JP3418982B2 - 内皮細胞の遺伝的変性 - Google Patents

内皮細胞の遺伝的変性

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Description

【発明の詳細な説明】 後援 本書で記述される研究は、国立保健研究所、ハーワー
ド・ヒューズメディカルインスチチュート及びホワイト
ヘッド生物医学研究所からの助成金により支援されたも
のである。
背景技術 内皮は、縁部同士接合されその結果細胞の膜を形成し
ている平担化された透明な細胞の単層である。内皮細胞
は、胚の原中層細胞又は中胚葉からの発達中に源を発し
ている。これらの細胞は、前眼房内、脳や脊髄の表面上
及び漿膜の自由表面上に発生する。さらに、これらの細
胞は、心臓、血管及びリンパ腺のライニング膜を形成し
ている。
近年開発された方法を用いて、種間遺伝的組換えを達
成することが可能である。異なる生物学的綱に由来する
遺伝子を、１つの選択された微生物の中で複製し発現さ
せることができる。従って、特定のウィルス又はプラス
ミドレプリコン（複製単位）に遺伝子を連鎖させること
によってその他の生体綱の特徴である代謝又は合成機能
（例えばホルモン合成、タンパク質合成、窒素固定）を
特定する遺伝子を微生物内に導入することが可能であ
る。
1970年後半以降、哺乳動物の体内にクローニングされ
たDNA配列を導入するための一般的方法の開発に向かっ
て進歩が見られた。しかしながら現在のところ、問題の
選択された遺伝物質を内皮細胞内に安定した形で導入
し、これらがそれを発現できるようにしかくしてコード
されたタンパク質又はポリペプチドを産生する効果的な
方法に対する必要性が存在する。
発明の要約 ここで記述する発明は、遺伝的に処理された内皮細
胞、特に例えば問題の遺伝物質を含む組換え型ゲノムを
有するレトロウィルスベクターを用いて、中に取り込ま
れたこの選択された問題の遺伝物質（DNA又はRNA）を発
現する遺伝的に処理された内皮細胞に関する。本発明は
同様に、このような遺伝物質を内皮細胞内に安定した形
で導入する方法及び遺伝的に処理された内皮細胞を用い
る方法にも関する。
本発明の内皮細胞はその中に安定した形で取り込まれ
た状態で、内皮細胞内での産生が望まれる１つの産物
（例えばタンパク質、ポリペプチド又は機能的RNA）を
コードする問題の遺伝物質を有している。変更された内
皮細胞は、この取込まれた遺伝物質を発現する（コード
された産物を産生する）。この問題の遺伝物質を、本書
では「取込まれた遺伝物質」と呼ぶ取込まれた遺伝物質
は、問題のあらゆる選択されたDNA（例えば、問題の産
物をコードする遺伝子の一部分又は全て）又は問題のRN
Aであってよい。これは又、例えば、正常な内皮細胞の
中に存在しこの細胞によって発現されるDNA又はRNA;内
皮細胞内に通常発生しないDNA又はRNA;通常内皮細胞中
に発生するもののそれらの中で生物学的に有意なレベル
（すなわちそれがコードするタンパク質又はポリペプチ
ドの正常な生理学的効果を生み出すのに充分なレベル）
では発現されないようなDNA又はRNA;内皮細胞内に発生
し、内皮細胞内で発現されるように変更されたDNA又はR
NA;及び、内皮細胞内で単独で又は何らかの組合せの形
で発現すべく変更されうるあらゆるDNA又はRNAでもあり
うる。本発明の内皮細胞は、同様に、選択可能な標識を
コードする遺伝物質を発現することもでき、かくして、
取込まれた遺伝物質を発現する細胞をインビトロ（生体
外）で識別し選択する手段を提供する。取込まれた遺伝
物質を含む内皮細胞を、「形質導入された内皮細胞」と
呼ぶ。
特に、内皮細胞内で通常生物学的に有意なレベルで発
現されない問題のポリペプチド又はタンパク質をコード
する遺伝物質を含む遺伝物質を用いて内皮細胞を安定し
た形で形質導入するためには、レトロウィルスベクター
が使用されてきた。このような形で導入される遺伝物質
としては、優性の選択可能な標識をコードする遺伝物質
も含まれていてよい。問題のポリペプチドを単独でコー
ドするDNA又は問題のポリペプチド及び優性選択可能標
識をコードするDNAを含む遺伝物質が、培養された内皮
細胞内に導入された。これらの遺伝子が取込まれた内皮
細胞（すなわちレトロウィルスベクターを使用して形質
導入された内皮細胞）によるこれらの遺伝子の発現も同
様に実証されてきた。
遺伝子はレトロウィルスベクターを用いて内皮細胞内
に導入されうることから、これらの遺伝子は、レトロウ
ィルスベクターの制御「上」にある（制御を受けてい
る）可能性がある；このような場合、問題の遺伝子は、
レトロウィルスプロモータから転写される。代替的に
は、問題の遺伝物質の転写を担う付加的なプロモータ要
素（組換え型レトロウィルス内に組込まれているプロモ
ータに加えて）をもつレトロウィルスベクターを使用す
ることができる。例えば、外部因子又はキューによって
変調された付加的なプロモータが存在する構成体を使用
することができ、かくしてこの外部因子又はキューを活
性化することによって内皮細胞により産生されつつある
ポリペプチドのレベルを制御することが可能となる。例
えば、熱ショックタンパク質というのは、プロモータが
温度によって調節されている遺伝子によりコードされる
タンパク質のことである。金属含有タンパク質メタロチ
オニンをコードする遺伝子のプロモータは、カドミウム
（Cd++）イオンに対する応答性をもつ、外部キューによ
り影響されるこのプロモータ又はその他のプロモータの
取り込みも又、工学処理された内皮細胞によるポリペプ
チドの産生の調節を可能にする。
内皮細胞は、インビトロ（生体外）又はインビボ（生
体内）という２つの一般的セッティングの中で形質導入
を受けることができる。両方のセッティング共、組換え
型レトロウィルスベクター又はその他のベクターの使用
を通してといったような、内皮細胞内への問題の遺伝物
質の転移のための方法の利用を必要とする。インビトロ
形質導入の場合、組織培養管内で成長させられた内皮細
胞は、問題の遺伝物質をコードする組換え型レトロウィ
ルスといったようなベクターに露呈され、かくして、形
質導入された内皮細胞を産生する。このとき、遺伝物質
でインビトロで形質導入を受けた内皮細胞はさまざまな
既知の方法のうちの１つを用いて移植される。このよう
な方法には、形質導入された内皮細胞でライニングされ
た合成血管又は人工弁の移植又は形質導入を受けた内皮
細胞を収納するべく設計された装置又はマトリクスの移
植などがあるが、これらに制限されるわけではない。
代替的には、１つの組織又は器官内で内皮細胞に問題
の遺伝物質を転移するための方法を適用することによっ
て、インビボで形質導入を行なうことが可能である。イ
ンビボ形質導入の場合、組織又は器官内に存在する内皮
細胞は、例えば問題の遺伝物質をコードする組換え型レ
トロウィルスに露呈される。このような方法としては、
特定の１器官、四肢又は血管の中への（例えばカテーテ
ルを介しての）部位特異的投与が含まれるが、これに制
限されるわけではない。インビトロで形質導入された内
皮細胞とは異なり、インビボで形質導入されたこれらの
内皮細胞は、その次に続く移植のための方法を必要とし
ない。
インビトロで形質導入された内皮細胞を移植する方法
も同様に本発明の主題である。インビトロで形質導入さ
れた内皮細胞は、血管再建手術において使用される補て
つ移植片（例えばダクロンやゴアテックスなどの合成材
料で作られた血管）を改善するのに特に有用である。例
えば、生きた器官又は四肢を灌流させる疾患のある動脈
に置換するべく人工動脈移植片が往々にして用いられ
る。しかしながら現在入手可能な移植片は通常合成材料
