BRPI0712034A2 - modulação de rnai de aha e usos terapêuticos do mesmo - Google Patents

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BRPI0712034A2
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Birgit Bramlage
Pamela Tan
Hans-Peter Vornlocher
William Balch
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Alnylam Pharmaceuticals Inc
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Abstract

MODULAçãO DE RNAi DE Aha E USOS TERAPêUTICOS DO MESMO. A presente presente invenção refere-se a um ácido ribonucléico bifilamentar (dsRNA) para inibir a expressão de um gene Aha (gene Ahal), compreendendo um filamento de antisentido tendo uma sequência de nucleotídeo que é menor que 30 nucleotídeos em comprimento, em geral 19-25 nucleotídeos em comprimento, e que é substancialmente complementar a pelo menos uma parte de um gene Aha. A invenção também refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo o dsRNA junto com um veiculo farmaceuticamente aceitável; métodos para tratar doenças causadas por expressão de Ahal e a expressão de um gene Aha usando a composição farmacêutica; e métodos para inibir a expressão de um gene Aha em uma célula.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MODULA- ÇÃO DE RNAi DE Aha E USOS TERAPÊUTICOS DO MESMO".
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção concerne a métodos de tratamento usando moduladores do Ativador do gene da ATPase da Proteína de Choque Tér- mico 90 (Aha). Mais especificamente, a invenção concerne a métodos de tratar distúrbios associados à atividade indesejada de Aha, administrando RNA de interferência curto que infra-regula a expressão de Aha, e agentes úteis neste.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Ativador da ATPase 1 da Proteína de Choque Térmico 90 (aqui: Aha1) é um ativador da atividade de ATPase da Hsp90 e é capaz de estimu- lar a atividade inerente de Hsp90 de levedura por 12 vezes e Hsp90 humana por 50 vezes (Panaretou, B. et al., Mol. Cell 2002, 10:1307-1318). Estudos bioquímicos mostraram que Ahal liga à região mediana de Hsp90 (Panare- tou et al., 2002, supra, Lotz1 G. PÁG., et al., J. Biol. Chem. 2003, 278:17228-17235), e recentes estudos estruturais do complexo de núcleo de Aha1-Hsp90 sugerem que a co-chaperona promova uma troca confor- macional na alça catalítica do segmento mediano (370-390) de Hsp90 que libera o Arg380 catalítico e facilita sua interação com a ATP no domínio de ligação de nucleotídeò N-terminal (Meyer, P. et al., EMBO J. 2004, 23:511- 519).
A proteína de choque térmico da chaperona molecular 90 (Hsp90) é responsável pela ativação in vivo ou maturação das proteínas cli- entes específicas (Picard, D., Cell Mol. Life Sei. 2002, 59:1640-1648; Pearl, L. H., e Prodromou, C., Adv. Protein Chem. 2002, 59:157-185; Pratt, W. B., e Toft, D. O., Exp. Biol. Med. 2003, 228:111-133; Prodromou, C., e Pearl, L. H., Curr. Câncer Drug Targets 2003, 3:301-323). Crucial para tal ativação é a atividade essencial de ATPase da Hsp90 (Panaretou, B., et al., EMBO J. 1998, 17:4829-4836), que dirige um ciclo conformacional que envolve asso- ciação transiente dos domínios de ligação de nucleotídeo N-terminais dentro do dímero de Hsp90 (Prodromou, C., et al., EMBO J. 2000, 19:4383-4392). Semelhante a uma chaperona molecular, HSP90 promove a maturação e mantém a estabilidade de um número grande de proteínas cli- entes conformacionalmente lábeis, a maioria destas está envolvida em pro- cessos biológicos que são freqüentemente desordenados dentro das células tumorais, tais como transdução de sinal, progressão do ciclocelular e apop- tose. Como resultado, e em contraste com outras terapêuticas alvejadas moleculares, os inibidores de HSP90 alcançam atividade anticâncer promis- sora mediante o rompimento simultâneo de muitos substratos oncogênicos dentro das células cancerosas (Whitesell L, e Dai C., Future Oncol. 2005; 1:529-540; WO 03/067262). Além disso, HSP90 tem estado implicada na degradação do Regulador de Condutância de Transmembrana de Fibrose Cística (CFTR). Mutações no gene de CFTR levam ao dobrâmento defeituo- so e ubiquinação da proteína como conseqüência da atividade de ATPase da HSP90. Seguindo ubiquitinação, CFTR é degradado antes de poder al- cançar seu sítio de atividade. Carência de CFTR ativo depois leva ao de- senvolvimento de fibrose cística em sujeitos humanos tendo tal mutação. Portanto, a inibição da atividade de HSP90 pode ser benéfica para sujeitos sofrendo de câncer ou Fibrose Cística.
Hsp90 constitui cerca de 1-2% de proteína celular total (Pratt, W. B., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1997, 37:297-326), e a inibição de tais quantidades grandes de proteína por meio de um antagonista ou inibidor potencialmente requereria a introdução de quantidades excessivas do inibi- dor ou antagonista em uma célula. Um método alternativo é a inibição de ativadores da atividade de ATPase da HSP90, tais como Ahal, que estão presentes em quantidades menores. Infra-regulando a quantidade de Ahal presente na célula, a atividade de HSP90 pode ser substancialmente dimi- nuída.
Homologia de seqüência significativa existe entre Aha 1 de Ho- mo sapiens (NM_012111.1), Mus musculus (NM_146036.1) e Pan troglody- tes (XM_510094.1). Um homólogo de Aha 1 de Rattus norvegicus claro não foi identificado; porém, há um gene de Rattus norvegicus (XM_223680.3) que foi denominado homólogo do ativador da proteína de choque térmico ATPase 2 (Ahsa 2) em base de sua homologia de seqüência à Ahsa 2 de levedura. Sua seqüência é homóloga ao gene 1110064P04 de cDNA de Rl- KEN de Mus musculus (NM_172391.3) que é por sua vez similar em se- qüência a Aha 1 de Mus musculus com exceção da mutilação N-terminal.
Um Ahsa 2 de Homo sapiens (NM_152392.1) foi também prognosticado, mas homologia de seqüência é limitada. As funções destes três genes pos- teriores não foram suficientemente elucidadas. Porém, existe uma região em que todas as seqüências acima são idênticas, e que podem ser usadas co- mo o alvo para agentes de RNAi. Pode ser vantajoso inibir a atividade de mais de um gene de Aha.
Recentemente, moléculas de RNA bifilamentar (dsRNA) foram mostradas bloquear expressão do gene em um mecanismo regulador alta- mente conservado conhecido como interferência de RNA (RNAi). WO 99/32619 (Fire et al.) descreve o uso de um dsRNA de pelo menos 25 nu- cleotídeos em comprimento para inibir a expressão dos genes em C. ele- gans. dsRNA foi também mostrado degradar RNA alvo em outros organis- mos, incluindo plantas (vide, por exemplo, WO 99/53050, Waterhouse et al.; e WO 99/61631, Heifetz et al.), Drosophila (vide, por exemplo, Yang, D. et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200), e mamíferos (vide WO 00/44895, Lim- mer; e DE 101 00 586.5, Kreutzer et al.). Este mecanismo natural tem agora se tornado o foco para o desenvolvimento de uma classe nova de agentes farmacêuticos para tratar distúrbios que são causados pela regulação aber- rante ou indesejada de um gene.
Apesar de avanços significativos no campo de RNAi e avanços no tratamento de processos patológicos mediados por HSP90, permanece uma necessidade por um agente que possa seletiva e eficientemente atenu- ar Atividade de ATPase da HSP90 usando a própria maquinaria de RNAi da célula. Tal agente possuirá atividade biológica alta e estabilidade in vivo, e eficazmente inibirá a expressão de um gene de Aha alvo, tal como Aha1, para o uso em tratar processos patológicos mediados direta ou indiretamen- te por expressão de Aha, por exemplo expressão de Ahal.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção fornece ácido ribonucléico bifilamentar (dsRNA), como também composições e métodos para inibir a expressão de um gene de Aha em uma célula ou mamífero usando tal dsRNA. A invenção também provê composições e métodos para tratar condições patológicas e doenças mediadas pela expressão de um gene de Aha, tais como em câncer ou fi- brose cística. O dsRNA da invenção compreende um filamento de RNA (o filamento antisentido) tendo uma região que é menos de 30 nucleotídeos em comprimento, em geral 19-24 nucleotídeos em comprimento, e é substanci- almente complementar a pelo menos parte de uma transcrição de mRNA de um gene de Aha.
Em um aspecto, a invenção fornece moléculas de ácido ribonu- cléico bifilamentar (dsRNA) para inibir a expressão de um gene de Aha. O dsRNA compreende pelo menos duas seqüências que são complementares uma à outra. O dsRNA compreende um filamento sentido compreendendo uma primeira seqüência e um filamento antisentido compreendendo uma segunda seqüência. O filamento antisentido compreende uma seqüência de nucleotídeo que é substancialmente complementar a pelo menos parte de um mRNA que codifica um gene de Aha, e a região de complementaridade é menos de 30 nucleotídeos em comprimento, em geral 19-24 nucleotídeos em comprimento. O dsRNA realiza clivagem de um mRNA que codifica um gene de Aha dentro da seqüência alvo de um segundo dsRNA tendo um filamento sentido selecionado do grupo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, θ SEQ ID NO: 183, e um filamento antisentido complementar ao último filamento sentido e selecionado do grupo de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, e SEQ ID NO: 184 (vide Tabela 1 e Tabela 2). O ge- ne de Aha é preferivelmente um gene de Ahal, e mais preferivelmente um gene de Ahal de Homo sapiens. 0 dsRNA, ao contatar com uma célula que expressa o gene de Aha1 pode inibir a expressão do gene de Aha na dita célula em pelo menos 20%, ou pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 85%, 90% ou 95%, por exemplo em células HeLa e/ou MLE 12. O dsRNA pode ser diferente do dito segundo dsRNA, mas pode ter pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 18, ou pelo menos 20 nucleotídeos contíguos por filamento em comum com uma das seqüências de nucleotídeo acima mencionadas.
Preferivelmente, o segundo dsRNA é selecionado do grupo de AL-DP-7301, AL-DP-7308, AL-DP-7318, AL-DP-7320, AL-DP-7322, AL-DP- 7324, AL-DP-7325, AL-DP-7326, AL-DP-7327, AL-DP-7329, AL-DP-7331, AL-DP-7333, AL-DP-7340, AL-DP-7342, AL-DP-7303, AL-DP-7305, AL-DP- 7307, AL-DP-7309, AL-DP-7316, e AL-DP-7337, AL-DP-7304, AL-DP-7312, AL-DP-7339, AL-DP-7344, AL-DP-7306, AL-DP-7317, AL-DP-7346, AL-DP- 7310, AL-DP-7323, AL-DP-7335, AL-DP-7338, AL-DP-7341, AL-DP-7302, AL-DP-7315, AL-DP-7328, AL-DP-7330, AL-DP-7336, AL-DP-7345, AL-DP- 9250, AL-DP-9251, AL-DP-9252, AL-DP-9253, AL-DP-9254, AL-DP-9255, AL-DP-9256, AL-DP-9257, AL-DP-9258, AL-DP-9259, AL-DP-9260, AL-DP- 9261, AL-DP-9262, AL-DP-9263, AL-DP-9264, AL-DP-9265, AL-DP-9266, AL-DP-9267, AL-DP-9268, AL-DP-9269, AL-DP-9270, AL-DP-9271, AL-DP- 9272, AL-DP-9273, AL-DP-9274, AL-DP-9275, AL-DP-9276, AL-DP-9277, AL-DP-9279, AL-DP-9280, AL-DP-9281, AL-DP-9282, AL-DP-9283, AL-DP- 9284, AL-DP-9285, AL-DP-9286, AL-DP-9287, AL-DP-9288, e AL-DP-9289 (vide Tabela 1 e Tabela 2).
Alternativamente, o próprio dsRNA pode ser selecionado do grupo de AL-DP-7301, AL-DP-7308, AL-DP-7318, AL-DP-7320, AL-DP- 7322, AL-DP-7324, AL-DP-7325, AL-DP-7326, AL-DP-7327, AL-DP-7329, AL-DP-7331, AL-DP-7333, AL-DP-7340, AL-DP-7342, AL-DP-7303, AL-DP- 7305, AL-DP-7307, AL-DP-7309, AL-DP-7316, e AL-DP-7337, AL-DP-7304, AL-DP-7312, AL-DP-7339, AL-DP-7344, AL-DP-7306, AL-DP-7317, AL-DP- 7346, AL-DP-7310, AL-DP-7323, AL-DP-7335, AL-DP-7338, AL-DP-7341, AL-DP-7302, AL-DP-7315, AL-DP-7328, AL-DP-7330, AL-DP-7336, AL-DP- 7345, AL-DP-9250, AL-DP-9251, AL-DP-9252, AL-DP-9253, AL-DP-9254, AL-DP-9255, AL-DP-9256, AL-DP-9257, AL-DP-9258, AL-DP-9259, AL-DP- 9260, AL-DP-9261, AL-DP-9262, AL-DP-9263, AL-DP-9264, AL-DP-9265, AL-DP-9266, AL-DP-9267, AL-DP-9268, AL-DP-9269, AL-DP-9270, AL-DP- 9271, AL-DP-9272, AL-DP-9273, AL-DP-9274, AL-DP-9275, AL-DP-9276, AL-DP-9277, AL-DP-9279, AL-DP-9280, AL-DP-9281, AL-DP-9282, AL-DP- 9283, AL-DP-9284, AL-DP-9285, AL-DP-9286, AL-DP-9287, AL-DP-9288, e AL-DP-9289 (vide Tabela 1 e Tabela 2).
O dsRNA pode compreender pelo menos um nucleotídeo modi- ficado. Preferivelmente, o nucleotídeo modificado é selecionado do grupo de: um nucleotídeo de 2'-0-metil modificado, um nucleotídeo compreenden- do um grupo 5'-fosforotioato, e um nucleotídeo terminal ligado a um derivado de colesterila ou grupo bisdecilamida de ácido dodecanóico. Alternativamen- te, o nucleotídeo modificado é selecionado do grupo de: um nucleotídeo 2'- deóxi-2'-flúor modificado, um nucleotídeo 2'-deóxi-modificado, um nucleotí- deo bloqueado, um nucleotídeo abásico, nucleotídeo 2'-amino-modificado, nucleotídeo 2'-alquil-modificado, nucleotídeo de morfolino, um fosforamida- to, e um nucleotídeo compreendendo base não-natural.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma célula isolada com- preendendo um dos dsRNAs da invenção. A célula é em geral uma célula mamífera, tal como uma célula humana. Outras modalidades da célula com- preendendo um dsRNA da invenção são como fornecidas acima para outros aspectos da invenção.
Em ainda outro aspecto, uma composição farmacêutica para i- nibir a expressão de um gene de Aha em um organismo é fornecida, com- preendendo um dsRNA e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o dsRNA compreende pelo menos duas seqüências que são complementa- res uma à outra, e em que um filamento sentido compreende uma primeira seqüência e um filamento antisentido compreende uma segunda seqüência compreendendo uma região de complementaridade que é substancialmente complementar a pelo menos uma parte de um mRNA que codifica um gene de Aha, e em que a dita região de complementaridade é menos de 30 nu- cleotídeos em comprimento, e em que o dsRNA realiza clivagem de um mRNA que codifica um gene de Aha dentro da seqüência alvo de um se- gundo dsRNA tendo um filamento sentido selecionado do grupo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, e SEQ ID NO: 183, e um filamento anti- sentido complementar ao último filamento sentido e selecionado do grupo de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEO ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, e SEQ ID NO: 184 (vide Tabe- la 1 e Tabela 2). Nisso, o gene de Aha pode ser um gene de Ahal, e prefe- rivelmente um gene de Ahal de Homo sapiens. O dsRNA compreendido na composição farmacêutica pode, sob contato com uma célula que expressa o dito gene de Aha, inibir a expressão do dito gene de Aha na dita célula em pelo menos 20%, ou pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 60%, 65%, 70%, 85%, 90% ou 95%, por exemplo em células HeLa e/ou MLE 12. O dsRNA pode ser diferente do dito segundo dsRNA, mas pode ter pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 18, ou pelo me- nos 20 nucleotídeos contíguos por filamento em comum com uma das se- qüências de nucleotídeo acima mencionadas.
Preferivelmente, o segundo dsRNA é selecionado do grupo de AL-DP-7301, AL-DP-7308, AL-DP-7318, AL-DP-7320, AL-DP-7322, AL-DP- 7324, AL-DP-7325, AL-DP-7326, AL-DP-7327, AL-DP-7329, AL-DP-7331, AL-DP-7333, AL-DP-7340, AL-DP-7342, AL-DP-7303, AL-DP-7305, AL-DP- 7307, AL-DP-7309, AL-DP-7316, e AL-DP-7337, AL-DP-7304, AL-DP-7312, AL-DP-7339, AL-DP-7344, AL-DP-7306, AL-DP-7317, AL-DP-7346, AL-DP- 7310, AL-DP-7323, AL-DP-7335, AL-DP-7338, AL-DP-7341, AL-DP-7302, AL-DP-7315, AL-DP-7328, AL-DP-7330, AL-DP-7336, AL-DP-7345, AL-DP- 9250, AL-DP-9251, AL-DP-9252, AL-DP-9253, AL-DP-9254, AL-DP-9255, AL-DP-9256, AL-DP-9257, AL-DP-9258, AL-DP-9259, AL-DP-9260, AL-DP- 9261, AL-DP-9262, AL-DP-9263, AL-DP-9264, AL-DP-9265, AL-DP-9266, AL-DP-9267, AL-DP-9268, AL-DP-9269, AL-DP-9270, AL-DP-9271, AL-DP- 9272, AL-DP-9273, AL-DP-9274, AL-DP-9275, AL-DP-9276, AL-DP-9277, AL-DP-9279, AL-DP-9280, AL-DP-9281, AL-DP-9282, AL-DP-9283, AL-DP-
9284, AL-DP-9285, AL-DP-9286, AL-DP-9287, AL-DP-9288, e AL-DP-9289 (vide Tabela 1 e Tabela 2).
Alternativamente, o dsRNA compreendido na própria composi- ção farmacêutica pode ser selecionado do grupo de AL-DP-7301, AL-DP- 7308, AL-DP-7318, AL-DP-7320, AL-DP-7322, AL-DP-7324, AL-DP-7325, AL-DP-7326, AL-DP-7327, AL-DP-7329, AL-DP-7331, AL-DP-7333, AL-DP- 7340, AL-DP-7342, AL-DP-7303, AL-DP-7305, AL-DP-7307, AL-DP-7309, AL-DP-7316, e AL-DP-7337, AL-DP-7304, AL-DP-7312, AL-DP-7339, AL- DP-7344, AL-DP-7306, AL-DP-7317, AL-DP-7346, AL-DP-7310, AL-DP- 7323, AL-DP-7335, AL-DP-7338, AL-DP-7341, AL-DP-7302, AL-DP-7315, AL-DP-7328, AL-DP-7330, AL-DP-7336, AL-DP-7345, AL-DP-9250, AL-DP- 9251, AL-DP-9252, AL-DP-9253, AL-DP-9254, AL-DP-9255, AL-DP-9256, AL-DP-9257, AL-DP-9258, AL-DP-9259, AL-DP-9260, AL-DP-9261, AL-DP-
9262, AL-DP-9263, AL-DP-9264, AL-DP-9265, AL-DP-9266, AL-DP-9267, AL-DP-9268, AL-DP-9269, AL-DP-9270, AL-DP-9271, AL-DP-9272, AL-DP- 9273, AL-DP-9274, AL-DP-9275, AL-DP-9276, AL-DP-9277, AL-DP-9279, AL-DP-9280, AL-DP-9281, AL-DP-9282, AL-DP-9283, AL-DP-9284, AL-DP- 9285, AL-DP-9286, AL-DP-9287, AL-DP-9288, e AL-DP-9289 (vide Tabela 1 e Tabela 2).
O dsRNA compreendido na composição farmacêutica pode compreender pelo menos um nucleotídeo modificado. Preferivelmente, o dito nucleotídeo modificado é selecionado do grupo de: um nucleotídeo de 2'-0-metil modificado, um nucleotídeo compreendendo um grupo 5'- fosforotioato, e um nucleotídeo terminal ligado a um derivado de colesterila ou grupo bisdecilamida de ácido dodecanóico. Alternativamente, o dito nu- cleotídeo modificado é selecionado do grupo de: um nucleotídeo 2'-deóxi-2'- flúor modificado, um nucleotídeo 2'-deóxi-modificado, um nucleotídeo blo- queado, um nucleotídeo abásico, nucleotídeo 2'-amino-modificado, nucleotí- deo 2'-alquil-modificado, nucleotídeo de morfolino, um fosforamidato, e um nucleotídeo compreendendo base não-natural.
Em ainda outro aspecto, um método para inibir a expressão de um gene de Aha em uma célula é fornecido, o método compreendendo:
(a) introduzir na célula um ácido ribonucléico bifilamentar (dsRNA), em que o dsRNA compreende pelo menos duas seqüências que são complementares uma à outra e em que um filamento sentido compre- ende uma primeira seqüência e um filamento antisentido compreende uma segunda seqüência compreendendo uma região de complementaridade que é substancialmente complementar a pelo menos uma parte de um mRNA que codifica Ahal, e em que a dita região de complementaridade é menos de 30 nucleotídeos em comprimento e em que o dsRNA realiza clivagem de um mRNA que codifica um gene de Aha dentro da seqüência alvo de um segundo dsRNA tendo um filamento sentido selecionado do grupo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEO ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, e SEQ ID NO: 183, e um filamento antisentido complementar ao último filamento sentido e selecionado do gru- po de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, e SEQ ID NO: 184; e (b) manter a célula produzida na etapa (a) durante um tem- po suficiente para obter degradação da transcrição de mRNA de um gene de Aha, assim inibindo a expressão de um gene de Aha na célula. O gene de Aha é preferivelmente um gene de Ahal, e mais preferivelmente um ge- ne de Ahal de Homo sapiens. O dsRNA pode ser diferente do dito segundo dsRNA, mas pode ter pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 18, ou pelo menos 20 nucleotídeos contíguos por filamento em co- mum com uma das seqüências de nucleotídeo acima mencionadas.
Preferivelmente, o segundo dsRNA é selecionado do grupo de AL-DP-7301, AL-DP-7308, AL-DP-7318, AL-DP-7320, AL-DP-7322, AL-DP- 7324, AL-DP-7325, AL-DP-7326, AL-DP-7327, AL-DP-7329, AL-DP-7331, AL-DP-7333, AL-DP-7340, AL-DP-7342, AL-DP-7303, AL-DP-7305, AL-DP- 7307, AL-DP-7309, AL-DP-7316, e AL-DP-7337, AL-DP-7304, AL-DP-7312, AL-DP-7339, AL-DP-7344, AL-DP-7306, AL-DP-7317, AL-DP-7346, AL-DP- 7310, AL-DP-7323, AL-DP-7335, AL-DP-7338, AL-DP-7341, AL-DP-7302, AL-DP-7315, AL-DP-7328, AL-DP-7330, AL-DP-7336, AL-DP-7345, AL-DP- 9250, AL-DP-9251, AL-DP-9252, AL-DP-9253, AL-DP-9254, AL-DP-9255, AL-DP-9256, AL-DP-9257, AL-DP-9258, AL-DP-9259, AL-DP-9260, AL-DP- 9261, AL-DP-9262, AL-DP-9263, AL-DP-9264, AL-DP-9265, AL-DP-9266, AL-DP-9267, AL-DP-9268, AL-DP-9269, AL-DP-9270, AL-DP-9271, AL-DP- 9272, AL-DP-9273, AL-DP-9274, AL-DP-9275, AL-DP-9276, AL-DP-9277, AL-DP-9279, AL-DP-9280, AL-DP-9281, AL-DP-9282, AL-DP-9283, AL-DP- 9284, AL-DP-9285, AL-DP-9286, AL-DP-9287, AL-DP-9288, e AL-DP-9289 (vide Tabela 1 e Tabela 2).
Alternativamente, o próprio dsRNA é selecionado do grupo de AL-DP-7301, AL-DP-7308, AL-DP-7318, AL-DP-7320, AL-DP-7322, AL-DP- 7324, AL-DP-7325, AL-DP-7326, AL-DP-7327, AL-DP-7329, AL-DP-7331, AL-DP-7333, AL-DP-7340, AL-DP-7342, AL-DP-7303, AL-DP-7305, AL-DP- 7307, AL-DP-7309, AL-DP-7316, e AL-DP-7337, AL-DP-7304, AL-DP-7312, AL-DP-7339, AL-DP-7344, AL-DP-7306, AL-DP-7317, AL-DP-7346, AL-DP- 7310, AL-DP-7323, AL-DP-7335, AL-DP-7338, AL-DP-7341, AL-DP-7302, AL-DP-7315, AL-DP-7328, AL-DP-7330, AL-DP-7336, AL-DP-7345, AL-DP- 9250, AL-DP-9251, AL-DP-9252, AL-DP-9253, AL-DP-9254, AL-DP-9255, AL-DP-9256, AL-DP-9257, AL-DP-9258, AL-DP-9259, AL-DP-9260, AL-DP- 9261, AL-DP-9262, AL-DP-9263, AL-DP-9264, AL-DP-9265, AL-DP-9266, AL-DP-9267, AL-DP-9268, AL-DP-9269, AL-DP-9270, AL-DP-9271, AL-DP- 9272, AL-DP-9273, AL-DP-9274, AL-DP-9275, AL-DP-9276, AL-DP-9277, AL-DP-9279, AL-DP-9280, AL-DP-9281, AL-DP-9282, AL-DP-9283, AL-DP- 9284, AL-DP-9285, AL-DP-9286, AL-DP-9287, AL-DP-9288, e AL-DP-9289. Preferivelmente, o método é executado in vitro. Outras modalidades do mé- todo para inibir a expressão de um gene de Aha em uma célula são como fornecidas acima para outros aspectos da invenção.
