WO2024053578A1 - 核酸の製造方法、不純物の除去方法及び不純物が少ない核酸 - Google Patents
核酸の製造方法、不純物の除去方法及び不純物が少ない核酸 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2024053578A1 WO2024053578A1 PCT/JP2023/032085 JP2023032085W WO2024053578A1 WO 2024053578 A1 WO2024053578 A1 WO 2024053578A1 JP 2023032085 W JP2023032085 W JP 2023032085W WO 2024053578 A1 WO2024053578 A1 WO 2024053578A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- nucleic acid
- group
- nucleophile
- protecting group
- solid phase
- Prior art date
Links
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 121
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 121
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 121
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 49
- 239000012535 impurity Substances 0.000 title claims description 38
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims abstract description 39
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 15
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 claims description 33
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 5
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 abstract description 33
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 abstract 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 59
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 36
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- -1 isobutyryl group Chemical group 0.000 description 17
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 15
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 12
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 12
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 11
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 11
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 10
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 description 9
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 8
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 8
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 8
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 8
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 4
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 4
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 4
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 4
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000178 Acrylic resin Polymers 0.000 description 3
- 239000004925 Acrylic resin Substances 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004813 Perfluoroalkoxy alkane Substances 0.000 description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N Pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N butan-2-ol Chemical compound CCC(C)O BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 239000012351 deprotecting agent Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 3
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 229920011301 perfluoro alkoxyl alkane Polymers 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 3
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YIMATHOGWXZHFX-WCTZXXKLSA-N (2r,3r,4r,5r)-5-(hydroxymethyl)-3-(2-methoxyethoxy)oxolane-2,4-diol Chemical compound COCCO[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O YIMATHOGWXZHFX-WCTZXXKLSA-N 0.000 description 2
- JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 1,1-dioxo-1$l^{6},2-benzodithiol-3-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)SS(=O)(=O)C2=C1 JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BBMCTIGTTCKYKF-UHFFFAOYSA-N 1-heptanol Chemical compound CCCCCCCO BBMCTIGTTCKYKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 1H-tetrazole Chemical compound C=1N=NNN=1 KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BWZVCCNYKMEVEX-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-Trimethylpyridine Chemical compound CC1=CC(C)=NC(C)=C1 BWZVCCNYKMEVEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ITQTTZVARXURQS-UHFFFAOYSA-N 3-methylpyridine Chemical compound CC1=CC=CN=C1 ITQTTZVARXURQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N Dimethoxyethane Chemical compound COCCOC XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N Dimethylamine Chemical compound CNC ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N N-Pentanol Chemical compound CCCCCO AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- MWKFXSUHUHTGQN-UHFFFAOYSA-N decan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCO MWKFXSUHUHTGQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LQZZUXJYWNFBMV-UHFFFAOYSA-N dodecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCO LQZZUXJYWNFBMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 2
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethanethiol Chemical compound CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N hexan-1-ol Chemical compound CCCCCCO ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004190 ion pair chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- ZWRUINPWMLAQRD-UHFFFAOYSA-N nonan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCO ZWRUINPWMLAQRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 2
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 2
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012508 resin bead Substances 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 2
- CCSBNBKMACZDGN-UHFFFAOYSA-N (2-phenoxyacetyl) 2-phenoxyacetate Chemical compound C=1C=CC=CC=1OCC(=O)OC(=O)COC1=CC=CC=C1 CCSBNBKMACZDGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GBBJBUGPGFNISJ-YDQXZVTASA-N (4as,7r,8as)-9,9-dimethyltetrahydro-4h-4a,7-methanobenzo[c][1,2]oxazireno[2,3-b]isothiazole 3,3-dioxide Chemical compound C1S(=O)(=O)N2O[C@@]32C[C@@H]2C(C)(C)[C@]13CC2 GBBJBUGPGFNISJ-YDQXZVTASA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- GZTYTTPPCAXUHB-UHFFFAOYSA-N 1,2-benzodithiol-3-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)SSC2=C1 GZTYTTPPCAXUHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUHZEENZYGFFBQ-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-Me3C6H3 Natural products CC1=CC(C)=CC(C)=C1 AUHZEENZYGFFBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 1-methylcytosine Chemical group CN1C=CC(N)=NC1=O HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XGDRLCRGKUCBQL-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazole-4,5-dicarbonitrile Chemical compound N#CC=1N=CNC=1C#N XGDRLCRGKUCBQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JNJFONBBNLVENC-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazole;trifluoromethanesulfonic acid Chemical compound C1=CNC=N1.OS(=O)(=O)C(F)(F)F JNJFONBBNLVENC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GQHTUMJGOHRCHB-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,6,7,8,9,10-octahydropyrimido[1,2-a]azepine Chemical compound C1CCCCN2CCCN=C21 GQHTUMJGOHRCHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVZJRBAUSGYWJI-UHFFFAOYSA-N 2,5-bis(3-dodecylthiophen-2-yl)thiophene Chemical compound C1=CSC(C=2SC(=CC=2)C2=C(C=CS2)CCCCCCCCCCCC)=C1CCCCCCCCCCCC GVZJRBAUSGYWJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-methylpyridine Natural products CC1=CC=C(C)N=C1 XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XECYTQKOWWBNNU-UHFFFAOYSA-N 2h-benzotriazole;trifluoromethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F.C1=CC=C2NN=NC2=C1 XECYTQKOWWBNNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004080 3-carboxypropanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 1
- NHQDETIJWKXCTC-UHFFFAOYSA-N 3-chloroperbenzoic acid Chemical compound OOC(=O)C1=CC=CC(Cl)=C1 NHQDETIJWKXCTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAJJXHRQPLATMK-UHFFFAOYSA-N 4,5-dichloro-1h-imidazole Chemical compound ClC=1N=CNC=1Cl QAJJXHRQPLATMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- TXLINXBIWJYFNR-UHFFFAOYSA-N 4-phenylpyridine-2-carbonitrile Chemical compound C1=NC(C#N)=CC(C=2C=CC=CC=2)=C1 TXLINXBIWJYFNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KKJFZIQEWZVVIV-UHFFFAOYSA-N 5-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]-2h-tetrazole Chemical compound FC(F)(F)C1=CC(C(F)(F)F)=CC(C2=NNN=N2)=C1 KKJFZIQEWZVVIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YWZHEXZIISFIDA-UHFFFAOYSA-N 5-amino-1,2,4-dithiazole-3-thione Chemical compound NC1=NC(=S)SS1 YWZHEXZIISFIDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GXGKKIPUFAHZIZ-UHFFFAOYSA-N 5-benzylsulfanyl-2h-tetrazole Chemical compound C=1C=CC=CC=1CSC=1N=NNN=1 GXGKKIPUFAHZIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical group BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GONFBOIJNUKKST-UHFFFAOYSA-N 5-ethylsulfanyl-2h-tetrazole Chemical compound CCSC=1N=NNN=1 GONFBOIJNUKKST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KSNXJLQDQOIRIP-UHFFFAOYSA-N 5-iodouracil Chemical group IC1=CNC(=O)NC1=O KSNXJLQDQOIRIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical group FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 125000004663 dialkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- WNAHIZMDSQCWRP-UHFFFAOYSA-N dodecane-1-thiol Chemical compound CCCCCCCCCCCCS WNAHIZMDSQCWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229920000840 ethylene tetrafluoroethylene copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000000752 ionisation method Methods 0.000 description 1
- 238000004460 liquid liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- LULAYUGMBFYYEX-UHFFFAOYSA-N metachloroperbenzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=CC(Cl)=C1 LULAYUGMBFYYEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- IRGSDUKBHFNZBP-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethyl-n'-(5-sulfanylidene-1,2,4-dithiazolidin-3-yl)methanimidamide Chemical compound CN(C)C=NC1NC(=S)SS1 IRGSDUKBHFNZBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920009441 perflouroethylene propylene Polymers 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-M periodate Chemical compound [O-]I(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N propylamine Chemical group CCCN WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- YWVYZMVYXAVAKS-UHFFFAOYSA-N pyridin-1-ium;trifluoromethanesulfonate Chemical compound C1=CC=[NH+]C=C1.[O-]S(=O)(=O)C(F)(F)F YWVYZMVYXAVAKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 150000003333 secondary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000012799 strong cation exchange Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 238000005987 sulfurization reaction Methods 0.000 description 1
- GFYHSKONPJXCDE-UHFFFAOYSA-N sym-collidine Natural products CC1=CN=C(C)C(C)=C1 GFYHSKONPJXCDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- KJIOQYGWTQBHNH-UHFFFAOYSA-N undecanol Chemical compound CCCCCCCCCCCO KJIOQYGWTQBHNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940054967 vanquish Drugs 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
Definitions
- the present invention relates to a method for producing a nucleic acid, a method for removing impurities, and a nucleic acid with few impurities.
- nucleic acid drugs have a unique mechanism of action that is not found in other drug discovery seeds, such as the ability to act specifically by forming base pairs with target mRNA, so future development is currently very important. It is a promising drug discovery seed.
- Patent Document 1 relates to a method for deprotecting oligonucleotides, and introduces methods such as contacting an oligonucleotide synthesized on a solid phase with an organic amine or the like to cleave a protecting group without removing the oligonucleotide from the solid phase. be done.
- Impurities are similarly strictly controlled in the production of drug substances, and the creation of a technology that removes impurities generated during the production of nucleic acids that serve as drug substances is even more desired.
- Patent Document 2 discloses that a mixed mode matrix containing a strong anion exchange ligand, a strong cation exchange ligand, and a hydrophobic ligand is used to remove uncomplexed oligonucleotides and impurities including failed sequences. Purification (Claim 1, [0006], etc.) is described.
- Patent Document 4 describes the purification of oligonucleotides using two-phase mobile phase-stationary phase liquid-liquid chromatography to remove other oligonucleotides such as shortmers and longmers (Claim 1, [0003]). is listed.
- Patent Document 5 describes purification of oligonucleotides (Claim 1, [0012], etc.) in which impurities such as short oligonucleotides are removed using a titratable anion exchange composition.
- Patent Document 6 describes purification of oligonucleotides (claim 1 etc.) in which impurities are removed using a porous carrier. The control and removal of non-oligonucleotide product-related impurities (PRI) in the production of therapeutic oligonucleotides is described in Non-Patent Document 1.
- PRI non-oligonucleotide product-related impurities
- Patent No. 4705716 Special Publication No. 2022-539327 Special table 2019-518759 publication
- Special table 2014-525254 publication Special Publication No. 2005-520547 Japanese Patent Application Publication No. 7-227284
- nucleic acids by-products (B)
- Byproduct (B) is very similar in molecular weight and physical properties to nucleic acid (A), so it cannot be removed even using conventionally known purification methods such as Patent Documents 1 to 6 and Non-Patent Document 1. . Therefore, an object of the present invention is to provide a method for producing a nucleic acid in which the content of impurities is reduced by removing the by-product (B). Another object of the present invention is to provide a method for removing byproduct (B) and a nucleic acid with less byproduct (B).
- the present inventors discovered that after synthesizing a nucleic acid, the synthesized nucleic acid is treated with a nucleophile while the amino group of the base part is protected with an acyl protecting group, and then deprotection is performed. It has been found that the content of by-product (B) can be significantly reduced by this. Based on this knowledge, the present inventors have completed the present invention shown below.
- Step A of synthesizing a nucleic acid in which the amino group of the base portion is protected with an acyl protecting group Production of a nucleic acid, comprising Step B of contacting the nucleic acid obtained in Step A with a nucleophile under neutral or acidic pH conditions, and Step C of deprotecting the protecting group of the nucleic acid obtained in Step B.
- Method. [2] The manufacturing method according to [1], wherein the pH is about 3 to about 8. [3] The manufacturing method according to [1] or [2], wherein the nucleophile is water and/or alcohol. [4] The production method according to any one of [1] to [3], which comprises contacting with the nucleophile at about 5 to about 80°C for about 0.25 hours or more.
- [5] The purpose is to contact a nucleic acid whose base moiety has an amino group protected with an acyl protecting group with a nucleophile under neutral or acidic pH conditions, and then to deprotect the protecting group of the nucleic acid.
- [6] The removal method according to [5], wherein the pH is about 3 to about 8.
- a nucleic acid wherein the detected ion intensity ratio during mass spectrometry of a nucleic acid and a nucleic acid impurity having a mass 34 Daltons larger than the nucleic acid that may be contained in the nucleic acid is 0.50 or less with respect to 100 of the nucleic acid.
- the method for producing a nucleic acid of the present invention can reduce the content of by-product (B) that cannot be removed by conventional techniques, and produce a highly pure nucleic acid.
