CN106256831A - 切掉rna寡核苷酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及RNA寡核苷酸切除方法，包括使所述载有RNA寡核苷酸的通用支持物与包含烷基胺和一价无机盐的水溶液接触的步骤。本发明提供了能够抑制副产物的产生并增加目标RNA寡核苷酸的产量的切除方法，在所述副产物中，目标RNA寡核苷酸没有从通用接头切掉，所述副产物是在将所述目标RNA寡核苷酸从通用支持物切掉的过程中产生的。

Description

切掉RNA寡核苷酸的方法
技术领域
本发明主要涉及核酸的化学合成的领域。更具体地，本发明涉及将RNA寡核苷酸从固相载体切掉的方法。
背景技术
使用亚磷酰胺方法的固相合成方法已广泛用于核酸(例如DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸等)的化学合成。在固相亚磷酰胺方法中，核酸合成通常通过以下步骤进行。
首先，使作为待合成的核酸的3'-端的核苷经由3'-OH基团与可裂解的接头(例如琥珀酰基等)酯键键合，从而将其预先负载在用于固相合成的载体上(核苷接头)。随后，将其上负载有所述核苷接头的所述用于固相合成的载体放在反应柱中并置于核酸自动合成仪上。
根据核酸自动合成仪的合成程序，通常在反应柱中进行包括以下步骤的合成反应：
(1) 使用酸(例如三氯乙酸/二氯甲烷溶液等)移除受保护的核苷的5'-OH基团的步骤；
(2) 在活化剂(四唑等)的存在下，使核苷亚磷酰胺(核酸单体)与去保护的5'-OH基团偶联的步骤；
(3) 使用乙酸酐等使未反应的5'-OH基团加帽的步骤；和
(4) 使用碘水等氧化亚磷酸的步骤。重复这个合成循环，且以从3'-端至5'-端的方向进行寡核苷酸的延伸反应，从而合成具有目标序列的核酸。
最后，使用氨水、甲胺溶液等水解可裂解的接头，且将合成的核酸从所述用于固相合成的载体切除(非专利文件1)。此外，还报道了使用包含NaCl的氢氧化钠水溶液进行裂解(非专利文件2)。
当进行上述的合成时，如上所述，需要通过可裂解的接头将作为待成为3'-端的起始材料的核苷预先负载在用于固相合成的载体上。3'-端根据期望合成的核酸的序列而变化，在DNA寡核苷酸的情况下需要4种：dA、dG、dC、dT，且在RNA寡核苷酸的情况下需要4种：rA、rG、rC、rU。在要合成修饰的寡核苷酸时，因为需要预先处理以负载经修饰的核苷的用于固相合成的载体，而使所述过程变得复杂。
为了克服上述问题，已提出用于固相合成的负载有通用接头的载体(通用支持物)，作为连接所述固相载体和所述起始材料的接头，替代至今通常使用的核苷-琥珀酰接头等。在使用通用支持物时，不考虑将成为期望合成的核酸的3'-端的核苷或核苷酸的种类，按照与一般核酸自动合成相同的那些步骤，通过待成为3'-端的核苷亚磷酰胺的反应开始合成，且在合成后，通过与常规方法相似的方法将目标核酸从通用支持物切掉。有利地，如上所述，不需要用于固相合成的负载有各种核苷-接头的载体。
按照惯例，作为将RNA寡核苷酸从通用支持物切掉的方法，通常使用包括接触烷基胺或氨水/烷基胺混合溶液的方法(专利文件1)。此外，近年来，已开发出包括接触乙醇胺的方法(专利文件4)。但是，在这些方法中，不能有效地将RNA寡核苷酸从通用接头切除，产生出大量副产物，且不能以良好的纯度切掉目标RNA寡核苷酸。也即，在将目标RNA寡核苷酸从通用支持物切掉的方法中，仅固相载体被切割，不能良好地将RNA寡核苷酸从通用接头切除，且有时产生副产物。尽管可以通过更强的亲核试剂、更严苛的温度条件等裂解RNA寡核苷酸和通用接头之间的键，但所述裂解显著促进了RNA寡核苷酸的分解，这被认为降低了目标RNA寡核苷酸的产量。在另一方面，当在温和条件下进行切割以尝试提高RNA寡核苷酸的产量时，会产生大量副产物，其中的RNA寡核苷酸和通用接头没有被切割。此外，因为所述副产物和所述目标RNA寡核苷酸具有相似的特性(例如分子量、极性等)，通过例如层析等的分离和纯化技术进行纯化成为了难题。主要由于这些原因，难以在RNA寡核苷酸的合成中使用通用支持物。
文件列表
专利文件
[专利文件1] US 5804683 A
[专利文件2] US 20040147735 A1
[专利文件3] US 7041817 B2
[专利文件4] WO 2009140125 A2
[非专利文件]
[非专利文件1] Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry (2000) 3.1.1-3.1.28
[非专利文件2] Nucleic Acids Research (1999) Vol. 27, No. 10。
发明内容
[本发明要解决的问题]
本发明的目的在于提供能够抑制副产物的产生并增加目标RNA寡核苷酸的产量的切除方法，在所述副产物中，RNA寡核苷酸没有从通用接头切掉，所述副产物是在将所述目标RNA寡核苷酸从通用支持物切掉的过程中产生的。
[解决问题的方式]
本发明人已进行了深入研究以试图解决上述问题，并且发现通过在将目标RNA寡核苷酸从通用支持物切掉的方法中，使固相寡核苷酸接触含有烷基胺和一价无机盐的水溶液，可以抑制副产物的产生并且可以提高目标RNA寡核苷酸的产量，由此得以完成本发明。
因此，本发明提供了以下方案。
[1] 将化学合成在通用支持物上的RNA寡核苷酸从所述支持物切掉的方法，其包括
使所述载有RNA寡核苷酸的支持物与包含烷基胺和一价无机盐的水溶液接触的步骤。
[2] 在上述[1]中所述的方法，其中上述水溶液进一步包含醇。
[3] 在上述[1]或[2]中所述的方法，其中上述烷基胺是伯烷基胺。
[4] 在上述[1]-[3]中任一项所述的方法，其中上述水溶液中包含的一价无机盐的浓度是1 - 100 mM。
[5] RNA寡核苷酸的生产方法，包括：在通用支持物上化学合成RNA寡核苷酸的步骤；和
根据上述[1]-[4]中任一项所述的方法将所述合成的RNA寡核苷酸从所述支持物切掉的步骤。
[本发明的效果]
本发明的RNA寡核苷酸切除方法可以抑制副产物的产生并且增加目标RNA寡核苷酸的产量，在所述副产物中，所述目标RNA寡核苷酸没有从通用接头切掉。
附图说明
图1显示了在实施例1和比较实施例1中获得的HPLC图谱。
具体实施方式
通过参考其优选实施方式，对本发明进行更详细的解释。
本发明提供了将RNA寡核苷酸从通用支持物切掉的方法。也即，将RNA寡核苷酸单独从负载在固相载体上的通用接头和化学合成的RNA寡核苷酸的结合形式切掉的方法。在本发明的方法的优选实施方式中，也可以在切掉RNA寡核苷酸的同时移除RNA寡核苷酸的3'-端上的磷酸基团。
假定其反应机理包括以下过程：
(a) 通过烷基胺将固相载体和通用接头之间的酯键裂解而将固相载体移除，
(b) 作为(a)的结果，在通用接头的氧上产生的负电荷与RNA寡核苷酸的3'-端上的磷酸基团中的磷原子形成新的PO键，
(c) 几乎与(b)同时，RNA寡核苷酸的3'-端上的磷酸基团与糖骨架之间的PO键被裂解，从而移除RNA寡核苷酸的3'-端的磷酸基团和通用接头，最终获得3'-端上的磷酸基团被移除的RNA寡核苷酸。
在过程(b)中，当通用接头的氧上产生的负电荷没有与RNA寡核苷酸的3'-端上的磷酸基团中的磷原子形成新的PO键，而是与反应体系中存在的氢原子(质子)形成OH键时，认为产生了其中没有将目标RNA寡核苷酸从通用接头切除的副产物。
认为可以通过使固相寡核苷酸与包含烷基胺和一价无机盐的水溶液接触，而有效地抑制导致过程(b)中产生副产物的反应，这是本发明的特征。上述水溶液优选包含醇。
根据本发明，可以高效地切掉目标RNA寡核苷酸，且可以实现RNA寡核苷酸生产成本的显著降低。还可以实现由于高成本而至今尚不能实现的使用通用支持物的RNA寡核苷酸的大量合成。也即，可以使用一种通用支持物，按照一般核酸自动合成相同的那些步骤，通过待成为3'-端的核苷亚磷酰胺的反应，来合成所期望合成的核酸，而不考虑在期望合成的核酸的3'-端上的核苷或核苷酸的种类。此外，可以以高纯度切掉目标RNA寡核苷酸，假定其有助于改善核酸药物产品的质量，所述核酸药物产品是RNA寡核苷酸的主要工业用途。
在本说明书中，“核酸”意为其中核苷酸通过磷酸二酯键连接的链化合物(寡核苷酸)，且包括DNA、RNA等。虽然核酸可以是单链和双链中的任一种，但是因为可以使用核酸合成仪进行高效合成，其优选为单链。在本说明书中，“核酸”不仅包括包含嘌呤碱基(例如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)等)和嘧啶碱基(例如胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)等)的寡核苷酸，还包括包含其他经修饰的杂环类碱基的经修饰的寡核苷酸。
在本说明书中，“RNA寡核苷酸”是上述“核酸”，其在链中具有一个或多个核糖核苷酸单元。RNA寡核苷酸可以在链中的不少于10%、不少于20%、不少于30%、不少于40%、不少于50%、不少于60%、不少于70%、不少于80%、不少于90%、不少于95%或全部核苷酸单元中包含核糖核苷酸。
尽管对RNA寡核苷酸的核苷酸长度没有特别地限制，但其优选地为2-200个核苷酸。当核苷酸长度过长时，获得的核酸的产量和纯度降低。
在本说明书中，“接头”是指通过共价键连接两种物质的分子，且在核酸固相合成中连接固相载体和核酸。
在本说明书中，“通用接头”是不考虑期望合成的核酸的3'-端上的核苷或核苷酸的种类，可以按照一般核酸自动合成相同的那些步骤，使待成为3'-端的核苷亚磷酰胺与之反应的接头。为此，通用接头通常具有两个相邻碳原子；所述碳原子之一具有作为核酸合成起点的-OH基团，而另一个碳原子具有在移除保护基团后成为亲核基团的基团(例如-OH基团、-NH2基团、-SH基团)。可用于本发明的通用接头的特定实例包括，但不限于，在下述实施例中使用的那些，在JP-A-2011-088843和JP-A-2013-177371中描述的那些，UnyLinker (注册商标) (由 Isis Pharmaceuticals制造)等。
在本说明书中的“通用支持物”是用于固相合成的载体，其载有通用接头。
对所述固相载体没有特别地限制，只要其可以容易地通过使用过量的试剂洗涤而移除，例如，可以使用多孔合成聚合物载体，例如玻璃多孔载体、聚苯乙烯载体、丙烯酰胺载体等。固相载体优选具有有助于核酸合成的官能团。所述“有助于核酸合成”的官能团是指能够成为核酸合成的起点并且允许接头添加的官能团。其特定的实例包括氨基、羟基等。特定固相载体的实例包括在JP-A-2011-088843和JP-A-2013-177371中描述的那些等。在优选的实施方式中，可以使用作为NittoPhase (注册商标) (由Nitto Denko Corporation制造)可商购获得的低膨胀聚苯乙烯颗粒。
在本说明书中，“烷基胺”优选为伯烷基胺，更优选为甲胺、乙胺、丙胺或丁胺，最优选地为甲胺。
在本说明书中，“一价无机盐”包括，例如，氯化锂、氯化钾、氯化钠、溴化钠、碘化钾等。构成一价无机盐且具有更高的原子量阳离子和阴离子都倾向于显示更好的本发明的效果。考虑到效果、易操作性和易得性，溴化钠是优选的。
在水溶液中包含的一价无机盐的浓度优选为1 - 100 mM，更优选为5 - 80 mM。
在本说明书中，“醇”优选为甲醇、乙醇、丙醇(异丙醇)或丁醇。支链的存在与否没有特别限制。考虑到效果、易操作性和易得性，异丙醇是最优选的。
在水溶液中的醇含量优选为1-80体积%，更优选为3-60体积%。
在本说明书中，“接触”包括，例如浸渍、搅拌浸渍、液体通流、过滤等。
在本说明书中，对包含烷基胺和一价无机盐的水溶液与固相载体上的寡核苷酸接触的优选温度和时间没有特别限制。当接触温度为20℃±5℃时，接触时间优选为1 - 24小时，且当接触温度为40℃±5℃时，接触时间优选为0.25 - 6小时。
本发明还提供了RNA寡核苷酸的生产方法，其使用上述的本发明的切除方法。所述生产方法包括在上述通用支持物上化学合成RNA寡核苷酸的步骤(核酸合成反应)，和通过上述的切除方法将合成的RNA寡核苷酸从所述支持物切掉的步骤。
在本说明书中，“核酸合成反应”意为具体组成核酸的核苷酸的延伸反应。也即，核苷循序地结合至结合在固相载体上的核苷、核苷酸或寡核苷酸，以给出延伸的寡核苷酸。核酸合成反应的实例包括H-膦酸酯法、磷酸酯法、固相亚磷酰胺法等。在这些方法中，固相亚磷酰胺方法是优选的，因为核酸显示出高可合成性且可以获得高纯度的核酸。
通过固相亚磷酰胺法的核酸合成反应的优选实施方式包括包含以下步骤的每一步的方法：
(a) 将通用支持物放置于核酸自动合成仪的反应柱中的步骤；
(b) 使酸(例如二氯乙酸溶液等)流过反应柱以移除羟基保护基团，并洗涤的步骤；
(c) 进行将对应于3'-端并通过四唑等活化的核苷亚磷酰胺偶联至上述羟基，使未反应的羟基加帽，和氧化亚磷酸酯的一系列步骤，和重复所述系列直到获得目标序列的步骤；和
(d) 在使用仪器完成合成步骤后，按照上述的本发明的切除方法处理用于核酸固相合成的载体，而获得目标RNA寡核苷酸的步骤。
实施例
以下通过参考实施例，对本发明进行更详细的解释，所述实施例不应理解为限制性的。
[实验1]
(RNA寡核苷酸的合成)
以对应于1 μmol的通用接头的量，将结合以下(A)-(D)的通用接头的通用支持物(NittoPhase (注册商标) (由Nitto Denko Corporation制造))分别填充至反应柱中，并且使用核酸合成仪nS-8II (由GeneDesign, Inc.制造)合成21 mer的RNA寡核苷酸(5'r(CGAGAAGCGCGAUACCAU GU) dT3') (SEQ ID NO: 1)。
(A) 下图的结合UnyLinker (注册商标) (由 Isis Pharmaceuticals制造)的通用支持物
(B) 下图的通用支持物
(C) 下图的通用支持物
(D)下图的通用支持物
。
[实施例1]
在通过使用(A)的通用支持物合成RNA寡核苷酸后，将与RNA寡核苷酸结合的固相载体于45℃在包含20 mM溴化钠的40%甲胺水溶液/异丙醇(1:1)混合溶液中浸渍4小时，从而将RNA寡核苷酸从固相载体切掉。依次向该溶液添加二甲亚砜和三乙胺三氟化氢，且将混合物在45℃加热1.5小时以移除RNA 2'-端保护基团(叔丁基二甲氧基甲硅烷基保护基团)。向该溶液添加50 mM乙酸钠溶液，且将所述混合物用水稀释以给出RNA寡核苷酸样品溶液。
[实施例2 - 4]
除了将(A)的通用支持物换为(B)的通用支持物之外，以如实施例1中相同方法，获得实施例2的RNA寡核苷酸样品溶液。
除了将(A)的通用支持物换为(C)的通用支持物之外，以如实施例1中相同方法，获得实施例3的RNA寡核苷酸样品溶液。
除了将(A)的通用支持物换为(D)的通用支持物之外，以如实施例1中相同方法，获得实施例4的RNA寡核苷酸样品溶液。
[比较实施例1]
在通过使用(A)的通用支持物合成RNA寡核苷酸后，将与RNA寡核苷酸连接的固相载体于65℃在28%氨水/40%甲胺水溶液的(1:1)混合溶液中浸渍1.5小时，从而将RNA寡核苷酸从固相载体切掉。依次向该溶液添加二甲亚砜和三乙胺三氟化氢，且将混合物在65℃加热1.5小时以移除RNA 2'-端保护基团(叔丁基二甲氧基甲硅烷基保护基团)。向该溶液添加50 mM乙酸钠溶液，且将所述混合物用水稀释以给出RNA寡核苷酸样品溶液。
[比较实施例2 - 4]
除了将(A)的通用支持物换为(B)的通用支持物之外，以如比较实施例1中相同方法，获得比较实施例2的RNA寡核苷酸样品溶液。
除了将(A)的通用支持物换为(C)的通用支持物之外，以如比较实施例1中相同方法，获得比较实施例3的RNA寡核苷酸样品溶液。
除了将(A)的通用支持物换为(D)的通用支持物之外，以如比较实施例1中相同方法，获得比较实施例4的RNA寡核苷酸样品溶液。
(测量RNA寡核苷酸纯度和副产物的量)
通过吸收分光光度计测量在实施例1-4和比较实施例1-4中获得的RNA寡核苷酸样品溶液的吸光度(OD/μmol：OD/1 μmol的通用接头)。
此外，通过高效液相层析(HPLC)测量在实施例1-4和比较实施例1-4中获得的RNA寡核苷酸样品溶液(测量条件：柱：Waters XBridge OST C18 2.5 μm 50×4.6 mm，UV检测：260 nm，缓冲液A：在水中100 mM HFIP/7 mM TEA, pH 8.0，缓冲液B：甲醇，温度：60℃)。实施例1和比较实施例1中获得的HPLC图谱显示在图1中。在图1中，目标RNA寡核苷酸的保留时间为大约14.8分钟，且连接至RNA寡核苷酸的通用接头的副产物的保留时间被检测为大约16.2分钟。
表1显示了实验1中获得的数据。在实施例中，证实了作为RNA寡核苷酸产量的指标的OD×FLP ((每1 μmol通用接头的吸光度:OD:光密度)×(通过HPLC测量的目标RNA寡核苷酸的纯度: FLP:全长纯度))增加，且其中通用接头与目标RNA寡核苷酸结合的副产物的产生被抑制。在另一个方面，证实在比较实施例中RNA寡核苷酸纯度低于实施例中的RNA寡核苷酸纯度，且副产物的量高。
表1
。
[实验2]
(RNA寡核苷酸的合成)
以对应于151 μmol通用接头的量，将(A)的通用支持物填充至反应柱中，且使用核酸合成仪AKTA oligopilot plus100 (由GE Healthcare Japan制造)合成21 mer的RNA寡核苷酸 (5'r (CGAGAAGCGCGAUACCAUGU) dT3') (SEQ ID NO: 1)。
[实施例5 - 11]
制备具有以下组成的水溶液(切除试剂)。
实施例5: (E) 含有20 mM氯化锂的40%甲胺水溶液/异丙醇(1:1)混合溶液
实施例6: (F) 含有20 mM氯化钾的40%甲胺水溶液/异丙醇(1:1)混合溶液
实施例7: (G) 含有20 mM碘化钾的40%甲胺水溶液/异丙醇(1:1)混合溶液
实施例8: (H) 含有20 mM氯化钠的40%甲胺水溶液/异丙醇(1:1)混合溶液
实施例9: (I) 含有20 mM溴化钠的40%甲胺水溶液/异丙醇(1:1)混合溶液
实施例10: (J) 含有20 mM溴化钠的40%甲胺水溶液/乙醇(1:1)混合溶液
实施例11: (K) 含有20 mM溴化钠的40%甲胺水溶液。
将其中结合上述RNA寡核苷酸的固相载体于45℃在上述的切除试剂(E) - (K)中浸渍2小时，从而将RNA寡核苷酸从所述固相载体切掉。依次向该溶液添加二甲亚砜和三乙胺三氟化氢，且将混合物在60℃加热1小时以移除RNA 2'-端保护基团(叔丁基二甲氧基甲硅烷基保护基团)。向该溶液添加50 mM乙酸钠溶液，且将所述混合物用水稀释以给出RNA寡核苷酸样品溶液。
[比较实施例5 - 7]
除了制备具有以下组成的水溶液(切除试剂)，以如比较实施例5中相同方法，获得RNA寡核苷酸样品溶液。
比较实施例5: (L) 40%甲胺水溶液
比较实施例6: (M) 40%甲胺水溶液/28%氨水(1:1)混合溶液
比较实施例7: (N) 40%甲胺水溶液/异丙醇 (1:1)混合溶液。
(测量RNA寡核苷酸产量和副产物的量)
在与实施例1-4和比较实施例1-4中相似的条件下，通过高效液相层析(HPLC)测量在实施例5-11和比较实施例5-7中获得的RNA寡核苷酸样品溶液。
表2显示了在实验2中获得的数据。在实施例中，证实了作为RNA寡核苷酸产量的指标的峰面积/nmol (每1 nmol通用接头的RNA寡核苷酸的HPLC峰面积)增加，且其中通用接头与目标RNA寡核苷酸结合的副产物的产生被抑制。
表2
。
[实验3]
制备具有以下组成的水溶液(切除试剂)。
实施例12: (O) 含有10 mM溴化钠的40%甲胺水溶液/异丙醇(1:1)混合溶液
实施例13: (P) 含有20 mM溴化钠的40%甲胺水溶液/异丙醇(1:1)混合溶液
实施例14: (Q) 含有30 mM溴化钠的40%甲胺水溶液/异丙醇(1:1)混合溶液
实施例15: (R) 含有20 mM溴化钠的40%甲胺水溶液/异丙醇(9:1)混合溶液
实施例16: (S) 含有20 mM溴化钠的40%甲胺水溶液/异丙醇(8:2)混合溶液
实施例17: (T) 含有20 mM溴化钠的40%甲胺水溶液/异丙醇(6:4)混合溶液
实施例18: (U) 含有60 mM溴化钠的40%甲胺水溶液/异丙醇(95:5)混合溶液
实施例19: (V) 含有60 mM溴化钠的40%甲胺水溶液/异丙醇(9:1)混合溶液
实施例20: (W) 含有60 mM溴化钠的40%甲胺水溶液/异丙醇(8:2)混合溶液。
将在实验2中获得的其中结合RNA寡核苷酸的固相载体于45℃在实施例12-17的切除试剂((O) - (T))中浸渍2小时，和于23℃在实施例18-20的切除试剂((U) - (W))中浸渍4小时，从而将RNA寡核苷酸从固相载体切掉。依次向该溶液添加二甲亚砜和三乙胺三氟化氢，且将实施例12-14 ((O) - (Q))在60℃加热1小时，和将实施例15-20 ((R) - (W))在45℃加热1.5小时，以移除RNA 2'-端保护基团和TBDMS保护基团。向这些溶液添加50 mM乙酸钠溶液，且将所述混合物用水稀释以给出RNA寡核苷酸样品溶液。
(测量RNA寡核苷酸产量和副产物的量)
以如实施例5 - 11和比较实施例5-7中相同的方式进行测量。
表3显示了实验3中获得的数据。在实施例中，证实作为RNA寡核苷酸产量的指标的峰面积/nmol (每1 nmol通用接头的RNA寡核苷酸的HPLC峰面积)增加，且其中通用接头与目标RNA寡核苷酸结合的副产物的产生被抑制。
表3
。
[实验4]
(RNA寡核苷酸的合成)
以对应于80 μmol通用接头的量，将(A)的通用支持物填充至反应柱中，且使用核酸合成仪AKTA oligopilot plus100 (由GE Healthcare Japan制造)合成19 mer的RNA寡核苷酸(5'-r (CCAUUAACGAGCUGCUUAA)-3' (SEQ ID NO: 2)。
相似地，以对应于80 μmol通用接头的量，将(A)的通用支持物填充至反应柱中，且使用核酸合成仪AKTA oligopilot plus100 (由GE Healthcare Japan制造)合成19 mer的RNA寡核苷酸(5'-r(UUAAGCAGCUCGUUAAUGG)-3' (SEQ ID NO: 3)。
(将RNA寡核苷酸从固相载体切掉)
制备具有以下组成的水溶液(切除试剂)。
切除试剂(X): 含有80 M溴化钠的40%甲胺水溶液/异丙醇 (8:2)混合溶液。
在实施例21中，将如上文所述获得的结合SEQ ID NO: 2的RNA寡核苷酸的固相载体于25℃在切除试剂(X)中浸渍18小时，从而将所述RNA寡核苷酸从所述固相载体切掉。在实施例22中，将如上文所述获得的结合SEQ ID NO: 3的RNA寡核苷酸的固相载体于25℃在切除试剂(X)中浸渍14小时，从而将所述RNA寡核苷酸从所述固相载体切掉。
依次向这些溶液添加二甲亚砜和三乙胺三氟化氢，且将混合物在65℃加热1.5小时以移除RNA 2'-端保护基团和TBDMS保护基团。向这些溶液添加50 mM乙酸钠溶液，且将所述混合物用水稀释以给出RNA寡核苷酸样品溶液。
(测量RNA寡核苷酸产量和副产物的量)
以如实施例5-11和比较实施例5-7中相同方式进行测量。
表4显示了实验4中获得的数据。在实施例21和22中，证实作为RNA寡核苷酸产量的指标的峰面积/nmol (每1 nmol通用接头的RNA寡核苷酸的HPLC峰面积)增加，且其中通用接头与目标RNA寡核苷酸结合的副产物的产生被抑制。
表4
峰面积/nmol FLP (%) 副产物(%)
实施例21 4810643 71.2 2
实施例22 5128200 75.9 3
本申请是基于在日本提交的专利申请号2015-123222 (提交日期：2015年6月18日)，其内容以其整体并入本文。

Claims (5)

1.将化学合成在通用支持物上的RNA寡核苷酸从所述支持物切掉的方法，包括：使所述载有RNA寡核苷酸的支持物与包含烷基胺和一价无机盐的水溶液接触的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中所述水溶液进一步包含醇。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述烷基胺是伯烷基胺。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述水溶液中包含的一价无机盐的浓度是1- 100 mM。
5.RNA寡核苷酸的生产方法，包括：在通用支持物上化学合成RNA寡核苷酸的步骤；和
根据权利要求1-4中任一项的方法将所述合成的RNA寡核苷酸从所述支持物切掉的步骤。
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