JP2018525037A - 遺伝子発現の調節のためのポリヌクレオチドナノ粒子及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、新規の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子、ならびに様々な生物体における遺伝子調節のためのそのようなナノ粒子及びそれらを含む組成物の使用を対象とする。
【選択図】図１

Description

優先権の主張
[0001]本出願は、２０１５年８月２４日に出願された米国仮出願第６２／２０９，２７８号の優先権を主張し、図面を含めてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

[0002]二本鎖ＲＮＡに基づいた干渉（ｄｓＲＮＡｉ）は、逆機能ゲノム学（ｒｅｖｅｒｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ）にとって重要なツールとなっている（Ｆｉｒｅ １９９８）。ＲＮＡｉは、真核生物において高度に保存されている天然に生じる防御機構である。ＲＮＡｉは、真核生物体においてトランスポゾン、ウイルス、及び他の高度に反復性のゲノム配列などの可動遺伝要素による発明に対してゲノムを保護し、発生プログラムの機能を制御するためにも保護する（Ｓｉｄａｈｍｅｄ ２０１０）。

[0003]ＲＮＡｉは、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮアーゼＩＩＩ型酵素により二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断することに関与し、次にこれらの相補的ＲＮＡ配列への結合による配列特異的で相同性依存性の転写後遺伝子サイレンシングを指示し、分解により、または転写阻害の誘導によって、これらの排除を誘発する（Ｆｉｒｅ １９９８、Ｍｅｉｓｔｅｒ ２００４）。

[0004]多価ＲＮＡ（ＭＶ−ＲＮＡ）は、接合クラスＲＮＡ分子を表し、これは正準ｄｓＲＮＡではないが、上に記載されたｄｓＲＮＡに基づいたＲＮＡｉ分子と同様の作用様式を有する。特有なことに、ＭＶ−ＲＮＡは、同じ、または異なる遺伝子において同時に複数の部位を切断する、ならびにｄｓＲＮＡｉと異なるプリプロセシング（ｐｒｅ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）経路を利用する能力を示す（米国特許公開第２０１１／０１５９５８６号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０１４１５５号）（図１５）。

[0005]ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＭＶ−ＲＮＡなどのＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）への装填における最初のステップとして、Ａｇｏ、ＰＡＺ、及びＰＩＷＩドメインと相互作用する。このように、サイレンシング複合体（すなわち、ＲＩＳＣ）による、またはダイサーによってもＲＮＡｉ分子の５’及び３’末端への利用能を制御することは、特異性を増強する。加えて、ダイサーによる長ｄｓＲＮＡのバイオジェネシス（ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）によって複数のｓｉＲＮＡ分子を産生することは、単一転写物から複数のｓｉＲＮＡ分子を産生することを意味する。ダイサーまたはドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）エンドヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡ ＲＮＡｉ前駆体の切断は、植物、動物、及びヒトにおいて一般的である。しかし、長ｄｓＲＮＡは、否定的な免疫学的応答に起因して哺乳動物において不十分なＲＮＡｉトリガーであり、ほぼ全ての用途において迅速に分解し、単一転写物から複数のＭＶ−ＲＮＡなどの短ＲＮＡｉ分子を正確に産生することを支持する。

[0006]ＲＮＡナノテクノロジー技術は、それ自体１９９８年から存在していた。ヌクレアーゼ分解、構造的柔軟性、血清不安定性、及びＲＮアーゼ感応性に対するＲＮＡの感受性を克服するために、何年にもわたって大きな努力が注がれており、ＲＮＡにより具体的な形状を構築するとき、大部分の商業的な利用にとって依然として課題がある。構造ＤＮＡ足場の使用を含む、いくつかの核酸自己集合方法が、インビボ送達用のｓｉＲＮＡ含有ナノ構造体の生成に用いられている。

[0007]ＲＮＡの分子間相互作用を利用して、ナノ粒子の多様なＲＮＡ集合体が試みられている。ｐＲＮＡ二量体、三量体、及び六量体の形成（Ｇｕｏ １９８７，１９８８、Ｓｈｕ ２００４，２００７，２０１１、Ｈａｑｕｅ ２０１２）も、十分に研究されている。ｐＲＮＡ分子は、バクテリオファージｐｈｉ２９をコアに含有し、三方接合部のそれぞれの末端に１個から多数の活性調節分子を含有する。インビトロ及びインビボの結果は、ｐＲＮＡ基質が、ＲＮＡ、ＤＮＡアプタマー、またはペプチドリガンドにより指示されうること、及び側鎖ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、ペプチド、または抗体により遺伝子調節されうることを示している。ＲＮＡＩ／ＩＩに基づいたＲＮＡナノリング（ｎａｎｏｒｉｎｇ）は、キッシング（ｋｉｓｓｉｎｇ）複合体（Ｙｉｎｇｌｉｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｐｉｒｏ ２００７、Ａｆｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１１、Ｇｒａｂｏｗ ｅｔ ａｌ．２０１１）、ＨＩＶ ＲＮＡのキッシングループ（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｔｉｎｏｃｏ １９９４、Ｂｉｎｄｅｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．２００８）、及びショウジョウバエビコイドｍＲＮＡの同調（ｈａｎｄ−ｉｎ−ａｒｍ）相互作用（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２００４）、（２）ｐＲＮＡ二量体、四量体、及び整列のパリンドローム配列媒介形成（Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．２００４）、（３）ｔｅｃｔｏ−ＲＮＡ二方接合（２ＷＪ）、３ＷＪ、及び四方接合（４ＷＪ）、ならびにｃｏｌＥ１キッシングループ相互作用による自己集合を含む非テンプレート集合を介した、第四級構造体を構築するＬＥＧＯ部分としてのＲＮＡモチーフ（Ｐｒａｔｓ ｅｔ ａｌ．１９９０、Ｃｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９６、Ｍｕｊｅｅｂ ｅｔ ａｌ．１９９８、Ｊａｅｇｅｒ ａｎｄ Ｌｅｏｎｔｉｓ ２０００、Ｌｉｌｌｅｙ ２０００、Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．２０１１ａ、Ｈａｑｕｅ ｅｔ ａｌ．２０１２）、（４）複数の治療的小ＲＮＡを運搬する熱力学的に安定しているコアのアーム伸長（Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．２０１１ａ、Ｈａｑｕｅ ｅｔ ａｌ．２０１２）、（５）タンパク質結合のためにねじれ回転モチーフを含有するＲＮＡ足場に３個のタンパク質が結合している、正三角形構築物などのナノ構造の形成の足場として機能するＲＮＡ結合タンパク質の使用（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０、Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．２０１１）を、逆転させる。

[0008]ほぼ３０年にわたる研究にもかかわらず、それぞれのＲＮＡナノ粒子は、商業的な利用を困難にする特徴によって不利な立場にある。ナノリングは、温度勾配により容易に変性しうる非共有結合的キッシングループ相互作用に依存しており、インビボで効率的に形成することができず、合理的集合にばらつきがありうる。ｐＲＮＡは、ナノリングの安定性の問題を克服するが、３個の活性分子に限定されているのでモル濃度を欠いており、ヌクレアーゼ分解の合理的な制御も欠いている。事実、上記のほぼ全てのナノ粒子は、非共有結合よって、モル濃度制限によって、またはヌクレアーゼ制御の欠如によって制限されている。

[0009]ＲＮＡマイクロスポンジ粒子をインビトロローリングサークル転写（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）により作製することができ、更には毒性をほとんど、または全く有することなくＲＮＡｉに使用できることが、以前に示された（Ｈａｍｍｏｎｄ ２０１２）。一本鎖コンカテマーとして反復発現している正準ｓｈＲＮＡ構造体を利用して、２μＭの球状粒子を形成し、次にＰＥＩ処理して約２００ナノメートルに凝縮した。Ｈａｍｍｏｎｄは、数千数百のｓｈＲＮＡの転写物が、最終的に、「マイクロスポンジ」と呼ばれる球状形態に崩壊するシートを形成することを例示した。そのようなマイクロスポンジは、活性ＲＮＡｉトリガーであることも示されている。しかし２０１４年には、Ｈａｍｍｏｎｄは、そのような球状形成がＲＮＡそれ自体と無関係であること、及びＴ７転写反応の際のナノ結晶ピロリン酸マグネシウムへのＲＮＡ結合の結果であることを証明した。そのようなＲＮＡマイクロスポンジが形成され、更にはＲＮＡｉに使用されうるが、小さいサイズのプログラム組成物を産生する能力、ならびにインビボにおいてそれを行う能力を欠いている。

[0010]球状核酸（ＳＮＡ）ナノ粒子抱合体が最近公開されており（Ｚｈｅｎｇ ２０１２，２０１３、Ｚｈｏｕ ２０１３、Ｊｅｎｓｅｎ ２０１３、Ｄｉｎｇ ２０１４）、金粒子の周囲に球状に配置された抱合型ｓｉＲＮＡを示している。金ナノ粒子は、活性核酸分子の共有及び非共有結合の両方をもたらす。配置は、金粒子中心の周りに積層している。この手法は、核酸の球状配置及び細胞透過に起因して活性であることが証明されているが、合成（無機）送達ベクターの中に留まっている。

[0011]ウイルスコートタンパク質またはカプシドタンパク質は、核酸の輸送及び保護において機能する。らせん対称の感染性ウイルス粒子は、コートタンパク質及びＲＮＡの水溶液と混合すると自己集合することが、半世紀前に示されていた（Ｈ．Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ，１９５５）。大部分の場合において、この保護層は、核酸を取り囲む典型的には棒状または球状の形状に自己集合する、コートタンパク質の複数のコピーの存在に起因する。自発的な自己集合過程についての多くの詳細は依然として不明瞭のままであるが、最近のデータ（‘Ｃｏａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ’の引用を参照すること）は、少なくともタンパク質間相互作用及び核酸の特徴が構造的な結果を決めることを示唆している。ササゲクロロティックモトルウイルス（ＣＣＭＶ）の場合において、証拠は、直径がヌクレオチドの長さによって制御されることを示唆している。研究者たちは、タンパク質／ＲＮＡを６：１の質量比で組み合わせると、３０００ｎｔ未満の長さが約２４〜２６ｎｍのコートタンパク質（ＣＰ）の直径をもたらすこと、及び４，５００ｎｔを超える長さが、約３０ｎｍのコートタンパク質（ＣＰ）の直径をもたらすことを決定した。インビトロ及びインビボにおけるＣＰの使用は、核酸を被包することが実証されているが、このＲＮＡ長さのＣＰ依存性は、長ｄｓＲＮＡの使用にとっては効率が悪く、短ＲＮＡｉトリガーにとってはプリパッケージ（ｐｒｅ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ）（すなわち、脂質に）しないと可能ではない。

[0012]プログラム可能な直径、ヌクレアーゼ安定性、モル濃度、細胞特異性、取り込み、ならびに遺伝子導入及び外因性用途の両方に有用である活性トリガーの信頼できるヌクレアーゼバイオジェネシスを伴う遺伝子調節のための自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を可能にする方法及び組成物が、依然として必要である。本発明は、この必要性に対処し、ヒト、動物、植物、昆虫、及び菌類に適用することができる。

[0013]本発明は、一般に、自己形成性ポリヌクレオチドに基づいたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ナノ粒子のための組成物及び方法に関する。より詳細には、本発明は、小型の球状、円盤状、または棒状のナノ粒子に自己形成する一本鎖ポリヌクレオチド内のＭＶ−ＲＮＡ分子の複数性を利用するための方法及び組成物を表す。得られるナノ粒子は、細胞取り込み、及びヌクレアーゼ安定性について特有の特性を示し、高いモル濃度のＲＮＡｉトリガーを送達する。

[0014]本明細書に開示されているポリヌクレオチドナノ粒子は、ナノ粒子のプログラム可能な直径、細胞送達、及び取り込み、ならびにエンドヌクレアーゼ消費による正確なトリガー放出を同時に伴って、１つ以上の生物体において、１個以上の遺伝子の遺伝子発現を同時に特異的に調節することに有用な新規組成物及び方法を提供する。本発明のそのような自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子は、高いトリガーモル濃度、インビトロ及びインビボ産生、ヌクレアーゼ抵抗性、ならびに複数の生物体への使用を示す。

[0015]本明細書において提供されるナノ粒子は、ＲＮＡステムの一般的な比よって区別され、ナノ粒子の表面近くの頻度がナノ粒子のコアのおよそ２倍である。

[0016]２個以上の接続されたＭＶ−ＲＮＡ分子を含み、エンドヌクレアーゼにより切断可能な少なくとも１個以上の連鎖ヌクレオチドにより、それぞれのＭＶ−ＲＮＡ分子が離されており、エンドヌクレアーゼにより切断されると、２個以上の接続されたＭＶ−ＲＮＡ分子が分離され、少なくとも１個の生物学的に活性なＲＮＡｉ分子が露出される単離ポリヌクレオチドナノ粒子が、本明細書において提供される。

[0017]ある特定の実施形態において、ナノ粒子は、連鎖ヌクレオチドにより一本鎖自己形成性ポリヌクレオチド円盤状または球状ナノ粒子構造につなぎ合わされている、２、３、６、９、１２、１５、２７、または２７個を超える別々のＭＶ−ＲＮＡ分子から構成される。

[0018]なお他の実施形態において、ナノ粒子は、分子を一本鎖自己形成性ポリヌクレオチド球状ナノ粒子構造に接続することによってつなぎ合わされている、２７個以上の別々のＭＶ−ＲＮＡ分子から構成される。

[0019]ある特定の実施形態において、単離ポリヌクレオチドナノ粒子は、図１〜３のいずれか１つに記載された一般的な構造のＭＶ−ＲＮＡの複数性を有する。

[0020]ある特定の実施形態において、ナノ粒子内の第１のＭＶ−ＲＮＡは、ポリヌクレオチドナノ粒子配列の５’及び３’の両方を含有することによって、ナノ粒子を閉鎖する。より特定的な実施形態において、ＭＶ−ＲＮＡの第１のガイド鎖は、ポリヌクレオチドナノ粒子の５’末端を表し、第２及び第３のガイド鎖部分は、ポリヌクレオチドナノ粒子の３’末端を表す。更により特定的な実施形態において、ＭＶ−ＲＮＡの第１及び第２のガイド鎖は、連結ループと共に、ポリヌクレオチドナノ粒子の５’末端を表し、第３のガイド鎖のみが、ポリヌクレオチドナノ粒子の３’末端を表す。

[0021]ある特定の実施形態において、直鎖状オリゴヌクレオチドの第１の鎖は、ポリヌクレオチドナノ粒子の５’末端を表し、第１のオリゴヌクレオチドに対する逆補体は、ポリヌクレオチドナノ粒子の３’末端を表し、２個の直鎖状オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成よって一群のＭＶ−ＲＮＡを閉鎖して、ステムを形成する。

[0022]他の実施形態において、ポリヌクレオチドナノ粒子は、相補性配列によって閉鎖されない。そのような実施形態は、単一ＭＶ−ＲＮＡ（図３Ａ）または積層ＭＶ−ＲＮＡ（図３Ｂ）のローリング転写による逆平行二次構造の転写に依存して、球体を作り出す。

[0023]なお他の実施形態において、エンドヌクレアーゼによる連鎖ヌクレオチドの切断によって、２個以上の接続されたＭＶ−ＲＮＡ分子は別々の実体として放出され、ここで別々のＭＶ−ＲＮＡガイド鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の基質である。特定的な実施形態において、エンドヌクレアーゼによる連鎖ヌクレオチドの切断は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に対して、別々のＭＶ−ＲＮＡ配列への利用能を制御する。他の特定的な実施形態において、連鎖ヌクレオチドの切断は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の基質であるＭＶ−ＲＮＡガイド鎖それぞれの、５’末端及び３’末端をもたらす。

[0024]なお他の実施形態において、エンドヌクレアーゼによる連鎖ヌクレオチドの切断によって、２個以上の接続されたＭＶ−ＲＮＡ分子は別々の実体として放出され、ここで別々のＭＶ−ＲＮＡガイド鎖は、マイクロＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ｍｉＲＩＳＣ）の基質である。特定的な実施形態において、エンドヌクレアーゼによる連鎖ヌクレオチドの切断は、マイクロＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ｍｉＲＩＳＣ）に対して、別々のＭＶ−ＲＮＡ配列のへ利用能を制御する。他の特定的な実施形態において、連鎖ヌクレオチドの切断は、マイクロＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ｍｉＲＩＳＣ）の基質であるＭＶ−ＲＮＡガイド鎖それぞれの、５’末端及び３’末端をもたらす。

[0025]２個以上のＭＶ−ＲＮＡ分子は、同一である、または異なっていることができ、例えば、アプタマー、リガンド、連鎖ヌクレオチド、ループ、ｓｓＲＮＡ末端、またはこれらの組み合わせを含むＭＶ−ＲＮＡ分子の群から選択されうる。