- the term "about” means a number within the range of ⁇ 10%, preferably within the range of ⁇ 5%, more preferably within the range of ⁇ 2% of the numerical value expressed in about. It means a value within a range, particularly preferably a value within ⁇ 1%.
- the nucleic acid production method of the present invention includes step A of synthesizing a nucleic acid in which the amino group of the base moiety is protected with an acyl protecting group, and the nucleic acid obtained in step A is subjected to pH conditions ranging from neutral to acidic.
- This is a method for producing a nucleic acid, comprising a step B of contacting the nucleic acid with a nucleophile, and a step C of deprotecting the protecting group of the nucleic acid obtained in step B.
- the nucleic acid in the present invention has a structure in which nucleosides are linked by a phosphodiester bond, a thiophosphate ester bond, or an amide phosphate ester bond, and is preferably an oligonucleotide.
- the length of the oligonucleotide is not particularly limited, but is, for example, 10 to 100 bases long, particularly preferably 12 to 60 bases long.
- the nucleic acid in the present invention is synthesized as a single strand, the sugar is ribose or deoxyribose, and the bases are adenine (A), thymine (T), uracil (U), guanine (G), and cytosine (C). It is selected from.
- the nucleic acid in the present invention preferably contains a purine base such as adenine.
- the unit of "base length" may be replaced with the unit of "mer” or the unit of "nucleotide”.
- Nucleic acids in the present invention include, for example, DNA or RNA.
- DNA unless otherwise specified, the sugar part is a deoxyribose ring, and the base part is selected from adenine, thymine, guanine, and cytosine.
- RNA unless otherwise specified, the sugar part is a ribose ring, and the base part is selected from adenine, uracil, guanine, and cytosine.
- the single-stranded RNA or DNA synthesized according to the present invention can be used as is as an antisense, CpG oligo, or aptamer, but it can be used by forming base pairs (annealing) between those with complementary base sequences.
- double-stranded RNA or DNA can also be produced and used as siRNA, miRNA, decoy, or HDO (hetero double-stranded nucleic acid).
- the nucleic acid in the present invention may have its base portion modified with a substituent, for example.
- substituents include a halogen group, an acyl group, an alkyl group, an arylalkyl group, an alkoxy group, a hydroxy group, an amino group, a monoalkylamino group, a dialkylamino group, a carboxy group, a cyano group, and a nitro group. can.
- modified base examples include 8-bromoadenyl group, 8-bromoguanyl group, 5-bromocytosyl group, 5-bromouracil group, 5-iodouracil group, 5-iodocytosyl group, 5-fluorouracil group, 5- Examples include methylcytosyl group (mC), 8-oxoguanyl group, and hypoxanthinel group.
- the nucleic acid in the present invention may be modified, for example, at the 2'-position or 5'-position or cross-linked at the sugar moiety.
- modification at the 2' position include 2'-F, 2'-O-methyl (2'-OMe), 2'-O-methoxyethyl (2'-MOE), and the like.
- modification at the 5' position include 5'-methyl (5'-Me), 5'-cyclopropylene (5'-CP), and the like.
- crosslinked modification examples include those in which a crosslinked structure is introduced between the 2' and 4' positions, such as 2',4'-BNA/LNA, 2',4'-BNACOC, 2', Examples include 4'-BNANC, ENA, AmNA, scpBNA, cEt, GuNA, and the like.
- Nucleic acids in the present invention can be modified by several nucleotides (eg, 1 to 3 nucleotides) or by all nucleotides.
- step A a nucleic acid in which the amino group of the base portion is protected with an acyl protecting group is synthesized.
- the base having an amino group include adenine, guanine, cytosine, and bases thereof modified with substituents.
- the acyl protecting group include benzoyl group, isobutyryl group, acetyl group, phenoxyacetyl group, isopropylphenoxyacetyl group, tert-butylphenoxyacetyl group, and preferably benzoyl group, acetyl group, or isobutyryl group. It will be done.
- the phosphodiester bond, thiophosphate bond, or amide phosphate bond in the nucleic acid may be protected with a protecting group.
- a protecting group for the phosphodiester bond, thiophosphate bond, or amide phosphate bond there may be mentioned protecting groups used in conventional methods, such as 2-cyanoethyl.
- the method for synthesizing the nucleic acid in step A is not limited, and examples include solid phase synthesis methods, liquid phase synthesis methods, and the like.
- a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method is preferred, and a solid phase synthesis method is particularly preferred.
- the details of the solid phase synthesis method will be explained below as an example.
- Solid phase synthesis method The solid-phase synthesis method in the present invention can be carried out according to conventional methods unless otherwise specified herein. Examples of the solid phase synthesis method include the H-phosphonate method, the phosphoester method, and the phosphoramidite method, and the phosphoramidite method is particularly preferred.
- step A the solid phase synthesis method using the phosphoramidite method can be carried out, for example, by sequentially performing the following steps (a) to (e).
- (b) Coupling step Using an activator, the phosphorus atom bonded to the 3'-position hydroxyl group of the nucleoside phosphoramidite is condensed with the 5'-position hydroxyl group of the nucleoside supported on the solid phase.
- Step (d) Capping step: A protective group is bonded to the 5'-position hydroxyl group of the nucleoside supported on the solid phase, which was unreacted in step (b), using a capping agent. The capping step is to prevent unreacted substances from step (b) from participating in the subsequent reactions of steps (a) to (d).
- Steps (a) to (e) are illustrated below using structural formulas.
- the structural formula below is an example of a deoxyribose ring (a hydrogen atom is bonded to the 2' position), but a ribose ring (a hydroxyl group to the 2' position) or a modified version thereof (for example, the 2' position is O-methoxyethylated ( The same applies when using 2'-MOE), O-methylated (2'-OMe) or fluorinated (2'-F).
- DMTr represents a 4,4'-dimethoxytrityl group.
- Base PG independently represents adenine, thymine, uracil, guanine, cytosine, or a modified version thereof, and the amino group of the base portion is protected with an acyl protecting group.
- the ⁇ portion represents a solid support bound to a linker.
- the solid phase carrier in solid phase synthesis include glass beads, resin beads, and silica gel, and preferably glass beads or resin beads.
- the linker include 3-aminopropyl, succinyl, 2,2'-diethanolsulfonyl, long chain alkylamino (LCAA), and the like.
- a 4-methoxytrityl group can also be used as a protecting group for the hydroxyl group at the 5' position of a nucleoside, nucleotide chain, nucleoside phosphoramidite, etc. supported on a solid phase. .
- step (b) examples include 1H-tetrazole, 5-ethylthiotetrazole, 4,5-dichloroimidazole, 4,5-dicyanoimidazole, benzotriazole triflate, imidazole triflate, pyridinium triflate, N,N -diisopropylethylamine, 2,4,6-collidine/N-methylimidazole, 5-(benzylthio)-1H-tetrazole, 5-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]tetrazole, and the like.
- X represents an oxygen atom or a sulfur atom.
- oxidizing agent in step (c) for example, metachloroperbenzoic acid, metaperiodate, hydrogen peroxide, iodine, (1S)-(+)-(10-camphorsulfonyl)oxaziridine, etc.
- sulfurizing agent for example, 3-[(N,N-dimethylaminomethylidene)amino]-3H-1,2,4-dithiazol-5-thione (DDTT), 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1- Dioxide (Beaucage reagent), 3H-1,2-benzodithiol-3-one, biphenylacetyl disulfide (PADS), tetraethylthiuram disulfide (TETD), 3-amino-1,2,4-
- step (d) examples include acetic anhydride, phenoxyacetic anhydride, and the like.
- Examples of the reaction solvent in step (d) include acetonitrile, pyridine, 2,6-lutidine, tetrahydrofuran, and a mixture thereof in any combination.
- Base PG , ⁇ , and X have the same meanings as above.
- R represents a 4,4'-dimethoxytrityl group or a hydrogen atom.
- n represents an integer of 0 or more.
- Examples of the cyanoethyl group removing agent in step (e) include triethylamine, diethylamine, and 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene.
- the cyanoethyl group removing agent can also be used after being diluted with, for example, acetonitrile, toluene, or the like.
- step B the nucleic acid obtained in step A is contacted with a nucleophile under neutral or acidic pH conditions.
- step B it is possible to reduce the content of by-products (B) that cannot be removed by conventional techniques, and to produce highly pure nucleic acids.
- nucleophile examples include, but are not limited to, water, alcohol, thiol, amine, halide ion, cyanide ion, and the like. Specifically, water, methanol, ethanol, n-propyl alcohol, isopropyl alcohol, butanol, pentanol, hexanol, heptanol, octanol, nonanol, decanol, undecanol, dodecanol, ethylene glycol, glycerol, phenol, methanethiol, ethanethiol.
- dodecanethiol dithiothreitol, methylamine, dimethylamine, ethylamine, diethylamine, ethylenediamine, aniline, pyrrolidine, piperidine, piperazine, morpholine and the like.
- a nucleophile that is a liquid may be used as a solvent.
- Step B is performed under neutral (e.g. pH 6-8) or acidic (e.g. pH 6 or below) pH conditions, preferably at a pH of about 3-8, more preferably at a pH of about 4-7. carried out under conditions.
- the amount of contact between the nucleophile and the compound in step B is not particularly limited, but from the viewpoint of production efficiency, it is preferably 1 mL to 1000 mL, more preferably 5 mL to 100 mL, particularly preferably 10 mL to 50 mL, per 1 mmol of nucleic acid. be. The longer the contact time between the nucleophile and the compound, the more effective the present invention tends to be.
- the time is 0.25 hours or more, preferably 0.5 hours or more, and more preferably 1 hour or more. More preferably, the time is 2 hours or more, and from the viewpoint of production efficiency, it is desirable that the time is within 24 hours.
- the temperature during the contact between the nucleophile and the compound in step B is not particularly limited, but is, for example, in the range of 5°C to 80°C, more preferably 10°C to 50°C, and is suitable for ease of operation. In view of this, the temperature is particularly preferably 15°C to 30°C.
- the material of the liquid contact surface of the container used when contacting with the nucleophile is not particularly limited, but includes, for example, SUS316, SUS316L, SUS304, glass, acrylic resin, polyethylene, polypropylene, polystyrene, PET, PTFE, PFA, ETFE, FEP and the like are preferably selected from glass, acrylic resin, polyethylene, polypropylene, polystyrene, PET, PTFE, and PFA, and more preferably selected from glass, acrylic resin, polyethylene, polypropylene, PTFE, and PFA.
- step B By carrying out the operation of contacting with a nucleophile in a non-metallic container, even if the target oligonucleotide has a thiophosphate, cleavage and deprotection due to elution of metal ions from the reaction container can be avoided. It is possible to suppress the generation of desulfurized impurities (thiophosphate bonds of the target oligonucleotide changed to phosphodiester bonds) during the process.
- Contact with the nucleophile in step B can be carried out in the reaction column used for synthesis, or in a separate container to which it is transferred after being removed from the reaction column.
- step C the protecting group of the nucleic acid obtained in step B is deprotected.
- step C deprotecting the protecting group
- step C can be simultaneously a step of cutting out the nucleic acid from the solid phase support.
- step (f) can be performed as step C.
- Excision/deprotection step The nucleic acid of the desired chain length produced in steps (e) and B is excised from the solid phase support using an excision/deprotection agent, and its base portion and 2' Protecting groups such as hydroxyl groups at positions are removed.
- Base PG , ⁇ , and X have the same meanings as above.
- Base independently indicates adenine, thymine, uracil, guanine, cytosine, or modified versions thereof from which protective groups have been removed.
- R represents a 4,4'-dimethoxytrityl group or a hydrogen atom.
- n represents an integer of 0 or more.
- the cutting/deprotecting agent examples include basic substances such as concentrated aqueous ammonia, methylamine, and sodium hydroxide.
- the ammonia concentration of the concentrated ammonia water is preferably 20 to 30% by weight, more preferably 25 to 30% by weight.
- the amount of the cutting/deprotecting agent used is preferably 10 mL to 1000 mL per 1 mmol of nucleic acid supported on the solid phase carrier, and more preferably 50 mL to 500 mL per 1 mmol of nucleic acid.
- the cutting/deprotecting agent can be diluted with water, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, 1-propyl alcohol, 1-butanol, 2-butanol, acetonitrile, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, dimethyl sulfoxide, etc. It can also be used, preferably diluted with water, ethanol or isopropyl alcohol.
- the reaction solution in the cutting/deprotection step is preferably basic, and more preferably has a pH of 10 to 14.
- the reaction temperature in step (f) is, for example, in the range of 5 to 75°C, preferably in the range of 15 to 60°C.
- the reaction time of step (f) is, for example, 48 hours or less, and preferably 24 hours or less.
- the cleavage/deprotection agent cleaves the nucleic acid from the solid support and further removes the protecting group bound to the nucleic acid.
- Steps (a) to (f) of the solid phase synthesis method described above can be carried out using a commercially available automatic nucleic acid synthesizer or the like. Further, according to the above steps, a nucleic acid is produced such that the nucleotide chain extends from the 3'-position carbon atom to the 5'-position carbon atom.
- the produced nucleic acids are purified by commonly used separation and purification means such as reversed phase chromatography, reversed phase ion pair chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, gel filtration chromatography, etc. can be purified. Furthermore, it is possible to remove salts, which are impurities contained in the solution, by ultrafiltration or the like, and it is possible to powderize the oligonucleic acid solution by freeze-drying.
- the nucleic acid production method of the present invention can reduce the content of byproduct (B) that cannot be removed by conventional techniques, and produce highly pure nucleic acids.
- the detected ion intensity ratio during mass spectrometry of a nucleic acid impurity (byproduct (B)) whose mass is 34 Daltons larger than that of the target nucleic acid (A) is 0 to 100 of the nucleic acid (A). .50 or less, preferably 0.10 or less.
- the inventors of the present application presume that by-product (B) is generated during the synthetic operation, mainly during the step (a) above, when a mutation occurs on the adenine base contained in the sequence to make it more polar. ing.
- the byproduct (B) and the target nucleic acid (A) have similar physical properties such as molecular weight and polarity, making it difficult to remove them using separation and purification techniques commonly used for nucleic acid production such as anion exchange chromatography. Therefore, it is desirable to reduce the content of the by-product (B) in Step B and Step C before the separation and purification step.
- the quality of the produced nucleic acids can be analyzed using commonly used nucleic acid analysis methods, such as reversed phase chromatography, reversed phase ion pair chromatography, ion exchange chromatography, etc. as separation means, and UV detectors and mass spectrometers as detectors. This can be done with a combination of etc.
- the amount of byproducts (impurities) in a nucleic acid can be calculated from the area ratio of detected peaks when using a UV detector, or from the detected ion intensity ratio when using a mass spectrometer.
- the mass of the molecule (neutral species) or the m/z of the monovalent ion is calculated by deconvoluting the group of multiply charged ions of the detected nucleic acid.
- a method of converting the obtained relative mass into a dimensionless quantity (obtained by dividing the number of charges of the ion) before calculation, a method of calculating by extracting the signal intensity of a specific multiply charged ion, etc. can be used.
- the method for removing impurities of the present invention involves contacting a nucleic acid whose base amino group is protected with an acyl protecting group with a nucleophile under neutral to acidic pH conditions, and then contacting the nucleic acid with a nucleophile under neutral to acidic pH conditions.
- This is a method of removing a nucleic acid impurity (byproduct (B)) whose mass is 34 Daltons larger than that of the nucleic acid from a target nucleic acid by deprotecting a protecting group.
- the impurity removal method of the present invention can be carried out by performing the above steps B and C.
- nucleic acid with few impurities The nucleic acid with few impurities of the present invention has a detected ion intensity ratio during mass spectrometry of a nucleic acid and a nucleic acid impurity having a mass 34 Daltons larger than the nucleic acid that can be contained in the nucleic acid, with respect to the nucleic acid 100. It is a nucleic acid with a value of 0.50 or less.
- the nucleic acid containing few impurities of the present invention can be produced using the above-described method for producing a nucleic acid of the present invention.
- the sugar moiety is a deoxyribose ring
- the base moiety is selected from adenine, thymine, guanine, and cytosine.
- LNA (2',4'-BNA) in the examples has a structure in which the sugar moiety is cross-linked (-CH 2 -) between the oxygen atom at the 2'-position and the carbon atom at the 4'-position of the ribose ring.
- the base portion is selected from adenine, thymine, guanine, and 5-methylcytosine.
- a benzoyl group is used as a protecting group for the amino group at the 6-position of adenine
- an isobutyryl group is used as a protecting group for the amino group at the 2-position of guanine
- a benzoyl group is used as a protecting group for the amino group at the 4-position of cytosine and 5-methylcytosine. base was used.
- the solid phase carrier to which the objective oligonucleotide was bound was immersed in a glass test tube in 20 mL of any of the nucleophiles listed in Table 1 per 1 mmol of solid phase carrier supported amount at 20° C. for 3 hours and shaken. Thereafter, the solid phase support was immersed in a 28% by weight ammonia aqueous solution/ethanol (4:1) mixed solution at 60°C for 8 hours to cleave the target oligonucleotide from the solid phase support and deprotect the protecting group. went.
- the mixed solution was diluted with a water/ethanol (4:1) mixed solution to obtain a crude solution of the target oligonucleotide (Examples 1 to 5).
- the above-mentioned solid phase carrier, linker, and target oligonucleotide are shown below.
- Solid phase support, linker Primer Support (registered trademark) 5G Unilinker 350 (Cytiva) Target oligonucleotide (FLP): 5'-T(L) ⁇ G(L) ⁇ C ⁇ T ⁇ A ⁇ G ⁇ C ⁇ A ⁇ G ⁇ A ⁇ T ⁇ G ⁇ C ⁇ T ⁇ A(L) ⁇ mC (L)-3' (SEQ ID NO: 1: 16mer, ⁇ indicates a phosphothioate bond. Also, each nucleoside unit with (L) next to the base is the same as LNA (2',4'-BNA). (The other nucleoside units are the same structural units as DNA. mC indicates that the base is methylcytosine.)
- a crude solution of the target oligonucleotide was obtained by carrying out the same operation under the same conditions as in Production Example 1, except that the solid phase support to which nucleotides were bound was changed to a mixed solution of 28% ammonia aqueous solution/ethanol (4:1). (Comparative Example 1).
- the solid phase support bound to the target oligonucleotide was immersed in a 28 wt% ammonia aqueous solution/ethanol (4:1) mixed solution at 60°C for 19 hours in a glass test tube to remove the target oligonucleotide from the solid phase support.
- the target oligonucleotide was excised and the protecting group was deprotected.
- Solid phase support, linker, and target oligonucleotide are shown below.
