CN103224502A - 用于核酸固相合成的接头和载体 - Google Patents

用于核酸固相合成的接头和载体 Download PDF

Info

Publication number
CN103224502A
CN103224502A CN2013100354321A CN201310035432A CN103224502A CN 103224502 A CN103224502 A CN 103224502A CN 2013100354321 A CN2013100354321 A CN 2013100354321A CN 201310035432 A CN201310035432 A CN 201310035432A CN 103224502 A CN103224502 A CN 103224502A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
solid phase
carrier
methyl
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2013100354321A
Other languages
English (en)
Inventor
塚本真幸
铃木纪尊
早川芳宏
前田惠里
森健二郎
味吞宪二郎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nagoya University NUC
Nitto Denko Corp
Original Assignee
Nagoya University NUC
Nitto Denko Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nagoya University NUC, Nitto Denko Corp filed Critical Nagoya University NUC
Publication of CN103224502A publication Critical patent/CN103224502A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/22—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Coating Of Shaped Articles Made Of Macromolecular Substances (AREA)

Abstract

本发明提供了能够合成在3'末端具有羟基的核酸的通用接头，携带该接头的通用载体，和使用该通用载体合成核酸的方法。本发明提供了用于核酸固相合成的接头，所述接头包含通过下式表示的化合物

Description

用于核酸固相合成的接头和载体
技术领域
本发明涉及用于核酸固相合成的接头，携带该接头的用于固相合成的载体和利用该载体的核酸制备方法。
背景技术
对于核酸如DNA、RNA等等的化学合成，广泛采用利用亚磷酰胺法的固相合成工艺。在固相亚磷酰胺法中，通常通过以下步骤合成核酸。
首先，将待合成核酸3’末端的核苷通过3’-OH基团与切割接头(如琥珀酰基)形成酯键，以便首先在用于固相合成的载体上携带核苷(核苷接头)。然后，将携带核苷接头的用于固相合成的载体置于反应柱中，然后将反应柱设置在自动化核酸合成仪上。
其后，根据自动化核酸合成仪的合成程序通常在反应柱中进行包括以下步骤的合成反应：
(1) 用酸如三氯乙酸/二氯甲烷溶液等等对带保护的核苷的5’-OH 基团进行脱保护的步骤；
(2) 在活化剂(四唑等等)存在的情况下用脱保护的5’-OH 基团偶联核苷亚磷酰胺(核酸单体)的步骤；
(3) 用乙酸酐等等为未反应的5’-OH 基团加帽的步骤；和
(4) 用含水碘等等氧化亚磷酸盐的步骤。
通过重复合成循环，促进从3’末端至5’末端方向的寡核苷酸延伸反应，合成具有期望序列的核酸。
最后，用氨水、甲胺溶液等等水解切割接头，以从用于固相合成的载体切割合成的核酸(非专利文献1)。
如上述，当进行以上提及的合成时，必需预先经由切割接头在用于固相合成的载体上携带将在3’末端的核苷(原材料)。而且，3’末端会随着期望合成的核酸的序列而变化。在DNA 寡核苷酸的情况下，dA、dG、dC、dT这四种是必要的，在RNA的情况下，rA、rG、rC、rU这四种也是必要的。为了合成经修饰的寡核苷酸，先前携带经修饰的核苷的用于固相合成的载体是必要的，这使得工艺变得复杂。
为了解决上述问题，已经开发了携带通用接头的用于固相合成的载体(通用载体)作为接头，以连接固相载体和原材料，替代目前为止通常使用的核苷-琥珀酰接头等等。利用通用载体，与用于期望合成的核酸的3’末端的核苷或者核苷酸的种类无关，所述方法包括在与常规自动化核酸合成相同的步骤中使核苷亚磷酰胺反应以位于3’末端以启动合成，和在合成期望的核酸后，通过与常规方法类似的方法从用于固相合成的载体切割所述核酸。如上所述制备携带各种核苷-接头的用于固相合成的载体不是必需的。
提出了一些通用载体，其为期望待合成的核酸的3’末端提供羟基(专利文献1–4和非专利文献2和3)。这些通用载体的结构具有两个相邻碳原子，一个碳原子与-OH 基团连接成为核酸合成的起点，另一个碳原子与基团(例如-OH 基团，-NH2 基团，-SH 基团)连接在除去保护基团后成为亲核基团。当在核酸合成后通过氨水等等切割核酸时，这些亲核基团的保护基团也被解离以攻击3’末端磷，磷酸基团被从3’末端切割以形成环磷酸酯。全部都用于合成在3’末端具有羟基的核酸。
在3’末端具有羟基的核酸是非常有用的，因为它在生化领域如核酸药物等方面被广泛要求。鉴于这样的情况，期望能够合成在5’末端或者3’末端具有羟基的核酸的通用接头和携带该接头的通用载体。
文献列表
专利文献
专利文献 1：US-B-5681945
专利文献 2：US-B-6653468
专利文献 3：WO2005/049621
专利文献 4：US-A-2005/0182241
非专利文献
非专利文献 1：Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry (2000) 3.1.1-3.1.28
非专利文献 2：Bio Techniques，22，752-756 (1997)
非专利文献 3：Tetrahedron，57，4977-4986 (2001)。
发明内容
本发明解决的问题
本发明目的是提供能够合成在3’末端具有羟基的核酸的通用接头，携带该接头的通用载体，和利用该通用载体合成核酸的方法。
特别地，本发明目的是提供用于固相合成的载体，其能够通用地以高纯度合成在3’末端具有羟基的核酸，其不需要具有预先携带的经修饰的核苷的用于固相合成的载体，即使在合成经修饰的寡核苷酸时。
解决问题的手段
因此，本发明提供以下。
[1] 用于核酸固相合成的接头，包括由下式代表的化合物
Figure 294705DEST_PATH_IMAGE001
其中
X1和X2各自独立地是能够通过酸解离的羟基保护基团，
L1和L2各自独立地是能够通过碱裂解的连接部分，
R1-R6各自独立地是氢原子；任选地被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基；C1-6烷氧基；C1-7酰基；单或双- C1-6烷基氨基；或卤素原子，或
R2 和R5和与之键合的碳原子连接在一起以形成3元至8元的碳环或杂环，所述碳环或杂环各自任选地被选自如下的取代基所取代：(1)氧代基，(2)任选地被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基，和(3)任选地被C1-6烷氧基-羰基取代的苯基。
