JP5048575B2 - オリゴヌクレオチドの脱シリル化の方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2004年4月5日に受理された米国特許仮出願第60/559,782号の優先権を享受し、その内容の全てを参照として本明細書に取り入れておく。
S.アグラワル(Agrawal)、Trends in Biotechnology,14:375-382(1996) J.マー(Marr)ら、Drug Discovery Today,1:94-102(1996) W.ラッシュ(Rush)、Science,276:1192-1193(1997) ウスマン(Usman)ら、J.Am.Chem.Soc.,109:7845(1987) スカリンジ(Scaringe)ら、Nucleic Acids Res.,5433-5341(1990) パーレオート(Perreault)ら、Biochemistry,30:4020-4025(1991) スリム(Slim)およびガイト(Gait)ら、Nucleic Acids Res.,19:1183-1188(1991) オダイ(Odai)ら、FEBS Lett.,267:150-152(1990) リー(Lee)ら、Cell,75:843(1993) ラインハート(Reinhart)ら、Nature,403:901(2000) ラヴクン(Ruvkun)、Science,2294:797(2001) デクラーク(Declerq)ら、Meth.Enzymol.,78:291(1981) ヴ−リ(Wu-Li)、Biol.Chem.,265:5470(1990) アウベル(Aubel)ら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,88:906(1991) レヴィ(Levy)ら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,62:357-361(1969) ゼレツニック(Zeleznick)ら、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,130:126-128(1969) ゲルボイン(Gelboin)ら、Science,167:205-207(1970) ドツィトヴェヴァ(Dzitoveva)ら、Mol.Psychiatry.,6(6):665-670(2001) エルバシール(Elbashir)ら、Genes Dev.,15(2):188-200(2001) バーステッド(Barstead)、Curr.Opin.Chem.Biol.,5(1):63-66(2001) タヴァーナラキス(Tavernarakis)、Nat.Genet.,24(2):180-183(2000) ザモレ(Zamore)、Nat.Struct.Biol.8(9):746-750(2001) ピアノ(Piano)ら、Curr.Biol.,10(24):1619-1622(2000) ニシカワ(Nishikawa)ら、Eur.J.Biochem.,268(20):5295-5299(2001) バーンスタイン(Bernstein)ら、Nature,409(6818):295-296(2001) ヴァウチェレ(Vaucheret)ら、J.Cell.Sci.,144(Pt 17):3083-3091(2001) エスコバー(Escobar)ら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,98(23):13437-13442(2001) ハモンド(Hammond)ら、Science,293(5532):1146-1150(2001年8月) スヴォボダ(Svoboda)ら、Development,127(19):4147-4156(2000) スヴォボダ(Svoboda)ら、Biochem.Biophys.Res.Commum.287(5):1099-1104(2001) L.L.クミンズ(Cummins)ら、Nucleic Acids Res.,23:2019(1995) ウールマン(Uhlmann),E.、ペイマン(Peyman),A.、Chem.Rev.,90:544(1990) マノハラン(Manoharan)、ChemBio.Chem.,3:1257(2002)
固相化学を用いたオリゴヌクレオチドの合成において最も一般的に用いられる方法は、ホスホルアミダイト法である。一般的な方法においては、アクチベーターの存在下において、ホスホルアミダイトに、支持体に結合したヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを反応させる。ホスホルアミダイトカップリング生成物を酸化し、保護ホスフェートを得る。本方法に使用できるホスホルアミダイト誘導体としては多様なものが知られており、最も汎用されているアクチベーターは1H−テトラゾールである。可溶性支持体を用いる同様な方法についても記載されている。ボロナ(Borona)ら、Nucleic Acids Res., 21: 1213-1217 (1993)などを参照。ホスホルアミダイト法は、オリゴヌクレオチド合成のための液相化学においても広く用いられている。さらに、デオキシリボヌクレオシドホスホルアミダイト誘導体がオリゴヌクレオチドの合成に使用されている。ビューケージ(Beaucage)ら、Tetrahedron Lett., 22: 1859-1862(1981)を参照。
本発明に従うアクチベーター化合物は、オリゴヌクレオチド合成において用いられるホスホルアミダイトの活性化に対して優れた特性を有する。一般的に、アクチベーター化合物は、1H−テトラゾールよりも爆発性が低く、アセトニトリルへの溶解性が高い。さらに、本発明に従うアクチベーター化合物は、デカマーRNA分子の合成に要する反応時間が1H−テトラゾールよりも短い。実施例1を参照。ある実施態様においては、本発明に従うアクチベーター化合物は電子吸引基を有しており、化合物のpKaを低下させている。より酸性のアクチベーター化合物は、特定の場合において、ホスホルアミダイトカップリング反応の速度を速めることができる。重要なことは、反応時間の短縮によって副作用発生の機会が抑えられ、それにより、所望する生成物がより高純度で得られる。さらに、本発明に従うアクチベーター化合物は、遊離複素環式化合物、または、アクチベーターとそれに対応するモノアルキル、ジアルキルもしくはトリアルキルアンモニウム塩との混合物(塩のアクチベーターに対するモル比は多様)である。本発明に従う好ましいアクチベーター化合物については、図1、2および3に示している。
R1、R2、R3およびR6は、それぞれ別異に、H、−NO2、−CN、−CF3、−SO2R8、−SR8、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アルコキシル、−OR7、−N(R7)2、−N(R7)C(O)R8、−C(O)R7または−CO2R8を表し;あるいは、R1およびR2、またはR2およびR3は、O、NおよびSより成る群から選択される0〜4個のヘテロ原子を有する4〜8員の環構造を形成し;
R4は、空位、または、ぞれぞれ別異に、−(C(R9)2)nCH3・Yを表し;
R5は、Hまたは−(C(R9)2)nCH3であり;
R7は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R8は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R9は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し;
nは、それぞれ別異に0〜15を表し;さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR8CO2 -を表す。
R2は、空位、または、それぞれ別異に−(C(R7)2)nCH3・Yを表し;
R4は、Hまたは−(C(R7)2)nCH3を表し;
R5は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R6は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R7は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し;
nは、それぞれ別異に0〜15を表し;さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR6CO2 -を表す。
R3は、空位、または、それぞれ別異に−(C(R7)2)nCH3・Yを表し;
R4は、Hまたは−(C(R7)2)nCH3を表し;
R5は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R6は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R7は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し;
nは、それぞれ別異に0〜15を表し;さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR6CO2 -を表す。
R2は、空位、または、それぞれ別異に−(C(R7)2)nCH3・Yを表し;
R3は、Hまたは−(C(R6)2)nCH3を表し;
R4は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R5は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R6は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し;
nは、それぞれ別異に0〜15を表し;
mは、1、2、3、4、5、6、7または8であり;さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR5CO2 -を表す。