- Preparative purification conditions Ion exchange resin; BioPro IEX SmartSep Q20 (YMC), column volume: 7 mL, column temperature: room temperature, mobile phase A: 10 mM aqueous sodium hydroxide/methanol (85:15) mixed solution, mobile phase B: 10mM sodium hydroxide/2M sodium chloride aqueous solution/methanol (85:15) mixed solution
- the by-product (B) in this specification has a common point that the mass is increased by 34 daltons compared to the target oligonucleotide, but it is a different substance depending on the type of target oligonucleotide.
- the amount of by-product (B)/amount of FLP (%) listed in Tables 1 to 4 above is the amount of by-product (B) when FLP (Full Length Product: target oligonucleotide) is taken as 100 (%). It is a percentage (%).
- Example 1 those that were contacted with the specific nucleophile (water, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, n-butanol) according to the present invention (Examples 1 to 5) were contacted with the nucleophile. It was shown that the content of the by-product (B) was significantly lower than that of the sample that was not treated (Comparative Example 1). At this time, in the case of Example 2 in which methanol was used as the nucleophile, the alkoxy byproduct in which the adenine base of the target oligonucleotide was substituted with a methoxy group was 3.20% (ratio when the target oligonucleotide was taken as 100%). ) was confirmed to occur. It is believed that the alkoxy by-product can be separated from the target oligonucleotide by reverse phase chromatography.
- the present invention contributes to the production of high quality nucleic acid medicines with low impurity content.
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本発明は、塩基部のアミノ基がアシル系保護基で保護された核酸を合成する工程Ａ、工程Ａで得られた核酸を、中性又は酸性のｐＨ条件下で求核剤と接触させる工程Ｂ、及び工程Ｂで得られた核酸の保護基を脱保護する工程Ｃを含む、核酸の製造方法等である。本発明によって、従来技術では除去できない副生成物（Ｂ）の含有量を低減させて、純度の高い核酸を製造することができる。
Description
本発明は、核酸の製造方法、不純物の除去方法及び不純物が少ない核酸に関する。
従来、上市される医薬品の薬理活性成分は専ら低分子化合物であったが、最近においてはペプチドや核酸といった中分子の薬理活性成分を含む医薬品も多く上市されるようになってきている。特に核酸医薬は、標的のｍＲＮＡに対して塩基対を形成することによって特異的に作用できる等の他の創薬シーズには見られない特徴的な作用機構を有することから今後の開発が現在非常に期待されている創薬シーズである。
核酸医薬の原料となる核酸は化学合成によって製造することが一般的に行われている。核酸の当該製造方法を紹介する文献として例えば下記の特許文献１が挙げられる。
特許文献１はオリゴヌクレオチドの脱保護法に関するものであり、固相合成したオリゴヌクレオチドと有機アミン等を接触させて、固相からオリゴヌクレオチドを脱離させずに保護基を切断することなどが紹介される。
特許文献１はオリゴヌクレオチドの脱保護法に関するものであり、固相合成したオリゴヌクレオチドと有機アミン等を接触させて、固相からオリゴヌクレオチドを脱離させずに保護基を切断することなどが紹介される。
医薬品は、その安全性を確保する観点から不純物の種類や量は各種規制の下で厳しく品質管理されている。原薬製造においても同様に不純物の管理は厳しくされるものであり、原薬となる核酸の製造において発生する不純物を除去させる技術の創出についてはなお一層望まれるものである。
不純物を除去させて核酸を精製する方法として、逆相カートリッジ（ＲＰＣ）、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ ＨＰＬＣ）、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）等が知られている。
また、特許文献２には、強陰イオン交換リガンド、強陽イオン交換リガンド及び疎水性リガンドを含む混合モードマトリックスを用いて、非複合化オリゴヌクレオチド及び失敗配列を含む不純物を除去する、オリゴヌクレオチドの精製（請求項１，［０００６］等）が記載されている。
また、特許文献２には、強陰イオン交換リガンド、強陽イオン交換リガンド及び疎水性リガンドを含む混合モードマトリックスを用いて、非複合化オリゴヌクレオチド及び失敗配列を含む不純物を除去する、オリゴヌクレオチドの精製（請求項１，［０００６］等）が記載されている。
特許文献３には、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて、ｎ－１不純物、Ｐ＝Ｏ不純物、脱塩基不純物、ＣＮＥｔ不純物、Ｎ＋１不純物等の生成物関連不純物を除去する、オリゴヌクレオチドの精製（請求項１，［０００６］等）が記載されている。
特許文献４には、二相系移動相－固定相液－液クロマトグラフィーを用いて、ショートマー、ロングマー等の他のオリゴヌクレオチドを除去する、オリゴヌクレオチドの精製（請求項１，［０００３］）が記載されている。
特許文献４には、二相系移動相－固定相液－液クロマトグラフィーを用いて、ショートマー、ロングマー等の他のオリゴヌクレオチドを除去する、オリゴヌクレオチドの精製（請求項１，［０００３］）が記載されている。
特許文献５には、滴定可能なアニオン交換組成物を用いて、短いオリゴヌクレオチド等の不純物を除去する、オリゴヌクレオチドの精製（請求項１，［００１２］等）が記載されている。
特許文献６には、多孔性の担体を用いて、不純物を除去する、オリゴヌクレオチドの精製（請求項１等）が記載されている。
非特許文献１には、治療用オリゴヌクレオチドの製造における、非オリゴヌクレオチド生成物関連不純物（ＰＲＩ）の制御及び除去が記載されている。
特許文献６には、多孔性の担体を用いて、不純物を除去する、オリゴヌクレオチドの精製（請求項１等）が記載されている。
非特許文献１には、治療用オリゴヌクレオチドの製造における、非オリゴヌクレオチド生成物関連不純物（ＰＲＩ）の制御及び除去が記載されている。
Org. Process Res. Dev., 2022, 26, 1130-1144
本願発明者らは、核酸の製造において、目的の核酸（Ａ）より質量が３４ダルトン大きい核酸（副生成物（Ｂ））が不純物として核酸（Ａ）に含まれるとの問題があることを見出した。副生成物（Ｂ）は、核酸（Ａ）に分子量及び物性が非常に近いために、特許文献１～６及び非特許文献１等の従来公知の精製方法を用いても、除去することはできない。
そこで、本発明の課題は、副生成物（Ｂ）を除去して、不純物の含有量を低減させる、核酸の製造方法を提供することにある。また、副生成物（Ｂ）を除去する方法、及び副生成物（Ｂ）が少ない核酸を提供することにある。
そこで、本発明の課題は、副生成物（Ｂ）を除去して、不純物の含有量を低減させる、核酸の製造方法を提供することにある。また、副生成物（Ｂ）を除去する方法、及び副生成物（Ｂ）が少ない核酸を提供することにある。
本発明者は、鋭意検討した結果、核酸の合成後、塩基部のアミノ基がアシル系保護基で保護された状態で、合成された核酸を求核剤で処理し、続いて脱保護を行うことによって副生成物（Ｂ）の含有量が優位に低減されることを見出した。本発明者はその知見に基づいて、以下に示す本発明を完成するに至った。
［１］ 塩基部のアミノ基がアシル系保護基で保護された核酸を合成する工程Ａ、
工程Ａで得られた核酸を、中性又は酸性のｐＨ条件下で求核剤と接触させる工程Ｂ、及び
工程Ｂで得られた核酸の保護基を脱保護する工程Ｃを含む、核酸の製造方法。
［２］ 前記ｐＨが約３～約８である、［１］に記載の製造方法。
［３］ 前記求核剤が水及び／又はアルコールである、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］ 約５～約８０℃で約０．２５時間以上、前記求核剤と接触させる、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
工程Ａで得られた核酸を、中性又は酸性のｐＨ条件下で求核剤と接触させる工程Ｂ、及び
工程Ｂで得られた核酸の保護基を脱保護する工程Ｃを含む、核酸の製造方法。
［２］ 前記ｐＨが約３～約８である、［１］に記載の製造方法。
［３］ 前記求核剤が水及び／又はアルコールである、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］ 約５～約８０℃で約０．２５時間以上、前記求核剤と接触させる、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］ 塩基部のアミノ基がアシル系保護基で保護された核酸を、中性又は酸性のｐＨ条件下で求核剤と接触させ、続いて核酸の保護基を脱保護することによる、目的の核酸から、前記核酸より３４ダルトン大きい核酸不純物を除去する方法。
［６］ 前記ｐＨが約３～約８である、［５］に記載の除去方法。
［７］ 前記求核剤が水及び／又はアルコールである、［５］又は［６］に記載の除去方法。
［８］ 約５～約８０℃で約０．２５時間以上、前記求核剤と接触させる、［５］～［７］のいずれかに記載の除去方法。
［９］ 核酸と、前記核酸に含まれ得る前記核酸よりも質量が３４ダルトン大きい核酸不純物の質量分析時の検出イオン強度比が、前記核酸１００に対して０．５０以下である、核酸。
［６］ 前記ｐＨが約３～約８である、［５］に記載の除去方法。
［７］ 前記求核剤が水及び／又はアルコールである、［５］又は［６］に記載の除去方法。
［８］ 約５～約８０℃で約０．２５時間以上、前記求核剤と接触させる、［５］～［７］のいずれかに記載の除去方法。
［９］ 核酸と、前記核酸に含まれ得る前記核酸よりも質量が３４ダルトン大きい核酸不純物の質量分析時の検出イオン強度比が、前記核酸１００に対して０．５０以下である、核酸。
本発明の核酸の製造方法は、従来技術では除去できない副生成物（Ｂ）の含有量を低減させて、純度の高い核酸を製造することができる。
以下で本発明の核酸の製造方法に係る諸事項を詳細に説明する。但し、以下の記載は本発明を説明するための例示であり、本発明をこの記載範囲にのみ特別限定する趣旨ではない。
本明細書及び特許請求の範囲で用いられる用語「約」は、約で示される数値の±１０％の範囲内の数値、好ましくは±５％の範囲内の数値、より好ましくは±２％の範囲内の数値、特に好ましくは±１％の範囲内の数値を意味する。
本明細書及び特許請求の範囲で用いられる用語「約」は、約で示される数値の±１０％の範囲内の数値、好ましくは±５％の範囲内の数値、より好ましくは±２％の範囲内の数値、特に好ましくは±１％の範囲内の数値を意味する。
１．核酸の製造方法
本発明の核酸の製造方法は、塩基部のアミノ基がアシル系保護基で保護された核酸を合成する工程Ａ、工程Ａで得られた核酸を、中性から酸性のｐＨ条件下で求核剤と接触させる工程Ｂ、及び工程Ｂで得られた核酸の保護基を脱保護する工程Ｃを含む、核酸の製造方法である。
本発明の核酸の製造方法は、塩基部のアミノ基がアシル系保護基で保護された核酸を合成する工程Ａ、工程Ａで得られた核酸を、中性から酸性のｐＨ条件下で求核剤と接触させる工程Ｂ、及び工程Ｂで得られた核酸の保護基を脱保護する工程Ｃを含む、核酸の製造方法である。
（核酸）
本発明における核酸は、ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合、チオリン酸エステル結合又はアミドリン酸エステル結合により連結した構造を有するものであり、オリゴヌクレオチドであることが好ましい。オリゴヌクレオチドの長さは、特に限定されないが、例えば１０～１００塩基長、特に好ましくは１２～６０塩基長である。
本発明における核酸は、合成されるものが１本鎖であり、糖がリボース又はデオキシリボース、塩基がアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）から選ばれるものである。本発明における核酸はアデニン等のプリン塩基を含むことが望ましい。本明細書において“塩基長”の単位は“ｍｅｒ”の単位又は“ヌクレオチド”の単位に置換しても良い。
本発明における核酸は、ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合、チオリン酸エステル結合又はアミドリン酸エステル結合により連結した構造を有するものであり、オリゴヌクレオチドであることが好ましい。オリゴヌクレオチドの長さは、特に限定されないが、例えば１０～１００塩基長、特に好ましくは１２～６０塩基長である。
本発明における核酸は、合成されるものが１本鎖であり、糖がリボース又はデオキシリボース、塩基がアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）から選ばれるものである。本発明における核酸はアデニン等のプリン塩基を含むことが望ましい。本明細書において“塩基長”の単位は“ｍｅｒ”の単位又は“ヌクレオチド”の単位に置換しても良い。
本発明における核酸として、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡが挙げられる。
ＤＮＡは、特記されない限り、糖部はデオキシリボース環であり、塩基部はアデニン、チミン、グアニン、シトシンから選ばれるものである。ＲＮＡは、特記されない限り、糖部はリボース環であり、塩基部はアデニン、ウラシル、グアニン、シトシンから選ばれる。
本発明により合成された１本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡは、そのままアンチセンス、ＣｐＧオリゴ又はアプタマーとして用いることもできるが、相補的な塩基配列を持つもの同士で塩基対を形成（アニーリング）させることで、２本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡを製造して、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、デコイ、ＨＤＯ（ヘテロ２本鎖核酸）として用いることもできる。