Em ainda outro aspecto, um método de tratar, impedir ou ge- renciar processos patológicos mediados por expressão de Aha é fornecido, compreendendo administrar a um paciente em necessidade de tal tratamen- to, prevenção ou gerenciamento uma quantidade terapêutica ou profilatica- mente eficaz de um dsRNA, em que o dsRNA compreende pelo menos duas seqüências que são complementares uma à outra e em que um filamento sentido compreende uma primeira seqüência e um filamento antisentido compreende uma segunda seqüência compreendendo uma região de com- plementaridade que é substancialmente complementar a pelo menos uma parte de um mRNA que codifica Aha1, e em que a dita região de comple- mentaridade é menos de 30 nucleotídeos em comprimento e em que o ds- RNA realiza clivagem de um mRNA que codifica um gene de Aha dentro da seqüência alvo de um segundo dsRNA tendo um filamento sentido selecio- nado do grupo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEO ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, e SEQ ID NO: 183, e um filamento antisentido complementar ao último filamento sentido e selecionado do grupo de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, e SEQ ID NO: 184. O dsRNA pode ser diferente do dito segundo dsRNA, mas pode ter pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 18, ou pelo menos 20 nucleotídeos contíguos por filamento em comum com uma das seqüências de nucleotídeo acima mencionadas.
Preferivelmente, o segundo dsRNA é selecionado do grupo de AL-DP-7301, AL-DP-7308, AL-DP-7318, AL-DP-7320, AL-DP-7322, AL-DP- 7324, AL-DP-7325, AL-DP-7326, AL-DP-7327, AL-DP-7329, AL-DP-7331, AL-DP-7333, AL-DP-7340, AL-DP-7342, AL-DP-7303, AL-DP-7305, AL-DP- 7307, AL-DP-7309, AL-DP-7316, e AL-DP-7337, AL-DP-7304, AL-DP-7312, AL-DP-7339, AL-DP-7344, AL-DP-7306, AL-DP-7317, AL-DP-7346, AL-DP- 7310, AL-DP-7323, AL-DP-7335, AL-DP-7338, AL-DP-7341, AL-DP-7302, AL-DP-7315, AL-DP-7328, AL-DP-7330, AL-DP-7336, AL-DP-7345, AL-DP- 9250, AL-DP-9251, AL-DP-9252, AL-DP-9253, AL-DP-9254, AL-DP-9255, AL-DP-9256, AL-DP-9257, AL-DP-9258, AL-DP-9259, AL-DP-9260, AL-DP- 9261, AL-DP-9262, AL-DP-9263, AL-DP-9264, AL-DP-9265, AL-DP-9266, AL-DP-9267, AL-DP-9268, AL-DP-9269, AL-DP-9270, AL-DP-9271, AL-DP- 9272, AL-DP-9273, AL-DP-9274, AL-DP-9275, AL-DP-9276, AL-DP-9277, AL-DP-9279, AL-DP-9280, AL-DP-9281, AL-DP-9282, AL-DP-9283, AL-DP- 9284, AL-DP-9285, AL-DP-9286, AL-DP-9287, AL-DP-9288, e AL-DP-9289 (vide Tabela 1 e Tabela 2).
Alternativamente, o próprio dsRNA é selecionado do grupo de AL-DP-7301, AL-DP-7308, AL-DP-7318, AL-DP-7320, AL-DP-7322, AL-DP- 7324, AL-DP-7325, AL-DP-7326, AL-DP-7327, AL-DP-7329, AL-DP-7331, AL-DP-7333, AL-DP-7340, AL-DP-7342, AL-DP-7303, AL-DP-7305, AL-DP- 7307, AL-DP-7309, AL-DP-7316, e AL-DP-7337, AL-DP-7304, AL-DP-7312, AL-DP-7339, AL-DP-7344, AL-DP-7306, AL-DP-7317, AL-DP-7346, AL-DP- 7310, AL-DP-7323, AL-DP-7335, AL-DP-7338, AL-DP-7341, AL-DP-7302, AL-DP-7315, AL-DP-7328, AL-DP-7330, AL-DP-7336, AL-DP-7345, AL-DP- 9250, AL-DP-9251, AL-DP-9252, AL-DP-9253, AL-DP-9254, AL-DP-9255, AL-DP-9256, AL-DP-9257, AL-DP-9258, AL-DP-9259, AL-DP-9260, AL-DP- 9261, AL-DP-9262, AL-DP-9263, AL-DP-9264, AL-DP-9265, AL-DP-9266, AL-DP-9267, AL-DP-9268, AL-DP-9269, AL-DP-9270, AL-DP-9271, AL-DP- 9272, AL-DP-9273, AL-DP-9274, AL-DP-9275, AL-DP-9276, AL-DP-9277, AL-DP-9279, AL-DP-9280, AL-DP-9281, AL-DP-9282, AL-DP-9283, AL-DP- 9284, AL-DP-9285, AL-DP-9286, AL-DP-9287, AL-DP-9288, e AL-DP-9289. Outras modalidades do método compreendendo administrar um dsRNA da invenção são como fornecidas acima para outros aspectos da invenção.
Em ainda outro aspecto, um vetor para inibir a expressão de um gene de Aha em uma célula é fornecido, o dito vetor compreendendo uma seqüência reguladora operavelmente ligada a uma seqüência de nucleotí- deo que codifica pelo menos um filamento de um dsRNA, em que um dos filamentos do dito dsRNA é substancialmente complementar a pelo menos uma parte de um mRNA que codifica Ahal e em que o dito dsRNA é menos de 30 pares de base em comprimento e em que o dsRNA realiza clivagem de um mRNA que codifica um gene de Aha dentro da seqüência alvo de um segundo dsRNA tendo um filamento sentido selecionado do grupo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, e SEQ ID NO: 183, e um filamento antisentido complementar ao último filamento sentido e selecionado do gru- po de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, e SEQ ID NO: 184. O dsRNA pode ser diferente do dito segundo dsRNA, mas pode ter pelo me- nos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 18, ou pelo menos 20 nucleotídeos contíguos por filamento em comum com uma das seqüências de nucleotídeo acima mencionadas.
Preferivelmente, o segundo dsRNA é selecionado do grupo de AL-DP-7301, AL-DP-7308, AL-DP-7318, AL-DP-7320, AL-DP-7322, AL-DP- 7324, AL-DP-7325, AL-DP-7326, AL-DP-7327, AL-DP-7329, AL-DP-7331, AL-DP-7333, AL-DP-7340, AL-DP-7342, AL-DP-7303, AL-DP-7305, AL-DP- 7307, AL-DP-7309, AL-DP-7316, e AL-DP-7337, AL-DP-7304, AL-DP-7312, AL-DP-7339, AL-DP-7344, AL-DP-7306, AL-DP-7317, AL-DP-7346, AL-DP- 7310, AL-DP-7323, AL-DP-7335, AL-DP-7338, AL-DP-7341, AL-DP-7302, AL-DP-7315, AL-DP-7328, AL-DP-7330, AL-DP-7336, AL-DP-7345, AL-DP- 9250, AL-DP-9251, AL-DP-9252, AL-DP-9253, AL-DP-9254, AL-DP-9255, AL-DP-9256, AL-DP-9257, AL-DP-9258, AL-DP-9259, AL-DP-9260, AL-DP- 9261, AL-DP-9262, AL-DP-9263, AL-DP-9264, AL-DP-9265, AL-DP-9266, AL-DP-9267, AL-DP-9268, AL-DP-9269, AL-DP-9270, AL-DP-9271, AL-DP- 9272, AL-DP-9273, AL-DP-9274, AL-DP-9275, AL-DP-9276, AL-DP-9277, AL-DP-9279, AL-DP-9280, AL-DP-9281, AL-DP-9282, AL-DP-9283, AL-DP- 9284, AL-DP-9285, AL-DP-9286, AL-DP-9287, AL-DP-9288, e AL-DP-9289 (vide Tabela 1 e Tabela 2). Outras modalidades do vetor da in- venção são como fornecidas acima para outros aspectos da invenção.
Em ainda outro aspecto, uma célula isolada compreendendo o vetor acima é fornecida. Outras modalidades da célula compreendendo um vetor da invenção são como fornecidas acima para outros aspectos da in- venção.
TABELA 1: AGENTES DE RNAi PARA A INFRA-REGULAÇÃO DE AHA 1 DE HOMO SAPIENS (NM_012111.1), MUS MUSCULUS (NM_146036.1) E PAN TROGLODYTES (XM_510094.1), E INTERAÇÕES NÃO-ALVO MÍNIMAS EM CÉLULAS DE RATO; AL-DP-7561, AL-DP-7562, AL-DP-7563 E AL-DP-7564 SÃO ADICIONALMENTE REATIVOS CRUZA- DOS PARA AHA 2A DE MUS MUSCULUS (NM_172391.3) E RATTUS NORVEGICUS (XM_223680.3)
<table>table see original document page 20</column></row><table> <table>table see original document page 21</column></row><table> <table>table see original document page 22</column></row><table> <table>table see original document page 23</column></row><table>
1 letras maiúsculas = desoxirribonucleotídeos; letras minúsculas = ribonucleotídeos
TABELA 2: AGENTES DE RNAi PARA A INFRA-REGULAÇÃO DE AHA 1 DE HOMO SAPIENS (NM_012111.1), MUS MUSCULUS (NM_146036.1) E PAN TROGLODYTES (XM_510094.1), E INTERAÇÕES NÃO-ALVO MÍNIMAS EM CÉLULAS HUMANAS
<table>table see original document page 23</column></row><table> <table>table see original document page 24</column></row><table> <table>table see original document page 25</column></row><table> <table>table see original document page 26</column></row><table>
1 letras maiúsculas = desoxirribonucleotídeos; letras minúsculas = ribonucleotídeos
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Nenhuma Figura é apresentada.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A invenção fornece ácido ribonucléico bifilamentar (dsRNA), como também composições e métodos para inibir a expressão de um gene de Aha em uma célula ou mamífero usando o dsRNA. A invenção também provê composições e métodos para tratar condições patológicas e doenças em um mamífero causadas pela expressão de um gene de Aha usando ds- RNA. dsRNA direciona a degradação sequência-específica de mRNA atra- vés de um processo conhecido como interferência de RNA (RNAi).
O dsRNA da invenção compreende um filamento de RNA (o fi- lamento antisentido) tendo uma região que é menos de 30 nucleotídeos em comprimento, em geral 19-24 nucleotídeos em comprimento, e é substanci- almente complementar a pelo menos parte de uma transcrição de mRNA de um gene de Aha. O uso destes dsRNAs permite a degradação alvejada de mRNAs de genes que estão implicados na replicação e/ou manutenção das células cancerosas em mamíferos, e/ou na degradação do Regulador de Condutância de Transmembrana de Fibrose Cística (CFTR) desdobrado. Usando ensaios com base em célula e animais, os inventores presentes demonstraram que dosagens muito baixas destes dsRNAs específica e efi- cientemente podem mediar RNAi, resultando em inibição significativa da expressão de um gene de Aha. Desse modo, os métodos e composições da invenção compreendendo estes dsRNAs são úteis para tratar processos patológicos mediados por expressão de Aha, por exemplo câncer e/ou fibro- se cística, alvejando um gene envolvido na degradação da proteína. A descrição detalhada a seguir descreve como fazer e usar o dsRNA e composições contendo dsRNA para inibir a expressão de um gene de Aha, como também composições e métodos para tratar doenças e dis- túrbios causados pela expressão de um gene de Aha, tais como câncer e/ou fibrose cística. As composições farmacêuticas da invenção compreendem um dsRNA tendo um filamento antisentido compreendendo uma região de complementaridade que é menos de 30 nucleotídeos em comprimento, em geral 19-24 nucleotídeos em comprimento, e é substancialmente comple- mentar a pelo menos parte de uma transcrição de RNA de um gene de Aha, junto com um veículo farmaceuticamente aceitável.
Consequentemente, certos aspectos da invenção fornecem composições farmacêuticas que compreendem o dsRNA da invenção junto com um veículo farmaceuticamente aceitável, métodos de usar as composi- ções para inibir expressão de um gene de Aha, e métodos de usar as com- posições farmacêuticas para tratar doenças causadas por expressão de um gene de Aha.
DEFINIÇÕES
Para conveniência, o significado de certos termos e frases usa- dos no relatório descritivo, exemplos, e reivindicações em anexo, é fornecido abaixo. Se houver uma discrepância evidente entre o uso de um termo em outras partes deste relatório descritivo e sua definição fornecida nesta se- ção, a definição nesta seção prevalecerá.
"G", "C", "A", "T" e "U" (independente se escritos em letras mai- úsculas ou letras minúsculas), cada em geral representa um nucleotídeo contendo guanina, citosina, adenina, timina, e uracila como uma base, res- pectivamente. Porém, será entendido que o termo "ribonucleotídeo" ou "nu- cleotídeo" pode também referir-se a um nucleotídeo modificado, como mais detalhado abaixo, ou uma porção de substituição do substituto. A pessoa versada é bem ciente que guanina, citosina, adenina, timina, e uracila po- dem ser substituídas por outras porçãos sem substancialmente alterar as propriedades de pareamento de base de um oligonucleotídeo compreen- dendo um nucleotídeo carregando tal porção de substituição. Por exemplo, sem limitação, um nucleotídeo compreendendo inosina como sua base pode parear em base com nucleotídeos contendo adenina, citosina, ou uracila. Consequentemente, nucleotídeos contendo uracila, guanina, ou adenina podem ser substituídos nas seqüências de nucleotídeo da invenção por um nucleotídeo contendo, por exemplo, inosina. Seqüências compreendendo tais porçãos de substituição são modalidades da invenção.
Como aqui usado, "gene de Aha" refere-se ao Ativador dos ge- nes de ATPase da Proteína de Choque Térmico 90. "Aha1" refere-se ao Ati- vador dos genes de ATPase 1 da Proteína de Choque Térmico 90, exem- pios não-exaustivos destes são encontrados sob os números de acesso do Genbank NM_012111.1 (Homo sapiens), NM_146036.1 (Mus musculus), e XM_510094.1 (Pan troglodytes). "Aha2" refere-se ao Ativador putativo dos genes de ATPase 2 da Proteína de Choque Térmico 90, também conhecido como Ahsa2, exemplos não-exaustivos destes podem ser encontrados sob os números de acesso do Genbank NM_172391.3 (Mus musculus) e XM_223680.3 (Rattus norvegicus).
Como aqui usado, "seqüência alvo" refere-se a uma porção con- tígua da seqüência de nucleotídeo de uma molécula de mRNA formada du- rante a transcrição de um gene de Aha, incluindo mRNA que é um produto do processamento de RNA de um produto de transcrição primário. A se- qüência alvo de qualquer agente de RNAi dado da invenção significa uma seqüência de mRNA de nucleotídeos X que são alvejados pelo agente de RNAi em virtude da complementaridade do filamento antisentido do agente de RNAi para tal seqüência e com a qual o filamento antisentido pode hibri- dar quando colocado em contato com o mRNA, em que X é o número de nucleotídeos no filamento antisentido mais o número de nucleotídeos em uma extensão unifilamentar do filamento sentido, se houver.
Como aqui usado, o termo "filamento compreendendo uma se- qüência" refere-se a um oligonucleotídeo compreendendo uma cadeia de nucleotídeos que é descrita pela seqüência referida usando a nomenclatura de nucleotídeo padrão.
Como aqui usado, e a menos que do contrário indicado, o termo "complementar", quando usado para descrever uma primeira seqüência de nucleotídeo em relação a uma segunda seqüência de nucleotídeo, refere-se à habilidade de um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo a primeira seqüência de nucleotídeo para hibridar e formar uma estrutura dú- plex sob certas condições com um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo com- preendendo a segunda seqüência de nucleotídeo, como será entendido pela pessoa versada. Tais condições podem, por exemplo, ser condições rigoro- sas onde condições rigorosas podem incluir: 400 mM de NaCI, 40 mM de PIPES pH 6,4, 1 mM de EDTA, 50QC ou 70QC durante 12-16 horas seguidas por lavagem. Outras condições, tais como condições fisiologicamente rele- vantes que podem ser encontradas dentro de um organismo, podem aplicar- se. A pessoa versada poderá determinar o conjunto de condições mais a- propriado para um teste de complementaridade de duas seqüências de a- cordo com a última aplicação dos nucleotídeos hibridados.
Este inclui pareamento de base do oligonucleotídeo ou polinu- cleotídeo compreendendo a primeira seqüência de nucleotídeo com o oligo- nucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo a segunda seqüência de nucleotídeo no comprimento inteiro da primeira e segunda seqüência de nu- cleotídeo. Tais seqüências podem ser referidas como "completamente com- plementares" com respeito uma à outra aqui. Porém, onde uma primeira se- qüência for referida como "substancialmente complementar" com respeito a uma segunda seqüência aqui, as duas seqüências podem ser completamen- te complementares, ou elas podem formar um ou mais, mas em geral não mais que 4, 3 ou 2 pares de base não-pareados sob hibridação, enquanto retendo a habilidade para hibridar sob as condições mais relevantes com sua última aplicação. Porém, onde dois oligonucleotídeos forem projetados para formar, sob hibridação, uma ou mais extensões unifilamentares, tais extensões não devem ser consideradas como disparidades com respeito à determinação de complementaridade. Por exemplo, um dsRNA compreen- dendo um oligonucleotídeo de 21 nucleotídeos em comprimento e outro oli- gonucleotídeo de 23 nucleotídeos em comprimento, em que o oligonucleotí- deo mais longo compreende uma seqüência de 21 nucleotídeos que é com- pletamente complementar ao oligonucleotídeo mais curto, ainda pode ser referido como "completamente complementar" para o propósito da invenção.
Seqüências "complementares", como aqui usadas, podem tam- bém incluir, ou ser formadas completamente de pares de base de não- Watson-Crick e/ou pares de base formados de nucleotídeos não-naturais e modificados, em até onde os requerimentos acima com respeito a sua habi- lidade para hibridar forem satisfeitos.
Os termos "complementar", "completamente complementar" e "substancialmente complementar" aqui pode ser usado com respeito ao pa- reamento de bases entre o filamento sentido e o filamento antisentido de um dsRNA, ou entre o filamento antisentido de um dsRNA e uma seqüência al- vo, como será entendido do contexto de seu uso.
Como aqui usado, um polinucleotídeo que é "substancialmente complementar a pelo menos parte de" um RNA mensageiro (mRNA) refere- se a um polinucleotídeo que é substancialmente complementar a uma por- ção contígua do mRNA de interesse (por exemplo, Ahal de codificação). Por exemplo, um polinucleotídeo é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA de Ahal se a seqüência for substancialmente complementar a uma porção não-interrompida de um mRNA que codifica Ahal.
O termo "RNA bifilamentar" ou "dsRNA", como aqui usado, refe- re-se a um complexo de moléculas de ácido ribonucléico, tendo uma estru- tura dúplex que compreende dois filamentos de ácido nucléico antiparalelos e substancialmente complementares, como definidos acima. Os dois fila- mentos que formam a estrutura dúplex podem ser porções diferentes de uma molécula de RNA maior, ou eles podem ser moléculas de RNA separa- das. Onde os dois filamentos fizerem parte de uma molécula maior, e por- tanto estarem conectados por uma cadeia não-interrompida de nucleotídeos entre a terminação 3' de um filamento e a terminação 5' do respectivo outro filamento que forma a estrutura dúplex, a cadeia de RNA de conexão é refe- rida como um "alça de alfinete". Onde os dois filamentos estiverem conecta- dos covalentemente por meio diferente de uma cadeia não-interrompida de nucleotídeos entre a terminação 3' de um filamento e a terminação 5' do respectivo outro filamento que forma a estrutura dúplex, a estrutura de co- nexão é referida como um "ligante". Os filamentos de RNA podem ter o mesmo número ou diferente de nucleotídeos. O número máximo de pares de base é o número de nucleotídeos no filamento mais curto do dsRNA me· nos qualquer extensão que esteja presente no dúplex. Além da estrutura dúplex, um dsRNA pode compreender uma ou mais extensões de nucleotí- deo.
Como aqui usado, uma "extensão de nucleotídeo" refere-se ao nucleotídeo não-pareado ou nucleotídeos que se protraem da estrutura dú- plex de um dsRNA quando uma terminação 3' de um filamento do dsRNA estende-se além da terminação 5' do outro filamento, ou vice-versa. "Cega" ou "terminação cega" significa que não há nenhum nucleotídeo não-pareado naquela terminação do dsRNA, isto é, nenhuma extensão de nucleotídeo. Um dsRNA "com terminação cega" é um dsRNA que não tem nenhuma ex- 15 tensão de nucleotídeo em qualquer terminação da molécula.
O termo "filamento antisentido" refere-se ao filamento de um dsRNA que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma seqüência alvo. Como aqui usado, o termo "região de complementaridade" refere-se à região no filamento antisentido que é substancialmente comple- mentar a uma seqüência, por exemplo uma seqüência alvo, como definida aqui. Onde a região de complementaridade não for completamente comple- mentar à seqüência alvo, as disparidades são mais toleradas nas regiões terminais e, se presente, estão em geral em uma região ou regiões termi- nais, por exemplo, dentro de 6, 5, 4, 3, ou 2 nucleotídeos dos términos 5' e/ou 3'. O mais preferivelmente, as disparidades estão localizadas dentro de 6, 5, 4, 3, ou 2 nucleotídeos do término de 5' do filamento antisentido e/ou do término de 3' do filamento sentido.
O termo "filamento sentido", como aqui usado, refere-se ao fi- lamento de um dsRNA que inclui uma região que é substancialmente com- plementar a uma região do filamento antisentido.
"Introduzir em uma célula", quando referir-se a um dsRNA, sig- nifica facilitar absorção ou absorvimento na célula, como é entendido por aqueles versados na técnica. Absorção ou absorvimento de dsRNA pode ocorrer através de processos celulares difusivos ou ativos sem ajuda, ou por agentes ou dispositivos auxiliares. O significado deste termo não é limitado a células in vitro; um dsRNA pode também ser "introduzido em uma célula", em que a célula faz parte de um organismo vivo. Em tal circunstância, a in- trodução na célula incluirá a liberação ao organismo. Por exemplo, para libe- ração in vivo, o dsRNA pode ser injetado em um sítio de tecido ou adminis- trado sistemicamente. Introdução in vitro em uma célula inclui métodos co- nhecidos na técnica tais como eletroporação e lipofecção.
Os termos "silêncio" e "inibir a expressão de", em até onde eles referirem a um gene de Aha, por exemplo um gene de Ahal, aqui se refe- rem a pelo menos supressão parcial da expressão de um gene de Aha, por exemplo um gene de Ahal, como manifestada por uma redução da quanti- dade de mRNA transcrito de um gene de Aha que pode ser isolado de uma primeira célula ou grupo de células em que um gene de Aha é transcrito e que tem ou foi tratado de modo que a expressão de um gene de Aha é inibi- da, quando comparada a uma segunda célula ou grupo de células substan- cialmente idênticas à primeira célula ou grupo de células mas que tem ou não foi tratadas assim (células de controle). Preferível mente, as células são células HeLa ou MLE 12. O grau de inibição usualmente é expressado em termos de
(mRNA em células de controle) - (mRNA em células tratadas) . 100%
mRNA em células de controle
Alternativamente, o grau de inibição pode ser dado em termos de uma redução de um parâmetro que é ligado funcionalmente a transcrição do gene de Aha, por exemplo a quantidade de proteína codificada por um gene de Aha que é segregado por uma célula, ou encontrado na solução após Iise de tais células, ou o número de células que exibem um certo fenó- tipo, por exemplo apoptose ou CFTR de superfície celular. Em princípio, si- Ienciamento de gene de Aha pode ser determinado em qualquer célula que expresse o alvo, constitutivamente ou através de engenharia genômica, e por qualquer ensaio apropriado. Porém, quando uma referência for necessá- ria para determinar se um dsRNA dado inibe a expressão de um gene de Aha em um certo grau e portanto é abrangido pela invenção imediata, os ensaios fornecidos nos Exemplos abaixo servirão como tal referência.
Por exemplo, em certas circunstâncias, expressão de um gene de Aha, por exemplo um gene de Aha1, é suprimida em pelo menos cerca de 20%, 25%, 35%, ou 50% por administração do oligonucleotídeo bifila- mentar da invenção. Em alguma modalidade, um gene de Aha, por exemplo um gene de Ahal, é suprimido em pelo menos cerca de 60%, 70%, ou 80% por administração do oligonucleotídeo bifilamentar da invenção. Em algu- mas modalidades, um gene de Aha, por exemplo um gene de Ahal, é su- primido em pelo menos cerca de 85%, 90%, ou 95% por administração do oligonucleotídeo bifilamentar da invenção. Tabela 6 provê valores para inibi- ção da expressão de Ahal usando várias moléculas de dsRNA da invenção.
Como aqui usado no contexto de expressão de Aha, por exem- plo Expressão de Aha1, os termos "tratar", "tratamento", e outros, referem- se a alívio ou mitigação de processos patológicos mediados por expressão de Aha. No contexto da presente invenção enquanto refere-se a quaisquer das outras condições recitadas aqui abaixo (diferentes de processos patoló- gicos mediados por expressão de Aha), os termos "tratar", "tratamento", e outros intencionam aliviar ou mitigar pelo menos um sintoma associado a tal condição, ou reduzir ou inverter a progressão de tal condição.
Como aqui usado, as frases "quantidade terapeuticamente efi- caz" e "quantidade profilaticamente eficaz" referem-se a uma quantidade que fornece um benefício terapêutico no tratamento, prevenção, ou gerenci- amento de processos patológicos mediados por expressão de Aha ou um sintoma evidente de processos patológicos mediados por expressão de Aha. A quantidade específica que é terapeuticamente eficaz pode ser facilmente determinada por médico usual, e pode variar, dependendo de fatores co- nhecidos na técnica, tais como, por exemplo o tipo de processos patológicos mediados por expressão de Aha, a história do paciente e idade, o estágio dos processos patológicos mediados por expressão de Aha, e a administra- ção de outros processos antipatológicos mediados por agentes de expres- são de Aha.