[2] 上述[1]的接头，其中L1和L2中至少一个可以被连接至载体而用于核酸固相合成。
[3] 上述[1]或[2]的接头，其中X1和X2是二甲氧基三苯甲基。
[4] 用于核酸固相合成的载体，其具有由下式代表的结构
Figure 211845DEST_PATH_IMAGE002
其中
X1和X2各自独立地是能够通过酸解离的羟基保护基团，
L1和L2各自独立地是能够通过碱裂解的连接部分，
Sp是固相载体，
R1-R6各自独立地是氢原子；任选地被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基；C1-6烷氧基；C1-7酰基；单或双- C1-6烷基氨基；或卤素原子，或
R2 和R5和与之键合的碳原子连接在一起以形成3元至8元的碳环或杂环，所述碳环或杂环各自任选地被选自如下的取代基所取代：(1)氧代基，(2)任选地被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基，和(3)任选地被C1-6烷氧基-羰基取代的苯基。
[5] 上述[4]的载体，其中L1是琥珀酰基。
[6] 上述[4]或[5]的载体，其中L1和L2是琥珀酰基。
[7] 上述[4]-[6]中任一项的载体，其中X1和X2是二甲氧基三苯甲基。
[8] 根据上述[4]-[7]中任一项所述的载体，其中Sp是由多孔性合成聚合物颗粒或多孔性玻璃颗粒组成的固相载体。
[9] 产生核酸的方法，包括在上述[4]-[8]中任一项的载体上进行核酸合成反应的步骤。
[10] 上述[9]的产生方法，其中通过固相亚磷酰胺方法进行所述核酸合成反应。
发明效果
本发明用于核酸固相合成的接头是通用接头，本发明的携带该接头的用于核酸合成的载体是通用载体。本发明的携带该接头的用于核酸合成的载体不需要携带期望合成的核酸的3’末端核苷酸的用于固相合成的载体，并且可以以高纯度合成在3’末端中引入具有羟基的核酸。它不需要预先携带具有经修饰的核苷或核苷酸的用于固相合成的载体，即使在合成经修饰的寡核苷酸时，并且能够以高纯度合成在3’末端中引入羟基的核酸。
因此，本发明的用于核酸合成的载体优选被用来自动合成在3’末端具有羟基的核酸。而且，利用本发明的用于核酸合成的载体的核酸制备方法不需要单独引入羟基到合成核酸的3’末端中，这与常规方法不同。
附图说明
图1显示在实施例2(a)和比较实施例1(b)中获得的DNA 寡核苷酸溶液的HPLC 图。
图2显示在实施例4(a)和比较实施例2(b)中获得的DNA 寡核苷酸溶液的HPLC 图。
图3显示在实施例6(a)和比较实施例3(b)中获得的DNA 寡核苷酸溶液的HPLC 图。
实施方案说明
此处所用术语“核酸”指的是一种直链化合物(寡核苷酸)，其中核苷酸经由磷酸二酯键连接，并且被认为包括DNA，RNA等。所述核酸可以为单链的或双链的。因为它允许利用核酸合成仪的有效合成，核酸优选是单链的。在本说明书中“核酸”不仅包括含有嘌呤碱基如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)等等和嘧啶碱基如胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)等等的寡核苷酸，而且还包括含有其它经修饰的杂环碱基的经修饰的寡核苷酸。
所述核酸的核苷酸长度并无特别限定，所述核酸优选为2-200核苷酸长度。如果核酸过长，则所得核酸的产率和纯度降低。
在本说明书中“接头”是指一种分子，其经由共价键连接两个物质。在本发明中，所述接头连接固相载体和核酸。
本发明的用于核酸固相合成的接头是由下式表示的。
Figure 804632DEST_PATH_IMAGE003
其中
X1和X2各自独立地是能够通过酸解离的羟基保护基团。
保护基团的实例包括三苯甲基(Tr)、单甲氧基三苯甲基(MMTr)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)等等。这些保护基团可以利用质子酸如三氯乙酸、二氯乙酸等等的二氯甲烷或者甲苯溶液解离。因为用酸脱保护是容易的，因此X1 和 X2优选地是DMTr。
L1和L2各自独立地是能够通过碱裂解的连接部分，L1和L2中的至少一个仅需要可以连接至用于核酸固相合成的载体。L1和L2的实例包括但不限于，琥珀酰基(琥珀酰基接头)，乙酰基或Q接头(Pon等，Nucleic Acids Res.，27，1531 (1999))等。为了使接头合成的步骤数最小化并降低成本，L1和L2中的至少一个优选琥珀酰基，更优选L1和L2是琥珀酰基。通过用氨水、氨水/甲胺混合物等的水解可以容易地裂解这些连接部分，在自动合成完成后，从用于固相合成的载体裂解寡核苷酸。也就是说，当产生具有连接在X1和X2位置的合成的寡核苷酸的分子时，认为从本发明的用于核酸固相合成的接头裂解L1和L2，这通过上述式所示，与此同时，本发明的接头由于产生的“o-”的亲核反应而从合成的寡核苷酸被释放并攻击在3'末端的磷原子以形成环状磷酸酯，从而可以获得在3'末端具有羟基的合成的寡核苷酸。后面描述了本发明的如这种通用的载体的反应。
R1-R6各自独立地是氢原子；任选地被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基；C1-6烷氧基；C1-7酰基；单或双- C1-6烷基氨基；或卤素原子，或
R2 和R5和与之键合的碳原子连接在一起以形成3元至8元的碳环或杂环，所述碳环或杂环各自任选地被选自如下的取代基所取代：(1)氧代基，(2)任选地被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基，和(3)任选地被C1-6烷氧基-羰基取代的苯基。
在本说明书中，“C1-6 烷基”的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、叔戊基、己基等等。这些中，甲基或者乙基是优选的。
在本说明书中，“C1-6 烷氧基”的实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等等。这些中，甲氧基是优选的。
在本说明书中，“任选地被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基”的实例包括对于上述的“C1-6烷基”所例举的那些基团，和甲氧基甲基、甲氧基乙基、甲氧基正丙基、甲氧基异丙基、乙氧基甲基、正丙氧基甲基、正丁氧基甲基等。这些中，甲基、乙基、甲氧基甲基或甲氧基乙基是优选的。
在本说明书中，作为“C1-7酰基”，可以提到
(1) 甲酰基
(2) 羧基，
(3) C1-6烷基-羰基，
(4) C1-6烷氧基-羰基，等等。
“C1-6烷基-羰基”的实例包括乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、己酰基等等。这些中，乙酰基是优选的。
“C1-6烷氧基-羰基” 的实例包括甲氧基羰基、乙氧基羰基、正丙氧基羰基、异丙氧基羰基、正丁氧基羰基、戊氧基羰基、己氧基羰基等等。这些中，甲氧基羰基是优选的。
上述“C1-7酰基”中，C1-6烷氧基-羰基是优选的，甲氧基羰基是尤其优选的。
在本说明书中，“单或双-C1-6烷基氨基”的实例包括甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、异丙基氨基、正丁基氨基、异丁基氨基、仲丁基氨基、叔丁基氨基、正戊基氨基、异戊基氨基、仲戊基氨基、叔戊基氨基、己基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、二正丙基氨基、二异丙基氨基、二正丁基氨基等等。这些中，甲基氨基、二甲基氨基、乙基氨基或二乙基氨基是优选的。
在本说明书中，“卤素原子”的实例包括氯原子、氟原子、溴原子、碘原子。这些中，氯原子或者氟原子是优选的。
在本说明书中，“3元至8元的碳环”的实例包括C3-8环烷烃，如环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷、环辛烷等等；以及C3-8环烯烃，如环丙烯、环丁烯、环戊烯、环己烯、环庚烯、环辛烯等等。这些基团中，C5-6环烷烃或C5-6环烯烃是优选的。
在本说明书中，“3元至8元的杂环”的实例包括包括3元至8元的(优选5元或6元的)芳族杂环基和非芳族杂环基团，其包含作为除了碳原子之外的环构成原子的1至4个选自如下的杂原子：氧原子、硫原子和氮原子，例如，3元至8元的芳族杂环如呋喃、噻吩、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、吡咯、咪唑、吡唑、噻唑、异噻唑、噁唑、异噁唑、噁二唑、噻二唑、三唑、三嗪等等；3元至8元的非芳族杂环如氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、吗啉、硫代吗啉、哌嗪、六亚甲基亚胺、噁唑烷、噻唑烷、咪唑烷、噁唑啉、噻唑啉、咪唑啉、间二氧杂环戊烯、二氧戊环、二氢噁二唑、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、噻喃、四氢噻喃、二氢呋喃、四氢呋喃、吡唑烷、吡唑啉、二氢吡啶、四氢吡啶、二氢嘧啶、四氢嘧啶、二氢三唑、四氢三唑等等等。这些中，5元或6元的非芳族杂环(优选四氢呋喃、吡咯烷)是优选的。
在本说明书中，“任选地被C1-6烷氧基-羰基取代的苯基”的实例包括苯基、2-甲氧基羰基苯基、3-甲氧基羰基苯基、4-甲氧基羰基苯基、2-乙氧基羰基苯基、3-乙氧基羰基苯基、4-乙氧基羰基苯基、2-正丙氧基羰基苯基、3-正丙氧基羰基苯基、4-正丙氧基羰基苯基、2-异丙氧基羰基苯基、3-异丙氧基羰基苯基、4-异丙氧基羰基苯基等等。这些中，苯基、2-甲氧基羰基苯基、3-甲氧基羰基苯基、4-甲氧基羰基苯基、2-乙氧基羰基苯基、3-乙氧基羰基苯基、4-乙氧基羰基苯基、2-乙氧基羰基苯基、3-乙氧基羰基苯基或4-乙氧基羰基苯基是优选的。
R1优选地是氢原子。
R3优选地是氢原子。
R4优选地是氢原子。
R6优选地是氢原子。
R2优选地是C1-7酰基，更优选C1-6烷氧基-羰基，尤其优选地是甲氧基羰基。
R5优选地是C1-7酰基，更优选C1-6烷氧基-羰基，尤其优选地是甲氧基羰基。
或者，R2和R5和与之键合的碳原子连接在一起以形成5元或6元的非芳族杂环(优选四氢呋喃或吡咯烷)，所述非芳族杂环各自任选地被选自如下的取代基所取代：(1)氧代基，(2)被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基，和(3)被C1-6烷氧基-羰基取代的苯基。
本发明的用于核酸固相合成的固相载体携带上述本发明的用于核酸固相合成的接头，通过下式表示
Figure 199841DEST_PATH_IMAGE004
其中X1和X2，L1和L2，以及R1-R6如上所定义。
Sp是固相载体。为了方便起见，Sp结合至L1，但也可以结合至L2。固相载体不受特别限定，只要过量使用的试剂可以被容易地通过洗涤除去，例如玻璃多孔性载体、多孔性合成聚合物载体如聚苯乙烯载体、丙烯酰胺载体等等，等等可以被提及。
在本发明的优选实施方案中，在上述式中，Sp是玻璃多孔性载体。
这里，“玻璃多孔性载体”是指一种多孔性载体，其含有玻璃作为构成的成分，它的实例包括但不限于粒状形状的多孔性玻璃颗粒(CPG)等等。更具体地说，作为上述CPG，具有长链氨基烷基间隔子的CPG 固相载体(LCAA-CPG固相载体)是优选使用的，和进一步为了合成长链核苷酸，使用具有优选20–400nm更优选50–200nm最优选100nm的CPG孔的CPG。
在本发明的另一个优选实施方案中，在上述式中，Sp是聚苯乙烯载体。这里，“聚苯乙烯载体”是一种固相载体，其由含有结构单元(A)和/或其作为结构单元的取代的衍生物的共聚物组成：所述结构单元(A)通过下式表示：
Figure 14213DEST_PATH_IMAGE005
。结构单元(A)的取代的衍生物的实例包括一种化合物，其中包含于结构单元(A)中的一个或者更多个氢原子(包括苯环的氢原子)被下列取代：碳数目为1-6的烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、叔戊基)、卤素原子、氨基、羟基、羧基、砜基、氰基、甲氧基、硝基、乙烯基等等。取代基优选是氨基或者羟基。取代基的位置不受特别限定，优选是相对于苯环上主链的对位。结构单元(A)的优选取代衍生物是在下式中显示的羟基苯乙烯结构单元(B)。
Figure 898992DEST_PATH_IMAGE006
相对于构成聚苯乙烯载体的共聚物中包含的结构单位总数，结构单元(A)和/或其取代衍生物的量不受特别限定，通常是50至100重量%，优选60至100重量%。
可与上述结构单元(A)共聚的单体化合物的具体的实例包括但不限于苯乙烯；核心烷基取代的苯乙烯如邻甲基苯乙烯、间甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、2,4-二甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、三甲基苯乙烯、和对叔丁基苯乙烯等等；α-烷基取代的苯乙烯如α-甲基苯乙烯、α-甲基-对甲基苯乙烯等等；核心卤代苯乙烯如氯苯乙烯、二氯苯乙烯、氟苯乙烯、五氟苯乙烯、溴苯乙烯等等；烷基卤苯乙烯如氯甲基苯乙烯、氟甲基苯乙烯等等；羟基苯乙烯；羟甲基苯乙烯；苯甲酸乙烯酯；苯乙烯磺酸钠；氰基苯乙烯；甲氧基苯乙烯；乙氧基苯乙烯；丁氧基苯乙烯；硝基苯乙烯；酰氧基苯乙烯如乙酰氧基苯乙烯、苯甲酰氧基苯乙烯等等，等等。进一步实例包括但不限于(甲基)丙烯酸烷酯单体如(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯等等，乙烯基氰单体例如丙烯腈、甲基丙烯腈、乙基丙烯腈等等，等等。
在本发明的另一个实施方案中，在上述式中，Sp可以是固相载体，由下列构成：苯乙烯-羟基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物颗粒(JP-A-2005-097545，JP-A-2005-325272和JP-A-2006-342245)或苯乙烯-(甲基)丙烯腈-羟基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(JP-A-2008-074979)，除了上述结构单位(A)和(B)外，具有由下式表示的二乙烯基苯结构单元(C)：
Figure 166026DEST_PATH_IMAGE007
等等。另外，上述二乙烯基苯结构单元(C)中的一个或者更多个氢原子(包括苯环的氢原子)可以被下列取代：碳数目为1-6的烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、叔戊基)、卤素原子、氨基、羟基、羧基、砜基、氰基、甲氧基、硝基、乙烯基等等。取代基优选地是氨基或者羟基。
在上述式中，当Sp是由上述苯乙烯-(甲基)丙烯腈-羟基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物组成的固相载体时，(甲基)丙烯腈的结构单元可以含有结构单元丙烯腈和甲基丙烯腈的每一个或者两者。当相对于苯乙烯-(甲基)丙烯腈-羟基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的结构单元总数，(甲基)丙烯腈的结构单元的量过高或者过低时，膨胀程度会随着有机溶剂的种类而大大变化。因此，该量优选为2–11mmol/g。
在本发明的另一个优选实施方案中，在上述式中，Sp是丙烯酰胺载体。更具体地说，在上述式中，Sp可以是用于固相合成的载体，其除以上提及结构单位(A)和(C)之外，还含有进一步含有(甲基)丙烯酰胺衍生物单体的芳族单乙烯化合物-二乙烯化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物。
在上述式中，当Sp是由上述芳族单乙烯化合物-二乙烯化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物组成的固相载体时，上述芳族单乙烯化合物不受特别限定。例如苯乙烯；核心烷基取代的苯乙烯如邻甲基苯乙烯、间甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、2,4-二甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、三甲基苯乙烯、对叔丁基苯乙烯等等；α-烷基取代的苯乙烯如α-甲基苯乙烯、α-甲基-对甲基苯乙烯等等；核心卤代苯乙烯如氯苯乙烯、二氯苯乙烯、氟苯乙烯、五氟苯乙烯、溴苯乙烯等等；烷基卤苯乙烯如氯甲基苯乙烯、氟甲基苯乙烯等等；羟基苯乙烯；羟甲基苯乙烯；苯甲酸乙烯酯；苯乙烯磺酸钠；氰基苯乙烯；甲氧基苯乙烯；乙氧基苯乙烯；丁氧基苯乙烯；硝基苯乙烯；酰氧基苯乙烯如乙酰氧基苯乙烯、苯甲酰氧基苯乙烯等等，等等可以被提及，优选苯乙烯。
上述(甲基)丙烯酰胺衍生物的实例包括但不限于N-烷基(甲基)丙烯酰胺；N,N-二烷基(甲基)丙烯酰胺；N-烷氧基烷基(甲基)丙烯酰胺；2-(甲基)丙烯酰胺烷烃磺酸；N-烷醇(甲基)丙烯酰胺如N-亚甲醇(甲基)丙烯酰胺等等；丙烯酰胺；甲基丙烯酰胺；二丙酮丙烯酰胺；N,N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺；丙烯酰吗啉；N-苯氧甲基(甲基)丙烯酰胺等等。
另外，包含于上述N-烷基(甲基)丙烯酰胺的烷基通常是碳数目为1-6、优选1-3的直链或者支链烷基。N-烷基(甲基)丙烯酰胺的实例包括N-甲基(甲基)丙烯酰胺、N-乙基(甲基)丙烯酰胺、N-正丙基(甲基)丙烯酰胺、N-异丙基(甲基)丙烯酰胺、N-叔丁基(甲基)丙烯酰胺、和N-月桂基(甲基)丙烯酰胺等等。
包含于上述N,N-二烷基(甲基)丙烯酰胺的两个烷基每一个通常为碳数目为1-6、优选1–3的直链或者支链烷基。N,N-二烷基(甲基)丙烯酰胺的实例包括N,N-二甲基(甲基)丙烯酰胺、N,N-二乙基(甲基)丙烯酰胺、N,N-二异丙基(甲基)丙烯酰胺、N,N-二叔丁基(甲基)丙烯酰胺、N,N-二月桂基(甲基)丙烯酰胺、N,N-二叔辛基(甲基)丙烯酰胺、N,N-二月桂基(甲基)丙烯酰胺、N,N-双环已基(甲基)丙烯酰胺等等。
包含于上述N-烷氧基烷基(甲基)丙烯酰胺的烷氧基通常是碳数目为1-6、优选1-3的直链或者支链烷氧基。包含于上述N-烷氧基烷基(甲基)丙烯酰胺的烷基通常是碳数目为1-6、优选1-3的直链或者支链烷基。N-烷氧基烷基(甲基)丙烯酰胺的实例包括N-甲氧基甲基(甲基)丙烯酰胺、N-乙氧基甲基(甲基)丙烯酰胺、N-丙氧基甲基(甲基)丙烯酰胺、N-丁氧基甲基(甲基)丙烯酰胺、N-乙氧基乙基(甲基)丙烯酰胺、N-甲氧基丙基(甲基)丙烯酰胺、N-乙氧基丙基(甲基)丙烯酰胺、N-异丙氧乙基(甲基)丙烯酰胺等等。
包含于上述2-(甲基)丙烯酰胺烷基磺酸中的烷烃通常是碳数目为1-6、优选1-3的直链或者支链烷烃。2-(甲基)丙烯酰胺烷基磺酸的实例包括2-丙烯酰胺丙磺酸、2-丙烯酰胺-正丁烷磺酸、2-丙烯酰胺-正己烷磺酸、2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸等等。
上述(甲基)丙烯酰胺衍生物优选地是二丙酮丙烯酰胺、N-异丙基(甲基)丙烯酰胺、N-甲氧基甲基(甲基)丙烯酰胺或者N,N-二甲基(甲基)丙烯酰胺。
来源于(甲基)丙烯酰胺衍生物单体的典型结构单元包括以下结构单元。
Figure 364926DEST_PATH_IMAGE008
Figure 843924DEST_PATH_IMAGE009
Figure 899605DEST_PATH_IMAGE010
Figure 653934DEST_PATH_IMAGE011
在上述式中，当Sp是丙烯酰胺固相载体并且来源于(甲基)丙烯酰胺衍生物单体的结构单元含量过小时，则不能获得避免核酸合成量减少和合成纯度下降的影响。另一方面，当它过高时，难以形成多孔性树脂珠粒。因此，它优选0.3–4mmol/g，更优选0.4-3.5mmol/g，进一步优选0.6–3mmol/g。
用作本发明的用于固相合成的载体的多孔性颗粒优选地是具有有助于核酸合成的官能团的多孔性颗粒。“有助于核酸合成的官能团”是指官能团，其能够成为核酸合成的起点并且能够被添加接头。特别地，氨基、羟基等等可以被提及。
有助于核酸合成的官能团含量不受特别限定。当官能团含量过小时，则核酸产量减少，当它过高时，则获得核酸的纯度降低。因此，它优选10-2000μmol/g，更优选50-1000μmol/g，进一步优选100-800μmol/g。
当有助于核酸合成的官能团是羟基时，则通过根据JIS K0070的滴定法测量本发明的多孔性颗粒的羟基的量。具体地，通过添加吡啶至25g乙酸酐达到总量100ml而制备乙酰化试剂。将上述乙酰化试剂(0.5ml)、吡啶(4.5ml)和样品(大约0.5g)置于烧瓶中，并在95-100℃下加热混合物2小时，以乙酰化羟基。然后，添加蒸馏水(1mL)入烧瓶，将混合物加热以将未被乙酰化消耗的乙酸酐分解为乙酸。利用0.5 mol/L的氢氧化钾水溶液，通过中和滴定法测量乙酸的量。分开地，以同样的方式进行空白测量，但是不添加样品。因为上述两个测量在摩尔数方面的差异是样品羟基的乙酰化消耗的乙酸酐的摩尔数(即样品的羟基的量)，因此将该数值除以样品重量以测定每1 g样品的羟基的量。
与固相载体结合的接头的量不受特别限定。当接头含量过低时，则核酸的产量降低。当接头含量过高时，则获得的核酸的纯度趋向降低，获得核酸的核苷酸数量趋向降低。因此，它优选在20-800μmol/g、更优选25-500μmol/g的范围内。
上述多孔性固相载体的形状不受特别限定，可以是任何形状的平板、颗粒、纤维等等。因为包装至合成反应容器的效率可以被增强并且反应容器不容易破坏，因而优选具有颗粒形状的多孔性合成聚合物。
说明书中的术语“颗粒”不意味着精确球状的，而是意味着具有任何恒定形式(例如大致球状的如椭圆球状的、多边形式、圆柱形式、无定形式如konpeito形式等等)。
虽然多孔性合成聚合物颗粒的一个颗粒的大小(体积)不受特别限定，当通过激光衍射(散射类型)测量的多孔性颗粒的平均粒度小于1μm时，当将其包装在柱中并且使用时会出现不方便，因为反压力变得过高或者溶液输送速率变慢。另一方面，当平均粒度大于1000μm时，载体颗粒之间的空隙变大，在具有预定体积的柱中有效包装载体颗粒变得困难。因此，优选1-1000μm，更优选5-500μm，进一步优选10-200μm。
虽然通过多点BET法测量的上述合成聚合物颗粒的比表面积不受特别限定，但当比表面积低于0.1m2/g时，则在有机溶剂中的膨胀率变低，合成反应趋向于难以发生。另一方面，当它大于500m2/g时，则细孔隙尺寸变小，合成反应趋向于难以发生。因此，比表面积优选地是0.1–500 m2/g，更优选10–300 m2/g，进一步优选50–200 m2/g。
另外，通过水银渗入技术测量的上述合成聚合物颗粒的平均细孔隙尺寸不受特别限定。然而，当孔隙尺寸过小时，则合成反应的区域变小，不容易发生期望的反应，或者核苷酸长度趋向于低于期望的数目。另一方面，当孔隙尺寸过大时，则作为反应区域的聚合体颗粒表面上的羟基和参与反应的物质之间的接触频率会降低以降低产量。因此，平均细孔隙尺寸优选地是1–200nm ，更优选5–100nm ，更优选20–70nm。
在本发明固相载体的优选实施方案中，在上述式中，Sp是低膨胀交联聚苯乙烯颗粒，其可以作为NittoPhase (注册商标)(NITTO DENKO Co. ，Ltd. 制造)市售可得。优选使用利用NittoPhase (注册商标)的固相核酸合成方法，因为它显示出小的由于杂质的峰面积，并且保证了从实验室规模到大规模合成系统的宽范围规模中的高产率和高纯度。
本发明的用于核酸固相合成的载体的制备方法
虽然本发明用于核酸固相合成的载体的制备方法不受特别限定，例如可以通过以下方法制备载体。
炔烃(例如，乙炔、二甲基乙炔)与呋喃等等反应以合成二环氧萘衍生物。然后，使用四氧化锇作为催化剂，该衍生物被氧化，与4,4'–二甲氧基三苯甲基氯等等反应以便用二甲氧基三苯甲基(DMTr基团)保护一部分羟基。然后，将该化合物与琥珀酸酐连同二氯甲烷和三乙胺反应以将琥珀酰接头部分连接至剩余的羟基，然后将其与具有-OH 基团或者-NH2 基团的固相载体结合，得到本发明用于核酸固相合成的载体。
利用本发明用于核酸固相合成的载体合成核酸的方法
为了利用本发明的用于核酸固相合成的载体进行核酸合成，使用核酸自动合成仪，并且可以使用本身已知的各种合成方法。在本说明书中，“核酸合成反应”特别地是指构成核酸的核苷酸的延伸反应。因此，核苷酸被顺序地结合到已结合到固相载体的核苷、核苷酸或者寡核苷酸，借此获得延伸的寡核苷酸。
可以通过H-亚磷酸酯方法、磷酸酯方法、固相亚磷酰胺法等等进行核酸合成反应。其中，由于合成核酸的高能力和获得核酸的高纯度，固相亚磷酰胺法是优选的。
通过固相亚磷酰胺法的核酸合成反应的优选实施方案包括例如由下列各步骤组成的方法：
(a) 将本发明的用于核酸固相合成的载体置于核酸自动合成仪反应柱中的步骤；
(b) 酸例如二氯乙酸溶液等等在反应柱中流动以除去羟基甲基保护基团并洗涤载体的步骤；
(c) 顺序进行下列各个步骤的步骤：偶联以连接对应3’末端的核苷亚磷酰胺(通过四唑激活等等)到上述羟甲基，对未反应的羟基加帽，和氧化亚磷酸盐，重复一系列步骤直到获得目的序列；和
(d) 在通过设备完成合成步骤后，将用于核酸固相合成的载体浸渍以切割连接部分，从而获得目的核酸。
作为上述制备方法的结果，发生以下式显示的化学反应，制备在3’末端具有羟基的核酸。具体的，在利用用于核酸固相合成的载体(A)的核酸合成方法中(其显示于实施例2中作为本发明的优选实施方案)，发生以下式显示的化学反应，并且制备在3’末端具有羟基的核酸。  
Figure 390946DEST_PATH_IMAGE012
其中球体表示固相载体，Ac表示乙酰基，Nuc表示核酸。
另外，在利用本发明的用于核酸固相合成的载体(B)和(C)的核酸合成方法中(其显示于实施例4和6中作为本发明的优选实施方案)，发生以下式显示的化学反应，并且制备在3’末端具有羟基的核酸。  
其中球体表示固相载体，Nuc表示核酸。
用于本发明的核酸制备方法的活化剂的实例包括但不限于1H-四唑、4,5-二氰基咪唑、5-乙硫基-1H-四唑、苯并咪唑鎓三氟甲基磺酸盐(BIT)、N-苯基苯并咪唑鎓三氟甲基磺酸盐、咪唑鎓三氟甲基磺酸盐(IMT)、N-PhIMP 、5-硝基苯并咪唑鎓三氟甲基磺酸盐、三唑鎓三氟甲基磺酸盐、1-羟基苯并三唑(HOBT)、N-(氰基甲基)吡咯烷鎓四氟化碳等等。
实施例
在下文中通过参考实施例更详细地解释本发明，这些实施例不构成对本发明的限制。
实施例1
用于核酸固相合成的载体(A)的制备
将丁炔二酸二甲酯和呋喃加入Schlenk烧瓶，并将混合物在室温下反应29天。该反应的产量为22%。使用四氧化锇作为催化剂，氧化获得的产物。然后，该产物与4,4' –二甲氧基三苯甲基氯等等反应，用DMTr基团保护一部分羟基。其后，将具有羟基的多孔性聚苯乙烯固相载体(由NITTO DENKO Co.，Ltd.生产，NittoPhase(注册商标))(其已经引入琥珀酰基)分散在乙腈中，加入上述化合物、HBTU和N,N-二异丙基乙胺，并将该混合物在28℃反应23 hr以使在固相载体上携带上述化合物。接着，加入4-二甲基氨基吡啶、乙腈、乙醇、二异丙基乙胺和HBTU，并将该混合物在28℃反应20 hr以对未反应的羧基加帽。加入乙酸酐、N-甲基咪唑、吡啶、4-二甲基氨基吡啶和乙腈，并将该混合物在28℃反应22 hr以对羟基加帽，由此获得本发明的用于核酸合成的固相载体(A)，其由下式表示：
Figure 157225DEST_PATH_IMAGE014
其中球体表示固相载体，Ac表示乙酰基。
本发明的接头与如上述获得的固相载体的结合量是41μmol/g。
实施例2
利用用于核酸固相合成的载体(A)合成20-mer DNA
将实施例1中制备的本发明的用于核酸合成的固相载体(A)(24.3 mg)包装进反应柱，使用自动化DNA/RNA合成仪ABI3400(Applied Biosystems制造)通过DMT-on(不除去5'-末端保护基团的方法)(合成规模1 μmol)合成20 mer DNA寡核苷酸(5'-ATACCGATTAAGCGAAGTTT-3'：SEQ ID NO：1)。合成后，在55℃将与DNA 寡核苷酸结合的固相载体浸于30%氨水/乙醇(3：1)混合溶液15小时，以从固相载体切割DNA 寡核苷酸。
比较实施例1
利用结合DMT-dT-3’-琥珀酸酯的用于固相合成的载体合成20-mer DNA
以与实施例1中相同的方法，将可切割的接头DMT-dT-3’-琥珀酸酯(Beijing OM Chemicals 制造)与市场上可获得的固相载体NittoPhase (注册商标)(NITTO DENKO Co .，Ltd .制造)结合。该化合物与固相载体的结合量为42μmol/g。将该固相载体(23.8 mg)填充进反应柱，以实施例2中相同的方式通过DMT-on(不除去5'-末端保护基团的方法)(合成规模1 μmol)合成20 mer DNA寡核苷酸(5'-ATACCGATTAAGCGAAGTTT-3'：SEQ ID NO：1)。合成后，从固相载体切割DNA 寡核苷酸。
实验实施例1
通过高效液相色谱法(HPLC)测量在实施例2和比较实施例1中获得的DNA 寡核苷酸溶液(测量条件：柱； Waters XBridge OST C18 2.5 μm 50 X 4.6 mm，UV 检测；260nm ，缓冲液A；100mM HFIP/7 mM TEA/水，pH 8.0，缓冲液B；甲醇，温度；30℃)。图1(a)和(b)显示每个HPLC 图。
另外，将在实施例2和比较实施例1中获得的DNA 寡核苷酸溶液进行LC-MS 分析。(测量条件，柱； Waters XBridge OST C18 2.5μm  50X4.6 mm，UV 检测；254nm ，缓冲液A：HFIP/7 mM TEA/水，pH 8.0，缓冲液B； 甲醇，温度；30℃)。
作为结果，实施例2中产生的DNA寡核苷酸的主峰被验证是在3'末端具有羟基的20-mer DNA寡核苷酸(分子量(实测值)；6439)。另一方面，比较实施例1中产生的DNA寡核苷酸的主峰也被验证是在3'末端具有羟基的20-mer DNA寡核苷酸(分子量(实测值)；6439)。
实施例3
用于核酸固相合成的载体(B)的制备
将丁炔二酸二甲酯和呋喃加入Schlenk烧瓶，并将混合物在室温下反应29天。该反应的产量为22%。使用四氧化锇作为催化剂，氧化获得的产物。然后，该产物与4,4'–二甲氧基三苯甲基氯等等反应，用DMTr基团保护一部分羟基。然后，加入琥珀酸酐等等以便将琥珀酰基引入上述化合物。将NittoPhase(注册商标)(由NITTO DENKO Co.，Ltd.生产)(其是具有羟基的交联的聚苯乙烯固相载体)分散在乙腈中，加入上述化合物、HBTU和N,N-二异丙基乙胺，并将该混合物在28℃反应23 hr以使在固相载体上携带它们。然后，添加4-二甲基氨基吡啶、乙腈、乙醇、二异丙基乙胺和HBTU，并且反应物在28℃下反应20小时，以为未反应的羟基加帽。添加乙酸酐、N-甲基咪唑、吡啶、4-二甲基氨基吡啶和乙腈，并且该混合物在28℃下反应22小时，以为未反应的羟基加帽，从而得到本发明的用于核酸合成的固相载体(B)，其由下式表示：
Figure 398851DEST_PATH_IMAGE015
其中球体表示固相载体。
本发明的接头与如上述获得固相载体的结合量是141μmol/g。
实施例4
利用用于核酸固相合成的载体(B)合成20-mer DNA
将实施例3中制备的本发明的用于核酸合成的固相载体(B)(7.1 mg)包装进反应柱，使用自动化DNA/RNA合成仪ABI3400(Applied Biosystems制造)通过DMT-on(不除去5'-末端保护基团的方法)(合成规模1 μmol)合成20-mer DNA寡核苷酸(5'- ATA CCG ATT AAG CGA AGT TT-3'：SEQ ID NO：1)。合成后，在55℃将与DNA寡核苷酸结合的固相载体浸于30％氨水/乙醇(3：1)混合溶液中15 hr以便从固相载体切割DNA寡核苷酸。
比较实施例2
利用结合DMT-dT-3’-琥珀酸酯的用于固相合成的载体合成20-mer DNA
如比较实施例1中相同的方式制备固相载体NittoPhase(其中结合96 μmol/g DMT-dT-3'-琥珀酸酯)。将该固相载体(10.4 mg)包装进反应柱，以实施例4中相同的方式通过DMT-on(合成规模1 μmol)合成20-mer DNA寡核苷酸(5'-ATA CCG ATT AAG CGA AGT TT-3'：SEQ ID NO：1)。合成后，从固相载体切割DNA 寡核苷酸。
实验实施例2
通过HPLC测定实施例4和比较实施例2中获得的DNA寡核苷酸溶液。测定条件为柱；XBridge OST C18 2.5 μm 50X4.6 mm (Waters制造)，UV检测； 260 nm，缓冲液A； 100 mM HFIP/7 mM TEA/水(pH 8.0)，缓冲液B；甲醇，温度：30℃。图2(a)和(b)显示每个HPLC图。
作为结果，实施例4中产生的DNA寡核苷酸的主峰被验证是在3'末端具有羟基的20-mer DNA寡核苷酸，因为检测时间和实施例2中相同。另一方面，比较实施例2中产生的DNA寡核苷酸的主峰也被验证是在3'末端具有羟基的20-mer DNA寡核苷酸，因为检测时间和比较实施例1中相同。
实施例5
用于核酸固相合成的载体(C)的制备
将丁炔二酸、四氢呋喃和呋喃加入Schlenk烧瓶，并将该混合物在室温下反应18天。该反应的产量为67%。通过硫酸二甲酯、碳酸钾和丙酮的混合物在回流下将获得的二羧酸转化为对应的二甲酯。使用四氧化锇作为催化剂，氧化获得的产物。然后，该产物与4,4'–二甲氧基三苯甲基氯等等反应，用DMTr基团保护一部分羟基，并通过柱色谱法纯化产物。
然后，加入琥珀酸酐等等以便将琥珀酰基引入上述化合物。将NittoPhase(注册商标)(由NITTO DENKO Co.，Ltd.生产)(其是具有羟基的交联的聚苯乙烯固相载体)分散在乙腈中，加入上述化合物、HBTU和N,N-二异丙基乙胺，并将该混合物在28℃反应23 hr以使在固相载体上携带它们。其后，加入4-二甲基氨基吡啶、乙腈、乙醇、二异丙基乙胺和HBTU，并将该混合物在28℃反应20 hr以对未反应的羧基加帽。加入乙酸酐、N-甲基咪唑、吡啶、4-二甲基氨基吡啶和乙腈，并将该混合物在28℃反应22 hr以对未反应的羟基加帽，由此获得本发明的用于核酸合成的固相载体(C)，其由下式表示：
其中球体表示固相载体。
本发明的接头与如上所述获得的固相载体的结合量为62 μmol/g。
实施例6
利用用于核酸固相合成的载体(C)合成20-mer DNA
将实施例5中制备的本发明的用于核酸合成的固相载体(C) (16.1 mg)包装进反应柱，使用自动化DNA/RNA合成仪ABI3400(Applied Biosystems制造)通过DMT-on(不除去5'-末端保护基团的方法)(合成规模1 μmol)合成20-mer DNA寡核苷酸(5'- ATA CCG ATT AAG CGA AGT TT-3'：SEQ ID NO：1)。合成后，在55℃将与DNA寡核苷酸结合的固相载体浸于30％氨水/乙醇(3：1)混合溶液中15 hr以便从固相载体切割DNA寡核苷酸。
比较实施例3
利用结合DMT-dT-3’-琥珀酸酯的用于固相合成的载体合成20-mer DNA
将在比较实施例2中制备的结合DMT-dT-3’-琥珀酸酯的固相载体(10.4mg )包装在反应柱中，并且以与实施例4中相同的方法，通过DMT-on (合成规模1μmol)合成20-mer DNA 寡核苷酸(5’-ATA CCG ATT AAG CGA AGT TT-3’：SEQ ID NO：1)。合成后，从固相载体切割DNA 寡核苷酸。
实验实施例3
通过HPLC测定实施例6和比较实施例3中获得的DNA寡核苷酸溶液。测定条件为柱；XBridge OST C18 2.5 μm 50X4.6 mm (Waters制造)，UV检测； 260 nm，缓冲液A； 100 mM HFIP/7 mM TEA/水(pH 8.0)，缓冲液B； 甲醇，温度：30℃。图3(a)和(b)显示每个HPLC图。
作为结果，实施例6中产生的DNA寡核苷酸的主峰被验证是在3'末端具有羟基的20-mer DNA寡核苷酸，因为检测时间和实施例2中相同。另一方面，比较实施例3中产生的DNA寡核苷酸的主峰也被验证是在3'末端具有羟基的20-mer DNA寡核苷酸，因为检测时间和比较实施例1中相同。
表1共同地显示了实验实施例1-3中获得的数据。
表1
Figure 379762DEST_PATH_IMAGE017
工业应用性
随着近年来核酸药物产品的开发，已经期望开发更有效和更功能性的方法用于合成核酸。除了常规核酸合成，本发明的用于核酸合成的固相载体可用于合成具有各种修饰的位点的核酸。此外，利用本发明的用于核酸合成的固相载体自动合成的在3'末端具有羟基的核酸可以广泛使用，无论核酸药物的类型如反义核酸、siRNA等等。
该申请基于在日本提交的专利申请号2012-016895(提交日期：2012年01月30日)，通过参照将其内容完全并入本文中。
无序列表文本
SEQ ID NO：1：人工合成的寡聚 20-mers。
序列表
 
<110>  NITTO DENKO CORPORATION
       NAGOYA UNIVERSITY
 
<120>  用于核酸固相合成的接头和载体
 
<130>  2659
 
<150>  JP-2012-016895
<151>  2012-01-30
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  合成的寡核苷酸
 
<400>  1
ataccgatta agcgaagttt                                                 20

Claims (10)

1.用于核酸固相合成的接头，包括由下式代表的化合物
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中
X1和X2各自独立地是能够通过酸解离的羟基保护基团，
L1和L2各自独立地是能够通过碱裂解的连接部分，
R1 - R6各自独立地是氢原子；任选地被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基；C1-6烷氧基；C1-7酰基；单或双- C1-6烷基氨基；或卤素原子，或
R2 和R5和与之键合的碳原子连接在一起以形成3元至8元的碳环或杂环，所述碳环或杂环各自任选地被选自如下的取代基所取代：(1)氧代基，(2)任选地被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基，和(3)任选地被C1-6烷氧基-羰基取代的苯基。
2.根据权利要求1所述的接头，其中L1和L2中至少一个可以被连接至载体而用于核酸固相合成。
3.根据权利要求1或2所述的接头，其中X1和X2是二甲氧基三苯甲基。
4.用于核酸固相合成的载体，其具有由下式代表的结构
Figure 12264DEST_PATH_IMAGE002
其中
X1和X2各自独立地是能够通过酸解离的羟基保护基团，
L1和L2各自独立地是能够通过碱裂解的连接部分，
Sp是固相载体，
R1 - R6各自独立地是氢原子；任选地被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基；C1-6烷氧基；C1-7酰基；单或双- C1-6烷基氨基；或卤素原子，或
R2 和R5和与之键合的碳原子连接在一起以形成3元至8元的碳环或杂环，所述碳环或杂环各自任选地被选自如下的取代基所取代：(1)氧代基，(2)任选地被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基，和(3)任选地被C1-6烷氧基-羰基取代的苯基。
5.根据权利要求4所述的载体，其中L1是琥珀酰基。
6.根据权利要求4或5所述的载体，其中L1和L2是琥珀酰基。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的载体，其中X1和X2是二甲氧基三苯甲基。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的载体，其中Sp是由多孔性合成聚合物颗粒或多孔性玻璃颗粒组成的固相载体。
9.产生核酸的方法，包括在根据权利要求4-8中任一项所述的载体上进行核酸合成反应的步骤。
10.根据权利要求9所述的产生方法，其中通过固相亚磷酰胺方法进行所述核酸合成反应。
CN2013100354321A 2012-01-30 2013-01-30 用于核酸固相合成的接头和载体 Pending CN103224502A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012016895 2012-01-30
JP2012-016895 2012-01-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103224502A true CN103224502A (zh) 2013-07-31

Family

ID=47623956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2013100354321A Pending CN103224502A (zh) 2012-01-30 2013-01-30 用于核酸固相合成的接头和载体

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8835656B2 (zh)
EP (1) EP2620444B1 (zh)
JP (1) JP6028979B2 (zh)
CN (1) CN103224502A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106256831A (zh) * 2015-06-18 2016-12-28 日东电工株式会社 切掉rna寡核苷酸的方法
CN107383246A (zh) * 2017-08-28 2017-11-24 盐城师范学院 一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体及其制备方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2522471A (en) * 2014-01-27 2015-07-29 Uwe Warnken Compositions for cells lysis and uses thereof
JP6537338B2 (ja) 2015-04-24 2019-07-03 日東電工株式会社 核酸固相合成用リンカー及び担体
JP7033402B2 (ja) 2017-07-05 2022-03-10 日東電工株式会社 固相核酸合成方法、固相核酸合成用溶液組成物
CN113004363A (zh) * 2021-03-02 2021-06-22 通用生物系统（安徽）有限公司 一种用于dna编码化合物库建库接头的生产工艺
WO2023017098A2 (en) 2021-08-11 2023-02-16 King's College London Compositions and methods for improved treatment of disorders affecting the central nervous system
US11814450B2 (en) 2021-10-22 2023-11-14 Hongene Biotech Corporation Polymeric solid support for oligonucleotide synthesis
WO2024024672A1 (ja) * 2022-07-29 2024-02-01 富士フイルム和光純薬株式会社 核酸合成用リンカーおよび固相担体

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6653468B1 (en) * 2002-07-31 2003-11-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Universal support media for synthesis of oligomeric compounds
WO2004058794A1 (en) * 2002-12-31 2004-07-15 Proligo Llc Methods and compositions for the tandem synthesis of two or more oligonuleotides on the same solid support
WO2005049621A1 (en) * 2003-11-13 2005-06-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5,6-dihydroxy-isoindole derivatives as linkers for oligomer solid phase synthesis

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9207380D0 (en) 1992-04-03 1992-05-13 Ici Plc Compounds
JP4602011B2 (ja) 2003-08-29 2010-12-22 日東電工株式会社 多孔質樹脂ビーズおよびその製造方法
US20050182241A1 (en) 2004-02-12 2005-08-18 Ctgen, Inc. Universal support for nucleic acid synthesis
JP4550447B2 (ja) * 2004-02-25 2010-09-22 独立行政法人科学技術振興機構 核酸固相合成用シリルリンカー
JP4799831B2 (ja) 2004-05-14 2011-10-26 日東電工株式会社 多孔質樹脂の製造方法
US7772439B2 (en) * 2004-10-25 2010-08-10 Operon Biotechnologies, Inc. Amino or thiol linker building block for the synthesis of amino- or thiol-functionalized nucleic acids and methods of making and use thereof
JP2006342245A (ja) 2005-06-08 2006-12-21 Nitto Denko Corp 多孔質樹脂ビーズ
JP4970881B2 (ja) 2006-09-21 2012-07-11 日東電工株式会社 固相合成用担体
FR2921831B1 (fr) * 2007-10-05 2014-05-09 Oreal Composition cosmetique ou dermatologique comprenant un polymere portant des groupes de jonction, et procede de traitement cosmetique
JP5360763B2 (ja) * 2009-10-21 2013-12-04 日東電工株式会社 核酸固相合成用リンカー及び担体

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6653468B1 (en) * 2002-07-31 2003-11-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Universal support media for synthesis of oligomeric compounds
WO2004058794A1 (en) * 2002-12-31 2004-07-15 Proligo Llc Methods and compositions for the tandem synthesis of two or more oligonuleotides on the same solid support
WO2005049621A1 (en) * 2003-11-13 2005-06-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5,6-dihydroxy-isoindole derivatives as linkers for oligomer solid phase synthesis

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106256831A (zh) * 2015-06-18 2016-12-28 日东电工株式会社 切掉rna寡核苷酸的方法
CN107383246A (zh) * 2017-08-28 2017-11-24 盐城师范学院 一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2620444A1 (en) 2013-07-31
US20130197117A1 (en) 2013-08-01
US8835656B2 (en) 2014-09-16
EP2620444B1 (en) 2015-05-06
JP2013177371A (ja) 2013-09-09
JP6028979B2 (ja) 2016-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103224502A (zh) 用于核酸固相合成的接头和载体
Flamme et al. Chemical methods for the modification of RNA
CN102060699B (zh) 用于固相合成核酸的接头和载体
Kaur et al. Perspectives on chemistry and therapeutic applications of Locked Nucleic Acid (LNA)
Oka et al. Stereocontrolled synthesis of oligonucleotide analogs containing chiral internucleotidic phosphorus atoms
Scaringe RNA oligonucleotide synthesis via 5′-silyl-2′-orthoester chemistry
EP1585755B1 (en) Methods and compositions for the tandem synthesis of two or more oligonuleotides on the same solid support
NZ514348A (en) L-ribo-LNA analogues
Li et al. 4′-Fluorinated RNA: synthesis, structure, and applications as a sensitive 19F NMR probe of RNA structure and function
EP3352872A1 (en) Triptycene derivatives for nucleic acid junction stabilization
AU2018223027B2 (en) Post-synthetic orthogonal amidation plus metal catalyzed azide-alkyne cycloaddition click chemistry on siRNA
KR20190065341A (ko) 올리고머 화합물들의 접합 방법
WO2005077966A1 (en) Substituted pixyl protecting groups for oligonucleotide synthesis
Saito et al. C8-alkynyl-and alkylamino substituted 2′-deoxyguanosines: a universal linker for nucleic acids modification
Samanta et al. Combinatorial nucleoside-deletion-scanning mutagenesis of functional DNA
EP1319012A1 (en) Process for producing multiple oligonucleotides on a solid support
WO2005083084A1 (en) Intercalating triplex forming oligonucleotide derivatives and process for the preparation thereof
Hartmann et al. Light-controlled cell-free protein synthesis using phosphorothioate-caged antisense oligonucleotides
Pon et al. Large-Scale Synthesis of “Cpep” RNA Monomers and Their Application in Automated RNA Synthesis
WO2014016202A1 (en) Methods for catalytic alkylation of nucleic acids
Bui Designing a DNA-encoded library of aptamer-like oligomers that target an antibody drug.
Jestřábová et al. Arylethynyl-or Alkynyl-Linked Pyrimidine and 7-Deazapurine 2′-Deoxyribonucleoside 3′-Phosphoramidites for Chemical Synthesis of Hypermodified Hydrophobic Oligonucleotides
CN117264004A (zh) 一种化合物及核酸合成方法
Wang et al. Dimethylthiarum disulfide: new sulfur transfer reagent in phosphorothioates oligonucleotide synthesis
Caruthers New methods for synthesizing DNA, RNA, and phosphonates

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20130731