[0026]連鎖ヌクレオチドは、ある特定の実施形態において、１、２、３個、またはそれ以上のヌクレオチドである。

[0027]ある特定の他の実施形態において、連鎖ヌクレオチドは、特定のｐＨ範囲で変性またはリアニールしてポリヌクレオチドナノ粒子の直径を変化させる、ステムループを形成する。

[0028]他の特定的な実施形態において、単離ポリヌクレオチドナノ粒子は、ヒト細胞、もしくは動物細胞、もしくは植物細胞、もしくは酵母細胞、もしくは昆虫細胞、もしくは細菌細胞から選択される宿主細胞内において、またはインビトロ転写によって発現する。

[0029]他の特定的な実施形態において、単離ポリヌクレオチドナノ粒子は、本発明におけるコートタンパク質の直径を決定する（図１８）。

[0030]他の特定的な実施形態において、単離ポリヌクレオチドナノ粒子は、宿主以外の生物体の遺伝子を標的にする。生物体特異性は、標的遺伝子へのＭＶ−ＲＮＡの相補性によって、及びアプタマー、リガンド、連鎖ヌクレオチド、ループ、長ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ末端、またはこれらの組み合わせなどの細胞取り込みシグナルによって決定されうる。

[0031]ある特定の特定的な実施形態において、単離ポリヌクレオチドナノ粒子は、プロモーターによるインプランタ（ｉｎ−ｐｌａｎｔａ）転写（遺伝子導入）により、または植物に局所的に適用され（外因性）、続いて図１〜３、８〜１０、及び１８のいずれか１つに記載されている一般的構造にインビトロ転写することによって、産生される。

[0032]ある特定の実施形態において、単離ポリヌクレオチドナノ粒子は、図１〜３、８〜１０、及び１８のいずれか１つに記載されている一般的構造を使用して、昆虫、もしくはウイルス、もしくは菌類、もしくは動物、もしくはヒト、もしくは宿主植物（図２４）、他の植物、またはこれらの任意の組み合わせの遺伝子を標的にする。

[0033]なお他の特定的な実施形態において、単離ポリヌクレオチドナノ粒子は、切断可能リボザイムにより環状化された単一ポリヌクレオチドナノ粒子である（図５及び１３）。

[0034]なお他の特定的な実施形態において、ポリヌクレオチドナノ粒子は、天然または合成のＲＮＡまたはＤＮＡを含む。

[0035]なお他の特定的な実施形態において、ポリヌクレオチドナノ粒子は、天然または合成のＲＮＡまたはＤＮＡ、２’修飾ヌクレオチド、ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）またはアンロックド（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）ヌクレオチドを含む。

[0036]本発明の別の態様によると、本明細書の実施形態のいずれかに記載されている１個以上の単離ポリヌクレオチドナノ粒子を、生理学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む組成物が提供される。

[0037]本発明のなお別の態様によると、２個以上のＲＮＡ分子を標的細胞に送達する方法であって、標的細胞を、本明細書に記載されている単離ポリヌクレオチドナノ粒子または組成物に接触させることを含む方法が提供される。

[0038]本発明の更になお別の態様によると、本明細書の実施形態のいずれかに記載されているように、比または表面対コアのステムは、３’への５’相補性によりに閉鎖されている、またはいない、それぞれのＭＶ−ＲＮＡの末端間の複数性を増加すること、または積層ＭＶ−ＲＮＡの末端間の配置を増加することによって、ナノ粒子の直径と比例する。

[0039]ＭＶ−ＲＮＡの複数性が増加している、自己形成性で自己送達性の約４０ｎｍのＭＶ−ＲＮＡｉナノ粒子の例である。 [0040]配列番号３９〜５２のＭＶ−ＲＮＡの複数性が増加しているポリヌクレオチドナノ粒子のファミリーのＲＮＡ折りたたみ二次構造であり、モル濃度（すなわち、効力）、スペクトル、及びヌクレアーゼ安定性を誘発する複数性の増加効果を示すチャートである。 [0041]（１）コアステム領域及び（２）表面ステム領域を示す（Ａ）４０ｎｍ及び（Ｂ）１００ｎｍのポリヌクレオチドナノ粒子構造である。コアステムと表面との比は、４０ｎｍ及び１００ｎｍの球体では、それぞれ１：２及び１：４である。 [0042]開放／閉鎖ＭＶ−ＲＮＡを使用するポリヌクレオチドナノ粒子の合理的な集合である。（１）閉鎖ＭＶ−ＲＮＡの５’リーダー配列（黒色）、（２）１個以上の末端間ＭＶ−ＲＮＡの領域の例（薄灰色）、（３）閉鎖ＭＶ−ＲＮＡの３’末端（黒色）、及び（４）高い複数性のある末端間ＭＶ−ＲＮＡの追加的な例示領域（薄灰色）。 [0043]転写による自己集合ナノ粒子である。（１）直鎖状のプロモーター、または（２）リボザイムフォーマットにより環状化されたプロモーターを使用して、ナノ粒子全体をＤＮＡから転写することができる。 [0044]合理的な構造及びサイズのＭＶ−ＲＮＡナノ粒子形態である。図６Ａは、１つの実施形態による一本鎖ポリヌクレオチドナノ粒子を示す。図６Ｂは、本明細書に記載されている方法で開放及び閉鎖し、予測される構造を有する約４０ｎｍのナノ粒子をもたらす、３個のＭＶ−ＲＮＡの複数性を有するナノ粒子の原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を示す。図６Ｃは、尾状１２単位ナノ粒子がもたらされているＡＦＭを示し、組成物中により多くのＭＶ−ＲＮＡ及び長いＲＮＡ転写物があるにもかかわらず、同じ直径を示している。図６Ｄは、ＣｒｙｏＥＭにより溶液中に観察された１６単位のＭＶ−ＲＮＡを示す。 [0045]一本鎖ナノ粒子のバイオジェネシスである。複数の末端間ＭＶ−ＲＮＡ（（１）、（２）、及び（３））、ならびに標的化アプタマーを含有する一本鎖ナノ粒子は、ダイサーまたはダイサー様バイオジェネシスの後に複数のＭＶ−ＲＮＡをもたらす。 [0046]ＴＲＩ複数性ナノ粒子である。 [0047]ＳＥＸＡ複数性ナノ粒子である。 [0048]十二面体及び高度複数性の粒子である。 [0049]ナノ粒子転写物のサイズの比較である。複数性が増加している例示のナノ粒子の２％アガロースゲル電気泳動：（１、２）環状化「ＵＮＩ」、（３）直鎖状「ＴＲＩ」、（４）環状化「ＴＲＩ」、（５）直鎖状「ＳＥＸＡ」、（６）環状化「ＳＥＸＡ」、（７）直鎖状「ＮＯＮＡ」、及び（８）環状化「ＮＯＮＡ」。 [0050]環状化自己形成性ＭＶ−ＲＮＡナノ粒子の単離である。（１）転写の際のリボザイム環状化の産物による全ての転写、（２）下側分画、（３）上側分画、及び（４、５）エキソヌクレアーゼ消化抵抗性により確認された環状化ＲＮＡナノ粒子。 [0051]環状化転写物の例示的なＲＮＡ折りたたみであり、それぞれ複数性が増加している。 [0052]ｄｓＲＢＤシグナルを有する約４０ｎｍの自己形成性ＭＶ−ＲＮＡｉナノ粒子である。 [0053]一本鎖ＭＶ−ＲＮＡモジュールの全体図である（参照として組み込まれる米国特許公開第２０１１／０１５９５８６号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０１４１５５号）。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はＭＶ−ＲＮＡ内の３つのガイド鎖に対応する。 [0054]一本鎖ポリヌクレオチドモジュールのダイサーバイオジェネシスである。（Ａ１）、（Ａ２）、（Ｂ１）、（Ｂ２）：ダイサー切断部位。 [0055]長ｄｓＲＮＡと比較した、それぞれのポリヌクレオチドナノ粒子の複数性が増えている経時的なダイサーバイオジェネシスである。 [0056]コートタンパク質によるＭＶ−ＲＮＡナノ粒子の被包である。（１）：コートまたはカプシドタンパク質。 [0057]反復複合性の転写方向である。ＲＮＡ折りたたみに基づいた有効な転写のため、単一ＭＶ−ＲＮＡ配列をポリヌクレオチドナノ粒子内において反復発現するように、どのように再方向付けできるかを例示している。（１）ＭＶ−ＲＮＡ配列内の個別のＭＶ−ＲＮＡガイド鎖の方向。（２）転写配列内の複数性における個別のＭＶ−ＲＮＡガイド鎖の方向。 [0058]ウェスタンコーンルートワーム（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃｏｒｎ Ｒｏｏｔｗｏｒｍ）におけるインビボ活性である。ＩＳＨ染色は、Ｈ_２Ｏ対照と比較した、本明細書に提供されているポリヌクレオチドナノ粒子を２つの異なる濃度で摂取した後のウェスタンコーンルートワームにおける、標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング効果を示している。 [0059]図２１Ａは、ナノ粒子を欠いている局所処理及び未処理植物と比較した、本明細書に提供されているＰＤＳ−１ポリヌクレオチドナノ粒子の局所施用の９日後のＰａｌｍｅｒ Ａｍａｒａｎｔｈにおける、フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング効果を示している。図２１Ｂは、分裂組織への処理の７日後の未処理葉の対する効果を示している。図２１Ｃは、いくつかの細胞に光退色を示している処理済葉の５日間の時間経過を示している。 [0060]長ｄｓＲＮＡと比較した、均質化トウモロコシ組織におけるポリヌクレオチドナノ粒子の体外核安定性である。 [0061]唾液中の体内核分解である。電気泳動は、１〜３０分間でのＲＮＡの分解産物を示している。長ｄｓＲＮＡにより産生された短分解産物が、それぞれ複数性が増加した、本明細書に提供されている２つの異なるナノ粒子により産生された短分解産物と比較される。 [0062]病害虫を標的にするナノ粒子のインプランタ転写である。ナノ粒子は植物中に安定して発現している。 [0063]単一ＭＶ−ＲＮＡに対する６個の反復ＭＶ−ＲＮＡから構成されるＭＶ−ＲＮＡナノ構造体の、同じ標的部位における等モル効力の利益についてのｑＲＴ−ＰＣＲグラフを示す。 [0064]ｐＨ応答性連鎖を有するポリヌクレオチドナノ粒子である。ｐＨ６〜８で未変性状態（左側）のｐＨ応答性連鎖（１）及びキッシングループ（２）、及びより低いｐＨでの拡大状態（右側、（３））。

[0065]下記に詳細に記載されているように、新規の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子のセットが構築され、予想外なことに、１個以上の遺伝子の標的遺伝子発現を低減することに有効であることが見出された。これらのポリヌクレオチドナノ粒子は、医薬、生物除草剤、及びバイオ農薬の用途が含まれるが、これらに限定されない様々な用途に最適な特徴を有する。このように、ポリヌクレオチドナノ粒子、これらのポリヌクレオチドナノ粒子を含む組成物及び製剤、ならびにこれらのポリヌクレオチドナノ粒子を使用する方法が、本明細書において提供される。

[0066]本明細書に開示されているポリヌクレオチドナノ粒子は、以前に記載されたＲＮＡｉ技術に対して、優れたサイズ／モル濃度、サイズ／電荷、及びサイズ／ヌクレアーゼ抵抗性の比、高いトリガーモル濃度、簡単なインビボ及びインビトロ産生、ヌクレアーゼ抵抗性、複数の遺伝子を同時に調節する能力、ならびに複数の生物体において発現を調節する能力を含む有意な利点を提供する。本開示のポリヌクレオチドナノ粒子は、また、ｄｓＲＮＡに関連するオフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）抑制を実質的に排除し、かつ遺伝子導入用途のために自己形成性ナノ粒子を提供するので、ＲＮＡｉに使用されている伝統的なｄｓＲＮＡ分子より優れている。本明細書において提供されているポリヌクレオチドナノ粒子の設計は、ナノの粒子が、プログラム可能な直径、細胞送達及び取り込み、ならびにエンドヌクレアーゼ消費による正確なトリガー放出を有することを可能にする。

[0067]ある特定の実施形態では、本明細書に開示されているポリヌクレオチドナノ粒子を使用して、複数の遺伝子または経路の発現を同時に調節することができる。これらの複数の遺伝子または経路は、全て、特定の表現型または複数の表現型に関連しうる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されているポリヌクレオチドナノ粒子を使用して、１個以上の遺伝子の異常な発現（すなわち、過剰もしくは過小発現）、または１個以上の経路の異常活性に関連する状態を治療することができる。例えば、本明細書に開示されているポリヌクレオチドナノ粒子を使用して、癌に関連する１個以上の遺伝子の発現を調節することによって、癌を治療することができる。

[0068]本明細書において提供されるポリヌクレオチドナノ粒子は、ＲＮＡステムの一般的な比よって先行技術の分子と区別され、ナノ粒子の表面近くの頻度がナノ粒子のコアのおよそ２倍である。この基本的なサイズ／ステムループの比は、ＲＮＡを更に小型化するために化学薬品を使用することなく、高いモル濃度の活性トリガーを含有する小型でヌクレアーゼ分解抵抗性のあるナノ粒子をもたらす。事実、本発明の自己形成性ナノ粒子は、単独で直接転写された後、ピノサイトーシス及び／またはエンドサイトーシスにとって十分に小さく（４０〜１００ナノメートルの範囲）、インビボ循環に有効なほど十分に大きい（２０ナノメートルを超える）（図１１を参照すること）。

[0069]本明細書において提供されるポリヌクレオチドナノ粒子は、それぞれ１個以上のヌクレオチドにより離されている２個以上の接続されたＭＶ−ＲＮＡを含み、エンドヌクレアーゼバイオジェネシスの後に少なくとも１個の生物学的に活性なＭＶ−ＲＮＡ分子をもたらす。ダイサーまたはダイサー様ヌクレアーゼ切断よりナノ粒子から取り外されたＭＶ−ＲＮＡを、それぞれ、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）及びｍｉＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ｍｉＲＩＳＣ）が含まれるが、これらに限定されない下流のサイレンシング複合体に装填することができる。取り外されたＭＶ−ＲＮＡは、下流の免疫刺激事象においても機能することができる。単一ナノ粒子による遺伝子抑制及び免疫刺激の両方の特徴の可能性は、特定の癌における免疫監視のために拮抗薬を抑制し、同時に特定の細胞に免疫応答を刺激する能力を提供する。このように、本明細書に提供されるポリヌクレオチドナノ粒子は、ＲＮＡ干渉、ｍｉＲＮＡ干渉、または免疫療法において、特有の一本鎖で純粋なＲＮＡナノ粒子前駆体として作用し、高度に拡大可能な活性トリガーモル濃度を含有しうるものである。

[0070]ある特定の実施形態において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドナノ粒子は、連鎖ヌクレオチドにより一本鎖自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子構造につなぎ合わされている、２、３、６、９、１２、１５、１６、２７、または２７個を超える別々のＭＶ−ＲＮＡ分子を含む。他の実施形態において、ポリヌクレオチドナノ粒子は、分子を一本鎖自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子に接続することによってつなぎ合わされている、２７個以上の別々のＭＶ−ＲＮＡ分子から構成される。ある特定の実施形態において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドナノ粒子は、図１〜３のいずれか１つに記載された一般的な構造のＭＶ−ＲＮＡの複数性を有する。ある特定の実施形態において、単一ポリヌクレオチドナノ粒子内のＭＶ−ＲＮＡの複数性は、全て異なっている。他の実施形態において、単一ポリヌクレオチドナノ粒子内の２個以上のＭＶ−ＲＮＡは、同じであってもよい。これらの実施形態において、ポリヌクレオチドナノ粒子内で繰り返されているＭＶ−ＲＮＡは、同じ、または異なる方向を向いていてもよい。

[0071]ある特定の実施形態において、ナノ粒子内の第１のＭＶ−ＲＮＡは、ポリヌクレオチドナノ粒子配列の５’及び３’の両方を含有することによって、ナノ粒子を閉鎖する。より特定的な実施形態において、ＭＶ−ＲＮＡの第１のガイド鎖は、ポリヌクレオチドナノ粒子の５’末端を表し、第２及び第３のガイド鎖部分は、ポリヌクレオチドナノ粒子の３’末端を表す。更により特定的な実施形態において、ＭＶ−ＲＮＡの第１及び第２のガイド鎖は、連結ループと共に、ポリヌクレオチドナノ粒子の５’末端を表し、第３のガイド鎖のみが、ポリヌクレオチドナノ粒子の３’末端を表す。