Como aqui usado, uma "composição farmacêutica" compreende uma quantidade farmacologicamente eficaz de um dsRNA e um veículo far- maceuticamente aceitável. Como aqui usado, "quantidade farmacologica- mente eficaz", "quantidade terapeuticamente eficaz" ou simplesmente "quantidade eficaz" referem-se àquela quantidade de um RNA eficaz para produzir o resultado farmacológico, terapêutico ou preventivo intencionado.
Por exemplo, se um tratamento clínico dado for considerado eficaz quando houver pelo menos uma redução de 25% em um parâmetro mensurável as- sociado a uma doença ou distúrbio, uma quantidade terapeuticamente efi- caz de um fármaco para o tratamento daquela doença ou distúrbio é a quan- tidade necessária para realizar pelo menos uma redução de 25% naquele parâmetro.
O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se ao veí- culo para administração de um agente terapêutico. Tais veículos incluem, mas não são limitados a, solução salina, solução salina tamponada, dextro- se, água, glicerol, etanol, e combinações dos mesmos. O termo especifica- mente exclui meio de cultura de célula. Para fármacos administrados oral- mente, os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limi- tados a excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como diluentes iner- tes, agentes desintegrantes, agentes de ligação, agentes lubrificantes, agen- tes adoçantes, agentes flavorizantes, agentes de coloração e conservantes. Diluentes inertes adequados incluem carbonato de sódio e cálcio, fosfato de sódio e cálcio, e lactose, enquanto amido de milho e ácido algínico são a- gentes desintegrantes adequados. Agentes de ligação podem incluir amido e gelatina, enquanto o agente lubrificante, se presente, em geral será estea- rato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos com um material tal como monoestearato de glicerila ou diestearato de glicerila, para tardar a absorção no trato gastrointestinal.
Como aqui usado, uma "célula transformada" é uma célula à qual um vetor foi introduzido do qual uma molécula de dsRNA pode ser ex- pressada.
ÁCIDO RIBONUCLÉICO BIFILAMENTAR (dsRNA)
Em uma modalidade, a invenção fornece moléculas de ácido ri- bonucléico bifilamentar (dsRNA) para inibir a expressão de um gene de Aha1 por exemplo um gene de Aha1, em uma célula ou mamífero, em que o ds- RNA compreende um filamento antisentido compreendendo uma região de complementaridade que é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA formado na expressão de um gene de Aha, por exemplo um gene de Aha1, e em que a região de complementaridade é menos de 30 nucleotí- deos em comprimento, em geral 19-24 nucleotídeos em comprimento. O dsRNA pode ser idêntico a um dos dsRNAs mostrados na Tabela 1 e Tabela 2, ou pode realizar clivagem de um mRNA que codifica um gene de Aha dentro da seqüência alvo de um dos dsRNAs mostrados na Tabela 1 e Ta- bela 2. Preferivelmente, o dsRNA tem pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 18, ou pelo menos 20 nucleotídeos contíguos por filamento em comum com pelo menos um filamento, mas preferivelmente ambos os filamentos, de um dos dsRNAs mostrados na Tabela 1 e Tabela 2. dsRNAs alternativos que alvejam outro lugar na seqüência alvo de um dos dsRNAs fornecidos na Tabela 1 e Tabela 2 podem ser facilmente de- terminados usando a seqüência alvo e a seqüência de Ahal de flanquea- mento.
O dsRNA compreende dois filamentos de RNA que são suficien- temente complementares para hibridarem-se para formar uma estrutura dú- plex. Um filamento do dsRNA (o filamento antisentido) compreende uma região de complementaridade que é substancialmente complementar, e em geral completamente complementar, a uma seqüência alvo, derivada da se- qüência de um mRNA formada durante a expressão de um gene de Aha, o outro filamento (o filamento sentido) compreende uma região que é com- plementar ao filamento antisentido, de modo que os dois filamentos hibri- dam-se e formam uma estrutura dúplex quando combinados sob condições adequadas. Em geral, a estrutura dúplex é entre 15 e 30, mais em geral en- tre 18 e 25, ainda mais em geral entre 19 e 24, e mais em geral entre 19 e 21 pares de base em comprimento. Similarmente, a região de complementa- ridade para a seqüência alvo é entre 15 e 30, mais em geral entre 18 e 25, ainda mais em geral entre 19 e 24, e mais em geral entre 19 e 21 nucleotí- deos em comprimento. O dsRNA da invenção pode também compreender uma ou mais extensões de nucleotídeo unifilamentar. O dsRNA pode ser sintetizado por métodos padrões conhecidos na técnica como também de- batidos abaixo, por exemplo, por uso de um sintetizador de DNA automati- zado, tal como está comercialmente disponível, por exemplo, de Biosearch, Applied Biosystems, Inc. Em uma modalidade preferida, um gene de Aha é o gene de Ahal humano. Em modalidades específicas, o primeiro filamento do dsRNA compreende as seqüências de sentido dos agentes de RNAi AL- DP-7301 - AL-DP-7346 e AL-DP-7561 - AL-DP-7564 (Tabela 1), e AL-DP- 9250 - AL-DP-9289 (Tabela 2), e a segunda seqüência é selecionada do grupo que consiste nas seqüências de antisentido de AL-DP-7301 - AL-DP- 7346 e AL-DP-7561 - AL-DP-7564 (Tabela 1) e AL-DP-9250 - AL-DP-9289 (Tabela 2).
Em outras modalidades, o dsRNA compreende pelo menos uma seqüência de nucleotídeo selecionada dos grupos de seqüências fornecidas acima para os agentes de RNAi AL-DP-7301 - AL-DP-7346 e AL-DP-7561 - AL-DP-7564 (Tabela 1) e AL-DP-9250 - AL-DP-9289 (Tabela 2). Em outras modalidades, o dsRNA compreende pelo menos duas seqüências selecio- nadas deste grupo, em que uma das pelo menos duas seqüências é com- plementar à outra das pelo menos duas seqüências, e uma das pelo menos duas seqüências é substancialmente complementar a uma seqüência de um mRNA gerada na expressão de um gene de Aha, por exemplo um gene de Aha1. Em geral, o dsRNA compreende dois oligonucleotídeos, em que um oligonucleotídeo pode ser descrito como o filamento sentido em um dos a- gentes de RNAi AL-DP-7301 - AL-DP-7346 e AL-DP-7561 - AL-DP-7564 (Tabela 1), e AL-DP-9250 - AL-DP-9289 (Tabela 2), e o segundo oligonucle- otídeo pode ser descrito como o filamento antisentido em um dos agentes de RNAi AL-DP-7301 - AL-DP-7346 e AL-DP-7561 - AL-DP-7564 (Tabela 1), e AL-DP-9250 - AL-DP-9289 (Tabela 2). A pessoa versada está bem ciente que dsRNAs compreenden- do uma estrutura dúplex de entre 20 e 23, mas especificamente 21, pares de base foram aclamadas como particularmente eficazes em induzir interfe- rência de RNA (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Porém, outros descobriram que dsRNAs mais curtos ou mais longos podem ser eficazes também. Nas modalidades descritas acima, em virtude da natureza das se- qüências de oligonucleotídeo fornecidas para os agentes de RNAi AL-DP- 7301 - AL-DP-7346 e AL-DP-7561 - AL-DP-7564 (Tabela 1), e AL-DP-9250 - AL-DP-9289 (Tabela 2), os dsRNAs da invenção podem compreender pelo menos um filamento de um comprimento de no mínimo 21 nt. Pode ser ra- zoavelmente esperado que dsRNAs mais curtos compreendendo uma das seqüências fornecidas aqui para os agentes de RNAi AL-DP-7301 - AL-DP- 7346 e AL-DP-7561 - AL-DP-7564 (Tabela 1), e AL-DP-9250 - AL-DP-9289 (Tabela 2), menos apenas alguns nucleotídeos em uma ou ambas termina- ções possam ser similarmente eficazes quando comparados aos dsRNAs descritos acima. Consequentemente, dsRNAs compreendendo uma se- qüência parcial de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais nucleotídeos contíguos de uma das seqüências dos agentes de RNAi AL-DP-7301 - AL- DP-7346 e AL-DP-7561 - AL-DP-7564 (Tabela 1), e AL-DP-9250 - AL-DP- 9289 (Tabela 2), e diferindo em sua habilidade para inibir a expressão de um gene de Aha, por exemplo um gene de Aha1, em um ensaio de FACS como descrito aqui abaixo em não mais que 5, 10, 15, 20, 25, ou 30% de inibição de um dsRNA compreendendo a seqüência total, é contemplado pela invenção.
Outros dsRNAs que clivam dentro da seqüência alvo dos agen- tes de RNAi AL-DP-7301 - AL-DP-7346 e AL-DP-7561 - AL-DP-7564 (Tabe- la 1), e AL-DP-9250 - AL-DP-9289 (Tabela 2), podem ser facilmente feitos usando a seqüência de gene de Ahal e a respectivo seqüência alvo. Os agentes de RNAi fornecidos na Tabela 1 e Tabela 2 identificam um sítio no mRNA de Ahal que é suscetível à clivagem com base em RNAi. Como tal a presente invenção inclui agentes de RNAi que alvejam dentro da seqüência alvejada por um dos agentes da presente invenção. Como aqui usado um dsRNA é dito alvejar dentro da seqüência de um segundo dsRNA se o dsR- NA clivar a mensagem em qualquer lugar dentro do mRNA sendo comple- mentar ao filamento antisentido do segundo dsRNA. Um tal dsRNA em geral terá pelos menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 18, ou pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de uma das seqüências fornecidas na Ta- bela 1 e Tabela 2 acopladas às seqüências de nucleotídeo adicionais tiradas da região contígua para a seqüência selecionada em um mRNA que codifica um gene de Aha. Por exemplo, os 15 nucleotídeos mais da 3' da seqüência alvo de AL-DP-7301 combinados com os próximos 6 nucleotídeos do gene de Ahal alvo produzem um agente de filamento simples de 21 nucleotídeos que são com base em uma das seqüências fornecidas na Tabela 1 e Tabela 2.
Preferivelmente, o segundo dsRNA é selecionado do grupo de dsRNAs que tem uma certa atividade na inibição da expressão de um gene de Aha em um ensaio adequado, tal como os ensaios descritos aqui. Por conseguinte, em certas modalidades preferidas, o segundo dsRNA é sele- cionado do grupo de AL-DP-7301, AL-DP-7308, AL-DP-7318, AL-DP-7320, AL-DP-7322, AL-DP-7324, AL-DP-7325, AL-DP-7326, AL-DP-7327, AL-DP- 7329, AL-DP-7331, AL-DP-7333, AL-DP-7340, AL-DP-7342, AL-DP-7303, AL-DP-7305, AL-DP-7307, AL-DP-7309, AL-DP-7316, e AL-DP-7337, AL- DP-7304, AL-DP-7312, AL-DP-7339, AL-DP-7344, AL-DP-7306, AL-DP- 7317, AL-DP-7346, AL-DP-7310, AL-DP-7323, AL-DP-7335, AL-DP-7338, AL-DP-7341, AL-DP-7302, AL-DP-7315, AL-DP-7328, AL-DP-7330, AL-DP- 7336, AL-DP-7345, AL-DP-9250, AL-DP-9251, AL-DP-9252, AL-DP-9253, AL-DP-9254, AL-DP-9255, AL-DP-9256, AL-DP-9257, AL-DP-9258, AL-DP- 9259, AL-DP-9260, AL-DP-9261, AL-DP-9262, AL-DP-9263, AL-DP-9264, AL-DP-9265, AL-DP-9266, AL-DP-9267, AL-DP-9268, AL-DP-9269, AL-DP- 9270, AL-DP-9271, AL-DP-9272, AL-DP-9273, AL-DP-9274, AL-DP-9275, AL-DP-9276, AL-DP-9277, AL-DP-9279, AL-DP-9280, AL-DP-9281, AL-DP- 9282, AL-DP-9283, AL-DP-9284, AL-DP-9285, AL-DP-9286, AL-DP-9287, AL-DP-9288, e AL-DP-9289.
O dsRNA da invenção pode conter uma ou mais disparidades para a seqüência alvo. Em uma modalidade preferida, o dsRNA da invenção contém não mais que 3 disparidades. Se o filamento antisentido do dsRNA contiver disparidades para uma seqüência alvo, é preferível que a área de disparidade não esteja localizada no centro da região de complementarida- de. Se o filamento antisentido do dsRNA contiver disparidades para a se- qüência alvo, é preferível que a disparidade esteja restringida a 5 nucleotí- deos de qualquer terminação, por exemplo 5, 4, 3, 2, ou 1 nucleotídeo da terminação 5' ou 3' da região de complementaridade, e preferivelmente da terminação 5'. Por exemplo, para um filamento de dsRNA de 23 nucleotí- deos que é complementar a uma região de um gene de Aha, o dsRNA em geral não contenha nenhuma disparidade dentro dos 13 nucleotídeos cen- trais. Em outra modalidade, o filamento antisentido do dsRNA não contém nenhuma disparidade na região das posições 1, ou 2, às posições 9, ou 10, do filamento antisentido (contando de 5'-3'). Os métodos descritos dentro da invenção podem ser usados para determinar se um dsRNA que contém uma disparidade para uma seqüência alvo é eficaz em inibir a expressão de um gene de Aha. Consideração da eficácia dos dsRNAs com disparidades em inibir expressão de um gene de Aha é importante, especialmente se a região particular de complementaridade em um gene de Aha for conhecida ter vari- ação de seqüência polimórfica dentro da população.
Em uma modalidade, pelo menos uma terminação do dsRNA tem uma extensão de nucleotídeo unifilamentar de 1 a 4, em geral 1 ou 2 nucleotídeos. dsRNAs tendo pelo menos uma extensão de nucleotídeo tem inesperadamente propriedades inibidoras superiores que suas contrapartes com terminação cega. Além disso, os inventores presentes descobriram que a presença de apenas uma extensão de nucleotídeo fortalece a atividade de interferência do dsRNA, sem afetar sua estabilidade geral. dsRNA tendo apenas uma extensão provaram particularmente estável e eficaz in vivo, como também em uma variedade de células, meios de cultura de célula, sangue, e soro. Em geral, a extensão unifilamentar fica localizada na termi- nação 3'-terminal do filamento antisentido ou, alternativamente, na termina- ção 3'-terminal do filamento sentido. O dsRNA pode também ter uma termi- nação cega, em geral localizada na terminação 5' do filamento antisentido. Tais dsRNAs melhoraram a estabilidade e a atividade inibidora, desse modo permitindo administração em baixas dosagens, isto é, menos que 5 mg/kg peso do corpo do recipiente por dia. Em geral, o filamento antisentido do dsRNA tem uma extensão de nucleotídeo na terminação 3', e a terminação 5' é cego. Em outra modalidade, um ou mais dos nucleotídeos na extensão são substituídos com um tiofosfato de nucleosídeo.
Em ainda outra modalidade, o dsRNA é quimicamente modifi- cado para intensificar a estabilidade. Os ácidos nucléicos da invenção po- dem ser sintetizados e/ou modificados por métodos bem estabelecidos na técnica, tais como aqueles descritos em "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage1 S. L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nova Ior- que, NY, USA, que é por este meio incorporado aqui por referência. Exem- plos específicos de compostos de dsRNA preferidos úteis nesta invenção incluem dsRNAs contendo cadeias principais modificadas ou nenhuma liga- ção de internucleosídeo natural. Como definidos neste relatório descritivo, os dsRNAs tendo cadeias principais modificadas incluem aqueles que retêm um átomo de fósforo na cadeia principal e aqueles que não têm um átomo de fósforo na cadeia principal. Para o propósito deste relatório descritivo, e como às vezes referido na técnica, dsRNAs modificados não tendo um áto- mo de fósforo em sua cadeia principal de internucleosídeo podem também ser considerados ser oligonucleosídeos.
Cadeias principais de dsRNA modificadas preferidas incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos de quiral, fosforoditioatos, fosfo- triésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metila e outros de alquila incluindo fosfonatos de 3'-alquileno e fosfonatos de quiral, fosfinatos, fosfo- ramidatos incluindo fosforamidato de 3'-amino e aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, e bora- nofosfatos tendo ligações 3'-5' normais, análogos ligados de 2'-5' destes, e aqueles tendo polaridade invertida em que os pares adjacentes das unida- des de nucleosídeo são ligados 3'-5' a 5'-3' ou 2'-5' a 5'-2'. Vários sais, sais misturados e formas de ácidos livres são também inclusos. Patentes U. S. representativas que ensinam a preparação das ligações contendo fósforo acima incluem, mas não são limitadas a, Pat. U. S. Nos. 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; e 5.625.050, cada uma destas é aqui incorporada por referência.
Cadeias principais de dsRNA modificadas preferidas que não incluem um átomo de fósforo nelas têm cadeias principais que são formadas por ligações de internucleosídeo de alquila ou cicloalquila de cadeia curta, heteroátomos misturados e ligações de internucleosídeo de alquila ou de cicloalquila, ou uma ou mais ligações de internucleosídeo heteroatômico ou heterocíclico de cadeia curta. Estas incluem aquelas tendo ligações de mor- folino (formado na parte da porção de açúcar de um nucleosídeo); cadeias principais de siloxano; cadeias principais de sulfeto, sulfóxido e sulfona; ca- deias principais de formacetila e tioformacetila; cadeias principais de forma- cetila de metileno e tioformacetila; cadeias principais contendo alqueno; ca- deias principais de sulfamato; cadeias principais de metileneimino e metile- noidrazino; cadeias principais de sulfonato e sulfonamida; cadeias principais de amida; e similares tendo partes de componentes de N, O, S e CH2 mistu- radas.
Patente U. S. representativa que ensina a preparação dos oli- gonucleosídeos acima incluem, mas não são limitadas a, Pat. U. S. Nos. 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; e, 5.677.439, cada uma destas é aqui incorporada por referência.
Em outros miméticos de dsRNA preferidos, tanto o açúcar como a ligação de internucleosídeo, isto é, a cadeia principal, das unidades de nucleotídeo são substituídos com grupos novos. As unidades de base são mantidas para hibridação com um composto alvo de ácido nucléico apropri- ado. Um tal composto oligomérico, um dsRNA mimético que foi mostrado ter propriedades de hibridação excelentes, é referido como um ácido nucléico de peptídeo (PNA). Em compostos de PNA, a cadeia principal de açúcar de um dsRNA é substituída com uma amida contendo a cadeia principal, em particular uma cadeia principal de aminoetilglicina. As nucleobases são reti- das e são direta ou indiretamente ligadas aos átomos de nitrogênio de aza da porção de amida da cadeia principal. Patente U. S. representativo que ensinam a preparação dos compostos de PNA incluem, mas não são limita- das a, Pat. U. S. Nos. 5.539.082; 5.714.331; e 5.719.262, cada uma destas é aqui incorporada por referência. Mais ensinamento de compostos de PNA podem ser encontrados em Nielsen et al., Sience, 1991, 254, 1497-1500.
A maioria das modalidades preferidas da invenção são dsRNAs com cadeias principais de fosforotioato e oligonucleosídeos com cadeias principais de heteroátomo, e em particular -CH2-NH-CH2-, -CH2-N(CH3)-O- CH2- [conhecidas como uma cadeia principal de metileno (metilimino) ou MMI], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- e -N(CH3)-CH2-CH2- [em que a cadeia principal de fosfodiéster nativa é representada como -O-P- O-CH2-] da Pat. U. S. No. 5.489.677 acima referida, e as cadeias principais de amida da Pat. U. S. No. 5.602.240 acima referida. Também preferidos são dsRNAs tendo estruturas de cadeia principal de morfolino da Pat. U. S. No. 5.034.506 acima referida.
DsRNAs modificados podem também conter uma ou mais por- çãos de açúcar substituídas. DsRNAs preferidos compreendem um dos se- guintes na posição 2': OH; F; O-, S-, ou N-alquila; O-, S-, ou N-alquenila; O-, S- ou N-alquinila; ou O-alquil-O-alquila, em que a alquila, alquenila e alquini- la podem ser Ci a C-ιο alquila ou C2 a C-io alquenila e alquinila substituídas ou insubstituídas. Particularmente preferidos são 0[(CH2)n0]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, e 0(CH2)n0N[(CH2)nCH3)]2, onde nem são de 1 a cerca de 10. Outros dsR- NAs preferidos compreendem um dos seguintes na posição 2': Ci a Ci0 al- quila inferior, alquila inferior substituída, alcarila, aralquila, O-alcarila ou O- aralquila, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquila, heterocicloalcarila, aminoalquilamino, poli- alquilamino, silila substituída, um grupo de clivagem de RNA, um grupo re- pórter, um intercalator, um grupo para melhorar as propriedades farmacoci- néticas de um dsRNA, ou um grupo para melhorar as propriedades farma- codinâmicas de um dsRNA, e outros substituintes tendo propriedades simi- lares. Uma modificação preferida inclui 2'-metoxietóxi 2'-O-CH2CH2OCH3, também conhecido como 2'-0-(2-metoxietil) ou 2'-MOE (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) isto é, um grupo alcóxi-alcóxi. Uma modifi- cação preferida também inclui 2'-dimetilaminooxietóxi, isto é, um grupo O(CH2)2ON(CH3)2, também conhecido como 2'-DMAOE, como descrito nos exemplos mais abaixo, e 2'-dimetilaminoetoxietóxi (também conhecido na técnica como 2'-0-dimetilaminoetoxietila ou 2'-DMAEOE), isto é, 2'-0-CH2- O-CH2-N(CH2)2, também descrito nos exemplos mais abaixo.
Outras modificações preferidas incluem 2'-metóxi (2'-OCH3), 2'- aminopropóxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) e 2'-flúor (2'-F). Modificações similares podem também ser feita nas outras posições no dsRNA, particularmente na posição 3' do açúcar no nucleotídeo terminal 3' ou em dsRNAs ligados 2'-5' e na posição 5' do nucleotídeo terminal 5'. DsRNAs pode também ter mimé- ticos de açúcar tais como porçãos de ciclobutila no lugar do açúcar de pen- tofuranosila. Patente U. S. representativo que ensina a preparação de tais estruturas de açúcar modificada incluem, mas não são limitadas a, Pat. U. S. Nos. 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; e 5.700.920, algumas destas são de propriedade comum com o pedido de patente imediato, e cada uma destas é aqui incorporada por refe- rência em sua totalidade.
DsRNAs podem também incluir modificações ou substituições da nucleobase (freqüentemente referidas na técnica simplesmente como "base"). Como aqui usado, nucleobases "inalteradas" ou "naturais" incluem as bases de purina adenina (A) e guanina (G), e as bases de pirimidina timi- na (T), citosina (C) e uracila (U). Nucleobases modificadas incluem outras nucleobases sintéticas e naturais tais como 5-metilcitosina (5-me-C), 5- hidroximetila citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil e outros derivados de alquila da adenina e guanina, 2-propila e outros derivados de alquila da adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5- halouracila e citosina, 5-propinil uracila e citosina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8- tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas8-substituídas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometila e outras uracilas e citosinasõ- substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8-azaguanina e 8- azaadenina, 7-deazaguanina e 7-daazaadenina e 3-deazaguanina e 3- deazaadenina. Nucleobases também incluem aquelas descrevedas na Pat. U. S. No. 3.687.808, aquelas descrevedas em Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, aquelas descrevedas por Englisch et al., Ange- wandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, e aquelas descrevedas por Sanghvi, Y S., Capítulo 15, DsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. e Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Certas destas nucleobases são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos oligoméricos da invenção. Estes incluem pirimidinas 5- substituídas, 6-azapirimidinas e N-2, N-6 e 0-6 purinas substituídas, incluin- do 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5-propinilcitosina. Substituições de 5-metilcitosina foram mostradas aumentar a estabilidade do dúplex de ácido nucléico em 0,6-1, graus C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. e Lebleu, B., Eds., DsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, págs. 276-278) e as substituições de base são presentemente preferidas, até mesmo mais particularmente quando combinadas com modificações de açúcar de 2'-0-metoxietila.
Patentes U. S. representativas que ensinam a preparação de certas nucleobases modificadas acima observadas como também outras nucleobases modificadas incluem, mas não são limitadas, à Pat. U. S. No. 3.687.808 acima observada, como também a Pat. U. S. Nos. 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121. 5.596.091; 5.614.617; e 5.681.941, cada uma destas é aqui in- corporada por referência, e Pat. U. S. No. 5.750.692, também aqui incorpo- rada por referência.
Outra modificação dos dsRNAs da invenção envolve ligar quimi- camente ao dsRNA uma ou mais porçãos ou conjugados que intensificam a atividade, distribuição celular ou absorção celular do dsRNA. Tais porçãos incluem mas não são limitadas a porçãos de lipídio tais como uma porção de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sei. USA, 199, 86, 6553- 6556), ácido cólico (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994 4 1053- 1060), um tioéter, por exemplo, berilo-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. Ν. I. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), uma cadeia alifática, por exemplo, dodecandiol ou resí- duos de undecila (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimi- e, 1993, 75, 49-54), um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou trietil-amônio 1,2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-h-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), uma poliamina ou uma cadeia de polietileno glicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), ou ácido acético de adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), uma porção de palmitila (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), ou uma porção de octadecilamina ou de hexilamino- carboniloxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).
Patentes U. S. Representativas quem ensinam a preparação de tais conjugados de dsRNA incluem, mas não são limitadas a. Pat. U. S. Nos. 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717. 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263 5.214.136 5.258.506 5.391.723 5.565.552 5.597.696
4.876.335; 4.904.582
5.082.830; 5.112.963
5.262.536; 5.272.250
5.416.203. 5.451.463
5.567.810; 5.574.142
4.958.013 5.214.136 5.292.873 5.510.475 5.585.481
5.082.830 5.245.022 5.317.098 5.512.667 5.587.371
5.112.963 5.254.469 5.371.241 5.514.785 5.595.726
5.599.923; 5.599.928 e 5.688.941, cada uma destas é aqui in- corporada por referência.