で作られており、数多くの合併症を伴い、その中でも最
悪のものは、高い率の再狭窄又は閉塞である。動物実験
は、移植片を移植前に自己由来の内皮細胞でライニング
することが移植片の再狭窄とそれに付随する病的結果を
減少させることはできるが、それを防止することはでき
ない。
しかしながら、移植された移植片の状況下でその性能
を改善するような形で本発明の方法に従って内皮細胞を
変更することが可能である。その例としては、管腔内の
凝塊形成を防ぐため、血栓崩壊剤の分泌又は発現、平滑
筋の肥大による管腔狭窄を防ぐための平滑筋増殖阻害因
子の分泌及び、内皮細胞の増殖を刺激し移植管腔の内皮
細胞ライニングの程度又は持続時間を改善するための内
皮細胞マイトジュン又はオートクリン（autocrine）因
子の発現及び／又は分泌などが含まれる。
類似の利用分野については、本発明の内皮細胞は同様
に、弁の表面の血栓形成力を低くすることによって塞栓
形成の危険性を減少させるべく人工心臓弁の表面を覆う
のに使用することも可能である。
本発明の方法によって形質導入された内皮細胞又は形
質導入された内皮細胞でライニングされた血管移植片は
同様に、疾病の予防又は治療において役立つポリペプチ
ド又はタンパク質の構成的合成及び送達を提供するのに
も利用できる。このようにして、ポリペプチドは、人間
の血流内に直接分泌される。これとは対照的に、現在利
用可能な方法には、望まれるポリペプチドの非経口投与
が関与している。
さらに、分離されたポリペプチド（例えばインシュリ
ン）の場合に一般に必要であるように、固体に投与する
前にポリペプチドを大量に（そして往々にして高い費用
をかけて）精製する必要は全く無い。本発明に従って変
更された内皮細胞は、通常産生される通りにポリペプチ
ドホルモンを産生する。
遺伝的に工学処理された内皮細胞の使用のもう１つの
利点は、特定の器官又は四肢に対し治療的レベルの分泌
産物の送達をターゲティングすることができるというこ
とにある。例えば、インビトロで形質導入された内皮細
胞でランニングのほどこされた血管移植片を特定の１器
官又は四肢の中に移植することが可能である；又、特定
の四肢、器官又は血管の内皮細胞をインビボで形質導入
することも可能である。形質導入されて内皮細胞の分泌
産物は高濃度で灌流された組織へと送達され、かくして
標的となった解剖学的場所に対する望ましい効果を達成
することになる。この産物は次に、心臓への戻りの間に
静脈循環内で非治療的レベルにまで希釈される。
本発明の送達システムのもつもう１つの重要な利点
は、それが連続したシステムであることから、ホルモン
ポリペプチドの短かい半減期が制限となることはないと
いう点にある。例えば、ヒト成長ホルモン（HGH）の半
減期は約19分であり、副甲状腺ホルモンの半減期は約21
/2〜５分である。
図面の簡単な説明 図１は、野生型マウス白血病ウィルス（レトロウィル
ス）ゲノムの概略図である。
図２は、本発明において有用な組換え型ゲノムを各々
有するレトロウィルスベクターの概略図である。図2a
は、pLJ、図2bはpEm、図2cはMFGであり、図2dはα−SGC
である。
図３は、図2aに示されたpLJベクター及びヒト副甲状
腺ホルモン遺伝子を用いた組換え型レトロウィルスベク
ターの構成の概略図である。
図４は、低密度リポタンパクレセプタ（LDLR）を発現
するレトロウィルスに感染し、螢光標識付けされたLDL
の摂取について分析されたウシの大動脈内皮細胞の写真
を含んでいる。図版Ａ−位相差下の未感染のウシ大動脈
内皮細胞、図版Ｂ−螢光照明下の未感染ウシ大動脈内皮
細胞；図版Ｃ−位相差下の感染したウシ大動脈内皮細
胞；図版Ｄ−螢光照明下の感染したウシ大動脈内皮細
胞。
図５は、ベータ−ガラクトシダーゼを発現するレトロ
ウィルスに感染し、インサイチュ（原位置）組織化学染
色を用いてその発現について分析されたウシ大動脈内皮
細胞の写真を含んでいる。図版Ａ−ベータガラクトシダ
ーゼ活性について染色された未感染のウシ大動脈内皮細
胞；図版Ｂ−ベータガラクトシダーゼ活性について染色
された未感染のウシ大動脈内皮細胞。
図６は、遺伝的に変更された内皮細胞のイヌ体内への
移植を示す絵画的図である。
図７は、tPA遺伝子の変更、変更を容易にするのに用
いられたオリゴヌクレオチド及び、図2cに描かれている
ベクター−MFG内への変更tPA遺伝子の挿入の概略図であ
る。
図８は、第VIII因子関連抗原の発現により識別された
内皮細胞の培養の写真である。
図9aは、tPAを発現するレトロウィルスに感染したイ
ヌの内皮細胞の写真である。tPAを発現する細胞内には
暗い細胞質染色が見られる。図9bはtPAレトロウィルス
に感染していない対照細胞の写真である。
図10は、MFG−tPA及びα−SGC−tPA組換え型レトロウ
ィルスの内皮細胞内への安定した組込みを示す細胞性ゲ
ノミックDNAのサザンブロットのオートラジオグラフの
写真である。
図11は、MFG−tPA及びα−SGC−tPA組換え型レトロウ
ィルスからのRNA発現を示す細胞性RNAのノーザンブロッ
トのオートラジオグラフの写真である。
図12は、tPAを発現するべく遺伝的に増大させられた
内皮細胞でのライニングを受けた合成移植片のイヌ体内
への移植後の効力を示すヒストグラムである。
図13aは、第VIII因子ポリペプチドのダイヤグラムで
ある。図13bは、レトロウィルスベクターを生成するた
めさまざまな構成体内で使用される制限酵素部位を示す
第VIII因子cDNAのダイヤグラムである。図13cは、垂直
線として欠失領域が示された状態の、レトロウィルスベ
クター内に挿入された第VIII因子cDNAの欠失誘導体のダ
イヤグラムである。図13dは、Hind III部位とPst I部位
の間のＢドメイン欠失の拡大図である。重鎖と軽鎖の接
合部におけるヌクレオチド配列は、ラインの上に記され
ており、相応するアミノ酸番号はラインの下に記されて
いる。
図14は、組立てられた最終レトロウィルスベクター、
MFG−第VIII因子の図である。
図15は、MFG−第VIII因子レトロウィルスの内皮細胞
内への安定した取込みを示す、細胞性ゲノミックDNAの
サザンブロットのオートラジオグラフの写真である。
図16は、α−SGC−LacZ組換え型レトロウィルスの図
である。
図17aは、α−SGC−LacZレトロウィルスでインビボで
形質導入された動脈の低倍率写真である。図17bは、同
じものの高倍率写真である。図17cは、形質導入を受け
ていない動脈の１セグメントである。
図18は、レトロウィルスベクターα−SGCの地図であ
る。
図19は、レトロウィルスベクターMFGの地図である。
発明の詳細な説明 問題の遺伝物質は、内皮細胞内に取り込まれ、結果と
して得られる工学処理された内皮細胞内で発現させられ
た。記述された方法に従って内皮細胞内に取り込まれる
問題の遺伝物質は、問題のあらゆる選択されたDNA（例
えば問題の産物をコードする遺伝子の全て又は一部分）
又は問題の産物をコードするあらゆる選択された遺伝
子）又は問題のあらゆる選択されたRNAであってよい。
例えば、これは、正常な内皮細胞内に存在しその中で発
現されるDNA又はRNA;内皮細胞内で通常発生しないDNA又
はRNA;通常２−内皮細胞内に発生するもののその中で生
物学的に有意なレベル（それがコードするタンパク質又
はポリペプチドの正常な生理学的効果を生み出すのに充
分なレベル）では発現されないDNA又はRNA;内皮細胞内
に発生しかかる細胞内で発現されうるような形で変更さ
れているDNA又はRNA;及び単独で又は何らかの組合せた
形で内皮細胞内で発現されるよう変更可能なあらゆるDN
A又はRNAであってよい。この問題の遺伝物質をここで
