CN114728995A - 制备具有改善的活性的催化活性dna分子的方法及其用于治疗哮喘的方法中的用途 - Google Patents

制备具有改善的活性的催化活性dna分子的方法及其用于治疗哮喘的方法中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种制备催化活性DNA分子的方法，所述方法导致催化活性DNA分子中的杂质的量显着降低，本发明亦涉及通过所述方法所获得的催化活性DNA分子及包含所述催化活性DNA分子的药物组合物，以及催化活性DNA分子及药物组合物在预防及/或治疗GATA‑3衍生的疾病的方法中的用途。

Description

制备具有改善的活性的催化活性DNA分子的方法及其用于治 疗哮喘的方法中的用途
技术领域
本发明涉及一种用于制备包括催化活性DNA的寡核苷酸的方法，涉及通过所述方法获得的寡核苷酸，涉及包含此种寡核苷酸的药物组合物，以及催化活性DNA或药物组合物用于在治疗GATA-3驱动的疾病方法中的用途：，其中所述寡核苷酸包括少量的杂质。
背景技术
催化活性DNA分子是一种单链的、合成的DNA分子，在自然界中并不存在。催化活性DNA分子的一个实例是10-23家族的脱氧核酶(DNAzyme)，其代表在1990年代所开发的一新类别的反义分子(anti-sense molecule)。术语“10-23家族”是指一般的脱氧核酶模型(圣托罗&乔伊斯,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,94(1997)4262-4266)。10-23模型的脱氧核酶-亦称为“10-23脱氧核酶”具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，其侧接两个受质结合结构域(例如，WO 2005/033314)。脱氧核酶的潜在优点包括相对较高的稳定性及不依赖细胞内的酵素。诸如脱氧核酶(DNAzyme)的催化活性DNA分子最近发现在治疗的应用中，例如在哮喘的治疗(例如，EP 3 093 022 B1)。诸如脱氧核酶的催化活性DNA分子的制备过程包括或由三个主要过程步骤所组成，即(1)合成，(2)裂解及去保护，以及(3)DNA分子的下游纯化及分离。
由于选择现有技术的合成及去保护的条件，此制备过程产生大量的乙氧基缩醛改性的脱嘌呤物质作为杂质。通过UPLC-MS分析所检测到的其他与制程相关的杂质例如是长链碱基(longmer)及不完全去保护的物质，即在G碱基处仍含有异丁酰基(isobutyryl,ibu)保护基团的寡核苷酸(参见图2)。
大多数的此等杂质对于脱氧核酶(DNAzyme)活性所需的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对有直接的负面影响，因此可能会降低产物的活性。此外，此等杂质会降低最终纯化的活性药物成分(active pharmaceutical ingredient,API)的产量。此外，所述制程的整体生产率很低，导致活性药物成分价格昂贵。
此等生产特异性杂质及催化活性DNA分子的修饰，例如通过脱嘌呤而失去核碱基，随后形成或不形成乙氧基缩醛修饰的核糖及/或核碱基的不完全去保护，显着地降低催化活性活性DNA分子与靶mRNA的沃森-克里克(Watson-Crick)的结合，从而显着降低催化活性DNA分子的效率。催化活性DNA分子的效率降低必须通过增加剂量来补偿，其会增加副作用及成本的风险。
此外，催化活性DNA分子的修饰及杂质具有与催化活性DNA分子几乎相同的物理化学特性，因此仅能在催化活性DNA分子大量损失的情况下通过色谱分离。
因此，非常需要一种寡核苷酸，例如具有分别增加的活性及效率的催化活性DNA分子，其是以合理的努力及以合理的成本所生产。
发明内容
本发明涉及一种用于制备诸如脱氧核酶(DNAzyme)的催化活性DNA分子的方法，所述方法包括以下的步骤或由以下的步骤所组成：
(a)在载体上合成所述催化活性DNA分子，其中包含核碱基保护基团(base-labilenucleobase-protection group)的多个核苷酸以从3’-端到5’-端的顺序方式进行组装，或使用有机质子供体活化剂的混合物从3’-端到5’-端的顺序方式进行组装；所述核碱基保护基团例如碱基不稳定的酰基；所述有机质子供体活化剂例如0.2M至0.45M四唑或其衍生物及单体结构嵌段亚酰胺(monomeric building block amidite)(嵌段亚磷酰胺)(blockphosphoramidite)，所述衍生物例如乙基硫代四唑(ethylthiotetrazole,ETT)、苄基硫代四唑(benzylthiotetrazole,BTT)或二氰基咪唑(dacitivity,dicyanoimidazole,DCI)，
(b)合成完成后，在30℃至45℃的温度下，将所述催化活性DNA分子从所述载体上切割下来，及将所述核碱基及/或多个主链保护基团从所述催化活性DNA分子上切割下来，持续5小时至20小时，
(c)通过液相色谱法及脱盐纯化所述催化活性DNA分子，所述液相色谱法例如离子交换色谱法，以及
(d)任选地通过冷冻干燥分离所述催化活性DNA分子。例如所述催化活性DNA分子的任何进一步纯化步骤或分离步骤，例如步骤(c)或步骤(d)被排除在外。活化剂：亚酰胺(amidite)的比例例如为50：50至70：30。所述核碱基及/或主链保护基团例如是碱基不稳定的酰基。
在此方法中的所述载体例如是固体载体，例如可控孔玻璃(controlled poreglass,CPG)或大孔聚苯乙烯(macro-porous polystyrene,MPPS)。
所述核苷酸例如进一步包括位于5’-羟基的4,4’-二甲氧基三苯甲基(4,4’-dimethoxytrityl,DMT)基团、位于3’-亚磷酸酯基的β-氰乙基(beta-cyanoethyl,C-Net)或其组合。