Não é necessário para todas as posições em um composto da- do serem modificadas uniformemente, e de fato mais que uma das modifi- cações acima mencionadas podem ser incorporadas em um composto sozi- nho ou até mesmo a um nucleosídeo só dentro de um dsRNA. A presente invenção também inclui compostos de dsRNA que são compostos quiméri- cos. Compostos "quiméricos" de dsRNA ou "quimeras", no contexto desta invenção, são compostos de dsRNA, particularmente dsRNAs contendo du- as ou mais regiões quimicamente distintas, cada composta de pelo menos uma unidade de monômero, isto é, um nucleotídeo no caso de um composto de dsRNA. Estes dsRNAs tipicamente contêm pelo menos uma região em que o dsRNA é modificado para conferir no dsRNA resistência aumentada, à degradação de nuclease, absorção celular aumentada, e/ou afinidade au- mentada de ligação pelo ácido nucléico alvo. Uma região adicionai do dsR- NA pode servir como um substrato para enzimas capazes de clivar RNA:DNA ou híbridos de RNA:RNA. Por via de exemplo, RNase H é uma endonuclease celular que cliva o filamento de RNA de um dúplex de RNA:DNA. Portanto, ativação de RNase H resulta na clivagem do alvo de RNA, assim grandemente intensificando a eficiência da inibição de dsRNA da expressão do gene. Por conseguinte, resultados comparáveis podem ser freqüentemente obtidos com dsRNAs mais curtos quando dsRNAs quiméri- cos forem usados, comparados às deoxidsRNAs de fosforotioato hibridando com a mesma região alvo. Clivagem do alvo de RNA pode ser detectada habitualmente através de eletroforese em gel e, se necessário, técnicas de hibridação de ácido nucléico associadas conhecidas na técnica.
Em certas circunstâncias, o dsRNA pode ser modificados por um grupo não-ligante. Várias moléculas não-ligantes foram conjugadas com os dsRNAs para intensificar a atividade, distribuição celular ou absorção ce- lular do dsRNA, e procedimentos para executar tais conjugações estão dis- poníveis na literatura científica. Tais porçãos não-ligantes incluíram porçãos de lipídio, tais como colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), um tioéter, por exemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. Ν. Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), uma cadeia alifática, por exemplo, dodecandiol ou resíduos de undecila (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou 1,2-di-O-hexadecil- rac-glicero-3-h-fosfonato de trietilamônio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), uma ca- deia de poliamina ou uma de polietileno glicol (Manoharan et al., Nucleosi- des & Nucleotides, 1995, 14:969), ou ácido acético de adamantano (Mano- haran et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), uma porção de palmitila (Mi- shra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), ou uma octadecilamina ou porção de hexilamino-carbonii-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais conjugados de dsRNA foram listadas a- cima. Protocolos de conjugação típicos envolvem a síntese de dsRNAs que carrega um aminoligante a uma ou mais posições da seqüência. O grupo amino é depois reagido com a molécula que é conjugada usando reagentes apropriados de acoplamento ou ativadores. A reação de conjugação ou po- de ser executada ainda com o dsRNA ligado ao suporte sólido ou seguindo clivagem do dsRNA na fase de solução. Purificação do conjugado de dsRNA por HPLC tipicamente fornece o conjugado puro.
AGENTES DE RNAi CODIFICADO POR VETOR
O dsRNA da invenção pode também ser expressado de vetores virais intracelularmente recombinantes in vivo. Os vetores virais recombinan- tes da invenção compreendem seqüências que codificam o dsRNA da in- venção e qualquer promotor adequado para expressar as seqüências de dsRNA. Promotores adequados incluem, por exemplo, as seqüências de promotor Pol Ill de U6 ou H1 e o promotor de citomegalovírus. Seleção de outros promotores adequados está dentro da habilidade na técnica. Os veto- res virais recombinantes da invenção podem também compreender promo- tores induzíveis ou reguláveis para expressão do dsRNA em um tecido parti- cular ou em um ambiente intracelular particular. O uso de vetores virais re- combinantes para liberar dsRNA da invenção para as células in vivo é deba- tido em mais detalhe abaixo.
dsRNA da invenção pode ser expressado de um vetor viral re- combinante ou como duas moléculas de RNA separadas, complementares, ou como uma molécula de RNA simples com duas regiões complementares.
Qualquer vetor viral capaz de aceitar as seqüências de codifica- ção para a(s) molécula(s) de dsRNA a ser(em) expressada(s) pode ser usa- do, por exemplo vetores derivados de adenovírus (AV); adenovírus associa- do (AAV); retrovírus (por exemplo, lentivírus (LV), Rhabdovírus, vírus de leu- cemia murina); vírus do herpes, e outros. O tropismo dos vetores virais pode ser modificado mediante pseudotipagem dos vetores com proteínas de en- velope ou outros antígenos de superfície de outros vírus, ou substituindo a proteína de capsídeo virais diferentes, conforme apropriado.
Por exemplo, vetores Ientivirais da invenção podem ser pseudo- tipado com proteínas de superfície de vírus de estomatite vesicular (VSV), raivas, Ebola, Mokola, e outros. Vetores de AAV da invenção podem ser fei- tos para alvejar células diferentes criando os vetores para expressar soroti- pos diferentes da proteína de capsídeo. Por exemplo, um vetor de AAV que expressa um capsídeo de sorotipo 2 em um genoma de sorotipo 2 é chama- do AAV 2/2. Este gene de capsídeo de sorotipo 2 no vetor AAV 2/2 pode ser substituído por um gene de capsídeo de sorotipo 5 para produzir um vetor AAV 2/5. Técnicas para construir vetores de AAV que expressam sorotipos de proteína de capsídeo diferentes estão dentro da habilidade na técnica; vide, por exemplo, Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801, a des- creveção inteira desta é aqui incorporada por referência.
Seleção de vetores virais recombinantes adequados para o uso na invenção, métodos para inserir seqüências de ácido nucléico para ex- pressar o dsRNA no vetor, e métodos de liberar o vetor viral para as células de interesse estão dentro da habilidade na técnica. Vide, por exemplo, Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechni- ques 6: 608-614; MiIIerA D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; e Rubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406, as descreveções inteiras destas são aqui incorporadas por referência.
Vetores virais preferidos são aqueles derivados de AV e AAV.
Em uma modalidade particularmente preferida, o dsRNA da invenção é ex- pressado como duas moléculas de RNA unifilamentar complementares se- paradas de um vetor de AAV compreendendo, por exemplo, os promotores de RNA recombinante de U6 ou H1, ou o promotor do citomegalovírus (CMV).
Um vetor de AV adequado para expressar o dsRNA da inven- ção, um método para construir o vetor de AV recombinante, e um método para liberar o vetor em células alvas, são descritos em Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.
Vetores de AAV adequados para expressar o dsRNA da inven- ção, métodos para construir o vetor de AV recombinante, e métodos para liberar os vetores em células alvas são descritos em Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Pat. U. S. No. 5.252.479; Pat. U. S. No. 5.139.941; Pedido de Patente Internacional No. WO 94/13788; e Pedido de Patente Internacional No. WO 93/24641, as descre- veções inteiras destes são aqui incorporadas por referência.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO Ds-RNA
Em uma modalidade, a invenção fornece composições farma- cêuticas compreendendo um dsRNA, como descrito aqui, e um veículo far- maceuticamente aceitável. A composição farmacêutica compreendendo o dsRNA é útil para tratar uma doença ou distúrbio associado à expressão ou atividade de um gene de Aha1 tal como processos patológicos mediados por expressão de Ahal. Tais composições farmacêuticas são formuladas com base no modo de liberação. Um exemplo são composições que são formu- ladas para administração sistêmica por meio de liberação parenteral.
As composições farmacêuticas da invenção são administradas em dosagens suficientes para inibir expressão de um gene de Aha. Os in- ventores presentes surpreendentemente descobriram que, por causa de sua eficiência melhorada, as composições compreendendo o dsRNA da inven- ção podem ser administradas em baixas dosagens. Uma dosagem máxima de 5 mg de dsRNA por quilograma do peso do corpo do recipiente por dia é suficiente para inibir ou completamente suprimir a expressão de um gene de Aha.
Em geral, uma dose adequada de dsRNA estará na faixa de 0,01 micrograma a 5,0 miligramas por quilograma do peso do corpo do reci- piente por dia, em geral na faixa de 1 micrograma a 1 mg por quilograma do peso do corpo por dia. A composição farmacêutica pode ser administrada uma vez diariamente, ou o dsRNA pode ser administrado como duas, três, ou mais subdoses em intervalos apropriados ao longo do dia ou até mesmo usando infusão ou liberação contínua através de uma formulação de libera- ção controlada. Em cujo caso, o dsRNA contido em cada subdose deve ser correspondentemente menor para alcançar a dosagem diária total. A unida- de de dosagem pode também ser composta para liberação durante vários dias, por exemplo, usando uma formulação de liberação contínua conven- cional que fornece liberação contínua do dsRNA em vários períodos do dia. Formulações de liberação sustentada são bem-conhecidas na técnica e são particularmente úteis para liberação vaginal dos agentes, tais como poderi- am ser usadas com os agentes da presente invenção. Nesta modalidade, a unidade de dosagem contém um múltiplo correspondente da dose diária.
O artesão versado apreciará que certos fatores podem influen- ciar a dosagem e regulação requeridas para eficazmente tratar um sujeito, incluindo mas não-limitado à severidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, a saúde geral e/ou idade do sujeito, e outras doenças presentes. Além disso, tratamento de um sujeito com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode incluir um tratamento simples ou uma série de tratamentos. Estimativas de dosagens eficazes e meias-vidas in vivo para os dsRNAs individuais abrangidos pela invenção podem ser feitas usando metodologias convencionais ou em base da testagem in vivo usando um modelo animal apropriado, como descrito em outro lugar aqui.
Avanços em genéticas de camundongo têm gerado vários mo- delos de camundongo para o estudo de várias doenças humanas, tais como processos patológicos mediados por expressão de Aha. Tais modelos são usados para testagem in vivo de dsRNA, como também para determinar uma dose terapeuticamente eficaz.
A presente invenção também inclui composições e formulações farmacêuticas que incluem os compostos de dsRNA da invenção. As com- posições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de vários modos dependendo se tratamento local ou sistêmico é desejado e da área a ser tratada. Administração pode ser tópica, pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo através de nebuli- zador; intratraqueana, intranasal, epidérmica e transdérmica, oral ou paren- teral. Administração parenteral inclui injeção ou infusão intravenosa, intra- arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; ou intracraniano, por exemplo, administração intratecal ou intraventricular.
Composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir emplastos transdérmicos, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, pulverizações, líquidos e pós. Veículos farmacêuti- cos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e outros podem ser necessários ou desejáveis. Preservativos revestidos, luvas e ou- tros podem também ser úteis. Formulações tópicas preferidas incluem aque- las em que os dsRNAs da invenção estão em admistão com um agente de liberação tópico tal como lipídios, lipossomas, ácidos graxos, ésteres de áci- do graxo, esteróides, agentes quelantes e tensoativos. Lipídios e lipossomas preferidos incluem neutro (por exemplo dioleoilfosfatidil etanolamina = NARCÓTICO, dimiristoilfosfatidil colina = DMPC, distearolifosfatidil colina) negativo (por exemplo dimiristoilfosfatidil glicerol = DMPG) e catiônico (por exemplo dioleoiltetrametilaminopropila = DOTAP e dioleoilfosfatidil etanola- mina = DOTMA). DsRNAs da invenção podem ser encapsulados dentro de Iipossomas ou podem formar complexos com estes, em particular para Ii- possomas catiônicos. Alternativamente, dsRNAs podem ser complexados em lipídios, em particular em lipídios catiônicos. Ácidos graxos e ésteres preferidos incluem mas não são limitados a ácido araquidônico, ácido oléico, ácido eicosanóico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirísti- co, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoléico, ácido linolênico, dicapra- to, tricaprato, monooleína, dilaurina, gliceril 1-monocaprato, 1- dodecilazaciclo-heptan-2-ona, um acilcarnitina, um acilcolina, ou um éster de Cmo alquila (por exemplo isopropilmiristato IPM), monoglicerídeo, diglicerí- deo ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. As formulações tópi- cas são descritas em detalhes no pedido de patente U. S. No. 09/315.298 depositado em 20 de maio de 1999, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
Composições e formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, microparticulados, nanoparticulados, suspensões ou solu- ções em água ou meios não-aquosos, cápsulas, cápsulas de gel, sachês, comprimidos ou minicomprimidos. Espessantes, agentes flavorizantes, dilu- entes, emulsificantes, auxiliares de dispersão ou aglutinantes podem ser desejáveis. Formulações orais preferidas são aquelas em que os dsRNAs da invenção são administrados junto com um ou mais intensificadores de penetração, tensoativos, e quelantes. Tensoativos preferidos incluem ácidos graxos e/ou ésteres ou sais dos mesmos, ácidos biliares e/ou sais dos mesmos. Ácidos biliares/sais preferidos incluem ácido quenodeoxicólico (CDCA) e ácido ursodeoxiquenodeoxicólico (UDCA)1 ácido cólico, ácido de- sidrocólico, ácido deoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicode- oxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodeoxicólico, tauro-24,25-diidro- fusidato de sódio e glicodiidrofusidato de sódio. Ácidos graxos preferidos incluem ácido araquidônico, ácido undecanóico, ácido oléico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirítico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoléico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerila, 1-dodecilazaciclo-heptan-2-ona, um acilcarnitina, um acilcolina, ou um monoglicerídeo, um diglicerídeo ou um sal farmaceuti- camente aceitável dos mesmos (por exemplo sódio). Também preferidas são combinações de intensificadores de penetração, por exemplo, ácidos graxos/sais em combinação com ácidos biliares/sais. Uma combinação par- ticularmente preferida é o sal de sódio de ácido láurico, ácido cáprico e UD- CA. Intensificadores de penetração também incluem polioxietileno-9-lauril éter, polioxietileno-20-cetil éter. DsRNAs da invenção podem ser liberados oralmente, em forma granular incluindo partículas secadas pulverizadas, ou complexados para formar micro ou nanopartículas. Agentes complexadores de DsRNA incluem poliamino ácidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacri- latos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albumi- nas, amidos, acrilatos, polietilenoglicóis (PEG) e amidos; polialquilcianoacri- latos; poliiminas derivatizada de DEAE, polulanas, celuloses e amidos. A- gentes complexadores particularmente preferidos incluem quitosana, N- trimetilquitosana, poli-L-lisina, poli-histidina, poliornitina, poliesperminas, pvi- amina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P (TDAE), poliaminoesti- reno (por exemplo p-amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etilcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilcianoacrilato), poli(iso-hexilcinaoacrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albumina e DEAE-dextrana, polimetilacrilato, poli-hexilacrilato, poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido DL-láctico-co-gIólico (PLGA)), alginato, e polietilenoglicol (PEG). Formulações orais para dsRNAs e sua preparação são descritas em deta- lhes no pedido de patente U. S. No. 08/886,829 (depositado em 19 de julho de 1997), No. 09/108.673 (depositado em 1e de julho de 1998), No. 09/256.515 (depositado em 23 de fevereiro de 1999), No. 09/082.624 (de- positado em 21 de maio de 1998) e No. 09/315.298 (depositado em 20 de maio de 1999), cada um destes é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
Composições e formulações para administração parenteral, in- tratecal ou intraventricular podem incluir soluções aquosas estéreis que po- dem também conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados tais como, mas não-limitados a, intensificadores de penetração, compostos vei- culares e outros veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
Composições farmacêuticas da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, soluções, emulsões, e formulações contendo Iiposso- ma. Estes composições podem ser geradas de uma variedade de compo- nentes que incluem, mas não são limitados a, líquidos pré-formados, sólidos auto-emulsionantes e semissólidos auto-emulsionantes.
As formulações farmacêuticas da presente invenção, que po- dem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem de unida- de, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem- conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de tra- zer em associação os componentes ativos com o(s) veículo(es) farmacêuti- co(s) ou excipiente(s). Em geral, as formulações são preparadas trazendo uniforme e intimamente em associação os componentes ativos com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e depois, se ne- cessário, modelando o produto.
As composições da presente invenção podem ser formuladas em quaisquer de muitas possíveis formas de dosagem tais como, mas não- limitadas a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, géis macios, supositórios, e enemas. As composições da presente invenção po- dem também ser formuladas como suspensões em meios aquosos, não- aquosos ou misturados. Suspensões aquosas podem também conter subs- tâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrana. A suspensão pode tam- bém conter estabilizantes.
Em uma modalidade da presente invenção as composições farmacêuticas podem ser formuladas e usadas como espumas. Espumas farmacêuticas incluem formulações tais como, mas não-limitadas a, emul- sões, microemulsões, cremes, geléias e lipossomas. Embora basicamente similares em natureza estas formulações variem nos componentes e na consistência do produto final. A preparação de tais composições e formula- ções é em geral conhecidas àqueles versados nas técnicas farmacêuticas e de formulação e podem ser aplicadas à formulação das composições da presente invenção.
EMULSÕES
As composições da presente invenção podem ser preparadas e formuladas como emulsões. Emulsões são tipicamente sistemas heterogê- neos de um líquido disperso em outro na forma de gotículas que usualmente excedem 0,1 μm em diâmetro (Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Ν. I., volume 1, pág., 199; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lie- berman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N. I., Volume 1, pág., 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Ν. I., volu- me 2, pág., 335; Higuchi et al., em Remington1S Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, pág., 301). Emulsões são freqüen- temente sistemas bifásicos compreendendo duas fases líquidas imiscíveis intimamente misturadas e dispersas entre si. Em geral, emulsões podem ser ou a variedade de água-em-óleo (a/o) ou óleo-em-água (o/a). Quando uma fase aquosa for dividida finamente e dispersa como gotículas minuciosas em uma fase oleosa de volume, a composição resultante é chamada uma emul- são de água-em-óleo (a/o). Alternativamente, quando uma fase oleosa for dividida finamente e dispersa como gotículas minuciosas em uma fase a- quosa de volume, a composição resultante é chamada uma emulsão de ó- leo-em-água (o/a). Emulsões podem conter componentes adicionais além das fases dispersas, e o fármaco ativo que pode estar presente como uma solução ou na fase aquosa, fase oleosa ou si mesmo como uma fase sepa- rada. Excipientes farmacêuticos tais como emulsificantes, estabilizantes, corantes, e antioxidantes podem também estar presentes, quando necessá- rio, nas emulsões. Emulsões farmacêuticas podem também ser emulsões múltiplas tais como as que são compreendidas de mais de duas fases, por exemplo, no caso de emulsões de óleo-em-água-em-óleo (o/a/o) e água- em-óleo-em-água (a/o/a). Tais formulações complexas freqüentemente for- necem certas vantagens que as emulsões binárias simples não fornecem. Emulsões múltiplas em que as gotículas de óleo individuais de uma emulsão de o/a incluem gotículas de água pequenas constituem uma emulsão de a/o/a. Igualmente um sistema de gotículas de óleo incluídas nos glóbulos de água estabilizados em uma fase contínua oleosa fornece uma emulsão de o/a/o.
Emulsões são caracterizadas por pouca estabilidade termodi- nâmica ou nenhuma. Freqüentemente, a fase dispersa ou descontínua da emulsão é bem dispersa na fase externa ou contínua e mantida nesta forma através dos meios de emulsificantes ou da viscosidade da formulação. Qualquer uma das fases da emulsão pode ser um semissólido ou um sólido, como é o caso de bases de unguento do estilo de emulsão e cremes. Outros meios de estabilizar emulsões requerem o uso de emulsificantes que podem ser incorporados em qualquer fase da emulsão. Emulsificantes podem ser classificados amplamente em quatro categorias: tensoativos sintéticos, e- mulsificantes de ocorrência natural, bases de absorção, e sólidos finamente dispersos (Idson, em Pharmaceuticals Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Ν. I., volume 1, pág., 199).
Tensoativos sintéticos, também conhecidos como agentes ati- vos de superfície, encontraram ampla aplicabilidade na formulação de emul- sões e foram revisados na literatura (Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova lorque, Ν. I., volume 1, pág., 285; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Ν. I., 1988, volume 1, pág., 199). Tensoativos são tipicamente anfifílicos e com- preendem um hidrófilo e uma porção hidrofóbica. A razão da natureza hidro- fílico para hidrofóbica do tensoativo foi denominado o equilíbrio hidrófi- lo/lipófilo (HLB) e é uma valiosa ferramenta na categorização e seleção de tensoativos na preparação das formulações. Tensoativos podem ser classi- ficados em classes diferentes com base na natureza do grupo hidrófilo: não- iônico, aniônico, catiônico e anfotérico (Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova lorque, Ν. I., volume 1, pág., 285).
Emulsificantes de ocorrência natural usados em formulações de emulsão incluem lanolina, cera de abelha, fosfatídeos, Iecitina e acácia. Ba- ses de absorção possuem propriedades hidrofílicos de modo que elas po- dem absorver água para formar emulsões de a/o ainda retendo suas consis- tências semissólidas, tais como lanolina anidra e petrolato hidrófilo. Sólidos finamente divididos têm também sido especialmente usados como emulsifi- cantes finos em combinação com tensoativos e em preparações viscosas.
Estes incluem sólidos inorgânicos polares, tais como hidróxidos de metal pesado, argila não-intumescente tal como bentonita, atapulgita, hectorita, caulim, montmorilonita, silicato de alumínio coloidal e silicato de alumínio de magnésio coloidal, pigmentos e sólidos não-polares tais como carbono ou triestearato de glicerila.
Uma variedade grande de materiais não-emulsificantes é tam- bém incluída nas formulações de emulsão e contribui para as propriedades das emulsões. Estes incluem gorduras, óleos, ceras, ácidos graxos, alcoóis graxos, ésteres graxos, umectantes, colóides hidrófilos, conservantes e anti- oxidantes (Block, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Ν. I., volume 1, pág., 335; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Ν. I., volume 1, pág., 199).
Colóides hidrófilos ou hidrocolóides incluem gomas de ocorrên- cia natural e polímeros sintéticos tais como polissacarídeos (por exemplo, acácia, ágar, ácido algínico, carragenina, goma guar, goma caraia, e traga- canto), derivados de celulose (por exemplo, carboximetilcelulose e carboxi- propilcelulose), e polímeros sintéticos (por exemplo, carbômeros, éteres de celulose, e polímeros de carboxivinil). Estes dispersam ou intumescem em água para formar soluções coloidais que estabilizam as emulsões formado- ras filmes interfaciais fortes ao redor das gotículas de fase dispersa e au- mentar a viscosidade da fase externa. Uma vez que as emulsões freqüentemente contêm vários com- ponentes tais como carboidratos, proteínas, esteróis e fosfatídeos que po- dem facilmente suportar o crescimento de micróbios, estas formulações fre- qüentemente incorporam conservantes. Conservantes comumente usados incluídos nas formulações de emulsão incluem metil parabeno, propil para- beno, sais de amônio quaternário, cloreto de benzalcônio, ésteres de ácido p-hidroxibenzóico, e ácido bórico. Antioxidantes são também comumente adicionados às formulações de emulsão para impedir deterioração da formu- lação. Antioxidantes usados podem ser descontaminantes de radicais livres tais como tocoferóis, gaiatos de alquila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ou agentes redutores tais como ácido ascórbico e metabissulfito de sódio, e sinergistas de antioxidante tais como ácido cítrico, ácido tartárico, e lecitina.
A aplicação das formulações de emulsão por meio vias derma- tológicas, orais e parenterais e métodos para sua fabricação foi revisada na literatura (Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Ν. I., volume 1, pág., 199). Formulações de emulsão para liberação oral foram muito extensamen- te usadas por causa da facilidade de formulação, como também eficácia de um ponto de vista de absorção e de biodisponibilidade (Rosoff, em Pharma- ceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Ν. I., volume 1, pág., 245; Idson, em Pharmaceu- tical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Mareei Dek- ker, Inc., Nova Iorque, Ν. I., volume 1, pág., 199). Laxantes de base de óleo mineral, vitaminas solúveis em água e preparações nutritivas graxas altas estão entre os materiais que foram comumente administrados de forma oral como emulsões de o/a.
Em uma modalidade da presente invenção, as composições de dsRNAs e ácidos nucléicos são formuladas como microemulsões. Um mi- croemulsão pode ser definida como um sistema de água, óleo e anfifílico que é uma solução simples opticamente isotrópica e termodinamicamente líquida estável (Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rie- gere Banker (Eds.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Ν. I., volume 1, pág., 245). Tipicamente, as microemulsões são sistemas que são prepara- dos dispersando um óleo primeiro em uma solução de tensoativo aquosa e depois adicionando uma quantidade suficiente de um quarto componente, em geral um álcool de comprimento de intermediário de cadeia para formar um sistema transparente. Portanto, as microemulsões foram também descri- tas como dispersões termodinamicamente estáveis, isotropicamente claras de dois líquidos imiscíveis que são estabilizados por filmes interfaciais de moléculas ativas de superfície (Leung e Shah, em: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publi- shers, Nova Iorque, páginas 185-215). Microemulsões são comumente pre- paradas por meio de uma combinação de três a cinco componentes que incluem óleo, água, tensoativo, co-tensoativo e eletrólito. Se a microemulsão for do tipo água-em-óleo (a/o) ou uma óleo-em-água (o/a) é dependente das propriedades do óleo e tensoativo usados e da estrutura e embalagem ge- ométrica das cabeças polares e caudas dos hidrocarbonetos das moléculas de tensoativo (Schott, em Remington1S Pharmaceutical Sciences, Mack Pu- blishing Co., Easton, Pa., 1985, pág., 271).
O método fenomenológico utilizando diagramas de fase foi ex- tensivamente estudado e rendeu um conhecimento inclusivo, para alguém versado na técnica, de como formular microemulsões (Rosoff, em Pharma- ceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Ν. I., volume 1, pág., 245; Block, em Pharmaceu- tical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Mareei Dek- ker, Inc., Nova Iorque, Ν. I., volume 1, pág., 335). Comparadas às emulsões convencionais, as microemulsões oferecem a vantagem de solubilizar fár- macos insolúveis em água em uma formulação de gotículas termodinami- camente estáveis que são formadas espontaneamente.