は、「取込まれた遺伝物質」と呼ぶ。
本発明の内皮細胞は、取込まれた遺伝物質を発現す
る。例えば、本発明の内皮細胞は、問題のポリペプチド
又はタンパク質をコードする遺伝物質（問題の遺伝物
質）を発現する。本発明の内皮細胞は同様に、選択可能
な標識をコードする遺伝子をも内含し発現することがで
きる。取込まれた遺伝物質を発現する内皮細胞をここで
は「形質導入された内皮細胞」と呼ぶ。
通常内皮細胞内に存在しこれによって発現されるDNA
である問題の遺伝物質は、内皮細胞内に取り込まれるこ
とが可能で、その結果、内皮細胞は望まれるタンパク
質、ポリペプチド又はRNAを過剰産生することができる
ことになる。
本書中に詳述するように、１つのホルモンをコードす
る遺伝物質が、組換え型ゲノムを有するウィルスを含む
培地に内皮細胞を露呈することによって（すなわちこれ
らの細胞を感染させることによって）、これらの細胞内
に導入された。使用した培地は、組換え型ウィルス産生
細胞が増殖された培地を収獲することによって得られた
ウィルス上清であった。すなわち、10％の子ウシ血清
（CS）及びペニシリン及びストレプトマイシンを伴うダ
ルベッコの調整イーグル培地（DME）内で集密的な密度
まで組織培養にて産生細胞を増殖させた。新鮮な培地を
付加し、ひきつづいて（例えば約12時間後）、培地を収
獲した。集密的産生細胞の10cmのプレートから約10mlの
培地を収獲した。収獲した培地（又はウィルスストッ
ク）を0.45ミクロンのミリポア・フィルタを通してろ過
して離脱した産生細胞を除去し、細胞を感染させるため
直ちに使用した。或いは又これは−70℃で保存されてい
る。培地を内皮細胞（受容内皮細胞）亜集密的プレート
から除去し、8mcg/mlのポリブレン（Aldrich）を含むウ
ィルスストック（例、プレート10cmあたり5ml）で迅速
に交換した。その後（例えば約12時間後）、これを除去
し新鮮培地と交換した。
感染性ウィルスの組換え型ゲノムは、内皮細胞内に取
込まれている問題の遺伝物質を含む。組換え型ゲノムは
同様に、優性選択可能標識をコードする遺伝物質も有す
ることができる。通常生物学的に有意なレベルでは発現
できないポリペプチドを発現する形質導入された内皮細
胞及び任意には優性の選択可能な標識を、本書で記述す
る要領で作製した。
１つのケースにおいて、組換え型ゲノムは、ヒト副甲
状腺ホルモン（hPTH）をコードする遺伝物質を含んでい
た。もう１つのケースでは、組換え型ゲノムは同様に、
優性の選択可能な標識をコードする遺伝子（例えば、細
菌中ではネオマイシン耐性を又哺乳動物細胞内ではG418
耐性をコードするneo遺伝子）をも含んでいた。その結
果、内皮細胞は形質導入を受けた…すなわち、問題の遺
伝物質（この場合、hPTHをコードするDNA及び任意にはn
eo遺伝子）は内皮細胞内に安定した形で導入された。形
質導入された内皮細胞は、コードされたhPTHを単独で又
はneo耐性タンパク質に加えて発現し、その結果細胞は
選択可能な特性をもつことになる。
もう１つのケースでは、組換え型ゲノムは問題の遺伝
物質（例えば、凝固性第VIII因子タンパク質又は組織プ
ラスミノーゲン活性化剤（tPA））のみを含み、優性な
選択可能標識をコードする遺伝子（例えば、neo遺伝
子）を含んでいなかった。その結果、形質導入された内
皮細胞は、第VIII因子タンパク質又はtPAを優性選択可
能標識の無い状態で発現することになる。
上述のように、内皮細胞は、分泌産物（例えばヒト副
甲状腺ホルモン（hPTH）（例１参照））、組織プラスミ
ノーゲン活性化剤（tPA）（例５参照）及びヒトの凝固
性第VIII因子タンパク質（例６参照）に対しコードする
遺伝子；膜レセプタ（例えば低密度リポタンパクレセプ
タ（LDLR））に対しコードする遺伝子（例２参照；及び
細胞間細菌性酵素（例えばベータガラクトシダーゼ））
に対しコードする遺伝子（例３参照）を用いて形質導入
された。
内皮細胞の形質導入は、インビトロ又はインビボのい
ずれでも行なうことができる。例えば、内皮細胞のイン
ビボ形質導入は、特定の器官、四肢又は血管内に（例え
ば例８に記されているようにカテーテルを介して）組換
え型レトロウィルスを部位特異的に投与することにより
固体の体内に導入される組換え型レトロウィルスを用い
て行なうことができる。内皮細胞のインビボ形質導入は
いくつかの利点を有し、そのうちの１つは、形質導入を
受けた内皮細胞を移植する方法が必要で無いという点に
ある。インビトロで形質導入された内皮細胞は、培養血
管から切除された組織培養血管内でまず成長させられ、
次に体内に導入又は移植される。
インビトロで形質導入された内皮細胞は、いくつかの
方法のうちの１つによって被移植者の体内に導入でき
る。例えば、形質導入を受けた内皮細胞を人工血管の管
腔上に接種することができ、ここでこれらの細胞は血管
の管腔を覆って集密性に至るまで成長することになる。
細胞は、天然血管の内膜及び中膜に似ている充分に組織
立った構造である新生内膜と呼ばれるもののライニング
を形成する（すなわち、平滑筋細胞のさらに深い層を伴
う内皮細胞のカバリング）。このアプローチの実施可能
性は、自己由来のレトロウィルス形質導入を受けた内皮
細胞が接種された血管移植片をイヌの体内に移植した実
験によって立証されている（例４参照）。
雑種の成犬から収獲した外頸静脈を、２回の連続継代
により10〜14日間インビトロで平板培養した内皮細胞の
供給源として利用した。各動物からの細胞を２つのアリ
コートに分割し、リポータ遺伝子、ベータ−ガラクトシ
ダーゼを含む複製不全レトロウィルスに感染させるか、
或いは又擬似感染させた。自己凝塊方法により内皮細胞
を亜集密的密度で小さな直径のダクロン移植片に接種
し、細胞を収獲したイヌの体内に頸動脈間置移植片とし
て外科的に移植した；各々のイヌは、遺伝的に変更され
た細胞が接種された移植片及び、擬似感染細胞が接種さ
れた対側性移植片を受けた。移植から５週間後に、移植
片を収獲し分析した。
より詳細な特徴づけを可能にするべく、移植片の一部
分の管腔表面から酵素的に細胞を収獲した。細胞の一次
培養を作成し、分析に先立ち約２〜３週間インビトロで
拡張させた。遺伝的に変更された内皮細胞を、サザン分
析及びlacZ遺伝子がコードするベクター発現されたベー
タガラクトシダーゼについての細胞化学検定によって、
この固体群の中で識別した。
移植片から収獲されインビトロで拡張された細胞の大
部分（95％未満）が、分化された内皮機能を保持してい
た。しかしながら、ウィルス誘導ベータガラクトシダー
ゼを発現したか又はプロウィルス配列を含んでいた細胞
の割合は、接種時点で分析された培養に比べ２〜10分の
１に一貫して減少していた。この不一致は一部分には、
融着から又は間隙を通しての成長による内皮細胞を伴う
移植片の部分的再増殖によるものである。形質導入され
た細胞は少なくとも５週間移植片の管腔上に存続し、形
質導入された遺伝子は機能し続けた。
代替的には、インビトロで形質導入された内皮細胞を
カテーテルを利用してインビボで血管上に移植すること
ができる。腹腔、胸膜空間及び心膜空間といったような
漿膜によりライニングされている体腔内に形質導入され
た内皮細胞を導入することも可能である。この場合、内
皮細胞は漿膜ライニングを接種し、腔内に産物を分泌す
る。このときこの産物はリンパ系を介して吸収される。
内皮細胞の分離 脊椎動物の数多くの種の毛細血管及び大きな血管（例
えば動脈、静脈）からの内皮細胞の分離及び維持は、文
献中に充分に記述されてきている。例えば、McGuire及
びOrkinは小動物の大きい血管からの内皮細胞を培養し
継代するための単純な手順を記述している。McGuire,R.
