例えば）ｄ（Ｃ＋ｚＧｓＴ＋ｏ）は２７量体のオリゴデオ キシリボヌクレオチド５’　−ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴおよび接頭辞“Ｓ”はホスホジエステル結合が硫化されていることを 示す。硫化工程は、ライヤーら（上記引用）によって記載されているように、３ Ｈ−１，２−ベンゾチオール−３−オン　１．１−ジオキシドを用いて行った。

各合成からの粗ＤＮＡの５°　−〇−ジメトキシトリチル誘導体は最初にシンら のバイオクロマトグラフィ（Ｂｉｏｃｈｒｏ＋ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）Ｎ第１巻 ・２２頁（１９８Ｂ）に記載されているような逆相分取りロマトグラフイーによ って精製した。

完全に硫化したホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと不完全にｉ化したホス ホロチオエートオリゴヌクレオチドの分析的分離は、パーキン−エルマー１５５ −２００オートサンプラーを用いるパーキン−エルマーシリーズ４１０Ｂ１０液 体クロマトグラフィーシステム、パーキン−エルマーモデル１０２０データーシ ステム、およびアプライド・バイオ・システムス社のモデル７５９八ＵＶ検出器 で行った。カラムは、１５ｃｍ　Ｘ内径７．５ｎ１１であり、粒径が１０μｍで 孔径が１０００オングストロームの第四アルキルアンモニウム官能支持体、ポリ マーラプスＰＣ−５ＡＸを装填した。緩衝溶液は３種類の成分から成る：　Ａ　 （５０ｍＭｍ酸アンモニウム緩衝液ｐＨ８，２およびアセトニトルを９５：５の 割合（ν／ν））　；　Ｂ　（５０ｍＭ燐酸アンモニウム緩衝液ｐＨ６，７に１ ．５Ｍの臭化カリウムを含むものおよびアセトニトルを８０　：　２０の割合（ ν／ｖ））　；およびＣ（アセトニトル）。臭化物のソフトベースカウンターイ オンの濃度は、５０Ａ　：　３０Ｂ　：　２０からＯＡ　：　８０Ｂ　：　２０ Ｃまで４８分かけて０．４５Ｍから１．２Ｍまでの直線を示した。流速は１．５ ｍｌ／分であり、溶出物質は２６０ｎｍでＵＶ吸収によって検出した。図１　ａ 　％　ｅは、それぞれ、化合物上、！（高い０）、２（低いＯ）、３、および↓ から得られたクロマトグラムである。ピーク上のローマ数字は下の表中のローマ 数字に対応しＮＭＲによって試験した。予備的な単離は約１５ｍｇのＤＮＡ　（ 上述のように調製した）を２１１１１の水に溶解し、上記と同じカラムにループ −インジェクター（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ　９１２５）を介して移すことによって行 われた。緩衝溶液と勾配は勾配サイクルが７０分であった以外は上記と同しであ った。２〜１２ｍｇの各ピークから成る画分を集め、それぞれ脱塩し、”Ｐ−Ｎ ＭＲ分析用に０．０に集めた。ＮＭＲはＪＥＯＬ　Ｇ５Ｘ−５００で２０２．４ ５　ＭＨｚのサンプリング周波数、０．６５５ｓの捕捉時間、６Ｓのパルス遅延 、および５μ５（４５°）の）ｉルス幅を用いて行うか、またはパリアン・ユニ ティ３０００で１２１．４２　ＭＨｚのサンプリング周波数、１〜６Ｓの捕捉時 間、Ｏ３のパルス遅延、および１１μ直９０”）のパルス幅を用いて行った０表 ■は化合物上およヒ叢のピークＩ−ＴＶに対応する成分中の硫化していないホス ホジエステル結合のＮＭＲ測定パーセンテージを比較したものである。

理論値（二項分布から得られる）および測定値は極めて近いことが容易に認めら れる。

ヒム　１および２のピークＩ−ＩＶの硫ヒしていないホスホジエステル　人のパ ーセンテージ化合物 ＮＭＲによる一゛　育　實１−− ピーク　上　１　上　１ １　０．０　０．１　０．０　０．Ｏ ＩＩ　５．１　３．６　３．８　５．０Ｉ［１８，８”１．”ｌ　７．７　１０ ．０ｒｖ　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ、　１１．５　１５．０最後に、化合物１〜玉の０ 倍、１倍、２倍、および３倍の酸化成分の画分は本発明の方法により決定され、 理論画分（二項分布から計算）およびＮＭＲ分析によって測定された全パーセン トＰ＝Ｓと比較した。結果は表■に示した。同じ化合物の複数の唄口は同し化合 物を別々に合成したもので、ある場合には他のものよりもあまり効果なく硫化さ れたことを示している。