Tensoativos usados na preparação de microemulsões incluem, mas não são limitados a, tensoativos iônicos, tensoativos não-iônicos, Brij 96, éteres de oleíla de polioxietileno, ésteres de ácido graxo de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (M0310), monooleato de hexaglicerol (P0310), pentaoleato de hexaglicerol (P0500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (M0750), sequioleato de decaglicerol (S0750), decaoleato de decaglicerol (DA0750), sozinho ou em combinação com cotensoativos. O cotensoativo, usualmente um álcool de cadeia curta tal como etanol, 1-propanol, e 1- butanol, serve para aumentar a fluidez interfacial penetrando no filme de tensoativo e por conseguinte criando um filme desordenado por causa do espaço vago gerado entre as moléculas de tensoativo. Porém, as microe- mulsões podem ser preparadas sem o uso de cotensoativos e sistemas de microemulsão auto-emulsificante livre de álcool são conhecidos na técnica. A fase aquosa pode tipicamente ser, mas não é limitada a, água, uma solu- ção aquosa do fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceróis, propileno glicóis, e derivados de etileno glicol. A fase de óleo pode incluir, mas não é limitada a, materiais tais como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, éste- res de ácido graxo, mono, di, e triglicerídeos de cadeia média (C8-C12), éste- res de ácido graxo de glicerila polioxietilada, alcoóis graxos, glicerídeos poli- glicolizados, C8-C10 glicerídeos saturados poliglicolizados, óleos vegetais e óleo de silicone.
Microemulsões são particularmente de interesse do ponto de vista de solubilização dos fármacos e a absorção intensificada dos fárma- cos. Microemulsões com base em lipídio (o/a e a/o) foram propostas intensi- ficar a biodisponibilidade oral dos fármacos, incluindo peptídeos (Constanti- nides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Microemulsões fornecem vanta- gens melhoradas de solubilização de fármaco, proteção de fármaco da hi- drólise enzimática, possível intensificação da absorção de fármaco devido às alterações induzidas por tensoativo na fluidez e permeabilidade da mem- brana, facilidade de preparação, facilidade de administração oral em formas de dosagem sólidas, potência clínica melhorada, e toxicidade diminuída (Constantinides et al., Pharmaceuticals Reserach, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Freqüentemente as microemulsões po- dem se formar espontaneamente quando seus componentes são reunidos em temperatura ambiente. Isto pode ser particularmente vantajoso ao formu- lar fármacos, peptídeos ou dsRNAs termoestáveis. Microemulsões têm tam- bém sido eficazes na liberação transdérmica de componentes ativos em a- plicações cosméticas e farmacêuticas. Espera-se que as composições de microemulsão e formulações da presente invenção facilite a absorção sis- têmica aumentada de dsRNAs e ácidos nucléicos do trato gastrointestinal, como também melhore a absorção celular local de dsRNAs e ácidos nucléi- cos dentro do trato gastrointestinal, vagina, cavidade bucal e outras áreas de administração.
Microemulsões da presente invenção podem também conter componentes adicionais e aditivos tais como monoestearato de sorbitan (Grill 3), Labrasol, e intensificadores de penetração para melhorar as propri- edades da formulação e intensificar a absorção dos dsRNAs e ácidos nu- cléicos da presente invenção. Intensificadores de penetração usados nas microemulsões da presente invenção podem ser classificados como perten- cendo a um dentre os tensoativos de cinco categorias vastas, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes, e não-tensoativos não-quelantes (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág., 92). Cada um destas classes foi debatida acima.
LIPOSSOMAS
Há muitas estruturas organizadas de tensoativos além das mi- croemulsões que foram estudadas e usadas para a formulação de fárma- cos. Estas incluem monocamadas, micelas, bicamadas e vesículas. Vesícu- las, tais como lipossomas, atraíram grande interesse por causa de sua es- pecificidade e a duração de ação que elas oferecem do ponto de vista de liberação de fármaco. Como usado na presente invenção, o termo "liposso- ma" significa uma vesícula composta de lipídios anfifílicos dispostos em uma bicamada ou bicamadas esféricas.
Lipossomas são vesículas unilamelares ou multilamelares tendo uma membrana formada de um material lipofílico e um interior aquoso. A porção aquosa contém a composição a ser liberada. Lipossomas catiônicos possuem a vantagem de serem capazes de fundirem-se com a parede da célula. Lipossomas não-catiônicos, embora não capazes de eficientemente fundirem-se como com a parede da célula, são absorvidos pelos macrófa- gos in vivo.
Para cruzar a pele mamífera intacta, as vesículas de lipídio têm que atravessar uma série de poros finos, cada com um diâmetro menor que 50 nm, sob a influência de um gradiente transdérmico adequado. Portanto, é desejável usar um Iipossoma que seja altamente deformável e capaz de a- travessar tais poros finos.
Mais vantagens dos Iipossomas incluem; Iipossomas obtidos de fosfolipídeos naturais são biocompatíveis e biodegradáveis; Iipossomas po- dem incorporar uma gama extensiva de água e fármacos solúveis em lipídio; Iipossomas podem proteger os fármacos encapsulados em seus comparti- mentos internos do metabolismo e degradação (Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Ν. I., volume 1, pág., 245). Considerações importantes na preparação de formulações de Iipossoma são a carga da superfície de lipí- dio, tamanho da vesícula e o volume aquoso dos lipossomas.
Lipossomas são úteis para a transferência e liberação de com- ponentes ativos para o sítio de ação. Porque a membrana Iipossomal é es- truturalmente similar às membranas biológicas, quando os lipossomas são aplicados a um tecido, os lipossomas começam a fundir com as membranas celulares e à medida que a fusão dos lipossomas e das células progride, os conteúdos Iipossomais são esvaziados na célula onde o agente ativo pode agir.
Formulações Iipossomais foram o foco de investigação extensi- va como o modo de liberação para muitos fármacos. Há evidência crescente que para administração tópica, os lipossomas apresentam várias vantagens sobre outras formulações. Tais vantagens incluem efeitos colaterais reduzi- dos relacionados à absorção sistêmica alta do fármaco administrado, acu- mulação aumentada do fármaco administrado ao alvo desejado, e a habili- dade para administrar uma ampla variedade de fármacos, hidrófilo e hidro- fóbico, na pele. Vários relatórios detalharam a habilidade dos Iipossomas para liberar agentes, incluindo DNA de peso molecular alto, na pele. Compostos incluindo analgésicos, anticorpos, hormônios e DNAs de peso molecular alto foram administrados à pele. A maior parte das aplicações resultou no alve- jamento da epiderme superior
Lipossomas enquadram-se em duas classes vastas. Liposso- mas catiônicos são Iipossomas positivamente carregados que interagem com as moléculas de DNA negativamente carregadas para formar um com- plexo estável. O complexo de DNA/lipossoma positivamente carregado liga à superfície da célula negativamente carregada e é interiorizado em um en- dossoma. Devido ao pH acídico dentro do endossoma, os Iipossomas são rompidos, liberando seus conteúdos no citoplasma da célula (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
Lipossomas que são sensíveis ao pH ou negativamente carre- gados, atraem o DNA ao invés do complexo com este. Uma vez que o DNA e o lipídio estão similarmente carregados, repulsão ao invés de formação de complexo ocorre. Não obstante, algum DNA é atraído para dentro do interior aquoso destes lipossomas. Lipossomas sensíveis ao pH foram usados para liberar DNA que codifica o gene de timidina cinase para monocamadas das células em cultura. Expressão do gene exógeno foi detectada nas células alvo (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
Um tipo principal da composição Iipossomal inclui fosfolipídeos diferentes de fosfatidilcolina naturalmente derivada. Composições Iiposso- mais neutras podem ser formadas, por exemplo, de fosfatidilcolina de dimi- ristoíla (DMPC) ou fosfatidilcolina de dipalmitoíla (DPPC). Composições Ii- possomais aniônicas em geral são formadas de fosfatidilglicerol de dimiristo- íla, enquanto lipossomas fusogênicas aniônicas são formadas primariamen- te de fosfatidiletanolamina de dioleoíla (DOPE). Outro tipo de composição lipossomal é formado de fosfatidilcolina (PC) tal como, por exemplo, PC de feijão-soja, e PC de ovo. Outro tipo é formado de misturas de fosfolipídeo e/ou fosfatidilcolina e/ou colesterol.
Vários estudos avaliaram a liberação tópica das formulações de fármacos Iipossomais à pele. Aplicação de Iipossomas contendo interferona à pele de cobaia resultou em uma redução das feridas de herpes da pele enquanto liberação de interferona por meio de outros meios (por exemplo como uma solução ou como uma emulsão) foi ineficaz (Weiner et al., Jour- nal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Também, um estudo adicional tes- tou a eficácia de interferona administrada como parte de uma formulação lipossomal para a administração de interferona usando um sistema aquoso, e concluiu que a formulação Iipossomal foi superior à administração aquosa (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).
Sistemas lipossomais não-iônicos foram também examinados para determinar sua utilidade na liberação de fármacos à pele, em particular sistemas compreendendo tensoativo não-iônico e colesterol. Formulações lipossomais não-iônicas compreendendo Novasome.TM. I (dilaurato de gli- cerila/colesterol/éter de polioxietileno-10-estearila) e Novasome.TM. Il (dies- tearato de glicerila/colesterol/éter de polioxietileno-10-estearil) foram usados para liberar ciclosporina-A na derme da pele do camundongo. Resultados indicaram que tais sistemas Iipossomais não-iônicos foram eficazes em faci- litar a deposição de ciclosporina-A em diferentes camadas da pele (Hu et al. S. Τ. P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
Lipossomas também incluem lipossomas "estericamente estabi- lizadas", um termo que, como aqui usado, refere-se aos lipossomas com- preendendo um ou mais Iipfdios especializados que, quando incorporados nos lipossomas, resultam em vidas de circulação otimizadas com relação aos lipossomas que carecem de tais lipídios especializados. Exemplos de lipossomas estericamente estabilizados são aqueles em que parte da por- ção de lipídio de formação de vesícula do lipossoma (A) compreende um ou mais glicolipídeos, tais como monosialogangliosídeo Gm1, ou (B) é derivati- zado com um ou mais polímeros hidrófilos, tais como uma porção de polieti- leno glicol (PEG). Embora não querendo estar preso a qualquer teoria parti- cular, a técnica acredita que, pelo menos para lipossomas estericamente estabilizados contendo gangliosídeos, esfingomielina, ou lipídios derivatiza- dos de PEG, as meia-vidas de circulação otimizadas destes lipossomas es- tericamente estabilizados derivam de uma absorção reduzida nas células do sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., FEBS Letters1 1987, 223, 42; Wu et al., Câncer Research, 1993, 53, 3765).
Vários Iipossomas compreendendo um ou mais glicolipídeos são conhecidos na técnica. Papahadjopoulos et al. (A Ann. Ν. I. Acad. Sci., 1987, 507, 64) relatou a habilidade de monosialogangliosídeo Gm 1, sulfato de galactocerebrosídeo e fosfatidilinositol melhorar as meia-vidas no sangue dos lipossomas. Estes achados foram expostos por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A, 1988, 85, 6949). Pat. U. S. No. 4.837.028 e WO 88/04924, ambos para Allen et al., descrevem lipossomas compreendendo (1) esfingomielina e (2) o gangliosídeo Gm1 ou um éster de sulfato de galac- tocerebrosídeo. Pat. U. S. No. 5.543.152 (Webb et al.) descreve lipossomas compreendendo esfingomielina. Lipossomas compreendendo 1,2-sn- dimiristoilfosfatidilcolina são descrevedos em WO 97/13499 (Lim et al).
Muitos lipossomas compreendendo Iipfdios derivatizados com um ou mais polímeros hidrófilos, e métodos de preparação dos mesmos, são conhecidos na técnica. Sunamoto et al. (Buli. Chem. Soe. Jpn., 1980, 53, 2778) descreveu lipossomas compreendendo um detergente não-iônico, 2C-I215G, que contém uma porção de PEG. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) observou que revestimento hidrófilo das partículas de poliestireno com glicóis poliméricos resulta em meia-vidas no sangue significativamente otimizadas. Fosfolipídeos sintéticos modificados para a ligação de grupos carboxílicos de polialquileno glicóis (por exemplo, PEG) são descritos por Sears (Pats. U. S. Nos. 4.426.330 e 4.534.899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) descreveu experimentos demonstrando que lipossomas compreendendo fosfatidiletanolamina (PE) derivatizada com PEG ou estea- rato de PEG tem aumentos significativos nas meia-vidas de circulação de sangue. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) esten- deu tais observações a outros fosfolipídeos derivatizados com PEG, por e- xemplo, DSPE-PEG, formados da combinação de diestearoilfosfatidiletano- lamina (DSPE) e PEG. Lipossomas tendo porçãos de PEG covalentemente ligadas em sua superfície externa são descritos na Patente européia No. EP O 445 131 Β1 e WO 90/04384 para Fisher. Composições Iipossomais con- tendo 1-20 por cento em mol de PE derivatizado com PEG, e métodos de uso das mesmas, são descritas por Woodle et al. (Pats. U. S. Nos. 5.013.556 e 5.356.633) e Martin et al. (Pat. U. S. No. 5.213.804 e Patente européia No. EP 0 496 813 B1). Lipossomas compreendendo vários outros conjugados de lipídio-polímero são descrevedos em WO 91/05545 e Pat. U. S. No. 5.225.212 (ambos para Martin et al.) e em WO 94/20073 (Zalipsky et al.). Lipossomas compreendendo lipídios de ceramida PEG-modificados são descritos em WO 96/10391 (Choi et al). Pat. U. S. No. 5.540.935 (Miyazaki et al.) e Pat. U. S. No. 5.556.948 (Tagawa et al.) descrevem Iipossomas con- tendo PEG que podem ser também derivatizados com porçãos funcionais em suas superfícies.
Um número limitado de Iipossomas compreendendo ácidos nu- cléicos é conhecido na técnica. WO 96/40062 para Thierry et al. descreve métodos para encapsular ácidos nucléicos de peso molecular alto em Iipos- somas. Pat. U. S. No. 5.264.221 para Tagawa et al. descreve Iipossomas ligados a proteína e afirma que os conteúdos de tais Iipossomas podem in- cluir dsRNA. Pat. U. S. No. 5.665.710 para Rahman et al. descreve certos métodos de encapsular oligodeoxinucleotídeos em lipossomas. WO 97/04787 para Amar et al. descreve lipossomas compreendendo dsRNAs alvejados para o gene de raf.
Transfersomas são ainda outro tipo de lipossomas, e são alta- mente agregados de lipídios deformáveis que são candidatos atrativos para veículos de liberação de fármaco. Transferssomas podem ser descritos co- mo gotículas de lipídio que são tão altamente deformáveis que eles são fa- cilmente capazes de penetrar através de poros que são menores que a gotí- cula. Transferssomas são adaptáveis ao ambiente no qual eles são usados, por exemplo eles estão auto-otimizantes (adaptáveis à forma dos poros na pele), auto-reparadores, freqüentemente alcançam seus alvos sem fragmen- tarem-se, e freqüentemente autocarregadores. Para fazer transferssomas é possível adicionar ativadores de borda de superfície, usualmente tensoati- vos, a uma composição Iipossomal padrão. Transferssomas foram usados para liberar albumina de soro à pele. A liberação mediada por transferssoma de albumina de soro foi mostrada ser tão eficaz quanto injeção subcutânea de uma solução contendo albumina de soro.
Tensoativos encontram ampla aplicação em formulações tais como emulsões (incluindo microemulsões) e lipossomas. O modo mais co- mum de classificar e avaliar as propriedades dos muitos tipos diferentes de tensoativos, naturais e sintéticos, é pelo uso do equilíbrio de hidrófilo/lipófilo (HLB). A natureza do grupo hidrófilo (também conhecido como a "cabeça") provê os meios mais úteis para categorizar os tensoativos diferentes usados nas formulações (Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Mareei Dekkerl Inc., Nova Iorque, Ν. I., 1988, pág., 285).
Se a molécula de tensoativo não for ionizada, é classificada como um tensoativo não-iônico. Tensoativos não-iônicos encontram ampla aplicação em produtos farmacêuticos e cosméticos e são utilizáveis em uma gama extensiva de valores de pH. Em geral seus valores de HLB variam de 2 a cerca de 18 dependendo de sua estrutura. Tensoativos não-iônicos in- cluem ésteres não-iônicos tais como ésteres de etileno glicol, ésteres de propileno glicol, ésteres de glicerila, ésteres de poliglicerila, ésteres de sorbi- tan, ésteres de sucrose, e ésteres etoxilados. Alcanolamidas e éteres não- iônicas tais como etoxilatos de álcool graxo, alcoóis propoxilados, e políme- ros de bloco etoxilados/propoxilados são também inclusos nesta classe. Os tensoativos de polioxietileno são os membros mais populares da classe de tensoativos não-iônicos.
Se a molécula de tensoativo carregar uma carga negativa quan- do for dissolvida ou dispersa em água, o tensoativo é classificado como ani- ônico. Tensoativos aniônicos incluem carboxilatos tais como sabões, Iactila- tos de acila, amidas de acila de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tais como sulfatos de alquila e sulfatos de alquila etoxilados, sulfonatos tais co- mo sulfonatos de alquil benzeno, isetionatos de acila, tauratos de acila e sulfossuccinatos, e fosfatos. Os membros mais importantes da classe de tensoativos aniônicos são os sulfatos de alquila e os sabões.
Se a molécula de tensoativo carregar uma carga positiva quan- do for dissolvida ou dispersada em água, o tensoativo é classificado como catiônico. Tensoativos catiônicos incluem sais de amônio quaternário e ami- nas etoxiladas. Os sais de amônio quaternário são os membros mais usa- dos desta classe.
Se a molécula de tensoativo tiver a habilidade ou carregar uma carga positiva ou negativa, o tensoativo é classificado como anfotérico. Ten- soativos anfotéricos incluem derivados de ácido acrílico, alquilamidas substi- tuídas, N-alquilbetaínas e fosfatídeos.
O uso de tensoativos em produtos de fármaco, formulações e em emulsões foi revisado (Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Mar- cel Dekker, Inc., Nova Iorque, Ν. I., 1988, pág., 285).
INTENSIFICADORES DE PENETRAÇÃO
Em uma modalidade, a presente invenção emprega vários in- tensificadores de penetração para realizar a liberação eficiente de ácidos nucléicos, particularmente dsRNAs, à pele dos animais. A maioria dos fár- macos está presente em solução tanto nas formas ionizadas como não- ionizadas. Porém, usualmente apenas fármacos solúveis em lipídio ou Iipofí- licos facilmente atravessam as membranas da célula. Foi descoberto que até mesmo fármacos não-lipofílicos podem cruzar as membranas da célula se a membrana a ser cruzada for tratada com um intensificador de penetra- ção. Além de auxiliar a difusão dos fármacos não-lipofílicos ao longo das membranas da célula, os intensificadores de penetração também intensifi- cam a permeabilidade dos fármacos lipofílicos.
Intensificadores de penetração podem ser classificados como pertencendo a um dentre cinco categorias vastas, isto é, tensoativos, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes, e não-tensoativos não-quelantes (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92). Cada uma das classes de intensificadores de penetração supracitadas são descritas abaixo em maior detalhe.
Tensoativos: com relação à presente invenção, os tensoativos (ou "agentes ativos de superfície") são entidades químicas que, quando dis- solvidas em uma solução aquosa, reduzem a tensão superficial da solução ou a tensão interfacial entre a solução aquosa e outro líquido, com o resul- tado que a absorção dos dsRNAs através da mucosa é intensificada. Além dos sais biliares e ácidos graxos, estes intensificadores de penetração inclu- em, por exemplo, Iauril sulfato de sódio, éter de polioxietileno-9-laurila e éter de polioxietileno-20-cetila) (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92); e emulsões perfluoroquímicas, tais como FC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Ácidos graxos: Vários ácidos graxos e seus derivados que atu- am como intensificadores de penetração incluem, por exemplo, ácido oléico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanóico), ácido mirístico, ácido palmí- tico, ácido esteárico, ácido linoléico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido ara- quidônico, 1-monocaprato de glicerol, 1-dodecilazaciclo-heptan-2-ona, acil- carnitinas, acilcolinas, C1-C10 alquil ésteres dos mesmos (por exemplo, meti- la, isopropila e t-butila), e mono- e di-glicerídeos dos mesmos (isto é, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92; Mura- nishi, Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
Sais biliares: O papel fisiológico da bílis inclui a facilitação da dispersão e absorção dos lipídios e vitaminas solúveis em gordura (Brunton, Capítulo 38 em: Goodman & Gilman The Pharmacological Basis of Thera- peutics, 9§ Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-HiII, Nova Iorque, 1996, págs. 934-935). Vários sais biliares naturais, e seus derivados sintéticos, atuam como intensificadores de penetração. Desse modo o termo "sais biliares" inclui quaisquer dos componentes de ocorrência natural da bílis como tam- bém qualquer de seus derivados sintéticos. Os sais biliares da invenção in- cluem, por exemplo, ácido eólico (ou seu sal de sódio farmaceuticamente aceitável, colato de sódio), ácido desidrocólico (deidrocolato de sódio), ácido deoxicólico (deoxicolato de sódio), ácido glucólico (glucolato de sódio), ácido glicólico (glicocolato de sódio), ácido glicodeoxicólico (glicodeoxicolato de sódio), ácido taurocólico (taurocolato de sódio), ácido taurodeoxicólico (tau- rodeoxicolato de sódio), ácido quenodeoxicólico (quenodeoxicolato de só- dio), ácido ursodeoxicólico (UDCA), tauro-24,25-diidro-fusidato de sódio (STDHF), glicodiidrofusidato de sódio e éter de polioxietileno-9-laurila (POE) (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pá- gina 92; Swinyard, Capítulo 39 Em: Remington1S Pharmaceuticals Sciences, Iei Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782-783; Muranishi, Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yama- shita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
Agentes Quelantes: Agentes quelantes, como usados com rela- ção à presente invenção, podem ser definidos como compostos que remo- vem íons metálicos da solução formando complexos com estes, com o re- sultado que a absorção dos dsRNAs através da mucosa é intensificada. Com relação ao seu uso como intensificadores de penetração na presente invenção, os agentes quelantes têm a vantagem adicionada de também ser- vir como inibidores de DNase, como a maioria das nucleases de DNA carac- terizadas requerem um íon de metal divalente para catálise e são desse modo inibidas pelos agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Agentes quelantes da invenção incluem mas não são limitados a etilenodiaminotetraacetato de dissódio (EDTA)1 ácido cítrico, salicilatos (por exemplo, salicilato de sódio, 5-metoxisalicilato e homovanilato), derivados de N-acila de colágeno, laurete-9 e derivados de N-amino acila de beta- dicetonas (enaminas) (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carri- er Systems, 1991, página 92; Muranishi, Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
Não-tensoativos não-quelantes: Como aqui usado, compostos de intensificação de penetração de não-tensoativo não-quelante podem ser definidos como compostos que demonstram atividade insignificante como agentes quelantes ou como tensoativos mas que no entanto intensificam a absorção dos dsRNAs através da mucosa alimentar (Muranishi, Criticai Re- views in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta classe de intensificadores de penetração incluí, por exemplo, ureias cíclicas insatura- das, derivados de 1-alquil- e 1-alquenilazaciclo-alcanona (Lee et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); e agentes anti-inflamatórios não-esteróides tais como diclofenaco sódico, indometacina e fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
Agentes que intensificam a absorção dos dsRNAs no nível celu- lar podem também ser adicionados às composições farmacêuticas e outras da presente invenção. Por exemplo, lipídios catiônicos, tais como Iipofectina (Junichi et al, Pat. U. S. No. 5.705.188), derivados de glicerol catiônico, e moléculas policatiônicas, tais como polilisina (Lollo et al., Pedido de Patente do PCT WO 97/30731), é também conhecido intensificar a absorção celular dos dsRNAs.
Outros agentes podem ser utilizados para intensificar a penetra- ção dos ácidos nucléicos administrados, incluindo glicóis tais como etileno glicol e propileno glicol, pirróis tais como 2-pirrol, azonas, e terpenos tais como Limoneno e mentona.
VEÍCULOS
Certas composições da presente invenção também incorporam compostos de veículo na formulação. Como aqui usado, "composto de veí- culo" ou "veículo" podem referir-se a um ácido nucléico, ou análogo do mesmo que seja inerte (isto é, não possua atividade biológica per se) mas seja reconhecido como um ácido nucléico por processos in vivo que redu- zem a biodisponibilidade de um ácido nucléico tendo atividade biológica, por exemplo, degradando o ácido nucléico biologicamente ativo ou promovendo sua remoção de circulação. A coadministração de um ácido nucléico e um composto de veículo, tipicamente com um excesso da última substância, pode resultar em uma redução substancial da quantidade de ácido nucléico restabelecido no fígado, rim ou outros reservatórios extracirculatórios, pre- sumivelmente devido à competição entre o composto de veículo e o ácido nucléico para um receptor comum. Por exemplo, o restabelecimento de um dsRNA de fosforotioato parcialmente em tecido hepático pode ser reduzido quando for coadministrado com ácido poliinosínico, sulfato de dextrana, áci- do policitídico ou ácido 4-acetamido-4'isotiociano-estilbeno-2,2'-dissulfônico (Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Anti- sense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
EXCIPIENTES
Em contraste com um composto de veículo, um "veículo farma- cêutico" ou "excipiente" é um solvente farmaceuticamente aceitável, agente de suspensão ou qualquer outro veículo farmacologicamente inerte para liberar um ou mais ácidos nucléicos a um animal. O excipiente pode ser lí- quido ou sólido e é selecionado, com a maneira planejada de administração em mente, para prover o volume desejado, consistência, etc., quando com- binado com um ácido nucléico e os outros componentes de uma composi- ção farmacêutica dada. Veículos farmacêuticos típicos incluem, mas não são limitados a, agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré- gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose, etc.); agentes de enchimento (por exemplo, Iactose e outros açúcares, celulose microcris- talina, pectina, gelatina, sulfato de cálcio, etil celulose, poliacrilatos ou fosfa- to de hidrogênio de cálcio, etc.); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, sílica, dióxido de silício coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, óleos vegetais hidrogenados, amido de milho, polietileno glicóis, benzoato de sódio, acetato de sódio, etc.); desintegrantes (por exemplo, a- mido, glicolato de amido de sódio, etc.); e agentes umectantes (por exem- plo, Iauril sulfato de sódio, etc).