W及びR.W.Orkin,Biotechniques,5:546−554（1987）。
往々にして子ウシの大動脈が内皮細胞の供給源であ
る。大きな動脈からの内皮細胞の分離のための代表的プ
ロトコルについて以下で説明する。収獲されたばかりの
大動脈の切片を、37℃で15〜20分間コラゲナーゼを含む
溶液中で（例、0.5mg/ml）、無菌状態に置く。次に大動
脈を２回培地（例えばRPMI1640）で２回洗い流し、管腔
の内皮細胞薄膜を、Booyse etalの方法に従って穏やか
な撹拌により完全培地（15mmのHepes,pH7.4、ペニシリ
ン／ストレプトマイシン及び20％のウシ胎児血清を含む
RPMI）内で除去する。Booyse,F.M etal.,Thrombosis Di
ath,Haemorsh,34:825−839（1975）。細胞パッチは、組
織培養フラスコの完全培地内に移される。
細胞は、プレートを分割し場合によってこれをカバー
する；プレートが集密的である場合、細胞は標準的な組
織培養技術を用いて継代されうる。培養の純度は、内皮
細胞によって特異的に取り込まれる蛍光標識づけされた
アセチル化LPLの摂取によって評価される。培養が純粋
でない場合（すなわち平滑筋細胞又は線維芽細胞といっ
たような内皮細胞以外の細胞で汚染されている場合）、
内皮細胞は、希釈を制限することによりクローニングさ
れ、純粋培養を生み出すため拡張させられる。内皮細胞
の寿命は培養内では制限されているが、解剖学的供給源
及び供与動物に応じて著しく変化する。ウシ大動脈内皮
細胞は、少なくとも15〜20継代の間培養内に維持され
た。
イヌ内皮細胞は、外頸静脈の外植されたセグメントか
ら分離することができ、ヒト細胞は臍（さい）静脈又は
伏在静脈のいずれかのセグメントから分離できる。ヒト
内皮細胞の純粋培養を再現可能な形で生み出すもののイ
ヌの静脈からの内皮細胞及び平滑筋の混合培養を産生す
ることのできるコラゲナーゼ処理が関与する公表された
手順により、全ての細胞を血管壁から自由にすることが
できる。（Hunter,T.J.et.al,.Trams Am.Soc,Artif Int
ern Organs,29:177182（1983）;Watkins,M.T.etal.,J.S
urg.Res.,36:588−596,1984）。平滑筋細胞の過剰成長
に対する可能性を制限するため、イヌの内皮細胞を、平
滑筋マイトジュンが低い培地補足物である血漿由来の血
清の中で培養することができる。全ての培養は、筋間特
異的アクチンアイソフォームを認識するモノクローナル
抗体で平滑筋細胞を識別し、第VIII因子関連抗原（Wagn
er,D.D.,etal.,J.Cell Biol.95;355−360,1982）を認識
する抗血清ならびに上述のような標識づけされたアセチ
ル化LDLで内皮細胞を識別する免疫組織化学手順によっ
て監視することができる。
レトロウィルスベクター レトロウィルスはRNAウィルスである；すなわちウィ
ルスゲノムはRNAである。しかしながらこのゲノミックR
NAは、形質導入された細胞の染色体DNAの中に安定した
形で効率良く組み込まれるDNAコピーの中に逆転写され
る。この安定した形で組込まれたDNAコピーはプロウィ
ルスと呼ばれ、その他のあらゆる遺伝子と同様、娘細胞
によって受け継がれる。図１に示されているように、野
生型レトロウィルスゲノム及びプロウィルスDNAは３つ
の遺伝子、すなわち２つの長末端反復（LTR）配列によ
りフランキングされた−gag,pol及びenvを有する。gag
遺伝子は内部構造（クヌレオカプシド）タンパク質をコ
ードする;pol遺伝子はRNA誘導DNAポリメラーゼ（逆転写
酵素）をコードする；又env遺伝子は、ウィルス性外被
糖タンパク質をコードする。５′及び３′のLTRは、ウ
ィルス粒子RNAの転写及びポリアデニル化を促進するの
に役立つ。
５′LTRに隣接して存在するのは、ゲノムの逆転写（t
RNAプライマ結合部位）及び粒子内へのウィルス性RNAの
効果的な包膜（Psi部位）のために必要な配列である。M
ulligeu,R.C.,のExperimental Manipulation of Geve E
xpression（遺伝子発現の実験的操作）、M.Inouye（e
d）.155−173（1983）;Mann,R.,etal.,Cell（細胞）、3
3:153−159（1983）;Cone,R.D.及びR.C.Mulligan,Proce
edings of the National Academy of Sciences.（国立
科学アカデミー会報）U.S.A.81:6349−6353（1984）。
包膜（又は感染性ウィルス粒子内へのレトロウィルス
RNAのパッケージング）のために必要な配列がウィルス
ゲノムから欠如している場合、結果は、ゲノミックRNA
の包膜を防止するシス作用性欠損である。しかしなが
ら、結果として得られる突然変異体は、なおも全てのウ
ィルス粒子タンパク質の合成を誘導することができる。
Mulligan及び共同研究者は、これらのPsi配列が欠失さ
せられたレトロウィルスゲノムならびに、染色体内に安
定した形で組み込まれた突然変異体ゲノムを含む細胞系
統について記述している。Mulligan,R.C.,のExperiment
al Manipulation of Gene Expression,M.Inouye（ed）.
155−173（1983）;Mann,R.,etal.,Cell,33:153−159（1
983）,Cone R.D.及びR.C.Mulligan,Proceedings of the
National Academy of Scieuces,U.S.A.,81:6349−6353
（1984）。これらの刊行物の教示は、本書中に参考とし
て内含されている。
Mulligan及び共同研究者が記述しているように、Psi
2細胞系統は、以下のような要領で構築された：すなわ
ち、ウィルス粒子内へのウィルス性RNAの包膜に関与す
る領域又はゲノムが欠失している（図１のPsi配列）よ
うな突然変異体マウス白血病ウィルス（MuLV）ゲノムを
構築した。このゲノムをDNA同時トランスフェクション
によりNIH3T3細胞内に安定した形で導入し、包膜のため
に使用されるウィルスタンパク質の全てを産生しそれで
も非感染性粒子を出芽した安定したトランスフェクタン
トを分離した。MuLVの突然変異体を、Pr65gagのための
コーティング配列を開始するAUGと推定のenv mRNA5′ス
プライス部位の間の感染性プロウィルスDNAクローンか
ら351個のヌクレオチドを欠失させることによって構築
した。欠失は、Bal I部位からPat I部位まで行ない、Hi
nd III部位を欠失箇所で生成した。
pMOV.（pMOVPsi）は以下のように構築された：すなわ
ち、３つの精製されたDNAフラグメントを合わせて連結
させてpMOVPsiを構築した。第１のものは、pMOVPsitをX
ho Iで完全になるまで消化させその後EcoR Iで部分消化
することによって得られた。Chumo−Kov,I.etal.,Journ
al of Virology（ウィルス学ジャーナル）、42:1088−1
098（1982）。MuLV内の2.0uのXho I部位から、全てpBR3
22のものである３′LTR,3′マウスフランキング配列を
通って延びEcoR II部位で終わるフラグメントを、電気
泳動分離の後アガロースゲルから精製した。Vogelstei
n,B及びP.Gillespie,Proceedings of the National Aca
demy of Sciences,USA,761:615−619（1979）。第２の
フラグメントは、Ba Iで完全になるまでpMOVPsitを消化
しその後pBR322内のBal I部位から５′マウスフランキ
ング配列及び５′LTRを通ってMuLVの0.7uにあるBal I部
位まで延びるフラグメントを精製することによって得ら
れた。その後、Hind IIIリンカー（共同研究）をT4 DNA
リガーゼを用いてこのフラグメントに平滑連結させ、余
剰のHind III及びEcoR Iでフラグメントを消化した。LT
R含有フラグメントを電気泳動分離の後アガロースゲル
から精製した。最終連結反応内に存在する第３のフラグ
メントは、MuLVのgag/pol領域がpSV2内にサブクローニ
ングされたpSV2gag/polから得られた。Mulligan,R.C,及
びP.Berg,Scieuce,209:1422−1427（1980）。pSV2−gag
/polをXho I及びHind IIIを用いて完全になるまで消化
させ、電気泳動分離の後アガロースゲルから、Hind III
部位（MuLVの1.0uでPst I部位から変化したもの）からM
uLVの2.0のXho Iまで延びるフラグメントを精製した。
これら３つのDNAフラグメントを次に等モル量で合計DNA
濃度50μg/mlで、リガーゼ緩衝液（50mMのトリス−Hcl
〔pH7.8〕、10mMのMgCl2、20mMのジチオトレイトール、
1.0mMのATP、50μg/mlのウシ血清アルブミン）中で混合
し、18時間15℃でT4 DNAリガーゼでインキュベートし
た。E.Coli（大腸菌）HB101を連結されたDNAでトランス
フェクションさせ、アンビシリン耐性トランスフェクタ
ントを得た。一定数の形質転換体から得たプラスミド
を、適切な制限エンドヌクレアーゼでの消化及びアガロ
ースゲルを通しての電気泳動により望まれる構造につい
てスクリーニングした。Dauis.R.W etal.,Methods in E
nzymology（酵素学方法）65;404−411（1980）。
染色体内に安定した形で組み込まれたPsi突然変異体
を含む細胞系統を、XGPRT発現が可能なSV40ハイブリッ
ドベクターであるpSV2gptとpMOV−Psiの同時トランスフ
ェクションによって作製した。Mulligan,R.C.及びP.Ber
g,Science,209:422−1427（1980）。このようにして得
られたgpt＋コロニーからの細胞をクローニングし、Psi
−1,Psi−２及びPsi−３という３つの系統の形で確立し
た。
Mulligan及び共同研究者によって記述されたPsi2細胞
系統は、環境栄養性（エコトロピック）モロニーマウス
白血病ウィルス（Mo−MuLV）クローンであるpMOV−Psi
でNIH3T3内皮細胞をトランスフェクションすることによ
って作られた。pMOVPsiは、全てのウィルス性遺伝子産
物を発現するが、ウィルスゲノムの包膜に必要なもので
あるPsi配列が欠如している。pMOV−Psi−は、マウス
（及び密に関係するげっ歯類）細胞上にのみ存在するレ
セプタを認識する環境栄養性ウィルス外被糖タンパク質
を発現する。
もう１つの細胞系統は、Psi−２様のパッケージング
細胞系統であるPsiam系統である。これらのPsi−am細胞
系統は、変更されたpMOV−Psi−ゲノムを含んでおり、
この中では環境栄養性外被糖タンパク質は、両栄養性ウ
ィルス4070Aから由来するエンペロープ配列で置換され
ている。Hartley,J.W.及びW.P.Rowe,Journal of Virolo
gy,19;19−25（1976）。その結果、これらの細胞系統
は、両栄養性宿主域を伴う組換え型ウィルスの産生のた
めに役立つ。Psi am細胞系統を作製するのに用いられる
レトロウィルスは、非常に広い哺乳動物宿主域（両栄養
性宿主域）を有し、ヒトの細胞を感染させるのに用いる
ことができる。組換え型ゲノムがPsiパッケージング配
列を有する場合、Psi−am細胞系統は、感染性レトロウ
ィルス粒子内に組換え型レトロウィルスゲノムをパッケ
ージングすることができる。Cone,R.及びMulligan,R.C.
