JP2022183382A - 改善されたイメテルスタットの調製方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 疾患を処置する方法を提供すること【解決手段】 本発明は、支持体結合オリゴヌクレオチドの3´-アミノ基の脱保護工程と、5´-ホスホルアミダイトとのカップリング工程と、アシルジスルフィドによる硫化工程とを含む、サイクル毎に3工程の固相支持体結合プロセスを使用するテロメラーゼ阻害剤イメテルスタットの調製方法に関し、これは、後続のサイクル中に未反応の3´-アミノオリゴヌクレオチド基が反応するのを防ぐために使用される追加のキャッピング工程が各サイクルにないことを特徴とする。イメテルスタットは以下の式を有する。JPEG2022183382000032.jpg4483【選択図】なし
Description
本発明は、支持体結合オリゴヌクレオチドの3´-アミノ基の脱保護工程と、5´-ホスホルアミダイトとのカップリング工程と、およびアシルジスルフィドによる硫化工程とを含む、サイクル毎に3工程の固相支持体結合プロセスを使用するテロメラーゼ阻害剤イメテルスタットの調製方法に関し、これは、後続のサイクル中に未反応の3´-アミノオリゴヌクレオチド基が反応するのを防ぐために使用される追加のキャッピング工程が各サイクルにないことを特徴とする。
イメテルスタット(配列番号1)は、パルミトイル脂質部分に共有結合したN3´→P5´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドであり、WO2005/023994に、化合物(1F)として記載されている。イメテルスタットのナトリウム塩は、強力で特異的なテロメラーゼ阻害剤として作用し、骨髄線維症(MF)、骨髄異形成症候群(MDS)、および急性骨髄性白血病(AML)などの障害を含むテロメラーゼ媒介障害、例えば癌の治療に使用され得る。
LPT基は、N3´→P5´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドに共有結合しているパルミトイル脂質を表す。13個のヌクレオチドの塩基配列は以下の通り、すなわち、TAGGGTTAGACAAであり、塩基B1~B13で表される。構造の-NH-P(=S)(OH)-および-OP(=S)(OH)-基は、塩形態で生じ得る。対象化合物の塩形態は、具体的に示されていない場合であっても、本明細書に示されている構造に含まれることが理解される。
-NH-P(=S)(OH)-基とチミン、アデニン、グアニン、およびシトシン塩基は、次の説明の図で使用される他の互変異性の配置において生じ得る。対象化合物のすべての互変異性型は、具体的に示されていない場合であっても、化合物の1つの可能な互変異性型が記載されている構造に包含されることが理解される。
先行技術
化合物(1F)としてイメテルスタットを調製するためにWO2005/023994において使用される合成スキームは、スキーム1およびスキーム2に記載されている。このオリゴヌクレオチドの合成は、固相ホスホルアミダイト法を使用して達成され、すべての反応は固相支持体上で行われる。イメテルスタットの合成は、3-パルミトイルアミド-1-O-(4,4´-ジメトキシトリチル)-2-O-スクシニルプロパンジオールを充填した細孔制御ガラス(LCAA-CPG)で行われる。オリゴヌクレオチドは、保護されたヌクレオシド5´-ホスホル-アミダイトを活性化剤の助けを借りて付加することにより、5´末端から3´末端へと組み立てられる。各伸長サイクルは、4つの異なる高度に制御された工程:脱保護、アミダイトカップリング、硫化およびキャッピング工程からなる。
スキーム1:イメテルスタット合成スキームサイクル1
化合物(1F)としてイメテルスタットを調製するためにWO2005/023994において使用される合成スキームは、スキーム1およびスキーム2に記載されている。このオリゴヌクレオチドの合成は、固相ホスホルアミダイト法を使用して達成され、すべての反応は固相支持体上で行われる。イメテルスタットの合成は、3-パルミトイルアミド-1-O-(4,4´-ジメトキシトリチル)-2-O-スクシニルプロパンジオールを充填した細孔制御ガラス(LCAA-CPG)で行われる。オリゴヌクレオチドは、保護されたヌクレオシド5´-ホスホル-アミダイトを活性化剤の助けを借りて付加することにより、5´末端から3´末端へと組み立てられる。各伸長サイクルは、4つの異なる高度に制御された工程:脱保護、アミダイトカップリング、硫化およびキャッピング工程からなる。
スキーム1:イメテルスタット合成スキームサイクル1
スキーム1では、固相支持合成は、固相支持体に結合したパルミトイルアミドプロパンジオールから酸不安定性4,4-ジメトキシトリチル(DMT)保護基を除去することから始まる。最初のホスホルアミダイトヌクレオチドを支持体にカップリングし、続いてアセトニトリルと2,6-ルチジンの混合物(1:1比)中のフェニルアセチルジスルフィド(PADS)の0.1M溶液を使用して蛍光体を硫化する。次に、キャッピング工程が、次の反応サイクルで未反応の固相支持体出発物質がホスホルアミダイトヌクレオチドとカップリングするのを防ぐために、適用される。キャッピングは、THF/無水イソ酪酸/2,6-ルチジンの18:1:1混合物を使用して行われる。
固相支持体での最初のサイクルの後、支持体に結合したオリゴヌクレオチドの3´-アミノ基と、スキーム2に示されるシーケンス中の次に必要なヌクレオチドに対応する保護ヌクレオチドホスホルアミダイトモノマーの過剰溶液との反応により、鎖延長が達成される。
スキーム2:イメテルスタット合成スキームサイクル2-13
スキーム2:イメテルスタット合成スキームサイクル2-13