Excipiente orgânico ou inorgânico farmaceuticamente aceitável adequado para administração não-parenteral que não deleteriamente reage com os ácidos nucléicos pode também ser usado para formular as composi- ções da presente invenção. Veículos farmaceuticamente aceitáveis adequa- dos incluem, mas não são limitados a, água, soluções de sal, alcoóis, polieti- leno glicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e outros.
Formulações para administração tópica dos ácidos nucléicos podem incluir soluções aquosas estéreis e não-estéreis, soluções não- aquosas em solventes comuns tais como alcoóis, ou soluções dos ácidos nucléicos em bases de óleo líquidas ou sólidas. As soluções podem também conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados. Excipientes orgâni- cos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis adequados para adminis- tração não-parenteral que não deleteriamente reage com os ácidos nucléi- cos podem ser usados.
Excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não são limitados a, água, soluções de sal, álcool, polietileno glicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, para- fina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e outros.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS PARA A LIBERAÇÃO PA- RA O TRATO RESPIRATÓRIO
Outro aspecto da invenção provê a liberação de agentes de IR- NA ao trato respiratório, particularmente para o tratamento de fibrose cística. O trato respiratório inclui as vias aéreas superiores, incluindo a orofaringe e laringe, seguidas pelas vias aéreas inferiores que incluem a traquéia segui- das por bifurcações nos brônquios e bronquíolos. As vias aéreas superiores e inferiores são chamadas as vias aéreas condutivas. Os bronquíolos termi- nais depois dividem em bronquíolos respiratórios que depois conduzem à última zona respiratória, os alvéolos, ou pulmão profundo. O pulmão profun- do, ou alvéolos, é o alvo primário de aerossóis terapêuticos inalados para liberação sistêmica dos agentes de iRNA.
Composições de liberação pulmonar podem ser liberadas atra- vés de inalação pelo paciente de uma dispersão de forma que a composi- ção, preferivelmente o agente de iRNA, dentro da dispersão possa alcançar o pulmão onde pode, por exemplo, ser absorvida facilmente através da regi- ão alveolar diretamente para a circulação do sangue. Liberação pulmonar pode ser eficaz tanto para liberação sistêmica como para liberação localiza- da para tratar doenças dos pulmões.
Liberação pulmonar pode ser alcançada através de métodos di- ferentes, incluindo o uso de formulações nebulizadas, aerossolizadas, mice- lulares e baseadas em pó seco; administração através de inalação pode ser oral e/ou nasal. Liberação pode ser alcançada com nebulizadores líquidos, inaladores com base em aerossol, e dispositivos de dispersão de pó seco. Dispositivos de dose medida são preferidos. Um dos benefícios de se usar um atomizador ou inalador é que o potencial para contaminação é minimi- zado porque os dispositivos ficam autocontidos. Dispositivos de dispersão de pós secos, por exemplo, liberam os fármacos que podem ser formulados facilmente como pós secos. Uma composição de iRNA pode ser estavel- mente armazenada como pós Iiofilizados ou secados por pulverização por si só ou em combinação com veículos de pó adequados. A liberação de uma composição para inalação pode ser mediada por um elemento de regulação de doseamento que pode incluir um cronômetro, contador de dose, disposi- tivo medidor de tempo, ou um indicador de tempo que quando incorporado no dispositivo permite rastreamento da dose, monitoramento de complacên- cia, e/ou desencadeamento de dose para um paciente durante a administra- ção do fármaco de aerossol.
Exemplos de dispositivos farmacêuticos para liberação de ae- rossol incluem inaladores de dose medida (MDIs), inaladores de pós secos (DPIs), e nebulizadores de jato de ar. Sistemas de liberação exemplares para inalação que podem ser facilmente adaptados para liberação dos agen- tes de iRNA em questão são descritos, por exemplo, nas Pats. U. S. Nos. 5.756.353; 5.858.784; e pedidos de patente do PCT W098/31346; W098/10796; WOOO/27359; W001/54664; W002/060412. Outras formula- ções de aerossol que podem ser usadas para liberar os agentes de iRNA são nas Pats. U. S. Nos. 6.294.153; 6.344.194; 6.071.497, e pedidos de pa- tente do PCT W002/066078; W002/053190; W001/60420; W000/66206. Também, métodos para liberar agentes de iRNA podem ser adaptados da- queles usados na liberação de outros oligonucleotídeos (por exemplo, um oligonucleotídeo antissentido) através de inalação, tais como descritos em Templin et al., Antisense Nucleic Acid Drugs Dev, 2000, 10:359-68; Sandra- sagra et al., Expert Opin Biol Ther, 2001, 1:979-83; Sandrasagra et al., Anti- sense NucIeicAcid Drug Dev, 2002, 12:177-81.
A liberação dos agentes inventivos pode também envolver a administração dos assim chamados "pró-fármacos", isto é formulações ou modificações químicas de uma substância terapêutica que requer alguma forma de processamento ou transporte através de sistemas inatos para o organismo sujeito para liberar a substância terapêutica, preferivelmente no sítio onde sua ação é desejada; esta modalidade posterior pode ser usada junto com liberação do trato respiratório, mas também junto com outras mo- dalidades da presente invenção. Por exemplo, os pulmões humanos podem remover ou rapidamente degradar os aerossóis depositados hidroliticamente cliváveis em períodos que variam de minutos a horas. Nas vias aéreas supe- riores, os epitélios ciliados contribuem para o "escalator mucociliar" por que as partículas são varridas das vias aéreas para a boca. Pavia, D., "Lung Mu- cociliary Clearance", em Aerossols and the Lung: Clinicai and Experimental Aspects, Clarke, S. W. e Pavia, D., Eds., Butterworths, Londres, 1984. Nos pulmões profundos, os macrófagos alveolares são capazes de realizar fago- citose de partículas logo após sua deposição. Warheit et al. Microscopy Res. Tech., 26: 412-422 (1993); e Brain, J. D., "Physiology and Pathophysiology of Pulmonary Macrophages", em The Reticuloendothelial System, S. M. Rei- chard e J. Filkins, Eds., Plenum, Nova Iorque, págs. 315-327, 1985.
Em modalidades preferidas, particularmente onde doseamento sistêmico com o agente de iRNA for desejado, os agentes de iRNA em ae- rossol são formulados como micropartículas. Micropartículas tendo um diâ- metro de entre 0,5 e dez mícrons podem penetrar os pulmões, atravessando a maioria das barreiras naturais. Um diâmetro de menos de dez mícrons é requerido para desviar-se da garganta; um diâmetro de 0,5 mícrons ou mai- or é requerido para evitar de ser exalado.
OUTROS COMPONENTES
As composições da presente invenção podem adicionalmente conter outros componentes adjuntos convencionalmente encontrados nas composições farmacêuticas, em seus níveis de uso estabelecidos na técni- ca. Desse modo, por exemplo, as composições podem conter materiais adi- cionais, compatíveis, farmaceuticamente ativos tais como, por exemplo, an- tipruríticos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios, ou pode conter materiais adicionais úteis em fisicamente formular as várias formas de dosagem das composições da presente invenção, tais como co- rantes, agentes flavorizantes, conservantes, antioxidantes, opacificadores, agentes espessantes e estabilizantes. Porém, tais materiais, quando adicio- nados, não deveriam interferir indevidamente com as atividades biológicas dos componentes das composições da presente invenção. As formulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes umectan- tes, emulsificantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, colo- rações, condimentos e/ou substâncias aromáticas e outros que não deleteri- amente interagem com o(s) ácido(s) nucléico(s) da formulação.
Suspensões aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrana. A suspensão pode também conter estabilizantes.
Certas modalidades da invenção fornecem composições farma- cêuticas que contêm (a) um ou mais agentes de dsRNA e (b) um ou mais outros agentes quimioterapêuticos que funcionam por um mecanismo de interferência de não-RNA. Exemplos de tais agentes quimioterapêuticos in- cluem mas não são limitados a daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, esorrubicina, bleomicina, mafosfa- mida, ifosfamida, arabinosida de citosina, bis-cloroetilnitrosureia, bussulfano, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, ansacrina, clorambucil, metilciclo- hexilnitrosureia, mostardas de nitrogênio, melfalano, ciclofosfamida, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiureia, deoxico- formicina, 4-hidroxiperoxiciclofosforamida, 5-fluorouracila (5-FU), 5- fluorodeoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colquicina, taxol, vincristina, vinblastina, etoposida (VP-16), trimetrexato, irinotecan, topotecan, gencitabi- na, teniposida, cisplatina e dietilestilbestrol (DES). Vide, em geral, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15§ Ed. 1987, págs. 1206-1228, Berkow et al., eds., Rahway, N. J. Quando usados com os compostos da invenção, tais agentes quimioterapêuticos podem ser usados individualmen- te (por exemplo, 5-FU e oligonucleotídeo), seqüencialmente (por exemplo, 5- FU e oligonucleotídeo durante um período de tempo seguido por MTX e oli- gonucleotídeo), ou em combinação com um ou mais outros tais agentes quimioterapêuticos (por exemplo, 5-FU, MTX e oligonucleotídeo, ou 5-FU, radioterapia e oligonucleotídeo). Fármacos anti-inflamatórios, incluindo mas não-limitados a fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais e corticosterói- des, e ármacos antivirais, incluindo mas não-limitados a ribivirina, vidarabi- na, aciclovir e ganciclovir, podem também ser combinados nas composições da invenção. Vide, em geral, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15a Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N. J., páginas 2499-2506 e 46- 49, respectivamente). Outros agentes quimioterapêuticos de não-dsRNA estão também dentro do escopo desta invenção. Dois ou mais compostos combinados podem ser usados junto ou seqüencialmente.
Toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas através de procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de célula ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre os efeitos tóxicos e terapêu- ticos é o índice terapêutico e pode ser expressada como a razão LD50ZED50. Compostos que exibem índice terapêutico alto são preferidos.
Os dados obtidos de ensaios de cultura de célula e estudos de animais podem ser usados na formulação uma faixa de dosagem para uso em seres humanos. A dosagem das composições da invenção fica em geral dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Para qualquer composto usado no método da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente de ensaios de cultu- ra de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para al- cançar uma faixa de concentração de plasma circulante do composto ou, quando apropriado, do produto de polipeptídeo de uma seqüência alvo (por exemplo, alcançando uma concentração diminuída do polipeptídeo) que in- clui a IC5O (isto é, a concentração do composto de teste que alcança uma inibição máxima da porção dos sintomas) conforme determinado na cultura de células. Tal informação pode ser usada para determinar doses úteis mais com precisão em seres humanos. Os níveis em plasma podem ser medidos, por exemplo, através de cromatografia líquida de alto desempenho.
Além de sua administração individualmente ou como uma plura- lidade, como debatido acima, os dsRNAs da invenção podem ser adminis- trados em combinação com outros agentes conhecidos eficazes no trata- mento de processos patológicos mediados por expressão de Aha. Em todo caso, o médico administrador pode ajustar a quantidade e regulação da ad- ministração de dsRNA em base dos resultados observados usando medidas de eficácia padrões conhecidas na técnica ou descritas aqui.
MÉTODOS PARA TRATAR DOENÇAS CAUSADAS POR EX- PRESSÃO DE UM GENE DE Aha
A invenção refere-se em particular ao uso de um dsRNA ou uma composição farmacêutica preparada deste para o tratamento de Fibrose Cística. Devido ao efeito inibidor na expressão de Ahal, um dsRNA de a- cordo com a invenção ou uma composição farmacêutica preparada deste pode intensificar a qualidade de vida de pacientes com Fibrose Cística.
Além disso, a invenção refere-se ao uso de um dsRNA ou uma composição farmacêutica da invenção visada para o tratamento de câncer, por exemplo, para inibir crescimento do tumor e metástase do tumor. Por exemplo, o dsRNA ou uma composição farmacêutica preparada deste pode ser usado para o tratamento de tumores sólidos, como câncer de mama, câncer pulmonar, câncer de cabeça e pescoço, câncer de cérebro, câncer abdominal, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de esôfago, câncer gastrointestinal, glioma, câncer de fígado, câncer de língua, neuroblastoma, osteossarcoma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de próstata, retinoblastoma, tumor de Wilm, mieloma múltiplo e para o tratamento de câncer de pele, como melanoma, para o tratamento de Iinfomas e câncer de sangue. A invenção também refere-se ao uso de um dsRNA de acordo com a invenção ou uma composição farmacêutica preparada deste para inibir expressão de Ahal e/ou para inibir acumulação de fluido de ascites e efu- são pleural em tipos diferentes de câncer, por exemplo, câncer de mama, câncer pulmonar, câncer de cabeça, câncer de pescoço, câncer de cérebro, câncer abdominal, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de esôfago, câncer gastrointestinal, glioma, câncer de fígado, câncer de língua, neuro- blastoma, osteossarcoma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de próstata, retinoblastoma, tumor de Wilm1 mieloma múltiplo, câncer de pele, melanoma, linfomas e câncer de sangue. Devido ao efeito inibidor em ex- pressão de Aha1, um dsRNA de acordo com a invenção ou uma composi- ção farmacêutica preparada deste pode intensificar a qualidade de vida de pacientes de câncer.
A invenção refere-se, além disso, ao uso de um dsRNA ou uma composição farmacêutica do mesmo, por exemplo, para tratar Fibrose Císti- ca ou câncer ou para impedir metástase do tumor, em combinação com ou- tros farmacêuticos e/ou outros métodos terapêuticos, por exemplo, com far- macêuticos conhecidos e/ou métodos terapêuticos conhecidos, tais como, por exemplo, aqueles que são empregados correntemente para tratar Fibro- se Cística ou câncer e/ou para impedir metástase do tumor. Onde a compo- sição farmacêutica visa para o tratamento de fibrose cística, preferência é dada a uma combinação com fisioterapia de tórax diária, enzimas pancreáti- cas oralmente aplicadas, antibióticos orais ou inalados diariamente para o- por-se à infecção pulmonar, terapia antiasma inalada, comprimidos de corti- costeróides, suplementos dietéticos de vitamina, especialmente AeD, ina- lação de Pulmozyme™, medicinas para aliviar a constipação ou melhorar a atividade dos suplementos de enzima, insulina para diabetes relacionada a CF, medicação para doença hepática associada a CF, e oxigênio para aju- dar com a respiração.
Onde a composição farmacêutica visa para o tratamento de câncer e/ou para impedir metástase do tumor, preferência é dada a uma combinação com terapia de radiação e agentes quimioterapêuticos, tais co- mo cisplatina, ciclofosfamida, 5-fluorouracila, adriamicina, daunorrubicina ou tamoxifeno.
A invenção pode também ser praticada incluindo com um agen- te de RNAi específico outro agente quimioterapêutico anticâncer, tal como qualquer agente quimioterapêutico convencional. A combinação de um a- gente de ligação específico com tais outros agentes pode potencializar o protocolo quimioterapêutico. Numerosos protocolos quimioterapêuticos se apresentarão na mente do médico versado como sendo capaz de incorpora- ção no método da invenção. Qualquer agente quimioterapêutico pode ser usado, incluindo agentes de alquilação, antimetabólitos, hormônios e anta- gonistas, radioisótopos, como também produtos naturais. Por exemplo, o composto da invenção pode ser administrado com antibióticos tais como doxorrubicina e outros análogos de antraciclina, mostardas de nitrogênio tais como ciclofosfamida, análogos de pirimidina tais como 5-fluorouracila, cis- platina, hidroxiureia, taxol e seus derivados naturais e sintéticos, e outros.
No caso de tumores misturados, tais como adenocarcinoma da mama onde os tumores incluem células dependentes de gonadotropina e independentes de gonadotropina, o composto pode ser administrado junto com Ieuprolida ou goserrelina como outro exemplo, (análogos de peptídeo sintéticos de LH- RH). Outros protocolos antineoplásticos incluem o uso de um composto de tetraciclina com outra modalidade de tratamento, por exemplo, cirurgia, radi- ação, etc., também referido aqui como "modalidades antineoplásticas ajun- tas". Desse modo, o método da invenção pode ser empregado com tais re- gimes convencionais com o benefício de reduzir os efeitos colaterais e in- tensificar a eficácia.
MÉTODOS PARA INIBIR EXPRESSÃO DE UM GENE DE Aha
Em ainda outro aspecto, a invenção provê um método para inibir a expressão de um gene de Aha em um mamífero. O método compreende administrar uma composição da invenção ao mamífero de modo que a ex- pressão do gene de Aha alvo, por exemplo Ahal, é silenciado. Por causa de sua especificidade alta, os dsRNAs da invenção especificamente alvejam os RNAs (primários ou processados) do gene de Aha alvo. Composições e mé- todos para inibir a expressão destes genes de Aha usando dsRNAs podem ser executados como descritos em outro lugar aqui.
Em uma modalidade, o método compreende administrar uma composição compreendendo um dsRNA, em que o dsRNA compreende uma seqüência de nucleotídeo que é complementar a pelo menos uma parte de uma transcrição de RNA de um gene de Aha1 por exemplo Aha1, do mamífero a ser tratado. Quando o organismo a ser tratado for um mamífero tal como um ser humano, a composição pode ser administrada por quais- quer meios conhecidos na técnica incluindo, mas não-limitada a vias orais ou parenterais, incluindo administração intravenosa, intramuscular, subcutâ- nea, transdérmica, via aérea (aerossol), nasal, retal, vaginal e tópica (inclu- indo bucal e sublingual). Em modalidades preferidas, as composições são administradas por infusão ou injeção intravenosa.
A menos que do contrário definido, todos termos técnicos e ci- entíficos aqui usados têm o mesmo significado que comumente entendido por alguém versado na técnica ao qual esta invenção compete. Embora mé- todos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou testagem da invenção, métodos e materiais ade- quados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionadas aqui são incorporados por refe- rência em sua totalidade. No caso de conflito, o relatório descritivo presente, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos, e e- xemplos são ilustrativos apenas e não intencionados ser limitativos.
EXEMPLOS
CAMINHADA DE GENE DE UM GENE DE Aha
Modelo de siRNA foi realizado para identificar siRNAs que alve- jam Aha1. As seqüências de mRNA de Aha 1 de Homo sapiens (NM_012111.1), Mus musculus (NM_146036.1) e Pan troglodytes (XM_510094.1) foram examinadas por análise de computador para identifi- car seqüências homólogas de 19 ou 21 nucleotídeos que rendem agentes de RNAi reativos cruzados entre estas três espécies. Daquelas identificadas, 48 tais seqüências foram selecionadas para interações não-alvas mínimas em ratos (pelo menos 3 disparidades para qualquer outro gene no genoma de rato, ou pelo menos duas disparidades para qualquer outro gene no ge- noma de rato, em que uma das ditas pelo menos duas disparidades fica lo- calizada em uma posição complementar à posição 9 ou 10 do filamento an- tisentido do agente de RNAi correspondente, contando 5' para 3') e os dsR- NAs correspondente sintetizados para triar (AL-DP-7301 - AL-DP-7346, vide Tabela 1). AL-DP-7561, AL-DP-7562, AL-DP-7563 e AL-DP-7564 que são adicionalmente reativos cruzados para Aha 2 de Mus musculus (NM_172391.3) e Rattus norvegicus (XM_223680.3), foram também sinteti- zados e triados. Além disso, umas 40 seqüências também foram seleciona- das para interações não-alvo mínimas prognosticadas em seres humanos (pelo menos 3 disparidades para qualquer outro gene no genoma humano, ou pelo menos duas disparidades para qualquer outro gene no genoma hu- mano, em que uma das ditas pelo menos duas disparidades fica localizada em uma posição complementar à posição 9 ou 10 do filamento antisentido do agente de RNAi correspondente, contando 5' para 3') e os dsRNAs cor- respondentes sintetizados para triar (AL-DP-9250 - AL-DP-9289, vide Tabela 2). 17 seqüências foram identificadas como pertencendo a ambos conjuntos (AL-DP-7301, AL-DP-7304, AL-DP-7305, AL-DP-7307, AL-DP-7310, AL-DP- 7312, AL-DP-7315, AL-DP-7316, AL-DP-7317, AL-DP-7323, AL-DP-7324, AL-DP-7332, AL-DP-7336, AL-DP-7337, AL-DP-7338, AL-DP-7342, e AL- DP-7344.
SÍNTESE DE dsRNA
FONTE DE REAGENTES
Onde a fonte de um reagente especificamente não for dada a- qui, tal reagente pode ser obtido de qualquer provedor de reagentes para biologia molecular em uma qualidade/pureza padrões para aplicação em biologia molecular.
SÍNTESE DE SIRNA
RNAs unifilamentares foram produzidos através de síntese de fase sólida em uma escala de 1 pmol usando um sintetizador 8909 Expedite (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Alemanha) e vidro de poro controlado (CPG, 500Á, Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemanha) como suporte sólido. RNA e RNA contendo nucleotídeos de 2'- O-metila foram gerados por síntese de fase sólida empregando as fosfora- miditas correspondentes e fosforamiditas de 2'-0-metilá, respectivamente (Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemanha). Estes blocos de constru- ção foram incorporados em sítios selecionados dentro da seqüência da ca- deia de oligorribonucleotídeo usando química de fosforamidita de nucleosí- deo padrão tal como descrita em Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S. L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, NI, EUA. Ligações de fosforotioato foram introduzidas por substituição da solu- ção de oxidante de iodo com uma solução do reagente de Beaucage (Chru- achem Ltd1 Glasgow, UK) em acetonitrila (1%). Outros reagentes subordina- dos foram obtidos de Mallinckrodt Baker (Griesheim, Alemanha).
Desproteção e purificação dos oligorribonucleotídeos brutos a- través de HPLC de permuta de ânion foram realizadas de acordo com os procedimentos estabelecidos. Rendimentos e concentrações foram determi- nados por absorção de UV de uma solução do respectivo RNA a um com- primento de onda de 260 nm usando um fotômetro espectral (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, UnterschleiBheim, Alemanha). RNA bifilamentar foi gerado misturando uma solução equimolar de filamentos complementares em tampão de anelamento (20 mM de fosfato de sódio, pH 6,8; 100 mM de cloreto de sódio), aquecido em um banho de água a 85 - 90°C durante 3 minutos e esfriado para temperatura ambiente em um período de 3 - 4 ho- ras. A solução de RNA anelada foi armazenada a -20°C até o uso.
Para a síntese de siRNAs conjugados com 3'-colesterol (aqui re- feridos como -Col-31), um suporte sólido apropriadamente modificado foi u- sado para síntese de RNA. O suporte sólido modificado foi preparado como segue:
Dietil-2-azabutano-1,4-dicarboxilato AA
<formula>formula see original document page 83</formula>
Uma solução aquosa a 4,7 M de hidróxido de sódio (50 ml) foi adicionada em uma solução esfriada a gelo agitada de cloridrato de glicinato de etila (32,19 g, 0,23 mol) em água (50 ml). Depois, acrilato de etila (23,1 g, 0,23 mol) foi adicionado e a mistura foi agitada em temperatura ambiente até conclusão da reação ser apurada por TLC. Após 19 h, a solução foi divi- dida com diclorometano (3 χ 100 ml). A camada orgânica foi secada com sulfato de sódio anidro, filtrada e evaporada. O resíduo foi destilado para fornecer AA (28,8 g, 61%).
Éster de etila de ácido 3-{Etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9- ilmetoxicarbonil-amino)-hexanoil]-amino}-propiônico AB
<formula>formula see original document page 84</formula>
AB
Ácido Fmoc-6-amino-hexanóico (9,12 g, 25,83 mmols) foi dis- solvido em diclorometano (50 ml) e esfriado com gelo. Diisopropilcarbodimi- da (3,25 g, 3,99 ml, 25,83 mmols) foi adicionada à solução a O°C. Foi depois seguido pela adição de Dietil-azabutano-1,4-dicarboxilato (5 g, 24,6 mmols) e dimetilamino piridina (0,305 g, 2,5 mmols). A solução foi trazida para tem- peratura ambiente e agitada por mais 6 h. Conclusão da reação foi apurada por TLC. A mistura de reação foi concentrada sob vácuo e acetato de etila foi adicionado para precipitar a diisopropil uréia. A suspensão foi filtrada. O filtrado foi lavado com 5% de ácido clorídrico aquoso, 5% de bicarbonato de sódio e água. A camada orgânica combinada foi secada em sulfato de sódio e concentrada para dar o produto bruto que foi purificado através de croma- tografia de coluna (50% EtOAC/Hexanos) para render 11,87 g (88%) de AB.
Éster de etila de ácido 3-[(6-amino-hexanoil)-etoxicarbonilmetil- amino]-propiônico AC
<formula>formula see original document page 84</formula>
AC
Éster de etila de ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9- ilmetoxicarbonilamino)-hexanoil]-amino}-propiônico AB (11,5 g, 21,3 mmols) foi dissolvido em 20% de piperidina em dimetilformamida a 0°C. A solução foi continuada agitando por 1 h. A mistura de reação foi concentrada sob vácuo, água foi adicionada ao resíduo, e o produto foi extraído com acetato de etila. O produto bruto foi purificado através de conversão em seu sal de cloridrato.
Éster de etila de ácido 3-({6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecaidro-1 H- ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}etoxicarbonilmetil- amino)-propiônico AD
<formula>formula see original document page 85</formula>
O sal de cloridrato de éster de etila de ácido 3-[(6-amino- hexanoil)-etoxicarbonilmetil-amino]-propiônico AC (4,7 g, 14,8 mmols) foi absorvido em diclorometano. A suspensão foi esfriada para 0°C em gelo. À suspensão, diisopropiletilamina (3,87 g, 5,2 ml, 30 mmols) foi adicionada. À solução resultante, cloroformato de colesterila (6,675 g, 14,8 mmols) foi adi- cionado. A mistura de reação foi agitada durante a noite. A mistura de rea- ção foi diluída com diclorometano e lavada com 10% de ácido clorídrico. O produto foi purificado através de cromatografia instantânea (10,3 g, 92%).