Pnoceedings of the National Academy of Sciences U.
S.A.81;6349−6353（1984）。
その他の２つのパッケージング細胞系統は、PsiCRIP
及びPsiCREとして知られている。これらの細胞系統は、
それぞれ両栄養性及び環境栄養性の宿主域をもつ高い力
価の組換え型レトロウィルスを安定した形で産生するク
ローンを分離するのに有用であることが立証されてい
る。これらの細胞系統については、Danos,O.及びR.C.Mu
lliganのProceedings of the National Academy of Sci
ences.U.S.A.85:6460−6464（1988）及び1988年９月１
日付の米国特許出願明細書第07/239,545の中に記述され
ている。この参考文献及び特許出願明細書の教示は本書
に参考として内含される。PsiCRIP及びPsiCREは、ブダ
ペスト条約の条文に基づきそれぞれCRL9808及びCRL9807
という受入番号でAmerican Type Culjure Collection,R
ockuille,MDに寄託されている。
野生型レトロウィルスゲノムは、Cone及びMulliganに
より、細胞内に新しい遺伝子を導入することのできるベ
クターとして使用するために変更された。図２に示され
ているように、gag,pol及びeno遺伝子は全て除去され、
neo遺伝子をコードするDNAセグメントがその代りに挿入
された。neo遺伝子は優性の選択可能標識として役立
つ。組換え型ゲノムの一部としてとどまるレトロウィル
ス配列にはLTRs,tRNA結合部位及びPsiパッケージング部
位が含まれる。Cepko,C etal.,Cell,37:1053−1062（19
84）。
本発明の形質導入された内皮細胞を産出する上で用い
られた付加的なベクター構成が図２に表わされており、
以下でこれについて記述する。
pLJ. このベクターの特性は、Korman,A.J.etal.,Proce
edings of the National Academy of Sciences,U.S.A.8
4;2150（1987）中に記述されている。このベクターは、
問題の遺伝子とneo遺伝子などの優性選択可能標識とい
う２つの遺伝子を発現することができる。問題の遺伝子
は、直接配位で、５′LTRに対してちょうど遠位のBamH
I/Sma I/Sal Iクローニング部位内へクローニングさ
れ、一方neo遺伝子は、クローニング部位よりさらに
３′のところである（クローニング部位から３′のとこ
ろにある）内部プロモータ（SV40からの）に対し遠位に
置かれている。PLJからの転写は２つの部位で開始され
る；すなわち１）問題の遺伝子の発現を担うものである
５′LTR及び２）neo遺伝子の発現を担う内部SV40プロモ
ータである。pLJの構造は図2aに示されている。
ベクターpLJは図2aに示されている。pLJ内では、問題
の遺伝物質はちょうど５′LTRの後に挿入される。この
遺伝物質の発現はLTRから転写され、neo遺伝子の発現は
内部SV40プロモータから転写される。
pEm. この単一のベクター内では、野生型ウィルスのga
g,pol及びenvに対するコーティング配列全体は、発現さ
れた唯一の遺伝子である問題の遺伝子で置換されてい
る。pEmベクターの構成要素について以下に記述する。
５′フランキング配列、つまり５′LTR及び400bpの隣接
する配列（BamH I部位まで）はPZIPからである；しかし
ながら３′LTRから150bp上流のCla I部位は、合成のBam
H Iリンカーと連結されており、ベクター内に存在するB
amH Iクローニング部位のもう１つの半分を形成する。p
BR322のHind III/EcoR Iはプラスミドバックボーンを形
成する。このベクターは、モロニーマウス白血病ウィル
スの１株からのクローニングされた配列に由来する、骨
髄増殖性間脱ウィルスに由来する配列から、類似のベク
ターが構築された。pEmの構造は図2bに示されている。
選択可能標識の無いベクターも又、問題の遺伝物質で
内皮細胞を形質導入するのに用いることができる。この
ようなベクターは基本的に、このような標識が中に存在
する前述のベクターの単純化である。ベクターpEmは図2
bに示されている；示されているとおり、このベクター
の主構成要素は５′と３′LTR、及び２つのLTRの間に挿
入された問題の遺伝物質である。
MFG MFGベクター（ATCC受入番号68750）にpEmベクターに
類似しているものの、パッケージング細胞系統内の組換
え型ゲノムの被包を増大させるためのMMLVからのgag配
列の1038の塩基対、ならびにスプライスアクセプタ配列
及び転写スタートを含むMOV−９に由来する350の塩基対
を内含している。Nco I及びBamH Iを含む18塩基対のオ
リゴヌクレオチドがMOV−９配列に続き、相容性ある部
位をもつ遺伝子の適当な挿入を可能にしている。MMLVLT
Rは転写を制御し、結果として得られるmRNAは、未変性g
agトランスクリプトの真正５′未翻訳領域とそのすぐ後
に続く挿入された遺伝子のオープンリーディングフレー
ムを含む。MFGの構造は、図2cに表わされている。MFGの
さらに詳細な地図が、図19に提供されている。
MFGは、Xho I/BamH I H4ヒストンプロモータフラグメ
ントに対して半−GAGレトロウィルスベクター（半−GAG
はBender,etal.,J.Virol.6I:1639−1646に記述されてい
る）のXho I/Nde Iを含む５′LTRを連結させることによ
り構築された。レトロウィルスベクターpEMBをNde I及
びBamH Iで消化させ、適切な配位で２つのLTRを含み又
ベクターのウィルス部分内にH4フラグメントをも含む中
間レトロウィルスベクターを産生するべくH4フラグメン
トにすでに連結された半GAGフラグメントに対して、
３′LTR含有フラグメントを連結させた。この中間ベク
ターを次にNde Iでの消化により線形化し、ベクターのp
B822部分内のNde I部位をポリメラーゼで充てんし連結
により破壊した。ベクターを次にXho Iで消化させ、Xho
I部位をNde Iリンカーに接合させた。その後、ベクタ
ーをBamH Iで分割させ、両方のLTRとpBR322配列）を含
む大きなフラグメントを精製した。
Xho IとBamH Iを有しかつ という配列も有するリンカーを合成し、図2C及び19の中
に示されているような環状ベクターMFGを形成するべく
〔Nde Iエッジの隣りにスプライスアクセプタ部位を含
むJpMOV9からのNde I/Xba Iフラグメントと透明化され
た中間ベクター上のBamH I部位の両方に対し連結させ
た。
αSGC. αSGCベクター（ATCC受入番号68755）は、tPA遺伝子
の発現を調節するためのα−グロビン遺伝子からの転写
プロモータ配列を利用する。プロモータ要素を含む600
の塩基対フラグメントは、付加的に転写開始のための配
列及び真正α−グロビンmRNAの５′未翻訳領域を含んで
いる。サイトメガロウィルスからの転写エンハンサーを
含む360塩基対フラグメントがα−グロビンプロモータ
に先行し、この要素からの転写を強化するのに用いられ
る。付加的に、MMLVエンハンサは３′LTRから欠失させ
られる。この欠失は感染時点で５′LTRに転移させら
れ、基本的に要素の転写活性化活性を失活させる。α−
SGCの構造は図2dに示されている。α−SGCのさらに詳し
い記述は図18に提供されている。
内皮細胞内への遺伝物質の導入及び遺伝物質の発現の評
価 パッケージング細胞系統によって産生された組換え型
両栄養性レトロウィルスを、内皮細胞の感染に使用す
る。上述のとおり、両栄養性レトロウィルスの組換え型
ゲノムはさまざまな構成要素を含みうるが、一般には２
つのLTRと、gagの代わりとしての第２のプロモータ配列
であるpol及びenv配列で構成されている。場合によって
は、選択可能標識をコードする遺伝子（例えばneo）も
含まれている。
問題の遺伝物質を内皮細胞内に導入するのに用いるべ
きウィルスストックには、上述のように１ミルあたり８
マイクログラム（mcg/ml）のポリブレン（Aldrich）が
補足され、これが内皮細胞の培養へ付加される。ウィル
スの力価が高い場合（例えば約106Cfu/ml）、ほぼ全て
の内皮細胞が感染を受けることになり、いかなる選択
（例えば組換え型ゲノムを含むベクターが中に導入され
た内皮細胞の選択）も必要とされない。力価が非常に低