[0072]ある特定の実施形態において、直鎖状オリゴヌクレオチドの第１の鎖は、ポリヌクレオチドナノ粒子の５’末端を表し、第１のオリゴヌクレオチドに対する逆補体は、ポリヌクレオチドナノ粒子の３’末端を表し、２個の直鎖状オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成よって一群のＭＶ−ＲＮＡを閉鎖して、ステムを形成する。

[0073]他の実施形態において、ポリヌクレオチドナノ粒子は、相補性配列によって閉鎖されない。そのような実施形態は、単一ＭＶ−ＲＮＡ（図３Ａ）または積層ＭＶ−ＲＮＡ（図３Ｂ）のローリング転写による逆平行二次構造の転写に依存して、球体を作り出す。

[0074]なお他の実施形態において、エンドヌクレアーゼによる連鎖ヌクレオチドの切断によって、２個以上の接続されたＭＶ−ＲＮＡ分子は別々の実体として放出され、ここで別々のＭＶ−ＲＮＡガイド鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の基質である。特定的な実施形態において、エンドヌクレアーゼによる連鎖ヌクレオチドの切断は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に対して、別々のＭＶ−ＲＮＡ配列への利用能を制御する。他の特定的な実施形態において、連鎖ヌクレオチドの切断は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の基質であるＭＶ−ＲＮＡガイド鎖それぞれの５’末端及び３’末端をもたらす。

[0075]なお他の実施形態において、エンドヌクレアーゼによる連鎖ヌクレオチドの切断によって、２個以上の接続されたＭＶ−ＲＮＡ分子は別々の実体として放出され、ここで別々のＭＶ−ＲＮＡガイド鎖は、マイクロＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ｍｉＲＩＳＣ）の基質である。特定的な実施形態において、エンドヌクレアーゼによる連鎖ヌクレオチドの切断は、マイクロＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ｍｉＲＩＳＣ）に対して、別々のＭＶ−ＲＮＡ配列への利用能を制御する。他の特定的な実施形態において、連鎖ヌクレオチドの切断は、マイクロＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ｍｉＲＩＳＣ）の基質であるＭＶ−ＲＮＡガイド鎖それぞれの５’末端及び３’末端をもたらす。

[0076]２個以上のＭＶ−ＲＮＡ分子は、同一である、または異なっていることができ、例えば、アプタマー、リガンド、連鎖ヌクレオチド、ループ、ｓｓＲＮＡ末端、またはこれらの組み合わせを含むＭＶ−ＲＮＡ分子の群から選択されうる。

[0077]本明細書に開示されているポリヌクレオチドナノ粒子内の連鎖ヌクレオチドは、１、２、３個、または３個を超えるヌクレオチドを含むことができる。ある特定の他の実施形態において、連鎖ヌクレオチドは、３〜１２個のヌクレオチドであり、特定のｐＨ範囲で変性または復元してポリヌクレオチドナノ粒子の直径を変化させる、ステムループを形成する。

[0078]ある特定の実施形態において、本明細書に提供されているポリヌクレオチドナノ粒子は、ヒト、非ヒト動物、植物、酵母、昆虫、もしくは細菌の細胞から選択される宿主細胞内において、またはインビトロ転写によって発現する。

[0079]ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドナノ粒子は、本発明におけるコートタンパク質の直径を決定する（図１８）。

[0080]本明細書において提供されるポリヌクレオチドナノ粒子は、表面に提示される単一または複数のＲＮＡ配列（アプタマー、長ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ）を含有することができ、一般的なＲＮＡｉ活性を損なうことなく、単一ＲＮＡナノ粒子による高モル濃度の細胞取り込み及び／または細胞特異性を可能にする。

[0081]他の特定的な実施形態において、単離ポリヌクレオチドナノ粒子は、宿主以外の生物体の遺伝子を標的にする。生物体特異性は、標的遺伝子へのＭＶ−ＲＮＡの相補性によって、及びアプタマー、リガンド、連鎖ヌクレオチド、ループ、長ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ末端、またはこれらの組み合わせなどの細胞取り込みシグナルによって決定されうる。

[0082]本明細書において提供されるポリヌクレオチドナノ粒子は、転写の典型的なイオン性状態下でのインビボまたはインビトロ発現により、ワトソンクリック塩基対を介して、約４０、約８０、約１００、または約１３０ナノメートルの安定した二次構造に自然に折りたたまれる（例えば、図６を参照すること）。

[0083]このような導入遺伝子発現により産生された自己形成性一本鎖ナノ粒子は、分解抵抗性、効力、ダイサーバイオジェネシス特異性、トリガーモル濃度、内因性遺伝子調節機構との宿主関連競合、及び生物界間（ｔｒａｎｓ−ｋｉｎｇｄｏｍ）の適用という点において、直鎖状ｄｓＲＮＡに基づいたＲＮＡｉ方法より優る利点を提供する（例えば、図１７、２３、２５を参照すること）。

[0084]これらの転写により産生された一本鎖ポリヌクレオチドナノ粒子は、安定性及び送達のために合成または脂質型被包による化学修飾を必要とする、他のＲＮＡｉナノ粒子組成物と比較して、簡潔なプロセスを提供し、費用の大きな低減をもたらす。

[0085]そのような自己形成性ナノ粒子を、有機化合物、無機化合物、ペプチド、またはカプシドタンパク質と組み合わせて、農業からヒトの治療薬までの広範囲の外因性用途をもたらすことができる。

[0086]正確に構造化された単一の転写物の制御エンドヌクレアーゼ媒介バイオジェネシスによる、複数または反復したＭＶ−ＲＮＡのインサイツ産生に関する組成物及び方法が、ある特定の実施形態において本明細書に提供される。特異的及び選択的な方法で転写物の制御バイオジェネシスを可能にする、正確に構造化された転写物も提供される。構造化ナノ粒子転写物のエンドヌクレアーゼバイオジェネシスは、ＲＮＡｉ分子の好ましい５’及び３’末端を露出させることによって、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の利用能を制御することができる。したがって、ある特定の実施形態において、本開示は、複数のＲＮＡｉ配列またはＭＶ−ＲＮＡ前駆体配列を含有し、これらは、インサイツエンドヌクレアーゼ切断の後、複数の生物学的に活性なＲＮＡ分子として放出され、同じ遺伝子内の複数の部位及び／または異なる標的遺伝子の１つ以上の部位を、同時に標的化阻害することを可能にする、一本鎖自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を提供する。これらの実施形態の非限定例が、図７及び１６に示されている。

[0087]ある特定の実施形態において、本明細書に提供される単離ポリヌクレオチドナノ粒子は、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を含む

[0088]本明細書において提供されるポリヌクレオチドナノ粒子は、ヌクレアーゼ抵抗性、増強されたモル濃度、拡大されたスペクトル、電荷分布、単一転写物からの複数の新規ＭＶ−ＲＮＡトリガー、摂取に最適なサイズと活動の関連性（Ｓｉｚｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）（ＳＡＲ）、及び植物プロモーターには長い転写物が必要にもかかわらず小ＲＮＡ分子のインプランタ発現を可能にすることを含む多数の重要な利点を提供し、直鎖状ｄｓＲＮＡでは可能ではなかった酵素産生された分子を支持する。更に、前駆体分子を安定化し、次に制御された様式により、生体内原位置で、単一または多価高モル濃度形態で活性ＲＮＡｉ分子の複数性を利用可能にする能力を有することは、有益である。

[0089]ある特定の実施形態において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドナノ粒子は、プロモーターによるインプランタ転写（遺伝子導入）により、または植物に局所的に適用され（外因性）、続いて図１〜３、８〜１０、及び１８のいずれか１つに記載されている一般的構造にインビトロ転写することによって、産生される。

[0090]ある特定の実施形態において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドナノ粒子は、図１〜３、８〜１０、及び１８のいずれか１つに記載されている一般的構造内の、昆虫、またはウイルス、または菌類、または同一生物界内（ｃｉｓ−ｋｉｎｇｄｏｍ）もしくは生物界間における宿主植物、あるいはこれらの任意の組み合わせの遺伝子を標的にする。

[0091]なお他の特定的な実施形態において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドナノ粒子は、切断可能なリボザイムにより環状化されて、５’リン酸末端または３’ヒドロキシル末端を有しないナノ粒子（図５及び１３）をもたらす、単一ポリヌクレオチドナノ粒子である。

[0092]ＲＮＡｉ分子の設計的な特徴及び産生技術は、一般に知られており、確立されている。したがって、本開示を考慮すると、エンドヌクレアーゼにより切断されると、望ましい複数性の生物学的に活性なＲＮＡｉ分子が、元の単一ポリヌクレオチドナノ粒子転写物から生体内原位置で放出されるように本明細書に記載されている連鎖ヌクレオチドにより離されている、複数のＭＶ−ＲＮＡ前駆体配列を含有する単離ポルヌクレオチドナノ粒子の産生方法が理解される。

[0093]上記に示されているように、ある実施形態において、本発明の単離ポリヌクレオチドナノ粒子に存在する２個の以上のＲＮＡｉ分子は、ＭＶ−ＲＮＡ前駆体である。そのような本発明の単離ポリヌクレオチドナノ粒子内に含有されている前駆体は、例えば、米国特許公開第２０１１／０１５９５８６号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０１４１５５号に記載されているように一価、二価、及び／または多価のいずれかであり、これらは、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。

[0094]本発明の単離ポリヌクレオチドナノ粒子内のＭＶ−ＲＮＡ配列の分離に使用される連鎖ヌクレオチドまたはステムループ連鎖要素は、一般に、（ｉ）１、２、３個のヌクレオチド、または（ｉｉ）３〜１２個のヌクレオチドステムループを含む（実施例１ｂ）。

[0095]単離ポリヌクレオチドナノ粒子の個別のＭＶ−ＲＮＡ内に含有されている細胞特異的アプタマー（図１）または長ｄｓＲＮＡ要素（図１０）は、細胞特異性または細胞取り込みに寄与する可能性がある。

[0096]標的細胞に侵入した後、エンドソームからの回避もアプタマーによって（実施例１ａ、２、３）、またはエンドソーム老化の際のｐＨ勾配により誘発されたナノ粒子の物理的変化によって（実施例１ｂ）、促進されうる。ある特定の実施形態において、本発明のナノ粒子は、ｐＨがより酸性になると、エンドソーム内で直径を拡大する（例えば、図２６を参照すること）。ある特定の実施形態において、本発明のナノ粒子は立体構造を変え、このようにして、包み込まれたカプシドタンパク質のエンドソーム膜破壊特徴に寄与する。

[0097]ＲＮアーゼＩＩＩエンドリボヌクレアーゼは、典型的には４つのクラスのうちの１に当てはまる（例えば、Ｌａｍｏｎｔａｇｎｅ ２００４を参照すること）。クラスＩのＲＮアーゼＩＩＩは、大部分が細菌及びバクテリオファージ内に見出され、伝統的なヌクレアーゼドメイン及びｄｓＲＮＡ結合ドメインの両方を有する全ての細菌酵素を含む。例示的なクラスＩのＲＮアーゼＩＩＩエンドリボヌクレアーゼには、Ｅ．ｃｏｌｉのｒｎｃが含まれる。

[0098]クラスＩＩ酵素は、典型的にはＮ末端伸長の存在によりクラスＩ酵素と区別される。例示的なクラスＩＩエンドリボヌクレアーゼには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅのＰａｃＩ及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲｎｔ１ｐが含まれる。

[0099]クラスＩＩＩ酵素は、典型的には２つのヌクレアーゼドメインを有し、植物及び霊長類の両方の酵素を含む。クラスＩＩＩ酵素の例には、ドローシャタンパク質が含まれる（例えば、Ｆｉｌｉｐｐｏｖ ２０００を参照すること）。ドローシャ酵素は、典型的には、ＲＩＳＣ複合体と相互作用して相補的ｍＲＮＡの切断を誘導することによって多種多様な他の遺伝子を調節する細胞により天然に発現された、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または短ＲＮＡ分子のプロセシングの開始に関与する。ドローシャ活性に必須であり、かつ正確なプロセシングに必要なプレｍｉＲＮＡの一本鎖フラグメントに結合することが可能である二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質パーシャ（Ｐａｓｈａ）（ＤＧＣＲ８とも呼ばれ、Ｄｅｎｌｉ ２００４を参照すること）も含有する、マイクロプロセッサー複合体と呼ばれるタンパク質複合体の一部として、ドローシャは存在する（Ｈａｎ ２００６）。ドローシャ及びパーシャは、両方とも細胞核に局在化して、プレｍｉＲＮＡ間のプロセッシングが生じる。この後者の分子は、次に、細胞質内においてＲＮアーゼダイサーによって成熟したｍｉＲＮＡに更にプロセスされる。

[00100]クラスＩＶのＲＮアーゼＩＩＩエンドリボヌクレアーゼには、ダイサー及びダイサー様ファミリーの酵素が含まれ、これらは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において機能することが知られている。ダイサーは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）及びプレマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を短二本鎖ＲＮＡフラグメントに切断する、ＲＮアーゼＩＩＩファリミーのエンドリボヌクレアーゼである。（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ２００１）。これらの短二本鎖ＲＮＡフラグメントは、多くの場合、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれ、典型的には約２０〜２５個のヌクレオチド長さであり、通常は３’末端に二塩基オーバーハングを含有する。ダイサー酵素は、二重ＲＮアーゼＩＩＩドメイン／モチーフ及び１つのＰＡＺドメイン（ＰＡＺドメインの構造についてはＳｏｎｇ ２００３を参照すること）を含有し、分子中のこれらの領域間の距離は、コネクターヘリックスの長さ及び角度によって決まり、産生ｓｉＲＮＡの長さを決定する（Ｍａｃｒａｅ ２００６）。ダイサーは、ＲＮＡ干渉経路の第一段階を触媒紙、ＲＩＳＣの形成を開始させ、この触媒構成要素のアルゴノートは、ｓｉＲＮＡガイド鎖に相補的な配列または標的遺伝子配列を有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解することができるエンドヌクレアーゼである（Ｊａｒｏｎｃｚｙｋ ２００５）。

[00101]なお他の特定的な実施形態において、ポリヌクレオチドナノ粒子は、グラスＩＶダイサーを含むエンドヌクレアーゼのお分解を遅くさせる。

[00102]なお他の特定的な実施形態において、ポリヌクレオチドナノ粒子は、天然または合成のＲＮＡまたはＤＮＡを含む。

[00103]なお他の特定的な実施形態において、ポリヌクレオチドナノ粒子は、天然または合成のＲＮＡまたはＤＮＡ、２’修飾、ロックドまたはアンロックドヌクレオチドを含む。

[00104]本発明の別の態様によると、ポリヌクレオチドナノ粒子は、本明細書の実施形態のいずれかに記載されている１個以上の単離ポリヌクレオチドナノ粒子を、生理学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む組成物を提供する。

[00105]本発明のなお別の態様によると、ポリヌクレオチドナノ粒子は、単一標的取り込み細胞事象を伴って、同じ、または異なる２個以上のＲＮＡ分子を送達する方法であって、標的細胞を、本明細書に記載されている単離ポリヌクレオチドナノ粒子または組成物に接触させることを含む方法を提供する。

[00106]本発明の更になお別の態様によると、本明細書の実施形態のいずれかに記載されているように、表面とコアのステム比は、３’への５’相補性によりに閉鎖されている、またはいない、それぞれのＭＶ−ＲＮＡの末端間の複数性を増加すること、または積層ＭＶ−ＲＮＡの末端間の配置を増加することによって、ナノ粒子の直径と比例する。

[00107]本発明のポリヌクレオチドナノ粒子は、天然または合成のＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはペプチド核酸、あるいはこれらの種類の分子いずれか、または全ての組み合わせを含むことができる。加えて、ポリヌクレオチドナノ粒子は、修飾核酸、または核酸の誘導体もしくは類縁体を含んでもよい。

[00108]好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドナノ粒子は、天然に生じるＲＮＡ、ＤＮＡ、２’Ｆｌｕｏｒ ＲＮＡ、２’−ＯＭｅＲＮＡ類縁体、または転写に適合する他のヌクレオチド部分から構成される。

[00109]本発明の文脈において、単離という用語は、材料の未変性状態において通常は材料に付随している構成要素から少なくとも部分的に遊離している材料を指す。単離は、元の供給源または周囲からの分離の程度という意味を含む。単離は、本明細書において、例えばＤＮＡに関して使用されるとき、コード配列から実質的に離れているポリヌクレオチドナノ粒子を指し、かつナノ粒子が、大きな染色体フラグメント、または他の機能性遺伝子もしくはポリペプチドコード領域などの無関係のＲＮＡまたはＤＮＡの大きな部分を含有しないことを指す。当然のことながら、これは元々単離されているＤＮＡ分子を指し、手作業により後にセグメントに付加された遺伝子またはコード領域を除外しない。

[00110]本発明の単離ポリヌクレオチドナノ粒子に行うことができる核酸修飾の例には、ビオチン標識化、蛍光標識化、第一級アミンをポリヌクレオチドナノ粒子に導入するアミノ修飾因子、リン酸機、デオキシウリジン、ハロゲン化ヌクレオシド、ホスホロチオエート、２’−ＯＭｅＲＮＡ類縁体、キメラＲＮＡ類縁体、ゆらぎ基、及びデオキシイノシンが含まれるが、これらに限定されない。

[00111]用語「類縁体」は、本明細書において使用されるとき、本明細書のポリヌクレオチドナノ粒子と同じ構造及び／または機能（例えば、標的への結合）を保持する分子、化合物、または組成物を指す。類縁体の例には、ペプチド模倣体、ペプチド核酸、ならびに小型及び大型の有機または無機化合物が含まれる。

[00112]用語「誘導体」または「変異体」は、本明細書において使用されるとき、１個以上の核酸欠失、付加、置換、または側鎖修飾によって、天然に生じる配列（例えば、標的配列）と異なる配列を指す。ある特定の実施形態において、変異体は、標的遺伝子配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。このように、例えば、ある特定の実施形態において、本発明のナノ粒子は、標的遺伝子配列の変異体に相補的な領域を含むことができる。

[00113]配列の標的化に関して、本発明の単離ポリヌクレオチドナノ粒子は、一般に、標的遺伝子またはポリヌクレオチドナノ粒子配列（あるいは、その変異体）の１つ以上の領域に相補的な、より好ましくは完全に相補的な配列を含有する。ある特定の実施形態において、標的遺伝子（または、ｍＲＮＡ）に相補的な配列領域の選択は、選択された標的配列の分析、ならびに二次構造、Ｔ_ｍ、結合エネルギー、及び相対的安定性の決定に基づいている。そのような配列は、宿主細胞において標的ｍＲＮＡへの特定の結合を低減または阻害する二量体、ヘアピン、または他の二次構造を形成する相対的不能に基づいて選択されうる。ｍＲＮＡの極めて好ましい標的領域には、ＡＵＧ翻訳開示コドンにおける、または近い領域、及びｍＲＮＡの５’領域に実質的に相補的な配列、ｍＲＮＡのコード領域に実質的に相補的な配列、またはｍＲＮＡの３’領域に実質的に相補的な実質的に相補的な配列が含まれる。二次構造分析及び標的部位選択の考慮は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウエアのｖ．４及び／もしくはＢＬＡＳＴＮ ２．０．５アルゴリズムソフトウエア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７，２５（１７）：３３８９−４０２）、またはＯｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ２．０．を使用して実施することができる。

[00114]１つの実施形態において、調節領域に結合するタンパク質がポルヌクレオチドナノ粒子の結合に干渉しうるので、標的部位は、優先的には、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）または開始コドン近くの（およそ７５塩基内の）領域の中に位置しない。加えて、潜在的な標的部位を、ＮＣＢＩサーバーにおいてｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍで利用可能なＢＬＡＳＴＮ ２．０．５などの適切なゲノムデータベースと比較してもよく、有意な相同性を有する潜在的な標的配列を、排除された他のコード配列と比較してもよい。

[00115]別の実施形態において、標的部位は、５’または３’未翻訳領域（ＵＴＲ）に位置する。加えて、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子の自己相補性は、標的のｍＲＮＡにおいて見出される特定の配列から構成される。

[00116]なお別の実施形態において、１つ以上の標的部位は、非コード遺伝子または外因的に導入されたＲＮＡに位置する。

[00117]別の実施形態において、標的部位への相補性は、好ましくは、ガイド鎖の３’末端の標的へのミスマッチまたはゆらぎを含む。そのような実施形態では、増幅過程における二次ＲＮＡｉトリガーの産生を制御することができる。

[00118]別の実施形態では、標的遺伝子の５’もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、または自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子の二次標的遺伝子において見出される確定ループ領域とのキッシングループ相互作用を形成するように、ループ領域を設計することができる。

[00119]標的遺伝子またはｍＲＮＡは、例えば、植物、動物（例えば、哺乳類）、原生動物、ウイルス、細菌、または真菌を含む任意の種の生物体から形成することができる。

[00120]上記に示されているように、ポリヌクレオチドナノ粒子の標的遺伝子配列及び相補的領域は、互いに完全に相補的でありうる、または完全に相補的ではなく、すなわち、鎖が生理学的条件下で互いにハイブリッド形成する限り、部分的に相補的でありうる。

[00121]遺伝子発現の調節方法

[00122]標的遺伝子は、既知の遺伝子標的でありうる、あるいは標的遺伝子は、既知のものでなくてもよく、すなわち、ランダム配列を使用することができる。ある特定の実施形態において、１個以上、好ましくは２個以上のｍＲＮＡの標的ｍＲＮＡレベルは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減される。

[00123]本発明の１つの実施形態において、標的遺伝子発現（すなわち、ｍＲＮＡ発現）の阻害レベルは、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはほぼ１００％であり、したがって、細胞または生物体は、事実上、いわゆる遺伝子の「ノックアウト」に等しいを有する。しかし、いくつかの実施形態では、表現型が、いわゆる遺伝子の「ノックダウン」に等しくなるように、部分的阻害のみを達成することが好ましいこともある。この遺伝子発現をノックダウンする方法を、治療的に、または研究のために（例えば、疾患状態のモデルを生成するため、遺伝子の機能を検査するため、作用物質遺伝に作用するかを評価するため、創薬用の標的を検証するため）に使用することができる。

[00124]更に本発明は、マイクロアレイを含む、本発明の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子のアレイを提供する。マイクロアレイは、典型的には化学及び生化学反応を実施するためにマイクロメートルからミリメートルの範囲の寸法を有する小型化アレイであり、本発明の実施形態に特に適している。アレイは、半導体工業及び／または生化学工業において既知であり、利用可能である本質的に任意及び全ての技術を使用して、マイクロエレクトロニクス及び／またはマイクロファブリケーションを介して構築することができるが、但し、そのような技術がポリヌクレオチドナノ粒子配列の沈着及び／または選別にとって扱いやすく、適合していることが条件である。

[00125]本発明のマイクロアレイは、複数の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子のハイスループット分析に特に望ましいものである。マイクロアレイは、典型的には、本発明の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を含む区別された領域またはスポットによって構築され、各スポットは、１個以上の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を、好ましくはアレイ表面の指定可能な位置に含む。本発明のアレイは、当該技術において利用可能な任意の方法により調製することができる。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘにより開発された光誘導化学合成方法（ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｏｃｅｓｓ）（例えば、米国特許第５，４４５，９３４号及び同第５，８５６，１７４号を参照すること）を使用し、固相光化学合成をフォトリソグラフファブリケーション技術と組み合わせることによって、チップ表面に生体分子を合成することができる。Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌにより開発された化学沈着手法は、合成前ｃＤＮＡプローブをチップ表面への誘導沈着に使用する（例えば、米国特許第５，８７４，５５４号を参照すること）。

[00126]ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドナノ粒子は、当該技術において広く利用可能な技術を使用して、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子として合成される。他の実施形態では、適切で広く知られている技術を使用して、インビトロまたはインビボにおいて発現される。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、本発明の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子の配列を含むインビトロ及びインビボ発現ベクターまたは配列を含む。当該技術において周知の方法を使用して、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子をコード摺る配列、ならびに適切な転写及び翻訳制御要素を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組み換えが含まれる。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．、及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。

[00127]発現ベクターは、典型的には調節配列を含み、これは自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子の発現を調節する。発現ベクターに存在する調節配列には、ベクターの非翻訳領域、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’及び３’非翻訳領域が含まれ、これらは宿主細胞タンパク質と相互作用して、転写及び翻訳を実施する。そのような要素は、長さ、及び特異性について多様でありうる。利用されるベクター系及び細胞に応じて、構成的及び誘導性プロモーターを含む任意の数の適切な転写及び翻訳要素を使用することができる。加えて、組織または細胞特異的プロモーターを使用することもできる。

[00128]哺乳類細胞における発現では、哺乳類遺伝子または哺乳類ウイルスのプロモーターが一般的に好ましい。加えて、多数のウイルスに基づいた発現系が一般に利用可能である。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的のポリペップチドをコードする配列は、後期プロモーター及び三者間リーダー配列から構成されるアデノウイルス転写／翻訳制御複合体に連結されうる。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域への挿入を使用して、感染宿主細胞においてポリペプチドを発現することができる生存ウイルスを得ることができる（Ｌｏｇａｎ １９８４）。加えて、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを使用して、哺乳類宿主細胞における発現を増加させることができる。

[00129]ある特定の実施形態において、本発明は、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子の条件的発現を提供する。様々な条件的発現系が知られてお入り、細胞及び動物の両方のために当該技術において利用可能であり、本発明は、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子の発現または活性を調節するために、任意のそのような条件的発現系の使用を考慮する。本発明の１つの実施形態では、例えば、誘導性発現がＲＥＶ−ＴＥＴ系の使用により達成される。この系の構成要素、及び遺伝子の発現を制御するためのこの系の使用方法は、文献において十分に考証されており、テトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｔＴＡ）またはリバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）は、市販されている（例えば、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ、ｐＴｅｔ−Ｏｎ、及びｐｔＴＡ−２／３／４ベクター、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。そのような系は、例えば、米国特許第５，６５０，２９８号、同第６，２７１，３４８号、同第５，９２２，９２７号に記載されており、これらは、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。

[00130]１つの特定の実施形態において、ポリヌクレオチドナノ粒子は、ｐＳＵＰＥＲベクター主鎖及び発現される自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子に対応する追加の配列を含むベクター系を使用して、発現される。ｐＳＵＰＥＲベクター系は、ｓｉＲＮＡ試薬の発現及び遺伝子発現の下方調節に有用なことが示されている（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ２００２ａ、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ２００２ｂ）。ＰＳＵＰＥＲベクターは、ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡから市販されている。

[00131]本発明のポリヌクレオチドナノ粒子を、標的遺伝子の発現を阻害または低減する能力に全て一般的に関連する、様々な目的に使用することができる。したがって、本発明は、１個以上の標的遺伝子の発現を低減する方法であって、本発明の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を、標的遺伝子、またはその相同体、変異体、もしくはオルソログを含有する細胞に導入することを含む方法を提供する。加えて、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を使用して、発現を間接的に低減することができる。例えば、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を使用して、第２の遺伝子の発現を導き出すトランスアクチベーターの発現を低減し、それによって第２の遺伝子の発現を低減することができる。同様に、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を使用して、発現を間接的に増加させことができる。例えば、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を使用して、第２の遺伝子の発現を阻害する転写リプレッサーの発現を低減し、それによって第２の遺伝子の発現を増加させことができる。

[00132]様々な実施形態において、標的遺伝子は、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子が導入される細胞、内在性遺伝子、外来性遺伝子、導入遺伝子、または形質移入後に細胞に存在する病原体の遺伝子から導き出される遺伝子である。特定の標的遺伝子、及び細胞に送達される自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子の量に応じて、本発明の方法は、標的遺伝子発現の部分的な、または完全な阻害を引き起こすことができる。標的遺伝子を含有する細胞は、任意の生物体（例えば、植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌、または真菌）に由来しうる、または含有されうる。

[00133]標的遺伝子発現の阻害は、標的遺伝子でコードされたタンパク質、及び／または標的遺伝子のｍＲＮＡレベル、及び／または遺伝子発現に関連する表現型の不在、またはそのレベルの観察可能な減少を、本発明の分野の当業者に既知の技術を使用して観察または検出することが含まれるが、これらに限定されない手段により検証することができる。

[00134]本発明の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子の導入により引き起こされる効果を決定するために検査することができる細胞特性の例には、細胞増殖、アポトーシス、細胞周期特性、細胞分化、及び形態が含まれる。

[00135]自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を、細胞に直接的（すなわち、細胞内）に導入することができる、または細胞外から、空洞、間質腔、生物体の循環に導入する、経口により、発現宿主の摂取により、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を含有する溶液に生物体を浸すことにより、もしくは自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を細胞に送達するのに十分な他の方法により導入することができる。

[00136]加えて、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を発現するように改変されたベクターを、細胞に導入することができ、そこでベクターは自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を発現し、それによって細胞内に導入される。発現ベクターを細胞に移動する方法は良く知られており、当該技術において利用可能であり、例えば、形質移入、リポフェクション、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、電気穿孔、マイクロインジェクション、感染、遺伝子銃、及びレトロ転位が含まれる。一般に、ベクターを細胞に導入する適切な方法は、ベクターの種類及び細胞の種類、ならびに当該技術において広く利用可能な教示に基づいて、当業者により容易に決定される。感染病原体を、例えば、鼻腔内吸入を含む当該技術において容易に利用可能な様々な方法により導入することができる。

[00137]本発明の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を使用して遺伝子発現を阻害する方法を、他のノックダウン及びノックアウト方法、例えば、遺伝子標的化、アンチセンスＲＮＡ，リボザイム、二本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ）と組み合わせて、標的遺伝子の発現を更に低減することができる。

[00138]異なる実施形態において、本発明の標的細胞は、初代細胞、細胞系、不死化細胞、または形質転換細胞である。標的細胞は、体細胞または生殖細胞でありうる。標的細胞は、ニューロンなどの非分裂細胞でありうる、または適切な細胞培養条件下でインビトロにおいて繁殖することができる。標的細胞は正常な細胞でありうる、または既知の遺伝子突然変異を含有するものを含む疾患細胞でありうる。本発明の真核生物標的細胞には、例えば、ヒト細胞、ネズミ細胞、齧歯類細胞、及び霊長類細胞などの哺乳類細胞が含まれる。１つの実施形態において、本発明の標的細胞は幹細胞であり、これには、例えば、ネズミ胚幹細胞などの胚幹細胞が含まれる。

[00139]本発明の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子及び方法を、植物において、例えば、遺伝子の全身的または非全身的な調節のためにＲＮＡを提供することによって、遺伝子を調節することに使用できる。

[00140]本発明の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子及び方法は、植物の有害生物または病原体の内在性遺伝子を調節するのに有用である。

[00141]本発明の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子及び方法は、炎症性疾患、心血管疾患、神経系疾患、腫瘍、脱髄性疾患、消化系疾患、内分泌系疾患、生殖器系、血液及びリンパ系疾患、免疫疾患、精神障害、筋骨格系疾患、神経疾患、神経筋疾患、代謝疾患、性感染症、皮膚及び結合組織病、泌尿器疾患、及び感染が含まれるが、これらに限定されない多種多様な疾患または障害のいずれかの治療に使用することができる。

[00142]ある特定の実施形態において、本方法は、動物において、特定の実施形態では哺乳類において、ある特定の実施形態ではヒトにおいて実施される。

[00143]したがって、１つの実施形態において、本発明は、遺伝子の調節解除、過剰発現、または突然変異に関連する疾患の治療または予防のために、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を使用する方法を含む。例えば、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を癌性細胞または腫瘍に導入し、それによって、発癌性／腫瘍原性表現型の維持に必要とされる、または関連する遺伝子の発現を阻害することができる。疾患または他の病理を予防するため、例えば、疾患／病理の開始または維持に必要な標的遺伝子を選択することができる。治療には、疾患に関連する任意の症状、または病理に関連する任意の臨床適応症の寛解が含まれうる。

[00144]加えて、本発明の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子は、遺伝子突然変異に関連する疾患または障害の治療に使用される。１つの実施形態において、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子は、突然変異遺伝子または対立遺伝子の発現の調節に使用される。そのような実施形態において、突然変異遺伝子は、突然変異遺伝子の領域に相補的な領域を含む自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子の標的である。この領域は突然変異を含んでもよいが、必ずしもその必要はなく、それは、遺伝子の別の領域も標的化され、突然変異遺伝子またはｍＲＮＡの発現の減少をもたらすことができるからである。ある特定の実施形態において、この領域は突然変異を含み、関連する実施形態において、得られた自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子は、突然変異ｍＲＮＡまたは遺伝子の発現を特異的に阻害するが、野生型ｍＲＮＡまたは遺伝子は阻害しない。そのような自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子は、例えば、対立遺伝子は突然変異しているが、他はしていない状況において、特に有用である。しかし他の実施形態において、この配列は必ずしも突然変異を含む必要はなく、したがって、野生型配列のみを含むこともある。そのような自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子は、例えば、全ての対立遺伝子が突然変異している状況において、特に有用である。様々な疾患及び障害が遺伝子突然変異に関連する、または遺伝子突然変異により引き起こされることは、当該技術において知られており、本発明は、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子による、任意のそのような疾患または障害の治療を包含する。