R2は、空位、または、それぞれ別異に−(C(R8)2)nCH3・Yを表し;
R5は、Hまたは−(C(R8)2)nCH3を表し;
R6は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R7は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R8は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し;
nは、それぞれ別異に0〜15を表し;さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR7CO2 -を表す。
ある実施態様においては、本発明は、上記化合物に関し、ここで、R2は空位であり;;さらに、R5はHである。
ホスホルアミダイト、アルコールおよび活性化剤を混合してホスファイト化合物を生成させるが、ここで、該活性化剤は、以下のような化合物より成る群から選択され:
R1、R2、R3およびR6は、それぞれ別異に、H、−NO2、−CN、−CF3、−SO2R8、−SR8、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アルコキシル、−OR7、−N(R7)2、−N(R7)C(O)R8、−C(O)R7または−CO2R8を表し;あるいは、R1およびR6、R1およびR2、または、R2およびR3は、O、NおよびSより成る群から選択される0〜4個のヘテロ原子を有する4〜8員の環構造を形成し;
R4は、空位、または、ぞれぞれ別異に、−(C(R9)2)nCH3・Yを表し;
R5は、Hまたは−(C(R9)2)nCH3であり;
R7は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R8は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R9は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し;
nは、それぞれ別異に0〜15を表し;さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR8CO2 -を表し;
R2は、空位、または、それぞれ別異に−(C(R7)2)nCH3・Yを表し;
R4は、Hまたは−(C(R7)2)nCH3を表し;
R5は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R6は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R7は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し;
nは、それぞれ別異に0〜15を表し;さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR6CO2 -を表し;
R3は、空位、または、それぞれ別異に−(C(R7)2)nCH3・Yを表し;
R4は、Hまたは−(C(R7)2)nCH3を表し;
R5は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R6は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R7は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し;
nは、それぞれ別異に0〜15を表し;さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR6CO2 -を表し;
R2は、空位、または、それぞれ別異に−(C(R6)2)nCH3・Yを表し;
R3は、Hまたは−(C(R6)2)nCH3を表し;
R4は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R5は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R6は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し;
nは、それぞれ別異に0〜15を表し;
mは、1、2、3、4、5、6、7または8であり;さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR5CO2 -を表し;
R2は、空位、または、それぞれ別異に−(C(R8)2)nCH3・Yを表し;
R5は、Hまたは−(C(R8)2)nCH3を表し;
R6は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R7は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し;
R8は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し;
nは、それぞれ別異に0〜15を表し;さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR7CO2 -を表す。
ある実施態様においては、本発明は、上述の方法に関し、ここで、前記ホスホルアミダイトは、3'−ヌクレオシドホスホルアミダイト、3'−ヌクレオチドホスホルアミダイト、または3'−オリゴヌクレオチドホスホルアミダイトである。
R2は、任意に置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキルまたはアルケニルであり;
R3およびR4は、それぞれ別異に、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはアラルキルを表し;あるいは、R3およびR4は、共に3〜8員の環構造を形成し;さらに、
R5は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはアラルキルである。
修飾オリゴヌクレオチドは、分子生物学的研究および抗ウイルス治療などのような用途において非常に重要である。RNAの翻訳を阻止し、ヌクレアーゼ耐性である修飾オリゴヌクレオチドは、アンチセンス反応試薬として有用である。ホスホロチオエート(P=S)結合を有する硫化オリゴヌクレオチドがこの領域の注目の的である。ホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチドは、核酸を認識するある種の酵素の立体化学的経路の決定においても有用である。
R1 およびR2は、それぞれ別異に、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキルまたは−N(R3)R4を表し、あるいは、R1 およびR2は共に、必要に応じて置換された芳香環を形成し;
R3は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり;
R4は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり;
nは、2、3または4であり;さらに、
XがC(O)のとき、R1はベンジルではない。
Yは、CN、P(OR2)2またはP(O)(OR2)2であり;
R1 は、それぞれ別異に、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキルまたは−N(R3)R4を表し;
R2は、それぞれ別異に、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アルカリ金属または遷移金属を表し、あるいは、R2が2個ある場合には、全体の電荷が+2であるようなアルカリ土類金属または遷移金属を共に形成し;
R3は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり;
R4は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり;さらに、
nは、2、3または4である。
R1 は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり;
R2 は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、C(O)N(R3)R4、C(S)N(R3)R4、C(S)N(R3)2、C(S)OR4 、CO2R4、C(O)R4または−C(S)R4であり;
R3 は、Hまたはアルキルであり;さらに、
R4 は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルである。
アルゴン雰囲気下、氷槽中で約0℃に冷却した容器内で、約1当量のクロロカルボニルスルフェニルクロリド、約1当量のチオ尿素、および約1当量のトリエチルアミンを混合し、得られた混合物を約6時間混合した後、該混合物をろ過し、濃縮して残渣を得、さらに、ジクロロメタン−ヘキサンから該残渣を再結晶させて化合物を得る。
ホスファイトおよび硫黄転移反応試薬を混合してホスホロチオエートを生成させるが、ここで、該硫黄転移反応試薬は、MoS4・Et3NCH2Ph、
R1 およびR2は、それぞれ別異に、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキルまたは−N(R3)R4を表し、あるいは、R1 およびR2は共に、必要に応じて置換された芳香環を形成し;
R3は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルを表し;
R4は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルを表し;
nは、2、3または4であり;さらに、
XがC(O)のとき、R1はベンジルではなく;
Yは、CN、P(OR2)2またはP(O)(OR2)2であり;
R1 は、それぞれ別異に、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキルまたは−N(R3)R4を表し;
R2は、それぞれ別異に、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アルカリ金属または遷移金属を表し、あるいは、R2が2個ある場合には、全体の電荷が+2であるようなアルカリ土類金属または遷移金属を共に形成し;
R3は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり;
R4は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり;さらに、
nは、2、3または4であり;さらに、
R1 は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり;
R2 は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、−C(O)N(R3)R4、−C(S)N(R3)R4、−C(S)N(R3)2、−C(S)OR4 、−CO2R4、−C(O)R4または−C(S)R4であり;
R3 は、Hまたはアルキルであり;さらに、
R4 は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルである、
より成る群から選択される。
R2は、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキルまたはアルケニルであり;
R3は、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニルまたは−(CR5 )2)p−ヘテロシクロアルキルであり;
R4は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはアラルキルであり;
R5は、Hまたはアルキルであり;さらに、
pは、1、2、3、4、5、6、7または8である。
オリゴヌクレオチド合成における一般的なホスフェート保護基はエチルニトリルである。この保護基の利点のひとつは、塩基を用いて保護されたホスフェートを処理することにより、容易に除去できる点である。転換の全体を以下に図示する:
アクリロニトリル捕捉剤の存在下、エチルシアニド基を有するホスフェート化合物を塩基と混合するが、このとき、該アクリロニトリル捕捉剤は、ポリマー結合チオール、4−n−ヘプチルフェニルメタンチオール、炭素原子数が少なくとも10以上であるアルカンチオール、ヘテロアリールチオール、アルキルチオールのナトリウム塩、
ここで、R1はアルキルであり;R2は、−SHまたは−CH2SHである。
R2は、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニルまたは−(C(R3 )2)p−ヘテロシクロアルキルであり;
R3は、Hまたはアルキルであり;さらに、
pは、1、2、3、4、5、6、7または8である。
ホスホロチオエートヌクレオチドのP=S結合は酸化剤に弱く、P=S結合がP=O結合に転換してしまう。本発明をひとつの側面から見ると、P=S結合の所望しない酸化を防ぐ方法に関する。P=S結合を所望しない酸化から守るためのひとつの方法は、ホスホロチオエート基のP=S結合よりも酸化されやすい化合物をホスホロチオエート含有ヌクレオチドと混合することである。ホスホロチオエート基のP=S結合よりも酸化されやすい化合物の例としては、2−ヒドロキシエタンチオール、EDTA、ビタミンE、無臭チオール類を含むチオール類、およびビタミンCなどが挙げられる。その他の化合物についても、当業者であれば、抗酸化剤に対してホスホロチオエート基のP=S結合の酸化され易さを比較することによって容易に確認できる。抗酸化剤は、ホスホロチオエート基のP=S結合よりも酸化され易くなければならない。
上述したように、ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、治療剤として有望である。ある例においては、ホスフェート結合およびホスホロチオエート結合を併せ持つオリゴヌクレオチドを調製することが有利である。ホスフェート結合およびホスホロチオエート結合を併せ持つオリゴヌクレオチドを調製するためのひとつの方法としては、第一のオリゴヌクレオチドを第二のオリゴヌクレオチドに結合させるが、このとき、第一のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート基を介して連結されたヌクレオシドを有し、第二のオリゴヌクレオチドは、ホスファイト基を介して連結されたヌクレオシドを有する。次に、ホスファイト基を酸化してホスフェート結合にする。別の方法としては、ホスホルアミド法を用い、第一のオリゴヌクレオチドに順にオリゴヌクレオチドを結合させていくことができる。次に、ホスファイト基を介して連結された新規に加えられたヌクレオシドを酸化することにより、ホスファイト結合をホスフェート結合に転換する。ホスファイトをホスフェートに転換する際に最もよく用いられる酸化剤のひとつは、I2/アミンである。I2/アミン反応試薬は非常に強力な酸化剤であり、その結果、ホスホロチオエート基も酸化されてホスフェート基になる。従って、ホスファイトをホスフェートに酸化するが、ホスホロチオエート基は酸化しないような緩和な酸化剤が必要である。ホスファイトをホスフェートに酸化するが、ホスホロチオエート基は酸化しないような酸化剤の例としては、NaClO2、クロロアミンおよびピリジン−N−オキシドの3つが挙げられる。本発明に使用することができるその他の酸化剤としては、CCl4、CCl4/水/アセトニトリル、CCl4/水/ピリジン、ジメチルカルボナート、または、CH2Cl2、NBSもしくはNCS中でのKNO3/TMSCl混合物、あるいは、酸化剤、非プロトン性有機溶媒、塩基および水の組み合わせなどが挙げられる。
ホスファイトを酸化剤と混合してホスフェートを生成させ、ここで、該酸化剤は、NaClO2、クロロアミン、ピリジン−N−オキシド、CCl4、CCl4/水/アセトニトリル、CCl4/水/ピリジン、ジメチルカルボナート、または、CH2Cl2、NBSもしくはNCS中でのKNO3/TMSCl混合物である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ヌクレオシドはリボヌクレオシドである。
R2は、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキルまたはアルケニルであり;
R3は、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニルまたは−(C(R5)2)pシクロアルキルであり;
R4は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはアラルキルであり;
R5は、Hまたはアルキルであり;さらに、
pは、1、2、3、4、5、6、7または8である。
RNAは、次のような方法に基づいて合成および精製される場合が多い:テトラゾールを用いてRNAアミダイトを活性化し、NH4OHを用いて環外のアミノ保護基を除去し、n−テトラブチルアンモニウムフルオリド(TBAF)を用いて2'−OHアルキルシリル保護基を除去し、さらに、脱保護したRNAをゲル精製して分析する。RNA化合物は、化学的方法または酵素的方法を用いて合成することができる。
本発明において使用するポリアミン化合物は、少なくとも2個のアミン官能基を有するポリマーであり、ここで、該アミン官能基は、少なくとも1個の水素原子を有する。ポリマーの分子量範囲は広い。ある実施態様においては、ポリマー化合物の分子量は約5000g/mol以上である。別の実施態様においては、ポリマーの分子量は、約10,000g/mol以上、約20,000g/mol以上または約30,000g/mol以上である。
本発明において使用するPEG-NH2化合物は、アミン官能基を有するポリエチレングリコールポリマーであり、ここで、該アミン官能基は、少なくとも1個の水素原子を有する。ポリマーの分子量範囲は広い。ある実施態様においては、PEG-NH2化合物の分子量は約5000g/mol以上である。別の実施態様においては、PEG-NH2化合物の分子量は、約10,000g/mol以上、約20,000g/mol以上または約30,000g/mol以上である。
本発明において使用する短鎖PEG-NH2化合物は、アミン官能基を有するポリエチレングリコールポリマーであり、ここで、該アミン官能基は、少なくとも1個の水素原子を有する。ポリマーの分子量範囲は、比較的小さい。
本発明において使用するシクロアルキルアミン類は、少なくとも1個のアミン官能基を有するシクロアルキル化合物であり、該アミン官能基は、少なくとも1個の水素原子を有する。本発明において使用するヒドロキシシクロアルキルアミン類は、少なくとも1個のアミン官能基および少なくとも1個の水酸基を有し、ここで、該アミン官能基は、少なくとも1個の水素原子を有する。代表的な例としては、以下の化合物などが挙げられる。
本発明において使用するヒドロキシアミン類は、少なくとも1個のアミン官能基および少なくとも1個の水酸基を有するアルキル、アリールおよびアラルキル化合物であり、ここで、該アミン官能基は、少なくとも1個の水素原子を有する。代表的な例としては、9−アミノノナノール、4−アミノフェノールおよび4−ヒドロキシベンジルアミンなどが挙げられる。
アミド保護基を有するオリゴヌクレオチドに、ポリアミン、PEHA、PEG-NH2 、短鎖PEG-NH2 、シクロアルキルアミン、ヒドロキシシクロアルキルアミン、ヒドロキシアミン、K2CO3/MeOHマイクロ波、チオアルキルアミン、チオール化アミン、β−アミノ−エチル−スルホン酸またはβ−アミノ−エチル−スルホン酸の硫酸ナトリウム塩を混合する。
既に記載しているように、保護基の使用は、オリゴヌクレオチド合成の重要な要素である。さらに、保護基の導入および除去は高収率で進行し、最終生成物中への不純物の混入を最小限に留めねばならない。発明者らは、オリゴヌクレオチドの合成中のシリル保護基の除去に対しては、次のような反応試薬が優れていることを見出した:ピリジン−HF、DMAP−HF、尿素−HF、アンモニア−HF、フッ化アンモニウム−HF、TAS−F、DASTおよびポリビニルピリジン−HFなど。例えば、図7および実施例5を参照。本発明において有用なその他のアリールアミン−HF反応試薬としては、下記の構造式AAで表される化合物などが挙げられ:
R2は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり;
R3は、アリール、またはヘテロアリールである。
さらに、上述の方法は、以下の化合物より成る群から選択される化合物のフッ化水素塩を用いて実施することができ:
シリル保護基を有するオリゴヌクレオチドに、ピリジン−HF、DMAP−HF、尿素−HF、TAS−F、DASTおよびポリビニルピリジン−HFまたは次の構造式AAで表されるアリールアミン−HF反応試薬を混合する:
R2は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり;さらに、
R3は、アリール、またはヘテロアリールである。
固相オリゴヌクレオチド合成は、制御多孔質ガラス上で行われる場合が多い、しかしながら、固相オリゴヌクレオチド合成は次のようなものの上で行うことができる:
1)フラクトシル(Fractosil)
2)CPGではないが、シリカを基本とする固体支持体(制御多孔質ガラス以外)
3)ポリスチレンビーズ上のユニバーサルリンカー
4)アルゴゲル(Argogel)
5)アルゴポア(Argopore)
6)AMポリスチレン
7)ノヴァゲル(Novagel)
8)PEGA;EM Merck poly(vinyl alcohol)(PVA);および日東電工(Nitto Denko)ポリスチレン
など。
一般的に、オリゴヌクレオチドは、連結基(linking group)を介して固体支持体に結合している。適切な連結基としては、オキザキルリンカー、スクシニルリンカー、ジカルボン酸リンカー、グリコリルリンカーまたはチオグリコリルリンカーなどが挙げられる。シリルリンカーも使用できる。例えば、ディブラシ(DiBlasi),C.M.、マックス(Macks),D.E.、タン(Tan),D.S.「固相有機合成用の酸安定性tert−ブチルジアリールシリル(TBDAS)リンカー(An Acid-Stable tert−Butyldiarylsilyl(TBDAS) Linker for Solid-Phase Organic Synthesis)」、Org.Lett.,2005;ASAPウェブ掲載日2005年5月30日、(Letter) DOI:10.1021/o1050370yなどを参照。ディブラシ(DiBlasi)らは、固相有機合成用の頑強なtert−ブチルジアリールシリル基(TBDAS)リンカーについて記載している。重要な点は、TBDASリンカーが、CH3CN中の水性HFに対して安定なことであり、このことにより、固相合成法において、HFに不安定な矩形の保護基を使用することができる。ひとつの方法として、リンカーの解裂は、トリス(ジメチルアミノ)スルホニウムジフルオロトリメチルシリケート(TAS-F)を用いて達成できることが確立された。
環境により優しい溶媒中で反応を行うことの重要性が高まっていることに呼応して、発明者らは、非ハロゲン性溶媒を用いてオリゴヌクレオチドを調製できることを見出した。例えば、オリゴヌクレオチドは、トルエン、テトラヒドロフラン、または1,4−ジオキサンを溶媒として調製できる。
H−ホスホナートカップリングを用いたRNA合成法は、活性化剤の存在下、H−ホスホナート置換ヌクレオシドに、第二のヌクレオシドの水酸基を反応させる過程を含む。最も一般的に使用される活性化剤のひとつは、塩化ピバロイルである。しかしながら、塩化ピバロイルは、可燃性、腐食性、揮発性(沸点は105〜106℃)であり、引火点が比較的低い(引火点は8℃)ことから、大量合成には不向きである。故に、上述の欠点を排した新規な活性化剤が希求されている。
H−ホスホナート、アルコールおよび活性化剤を混合してホスホジエステル化合物を調製するが、このとき、該活性化剤は、C8-C20アルキルカルボニルクロリド、塩化アリールカルボニルおよび塩化アラルキルカルボニルより成る群から選択される。
R2は、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、または−(C(R6)2)pヘテロシクロアルキルであり;R6は、Hまたはアルキルであり;さらに、pは、1、2、3、4、5、6、7または8である。
RNA調製において遭遇するひとつの共通した問題点は、高純度で所望するオリゴヌクレオチドを得ることである。多くの場合、オリゴヌクレオチドの調製に使用される反応では、100%の転換が達成されないか、または副生成物が生成する。不幸なことに、未反応の出発材料および副生成物は同様な化学的特性を有している場合が多く、これらの不純物からの所望する生成物の分離を非常に困難にしている。
第一のオリゴヌクレオチドを第二のオリゴヌクレオチドにアニールさせて二本鎖オリゴヌクレオチドを形成させ、該二本鎖オリゴヌクレオチドをクロマトグラフィー精製する。
上述したように、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、RNA化合物の精製に使用される重要な方法である。オリゴヌクレオチドの精製に関しては、非常に多様なカラム、溶媒、添加剤および条件が報告されている。しかしながら、RNA化合物を精製するために現在行われている方法は、大量の不純物からRNA化合物を分離しきれていない。本明細書では、現行のHPLC法を改良し、不純物の混入が実質的に減少しているRNA化合物を提供する:
1)オリゴヌクレオチドの分析的HPLC分離において、イオン対化剤としてテトラブチルアンモニウムアセタートを使用する。分析的HPLC分離におけるテトラブチルアンモニウムアセタートの使用については、M.ギラー(Gilar)、Analytical Biochemistry,298:196-206(2001))を参照。
2)RNA化合物の親油性コンジュゲート用には、C-18またはC-4カラムを用い、DMTが結合していない状態でHPLC精製を行う。 ◎
3)溶媒としてエタノールまたはアセトニトリルを使用してRNA化合物をHPLC精製する。
上述したように、RNA合成において保護基は有用な役割を果たす。本明細書においては、RNA合成において使用できる数種の新規な保護基を記載している。RNA合成に使用できる2'−保護基のひとつのグループはカルボナート類である。ひとつの好ましいカルボナートは、以下に示すプロパルギルカルボナートである:
ジメトキシトリチル(DMT)の代わりに、モノメトキシトリチル(MMT)、9−フェニルキサンテン−9−イル(Pixyl)および9−(p−メトキシフェニル)キサンテン−9−イル(Mox)およびそれらのアナログを使用することができる。
1)NpsおよびDNPS基(フクヤマ(Fukutyama))
2)フェナセチル(ペニシリンGアシラーゼを用いて除去)
本発明を別の側面から見ると、酵素を用いて除去できる保護基に関する。−O2CCH2Rで表されるアラルキルエステル類(ここで、Rは、フェニル、ピリジニル、アニリン、キノリンまたはイソキノリンである)は、ペニシリンGアシラーゼを用いて酵素解裂を行うことにより、ヌクレオシドの2'位から除去できる。リボースの2'位にアラルキルエステル保護基を有するヌクレオシドの代表例は、図45に示している。さらに、図45に示しているものを含むある種の内部アミダイトも酵素解裂によって除去できる。
C2位に保護基を有する必要に応じて置換されたリボースに酵素を混合し、C2位に水酸基を有する必要に応じて置換されたリボースを生成する。
ある実施態様においては、隣接する2個のチミジンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを合成することが好ましい。より好ましい実施態様においては、チミジンヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの3'末端に位置している。チミジン−チミジン(TT)ヌクレオチドユニットは、液相化学を用いて調製することができ、次に、TTユニットを固体支持体に結合させる。ある実施態様においては、TTユニットは、ホスホロチオエート基を介して連結されている。ある実施態様においては、ホスホロチオエートTTユニットの別異の立体異性体を分離した後に、TTユニットを固体支持体に結合させる。オリゴヌクレオチド鎖の残りの部分は、TT−支持体結合ユニットをプライマーとして用い、標準的な固相合成法によって合成することができる。ある実施態様においては、チミジン−チミジンヌクレオチドユニットは、デオキシチミジン残基から調製される。
液相化学を経てジヌクレオシド基を合成し、該ヌクレオシド基を固体支持体に結合させてプライマーを形成し、固相合成法を用いて該プライマーにさらにヌクレオチドを付加する。
重要なことは、上述の改良点の任意のひとつは、単独で標準的なヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド合成法と組み合わせることができること、あるいは、上述の改良点は、そのひとつ以上を、標準的なヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド合成法と組み合わせることができることである。さらに、当業者であれば、上述の各改良点に最適な条件を即座に判断することができる。
上述したように、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成および精製に用いる方法および反応試薬に関する。以下の記載は、オリゴヌクレオチドの主要な型および構造的特徴のうちのいくつかを簡潔に記すものである。重要なことは、以下の項は、代表例を述べただけであり、本発明の範ちゅうを制限することを意味するものではない。
q1は、1〜10までの整数であり;
q2は、1〜10までの整数であり;
q3は、0または1であり;
q4は、0、1または2であり;
各Z1、Z2およびZ3は、それぞれ別に、C4〜C7シクロアルキル、C5〜C14アリールまたはC3〜C15複素環であり、このとき、該複素環基内のヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄から選択され;
Z4は、OM1、SM1またはN(M1)2であり;各M1は、それぞれ別異に、H、C1〜C8アルキル、C1〜C8ハロアルキル、C(=NH)N(H)M2、C(=O)N(H)M2またはOC(=O)N(H)M2であり;M2は、HまたはC1〜C8アルキルであり;さらに、
Z5は、C1〜C10アルキル、C1〜C10ハロアルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル、C6〜C14アリール、N(Q3)(Q4)、OQ3、ハロ、SQ3またはCNである。
オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部位、ヘキソース、シクロヘキセニルなどの糖ミメチックも有する。そのような修飾糖構造の調製について開示している米国特許の代表例としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない:第4,981,957号、第5,118,800号、第5,319,080号、第5,359,044号、第5,393,878号、第5,446,137号、第5,466,786号、第5,514,785号、第5,519,134号、第5,567,811号、第5,576,427号、第5,591,722号、第5,597,909号、第5,610,300号、第5,627,0531号、第5,639,873号、第5,646,265号、第5,658,873号、第5,670,633号、第5,700,920号および第5,859,221号など。これらの全てを参照として本明細書中に取り入れておく。
(1)ヌクレオシドの大多数または全てが修飾されているにもかかわらず、適切な三次元外郭構造内で塩基(または修飾塩基)を呈することができるアンチセンス鎖を有するが、これは、正しい塩基対を形成し、さらに、相同な標的RNAと二本鎖構造を形成するためであり、標的RNAの解裂などによって標的を抑制制御するのに十分である;
(2)ヌクレオシドの大多数または全てが修飾されているにもかかわらず、「RNA様」特性を保持している、すなわち、リボヌクレオチドに基づく内容物からなるRNA分子の全体的な構造的、化学的および物理的特徴を、限定的ではないが、あるいは、部分的ではあるが有する。例えば、siRNA剤は、ヌクレオチド糖の全てが、2'−ヒドロキシルの代わりに2'−フルオロなどを有するセンスおよび/またはアンチセンス鎖などを含む場合がある。このデオキシリボヌクレオチド含有剤は、RNA様特性を呈することが期待される。理論的裏付けがあるわけではないが、電気的に陰性であるフッ素は、リボースの2'位に結合した場合には、アキシアル方向を好む。フッ素のこのような空間的傾向は、次に、糖をC3'−エンドパッカーに結合させる。これは、RNA分子内で観察されるものと同様のパッカー様式であり、RNA特徴的なAファミリー型へリックスが生じる。さらに、フッ素は、良好な水素結合アクセプターであることから、RNA構造を安定化させることが知られている水分子と同様な水素結合相互作用に関与することができる。一般的に、糖の2'位における修飾部位は、デオキシリボヌクレオチドのH部位の特徴よりもリボヌクレオチドのOH部位のそれに近いH結合に入っていくことができる。好ましいsiRNA剤は、糖の全て、または、少なくとも50、75、80、85、90または95%おいてC3'−エンドパッカーを呈する;RNA特徴的なAファミリー型へリックスを呈するのに十分量のC3'−エンドパッカーを糖内に呈する;C3'−エンドパッカー構造ではない糖は、20、10、5、4、3、2または1個以下である。
便宜を図るため、請求項、明細書および実施例において使用されている用語をこの項にまとめている。
ある実施態様においては、活性化塩を形成させることにより、アクチベーターの強度が増し、RNA合成のカップリング時間が減少する。
ジヌクレオチド2およびヘキサマー3は、メーカーが作成した標準的な93段階サイクルに、以下のように待ち段階に変形を加え、394ABI装置上で合成した。アクチベーターとしては5−(エチルチオ)−1H−テトラゾール(0.25M)を用い、PS−酸化には1の無水アセトニトリル溶液(0.05M)を用いた。硫化時間は約4分であった。合成完結後、55℃において水性アンモニアで1時間処理することにより、支持体から2および3を脱保護した。HPLC精製後、化合物をLC-MSで分析した。
A.P=O骨格を有する配列23およびP=S骨格を有する配列24の固相合成
ÅKTA OligoPilot 100を使用し、500ÅのdT-CPGを用いた6.3mlのカラムで200μmolスケールの合成を行った(担体1gあたり97μmol)(プライム・シンセシス(Prime Synthesis)社、ペンシルバニア州アストン)。脱トリチル化は、ジクロロメタン(CH2Cl2)中、3%のジクロロ酢酸(DCA)を用いて行った。カップリングは、アセトニトリル(MeCN)中、それぞれ0.2Mに調整したDNA3'−β−シアノエチルホスホルアミダイト(CEP)(2当量)またはRNA3'−β−シアノエチルホスホルアミダイト(2.5当量)(ピアス核酸(Pierce Nucleic Acids)社、ウィスコンシン州ミルウォーキー)を用いて行った。アクチベーターは、MeCN中で0.6Mに調整した5−エチルチオテトラゾール(アメリカン・インターナショナル・ケミカル(American International Chemical)社、マサチューセッツ州ナティック)であり、RNA CEPに対しては3倍過量、DNA CEPに対しては4.5倍過量で使用した。酸化は、90%のピリジン+10%の水中、50mMのI2を介して、または、MeCN中で0.05Mの3−エトキシ−1,2,4−ジチアゾリジン−5−オン(EDITH)を用いて行った(Q.ク(Xu)ら、Nucleic Acids Research,24(18):3643-3644)。キャッピングは、MeCN中、10%の無水酢酸(Ac2O)+10%の1−メチルイミダゾール(1−MeIm)+15%の2,6−ルチジンを用いて行った。
ÅKTA OligoPilot 100を使用し、500ÅのdT-CPGを用いた6.3mlのカラムで200μmolスケールの合成を行った(担体1gあたり97μmol) (プライム・シンセシス(Prime Synthesis)社、ペンシルバニア州アストン)。脱トリチル化は、ジクロロメタン(CH2Cl2)中、3%のジクロロ酢酸(DCA)を用いて行った。カップリングは、アセトニトリル(MeCN)中でそれぞれ0.2Mに調整したDNA CEP(2当量)またはRNACEP(2.5当量)(ピアス核酸(Pierce Nucleic Acids)社、ウィスコンシン州ミルウォーキー)を用いて行った。アクチベーターは、MeCN中、0.6Mの5−エチルチオテトラゾール(アメリカン・インターナショナル・ケミカル(American International Chemical)社、マサチューセッツ州ナティック)であり、RNA CEPに対しては3倍過量、DNA CEPに対しては4.5倍過量で使用した。酸化は、90%のピリジン+10%の水中、50mMのI2を介して行った。チオール化は、3−ピコリン:MeCN(1:1)中で0.2Mのフェニルアセチルジスルフィド(PADS)を用いて、または、MeCN中で0.05Mの3−エトキシ−1,2,4−ジチアゾリジン−5−オン(EDITH)を用いることにより行った(Q.ク(Xu)ら、Nucleic Acids Research,24(18):3643-3644)。キャッピングは、MeCN中、10%の無水酢酸(Ac2O)+10%の1−メチルイミダゾール(1−MeIm)+15%の2,6−ルチジンを用いて行った。EDITHを用いる場合には、キャッピングは、チオール化反応の前後のいずれでも行うことができた(M.マ(Ma)ら、Nucleic Acids Research,25(18):3590-3593(1997))。
概論
多様な脱保護法に対して、以下のオリゴヌクレオチド配列を使用した:
PyHFおよびDBU(容量比約1:4)をDMSO(PyHFの4〜5倍量)に溶解して混合し、65℃で15分加熱した。これが2段階反応の条件である。
1.5μlのDMSOの混合物を用い、65℃で脱シリル化したところ、15分後の収率は52/52%、30分後の収率は52/51%、1時間後の収率は52/52%、1.5時間後の収率は53/55%、および2.5時間後の収率は52/55%であった。
シリル脱保護反応試薬:エタノール性アンモニア1容量につき、脱シリル化混合物(1mlのPyHF、3.5mlのDBU、4mlのDMSO)4容量を用い、60℃で20分間加熱した。
シリル脱保護反応試薬:ポリ[4−ビニルピリジニウムポリ(ヒドロジェンフルオリド)](PVPHF)1mgあたり、5μlのDMSO+2.5μlのDBUを用い、65℃で20分間加熱した。
PVPHFを用いた一段階脱保護:エタノール性アンモニア10μlに約30〜40μlのDMSOおよび約3mgのPVPHFを加えた。脱保護の所要時間は1.5時間以内である。
PVPHFを用いた一段階脱保護:エタノール性アンモニア10μlに約30〜40μlのDMSO、5μlのDBUおよび約4.5mgのPVPHFを加えた。脱保護の所要時間は40分以内である。
約1μmolのメチルアミンで脱保護し、乾燥させた27は、0.2mlのDMF中に0.16gのTAS-Fを加えた溶液を用いて55℃で2時間処理した。反応は完結せず、溶液の一部がゲル状になり、反応混合物は均一ではなかった。この反応混合物に20μlの水を加えた。55℃で一晩放置すると、反応混合物は透明になった。HPLC精製を行ったところ、この反応の収率は51/55%であった。本反応の再現性はよくなかった。80mgのTAS-Fおよび0.2mlのピリジンを用い、約0.6μmolの27を65℃で処理した。2時間後の収率はわずかに22/21%であった。80mgのTAS-Fおよび0.2mlのN−メチルピロリジノンを用い、約0.6μmolの27を65℃で処理した。反応過程において沈殿が生成し、2時間後の収率は34/37%であった。27mgのTAS-F、0.15mlのN−メチルピロリジノンおよび0.5mlのDMSOを用い、約0.4μmolの27を65℃で2時間処理した。収率は35/24%であった。27mgのTAS-F、0.15mlのN−メチルピロリジノンおよび0.05mlのDMSOを用い、約0.4μmolの27を65℃で2時間処理した。収率は25/25%であった。27mgのTAS-F、0.15mlのN−メチルピロリジノンおよび0.05mlのピリジンを用い、約0.4μmolの27を65℃で2時間処理した。収率は22/22%であった。エタノール性アンモニアで脱保護し、乾燥させた27の約1μmolのサンプルについて、75mgのTAS-Fおよび0.2mlのDMSOを用いて65℃で処理した。2時間後の収率は39/41%であった。同じサンプル約1μmolについて、75mgのTAS-Fおよび0.2mlのDMFを用い、65℃で処理した。反応の進行中に沈殿が生成し、2時間後の収率は21/21%であった。アンモニアで脱保護し、乾燥させた27の約1μmolについて、75mgのTAS-Fおよび0.2mlのDMSOを用い、65℃で処理した。2時間後の収率は31/30%であった。同じサンプル約1μmolについて、75mgのTAS-Fおよび0.2mlのDMFを用い、65℃で処理した。沈殿が生成し、2時間後の収率は21/24%であった。
MeNH2で脱保護し(65℃、20分)、乾燥させた28の約40ODのサンプルについて、41mgのTAS-Fおよび90μlのDMFを用い、65℃で処理した。注入は30分後、1時間後、2時間後に終了し、その後、室温で一晩放置した。めぼしい量の反応生成物は得られなかった。別の約40ODのサンプルについて、41mgのTAS-F、90μlのDMFおよび40μlの水を用い、65℃で処理した。注入は30分後、1時間後、2時間後に終了し、その後、室温で一晩放置した。HPLCにおいては、生成物に相当する主要ピークは検出されなかった。エタノール性アンモニアで脱保護した(65℃、40分)28の約40ODのサンプルについて、同様の脱保護条件を適用したが、結果は同様であった(主要ピークは検出されず)。
A.脱保護1(標準法)
オリゴヌクレオチドは、塩基およびホスフェート基の脱保護と同様に、2.0mlのアンモニア混合物および8Mのエタノール性メチルアミン(1:1)を用い、65℃、30分かけて支持体から解裂させた。反応管を氷上で短時間冷却し、エタノール性アンモニア混合物を新しい微量遠心管に移した。CPGは、脱イオン水(2×0.1ml)で洗浄し、ドライアイス上に10分間置いた後、真空乾燥機(speed vac.)内で乾燥させた。
条件A:TBAFの場合、マイクロ波照射後、反応を水で停止し、次に脱塩した。
発明者らは、一本鎖RNA組成物中の不純物は、一本鎖RNAの混合物をアニールして二本鎖RNAを形成させたものについて、HPLC精製を行うことによって容易に除去できるという驚くべき事実を発見した。
図9に、精製法の全体的な流れを図示している。AL-DP-4014の精製に対して使用した特別な方法については、図11および12に示している。
Luna C-18カラム、150×2.0mm、温度=25℃、流速=0.2ml/分
緩衝液A:35mm TEAA (pH7)、100mmHFIP
緩衝液B:MeOH
濃度勾配:50分でBを25から35%に、さらに、55分時にBが85%になるように上昇させ、再平衡化
イオン交換HPLC
Dnapac PA-100イオン交換カラム、250×4mm、温度=65℃、流速=1ml/分
緩衝液A:50mMのNaClO4、25mMのTris(pH9.0)、1mMのEDTA、20%のCAN
緩衝液B:400mMのNaClO4、25mMのTris(pH9.0)、1mMのEDTA、20%のCAN
濃度勾配:2.00分間Bは0%、17分時にBが40%になるように上昇させ、○分時にBが65%になるように上昇させ、さらに、32.5分時にBが100%になるように上昇させた後、再平衡化
キャピラリーゲル電気泳動
DNA 100R Gel、温度=40℃
12KVで分離し、極を逆にする
LC-MS分析
Chromolith speedrod 50×4mm、温度=25℃、流速=0.8ml/分
緩衝液A:20%のMeOH、10mMのTBAA、pH7.0
緩衝液B:80%のMeOH、10mMのTBAA、pH7.0
濃度勾配:19.5分間にBを40%から80%に、23分時にBを100%まで上昇させた後、再平衡化
負イオンモードで500〜3000まで質量をスキャンする。
AL-DP-4014の精製に用いた特別な方法については、図11および12に示している。図14〜18に示しているクロマトグラフデータから、AL-DP-4014用精製法により、実質的に純粋型が得られたことが示されている。精製法は、AL-DP-4127、AL-DP-4139およびAL-DP-4140について上に記載されているものと同様に行った。分析機器から得られた結果は図19〜39に示している。
固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドは、トリエチルアミン(またはpKa=9〜12のアミン)、有機溶媒(例えば、アセトニトリル、THFなど)、ならびにチオールもしくは無臭チオールの混合物を過量に用いて処理した。アルキルアミンはアクリロニトリルを生成し、これはチオールによって捕獲される。この点は、キャパルディ(Capaldi)らによって記載された方法(Org. Process Res.Dev.7:832-838(2003))よりも優れている。
段階1.オリゴヌクレオチド合成
ヌクレオチドは全て、AKTAoligopilot合成装置で合成した。合成には、市販の制御多孔質ガラス固体支持体(プライム・シンセシス(Prime Synthesis)社のdT-CPG、rC-CPG、rU-CPG)または自家製固体支持体(2004年8月10日に受理された米国特許仮出願60/600,703号、および2004年4月16日に受理されたPCT/US04/11829号に記載されているフタルイミド−ヒドロキシ−プロリノール−CPG、ヒドロキシプロリノール−コレステロール−CPG)を用いた。標準的な保護基が付いたRNAホスホルアミダイトおよび2'−O−修飾RNAホスホルアミダイト(5'−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2'−t−ブチルジメチルシリル−アデノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−シチジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−グアノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−ウリジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−O−メチル−アデノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2'−O−メチル−シチジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2シアノエチル−ホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチル−2'−O−メチル−グアノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチル−ホスホルアミダイト、および5'−O−ジメトキシトリチル−2'−O−メチル−ウリジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチル−ホスホルアミダイト)は、ピアス核酸テクノロジーズ(Pierce Nucleic Acids Technologies)社およびケムジーンズ・リサーチ(ChemGenes Reseach)社から購入した。2'−F−ホスホルアミダイト(5'−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2'−フルオロ−シチジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイトおいよび5'−O−ジメトキシトリチル−2'−フルオロ−ウリジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチル−ホスホルアミダイト)は、プロメガ(Promega)社から購入した。ホスホルアミダイトは、グアノシンおよび2'−O−メチル−ウリジンを除き、全て、CH3CN中、0.2Mで使用した(グアノシンおよび2'−O−メチル−ウリジンは、10%のTHF/CH3CN(v/v)中、0.2Mの濃度で使用した)。全てのホスホルアミダイトカップリングに対して、カップリング/リサイクル時間は16分に設定した。アクチベーターとしては5−エチル−チオ−テトラゾール(0.75M、アメリカン・インターナショナル・ケミカルズ(Amerian International Chemicals)社)を用いた。PO酸化用には、水/ピリジン(10:90、v/v)中、50mMのヨウ素を使用し、PS酸化用には、2,6−ルチジン/CH3CN(1:1、v/v)中、2%のPADS(GLシンセシス(GL Synthesis)社)を用いた。コレステロールおよびアミノリンカーホスホルアミダイトは自ら合成し、コレステロールについては、ジクロロメタン中0.1M、アミノリンカーについては、CH3CN中0.2Mの濃度で使用した。コレステロールおよびアミノリンカーホスホルアミダイトに対するカップリング/リサイクル時間はいずれも16分で行った。
(a)2'−フルオロ修飾を伴わないRNAの脱保護:合成完了後、支持体を100mlのガラス瓶(VWR)に移した。オリゴヌクレオチドは、40%のメチルアミン(アルドリッヒ(Aldrich)社)水溶液(40ml)を用い、45℃、90分かけて、塩基およびホスフェート基を同時に脱保護することにより、支持体から解裂させた。瓶は氷上で短時間冷却し、メチルアミンは新しい500mlの瓶にろ過して入れた。CPGは、40mlのDMSOを用いて3回洗浄した。混合物をドライアイス上で冷却した。
全てのサンプルについて、10μlのアリコートを990μlの脱イオン化ヌクレアーゼ不含水(1.0ml)で希釈し、260nmにおける吸光度を読み取った。
(a)コンジュゲートしていないオリゴヌクレオチド:コンジュゲートしていない粗オリゴヌクレオチドは、まず、HPLC(Dionex PA 100)で分析した。緩衝液としては、20mMのホスフェート(pH11)(緩衝液A)および20mMのホスフェート+1.8MのNaBr(pH11)(緩衝液B)を用いた。流速は1.0ml/分、モニター波長は260〜280nmとした。各サンプルの注入量は5〜15μlであった。
精製したオリゴヌクレオチドは、Sephadex G-25カラムを用い、AKTA Explorer system(アマシャム・バイオサイエンシーズ(Amersham Biosciences)社)で脱塩した。はじめに、水を流速25ml/分で20〜30分流すことによってカラムを洗浄した。次に、サンプルを25mlずつに分けてカラムに入れた。溶出した塩不含フラクションを合わせて乾燥させ、50mlのRNA不含水で再構成した。
脱塩した各オリゴヌクレオチドの約0.3ODのサンプルは、300μlの水で希釈し、CGE、イオン交換HPLCおよびLC/MSを用いて分析した:
段階1:オリゴヌクレオチド合成
ヌクレオチドは全て、AKTAoligopilot 合成装置で合成した。合成には、市販の制御多孔質ガラス固体支持体(dT-CPG、U-CPG 500)またはヒドロキシ−プロリノール−コレステロール固体支持体(2004年8月10日に受理された米国特許仮出願60/600,703号、および2004年4月16日に受理されたPCT/US04/11829号に記載)を用いた。オリゴヌクレオチド合成用には、標準的な保護基が付いたRNAホスホルアミダイト(5'−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2'−t−ブチルジメチルシリル−アデノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−シチジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−グアノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−ウリジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイトおよび5'−O−ジメトキシトリチル−チミジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト)を用いた。グアノシンおよび2'−OMeウリジンを除く全てのホスホルアミダイトは、アセトニトリル中、0.2Mの濃度で用い、グアノシンおよび2'−OMeウリジンについては、10%のTHF/アセトニトリル(v/v)中、0.2Mの濃度で用いた。カップリング/リサイクル時間は、12mlの合成カラム中、流速500cm/時間で14分に設定した。アクチベーターとしては5−エチル−チオ−テトラゾール(0.75M)を用いた。PO酸化用には、10%の水を加えたピリジン中、0.5Mのヨウ素を使用し、PS酸化用には、CH3CN/2,6−ルチジンの1:1混合物中、0.2MのPADSを用いた。キャッピング混合物Aは、20%のN−メチルイミダゾール+80%のCH3CNであり、キャッピング混合物Bは、25%の無水酢酸+30%の2,6−ルチジン+45%のCH3CNあった。
)オリゴヌクレオチドから塩基およびホスフェート保護基を同時に除去することによって支持体からオリゴヌクレオチドを解裂させ、2)2'−O−TBDMS基を脱保護した。
(a)イオン交換HPLC精製:イオン交換精製に使用した緩衝液は、20mMのリン酸ナトリウムおよび10%のCH3CN(pH8.5)(緩衝液A)、ならびに20mMのリン酸ナトリウム、1MのNaBrおよび10%のCH3CN(pH8.5)(緩衝液B)であった。粗オリゴヌクレオチドの量が10,000OD以下の場合には、TSK-Gel super Q-5PW樹脂を充填したウォーターズ(Waters)社の2cmのカラムを使用した。流速は10ml/分、濃度勾配は、30分以上かけて緩衝液Bを0から20%にし、次に、200分以上かけて緩衝液Bを20から50%にした。
精製したオリゴヌクレオチドは、分子ふるい樹脂であるSephadex G-25を充填したウォーターズ(Waters)社の5cmのカラムを用いて脱塩した。流速は25ml/分で行った。溶出した塩不含フラクションを合わせて乾燥させ、RNase不含水で再構成した。
約0.15ODのオリゴヌクレオチドを水で希釈して150μlにした。生成物の質量および純度(以下に示す)は、LC/MS分析および陰イオン交換HPLCまたはCGEで測定した:
段階1:オリゴヌクレオチドの合成
合成、精製および脱塩は、実施例9の段階1の記載と同様に行った。
合成完了後、0.5Mのピペリジン(CH3CN中)(約30ml)を流速5〜10ml/分でカラムに通し、ホスフェート結合からシアノエチル保護基を除去したが、このとき、RNAは支持体に結合したままであった。次に、以下の解裂および脱保護の2つの段階を行うために脱保護の2つの方法を評価した:段階1)支持体からのオリゴヌクレオチドの解裂は、オリゴヌクレオチドからの塩基保護基の除去と同時に行い;段階2)2'−O−TBDMS基の脱保護を行った。
段階1:オリゴヌクレオチドの合成
合成、精製および脱塩は、実施例10の段階1の記載と同様に行った。オリゴヌクレオチドAL-SQ-5548(5'−AAAGUGCACAACAUUAUACdTdT−3'、ここで、3'末端の2個のヌクレオチド(これらはデオキシチミジン)を除く全ての残基はリボヌクレオチドであった)およびAL-SQ-5549(5'−GUAUAAUGUGCACUUUdTdT−3')の合成は、400μmolスケールで行った。AL-SQ-5548の計算によって求めた質量は6645.03であり、測定された質量は6644.94であった。AL-SQ-5549の計算によって求めた質量は6609.88であり、測定された質量は6609.70であった。
脱保護は94μmolスケールで行った。100mlのSchott瓶に乾燥CPG(1.5g)を入れた。瓶にメチルアミン(40%水溶液、25ml)を加え、混合物を45℃の振とうオーブンに1.5時間入れた。混合物を冷却、ろ過し、ろ液を250mlのSchott瓶に入れた。CPGは、ろうと上、25mlのDMSOを用いて3回洗浄した。合わせたろ液をドライアイス中で10分間冷却した。HFのピリジン溶液(アルドリッヒ(Aldrich)社、20ml)を瓶に加えた。混合物をよく振とうし、40℃の振とうオーブンに1時間入れた。混合物を室温まで冷却し、50mMの酢酸ナトリウム(150ml)を加えて反応を停止した。最終溶液は4℃で保存した。
粗収率を計算することを目的として、以下の方法を用いた。粗オリゴヌクレオチド溶液中に存在するピリジンは254nmで吸収を起こすことから、吸収は280nmで測定した。少量の粗支持体は、HFのピリジン溶液の代わりにTEA3HFを用いて脱保護した。このサンプルの吸収は、254nmおよび280nmで測定した。このサンプルのA254のA280に対する比に基づき、ピリジンを含むサンプルの254nmにおける吸収を求めた。
段階1:オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは、AKTA oligopilot合成装置を用いて合成した。市販の制御多孔質ガラス固体支持体(プライム・シンセシス(Prime Synthesis)社)を使用した。標準的な保護基が付いたRNAホスホルアミダイトおよび2'−O−メチル修飾RNAホスホルアミダイト(5'−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2'−t−ブチルジメチルシリル−アデノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−シチジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−グアノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−ウリジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−O−メチル−アデノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2'−O−メチル−シチジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチル−ホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチル−2'−O−メチル−グアノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−シアノエチルホスホルアミダイトおよび5'−O−ジメトキシトリチル−2'−O−メチル−ウリジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト)は、ピアス核酸テクノロジーズ(Pierce Nucleic Acids Technologies)社およびケムジーンズ・リサーチ(ChemGenes Research)社から購入した。2'−F−ホスホルアミダイト(5'−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2'−フルオロ−シチジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−2'−フルオロ−ウリジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト)は、プロメガ(Promega)社から購入した。
250mlのSchott瓶中で、CPGを180mlのメチルアミン水溶液(アルドリッヒ(Aldrich)社)と混合した。混合物を45℃の振とうオーブンに75分間入れた。混合物を冷却し、ろ液を1LのSchott瓶に入れ、CPGを160mlのDMSOで3回洗浄した。ろ液を合わせ、ドライアイス中で10分間冷却した。混合物にTEA3HF(アルファ・イーサー(Alfa Aesar)社、270ml)を加えた。瓶を40℃の振とうオーブンに65分間入れた。混合物を室温まで冷却し、50mMの酢酸ナトリウム(1L)を加えて反応を停止した。
オリゴヌクレオチドは、TSK-Gel super Q-5PW(20)樹脂を充填した5cm×17〜18cmのカラムを用いた逆相HPLCによって精製した。温度は55〜65℃に維持した。緩衝液は、20mM のリン酸ナトリウムおよび10%のACN(v/v)(pH8.5)(緩衝液A)、ならびに20mMのリン酸ナトリウム、1MのNaBrおよび10%のACN(v/v)(pH8.5)(緩衝液B)を用いた。流速は60ml/分、濃度勾配は、160分で緩衝液Bを20%から40%にした。
本明細書中に引用している全ての特許および印刷物を参照として本明細書中に取り入れておく。
当業者であれば、日常の実験から、本明細書に記載している発明の特定の実施態様と等価な多くの実施態様に気付くはずである。そのような等価の実施態様についても請求項に包含されるものとする。
Claims (27)
- (a)固相ホスホルアミダイト法、液相ホスホルアミダイト法、固相H−ホスホナート法、液相H−ホスホナート法、固相−液相ハイブリッドホスホリアミダイト法および固相−液相ハイブリッドH−ホスホナート法に基づく合成法よりなる群から選択される方法を用いて、1以上のヌクレオチドを含む核酸分子を合成し;
(b)前記工程(a)からの核酸分子を、該核酸分子から、アミノ基を保護するアミド基または置換アミド基およびホスフェート基を保護するシアノエチル基または置換シアノエチル基を除去するのに適した条件下で、水性メチルアミン、アンモニア、ピペリジン、またはそれらの組合せと接触させ;
(c)前記工程(b)からの核酸分子を含む反応混合物を、ピリジン−HF、トリス(ジメチルアミノ)スルホニウムジフルオロトリメチルシリケート(TAS-F)またはポリビニルピリジン−HF、ならびにDMSO、DMF、エタノール、イソプロパノール、メタノール、アセトニトリルおよびそれらの組合せより成る群から選択される少なくとも1つの極性溶媒と、シリル保護基を除去するため水性条件下で接触させ;
(d)前記工程(c)からの核酸分子を含む反応混合物を、適切な緩衝液中においてクロマトグラフィーに装填し;そして
(e)適切な溶出緩衝液を用いて精製勾配をかけ、フラクションを分析し、さらに精製フラクションをプールしさらに脱塩する;
工程を含む方法。 - 前記核酸分子が、1以上のリボヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記核酸分子がsiRNA分子であることを特徴とする請求項2記載の方法。
- 前記核酸分子が、1以上の2'-デオキシ-2'-フルオロヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項2記載の方法。
- 前記核酸分子が、1以上のデオキシリボヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項2記載の方法。
- 前記核酸分子が、糖修飾、塩基修飾、骨格の修飾、および1以上の親油性部分へのコンジュゲーションから成る群より選択される1以上の化学修飾を含むことを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記糖修飾が、2'-糖修飾または3'-糖修飾であることを特徴とする請求項6記載の方法。
- 前記2'-糖修飾が、2'-O−メチル修飾であることを特徴とする請求項7記載の方法。
- 前記骨格の修飾が、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホナート、チオノアルキルホスホナート、ホスフィナート、ホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、ボラノホスフェート、およびそれらの組合せより成る群から選択されるホスフェート骨格の修飾であることを特徴とする請求項6記載の方法。
- 前記化学修飾が、1以上の親油性部分へのコンジュゲーションであり、該親油性部分がコレステロールまたはコレステロール誘導体を含むことを特徴とする請求項6記載の方法。
- 前記核酸分子が、該核酸分子の3'末端、5'末端、または3'末端および5'末端の両方において、1以上の末端修飾を含むことを特徴とする請求項6記載の方法。
- 前記工程(a)の合成法が、固相ホスホルアミダイト法、液相ホスホルアミダイト法、または固相−液相ハイブリッドホスホリアミダイト法であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記水性メチルアミン、アンモニア、ピペリジン、またはそれらの組合せを、エタノールと予め混合することを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記シリル保護基が、t-ブチルジメチルシリル(TBDMSi)基であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記工程(c)においてピリジン-HFおよびDMSOを用い、それらを、DBU、Hunig塩基、ピリジン、ピペリジンおよびN-メチルイミダゾールよりなる群から選択される塩基と、予め混合することを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記工程(c)において、ポリビニルピリジン-HFを用いることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記核酸分子が、二本鎖核酸分子であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記核酸分子が、一本鎖核酸分子であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーがイオン交換クロマトグラフィーであり、装填用の緩衝液が、水、エタノールまたはアセトニトリルを含むことを特徴とする請求項1記載の方法。
- 前記工程(e)において脱塩工程を適用しあるいは脱塩工程を適用しないで、前記核酸分子を第2の核酸分子とアニーリングさせて二本鎖核酸分子を形成し;さらに
前記二本鎖核酸分子をクロマトグラフィー精製にかける;工程をさらに含むことを特徴とする請求項1記載の方法。 - (a)固相ホスホルアミダイト法、液相ホスホルアミダイト法、固相H−ホスホナート法、液相H−ホスホナート法、固相−液相ハイブリッドホスホリアミダイト法および固相−液相ハイブリッドH−ホスホナート法に基づく合成法よりなる群から選択される方法を用いて、1以上のヌクレオチドを含む核酸分子を合成し;
(b)前記工程(a)からの核酸分子を、該核酸分子から、アミノ基を保護するアミド基または置換アミド基およびホスフェートを保護するシアノエチル基または置換シアノエチル基を除去するのに適した条件下で、水性メチルアミン、アンモニア、ピペリジン、またはそれらの組合せと接触させ;
(c)前記工程(b)からの核酸分子からを含む反応混合物を、ピリジン−HF、トリス(ジメチルアミノ)スルホニウムジフルオロトリメチルシリケート(TAS-F)またはポリビニルピリジン−HF、ならびにDMSO、DMF、エタノール、イソプロパノール、メタノール、アセトニトリルおよびそれらの組合せより成る群から選択される少なくとも1つの極性溶媒と、シリル保護基を除去するため水性条件下で接触させ;
(d)前記工程(c)からの核酸分子を含む反応混合物を、水、約20mMリン酸ナトリウム中のエタノールまたは約20mMリン酸ナトリウム中のアセトニトリルを含む装填用緩衝液中においてイオン交換クロマトグラフィーに装填し;そして
(e)適切な溶出緩衝液を用いて精製勾配をかけ、フラクションを分析し、さらに精製フラクションをプールしさらに脱塩する;
工程を含む方法。 - 前記核酸分子を含む反応混合物を、前記工程(d)の前または後に、適切な緩衝液中において逆相クロマトグラフィーに装填する工程をさらに含む請求項21記載の方法。
- 前記工程(e)において脱塩工程を適用しあるいは脱塩工程を適用しないで、前記核酸分子を第2の核酸分子とアニーリングさせて二本鎖核酸分子を形成し;さらに
前記二本鎖核酸分子をクロマトグラフィー精製にかける;工程をさらに含むことを特徴とする請求項21記載の方法。 - 前記二本鎖核酸分子をクロマトグラフィー精製にかける工程が:
前記二本鎖核酸分子を適切な緩衝液中においてクロマトグラフィーに装填し;そして
適切な溶出緩衝液を用いて精製勾配をかけ、フラクションを分析し、さらに精製フラクションをプールしさらに脱塩する;工程を含むことを特徴とする請求項23記載の方法。 - 前記クロマトグラフィー精製が、高速液体クロマトグラフィーであることを特徴とする請求項23記載の方法。
- 前記核酸分子が、1以上のリボヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項23記載の方法。
- 前記二本鎖核酸分子がsiRNAであることを特徴とする請求項23記載の方法。
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