い場合、neoなどの選択可能標識をもつレトロウィルス
ベクターを用いることが必要である。選択可能標識が用
いられる場合、ウィルスに対する露呈の後細胞は集密性
に達するまで成長させられ選択培地（例えば抗生物質G4
18を含む培地）の中に分割される。
neo遺伝子は、細菌内でネオマイシン耐性を又哺乳動
物細胞内で抗生物質G418耐性をコードするトランスポゾ
ンTn5に由来する細菌性遺伝子である。このneo遺伝子
は、優性選択可能標識として作用する；哺乳細胞中のそ
の存在は細胞を、一般に細胞の死枯をひき起こす抗生物
質であるG418の存在下で成長する細胞へと変換する。そ
の結果、哺乳動物細胞内でのこの遺伝子の存在は、G418
を含む培地内で細胞を培養することによって決定するこ
とができる。この組換え型ゲノムを有する組換え型レト
ロウィルスを、neoウィルスと呼ぶ。
neo遺伝子をもつ組換え型レトロウィルスベクターは
クローニング部位も有している。その結果、問題の遺伝
物質をベクター内に導入し、neo遺伝子と共に内皮細胞
内に取り込ませ、組換え型レトロウィルスでの形質導入
を受けた内皮細胞（組込まれた遺伝物質を有する内皮細
胞と呼ぶ）によって発現させることが可能となる。
レトロウィルスベクターを用いて、内皮細胞内のほぼ
あらゆる問題の遺伝子を発現することが可能であるはず
である。３つの異なるクラスのタンパク質をコードする
遺伝子を発現するレトロウィルスベクターが構築されて
きた：すなわち分泌されたホルモン又はポリペプチド
（例えばhPTH,tPA又は第VIII因子）、膜レセプタ（LDL,
LDLR用レセプタ）及び細胞間酵素（ベータ−ガラクトシ
ダーゼ）である。内皮細胞内に取込まれたときの組換え
型レトロウィルスベクターの効果的な発現が立証されて
きており、例中に詳述されている。
その他のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝
物質の導入 その他のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺
伝子も同様に、適切なレトロウィルスベクターを用いて
内皮細胞内に導入することが可能である。例えば、ヒト
成長ホルモン（hGH）をコードする遺伝子、凝固第IX因
子をコードする遺伝子又はインシュリンをコードする遺
伝子を、内皮細胞内に導入することができる。このよう
な遺伝子は、単独で又はneo遺伝子といった選択可能標
識と組合わせた形で内皮細胞内に導入されうる。
これらの遺伝子ならびにその他の遺伝子は、hPTH遺伝
子について上で記述したのと同じ要領で内皮細胞内に導
入させることができ、結果として得られた形質導入され
た内皮細胞を体内の適切な部位内に移植するかかかる部
位上に塗布することが可能である。
内皮細胞内への問題の遺伝物質の導入のためのその他の
賦形剤と手段 内皮細胞を遺伝的に処理するか又は変更するためには
レトロウィルス以外の賦形剤を用いることも可能であ
る。問題の遺伝子情報は、内皮細胞内で問題の遺伝物質
を発現できるあらゆるウィルスを用いて内皮細胞内に導
入されうる。例えばSV40、ヘルペスウィルス、アデノウ
ィルス及びヒト乳頭腫ウィルスなどをこの目的で使用す
ることができる。
被移植細胞内に安定した形で取り込まれないもののエ
ビソーム的に発現される（被移植細胞ゲノムから区別さ
れた又は分離した状態にとどまる）ような形で、問題の
遺伝物質を内皮細胞内に導入することも同様に可能であ
る。
さらに、問題の遺伝物質を内皮細胞内に導入するに
は、化学的又は物理的手段を利用することができる。化
学的手段の一例としては一般に用いられているリン酸カ
ルシウムトランスフェクション手順があり、物理的手段
の一例としては問題の遺伝物質の細胞内への進入を可能
にする電流に対し細胞を露呈する電気泳動法がある。
取込まれた遺伝物質を有する内皮細胞の利用 血管移植片（グラフト又はインプラント）の性能の改善 重症の疾病状態の多くに、生命器官に供給を行なう動
脈の狭窄又は閉塞が関与している。このような疾病状態
に最も一般的に関わっている病理的メカニズムは、アテ
ローム性動脈硬化症である。例として挙げられるのは、
冠状動脈疾患に起因する狭心症及び心筋梗塞；血管疾患
に起因する一過性脳虚血発作及び卒中；腎動脈狭窄に起
因する腎血管高血圧症、究極的には腎不全；及び末梢動
脈の血管疾患によってひき起こされ最も重症の場合には
切断という結果を招きうる下肢の跛行である。アテロー
ム性動脈硬化疾病巣に対する疾病素因を個体に与える作
用因子（例えば高血圧、喫煙が除去されるのでないかぎ
り、これらの疾病状態の自然な成行きは通常アテローム
性動脈硬化疾病巣の進行であり、結果として永久的損傷
又は死を招く。
進行したアテローム性動脈硬化症に対する、受入られ
広く用いられている治療的アプローチは、主要な狭窄又
は閉塞の部位を、ダクロンやゴアテックスといった合成
材料製の人工血管を用いてバイパスすることである。毎
年350000以上の血管移植片が移植されている。このアプ
ローチがもつ１つの主要な問題点は、人工血管がきわめ
て血栓形成性が高く（凝塊を発達させる傾向をもつ）、
このことが非常に高い再狭窄率を導いている。自己由来
の内皮細胞を人工血管の管腔に接種することによってこ
の問題を軽減することが可能であった；内皮細胞でライ
ニングされた移植片の血栓形成性はさらに低いものと推
定される。変更された内皮細胞が特に有用となるのは、
このような背景の下においてである。
内皮細胞は、それをライニングした補てつ用移植片と
いう状況下でのその性能を改善するべく本発明の方法に
従って遺伝的に変更することができる。内皮細胞でライ
ニングされた補てつ用移植片を用いるための既存のプロ
トコルは、いくつかの重大なテクノロジー上の問題点に
よって複雑なものとなっているが、これらの問題点の大
部分は遺伝的に処理された内皮細胞の利用によって克服
できるものである。
内皮化された移植片に伴う１つの問題点は、人工血管
の管腔が補てつの壁と管腔表面の間の平滑筋細胞の増殖
のために漸進的に狭くなることにある。これを防止する
１つの方法は、平滑筋細胞の成長を抑制する産物を分泌
する遺伝子を内皮細胞内に導入することである。近年に
なって、間葉細胞及び／又は上皮細胞の増殖を制御する
数多くのタイプのオートクリン：パラクリン成長因子が
識別され、その遺伝子がクローニングされてきた。この
ような遺伝子は、本発明の方法を用いて内皮細胞内に導
入することができる。結果として得られる形質導入され
た内皮細胞は、細胞成長阻害因子を産生する。
内皮化された移植片プロトコルに伴うもう１つの技術
的問題点は、補てつ用移植片に対する内皮細胞の結合
（平板培養）効率が比較的低いということにある。これ
を改善するためのこれまでの試みは、移植片表面の組成
を変更することに向けられてきており、その成功は限り
あるものであった。本発明の方法を用いると、膜レセプ
タをコードする遺伝子を内皮細胞内に導入することが可
能である。このとき人工血管の管腔をレセプタのための
リガンドでコーティングすることができ、かくして膜レ
セプタ／リガンドの相互作用を通して管腔表面に対する
内皮細胞の結合は容易なものとなる。
本発明の遺伝的に処理された内皮細胞は、内皮細胞で
ライニングされた補てつ用移植片の血栓形成性を低下さ
せるのに用いることができる。凝塊形成のメカニズム
は、血小板の付着とそれに続くフィブリン（線維素）の
沈着及び凝塊の伝播であると考えられている。これは、
（組織プラスミノーゲン活性化剤（TPA）又はストレプ
トキナーゼといった凝塊を溶解する作用因子などの）血
栓形成作用因子を分泌する遺伝的に処理された内皮細胞
を移植片に接種することによって最小限にするかまたは
場合によっては削除することができる。
四肢又は器官に産物を送達するための変更内皮細胞の利
用 本発明は同様に、補てつを内含する動脈によって灌流
された四肢又は器官にとって恩恵のある因子を分泌する
遺伝子を内皮細胞内に導入するために使用することもで
きる。例えば、一般的な臨床上の問題点は人工血管の部
位に対し遠位に小さい血管の広範な狭窄が存在すること
である。これは、真性糖尿病に付随する血管疾患の特徴
である。移植片を用いたさらに大きい血管の再生は、患
部である四肢又は器官に対する灌流の不完全な再構成を
導く。
危険にさらされた器官又は四肢に対する血管流を促進
する１つの方法は、輸入管全てを最大限に拡張させるこ
とである。経口又は非経口投与の薬剤でこれを行なおう
とする試みは、ほとんど治療的利益をもたらさず、しか