[00145]ある特定の実施形態では、病原体の遺伝子が阻害のために標的になる。例えば、遺伝子は、宿主の免疫抑制を直接的に引き起こす可能性がある、または病原体の複製、病原体の伝搬、または感染の維持に必須でありうる。加えて、標的遺伝子は、宿主への病原体の侵入、病原体もしくは宿主による薬物代謝、病原体ゲノムの複製もしくは組み込み、宿主における感染の確立もしくは伝播、または次世代病原体の集合に関与する病原体遺伝子または宿主遺伝子でありうる。予防の方法（すなわち、感染の危険性の予防または減少）、ならびに感染に関連する症状の頻度または重篤度の低減は、本発明に含まれる。例えば、病原体による感染の危険性がある細胞、または既に感染している細胞、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染は、本発明の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子の導入による治療の標的となりうる。

[00146]他の特定的な実施形態において、本発明は任意の種類の癌の治療または治療の開発に使用される。本明細書に記載されている方法を使用して治療されうる腫瘍の例には、神経芽細胞腫、骨髄腫、前立腺癌、小細胞肺癌、結腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、脳癌、乳癌、白血病、リンパ腫などが含まれるが、これらに限定されない。

[00147]自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子、ならびに発現ベクター（ウイルスベクター及びウイルスを含む）を、インビトロまたはエキソビボにおいて細胞に導入し、次に続いて動物に配置して治療を実施することができる、またはインビボ投与により、患者に直接導入することができる。したがって、本発明は、ある特定の実施形態において遺伝子治療の方法を提供する。本発明の組成物を、非経口、静脈内、全身的、局所的、経口、腫瘍内、筋肉内、皮下、腹腔内、吸入、または任意の送達方法を含む多数の方法の方法いずれかによって、患者に投与することができる。１つの実施形態において、組成物は非経口投与され、すなわち、動脈内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与される。特定的な実施形態において、リポソーム組成物は、静脈内注入により投与される、またはボーラス注射により腹腔内に投与される

[00148]本発明の組成物は、対象への送達に適した薬学的組成物として処方される。本発明の薬学的組成物は、多くの場合、１つ以上の緩衝剤（例えば、中性緩衝食塩水もしくはリン酸緩衝食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、デキストロース、もしくはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドもしくはグリシンなどのアミノ酸、酸化防止剤、静菌剤、ＥＤＴＡもしくはグルタチオンなどのキレート剤、佐剤（例えば、水酸化アルミニウム）、製剤を受容者の血液に等張、低張、もしくは弱高張にする溶質、懸濁剤、増粘剤、及び／または防腐剤を更に含む。あるいは、本発明の組成物を凍結乾燥物として処方することができる。

[00149]患者に投与される自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子の量は、例えば、疾患、及び使用されるベクター（ベクターが投与される場合）から発現される自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子のレベルを含む様々な要因に基づいて、医師によって容易に決定することができる。一用量あたりの投与量は、典型的には最小治療用量を超えるが、毒性用量を下回るように選択される。一用量あたりの量の選択は、患者の病歴、他の療法の使用、及び疾患の性質などの多数の要因によって決まる。加えて、投与量は、治療に対する患者の応答、及び任意の治療関連副作用の存在または重篤度に応じて、治療全体にわたって調整することができる。

[00150]本発明は、生物体において遺伝子機能を特定する方法であって、以前は機能が不明であった標的遺伝子の活性を阻害するため、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を使用すること含む方法を更に含む。伝統的な遺伝子スクリーニングによる時間と労力を要する突然変異体の単離の代わりに、機能ゲノム科学は、本発明を用いて標的遺伝子活性の量を低減する、及び／またはタイミングを変えることのよって、特徴付けられていない遺伝の機能を決定することを想定している。本発明を、医薬の潜在的な標的を決定すること、開発に関連する正常及び病理事象を理解すること、生後発達／老化に関与するシグナル伝達経路を決定することなどに使用することができる。酵母、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ及びＣ．ｅｌｅｇａｎｓのゲノムの全配列を含む、ゲノム及び発現遺伝子源からヌクレオチド配列情報を取得する速度が増加していることに、本発明を合わせて、生物体（例えば、線虫）における遺伝子機能決定することができる。特定のコドンを使用するのに異なる生物体を選択すること、関連する遺伝子産物のために配列データベースを検索すること、遺伝形質の連鎖地図を、ヌクレオチド配列が誘導される物理地図と相関させること、及び人工知能による方法の使用によって、そのような配列決定プロジェクトにおいて取得されたヌクレオチド配列から推定オープンリーディングフレームを確定することができる。

[00151]１つの実施形態において、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子は、例えば、遺伝子機能または生物学的活性を決定するため、発現した配列タグ（ＥＳＴ）により利用可能な部分配列に基づいた遺伝子発現を阻害するために使用される。増殖、発達、代謝、疾患抵抗性、または他の生物学的過程における機能的変化は、ＥＳＴ遺伝子産物の正常の役割を示している。

[00152]自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を、標的遺伝子を含有する無傷の細胞／生物体に導入できる容易さは、本発明をハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に使用することを可能にする。例えば、異なる発現遺伝子を阻害することができる自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を含有する溶液を、規則的に整列されたマイクロタイタープレートに位置する個別のウエルに入れることができ、各ウエルにおける無傷の細胞／生物体を、標的遺伝子活性の阻害に起因する挙動または発達の任意の変化または修飾についてアッセイすることができる。標的遺伝子の機能を、遺伝子活性が阻害されたとき、細胞／生物体に対する効果についてアッセイすることができる。１つの実施形態において、本発明の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子はケモゲノミクススクリーニングに使用され、すなわち、本発明の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を使用して遺伝子発現を低減することによって、疾患モデルを逆転する能力について化合物を試験する。

[00153]生物体の特徴が、ＲＦＬＰまたはＱＴＬ分析により多形に関連することが決定される場合、本発明を使用して、遺伝子多形がその特徴の直接的な原因でありうるかに関して洞察を得ることができる。例えば、そのような遺伝子多形に近接する、遺伝子多形または配列を画定するフラグメントを増幅して、ＲＮＡを産生することができ、自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を生物体に導入することができ、特徴の変化が阻害と相関するかを決定することができる。

[00154]本発明は、必須遺伝子の阻害を可能にすることにおいても有用である。そのような遺伝子は、特定発達段階または細胞区画のみにおいて細胞または生物体の生存にとって必要でありうる。条件的突然変異の機能性等価物は、生存にとって必要でないとき、または場合に標的遺伝子の活性を阻害することによって産生されうる。本発明は、標的ゲノムに永久的突然変異を導入することなく、生物体の特定の発達時点または位置に自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を付加することができる。同様に、本発明は、望ましいときのみに自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子を発現する、誘導的または条件的ベクターの使用を考慮する。

[00155]本発明は、また、遺伝子産物が創薬または開発の標的であるかを検証する方法に関する。分解する遺伝子に対応するｍＲＮＡを標的にする自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子が、細胞または生物体に導入される。細胞または生物体は、ｍＲＮＡの分解が生じる状態に維持され、遺伝子発現の減少をもたらす。遺伝子発現の減少が細胞または生物体に影響を与えるかについて、決定される。遺伝子発現の減少が影響を与える場合、遺伝子産物は、創薬または開発の標的である。

[00156]自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子の設計及び産生方法

[00157]本発明の自己形成性ポリヌクレオチドナノ粒子は、転写の際に球状二次構造をとるように、末端間に配置された新規で特有の機能性配列のセットをＭＶ−ＲＮＡとして含み、このことがポリヌクレオチドナノ粒子に利点を付与している。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを設計する方法を含む。そのような方法は、典型的には、ポリヌクレオチドナノ粒子内に含有された様々なＭＶ−ＲＮＡの適切な方向付けを伴う。

[00158]本発明の単離ポリヌクレオチドナノ粒子を産生する１つの例示的な例では、下記のセクション「ＩＩＩ」に示されているフォーマットの個別のＭＶ−ＲＮＡ分子配列が、「分子」と「連鎖」（Ｉ）の間に介在する５’〜３’パターンの使用によって２個以上のＭＶ−ＲＮＡ分子の鎖に隣接して、単一の単離オリゴヌクレオチド配列になり、これは下記のセクション「ＩＶ」に記載されているように任意に閉鎖されている。この方法で産生されたＭＶ−ＲＮＡナノ粒子の非限定例が、図４及び６に示されている。

[00159]得られたオリゴヌクレオチドは、ＭＶ−ＲＮＡの所定の反復（複数性）の直鎖状または環状パターンを使用して構築される。任意に、完全環状化（５’リン酸を欠いている）型は、（ＩＶ）の単離オリゴヌクレオチド配列を、（Ｖ）の逆方向リボザイム配列（ａ）及び（ｂ）の間に挿入することによって、作り出すことができる。

[00160]ナノ粒子集合体の特徴は以下である。

[00161]Ｉ．例示的な連鎖の特徴

[00162]真核及び原核生物体における発現のための、本発明の単離ポリヌクレオチドに使用される連鎖の特徴が、下記に例示的に記載されている。

[00163]
ａ．一連鎖：＜モノヌクレオチド＞

[00164]
ｂ．二連鎖：＜ジヌクレオチド＞

[00165]
ｃ．ｐＨ連鎖：＜ｐＨ連鎖＞

[00166]ＩＩ．例示的なＭＶ−ＲＮＡループの特徴

[00167]真核及び原核生物体における発現のための、本発明の単離ポリヌクレオチドに使用されるＭＶ−ＲＮＡ内のループの特徴が、下記に例示的に記載されている。

[00168]
ａ．ダイサー１：＜５〜１２ｎｔループ＞

[00169]
ｂ．ｒｎｔ１：＜１３ｎｔステムテトラループ＞

[00170]
ｃ．アプタマー：＜アプタマー＞

[00171]ＩＩＩ．例示的なＭＶ−ＲＮＡ分子の特徴

[00172]本発明の単離ポリヌクレオチドに使用される特徴が、下記に例示的に記載されている。

[00173]
ａ．ＭＶ−ＲＮＡ Ｉを標的にする：＜一次ガイド＞＜ループ＞＜二次ガイド＞＜アプタマー＞＜キーガイド＞

[00174]
ｂ．ＭＶ−ＲＮＡ ＩＩを標的にする：＜一次ガイド＞＜アプタマー＞＜二次ガイド＞＜ループ＞＜キーガイド＞

[00175]
ｃ．ＭＶ−ＲＮＡ ＩＩＩを標的にする：＜一次ガイド＞＜アプタマー＞＜二次ガイド＞＜プタマー＞＜キーガイド＞

[00176]
ｄ．ＭＶ−ＲＮＡ ＩＩを標的にしない：＜一次ガイド＞＜ループ＞＜二次ガイド＞＜ループ＞＜キーガイド＞

[00177]ＩＶ．例示的なナノ粒子の開放／閉鎖の特徴

[00178]本発明の単離ポリヌクレオチドの５’〜３’末端の閉鎖に使用される特徴が、「開放配列」及び「閉鎖配列」を確定することによって、下記に例示的に記載されている。

[00179]
ａ．ＭＶ−ＲＮＡフラグメントの開放：＜一次ガイド＞＜ループ＞＜二次ガイド＞

[00180]
ｂ．ＭＶ−ＲＮＡフラグメントの閉鎖：＜キーガイド＞

[00181]
ｃ．ＭＶ−ＲＮＡフラグメントＩＩの開放：＜一次ガイド＞

[00182]
ｄ．ＭＶ−ＲＮＡフラグメントＩＩの閉鎖：＜二次ガイド＞＜ループ＞＜キーガイド＞

[00183]
ｅ．ＲＮＡフラグメントの開放：＜ｓｓＲＮＡ １〜４００ｎｔ＞

[00184]
ｆ．ＲＮＡフラグメントの閉鎖：＜上記の「ｃ」と部分的または完全に相補的なｓｓＲＮＡ １〜４００ｎｔ＞

[00185]Ｖ．ＭＶ−ＲＮＡ分子をナノ粒子フォーマットに接続する例示的な設計

[00186]
ａ．５’〜３’の一般的なパターン直鎖状では、＜ＲＮＡｉ分子１＞＜連鎖＞＜ＲＮＡｉ分子２＞＜連鎖＞，，，．．繰り返しである。環状では、＜開放配列＞＜ＲＮＡｉ分子１＞＜連鎖＞＜ＲＮＡｉ分子２＞＜連鎖＞，，，．．繰り返し＜閉鎖配列＞である。

[00187]
ｂ．積層ＭＶ−ＲＮＡナノ粒子の例外（図３Ｂ）：ＭＶ−ＲＮＡ分子を積層することは、特有のパターンを有して、構造化転写物の完全性を確実にし、高い表面とコアのステム比を作り出す。一般に、追加のＭＶ−ＲＮＡ配列が、Ｐ鎖オーバーハングの前及びＳ鎖の後の先行ＭＶ−ＲＮＡのループに挿入され、追加のＭＶ−ＲＮＡが、Ｓ鎖オーバーハングの後及びＫ鎖の前に挿入される。＜ＭＶ−ＲＮＡ＿１一次鎖＞＜２ｎｔ ＯＨ＞＜ＭＶ−ＲＮＡ＿２＞＜２ｎｔ ＯＨ＞＜ＭＶ−ＲＮＡ＿１二次鎖＞＜２ｎｔ ＯＨ＞＜ＭＶ−ＲＮＡ＿３＞＜２ｎｔ ＯＨ＞＜ＭＶ−ＲＮＡ＿１キー鎖＞＜連鎖＞，．，．，．，．，．，繰り返し。同じ配列の複数の種類を連鎖するとき、ＲＮＡｉ分子に介在させながら、配列方向の（Ｐ、Ｓ、Ｋ、またはＳ、Ｋ、Ｐ、またはＫ、Ｐ、Ｓ）を換えることができる。このことは、細胞内分子結合における転写の際に、最近接のワトソンクリック相互作用が交互構造をもたらしうるように助ける。

[00188]Ｖ．ポリヌクレオチドナノ粒子のリボザイムに基づいた環状化

[00189]当該技術に記載されている方法を使用して、転写反応の一部としてＲＮＡ転写物を生体内原位置で環状化することができる（Ｐｅｒｒｉｍａｎ １９９８）。５’リン酸の除去及びナノ粒子の完全な環状化のため、上記のモチーフを使用して設計されたナノ粒子配列を、下記の「環状化＿５」と「環状化＿３」配列の灰田に挿入して、完全な転写物を確定した。

[00190]
ａ．環状化＿５：

[00191]
ｂ．環状化＿３

[00192]ＩＶ．接続されたＲＮＡｉ分子の検証

[00193]上記のパターンを使用して完全な配列が設計されると、ｃｏｆｏｌｄ、Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡｆｏｌｄ、ｍＦｏｌｄ、または特にＭｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ＲＮＡｉ ＣｌｏｕｄなどのコンピュータープログラムによりＲＮＡの折りたたみが、二次構造の完全性を計算的に検証する。得られた折りたたみの表示または図は、遊離ヌクレオチドを「．」と示し、結合ヌクレオチドを「（」または「）」と示す。相対自由エネルギー及び融解温度も正確な転写物の安定性を示す。得られた図が正確な構造化転写物を表していると見なすことができる。

[00194]また、コンピュータープログラム、ならびにコンピューター読み出し可能媒体及びこれらのプログラムを含むコンピューター、ならびに本明細書に記載されている相補的特徴に基づいてナノ粒子のＭＶ−ＲＮＡ配列を選択するためのこれらの使用も、本明細書において提供される。ある特定の実施形態において、使用者は、標的遺伝子の配列、位置、または名称に関する情報を、コンピューターに提供する。コンピューターは、この入力を本発明のプログラムで使用して、標的遺伝子の１つ以上の適切な領域を特定してＭＶ−ＲＮＡフォーマットにおいて標的にし、本発明のポリヌクレオチドナノ粒子の集合体に使用される相補的配列を出力または提供する。典型的には、このプログラムは、標的遺伝子を含む、ゲノム配列に相補的ではない一連の配列を選択する、または標的遺伝子に相補的であるポリヌクレオチドナノ粒子の領域を選択する。望ましい場合、このプログラムは、ギャップ領域、折りたたみ表示、及び折りたたみ図も提供する。適切なＭＶ−ＲＮＡの方向、複数性、アプタマー、リープ、連鎖、開放／閉鎖配列、クローン化部位、及び必要な転写要素を選択すると、コンピュータープログラムは、この情報を使用者に出力または提供する。

[00195]本発明のプログラムは、標的遺伝子を含有する生物体のゲノム配列関する入力、例えば、公共または民間のデータベース、ならびに特定の配列の二次構造及び／またはハイブリッド形成の特徴を予測する追加的なプログラムを更に使用して、ポリヌクレオチドナノ粒子が正確な二次構造を採用し（すなわち、ｍＦｏｌｄ、ＲＮＡｆｏｌｄ、ｃｏｆｏｌｄ）、非標的遺伝子とハイブリッド形成しないこと（ＢＬＡＳＴｎ）を確実にすることができる。