ＤＮＡは、特記されない限り、糖部はデオキシリボース環であり、塩基部はアデニン、チミン、グアニン、シトシンから選ばれるものである。ＲＮＡは、特記されない限り、糖部はリボース環であり、塩基部はアデニン、ウラシル、グアニン、シトシンから選ばれる。
本発明により合成された１本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡは、そのままアンチセンス、ＣｐＧオリゴ又はアプタマーとして用いることもできるが、相補的な塩基配列を持つもの同士で塩基対を形成（アニーリング）させることで、２本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡを製造して、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、デコイ、ＨＤＯ（ヘテロ２本鎖核酸）として用いることもできる。
（核酸の修飾）
本発明における核酸は、例えばその塩基部が置換基によって修飾されたものであっても良い。置換基として、例えば、ハロゲン基、アシル基、アルキル基、アリールアルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシ基、シアノ基、ニトロ基等を挙げることができる。当該修飾された塩基として、例えば、８－ブロモアデニル基、８－ブロモグアニル基、５－ブロモシトシル基、５－ブロモウラシル基、５－ヨードウラシル基、５－ヨードシトシル基、５－フルオロウラシル基、５－メチルシトシル基（ｍＣ）、８－オキソグアニル基、ヒポキサンチニル基等が挙げられる。
本発明における核酸は、例えばその塩基部が置換基によって修飾されたものであっても良い。置換基として、例えば、ハロゲン基、アシル基、アルキル基、アリールアルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシ基、シアノ基、ニトロ基等を挙げることができる。当該修飾された塩基として、例えば、８－ブロモアデニル基、８－ブロモグアニル基、５－ブロモシトシル基、５－ブロモウラシル基、５－ヨードウラシル基、５－ヨードシトシル基、５－フルオロウラシル基、５－メチルシトシル基（ｍＣ）、８－オキソグアニル基、ヒポキサンチニル基等が挙げられる。
本発明における核酸は、例えばその糖部につき２’位、５’位の修飾や架橋型修飾がされたものであってもよい。２’位の修飾の具体例として、例えば、２’－Ｆ、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）等が挙げられる。５’位の修飾の具体例として、例えば、５’－メチル（５’－Ｍｅ）、５’－シクロプロピレン（５’－ＣＰ）等が挙げられる。当該架橋型修飾の具体例として、２’位と４’位間に架橋構造を導入したものがあり、例えば、２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡ、２’，４’－ＢＮＡＣＯＣ、２’，４’－ＢＮＡＮＣ、ＥＮＡ、ＡｍＮＡ、ｓｃｐＢＮＡ、ｃＥｔ、ＧｕＮＡ等が挙げられる。
本発明における核酸は、数ヌクレオチド単位（例えば１～３ヌクレオチド）又は全ヌクレオチド単位で修飾することが可能である。
本発明における核酸は、数ヌクレオチド単位（例えば１～３ヌクレオチド）又は全ヌクレオチド単位で修飾することが可能である。
（核酸の合成方法）
（１）工程Ａ
工程Ａで、塩基部のアミノ基がアシル系保護基で保護された核酸を合成する。
アミノ基を有する塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、又はそれらが置換基で修飾された塩基が挙げられる。アシル系保護基としては、例えばベンゾイル基、イソブチリル基、アセチル基、フェノキシアセチル基、イソプロピルフェノキシアセチル基、ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基等が挙げられ、好ましくはベンゾイル基、アセチル基又はイソブチリル基等が挙げられる。
更に、工程Ａにおいて、核酸におけるリン酸ジエステル結合、チオリン酸エステル結合又はアミドリン酸エステル結合は、保護基で保護されていてもよい。リン酸ジエステル結合、チオリン酸エステル結合又はアミドリン酸エステル結合の保護基としては、常法で用いられる保護基が挙げられ、例えば２－シアノエチルが挙げられる。
（１）工程Ａ
工程Ａで、塩基部のアミノ基がアシル系保護基で保護された核酸を合成する。
アミノ基を有する塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、又はそれらが置換基で修飾された塩基が挙げられる。アシル系保護基としては、例えばベンゾイル基、イソブチリル基、アセチル基、フェノキシアセチル基、イソプロピルフェノキシアセチル基、ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基等が挙げられ、好ましくはベンゾイル基、アセチル基又はイソブチリル基等が挙げられる。
更に、工程Ａにおいて、核酸におけるリン酸ジエステル結合、チオリン酸エステル結合又はアミドリン酸エステル結合は、保護基で保護されていてもよい。リン酸ジエステル結合、チオリン酸エステル結合又はアミドリン酸エステル結合の保護基としては、常法で用いられる保護基が挙げられ、例えば２－シアノエチルが挙げられる。
工程Ａの核酸を合成する方法としては、限定されるものではなく、固相合成方法、液相合成方法等が挙げられる。好ましくは固相合成方法又は液相合成方法であり、特に好ましくは固相合成方法である。以下に、一例として固相合成方法の詳細を説明する。
（固相合成方法）
本発明における固相合成方法は、本明細書において特記されない限り、常法に従って行うことができる。固相合成方法は、Ｈ－ホスホネート法、ホスホエステル法、ホスホロアミダイト法が挙げられ、特に好ましくはホスホロアミダイト法が挙げられる。
工程Ａにおいて、ホスホロアミダイト法による固相合成法は、例えば、以下の工程（ａ）～（ｅ）を順に行うことで実行できる。
（ａ）脱保護工程：固相にリンカーを介して担持されたヌクレオシドの５’位の水酸基の保護基を除去する。
（ｂ）カップリング工程：活性化剤を用いてヌクレオシドホスホロアミダイトの３’位水酸基に結合したリン原子と固相に担持されたヌクレオシドの５’位の水酸基間で縮合させる。
（ｃ）酸化／硫化工程：酸化剤又は硫化剤を用いてヌクレオシド間の亜リン酸エステル結合（保護基が結合したものも含む）をリン酸ジエステル結合（保護基が結合したものも含む）又はチオリン酸エステル結合（保護基が結合したものも含む）に変換する。
（ｄ）キャッピング工程：工程（ｂ）において未反応だった、固相に担持されたヌクレオシドの５’位の水酸基にキャップ化剤を用いて保護基を結合させる。キャッピング工程は工程（ｂ）の未反応物が次回以降の工程（ａ）～（ｄ）の反応に関与することを防ぐためのものである。
（ｅ）シアノエチル基除去工程：工程（ａ）～（ｄ）を所望の回数繰り返したのち、製造された所望の鎖長の核酸を固相から脱離させずに、ヌクレオシド間のリン酸ジエステル結合又はチオリン酸エステル結合から保護基を除去する。
本発明における固相合成方法は、本明細書において特記されない限り、常法に従って行うことができる。固相合成方法は、Ｈ－ホスホネート法、ホスホエステル法、ホスホロアミダイト法が挙げられ、特に好ましくはホスホロアミダイト法が挙げられる。
工程Ａにおいて、ホスホロアミダイト法による固相合成法は、例えば、以下の工程（ａ）～（ｅ）を順に行うことで実行できる。
（ａ）脱保護工程：固相にリンカーを介して担持されたヌクレオシドの５’位の水酸基の保護基を除去する。
（ｂ）カップリング工程：活性化剤を用いてヌクレオシドホスホロアミダイトの３’位水酸基に結合したリン原子と固相に担持されたヌクレオシドの５’位の水酸基間で縮合させる。
（ｃ）酸化／硫化工程：酸化剤又は硫化剤を用いてヌクレオシド間の亜リン酸エステル結合（保護基が結合したものも含む）をリン酸ジエステル結合（保護基が結合したものも含む）又はチオリン酸エステル結合（保護基が結合したものも含む）に変換する。
（ｄ）キャッピング工程：工程（ｂ）において未反応だった、固相に担持されたヌクレオシドの５’位の水酸基にキャップ化剤を用いて保護基を結合させる。キャッピング工程は工程（ｂ）の未反応物が次回以降の工程（ａ）～（ｄ）の反応に関与することを防ぐためのものである。
（ｅ）シアノエチル基除去工程：工程（ａ）～（ｄ）を所望の回数繰り返したのち、製造された所望の鎖長の核酸を固相から脱離させずに、ヌクレオシド間のリン酸ジエステル結合又はチオリン酸エステル結合から保護基を除去する。
工程（ａ）～（ｅ）につき、構造式を用いて以下に例示する。
なお、下記構造式はデオキシリボース環（２’位に水素原子が結合）の例だが、リボース環（２’位に水酸基）やそれを修飾したもの（例えば２’位がＯ－メトキシエチル化（２’－ＭＯＥ）、Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）又はフルオロ化（２’－Ｆ）されたもの）を用いた場合も同様である。
なお、下記構造式はデオキシリボース環（２’位に水素原子が結合）の例だが、リボース環（２’位に水酸基）やそれを修飾したもの（例えば２’位がＯ－メトキシエチル化（２’－ＭＯＥ）、Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）又はフルオロ化（２’－Ｆ）されたもの）を用いた場合も同様である。
工程（ａ）：
［式中、ＤＭＴｒは４，４’－ジメトキシトリチル基を表す。ＢａｓｅＰＧはアデニン、チミン、ウラシル、グアニン、シトシン又はそれらを修飾したものを独立して示しており、その塩基部のアミノ基はアシル系保護基で保護される。●部分は、リンカーと結合した固相担体を表す。］
固相合成における固相担体として、例えば、ガラスビーズ、樹脂ビーズ、シリカゲルを挙げることができ、好ましくはガラスビーズ又は樹脂ビーズである。
リンカーとしては、例えば、３－アミノプロピル、スクシニル、２，２’－ジエタノールスルホニル、ロングチェーンアルキルアミノ（ＬＣＡＡ）等を挙げることができる。
固相に担持されたヌクレオシド、ヌクレオチド鎖、ヌクレオシドホスホロアミダイト等の５’位の水酸基の保護基として、４，４’－ジメトキシトリチル基以外に例えば、４－メトキシトリチル基等を用いることもできる。
［式中、ＤＭＴｒは４，４’－ジメトキシトリチル基を表す。ＢａｓｅＰＧはアデニン、チミン、ウラシル、グアニン、シトシン又はそれらを修飾したものを独立して示しており、その塩基部のアミノ基はアシル系保護基で保護される。●部分は、リンカーと結合した固相担体を表す。］
固相合成における固相担体として、例えば、ガラスビーズ、樹脂ビーズ、シリカゲルを挙げることができ、好ましくはガラスビーズ又は樹脂ビーズである。
リンカーとしては、例えば、３－アミノプロピル、スクシニル、２，２’－ジエタノールスルホニル、ロングチェーンアルキルアミノ（ＬＣＡＡ）等を挙げることができる。
固相に担持されたヌクレオシド、ヌクレオチド鎖、ヌクレオシドホスホロアミダイト等の５’位の水酸基の保護基として、４，４’－ジメトキシトリチル基以外に例えば、４－メトキシトリチル基等を用いることもできる。
工程（ｂ）：
［式中、ＤＭＴｒ、ＢａｓｅＰＧ、●部分は、前記と同義である。］
工程（ｂ）で用いる活性化剤として、例えば、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオテトラゾール、４，５－ジクロロイミダゾール、４，５－ジシアノイミダゾール、ベンゾトリアゾールトリフラート、イミダゾールトリフラート、ピリジニウムトリフラート、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、２，４，６－コリジン／Ｎ－メチルイミダゾール、５－（ベンジルチオ）－１Ｈ－テトラゾール、５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］テトラゾール等を挙げることができる。
工程（ｂ）で用いる活性化剤として、例えば、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオテトラゾール、４，５－ジクロロイミダゾール、４，５－ジシアノイミダゾール、ベンゾトリアゾールトリフラート、イミダゾールトリフラート、ピリジニウムトリフラート、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、２，４，６－コリジン／Ｎ－メチルイミダゾール、５－（ベンジルチオ）－１Ｈ－テトラゾール、５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］テトラゾール等を挙げることができる。
工程（ｃ）：
［式中、ＤＭＴｒ、ＢａｓｅＰＧ、●部分は、前記と同義である。Ｘは酸素原子もしくは硫黄原子を表す。］
工程（ｃ）の酸化剤として、例えばメタクロロ過安息香酸、メタ過ヨウ素酸塩、過酸化水素、ヨウ素、（１Ｓ）－（＋）－（１０－カンファースルホニル）オキサジリジン等を、硫化剤として、例えば３－［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン、ビスフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＡＤＴＴ）等を挙げることができる。工程（ｃ）の反応溶媒として、例えばジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン、３－ピコリン、水、テトラヒドロフランまたはこれらを任意の組合せで混合した溶媒等が挙げられる。
工程（ｃ）の酸化剤として、例えばメタクロロ過安息香酸、メタ過ヨウ素酸塩、過酸化水素、ヨウ素、（１Ｓ）－（＋）－（１０－カンファースルホニル）オキサジリジン等を、硫化剤として、例えば３－［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン、ビスフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＡＤＴＴ）等を挙げることができる。工程（ｃ）の反応溶媒として、例えばジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン、３－ピコリン、水、テトラヒドロフランまたはこれらを任意の組合せで混合した溶媒等が挙げられる。
工程（ｄ）：
［式中、ＤＭＴｒ、ＢａｓｅＰＧ、●部分は、前記と同義である。］
工程（ｄ）のキャップ化剤として、例えば無水酢酸、フェノキシ酢酸無水物等を挙げることができる。工程（ｄ）の反応溶媒として、例えばアセトニトリル、ピリジン、２，６－ルチジン、テトラヒドロフランまたはこれらを任意の組合せで混合した溶媒等が挙げられる。
工程（ｄ）のキャップ化剤として、例えば無水酢酸、フェノキシ酢酸無水物等を挙げることができる。工程（ｄ）の反応溶媒として、例えばアセトニトリル、ピリジン、２，６－ルチジン、テトラヒドロフランまたはこれらを任意の組合せで混合した溶媒等が挙げられる。
工程（ｅ）：
［式中、ＢａｓｅＰＧ、●、Ｘは、前記と同義である。Ｒは４，４’－ジメトキシトリチル基又は水素原子を表す。ｎは０以上の整数を表す。］
工程（ｅ）のシアノエチル基除去剤として、例えば、トリエチルアミン、ジエチルアミン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等を挙げることができる。当該シアノエチル基除去剤は、例えば、アセトニトリル、トルエン等で希釈して使用することもできる。
工程（ｅ）のシアノエチル基除去剤として、例えば、トリエチルアミン、ジエチルアミン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等を挙げることができる。当該シアノエチル基除去剤は、例えば、アセトニトリル、トルエン等で希釈して使用することもできる。
（２）工程Ｂ
工程Ｂで、工程Ａで得られた核酸を、中性又は酸性のｐＨ条件下で求核剤と接触させる。工程Ｂによって、従来技術では除去できない副生成物（Ｂ）の含有量を低減させて、純度の高い核酸を製造することができる、