Éster de etila de ácido 1-{6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecaidro-1 H- ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}-4-oxo-pirrolidina-3- carboxílico AE <formula>formula see original document page 86</formula>
T-butóxido de potássio (1,1 g, 9,8 mmols) foi empastado em 30 ml de tolueno seco. A mistura foi esfriada para O0C em gelo e 5 g (6,6 mmols) de diéster AD foram adicionados lentamente com agitação dentro de 20 min. A temperatura foi mantida abaixo de 5°C durante a adição. A agita- ção foi continuada por 30 min a 0°C e 1 ml de ácido acético glacial foi adi- cionado, imediatamente seguido por 4 g de NaH2PCVH2O em 40 ml de á- gua. A mistura resultante foi extraída duas vezes com 100 ml de diclorome- tano cada e os extratos orgânicos combinados foram lavados duas vezes com 10 ml de tampão de fosfato cada, secados, e evaporados à secura. O resíduo foi dissolvido em 60 ml de tolueno, esfriado para 0°C e extraído com três porções de 50 ml de tampão de carbonato frio a pH 9,5. Os extratos aquosos foram ajustados para pH 3 com ácido fosfórico, e extraídos com cinco porções de 40 ml de clorofórmio que foram combinadas, secadas e evaporadas à secura. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna usando 25% de etilacetato/hexano para fornecer 1,9 g de b-cetoéster (39%).
Éster de 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17-tetradecaidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ila de ácido [6- (3-hidróxi-4-hidroximetil-pirrolidin-1 -il)-6-oxo-hexil]-carbâmico AF <formula>formula see original document page 87</formula>
AF
Metanol (2 ml) foi adicionado a gotas em um período de 1 h a uma mistura sob refluxo de b-cetoéster AE (1,5 g, 2,2 mmols) e boroidreto de sódio (0,226 g, 6 mmols) em tetraidrofurano (10 ml). Agitação foi continu- ada em temperatura de refluxo por 1 h. Após esfriar para temperatura ambi- ente, 1 N de HCI (12,5 ml) foi adicionado, a mistura foi extraída com etilace- tato (3 χ 40 ml). A camada de etilacetato combinada foi secada em sulfato de sódio anidro e concentrada sob vácuo para render o produto que foi puri- ficado através de cromatografia de coluna (10% de MeOH/CHCI3) (89%).
Ésterde 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17-tetradecaidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ila de ácido (6-{3- [Bis-(4-metóxi-fenil)-fenil-metoximetil]-4-hidróxi-pirrolidin-1-il}-6-oxo-hexil)- carbâmico AG
<formula>formula see original document page 87</formula>
Diol AF (1,25 gm 1,994 mmols) foi secado evaporando com piri- dina (2 χ 5mL) a vácuo. Piridina anidra (10 ml) e 4,4'-dimetoxitritilcloreto (0,724 g, 2,13 mmols) foi adicionado com agitação. A reação foi realizada em temperatura ambiente durante a noite. A reação foi extinguida pela adi- ção de metanol. A mistura de reação foi concentrada sob vácuo e ao resíduo diclorometano (50 ml) foi adicionado. A camada orgânica foi lavada com 1M de bicarbonato de sódio aquoso. A camada orgânica foi secada em sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada. A piridina residual foi removida eva- porando com tolueno. O produto bruto foi purificado através de cromatogra- fia de coluna (2% de MeOH/clorofórmio, Rf = 0,5 em 5% de MeOH/CHCI3) (1,75 g, 95%).
Éster de mono-(4-[bis-(4-metóxi-fenil)-fenil-metoximetil]-1 -{6-[17- (1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetrade- caidro-1H ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexahoil}-pirrolidin-3- il) de ácido succínico AH <formula>formula see original document page 89</formula>
O composto AG (1,0 g, 1,05 mmol) foi misturado com anidrido succínico (0,150 g, 1,5 mmol) e DMAP (0,073 g, 0,6 mmol) e secado em um vácuo a 40°C durante a noite. A mistura foi dissolvida em dicloroetano anidro (3 ml), trietilamina (0,318 g, 0,440 mL, 3,15 mmols) foi adicionada e a solu- ção foi agitada em temperatura ambiente sob atmosfera de argônio por 16 h. Foi depois diluída com diclorometano (40 ml) e lavada com gelo ácido cítrico aquoso frio (5 %p, 30 ml) e água (2 X 20 ml). A fase orgânica foi secada em sulfato de sódio anidro e concentrada à secura. O resíduo foi usado como tal para a próxima etapa.
CPG derivatizado com colesterol Al
<formula>formula see original document page 89</formula>
Succinato AH (0,254 g, 0,242 mmol) foi dissolvido em uma mis- tura de diclorometano/acetonitrila (3:2, 3 ml). Àquela solução DMAP (0,0296 g, 0,242 mmol) em acetonitrila (1,25 ml), 2,2'-Ditio-bis(5-nitropiridina) (0,075 g, 0,242 mmol) em acetonitrila/dicloroetano (3:1, 1,25 ml) foram adicionados sucessivamente. À solução resultante trifenilfosfina (0,064 g, 0,242 mmol) em acetonitrila (0,6 ml) foi adicionada. A mistura de reação tornou-se de cor laranja clara. A solução foi brevemente agitada usando um agitador de ação de pulsos (5 min). Alquilamina de cadeia Ionga-CPG (LCAA-CPG) (1,5 g, 61 mM) foi adicionada. A suspensão foi agitada por 2 h. A CPG foi filtrada através de um funil sinterizado e lavada sucessivamente com acetonitrila, diclorometano e éter. Grupos amino não-reagidos foram mascarados usan- do anidrido acético/piridina. O carregamento alcançado da CPG foi medido tirando a medição de UV (37 mM/g).
A síntese de siRNAs carregando um grupo bisdecilamida de á- cido 5'-12-dodecanóico (aqui referido como "5'-C32-") ou um grupo derivado de 5'-colesterila (aqui referido como "5'-Col-") foi executada como descrita em WO 2004/065601, exceto que, para o derivado de colesterila, foi execu- tada a etapa de oxidação usando o reagente de Beaucage para introduzir uma ligação de fosforotioato à terminação 5' do oligômero de ácido nucléico.
Seqüências de ácido nucléico são representadas abaixo usando nomenclatura padrão, e especificamente as abreviações da Tabela 2.
TABELA 3: ABREVIAÇÕES DOS MONÔMEROS DE NUCLEO- TÍDEO USADOS NA REPRESENTAÇÃO DA SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NU- CLÉICO. Será entendido que estes monômeros, quando presentes em um oligonucleotídeo, estão ligados mutuamente através de ligações de 5'-3'- fosfodiéster.
<table>table see original document page 90</column></row><table> <table>table see original document page 91</column></row><table>
a Letras maiúsculas representam 2'-deoxirribonucleotídeos (DNA), letras minúsculas representam ribonucleotídeos (RNA)
VETORES DE EXPRESSÃO DE DSRNA
Em outro aspecto da invenção, moléculas de dsRNA específicas para Ahal que modulam a atividade de expressão do gene Ahal são ex- pressadas das unidades de transcrição inseridas nos vetores de DNA ou RNA (vide, por exemplo, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., Publicação Internacional do PCT No. WO 00/22113, Conrad, Publica- ção Internacional do PCT No. WO 00/22114, e Conrad, Pat. U. S. No. 6.054.299). Estes transgenes podem ser introduzidos como uma construção linear, um plasmídeo circular, ou um vetor viral, que podem ser incorporados e herdados como um transgene integrado no genoma hospedeiro. O trans- gene pode também ser construído para permití-lo ser herdado como um plasmídeo extracromossômico (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1995)92:1292).
Os filamentos individuais de um dsRNA podem ser transcritos por promotores em dois vetores de expressão separados e podem ser co- transfeccionados em uma célula alvo. Alternativamente cada filamento indi- vidual do dsRNA pode ser transcrito por promotores ambos destes estão localizados no mesmo plasmídeo de expressão. Em uma modalidade prefe- rida, um dsRNA é expressado como uma repetição invertida unida por uma seqüência de polinucleotídeo de Iigador de modo que o dsRNA tem uma estrutura tronco e de alça.
Os vetores de expressão de dsRNA recombinante são em geral plasmídeos de DNA ou vetores virais. dsRNA que expressam vetores virais podem ser construídos com base em, mas não-limitado a, adenovírus asso- ciado (para uma revisão, vide Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)); adenovírus (vide, por exemplo, Berkner, et al., BioTe- chniques (1998) 6:616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434), e Rosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155)); ou alfavírus como também outros conhecidos na técnica. Retrovírus foram usados para introduzir uma varie- dade de genes em muitos tipos de células diferentes, incluindo células epite- liais, in vitro e/ou in vivo (vide, por exemplo, Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos e Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Nad. Acad. Sei. USA 89:7640-19 ; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl.Acad. Sei. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Im- munol. 150:4104-4115; patente U. S. No. 4.868.116; patente U. S. No. 4.980.286; Pedido de Patente do PCT WO 89/07136; Pedido de Patente do PCT WO 89/02468; Pedido de Patente do PCT WO 89/05345; e Pedido de Patente do PCT WO 92/07573). Vetores retrovirais recombinantes capazes de transduzir e expressar genes inseridos no genoma de uma célula podem ser produzidos transfeccionando o genoma retroviral recombinante em li- nhagens celulares de embalagem adequadas tais como PA317 e Psi-CRIP (Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6349). Vetores adenovirais recombinantes podem ser usados para infetar uma ampla variedade de células e tecidos em hos- pedeiros suscetíveis (por exemplo, rato, hamster, cachorro, e chimpanzé) (Hsu et al., 1992, J., Infectious Disease, 166:769), e também têm a vanta- gem de não requerer células mitoticamente ativas para infecção.
O promotor dirigindo a expressão de dsRNA ou em um plasmí- deo de DNA ou vetor viral da invenção pode ser uma RNA polimerase euca- riótica I (por exemplo promotor de RNA ribossômico), RNA Il polimerase (por exemplo promotor prematuro do CMV ou promotor da actina ou promotor de snRNA de U1) ou em geral promotor de RNA polimerase Ill (por exemplo promotor de RNA de SnRNA de U6 ou de 7SK) ou um promotor procariótico, por exemplo, o promotor T7, contanto que o plasmídeo de expressão tam- bém codifique T7 RNA polimerase requerida para transcrição de um promo- tor T7. O promotor pode também dirigir a expressão do transgene para o pâncreas (vide, por exemplo seqüência reguladora de insulina para o pân- creas (Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:2511-2515)).
Além disso, a expressão do transgene pode ser precisamente regulada, por exemplo, usando uma seqüência reguladora induzível e siste- mas de expressão tais como uma seqüência reguladora que seja sensível a certos reguladores fisiológicos, por exemplo, níveis de glicose circulante, ou hormônios (Docherty et al., 1994, FASEB J., 8:20-24). Tais sistemas de ex- pressão induzível, adequados para o controle de expressão do transgene em células ou em mamíferos incluem regulação por eedisona, através de estrogênio, progesterona, tetraciclina, indutores químicos de dimerização, e isopropil-beta-D1-tiogalactopiranosídeo (EPTG). Uma pessoa versada na técnica poderia selecionar a seqüência reguladora/promotora apropriada com base no uso intencionado do transgene de dsRNA.
Em geral, vetores recombinantes capazes de expressar molécu- las de dsRNA são liberados como descrito abaixo, e persistem em células alvos. Alternativamente, vetores virais podem ser usados que fornecem ex- pressão transiente das moléculas de dsRNA. Tais vetores podem ser admi- nistrados repetidamente quando necessário. Uma vez expressos, os dsR- NAs ligam ao RNA alvo e modulam sua função ou expressão. Liberação dos vetores de expressão de dsRNA pode ser sistêmica, tal como por adminis- tração intravenosa ou intramuscular, por administração às células alvos ex- plantadas do paciente seguidas por reintrodução no paciente ou por quais- quer outros meios que permitam introdução em uma célula alvo desejada.
plasmídeos de DNA de expressão de dsRNA são tipicamente transfeccionados em células alvas como um complexo com veículos de lipí- dios catiônicos (por exemplo Oligofectamina) ou veículos baseados de lipí- dios não-catiônicos (por exemplo Transit-TKO™). Transfecções de lipídios múltiplas para choques mediados por dsRNA que alvejam regiões diferentes de um gene de Aha 1 simples ou genes de Aha 1 múltiplos em um período de uma semana ou mais são também contempladas pela invenção. Introdução com sucesso dos vetores da invenção em células hospedeiras pode ser monitorada usando vários métodos conhecidos. Por exemplo, transfecção transiente pode ser sinalizada com repórter, tal como um marcador fluores- cente, tal como Proteína Fluorescente Verde (GFP). Transfecção estável de células ex vivo pode ser assegurada usando marcadores que provêem a célula transfeccionada com resistência aos fatores ambientais específicos (por exemplo, antibióticos e fármacos), tais como resistência à higromicina B.
As moléculas de dsRNA específicas para Ahal podem também ser inseridas nos vetores e usadas como vetores de terapia de gene para pacientes humanos. Vetores de terapia de gene podem ser liberados a um sujeito, por exemplo, por injeção intravenosa, administração local (vide pa- tente U. S. 5.328.470) ou através de injeção estereotática (vide por exemplo, Chen et al. (1994) Proc. Nati Acad. Sei. USA 91:3054-3057). A preparação farmacêutica do vetor de terapia de gene pode incluir o vetor de terapia de gene em um diluente aceitável, ou pode compreender uma matriz de libera- ção lenta no qual o veículo de liberação de gene está embutido. Alternati- vamente, onde o vetor de liberação de gene completo pode ser produzido intacto das células recombinantes, por exemplo, vetores retrovirais, a prepa- ração farmacêutica pode incluir uma ou mais células que produzem o siste- ma de liberação de gene.
SIRNA Ahal EM VARREDURA IN VITRO VARREDURA DE DOSE ÚNICA EM CÉLULAS Hela E MLE 12 Células HeLa foram obtidas da American Type Culture Collecti- on (Rockville, MD, cat. No. HB-8065) e cultivadas em F12 de HarrVs (Bioc- hrom AG, Berlim, Alemanha, cat. No. FG0815) suplementado para conter 10% de soro de bezerro fetal (FCS) (Biochrom AG, Berlim, Alemanha, cat. No. S0115), Penicilina 100 U/ml, Estreptomicina 100 pg/ml (Biochrom AG, Berlim, Alemanha, cat. No. A2213) a 37°C em uma atmosfera com 5% de CO2 em uma incubadora umedecida (Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Alemanha).
Células de MLE 12 foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD, cat. No. CRL-2110) e cultivadas em Meio de Hl- TES (mistura 1:1 de MEM de Dulbecco (Biochrom AG, Berlim, Alemanha, cat. No: F0435) + F12 de Ham (Biochrom AG, Berlim, Alemanha, cat. No: FG0815)) suplementado para conter 2% de soro de bezerro fetal (FCS) (Bi- ochrom AG, Berlim, Alemanha, cat. No. S0115), Penicilina 100 U/ml, Estrep- tomicina 100 Mg/ml (Biochrom AG, Berlim, Alemanha, cat. No. A2213), 4 mM de L-Glutamina (Biochrom AG, Berlim, Alemanha, cat. No: K0282), 1 χ Insu- lina/T ransferrina/Na-Selenita (Gibco: 51500-056), 10 nM de Hidrocortisona (Sigma Munique, Alemanha, cat. No: H6909), 10 nM de β-Estradiol (Sigma Munique, Alemanha, cat. No: E2257), e 10mM de HEPES (USB Europe GmBH, Staufen, Alemanha, cat. No.: 16926) a 37°C em uma atmosfera com 5% de CO2 em uma incubadora umedecida (Heraeus HERAcell, Kendro La- boratory Products, Langenselbold, Alemanha).
TRANSFECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE mRNA
Células HeLa e MLE12 foram semeadas a uma densidade de 2,0 χ 10^4 células/célula em placas de 96 cavidades para transfecção com siRNA, e transfeccionadas diretamente. Transfecção de siRNA (30 nM) foi realizada com Iipofectamina 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemanha, cat. No. 11668-019) como descrita pelo fabricante. 24 horas após transfec- ção, as células foram Iisadas e os níveis de mRNA de Ahal foram quantifi- cados com o kit Quantigene Explore (Genosprectra, Dumbarton Circle Fre- mont, USA, cat. No. QG-000-02) de acordo com o protocolo do fabricante. Níveis de mRNA de Ahal foram normalizados para mRNA de GAPDH. As leituras foram obtidas em quadruplicações para cada siRNA. Dúplices de siRNA não relacionados para o gene de Ahal foram usados como controle. A atividade de um dúplex de siRNA específico para Ahal dado foi expres- sada como por cento da concentração de mRNA de Ahal em células trata- das com relação à concentração de mRNA de Ahal em células tratadas com o dúplex de siRNA de controle.
TABELA 4: SEQÜÊNCIAS DE SONDA USADAS COM O KIT DE QUANTIGENE EXPLORE (GENOSPECTRA) NA QUANTIFICAÇÃO DE AHA1 DE Homo Sapiens (HS)
<table>table see original document page 96</column></row><table>
TABELA 5: SEQÜÊNCIAS DE SONDA USADAS COM KIT DE QUANTIGENE EXPLORE (GENOSPECTRA) NA QUANTIFICAÇÃO DE AHA1 DE Mus Musculus (mm)
<table>table see original document page 97</column></row><table> <table>table see original document page 98</column></row><table>
CURVA DE DOSE-RESPOSTA EM CÉLULAS HeLa Transfecção e quantificação de mRNA: Para transfecção com siRNA, as células HeLa foram semeadas a uma densidade de 2,0 χ 104 cé- lulas/cavidade em placas de 96 cavidades e transfeccionadas diretamente.
Transfecção de siRNA foi realizada com Iipofectamina 2000 (Invitrogen Gm- bH, Karlsruhe, Alemanha, cat. No. 11668-019) como descrito pelo fabrican- te. siRNAs foram concentrados de 30 nM em diluições de 3 vezes para 14 pM. 24 horas após transfecção, as células HeLa foram Iisadas e os níveis de mRNA de Ahal foram quantificados com o kit Quantigene Explore (Genos- prectra, Dumbarton Circle Fremont, USA, cat. No. QG-000-02) de acordo com o protocolo. Níveis de mRNA de Ahal foram normalizados para mRNA de GAP-DH. Para cada siRNA, quatro pontos de dados individuais foram colhidos. Dúplices de siRNA não relacionados ao gene de Ahal foram usa- dos como controle. A atividade de um dúplex de siRNA específico para A- ha1 dado foi expressada como por cento de concentração de mRNA de A- ha1 em células tratadas com relação à concentração de mRNA de Ahal em células tratadas com o dúplex de siRNA de controle. Ajuste XL foi usado para calcular os valores de IC5O-
Tabela 6 fornece valores para inibição da expressão de Ahal usando várias moléculas de dsRNA da invenção.
TABELA 6: mRNA De Ahal RESIDUAL EM % DE CONTROLE EM CÉLULAS HeLa E MLE12 TRATADAS COM SOLUÇÕES DE 30 nM DE VÁRIOS AGENTES DE RNAi ESPECÍFICOS PARA Aha1, E IC50 PARA AGENTES DE RNAi SELECIONADOS DETERMINADOS EM CÉLULAS HeLa <table>table see original document page 99</column></row><table> <table>table see original document page 100</column></row><table> <table>table see original document page 101</column></row><table>
Em resumo, AL-DP-7301, AL-DP-7308, AL-DP-7318, AL-DP- 7320, AL-DP-7322, AL-DP-7324, AL-DP-7325, AL-DP-7326, AL-DP-7327, AL-DP-7329, AL-DP-7331, AL-DP-7333, AL-DP-7340, e AL-DP-7342 inibi- ram expressão de Ahal em pelo menos 80% em células HeLa e MLE12, AL-DP-7303, AL-DP-7305, AL-DP-7307, AL-DP-7309, AL-DP-7316, e AL- DP-7337 inibiram expressão de Ahal em pelo menos 80% em células HeLa e em pelo menos 70% em células MLE12, AL-DP-7304, AL-DP-7312, AL- DP-7339, e AL-DP-7344 inibiram expressão de Ahal em pelo menos 80% em células HeLa e em pelo menos 60% em células MLE12, AL-DP-7306, AL-DP-7317, e AL-DP-7346 inibiram expressão de Ahal em pelo menos 70% em células HeLa e em pelo menos 50% em células MLE12, AL-DP- 7310, AL-DP-7323, AL-DP-7335, AL-DP-7338, e AL-DP-7341 inibiram ex- pressão de Ahal em pelo menos 40% em células HeLa e MLE12, e AL-DP- 7302, AL-DP-7315, AL-DP-7328, AL-DP-7330, AL-DP-7336, e AL-DP-7345 inibiram expressão de Ahal em pelo menos 20% em células HeLa e MLE12.
Além disso, AL-DP-9250, AL-DP-9252, AL-DP-9253, AL-DP- 9254, AL-DP-9255, AL-DP-9256, AL-DP-9257, AL-DP-9258, AL-DP-9259, AL-DP-9260, AL-DP-9264, AL-DP-9265, AL-DP-9266, AL-DP-9268, AL-DP- 9269, AL-DP-9270, AL-DP-9271, AL-DP-9273, AL-DP-9274, AL-DP-9275, AL-DP-9276, AL-DP-9277, AL-DP-9279, AL-DP-9280, AL-DP-9281, AL-DP- 9282, AL-DP-9283, AL-DP-9285, AL-DP-9287, e AL-DP-9289 inibiram ex- pressão de Ahal em pelo menos 80% em células HeLa, AL-DP-9261, AL- DP-9262, AL-DP-9263, AL-DP-9272, e AL-DP-9288 inibiram expressão de Ahal em pelo menos 70% em células HeLa, AL-DP-9263 inibiu expressão de Ahal em pelo menos 60% em células HeLa, AL-DP-9267 inibiu expres- são de Ahal em pelo menos 50% em células HeLa, AL-DP-9251 inibiu ex- pressão de Ahal em pelo menos 40% em células HeLa, e AL-DP-9286 ini- biu expressão de Ahal em pelo menos 30% em células HeLa. Listagem de seqüência
<110> Alnylam Pharmaceuticals, Inc.