[00196]本発明の実施は、細胞生物学、分子生物学、微生物学、及び組み換えＤＮＡの様々な従来の技術を用い、それらは当該技術の技能の範囲内である。そのような技術は、文献において完全に記載されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、及びＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８５）を参照すること。

[00197]以下の実施例は、本発明をより良く例示するために提供されており、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。特定の材料が記述されている程度において、これは単に例示の目的であり、本発明を制限することを意図していない。当業者は、創意工夫の能力を発揮することなく、かつ本発明の範囲から逸脱することなく、同等の方法及び反応体を開発することができる。多くの変更を本明細書に記載されている手順に行うことができ、依然として本発明の境界内に留まることが理解される。そのような変更が本発明の範囲内に含まれることが、本発明者たちの意図である。

[00198]実施例１：ヒト前立腺癌の治療のための自己形成性一本鎖ポリヌクレオチドＭＶ−ＲＮＡナノ粒子

[00199]この例は、ヒト去勢抵抗性前立腺癌に寄与する複数の遺伝子を標的にする、本発明のナノ粒子配列の集合体を記載する。それぞれのナノ粒子は、細胞特異的取り込みのためにＰＳＭＡ標的化アプタマー配列と、エンドソーム移動のためにクラスリンピットエンドサイトーシスアプタマー配列の両方を利用する。ナノ粒子は全体として、エンドサイトーシス毎に複数の活性ＭＶ−ＲＮＡ ＲＮＡｉトリガーを送達し、ナノ粒子ポリヌクレオチドナノ粒子内のＭＶ−ＲＮＡの複数性を増加することによって拡大可能である。２個の多数遺伝子経路がこの例によって標的にされており、（１）ヒトＡＫＴ（配列番号８９）、ヒトＭＡＰ３Ｋ（配列番号９０、ＮＭ＿００５９２１）、及びヒトＰＬＫ１（配列番号９１、ＮＭ＿００５０３０）、ならびに（２）ヒトアンドロゲン受容体（配列番号９２及び配列番号９３（変異転写物））／ｃＭＥＴ（配列番号９４、Ｘ５４５５９）である。それぞれの標的セットは、ＭＶ−ＲＮＡの標的化、または極めて効果的なＭＶ−ＲＮＡトリガーのモル濃度を増加する反復複数性において、広範囲にわたって本発明の一部または全てのナノ粒子を表示することができる。

[00200]選択されたＭＶ−ＲＮＡは、標的を選びながら指定された、様々なダイサーループ及び標的化アプタマー配列を含有した。そのようなループが、下記のそれぞれのＭＶ−ＲＮＡ配列に太字で示されている。これらのループ配列は、ナノ粒子配列を集合させながら容易に動き回って、任意の好ましい方法によりアプタマーの標的化に寄与することができる。それぞれのＭＶ−ＲＮＡは、３’「ＵＵ」オーバーハングも含有し、これを、ｓｓＲＮＡエンドヌクレアーゼへの感受性が少なくなるように「ＡＧ」に変えることができる、またはｓｓＲＮＡエンドヌクレアーゼによる、オーバーハングの第２のヌクレオチドの後ろの切断の確率を高めるため、「ＡＣ」、「ＧＣ」、「ＡＵ」、もしくは「ＧＵ」に変えることができる。

[00201]選択されたＭＶ−ＲＮＡのループ：

[00202]ダイサー１のループ：ＵＣＡＡＧＡＡＡＣ（配列番号３）

[00203]ダイサー２のループ：ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵ（配列番号４）

[00204]ダイサー３のループ：ＵＵＣＡＵＡＧＡＧＡ（（配列番号５）

[00205]ＰＳＭＡのループ：

[00206]クラスリンピットのループ：

[00207]２個の経路それぞれにおける選択されたＭＶ−ＲＮＡの例が、下記に記載される。「プロジェクト番号」は、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ＲＮＡｉ Ｃｌｏｕｄソフトウエアアプリケーションのプロジェクト番号を指す。それぞれのＭＶ−ＲＮＡ配列には、標的鎖における各ガイド鎖の結合部位を示す３つの連続番号が指定されている。

[00208]ＡＲ（目的の一次経路）：

[00209]アンドロゲン受容体／ｃＭＥＴ、プロジェクト番号Ｐ００９００：

[00210]ＭＶ−ＲＮＡ１２６９／２０３０／２８９６：

[00211]ＭＶ−ＲＮＡ５１２４／３３６３／４４５６：

[00212]ＭＶ−ＲＮＡ７２７６／４０９５／６２３５：

[00213]アンドロゲン受容体／Ｖ．１−２、プロジェクト番号Ｐ００９０１：

[00214]ＭＶ−ＲＮＡ２８５４／１１８６／９７２２：

[00215]ＭＶ−ＲＮＡ２９８／５８５／１４７３：

[00216]Ｈｓアンドロゲン受容体、プロジェクト番号Ｐ００９６３：

[00217]ＭＶ−ＲＮＡ６８２０／７２３０／９８３２：

[00218]ＭＶ−ＲＮＡの開放／閉鎖

[00219]ＭＶ−ＲＮＡ３９００／３３０４：

[00220]アンドロゲン受容体／ｃＭｅｔＩＩ、プロジェクト番号Ｐ００９６２：

[00221]ＭＶ−ＲＮＡ３９２／２３５６／３７５：

[00222]ＭＶ−ＲＮＡ９３６／１７２７／７５１８：

[00223]ＭＶ−ＲＮＡ１８２６／３１８６／４２７４：

[00224]ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＭＴＯＲ（目的の二次経路）

[00225]ＡＫＴ１／ＭＡＰ３Ｋ／ＰＬＫ１、プロジェクト番号Ｐ００８４０

[00226]有効なＰＬＫ１部位

[00227]ＭＶ−ＲＮＡ１５３／１４２５／１５０４：

[00228]ＭＶ−ＲＮＡ４８１／１４７８／１８０２：

[00229]この例のナノ粒子は、減衰転写（ｆａｌｌ−ｏｆｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）に消化されたＤＮＡテンプレートのＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで産生することができる。

[00230]標的化アプタマーによる十二面体ポリヌクレオチドナノ粒子の集合

[00231]上記に列挙された１２個のＭＶ−ＲＮＡ（配列番号８〜１９）を使用して、開放／閉鎖ＭＶ−ＲＮＡ、及びコアとして一連の連鎖ＭＶ−ＲＮＡを確定することによって、本発明のナノ粒子を作製することができる。複数性は、２回から上限の遺伝子合成または転写環境の範囲でありうる。この例は、単純化したモデルとして１２単位（十二面体）ナノ粒子に集合させる。

[00232]ナノ粒子の「連鎖」、「開放」、「閉鎖」、及び「コア」構成要素は、以下である。

[00233]連鎖構成要素：ＡＣ

[00234]開放構成要素：

[00235]連鎖を有する上記のＭＶ−ＲＮＡ（開放／連鎖ＭＶ−ＲＮＡ配列を含まない）により集合された前立腺癌ナノ粒子コア構成要素：

[00236]閉鎖構成成分：

[00237]最終のポリヌクレオチド配列は、配列をＤＮＡに変換し、５’Ｔ７転写開始部位（ＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＮ、配列番号２３、「Ｎ」はＴ７転写物の開始ヌクレオチド、好ましくは「Ｇ」を示す）、次にクローン化のために制限酵素部位を付加することによって、インビトロ転写テンプレートに変換することができる。この例では、ｐＵＣ５７（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＮＪ）ベクターが、フラグメントをＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ部位にクローン化する遺伝子合成及びテンプレート増幅に使用される。

[00238]上記に設計された十二面体ナノ粒子（前立腺癌ナノ粒子）の転写のためにｐＵＣ５７にクローンされたＤＮＡ転写テンプレートの最終ヌクレオチド配列：

[00239]当業者は、これを異なるプロモーターにより容易に利用できること、したがってこの例が制限的ではないことを認識することができる。例えば、哺乳類Ｈ１プロモーターによる同じ例のインビボ発現は、ＴＡＴＡボックス（ｐＳＵＰＥＲ）の後の転写開始部位として「ＧＧＧ」、及び停止シグナルとして「ＴＴＴＴＴ」を利用することによって、容易に達成することができる。

[00240]標的化アプタマーを有する前立腺癌十二面体ポリヌクレオチドナノ粒子の得られたＲＮＡ転写物：

[00241]反復複合性による十二面体ポリヌクレオチドナノ粒子

[00242]高度に活性なＭＶ−ＲＮＡのモル濃度を増加する理想的な方法は、ポリヌクレオチドナノ粒子配列内の反復である。転写に基づいた折りたたみを保存するため、ナノ粒子配列を確定するとき、一対の異なるＭＶ−ＲＮＡを介在させる、または単一ＭＶ−ＲＮＡの方向を交差させることは、二次構造の保存を助ける（例えば、図１９を参照すること）。そのような転写に基づいた構造を確認するため、「ｃｏｆｏｌｄ」などのコンピュータープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅ−ｒｎａ．ｏｒｇ／ｃｏｆｏｌｄ／）が、ＲＮＡ二次構造を予測するために自由エネルギーに依存しているプログラムの使用よりも提案されている。

[00243]数個の反復ＭＶ−ＲＮＡを介在させることが、モル濃度を増加する有効な方法である。ＭＶ−ＲＮＡ３９２／２３５６／３７５：

[00244]ＭＶ−ＲＮＡ９３６／１７２７／７５１８：

[00245]ＭＶ−ＲＮＡ１８２６／３１８６／４２７４：

[00246]開放構成要素：

[00247]配列番号１６、１７、及び２０の３個のＭＶ−ＲＮＡを反復させ、同時にそれぞれの転写指示を介在させることによって生成されたモル濃度増加ナノ粒子：

[00248]閉鎖構成成分：

[00249]ＭＶ−ＲＮＡの反復及び介在によって作製された、「開放」、「閉鎖」、及び「コア」配列を含有するナノ粒子配列の例：

[00250]ｃｏｆｏｌｄ出力（折りたたみ表示）：

[00251]ポリヌクレオチドナノ粒子の環状化

[00252]ヒトに使用される理想的なポリヌクレオチドナノ粒子は、環状化リボザイムを使用して作り出し（Ｐｅｒｒｉｍａｎ １９９８）、免疫刺激５’リン酸を除去し、インビボ用途でのエキソヌクレアーゼ分解を低減することができる。ナノ粒子からのリボザイム産物の精製は、エキソヌクレアーゼ消費（図１２）、ＨＰＬＣ、ゲル抽出、またはサイズ排除カラムに装填されたｍｇ量のＦＰＬＣの使用（Ｋｉｍ ２００７）によって実施することができる。

[00253]配列フラグメントは、ＲＮＡシクラーゼリボザイム使用して作り出した。＜５’シクラーゼリボザイム配列＞＜ポリヌクレオチドナノ粒子転写物＞＜３’シクラーゼリボザイム配列＞のモデルを使用して、環状化ナノ粒子は、転写の際に、またはその後の環状化反応を利用して作製することができる。

[00254]シクラーゼリボザイム配列は、下記である。

[00255]Ｔ７を有する５’末端：

[00256]３’末端：

[00257]以下の配列は、前立腺癌標的化ナノ粒子を上記のシクラーゼリボザイム配列の間に挿入することによって生成された、前立腺癌標的化環状十二面多ナノ粒子を表す。

[00258]モル濃度の増加のために高度の構造化されたポリヌクレオチドナノ粒子

[00259]コアの反復は、モル濃度の増加に有効な方法でありうる。下記のポリヌクレオチドナノ粒子は、直径が４０〜６０ｎｍの高度に詰め込まれた球体を形成する。この例では、各ナノ粒子は、それぞれ４通りトリガーを有するおよそ４８個のＭＶ−ＲＮＡを送達する。

[00260]開放構成要素：

[00261]コア構成要素（上記の連鎖ＭＶ−ＲＮＡの集まり）

[00262]コア１：

[00263]コア２：

[00264]コア３：

[00265]コア４：

[00266]閉鎖構成成分：

[00267]上記の反復領域及び開放／閉鎖構成要素を集合させた最終ポリヌクレオチドナノ粒子：

[00268]二次構造を示すｃｏｆｏｌｄ出力（折りたたみ表示）：

[00269]実施例２：Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ（ウェスタンコーンルートワーム）を標的にする自己形成性一本鎖ポリヌクレオチドＭＶ−ＲＮＡナノ粒子：

[00270]この例は、ウェスタンコーンルートワームの複数の遺伝子を標的にする安定した多価一本鎖ＲＮＡナノ粒子としての本発明のＭＶ−ＲＮＡナノ粒子の集合を記載する。この例は、＞６０ｂｐの長ｄｓＲＮＡのみがこの昆虫において活性に達しうるという公表されている要件と対照的に、摂取されたＲＮＡの新規なサイズ／活性関係を例示する（図２０）。

[00271]多価及び転写長さなどの追加的な利益も、商業的に実現することができる。本発明は、摂取されたＲＮＡのプロモーター誘導産生またはサイズ活性関係のために、正準（バイオジェネシス後）形態に対して長さを最適化することができる、長前駆体転写物の酵素バイオジェネシスを誘発する（Ｔｕｒｎｅｒ ２００６）。

[00272]ポリヌクレオチドナノ粒子に利用されるＭＶ−ＲＮＡナノ粒子の集まり

[00273]「プロジェクト番号」は、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ＲＮＡｉ Ｃｌｏｕｄソフトウエアアプリケーションのプロジェクト番号を指す。ＭＶ−ＲＮＡは、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａのｖＡＴＰアーゼ（ＣＮ４９８３３７．１、配列番号９６）、チトクロムＰ４５０（配列番号９７）、ＣＯＰＩ（配列番号９８）、Ｒｉｂｏ Ｓ４（配列番号９９）、Ｄｖｓｎｆ７（配列番号１００）、ＥＴ３（配列番号１０１）、ＡＴＰアーゼＤサブユニット１の一部（配列番号１０２）、及びＡＴＰアーゼＥ（配列番号１０３）を標的にすることによって、生成した。

[00274]ＭＶ−ＲＮＡ ＷＣＲ＿ＳＮＦ７＿５９６（プロジェクト番号Ｐ００９４２）：

[00275]ＭＶ−ＲＮＡ ＷＣＲ＿ＲＩＢＯＳ4＿１７８（プロジェクト番号Ｐ００９５３）：

[00276]ＭＶ−ＲＮＡ ＷＣＲ＿ＣＯＰＩ＿２４２（プロジェクト番号Ｐ００９５０）：

[00277]ＭＶ−ＲＮＡ ＷＣＲ＿ＲＩＢＯＳ４＿４９０（プロジェクト番号Ｐ００９５３）：

[00278]ＭＶ−ＲＮＡ ＷＣＲ＿ＳＮＦ７＿６２（プロジェクト番号Ｐ００９４２）：

[00279]ＭＶ−ＲＮＡ ＷＣＲ＿ＳＮＦ７＿３９９（プロジェクト番号Ｐ００９４２）：

[00280]ＭＶ−ＲＮＡ ＷＣＲ＿ＲＩＢＯＳ４＿６４２（プロジェクト番号Ｐ００９５３）：

[00281]ＷＣＲ＿ＣＯＰＩ＿１２４９（プロジェクト番号Ｐ００９５０）：

[00282]ＭＶ−ＲＮＡ ＷＣＲ＿ＲＩＢＯＳ４＿５９３（プロジェクト番号Ｐ００９５３）：

[00283]

[00284]ＭＶ−ＲＮＡ ＷＣＲ＿ＳＮＦ７＿４７２（プロジェクト番号Ｐ００９４２）：

[00285]ＭＶ−ＲＮＡ ＷＣＲ＿ＣＯＰＩ＿７８０（プロジェクト番号Ｐ００９５０）：

[00286]ＭＶ−ＲＮＡ ＷＣＲ＿ＲＩＢＯＳ４＿３９７（プロジェクト番号Ｐ００９５３）：

[00287]ＭＶ−ＲＮＡ ＷＣＲ＿ＣＯＰＩ＿１２５（プロジェクト番号Ｐ００９５０）：

[00288]ＭＶ−ＲＮＡ ＷＣＲ＿ＳＮＦ７＿３００（プロジェクト番号Ｐ００９４２）：

[00289]クラスリンピット及びＧａｌＮａｃ取り込みアプタマーを有するＷＣＲ標的化ポリヌクレオチドナノ粒子の集合

[00290]上記のＭＶ−ＲＮＡを、標的遺伝子の１個を標的にするナノ粒子あたり１個のＭＶ−ＲＮＡを有するＴＲＩとして、３つのセットに集めた（図１、２）。得られた３個のＭＶ−ＲＮＡは、本出願の設計指示に従って単一のポリヌクレオチド配列に連鎖した。３個のＭＶ−ＲＮＡのうちの２個は、「クラスリンピット」または「ＧａｌＮａｃ」のいずれかとして１個のループにアプタマーを含有した（図１、２）。