工程Ｂで、工程Ａで得られた核酸を、中性又は酸性のｐＨ条件下で求核剤と接触させる。工程Ｂによって、従来技術では除去できない副生成物（Ｂ）の含有量を低減させて、純度の高い核酸を製造することができる、
求核剤としては、特に限定されないが、水、アルコール、チオール、アミン、ハロゲン化物イオン、シアン化物イオン等が挙げられる。具体的には、水、メタノール、エタノール、ｎ－プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、エチレングリコール、グリセロール、フェノール、メタンチオール、エタンチオール、ドデカンチオール、ジチオスレイトール、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、アニリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン等が挙げられる。好ましくは水、アルコール、チオールから選ばれ、より好ましくは水及び／又はアルコールが挙げられ、更に好ましくは水、１級アルコール及び２級アルコールが挙げられ、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ－ブチルアルコールから選ばれ、入手および扱いの容易さなどから更により好ましくは水、メタノール、エタノールから選ばれ、最も好ましくは水である。液体である求核剤は、溶媒として用いてもよい。
工程Ｂは、中性（例えばｐＨ６～８）又は酸性（例えばｐＨ６以下）のｐＨ条件下で行われ、好ましくは約３～８のｐＨ条件下で行われ、より好ましくは約４～７のｐＨ条件下で行われる。
工程Ｂにおける求核剤と合成物の接触量は、特に限定されないが、生産効率の観点などから核酸１ｍｍｏｌに対して好ましくは１ｍＬ～１０００ｍＬ、より好ましくは５ｍＬ～１００ｍＬ、特に好ましくは１０ｍＬ～５０ｍＬである。求核剤と合成物の接触時間は、長いほど本発明の効果が高まる傾向にあり、例えば０．２５時間以上であり、好ましくは０．５時間以上であり、より好ましくは１時間以上であり、更に好ましくは２時間以上であって、生産効率の観点などから２４時間以内にあることが望ましい。
工程Ｂにおける求核剤と合成物の接触中の温度は、特に限定されないが、例えば５℃～８０℃の範囲内の温度であり、より好ましくは１０℃～５０℃であり、操作の容易さの観点などから特に好ましくは１５℃～３０℃である。
工程Ｂにおける求核剤と合成物の接触量は、特に限定されないが、生産効率の観点などから核酸１ｍｍｏｌに対して好ましくは１ｍＬ～１０００ｍＬ、より好ましくは５ｍＬ～１００ｍＬ、特に好ましくは１０ｍＬ～５０ｍＬである。求核剤と合成物の接触時間は、長いほど本発明の効果が高まる傾向にあり、例えば０．２５時間以上であり、好ましくは０．５時間以上であり、より好ましくは１時間以上であり、更に好ましくは２時間以上であって、生産効率の観点などから２４時間以内にあることが望ましい。
工程Ｂにおける求核剤と合成物の接触中の温度は、特に限定されないが、例えば５℃～８０℃の範囲内の温度であり、より好ましくは１０℃～５０℃であり、操作の容易さの観点などから特に好ましくは１５℃～３０℃である。
求核剤と接触させる際に使用する容器の接液面の材質は、特に限定されないが、例えばＳＵＳ３１６、ＳＵＳ３１６Ｌ、ＳＵＳ３０４、ガラス、アクリル樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ＰＥＴ、ＰＴＦＥ、ＰＦＡ、ＥＴＦＥ、ＦＥＰ等が挙げられ、好ましくはガラス、アクリル樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ＰＥＴ、ＰＴＦＥ、ＰＦＡから選ばれ、より好ましくはガラス、アクリル樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＰＴＦＥ、ＰＦＡから選ばれるものである。求核剤と接触させる操作を非金属製容器中で実施することにより、目的オリゴヌクレオチドがチオリン酸エステルを有する場合であっても、反応容器からの金属イオンの溶出に起因する切出および脱保護工程中の脱硫体不純物（目的オリゴヌクレオチドのチオリン酸エステル結合がリン酸ジエステル結合に変化したもの）の生成を抑制することが可能である。
工程Ｂにおける求核剤との接触は、合成に用いた反応カラムの中で行うか、或いは反応カラムから取り出した後に移送した別容器の中で行うことができる。
工程Ｂにおける求核剤との接触は、合成に用いた反応カラムの中で行うか、或いは反応カラムから取り出した後に移送した別容器の中で行うことができる。
（３）工程Ｃ
工程Ｃで、工程Ｂで得られた核酸の保護基を脱保護する。
工程Ａの核酸の合成する方法が固相合成方法である場合は、工程Ｃ（保護基を脱保護する工程）は同時に固相担体からの核酸の切出工程であることが可能である。
工程Ａの上記の工程（ａ）～（ｅ）及び工程Ｂに続いて、工程Ｃとして以下の工程（ｆ）を行うことができる。
（ｆ）切出・脱保護工程：工程（ｅ）及び工程Ｂまでで製造された所望の鎖長の核酸を切出・脱保護剤を用いて固相担体から切出し、その塩基部や２’位の水酸基等の保護基を脱離させる。
工程Ｃで、工程Ｂで得られた核酸の保護基を脱保護する。
工程Ａの核酸の合成する方法が固相合成方法である場合は、工程Ｃ（保護基を脱保護する工程）は同時に固相担体からの核酸の切出工程であることが可能である。
工程Ａの上記の工程（ａ）～（ｅ）及び工程Ｂに続いて、工程Ｃとして以下の工程（ｆ）を行うことができる。
（ｆ）切出・脱保護工程：工程（ｅ）及び工程Ｂまでで製造された所望の鎖長の核酸を切出・脱保護剤を用いて固相担体から切出し、その塩基部や２’位の水酸基等の保護基を脱離させる。
工程（ｆ）：
［式中、ＢａｓｅＰＧ、●、Ｘは、前記と同義である。Ｂａｓｅは保護基を除去したアデニン、チミン、ウラシル、グアニン、シトシン又はそれらを修飾したものを独立して示す。Ｒは４，４’－ジメトキシトリチル基又は水素原子を表す。ｎは０以上の整数を表す。］
（切出・脱保護工程における反応液）
切出・脱保護剤として、例えば、濃アンモニア水、メチルアミン、水酸化ナトリウム等の塩基性物質を挙げることができる。濃アンモニア水のアンモニア濃度は２０～３０重量％が好ましく、２５～３０重量％がより好ましい。使用される切出・脱保護剤の量は、固相担体に担持されている核酸１ｍｍｏｌに対して１０ｍＬ～１０００ｍＬが好ましく、核酸１ｍｍｏｌに対して５０ｍＬ～５００ｍＬがより好ましい。
切出・脱保護剤は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、１－プロピルアルコール、１－ブタノール、２－ブタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、ジメチルスルホキシド等で希釈して使用することもでき、好ましくは水、エタノール又はイソプロピルアルコールで希釈される。切出・脱保護工程における反応液は塩基性であることが好ましく、ｐＨ１０～１４であることがより望ましい。
切出・脱保護剤として、例えば、濃アンモニア水、メチルアミン、水酸化ナトリウム等の塩基性物質を挙げることができる。濃アンモニア水のアンモニア濃度は２０～３０重量％が好ましく、２５～３０重量％がより好ましい。使用される切出・脱保護剤の量は、固相担体に担持されている核酸１ｍｍｏｌに対して１０ｍＬ～１０００ｍＬが好ましく、核酸１ｍｍｏｌに対して５０ｍＬ～５００ｍＬがより好ましい。
切出・脱保護剤は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、１－プロピルアルコール、１－ブタノール、２－ブタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、ジメチルスルホキシド等で希釈して使用することもでき、好ましくは水、エタノール又はイソプロピルアルコールで希釈される。切出・脱保護工程における反応液は塩基性であることが好ましく、ｐＨ１０～１４であることがより望ましい。
工程（ｆ）の反応温度は、例えば、５～７５℃の範囲内の温度であり、好ましくは１５～６０℃の範囲内の温度である。工程（ｆ）の反応時間は、例えば４８時間以下であり、２４時間以下で行われることが好ましい。
切出・脱保護剤によって、固相担体からの核酸の切出が行われ、更に核酸に結合している保護基が除去される。
上記の固相合成法の工程（ａ）～（ｆ）は、市販の核酸自動合成装置等を用いて実施することが可能である。また、上記の工程に従って、３’位の炭素原子から５’位の炭素原子の方向へヌクレオチド鎖が伸長するように核酸が製造される。
切出・脱保護剤によって、固相担体からの核酸の切出が行われ、更に核酸に結合している保護基が除去される。
上記の固相合成法の工程（ａ）～（ｆ）は、市販の核酸自動合成装置等を用いて実施することが可能である。また、上記の工程に従って、３’位の炭素原子から５’位の炭素原子の方向へヌクレオチド鎖が伸長するように核酸が製造される。
（４）分離精製工程
製造された核酸は、一般に行われる分離精製手段、例えば逆相クロマトグラフィー、逆相イオンペアクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等によって核酸の精製を行うことができる。また更に、限外ろ過などにより溶液中に含まれる不純物である塩を除去することが可能であり、凍結乾燥によってオリゴ核酸溶液を粉体化させることが可能である。
製造された核酸は、一般に行われる分離精製手段、例えば逆相クロマトグラフィー、逆相イオンペアクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等によって核酸の精製を行うことができる。また更に、限外ろ過などにより溶液中に含まれる不純物である塩を除去することが可能であり、凍結乾燥によってオリゴ核酸溶液を粉体化させることが可能である。
（副生成物（Ｂ））
本発明の核酸の製造方法は、従来技術では除去できない副生成物（Ｂ）の含有量を低減させて、純度の高い核酸を製造することができる。具体的には、目的の核酸（Ａ）に対して質量が３４ダルトン大きい核酸不純物（副生成物（Ｂ））の質量分析時の検出イオン強度比が、核酸（Ａ）１００に対して、０．５０以下、好ましくは０．１０以下である。
副生成物（Ｂ）は合成操作中、主として前記の工程（ａ）中に、その配列中に含まれるアデニン塩基上により高極性となるような変異が生じることで生成すると本願発明者は推定している。また、副生成物（Ｂ）と目的の核酸（Ａ）は分子量、及び極性等の物性が近く、陰イオン交換クロマトグラフィー等の核酸製造に一般に用いられる分離精製技術での除去が困難である。そこで、分離精製工程の前に、工程Ｂ及び工程Ｃで副生成物（Ｂ）の含有率を低減させることが望ましい。
本発明の核酸の製造方法は、従来技術では除去できない副生成物（Ｂ）の含有量を低減させて、純度の高い核酸を製造することができる。具体的には、目的の核酸（Ａ）に対して質量が３４ダルトン大きい核酸不純物（副生成物（Ｂ））の質量分析時の検出イオン強度比が、核酸（Ａ）１００に対して、０．５０以下、好ましくは０．１０以下である。
副生成物（Ｂ）は合成操作中、主として前記の工程（ａ）中に、その配列中に含まれるアデニン塩基上により高極性となるような変異が生じることで生成すると本願発明者は推定している。また、副生成物（Ｂ）と目的の核酸（Ａ）は分子量、及び極性等の物性が近く、陰イオン交換クロマトグラフィー等の核酸製造に一般に用いられる分離精製技術での除去が困難である。そこで、分離精製工程の前に、工程Ｂ及び工程Ｃで副生成物（Ｂ）の含有率を低減させることが望ましい。
製造した核酸の品質の分析は、一般に行われる核酸の分析手段、例えば分離手段としては逆相クロマトグラフィー、逆相イオンペアクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど、検出器としてはＵＶ検出器、質量分析計など、を組み合わせたもので行うことができる。核酸中の副生成物（不純物）量は、ＵＶ検出器を用いる場合は検出されたピークの面積比、質量分析計を用いる場合は検出されるイオン強度比などから算出することができる。イオン強度比の算出方法として、検出された核酸の多価イオン群をデコンボリューション操作によって分子（中性種）の質量あるいは１価イオンのｍ／ｚ（イオンの質量を統一原子質量単位で割って得られる相対質量をイオンの電荷数で割って得られる無次元量）に変換してから計算する方法や、特定の多価イオンの信号強度を抽出して計算する方法などを用いることができる。
２．不純物の除去方法
本発明の不純物の除去方法は、塩基部のアミノ基がアシル系保護基で保護された核酸を、中性から酸性のｐＨ条件下で求核剤と接触させ、続いて核酸の保護基を脱保護することによる、目的の核酸から、質量が前記核酸より３４ダルトン大きい核酸不純物（副生成物（Ｂ））を除去する方法である。
本発明の不純物の除去方法は、上記の工程Ｂ及び工程Ｃを行うことで実施することができる。
本発明の不純物の除去方法は、塩基部のアミノ基がアシル系保護基で保護された核酸を、中性から酸性のｐＨ条件下で求核剤と接触させ、続いて核酸の保護基を脱保護することによる、目的の核酸から、質量が前記核酸より３４ダルトン大きい核酸不純物（副生成物（Ｂ））を除去する方法である。
本発明の不純物の除去方法は、上記の工程Ｂ及び工程Ｃを行うことで実施することができる。
３．不純物が少ない核酸
本発明の不純物が少ない核酸は、核酸と、前記核酸に含まれ得る前記核酸よりも質量が３４ダルトン大きい核酸不純物の質量分析時の検出イオン強度比が、前記核酸１００に対して０．５０以下である、核酸である。
本発明の不純物が少ない核酸は、上記の本発明の核酸の製造方法を用いて製造することができる。
本発明の不純物が少ない核酸は、核酸と、前記核酸に含まれ得る前記核酸よりも質量が３４ダルトン大きい核酸不純物の質量分析時の検出イオン強度比が、前記核酸１００に対して０．５０以下である、核酸である。
本発明の不純物が少ない核酸は、上記の本発明の核酸の製造方法を用いて製造することができる。
以下に実施例等を掲げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等のみに限定されるものではない。
下記実施例等のＤＮＡは、特記されない限り、糖部はデオキシリボース環であり、塩基部はアデニン、チミン、グアニン、シトシンから選ばれるものである。実施例におけるＬＮＡ（２’，４’－ＢＮＡ）は、特記されない限り、糖部はリボース環の２’位の酸素原子と４’位の炭素原子間が架橋（－ＣＨ２－）された構造を有するものであり、塩基部はアデニン、チミン、グアニン、５－メチルシトシンから選ばれる。製造例及び比較製造例では、アデニンの６位アミノ基の保護基としてベンゾイル基、グアニンの２位アミノ基の保護基としてイソブチリル基、シトシン及び５－メチルシトシンの４位アミノ基の保護基としてベンゾイル基を使用した。
下記実施例等のＤＮＡは、特記されない限り、糖部はデオキシリボース環であり、塩基部はアデニン、チミン、グアニン、シトシンから選ばれるものである。実施例におけるＬＮＡ（２’，４’－ＢＮＡ）は、特記されない限り、糖部はリボース環の２’位の酸素原子と４’位の炭素原子間が架橋（－ＣＨ２－）された構造を有するものであり、塩基部はアデニン、チミン、グアニン、５－メチルシトシンから選ばれる。製造例及び比較製造例では、アデニンの６位アミノ基の保護基としてベンゾイル基、グアニンの２位アミノ基の保護基としてイソブチリル基、シトシン及び５－メチルシトシンの４位アミノ基の保護基としてベンゾイル基を使用した。
［製造例１］
（求核剤種の検討）
固相担体を充填したＳＵＳ３１６Ｌ製反応カラムと核酸合成装置ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ（登録商標）ｐｌｕｓ１００を用い、固相担体とリンカーを介して結合しているヌクレオシドに順次ホスホロアミダイトを縮合し、最後にトリエチルアミン／アセトニトリル（１：１）混合溶液を通液することで目的のオリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）を合成した。