も数多くの全身性副作用が付随していた。これは、一部
には、血管拡張剤が適切な組織にターゲッティングされ
ていないという事実によってひき起こされたものであ
る。心房性naturetic因子といった効力ある血管拡張剤
を分泌するべく処理された内皮細胞が、１つの代替的ア
プローチである。当該出願においては、患部である器官
又は四肢の近くの形質導入された内皮細胞をインビボ形
質導入により移植又は生成することができ、かくして、
患部器官又は四肢はきわめて高い濃度の血管拡張剤を含
む動脈血での灌流を受けることになる。その結果、全体
的な血管灌流は増大する。しかしながら血管拡張剤は心
臓に戻った時点で非薬学的レベルにまで希釈され、従っ
て全身性の非選択的な手法により投与されたときに起こ
る血管拡張剤の多くの全身性副作用が未然に防がれるこ
とになる。
送達システムとしての変更内皮細胞の利用 本発明は、生物学的に意義ある量では内皮細胞内で通
常再生されない選択されたポリペプチド及びタンパク質
といった選択された１つのタンパク質又はポリペプチド
を産生するような形で内皮細胞を遺伝的に処理し、これ
らを体の血流又はその他の部域（例えば中枢神経系）内
に分泌することを可能にする。このようにして形成され
た内皮細胞は、必要とされる物質の（注射、輸液などに
よる）定期的投与を必要とする現在の養生法に置き換わ
る連続した薬剤送達システムとして役立つことができ
る。
例えば、これは、現在のところ膵臓から分離され大量
に精製され次にインシュリン再生又は利用が損なわれた
人体の内部へと注入されなくてはならないインシュリン
の連続的送達を提供するのに使用することができる。こ
のようにして、インシュリンを連続的薬剤送達システム
を介して体内に導入でき、その結果日々のインシュリン
注射の必要性は全くなくなる。
遺伝的に処理された内皮細胞は同様に、凝固因子の産
生のためにも利用できる。血友病患者には、凝固に関与
する第VIII因子と呼ばれるタンパク質が欠如している。
第VIII因子は現在注射によって投与されている。しかし
ながら、第VIII因子をコードする遺伝子をもつ形質導入
された内皮細胞は、インビトロで第VIII因子を産生し送
達することができる。
内皮細胞内への問題の遺伝物質の取り込みは、遺伝性
疾患の治療及び後天的疾患の治療において特に価値ある
ものでありうる。遺伝性疾患の場合、このアプローチ
は、遺伝的に変更された内皮細胞及び代謝シンクとして
使用されうるその他の細胞を提供するのに利用される。
すなわちこのような内皮細胞は、患者体内に高レベルで
蓄積された潜在的に毒性のある物質を減成させるのに役
立つ。例えば、アデノシンデアミナーゼをコードする遺
伝子を発現する形質導入された内皮細胞を、有毒なプリ
ンヌクレオシドの蓄積という結果をもたらす酵素アデノ
シンテアミナーゼの欠損によってひき起こされた重症の
遺伝形態の複合型免疫欠損を治療するのに用いることが
できる。本発明の内皮細胞は同様に、体が通常産生する
産物（例えば酵素又はホルモン）が産生されないか又は
不充分な量しか作られないような遺伝病の治療にも使用
できる。ここでは、欠如しているか又は適切に産生され
ない物質をコードする遺伝子で形質導入された内皮細胞
を、この物質を充分な量産生するために用いることがで
きる。例えば、遺伝型の気腫において欠如しているタン
パク質つまり欠損タンパク質であるアルファ−１アニト
リプシンを産生するのにこれを用いることができる。
遺伝的に処理された内皮細胞（すなわち問題の遺伝物
質で形質導入された内皮細胞）の使用を通して治療を提
供することのできる後天的疾患は数多く存在する。例え
ば、慢性疾患に一般に存在し往々にして慢性腎不全を伴
う貧血症（例えば血液透析患者における）を治療するの
に、このような細胞を用いることができる。この場合、
エリスロポイエチンをコードする遺伝子を中に取り込ん
でいる内皮細胞は、エリスロポイチンを分泌しかくして
赤血球形成（すなわち赤血球の産生）を増大させるべく
骨髄を刺激することにより貧血症を補正する。
本発明の形質導入された内皮細胞は同様に、血栓の形
成を防止する活性化剤として低い全身用量の組織プラス
ミノーゲン活性化剤を投与するのにも使用することがで
きる。この場合、tPAをコードする遺伝物質を取り込ん
だ内皮細胞は、血栓形成の予防が望まれる患者の体内で
の凝縮を阻害することになる。これは例えば、冠状動脈
疾患、脳血管疾患、末梢血管閉塞性疾患、肺塞栓症など
にみられる静脈（例えば、表在性）血栓症又は深静脈血
栓症などの一般的障害に対する予防として役に立つだろ
う。カルシトニンをコードするDNAを含む内皮細胞は、
骨の代謝の進行性慢性障害であるパジェット病の治療に
用いることができる。現在の治療は、カルシトニンの皮
下投与に依存している。
インターロイキン（例えばIL−1,IL−2,IL−３）を産
生し分泌するよう工学処理された内皮細胞は、いくつか
の状況の下で使用することができる。例えば、現在使用
されている療法（例えば化学療法）のいくつかがもたら
す結果は、往々にして骨髄の直接的抑制によってひき起
こされる好中球減少（血中好中球数の異常な低下）の誘
発である。例えば、後天的免疫不全症候群（AIDS）の治
療において用いられるAZTならびにほぼ全ての化学療法
剤の使用は好中球減少を結果としてもたらす。この状態
の結果として、数多くの生命を脅す感染症がもたらされ
る。これらの場合においては、例えばIL−３をコードす
る遺伝物質を含み従ってIL−３を発現し分泌するような
内皮細胞の移植を通してのIL−３の投与を、好中球数を
増大させるのに使用することができる。さらに、血小板
の産生を刺激するトロンボポイエチンの投与は、血小板
数が少ない数多くの状態の治療に使用できる。この場
合、トロンボポイエチンのための遺伝子で形質導入され
た内皮細胞が血小板産生を刺激できる。
遺伝物質を取り込んだ内皮細胞のもう１つの関連利用
分野は、AIDSの治療である。免疫系を刺激するインター
ロイキン２及びインターロイキン３は、AIDSの治療にお
いて有効なものである可能性がある。これらの分子は、
これら２つのポリペプチド（現在周期的注入により投与
されているもの）を産生するべく遺伝的に処理された内
皮細胞によって送達されうる。
本発明のもう１つの用途は、酵素欠損疾患の治療にお
けるものである。この場合、内皮細胞内に導入された遺
伝子によってコードされた産物は（ホルモンと同様に）
分泌されない；むしろ、それは、細胞内部に残る酵素で
ある。患者に特定の１酵素が欠如していてさまざまなア
ミノ酸又はその他の代謝産物を代謝できないでいる遺伝
病の数多くの症例が存在する。これらの酵素のための適
正な遺伝子は、形質導入された内皮細胞を介して導入さ
れうる。例えば、冒された患者が酵素アデノシンデアミ
ナーゼを欠如しているような遺伝病が存在する。この酵
素は、尿酸へのプリンの減成に関与するものである。本
発明を用いると、形質導入された細胞が体内で存在する
部域を血液が通過するときにこれを解毒するのに充分高
いレベルで欠如している酵素を発現する形質導入された
内皮細胞を産生することが可能となる。
本発明は又、獣医学の分野でも利用できる。例えば、
そうでなければ周期的に（例えば毎回又はさらに頻度を
減らして）注射することによって提供されることになる
薬剤及びホルモンなどの物質を動物に送達する上で、形
質導入された内皮細胞を使用することが可能である。本
発明の変更された内皮細胞の使用は、動物の体内に変更
された細胞が存在することによって進行ベースでコード
されたタンパク質が大量に提供され、かくして物質を毎
日／周期的に投与する必要性がなくなるという利点をも
つ。
ここで、制限的意味を全くもたない以下の例を用いて
本発明を例示していく。
例1.形質導入された内皮細胞内のヒト副甲状腺ホルモン
の産生 pLJのBamH Iクローニング部位では、問題の遺伝物質
を挿入することができる。問題の遺伝物質は、上述のよ
うにDNAであってよい。
特に、ヒト副甲状腺ホルモン（hPTH）をコードする遺
伝子のコピーをこの部位（例えばpLJ内）に以下の要領
で挿入した:pLJプラスミドをBamH Iで消化し、ひきつづ
き酵素子ウシ腸内ホスファターゼで処理した。これに続
いて、アガロースゲル上で線形ベクターを分画しガラス
玉を用いて精製した。さらに、pBR322内へクローニング
されたヒトPTHの完全なcDNAを含む、Hendy etal.が記述
しているプラスミドから、ヒトPTH遺伝子を含むBamH I
フラグメントを調製した。Hendy,G.N.etal.,Proc.Natl.