[00291]ＧａｌＮａｃ：

[00292]クラスリンピット：

[00293]インビトロＴ７転写が３個のＲＮＡナノ粒子を産生するように計画されたので、Ｔ７転写産出に最も適したヌクレオチドにより開始する特定のＭＶ−ＲＮＡ（「Ｇｎｎ」、「ＧＧｎ」）を、本発明の本記載の指示に従って、ナノ粒子の開放／閉鎖のために選択した。

[00294]下記のそれぞれのナノ粒子は、テンプレート消費後の転写を助けるため、Ｔ７転写開始部位（ＢＯＬＤ）及び短ランダムＤＮＡフラグメント「ＡＡＴＴ」を付加して、インビトロ転写により調製した。ＤＮＡテンプレートをｐＵＣ５７（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＮＪ）のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位にクローンし、増幅し、次に、インビトロ転写反応を実施する前に、適切な制限酵素により消費した。特定の制限酵素によるヌクレオチド付加のために、３’制限部位を変更してもよい。この場合、「Ｔ」がＸｂａＩ消費後にテンプレートに戻って付加されるので、ナノ粒子の最終ヌクレオチドが除去される。

[00295]Ｔ７開始：

[00296]上記のＭＶ−ＲＮＡを、ＷＣＲ幼生に給餌するため、ＴＲＩナノ粒子として３個のセットに集めた。各ＴＲＩナノ粒子では、開放／閉鎖ＭＶ−ＲＮＡ、をＴ７転写に基づいて上に記載されたように選択した。

[00297]ＴＲＩ＿ｃ６３６ｃ５９６ｒ１７８：

[00298]ＴＲＩ＿ｃ２４２２ｒ４９０ｓ６２：

[00299]ＴＲＩ＿ｓ３９９ｒ６４２ｃ１２４９：

[00300]ＴＲＩ＿ｒ５９３ｓ４７２ｃ７８０：

[00301]ＴＲＩ＿ｒ３９７ｃ１２５ｓ３００：

[00302]二次構造を示すｃｏｆｏｌｄ出力（折りたたみ表示）：

[00303]クラスリンピット及びＧａｌＮａｃ取り込みアプタマーを有するＭＶ−ＲＮＡトリガーモル濃度の増加

[00304]次に上記の個別のＭＶ−ＲＮＡを、多数のＭＶ−ＲＮＡのナノ粒子にする本出願の設計支持に従って、単一ポリヌクレオチド配列に連鎖した。単一ＭＶ−ＲＮＡは、Ｔ７転写産出に適合したヌクレオチドに基づいて、ナノ粒子の開放／閉鎖フラグメントとして選択した。

[00305]開放／閉鎖配列は、以下である。

[00306]ナノ粒子開放配列（ＷＣＲ＿ＣＯＰＩ＿６３６の５’）ＷＣＲ＿ＣＯＰＩ＿６３６：

[00307]コア閉鎖（ＷＣＲ＿ＣＯＰＩ＿６３６の３’末端）：

[00308]Ｔ７によるインビトロ転写のために得られたナノ粒子テンプレート（下線は転写物：

[00309]ＷＣＲ＿ＰＲＥＳＣＲＥＥＮ＿ａｐｔ：

[00310]二次構造を示すｃｏｆｏｌｄ出力（折りたたみ表示）：

[00311]「ＧａｌＮａｃ」及び「クラスリンピット」アプタマーの両方が除去されている同じナノ粒子を設計することもできる。

[00312]ＷＣＲ＿ＰＲＥＳＣＲＥＥＮ＿ＮＯＮＥ：

[00313]二次構造を示すｃｏｆｏｌｄ出力（折りたたみ表示）：

[00314]ｄｓＲＢＤ取り込みシグナルを有するポリヌクレオチドナノ粒子

[00315]ナノ粒子の開放／閉鎖配列を変えて、ナノ粒子から離れて伸びている（ｌｅａｄｉｎｇ ｏｆｆ）ｄｓＲＮＡフラグメントまたは「尾」をもたらすこともできる（図１４の「Ａ」を参照すること）。

[00316]Ｔ７＋ＧＦＰ開放配列（配列番号９５）：

[00317]

[00318]ＧＦＰ閉鎖配列ＤＮＡ（上記の「ＧＦＰ開放」にアニールする）：

[00319]

[00320]ｄｓＲＢＤ取り込みシグナルを有するＷＣＲナノ粒子の産生のためのＤＮＡテンプレート

[00321]二次構造を示すｃｏｆｏｌｄ出力（折りたたみ表示）：

[00322]インビトロまたはインビボにおけるポリヌクレオチドナノ粒子の環状化

[00323]ヒトに使用される理想的なナノ粒子は、環状化リボザイムを使用して作り出し（Ｍａｎｎｙ Ａｒｅｓ，１９９８）、免疫刺激５’リン酸を除去し、インビボ用途でのエキソヌクレアーゼ分解を低減することができる。ナノ粒子からのリボザイム産物の精製は、エキソヌクレアーゼ消費（図１２）、ＨＰＬＣ、ゲル抽出、またはサイズ排除カラムに装填されたｍｇ量のＦＰＬＣの使用（Ｋｉｍ ２００７）によって実施することができる。

[00324]配列フラグメントは、ＲＮＡシクラーゼリボザイム使用して作り出した。＜５’シクラーゼリボザイム配列＞＜ポリヌクレオチドナノ粒子転写物＞＜３’シクラーゼリボザイム配列＞のモデルを使用して、環状化ナノ粒子は、転写の際に、またはその後の環状化反応を利用して作製することができる。

[00325]シクラーゼリボザイム配列は、下記である。

[00326]Ｔ７を有する５’末端：

[00327]３’末端：

[00328]

[00329]この配列の例は、インビトロＴ７転写の後にＷＣＲ ｖＡＴＰアーゼを標的にする環状ＴＲＩナノ粒子をもたらすように上記のシクラーゼリボザイム配列の間に挿入されるＷＣＲ ＥＳＴ３、ｖＡＴＰアーゼＡ、及びＳｎｆ７を標的にする、ＴＲＩナノ粒子を示す。

[00330]ＴＲＩナノ粒子環状化ＤＮＡテンプレート（ＷＣＲｔｒｌｍ＿ＩＩＩ．Ｃ）：

[00331]同じ環状化をインプランタ（インビボ）発現の際に生じることができる。例えば、トウモロコシにおいて本発明のナノ粒子を作製することを選択してもよい。そのようなトウモロコシに発現したナノ粒子は、組織内においてより安定していることを示し（図２２）、有害生物による摂取の際に高い濃度をもたらすことができる。上記の５’シクラーゼリボザイム、ポリヌクレオチドナノ粒子配列、及び３’シクラーゼリボザイムを所望のクローンに挿入することによって、植物において形質転換する前に、ユビキチンまたはＣＭＶなどのプロモーターを容易に使用することができる。

[00332]実施例３：Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｐａｌｍｅｒｉ（アカザ）を標的にする自己形成性一本鎖ポリヌクレオチドＭＶ−ＲＮＡナノ粒子：

[00333]この例は、増加したモル濃度及びスペクトルを伴って１、２、または３個の植物遺伝子を同時に標的にする安定した多価一本鎖ＲＮＡナノ粒子としての本発明のポリヌクレオチドナノ粒子の集合を記載する。この例は、Ｐａｌｍｅｒ Ａｍａｒａｎｔｈへの外因性（噴霧または滴下）適用のためのナノ粒子のインビトロ産生を例示する。

[00334]生物除草剤の散布範囲、植物細胞取り込み、及び製剤安定性のための多価などの利益が、表現型の応答を観察することによって分かる（図２１）。この場合、光退色（催色）が、フィトエンデサチュラーゼ発現（配列番号１０４）の低減によって、適用の１０日後に処理植物において観察可能である。この例における追加のＰａｌｍｅｒ Ａｍａｒａｎｔｈ標的は、ＥＰＳＰＳ（配列番号１０５）及びＨＰＰＤ（配列番号１０６）である。

[00335]クラスリンピット：

[00336]Ｔ７開始：

[00337]ポリヌクレオチドナノ粒子の設計に利用されるＭＶ−ＲＮＡの例

[00338]ナノ粒子を構成する個別の二価ＭＶ−ＲＮＡ：

[00339]ＰＤＳ二価：

[00340]ＭＶ−ＲＮＡ６５５／１０８９：

[00341]ＭＶ−ＲＮＡ４３０／１１７３：

[00342]ＭＶ−ＲＮＡ１０９５／３８８：

[00343]ＭＶ−ＲＮＡ７３６／８８８：

[00344]ＥＰＳＰＳ二価：

[00345]ＭＶ−ＲＮＡ１４３０／９８９：

[00346]ＭＶ−ＲＮＡ５４６／１４３７：

[00347]ＭＶ−ＲＮＡ８５４／９４７：

[00348]ＭＶ−ＲＮＡ１１６５／１３１７：

[00349]ＨＰＰＤ＿二価：

[00350]ＭＶ−ＲＮＡ４９２／９８４：

[00351]^＊粒子の開放Ｔ７転写開始及び閉鎖配列に使用される「６５５／１０８９」

[00352]ナノ粒子を構成する個別の三価ＭＶ−ＲＮＡ：

[00353]ＭＶ−ＲＮＡ７９２／９４９／１１５６：

[00354]ＭＶ−ＲＮＡ２６３／１１１２／１５２１：

[00355]ＭＶ−ＲＮＡ１３６５／１１４６／１４９０：

[00356]ＭＶ−ＲＮＡ３７０／５８６／９５８：

[00357]^＊粒子の開放Ｔ７転写開始及び閉鎖配列に使用される「７９２／９４９／１１５６」

[00358]ＰＤＳ三価：

[00359]ＭＶ−ＲＮＡ５４４／１４９６／１３４０：

[00360]ＭＶ−ＲＮＡ８４／２９４／５３８：

[00361]ＭＶ−ＲＮＡ９３／５１２／５０３：

[00326]ＭＶ−ＲＮＡ１１８５／４２３／９７１：

[00363]Ｐａｌｍｅｒ Ａｍａｒａｎｔｈのフィトエンデサチュラーゼを標的にする局所施用のための、クラスリンピットエンドサイトーシスシグナルを有するＴＲＩポリヌクレオチドナノ粒子

[00364]ＰＡ＿ｐｄｓ＿ＴＲＩ ＤＮＡテンプレート：

[00365]二次構造を示すｃｏｆｏｌｄ出力（折りたたみ表示）：

[00366]Ｐａｌｍｅｒ Ａｍａｒａｎｔｈの生物除草剤としてのＰＤＳ、ＥＰＳＰＳ、及びＨＰＰＤを標的にする局所施用のための、クラスリンピットエンドサイトーシスシグナルを有するＴＲＩポリヌクレオチドナノ粒子

[00367]ＰＡ＿ｐｄｓ，ｅｐｓｐｓ，ｈｐｐｄ＿ＴＲＩ ＤＮＡテンプレート：

[00368]二次構造を示すｃｏｆｏｌｄ出力（折りたたみ表示）：

[00369]Ｐａｌｍｅｒ Ａｍａｒａｎｔｈの生物除草剤としてのＰＤＳ、ＥＰＳＰＳを標的にする局所施用のための、クラスリンピットエンドサイトーシスシグナルを有する十二面体ポリヌクレオチドナノ粒子

[00370]ＰＡ＿ｐｄｓ＿ｅｐｓｐｓ＿Ｄ８ ＤＮＡテンプレート：

[00371]二次構造を示すｃｏｆｏｌｄ出力（折りたたみ表示）：

[00372]ＰＡ＿ｐｄｓ＿ｅｐｓｐｓ＿Ｔ８ ＤＮＡテンプレート：

[00373]二次構造を示すｃｏｆｏｌｄ出力（折りたたみ表示）：

[00374]上記に記述されたように、先行の記述は単に本発明の様々な実施形態を例示することが意図される。上記に考察された特定の修飾は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。様々な等価物、変化、及び修飾を、本発明の範囲を逸脱することなく行えることが、当業者には明白であり、そのような等価実施例が本明細書に含まれるべきであることが理解される。本明細書に引用された全ての参考文献は、その全体が本明細書に記載されているかのように、参照として組み込まれる。
参考文献
１．Ａｄｏｌｐｈ ＆ Ｂｕｔｌｅｒ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １０９：３４５−３５７（１９７７）
２．Ａｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６２：３５８１−３５８８（１９８８）
３．Ａｎｎａｍａｌａｉ ＆ Ｒａｏ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３２：６５０−６５８（２００５）
４．Ａｎｎａｍａｌａｉ ＆ Ｒａｏ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８０：１００９６−１０１０８（２００６）
５．Ａｎｎａｍａｌａｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２：１４８４−１４９０（２００８）
６．Ｂａｍｕｎｕｓｉｎｇｈｅ ＆ Ｓｅｏ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８５：２９５３−２９６３（２０１１）
７．Ｂａｎｃｒｏｆｔ Ａｄｖ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ １６：９９−１３４（１９７０）
８．Ｂａｎｃｒｏｆｔ ＆ Ｈｉｅｂｅｒｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３２：３５４−３５６（１９６７）
９．Ｂａｎｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３９：９２４−９３０（１９６９）
１０．Ｂａｓｎａｋ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９５：９２４−９３６（２０１０）
１１．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−６（２００１）
１２．Ｂｒｉｄｄｏｎ ＆ Ｍａｒｋｈａｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ，ｐｐ．１５８−１６５ Ｍｕｒｐｈｙ ＦＡ，ｅｔ ａｌ．（編），Ｖｉｒｕｓ ｔａｘｏｎｏｍｙ：ａｒｃｈｉｖｅｓ ｉｎ ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９５）
１３．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０（２００２ａ）
１４．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２：２４３（２００２ｂ）
１５．Ｃａｄｅｎａ−Ｎａｖａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ １１５：２３８６−２３９１（２０１１）
１６．Ｃａｓｐａｒ ＆ Ｋｌｕｇ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ ２７：１−２４（１９６２）
１７．Ｃｈｏｉ ＆ Ｒａｏ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７５：２０７−２１７（２０００）
１８．Ｃｈｏｉ ＆ Ｒａｏ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７５：２４９−２５７（２０００）
１９．ｄｅＨａｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６：４７８３−４７９０（１９７７）
２０．Ｄｅｎｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３２：２３１−５（２００４）
２１．Ｄｒｅｈｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０６：４２５−４３８（１９８９）
２２．Ｄｚｉａｎｏｔｔ ＆ Ｂｕｊａｒｓｋｉ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５：５５３−５６２（１９９１）
２３．Ｅｌｒａｄ ＆ Ｈａｇａｎ Ｐｈｙｓ Ｂｉｏｌ ７：０４５００３（２０１０）
２４．Ｆｉｌｉｐｐｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ２４５：２１３−２２１（２０００）
２５．Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−１１（１９９８）
２６．Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４４：２１２−２１８（１９９８）
２７．Ｆｒｉｓｃｈｍｕｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８２：６７３−６７６（２００１）
２８．Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １２５：８８７−９０１（２００６）
２９．Ｈｉｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３４：４９２−５０８（１９６８）
３０．Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ９４：１４２８−１４３６（２００８）
３１．Ｊａｒｏｎｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３８７：５６１−７１（２００５）
３２．Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３５：４５５−４６４（２００４）
３３．Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ １９：２６３−２７３（１９７３）
３４．Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ ５：１２４３−１２５２（２０１１）
３５．Ｋｉｍ ＲＮＡ １３：２８９−２９４（２００７）
３６．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ＆ Ｅｈａｒａ Ａｎｎ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ Ｓｏｃ Ｊｐｎ ６１：９９−１０２（１９９５）
３７．Ｋｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：１３６５０−１３６５５（１９９９）
３８．Ｌａｍｏｎｔａｇｎｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：２２３１−２２４１（２００４）
３９． Ｌａｖｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｂ １１３：３８１３−３８２０（２００９）
４０．Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９（１９８４）
４１．Ｌｕｓｔｉｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６２：２３２９−２３３６（１９８８）
４２．Ｍａｃｒａｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１：１９５−８（２００６）
４３．Ｍａｓｃｏｔｔｉ ＆ Ｌｏｈｍａｎ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：３１４２−３１４６（１９９０）
４４．Ｍｅｉｓｔｅｒ ＆ Ｔｕｓｃｈｌ Ｎａｔｕｒｅ ４３１：３４３−９（２００４）
４５．Ｎｕｇｅｎｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：４２７−４３５（１９９７）
４６．Ｏｂｅｎａｕｅｒ−Ｋｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３：１６８７−１６９６（２００２）
４７． Ｐｅｒｒｉｍａｎ ＆ Ａｒｅｓ ＲＮＡ ４：１０４７−１０５４（１９９８）
４８．Ｐｆｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ ２７６：９９−１０７（１９７６）
４９．Ｐｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４：７１７４−７１８４（２０１０）
５０．Ｐｒｉｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｂ １１４：５５２２−５５３３（２０１０）
５１．Ｑｕ ＆ Ｍｏｒｒｉｓ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１：１４２８−１４３５（１９９７）
５２．Ｒａｏ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ ４４：６１−８７（２００６）
５３．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）
５４．Ｓｉｄａｈｍｅｄ ＆ Ｂｒｕｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６２３：３−１９（２０１０）
５５．Ｓｉｋｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ ５：５４−５７（２００７）
５６．Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １０：１０２６−３２（２００３）
５７．Ｓｏｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９１：６３９−６５８（１９８６）
５８．Ｓｐｅｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：６３−７８（１９９５）
５９．Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４：１３５４−１３５９（２００７）
６０．Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １５４：５９−６７（２００６）
６１．Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １５：３８３−３９１（２００６）
６２．ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｒａａｆ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ３：９１７７−９１８２（１９９２）
６３．Ｖｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９：６２３９−６２４８（２００５）
６４．Ｖｅｒｄｕｉｎ ＆ Ｂａｎｃｒｏｆｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３７：５０１−５０６（１９６９）
６５．Ｙｏｆｆｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５：１６１５３−１６１５８（２００８）
６６．Ｚａｎｄｉ ＆ ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｃｈｏｏｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ． ９６：９−２０（２００９）
６７．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７９：４７１−４７７（２００１）
６８．Ｚｌｏｔｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７７：４５０−４５６（２０００）
配列番号８９：ＡＫＴ（プロテインキナーゼＢのＸ６１０３７ Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ ｍＲＮＡ）：
配列番号９０：ＭＡＰ３Ｋ（ＮＭ＿００５９２１ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ１、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＭＡＰ３Ｋ１）、ｍＲＮＡ）：
配列番号９１：ＰＬＫ１（ＮＭ＿００５０３０ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓポロ様キナーゼ１）：
配列番号９２：アンドロゲン受容体変異体１（ＮＭ＿００００４４．３ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓアンドロゲン受容体（ＡＲ）、転写変異体１）：
配列番号９３：アンドロゲン受容体変異体2（ＮＭ＿００１０１１６４５．２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓアンドロゲン受容体（ＡＲ）、転写変異体）：
配列番号９４：ｃＭＥＴ（ｍｅｔ原腫瘍形成遺伝子のＸ５４５５９ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｍＲＮＡ）：
配列番号９５：ＧＦＰ：
配列番号９６：Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａに対するｖＡＴＰアーゼ、ＣＮ４９８３３７．１：
配列番号９７：Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａに対するチトクロムＰ４５０：
配列番号９８：Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａに対するＣＯＰＩ：
配列番号９９：Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａに対するＲｉｂｏ Ｓ４：
配列番号１００：Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａに対するＤｖｓｎｆ７：
配列番号１０１：Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａに対するＥｔ３：
配列番号１０２：ＰＩＣ１６００５、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａに対するｖＡＴＰアーゼＤサブユニット１の一部：
配列番号１０３：ＰＩＣ１７５０５、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａに対するｖＡＴＰアーゼＥ：
配列番号１０５：Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｐａｌｍｅｒｉ ＥＰＳＰＳ：
配列番号１０６：Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｐａｌｍｅｒｉ ＨＰＰＤ：