次に該目的オリゴヌクレオチドが結合した固相担体を、ガラス製試験管中で固相担体担持量１ｍｍｏｌあたり２０ｍＬの表１記載のいずれかの求核剤に２０℃で３時間浸漬し振盪した。その後、該固相担体を２８重量％アンモニア水溶液／エタノール（４：１）混合溶液に６０℃で８時間浸漬して、固相担体からの該目的オリゴヌクレオチドの切出及び保護基の脱保護を行った。
（求核剤種の検討）
固相担体を充填したＳＵＳ３１６Ｌ製反応カラムと核酸合成装置ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ（登録商標）ｐｌｕｓ１００を用い、固相担体とリンカーを介して結合しているヌクレオシドに順次ホスホロアミダイトを縮合し、最後にトリエチルアミン／アセトニトリル（１：１）混合溶液を通液することで目的のオリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）を合成した。
次に該目的オリゴヌクレオチドが結合した固相担体を、ガラス製試験管中で固相担体担持量１ｍｍｏｌあたり２０ｍＬの表１記載のいずれかの求核剤に２０℃で３時間浸漬し振盪した。その後、該固相担体を２８重量％アンモニア水溶液／エタノール（４：１）混合溶液に６０℃で８時間浸漬して、固相担体からの該目的オリゴヌクレオチドの切出及び保護基の脱保護を行った。
上記切出・脱保護後に、当該混合溶液を水／エタノール（４：１）混合溶液で希釈することで、該目的オリゴヌクレオチドのクルード液を得た（実施例１～５）。
尚、上記の固相担体、リンカー、目的オリゴヌクレオチドは以下に示すものである。
固相担体、リンカー：Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ（登録商標） ５Ｇ Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ ３５０（Ｃｙｔｉｖａ）
目的オリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）：５’－Ｔ（Ｌ）＾Ｇ（Ｌ）＾Ｃ＾Ｔ＾Ａ＾Ｇ＾Ｃ＾Ａ＾Ｇ＾Ａ＾Ｔ＾Ｇ＾Ｃ＾Ｔ＾Ａ（Ｌ）＾ｍＣ（Ｌ）－３’（配列番号１：１６ｍｅｒ、＾はホスホチオエート結合を示す。また、塩基の横に（Ｌ）が記載された各ヌクレオシド単位はＬＮＡ（２’，４’－ＢＮＡ）と同一の構造であり、その他ヌクレオシド単位はＤＮＡと同一の構造単位を示す。ｍＣは塩基がメチルシトシンであることを示す。）
尚、上記の固相担体、リンカー、目的オリゴヌクレオチドは以下に示すものである。
固相担体、リンカー：Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ（登録商標） ５Ｇ Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ ３５０（Ｃｙｔｉｖａ）
目的オリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）：５’－Ｔ（Ｌ）＾Ｇ（Ｌ）＾Ｃ＾Ｔ＾Ａ＾Ｇ＾Ｃ＾Ａ＾Ｇ＾Ａ＾Ｔ＾Ｇ＾Ｃ＾Ｔ＾Ａ（Ｌ）＾ｍＣ（Ｌ）－３’（配列番号１：１６ｍｅｒ、＾はホスホチオエート結合を示す。また、塩基の横に（Ｌ）が記載された各ヌクレオシド単位はＬＮＡ（２’，４’－ＢＮＡ）と同一の構造であり、その他ヌクレオシド単位はＤＮＡと同一の構造単位を示す。ｍＣは塩基がメチルシトシンであることを示す。）
［比較製造例１］
製造例１で合成した目的オリゴヌクレオチドが結合した固相担体を用い、「次に該目的オリゴヌクレオチドが結合した固相担体を、ガラス製試験管中で固相担体担持量１ｍｍｏｌあたり２０ｍＬの表１記載のいずれかの求核剤に２０℃で３時間浸漬し振盪した。その後、該固相担体を２８重量％アンモニア水溶液／エタノール（４：１）混合溶液に」を、「次に該目的オリゴヌクレオチドが結合した固相担体を２８重量％アンモニア水溶液／エタノール（４：１）混合溶液に」に変更した以外は製造例１と同条件で同操作を行って、目的オリゴヌクレオチドのクルード液を得た（比較例１）。
製造例１で合成した目的オリゴヌクレオチドが結合した固相担体を用い、「次に該目的オリゴヌクレオチドが結合した固相担体を、ガラス製試験管中で固相担体担持量１ｍｍｏｌあたり２０ｍＬの表１記載のいずれかの求核剤に２０℃で３時間浸漬し振盪した。その後、該固相担体を２８重量％アンモニア水溶液／エタノール（４：１）混合溶液に」を、「次に該目的オリゴヌクレオチドが結合した固相担体を２８重量％アンモニア水溶液／エタノール（４：１）混合溶液に」に変更した以外は製造例１と同条件で同操作を行って、目的オリゴヌクレオチドのクルード液を得た（比較例１）。
［製造例２］
（接触条件の比較検討）
「固相担体担持量１ｍｍｏｌあたり２０ｍＬの表１記載のいずれかの求核剤に２０℃で３時間浸漬し振盪した。」を「表２記載のいずれかの接触温度、固相担体担持量あたりの水接触量、接触時間の条件で水に浸漬し振盪した。」に変更した以外は製造例１と同条件で同操作を行って、目的オリゴヌクレオチドのクルード液を得た（実施例６～１２）。
（接触条件の比較検討）
「固相担体担持量１ｍｍｏｌあたり２０ｍＬの表１記載のいずれかの求核剤に２０℃で３時間浸漬し振盪した。」を「表２記載のいずれかの接触温度、固相担体担持量あたりの水接触量、接触時間の条件で水に浸漬し振盪した。」に変更した以外は製造例１と同条件で同操作を行って、目的オリゴヌクレオチドのクルード液を得た（実施例６～１２）。
［比較製造例２］
製造例２で合成した目的オリゴヌクレオチドが結合した固相担体を用い、比較製造例１と同条件で同操作を行うことで、目的オリゴヌクレオチドのクルード液を得た（比較例２）。
製造例２で合成した目的オリゴヌクレオチドが結合した固相担体を用い、比較製造例１と同条件で同操作を行うことで、目的オリゴヌクレオチドのクルード液を得た（比較例２）。
［製造例３］
（接触時間の検討）
固相担体を充填したＳＵＳ３１６Ｌ製反応カラムと核酸合成装置ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ（登録商標）ｐｌｕｓ１００を用い、固相担体とリンカーを介して結合しているヌクレオシドに順次ホスホロアミダイトを縮合し、最後にトリエチルアミン／アセトニトリル（１：１）混合溶液を通液することで目的のオリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）を合成した後、固相担体担持量１ｍｍｏｌあたり９６０ｍＬの水を４分間で反応カラムに通液することで固相担体と水を接触させた。
次に該目的オリゴヌクレオチドが結合した固相担体を、ガラス製試験管中で２８重量％アンモニア水溶液／エタノール（４：１）混合溶液に６０℃で１９時間浸漬して、固相担体からの該目的オリゴヌクレオチドの切出及び保護基の脱保護を行った。
（接触時間の検討）
固相担体を充填したＳＵＳ３１６Ｌ製反応カラムと核酸合成装置ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ（登録商標）ｐｌｕｓ１００を用い、固相担体とリンカーを介して結合しているヌクレオシドに順次ホスホロアミダイトを縮合し、最後にトリエチルアミン／アセトニトリル（１：１）混合溶液を通液することで目的のオリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）を合成した後、固相担体担持量１ｍｍｏｌあたり９６０ｍＬの水を４分間で反応カラムに通液することで固相担体と水を接触させた。
次に該目的オリゴヌクレオチドが結合した固相担体を、ガラス製試験管中で２８重量％アンモニア水溶液／エタノール（４：１）混合溶液に６０℃で１９時間浸漬して、固相担体からの該目的オリゴヌクレオチドの切出及び保護基の脱保護を行った。
上記切出・脱保護後に、当該混合溶液を水／エタノール（４：１）混合溶液で希釈することで、該目的オリゴヌクレオチドのクルード液を得た（参考例１）。
尚、上記の固相担体、リンカー、目的オリゴヌクレオチドは以下に示すものである。
固相担体、リンカー：Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ（登録商標） ５Ｇ Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ ３５０（Ｃｙｔｉｖａ）
目的オリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）：５’－Ｃ＾Ｔ＾Ａ＾Ｇ＾Ｃ＾Ａ＾Ｇ＾Ａ＾Ｔ＾Ｇ＾Ｃ＾Ｔ－３’（配列番号２：１２ｍｅｒ ＤＮＡ、＾はホスホチオエート結合を示す）
尚、上記の固相担体、リンカー、目的オリゴヌクレオチドは以下に示すものである。
固相担体、リンカー：Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ（登録商標） ５Ｇ Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ ３５０（Ｃｙｔｉｖａ）
目的オリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）：５’－Ｃ＾Ｔ＾Ａ＾Ｇ＾Ｃ＾Ａ＾Ｇ＾Ａ＾Ｔ＾Ｇ＾Ｃ＾Ｔ－３’（配列番号２：１２ｍｅｒ ＤＮＡ、＾はホスホチオエート結合を示す）
［比較製造例３］
「目的のオリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）を合成した後、固相担体担持量１ｍｍｏｌあたり９６０ｍＬの水を４分間で反応カラムに通液することで固相担体と水を接触させた。」を、「目的のオリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）を合成した。」に変更した以外は製造例３と同条件で同操作を行って、目的オリゴヌクレオチドのクルード液を得た（比較例３）。
「目的のオリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）を合成した後、固相担体担持量１ｍｍｏｌあたり９６０ｍＬの水を４分間で反応カラムに通液することで固相担体と水を接触させた。」を、「目的のオリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）を合成した。」に変更した以外は製造例３と同条件で同操作を行って、目的オリゴヌクレオチドのクルード液を得た（比較例３）。
［製造例４］
（目的オリゴヌクレオチドの精製）
製造例１と同条件・同操作で取得したクルード液（求核剤として水を使用したもの、実施例１３）及び比較製造例１と同条件・同操作で取得したクルード液（比較例４）を用意した。
上記クルード液を其々、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて下記条件で分取精製し、精製後のオリゴヌクレオチド含有液を得た（実施例１３，比較例４）。
分取精製条件：イオン交換樹脂；ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＳｍａｒｔＳｅｐ Ｑ２０（ＹＭＣ）、カラム体積；７ｍＬ、カラム温度；室温、移動相Ａ：１０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液／メタノール（８５：１５）混合溶液、移動相Ｂ：１０ｍＭ水酸化ナトリウム・２Ｍ塩化ナトリウム水溶液／メタノール（８５：１５）混合溶液
（目的オリゴヌクレオチドの精製）
製造例１と同条件・同操作で取得したクルード液（求核剤として水を使用したもの、実施例１３）及び比較製造例１と同条件・同操作で取得したクルード液（比較例４）を用意した。
上記クルード液を其々、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて下記条件で分取精製し、精製後のオリゴヌクレオチド含有液を得た（実施例１３，比較例４）。
分取精製条件：イオン交換樹脂；ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＳｍａｒｔＳｅｐ Ｑ２０（ＹＭＣ）、カラム体積；７ｍＬ、カラム温度；室温、移動相Ａ：１０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液／メタノール（８５：１５）混合溶液、移動相Ｂ：１０ｍＭ水酸化ナトリウム・２Ｍ塩化ナトリウム水溶液／メタノール（８５：１５）混合溶液
［試験例１：副生成物（Ｂ）量の測定］
製造例１～４および比較製造例１、２で製造した各オリゴヌクレオチドのクルード液（製造例４は精製後のオリゴヌクレオチド含有液についても）につき、超高速液体クロマトグラフ質量分析法（ＵＨＰＬＣ－ＭＳ）による測定を下記条件で行い、目的オリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）の量及び目的オリゴヌクレオチドより質量が３４ダルトン増加した副生成物（Ｂ）の量を求め、副生成物（Ｂ）の含有率（副生成物のイオン強度／目的オリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）のイオン強度（％））を計算した。尚、本明細書における副生成物（Ｂ）は目的オリゴヌクレオチドより質量が３４ダルトン増加したものである点で共通するが、目的オリゴヌクレオチドの種類毎に異なる物質となる。
測定条件：ＵＨＰＬＣ装置；Ｖａｎｑｕｉｓｈ ＵＨＰＬＣシステム、質量分析計；Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ、カラム；Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８、１３０Å、 １．７μｍ、 ２．１ｍｍ×１００ｍｍ、ＵＶ検出；２６０ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；１００ｍＭ ＨＦＩＰ，８ｍＭ ＴＥＡ ｉｎ Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮ＝９８：２、ＢｕｆｆｅｒＢ；Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮ＝５０：５０、温度；６０℃、イオン化法；ＥＳＩ、検出モード；ネガティブ、スプレー電圧；２．５｜ｋＶ｜、キャピラリー温度；２５０℃
上記で測定した結果は下記の表１～４において示される通りである。
製造例１～４および比較製造例１、２で製造した各オリゴヌクレオチドのクルード液（製造例４は精製後のオリゴヌクレオチド含有液についても）につき、超高速液体クロマトグラフ質量分析法（ＵＨＰＬＣ－ＭＳ）による測定を下記条件で行い、目的オリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）の量及び目的オリゴヌクレオチドより質量が３４ダルトン増加した副生成物（Ｂ）の量を求め、副生成物（Ｂ）の含有率（副生成物のイオン強度／目的オリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）のイオン強度（％））を計算した。尚、本明細書における副生成物（Ｂ）は目的オリゴヌクレオチドより質量が３４ダルトン増加したものである点で共通するが、目的オリゴヌクレオチドの種類毎に異なる物質となる。
測定条件：ＵＨＰＬＣ装置；Ｖａｎｑｕｉｓｈ ＵＨＰＬＣシステム、質量分析計；Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ、カラム；Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８、１３０Å、 １．７μｍ、 ２．１ｍｍ×１００ｍｍ、ＵＶ検出；２６０ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；１００ｍＭ ＨＦＩＰ，８ｍＭ ＴＥＡ ｉｎ Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮ＝９８：２、ＢｕｆｆｅｒＢ；Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮ＝５０：５０、温度；６０℃、イオン化法；ＥＳＩ、検出モード；ネガティブ、スプレー電圧；２．５｜ｋＶ｜、キャピラリー温度；２５０℃