所述脱氧核酶(DNAzyme)例如是hgd40，所述hgd40包括SEQ ID NO.1(5’-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG)。
本发明进一步涉及通过本发明的方法所获得的催化活性DNA分子，其催化活性DNA分子包括在0.5wt％至12wt％范围内的杂质，所述杂质指的是所有杂质的总和，例如所有第IV类杂质，液相色谱中的主产物峰之前及之后洗脱。所述催化活性DNA分子例如是脱氧核酶(DNAzyme)，其例如针对GATA-3的脱氧核酶。
本发明的催化活性DNA分子或如药物组合物例如是用于预防及/或治疗患有GATA-3衍生的疾病的人类患者的方法中的用途。
通过本发明的方法所获得的催化活性DNA例如是用于预防及/或治疗患有第2型哮喘的人类患者的方法中的用途，所述第2型哮喘例如第2型高度哮喘(type-2-high-asthma)，其中所述人类患者的特征在于(i)血液嗜酸性粒细胞的计数为3％或更多，特别是4％或更多，更特别是5％或更多；及/或(ii)血嗜酸性粒细胞的计数为每公升具有350x 106个血嗜酸性粒细胞或更多，特别是每公升具有450x 106个血嗜酸性粒细胞或更多；及/或(iii)呼气的一氧化氮的分数(fractional)为35ppb或40ppb或更高。
此外，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包括通过本发明的方法所获得的催化活性DNA分子及药学上可接受的载体。
所述药物组合物例如是用于预防及/或治疗患有第2型哮喘的人类患者的方法中的用途，所述第2型哮喘例如第2型高度哮喘(type-2-high-asthma)，其中所述人类患者的特征在于(i)血液嗜酸性粒细胞的计数为3％或更多，特别是4％或更多，更特别是5％或更多；及/或(ii)血嗜酸性粒细胞的计数为每公升具有350x 106个血嗜酸性粒细胞或更多，特别是每公升具有450x 106个血嗜酸性粒细胞或更多；及/或(iii)呼气的一氧化氮的分数(fractional)为35ppb或40ppb或更高。
所述催化活性DNA分子或所述药物组合物例如是经由以下方式给药：口服、经鼻、静脉内、皮下、局部、直肠、肠胃外、肌肉内、脑池内、阴道内、腹膜内、鞘内、血管内、局部(粉末、软膏或滴剂)或以喷雾剂或吸入剂的形式。
本文中所引用或参考的所有文件(“本文引用的文件”)，以及在本文引用的文件中所引用或参考的所有文件，以及任何制造商的说明书、描述、产品说明书及本文提到的任何产品的产品说明书或或在通过引用并入本文的任何文件中，在此通过引用并入本文中，且可用于本发明的实践中。更具体地，所有引用的文件皆以引用的方式并入，如同各个单独的文件被具体地及单独地指出以引用的方式并入。
附图说明
在说明本发明的实施例的附图中，其中相似的附图标记表示在各个视图中的对应部分。
图1显示用于合成包括诸如脱氧核酶(DNAzyme)的催化活性DNA的寡核苷酸的示意图。
图2描绘一般固相亚磷酰胺(phosphoramidite)合成循环。
图3描绘根据本发明的方法(X48179K1K2)所制备的脱氧核酶与根据现有技术的方法所制备的脱氧核酶的多个批次的批次比较。
图4显示通过现有技术的方法所制备的hgd40的多个批次的杂质的变化。
具体实施方式
本发明涉及一种寡核苷酸的生产方法，例如规模化生产，所述寡核苷酸例如催化活性DNA分子，诸如脱氧核酶(DNAzyme)。所述方法包括在合成步骤的期间使用活化剂，所述活化剂例如有机供质子活化剂及亚酰胺，例如溶解在干燥的单极性有机溶剂例如乙腈中。此外，所述方法包括在30℃至45℃的温度下进行5小时至20小时的去保护步骤。
本发明的极大优点是诸如催化活性DNA分子的寡核苷酸的制备，所述催化活性DNA分子例如包含显着减少的杂质的脱氧核酶(DNAzyme)。本发明的杂质例如是第IV类杂质。第IV类杂质的总和<12wt％，例如在以下的范围内：0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％或0.9wt％至4.5wt％、1wt％至4wt％、1.2wt％至3.8wt％、1.4wt％至3.6wt％、1.5wt％至3.5wt％、1.6wt％至3.4wt％、1.7wt％至3.2wt％、1.8wt％至3wt％、2wt％至2.5wt％或最大。0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1wt％、1.2wt％、1.5wt％、1.7wt％、1.9wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％、3.5wt％、4wt％或4.5wt％指的是在液相色谱中的主产物峰之前及之后洗脱的所有第IV类杂质的总和。
关键的第IV类杂质对氢键诱导的沃森-克里克(Watson-Crick)与靶分子结合很重要的官能团进行修饰及阻断。因此，此种第IV类杂质的减少直接产生催化活性DNA分子的靶特异性增加。其使寡核苷酸的催化活性持续增加，导致寡核苷酸在其治疗应用中的(潜在)剂量减少。此外，通过本发明的方法所获得的催化活性DNA分子显示出改进的靶相互作用，例如与其受质的结合，其特征在于改进的动力学。
根据寡核苷酸安全委员会(oligonucleotide safety working group,OSWG)，寡核苷酸治疗剂中的杂质分为四类：第I至III类不被视为关键杂质，无需在毒理学研究中进行额外的评估。第IV类杂质因其非天然来源而被定义为关键杂质，因此需要对其毒理学特性进行评估。官方分类如表1所示：
Figure BDA0003635400600000061
表1：杂质分类，OSWG出版物，卡帕尔迪等人，NAT 2017
第1类杂质对制程相关的杂质进行分类，此等杂质亦是亲本分子的主要代谢物，即在3’-端或5’-端处的一个核苷酸的核酸内切的缺失(endonucleolytic loss)；或偶联物或连接子(linker)的缺失。由于此等杂质在结构上与主要代谢物相同，因此此等杂质将预设通过毒理学研究进行鉴定。
第2类杂质对制程相关的杂质进行分类，此等杂质包含结构元素，所述结构元素是天然存在于核酸中，但仍代表修饰的亲本化合物，即在硫代磷酸酯寡核苷酸(phosphorothioate oligonucleotide)中的磷酸二酯杂质或5-甲基胞嘧啶降解为胞嘧啶。此种结构元素的内源性存在排除与杂质相关的固有安全性顾虑。
第3类杂质对制程相关的杂质进行分类，此等杂质不同于在分子序列的碱基上的亲本分子，即(n-1)、(n-x)、(n+1)及(n+x)或胸腺嘧啶脱氨为胞嘧啶。由于序列改变或免疫刺激基序的产生，此类特定杂质的安全性顾虑将仅限于不太可能的脱靶效应(off-targeteffect)。在治疗性反义方法中，任何特定修饰序列的水平皆太低而无法产生药理作用。
第4类杂质对制程相关的杂质进行分类，此等杂质具有在亲本分子或天然核酸中未发现的结构元素，即碱基修饰或主链修饰的部分，例如CNET(T-碱基的丙烯腈加合物)、去嘌呤物质、起始材料相关的修饰或转氨基(C-碱基的甲基加合物)物质。倘若规范限制高于验证阈值(qualification threshold)，则应在非临床毒理学研究中评估第4类杂质的安全性。
不同杂质的含量及性质通过紫外线检测的色谱分离及连续的高解吸(high-resolution)质谱分析来确定。之后，各个已识别的杂质与制备过程的相应单元操作直接相关。
由于治疗性寡核苷酸的高纯度是必要的，因此治疗性寡核苷酸的制备过程应避免形成大量的杂质，例如关键的第IV类杂质。
以下将更详细地描述本发明的元素。此等元素与特定的实施例一起列出，然而，应该理解其可以任何方式及任何数量组合，以建立附加的实施例。各种描述的实例及实施例不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施例。此描述应被理解为支持及涵盖将明确描述的实施例与任何数量的公开元素组合的实施例。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的元素的任何排列及组合皆应被认为是由本申请的描述所公开的。
在整个说明书及权利要求书中，除非上下文另有要求，否则“包括(comprise)”一词以及诸如“包括(comprises)”及“包括(comprising)”之类的变体将被理解为暗示包含所述构件、整数或步骤或多个构件组、多个整数或多个步骤，但不排除任何其他的构件、整数或步骤或多个整数或多个步骤。除非本文另有说明，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)所使用的术语“一(a)”及“一(an)”及“所述(the)”以及类似的指称词将被解释为涵盖单数及复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。本文中数值范围的列举仅意在用作单独引用落入所述范围内的各个单独值的简写方法。除非在本文中另有说明，否则各个单独的值皆包含在说明书中，如同其在本文中被单独引用。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法皆可以任何合适的顺序执行。本文中所提供的任何及所有的实例或示例性语言(例如，“诸如(such as)”、“例如(for example)”)的使用仅旨在更佳地说明本发明，且不对本发明额外要求保护的范围构成限制。说明书中的任何语言皆不应被解释为指示对本发明的实施必要的任何未要求保护的元素
通常，包括诸如脱氧核酶(DNAzyme)的催化活性DNA分子的寡核苷酸的合成是通过依序固相化学进行的，所述固相化学采用成熟的磷酸二酯或亚磷酸三酯步骤准则，分别使用诸如H-膦酸酯(H-phosphonate)的单体结构嵌段及亚磷酰胺结构嵌段。全自动合成过程是使用市售的计算机控制的DNA合成仪器和及流通式固定床或分批式搅拌床的技术进行。对于正在进行的制程的制程控制及在线监控，合成器(synthesizer)包含在线紫外线、压力及电导率检测器。
简言之，此等方法包括固体载体，所述固体载体使用氨基及/或羟基部分及连接子分子进行功能化，所述固体载体例如固体载体树脂，随后锚定寡核苷酸的最3’-端的核苷。通过受控的化学反应，通过逐步添加相应的核苷酸残基，将所需的寡核苷酸序列依序地组装，例如合成组装在固体载体上。催化活性DNA分子例如根据亚磷酰胺(phosphoramidite)或H-膦酸酯(H-phosphonate)化学以依序的方式进行合成组装。
核苷间键(inter-nucleoside linkage)是在进入核苷的3’-官能团与固相载体结合的寡核苷酸的相应5’端-核苷的高反应性5’-羟基之间形成。在亚磷酰胺(phosphoramidite)方法中，所述核苷间键是受保护的亚磷酸三酯部分，而在H-膦酸酯(H-phosphonate)方法中，其是H-膦酸酯磷酸二酯部分。
现有技术的固相载体树脂被用作合成寡核苷酸的起点，所述寡核苷酸包括本发明的诸如脱氧核酶(DNAzyme)的催化活性DNA分子(例如hgd40)。固相碱基材料可为有机(聚合物)或无机性质，即可控孔玻璃(controlled pored glass,CPG)。
在固相合成过程中用作单体合成子(monomeric synthon)的2’-脱氧-亚磷酰胺(2’-deoxy-phosphoramidite)携带例如在核糖的5’-羟基官能团上的酸不稳定保护基团，例如4,4’-二甲氧基三苯甲基(4,4’-dimethoxytriphenylmethyl,DMT)基团，以及在3’-O-(N,N)-二烷基-亚磷酸三酯(3’-O-(N,N)-dialkyl-phosphite triester)基团上的碱基不稳定保护基团，例如β-氰乙基(β-cyanoethyl,C-NEt)。
三种核碱基腺嘌呤、胞苷及鸟嘌呤的潜在反应性外环氨基官能团(reactiveexocyclic amino function)例如分别被碱基不稳定的酰基保护，以防止在合成过程中不希望得到的的副反应及杂质形成；胸苷并不具有外环氨基功能(exocyclic aminofunction)，因此无需任何核碱基保护。
在合成中的缩合反应期间的第一步，(N,N)-二异烷基基团((N,N)-diisoalkyl-group)使用有机质子供体活化剂(organic proton-donating activator)进行质子化，例如，诸如布朗斯台德酸(
Figure BDA0003635400600000101
Acid)的弱有机酸，通常为四唑或四唑衍生物，例如苄硫基四唑/5-(苄硫基)-1H-四唑(benzylthiotetrazole,BTT、5-(benzylmercapto)-1H-tetrazole,BMT)、二氰基咪唑(dicyanoimidazole,DCI)及/或5-(乙硫基)-1H-四唑(5-(ethylthio)-1H-tetrazole,ETT)。此种亲核攻击(nucleophilic attack)在进入的单体与活化剂之间形成例如四唑盐(tetrazolide salt)，作为高反应性中间体，其完成在载体结合的寡核苷酸链的游离5’-羟基的缩合反应。
在固相合成过程中用作单体合成子(monomeric synthon)的2’-脱氧-H-磷酸酯单酯(2’-deoxy-H-phosphonate monoester)在核糖的5’-羟基官能团上带有酸不稳定的保护基团，例如4,4’-二甲氧基三苯甲基(4,4’-dimethoxytriphenylmethyl,DMT，二甲氧基三苯甲基(dimethoxytrityl)基团。无需磷酸盐保护基团。
寡核苷酸例如在线性、多步骤固相合成中组装，且在此过程中不分离中间体。
诸如催化活性DNA分子的寡核苷酸的合成循环起始于倒置的脱氧胸苷3’-核苷(inverted deoxy-thymidine 3’-nucleoside)，例如4,4’-二甲氧基三苯甲基(4,4’-dimethoxytriphenylmethyl,DMT)在3’-羟基官能团处受到保护，并例如通过5’-羟基功能及通过碱基不稳定的琥珀酰基连接子(base-labile succinyl linker)。在此核苷上，将序列中的下一个核苷酸偶联，之后通过逐步添加核苷酸残基，以将诸如催化活性DNA分子的寡核苷酸的序列连续的3’→5’延伸。
添加一核苷所需的所有试剂例如根据定义的及计算机控制的合成配方通过柱进行传递。如图1所示，各个耦合循环是由以下四个主要化学步骤所组成。
在各个主要步骤之间，例如进行乙腈洗涤步骤，以去除过量的反应物及反应副产物。寡核苷酸通过在生长链的高反应性5’-OH-末端添加3’-亚磷酰胺而延长。重复合成循环直至根据催化活性DNA分子的编程核苷酸序列完成全长寡聚体的合成为止。
在寡核苷酸合成之后，发生此种寡核苷酸的裂解及去保护。在催化活性DNA分子合成的最后脱三苯甲基化步骤之后，例如通过使连接载体的寡核苷酸与二乙胺在乙腈中的溶液反应，以去除桥连磷酸三酯键的β-氰乙基保护基团。所述β-氰乙基去保护步骤同样在合成器上以受控方式进行。
在完成DEA处理后，例如将柱从合成器中取出，并且例如通过诸如氮气或氩气的惰性气体干燥所包含的固体载体。随后，寡核苷酸通过使用在乙醇中的浓氨来裂解碱基不稳定的琥珀酰连接子，并从固体载体上释放出来。之后在诸如水或乙醇的合适的溶剂中，任选地在升高的温度下，例如在介于20℃与70℃之间、介于25℃与65℃之间、介于30℃与60℃之间、介于35℃与55℃之间或介于40℃与50℃的范围内，将固相从柱中除去，且寡核苷酸从固相载体连续释放，例如通过用碱来裂解碱基不稳定的琥珀酰基连接子，所述碱例如浓氨或乙胺或其混合物(氨甲胺)(ammonia methylamine,AMA)。较高的温度会加快反应速度，但亦会增加包括催化活性DNA，例如hgd40在内的寡核苷酸的化学修饰或降解的速率，从而导致产生无需的杂质。
此种处理亦裂解碱基不稳定的核碱基保护基团(base-labile nucleobase-protection group)。例如通过过滤除去剩余的固体载体珠粒(bead)之后，粗产物将在各自的去保护溶液，例如氨溶液中获得。或者，例如以流通(flow through)方式进洗涤所述去保护溶液，例如在例如室温下通过柱10至120分钟、15至90分钟或30至60分钟，以释放介于寡核苷酸和与固相珠粒之间的连接子。之后将所述寡核苷酸释放至溶液中，且将此种含有此寡核苷酸的溶液任选地转移至去保护步骤，例如在去保护容器中，并且例如通过加热溶液来去保护。合成完成后，可通过本发明的方法所获得的催化活性DNA分子，例如，如脱氧核酶(DNAzyme)是从固相载体树脂上裂解下来，并且使用碱性水溶液连续除去核碱基及主链保护基团。温度例如升高至30℃至45℃，并持续例如5至20小时。
本发明的寡核苷酸的制备过程以例如纯化及分离的程序结束。裂解及去保护后所获得的含全长寡核苷酸的粗溶液包含多种与产品及制程相关的杂质，例如失效序列(failure sequences)(n-1种类，短链)、带有额外碱基的序列(n+x种类，长链)、分别来自保护基团的不完全裂解的化学修饰产物及碱基修饰的化合物。此外，在酸性去三苯甲基化步骤期间，可能会发生核苷酸的脱嘌呤作用，并导致产生无碱基(abasic)产物，缺少一个或多个嘌呤碱基。利用碱性水溶液处理后，例如在氨裂解过程中，此等无碱基产物部分降解为较短的(n-x)-片段。
此等潜在杂质中的任何一者皆可在纯化过程中分离，例如通过诸如离子交换(ionexchange,IEX)液相色谱法的液相色谱法。例如，在根据本发明的用于制备催化活性DNA分子的方法中，除了液相色谱法及脱盐，以及任选的冷冻干燥之外，催化活性DNA分子的任何进一步纯化步骤及/或分离步骤被排除在外。
从裂解过程中所获得的4,4’-二甲氧基三苯甲基去除(DMT-off)粗产物例如被稀释，并以规定的浓度加载至填充有强阴离子交换树脂的色谱柱上。通过碱性水溶液中的氯化钠梯度实现全长产物与副产物的分离。在梯度分离过程中，收集含有寡核苷酸的流出液的分馏物，并通过UPLC-MS进行连续分析。
之后将满足给定的规格标准的分馏物合并，并通过IEX-HPLC再次分析，以确认合并的结果。
此等合并的分馏物含有来自梯度洗脱的过量盐，例如进行切向流过滤(tangential flow filtration,TFF)。倘若必要，在缓冲液更换步骤期间调节溶液的pH值，之后将过滤及浓缩的产品进行冷冻干燥，以得到最终的活性药物成分(activepharmaceutical ingredient,API)，其为无定形粉末或饼状。收集活性药物成分(API)，且最终储存在-20℃的带有螺旋盖
Figure BDA0003635400600000132
的无菌HDPE瓶中。
Figure BDA0003635400600000131
Figure BDA0003635400600000141
表2：相较于根据本发明的新制程，hgd40批次的产品纯度及杂质水平前产物峰及后产物峰。
由于选择现有技术的合成及去保护条件，所述制备过程产生大量的乙氧基缩醛改性的脱嘌呤物质作为杂质。通过UPLC-MS分析所检测到的其他与制程相关的杂质是较长碱基且不完全去保护的物质，即在G碱基处仍含有异丁酰基(isobutyryl,ibu)保护基团的寡核苷酸(参见图2)。
大多数的此等杂质对于脱氧核酶(DNAzyme)活性所需的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对有直接的负面影响，因此可能会降低产物的活性。此外，此等杂质会降低最终纯化的活性药物成分(active pharmaceutical ingredient,API)的产量。此外，所述制程的整体生产率很低，导致活性药物成分价格昂贵。
Figure BDA0003635400600000142
Figure BDA0003635400600000151
表3：详细分析显示相较于根据本发明的新制程的四种最主要的制程相关的杂质。
从表3中可以看出，在各批次中皆会产生大量(2.12％至8.53％)的乙氧基缩醛杂质。此种杂质在高温(55℃)下使用乙醇氨溶液的裂解及去保护步骤中产生，且显然与制程相关。所述杂质在HPLC纯化过程中难以去除，且无法形成沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对，从而降低诸如脱氧核酶(DNAzyme)的催化活性DNA分子的活性。
G-核碱基上残留的异丁酰基保护基(isobutyryl,ibu)可在各批次中检测到介于0.00％与4.94％之间的水平。此种杂质与氨处理期间的G-核碱基的不完全去保护有关。在HPLC纯化过程中难以去除并阻断沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对，从而降低诸如脱氧核酶(DNAzyme)的催化活性DNA分子的活性。
所述(n+1)杂质表示在分子中的随机位置处的具有一个附加碱基的杂质的异质基团。根据分子内的位置，额外的碱基可能会分散诸如脱氧核酶(DNAzyme)的催化活性DNA分子与靶mRNA的适当结合，从而降低活性。双偶联是由于不受控制的偶联反应而发生的。在所有的批次中，其含量皆介于0.78％与2.14％之间。在纯化过程中，杂质在主峰附近洗脱，且难以去除。
所述(n-1)杂质表示在分子中的随机位置处缺少一个碱基的杂质的异质基团。根据分子内的位置，缺失的碱基可能会分散诸如脱氧核酶(DNAzyme)的催化活性DNA分子与靶mRNA的适当结合，从而降低活性。缺失的碱基可能与引入碱基的不完全偶联(未优化的偶联条件)或在去三苯甲基化步骤期间的不完全氧化作用及相关的链裂解有关。在所有的批次中，其含量皆介于0.57％与4.96％之间。在纯化过程中，杂质在主峰附近洗脱，且极难去除。
用此制程所获得的粗产率(纯化前)在介于2.57gm/mmol与3.41gm/mmol之间的合成规模检测。由于诸如脱氧核酶(DNAzyme)hgd40的催化活性DNA分子的分子量为10603Da，因此理论产量为10.6gm/mmol合成规模，纯化前观察到的产量是介于24.25％与32.17％之间。在纯化与下游过程中，预计还会有50％的产率损失。因此，计算总产率是介于12.13％与16.85％之间。
通过高解析(high-resolution)UPLC-MS对所有可用的脱氧核酶(DNAzyme)hgd40-批次进行深入分析之后，优化相关的各个制程步骤，以最大限度地减少与制程相关的杂质负载。
Figure BDA0003635400600000161
Figure BDA0003635400600000171
表4：根据现有技术于2013年所制备的单一批次(临床批次2)的示例性高解析杂质分布。RRT是“相对滞留时间(relative retention time)”的缩写，FLP是“全长产品(fulllength product)”的缩写，ID是“识别(identification)”的缩写。
上表4描述hgd40批次#200293纯化后的示例性杂质分布，所述批次#200293于2013年使用本发明的既定制备方法进行制备。如表2所示，此批次以83.75％的纯度释出，粗产率为例如4.77gm/mmol合成规模。由于hgd40具有10603Da的分子量，因此具有例如10.6gm/mmol合成规模的理论产率，因此在纯化前观察到的产率计算为例如45.00％。前产物杂质峰计算为5.31％，后产物杂质峰加起来为8.94％。分子释出时的最终产率计算为例如2.47gm/mmol或以理论产率计算为23.30％。
本发明的方法是基于前述的任何方法，但显着地减少甚至消除杂质，例如(n+1)杂质、(n-1)杂质或其组合。可通过本发明的方法所获得的诸如脱氧核酶(DNAzyme)的催化活性DNA分子包括显着减少的总杂质，例如<20％、<15％、<12％、<10％或<5％范围内的总杂质指通过诸如分析型HPLC或FPLC的液相色谱在主产物峰之前及之后洗脱的所有杂质。
催化活性DNA分子的减少的杂质不仅改善例如催化活性，而且改善催化活性DNA分子的受质结合，即催化活性DNA分子与其受质的相互作用。相较于现有技术的催化活性DNA分子，此等改善例如导致催化活性DNA分子的效力提高。
本发明的方法包括例如可控孔玻璃(controlled pore glass,CPG)或大孔聚苯乙烯(macro-porous polystyrene,MPPS)作为寡核苷酸合成中的聚合树脂。树脂负载例如在10至500μmol/gm、50至450μmol/gm、100至400μmol/gm、150至350μmol/gm、200至300μmol/gm或60至120μmol/gm的范围内。
任选地，本发明的方法包括使用活化剂及/或亚酰胺。所述活化剂是例如诸如有机酸的酸，例如诸如四唑或其衍生物的有机布朗斯台德酸(
Figure BDA0003635400600000181
Acid)，例如乙基硫代四唑(ethylthiotetrazole,ETT)、苄基硫代四唑(benzylthiotetrazole,BTT/BMT)或二氰基咪唑(dicyanoimidazole,DCI)，其例如溶解于干燥的单极性有机溶剂，例如乙腈。诸如布朗斯台德酸(
Figure BDA0003635400600000182
Acid)的活化剂可包括诸如碱性化合物的添加剂，例如N-甲基咪唑(N-methyl imidazole)，例如浓度为0.05M至0.2M。诸如四唑或其衍生物的活化剂，例如乙基硫代四唑(ethylthiotetrazole,ETT)、苄基硫代四唑(benzylthiotetrazole,BTT/BMT)或二氰基咪唑(dicyanoimidazole,DCI)的浓度例如为0.1M至1M、0.2M至0.8M、0.3M至0.6M或0.5M。亚酰胺浓度例如为0.1M至0.25M。亚酰胺例如溶解在干燥的诸如乙腈的单极性有机溶剂中。亚酰胺当量例如为0.5eq至5.0eq、1.0eq至4.0eq、1.5eq至3.5eq或1.2eq至3.0eq。本发明的方法中的活化剂：亚酰胺的比例例如为10：90、20：80、30：70、40：60、50：50、60：40、70：30、80：20或90：10，或10：90至90：10、20：80至80：20、30：70至70：30、40：60至60：40或50：50至70：30。
任选地，本发明的方法进一步使用封端试剂(capping reagent)，例如诸如乙酸酐的酸酐，例如溶解在干燥的诸如乙腈的单极性有机溶剂中。诸如乙酸酐的酸酐的量例如为3％至100％、5％至50％、10％至40％、20％至30％或10％至30％。
在裂解及去保护步骤中，例如使用诸如浓氨水溶液的碱性水溶液。裂解及去保护步骤的持续时间为例如1小时至24小时、5小时至20小时、10小时至15小时或8小时至16小时。裂解及去保护步骤的温度为例如10℃至60℃、15℃至55℃、20℃至50℃、30℃至45℃或35℃至40℃。
在本发明的纯化步骤中所使用的纯化树脂是例如使用强阴离子交换基团修饰的多孔亲水聚合物珠粒。此种聚合物的一个实例是TSKGel SuperQ 5PW20。
在纯化步骤中，例如使用两种不同的缓冲剂，所述缓冲剂例如碱金属氢氧化物，如单独的氢氧化钠或碱金属氢氧化物与碱金属卤化物的组合。第一缓冲液包括或由以下所组成：例如在水中的1mM至30mM、5mM至25mM、10mM至20mM或5mM至25mM氢氧化钠；第二缓冲液包括或由以下所组成：例如1mM至30mM、5mM至25mM、10mM至20mM或5mM至25mM氢氧化钠水溶液及0.5至2.0NaBr、1.0至1.8NaBr或1.5NaBr。
所有上述参数可分别以不同的量及浓度相互组合。
在本发明的方法中所使用的材料及方法步骤的实例与现有技术常用的方法中所使用的材料及方法步骤的比较如下表5所示：
Figure BDA0003635400600000191
Figure BDA0003635400600000201
表5：比较现有技术方法的CPP与本发明的方法的CPP
上述及列出的所有过程变化皆是DNA合成的关键制程参数(critical processparameter,CPP)，可直接与观察到的杂质谱相关联，如表4及表5所示。
可通过本发明的方法所获得的本发明的催化活性DNA分子是例如针对GATA-3的脱氧核酶(DNAzyme)。所述脱氧核酶(DNAzyme)的序列例如选自WO 2005/033314的序列hgd1至hgd70(参见WO 2005/033314的图3)，特别是选自序列hgd11、hgd13、hgd17及hgd40，更特别地是hgd40(5'-GTGGATGGAGggctagctacaacgaGTCTTGGAG；SEQ ID NO：1)，即脱氧核酶(DNAzyme)包括此等序列或由此等序列所组成。
脱氧核酶(DNAzyme)“hgd40”包括或由例如34个碱基所组成，其序列为5'-GTGGATGGAGggctagctacaacgaGTCTTTGGAG。3’区域及5’区域的9个碱基形成两个结合域(bindingdomain)，其高度特异性地结合GATA-3的靶mRNA。所述分子的中心核心代表催化结构域，所述催化结构域负责在hgd40与GATA-3mRNA结合后对靶标进行裂解。药品物质hgd40的特点在于通过吸入给药的部位具有高生物活性及生物利用度。
本发明的诸如脱氧核酶(DNAzyme)hgd40的催化活性DNA分子例如是包含在制剂中，所述制剂可通过口服、经鼻、静脉内、皮下、局部、直肠、肠胃外、肌肉内、脑池内、阴道内、腹膜内、鞘内、血管内、局部(粉末、软膏或滴剂)或以喷雾剂或吸入剂的形式。根据需要，活性成分例如在无菌条件下与生理上可接受的赋形剂及可能的防腐剂、缓冲剂或推进剂进行混合。
脱氧核酶(DNAzyme)hgd40是例如包含在用于吸入的制剂中或溶解在PBS中。
可通过本发明的方法所获得的诸如脱氧核酶(DNAzyme)的催化活性DNA分子用于预防及/或治疗GATA-3衍生的疾病、病症或症状的方法中。此类疾病、病症或症状是其中相较于在细胞中的正常水平，GATA-3在细胞中上调的任何疾病、病症或症状。所述细胞是任何表达GATA-3的细胞，例如免疫细胞。GATA-3的上调例与导致例如疾病、病症或症状爆发的病理过程的开始、影响及/或升级相关。此种疾病是例如第2型炎症或疾病，例如TH-2驱动的疾病、病症或症状。特别地，所述第2型炎症或疾病是例如第2型哮喘，诸如第2型高度哮喘(type-2-high-asthma)。
实例：
以下的实例说明本发明的不同的实施例，但本发明不限于此等实例。
实例1：小规模单批次的高解析杂质谱的制备
用本发明的方法所获得的hgd40脱氧核酶(DNAzyme)的粗产率(纯化前)以5.91gm/mmol合成规模进行检测。由于hgd40的分子量为10603Da，因此理论产率为10.6gm/mmol合成规模，纯化前所观察到的产率计算为55.75％(相较于之前的制程增加9.75％)。在纯化及下游过程中，观察到67.8％的产率。预产物杂质峰计算为5.70％(+0.39％)，后产物杂质峰加起来为4.02％(-4.92％)。由于制程变化，两种杂质(乙缩醛及异丁酰改性)完全消失，且检测到低百分比(CNET)的一种新杂质。因此，总产率计算为37.5％(相较于之前的制程增加14.20％)。
表6显示使用本发明的方法于2019年所制备的小规模单批次的示例性高解析杂质谱：
Figure BDA0003635400600000221
实例2：裂解分析
脱氧核酶(DNAzyme)hgd40的活性基于溶液中的结构形成，因此功能分析法可用于确定靶向功效。因此，开发一种功能性体外裂解分析来监控不同的hgd40批次的时间依赖性裂解活性。
Hgd40具有一个中央的23个碱基的催化结构域，两侧是GATA-3mRNA特异性的五核苷酸(nucleotide,nt)长的结合臂。综合设计及制备作为分析靶点的与hgd40的内源性mRNAGATA-3靶区域相对应的40nt RNA序列。所述40nt RNA将被hgd40特异性切割为17nt及23nt片段。此等片段可通过变性HPLC良好地分离。通过变性离子对反相高效液相色谱(ion-pairing reversed-phase high-performance liquid chromatography,IP-RP-HPLC)在不同的时间点分析hgd40的裂解动力学。
图3显示总共五个批次的裂解分析。批次X48179K1K2已根据本发明的方法制备；批次138976、158602、200293、257848已根据现有技术的方法制备。结果已针对溶液中的hgd40含量进行标准化，并呈现于下表7中。
Figure BDA0003635400600000231
Figure BDA0003635400600000241
表7：裂解分析的结果
表7表明根据本发明的方法所制备的hgd40相较于其他的批次最初具有更高的活性。活性的增加与40个碱基(40mer)裂解模板的减少是直接相关。本发明的方法显示在9.02％与17.68％之间的初始较高活性。随着时间的推移，随着模板被缓慢消化，本发明的方法在25分钟至30分钟及现有技术的方法在35分钟时达到平台期(plateau)，因此数量减少。根据本发明的方法所制备的Hgd40显示相较于旧的批次更快的裂解动力。
实例3：关键制程相关杂质的测试
根据现有技术的方法，在2009年至2017年间制备八批次的hgd40，并测试关键制程相关的杂质的水平(参见表8)。2019年根据本发明的方法制备一批次的hgd40。
不同杂质的水平及性质通过紫外线(UV)检测的色谱分离及连续的高解析质谱分析来确定。各个标识皆与制备过程的各个单元操作直接相关。
通过比较根据现有技术的方法所制备的九个不同的hgd40批次的分析结果，监控关键杂质的量，并直接与根据本发明的方法所制备的hgd40批次的杂质进行比较。本发明的方法导致显着较低量的关键第IV类杂质及较高的寡核苷酸的产率。如表8所示，现有技术的方法产生可检测的范围内的关键杂质。供应1的批次hgd40(批号X48179K1K2)是根据本发明的方法所生产的，显示杂质含量低至0.96wt％，而通过根据现有技术的方法所生产的供应2的所有其他批次hgd40的杂质大约介于5wt％与15wt％之间。只有当供应2的批次hgd40进行深度纯化(批号255603及164154)时，杂质才会减少至大约2.5wt％至3.75wt％。在生产hgd40批次后的纯化步骤需要大量的时间及材料。同时，寡核苷酸的产率降低。
Figure BDA0003635400600000251
表8总结各个批次中所包含第IV类杂质的百分比。除了2019年的批次之外，所有的批次皆由供应2制造；2019年的批次X48179K1K2是通过供应1根据本发明所制备。
表的左侧所列出的所有第IV类杂质的百分比皆通过高解析粗制(未经纯化)寡核苷酸产品进行检测。相较之下，表8的右侧的两个批次显示高纯度的参考材料。批次号码255603的参考材料已从批次号码254936中纯化出来，日期为2017年；批次号码164154的参考材料已从批次号码161713中纯化出来，日期为2011年。
通过先前的制备所产生的关键第IV类杂质介于4.86％(批次161713，2011年)与15.08％(批次257848，2018年)的范围之间。如同纯化的参考材料批次的分析所证明，此等杂质可被纯化出来，但确实会降低整体合成产率。在最初的实验中，新开发的制程仅将第IV类杂质提高至0.96％。表9描绘使用根据现有技术的方法的粗活性药物成分((activepharmaceutical ingredient,API)的典型杂质谱；表10描绘通过本发明的方法所产生的寡核苷酸的杂质谱。第IV类杂质仅在进行化合物特定性高解析分析LC-MS方法之后方能被检测到。
图4显示通过表8所列的现有技术的方法所制备的hgd40批次的杂质的变化。
在下一步中，如表9所示，进一步研究通过现有技术的方法所制备的hgd40批次的杂质，以确定杂质的类型：
Figure BDA0003635400600000261
Figure BDA0003635400600000271
表9：在通过现有技术的方法生产的寡核苷酸中所观察到的杂质的类型。关键的第IV类杂质以粗体字突出显示。
亦分析通过根据本发明的方法所生产的寡核苷酸中的杂质的类型，并在表10中进行描述。此等杂质皆不属于被定义为关键的第IV类杂质，因为其非天然来源，因此需要对其毒理学特性进行评估。
Figure BDA0003635400600000281
Figure BDA0003635400600000291
Figure BDA0003635400600000301
表10：通过本发明的方法所产生的寡核苷酸的杂质的类型。关键的第IV类杂质以粗体字突出显示。

Claims (15)

1.一种用于制备催化活性DNA分子的方法，其特征在于：所述方法包括步骤：
(a)在载体上合成所述催化活性DNA分子，其中包含核碱基保护基团的多个核苷酸以从3’-端到5’-端的顺序方式进行组装，或使用有机质子供体活化剂的混合物从3’-端到5’-端的顺序方式进行组装，所述有机质子供体活化剂例如0.2M至0.45M四唑或其衍生物及单体结构嵌段亚酰胺，所述衍生物例如乙基硫代四唑、苄基硫代四唑或二氰基咪唑，
(b)合成完成后，在30℃至45℃的温度下，将所述催化活性DNA分子从所述载体上切割下来，及将所述核碱基及/或多个主链保护基团从所述催化活性DNA分子上切割下来，持续5小时至20小时，
(c)通过液相色谱法及脱盐纯化所述催化活性DNA分子，以及
(d)任选地通过冷冻干燥分离所述催化活性DNA分子，
其中所述催化活性DNA分子的任何进一步纯化步骤或分离步骤被排除在外。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述载体是固体载体，例如可控孔玻璃或大孔聚苯乙烯。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述核碱基及/或主链保护基团是碱基不稳定的酰基。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：所述核苷酸进一步包括位于5’-羟基的4,4’-二甲氧基三苯甲基基团、位于3’-亚磷酸酯基的β-氰乙基或其组合。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于：所述活化剂为0.2M至0.45M四唑或其衍生物，例如乙基硫代四唑、苄基硫代四唑、二氰基咪唑或其组合。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于：所述活化剂：亚酰胺的比例为50：50至70：30。
7.如权利要求1至4中任一项所所述的方法，其特征在于：所述催化活性DNA分子是脱氧核酶。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述脱氧核酶是hgd40，所述hgd40包括SEQID NO.1(5’-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG)。
9.一种通过如权利要求1至4中任一项所述的方法所获得的催化活性DNA分子，其特征在于：所述催化活性DNA分子包括在0.1wt％至4.5wt％的范围内的总杂质，所述总杂质指的是在液相色谱法中，于主产物峰之前及之后洗脱的所有杂质的总和。
10.如权利要求9所述的催化活性DNA分子，其特征在于：所述催化活性DNA分子是脱氧核酶，例如针对GATA-3的脱氧核酶。
11.如权利要求9或10所述的催化活性DNA分子，其特征在于：所述脱氧核酶是hgd40，所述hgd40包括SEQ ID NO.1(5’-GTGGATGGAGggctagctacaacgaGTCTTGGAG)。
12.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包括如权利要求9至11中任一项所述的催化活性DNA分子的及药学上可接受的载体。
13.一种如权利要求9或11中任一项所述的催化活性DNA分子或如权利要求12所述的药物组合物的用途，其特征在于：所述催化活性DNA分子或所述药物组合物是用于预防及/或治疗患有GATA-3衍生的疾病的人类患者的方法。
14.一种如权利要求12或13所述的药物组合物或如权利要求9至11中任一项或13所述的催化活性DNA分子用于预防及/或治疗患有第2型哮喘的人类患者的方法的用途，其特征在于：所述人类患者的(i)血液嗜酸性粒细胞的计数为3％或更多，特别是4％或更多，更特别是5％或更多；及/或(ii)血嗜酸性粒细胞的计数为每公升具有350x106个血嗜酸性粒细胞或更多，特别是每公升具有450x106个血嗜酸性粒细胞或更多；及/或(iii)呼气的一氧化氮的分数为35ppb或40ppb或更高。
15.如权利要求13或14所述的催化活性DNA分子或药物组合物，其特征在于：所述催化活性DNA分子或所述药物组合物是经由以下方式给药：口服、经鼻、静脉内、皮下、局部、直肠、肠胃外、肌肉内、脑池内、阴道内、腹膜内、鞘内、血管内、局部(粉末、软膏或滴剂)或以喷雾剂或吸入剂的形式。
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