表１ ＮＭＲによる　パーセンテージＰ＝ＳおよびＨＰ　Ｌ　Ｃ（Ｅｘｐ）および　ｉ Ａ′Ｉ（ＣａｌＣ）による　ム　１〜４のＯ，１，２、および３　の　のパーセ ンテージ ＡＮＭＲピークＩ　ピーク■　ピーク■　ピーク■Ｃａ１ｃ　Ｅｘｐ　Ｃａ１ｃ 　Ｅｘｐ　Ｃａ１ｃ　Ｅｘｐ　Ｃａ１ｃ　Ｅｘｐｌ　９９．３　８３．３　８３ ．７　１５．３　１４．１　１．３５　１．９　．０７　０．３１　９Ｂ、３　 ６４．０　６４．５　２８．８　２９．０　６．２　５．６　０．９　０．８１ 　９Ｂ、０　５９．１　５Ｂ、１　３１．４　２９．４　８．０　９．８　１． ３　２．７２　９９．６　９２．３　９０．０　７．４　７．９　０．３　＜２ 　＜＜０．１＜０．５２　９７．３　５７．８　５２．４　３２．１　３３．５ 　８．５　１１．３　１．４　２．８３　９９．７　９４．４　９３．８　５． ４　５．９　＜０．２＜０．５　＜０．１＜０．５４　９９．７　９４．４　９ ３．０　５．４　７．０　＜０．２＜０．５　＜０．１＜０．５大施汎Ｉ 陰イオン交換体がジエチルアミノエチルカオチン（Ｎｕｃｌｅｕ−３ｉ１．　Ｍ ａｃｈｅｒｙ　＆　Ｎａｇｅｌ　ドイツ）を用いて誘導したシリカゲルであった 以外は、化合物上と同じ分離を実施例１に記述したように行った。結果を図２の クロマトグラムに示す。右側の最高のピークは完全にチオエート化したオリゴヌ クレオチドに相当する。

夫見桝主 実施例１の化合物上は次の事項以外は実施例１に記載したように精製した：　（ ｉ）緩衝液ＡおよびＢを用いた（Ａは１０ｍＭのＮａＯＨｐＨ１２およびＢは１ ０ｎ＋ＭのＮａＯＨｐＨ１２，２に溶解した１、５ＭのＫＢｒから成る）、（ｉ ｉ）　ＰＬ−５ＡＸ支持体を１５×内径０．４６ｃ、ｍのカラムに装填した、お よび（ｉｉｉ）緩衝液比Ａ：Ｂ＝７０：３０からＡ：Ｂ＝１０　：　９０までカ ラム条件を変えて４０分間で１．０■１／分の流速を用い室温で、臭化物濃度を 増加する直線勾配を用いて分離を行った。

有機改質剤は添加しなかった。溶出した物質は２６０ｎｍの吸収によって検出し た。結果は図３に示す。高いｐＨおよび有機改質剤のない条件下で達成された分 離範囲は、中性に近いｐ　Ｈ（６，７〜８．２）および少なくとも２０％の有機 改質剤の条件下の同じ化合物に対して達成されたものと殆ど同一である（図ＩＢ ）。

凹Ｉ五呈里星豆所 図１ａｘｅは１個またはそれ以上の硫化していないホスホジエステル結合をもつ 成分から完全に硫化された成分を分離することを示すホスホロチオエートオリゴ ヌクレオチドのクロマトグラムである。陰イオン交換体は第四アンモニウムカチ オンを用いて誘導したスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーであった。

図２は１個またはそれ以上の硫化していないホスホジエステル結合をもつ成分か ら完全に硫化された成分を分離することを示すホスホロチオエートオリゴヌクレ オチドのクロマトグラムである。

陰イオン交換体はジエチルアミノエチル第三アミンカチオンを用いて誘導したシ リカゲルであった。

図３は交換体マトリックスがスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーであるとき 、高いｐＨと有機改質剤のない条件下に完全にチオエート化したオリゴヌクレオ チドと部分的にチオエート化したオリゴヌクレオチドを分離することを示すクロ マトグラムである。

ｓ＋ＮＬＪ−ｒｃｂ　ＦＩＧ、Ｉ　Ｃ１５，０＋５．０　’Ｌ５．Ｏ’！１５． ０　４Ｅ、ＯＳ５．０６、ｏ　１５．０　２５．ｏ　Ｂ’５．ｏ　４５．０６、 ＯＳ５．０　２５．０　’ｐ５．ｏ　４５．０ＦＩＯ，１ｅ ＦＩＧ、２ ＦＩＯ，３

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）完全に硫化したおよび不完全に硫化したホスホロチオエートまたはホ スホロジチオエートオリゴヌクレオチドの混合物を用いて陰イオン交換体を含浸 させ； （ｂ）時間と共に試料脱着濃度まで単調に増加するソフトベースカウンターイオ ンの濃度から成る緩衝溶液を陰イオン交換体に通過させ；そして （ｄ）溶出液を工程（ｂ）から回収する各工程から成る、完全に硫化したおよび 不完全に硫化したホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートオリゴヌクレ オチドの混合物から完全に硫化したホスホロチオエートまたはホスホロジチオエ ートオリゴヌクレオチドを分離する方法。
2. ２．前記陰イオン交換体が、アガロース、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマ ー、シリカゲル、およびメタクリルポリマーから成る群から選ばれるマトリック スを含む請求項１記載の方法。
3. ３．前記マトリックスが第三または第四アルキルアンモニウムカオチンを用いて 誘導される請求項２記載の方法。
4. ４．前記ソフトベースカウンターイオンが臭化物、チオシアネート、ヨウ化物、 アジド、シアネート、チオサルフェート、無機硫化物、および式ＲＳ−の有機硫 化物（式中、Ｒは６ないし１０個の炭素原子を有するアリールまたは１ないし６ 個の炭素原子を有するアルキルである）から成る群から選ばれる請求項３記載の 方法。
5. ５．前記第三または第四アルキルアンモニウムカオチンがジエチルアミノエチル 、第四アミノエチル、および第四アミンから成る群から選ばれる請求項４記載の 方法。
6. ６．前記ソフトベースカウンターイオンが臭化物、チオシアネート、および式Ｒ Ｓ−の有機硫化物（式中、Ｒはフェニル、メチルまたはエチル）から成る群から 選ばれる請求項５記載の方法。
7. ７．前記ソフトベースカウンターイオンが、臭化物、チオシアネート、ヨウ化物 、アジド、シアネート、チオサルフェート、無機硫化物、および式ＲＳ−の有機 硫化物（式中、Ｒは６ないし１０個の炭素原子を有するアリールまたは１ないし ６個の炭素原子を有するアルキルである）から成る群から選ばれる請求項１記載 の方法。
8. ８．前記ソフトベースカウンターイオンが臭化物、チオシアネート、アジド、硫 化物、ヨウ化物、および式ＲＳ−の有機硫化物（式中、Ｒはフェニル、メチルま たはエチルである）から成る群から選ばれる請求項７記載の方法。
9. ９．前記ソフトベースカウンターイオンが臭化物、チオシアネート、アジド、硫 化物、ヨウ化物から成る群から選ばれる請求項８記載の方法。
10. １０．前記緩衝溶液が時間と共に出発濃度から前記試料脱着濃度まで直線で増加 するソフトベースカウンターイオンの濃度から成る請求項９記載の方法。
11. １１．前記ソフトベースカウンターイオンが１分につき１ないし２パーセントの 範囲の速度で濃度を増加する請求項１０記載の方法。
12. １２．（ａ）完全に硫化したおよび不完全に硫化したホスホロチオエートまたは ホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドの混合物を用いて陰イオン交換体を含 浸させ、（ｂ）溶出した完全に硫化したおよび不完全に硫化したホスホロチオエ ートおよびホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドのクロマトグラムを形成す るように、時間と共に試料脱着濃度まで単調に増加するソフトベースカウンター イオンの濃度から成る緩衝溶液を陰イオン交換体に通過させ；そして（ｃ）クロ マトグラム上の完全に硫化したおよび不完全に硫化したホスホロチオエートまた はホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドの両者に相当する全ピーク下の全面 積に対するクロマトグラム上の完全に硫化したホスホロチオエートまたはホスホ ロジチオエートオリゴヌクレオチドに相当するピーク面積の割合を計算する各工 程から成る、 完全に硫化したおよび不完全に硫化したホスホロチオエートまたはホスホロジチ オエートオリゴヌクレオチドの混合物における完全に硫化したホスホロチオエー トまたはホスホロジチオエートの画分を測定する方法。
13. １３．前記ソフトベースカウンターイオンが臭化物、チオシアネート、アジド、 硫化物、およびヨウ化物から成る群から選ばれる請求項１２記載の方法。
14. １４．前記ソフトベースカウンターイオンが臭化物およびチオシアネートから成 る群から選ばれる請求項１３記載の方法。
15. １５．前記緩衝溶液が時間と共に前記試料脱着濃度まで直線で増加するソフトベ ースカウンターイオンの濃度から成る請求項１４記載の方法。