JP4550447B2 - 核酸固相合成用シリルリンカー - Google Patents
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Description
本発明は、ＤＮＡ合成に用いる固相担体に効率よく導入できるシリルリンカーに関する。
核酸関連研究の多様化が進む中で、酸化損傷ＤＮＡオリゴマーや塩基性条件下で不安定な官能基をもつＤＮＡオリゴマーなど通常のＤＮＡ合成で用いる塩基性条件（アンモニア処理）では分解してしまう機能性分子の迅速かつ高純度な合成が望まれている。
これまでに、中性条件で切り出しができるシリルリンカーとして、本発明者の一人である関根が開発した安息香酸型化合物であるiP2Si-C6H4-C(O)- 型のものが知られていた（非特許文献１）。しかし、これは固相担体への導入にほぼ１日もの長い時間を要し、又、その導入効率も、特にアミノ基総量が少ないＨＣＰ固相（３４μmol/g）への導入に場合には極めて低く（６‐８μmol/ｇ）、実用性の点で十分ではなかった。
Kobori, A.; Miyata, K.; Ushioda, M.; Seio, K.; Sekine, M., Chemistry Letters, 2002, 16-17
従って、本発明は、固相担体に効率よく導入できるシリルリンカーを開発することを目的とする。発明者は鋭意研究の結果、従来のシリルリンカーにさらにスペーサーを導入することによってこの課題を解決し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、以下の一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩若しくはである核酸固相合成用シリルリンカー：
Ｈ-（Ｒ１）Ｓｉ（Ｒ２）-（Ｃ６Ｈ４）-ＣＯＮＨ-（Ａ）-ＣＯＯＨ （Ｉ）
（式中、Ｒ１及びＲ２は、アルキル基又はアリール基であり、（Ａ）はスペーサー部位を示す）
に係る。
Ｈ-（Ｒ１）Ｓｉ（Ｒ２）-（Ｃ６Ｈ４）-ＣＯＮＨ-（Ａ）-ＣＯＯＨ （Ｉ）
（式中、Ｒ１及びＲ２は、アルキル基又はアリール基であり、（Ａ）はスペーサー部位を示す）
に係る。
更に、本発明は、上記化合物がヌクレオシド又はその誘導体（例えば、糖の５位水酸基が適当な保護基で保護されているもの等）の糖の３位に酸素原子を介して結合して成る、３’末端ヌクレオシドユニットに係る。特に、ヌクレオシドを構成する塩基がチミンである場合には、アミノ基がないので、固相への導入時に保護する必要がないので有利である。
又、本発明はこの３’末端ヌクレオシドユニット又は核酸固相合成用シリルリンカーが導入されている、当業者に公知の任意の固相担体、特にＨＣＰ固相担体に係るものである。又、本発明の固相担体を用いる核酸オリゴマーの合成方法にも係る。この方法は、特に、アセチル化シトシンのような塩基性条件下では不安定な修飾塩基を含む核酸オリゴマーの合成に有利である。
本発明の新規シリルリンカーは中性条件で切り出しができ、更に、３’末端ヌクレオシドユニットの固相担体への導入量を、ＤＮＡ合成において最適とされていた２０−３０μmol/g程度に飛躍的に向上することができた。
本発明化合物におけるスペーサー部位（Ａ）としては、所望の目的を達成することができる限り、当業者に公知の任意のものを使用することが出来る。例えば、一般式（ＩＩ）：
−（ＣＨ２）ｎ− （ＩＩ）
（式中、ｎは自然数、好ましくは２〜１８を示す）で示されるアルキレン基を挙げることが出来る。アルキレン基中に、少なくとも一つのほかの基、例えば、エーテル結合又はチオエーテル結合を有することも可能である。
−（ＣＨ２）ｎ− （ＩＩ）
（式中、ｎは自然数、好ましくは２〜１８を示す）で示されるアルキレン基を挙げることが出来る。アルキレン基中に、少なくとも一つのほかの基、例えば、エーテル結合又はチオエーテル結合を有することも可能である。
シリル基上には当業者に公知の任意の置換基であるＲ１及びＲ２があってもよく、例えば、炭素原子数が１〜５を有するアルキル基、又は、任意の位置で、該アルキル基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲノ基、又はアルコキシ基で置換されていても良い、ベンジル基、フェニル基、及びナフチル基にようなアリール基を挙げることが出来る。
更に、本発明化合物のベンゼン環骨格が当業者に公知の任意の置換基を有するものであっても良い。かかる置換基の例としては、炭素原子数が１〜４を有するアルキル基、ハロゲノ基、ニトロ基、シアノ基、及びメトキシ基から成る群から選択される。尚、-ＣＯＮＨ-とＳｉはベンゼン環骨格にパラの位置で結合している。
本発明化合物の塩若しくはエステルとしては当業者に公知の任意のものから選択することができ、例えば、トリエチルアンモニウム塩、トリブチルアンモニウム塩、及びエチルジイソプロピルアンモニウム塩等の塩、並びに、シアノエチルエステル、アリルエステル、及び４−ニトロフェニルエチルエステル等のエステルを挙げることが出来る。
本発明の化合物は、本明細書、特に以下の実施例の記載等を参照することによって、当業者であれば容易に合成することが出来る。また、本明細書に記載されていない諸条件は当業者が適宜選択することができる。
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲は以下の実施例によって何ら制限されるものではない。
実施例１：シリルリンカーの合成
4-ジイソプロピルシラニルベンゾイルクロライド（２）
4-ジイソプロピルシラニル安息香酸 1 (6.7 g, 28.4 mmol)と塩化チオニル (3.2 mL, 42.6 mmol) を混合し、2時間加熱還流を行った。その後、目的物を減圧蒸留 (1mmHg, 102-104℃) により単離精製した(5.6 g, 77 %)。このＮＭＲデータは以下のとおりである。
4-ジイソプロピルシラニルベンゾイルクロライド（２）
4-ジイソプロピルシラニル安息香酸 1 (6.7 g, 28.4 mmol)と塩化チオニル (3.2 mL, 42.6 mmol) を混合し、2時間加熱還流を行った。その後、目的物を減圧蒸留 (1mmHg, 102-104℃) により単離精製した(5.6 g, 77 %)。このＮＭＲデータは以下のとおりである。
1H NMR (CDCl3): 0.95-1.06 (m, 12H), 1.21-1.29 (m, 2H), 3.99 (t, 1H, J = 3.1 Hz), 7.64 (d, 2H, J = 7.8 Hz), 8.03 (d, 2H, J = 7.8 Hz).
13C NMR (CDCl3): 10.7, 18.5, 18.7, 130.0, 133.6, 135.9, 144.5, 168.3.
13C NMR (CDCl3): 10.7, 18.5, 18.7, 130.0, 133.6, 135.9, 144.5, 168.3.
4-[4- (ジイソプロピルシラニル) ベンゾイルアミノ] ブタン酸（３）
4-アミノブタン酸 (910 mg, 8.94 mmol)を溶解させた1N水酸化ナトリウム水溶液 (9 mL)に、ジイソプロピルシラニルベンゾイルクロライド 2 (1.7 g, 6.7 mmol)を加え、8時間撹拌をおこなった。続いて、この水溶液に12N塩酸をpHが2になるまで加え、400 mLのCH2Cl2を用いて抽出、有機層を回収した。この有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去させた。目的物の単離精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて行った。クロロホルムに0-3%メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の白色個体を得た(1.4 g, 65 %)。このＮＭＲデータは以下のとおりである。
4-アミノブタン酸 (910 mg, 8.94 mmol)を溶解させた1N水酸化ナトリウム水溶液 (9 mL)に、ジイソプロピルシラニルベンゾイルクロライド 2 (1.7 g, 6.7 mmol)を加え、8時間撹拌をおこなった。続いて、この水溶液に12N塩酸をpHが2になるまで加え、400 mLのCH2Cl2を用いて抽出、有機層を回収した。この有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去させた。目的物の単離精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて行った。クロロホルムに0-3%メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の白色個体を得た(1.4 g, 65 %)。このＮＭＲデータは以下のとおりである。
1H NMR (CDCl3): 0.93-1.06 (m, 12H), 1.16-1.25 (m, 2H), 1.94 (t, 2H, J = 4.1 Hz), 2.45 (t, 2H, J = 6.9 Hz), 3.50 (dd, 2H, J = 6.5 Hz, J = 9.7 Hz), 3.93 (t, 1H, J =3.1 Hz), 6.77 (brs, 1H), 7.54 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.72 (d, 2H, J = 8.1 Hz).
13C NMR (CDCl3): 10.5, 17.9, 18.3, 18.4, 24.3, 31.6, 39.5, 57.9, 77.2, 125.8, 134.3, 135.3, 138.6, 168.3, 176.6.
13C NMR (CDCl3): 10.5, 17.9, 18.3, 18.4, 24.3, 31.6, 39.5, 57.9, 77.2, 125.8, 134.3, 135.3, 138.6, 168.3, 176.6.
4-[4- (ジイソプロピルシラニル) ベンゾイルアミノ] ブタン酸 2-シアノエチルエステル （４）
4-[4- (ジイソプロピルシラニル) ベンゾイルアミノ] ブタン酸 3 (1.3 g, 4.1 mmol)と2-シアノエタノール (548 μL, 8.1 mmol)、トリエチルアミン (828 μL, 6.1 mmol)を溶解させたピリジン溶液 (20 mL) に縮合剤N,N-ビス (2-オキソ-3-オキサゾリジニル)-ホスフィン酸クロリド BOP-Cl (1.5 g, 6.1 mmol) を加える。室温で3時間撹拌後、水 (5 mL) を加える。5分後、クロロホルム(200 mL)で希釈後、5wt%-炭酸水素ナトリウム水溶液150mlで3回抽出操作を行った。さらに、有機層を回収し無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去させる。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、クロロホルムに0-3%メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的物を得た(1.2 g,79%)。このＮＭＲデータは以下のとおりである。
4-[4- (ジイソプロピルシラニル) ベンゾイルアミノ] ブタン酸 3 (1.3 g, 4.1 mmol)と2-シアノエタノール (548 μL, 8.1 mmol)、トリエチルアミン (828 μL, 6.1 mmol)を溶解させたピリジン溶液 (20 mL) に縮合剤N,N-ビス (2-オキソ-3-オキサゾリジニル)-ホスフィン酸クロリド BOP-Cl (1.5 g, 6.1 mmol) を加える。室温で3時間撹拌後、水 (5 mL) を加える。5分後、クロロホルム(200 mL)で希釈後、5wt%-炭酸水素ナトリウム水溶液150mlで3回抽出操作を行った。さらに、有機層を回収し無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去させる。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、クロロホルムに0-3%メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的物を得た(1.2 g,79%)。このＮＭＲデータは以下のとおりである。
1H NMR (CDCl3): 0.89-1.00 (m, 12H), 1.15-1.21 (m, 2H), 1.89 (t, 2H, J = 6.9 Hz), 2.40 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 2.62 (t, 2H, J = 6.2 Hz), 3.42 (dd, 2H, J = 6.6 Hz, J = 12.8 Hz), 3.89 (t, 1H, J =3.0 Hz), 4.18 (t, 2H, J =6.2 Hz), 6.99 (brs, 1H), 7.49 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.72 (d, 2H, J = 7.8 Hz).
13C NMR (CDCl3): 10.4, 17.8, 18.3, 18.4, 24.4, 31.2, 39.1, 58.5, 77.2, 116.7, 125.7, 134.7, 135.3, 138.4, 167.4, 172.4.
13C NMR (CDCl3): 10.4, 17.8, 18.3, 18.4, 24.4, 31.2, 39.1, 58.5, 77.2, 116.7, 125.7, 134.7, 135.3, 138.4, 167.4, 172.4.
5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-チミジン-3’-O-ジイソプロピルシリル-4-ベンゾイルアミノブタン酸トリエチルアンモニウム（６）
4-[4- (ジイソプロピルシラニル) ベンゾイルアミノ] ブタン酸 2-シアノエチルエステル4 (1.1 g, 2.9 mmol)を無水CH2Cl2 15mLに溶解し、1,3-ジクロロ-4,4-ジメチルヒダントイン (1.2 g, 5.9 mmol)を加える。室温30分の撹拌の後、この反応溶液を5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)チミジン (3.2 g, 5.9 mmol)とイミダゾール (2.0 g, 29.4 mmol)を溶解させた無水CH2Cl2 10mLに加える。室温で30分撹拌後、水 (5 mL) を加える。5分後、クロロホルム(100 mL)で希釈後、5wt%-炭酸水素ナトリウム水溶液100mlで3回抽出操作を行った。さらに、有機層を回収し無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去させる。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (1%ピリジン) により精製し、ヘキサンに30-100%クロロホルムのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去した。その後、アセトニトリル30 mLに溶解し、DBU (1.7 mL, 11.2 mmol)を加えて、室温で30分間撹拌した。その後、0.5 Mの炭酸トリエチルアンモニウムバッファー100 mLを加え、クロロホルム100 mLで抽出を行った。さらに、有機層を回収し無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去させる。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、クロロホルムに1%のトリエチルアミンを混合し、0-3%メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的物を得た(1.5 g, 54%)。このＮＭＲデータは以下のとおりである。
4-[4- (ジイソプロピルシラニル) ベンゾイルアミノ] ブタン酸 2-シアノエチルエステル4 (1.1 g, 2.9 mmol)を無水CH2Cl2 15mLに溶解し、1,3-ジクロロ-4,4-ジメチルヒダントイン (1.2 g, 5.9 mmol)を加える。室温30分の撹拌の後、この反応溶液を5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)チミジン (3.2 g, 5.9 mmol)とイミダゾール (2.0 g, 29.4 mmol)を溶解させた無水CH2Cl2 10mLに加える。室温で30分撹拌後、水 (5 mL) を加える。5分後、クロロホルム(100 mL)で希釈後、5wt%-炭酸水素ナトリウム水溶液100mlで3回抽出操作を行った。さらに、有機層を回収し無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去させる。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (1%ピリジン) により精製し、ヘキサンに30-100%クロロホルムのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去した。その後、アセトニトリル30 mLに溶解し、DBU (1.7 mL, 11.2 mmol)を加えて、室温で30分間撹拌した。その後、0.5 Mの炭酸トリエチルアンモニウムバッファー100 mLを加え、クロロホルム100 mLで抽出を行った。さらに、有機層を回収し無水硫酸ナトリウムで乾燥してろ過し、溶媒を減圧留去させる。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、クロロホルムに1%のトリエチルアミンを混合し、0-3%メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的物を得た(1.5 g, 54%)。このＮＭＲデータは以下のとおりである。
1H NMR (CDCl3): 0.92-1.08 (m, 12H), 1.18-1.30 (m, 11H), 1.49 (s, 3H), 1.93 (t, 2H, J = 6.3 Hz), 2.35-2.47 (m, 4H), 3.42 (d, 2H, J = 7.3 Hz), 3.45-3.75 (m, 8H), 3.78 (s, 6H), 4.14 (s, 1H), 4.64 (s, 1H), 6.44 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 6.80 (d, 4H, J = 7.6 Hz), 7.18-7.80 (m, 14H).
実施例２：固相担体（７）の調製
十分乾燥させたハイリークロスリンクポリスチレン（ＨＣＰ）固相担体 (500mg 52μmol)、5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル), 3’-O-(ジイソプロピルシリル-4-ベンゾイルアミノブタン酸トリエチルアンモニウム)チミジン3-9 (260 μmol) そしてDCC (268 1.3mmol) をジクロロメタン (5 mL)に溶かし、室温12時間撹拌する。反応後、固相担体をろ過し、アセトニトリルでの洗浄・乾燥を行った後、無水酢酸 (0.5ml)とDMAP (5 mg) をピリジン (4.5 mL) に溶かした溶液に加える。3時間撹拌を行った後、固相担体を再度ろ過し、アセトニトリルで洗浄した。固相担体への導入量は、トリチル基の比色定量より求めた(21 μmol/g)。
以上の各合成ステップを以下の化１及び化２にまとめて示した。
十分乾燥させたハイリークロスリンクポリスチレン（ＨＣＰ）固相担体 (500mg 52μmol)、5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル), 3’-O-(ジイソプロピルシリル-4-ベンゾイルアミノブタン酸トリエチルアンモニウム)チミジン3-9 (260 μmol) そしてDCC (268 1.3mmol) をジクロロメタン (5 mL)に溶かし、室温12時間撹拌する。反応後、固相担体をろ過し、アセトニトリルでの洗浄・乾燥を行った後、無水酢酸 (0.5ml)とDMAP (5 mg) をピリジン (4.5 mL) に溶かした溶液に加える。3時間撹拌を行った後、固相担体を再度ろ過し、アセトニトリルで洗浄した。固相担体への導入量は、トリチル基の比色定量より求めた(21 μmol/g)。
以上の各合成ステップを以下の化１及び化２にまとめて示した。
実施例３：シリルリンカーを用いたDNA合成
一部のシトシン塩基部位のアミノ基がアセチル化されたＤＮＡ１３量体d[GCacATCAGCacCacTCAT]の合成をおこなった。尚，このアセチル基はアンモニア程度の弱い塩基性条件で不安である．しかし，このアセチル化されたシトシン塩基はグアニン塩基とワトソンークリック型の塩基対を形成でき、これを含むDNAオリゴマーは天然型のシトシン塩基より二重鎖形成能が高いという特殊な性質をもっている。
一部のシトシン塩基部位のアミノ基がアセチル化されたＤＮＡ１３量体d[GCacATCAGCacCacTCAT]の合成をおこなった。尚，このアセチル基はアンモニア程度の弱い塩基性条件で不安である．しかし，このアセチル化されたシトシン塩基はグアニン塩基とワトソンークリック型の塩基対を形成でき、これを含むDNAオリゴマーは天然型のシトシン塩基より二重鎖形成能が高いという特殊な性質をもっている。
DNAオリゴマーの自動合成機による合成は、HCP固相担体7 (1μmol, 21μmo/g)をApplied Biosystem Inc.(ABI) のDNA/RNA Synthesizer 392に用いておこなった。合成各鎖伸長サイクルは、以下の表に示すとおりである。
続いて、DMTr基を1分間の3% trichloroacetic acid in CH2Cl2 (2 mL)で除去し、CH2Cl2 (1 mL x 3), CH3CN (1 mL x 3)で固相担体を洗浄した。その後、10% DBU in CH3CN (500 μL) でシアノエチル基を除去した。CH3CN (1 mL x 3)で固相担体を洗浄した後に、TBAF (131 mg, 0.5 mmol) と酢酸 (24 μL, 0.5mmol) を無水THF 500 μLに溶かした反応溶液で固相担体を1時間処理し、DNAオリゴマーの切り出しを行った。得られた混合溶液をSep-Pak C18カートリッジを用いて、脱塩後、さらに水で希釈し、逆相・陰イオン交換HPLCを用いて解析をした。得られた化合物の質量分析に結果は以下のとおりである：d[GCacATCAGCacCacTCAT], Mass (M-H) calcd 4017.72, found 4018.00。
本発明のシリルリンカー又は３’末端ヌクレオシドユニットを用いることによって、塩基性で不安定な様々な機能をもつ官能基をもつＤＮＡ誘導体の合成できるようになる。
Claims (14)
- 以下の一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩若しくはエステルである核酸固相合成用シリルリンカー：
Ｈ-（Ｒ１）Ｓｉ（Ｒ２）-（Ｃ６Ｈ４）-ＣＯＮＨ-（Ａ）-ＣＯＯＨ （Ｉ）
（式中、Ｒ１及びＲ２は、アルキル基、アリール基、又は、アルキル基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲノ基、若しくはメトキシ基で置換されているアリール基であり、ベンゼン環骨格（Ｃ ６ Ｈ ４ ）は炭素原子数１〜４を有するアルキル基、ハロゲノ基、ニトロ基、シアノ基、及びメトキシ基から成る群から選択される置換基を有していてもよく、（Ａ）はスペーサー部位を示す）。 - スペーサー部位（Ａ）が、−（ＣＨ２）ｎ−：（ｎは自然数を示す）で示されるアルキレン基、又は、アルキレン基中に少なくとも一つのエーテル結合若しくはチオエーテル結合を有するものである、請求項１記載のシリルリンカー。
- ｎが２〜１８である、請求項２記載のシリルリンカー。
- アルキレン基中に、少なくとも一つのエーテル結合又はチオエーテル結合を有する、請求項２又は３に記載のシリルリンカー。
- Ｒ１及びＲ２が炭素原子数が１〜５を有するアルキル基である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のシリルリンカー。
- Ｒ１及びＲ２のアリール基が、アルキル基、ニトロ基、シアノ基、ハロゲノ基、又はメトキシ基で置換されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のシリルリンカー。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載のシリルリンカーのＳｉがヌクレオシド又はその誘導体の糖の３位に酸素原子を介して結合して成る、３’末端ヌクレオシドユニット。
- ヌクレオシドを構成する塩基がチミンである、請求項７記載の３’末端ヌクレオシドユニット。
- 5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-チミジン-3’-O-ジイソプロピルシリル-4-ベンゾイルアミノブタン酸トリエチルアンモニウムである請求項８記載の３’末端ヌクレオシドユニット。
- 請求項７記載の３’末端ヌクレオシドユニットが導入されている固相担体。
- ３’末端ヌクレオシドユニットが２０−３０μmol/gの割合で導入されている、請求項１０記載の固相担体。
- ＨＣＰ固相担体である、請求項１０又は１１記載の固相担体。
- 請求項１０、１１又は１２に記載の固相担体を用いる、核酸オリゴマーの合成方法。
- 核酸オリゴマーが修飾塩基を含むものである、請求項１３記載の合成方法。
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