[00257]以下の配列は、前立腺癌標的化ナノ粒子を上記のシクラーゼリボザイム配列の間に挿入することによって生成された、前立腺癌標的化環状十二面多ナノ粒子を表す。

[00263]コア２：

[00374]上記に記述されたように、先行の記述は単に本発明の様々な実施形態を例示することが意図される。上記に考察された特定の修飾は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。様々な等価物、変化、及び修飾を、本発明の範囲を逸脱することなく行えることが、当業者には明白であり、そのような等価実施例が本明細書に含まれるべきであることが理解される。本明細書に引用された全ての参考文献は、その全体が本明細書に記載されているかのように、参照として組み込まれる。
参考文献
１．Ａｄｏｌｐｈ ＆ Ｂｕｔｌｅｒ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １０９：３４５−３５７（１９７７）
２．Ａｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６２：３５８１−３５８８（１９８８）
３．Ａｎｎａｍａｌａｉ ＆ Ｒａｏ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３２：６５０−６５８（２００５）
４．Ａｎｎａｍａｌａｉ ＆ Ｒａｏ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８０：１００９６−１０１０８（２００６）
５．Ａｎｎａｍａｌａｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２：１４８４−１４９０（２００８）
６．Ｂａｍｕｎｕｓｉｎｇｈｅ ＆ Ｓｅｏ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８５：２９５３−２９６３（２０１１）
７．Ｂａｎｃｒｏｆｔ Ａｄｖ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ １６：９９−１３４（１９７０）
８．Ｂａｎｃｒｏｆｔ ＆ Ｈｉｅｂｅｒｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３２：３５４−３５６（１９６７）
９．Ｂａｎｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３９：９２４−９３０（１９６９）
１０．Ｂａｓｎａｋ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９５：９２４−９３６（２０１０）
１１．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−６（２００１）
１２．Ｂｒｉｄｄｏｎ ＆ Ｍａｒｋｈａｍ．Ｆａｍｉｌｙ Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ，ｐｐ．１５８−１６５ Ｍｕｒｐｈｙ ＦＡ，ｅｔ ａｌ．（編），Ｖｉｒｕｓ ｔａｘｏｎｏｍｙ：ａｒｃｈｉｖｅｓ ｉｎ ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９５）
１３．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０（２００２ａ）
１４．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２：２４３（２００２ｂ）
１５．Ｃａｄｅｎａ−Ｎａｖａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ １１５：２３８６−２３９１（２０１１）
１６．Ｃａｓｐａｒ ＆ Ｋｌｕｇ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ ２７：１−２４（１９６２）
１７．Ｃｈｏｉ ＆ Ｒａｏ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７５：２０７−２１７（２０００）
１８．Ｃｈｏｉ ＆ Ｒａｏ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７５：２４９−２５７（２０００）
１９．ｄｅＨａｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６：４７８３−４７９０（１９７７）
２０．Ｄｅｎｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３２：２３１−５（２００４）
２１．Ｄｒｅｈｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０６：４２５−４３８（１９８９）
２２．Ｄｚｉａｎｏｔｔ ＆ Ｂｕｊａｒｓｋｉ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５：５５３−５６２（１９９１）
２３．Ｅｌｒａｄ ＆ Ｈａｇａｎ Ｐｈｙｓ Ｂｉｏｌ ７：０４５００３（２０１０）
２４．Ｆｉｌｉｐｐｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ２４５：２１３−２２１（２０００）
２５．Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−１１（１９９８）
２６．Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４４：２１２−２１８（１９９８）
２７．Ｆｒｉｓｃｈｍｕｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８２：６７３−６７６（２００１）
２８．Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １２５：８８７−９０１（２００６）
２９．Ｈｉｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３４：４９２−５０８（１９６８）
３０．Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ９４：１４２８−１４３６（２００８）
３１．Ｊａｒｏｎｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３８７：５６１−７１（２００５）
３２．Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３５：４５５−４６４（２００４）
３３．Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ １９：２６３−２７３（１９７３）
３４．Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ ５：１２４３−１２５２（２０１１）
３５．Ｋｉｍ ＲＮＡ １３：２８９−２９４（２００７）
３６．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ＆ Ｅｈａｒａ Ａｎｎ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ Ｓｏｃ Ｊｐｎ ６１：９９−１０２（１９９５）
３７．Ｋｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：１３６５０−１３６５５（１９９９）
３８．Ｌａｍｏｎｔａｇｎｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：２２３１−２２４１（２００４）
３９． Ｌａｖｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｂ １１３：３８１３−３８２０（２００９）
４０．Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９（１９８４）
４１．Ｌｕｓｔｉｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６２：２３２９−２３３６（１９８８）
４２．Ｍａｃｒａｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１：１９５−８（２００６）
４３．Ｍａｓｃｏｔｔｉ ＆ Ｌｏｈｍａｎ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：３１４２−３１４６（１９９０）
４４．Ｍｅｉｓｔｅｒ ＆ Ｔｕｓｃｈｌ Ｎａｔｕｒｅ ４３１：３４３−９（２００４）
４５．Ｎｕｇｅｎｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：４２７−４３５（１９９７）
４６．Ｏｂｅｎａｕｅｒ−Ｋｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３：１６８７−１６９６（２００２）
４７． Ｐｅｒｒｉｍａｎ ＆ Ａｒｅｓ ＲＮＡ ４：１０４７−１０５４（１９９８）
４８．Ｐｆｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ ２７６：９９−１０７（１９７６）
４９．Ｐｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４：７１７４−７１８４（２０１０）
５０．Ｐｒｉｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｂ １１４：５５２２−５５３３（２０１０）
５１．Ｑｕ ＆ Ｍｏｒｒｉｓ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１：１４２８−１４３５（１９９７）
５２．Ｒａｏ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ ４４：６１−８７（２００６）
５３．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）
５４．Ｓｉｄａｈｍｅｄ ＆ Ｂｒｕｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６２３：３−１９（２０１０）
５５．Ｓｉｋｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ ５：５４−５７（２００７）
５６．Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １０：１０２６−３２（２００３）
５７．Ｓｏｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９１：６３９−６５８（１９８６）
５８．Ｓｐｅｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：６３−７８（１９９５）
５９．Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４：１３５４−１３５９（２００７）
６０．Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １５４：５９−６７（２００６）
６１．Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １５：３８３−３９１（２００６）
６２．ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｒａａｆ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ３：９１７７−９１８２（１９９２）
６３．Ｖｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９：６２３９−６２４８（２００５）
６４．Ｖｅｒｄｕｉｎ ＆ Ｂａｎｃｒｏｆｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３７：５０１−５０６（１９６９）
６５．Ｙｏｆｆｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５：１６１５３−１６１５８（２００８）
６６．Ｚａｎｄｉ ＆ ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｃｈｏｏｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ． ９６：９−２０（２００９）
６７．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７９：４７１−４７７（２００１）
６８．Ｚｌｏｔｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７７：４５０−４５６（２０００）
配列番号８９：ＡＫＴ（プロテインキナーゼＢのＸ６１０３７ Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ ｍＲＮＡ）：
配列番号９０：ＭＡＰ３Ｋ（ＮＭ＿００５９２１ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ１、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ（ＭＡＰ３Ｋ１）、ｍＲＮＡ）：
配列番号９１：ＰＬＫ１（ＮＭ＿００５０３０ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓポロ様キナーゼ１）：
配列番号９２：アンドロゲン受容体変異体１（ＮＭ＿００００４４．３ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓアンドロゲン受容体（ＡＲ）、転写変異体１）：
配列番号９３：アンドロゲン受容体変異体2（ＮＭ＿００１０１１６４５．２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓアンドロゲン受容体（ＡＲ）、転写変異体）：
配列番号９４：ｃＭＥＴ（ｍｅｔ原腫瘍形成遺伝子のＸ５４５５９ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｍＲＮＡ）：
配列番号９５：ＧＦＰ：
配列番号９６：Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａに対するｖＡＴＰアーゼ、ＣＮ４９８３３７．１：
配列番号９７：Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａに対するチトクロムＰ４５０：
配列番号９８：Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａに対するＣＯＰＩ：
配列番号９９：Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａに対するＲｉｂｏ Ｓ４：
配列番号１００：Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａに対するＤｖｓｎｆ７：
配列番号１０１：Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａに対するＥｔ３：
配列番号１０２：ＰＩＣ１６００５、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａに対するｖＡＴＰアーゼＤサブユニット１の一部：
配列番号１０３：ＰＩＣ１７５０５、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａに対するｖＡＴＰアーゼＥ：
配列番号１０５：Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｐａｌｍｅｒｉ ＥＰＳＰＳ：
配列番号１０６：Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｐａｌｍｅｒｉ ＨＰＰＤ：
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
直径がおよそ４０ｎｍであり、外面が中心の少なくとも２倍のステム比を有する単離ポリヌクレオチドナノ粒子であって、２つ以上の接続されたＭＶ−ＲＮＡ配列を含み、それぞれのＭＶ−ＲＮＡ配列が連鎖要素によって離されている、単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
［２］
直径がおよそ１００ｎｍであり、外面が中心の少なくとも４倍のステム比を有する単離ポリヌクレオチドナノ粒子であって、３つのＭＶ−ＲＮＡの積層セットを含み、それぞれの積層ＭＶ−ＲＮＡセットが連結要素によって離されている、単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
［３］
前記ポリヌクレオチドナノ粒子が、１つまたは表面ループにアプタマーまたは細胞取り込み配列を含有する、［１］または［２］に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
［４］
前記ポリヌクレオチドナノ粒子が、図１〜３のいずれか１つに記載されている一般的構造を有する、［１］に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
［５］
前記ポリヌクレオチドナノ粒子が、（ｉ）閉鎖配列として作用する、単一ＭＶ−ＲＮＡの５’末端及び同じＭＶ−ＲＮＡの３’末端、または（ｉｉ）閉鎖配列として作用するｄｓＲＮＡを含有する、［１］に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
［６］
前記連鎖要素が、エンドヌクレアーゼにより切断可能な、（ｉ）ステムループ構造、または（ｉｉ）ジヌクレオチド、または（ｉｉｉ）モノヌクレオチドを含む、［１］または［２］に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
［７］
前記ポリヌクレオチドナノ粒子が、天然または合成のＲＮＡまたはＤＮＡを含む、［１］または［２］に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
［８］
前記切断可能な連鎖配列が、３〜１２個のヌクレオチドである、［１］〜［１２］のいずれか一に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
［９］
前記ポリヌクレオチドナノ粒子が、リボザイム切断により環状化された単一ポリヌクレオチドナノ粒子である、［１］または［２］に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
［１０］
前記ポリヌクレオチドナノ粒子が、植物細胞、もしくはヒト細胞、もしくは酵母細胞、もしくは細菌細胞から選択される宿主細胞内において、またはインビトロ転写によって発現する、［１］または［２］に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
［１１］
前記ポリヌクレオチドナノ粒子が、宿主細胞内において発現し、前記宿主以外の遺伝子を標的にする、［１］または［２］に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
［１２］
［１］〜［９］のいずれか一に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子を、生理学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む、組成物。

Claims (12)

1. 直径がおよそ４０ｎｍであり、外面が中心の少なくとも２倍のステム比を有する単離ポリヌクレオチドナノ粒子であって、２つ以上の接続されたＭＶ−ＲＮＡ配列を含み、それぞれのＭＶ−ＲＮＡ配列が連鎖要素によって離されている、単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
2. 直径がおよそ１００ｎｍであり、外面が中心の少なくとも４倍のステム比を有する単離ポリヌクレオチドナノ粒子であって、３つのＭＶ−ＲＮＡの積層セットを含み、それぞれの積層ＭＶ−ＲＮＡセットが連結要素によって離されている、単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
3. 前記ポリヌクレオチドナノ粒子が、１つまたは表面ループにアプタマーまたは細胞取り込み配列を含有する、請求項１または２に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
4. 前記ポリヌクレオチドナノ粒子が、図１〜３のいずれか１つに記載されている一般的構造を有する、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
5. 前記ポリヌクレオチドナノ粒子が、（ｉ）閉鎖配列として作用する、単一ＭＶ−ＲＮＡの５’末端及び同じＭＶ−ＲＮＡの３’末端、または（ｉｉ）閉鎖配列として作用するｄｓＲＮＡを含有する、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
6. 前記連鎖要素が、エンドヌクレアーゼにより切断可能な、（ｉ）ステムループ構造、または（ｉｉ）ジヌクレオチド、または（ｉｉｉ）モノヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
7. 前記ポリヌクレオチドナノ粒子が、天然または合成のＲＮＡまたはＤＮＡを含む、請求項１または２に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
8. 前記切断可能な連鎖配列が、３〜１２個のヌクレオチドである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
9. 前記ポリヌクレオチドナノ粒子が、リボザイム切断により環状化された単一ポリヌクレオチドナノ粒子である、請求項１または２に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
10. 前記ポリヌクレオチドナノ粒子が、植物細胞、もしくはヒト細胞、もしくは酵母細胞、もしくは細菌細胞から選択される宿主細胞内において、またはインビトロ転写によって発現する、請求項１または２に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
11. 前記ポリヌクレオチドナノ粒子が、宿主細胞内において発現し、前記宿主以外の遺伝子を標的にする、請求項１または２に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子。
12. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドナノ粒子を、生理学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む、組成物。