上記で測定した結果は下記の表１～４において示される通りである。
［試験例２：目的オリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）量の測定］
製造例４で製造したオリゴヌクレオチドのクルード液および精製後のオリゴヌクレオチド含有液の各試料溶液の其々につき、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）による測定を下記条件で行い、目的オリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）の純度（目的オリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）のピーク面積／全ピークの総面積（％））を計算した
測定条件：ＵＨＰＬＣ装置；ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ、カラム；Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、ＵＶ検出；２６０ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；１００ｍＭ ＨＦＩＰ，８ｍＭ ＴＥＡ ｉｎ Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮ＝９８：２、ＢｕｆｆｅｒＢ；Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮ＝５０：５０、温度；６０℃
更に、製造例４で製造したオリゴヌクレオチドのクルード液および精製後のオリゴヌクレオチド含有液の各試料溶液の其々につき、水で希釈後、分光光度計による吸光度の測定を行い、得られたＯＤ値から収率（理論上取得可能な最大のＯＤ値に対する実際に測定して得られたＯＤ値の割合）を算出した。
上記で測定した結果は下記の表４において示される通りである。
製造例４で製造したオリゴヌクレオチドのクルード液および精製後のオリゴヌクレオチド含有液の各試料溶液の其々につき、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）による測定を下記条件で行い、目的オリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）の純度（目的オリゴヌクレオチド（ＦＬＰ）のピーク面積／全ピークの総面積（％））を計算した
測定条件：ＵＨＰＬＣ装置；ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ、カラム；Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、ＵＶ検出；２６０ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；１００ｍＭ ＨＦＩＰ，８ｍＭ ＴＥＡ ｉｎ Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮ＝９８：２、ＢｕｆｆｅｒＢ；Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮ＝５０：５０、温度；６０℃
更に、製造例４で製造したオリゴヌクレオチドのクルード液および精製後のオリゴヌクレオチド含有液の各試料溶液の其々につき、水で希釈後、分光光度計による吸光度の測定を行い、得られたＯＤ値から収率（理論上取得可能な最大のＯＤ値に対する実際に測定して得られたＯＤ値の割合）を算出した。
上記で測定した結果は下記の表４において示される通りである。
上記の表１～４に記載の副生成物（Ｂ）量／ＦＬＰ量（％）は、ＦＬＰ（Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ：目的オリゴヌクレオチド）を１００（％）とした場合の副生成物（Ｂ）の割合（％）である。
表１で示される様に、本発明にかかる特定の求核剤（水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ－ブタノール）と接触させたもの（実施例１～５）は、求核剤と接触させなかったもの（比較例１）よりも、副生成物（Ｂ）の含有率が有意に低いことが示された。
この際、求核剤をメタノールとした実施例２の場合には目的オリゴヌクレオチドのアデニン塩基がメトキシ基に置換したアルコキシ副生成物が３．２０％（目的オリゴヌクレオチドを１００％とした場合の割合）生じることが確認された。アルコキシ副生成物は逆相クロマトグラフィーで目的オリゴヌクレオチドと分離可能と考えられる。
この際、求核剤をメタノールとした実施例２の場合には目的オリゴヌクレオチドのアデニン塩基がメトキシ基に置換したアルコキシ副生成物が３．２０％（目的オリゴヌクレオチドを１００％とした場合の割合）生じることが確認された。アルコキシ副生成物は逆相クロマトグラフィーで目的オリゴヌクレオチドと分離可能と考えられる。
表２で示される様に、本発明にかかる水との接触について、接触させる水の量は副生成物（Ｂ）の含有率に影響を与えないことが示された（実施例７、８）。
また、水と０．５時間接触させることで（実施例９）、水と接触させなかった場合（比較例２）より副生成物（Ｂ）の含有率が有意に低くなることが示された。また、副生成物（Ｂ）の減少率は、４分間のみ水と接触させた場合（表３の参考例１）よりも０．５時間接触させた場合（表２の実施例９）の方が大きく、２時間接触させた場合（表２の実施例１０）では更に大きいことが示された。以上の結果より、接触時間の延長に伴って副生成物（Ｂ）の含有率を低減させる効果が増強されることが示された。
また、水と０．５時間接触させることで（実施例９）、水と接触させなかった場合（比較例２）より副生成物（Ｂ）の含有率が有意に低くなることが示された。また、副生成物（Ｂ）の減少率は、４分間のみ水と接触させた場合（表３の参考例１）よりも０．５時間接触させた場合（表２の実施例９）の方が大きく、２時間接触させた場合（表２の実施例１０）では更に大きいことが示された。以上の結果より、接触時間の延長に伴って副生成物（Ｂ）の含有率を低減させる効果が増強されることが示された。
また、水との接触温度が３０℃の場合（表２の実施例１１）は接触温度が１５℃の場合（表２の実施例６）や２０℃の場合（表２の実施例９）よりも副生成物（Ｂ）が速く減少することが示された。以上の結果より、接触温度の上昇に伴って該不純物の含有率を低減させる効果が増強されることが示された。
表４で示される様に、本発明にかかる水との接触は、通常の分取精製操作よりも副生成物（Ｂ）の含有率を低減させる効果が高いことが示された。また、水との接触の有無は、ＦＬＰ純度や収率に対して影響を及ぼさないことが確認された。
表４で示される様に、本発明にかかる水との接触は、通常の分取精製操作よりも副生成物（Ｂ）の含有率を低減させる効果が高いことが示された。また、水との接触の有無は、ＦＬＰ純度や収率に対して影響を及ぼさないことが確認された。
本発明は不純物含量の低い高品質な核酸医薬を製造することに貢献するものである。
Claims (9)
- 塩基部のアミノ基がアシル系保護基で保護された核酸を合成する工程Ａ、
工程Ａで得られた核酸を、中性又は酸性のｐＨ条件下で求核剤と接触させる工程Ｂ、及び
工程Ｂで得られた核酸の保護基を脱保護する工程Ｃを含む、核酸の製造方法。 - 前記ｐＨが約３～約８である、請求項１に記載の製造方法。
- 前記求核剤が水及び／又はアルコールである、請求項１又は２に記載の製造方法。
- 約５～約８０℃で約０．２５時間以上、前記求核剤と接触させる、請求項１～３のいずれかに記載の製造方法。
- 塩基部のアミノ基がアシル系保護基で保護された核酸を、中性又は酸性のｐＨ条件下で求核剤と接触させ、続いて核酸の保護基を脱保護することによる、目的の核酸から、前記核酸より質量が３４ダルトン大きい核酸不純物を除去する方法。
- 前記ｐＨが約３～約８である、請求項５に記載の除去方法。
- 前記求核剤が水及び／又はアルコールである、請求項５又は６に記載の除去方法。
- 約５～約８０℃で約０．２５時間以上、前記求核剤と接触させる、請求項５～７のいずれかに記載の除去方法。
- 核酸と、前記核酸に含まれ得る前記核酸よりも質量が３４ダルトン大きい核酸不純物の質量分析時の検出イオン強度比が、前記核酸１００に対して０．５０以下である、核酸。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022-142150 | 2022-09-07 | ||
| JP2022142150 | 2022-09-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2024053578A1 true WO2024053578A1 (ja) | 2024-03-14 |
Family
ID=90191003
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2023/032085 WO2024053578A1 (ja) | 2022-09-07 | 2023-09-01 | 核酸の製造方法、不純物の除去方法及び不純物が少ない核酸 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2024053578A1 (ja) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6036493A (ja) * | 1983-08-08 | 1985-02-25 | Nippon Zeon Co Ltd | 保護された核酸関連物質の分離法 |
| JP2002536381A (ja) * | 1999-02-05 | 2002-10-29 | アマーシャム・ファルマシア・バイオテック・インコーポレーテッド | オリゴヌクレオチドを脱保護するための方法 |
| JP2014525254A (ja) * | 2011-09-02 | 2014-09-29 | グラクソ グループ リミテッド | 混合物から目的のオリゴヌクレオチドを分離するためのプロセス |
| JP2019518759A (ja) * | 2016-06-14 | 2019-07-04 | バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． | オリゴヌクレオチドの精製のための疎水性相互作用クロマトグラフィー |
| WO2021045141A1 (ja) * | 2019-09-04 | 2021-03-11 | 神戸天然物化学株式会社 | オリゴヌクレオチドの脱保護方法 |
-
2023
- 2023-09-01 WO PCT/JP2023/032085 patent/WO2024053578A1/ja unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6036493A (ja) * | 1983-08-08 | 1985-02-25 | Nippon Zeon Co Ltd | 保護された核酸関連物質の分離法 |
| JP2002536381A (ja) * | 1999-02-05 | 2002-10-29 | アマーシャム・ファルマシア・バイオテック・インコーポレーテッド | オリゴヌクレオチドを脱保護するための方法 |
| JP2014525254A (ja) * | 2011-09-02 | 2014-09-29 | グラクソ グループ リミテッド | 混合物から目的のオリゴヌクレオチドを分離するためのプロセス |
| JP2019518759A (ja) * | 2016-06-14 | 2019-07-04 | バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． | オリゴヌクレオチドの精製のための疎水性相互作用クロマトグラフィー |
| WO2021045141A1 (ja) * | 2019-09-04 | 2021-03-11 | 神戸天然物化学株式会社 | オリゴヌクレオチドの脱保護方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5048575B2 (ja) | オリゴヌクレオチドの脱シリル化の方法 | |
| EP1954707B1 (en) | Polynucleotide containing a phosphate mimetic | |
| EP1792909A1 (en) | Synthesis of polynucleotides | |
| JP6730932B2 (ja) | リン保護基ならびにそれらの調製方法および使用 | |
| WO2009100320A2 (en) | Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs | |
| Beaucage | Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotides | |
| JP4705716B2 (ja) | オリゴヌクレオチドの脱保護法 | |
| EP0767668A1 (en) | Polynucleoside chain having multiple nucleosides, the nucleosides coupled by guanidyl linkages | |
| JP2002536381A5 (ja) | ||
| JP2010248084A (ja) | 新規洗浄溶媒を用いるオリゴヌクレオチド合成法 | |
| KR20160150051A (ko) | Rna 올리고뉴클레오티드 절단 방법 | |
| EP2276775B1 (en) | Process for the manufacture of oligonucleotides | |
| WO2024053578A1 (ja) | 核酸の製造方法、不純物の除去方法及び不純物が少ない核酸 | |
| JPH09505307A (ja) | 多キラル合成フォスホネートオリゴマー類 | |
| CA2424716A1 (en) | Process for producing multiple oligonucleotides on a solid support | |
| Saneyoshi et al. | Chemical synthesis of RNA via 2′-O-cyanoethylated intermediates | |
| JP2023154962A (ja) | チオリン酸結合を有する核酸の製造方法 | |
| JP6429264B2 (ja) | ボラノホスフェート化合物、及び核酸オリゴマー | |
| WO2023054350A1 (ja) | 精製ジクロロ酢酸の製造方法 | |
| WO2022064908A1 (ja) | 核酸オリゴマーの製造方法 | |
| Ravikumar et al. | 4-Cyano-2-butenyl group: A new type of protecting group in oligonucleotide synthesis via phosphoramidite approach | |
| CN114728995A (zh) | 制备具有改善的活性的催化活性dna分子的方法及其用于治疗哮喘的方法中的用途 | |
| WO2004048376A1 (ja) | 二環性ナフチリジンヌクレオシド | |
| Thillier et al. | Innovative Chemistry for Synthesis of Regular RNA, 5′-Triphosphate RNA, or 5′-Capped RNA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 23863116 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |