KR20220113675A - 개선된 활성을 갖는 촉매 활성 dna 분자의 제조 방법 및 천식의 치료 방법에서의 이의 용도 - Google Patents

개선된 활성을 갖는 촉매 활성 dna 분자의 제조 방법 및 천식의 치료 방법에서의 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20220113675A
KR20220113675A KR1020227014938A KR20227014938A KR20220113675A KR 20220113675 A KR20220113675 A KR 20220113675A KR 1020227014938 A KR1020227014938 A KR 1020227014938A KR 20227014938 A KR20227014938 A KR 20227014938A KR 20220113675 A KR20220113675 A KR 20220113675A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
catalytically active
dna molecule
active dna
impurities
dnazyme
Prior art date
Application number
KR1020227014938A
Other languages
English (en)
Inventor
토마스 루프
Original Assignee
스터나 바이올로지칼스 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 스터나 바이올로지칼스 게엠베하 filed Critical 스터나 바이올로지칼스 게엠베하
Publication of KR20220113675A publication Critical patent/KR20220113675A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/127—DNAzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 촉매 활성 DNA 분자에서 유의미하게 감소된 양의 불순물을 야기하는 촉매 활성 DNA 분자의 제조 방법, 이러한 방법에 의해 수득가능한 촉매 활성 DNA 분자 및 이러한 촉매 활성 DNA 분자를 포함하는 약학적 조성물뿐만 아니라 GATA-3-유래 질환의 예방 및/또는 치료 방법에서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

개선된 활성을 갖는 촉매 활성 DNA 분자의 제조 방법 및 천식의 치료 방법에서의 이의 용도
본 발명은 촉매 활성 DNA를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 제조 방법, 이 방법에 의해 수득가능한 올리고뉴클레오티드, 이러한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물, 및 GATA-3 유래 질환의 치료 방법에서의 촉매 활성 DNA 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 적은 양의 불순물을 포함한다.
촉매 활성 DNA 분자는 단일-가닥, 합성 DNA 분자이고, 이는 자연적으로 발생되지 않는다. 촉매 활성 DNA 분자의 예는 1990년도에 개발된 안티-센스 분자의 새로운 부류를 나타내는 10-23개의 계열의 DNAzyme이다. 용어 "10-23개의 계열"은 일반적인 DNAzyme 모델을 지칭한다 (Sontoro& Joyce, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94 (1997) 4262-4266). "10-23개의 DNAzyme"로서도 지칭되는 - 10-23개의 모델의 DNAzyme은 15개의 데옥시리보뉴클레오티드의 촉매 도메인을 갖고, 이는 2개의 기질 결합 도메인에 의해 측접된다 (예를 들어 WO 2005/033314). DNAzyme의 잠재적 장점은 상대적으로 높은 안정성 및 세포내 효소에 대한 비의존성을 포함한다. 촉매 활성 DNA 분자 예컨대 DNAzyme은 예를 들어 천식의 치료와 같이 최근 치료적 응용분야가 발견되었다 (예를 들어 EP 3 093 022 B1). 촉매 활성 DNA 분자 예컨대 DNAzyme의 제조 공정은 DNA 분자의 1) 합성, 2) 절단 및 탈보호 및 3) 하류 정제 및 단리인 3개의 주요 공정 단계를 포함하거나 이로 이루어진다.
선행 기술의 선택된 합성 및 탈보호 조건으로 인하여, 제조 공정은 불순물로서 많은 양의 에톡시아세탈-개질된, 탈퓨린화된 종을 생성한다. UPLC-MS 분석에 의해 검출된 다른 공정-관련 불순물은 예를 들어 롱머 및 불완전하게 탈보호된 종, 즉, G-염기에서 이소부티릴 (ibu) 보호기를 여전히 함유하는 올리고뉴클레오티드이다 (도 2 참조).
이 불순물의 대부분은 DNAzyme 활성에 필요한 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기-쌍에 직접적인 부정적인 영향을 미치고 이에 따라 생성물의 활성을 저하시킬 수 있다. 또한, 이러한 불순물은 최종 정제된 활성 약학적 성분 (API) 수율을 저하시킨다. 게다가, 공정의 전체 생산성은 낮고 이는 고가의 API를 야기한다.
촉매 활성 DNA 분자의 이러한 생산-특이적 불순물 및 변형 예컨대 에톡시아세탈-개질된 리보오스의 후속 형성이 있거나 없는 탈퓨린화를 통한 핵염기의 손실 및/또는 핵염기의 불완전한 탈보호는 결과적으로 촉매 활성 DNA 분자의 효율을 유의미하게 감소시키는 표적 mRNA에의 촉매 활성 DNA 분자의 왓슨-크릭-결합을 유의미하게 감소시킨다. 촉매 활성 DNA 분자의 감소된 효율은 부작용의 위험 및 비용을 증가시키는 증가된 용량의 투여에 의해 보충되어야 한다.
또한, 촉매 활성 DNA 분자의 변형 및 불순물은 촉매 활성 DNA 분자와 거의 동일한 물리화학적 특성을 가지며, 이에 따라 촉매 활성 DNA 분자의 높은 손실 하에서 크로마토그래피를 통해서만 분리될 수 있다.
따라서, 각각 합리적 노력 및 합리적 비용으로 생성되는 증가된 활성 및 효율을 갖는 촉매 활성 DNA 분자와 같은 올리고뉴클레오티드의 높은 필요성이 존재한다.
본 발명의 요약
본 발명은 촉매 활성 DNA 분자 예컨대 DNAzyme의 제조 방법에 관한 것이며, 이는 하기 단계를 포함하거나 이로 이루어진다:
a) 지지체 상에서의 촉매 활성 DNA 분자의 합성 단계로서, 여기서 예를 들어 염기-분해성 아실기인 핵염기 보호기를 포함하는 뉴클레오티드는 예를 들어 0.2 내지 0.45 M 테트라졸 또는 이의 유도체 예컨대 에틸티오테트라졸 (ETT), 벤질티오테트라졸 (BTT), 다시티비티(dacitivity), 디시아노이미다졸 (DCI) 또는 이들의 조합인 유기 양성자-공여 활성제, 및 단량체성 빌딩 블록 아미다이트 (블록 포스포아미다이트)의 혼합물을 이용하여 3'-말단으로부터 출발하여 5'-말단으로 또는 3'-말단으로부터 출발하여 5'-말단으로의 순차적인 방식으로 조립되는 단계,
b) 합성의 완료 후, 5 내지 20시간 동안 30 내지 45℃의 온도에서 지지체로부터의 촉매 활성 DNA 분자 및 촉매 활성 DNA 분자로부터의 핵염기 및/또는 골격 보호기를 절단하는 단계,
c) 액체 크로마토그래피, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피를 통해 촉매 활성 DNA 분자를 정제하고 탈염시키는 단계, 및
d) 선택적으로 동결 건조를 통해 촉매 활성 DNA 분자를 단리하는 단계. 예를 들어 단계 c) 또는 단계 d)의 촉매 활성 DNA 분자의 임의의 추가의 정제 단계 또는 단리 단계는 제외된다. 활성제 및 아미다이트는 예를 들어 비 50:50 내지 70:30로 설정된다. 핵염기 및/또는 골격 보호기는 예를 들어 염기-분해성 아실기이다.
이 방법에서의 지지체는 예를 들어 고체 지지체 예컨대 제어된 기공 유리 (CPG) 또는 거대-기공 폴리스티렌 (MPPS)이다.
뉴클레오티드는 예를 들어 5'-하이드록실기에서의 4,4'-디메톡시트리틸 (DMT)기, 3'-포스파이트기에서의 베타-시아노에틸 (C-NEt) 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.
DNAzyme은 예를 들어 서열 번호 1 (5'GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG)를 포함하는 hgd40이다.
본 발명은 액체 크로마토그래피에서의 주요 생성물 피크 이전 및 이후에 용출되는, 모든 부류 IV 불순물과 같은 모든 불순물의 전체를 지칭하는 0.5 중량% 내지 12 중량%의 범위로 불순물을 포함하는 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 촉매 활성 DNA 분자를 추가로 지칭한다. 예를 들어 촉매 활성 DNA 분자는 예를 들어 GATA-3에 대한 DNAzyme이다.
본 발명의 촉매 활성 DNA 분자 또는 약학적 조성물은 예를 들어 GATA-3-유래 질환을 앓고 있는 인간 환자를 예방 및/또는 치료 방법에서의 용도이다.
본 발명의 방법에 의해 수득가능한 촉매 활성 DNA는 예를 들어 2형 천식, 예를 들어 2형 고도 천식을 앓고 있는 인간 환자의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 것이고, 여기서, 인간 환자는 (i) 3% 이상, 특히 4% 이상, 보다 특히 5% 이상의 혈액 호산구 수치; 및/또는 (ii) 350 x 106/L 이상, 특히 450 x 106/L 이상의 혈액 호산구 수치; 및/또는 (iii) 35 ppb 또는 40 ppb 이상의 호기 산화질소 농도(fractional expiratory nitric oxide)를 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 촉매 활성 DNA 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
약학적 조성물은 예를 들어 2형 천식, 예를 들어 2형 고도 천식을 앓고 있는 인간 환자의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 것이고, 여기서 인간 환자는 (i) 3% 이상, 특히 4% 이상, 보다 특히 5% 이상의 혈액 호산구 수치; 및/또는 (ii) 350 x 106/L 이상, 특히 450 x 106/L 이상의 혈액 호산구 수치; 및/또는 (iii) 35 ppb 또는 40 ppb 이상의 호기 산화질소 농도를 특징으로 한다.
촉매 활성 DNA 분자 또는 약학적 조성물은 예를 들어 경구로, 비강으로, 정맥내로, 피하로, 국소적으로, 직장으로, 비경구적으로, 근육내로, 낭내로, 질내로, 복막내로, 척수강내로, 혈관내로, 국소적으로 (분말, 연고 또는 액적) 또는 스프레이 또는 흡입제의 형태로 투여된다.
본원에 인용되거나 참조된 모든 문헌 ("본원의 인용 문헌") 및 본원에 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조사의 지침서, 설명서, 제품 사양 및 제품 시트와 함께 본원의 인용된 문헌에서, 또는 본원에 참조로 편입된 임의의 문헌에서 인용되거나 참조된 모든 문헌은 본원에 참조로 편입되며, 본 발명의 실시를 위해 이용될 수 있다. 보다 상세하게는, 모든 참조된 문헌은 각각의 개별 문헌이 참조로 편입되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로 편입된다.
도 1은 촉매 활성 DNA 예컨대 DNAzyme을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성에 대한 개략도를 나타낸다.
도 2는 일반적인 고체상 포스포아미다이트 합성 사이클을 도시한다.
도 3은 본 발명 (X48179K1K2)의 방법에 따라 제조된 DNAzyme와 선행 기술의 방법에 따라 제조된 DNAzyme의 배치 비교를 도시한다.
도 4는 선행 기술의 방법에 의해 제조된 hgd40의 배치의 불순물의 변동을 나타낸다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드 예컨대 촉매 활성 DNA 분자, 예를 들어, DNAzyme의 생산, 예를 들어 확장 가능한 생산을 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 예를 들어 합성 단계 동안 무수 비극성 유기 용매 예컨대 아세토니트릴에 용해된 활성제 예컨대 유기 양성자-공여 활성제 및 아미다이트의 용도를 포함한다. 추가로 상기 방법은 5 내지 20시간 동안 30 ℃ 내지 45 ℃의 온도에서 탈보호 단계를 포함한다.
본 발명의 큰 장점은 올리고뉴클레오티드 예컨대 촉매 활성 DNA 분자, 예를 들어, 유의미하게 감소된 불순물을 포함하는 DNAzyme의 생산이다. 본 발명의 불순물은 예를 들어, 부류 IV 불순물이다. 총 부류 IV 불순물은 액체 크로마토그래피에서의 주요 생성물 피크 이전 및 이후에 용출되는 모든 부류 IV 불순물의 전체를 지칭하는 < 12 중량% 예를 들어 0.1 중량%, 0.2 중량%, 0.3 중량%, 0.4 중량%, 0.5 중량%, 0.6 중량%, 0.7 중량%, 0.8 중량% 또는 0.9 중량% 내지 4.5 중량%, 1 중량% 내지 4 중량%, 1.2 중량% 내지 3.8 중량%, 1.4 중량% 내지 3.6 중량%, 1.5 중량% 내지 3.5 중량%, 1.6 중량% 내지 3.4 중량%, 1.7 중량% 내지 3.2 중량%, 1.8 중량% 내지 3 중량%, 2 중량% 내지 2.5 중량% 또는 최대 0.1 중량%, 0.2 중량%, 0.3 중량%, 0.4 중량%, 0.5 중량%, 0.6 중량%, 0.7 중량%, 0.8 중량%, 0.9 중량%, 1 중량%, 1.2 중량%, 1.5 중량%, 1.7 중량%, 1.9 중량%, 2 중량%, 2.5 중량%, 3 중량%, 3.5 중량%, 4 중량% 또는 4.5 중량%의 범위이다.
중요한 부류 IV 불순물은 표적 분자에 대한 수소 결합 유도 왓슨-크릭 결합에 대해 중요한 작용기를 변형하고 차단한다. 따라서, 이러한 부류 IV 불순물의 나타난 감소는 촉매 활성 DNA 분자의 증가된 표적 특이성을 직접적으로 산출한다. 이는 올리고뉴클레오티드의 촉매 활성의 증가를 지속시키고, 그것의 치료 응용분야에서 올리고뉴클레오티드의 (잠재적으로) 감소된 용량을 야기한다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 촉매 활성 DNA 분자는 개선된 표적 상호작용, 예를 들어 개선된 동력학을 특징으로 하는 이의 기재에 대한 결합을 나타낸다.
올리고뉴클레오티드 안전 연구원 (OSWG)에 따르면, 올리고뉴클레오티드 치료제에서의 불순물은 하기 4개의 부류로 분류된다: 부류 I - III은 중요한 것으로 보이지 않고 독성학 연구에서의 추가의 평가를 필요로 하지 않는다. 부류 IV 불순물은 그것의 비자연적 기원으로 인하여 중요한 것으로 정의되며, 이에 따라 그의 독성학적 특성의 평가를 필요로 한다. 공식 분류는 표 1에 나타나 있다:
[표 1] 불순물 분류, OSWG 공개, 문헌 [Capaldi et al., NAT 2017]
Figure pct00001
부류 1 불순물은 또한 모 분자의 주요 대사산물, 즉, 3'- 또는 5'-말단에서의 하나의 뉴클레오티드의 엔도뉴클레오리틱 손실물; 또는 접합체 또는 링커의 손실물인 공정-관련 불순물로 분류된다. 이는 주요 대사산물과 구조적으로 동일할 것이기 때문에, 이러한 불순물은 독성학 연구를 통해 일반적으로 적격처리될 것이다.
부류 2 불순물은 핵산에서 자연적으로 발생된 구조적 성분을 함유하는 공정-관련 불순물로 분류되고, 그러나 변형된 모 화합물, 즉, 시토신으로의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 5-메틸 시토신 분해에서의 포스포디에스테르 불순물을 여전히 나타낸다. 이러한 구조적 성분의 내생적 존재는 불순물과 관련된 고유한 안전성 문제를 배제한다.
부류 3 불순물은 분자 서열, 즉 (n-1), (n-x), (n+1) 및 (n+x) 또는 시토신으로의 티민의 탈아미노화에 기초하여 모 분자와 상이한 공정-관련 불순물로 분류된다. 이 특정 부류의 불순물에 대한 안전성 문제는 서열 변경 또는 면역 자극 모티프의 생성으로 인해 가능하지 않은 비표적 효과 (off-target effect)로 제한될 것이다. 치료적 안티센스 방법에서, 임의의 특정 변형된 서열의 수준은 약리학적 효과를 생성하기 위해서는 너무 낮을 것이다.
부류 4 불순물은 모 분자 또는 천연 핵산에서 발견되지 않은 구조적 요소, 즉, 염기-변형된 또는 골격-변형된 모이어티 예컨대 CNET (T-염기의 아크릴로니트릴-부가물), 탈퓨린화된 종, 출발 물질-관련 변형 또는 아미노기 전이된 (C-염기의 메틸-부가물) 종을 갖는 공정-관련 불순물으로 분류된다. 부류 4 불순물의 안전성은 규격 한계값이 적격 임계값을 초과하는 경우에 비임상적 독성학 연구에서 평가되어야 한다.
상이한 불순물의 수준 및 특징은 UV-검출 및 연속적인 고해상도 질량 분광 분석을 사용하는 크로마토그래피 분리에 의해 확인된다. 각각의 확인된 불순물은 이후 제조 공정의 개개의 단위 작업와 직접적으로 관련된다.
치료적 올리고뉴클레오티드의 고순도가 필수적이기 때문에, 치료적 올리고뉴클레오티드는 유의미한 양의 불순물 예컨대 중요한 부류 IV 불순물의 형성을 회피하는 공정에 의해 제조될 것이다.
하기에서, 본 발명의 구성요소는 보다 상세하게 기재될 것이다. 이러한 구성요소는 특정 구현예로 열거되나, 이들이 추가의 구현예를 생성하기 위해 임의의 방식으로 임의의 수로 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양하게 기재된 실시예 및 구현예는 본 발명을 명시적으로 기재된 구현예로만 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 이 설명은 명시적으로 기재된 구현예를 임의의 수의 개시된 구성요소와 조합하는 구현예를 지원하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 게다가, 본 출원에서 모든 기재된 구성요소의 임의의 순열 및 조합은 문맥이 달리 나타내지 않는 한, 본 출원의 기재에 의해 개시되는 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", 및 변형어 예컨대 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 임의의 다른 구성원, 정수 또는 단계 또는 구성원, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하는 것이 아닌 언급된 구성원, 정수 또는 단계 또는 구성원, 정수 또는 단계의 그룹의 개입을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명을 기술하는 맥락에서 (특히 청구범위의 맥락에서) 사용되는 단수용어 ("a" 및 "an" 및 "the") 및 유사한 지시어는 본원에서 달리 나타내거나 또는 맥락에서 명백하게 상충되지 않는 한, 단수 및 복수 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서의 값의 범위의 언급은 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서 역할을 하는 것으로 의도된다. 본원에 달리 나타내지 않은 한, 각각의 개별 값은 이것이 본원에 개별적으로 언급되는 바와 같이 명세서에 편입된다. 본원에 기재된 모든 방법은 본원에 달리 나타내지 않거나 맥락에서 명백하게 상충되지 않는 한, 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 그리고 모든 예 또는 예시적인 표현 (예를 들어, "예컨대", "예를 들어")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것이며, 달리 청구된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서에서의 표현은 본 발명의 실시에 필요한 청구되지 않은 임의의 구성요소를 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다.
일반적으로, 촉매 활성 DNA 분자 예컨대 DNAzyme을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성은 단량체성 빌딩 블록 예컨대 각각 H-포스포네이트 및 포스포아미다이트 빌딩 블록을 사용하는 것에 의한 잘 확립된 포스포디에스테르 또는 포스파이트트리에스테르 프로토콜을 이용하는 순차적 고체상 화학에 의해 수행된다. 완전-자동화된 합성 공정은 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 제어된 DNA 합성 기기 및 유동, 고정층 또는 배치형 교반층 기술을 사용하여 수행된다. 진행 중인 공정의 공정 제어 및 온라인 모니터링을 위해 합성기는 온라인 UV, 압력 및 전도도 검출기를 포함한다.
간단하게는, 이러한 방법은 아미노 및/또는 히드록실 모이어티 및 링커 분자로 작용화되고, 이후 올리고뉴클레오티드의 3'-최상위 뉴클레오시드(3'-most nucleoside)를 고정하는 고체 지지체 예컨대 고체 지지체 수지를 포함한다. 조절된 화학 반응에 의해, 바람직한 올리고뉴클레오티드 서열은 개개의 뉴클레오티드 잔기의 단계적 첨가에 의해 고체 지지체 상에서 순차적으로 조립되고, 예를 들어 합성적으로 조립된다. 촉매 활성 DNA 분자는 예를 들어 포스포아미다이트 또는 H-포스포네이트 화학에 따른 순차적인 방식으로 합성적으로 조립된다.
뉴클레오시드간 연결은 유입되는 뉴클레오시드의 3'-작용기와 고체 지지체-결합 올리고뉴클레오티드의 각각의 5'-말단 뉴클레오시드의 고반응성 5'-하이드록실기 사이에 형성된다. 포스포아미다이트 방법에서, 뉴클레오시드간 연결은 보호된 포스파이트 트리에스테르 모이어티이고, 반면 H-포스포네이트 방법에서, 이는 H-포스포네이트 포스포디에스테르 모이어티이다.
최신 기술의 고체상 지지체 수지는 본 발명의 촉매 활성 DNA 분자 예컨대 DNAzyme (예를 들어, hgd40)을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성을 위한 출발점으로서 사용된다. 고체상 염기 물질은 유기물 (중합체성), 무기물 특징, 즉, CPG (제어된 기공 유리)의 것일 수 있다.
고체상 합성 동안 단량체성 신톤으로서 사용되는 2'-데옥시-포스포아미다이트는 예를 들어 리보오스의 5'-히드록실 작용기에서의 산 분해성 보호기 예컨대 4,4'-디메톡시트리페닐메틸 (DMT) 기, 및 3'-O-(N, N)-디알킬-포스파이트 트리에스테르기 상의 염기-분해성 보호기 예컨대 β-시아노에틸 (C-NEt)를 수반한다.
3개의 핵염기 아데닌, 시티딘, 및 구아닌의 잠재적 반응성인 외향고리 아미노 작용기는 예를 들어 염기-분해성 아실기에 의해 보호되어 각각 합성 공정 동안 바람직하지 않은 부작용 및 불순물-형성을 방지하고; 티미딘은 외향고리 아미노 작용기를 가지지 않고 이에 따라 임의의 핵염기 보호를 필요로 하지 않는다.
축합 반응 동안 합성시 제1 단계로서, (N,N)-디이소알킬기는 유기 양성자-공여 활성제, 예를 들어, 유기 약산 예컨대 브뢴스테드 산, 보통 테트라졸 또는 테트라졸-유도체 예컨대 벤질티오테트라졸/5-(벤질머캅토)-1H-테트라졸 (BTT, BMT), 디시아노이미다졸 (DCI) 및/또는 5-(에틸티오)-1H-테트라졸 (ETT)을 사용하여 양성자화된다. 이 친핵성 공격은 예를 들어 지지체-결합 올리고뉴클레오티드 사슬의 유리 5'-하이드록실기 상의 축합 반응을 완료하는 고반응성 중간체로서 활성제와 유입되는 단량체 사이에 테트라졸라이드 염을 형성한다.
고체상 합성 동안 단량체성 신톤으로서 사용되는 2'-데옥시-H-포스포네이트 모노에스테르는 리보오스의 5'-히드록실 작용기에서의 산 분해성 보호기 예컨대 4,4'-디메톡시트리페닐메틸 (DMT, 디메톡시트리틸) 기를 수반한다. 포스페이트 보호기에 대한 요건은 존재하지 않는다.
올리고뉴클레오티드는 예를 들어 선형, 다단계 고체상 합성에서 조합되고, 중간체는 이 공정 동안 단리되지 않는다.
올리고뉴클레오티드 예컨대 촉매 활성 DNA 분자의 합성 사이클은 역위 데옥시-티미딘 3'-뉴클레오시드에서 개시되고, 이는 예를 들어 3'-히드록시 작용기에서 DMT 보호되고, 예를 들어 5'-히드록시 작용기에 의해 그리고 염기-분해성 석시닐 링커를 통해 고체상 비드에 공유 결합된다. 이 뉴클레오시드 상에서, 서열에서의 다음 뉴클레오티드가 결합되고 이후 뉴클레오티드 잔기의 단계적 첨가에 의해 올리고뉴클레오티드 예컨대 촉매 활성 DNA 분자의 서열의 연속적인 3' -> 5' 연장이 후속된다.
하나의 뉴클레오시드의 첨가를 위해 요구되는 모든 시약은 예를 들어 정의되고 그리고 컴퓨터-제어된 합성 방식에 따라 컬럼을 통해 전달된다. 각각의 커플링 사이클은 도 1에 나타낸 하기 4개의 주요 화학적 단계로 이루어진다.
각각의 주요 단계들 사이에서 예를 들어 아세토니트릴 세척 단계가 수행되어 과량의 반응물 및 반응 부산물을 제거한다. 올리고뉴클레오티드는 성장하는 사슬의 고반응성 5'-OH-말단에 3'-포스포아미다이트를 첨가하여 연장된다. 합성 사이클은 전장 올리고머의 합성이 촉매 활성 DNA 분자의 프로그래밍된 뉴클레오티드 서열에 따라 완료될 때까지 반복된다.
올리고뉴클레오티드의 합성 이후, 이 올리고뉴클레오티드의 절단 및 탈보호가 일어난다. 촉매 활성 DNA 분자의 합성의 최종 탈트리틸화 단계 이후, 가교된 포스페이트 트리에스테르 연결의 β-시아노에틸 보호기는 예를 들어 지지체-결합된 올리고뉴클레오티드를 아세토니트릴 중의 디에틸아민의 용액과 반응시켜 제거된다. 이 β-시아노에틸 탈보호 단계는 동일하게 제어된 방식으로 합성기 상에서 수행된다.
DEA-처리의 완료 후, 컬럼은 예를 들어 합성기로부터 제거되고, 포함된 고체 지지체는 예를 들어 불활성 기체 예컨대 질소 또는 아르곤에 의해 건조된다. 연속적으로, 올리고뉴클레오티드는 에탄올 중의 농축된 암모니아로 염기-분해성 석시닐 링커의 절단에 의해 고체 지지체로부터 방출된다. 고체상은 이후 컬럼으로부터 제거되고, 올리고뉴클레오티드는 선택적으로 고온에서, 예를 들어 20℃ 내지 70℃, 25℃ 내지 65℃, 30℃ 내지 60℃, 35℃ 내지 55℃ 또는 40℃ 내지 50℃의 범위에서 적절한 용매 예컨대 물 또는 에탄올 중의 농축된 암모니아 또는 에틸아민 또는 이의 혼합물 (암모니아 메틸아민, AMA)과 같은 염기로의 염기-분해성 석시닐 링커의 절단에 의해 고체 지지체로부터 연속적으로 방출된다. 온도가 높을수록 반응 속도가 가속되나, 또한 원하지 않은 불순물을 야기하는 촉매 활성 DNA, 예를 들어, hgd40을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 화학적 개질 또는 분해의 속도를 증가시킨다.
이 처리는 또한 염기-분해성 핵염기-보호기를 절단한다. 예를 들어 여과에 의한 잔여 고체 지지체 비드의 제거 후, 조 생성물은 개개의 탈보호 용액, 예를 들어, 암모니아 용액에서 수득될 것이다. 대안적으로, 탈보호 용액은 예를 들어 실온에서 컬럼을 통해 예를 들어 10 - 120 분, 15 - 90 분 또는 30 - 60 분에 걸쳐 예를 들어 플로우 스루(Flow Through) 방식으로 세척되어 올리고뉴클레오티드와 고체상 비드 사이의 링커를 방출한다. 올리고뉴클레오티드는 이후 용액에서 방출되고, 이 올리고뉴클레오티드-함유 용액은 선택적으로 탈보호 단계, 예를 들어, 탈보호 용기로 이송되고, 예를 들어 용액의 가열에 의해 탈보호된다. 합성의 완료 후, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 촉매 활성 DNA 분자 예컨대 DNAzyme은 예를 들어 고체상 지지체 수지로부터 절단되고, 핵염기 및 골격 보호기는 염기성 수용액을 사용하여 연속적으로 제거된다. 온도는 예를 들어 5 내지 20시간의 기간 동안 예를 들어 30℃ 내지 45℃로 증가된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 제조 공정은 예를 들어 정제 및 단리 과정으로 종결된다. 절단 및 탈보호 이후 수득된 조 전장 올리고뉴클레오티드-함유 용액은 다양한 생성물- 및 공정-관련 불순물, 예컨대 각각 실패 서열 (failure sequence) (n-1 종, 쇼트머), 추가의 염기를 갖는 서열 (n+x 종, 롱머), 보호기의 불완전한 절단으로부터 유래된 화학적으로 개질된 생성물, 및 염기-개질된 화합물을 포함한다. 게다가, 산성 탈트리틸화 단계 동안, 뉴클레오티드의 탈퓨린화가 일어나 하나 이상의 퓨린 염기가 누락된 무염기성 생성물의 발생을 유발할 수 있다. 염기성 수용액으로의 처리시, 예를 들어 암모니아로의 절단 동안 이 무염기성 생성물은 쇼트머 (n-x)- 단편으로 부분적으로 분해된다.
임의의 이러한 잠재적 불순물은 예를 들어 액체 크로마토그래피 예컨대 이온 교환 (IEX) 액체 크로마토그래피에 의한 정제 동안 분리될 수 있다. 예를 들어, 액체 크로마토그래피 이외의 촉매 활성 DNA 분자의 추가의 정제 단계 및/또는 단리 단계 및 탈염, 및 선택적으로 동결 건조는 본 발명에 따라 촉매 활성 DNA 분자의 제조 방법에서 배제된다.
절단 과정으로부터 수득된 조 DMT-무함유 생성물은 강한 음이온 교환 수지로 팩킹된 크로마토그래피 컬럼 상에서 정의된 농도로 희석되어 장입된다. 부산물로부터의 전장 생성물의 분리는 알칼리 수용액 중의 염화나트륨의 구배에 의해 달성된다. 구배 분리 동안, 올리고뉴클레오티드를 함유하는 유출물의 분획이 수집되고 UPLC-MS에 의해 연속적으로 분석된다.
주어진 사양 기준을 충족하는 분획을 이후 취합하고 다시 IEX-HPLC로 분석하여 취합의 결과를 확인한다.
이러한 조합된 분획은 구배 용출로부터의 과량의 염을 함유하고, 예를 들어 접선 유동 여과 (Tangential Flow Filtration, TFF)로 처리된다. 필요한 경우, 용액의 pH는 버퍼 교환 단계 동안 조정되고, 여과되고 농축된 생성물은 이후 동결 건조되어 비결정성 분말 또는 케이크로서 최종 활성 약학적 성분 (API)을 생성하였다. API는 수확되어 -20℃에서 스크류 캡을 가진 멸균 HDPE 병 (Nalgene®)에 최종적으로 저장된다.
[표 2] 본 발명에 따른 신규한 공정과 비교되는 hgd40 배치의 생성물 순도 및 불순물 사전- 및 사후-생성물 피크의 수준
Figure pct00002
선행 기술의 선택된 합성 및 탈보호 조건으로 인하여, 이 제조 공정은 불순물로서 많은 양의 에톡시아세탈-개질된, 탈퓨린화된 종을 생성한다. UPLC-MS 분석에 의해 검출된 다른 공정-관련 불순물은 롱머 및 불완전하게 탈보호된 종, 즉, G-염기에서 이소부티릴 (ibu) 보호기를 여전히 함유하는 올리고뉴클레오티드이다 (도 2 참조).
이러한 불순물의 대부분은 DNAzyme 활성에 필요한 왓슨-크릭 염기-쌍에 직접적인 부정적인 영향을 미치고 이에 따라 생성물의 활성을 저하시킬 수 있다. 또한, 이러한 불순물은 최종 정제된 활성 약학적 성분 (API) 수율을 저하시킨다. 게다가, 공정의 전체 생산성은 낮고 이는 고가의 API를 야기한다.
[표 3] 본 발명에 따른 신규한 공정과 비교되는 4개의 가장 지배적인 공정-관련 불순물을 나타내는 상세한 분석
Figure pct00003
표 3으로부터 추론할 수 있는 바와 같이, 상당한 양 (2.12% - 8.53%)의 에톡시아세탈 불순물은 각 배치에서 발생되고 있다. 이 불순물은 고온 (55℃)에서 에탄올 암모니아 용액을 사용하는 절단 및 탈보호 단계 동안 생성되고, 명백하게 공정-관련된다. 불순물은 HPLC 정제 동안 제거하기 곤란하며, 왓슨-크릭 염기-쌍을 형성할 수 없고 이에 따라 촉매 활성 DNA 분자 예컨대 DNAzyme의 활성을 저하시킨다.
G-핵염기 상의 잔여 이소부티릴 보호기 (ibu)는 각 배치에서 0.00% 내지 4.94%의 수준으로 검출될 수 있다. 이 불순물은 암모니아-처리 동안 G-핵염기의 불완전한 탈보호와 관련된다. 이는 HPLC 정제 동안 제거하기 곤란하며, 왓슨-크릭 염기-쌍을 차단하고, 이에 따라 촉매 활성 DNA 분자 예컨대 DNAzyme의 활성을 저하시킨다.
(n+1) 불순물은 분자 내의 무작위 위치에서 하나의 추가의 염기를 가진 불순물의 이질적인 그룹을 나타낸다. 분자 내의 위치에 따라, 누락된 염기는 촉매 활성 DNA 분자 예컨대 DNAzyme의 표적 mRNA에의 적절한 결합을 방해할 수 있고, 이에 따라 활성을 저하시킨다. 이중-결합은 조절되지 않은 커플링 반응으로 인하여 발생된다. 이는 모든 배치에서 0.78% 내지 2.14%의 수준으로 발견될 수 있다. 정제 동안, 불순물은 주요 피크 부근에서 용출되고, 제거하기 매우 곤란하다.
(n-1) 불순물은 분자 내의 무작위 위치에서 하나의 염기가 누락된 불순물의 이질적인 그룹을 나타낸다. 분자 내의 위치에 따라, 누락된 염기는 촉매 활성 DNA 분자 예컨대 DNAzyme의 표적 mRNA에의 적절한 결합을 방해할 수 있고, 이에 따라 활성이 저하된다. 누락된 염기는 유입되는 염기의 불완전한 커플링 (비최적화된 커플링 조건), 또는 탈트리틸화 단계 동안 불완전한 산화 및 관련된 가닥 절단과 관련될 수 있다. 이는 모든 배치에서 0.57% 내지 4.96%의 수준으로 발견될 수 있다. 정제 동안, 불순물은 주요 피크 부근에서 용출되고, 제거하기 극히 곤란하다.
이 공정으로 얻은 조 수율 (정제 전)을 2.57 내지 3.41 gm/mmol 합성 규모로 측정하였다. 촉매 활성 DNA 분자 예컨대 DNAzyme hgd40이 10603 Da의 분자량 및 이에 따라 10.6 gm/mmol 합성 규모의 이론적 수율을 가짐에 따라, 정제 전 관측된 수율은 24.25% 내지 32.17%이다. 정제 및 하류의 다른 것 동안 50% 수율 손실이 예상될 수 있다. 전체 총 수율은 이에 따라 12.13% 내지 16.85%로 계산된다.
고해상도 UPLC-MS를 통한 모든 이용가능한 DNAzyme hgd40-배치의 심층 분석 후, 관련 개별 공정 단계를 최적화하여 공정-관련 불순물 부담을 최소화하였다.
[표 4] 선행 기술에 따라 2013년도에 제조된 단일 배치 (임상 배치 2)의 예시적인 고해상도 불순물 프로파일. RRT의 경우 "상대적 체류 시간(Relative Retention Time)", FLP의 경우 "전장 생성물(Full Length Product)", ID의 경우 "식별(Identification)"의 약어이다.
Figure pct00004
상기 표 4는 본 발명의 확립된 제조 공정을 사용하여 2013년도에 제조된 hgd40 배치 #200293에 대한 정제 이후 예시적인 불순물 프로파일을 기재한다. 표 2에 도시된 바와 같이, 이 배치는 예를 들어 4.77 gm/mmol 합성 규모의 조 수율과 함께 83.75%의 순도로 방출되었다. hgd40은 10603 Da의 분자량 및 이에 따른 예를 들어 10.6 gm/mmol 합성 규모의 이론적 수율을 가짐에 따라, 정제 전 관측된 수율은 예를 들어 45.00 %으로 계산된다. 사전-생성물 불순물 피크는 5.31%로 계산되고, 사후 생성물 불순물 피크는 최대 8.94%로 합산된다. 분자의 방출시 최종 수율은 예를 들어 2.47 gm/mmol로 계산되거나 이론적 수율에 대해 23.30 %로 계산된다.
본 발명의 방법은 앞서 기재된 방법 중 임의의 것에 기초하지만, 불순물 예컨대 (n+1) 불순물, (n-1) 불순물 또는 이들의 조합을 유의미하게 감소시키거나 심지어 이를 근절시킨다. 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 촉매 활성 DNA 분자 예컨대 DNAzyme은 유의미하게 감소된 총 불순물 예를 들어 액체 크로마토그래피 예컨대 분석적 HPLC 또는 FPLC를 통해 주요 생성물 피크 이전 및 이후 용출된 모든 불순물을 지칭하는 < 20 %, < 15 %, < 12%, < 10 % 또는 < 5 %의 범위의 총 불순물을 포함한다.
촉매 활성 DNA 분자의 감소된 불순물은 예를 들어 촉매 활성뿐만 아니라 촉매 활성 DNA 분자의 기질 결합, 즉, 촉매 활성 DNA 분자와 그 기질의 상호작용을 개선한다. 이러한 개선은 예를 들어 선행 기술의 촉매 활성 DNA 분자와 비교하여 촉매 활성 DNA 분자의 개선된 능력을 야기한다.
본 발명의 방법은 올리고뉴클레오티드의 합성에서 중합체성 수지로서 예를 들어 제어된 기공 유리 (CPG) 또는 거대기공 폴리스티렌 (MPPS)을 포함한다. 수지 장입량은 예를 들어 10 내지 500 μmol/gm, 50 내지 450 μmol/gm, 100 내지 400 μmol/gm, 150 내지 350 μmol/gm, 200 내지 300 μmol/gm 또는 60 내지 120 μmol/gm의 범위이다.
선택적으로 본 발명의 방법은 활성제 및/또는 아미다이트의 사용을 포함한다. 활성제는 예를 들어 산 예컨대 유기산, 예를 들어 유기 브뢴스테드 산 예컨대 테트라졸 또는 이의 유도체 예컨대 에틸티오테트라졸 (ETT), 벤질티오테트라졸 (BTT/BMT) 또는 디시아노이미다졸 (DCI)이고, 이는 예를 들어 무수 비극성 유기 용매 예컨대 아세토니트릴에 용해된다. 활성제 예컨대 브뢴스테드 산은 첨가제 예컨대 염기성 화합물 예를 들어 N-메틸 이미다졸을 예를 들어 0.05 내지 0.2 M의 농도로 포함한다. 활성제 예컨대 테트라졸 또는 이의 유도체 예를 들어, ETT, BTT/BMT 또는 DCI의 농도는 예를 들어 0.1 M 내지 1 M, 0.2 M 내지 0.8 M, 0.3 M 내지 0.6 M 또는 0.5 M이다. 아미다이트 농도는 예를 들어 0.1 내지 0.25 M이다. 아미다이트는 예를 들어 무수 비극성 유기 용매 예컨대 아세토니트릴에 용해된다. 아미다이트 당량은 예를 들어 0.5 내지 5.0 eq, 1.0 내지 4.0 eq, 1.5 내지 3.5 eq 또는 1.2 내지 3.0 eq이다. 본 발명의 방법에서의 활성제 : 아미다이트의 비는 예를 들어 10 : 90, 20 : 80, 30 : 70, 40 : 60, 50 : 50, 60 : 40, 70 : 30, 80 : 20 또는 90 : 10, 또는 10 : 90 내지 90 : 10, 20 : 80 내지 80 : 20, 30 : 70 내지 70 : 30, 40 : 60 내지 60 : 40 또는 50 : 50 내지 70 : 30이다.
선택적으로, 본 발명의 방법은 추가로 캡핑 시약을 사용하고, 이는 예를 들어, 무수 비극성 유기 용매 예컨대 아세토니트릴에 용해된 예를 들어 산 무수물 예컨대 아세트산 무수물이다. 산 무수물 예컨대 아세트산 무수물의 양은 예를 들어 3 내지 100 %, 5 내지 50 %, 10 내지 40 %, 20 내지 30 % 또는 10 내지 30 %이다.
절단 및 탈보호 단계에서, 예를 들어 염기성 수용액 예컨대 농축된 암모니아 수용액이 사용된다. 절단 및 탈보호 단계의 기간은 예를 들어 1 내지 24 시간, 5 내지 20 시간, 10 내지 15 시간 또는 8 내지 16 시간이다. 절단 및 탈보호 단계의 온도는 예를 들어 10 내지 60℃, 15 내지 55℃, 20 내지 50℃, 30 내지 45℃ 또는 35 내지 40℃이다.
본 발명의 정제 단계에서 사용되는 정제 수지는 예를 들어 다공성 친수성 중합체 비드이고, 이는 강한 음이온 교환기로 개질된다. 이러한 중합체의 예는 TSKGel SuperQ 5PW 20이다.
정제 단계에서, 예를 들어 2개의 상이한 버퍼가 사용되며 이는 예를 들어 알칼리 수산화물 예컨대 수산화나트륨 단독 또는 알칼리 수산화물 및 알칼리 할라이드의 조합이다. 제1 버퍼는 수중 예를 들어 1 내지 30 mM, 5 내지 25 mM, 10 내지 20 mM 또는 5 내지 25 mM 수산화나트륨을 포함하거나 이로 이루어지고; 제2 버퍼는 예를 들어 수중 1 내지 30 mM, 5 내지 25 mM, 10 내지 20 mM 또는 5 내지 25 mM 수산화나트륨 및 0.5 내지 2.0 NaBr, 1.0 내지 1.8 NaBr 또는 1.5 NaBr을 포함하거나 이로 이루어진다.
모든 상기 언급된 파라미터는 각각 상이한 양 및 농도로 서로 조합될 수 있다.
일반 선행 기술 방법에서 사용되는 물질 및 방법 단계와 비교되는 본 발명의 방법에 사용되는 물질 및
방법 단계의 예는 하기 표 5에 나타나 있다:
[표 5] 본 발명의 방법의 CPP와 비교되는 선행 기술 방법의 CPP
Figure pct00005
상기 기재되고 열거된 모든 공정 변화는 DNA 합성을 위한 중요 공정 파라미터 (CPP)이고, 이는 표 4 및 5에 나타난 관측된 불순물 프로파일과 직접적으로 연관될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 수득가능한 본 발명의 촉매 활성 DNA 분자는 예를 들어 GATA-3에 대한 DNAzyme이다. 이 DNAzyme의 서열은 예를 들어 WO 2005/033314의 서열 hgd1 내지 hgd70 (예를 들어 WO 2005/033314의 도 3 참조)으로부터 선택되고, 특히 서열 hgd11, hgd13, hgd17 및 hgd40, 보다 특히 hgd40 (5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG; 서열 번호 1)의 서열로부터 선택되고, 즉, DNAzyme은 이러한 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
DNAzyme "hgd40"은 예를 들어 서열 5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG을 갖는 34개의 염기를 포함하거나 이로 이루어진다. 3' 및 5' 영역 둘 모두에서의 9개의 염기는 2개의 결합 도메인을 형성하고, 이는 GATA-3의 표적 mRNA에 고도로 특이적으로 결합된다. 분자의 중심 코어는 GATA-3 mRNA에의 hgd40의 결합 후 표적의 절단을 처리하는 촉매 도메인을 나타낸다. 약물 물질 hgd40은 흡입에 의한 약물 전달의 부위에서의 높은 생체활성 및 생체이용가능성을 특징으로 한다.
본 발명의 촉매 활성 DNA 분자 예컨대 DNAzyme hgd40은 예를 들어 경구로, 비강으로, 정맥내로, 피하로, 국소적으로, 직장으로, 비경구적으로, 근육내로, 낭내로, 질내로, 복막내로, 척수강내로, 혈관내로, 국소적으로 (분말, 연고 또는 액적) 또는 스프레이 또는 흡입제의 형태로 투여되는 환자에 투여될 수 있는 제형에 포함된다. 활성 성분은 예를 들어 요건에 따라 생리학적으로 허용가능한 부형제 및 가능한 보존제, 버퍼 또는 추진체와 멸균 조건 하에 혼합된다.
DNAzyme hgd40은 예를 들어 흡입을 위한 제형에 포함되거나 PBS에 용해된다.
본 발명의 방법에 의해 수득가능한 촉매 활성 DNA 분자 예컨대 DNAzyme은 예를 들어 GATA-3-유래 질환, 질병 또는 병태의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용된다. 이러한 질환, 질병 또는 병태는 GATA-3가 세포에서의 정상 수준과 비교하여 세포에서 상향조절되는 임의의 질환, 질병 또는 병태이다. 상기 세포는 GATA-3를 발현하는 임의의 세포 예를 들어 면역 세포이다. GATA-3의 상향조절은 예를 들어 질환, 장애 또는 병태 발병, 증상의 발달 및/또는 질환, 장애 또는 병태의 진행을 야기하는 병리학적 과정의 개시, 영향 및/또는 확대와 연관된다. 이러한 질환은 예를 들어 2형 염증 또는 질환, 예를 들어 TH-2-유래 질환, 장애 또는 병태이다. 특히, 2형 염증 또는 질환은 예를 들어 2형 천식 예컨대 2형 고도 천식이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 상이한 구현예를 예시하나, 본 발명은 이 실시예로 제한되지 않는다.
실시예 1: 소규모 단일 배치의 고해상도 불순물 프로파일의 제조
본 발명의 방법으로 수득되는 hgd40 DNAzyme의 조 수율 (정제 전)은 5.91 gm/mmol 합성 규모로 측정되었다. hgd40가 10603 Da의 분자량 및 이에 따른 10.6 gm / mmol 합성 규모의 이론적 수율을 가짐에 따라, 정제 전의 관측된 수율은 55.75% (이전 공정과 비교하여 +9.75%)로 계산된다. 정제 및 하류 과정에서 67.8%의 수율이 관측되었다. 사전-생성물 불순물 피크는 5.70% (+0.39%)로 계산되고, 사후-생성물 불순물 피크는 최대 4.02% (-4.92%)로 합산된다. 2개의 불순물은 공정 변화로 인하여 완전하게 사라졌고 (에톡시아세탈 및 이소부티릴-개질), 하나의 신규한 불순물은 낮은 백분율로 검출되었다 (CNET). 이에 따라 총 전체 수율은 37.5% (이전 공정과 비교하여 +14.20%)로 계산된다.
[표 6] 본 발명의 방법을 사용하는 2019년에 제조된 소규모 단일 배치의 예시적인 고해상도 불순물 프로파일을 나타냄:
Figure pct00006
실시예 2: 절단 검정
DNAzyme hgd40의 활성은 용액에서의 구조 형성에 기초하고, 이로써 기능 검정은 표적 효과를 결정하도록 구현될 수 있다. 따라서, 기능적 시험관내 절단 검정은 상이한 hgd40-배치의 시간-의존적 절단 활성을 모니터링하기 위해 개발되었다.
Hgd40은 GATA-3 mRNA 특이적, 5개의 뉴클레오티드 (nt) 긴 결합 아암에 의해 양면 상에 측접된 23개의 중앙 염기 촉매 도메인을 보유한다. 검정 표적으로서, hgd40의 내생적 mRNA GATA-3 표적 영역에 상응하는 40nt RNA 서열은 합성적으로 설계되어 제조되었다. 40nt RNA는 hgd40에 의해 17nt 및 23nt 단편으로 특이적으로 절단될 것이다. 이러한 단편들은 HPLC를 변형함으로서 잘 분리될 수 있다. hgd40의 절단 동력학을 이온-쌍 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (IP-RP-HPLC)를 변형함으로써 상이한 시점에서 분석하였다.
도 3은 총 5개의 배치에 대한 절단 검정을 나타낸다. 배치 X48179K1K2는 본 발명의 방법에 따라 제조되었고; 배치 138976, 158602, 200293, 257848은 선행 기술의 방법에 따라 제조되었다. 결과는 용액 중 hgd40 함량에 대해 정규화되었고, 하기 표 7에 나타낸다.
[표 7] 절단 검정의 결과
Figure pct00007
표 7은 본 발명의 방법에 따라 제조된 hgd40가 다른 배치와 비교하여 초기의 더 높은 활성을 갖는 것을 나타낸다. 활성의 증가는 40mer 절단 템플레이트의 감소와 직접적으로 관련된다. 본 발명의 방법은 9.02 내지 17.68%의 초기의 더 높은 활성을 나타낸다. 템플레이트가 본 발명의 방법에 대해 25 - 30분에서 그리고 선행 기술의 방법에 대해 35분에서 안정기로 서서히 소화되기 때문에 수치는 시간에 따라 감소된다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 Hgd40은 오래된 배치들보다 더 빠른 절단 동력학을 나타낸다.
실시예 3: 중요한 공정-관련 불순물의 시험
8개의 배치 hgd40을 선행 기술의 방법에 따라 2009년 내지 2017년에 제조되었고, 중요한 공정-관련 불순물의 수준에 대해 시험되었다 (표 8 참조). hgd40의 하나의 배치를 본 발명의 방법에 따라 2019년에 제조되었다.
상이한 불순물의 수준 및 특징을 UV-검출 및 연속적인 고해상도 질량 분광 분석을 사용하는 크로마토그래피 분리에 의해 확인하였다. 각각의 확인된 것은 제조 공정의 개개의 단위 작업과 직접적으로 관련되었다.
선행 기술의 방법에 따라 제조된 9개의 상이한 hgd40 배치의 분석 결과를 비교함으로써 중요한 불순물의 양을 모니터링하였고, 본 발명의 방법에 따라 제조된 hgd40 배치의 불순물과 직접적으로 비교하였다. 본 발명의 방법은 중요한 부류 IV 불순물의 유의미하게 더 적은 양 및 올리고뉴클레오티드의 더 높은 수율을 야기한다. 선행 기술의 방법은 표 8에 나타낸 바와 같이 검출 가능한 범위에서 중요한 불순물을 생성하였다. 공급처 1의 배치 hgd40 (배치 번호 X48179K1K2)을 본 발명의 방법에 따라 제조하였고, 0,96 중량%로 낮게 불순물을 나타내고, 반면 선행 기술에 따른 방법에 의해 생성된 공급처 2의 모든 다른 배치 hgd40의 불순물은 약 5 내지 15 중량%로 변화된다. 공급처 2의 배치 hgd40이 집중적으로 정제된 경우에만 (배치 번호 255603 및 164154), 불순물은 약 2.5 내지 3.75 중량%로 감소되었다. hgd40 배치 생산 이후의 정제 단계는 시간 및 재료에 많은 노력을 필요로 한다. 동시에, 올리고뉴클레오티드의 수율은 감소된다.
[표 8] 각 배치에서의 함유된 부류 IV-유형 불순물의 백분율의 요약. 2019년 배치에 대해 예상되는 모든 배치는 공급처 2에 의해 제조되었고; 2019 배치 X48179K1K2는 본 발명에 따라 공급처 1에 의해 제조되었다.
Figure pct00008
표의 좌측 부분에 열거된 총 부류 IV 불순물에 대한 모든 백분율은 고해상도 루드 (비정제된) 올리고뉴클레오티드 생성물에 의해 측정된다. 비교하면, 표 8의 우측 부분의 2개의 배치는 고도로 정제된 참조 물질을 나타낸다. 배치 번호 255603인 참조 물질은 2017년도의 배치 254936에서 정제되었고; 배치 번호 164154인 참조 물질은 2011년도의 배치 161713에서 정제되었다.
이전 공정에 의해 생성된 중요한 부류 IV 불순물은 4.86% (배치 161713, 2011년도) 내지 15.08% (배치 257848, 2018년도)의 범위이다. 이러한 불순물은 정제된 참조 물질 배치의 분석에 의해 입증되는 바와 같이 정제될 수 있으나, 전체 합성 수율을 저하시킨다. 초기 실험에서, 새롭게 개발된 공정은 단지 0.96%로 부류 IV 불순물을 증가시켰다. 표 9는 선행 기술에 따른 방법을 사용하여 조 API의 통상적인 불순물 프로파일을 도시하며; 도 10은 본 발명에 방법에 의해 생성된 올리고뉴클레오티드에 대한 불순물 프로파일을 도시한다. 부류 IV 불순물은 화합물-특이적 고해상도 분석 LC-MS 방법의 개발 이후 유일하게 검출될 수 있다.
도 4는 표 8에 열거된 선행 기술의 방법에 의해 생성된 hgd40의 배치의 불순물의 변화를 나타낸다.
다음 단계에서, 선행 기술의 방법에 의해 제조된 hgd40 배치의 불순물을 추가로 조사하여 표 9에 나타난 불순물의 유형을 확인하였다:
[표 9] 선행 기술의 방법에 의해 생성된 올리고뉴클레오티드에서 관측된 불순물의 유형. 중요한 부류 IV 불순물은 굵은 문자로 강조된다.
Figure pct00009
본 발명에 따른 방법에 의해 생성된 올리고뉴클레오티드 내의 불순물의 유형을 또한 분석하였고 표 10에 도시되어 있다. 이러한 불순물은 그것의 비-자연적 유래로 인하여 중요한 것으로 정의된 부류 IV 불순물에 속하지 않으며, 이에 따라 그의 독성학적 특성의 평가를 필요로 한다.
[표 10] 본 발명의 방법에 의해 생성된 올리고뉴클레오티드의 불순물의 유형. 중요한 부류 IV 불순물은 굵은 문자로 강조된다.
Figure pct00010

Claims (15)

  1. 촉매 활성 DNA 분자의 제조 방법으로서,
    a) 지지체 상에서의 촉매 활성 DNA 분자의 합성 단계로서, 여기서 핵염기 보호기를 포함하는 뉴클레오티드는 예를 들어 0.2 내지 0.45 M 테트라졸 또는 이의 유도체 예컨대 에틸티오테트라졸 (ETT), 벤질티오테트라졸 (BTT) 또는 디시아노이미다졸 (DCI)인 유기 양성자-공여 활성제, 및 단량체성 빌딩 블록 아미다이트의 혼합물을 이용하여 3'-말단으로부터 출발하여 5'-말단으로 또는 3'-말단으로부터 출발하여 5'-말단으로의 순차적인 방식으로 조립되는 단계,
    b) 합성의 완료 후, 5 내지 20시간 동안 30 내지 45℃의 온도에서 지지체로부터 촉매 활성 DNA 분자를 그리고 촉매 활성 DNA 분자로부터 핵염기 및/또는 골격 보호기를 절단하는 단계,
    c) 액체 크로마토그래피를 통해 촉매 활성 DNA 분자를 정제하고 탈염시키는 단계, 및
    d) 선택적으로 동결 건조를 통해 촉매 활성 DNA 분자를 단리하는 단계
    를 포함하며,
    여기서 촉매 활성 DNA 분자의 임의의 추가 정제 단계 또는 단리 단계가 배제되는, 촉매 활성 DNA 분자의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지지체는 고체 지지체 예컨대 제어된 기공 유리 (CPG) 또는 거대기공 폴리스티렌 (MPPS)인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵염기 및/또는 골격 보호기는 염기-분해성 아실기인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드는 5'-하이드록실기에서의 4,4'-디메톡시트리틸 (DMT) 기, 3'-포스파이트기에서의 베타-시아노에틸 (C-Net) 또는 이들의 조합을 더 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성제는 0.2 내지 0.45 M 테트라졸 또는 이의 유도체 예컨대 에틸티오테트라졸 (ETT), 벤질티오테트라졸 (BTT/BMT), 디시아노이미다졸 (DCI) 또는 이들의 조합인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성제 : 아미다이트의 비는 50:50 내지 70:30인 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 촉매 활성 DNA 분자는 DNAzyme인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 DNAzyme은 서열 번호 1 (5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG)을 포함하는 hgd40인 방법.
  9. 액체 크로마토그래피에서의 주요 생성물 피크의 이전 및 이후 용출되는 모든 불순물의 전체를 지칭하는 0.1 중량% 내지 4.5 중량%의 범위의 총 불순물을 포함하는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 촉매 활성 DNA 분자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 촉매 활성 DNA 분자는 예를 들어 GATA-3에 대한 DNAzyme인 촉매 활성 DNA 분자.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 DNAzyme은 서열 번호 1 (5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG)을 포함하는 hgd40인 촉매 활성 DNA 분자.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 촉매 활성 DNA 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  13. GATA-3-유래 질환을 앓고 있는 인간 환자의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한, 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 촉매 활성 DNA 분자 또는 제12항에 따른 약학적 조성물.
  14. 2형 천식을 앓고 있는 인간 환자의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한, 제12항 또는 제13항에 따른 약학적 조성물, 또는 제9항 내지 제11항 및 제13항 중 어느 한 항에 따른 촉매 활성 DNA 분자로서, 여기서 상기 인간 환자는 (i) 3% 이상, 특히 4% 이상, 보다 특히 5% 이상의 혈액 호산구 수치; 및/또는 (ii) 350 x 106/L 이상, 특히 450 x 106/L 이상의 혈액 호산구 수치; 및/또는 (iii) 35 ppb 또는 40 ppb 이상의 호기 산화질소 농도를 특징으로 하는 약학적 조성물, 또는 촉매 활성 DNA 분자.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 촉매 활성 DNA 분자 또는 약학적 조성물은 경구로, 비강으로, 정맥내로, 피하로, 국소적으로, 직장으로, 비경구적으로, 근육내로, 낭내로, 질내로, 복막내로, 척수강내로, 혈관내로, 국소적으로 (분말, 연고 또는 액적) 또는 스프레이 또는 흡입제의 형태로 투여되는 촉매 활성 DNA 분자 또는 약학적 조성물.
KR1020227014938A 2019-10-07 2020-10-07 개선된 활성을 갖는 촉매 활성 dna 분자의 제조 방법 및 천식의 치료 방법에서의 이의 용도 KR20220113675A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19201713.5A EP3805242A1 (en) 2019-10-07 2019-10-07 Method for the production of a catalytically active dna molecule having improved activity and its use in a method of treating asthma
EP19201713.5 2019-10-07
PCT/EP2020/078136 WO2021069502A1 (en) 2019-10-07 2020-10-07 Method for the production of a catalytically active dna molecule having improved activity and its use in a method of treating asthma

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220113675A true KR20220113675A (ko) 2022-08-16

Family

ID=68172111

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227014938A KR20220113675A (ko) 2019-10-07 2020-10-07 개선된 활성을 갖는 촉매 활성 dna 분자의 제조 방법 및 천식의 치료 방법에서의 이의 용도

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220340904A1 (ko)
EP (2) EP3805242A1 (ko)
JP (1) JP2022552193A (ko)
KR (1) KR20220113675A (ko)
CN (1) CN114728995A (ko)
CA (1) CA3152888A1 (ko)
IL (1) IL291938A (ko)
WO (1) WO2021069502A1 (ko)

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5348868A (en) * 1992-04-24 1994-09-20 Beckman Instruments, Inc. Methods and reagents for cleaving and deprotecting oligonucleotides
JPH09509323A (ja) * 1994-02-23 1997-09-22 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド 疾患関連遺伝子の発現を阻害するための方法および試薬
US6054576A (en) * 1997-10-02 2000-04-25 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Deprotection of RNA
AU2001284268A1 (en) * 2000-09-07 2002-03-22 Avecia Biotechnology, Inc. Synthons for oligonucleotide synthesis
US7655790B2 (en) * 2002-07-12 2010-02-02 Sirna Therapeutics, Inc. Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives
DE10346487A1 (de) * 2003-10-02 2005-05-12 Transmit Technologietransfer Verfahren zur Herstellung eines Zell- und/oder Gewebe- und/oder Krankheitsphasen-spezifischen Arzneimittels
US20050267300A1 (en) * 2004-04-05 2005-12-01 Muthiah Manoharan Processes and reagents for oligonucleotide synthesis and purification
EP1995253B1 (en) * 2006-02-27 2016-12-21 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Method for detaching protecting group on nucleic acid
DE102009058769A1 (de) * 2009-12-16 2011-06-22 MagForce Nanotechnologies AG, 10589 Temperaturabhängige Aktivierung von katalytischen Nukleinsäuren zur kontrollierten Wirkstofffreisetzung
DE102010007562A1 (de) * 2010-02-10 2011-08-11 sterna biologicals GmbH & Co KG, 35043 Dermatologische, pharmazeutische Zusammensetzung geeignet für Oligonukleotide
JP6730932B2 (ja) * 2014-04-30 2020-07-29 アジレント・テクノロジーズ・インクＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． リン保護基ならびにそれらの調製方法および使用
DK3093022T3 (da) 2015-05-15 2019-11-04 Sterna Biologicals Gmbh & Co Kg Gata-3-inhibitorer til anvendelse i behandlingen af th2-drevet astma
CN106256831A (zh) * 2015-06-18 2016-12-28 日东电工株式会社 切掉rna寡核苷酸的方法
WO2017005818A1 (en) * 2015-07-08 2017-01-12 Kuros Biosciences Ag Guanine-rich oligonucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
IL291938A (en) 2022-06-01
JP2022552193A (ja) 2022-12-15
CA3152888A1 (en) 2021-04-15
US20220340904A1 (en) 2022-10-27
EP3805242A1 (en) 2021-04-14
CN114728995A (zh) 2022-07-08
EP4041741A1 (en) 2022-08-17
WO2021069502A1 (en) 2021-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102335801B1 (ko) 안티센스 핵산
TWI801843B (zh) 製備寡聚物之方法
JPH08508493A (ja) ７−デアザプリン修飾オリゴヌクレオチド
WO2017047707A1 (ja) アンチセンス核酸
EP2125854B1 (en) Oligonucleotides containing high concentrations of guanine monomers
AU5469399A (en) 2&#39;-o-aminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
JPH072889A (ja) ２’−エーテル基を有するヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド
WO2000006590A1 (en) Rna targeted 2&#39;-modified oligonucleotides that are conformationally preorganized
JP7476101B2 (ja) ホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むギャップマーオリゴヌクレオチド
CN110023322B (zh) 新的双环核苷和由其制备的寡聚体
AU2017203685A1 (en) 3&#39;end caps for RNAi agents for use in RNA interference
EP4092118A1 (en) Novel thiophosphoramidites
US20210347800A1 (en) Process for the purification of oligonucleotides
Gao et al. Double-stranded cyclic oligonucleotides with non-nucleotide bridges
JPH09505307A (ja) 多キラル合成フォスホネートオリゴマー類
JP6828219B1 (ja) 核酸分子の製造方法
KR20220113675A (ko) 개선된 활성을 갖는 촉매 활성 dna 분자의 제조 방법 및 천식의 치료 방법에서의 이의 용도
KR20110004880A (ko) 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법
Ravikumar et al. Large-scale synthesis of oligodeoxyribonucleotide phosphorothioate using controlled-pore glass as support
WO2023117738A1 (en) Threose nucleic acid antisense oligonucleotides and methods thereof
CN112876534B (zh) 肝靶向化合物及缀合物
JP7476102B2 (ja) ホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド
Perez-Rentero et al. Novel oligonucleotide analogues containing a morpholinoamidine unit
Wagner et al. Pentopyranosyl Oligonucleotide Systems, Communication No. 12, The β‐d‐Xylopyranosyl‐(4′→ 2′‐oligonucleotide System
JP2022512877A (ja) Ｔｉａ１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド