CN102575252B

CN102575252B - 用于多价rna干扰的多核苷酸、组合物及其使用方法

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Publication number: CN102575252B
Application number: CN201080034204.7A
Authority: CN
Inventors: 托德·M·郝瑟尔
Original assignee: Halo Bio RNAI Therapeutics Inc
Current assignee: Halo Bio RNAI Therapeutics Inc
Priority date: 2009-06-01
Filing date: 2010-06-01
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2030-06-01
Also published as: US20180346908A1; CN102575252A; CA2764158A1; ES2804764T3; US20120184598A1; WO2010141511A3; EP2438168A2; WO2010141511A2; JP5875976B2; US20160160215A1; JP2015192674A; EP2438168A4; JP2012528572A; US9957505B2; EP2438168B1; US9200276B2

Abstract

本发明包括具有两个或多个靶特异性区的二价或多价核酸分子或核酸分子复合物，其中所述靶特异性区与单靶基因在多于一个不同的核苷酸位点互补，和/或其中所述靶区与多于一个靶基因或靶序列互补。还包括的是包含这样的核酸分子的组合物，以及将所述组合物用于多价RNA干扰和治疗各种疾病和感染的方法。

Description

用于多价RNA干扰的多核苷酸、组合物及其使用方法

相关技术描述

基因沉默或抑制基因表达的现象对于治疗和诊断目的及对于研究基因功能本身来说具有重要的保证。该现象的实例包括反义技术和dsRNA形成的转录后基因沉默(PTGS)，其以RNA干扰(RNAi)的形式变得普遍。

用于基因沉默的反义策略近年来备受关注。基本概念简单，但原理上有效：反义核酸(NA)碱基与靶RNA配对导致所靶定的RNA失活。由反义RNA或DNA识别靶RNA可以被认为是杂交反应。由于靶是通过序列互补性结合的，这意味着反义NA的合适选择应当保证高特异性。所靶定RNA的失活可以通过不同途径发生，取决于反义NA(已修饰或未修饰的DNA或RNA，或其杂化物)的性质和发生抑制的生物系统的特性。

基于RNAi的基因阻抑是广泛认可的方法，其中正义和反义RNA形成双链RNA(dsRNA)，如作为长RNA双链(19-24个核苷酸双链)，或作为短发卡dsRNA双链(shRNA)，其通过包括酶和/或蛋白复合物机制与基因调控有关。长RNA双链和shRNA双链是通过描述为Dicer的内切核糖核酸酶加工成小干扰RNA(siRNA)的前体。所加工的siRNA或直接引入的siRNA被认为连接蛋白复合物RISC用于导向由RISC/siRNA复合物剪切的互补基因。

然而，有效的反义和RNAi技术发展中持续存在许多问题。例如，DNA反义寡聚核苷酸显示仅短期有效并且通常所需剂量是有毒的；同样地，反义RNA的使用由于稳定性问题也被证明无效。此外，已证明在RNAi中使用的siRNA由于任一链导向剪切潜在包括于内源性调节途径的复合物而导致重要的脱靶阻抑。已尝试使用各种方法通过降低核酸酶的敏感性和利用对siRNA的化学修饰来提高反义稳定性。这些包括修饰正常的磷酸二酯骨架，如利用硫代磷酸酯或甲基磷酸酯，掺入2’-OMe-核苷酸，利用肽核酸(PNA)，以及利用3’端加帽，如3’-氨丙基修饰或3’-3’端键。然而，这些方法可能是昂贵的并且需要额外的步骤。此外，非天然存在的核苷酸的使用和修饰排除了体内表达反义或siRNA序列的能力，从而需要合成它们并随后给予。另外，siRNA双链对单基因显示主要效力而对第二基因脱靶。该无意的作用是负面的并且不是可靠的RNAi多价。

因此，仍然还存在需要用于靶定、定向抑制体外和体内，特别是高等脊椎动物细胞内的基因功能的有效和持续的方法和组合物，包括能够多价基因抑制的单分子复合物。

发明简述

本发明提供新的组合物和方法，其包括精确构建的寡聚核苷酸，当核苷酸靶位点序列各自互不相同时，所述寡聚核苷酸在同时特异性调节一个或多个基因的基因表达中是有用的。

在某些实施方案中，本发明包括分离的精确构建的三链多核苷酸复合物，其包含具有与靶基因或序列在多个位点互补的序列区或与多个基因在单个位点互补的序列的区。

在某些实施方案中，本发明包括分离的精确构建的多核苷酸，其包含具有与靶基因或序列在多个位点互补的序列区或与多个基因在单个位点互补的序列区；各自具有部分自身互补区。在具体实施方案中，所述寡聚核苷酸包含两个或多个自身互补区。在某些实施方案中，本发明的多核苷酸包含RNA、DNA或肽核酸。

某些实施方案涉及至少三个分开的多核苷酸的多核苷酸复合物，所述多核苷酸复合物包含(a)第一多核苷酸，其包含与第一靶序列互补的靶特异性区、5’区和3’区；(b)第二多核苷酸，其包含与第二靶序列互补的靶特异性区、5’区和3’区；以及(c)第三多核苷酸，其包含无效区或与第三靶特异性互补的靶特异性区、5’区和3’区，其中所述第一、第二和第三多核苷酸的靶特异性区各自与不同的靶序列互补，其中所述第一多核苷酸的5’区与第三多核苷酸的3’区互补，其中所述第一多核苷酸的3’区与所述第二多核苷酸的5’区互补，以及其中所述第二多核苷酸的3’区与所述第三多核苷酸的5’区互补，并且其中所述三个分开的多核苷酸通过它们互补的3’区和5’区杂交以形成具有第一、第二和第三单链区以及第一、第二和第三自身互补区的多核苷酸复合物。

在某些实施方案中，所述第一、第二和/或第三多核苷酸包含约15-30个核苷酸。在某些实施方案中，所述第一、第二和/或第三多核苷酸包含约17-25个核苷酸。在某些实施方案中，一个或多个所述自身互补区包含约5-10个核苷酸对。在某些实施方案中，一个或多个所述自身互补区包含约7-8个核苷酸对。

在某些实施方案中，所述第一、第二和第三靶序列中的每个存在于相同的基因、cDNA、mRNA或microRNA中。在某些实施方案中，所述第一、第二和第三靶序列中的至少两个存在于不同的基因、cDNA、mRNA或microRNA中。

在某些实施方案中，各多核苷酸的5’区和/或3’区全部或部分还与该多核苷酸的靶序列互补。在某些实施方案中，一个或多个自身互补区包含3’突出。

某些实施方案涉及自身杂交多核苷酸分子，所述自身杂交多核苷酸分子包括：(a)第一核苷酸序列，其包含与第一靶序列互补的靶特异性区、5’区和3’区，(b)第二核苷酸序列，其包含与第二靶序列互补的靶特异性区、5’区和3’区，以及(c)第三核苷酸序列，其包含无效区或与第三靶序列互补的靶特异性区、5’区和3’区，其中所述各第一、第二和第三核苷酸序列的靶特异性区与不同的靶序列互补，其中所述第一核苷酸序列的5’区与所述第三核苷酸序列的3’区互补，其中所述第一核苷酸序列的3’区与所述第二核苷酸序列的5’区互补，以及其中所述第二核苷酸序列的3’区与所述第三核苷酸序列的5’区互补，并且其中所述5’区各自与它们互补的3’区杂交以形成具有第一、第二和第三单链区以及第一、第二和第三自身互补区的自身杂交多核苷酸分子。

在某些实施方案中，所述第一、第二或第三多核苷酸序列包含约15-60个核苷酸。在某些实施方案中，所述靶特异性区包含约15-30个核苷酸。在某些实施方案中，一个或多个所述自身互补区包含约10-54个核苷酸。在某些实施方案中，一个或多个所述自身互补区包含3’突出。在某些实施方案中，一个或多个所述自身互补区形成茎-环结构。在某些实施方案中，一个或多个所述自身互补区包含在靶特异性区之外的二核苷酸AG/UU近端盒。在某些实施方案中，一个或多个所述自身互补区包含在靶特异性区之外的四核苷酸远端盒，其中所述远端盒的第三个核苷酸不是G。还包括的是编码自身杂交多核苷酸分子的载体，如本文所述。

在某些实施方案中，自身互补区包含由双环、四环或更大的环组成的茎-环结构。在某些实施方案中，所述序列与包含至少17个核苷酸或17至30个核苷酸(包括其中所有整数)的靶基因序列互补。

在某些实施方案中，所述自身互补区(或双链区)包含至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少24个核苷酸、或者12至54或60个核苷酸(包括其中所有整数)。

在某些实施方案中，茎-环结构的环区包含至少1个核苷酸。在某些实施方案中，所述环区包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个核苷酸。

在进一步的实施方案中，茎-环结构的环区由特定的四环序列NGNN或AAGU或UUUU或UUGA或GUUA组成，其中这些序列是5’至3’。

在进一步的实施方案中，本发明包括能够表达本发明的多核苷酸的表达载体。在不同的实施方案中，所述表达载体是组成型或诱导型载体。

本发明进一步包括包含生理上可接受的载体和本发明的多核苷酸的组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供用于减少基因表达的方法，所述方法包括将本发明的多核苷酸复合物或分子引入细胞。在不同的实施方案中，所述细胞是植物、动物、原生动物、病毒、细胞或真菌。在一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物。

在一些实施方案中，将所述多核苷酸复合物或分子直接引入所述细胞，而在另一个实施方案中，将所述多核苷酸复合物或分子通过足以递送分离的多核苷酸的方法细胞外引入所述细胞。

在另一个实施方案中，本发明包括治疗疾病的方法，所述方法包括将本发明的多核苷酸复合物或分子引入细胞，其中所靶定基因的过表达与疾病相关。在一个实施方案中，所述疾病是癌症。

本发明进一步提供在患者中治疗感染的方法，所述方法包括向患者引入本发明的多核苷酸复合物或分子，其中所述分离的多核苷酸介导感染因子的进入、复制、整合、传播或维持。

在又一个相关的实施方案中，本发明提供用于鉴别基因功能的方法，所述方法包括向细胞引入本发明的多核苷酸复合物或分子，其中所述多核苷酸复合物或分子抑制所述基因的表达，以及测定所述多核苷酸复合物或分子的引入对所述细胞特性的影响，从而确定所靶定基因的功能。在一个实施方案中，所述方法利用高通量筛选进行。

在进一步的实施方案中，本发明提供设计包含用于调节靶基因表达的两个或多个自身互补区的多核苷酸序列的方法，所述方法包括：(a)选择长度为17至25个核苷酸并且与靶基因或多靶基因互补的第一3个引导序列；(b)选择长度为4至54个核苷酸的一个或多个另外的序列，其包含自身互补区并且与所述第一序列不完全互补；以及任选地，(c)定义(b)中的序列基序互补、不互补，或者复制与步骤(a)中所选择的序列不互补的基因序列。

在另一个实施方案中，所述突变的基因是由编码突变体p53多肽的基因表达的基因。在另一个实施方案中，所述基因是病毒，并且可以包括一个或多个不同的病毒基因。在具体实施方案中，所述基因是HIV基因，如gag、pol、env或tat等等本文所述和本领域内已知的基因。在另一个实施方案中，所述基因是ApoB。

附图简要说明

图1至图6示出本发明的示例性多核苷酸结构。

图1给出三个分开的多核苷酸分子的多核苷酸复合物。(A)显示包含与靶基因上的位点互补的序列区(阴影线)；(B)显示包含与靶基因上的第二位点或不同基因上的位点互补的序列区(交叉-阴影线)；(C)显示与靶基因上的第三位点或不同基因上的位点互补的序列区(填充为黑色)。数字1、2和3指示导向基因沉默的各寡聚核苷酸的3’端；(A)负荷于方向1，(B)方向2及(C)方向3。各分子的3’区和5’区相互杂交以形成它们各自的自身互补区或双链区，由连接条指示。各多核苷酸包含两个核苷酸3’突出。

图2给出本发明具有三个单链区和三个自身互补区的单一自身杂交的多核苷酸，其是用于加工成核心分子的前体。靶特异性区加黑。(D)显示用四核苷酸的四环加帽的自身互补茎-环区(填充为白色)；(D)还显示在茎-环结构之内具有14/16个核苷酸剪切位点的茎-环区；剪切可以通过RNaseIII发生以去除茎环核苷酸(显示为白色)；(E)显示远端盒，其中由5’至3’确定的第三个核苷酸不为G，因为认为G的存在会阻断去除茎-环区所必需的RNaseIII剪切；(F)显示二核苷酸AG/UU近端盒，其为RNaseIII识别和结合RNaseIII的体内决定因素(Nichols2000)；(G)显示四环。图2中给出的多核苷酸分子是加长的转录本RNA，在细胞内由RNaseIII“预加工”。所得RNA结构与图1中描述的结构相同。

图3描述具有四环形式的自身-形成的单链寡聚核苷酸。(H)显示四环；(I)显示当前导链掺入2个核苷酸突出时连接两个核心链的三环。在该结构中，将四环用于模拟图1给出结构中的突出的3’羟基/5’磷酸酯会怎样并且比图2给出的结构更直接起作用。正如实施例2所证实，该短的四环形式直接导向沉默而无预加工。认为GUUA环扭曲环内的核苷酸并暴露氢原子(参见如，NucleicAcidsResearch，2003，Vol.31，No.3，Fig.6，page1094)。该结构与PAZ或RISC相容。

图4描述了用于二价应用的自身-形成的单链寡聚核苷酸。(J)显示连接两个核心链的更大的环；(K)显示作为竞争复合物形成的关键链，但是对靶基因“无效”，即对靶基因非特异。两个靶特异性区有阴影线。该结构是与RNA转录本合作时用于“二价”应用的组合物。由于化学修饰是不可能的，所述结构决定了负荷和沉默活性不均匀。分子的初始19个核苷酸是PRIMARY链，(K)显示失活的KEY链，以及SECONDARY链是分子的最后21个核苷酸。首要优先负荷至RISC并且起作用是SECONDARY链通过暴露5’/3’端。其次优先PRIMARY链，其在细胞中RNaseIII预加工之后暴露。无效的KEY链的3’端不起作用，因为大的环既未加工也不与负荷至RISC自身相容。

图5描述了本发明多核苷酸复合物具有修饰的RNA碱基。(L)、(M)和(N)示出Tm可以通过使用修饰的RNA(如2’-O-甲基RNA或2’-氟RNA取代2’-OHRNA)逐步增加的区(由虚线限定)，以优选端1、2或3的退火和/或沉默顺序。

图6描述了本发明寡聚核苷酸复合物的两个实施方案。(O)示出该链沉默功能失活的平端DNA链；和(P)示出可以利用用于偶联递送化学物质、配体、抗体或其他净荷或靶分子的端。

图7给出与标准shRNA分子相比，由本发明的多价-siRNA分子阻抑GFP表达的结果(参见实施例1)。图7A给出相对shRNA对照(设置为100％)，由MV克隆longl(108％)和MV克隆longll(119％)增强阻抑GFP。图7B给出相对shRNA对照(设置为100％)，由合成的MV-siRNAGFPl(127％)增强阻抑GFP表达，当合成的MV-siRNA复合物的一条链由DNA链(MF-siRNAGFPIDNA(116％))置换时其轻微降低。

图8给出用于GFP编码序列(SEQIDNO：8)的示例性靶定区(下划线)。

图8A给出由实施例1中的表1和表2的MV-siRNA分子靶定的区。图8B和图8C给出另外的示例性靶定区。

图9给出MV-siRNA分子对HIV复制的抑制作用，其中靶定gag和tat的二价MV-siRNA对HIV复制的抑制作用比仅靶定gag的siRNA显著更强。二价MV-siRNA显示10天时56.89％的抑制，40天时60.02％的抑制，相比单独靶定gag的siRNA，其显示10天时19.77％的抑制，40天时32.43％的抑制。

图10给出示例性HIV基因组核苷酸序列(SEQIDNO：9)，其可以根据本发明的MV-siRNA分子被靶定。该序列从图10A延伸至图10D。

图11给出env基因的核苷酸序列(SEQIDNO：4)，源自图10的HIV基因组序列。

图12提供另外的HIV序列。图12A给出gag基因的核苷酸序列(SEQIDNO：2)，图12B给出tat基因的核苷酸序列(SEQIDNO：3)，二者都源自图10的HIV基因组序列。

图13给出鼠科动物载脂蛋白B(ApoB)的编码序列(SEQIDNO：10)，其可以使用本文提供的某些MV-siRNA靶定。该序列从图13A延伸至图13E。

图14给出人载脂蛋白B(apoB)的mRNA序列(SEQIDNO：1)，其可以使用本文提供的某些MV-siRNA靶定。该序列从图14A延伸至图14E。

发明详述

本发明提供用于在多靶位点抑制基因表达或用于在一个或多个靶位点抑制多个基因表达的新的组合物和方法，其中所述位点在真核细胞体内和体外并非相等的核苷酸序列。特别地，本发明提供多核苷酸复合物和多核苷酸分子，其包含具有与一个或多个靶基因区互补的序列的两个、三个或多个区，其能够靶定并减少靶基因表达。在不同的实施方案中，本发明的组合物和方法可以用于通过靶定靶基因内或它表达的RNA的多位点而抑制单靶基因的表达。可选择地，它们可以用于通过靶定两个或多个不同的基因内或它们表达的RNA的位点而靶定两个或多个不同的基因。

本发明提供优于传统siRNA分子的重要优势。首先，与仅靶定靶基因内一个区的RNAi因子相比，当本发明的多核苷酸复合物或分子靶定单靶基因内的两个或多个区时，它们能够实现更强的抑制来自靶基因的基因表达。此外，利用单一多核苷酸复合物或分子，本发明靶定两个或多个不同靶基因的多核苷酸复合物或分子可以用于抑制与疾病或障碍相关的多靶基因的表达。此外，本发明的多核苷酸复合物和分子无需存在于常规双链RNAi因子中的另外的非靶定链，因此它们没有由非靶定链引起的脱靶效应。因此，本发明的多核苷酸复合物和分子提供令人惊奇的优于现有技术的多核苷酸抑制物(包括反义RNA和RNA干扰分子)的优势，包括针对一个或多个靶基因的增加的潜力和增强的效力。

本发明还基于利用与靶基因的一个、两个或三个不同核酸序列互补的仅一条、两条或三条引导链，识别导向用于剪切的蛋白复合物的多核苷酸结构。虽然利用许多相同的内源性机制，该多价功能致使比dsRNA显著更广泛和有力的抑制靶基因或靶基因组。

本发明的某些实施方案还基于识别由3’突出和5’磷酸酯表示方向的多核苷酸结构致使不含正义链的复合物，有助于比基于dsRNA的siRNA更强的特异性。

鉴于它们的有效性，可以将本发明的组合物递送至细胞或受体，具有由与靶基因或多靶基因互补的单引导链特异性预测的伴随保证。

多价siRNA

本发明包括包含与一个或多个靶基因区互补的两个或多个靶定区的多核苷酸复合物和分子。本发明的多核苷酸复合物和分子可以被称为多价siRNA(mv-siRNA)，因为它们包含与一个或多个靶基因区互补的至少两个靶定区。因此，通过靶定单靶基因内的两个或多个区，或者通过靶定两个或多个靶基因内的一个或多个区，本发明的组合物和方法可以用于抑制或减少一个或多个靶基因的表达。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸复合物包含三个或多个分开的寡聚核苷酸，各自具有5’端和3’端，具有包含靶定区的两个或多个寡聚核苷酸，如本文所述寡聚核苷酸相互杂交以形成复合物。各链在本文被称为“引导链”。在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸分子是包含三条或多条引导链的单一多核苷酸，具有包含靶定区的两条或多条引导链，其中多核苷酸通过自身互补区自身杂交以形成本文所述的结构。然后可以例如细胞内加工所得到的结构，以去除连接各条引导链的环结构。可以存在于不同的寡聚核苷酸中或单一多核苷酸内的各引导链包含与其他引导链互补的区。

在某些实施方案中，本发明提供多核苷酸复合物和分子，其包含至少三条引导链，其中至少两条包含与一个或多个靶基因内的不同序列互补的区。在不同的实施方案中，本发明的多核苷酸复合物包含各自包含一条或多条引导链的两个、三个或多个分开的多核苷酸，其可以相互杂交以形成复合物。在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸分子包含单一多核苷酸，其在单一多核苷酸的不同区内包含三条或多条引导链。

本发明的某些实施方案涉及具有至少三条引导链的多核苷酸复合物或分子，其中两条或多条与一个或多个靶基因部分或全部互补；并且在相互互补(即与另一条引导链的区互补)的任一端处各自具有约4至约12个，约5至约10个，或优选约7至约8个核苷酸，允许形成多核苷酸复合物(参见如图1)。例如，引导链的各端可以包含与多核苷酸复合物或分子的另一条引导链的一端处的核苷酸互补的核苷酸。某些实施方案可以包括包含4、5、6或更多个(条)独立的多核苷酸分子或引导链的多核苷酸复合物。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸复合物包含至少三个分开的多核苷酸，其包括：(1)第一多核苷酸，其包含与第一靶序列互补的靶特异性区、5’区和3’区；(2)第二多核苷酸，其包含与第二靶序列互补的靶特异性区、5’区和3’区；以及(3)第三多核苷酸，其包含无效区或与第三靶特异性互补的靶特异性区、5’区和3’区，其中所述第一、第二和第三多核苷酸的靶特异性区各自与不同的靶序列互补，其中所述第一多核苷酸的5’区与所述第三多核苷酸的3’区互补，其中所述第一多核苷酸的3’区与所述第二多核苷酸的5’区互补，以及其中所述第二多核苷酸的3’区与所述第三多核苷酸的5’区互补，并且其中所述三个分开的多核苷酸通过它们互补的3’和5’区杂交，以形成具有第一、第二和第三单链区以及第一、第二和第三自身互补区的多核苷酸复合物。

如以上所述，在具体实施方案中，本发明的多核苷酸复合物包含至少三个分开的寡聚核苷酸，各自具有5’端和3’端。如图1所示，第一寡聚核苷酸的5’端处的区与第三寡聚核苷酸的3’端处的区退火；第三寡聚核苷酸的5’端处的区与第二寡聚核苷酸的3’端处的区退火；以及第二寡聚核苷酸的5’端处的区与第一寡聚核苷酸的3’端处的区退火。如果复合物中存在另外的寡聚核苷酸，那么它们以相似的方式与复合物的其他寡聚核苷酸退火。寡聚核苷酸末端处相互退火的区可以包括5’端和/或3’端处的终端核苷酸。杂交的3’端和5’端的区都包括寡聚核苷酸的终端核苷酸，所得到的双链区是平端。在具体实施方案中，3’端处退火的区不包括终端和/或倒数第二个核苷酸，得到的双链区具有一个或两个核苷酸3’突出。

在某些实施方案中，所述引导链存在于单一多核苷酸分子中，并且杂交以形成具有三个单链区和三个自身互补区(或双链区)的单一自身杂交多核苷酸，以及至少两个靶特异性区(参见如图2)。在相关实施方案中，单分子可以包含至少3、至少4、至少5或至少6条引导链，并且分别形成具有至少3、至少4、至少5或至少6个自身互补区(或双链区)和至少2、至少3、至少4或至少5个靶特异性区的单一自身杂交多核苷酸。在具体实施方案中，该单一自身杂交多核苷酸是前体分子，其可以由细胞加工以去除环区和任选地许多近端双链区，得到活性mv-siRNA分子(参见如图2)。

因而，在具体实施方案中，本发明包括自身杂交多核苷酸分子，所述自身杂交多核苷酸分子包含：(1)第一核苷酸序列，其包含与第一靶序列互补的靶特异性区、5’区和3’区；(2)第二核苷酸序列，其包含与第二靶序列互补的靶特异性区、5’区和3’区；以及(3)第三核苷酸序列，其包含无效区或与第二靶序列互补的靶特异性区、5’区和3’区，其中所述第一、第二和第三核苷酸序列的靶特异性区各自与不同的靶序列互补，其中所述第一核苷酸序列的5’区与所述第三核苷酸序列的3’区互补，其中所述第一核苷酸序列的3’区与所述第二核苷酸序列的5’区互补，以及其中所述第二核苷酸序列的3’区与所述第三核苷酸序列的5’区互补，并且其中所述5’区各自与它们互补的3’区杂交，以形成具有第一、第二和第三单链区以及第一、第二和第三自身互补区的自身杂交多核苷酸分子。

在具体实施方案中，本发明的单一自身杂交多核苷酸可以在多核苷酸与其自身退火时形成的单链环中包含一个或多个可剪切的核苷酸。一旦单一自身杂交多核苷酸与其自身退火，所述可剪切的核苷酸可以被剪切以得到包含三个或多个分开的寡聚核苷酸的多核苷酸复合物。根据本发明可以使用的可剪切的核苷酸的实例包括但不限于，可光剪切的核苷酸，如pcSpacer(GlenResearchProducts，Sterling，VA，USA)，或亚磷酰胺核苷酸。

如本文所使用，本发明的多核苷酸复合物和分子包括分离的多核苷酸，其包含三个单链区，其中至少两个与两个或多个靶序列互补，各靶序列位于一个或多个靶基因内，并且包含通过形成双链区如茎-环结构而相互连接单链区的5’端或3’端的至少两个或三个自身互补区。所述多核苷酸在本文中还可以被称为寡聚核苷酸。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸复合物和分子包含与靶基因互补的两个或多个序列区。在具体实施方案中，这些区与相同的靶基因或基因互补，而在另一个实施方案中，它们与两个或多个不同的靶基因或基因互补。

因此，本发明包括一个或多个自身互补多核苷酸，其包含与一个或多个靶基因或基因互补的一系列序列。在具体实施方案中，这些序列由与靶基因序列不互补或不完全互补和与自身互补区不互补的序列区分开。在另一个实施方案中，所述多核苷酸包含与靶基因或基因互补的多个序列，所述多核苷酸包含在与靶基因互补的一个或多个序列区的5’端、3’端或二者处的自身互补区。在具体实施方案中，多核苷酸包含与一个或多个靶基因互补的两个或多个序列区，具有位于与靶基因互补的各引导链的5’端和3’端处的自身互补区。在某些实施方案中，除了与它们相应的3’或5’区互补之外，这些3’区和5’区全部或部分可以与所述靶序列互补。

术语“互补”是指根据标准碱基配对原则全部或部分相互互补的核苷酸序列。术语“部分互补”是指具有小于完全互补但仍具有足够数量的互补核苷酸对来支持生理条件下核苷酸延伸内的结合或杂交的序列。

具体实施方案在具体实施方案中，与靶基因(即靶定区)互补的引导链区与靶基因相比可以包含一个或多个核苷酸错配。任选地，引导链中的错配核苷酸可以用解锁核酸(UNA)或亚磷酰胺核酸(如rSpacer，GlenResearch，Sterling，VA，USA)置换，以允许错配的核苷酸与靶基因碱基配对，如沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对。

如本文所使用，术语“自身互补”或“自身互补区”可以指本发明的多核苷酸分子的区，该区与相同分子的另一个区结合或杂交以形成A-T(U)和G-C杂交对，从而形成双链区；和/或可以指第一核苷酸分子的区，该区与第二或第三核苷酸分子的区结合以形成本发明的多核苷酸复合物(即RNAi多核苷酸复合物)，其中所述复合物能够对抗两个或多个靶位点的RNAi干扰活动。相互结合以形成自身互补区的两个区可以是邻近的，或者可以由其他核苷酸分开。此外，正如在RNAi多核苷酸复合物中，两个区可以在分开的核苷酸分子上。

在某些实施方案中，“自身互补区”包含与所定义的第二或第三核苷酸序列的“5’区”结合或杂交的所定义的第一核苷酸序列的“3’区”，其中所定义的第二或第三序列在相同分子内，以形成自身杂交多核苷酸分子。在某些实施方案中，“自身互补区”包含与分开的多核苷酸分子的“5’区”结合或杂交的第一多核苷酸分子的“3’区”，以形成多核苷酸复合物。这些3’区和5’区一般定义为与它们各自的靶特异性区相关，在于5’区在靶特异性区的5’端处，而3’区在靶特异性区的3’端处。在某些实施方案中，这些3’区和5’区中的一个或两个不仅与它们相应的3’区或5’区杂交以形成自身互补区，还可以被设计成包含它们各自靶序列的全部或部分互补，从而形成部分靶特异性区。在这些实施方案中，靶特异性区包含单链区和自身互补(即双链)区。

在某些实施方案中，这些“自身互补区”包含约5-12个核苷酸对，优选5-10或7-8个核苷酸对，包括它们之间的全部整数。同样地，在某些实施方案中，各3’区或5’区包含约5-12个核苷酸，优选5-10或7-8个核苷酸，包括它们之间的全部整数。

术语“不互补”表明在核苷酸的特定延伸中，与靶比对之内没有核苷酸来形成A-T(U)或G-C杂交。术语“不完全-互补”表明在核苷酸延伸中，与靶比对的至少一个核苷酸对来形成A-T(U)或G-C杂交，但是互补核苷酸对的数量不足以在生理条件下的核苷酸延伸内支持结合。

术语“分离的”是指至少部分不含在物质的自然状态时正常伴随该物质的组分的物质。分离意味着从原始来源或环境一定程度的分开。如本文所使用，分离的，例如与DNA相关，是指基本上远离另一编码或非编码序列的多核苷酸，并且DNA分子可以包含大部分不相关的编码DNA，如大的染色体片段或其他功能性基因或多肽编码区。当然，这是指作为原始分离的DNA分子，并不排除随后由人工添加到区段的基因或编码区。

在各种实施方案中，本发明的多核苷酸复合物或分子包含RNA、DNA或肽核酸或这些类型分子的任意或全部组合。此外，多核苷酸可以包含修饰的核酸或核酸衍生物或类似物。核酸修饰的一般实例包括但不限于生物素标记、荧光标记、将伯胺引入多核苷酸的氨基修饰剂、磷酸基团、脱氧尿苷、卤化核苷、硫代磷酸、2’-O-甲基RNA类似物、手性RNA类似物、摆动(wobble)基团、通用碱基和脱氧肌苷。

多核苷酸或寡聚核苷酸的“亚单位”是指一个核苷酸(或核苷酸类似物)单位。术语可以涉及具有或不具有附着的亚单位间连接的核苷酸单位，尽管当涉及“带电荷的亚单位”时，电荷一般存在于亚单位间连接内(如磷酸或硫代磷酸酯键或阳离子键)。特定合成的MV-siRNA可以利用一个或多个不同类型的亚单位和/或亚单位间连接，主要改变它的稳定性、Tm、RNase灵敏度或所期望的其他特征。例如，某些实施方案可以使用具有一个或多个2’-O-甲基RNA亚单位的RNA亚单位。

多核苷酸或寡聚核苷酸的环化亚单位可以基于核糖或其他戊糖，或在某些实施方案中，替代或修饰基团。修饰的寡聚核苷酸骨架的实例包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基及其他烷基膦酸酯(包括3’-亚烃基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、磷酰胺酯(包括3’-氨基磷酰胺酯和氨烷基磷酰胺酯)、磷酰二胺酯、硫羰磷酰胺酯、硫羰烷基磷酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和borano磷酸酯(boranophosphates)，所述borano磷酸酯具有正常3’-5’连接，这些2’-5’连接的类似物和那些具有反向极性的类似物，其中核苷单位的邻近对之间通过3’-5’与5’-3’或2’-5’与5’-2’相连接。还可预期的是肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、2’-O-甲基寡聚核苷酸(2’-OMe)、2’-甲氧基乙氧基寡聚核苷酸(MOE)等等本领域内已知的寡聚核苷酸。

嘌呤或嘧啶碱基配对部分一般是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或肌苷。还包括的是诸如4-吡啶酮、2-吡啶酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯(2，4，6-trime115thoxybenzene)、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨苯基、5-烷基胞苷(如5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(如胸腺嘧啶核糖核苷)、5-卤素尿苷(如5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶，如6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷(quesosine)、2-硫尿苷、4-硫尿苷、怀丁苷(wybutosine)、wybutoxosine、4-乙酰胞苷(4-acetyltidine)、5-(羧羟甲基)尿苷、5’-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、β-D-半乳糖基Q核苷、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基尿苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿苷、5-甲氧基氨甲基尿苷、5-甲基羧甲基尿苷(5-methylcarbonyhnethyluridine)、5-甲氧基尿苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、β-D-甘露糖基Q核苷、尿苷-5-氧乙酸、2-硫胞苷、苏氨酸衍生物及其它(Burgin等，1996，Biochemistry，35，14090，Uhlman&Peyman，见上)。在这方面，用“修饰的碱基”意指除了腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘌呤(U)之外的核苷酸碱基，如上所述；该碱基可以用于反义分子中的任意位点。本领域技术人员将意识到取决于低聚物的应用或化学性质，T和U可相互替换。例如，对于其他反义化学物质如更RNA-样的2’-O-甲基反义寡聚核苷酸，T碱基可以显示为U。

如上所述，本文提供的某些多核苷酸或寡聚核苷酸包括一个或多个肽核酸(PNA)亚单位。肽核酸(PNA)是DNA类似物，其骨架与脱氧核糖骨架在结构上是同形的，由附着嘧啶或嘌呤碱基的N-(2-氨基乙基)甘氨酸单位组成。包含天然嘧啶和嘌呤碱基的PNA与互补寡聚核苷酸按照沃森-克里克碱基配对原则杂交，并且在碱基对识别方面模拟DNA(Egholm，Buchardt等，1993)。PNA的骨架由肽键而非磷酸二酯键形成，使得它们适合用于反义应用(参见以下结构)。完全由PNA组成的骨架不带电荷，致使PNA/DNA或PNA/RNA双链显示大于正常的热稳定。核酸酶或蛋白酶不识别PNA。

使用本领域已知的技术可以产生PNA。PNA是DNA类似物，其中聚酰胺骨架取代传统DNA磷酸核糖环。尽管基本结构变成天然结构，PNA能够在螺旋形式中序列-特异性地结合DNA或RNA。PNA的特征包括与互补DNA或RNA的高结合亲和力，由单碱基错配引起的失稳效应，对核酸酶和蛋白酶的抗性，与DNA或RNA杂交不依赖于盐浓度，以及与同型嘌呤DNA形成三链。Panagene^TM已开发其专有的BtsPNA单体(Bts；苯并噻唑-2-磺酰基)和专有的低聚反应工艺。利用BtsPNA单体的PNA低聚反应由脱保护、配对和加帽的重复循环组成。Panagene关于此技术的专利包括US6969766、US7211668、US7022851、US7125994、US7145006和US7179896。教导制备PNA化合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262，各自在此引入作为参考。PNA化合物的进一步教导可以在Nielsen等，Science，1991，254，1497中找到。

还包括的是“锁核酸”亚单位(LNA)。本领域已知LNA的结构：例如Wengel等，ChemicalCommunications(1998)455；Tetrahedron(1998)54，3607，以及AccountsofChem.Research(1999)32，301)；Obika等，TetrahedronLetters(1997)38，8735；(1998)39，5401，以及BioorganicMedicinalChemistry(2008)16，9230。

多核苷酸和寡聚核苷酸可以掺入一个或多个LNA；在一些情况中，化合物可以完全由LNA组成。本领域内已知用于合成独立的LNA核苷亚单位并将它们掺入寡聚核苷酸的方法：美国专利号7,572,582；7,569,575；7,084,125；7,060,809；7,053,207；7,034,133；6,794,499；以及6,670,461。典型的亚单位间接头包括磷酸二酯和硫代磷酸酯部分；可选择地，可以使用不含磷原子的接头。一个实施方案包括含有LNA的化合物，其中各LNA亚单位由RNA或DNA亚单位(即脱氧核糖核苷酸)分开。进一步的示例性化合物可以由交互的LNA和RNA或DNA亚单位组成，其中亚单位间接头是硫代磷酸酯。

某些多核苷酸或寡聚核苷酸可以包含具有碱基配对部分的基于吗啉的亚单位，由不带电荷或基本上不带电荷的键连接。术语“吗啉低聚物”或“PMO”(氨基磷酸酯吗啉低聚物或二氨基磷酸酯吗啉低聚物)是指由吗啉亚单位结构组成的寡聚核苷酸类似物，其中(i)所述结构由含磷原子的键连接在一起，长1至3个原子，优选长2个原子，并且优选不带电荷或阳离子的，将一个亚单位的吗啉氮原子连接到邻近亚单位的5’环外碳原子，和(ii)各吗啉环具有嘌呤或嘧啶或等价的碱基配对部分，由碱基特异性氢键有效结合多核苷酸中的碱基。

只要它们不干扰结合或活性，对这种连接可以做出各种改变。例如，附着到磷原子的氧原子可以用硫(硫代磷二酰胺)取代。5’氧原子可以用氨基或低级烷基取代的氨基取代。连接到磷原子的悬挂氮原子可以未被取代，用(任选取代的)低级烷基单取代或双取代。嘌呤或嘧啶碱基配对部分一般是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或肌苷。吗啉低聚物的合成、结构和结合特征在美国专利号5,698,685、5,217,866、5,142,047、5,034,506、5,166,315、5,521,063和5,506,337，以及PCT申请号PCT/US07/11435(阳离子键)和US08/012804(改进的合成)中详细描述，其在此全部引入作为参考。

本发明的一方面，MV-siRNA包含至少一个配体限定改变的或非天然的核苷碱基。包括的是净荷分子和靶定分子。大量化合物可以用作改变的碱基。所改变碱基的结构在一定程度上是重要的，改变的碱基应当基本上不阻止寡聚核苷酸与它的靶如mRNA相结合。在某些实施方案中，所改变的碱基是二氟甲苯基、硝基吡咯基、硝基咪唑基、硝基吲哚基、萘基(napthalenyl)、乙酰基蒽(anthrancenyl)、吡啶基、喹啉基、芘基，或本文所述的任何一种非天然核苷碱基的二价基。在某些实施方案中，所述非天然核苷碱基是二氟甲苯基(difluorotolyl)、硝基吡咯基或硝基咪唑。在某些实施方案中，所述非天然核苷碱基是二氟甲苯基。

本领域内已知各种各样的配体并且都适用于本发明。例如，配体可以是类固醇、胆汁酸、脂质、叶酸、吡哆醛、B12、核黄素、生物素、芳香族化合物、多环化合物、冠醚、嵌入剂、剪切分子、蛋白结合因子或碳水化合物。在某些实施方案中，配体是类固醇或芳香族化合物。在某些实施方案中，配体是胆甾醇。

在另一个实施方案中，为了改进细胞靶定和吸收的目的，将多核苷酸或寡聚核苷酸限定至配体。例如，MV-siRNA因子可以限定至抗体或其抗原结合片段。作为另外的例子，MV-siRNA因子可以限定至特异性配体结合分子，如特异性结合特定细胞表面受体的多肽或多肽片段，或更普遍地增强细胞吸收的多肽或多肽片段，如富含精氨酸的肽。

本文所使用的术语“类似物”是指保持与本文多核苷酸相同的结构和/或功能(如结合到靶)的分子、化合物或组合物。类似物的例子包括肽模拟物以及小的和大的有机或无机化合物。

本文所使用的术语“衍生物”或“变体”是指通过一个或多个核酸缺失、添加、置换或侧链修饰，与天然存在的多核苷酸(如靶基因序列)不同的多核苷酸。在某些实施方案中，变体具有与靶基因序列区至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性。因而，例如在某些实施方案中，本发明的寡聚核苷酸包含与靶基因序列的变体互补的区。

本发明的多核苷酸复合物和分子包含与靶基因或多核苷酸序列(或其变体)的区各自互补的序列区或两个或多个序列区，并且在具体实施方案中，与靶基因或多核苷酸序列(或其变体)的区各自完全互补。在具体实施方案中，靶基因是哺乳动物基因，如人基因，或感染哺乳动物的微生物如病毒的基因。在某些实施方案中，靶基因是治疗的靶。例如，靶基因可以是其表达或过表达与人类疾病或障碍相关的基因。这可以是突变基因或野生型或正常基因。已鉴别了各种治疗靶基因，并且这些中的任何一种可以由本发明的多核苷酸复合物和分子靶定。治疗靶基因包括但不限于，原癌基因、生长因子基因、与疾病如白血病相关的易位、炎症蛋白基因、转录因子基因、生长因子受体基因、抗凋亡基因、白细胞介素、钠离子通道基因、钾离子通道基因，例如但不限于以下基因或编码以下蛋白的基因：载脂蛋白B(ApoB)、载脂蛋白B-100(ApoB-100)、bcl家族成员包括bcl-2和bcl-x、MLL-AF4、Huntington基因、AML-MT68融合基因、IKK-B、Ahal、PCSK9、Eg5、转化生长因子β(TGFβ)、Nav1.8、RhoA、HIF-1α、Nogo-L、Nogo-R、toll-样受体9(TLR9)、血管内皮生长因子(VEGF)、SNCA、β-连接素、CCR5、c-myc、p53、白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-12、白细胞介素-6、白细胞介素-17a(IL-17a)、白细胞介素-17f(IL-17f)、Osteopontin(OPN)基因、银屑病基因以及肿瘤坏死因子基因。

在具体实施方案中，本发明的多核苷酸复合物或分子包含引导链或靶特异性区靶定两个或多个基因，如与特定疾病或障碍相关的两个或多个基因。例如，它们可以包括与白细胞介素-1基因或mRNA和肿瘤坏死因子基因或mRNA互补的引导链；与白细胞介素-1基因或mRNA和白细胞介素-12基因或mRNA互补的引导链；或与白细胞介素-1基因或mRNA、白细胞介素-12基因或mRNA以及肿瘤坏死因子基因或mRNA互补的引导连，用于治疗风湿性关节炎。在一个实施方案种，它们包含与osteopontin基因或mRNA和TNF基因或mRNA互补的引导链。

治疗靶基因的其他实例包括编码病毒蛋白的基因和mRNA，如人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白、HTLV病毒蛋白、丙型肝炎病毒(HCV)蛋白、埃博拉病毒蛋白、JC病毒蛋白、疱疹病毒蛋白、人多瘤病毒蛋白、流感病毒蛋白以及劳氏肉瘤病毒蛋白。在具体实施方案中，本发明的多核苷酸复合物或分子包含与由特定病毒表达的两个或多个基因或mRNA互补的引导链，如两个或多个HIV蛋白基因或两个或多个疱疹病毒蛋白基因。在另一个实施方案中，它们包含具有与两个或多个单纯疱疹病毒基因或mRNA互补的引导链，如HSV-2的UL29基因或mRNA和Nectin-1基因或mRNA，以减少HSV-2表达、复制或活性。在一个实施方案中，具有靶定两个或多个HSV-2基因或mRNA的区的多核苷酸复合物或分子存在于局部递送的制剂中。

在具体实施方案中，本发明的多核苷酸复合物和分子包含靶定载脂蛋白B(ApoB)基因或mRNA如人ApoB基因或mRNA或小鼠ApoB基因或mRNA的一条(个)、两条(个)、三条(个)或更多引导链或靶特异性区。因此，在具体实施方案中，它们包括包含与SEQIDNO：1中列出的人ApoB序列区互补的区的一个、两个、三个或更多区。在另一个实施方案中，它们包括包含与SEQIDNO：10中列出的小鼠ApoB序列区互补的区的一个、两个、三个或更多区。在具体实施方案中，它们包含具有所附实施例中列出的特定序列的两个或更多引导序列。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸复合物和分子包含靶定HIV基因的一条(个)、两条(个)、三条(个)或更多引导链或区。在具体实施方案中，它们靶定编码选自以下的一种或多种蛋白的一个、两个、三个或更多HIV基因或mRNA：HIVgag、HIVtat、HIVenv、HIVgag-pol、HIVvif及HIVnef蛋白。因此，在具体实施方案中，它们包含与SEQIDNO：2中列出的HIVgag序列区互补的一个、两个、三个或更多区；与SEQIDNO：3中列出的HIVtat序列区互补的一个、两个、三个或更多区；与SEQIDNO：4中列出的HIVenv序列区互补的一个、两个、三个或更多区；与SEQIDNO：5中列出的HIVgag-pol序列区互补的一个、两个、三个或更多区；与SEQIDNO：6中列出的HIVvif序列区互补的一个、两个、三个或更多区；与SEQIDNO：7中列出的HIVnef序列区互补的一个、两个、三个或更多区。在具体实施方案中，它们包含具有所附实施例中列出的特异HIV序列的两个或更多引导序列。

在某些实施方案中，选择与靶基因(或基因)互补的序列区是基于分析所选择靶序列并测定二级结构、T_m、结合能以及相对稳定性和细胞特异性。可以选择这样的序列是基于它们相对不能形成二聚体、发卡或其它会减少多核苷酸的结构完整性或阻止特异性结合宿主细胞的靶基因的二级结构。

靶基因或mRNA的优选靶区可以包括位于或接近AUG翻译起始密码子的那些区，以及与基因或mRNA的5’区基本上互补的那些序列。例如利用OLIGO引物分析软件v.4和/或BLASTN2.0.5算法软件(Altschul等，NucleicAcidsRes.1997，25(17)：3389-402)或Oligoengine工作站2.0，可以进行这些二级结构分析和靶位点选择考虑因素。

在一个实施方案中，靶位点优选不位于5’和3’未翻译区(UTR)内或接近起始密码子的区(大约75个碱基内)，因为结合调节区的蛋白可以干扰多核苷酸的结合。此外，潜在的靶位点可以与合适的基因组数据库比较，如BLASTN2.0.5，可在NCBI服务器(www.ncbi.nlm)获得，以及与其他消除的编码序列具有显著同源性的潜在靶序列。

在另一个实施方案中，靶位点位于5’或3’未翻译区(UTR)内。此外，多核苷酸的自身互补区可以由靶基因中存在的特定序列组成。

靶基因可以是任何物种，包括例如植物、动物(如哺乳动物)、原生动物、病毒(如HIV)、细菌或真菌。在某些实施方案中，本发明的多核苷酸可以包含实施例1中的GFP序列、实施例2中的HIV序列或实施例3中的ApoB序列，或者与实施例1中的GFP序列、实施例2中的HIV序列或实施例3中的ApoB序列互补。

如上所述，多核苷酸的靶基因序列和互补区可以相互完全互补，或者只要在生理条件下链相互杂交，它们可以不是完全互补。

本发明的多核苷酸复合物和分子包含与一个或多个靶基因、以及一个或多个自身互补区和/或相互连接的环互补的至少一个、两个或三个区。一般，与靶基因互补的区长度为15至17至24个核苷酸，包括这些范围内的整数值。该区可以是至少16个核苷酸的长度、至少17个核苷酸的长度、至少20个核苷酸的长度、至少24个核苷酸的长度、15至24个核苷酸的长度、16至24个核苷酸的长度、或17至24个核苷酸的长度，包含端点值，包括这些范围内的任何整数值。

自身互补区一般为2至54个核苷酸的长度、至少2个核苷酸的长度、至少16个核苷酸的长度、或至少20个核苷酸的长度，包括这些范围内的任何一个整数。因此，在一个实施方案中，自身互补区可以包含约1-26个核苷酸对。单链区可以为约3-15个核苷酸，包括中间的全部整数。无效区是指至少通过设计的任何靶基因的非特异性区。无效区或链可以用于代替靶特异性区，如在设计本发明的二价多核苷酸复合物或分子(参见如图IV(K))中。

在某些实施方案中，自身互补区足够长以形成双链结构。在某些实施方案中，3’区和5’区可以杂交以用于包含茎-环结构的自身互补区(即双链区)。因此，在一个实施方案中，自身互补区的一级序列包含相互互补的两个延伸序列，所述序列由不互补或是不完全互补的另外的序列分开。虽然不是最佳，在某些实施方案中另外的序列可以是互补的。另外的序列形成茎-环结构的环，因此必须足够长以利于允许两个互补的延伸相互结合必需的折叠。在具体实施方案中，环序列包含至少3个、至少4个、至少5个或至少6个碱基。在一个实施方案中，环序列包含4个碱基。相互互补(在自身互补区内；即茎区)的两个延伸序列具有足以在生理条件下相互特异性杂交的长度。在某些实施方案中，各延伸包含4至12个核苷酸；在另一个实施方案中，各延伸包含至少4个、至少5个或至少6个、至少8个或至少10个核苷酸，或这些范围内的任何整数值。在具体实施方案中，自身互补区包含由至少4个核苷酸的环序列分开的至少4个互补核苷酸的两个延伸。在某些实施方案中，全部或部分自身互补区可以与多核苷酸区互补或不互补，所述多核苷酸区与靶基因或基因互补。

在具体实施方案中，自身互补区具有适合于自身互补区结合如以形成茎-环结构的热力学参数。

在一个实施方案中，为保证能量组合物足以形成期望的结构如茎-环结构，自身互补区通过使用RNA经自由能分析和比较剩余“非自身互补区”或环区内所含能量进行动力学计算。通常，确定茎环结构的组合物时要考虑基因靶定区的不同核苷酸序列，以保证形成这样的结构。自由能分析公式可以再次被改变以说明核苷酸类型或其使用的环境pH。本领域内可利用许多不同的二级结构预测程序，并且每一种根据本发明可以使用。还可以公开获得用于RNA和DNA碱基的热力学参数与靶序列选择算法组合，其中几种是本领域内可利用的。

在一个实施方案中，多核苷酸复合物分子包含以下核苷酸或由以下核苷酸组成：(a)包含长度为17至24个核苷酸(包括其间的任何整数值)的三个寡聚核苷酸，其与任选地由(b)包含长度为16至54个核苷酸(包括其间的任何整数值)的自身互补序列或(c)能够形成环的2至12个核苷酸加侧翼的至少一部分基因分子互补，并且能够在生理条件下与其杂交。在一个实施方案中，各自身互补序列能够形成茎-环结构，其中的一个位于第二引导链的5’端，其中的一个位于第二引导链的3’端。

在某些实施方案中，自身互补区用作补充其自身酶剪切和/或与基因调控的催化过程相关蛋白的特定区相结合的结构。此外，所述环可以具有某些4-核苷酸(如四环NGNN、AAGU、UUGA或GUUA)结构以促进由RNase如RNaseIII剪切自身互补区。此外，所述自身互补区可以由RNaseIII剪切11/13或14/16个核苷酸成剩下2个核苷酸3’端的双链区。在某些实施方案中，所述四环具有序列GNRA或GNYA，其中N表示任何一种核苷酸或核苷，R表示嘌呤核苷酸或核苷；以及Y表示嘧啶核苷酸或核苷。

在某些实施方案中，已如上所述被酶剪切的自身互补多核苷酸将装载到RISC复合物的蛋白区。在某些实施方案中，包含大于4核苷酸的环的自身互补区可以防止由RNase如RNaseIII剪切自身互补区。在优选的实施方案中，本发明的多核苷酸与靶基因相结合并减少靶基因表达。靶基因可以是已知的基因靶，或可选择地，靶基因可以是未知的，即可以使用随机序列。在某些实施方案中，减少靶基因水平至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％。

在本发明的一个实施方案中，靶基因表达(即基因表达)的抑制水平为至少90％、至少95％、至少98％和至少99％或几乎100％，因而细胞或生物体将有效具有相当于所谓基因“敲除”的表型。然而，在一些实施方案中，可以优选实现仅部分抑制，使得表型相当于所谓基因“敲低”。敲低基因表达的这种方法可以在治疗上使用或用于研究(如产生疾病状态模型、检测基因功能、评估因子是否作用于基因、验证用于药物发现的靶)。

本发明的多核苷酸复合物和分子可以用于靶定和减少或抑制基因(包含编码序列和非编码序列)、cDNA、mRNA或microRNA表达。在具体实施方案中，它们的引导链或靶定区与mRNA或microRNA相结合。

本发明进一步提供本发明的多核苷酸的阵列，包括微阵列。微阵列是一般具有微米至毫米范围尺寸的小型化装置，用于进行化学和生化反应，并且特别适合用于本发明的实施方案。阵列可以利用基本上任何和全部已知技术凭借微电子和/或微加工构造，并且在半导体行业和/或生化行业中可利用，假如这样的技术顺从于并且与多核苷酸序列的沉积和/或筛选相容。

本发明的微阵列特别期望用于多种多核苷酸的高通量分析。微阵列一般被构造成具有包含本发明的多核苷酸的离散区或斑点，各斑点优选在阵列表面上定位寻址的位置处包含一个或多个多核苷酸。本发明的阵列可以通过本领域内可利用的任何方法制备。例如，由Affymetrix开发的光导化学合成法(参见美国专利号5,445,934和5,856,174)可以用于在芯片表面通过结合固相光化学合成和光刻制造技术合成生物分子。由lncyte制药开发的化学沉积法利用预先合成的cDNA探针定向沉积于芯片表面(参见如美国专利号5,874,554)。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸分子利用本领域内普遍利用的技术化学合成，并且作为三链复合物退火。在相关的实施方案中，本发明多核苷酸复合物的三条或更多引导链可以独立地化学合成并且退火来产生多核苷酸复合物。

在另一个实施方案中，它在体外或体内利用合适且普遍已知的技术如载体或质粒构建体表达。因此，在某些实施方案中，本发明包括体外和体内表达载体，所述表达载体包含由茎-环或环相互连接形成核苷酸序列的本发明的多核苷酸序列。本领域技术人员所熟知的方法可以用于构建表达载体，所述表达载体包含编码多核苷酸的序列以及适当的转录和翻译控制元件。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。这类技术描述于，例如Sambrook，J.等(1989)MolecularCloning，ALaboratoryManual(分子克隆实验指南)，ColdSpringHarborPress，Plainview，N.Y.，以及Ausubel，F.M.等(1989)CurrentProtocolsinMolecularBiology(现代分子生物学实验技术)，JohnWiley&Sons，NewYork，N.Y。

载体或核酸构建系统可以包含单一载体或质粒，两个或多个载体或质粒，其包含总DNA一起被引入至宿主细胞基因组或转位子中。载体的选择一般取决于载体与要将载体引入的宿主细胞的相容性。在本例子中，所述载体或核酸构建体优选在哺乳动物细胞中功能可操作的载体或核酸构建体。所述载体还可以包括可以用于选择或鉴别适当的转化体或转染体的选择标志物如抗生素或药物抗性基因或报告基因(如绿色荧光蛋白、荧光素酶)。示例性递送系统可以包括病毒载体系统(即病毒介导的转导)，包括但不限于逆转录病毒(如慢病毒)载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体及疱疹病毒载体等等本领域内已知的载体。

如上所述，某些实施方案使用逆转录病毒载体，如慢病毒载体。术语“慢病毒”是指能够感染分裂和非分裂细胞的复杂逆转录病毒属。慢病毒的例子包括HIV(人类免疫缺陷病毒，包括HIV-1型和HIV-2型)、visna-maedi、山羊关节炎-脑炎病毒、马传染性贫血病毒、描免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒载体可以源自这些病毒中的任何一种或多种(参见如，Evans等，HumGeneTher.10：1479-1489，1999；Case等，PNASUSA96：2988-2993，1999；Uchida等，PNASUSA95：11939-11944，1998；Miyoshi等，Science283：682-686，1999；Sutton等，JVirol72：5781-5788，1998；以及Frecha等，Blood.112：4843-52，2008，各自整体在此引入作为参考)。

在某些实施方案中，逆转录病毒载体包含来自慢病毒基因组如HIV基因组或SIV基因组的某些最小序列。慢病毒的基因组一般有机化成5’长末端重复序列(LTR)区、gag基因、pol基因、env基因、附属基因(如nef、vif、vpr、vpu、tat、rev)和3’LTR区。将病毒LTR分成三个区，被称为U3、R(重复)和U5。U3区包含增强子和启动子元件，U5区包含多聚腺苷酸化信号和分开U3区和U5区的R区。R区的转录序列出现在病毒RNA的5’和3’端(参见如“RNAViruses：APracticalApproach”(RNA病毒实用方法)(AlanJ.Cann编，OxfordUniversityPress，2000)；ONarayan，J.Gen.Virology.70：1617-1639，1989；Fields等，FundamentalVirologyRavenPress，1990；Miyoshi等，JVirol.72：8150-7，1998；以及美国专利号6,013,516，各自整体引入作为参考)。为了调节所期望的载体活性，慢病毒载体可以包含任何一个或多个慢病毒基因组的这些元件，或者如为了减少慢病毒复制的病理效应或为了限制慢病毒载体单轮感染，它们可以包含缺失、插入、置换或突变的一个或多个这些元件，。

一般，最小的逆转录病毒载体包含某些5’LTR和3’LTR序列、一个或多个关注的基因(待表达于靶细胞中)、一个或多个启动子和用于包装RNA的顺式作用序列。可以包括本文所述和本领域内已知的其他调节序列。病毒载体一般克隆到可以转染至包装细胞系如真核细胞(如293-HEK)的质粒，并且一般还包含对细菌中复制质粒有用的序列。

在某些实施方案中，所述病毒载体包含来自逆转录病毒如慢病毒的5’和/或3’LTR的序列。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。优选的LTR序列是HIVLTR序列。

在某些实施方案中，所述病毒载体包含来自慢病毒5’LTR的R和U5序列和来自慢病毒的失活或“自身-失活”的3’LTR。“自身-失活的3’LTR”’是包含防止LTR序列驱动下游基因表达的突变、置换或缺失的3’长末端重复序列(LTR)。来自3’LTR的U3区拷贝用作在整合的前病毒中产生两种LTR的模板。因而，当具有失活的缺失或突变的3’LTR作为前病毒的5’LTR整合时，没有来自5’LTR的转录是可能的。这消除了病毒增强子/启动子和任何内源性增强子/启动子之间的竞争。自身-失活3’LTR描述于，例如Zufferey等，JVirol.72：9873-9880，1998；Miyoshi等，JVirol.72：8150-8157，1998；以及Iwakuma等，Virology261：120-132，1999，各自整体引入作为参考。自身失活3’LTR可以通过本领域内任何已知的方法形成。在某些实施方案中，所述3’LTR的U3元件含有缺失其增强子序列，优选TATA盒、Spl和/或NF-κB位点。自身失活3’LTR的结果是，整合入宿主细胞基因组的前病毒将包含失活的5’LTR。

表达载体一般包括调节序列，其调节多核苷酸的表达。调节序列存在于表达载体中，包括所述载体的那些非翻译区，如增强子、启动子、5’和3’非翻译区，其与宿主细胞蛋白相互作用以实现转录和翻译。这样的元件可以改变它们的强度和特异性。取决于所利用的载体系统和细胞，可以使用任何数量的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。此外，还可以使用组织特异性或细胞特异性启动子。

对于在哺乳动物细胞中表达，通常优选来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。此外，通常可利用许多基于病毒的表达系统。例如，将腺病毒用作表达载体的情况中，可以将编码关注多肽的序列连接到由晚期启动子和三重前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物。插入病毒基因组的非必需E1或E3区可以用于获得能够在所感染的宿主细胞中表达多肽的活病毒(Logan，J.和Shenk，T.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81：3655-3659)。此外，转录增强子如劳氏肉瘤病毒(RSV)增强子，可以用于哺乳动物宿主细胞中增加表达。

某些实施方案可以使用一个或多个RNA聚合酶II和III启动子。RNA聚合酶III启动子的合适选择可以在例如Paule和White，NucleicAcidsResearch.，VoI28，pp1283-1298，2000中发现，其整体引入作为参考。RNA聚合酶II和III启动子还包括任何合成的或改造的DNA片段，所述DNA片段可以分别定向RNA聚合酶II和III转录其下游RNA编码序列。进一步地，RNA聚合酶II或III(PolII或III)启动子或用作病毒载体部分的启动子可以是诱导型。任何合适的诱导型PolII或III启动子可以与本发明的方法一起使用。示例性PolII或III启动子包括四环素响应性启动子，提供于Ohkawa和Taira，HumanGeneTherapy，Vol.11，pp577-585，2000；和Meissner等，NucleicAcidsResearch，Vol.29，pp1672-1682，2001，各自整体引入作为参考。

可以使用的组成型启动子的非限制性实例包括用于泛素的启动子、CMV启动子(参见如Karasuyama等，J.Exp.Med.169：13，1989)、β-肌动蛋白(参见如Gunning等，PNASUSA84：4831-4835，1987)以及pgk启动子(参见如Adra等，Gene60：65-74，1987)；Singer-Sam等，Gene32：409-417，1984；以及Dobson等，NucleicAcidsRes.10：2635-2637，1982，各自整体引入作为参考)。组织特异性启动子的非限制性实例包括lck启动子(参见如Garvin等，Mol.CellBiol.8：3058-3064，1988；和Takadera等，Mol.CellBiol.9：2173-2180，1989)、myogenin启动子(Yee等，GeneandDevelopment7：1277-1289.1993)以及thyl(参见如Gundersen等，Gene113：207-214，1992)。

启动子的其他实例包括泛素-C启动子、人μ重链启动子或Ig重链启动子(如MH-b12)以及人κ轻链启动子或Ig轻链启动子(如EEK-b12)，其在B-淋巴细胞中起作用。MH-b12启动子含有人μ重链启动子，其前面是由基质结合区加侧翼的iEμ增强子，而EEK-b12启动子含有κ轻链启动子，其前面是内源性增强子(iEκ)、基质结合区和3’增强子(3’Eκ)(参见如Luo等，Blood.113：1422-1431，2009，在此引入作为参考)。因此，某些实施方案可以使用一个或多个这些启动子或增强子元件。

在某些实施方案中，本发明提供用于条件表达的多核苷酸。各种条件表达系统是本领域内已知并且可利用于细胞和动物中使用，而且本发明预期使用任何这样的条件表达系统来调节多核苷酸的表达或活性。在本发明的一个实施方案中，例如，利用REV-TET系统实现诱导型表达。该系统的成分和利用系统来控制基因表达的方法在文献中有据可查，并且表达四环素控制的反式激活因子(tTA)或反式tTA(rtTA)的载体可商购获得(如pTet-Off、pTet-On和ptTA-2/3/4载体，Clontech，PaloAlto，CA)。这样的系统描述于，例如美国专利号5650298、6271348、5922927及相关专利，其整体在此引入作为参考。

在某些实施方案中，本文提供的病毒载体(如逆转录病毒、慢病毒)是具有一个或多个所选择的病毒糖蛋白或包膜蛋白的“假型”，主要来靶定所选择的细胞类型。假型通常是指将一个或多个异源病毒糖蛋白结合到细胞表面病毒颗粒，通常允许病毒颗粒感染所选择的与其正常靶细胞不同的细胞。“异源”元件源自除病毒载体的RNA基因组来源的病毒之外的病毒。一般，病毒载体的糖蛋白编码区如通过缺失已遗传改变，以防止表达其自身糖蛋白。仅仅通过举例的方式，来自HIV-来源的慢病毒载体的包膜糖蛋白gp41和/或gp120一般先于具有异源病毒糖蛋白的假型缺失。

病毒载体的传代可以使用本领域内已知的任何合适的遗传工程技术，包括但不限于限制性核酸内切酶消化、连接、转化、质粒纯化、PCR扩增和DNA测序的标准技术，例如，如Sambrook等所描述(MolecularCloning：ALaboratoryManual(分子克隆实验指南).ColdSpringHarborLaboratoryPress，N.Y.(1989))，Coffin等(Retroviruses(逆转录病毒).ColdSpringHarborLaboratoryPress，N.Y.(1997))和“RNAViruses：APracticalApproach(RNA病毒实用方法)”(AlanJ.Cann，编，OxfordUniversityPress，(2000))。

可以将本领域内已知的任何各种方法用于产生合适的逆转录病毒颗粒，其基因组包含病毒载体的RNA拷贝。正如一种方法，基于病毒载体进入具有期望的靶细胞特异性的病毒颗粒，可以将病毒载体引入包装病毒基因组RNA的包装细胞系。包装细胞系一般以反式提供将病毒基因组RNA包装到病毒颗粒和感染靶细胞所必需的病毒蛋白，包括结构gag蛋白，酶pol蛋白和包膜糖蛋白。

在某些实施方案中，所述包装细胞系可以稳定地表达某些必需或期望的病毒蛋白(如gag、pol)(参见如美国专利号6,218,181，在此引入作为参考)。在某些实施方案中，所述包装细胞系可以用编码某些必需或期望的病毒蛋白(如gag、pol、糖蛋白)的质粒瞬时感染，包括本文描述的风疹病毒糖蛋白序列。在一个示例性实施方案中，所述包装细胞系稳定地表达gag和pol序列，然后所述细胞系用编码病毒载体的质粒和编码糖蛋白的质粒转染。引入期望的质粒之后，将病毒颗粒收集并相应地处理，如通过超滤以完成病毒颗粒的浓缩贮存。示例性包装细胞系包括293(ATCCCCLX)、HeLa(ATCCCCL2)、D17(ATCCCCL183)、MDCK(ATCCCCL34)、BHK(ATCCCCL-10)和Cf2Th(ATCCCRL1430)细胞系。

在一个具体实施方案中，利用载体系统表达多核苷酸，所述载体系统包含pSUPER载体骨架和相应于待表达的多核苷酸的另外的序列。已证明pSUPER载体系统对于表达shRNA试剂和下调基因表达是有用的(Brummelkamp，TT等，Science296：550(2002)和Brummelkamp，T.R等，CancerCell，在线发表，2002年8月22日)。PSUPER载体可从OligoEngine(Seattle，WA)商购获得。

调节基因表达的方法

本发明的多核苷酸可以用于各种目的，全部大体上涉及它们抑制或减少一个或多个靶基因表达的能力。因此，本发明提供减少一个或多个靶基因表达的方法，所述方法包括将本发明的多核苷酸复合物或分子引入包含所述一个或多个靶基因的细胞。在具体实施方案中，所述多核苷酸复合物或分子包含共同靶定一个或多个靶基因的一条或多条引导链。在一个实施方案中，将本发明的多核苷酸引入含有由一条(个)、两条(个)或三条(个)引导链或靶定区靶定的靶基因或其同源物、其变体或其直系同源物的细胞。

此外，本发明的多核苷酸可以用于间接地减少表达。例如，本发明的多核苷酸复合物或分子可以用于减少驱动第二基因(即靶基因)表达的转录激活因子的表达，从而减少第二基因的表达。同样地，多核苷酸可以用于间接地增加表达。例如，本发明的多核苷酸复合物或分子可以用于减少抑制第二基因表达的转录阻遏因子的表达，从而增加第二基因的表达。

在各种实施方案中，靶基因是源自待引入多核苷酸的细胞的基因、内源性基因、外源性基因、转基因或转染细胞之后细胞中存在的病原体基因。取决于特定的靶基因和递送至细胞的多核苷酸的量，本发明的方法可导致部分或全部抑制靶基因的表达。含有靶基因的细胞可以源自或包含于任何生物体(如植物、动物、原生动物、病毒、细菌或真菌)。如本文所使用，“靶基因”包括基因、mRNA和microRNA。

抑制靶基因的表达可以利用本发明领域内技术人员已知的技术，通过包括但不限于以下的方法验证：观测或检测由靶基因编码的蛋白水平的缺失或可观测的降低，表达自靶基因(如mRNA0)的基因产物水平的缺失或可观测的降低，和/或与基因表达相关的表型。

可以检测以确定由引入本发明的多核苷酸复合物或分子而引起的作用的细胞特征的实例包括细胞生长、凋亡、细胞周期特征、细胞分化和形态。

可以将本发明的多核苷酸复合物或分子直接引入细胞(即细胞内)或细胞外引入生物体如哺乳动物的空腔或胞间隙，进入生物体循环，所述引入包括经口引入、通过将生物体浸泡于含有多核苷酸的溶液中引入，或通过足以递送多核苷酸至细胞的一些其他方法引入。

此外，可以将改造成表达多核苷酸的载体引入细胞，其中所述载体表达多核苷酸，从而将它引入细胞。本领域内普遍已知并且可利用的转移表达载体至细胞的方法，包括如转染、脂质体转染、划痕荷载、电穿孔、显微注射、感染、基因枪和反转录转座。通常，本领域技术人员基于载体类型和细胞类型，以及本领域内普遍可利用的教导易于确定将载体引入细胞的合适方法。感染因子可以通过本领域内易于利用的各种方法引入，包括如鼻腔吸入。

利用本发明的寡聚核苷酸抑制基因表达的方法可以联合其他敲低和敲除方法，如基因靶定、反义RNA、核酶、双链RNA(如shRNA和siRNA)以进一步减少靶基因的表达。

在不同的实施方案中，本发明的靶细胞是原代细胞、细胞系、永生细胞或转化细胞。靶细胞可以是体细胞或生殖细胞。所述靶细胞可以是非分裂的细胞，如神经细胞，或它在合适的细胞培养条件中能够体外增殖。靶细胞可以是正常细胞，或它们可以是疾病细胞，包括含有已知的基因突变的那些细胞。本发明的真核靶细胞包括哺乳动物细胞如，例如人细胞、鼠科动物细胞、啮齿动物细胞和灵长类动物细胞。在一个实施方案中，本发明的靶细胞是干细胞，其包括例如胚胎干细胞，如鼠科动物的胚胎干细胞。

可以将本发明的多核苷酸复合物、分子和方法用于治疗任何各种疾病或障碍，包括但不限于炎症性疾病、心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤、脱髓鞘疾病、消化系统疾病、内分泌系统疾病、生殖系统疾病、血液和淋巴系统疾病、免疫性疾病、精神障碍、肌肉骨骼疾病、神经疾病、神经肌肉疾病、代谢性疾病、性传播疾病、皮肤和结缔组织病、泌尿系统疾病以及感染。

在某些实施方案中，所述方法对动物实施，在具体实施方案中，对哺乳动物实施，以及在某些实施方案中，对人实施。

因此，在一个实施方案中，本发明包括利用本发明的多核苷酸复合物或分子用于治疗或预防与基因失控、过表达或突变相关的疾病的方法。例如，可以将本发明的多核苷酸复合物或分子引入癌细胞或肿瘤，从而抑制维持致癌/致瘤表型所需基因或相关基因的表达。为预防疾病或其他病理，可以选择例如启动或维持疾病/病理所需的靶基因。治疗可以包括改善与疾病相关的任何症状或与病理相关的临床指征。

此外，将本发明的多核苷酸用于治疗与基因突变相关的疾病或障碍。在一个实施方案中，将多核苷酸用于调控突变基因或等位基因的表达。在这样的实施方案中，所述突变基因是多核苷酸复合物或分子的靶，其将包含与所述突变基因的区互补的区。该区可以包括突变，但不是必需的，因为也可以靶定基因的另一个区，导致减少突变基因或基因的表达。在某些实施方案中，该区包含突变，并且在相关实施方案中，所述多核苷酸复合物或分子特异性抑制突变基因或基因的表达，但不抑制野生型基因或基因的表达。这样的多核苷酸在如其中一个等位基因突变但另一个未突变的情形中是特别有用的。然而，在另一个实施方案中，该序列不一定会包含突变，并且可以因此仅包含野生型序列。这样的多核苷酸在如其中全部等位基因突变的情形中是特别有用的。本领域内已知各种疾病和障碍与基因突变相关或由基因突变引起，并且本发明包括用多核苷酸治疗任何这样的疾病或障碍。

在某些实施方案中，靶定病原体的基因用于抑制。例如，基因可以直接引起宿主免疫抑制或对于病原体复制、病原体传播或维持感染是必需的。此外，靶基因可以是负责病原体进入其宿主、通过病原体或宿主的药物代谢、病原体基因组的复制或整合、在宿主中感染的建立或扩散、或组装下一代病原体的病原体基因或宿主基因。预防(即防止或降低感染风险)、以及降低与感染相关症状的频率或严重性的方法包括于本发明中。例如，通过引入根据本发明的多核苷酸，可以靶定处于病原体感染风险中的细胞或已被感染的细胞，特别是人免疫缺陷病毒(HIV)感染，用于治疗(靶定序列参见实施例1和实施例2)。因而，在一个实施方案中，将靶定一个或多个HIV蛋白的本发明的多核苷酸复合物或分子用于治疗或抑制HIV感染或获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。

在其他具体实施方案中，将本发明用于治疗或开发治疗任何类型的癌症。可以利用本文描述的方法治疗的肿瘤的实例包括但不限于，神经母细胞瘤、骨髓瘤、前列腺癌、小细胞肺癌、结肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、脑瘤、乳癌、白血病、淋巴瘤及其他。

在一个实施方案中，将靶定载脂蛋白B(apoB)的本发明的多核苷酸复合物或分子用于治疗、减少或抑制动脉硬化症或心脏病。ApoB是低密度脂蛋白(LDL)的主要载脂蛋白，其负责运送胆固醇至组织。LDL颗粒上的ApoB担当LDL受体的配体，并且高水平的ApoB可导致引起血管病(动脉硬化症)的斑块，导致心脏病。

可以将多核苷酸复合物、分子和表达载体(包括病毒载体和病毒)引入体外或离体细胞，随后放入动物以影响治疗，或者可以将它们通过体内给予直接引入患者。因而，在某些实施方案中，本发明提供基因治疗方法。可以将本发明的组合物以许多方式中的任何一种给予患者，包括肠胃外、静脉内、全身、局部、经口、瘤内、肌内、皮下、腹膜内、吸入或任何这样的递送方法。在一个实施方案中，所述组合物可以肠胃外给予，即关节内、静脉内、腹膜内、皮下或肌内。在具体的方案中，所述脂质体组合物通过静脉内输注给予或由弹丸注射腹膜内给予。

本发明的组合物可以制成适合于递送至个体的药物组合物。本发明的药物组合物将通常进一步包含一种或多种缓冲液(如中性缓冲生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水)、碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、右旋糖或右旋糖酐)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂如EDTA或谷胱甘肽、佐剂(如氢氧化铝)、使得制剂与接受者血液等渗、低渗或轻微高渗的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。可选择地，本发明的组合物可以制成冷冻干燥制剂。

给予患者的寡聚核苷酸的量可以由医师根据各种因素容易地确定，所述因素包括如，疾病和由所使用的载体表达的寡聚核苷酸水平(在给予载体的情况下)。所给予的每剂量的量一般选择高于最小治疗剂量但低于中毒剂量。每剂量的量的选择将取决于许多因素，如患者的病史、其他疗法的使用以及疾病的性质。此外，所给予的量可以贯穿治疗调整，取决于患者对治疗的响应和任何治疗相关副作用的出现或严重性。

测定基因功能的方法

本发明进一步包括鉴别生物体中基因功能的方法，所述方法包括使用本发明的多核苷酸复合物或分子来抑制先前未知功能的靶基因的活性。代替通过传统基因筛选费时费力的分离突变体，通过使用本发明来测定未表征基因的功能基因组学设想以减少靶基因活性的量和/或改变靶基因活性的时机。本发明可以用于确定用于制药学的潜在靶，理解与发育相关的正常和病理事件，确定负责出生后发育/变老的信号通路等。从基因组和表达基因来源加速获取核苷酸序列信息，包括酵母、黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫基因组的全部序列，可以与本发明结合来测定生物体中的基因功能(如线虫)。优选不同生物体来使用特定密码子，搜索相关基因产物的序列数据库，关联遗传特征连锁图谱与核苷酸序列所源自的物理图谱，以及人工智能方法可以用于限定来自在这样的测序计划中已获取的核苷酸序列的假定开放阅读框。

在一个实施方案中，如为了测定基因的功能或生物学活性，基于获自表达序列标签(EST)的部分序列，将本发明的多核苷酸用于抑制基因表达。在生长、发育、代谢、抗病或其他生物学过程中的功能变化会指征EST的基因产物的正常作用。

可以将多核苷酸方便地引入包含靶基因的完整细胞/生物体允许将本发明用于高通量筛选(HTS)。例如，可以将含有能够抑制不同表达基因的多核苷酸的溶液按照有序排列放置于微量滴定板上定位的独立孔内，并且可以分析各孔内的完整细胞/生物体用于由于抑制靶基因活性在行为或发育中的任何变化或改变。可以从基因活性被抑制时其对完整细胞/生物体的影响来分析靶基因的功能。在一个实施方案中，将本发明的多核苷酸用于化学遗传学筛选，即检测化合物逆转通过利用本发明的多核苷酸减少基因表达模拟的疾病的能力。

若通过RFLP或QTL分析，生物体的特征被确定为与多态性遗传连锁，可以将本发明用于获得关于遗传多态性是否可以是直接造成所述特征的观点。例如，可以扩增限定遗传多态性的片段或邻近这样的遗传多态性的序列以产生RNA，可以将多核苷酸引入生物体，以及可以确定特征的改变是否与抑制相关联。

本发明在允许抑制必需基因中同样是有用的。这样的基因仅在发育的特定阶段或细胞区室对于细胞或生物体活力来说可能是必需的。何时或何处对于活力不是必需时，可以通过抑制靶基因的活性产生条件突变的功能等价物。本发明允许在生物体发育的特定时间和特定区域添加多核苷酸，而不会向靶基因组引入永久突变。同样地，本发明预期使用仅在期望时表达多核苷酸的诱导型或条件性载体。

本发明还涉及验证基因产物是否是用于药物发现或开发的靶的方法。将靶定基因的多核苷酸引入细胞或生物体，所述靶定基因相应于降解的基因。将细胞或生物体保持于发生基因降解的条件下，导致减少基因的表达。测定减少基因的表达是否对细胞或生物体有影响。若减少基因的表达有影响，那么基因产物就是用于药物发现或开发的靶。

设计和产生多核苷酸复合物和分子的方法

本发明的多核苷酸复合物和分子包括新颖独特的功能序列组，以使得采用含有一个或多个双链区(有时由茎-环或环结构邻接)的二级结构的方式排列，赋予多核苷酸的优势。因此，在某些实施方案中，本发明包括设计本发明的多核苷酸复合物和分子的方法。这样的方法一般包括适当选择多核苷酸复合物和分子的各种序列成分。术语“一级链”、“二级链”和“关键链”是指本发明的多核苷酸复合物或分子中存在的各种引导链。

在一个实施方案中，多核苷酸复合物的基本设计如下：

设计基序：

(一级链)(UU)(二级链)(UU)(关键链)(UU)

因此，在相关实施方案中，将多核苷酸设计如下：

II.(二级链)(UU)(UU)(关键链)(UU)(一级链)

III.(二级链)(UU)(环或茎-环)(关键链)(UU)(环或茎-环)(一级链)(UU)

设置参数

设置用于自身互补的seedsize大约38-43％。对于19个核苷酸靶，范围或7或8个核苷酸优选作为SEED_SIZE。

对于各基因，定义PRIMARY和SECONDARY靶基因。

定义PRIMARY链

从一个或多个靶基因序列开始。对于各基因，构造满足G/C含量、特异性和不含poly-A或poly-G标准的PRIMARY靶序列17-24个核苷酸基序的列表。对于每一种，还得到SECONDARY和KEY链。

得到SECONDARY和KEY链

d.对于各基因上的各靶序列，通过与SECONDARY基因各序列反向的SEED_SIZE聚类比对碱基1。

记录精确比对的序列。SECONDARY基因上的靶序列是比对起点，减去基序的长度，加上SEED_SIZE来比对起点，加上SEED_SIZE。SECONDARY链是反向互补的。

为得到各KEY链，定义SEED_A作为通过PRIMARY链的SEED_SIZE的碱基1，定义SEED_B作为基序长度减去SEED_SIZE至SECONDARY链的基序长度处的碱基。设置MID_SECTION作为长基序序列长度减去SEED_A长度加上SEED_B长度的重复的符号“丨”设置关键比对序列作为SEED_A、MID_SECTION、SEED_B。聚类比对用于关键区段的靶基因。记录KEY靶序列作为在关键靶基因上比对hit处的碱基至碱基比对hit加上基序长度。KEY链是反向互补的。

构建任选的多核苷酸

g.构造具有熔融温度在靶的相等长度区占优势的(4-24)个核苷酸的备选茎A&B。茎链具有A-T、G-C相互互补。长度和组合物取决于选择哪种内切核糖核酸酶用于预加工茎-环结构。

h.构造具有熔融温度在靶的相等长度区占优势的(4-24)个核苷酸的备选茎C&D。茎链具有A-T、G-C相互互补，但是不与茎A&B互补。长度和组合物取决于选择哪种内切核糖核酸酶用于预加工茎-环结构。

i.构造具有(4-12)个富含A-T的核苷酸至环A&B的环备选物。长度和组合物取决于选择哪种内切核糖核酸酶用于预加工茎-环结构。建议所描述的四环用于由RNaseIII或Pac1RNaseIII内切核糖核酸酶加工更长的茎，如(图A)所示。建议更大的环用于防止RNaseIII或Pac1加工并放在更短的茎上，如(图C，图D)所示。

j.形成用于各基序备选物的邻近序列。

k.利用具有期望参数的软件折叠备选序列。

l.从输出，定位具有单链靶区的结构，其任意一端或两端具有期望的茎/环结构加侧翼。

在一个实施方案中，设计包含用于调节靶基因(即多核苷酸)表达的一个或多个自身互补区的多核苷酸序列的方法包括：(a)选择长度为17至30个核苷酸并且与靶基因互补的第一序列；以及(b)选择长度为12至54个核苷酸的一个或多个另外的序列，其包含自身互补区并且不与第一序列互补。

在某些实施方案中，这些方法包括确定或预测由步骤(b)所选择的序列采用的二级结构，例如为了确定它们能够采用茎-环结构。

同样地，这些方法可以包括验证步骤，其中包括如在体内或体外测试系统中，测试所设计的多核苷酸序列抑制靶基因表达的能力。

本发明进一步预期基于本文所述的互补特征，应用计算机程序来选择多核苷酸序列。因此，本发明提供用于选择多核苷酸序列的计算机软件程序和包含所述软件程序的计算机可读媒介，以及含有一种本发明程序的计算机。

在某些实施方案中，使用者提供具有关于序列、位点或靶基因名称信息的计算机。所述计算机使用此输入本发明的程序来鉴别靶定的靶基因的一个或多个适当的区，并且输出或提供在本发明的多核苷酸中使用的互补序列。然后计算机程序使用该序列信息来选择多核苷酸的一个或多个自身互补区的序列。一般，所述程序将选择不与基因组序列互补的序列，所述基因组序列包括靶基因或与靶基因互补的多核苷酸的区。此外，所述程序将选择相互之间不互补的自身互补区的序列。当期望时，程序还提供缺口区的序列。在选择适当的序列时，计算机程序向使用者输出或提供该信息。

本发明的程序可以进一步使用输入关于含有靶基因的生物体的基因组序列，如公共或私营数据库，以及预测特定序列的二级结构和/或杂交特性的其他程序，以保证多核苷酸采用正确的二级结构并且不与非靶基因杂交。

本发明部分基于令人惊奇的发现，如本文所述的多核苷酸非常有效的减少一个或多个基因的靶基因表达。多核苷酸提供优于以前所述的反义RNA的重要优势，包括增加潜力和增强对多靶基因的效力。此外，本发明的多核苷酸提供优于用于siRNA的传统dsRNA分子的额外优势，因为多核苷酸的使用基本上消除了与dsRNA分子相关的脱靶阻抑并且提供多价RNAi。

可理解的是可以将本发明的组合物和方法用于靶定各种不同的靶基因。术语“靶基因”可以指基因、mRNA或microRNA。因此，本文提供的靶序列可以描述为DNA序列或RNA序列。本领域技术人员将理解的是，本发明的组合物可包括与本文提供的DNA或RNA序列互补的区。因而，无论提供DNA或RNA靶序列，可理解的是同样可以分别靶定相应的RNA或DNA靶序列。

本发明的实施将使用本领域技术内的细胞生物学、分子生物学、微生物学和重组DNA的各种常规技术。这样的技术已完整描述于文献中。参见例如，MolecularCloning：ALaboratoryManual(分子克隆实验手册)，第二版，Sambrook，Fritsch和Maniatis编(ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)；以及DNACloning(DNA克隆)，VolumesIandII(D.N.Glover编.1985)。

本文引用的全部专利、专利申请和非专利文献整体引入作为参考，正如每一个都独立地引入作为参考。

可以将以上所描述的各种实施方案组合以提供进一步的实施方案。在本说明书引用和/或列于申请记录表的全部美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物在此整体引入作为参考。实施方案方面可以变化，若必要的话使用各种专利、申请和出版物的概念以提供更进一步的实施方案。

根据以上详细说明可以对实施方案进行这些和其他改变。总的来说，以下权利要求中所使用的术语不应当解释为限制要求说明书和权利要求中公开的具体实施方案，而应当解释为包括全部可能的实施方案连同这样的权利要求给予权利的等价物的完整范围。因此，权利要求并不受公开内容所限制。

实施例

实施例1

TRIVOID抗-GFP

针对单个基因——绿色荧光蛋白(GFP)设计多价siRNA。测试针对GFP的多价合成的RNAMV-siRNA复合物来与单shRNA克隆相比，比较阻抑活性。此外，为测试失活合成的MV-siRNA复合物的一条链的作用，一条链用DNA(T1-19_C_dna)取代；如以下所示。该取代导致阻抑相对下降约30％。此外，测试本文所述的MV-siRNA自身互补克隆的“短”和“长”形式，并与已公开的shRNA克隆相比，比较GFP表达的阻抑。

以下表1给出合成的MV-siRNA的低聚物序列以及DNA取代链。

图8A示出GFP编码序列的靶定区。

表1合成的MV-siRNA的寡核苷酸

名称	序列	SEQ ID NO：
			TI-19/7A	GGGCAGCUUGCCGGUGGUGUU	11
TI-19/7B	CACCACCCCGGUGAACAGCUU	12
			TI-19/7C	GCUGUUCACGUCGCUGCCCUU	13
TI-19/7C dna	GCTGTTCACGTCGCTGCCC	14

为制备合成的多价-siRNA(MV-siRNA)，将以上独立的寡核苷酸的各试管重悬于不含RNase的水中，以获得50μM(50pmoles/μL)的终浓度。然后将独立的寡核苷酸作为(a)Tl-19/7_A，Tl-19/7_B和Tl-19/7_C(MV-siRNAGFP_l)或作为(b)Tl-19/7_A，Tl-19/7_B和Tl-19/7_C_dna(MV-siRNAGFPlDNA)组合，并且如下退火：将30μL的每一种重悬的寡聚核苷与10μL的10倍退火缓冲液组合(100mMTris-HClpH7.5，1MNaCl，10mMEDTA)，旋涡混合，于94℃加热5分钟，并在30分钟内逐步冷却至70℃。退火的MV-siRNA的终浓度是约15μM。

为制备多价-siRNA克隆和shRNA对照，依照pSUPER手册，将以下表2中的序列克隆至pSUPER载体。用于各指定克隆(如Tl、T1_long、Tll)的第一序列代表自身互补多价siRNA的序列，其在细胞中表达为RNA转录本(与表1中合成的MV-siRNA序列相比)，并且被称为“_as”的序列是该分子的编码序列部分。

表2MV-siRNA表达克隆的寡核苷酸

为测试对GFP-表达的作用，用Lipofectamine2000将退火的MV-siRNA分子(每孔终浓度7.5nM)和含有MV-siRNA克隆或shRNA对照的pSUPER载体转染至293细胞，其组成型表达GFP。转染之后24小时，通过流式细胞仪测量GFP荧光。

一个实验的结果在以下表3中给出并总结于图7A中。在图7A中，与shRNA对照(该图中被称为“siRNA”)相比，MV-siRNAlongl和longll克隆显示显著增强阻抑GFP活性。

表3

孔	转染的：	平均荧光	％GFP
				阳性shRNA	shRNA	330	66％
	shRNA	302	60％
				合成的：	MV-siRNA	305	61％
克隆：	MV-siRNA short TI	360	72％
					MV-siRNA long TI	218	43％
	MV-siRNA long TII	245	49％
				阴性	空白	502	100％
	非-GFP 293细胞	0.5	0％

图7B给出与shRNA克隆(该图中被称为“siRNA”)相比，合成的MV-siRNAGFPl复合物显示增强阻抑GFP活性的实验结果。然而，当一条链用DNA取代时，对于MV-siRNAGFPl复合物的阻抑活性稍微减小，如对于合成的MV-siRNAGFPlDNA复合物所示。

定向GFP的示例性合成的MV-siRNA还可以如以下表4设计，其中T1.A-C的3个寡核苷酸可以如以上所述退火。同样地，T2.A-C的3个寡核苷酸可以如以上所述退火。

表4示例性合成的siRNA组T1和T2

名称	序列	SEQ ID NO：
			T1.A	CUGCUGGUAGUGGUCGGCGUU	25
T1.B	CGCCGACUUCGUGACGUGCUU	26
			T1.C	GCACGUCGCCGUCCAGCAGUU	27
T2.A	GUUGCCGUCGUCCUUGAAGUU	28
			T2.B	CUUCAAGUGGAACUACGGCUU	29
T2.C	GCCGUAGGUAGGCGGCAACUU	30

定向GFP的MV-siRNA克隆还可以如以下表5设计。如上所述，这些序列可以克隆至pSuper载体或任何其他载体系统。

表5示例性MV-siRNA克隆

实施例2

TRIVOID抗-HIV

可以设计多价siRNA对抗无关位点处的多基因。在本实施例中，测试克隆的MV-siRNA对抗HIV。这些结果显示对抗HIV的Gag和Tat(hv_sB)基因的二价MV-siRNA分子比单独定向对抗Gag(hv_s)的siRNA显著更有效地抑制HIV复制。

依照制造商指南，将表6中给出的寡核苷酸克隆至pSUPER.neo+gfp载体。hv_s仅靶定Gag，而hv_sB靶定Gag和Tat。

表6抗-HIVMV-siRNA克隆

将编码MV-siRNA克隆的载体构建体转染至细胞，并且用具有1.0的MOI的HIV-1(pNL4.3菌株)感染后10天和40天进行分析。图9给出转染后10天，由靶定Gag和Tat的MV-siRNA抑制HIV复制比由仅靶定Gag的siRNA分子抑制更强约3倍。

可以将多价siRNA设计成靶定1、2或3个不同的HIV基因。图10提供了示例性HIV基因组序列。图11提供了env基因序列，图12A提供了gag基因，以及图12B提供了tat基因。通常可以如下由它们的核苷酸序列范围定义和靶定HIV的各种基因或区：5’LTR：1-181；GAG：336-1838；POL：1631-4642；VIF：4587/4662-5165；VPR：5105-5395(包括5157、5266和5297处突变)；TAT：5376-7966；REV：5515-8195；VPU：5607-5852；ENV：5767-8337；NEF：8339-8959；以及3’LTR：8628-9263。基于这些靶基因，以下表7提供了HIV的示例性MV-RNA寡核苷酸序列。

表7示例性三价MV-siRNA序列

No.	序列	靶基因	SEQ ID NO：
				1	GCCUUCCCUUGUGGGAAGGUU	1649	47
2	CCUUCCCUUGUGGGAAGGCUU	1648	48
				3	GCCUUCCUUGUGGGAAGGCUU	1648	49

				4	UUCUGCACCUUACCUCUUAUU	6259	50

No.	序列	靶基因	SEQ ID NO：
				5	UAAGAGGAAGUAUGCUGUUUU	4062	51
6	AACAGCAGUUGUUGCAGAAUU	5291	52

7	CCAGACAAUAAUUGUCUGGUU	7387	53
				8	CCAGACAAUAAUUGUCUGGUU	7387	53
9	CCAGACAAUAAUUGUCUGGUU	7387	53

10	CUCCCAGGCUCAGAUCUGGUU	16	54
				11	CCAGAUCUUCCCUAAAAAAUU	1630	55
12	UUUUUUAUCUGCCUGGGAGUU	7011	56

13	UGGGUUCCCUAGUUAGCCAUU	40	57
				14	UGGCUAAGAUCUACAGCUGUU	8585	58
15	CAGCUGUCCCAAGAACCCAUU	7325	59

16	AUCCUUUGAUGCACACAAUUU	591	60
				17	AUUGUGUCACUUCCUUCAGUU	6988	61
18	CUGAAGGAAGCUAAAGGAUUU	1785	62

19	UCCUGUGUCAGCUGCUGCUUU	685	63

No.	序列	靶基因	SEQ ID NO：
				20	AGCAGCAUUGUUAGCUGCUUU	8481	64
21	AGCAGCUUUAUACACAGGAUU	9046	65

22	ACCAACAAGGUUUCUGUCAUU	1284	66
				23	UGACAGAUCUAAUUACUACUU	6573	67
24	GUAGUAAUUAUCUGUUGGUUU	6311	68

25	CUGAGGGAAGCUAAAGGAUUU	1785	69
				26	AUCCUUUGAUGCACACAAUUU	591	60
27	AUUGUGUCACUUCCCUCAGUU	6988	61

28	CAAAGCUAGAUGAAUUGCUUU	3534	70
				29	AGCAAUUGGUACAAGCAGUUU	5432	71
30	ACUGCUUGUUAGAGCUUUGUU	2952	72

31	AGGUCAGGGUCUACUUGUGUU	4872	73
				32	CACAAGUGCUGAUAUUUCUUU	5779	74
33	AGAAAUAAUUGUCUGACCUUU	7384	75

34	CUAAGUUAUGGAGCCAUAUUU	5212	76

No.	序列	靶基因	SEQ ID NO：
				35	AUAUGGCCUGAUGUACCAUUU	758	77
36	AUGGUACUUCUGAACUUAGUU	4736	78

37	UGGCUCCAUUUCUUGCUCUUU	5365	79
				38	AGAGCAACCCCAAAUCCCCUU	7544	80
39	GGGGAUUUAGGGGGAGCCAUU	4191	81

40	AUCUCCACAAGUGCUGAUAUU	5784	82
				41	UAUCAGCAGUUCUUGAAGUUU	8942	83
42	ACUUCAAAUUGUUGGAGAUUU	8158	84

43	AGACUGUGACCCACAAUUUUU	5862	85
				44	AAAUUGUGGAUGAAUACUGUU	4310	86
45	CAGUAUUUGUCUACAGUCUUU	499	87

46	ACAGGCCUGUGUAAUGACUUU	6362	88
				47	AGUCAUUGGUCUUAAAGGUUU	8559	89
48	ACCUUUAGGACAGGCCUGUUU	6371	90

49	UCAGUGUUAUUUGACCCUUUU	6973	91

No.	序列	靶基因	SEQ ID NO：
				50	AAGGGUCUGAGGGAUCUCUUU	135	92
51	AGAGAUCUUUCCACACUGAUU	158	93

52	CAUAGUGCUUCCUGCUGCUUU	7337	94
				53	AGCAGCAUUGUUAGCUGCUUU	8481	95
54	AGCAGCUAACAGCACUAUGUU	8190	96

55	GCUGCUUAUAUGCAGGAUCUU	9044	97
				56	GAUCCUGUCUGAAGGGAUGUU	531	98
57	CAUCCCUGUUAAAAGCAGCUU	7118	99

58	UGGUCUAACCAGAGAGACCUU	9081	100
				59	GGUCUCUUUUAACAUUUGCUU	928	101
60	GCAAAUGUUUUCUAGACCAUU	7557	102

61	CUCCCAGGCUCAGAUCUGGUU	9097	103
				62	CCAGAUCUUCCCUAAAAAAUU	1630	55
63	UUUUUUAUCUGCCUGGGAGUU	7011	56

64	UGGGUUCCCUAGUUAGCCAUU	9121	104

No.	序列	靶基因	SEQ ID NO：
				65	UGGCUAAGAUCUACAGCUGUU	8585	58
66	CAGCUGUCCCAAGAACCCAUU	7325	59

为由以上表7的序列制备靶定HIV的MV-siRNA复合物，可以将独立的寡核苷酸如下组合和退火：1)MV-siRNA_1649/1648/1648；退火序列1&2和3。2)MV-siRNA_6259/4062/5291；退火序列4&5和6。3)MV-siRNA_7387/7387/7387；退火序列7&8和9。4)MV-siRNA_16/1630/7011；退火序列10&11和12。5)MV-siRNA_40/8585/7325；退火序列13&14和15。6)MV-siRNA_591/6988/1785；退火序列16&17和18。7)MV-siRNA_685/8481/9046；退火序列19&20和21。8)MV-siRNAJ284/6573/6311；退火序列21&22和23。9)MV-siRNA_1785/591/6988；退火序列24&25和26。10)MV-siRNA_3534/5432/2952；退火序列27&28和29。11)MV-siRNA_4872/5779/7384；退火序列30&31和32。12)MV-siRNA_5212/758/4736；退火序列33&34和35。13)MV-siRNA_5365/7544/4191；退火序列36&37和38。14)MV-siRNA_5784/8942/8158；退火序列39&40和41。15)MV-siRNA_5862/4310/499；退火序列42&43和44。16)MV-siRNA_6362/8559/6371；退火序列45&46和47。17)MV-siRNA_6973/135/158；退火序列48&49和50。18)MV-siRNA_7337/8481/8190；退火序列51&52和53。19)MV-siRNA_9044/531/7118；退火序列54&55和56；20)MV-siRNA_9081/928/7557；退火序列57&58和59。21)MV-siRNA_9097/1630/7011；退火序列60&61和62。22)MV-siRNA9121/8585/7325；退火序列63&64和65。

实施例3

TRIVOID抗-ApoB

通过靶定单基因的2-3个位置，可以将多价siRNA设计为阻抑大基因。MV-siRNA还可以使用可选择的RNA化学物质来提高退火过程中的Tm。在本实施例中，如以下表8所示，设计一系列MV-siRNA来靶定载脂蛋白B(ApoB)基因，并且括号内显示存在的任选2’-O甲基RNA亚单位。

表8ApoB的三价MV-siRNA

No.	序列	靶基因	SEQ ID NO：
				1	(UGGAACU)UUCAGCUUCAUAUU	ApoB268	105
2	(UAUGAAG)GCACCAUGAUGUUU	ApoB9905	106
				3	(ACAUCAU)CUUCC(AGUUCCA)UU	ApoB1703	107
4	(ACUCUUC)AGAGUUCUUGGUUU	ApoB448	108
				5	(ACCAAGA)CCUUGGAGACACUU	ApoB2288	109
6	(GUGUCUC)AGUUG(GAAGAGU)UU	ApoB6609	110
				7	(ACCUGGA)CAUGGCAGCUGCUU	ApoB469	111
8	(GCAGCUG)CAAACUCUUCAGUU	ApoB458	112
				9	(CUGAAGA)CGUAU(UCCAGGU)UU	ApoB12263	113
10	(CAGGGUA)AAGAACAAUUUGUU	ApoB520	114
				11	(CAAAUUG)CUGUAGACAUUUUU	ApoB4182	115
12	(AAAUGUC)CAGCG(UACCCUG)UU	ApoB12548	116
				13	(CCCUGGA)CACCGCUGGAACUUUU	ApoB279	117
14	(AAGUUCC)AAUAACUUUUCCAUUU	ApoB9161	118

No.	序列	靶基因	SEQ ID NO：
				15	(AUGGAAA)AGGCAAG(UCCAGGG)UU	ApoB9968	119
16	(CCCUGGA)CACCGCUGGAACUUUUU	ApoB278	120
				17	(AAAGUUC)CAAUAACUUUUCCAUUU	ApoB9161	121
18	(AUGGAAA)AUGGCAAG(UCCAGGG)UU	ApoB9968	122

为由以上表8的序列制备合成的MV-siRNA三价复合物，可以将独立的寡核苷酸如以下组合和退火：1)MV-siRNA_268/9950/1703；退火序列1&2，然后3。2)MV-siRNA_448/2288/6609；退火序列4&5，然后6。3)MV-siRNA_469/458/12263；退火序列7&8，然后9。4)MV-siRNA_520/4182/12548；退火序列10&11，然后12。5)MV-siRNA_279/9161/9986；退火序列13&14；然后15。6)MV-siRNA_278/9161/9986；退火序列16&17，然后18。

设计具有有效一级和二级链的多价siRNA还可以使用摆动或通用碱基来完成靶互补，或平端DNA来失活沉默任何靶的链。以下表9给出涉及ApoB的示例性寡核苷酸，其中(^*)表示任选的摆动或通用碱基。

表9ApoB的示例性二价MV-siRNA

No.	序列	靶基因	SEQ ID NO：
				19	UGAAUCGAGUUGCAUCUUUUU	ApoB223	123
20	AAAGAUGCUGCUCAUCACAUU	ApoB883	124
				21	UGUGAUGACACUCGAUUCAUU	ApoB10116(G/A对)	125
22	U UGAUACACUCGAUUCAUU	ApoB10116(通用碱基)	126
				23	TGTGATGACACTCGATTCA	无效10116	127
24	CAGCUUGAGUUCGUACCUGUU	ApoB483	128

No.	序列	靶基因	SEQ ID NO：
				25	CAGGUACAGAGAACUCCAAUU	ApoB11596	129
26	UUGGAGUCUGACCAAGCUGUU	ApoB2454	130
				27	UUGGAGUCUGACAAGCUUU	ApoB2454	131
28	TTGGAGTCTGACCAAGCTG	无效2454	132

为由以上表9的序列制备合成的MV-siRNA二价复合物，可以将独立的寡核苷酸如以下组合和退火：7a)MV-siRNA_223/883/10116)；退火序列19、20和21。7b)MV-siRNA_223/883/10116^*)；退火序列19、20和22。7c)MV-siRNA_223/883/无效)；退火序列19、20和23。8a)MV-siRNA_483/11596/2454)；退火序列24、25和26。8b)MV-siRNA_483/11596/2454^*)；退火序列24、25和26。8c)MV-siRNA_483/11596/无效)；退火序列24、25和26。

通过靶定单基因的2-3个位置，还可以将多价-siRNA设计为阻抑大基因。如以上所述，瞬时MV-siRNA的某些实施方案还可以使用可选择的RNA化学物质来提高退火过程中的Tm。在以下表10中，括号内显示任选的2’-O甲基RNA2’-氟碱基。其他可选择的碱基例子中，如果期望的话，5-甲基还可以增加MV-siRNA结构的Tm。

表10ApoB的示例性三价MV-siRNA

No.	序列	靶基因	SEQ ID NO：
				1	UGG(AA)CUUUCAGCUUCAUAUU	ApoB268	105
2	U(AU)GAAGGCACCAUGAUGUUU	ApoB9905	106
				3	(ACAUCAU)CUUCCAGUUCCAUU	ApoB1703	107
4	AC(U)CUUCAGAGUUCUUGGUUU	ApoB448	108

为由以上表10中的序列制备合成的MV-siRNA二价复合物，可以将独立的寡核苷酸如以下组合和退火：1)MV-siRNA_268/9950/1703；退火序列1&2，然后3。2)MV-siRNA_448/2288/6609；退火序列4&5，然后6。3)MV-siRNA_469/458/12263；退火序列7&8，然后9。4)MV-siRNA_520/4182/12548；退火序列10&11，然后12。5)MV-siRNA_279/9161/9986；退火序列13&14，然后15。6)MV-siRNA_278/9161/9986；退火序列16&17，然后18。7)MV-siRNA_6427/8144/12831；退火序列19&20，然后21。7b)MV-siRNA_6427/8144/12831；退火链22，然后剪切磷酸酯和氢氧化铵的连接。7b)MV-siRNA_6427/8144/12831；退火链22，然后用300-350nm光谱范围的UV光剪切PCspacer。

在某些实施方案中，设计具有有效一级和二级链的多价-siRNA可以使用摆动、间隔区或无碱基的(abasic)碱基类型(例子在以下表11显示为(^*))来完成靶互补，或平端DNA来失活沉默任何靶的链。在一些实施方案中，UNA、亚磷酰胺接头、rSpacer、5-硝基吲哚可以用作有效的无碱基的碱基取代错配的核苷酸。若期望，使用无碱基的碱基可导致减小Tm和/或围绕无碱基位点的嘧啶可利用2’-氟碱基按每个2’-氟碱基提高Tm约2度。

表11靶定ApoB的示例性MV-siRNA

为由以上表11的序列制备合成的MV-siRNA二价复合物，可以将独立的寡核苷酸如以下组合和退火：7a)MV-siRNA_223/883/10116)；退火序列23、24和25。7b)MV-siRNA_223/883/10116^*)；退火序列23、24和26。7c)MV-siRNA_223/883/无效)；退火序列23、24和27。8a)MV-siRNA_483/11596/2454)退火序列28，29和30。8b)MV-siRNA_483/11596/2454^*)；退火序列28、29和31。8c)MV-siRNA_483/11596/无效)；退火序列28、29和32。9)MV-siRNA_9244/1958/8005)；退火序列33、34和35。9b)MV-siRNA_9244/1958/8005)；退火序列33、34和36。10)MV-siRNAJ0439/9244/2284)；退火序列37、38和39。10b)MV-siRNAJ0439/9244/2284)；退火序列37、38和40。11)MV-siRNA_452/11588/9244)；退火序列41、42和43。11b)MV-siRNA_452/11588/9244)；退火序列41、42和44。

如以上表12示例，多价siRNA可以靶定对抗人ApoB。二价MV-siRNA可以具有对各链结构和靶互补性的各种耐受功能。

表12示例性靶定人ApoB的多价-siRNA

No.	序列	ApoB基因位点	SEQ ID NO：
				1	CUUCAUCACUGAGGCCUCUUU	1192	148
2	AGAGGCCAAGCUCUGCAUUUU	5140	149
				3	AAUGCAGAUGAAGAUGAAGAA	10229	150

				4	UUCAGCCUGCAUGUUGGCUUU	2724	151
5	AGCCAACUAUACUUGGAUCUU	13294	152
				6	GAUCCAAAAGCAGGCUGAAGA	4960	153

				7	CCCUCAUCUGAGAAUCUGGUU	8927	154

No.	序列	ApoB基因位点	SEQ ID NO：
				8	CCAGAUUCAUAAACCAAGUUU	9044	155
9	ACUUGGUGGCCCAUGAGGGUU	3440	156

10	UCAAGAAUUCCUUCAAGCCUU	9595	157
				11	GGCUUGAAGCGAUCACACUUU	758	158
12	AGUGUGAACGUAUUCUUGAUU	4367	159

13	UUGCAGUUGAUCCUGGUGGUU	344	160
				14	CCACCAGGUAGGUGACCACUU	1354	161
15	GUGGUCAGGAGAACUGCAAUU	2483	162

16	CCUCCAGCUCAACCUUGCAUU	358	163
				17	UGCAAGGUCUCAAAAAAUGUU	6341	164
18	CAUUUUUGAUCUCUGGAGGUU	4043	165

19	CAGGAUGUAAGUAGGUUCAUU	570	166
				20	UGAACCUUAGCAACAGUGUUU	5687	167
21	ACACUGUGCCCACAUCCUGUU	9109	168

22	GGCUUGAAGCGAUCACACUUU	758	169

No.	序列	ApoB基因位点	SEQ ID NO：
				23	AGUGUGAACGUAUUCUUGUUU	4367	170
24	ACAAGAAUUCCUUCAAGCCUU	9595	171

25	UGAAGAGAUUAGCUCUCUGUU	1153	172
				26	CAGAGAGGCCAAGCUCUGCUU	5143	173
27	GCAGAGCUGGCUCUCUUCAUU	10304	174

28	CUCAGUAACCAGCUUAUUGUU	1170	175
				29	CAAUAAGAUUUAUAACAAAUU	7084	176
30	UUUGUUAUCUUAUACUGAGUU	9650	177

31	GAACCAAGGCUUGUAAAGUU U	1258	178
				32	ACUUUACAAAAGCAACAAUUU	6286	179
33	AUUGUUGUUAAAUUGGUUCUU	6078	180

34	CAGGUAGGUGACCACAUCUUU	1350	181
				35	AGAUGUGACUGCUUCAUCAUU	1203	182
36	UGAUGAACUGCGCUACCUGUU	8486	183

37	CCAGUCGCUUAUCUCCCGGUU	1786	184

No.	序列	ApoB基因位点	SEQ ID NO：
				38	CCGGGAGCAAUGACUCCAGUU	2678	185
39	CUGGAGUCAUGGCGACUGGUU	2486	186

40	UGGAAGAGAAACAGAUUUGUU	2046	187
				41	CAAAUCUUUAAUCAGCUUCUU	2403	188
42	GAAGCUGCCUCUUCUUCCAUU	12299	189

43	AUCCAAAGGCAGUGAGGGUUU	2152	190
				44	ACCCUCAACUCAGUUUUGAUU	12242	191
45	UCAAAACCGGAAUUUGGAUUU	3316	192

46	UAGAGACACCAUCAGGAACUU	2302	193
				47	GUUCCUGGAGAGUCUUCAAUU	1102	194
48	UUGAAGAAUUAGGUCUCUAUU	1153	195

49	GCUCAUGUUUAUCAUCUUUUU	2350	196
				50	AAAGAUGCUGAACUUAAAGUU	7622	197
51	CUUUAAGGGCAACAUGAGCUU	2863	198

52	GGAGCAAUGACUCCAGAUGUU	2675	199

No.	序列	ApoB基因位点	SEQ ID NO：
				53	CAUCUGGGGGAUCCCCUGCUU	2544	200
54	GCAGGGGAGGUGUUGCUCCUU	912	201

55	UCACAAACUCCACAGACACUU	2761	202
				56	GUGUCUGCUUUAUAGCUUGUU	5672	203
57	CAAGCUAAAGGAUUUGUGAUU	9683	204

58	GCAGCUUGACUGGUCUCUUUU	2914	205
				59	AAGAGACUCUGAACUGCCCU U	4588	206
60	GGGCAGUGAUGGAAGCUGCUU	8494	207

61	CAGGACUGCCUGUUCUCAAUU	2996	208
				62	UUGAGAACUUCUAAUUUGGUU	8522	209
63	CCAAAUUUGAAAAGUCCUGUU	9855	210

64	UGUAGGCCUCAGUUCCAGCUU	3132	211
				65	GCUGGAAUUCUGGUAUGUGUU	8335	212
66	CACAUACCGAAUGCCUACAUU	9926	213

67	GACUUCACUGGACAAGGUCUU	3300	214

No.	序列	ApoB基因位点	SEQ IE NO：
				68	GACCUUGAAGUUGAAAAUGUU	5301	215
69	CAUUUUCUGCACUGAAGUCUU	11983	216

70	AAGCAGUUUGGCAGGCGACUU	3549	217
				71	GUCGCCUUGUGAGCACCACUU	5039	218
72	GUGGUGCCACUGACUGCUUUU	12521	219

73	CAGAUGAGUCCAUUUGGAGUU	3568	220
				74	CUCCAAACAGUGCCAUGCCUU	9142	221
75	GGCAUGGAGCCUUCAUCUGUU	3256	222

76	CACAGACUUGAAGUGGAGGUU	4086	223
				77	CCUCCACUGAGCAGCUUGAUU	2924	224
78	UCAAGCUUCAAAGUCUGUGUU	974	225

79	AUGGCAGAUGGAAUCCCACUU	4102	226
				80	GUGGGAUCACCUCCGUUUUUU	2971	227
81	AAAACGGUUUCUCUGCCAUUU	12836	228

82	UGAUACAACUUGGGAAUGGUU	4148	229

No.	序列	ApoB基因位点	SEQ ID NO：
				83	CCAUUCCCUAUGUCAGCAUUU	2971	230
84	AUGCUGACAAAUUGUAUCAUU	12836	231

为由以上表12的序列制备合成的MV-siRNA二价复合物，可以将独立的寡核苷酸如下组合和退火：MV-siRNA；退火序列1、2和3。MV-siRNA；退火序列4、5和6。MV-siRNA；退火序列7、8和9。MV-siRNA；退火序列10、11和12。MV-siRNA；退火序列13、14和15。MV-siRNA；退火序列16、17和18。MV-siRNA；退火序列19、20和21。MV-siRNA；退火序列22、23和24。MV-siRNA；退火序列25、26和27。MV-siRNA；退火序列28、29和30。MV-siRNA；退火序列31、32和33。MV-siRNA；退火序列34、35和36。MV-siRNA；退火序列37、38和39。MV-siRNA；退火序列40、41和42。MV-siRNA；退火序列43、44和45。MV-siRNA；退火序列46、47和48。MV-siRNA；退火序列49、50和51。MV-siRNA；退火序列52、53和54。MV-siRNA；退火序列55、56和57。MV-siRNA；退火序列58、59和60。MV-siRNA；退火序列61、62和63。MV-siRNA；退火序列64、65and66。MV-siRNA；退火序列67、68和69。MV-siRNA；退火序列70、71和72。MV-siRNA；退火序列73、74和75。MV-siRNA；退火序列76、77和78。MV-siRNA；退火序列79、80和81。MV-siRNA；退火序列82、83和84。

可以将定向ApoB的MV-siRNA用于治疗或管理各种广泛的与靶蛋白表达相关的疾病或病症，如本文所述和本领域内已知。

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28.NoncatalyticassemblyofhbonucleaseIIIwithdouble-strandedRNA.[Structure.2004]

29.IntermediatestatesofribonucleaseIIIincomplexwithdouble-strandedRNA.[Structure.2005]

30.ReviewStructuralbasisfornon-catalyticandcatalyticactivitiesofribonucleaseIII.[ActaCrystallogrDBiolCrystallogr.2006]

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33.Astepwisemodelfordouble-strandedRNAprocessingbyribonucleaseIII.[MoIMicrobiol.2008]

34.Review：ThemechanismofRNaseIIIaction：howdicerdices.[CurrTopMicrobiolImmunol.2008].

Claims

1.由以下组成的多核苷酸复合物：

(a)第一多核苷酸，其由与第一靶序列互补的靶特异性区、第一5’区和第一3’区组成，其中所述5’区、3’区或两者任选地与第一靶序列具有全部或部分的互补性；

(b)第二多核苷酸，其由与第二靶序列互补的靶特异性区、第二5’区和第二3’区组成，其中所述5’区、3’区或两者任选地与第二靶序列具有全部或部分的互补性；以及

(c)第三多核苷酸，其由与第三靶序列互补的靶特异性区、第三5’区和第三3’区组成，其中所述5’区、3’区或两者任选地与第三靶序列具有全部或部分的互补性；

其中所述第一、第二和第三靶特异性区与不同的靶序列互补，

其中所述第一多核苷酸的第一5’区与所述第三多核苷酸的第三3’区互补，

其中所述第一多核苷酸的第一3’区与所述第二多核苷酸的第二5’区互补，以及

其中所述第二多核苷酸的第二3’区与所述第三多核苷酸的第三5’区互补，

其中所述三个分开的多核苷酸通过它们互补的3’区和5’区杂交以形成具有第一、第二和第三单链区以及第一、第二和第三自身互补区的多核苷酸复合物；并且

其中所述多核苷酸复合物不含任何非靶定链。

2.由以下组成的多核苷酸复合物：

(a)第一核苷酸序列，其由与第一靶序列互补的靶特异性区、第一5’区和第一3’区组成，其中所述第一5’区、第一3’区或两者任选地与第一靶序列具有全部或部分的互补性；

(b)第二核苷酸序列，其由与第二靶序列互补的靶特异性区、第二5’区和第二3’区组成，其中所述第二5’区、第二3’区或两者任选地与第二靶序列具有全部或部分的互补性；以及

(c)第三核苷酸序列，其由无效区、第三5’区和第三3’区组成；

其中所述第一和第二靶特异性区与不同的靶序列互补，

其中所述第一核苷酸序列的第一5’区与所述第三核苷酸序列的第三3’区互补，

其中所述第一核苷酸序列的第一3’区与所述第二核苷酸序列的第二5’区互补，以及

其中所述第二核苷酸序列的第二3’区与所述第三核苷酸序列的第三5’区互补，

其中所述5’区各自与它们互补的3’区杂交以形成具有第一、第二和第三单链区以及第一、第二和第三自身互补区的自身杂交多核苷酸分子；并且

其中所述多核苷酸复合物不含任何非靶定链。

3.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中所述第一、第二和/或第三多核苷酸由15-30个核苷酸组成。

4.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中所述第一、第二和/或第三多核苷酸由17-25个核苷酸组成。

5.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中所述一个或多个自身互补区由5-10个核苷酸对组成。

6.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中所述一个或多个自身互补区由7-8个核苷酸对组成。

7.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中所述第三多核苷酸由与第三靶序列互补的靶特异性区组成。

8.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中所述靶特异性区各自与不同的靶序列互补。

9.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中所述靶序列中的每个存在于相同的基因、cDNA、mRNA或microRNA中。

10.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中所述靶序列存在于不同的基因、cDNA、mRNA或microRNA中。

11.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中所述自身互补区包含3’突出。

12.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中所述第一、第二或第三核苷酸序列由15-60个核苷酸组成。

13.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中所述靶特异性区各自包含约15-30个核苷酸。

14.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中所述一个或多个自身互补区包含约10-54个核苷酸。

15.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中所述一个或多个自身互补区包含3’突出。

16.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中所述一个或多个自身互补区形成茎-环结构。

17.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中所述一个或多个自身互补区包含位于所述靶特异性区之外的二核苷酸AG/UU近端盒。

18.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中所述一个或多个自身互补区包含位于所述靶特异性区之外的四核苷酸远端盒，其中所述远端盒的第三个核苷酸不是G。

19.编码权利要求1或2所述的多核苷酸复合物的载体。

20.减少基因表达的体外方法，所述方法包括将权利要求1至18中任一项所述的多核苷酸复合物或权利要求19所述的载体引入细胞。

21.权利要求1至18中任一项所述的多核苷酸复合物或权利要求19所述的载体在制备用于减少基因表达的药物中的用途。

22.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中靶特异性区中的每个与HIV基因的mRNA转录本的不同靶区互补。

23.如权利要求19所述的载体，其中靶特异性区中的每个与HIV基因的mRNA转录本的不同靶区互补。

24.如权利要求21所述的用途，其中靶特异性区中的每个与HIV基因的mRNA转录本的不同靶区互补。

25.如权利要求1或2所述的多核苷酸复合物，其中靶特异性区中的每个与人载脂蛋白B(ApoB)基因的mRNA转录本的不同靶区互补。

26.如权利要求19所述的载体，其中靶特异性区中的每个与人载脂蛋白B(ApoB)基因的mRNA转录本的不同靶区互补。

27.如权利要求21所述的用途，其中靶特异性区中的每个与人载脂蛋白B(ApoB)基因的mRNA转录本的不同靶区互补。