スキーム2では、支持体結合オリゴヌクレオチドの3´-アミノ基の脱保護(a)、続いて、イメテルスタットの配列中の次に必要なヌクレオチドに対応する保護ヌクレオチドホスホルアミダイトモノマーの過剰溶液を含む支持体結合オリゴヌクレオチドの3´-アミノ基のカップリング反応(b)によって達成される、鎖延長プロセスの最初のサイクルが示される。カップリング反応に続いて、支持体結合オリゴヌクレオチドの蛍光体の硫化(c)および任意の未反応の固相支持体出発物質(b)が次の反応サイクルで5´-ホスホルアミダイトヌクレオチドとカップリングするのを防ぐためのキャッピング工程(スキーム3を参照)を行う。スキーム2の反応サイクルを12回繰り返した後、固相支持体結合オリゴヌクレオチドを、エタノールと濃アンモニアの1:1の混合物で処理した後、HPLC精製して、イメテルスタットを取得する。
THF/無水イソ酪酸/2,6-ルチジンの18:1:1混合物を使用するキャッピング工程は、カップリング工程の後、一次3´-アミノ基を有する任意の残りの固相支持体結合オリゴヌクレオチド(b)を、保護された(または「キャップされた」)3´-アミノ基を有するオリゴヌクレオチド(e)に変換するために行われ、次の反応サイクルで一次3´-アミノ基がホスホルアミダイトヌクレオチドとカップリングするのを防ぐ。
WO01/18015は、実施例3において、配列番号2と共にN3´→P5´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドおよびキャッピング工程を包含するこのオリゴヌクレオチドの調製方法を開示している。
Herbert BSらは、GRN163の脂質修飾について議論している(Oncogene(2005)24,5262-5268)。
Makiko Horieらは、ヒトテロメラーゼRNAサブユニットを標的とする2´-O、4´-c-エチレン架橋核酸オリゴヌクレオチドの合成および特性について議論している(Nucleic Acids Symposium Series(2005)49,171-172)。
Herbert BSらは、GRN163の脂質修飾について議論している(Oncogene(2005)24,5262-5268)。
Makiko Horieらは、ヒトテロメラーゼRNAサブユニットを標的とする2´-O、4´-c-エチレン架橋核酸オリゴヌクレオチドの合成および特性について議論している(Nucleic Acids Symposium Series(2005)49,171-172)。
Oncogene(2005)24,5262-5268
Nucleic Acids Symposium Series(2005)49,171-172
WO01/18015およびWO2005/023994に開示されている固相支持体結合プロセスにおけるカップリング反応は、支持体結合オリゴヌクレオチド上の未反応の一次3´アミノ基が後続のサイクル中に反応するのを防ぐキャッピング工程を含む。
驚くべきことに、先行技術に記載されているキャッピング工程の使用は不要であり、イメテルスタットは、追加のキャッピング工程なしで、3工程サイクルを使用して調製され、特定のキャッピング工程を使用する先行技術の4工程サイクルと比較して、ほぼ同一の収率と純度を有することが、見出された。各サイクルからキャッピング工程を削除すると、サイクル工程の数が22%(54から42工程に)削減され、結果としてプロセス時間が短縮されるため、プロセス全体にメリットがある。また、溶媒消費量が、よりグリーンなプロセスを実現するサイクル工程の削減により、削減される。
本文中で用語「キャッピング工程」が使用されている場合は、常に、固相支持体結合オリゴヌクレオチド上の一次遊離3´-アミノ基が、続くカップリング工程で保護された3´-アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ-ホスホルアミダイトモノマーとのカップリング反応に参加できない置換二次または三次3´-アミノ基に変換される付加的な化学プロセス工程を定義することが意図されている。
一実施形態では、本発明は、次式のオリゴヌクレオチドN3´→P5´チオホスホルアミデートの合成方法に関する。
この方法は、
a)式(A)(式中、PGは酸不安定性保護基である)の固相支持体に付着した最初の3´-アミノ保護ヌクレオチドを提供することと、
b)保護された3´-アミノ基を脱保護して、遊離3´-アミノ基を形成することと、
c)遊離3´-アミノ基を、式(B´n)(式中、n=2)の保護された3´アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマーと反応させて、ヌクレオシド間N3´→P5´-ホスホルアミダイト結合を形成することと、
d)アシルジスルフィドを用いてヌクレオシド間ホスホルアミダイト基を硫化して、N3´→P5´チオホスホルアミデートを形成することと、
e)連続した順序で11回、脱保護工程b)と、式(B´n)の保護された3´-アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ-ホスホルアミダイトモノマーを用いたカップリング工程c)であって、モノマー(B´n)中の保護さ
れたヌクレオシド塩基B´が、それぞれ11回のカップリング工程で順次保護された核酸塩基B3~B13である、カップリング工程c)と、硫化工程d)とを繰り返すことと、f)酸不安定性保護基PGを除去することと、
g)固相支持体からイメテルスタットを脱保護および切断することと、を含み、
付加的なキャッピング工程が、反応工程a)~e)のいずれにおいても実施されないことを特徴とする。
a)式(A)(式中、PGは酸不安定性保護基である)の固相支持体に付着した最初の3´-アミノ保護ヌクレオチドを提供することと、
e)連続した順序で11回、脱保護工程b)と、式(B´n)の保護された3´-アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ-ホスホルアミダイトモノマーを用いたカップリング工程c)であって、モノマー(B´n)中の保護さ
れたヌクレオシド塩基B´が、それぞれ11回のカップリング工程で順次保護された核酸塩基B3~B13である、カップリング工程c)と、硫化工程d)とを繰り返すことと、f)酸不安定性保護基PGを除去することと、
g)固相支持体からイメテルスタットを脱保護および切断することと、を含み、
付加的なキャッピング工程が、反応工程a)~e)のいずれにおいても実施されないことを特徴とする。
一実施形態では、本発明は、次式のN3´→P5´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットの合成方法に関する。
この方法は、
a)式(A)(式中、PGは酸不安定性保護基である)の固相支持体に付着した最初の3´-アミノ保護ヌクレオチドを提供することと、
b)保護された3´-アミノ基を脱保護して、遊離3´-アミノ基を形成することと、
c)遊離3´-アミノ基を、式(B´n)の保護された3´アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマー(n=2のB´nは、保護されたAである)と反応させて、ヌクレオシド間N3´→P5´-ホスホルアミダイト結合を形成することと、
d)アシルジスルフィドを用いてヌクレオシド間ホスホルアミダイト基を硫化して、N3´→P5´チオホスホルアミデートを形成することと、
e)連続した順序で11回、脱保護工程b)と、式(B´n)の保護された3´-アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ-ホスホルアミダイトモノマーを用いたカップリング工程c)であって、モノマー(B´n)のヌクレオシド塩基B´が、Bがチミンである場合を除いて保護されたBであり、Bnが、それぞれ11回のカップリング工程で順次核酸塩基B3~B13である、カップリング工程c)と、硫化工程d)とを繰り返すことと、
f)酸不安定性保護基PGを除去することと、
g)固相支持体からイメテルスタットを脱保護および切断することと、を含み、
付加的なキャッピング工程が、反応工程a)~e)のいずれにおいても実施されないことを特徴とする。
a)式(A)(式中、PGは酸不安定性保護基である)の固相支持体に付着した最初の3´-アミノ保護ヌクレオチドを提供することと、
e)連続した順序で11回、脱保護工程b)と、式(B´n)の保護された3´-アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ-ホスホルアミダイトモノマーを用いたカップリング工程c)であって、モノマー(B´n)のヌクレオシド塩基B´が、Bがチミンである場合を除いて保護されたBであり、Bnが、それぞれ11回のカップリング工程で順次核酸塩基B3~B13である、カップリング工程c)と、硫化工程d)とを繰り返すことと、
f)酸不安定性保護基PGを除去することと、
g)固相支持体からイメテルスタットを脱保護および切断することと、を含み、
付加的なキャッピング工程が、反応工程a)~e)のいずれにおいても実施されないことを特徴とする。
一実施形態では、本発明は、次式のN3´→P5´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットの合成方法に関する。
この方法は、
a)式(A)(式中、PGは酸不安定性保護基である)の固相支持体に付着した最初の3´-アミノ保護ヌクレオチドを提供することと、
b)PGで保護された3´-アミノヌクレオチドを脱保護して、式(A´)の遊離3´-アミノヌクレオチドを形成することと、
c)遊離3´-アミノヌクレオチドを、保護された3´-アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマー(B´n)(n=2のB´nは保護されたAである)とカップリングさせて、ヌクレオシド間N3´→P5´-ホスホルアミダイト結合を形成することと、
d)アシルジスルフィドを用いてN3´→P5´ホスホルアミダイト結合を硫化して、ヌクレオシド間N3´→P5´チオホスホルアミデート結合を形成することと、
e)連続した順序で11回、
脱保護工程b)と、
式(B´n)の保護された3´-アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ-ホスホルアミダイトモノマーを用いたカップリング工程c)であって、モノマー(B´n)のヌクレオシド塩基B´が、Bがチミンである場合をいて保護されたBであり、Bnは、それぞれ11回のカップリング工程で順次、核酸塩基B3~B13である、カップリング工程c)と、
硫化工程d)と、を繰り返して、
固相支持体に付着した保護されたN3´→P5´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットを生成することと、
f)保護されたN3´→P5´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットから、3´末端酸不安定性保護基PGを除去することと、
g)固相支持体から、保護されたN3´→P5´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットを脱保護して切断し、イメテルスタットを生成することと、を含み、
付加的なキャッピング工程が、反応工程a)~e)のいずれにおいても実施されないことを特徴とする。
a)式(A)(式中、PGは酸不安定性保護基である)の固相支持体に付着した最初の3´-アミノ保護ヌクレオチドを提供することと、
e)連続した順序で11回、
脱保護工程b)と、
式(B´n)の保護された3´-アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ-ホスホルアミダイトモノマーを用いたカップリング工程c)であって、モノマー(B´n)のヌクレオシド塩基B´が、Bがチミンである場合をいて保護されたBであり、Bnは、それぞれ11回のカップリング工程で順次、核酸塩基B3~B13である、カップリング工程c)と、
硫化工程d)と、を繰り返して、
固相支持体に付着した保護されたN3´→P5´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットを生成することと、
f)保護されたN3´→P5´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットから、3´末端酸不安定性保護基PGを除去することと、
g)固相支持体から、保護されたN3´→P5´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットを脱保護して切断し、イメテルスタットを生成することと、を含み、
付加的なキャッピング工程が、反応工程a)~e)のいずれにおいても実施されないことを特徴とする。
制御された細孔ガラス(CPG)、高度に架橋されたポリスチレン、架橋ポリスチレン支持体を充填されたハイブリッド制御された細孔ガラス、アクリル共重合体、セルロース、ナイロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレインなどで作成された微粒子などを含むがこれらに限定されない、多種多様な固相担体が、本発明で使用され得る。
式(A)の固相支持体に付着した3´-アミノ保護ヌクレオチドは、
3-パルミトイルアミド-1-O-(4,4´-ジメトキシトリチル)-2-O-スクシニルプロパンジオールが充填された制御細孔ガラス支持体が、式(B´1)の保護された3´-アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマーとカップリングされているWO2005/023994に開示されているように、調製することができる。
式中、PGは酸不安定性保護基である。適切な酸不安定性3´-アミノ保護基PGは、例えば、トリフェニルメチル(すなわち、トリチルまたはTr)、p-アニシルジフェニルメチル(すなわち、モノメトキシトリチルまたはMMT)、およびジ-p-アニシルフェニルメチル(すなわち、ジメトキシトリチルまたはDMT)であるが、これらに限定されない。
式(B´n )の保護された3´-アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマーは、例えば、トリフェニルメチル(すなわち、トリチルまたはTr)、p-アニシルジフェニルメチル(すなわち、モノメトキシトリチルまたはMMT)、およびジ-p-アニシルフェニルメチル(すなわち、ジメトキシトリチルまたはDMT)などの酸不安定性基である3´-アミノ保護基PGを有する。さらに、ヌクレオシド塩基B´は、塩基不安定性保護基(チミンを除く)で保護されている。
ヌクレオチドモノマーB´1およびB´2~B´13は、3-パルミトイルアミド-1-O-(4,4´-ジメトキシトリチル)2-O-スクシニルプロパンジオールを装填し、ヌクレオチドモノマーB´1にカップリングされた固相支持体の提供から開始する13回のカップリング工程およびヌクレオチドモノマーB´2~B´13が使用される、12の脱保護、カップリング、および硫化反応の次のサイクルで、連続的に使用される。
3´-アミノ保護基PGは、例えば、ジクロロメタンまたはトルエン中のジクロロ酢酸などの酸性溶液で処理することにより除去することができる。
式(B´n)の保護された3´-アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピル-アミノホスホルアミダイトモノマーのヌクレオシド塩基B´は、工程g)で除去される塩基不安定性保護基で保護されている。ヌクレオシド塩基アデニン、シトシンまたはグアニンに適した塩基不安定性保護基は、例えば、アセチル、ベンゾイル、イソブチリル、ジメチルホルムアミジニル、またはジベンジルホルムアミジニルなどのアシル基である。オリゴヌクレオチド合成で使用される反応条件下では、チミンヌクレオシド塩基は保護を必要としません。酸不安定性基保護基PGで保護された3´-アミノおよび塩基不安定性保護基で保護されたヌクレオシド塩基B´を有する式(B´n)のそのような保護された3´-アミノ-ヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマーは、市販されているか、WO2006/014387に記載されているように、調製することができる。
カップリング工程c)は、固体支持体に共有結合した(オリゴ)ヌクレオチドの遊離アミノ基を含む反応容器に、式(Bn)の保護された3´-アミノ-ヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマーの溶液および活性化剤の溶液(またはホスホルアミダイトモノマー(Bn)および活性化剤を含有する溶液)を添加することにより実施される。次に、混合物を機械的ボルテックス、不活性ガスの散布などの方法で混合する。あるいは、モノマーおよび活性化剤の溶液を、遊離3´-アミノ基を持つ固相支持された(オリゴ)ヌクレオチドを含む反応容器(またはカラム)を通して流すことができる。モノマーおよび活性化剤は、事前に混合するか、適切な合成装置のバルブブロックで混合するか、事前活性化容器で混合し、必要に応じて事前に平衡化するか、または反応容器に別々に加えることができる。
本発明における使用のための活性化剤の例は、テトラゾール、5-(エチルチオ)-1H-テトラゾール、5-(4-ニトロ-フェニル)テトラゾール、5-(2-チエニル)-1H-テトラゾール、トリアゾール、ピリジニウムクロリドなどであるが、これらに限定されない。適切な溶媒は、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタンなどである。実際、アセトニトリルは、オリゴヌクレオチド合成に一般的に使用される溶媒である。
工程d)で使用するための硫化剤は、溶媒に溶解されたアシルジスルフィドである。アシルジスルフィドは、例えば、ジベンゾイルジスルフィド、ビス(フェニルアセチル)ジスルフィド(PADS)、ビス(4-メトキシベンゾイル)ジスルフィド、ビス(4-メチルベンゾイル)ジスルフィド、ビス(4-ニトロベンゾイル)ジスルフィドおよびビス(4-クロロベンゾイル)ジスルフィドである。
フェニルアセチルジスルフィド(PADS)は、硫化反応に一般的に使用される薬剤であり、最適な硫化活性を得るために塩基性溶液で「熟成」するのが最適である(Scotson J.L.et al.,Org.Biomol.Chem.,vol.14,10840-10847,2016)。PADSに適した溶媒は、例えば、3-ピコリンまたは2,6-ルチジンなどの塩基性溶媒と、アセトニトリル、トルエン、1-メチルピロリジノンまたはテトラヒドロフランなどの共溶媒との混合物である。共溶媒の量に対する塩基性溶媒の量は、1:1の比率を含む任意の比率であり得る。その対応するチオリン酸塩に変換される亜リン酸エステルに応じて、「新鮮な」PADSおよび「熟成した」PADSの両方が使用され得るが、「熟成した」PADSは、硫化の速度および効率を改善することが示されている。「熟成した」PADS溶液は、硫化反応で使用する前にしばらく
維持された、新しく調製されたPADS溶液である。熟成時間は、数時間から48時間まで変化する可能性があり、当業者は、硫化反応の収率と純度を分析することで最適な熟成時間を決定できます。
維持された、新しく調製されたPADS溶液である。熟成時間は、数時間から48時間まで変化する可能性があり、当業者は、硫化反応の収率と純度を分析することで最適な熟成時間を決定できます。
本発明によるイメテルスタットの調製のために、アセトニトリルと2,6-ルチジンの混合物中の、好ましくは1:1の比率の、4~14時間の熟成時間のPADS溶液が、使用される。2,6-ルチジンが使用される場合、2,3,5-コリジン(2,6-ルチジンの不純物としてよく見られる)の量を0.1%未満に制限すると、硫化の効率が向上し、望ましくない蛍光体酸化が観察されることが少ない。
工程g)で、イメテルスタットが脱保護され、固相支持体から切断される。脱保護には、β-シアノエチル基およびヌクレオチド塩基上の塩基不安定性保護基の除去が含まれる。これは、アセトニトリル中のジエチルアミン(DEA)溶液などの塩基性溶液で処理した後、エタノールなどのアルコールに溶解されたアンモニア水で処理することで、実行され得る。
本発明の反応工程a)~f)は、10℃~40℃の温度範囲で実施される。より好ましくは、これらの反応は、15℃~30℃の制御された温度範囲で実施される。特に、本発明の反応工程b)は、15℃~30℃、特に17℃~27℃の温度範囲で実施される。特に、本発明の反応工程d)は、17℃~25℃、特に18℃~22℃、さらに特に19℃の温度範囲で実施される。イメテルスタットが脱保護され、固相支持体から切断される工程g)は、30℃~60℃の温度範囲で実施される。使用される装置および特定の反応条件に応じて、上記の範囲内の各工程a)~g)の最適な反応温度は、当業者によって決定され得る。
伸長サイクルの各工程の後、固相支持体は、次の反応に備えて、溶媒、例えば、アセトニトリルで洗浄される。
工程g)の後、粗イメテルスタットが、そのアンモニウム塩の形態で得られ、次に、ポリマーまたはシリカベースの樹脂を使用して分取逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)で精製し、トリエチルアミンの形態で精製されたイメテルスタットを取得する。過剰のナトリウム塩を加えた後、溶液をダイアフィルトレーションにより脱塩し、それによりイメテルスタットナトリウムを得て、これを凍結乾燥して水を除去する。
実験部
「室温」または「周囲温度」は、通常21~25℃である。
「室温」または「周囲温度」は、通常21~25℃である。
実験1(キャッピング工程なし)
トルエン中の3%ジクロロ酢酸(DCA)、アセトニトリル中の0.5Mの5-(エチルチオ)-1H-テトラゾール、アセトニトリル中の式(B´n)の0.15Mのすべての4ヌクレオチドモノマー、アセトニトリルと2,6-ルチジンの1:1混合物中の0.2Mフェニルアセチルジスルフィド(PADS)およびアセトニトリル中の20%DEA(ジエチルアミン)を含む、すべての試薬および出発物質溶液を調製した。
トルエン中の3%ジクロロ酢酸(DCA)、アセトニトリル中の0.5Mの5-(エチルチオ)-1H-テトラゾール、アセトニトリル中の式(B´n)の0.15Mのすべての4ヌクレオチドモノマー、アセトニトリルと2,6-ルチジンの1:1混合物中の0.2Mフェニルアセチルジスルフィド(PADS)およびアセトニトリル中の20%DEA(ジエチルアミン)を含む、すべての試薬および出発物質溶液を調製した。
オリゴヌクレオチド合成は、脱トリチル化とそれに続くカップリング、および周囲温度での硫化からなる反復合成サイクルを利用して、5´から3´の方向で実施された。
カラム(直径:3.5cm)に、ヌクレオチドモノマーB´1とカップリングした3-パルミトイルアミド-1-O-(4,4´-ジメトキシトリチル)-2-O-スクシニルプロパンジオール(容量400μmol/gに基づいて3.5mmol)を充填した固体支持体を充填した。トルエン中の3%ジクロロ酢酸(DCA)を使用して脱トリチル化を達成し(量は各脱トリチル化工程で6.5~13.4カラム体積の間である)、固体支持体結合ヌクレオチドを、アセトニトリル(量:5カラム体積)で洗浄した。式(B´n)の次のヌクレオチドモノマーとのカップリングを、アセトニトリル中の0.5Mの5-(エチルチオ)-1H-テトラゾールの溶液と、順にアセトニトリルに溶解し、カラムを通過した、式(B´n)の0.15Mの次のヌクレオチドモノマーを、ポンプで送ることにより達成した。カラムをアセトニトリルで洗浄した(量:2カラム容量)。次に、アセトニトリルと2,6-ルチジンの1:1混合物中の0.2Mフェニルアセチルジスルフィド(PADS)の溶液をカラムにポンプで送り、続いてカラムをアセトニトリル(量:5カラム容量)で洗浄することにより、硫化を実施した。
脱トリチル化、式(B´n)の次のヌクレオチドモノマーとのカップリング、および硫化の合成サイクルを12回繰り返した後、トルエン中の3%ジクロロ酢酸(DCA)を使用した脱トリチル化(量は6.5~13.4カラム容量の間)を行った。
合成サイクルが完了したら、固体支持体支持体上の粗オリゴヌクレオチドを、ジエチルアミン(DEA)溶液で処理し、続いて55℃の温度で水酸化アンモニウム溶液:エタノール(体積比3:1)で処理した。反応混合物を55℃で4~24時間熟成させ、室温まで冷却し、スラリーを濾過してポリマー支持体を除去した。アンモニウム形態のイメテルスタットを含む溶液を、実験3のHPLC分析手順にかけた。
実験2(キャッピング工程あり)
トルエン中の3%ジクロロ酢酸(DCA)、アセトニトリル中の0.5Mの5-(エチルチオ)-1H-テトラゾール、アセトニトリル中の0.15Mの式(B´n)のすべての4ヌクレオチドモノマー、アセトニトリルと2,6-ルチジン混合物の1:1混合物中の0.2Mフェニルアセチルジスルフィド(PADS)、キャッピング剤Aとしてのアセトニトリル中の20%N-メチルイミダゾール(NMI)、アセトニトリルとキャッピング剤Bとしての2,6-ルチジン混合物の1:1混合物中の無水イソ酪酸およびアセトニトリル中の20%DEAを含む、すべての試薬および出発物質溶液を調製した。
トルエン中の3%ジクロロ酢酸(DCA)、アセトニトリル中の0.5Mの5-(エチルチオ)-1H-テトラゾール、アセトニトリル中の0.15Mの式(B´n)のすべての4ヌクレオチドモノマー、アセトニトリルと2,6-ルチジン混合物の1:1混合物中の0.2Mフェニルアセチルジスルフィド(PADS)、キャッピング剤Aとしてのアセトニトリル中の20%N-メチルイミダゾール(NMI)、アセトニトリルとキャッピング剤Bとしての2,6-ルチジン混合物の1:1混合物中の無水イソ酪酸およびアセトニトリル中の20%DEAを含む、すべての試薬および出発物質溶液を調製した。
オリゴヌクレオチド合成を、脱トリチル化とそれに続くカップリング、および周囲温度で実施した硫化からなる反復合成サイクルを利用して、5´から3´の方向で実施した。
カラム(直径:3.5cm)に、ヌクレオチドモノマーB´1とカップリングした3-パルミトイルアミド-1-O-(4,4´-ジメトキシトリチル)-2-O-スクシニルプロパンジオール(容量400μmol/gに基づいて3.5mmol)を充填した固体支持体を充填した。トルエン中の3%ジクロロ酢酸(DCA)を使用して脱トリチル化を達成し(量は各脱トリチル化工程で6.5~13.4カラム体積の間である)、固体支持体結合ヌクレオチドを、アセトニトリル(量:5カラム体積)で洗浄した。式(B´n)の次のヌクレオチドモノマーとのカップリングを、アセトニトリル中の0.5Mの5-(エチルチオ)-1H-テトラゾールの溶液と、順にアセトニトリルに溶解し、カラムを通過した、式(B´n)の0.15Mの次のヌクレオチドモノマーを、ポンプで送ることにより達成した。カラムをアセトニトリルで洗浄した(量:2カラム容量)。次に、アセトニトリルと2,6-ルチジンの1:1混合物中の0.2Mフェニルアセチルジスルフィド(PADS)の溶液をカラムにポンプで送り、続いてカラムをアセトニトリル(量:5カラム容量)で洗浄することにより、硫化を実施した。
硫化に続いてキャッピング工程を行った。所定のサイクルの各キャッピングでは、キャッピング剤NMIの37~47等量(eq.)、キャッピング剤Bイソ酪酸無水物(IBA)の9~11等量、および2,6ルチジンの1.4~1.8等量を使用した。キャッピング剤AとBは、50:50、35:65、65:35などの異なる比率の別々のポンプを用いて、カラムにポンプで送った。
脱トリチル化、式(B´n)の次のヌクレオチドモノマーとのカップリングおよび硫化、キャッピングの合成サイクルを12回繰り返した後、トルエン中の参%ジクロロ酢酸(DCA)を使用した脱トリチル化(量は6.5~13.4カラム容量の間)を行った。
合成サイクルが完了したら、固体支持体支持体上の粗オリゴヌクレオチドを、ジエチルアミン(DEA)溶液で処理し、続いて55℃の温度で水酸化アンモニウム溶液:エタノール(体積比3:1)で処理した。反応混合物を55℃で4~24時間熟成させ、室温まで冷却し、スラリーを濾過してポリマー支持体を除去した。アンモニウム形態のイメテルスタットを含む溶液を、実験3のHPLC分析手順にかけた。
実験参:キャッピングなしとキャッピングの比較
実験1および実験2で得られたイメテルスタットを、HPLCで分析した。13個のヌクレオチドを有する所望の完全長オリゴヌクレオチドの量を決定し、実験1および実験2について、以下の表にリストした。また、ショートマーの総量を、具体的には12マーを、実験1および実験2について、以下の表に測定し、列挙した。
HPLC分析法:
カラムタイプ:Kromasil C18、粒子サイズ3.5μm、4.6×150mm溶離液:
A:14.4mM TEA/386mM HFIP(ヘキサフルオロイソプロパノール)/100ppm(w/v)水中のNa2EDTA
B:5%IPAを含む50%MeOH、50%EtOH
勾配:
表:キャッピングとキャッピングなしの実験(実験1は2回実行され、結果は実験1aおよび1bとしてリストされている)。
実験1および実験2のHPLC分析は、キャッピングなしの実験とキャッピングの実験とで、収量と純度が同等であることを示している。
メインピーク%には、完全長オリゴヌクレオチド+PO不純物+脱プリン不純物が含まれる。
PO不純物は、チオホスホルアミデートヌクレオシド間結合の代わりに、1つ以上のオキソホスホルアミデートヌクレオシド間結合を含む不純物である。
実験1および実験2で得られたイメテルスタットを、HPLCで分析した。13個のヌクレオチドを有する所望の完全長オリゴヌクレオチドの量を決定し、実験1および実験2について、以下の表にリストした。また、ショートマーの総量を、具体的には12マーを、実験1および実験2について、以下の表に測定し、列挙した。
HPLC分析法:
カラムタイプ:Kromasil C18、粒子サイズ3.5μm、4.6×150mm溶離液:
A:14.4mM TEA/386mM HFIP(ヘキサフルオロイソプロパノール)/100ppm(w/v)水中のNa2EDTA
B:5%IPAを含む50%MeOH、50%EtOH
勾配:
メインピーク%には、完全長オリゴヌクレオチド+PO不純物+脱プリン不純物が含まれる。
PO不純物は、チオホスホルアミデートヌクレオシド間結合の代わりに、1つ以上のオキソホスホルアミデートヌクレオシド間結合を含む不純物である。
溶媒の使用と反応時間
アセトニトリル0.45L/mmolを使用して、試薬の調製中のアセトニトリル使用全体の約25%に相当するキャッピング剤Aおよびキャッピング剤Bの試薬を調製した。各化学反応工程の後に溶媒洗浄が続くため、各キャッピング工程の後も、溶媒の約40カラム容量に相当する溶媒洗浄が行われる。所定の合成実行で約212カラム容量の溶媒洗浄が行われることを考慮すると、キャッピング工程には洗浄溶媒の約19%が使用される。各キャッピング工程には3~6分かかる。これは、13サイクルとDEA処理とを含む全体の合成時間の約8%に相当する。
アセトニトリル0.45L/mmolを使用して、試薬の調製中のアセトニトリル使用全体の約25%に相当するキャッピング剤Aおよびキャッピング剤Bの試薬を調製した。各化学反応工程の後に溶媒洗浄が続くため、各キャッピング工程の後も、溶媒の約40カラム容量に相当する溶媒洗浄が行われる。所定の合成実行で約212カラム容量の溶媒洗浄が行われることを考慮すると、キャッピング工程には洗浄溶媒の約19%が使用される。各キャッピング工程には3~6分かかる。これは、13サイクルとDEA処理とを含む全体の合成時間の約8%に相当する。
実験4(脱トリチル化温度)
脱トリチル化温度は、n-1および脱プリン不純物の制御に関して影響を及ぼす。シンセサイザーの入口のデブロッキング溶液の温度は17.5~27℃(3.5mmolスケール)の間で選択され、選択された温度はすべての脱トリチル化工程で同等に保たれた。アセトニトリル洗浄も、脱ブロッキング溶液と同じ温度に保たれた。脱プリンされた不純物の割合は、温度とともに直線的に増加し、n-1はより低温でより高くなった。
脱トリチル化温度は、n-1および脱プリン不純物の制御に関して影響を及ぼす。シンセサイザーの入口のデブロッキング溶液の温度は17.5~27℃(3.5mmolスケール)の間で選択され、選択された温度はすべての脱トリチル化工程で同等に保たれた。アセトニトリル洗浄も、脱ブロッキング溶液と同じ温度に保たれた。脱プリンされた不純物の割合は、温度とともに直線的に増加し、n-1はより低温でより高くなった。
実験5(硫化工程温度)
以下の実験では、硫化反応に使用されるPADS溶液の温度(RTは室温を意味する)を、PO不純物(硫化の代わりにリン酸化が発生した不純物)の割合についてテストした。温度が低いと、PO%が低くなる。
以下の実験では、硫化反応に使用されるPADS溶液の温度(RTは室温を意味する)を、PO不純物(硫化の代わりにリン酸化が発生した不純物)の割合についてテストした。温度が低いと、PO%が低くなる。
配列番号:1-イメテルスタットおよびイメテルスタットナトリウム
5´-R-TAGGGTTAGACAA-NH2-3´
式中、Rはパルミトイル[(CH2)14CH3]アミドを表し、アミノグリセロールリンカーを介してN3´→P5´チオホスホルアミデート(NPS)結合オリゴヌクレオチドの5´-チオリン酸基に結合する。
5´-R-TAGGGTTAGACAA-NH2-3´
式中、Rはパルミトイル[(CH2)14CH3]アミドを表し、アミノグリセロールリンカーを介してN3´→P5´チオホスホルアミデート(NPS)結合オリゴヌクレオチドの5´-チオリン酸基に結合する。
本発明の好ましい実施形態によれば、例えば、以下が提供される。
(項1)
次式のN3´→P5´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットの合成方法であって、
前記方法は、
a)式(A)(式中、PGは酸不安定性保護基である)の固相支持体に付着した最初の3´-アミノ保護ヌクレオチドを提供することと、
b)前記保護された3´-アミノ基を脱保護して、遊離3´-アミノ基を形成することと、
c)前記遊離3´-アミノ基を、式(B´ n )の保護された3´-アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマー(n=2のB´ n は、保護されたAである)と反応させて、ヌクレオシド間N3´→P5´-ホスホルアミダイト結合を形成することと、
d)アシルジスルフィドを用いて前記ヌクレオシド間ホスホルアミダイト基を硫化して、N3´→P5´チオホスホルアミデートを形成することと、
e)連続した順序で11回、前記脱保護工程b)と、式(B´ n )の保護された3´-アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ-ホスホルアミダイトモノマーを用いたカップリング工程c)であって、モノマー(B´ n )のヌクレオシド塩基B´が、Bがチミンである場合を除いて保護されたBであり、B n が、それぞれ11回のカップリング工程で順次核酸塩基B 3 ~B 13 である、カップリング工程c)と、前記硫化工程d)とを繰り返すことと、
f)前記酸不安定性保護基PGを除去することと、
g)前記固相支持体からイメテルスタットを脱保護および切断することと、を含み、
付加的なキャッピング工程が、反応工程a)~e)のいずれにおいても実施されないことを特徴とする、方法。
(項2)
イメテルスタットが、そのナトリウム塩にさらに変換される、上記項1に記載の方法。
(項3)
前記アシルジスルフィドが、ジベンゾイルジスルフィド、ビス(フェニルアセチル)ジスルフィド(PADS)、ビス(4-メトキシベンゾイル)ジスルフィド、ビス(4-メチルベンゾイル)ジスルフィド、ビス(4-ニトロベンゾイル)ジスルフィドおよびビス(4-クロロベンゾイル)ジスルフィドから選択される、上記項1または2に記載の方法。
(項4)
前記アシルジスルフィドがPADSである、上記項3に記載の方法。
(項5)
PADSが、3-ピコリンまたは2,6-ルチジンと、アセトニトリル、トルエン、1-メチルピロリジノンおよびテトラヒドロフランから選択される共溶媒との混合物中に溶解される、上記項4に記載の方法。
(項6)
PADSが、2,6-ルチジンとアセトニトリルとの混合物に溶解される、上記項5に記載の方法。
(項7)
前記PADS溶液が使用の4時間~14時間前に熟成される、上記項6に記載の方法。
(項8)
前記酸不安定性基PGが、トリフェニルメチル、p-アニシルジフェニルメチル、およびジ-p-アニシルフェニルメチルから選択される、上記項1~7のいずれか一項に記載の方法。
(項9)
前記酸不安定性保護基PGが、酸性溶液での処理により除去される、上記項1~8のいずれか一項に記載の方法。
(項10)
前記式(B´ n )のモノマー中のアデニン、シトシンおよびグアニン塩基上の塩基不安定性保護基が、アセチル、ベンゾイル、イソブチリル、ジメチルホルムアミジニル、およびジベンジルホルムアミジニルから選択される、上記項1~9のいずれか一項に記載の方法。
(項11)
前記カップリング工程c)が、テトラゾール、5-(エチルチオ)-1H-テトラゾール、5-(4-ニトロ-フェニル)テトラゾール、5-(2-チエニル)-1H-テトラゾール、トリアゾール、およびピリジニウムクロリドから選択される活性化剤を用いて実施される、上記項1~10のいずれか一項に記載の方法。
(項12)
工程g)が塩基性溶液での処理により実施される、上記項1~11のいずれか一項に記
載の方法。
(項13)
前記塩基性溶液が、アセトニトリルに溶解したジエチルアミンまたはアルコールに溶解したアンモニア水、または両方の組み合わせである、上記項12に記載の方法。
(項1)
次式のN3´→P5´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットの合成方法であって、
前記方法は、
a)式(A)(式中、PGは酸不安定性保護基である)の固相支持体に付着した最初の3´-アミノ保護ヌクレオチドを提供することと、
b)前記保護された3´-アミノ基を脱保護して、遊離3´-アミノ基を形成することと、
c)前記遊離3´-アミノ基を、式(B´ n )の保護された3´-アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマー(n=2のB´ n は、保護されたAである)と反応させて、ヌクレオシド間N3´→P5´-ホスホルアミダイト結合を形成することと、
d)アシルジスルフィドを用いて前記ヌクレオシド間ホスホルアミダイト基を硫化して、N3´→P5´チオホスホルアミデートを形成することと、
e)連続した順序で11回、前記脱保護工程b)と、式(B´ n )の保護された3´-アミノヌクレオシド-5´-O-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ-ホスホルアミダイトモノマーを用いたカップリング工程c)であって、モノマー(B´ n )のヌクレオシド塩基B´が、Bがチミンである場合を除いて保護されたBであり、B n が、それぞれ11回のカップリング工程で順次核酸塩基B 3 ~B 13 である、カップリング工程c)と、前記硫化工程d)とを繰り返すことと、
f)前記酸不安定性保護基PGを除去することと、
g)前記固相支持体からイメテルスタットを脱保護および切断することと、を含み、
付加的なキャッピング工程が、反応工程a)~e)のいずれにおいても実施されないことを特徴とする、方法。
(項2)
イメテルスタットが、そのナトリウム塩にさらに変換される、上記項1に記載の方法。
(項3)
前記アシルジスルフィドが、ジベンゾイルジスルフィド、ビス(フェニルアセチル)ジスルフィド(PADS)、ビス(4-メトキシベンゾイル)ジスルフィド、ビス(4-メチルベンゾイル)ジスルフィド、ビス(4-ニトロベンゾイル)ジスルフィドおよびビス(4-クロロベンゾイル)ジスルフィドから選択される、上記項1または2に記載の方法。
(項4)
前記アシルジスルフィドがPADSである、上記項3に記載の方法。
(項5)
PADSが、3-ピコリンまたは2,6-ルチジンと、アセトニトリル、トルエン、1-メチルピロリジノンおよびテトラヒドロフランから選択される共溶媒との混合物中に溶解される、上記項4に記載の方法。
(項6)
PADSが、2,6-ルチジンとアセトニトリルとの混合物に溶解される、上記項5に記載の方法。
(項7)
前記PADS溶液が使用の4時間~14時間前に熟成される、上記項6に記載の方法。
(項8)
前記酸不安定性基PGが、トリフェニルメチル、p-アニシルジフェニルメチル、およびジ-p-アニシルフェニルメチルから選択される、上記項1~7のいずれか一項に記載の方法。
(項9)
前記酸不安定性保護基PGが、酸性溶液での処理により除去される、上記項1~8のいずれか一項に記載の方法。
(項10)
前記式(B´ n )のモノマー中のアデニン、シトシンおよびグアニン塩基上の塩基不安定性保護基が、アセチル、ベンゾイル、イソブチリル、ジメチルホルムアミジニル、およびジベンジルホルムアミジニルから選択される、上記項1~9のいずれか一項に記載の方法。
(項11)
前記カップリング工程c)が、テトラゾール、5-(エチルチオ)-1H-テトラゾール、5-(4-ニトロ-フェニル)テトラゾール、5-(2-チエニル)-1H-テトラゾール、トリアゾール、およびピリジニウムクロリドから選択される活性化剤を用いて実施される、上記項1~10のいずれか一項に記載の方法。
(項12)
工程g)が塩基性溶液での処理により実施される、上記項1~11のいずれか一項に記
載の方法。
(項13)
前記塩基性溶液が、アセトニトリルに溶解したジエチルアミンまたはアルコールに溶解したアンモニア水、または両方の組み合わせである、上記項12に記載の方法。
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