<120> MODULAÇÃO DE RNAi DE AHA E USOS TERAPÊUTICOS DO MESMO
<130> 14174-132W01
<140> PCT/US07/69229 <141> 2007-05-18
<150> US 60/801.840 <151> 2006-05-19
<160> 217
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 1
auugguccac ggauaagcut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2 '-O-metila"
<400> 2
agcuuauccg uggaccaaut t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 3
gugaguaagc uugauggagt t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 4
cuccaucaag cuuacucact t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 5
agucaaaauc cccacuugut t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato <220> <221> <222> <223>
base_modificada
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,.15, 16, 17, 18, 19
/base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 6
acaagugggg auuuugacut t
21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 7
aaaucucgug gccuuaaugt t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 8
cauuaaggcc acgagauuut t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila" <400> 9
gagauuagug ugagccuugt t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
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<400> 10
caaggcucac acuaaucuct t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 11
aaucucgugg ccuuaaugat t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 12
ucauuaaggc cacgagauut t 21 <210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 13
agauuagugu gagccuugct t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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gcaaggcuca cacuaaucut t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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cgggcggacg ccaccaacgt t 21
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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cguugguggc guccgcccgt t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 17
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<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
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<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência
artificial
<220> <223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 19
gggcggacgc caccaacgut t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 20
acguuggugg cguccgccct t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 21
caacgucaac aacuggcact t 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para
<220>
infrarregulação de Aha 1 <223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 22
gugccaguug uugacguugt t 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 23
gcgggcggac gccaccaact t 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 24
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<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220> <221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 <223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 25
aucucguggc cuuaaugaat t 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
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<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 27
acgucaacaa cuggcacugt t 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nuclc-osideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila" <400> 28
cagugccagu uguugacgut t 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 29
accaacguca acaacuggct t 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 30
gccaguuguu gacguuggut t 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 31
acgcuggauc guggaggagt t 21 <210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 32
cuccuccacg auccagcgut t 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223>
Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 33
agacccacgc uggaucgugt t 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 51-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 34
cacgauccag cgugggucut t 21
<210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 35
gacccacgcu ggaucguggt t 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 36
ccacgaucca gcguggguct t 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 37
gaauuuacau cagcacccut t 21
<210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Agentes de RNAi para <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 38
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<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5' -fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 39
gggaauuuac aucagcacct t 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para inf rarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<4 00> 40
ggugcugaug uaaauuccct t 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220> <223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 41
ugggaauuua caucagcact t 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 42
gugcugaugu aaauucccat t 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAx para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 43
ccaacgucaa caacuggcat t 21
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220> <221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 <223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 44
ugccaguugu ugacguuggt t
21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 45
aaguggggug agggagacct t 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<4 00> 46
ggucucccuc accccacuut t 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila" <400> 47
acacaaaucu cguggccuut t 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 48
aaggccacga gauuugugut t 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 49
acccacgcug gaucguggat t 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificida
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 50
uccacgaucc agcgugggut t 21 <210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 51
gagucaaaau ccccacuugt t 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 52
caagugggga uuuugacuct t 21
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 53
gagcucuaua gaguguuuat t 21
<210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 54
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<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 55
ggcagcggua cuacuuugat t 21
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 56
ucaaaguagu accgcugcct t 21
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 57
gacacaaauc ucguggccut t 21
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 58
aggccacgag auuuguguct t 21
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 59
agcgggcgga cgccaccaat t 21
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Agentes de RNAi para
<220> <223> ácido nucléico 51-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 60
uugguggcgu ccgcccgcut t 21
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 61
caaaaucccc acuuguaagt t 21
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 62
cuuacaagug gggauuuugt t 21
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220> <221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 <223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 63
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<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 64
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<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 65
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<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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cucaucuuug gcaaggcuct t 21
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 67
ugacacaaau cucguggcct t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_iaodificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 70
aaacacucua uagagcucct t 21
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 71
cccacgcugg aucguggagt t 21
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 72
cuccacgauc cagcgugggt t 21
<210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de KNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 51-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 73
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<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5' carecendo de 5'-fosfato
terminal é um nucleosideo.
isto é, base + açúcar mas
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 74
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<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 75
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<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
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<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 77
agccugacac aaaucucgut t 21
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 78
acgagauuug ugucaggcut t 21
<210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Agentes de RNAi para
nfrarregulaçao de Aha 1
<220> <223> ácido nucléico 51-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 79
agauccccaa uuugucugat t 21
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 80
ucagacaaau uggggaucut t 21
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 81
agggagaccc acgcuggaut t 21
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220> <221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 <223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 82
auccagcgug ggucucccut t 21
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 83
gagggagacc cacgcuggat t 21
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 84
uccagcgugg gucucccuct t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nuclúico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila" <400> 85
gccaaguggg gugagggagt t 21
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 86
cucccucacc ccacuuggct t 21
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 87
uggcagcggu acuacuuugt t 21
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 88
caaaguagua ccgcugccat t 21 <210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<20>
<221> base_modifiçada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 89
ugagggagac ccacgcuggt t 21
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<400> 90
ccagcguggg ucucccucat t 21
<210> 91
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<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
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<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
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<220>
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<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
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gcucacacua aucuccacut t 21
<210> 93
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<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 93
aggagcucua uagaguguut t 21
<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2 1-O-metila"
<400> 94
aacacucuau agagcuccut t 21
<210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Agentes de RNAi para <220>
<223> ácido nucléico 51-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 95
agcgguacua cuuugagggt t 21
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 96
cccucaaagu aguaccgcut t 21
<210> 97
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220> <221> base modificada <222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 <223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila" <400> 97 cgcuggaucg uggaggagct t 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Seqcência artificial <220> <223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220> <223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 98
gcuccuccac gauccagcgt t 21
<210> 99
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-0-metila"
<400> 99
gcuggaucgu ggaggagcgt t 21
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 100
cgcuccucca cgauccagct t 21
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220> <221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 <223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 101
cuggaucgug gaggagcggt t 21
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<4 00> 102
ccgcuccucc acgauccagt t 21
<210> 103
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila"
<400> 103
uggaucgugg aggagcgggt t 21
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-O-metila" <400> 104
cccgcuccuc cacgauccat t 21
<210> 105
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 51-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 105
gccugacaca aaucucgugt t 21
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 106
cacgagauuu gugucaggct t 21
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 107
ccugacacaa aucucguggt t 21 <210> 108
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 108
ccacgagauu ugugucaggt t 21
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 109
acgccaccaa cgucaacaat t 21
<210> 110
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> basejmodifiçada
<222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi"
<400> 110
uuguugacgu ugguggcgut t 21
<210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 111
agcucuauag aguguuuact t 21
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 112
guaaacacuc uauagagcut t 21
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <4 00> 113
gggcuggcag cgguacuact t 21
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 114
guaguaccgc ugccagccct t 21
<210> 115
<211> 21
<212> DNft
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-teirminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 115
cuggcagcgg uacuacuuut t 21
<210> 116
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 116
aaaguaguac cgcugccagt t 21
<210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para
<220> <223> ácido nucléico 51-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidr6xi" <400> 117
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <4 00> 118
acuaaucucc acuucaucct t 21
<210> 119
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente <400> 119
accagaggag cucuauagat t 21
nucleosideo, isto é, base + açúcar mas
de 2'-hidróxi"
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220> <221> basejmodificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 120
ucuauagagc uccucuggut t 21
<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 51-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 121
aaguggagau uagugugagt t 21
<210> 122
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" «S00> 122
cucacacuaa ucuccacuut t 21
<210> 123
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 123
gaggagcucu auagagugut t 21
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 124
acacucuaua gagcuccuct t 21
<210> 125
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 125
gggagaccca cgcuggauct t 21
<210> 126
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi"
<400> 126
gauccagcgu gggucuccct t 21 <210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 127
ugagccugac acaaaucuct t 21
<210> 128
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para inf rarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 128
gagauuugug ucaggcucat t 21
<210> 129
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para inf rarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 129
gcggacgcca ccaacgucat t 21
<210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é uin nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 130
ugacguuggu ggcguccgct t 21
<210> 131
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 131
cggacgccac caacgucaat t 21
<210> 132
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 132
uugacguugg uggcguccgt t 21
<210> 133
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 133
gaaguggaga uuagugugat t 21
<210> 134
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400 134
ucacacuaau cuccacuuct t 21
<210> 135
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada <222> 1..19
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cucguggccu uaaugaaggt t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220> <223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidrõxi" <400> 136
ccuucauuaa ggccacgagt t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é ura nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
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<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
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<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
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<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
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<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
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<220> <223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
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<221> base_modificada <222> 1..19
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<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
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<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
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<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
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<220>
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<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
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<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1 <220>
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<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
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<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
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<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
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<223> ácido nucléico 51-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220> <221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 177
aaauccccac uuguaagaut t 21
<210> 178
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 178
aucuuacaag uggggauuut t 21
<210> 179
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 179
uccccaauuu gucugaugat t 21
<210> 180
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosideo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada
<222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 180
ucaucagaca aauuggggat t 21
<210> 181
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5 terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5 fosfato
<220>
<221> base_modifiçada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 181
auggccaagu ggggugaggt t 21
<210> 182
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 182
ccucacccca cuuggccaut t 21
<210> 183
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 51-fosfato
<220>
<221> base_modifiçada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 183
ggagucaaaa uccccacuut t 21 <210> 184
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Agentes de RNAi para infrarregulação de Aha 1
<220>
<223> ácido nucléico 5'-terminal é um nucleosídeo, isto é, base + açúcar mas carecendo de 5'-fosfato
<220>
<221> base_modificada <222> 1..19
<223> /base-mod = "base correspondente de 2'-hidróxi" <400> 184
aaguggggau uuugacucct t 21
<210> 185
<211> 45
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> seqüência de sonda de bDNA usada para quantificação de Ahal de Homo sapiens
<400> 185
gatgtaaatt cccattgctt ctcttttttc tcttggaaag aaagt 45
<210> 186
<211> 43
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> seqüência de sonda de bDNA usada para quantificação de Ahal de Homo sapiens
<400> 186
tgaactctgt tttgagggtg cttttttctc ttggaaagaa agt 43
<210> 187
<211> 46
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> seqüência de sonda de bDNA usada para quantificação de Ahal de Homo sapiens
<400> 187
gggtctactg actctccatt cattgttttt ctcttggaaa gaaagt 4 6
<210> 188
<211> 41
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> seqüência de sonda de bDNA usada para quantificação de Ahal de Homo sapiens
<400> 188
ccttgcgctc ctcagttttc tttttctctt ggaaagaaag t 41 <210> 189 <211> 44 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 189
ggtttttgaa ggagcaggct tagtttttct cttggaaaga aagt
44
<210> 190 <211> 47 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 190
acgctgtttt catcagacaa atttttttag gcataggacc cgtgtct 47
<210> 191 <211> 49 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 191
gctcacacta atctccactt catccttttt aggcatagga cccgtgtct 4 9
<210> 192 <211> 46 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 192
tcattaaggc cacgagattt gttttttagg cataggaccc gtgtct 46
<210> 193 <211> 45 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 193
<210> 194
<211> 44
<212> DNA
<213> Seqüência
artificial <220>
<223> seqüência de sonda de bDNA usada para quantificação de Ahal de Homo sapiens <400> 194
actccaacag gtctggcctg tttttaggca taggacccgt gtct 44
<210> 195
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência
artificial
<220>
<223> seqüência de sonda de bDNA usada para quantificação de Ahal de Homo sapiens <400> 195
gtcaggctca tctttggcaa g 21
<210> 196
<211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência
artificial
<220>
<223> seqüência de sonda de bDNA usada para quantificação de Ahal de Homo sapiens <400> 196
tagaagtttc accccttctt cct 23
<210> 197
<211> 18
<212> DNA
<213> Seqüência
artificial
<220>
<223> seqüência de sonda de bDNA usada para quantificação de Ahal de Homo sapiens <400> 197
agtgctggct gccccact 18
<210> 198 <211> 39 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 198
ctcgaacggc caggaacatt tttctcttgg aaagaaagt 39
<210> 199 <211> 44 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 199
gcacttgccc tcttcatttt ctatttttct cttggaaaga aagt
44 <210> 200 <211> 40 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 200
ttgatggatg cctccccatt ttttctcttg gaaagaaagt 40
<210> 201 <211> 44 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 201
aactctgtct tgagggtgct gattttttct cttggaaaga aagt 44
<210> 202 <211> 40 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 202
tttggcctgg ctttttgaat ttttctcttg gaaagaaagt 40
<210> 203 <211> 49 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 203
caagcttgtt cacttcggtc acctcttttt aggcatagga cccgtgtct
49
<210> 204 <211> 50 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 204
cctgacttag aggtacctgt ccagtttttt taggcatagg acccgtgtct 50
<210> 205
<211> 52
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> seqüência de sonda de bDNA usada para quantificação de Ahal de Mus musculus <400> 205
gatttccaca tgtcctttgt actgcacttt tttaggcata ggacccgtgt ct 52
<210> 206 <211> 45 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 206
attttcatca gacaaattgg gtttttaggc ataggacccg tgtct 45
<210> 207 <211> 46 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 207
taatctccac ttcatccacg cttttttagg cataggaccc gtgtct 4 6
<210> 208 <211> 44 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 208
tttcaccccg tcttccttca tttttaggca taggacccgt gtct
44
<210> 209 <211> 51 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 209
<210> 210 <211> 24 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> seqüência de sonda de <400> 210
aagataagtt tgcctttcct gttg
24
<210> 211 <211> 25 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> seqüência de sonda de bDNA usada para quantificaçao de Ah31 de Mus muscuIus <400> 211
cagtttgatg gtccactcat agaag 25
<210> 212
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> seqüência de sonda de bDNA usada para quantificação de Ahal de Mus musculus
<400> 212
catctttggc aaggctcaca c 21
<210> 213
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> seqüência de sonda de bDNA usada para quantificação de Ahal de Mus musculus
<400> 213
ttaaggccac gagatttgtg tcaggct 27
<210> 214
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> seqüência de sonda de bDNA usada para quantificação de Ahal de Mus musculus
<400> 214
gtaaattccc actgcttctc tcagaag 27
<210> 215
<211> 25
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> seqüência de sonda de bDNA usada para quantificação de Ahal de Mus musculus
<400> 215
cactggatct actgactctc cattc 25
<210> 216
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> seqüência de sonda de bDNA usada para quantificação de Aha1 de Mus inusculus
<400> 216
ctcagtcttt agtgctggct ggcc 24 <210> <211> <212> <213>
<220> <223>
217
23
DNA
Seqüência artificial
seqüência de sonda de bDNA usada para quantificação de Ahal de Mus musculus
<400> 217
ggagcagact tagccttgca agt 23

Claims (25)

1. Ácido ribonucléico bifilamentar (dsRNA) para inibir a expres- são de um gene Aha humano em uma célula, em que o dito dsRNA com- preende pelo menos duas seqüências que são complementares uma à outra e em que um filamento de sentido compreende uma primeira seqüência e um filamento de antisentido compreende uma segunda seqüência compre- endendo uma região de complementaridade que é substancialmente com- plementar a pelo menos uma parte de um mRNA que codifica um gene Aha e em que a dita região de complementaridade é menos de 30 nucleotídeos em comprimento e em que o dsRNA realiza clivagem de um mRNA que co- difica um gene Aha dentro da seqüência alvo de um segundo dsRNA tendo um filamento de sentido selecionado do grupo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: -109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: -143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: -179, SEQ ID NO: 181, e SEQ ID NO: 183, e um filamento de antisentido complementar ao último filamento de sentido e selecionado do grupo de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: -14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: -34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: -54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: -72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: -90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: -116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: -150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, e SEQ ID NO: 184.
2. dsRNA de acordo com a reivindicação 1, em que o dito gene Aha é um gene Ahal, e preferivelmente um gene Ahal de Homo sapiens.
3. dsRNA de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que, sob contato com uma célula que expressa o dito gene Aha, o dsRNA inibe ex- pressão do dito gene Aha na dita célula por pelo menos 20%.
4. dsRNA de acordo com a reivindicação 3, em que a dita inibi- ção de pelo menos 20% da expressão de um gene Aha é realizada em célu- las de HeLa e/ou MLE12.
5. dsRNA de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o dsRNA é selecionado do grupo de AL-DP-7301, AL-DP-7308, AL-DP- -7318, AL-DP-7320, AL-DP-7322, AL-DP-7324, AL-DP-7325, AL-DP-7326, AL-DP-7327, AL-DP-7329, AL-DP-7331, AL-DP-7333, AL-DP-7340, AL-DP- -7342, AL-DP-7303, AL-DP-7305, AL-DP-7307, AL-DP-7309, AL-DP-7316, e AL-DP-7337, AL-DP-7304, AL-DP-7312, AL-DP-7339, AL-DP-7344, AL-DP- -7306, AL-DP-7317, AL-DP-7346, AL-DP-7310, AL-DP-7323, AL-DP-7335, AL-DP-7338, AL-DP-7341, AL-DP-7302, AL-DP-7315, AL-DP-7328, AL-DP- -7330, AL-DP-7336, AL-DP-7345, AL-DP-9250, AL-DP-9251, AL-DP-9252, AL-DP-9253, AL-DP-9254, AL-DP-9255, AL-DP-9256, AL-DP-9257, AL-DP- -9258, AL-DP-9259, AL-DP-9260, AL-DP-9261, AL-DP-9262, AL-DP-9263, AL-DP-9264, AL-DP-9265, AL-DP-9266, AL-DP-9267, AL-DP-9268, AL-DP- -9269, AL-DP-9270, AL-DP-9271, AL-DP-9272, AL-DP-9273, AL-DP-9274, AL-DP-9275, AL-DP-9276, AL-DP-9277, AL-DP-9279, AL-DP-9280, AL-DP- -9281, AL-DP-9282, AL-DP-9283, AL-DP-9284, AL-DP-9285, AL-DP-9286, AL-DP-9287, AL-DP-9288, e AL-DP-9289.
6. dsRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações pre- cedentes, em que o dito dsRNA compreende pelo menos um nucleotídeo modificado.
7. dsRNA de acordo com a reivindicação 6, em que o dito nu- cleotídeo modificado é selecionado do grupo de: um nucleotídeo de 2'-0- metila modificada, um nucleotídeo compreendendo um grupo 5'- fosforotioato, e um nucleotídeo terminal ligado a um derivado de colesterila ou grupo bisdecilamida de ácido dodecanóico.
8. dsRNA de acordo com a reivindicação 6, em que o dito nu- cleotídeo modificado é selecionado do grupo de: um nucleotídeo 2'-deóxi-2'- flúor modificado, um nucleotídeo 2'-deóxi-modificado, um nucleotídeo trava- do, um nucleotídeo abásico, nucleotídeo 2'-amino-modificado, nucleotídeo -2'-alquil-modificado, nucleotídeo de morfolino, um fosforamidato, e um nu- cleotídeo compreendendo base não-natural.
9. Célula compreendendo o dsRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes.
10. Composição farmacêutica para inibir a expressão de um ge- ne Aha em um organismo, compreendendo um dsRNA e um veículo farma- ceuticamente aceitável, em que o dsRNA compreende pelo menos duas se- quências que são complementares uma à outra e em que um filamento de sentido compreende uma primeira seqüência e um filamento de antisentido compreende uma segunda seqüência compreendendo uma região de com- plementaridade que é substancialmente complementar a pelo menos uma parte de um mRNA que codifica um gene Aha, e em que a dita região de complementaridade é menos de 30 nucleotídeos em comprimento, e em que o dsRNA realiza clivagem de um mRNA que codifica um gene Aha dentro da seqüência alvo de um segundo dsRNA tendo um filamento de sentido sele- cionado do grupo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: -113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: -147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, e SEQ ID NO: 183, e um filamento de antisentido complementar ao último filamento de sentido e selecionado do grupo de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: -112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: -146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, -SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: -182, e SEQ ID NO: 184.
11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação -10, em que o dito gene Aha é um gene Aha1, e preferivelmente um gene Ahal de Homo sapiens.
12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que, sob contato com uma célula que expressa o dito gene Aha, o dsRNA inibe expressão do dito gene Aha na dita célula por pelo menos 20%.
13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação -12, em que a dita inibição de pelo menos 20% da expressão de um gene Aha é realizada em células de HeLa e/ou MLE12.
14. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindica- ções 10 a 13, em que o dsRNA é selecionado do grupo de AL-DP-7301, AL- DP-7308, AL-DP-7318, AL-DP-7320, AL-DP-7322, AL-DP-7324, AL-DP- -7325, AL-DP-7326, AL-DP-7327, AL-DP-7329, AL-DP-7331, AL-DP-7333, AL-DP-7340, AL-DP-7342, AL-DP-7303, AL-DP-7305, AL-DP-7307, AL-DP- - 7309, AL-DP-7316, AL-DP-7337, AL-DP-7304, AL-DP-7312, AL-DP-7339, AL-DP-7344, AL-DP-7306, AL-DP-7317, AL-DP-7346, AL-DP-7310, AL-DP- - 7323, AL-DP-7335, AL-DP-7338, AL-DP-7341, AL-DP-7302, AL-DP-7315, AL-DP-7328, AL-DP-7330, AL-DP-7336, AL-DP-7345, AL-DP-9250, AL-DP- - 9251, AL-DP-9252, AL-DP-9253, AL-DP-9254, AL-DP-9255, AL-DP-9256, AL-DP-9257, AL-DP-9258, AL-DP-9259, AL-DP-9260, AL-DP-9261, AL-DP- - 9262, AL-DP-9263, AL-DP-9264, AL-DP-9265, AL-DP-9266, AL-DP-9267, AL-DP-9268, AL-DP-9269, AL-DP-9270, AL-DP-9271, AL-DP-9272, AL-DP- - 9273, AL-DP-9274, AL-DP-9275, AL-DP-9276, AL-DP-9277, AL-DP-9279, AL-DP-9280, AL-DP-9281, AL-DP-9282, AL-DP-9283, AL-DP-9284, AL-DP- - 9285, AL-DP-9286, AL-DP-9287, AL-DP-9288, e AL-DP-9289.
15. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindica- ções 10 a 14, em que o dito dsRNA compreende pelo menos um nucleotí- deo modificado.
16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, em que o dito nucleotídeo modificado é selecionado do grupo de: um nucleotídeo de 2'-0-metil modificado, um nucleotídeo compreendendo um grupo 5'-fosforotioato, e um nucleotídeo terminal ligado a um derivado de colesterila ou grupo bisdecilamida de ácido dodecanóico.
17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, em que o dito nucleotídeo modificado é selecionado do grupo de: um nucleotídeo 2'-deóxi-2,-flúor modificado, um nucleotídeo 2'-deóxi-modificado, um nucleotídeo travado, um nucleotídeo abásico, nucleotídeo 2'-amino- modificado, nucleotídeo 2'-alquil-modificado, nucleotídeo de morfolino, um fosforamidato, e um nucleotídeo compreendendo base não-natural.
18. Método para inibir a expressão de um gene Aha em uma cé- lula, o método compreendendo: (a) introduzir na célula um ácido ribonucléico bifilamentar (dsRNA), em que o dsRNA compreende pelo menos duas seqüências que são complementares uma à outra e em que um filamento de sentido com- preende uma primeira seqüência e um filamento de antisentido compreende uma segunda seqüência compreendendo uma região de complementarida- de que é substancialmente complementar a pelo menos uma parte de um mRNA que codifica Ahal, e em que a dita região de complementaridade é menos de 30 nucleotídeos em comprimento e em que o dsRNA realiza cli- vagem de um mRNA que codifica um gene Aha dentro da seqüência alvo de um segundo dsRNA tendo um filamento de sentido selecionado do grupo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: -13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: -33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: -53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: -71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ -ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: -89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: -115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, -SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: -149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ -ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, e SEQ ID NO: 183, e um fila- mento de antisentido complementar ao último filamento de sentido e sele- cionado do grupo de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, -SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEO ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: -122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: -156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, e SEQ ID NO: 184; e (b) manter a célula produzida na etapa (a) durante um tempo suficiente para obter degradação da transcrição de mRNA de um gene Aha, assim inibindo a expressão de um gene Aha na célula.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o gene é um gene Aha1, e preferivelmente um gene Ahal de Homo sapiens.
20. Método de acordo com a reivindicação 18 ou 19, em que o dsRNA é selecionado do grupo de AL-DP-7301, AL-DP-7308, AL-DP-7318, AL-DP-7320, AL-DP-7322, AL-DP-7324, AL-DP-7325, AL-DP-7326, AL-DP- -7327, AL-DP-7329, AL-DP-7331, AL-DP-7333, AL-DP-7340, AL-DP-7342, AL-DP-7303, AL-DP-7305, AL-DP-7307, AL-DP-7309, AL-DP-7316, e AL- DP-7337, AL-DP-7304, AL-DP-7312, AL-DP-7339, AL-DP-7344, AL-DP- -7306, AL-DP-7317, AL-DP-7346, AL-DP-7310, AL-DP-7323, AL-DP-7335, AL-DP-7338, AL-DP-7341, AL-DP-7302, AL-DP-7315, AL-DP-7328, AL-DP- -7330, AL-DP-7336, AL-DP-7345, AL-DP-9250, AL-DP-9251, AL-DP-9252, AL-DP-9253, AL-DP-9254, AL-DP-9255, AL-DP-9256, AL-DP-9257, AL-DP- -9258, AL-DP-9259, AL-DP-9260, AL-DP-9261, AL-DP-9262, AL-DP-9263, AL-DP-9264, AL-DP-9265, AL-DP-9266, AL-DP-9267, AL-DP-9268, AL-DP- -9269, AL-DP-9270, AL-DP-9271, AL-DP-9272, AL-DP-9273, AL-DP-9274, AL-DP-9275, AL-DP-9276, AL-DP-9277, AL-DP-9279, AL-DP-9280, AL-DP- -9281, AL-DP-9282, AL-DP-9283, AL-DP-9284, AL-DP-9285, AL-DP-9286, AL-DP-9287, AL-DP-9288, e AL-DP-9289.
21. Método de qualquer uma das reivindicações 18 a 20, em que o método é executado in vitro.
22. Método de tratar, prevenir ou controlar processos patológi- cos mediados por expressão de Aha compreendendo administrar a um pa- ciente em necessidade de tal tratamento, prevenção ou gerenciamento uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um dsRNA, em que o dsRNA compreende pelo menos duas seqüências que são complementares uma à outra e em que um filamento de sentido compreende uma primeira seqüência e um filamento de antisentido compreende uma segunda se- quência compreendendo uma região de complementaridade que é substan- cialmente complementar a pelo menos uma parte de um mRNA que codifica Ahal, e em que a dita região de complementaridade é menos de 30 nucleo- tídeos em comprimento e em que o dsRNA realiza clivagem de um mRNA que codifica um gene Aha dentro da seqüência alvo de um segundo dsRNA tendo um filamento de sentido selecionado do grupo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: -109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: - 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: - 179, SEQ ID NO: 181, e SEQ ID NO: 183, e um filamento de antisentido complementar ao último filamento de sentido e selecionado do grupo de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: - 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: - 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: - 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: - 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: - 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: - 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: - 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, e SEQ ID NO: 184.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o dsRNA é selecionado do grupo de AL-DP-7301, AL-DP-7308, AL-DP-7318, AL-DP- - 7320, AL-DP-7322, AL-DP-7324, AL-DP-7325, AL-DP-7326, AL-DP-7327, AL-DP-7329, AL-DP-7331, AL-DP-7333, AL-DP-7340, AL-DP-7342, AL-DP- -7303, AL-DP-7305, AL-DP-7307, AL-DP-7309, AL-DP-7316, e AL-DP-7337, AL-DP-7304, AL-DP-7312, AL-DP-7339, AL-DP-7344, AL-DP-7306, AL-DP- -7317, AL-DP-7346, AL-DP-7310, AL-DP-7323, AL-DP-7335, AL-DP-7338, AL-DP-7341, AL-DP-7302, AL-DP-7315, AL-DP-7328, AL-DP-7330, AL-DP- -7336, AL-DP-7345, AL-DP-9250, AL-DP-9251, AL-DP-9252, AL-DP-9253, AL-DP-9254, AL-DP-9255, AL-DP-9256, AL-DP-9257, AL-DP-9258, AL-DP- -9259, AL-DP-9260, AL-DP-9261, AL-DP-9262, AL-DP-9263, AL-DP-9264, AL-DP-9265, AL-DP-9266, AL-DP-9267, AL-DP-9268, AL-DP-9269, AL-DP- -9270, AL-DP-9271, AL-DP-9272, AL-DP-9273, AL-DP-9274, AL-DP-9275, AL-DP-9276, AL-DP-9277, AL-DP-9279, AL-DP-9280, AL-DP-9281, AL-DP- -9282, AL-DP-9283, AL-DP-9284, AL-DP-9285, AL-DP-9286, AL-DP-9287, AL-DP-9288, e AL-DP-9289.
24. Vetor para inibir a expressão de um gene Aha em uma célu- la, o dito vetor compreendendo uma seqüência reguladora operavelmente ligada a uma seqüência de nucleotídeo que codifica pelo menos um filamen- to de um dsRNA, em que um dos filamentos do dito dsRNA é substancial- mente complementar a pelo menos uma parte de um mRNA que codifica Ahal e em que o dito dsRNA é menos de 30 pares de base em comprimen- to e em que o dsRNA realiza clivagem de um mRNA que codifica um gene Aha dentro da seqüência alvo de um segundo dsRNA tendo um filamento de sentido selecionado do grupo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: -9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: -129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: -165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, e SEQ ID NO: 183, e um filamento de antisentido complementar ao último fi- lamento de sentido e selecionado do grupo de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: -8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: -128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: -164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, e SEQ ID NO: 184.
25. Célula compreendendo o vetor como definido na reivindicação 24.
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