Acad.Sa.USA.,78:7365−7369（1981）。図３参照。
全てコーディング配列である17bpの５′未翻訳配列及
び155bpの３′未翻訳配列を含むPTH cDNAのサブフラグ
メントを、Dde I及びHinf Iで初期プラスミドを消化し6
00bpのフラグメントを分離することによって分離した。
凹んだ末端を満たすべくリン酸塩中でデオキシヌクレオ
シド存在下でDNAポリメラーゼでフラグメントをインキ
ュベートした。T4DNAリガーゼで平滑末端にBamH Iリン
カーを連結した。BamH Iでこの連結混合物を消化するこ
とによって真正BamH I制限フラグメントを生成した。次
にこれを、ベクター構成においてhPTHの供給源として用
いられるプラスミドであるpBR322のBamH I部位内にサブ
クローニングした。
T4DNAリガーゼの存在下で、等量のpLJ線形バックボー
ンとBamH I PTHフラグメントを合わせて付加した。結果
として得られた混合物を、２つのフラングメントの連結
に適した条件の下で維持した。この連結混合物を細菌性
HB101を形質転換するのに用い、次にこのHB101を、カナ
マイシンを含む寒天上で平板培養した。Maniatis,T.eta
l,Moleculer Cloning;A Laboratory Manual（分子クロ
ーニング：実験室マニュアル）、Cold Spring Harbor L
aboratory,p.p.250−251,504;Boliver,F.およびK.Backm
an,Methods in Enzymology中、R.Wu（ed.）Vol.68,Acad
emic Press,N.Y.（1979）。結果として得られたコロニ
ーを組換え型プラスミドについて分析した。
副甲状腺ホルモンは、体内のカルシウムの調節におい
て１つの役割を果たすポリペプチドである。hPTH遺伝子
は、ヒトの内皮細胞内に存在しているものの、これらの
細胞内で生物学的に意義あるレベルでは発現されない。
hPTHといったポリペプチドホルモン又は通常は内皮細胞
によって生物学的に意義あるレベルで作られることのな
いその他の物質を作ることのできる内皮細胞を、個体上
に植えつけるか又は個体内に移植することができ、これ
らの細胞はホルモン又はその他の物質のための連続的な
合成及び送達システムとして役立つことができる。
hPTHをコードするDNA及び選択可能標識（例えばneo遺
伝子）をコードするDNAを含んでいた組換え型ウィルス
構成体を産生するPsi am細胞を用いて、上述のとおりに
ウィルスストックを産生した。ウィルスストックを収獲
した;hPTH遺伝子を含むウィルスで形質導入されるべき
内皮細胞を、このストックと共にインキュベートした。
この場合、G418を含む培地上で培養することによって形
質導入された内皮細胞を識別し選択するのに選択可能標
識を用いる。ウィルス力価が充分に高い場合、本質的に
全ての内皮細胞が感染を受け、選択可能標識や適切な培
地を用いての選択は不必要である。
hPTH遺伝子を有する組換え型レトロウィルスで形質導
入された内皮細胞のhPTH遺伝子を発現する能力は、以下
の要領でインビトロで評価された：ウシの大動脈内皮細
胞は、子ウシの大動脈からの外植片に由来するものであ
った。細胞は、制限ある寿命を有し、二次培養と呼ばれ
る。ウシ大動脈内皮細胞を、上述のとおりにウィルスに
感染させ、ネオマイシン内で選択しなかった。形質導入
されたウシ大動脈内皮細胞を10cmの組織培養皿上に接種
し、集密性をもつまで成長させた。次に新鮮培地（10％
のCS及びペニシリン及びストレプトマイシンを伴うDM
E）を付加した；この点を以下ゼロ時点と呼ぶ。24時間
経過後、培地を除去し、ヒトPTHの産生について細胞を
評価した。
無傷hPTHを測定する放射性免疫検定法（Nichols）を
用いてhPTHの存在についてアリュートを分析した。この
技術は、血清中のヒト無傷副甲状腺ホルモンの定量測定
のためのAllegroTM無傷PTH/免疫検定システム、Nichols
Institute Diagnostics,San Juan Capistrano,CA（36B
−2170、発効7/86改訂）の中で記述されており、その教
示は本書中に参考として内含されている。検定は、血清
ミリリットルあたり約１ナノグラム（ng/ml）の感度を
有し、ウシのPTHと交差反応しないという点でヒトPTHに
対し特異的であることが示されている。実験結果は、経
時的にRIAにより測定されるようにhPTHの産生として報
告されている。結果は表Ｉに示されている。
本発明に従ったhPTHをコードするDNAで形質導入され
たウシ大動脈からの内皮細胞は、受入れ番号CRL 9601で
American Type Culture Collection（Rockville,MD）に
寄託された。
例2.形質導入された内皮細胞内のヒトLDLレセプタの産
生 ヒトLDLレセプタ（LDLR）のためのcDNAをpEmベクター
内に挿入した。LDLRのためのcDNAは、以下の要領でpEM
内への挿入用に調製された。Hind IIIでの消化によって
ベクターpTZ1（University of Texas Healtl Science C
enterのGoldstein博士から得たもの）からLDLRcDNAを切
除した。LDLRコーディング配列の全てを含む2.6kbのHin
d IIIフラグメントをクレノウフラグメントで平滑末端
化し。T4DNAリガーゼを用いてcDNAに対しBcl Iオリゴヌ
クレオチドリンカー（NSBから）を連結した。最後に、
この連結混合物を余剰の酵素Bcl Iで消化し、アガロー
スゲル上でフラグメントを分画し、精製した。これを、
以下の要領でpEmのBamH Iクローニング部位内に挿入し
た。pEmをBamH Iで消化し、線形化されたプラスミドを
子ウシ腸内ホスファターゼで消化した。等量のリンカー
入りLDLRインサートとpEMバックボーンと混合してT4DNA
リガーゼで連結させた。HB101を形質転換させるため連
結混合物を使用し、適当なレトロウィルスベクターにつ
いてアンピシリン耐性コロニーを分析した。pEm−LDLR
ベクターをPsi−am細胞系統内にトランスフェクション
し、組換え型ウィルスを大量に生産したクローンを識別
した。PTHについて記述されているようにウシ大動脈内
皮細胞の培養を感染させるためウィルスストックを用い
た。
LDLR発現のインビトロ評価は、以下の要領で行なっ
た：対照の又は形質導入されたウシ大動脈内皮細胞の集
密的プレートを、約８時間10μg/mlの濃度で螢光標識
（Biomedical Tech Incから得たもの）とコンジュゲー
トされたLDLと共にインキュ−ベートさせた。これに続
いて、PBSで細胞を洗浄し、PBS中0.5％のグルテルアル
デヒド内で固定させた。次にこれらの細胞を、螢光標識
付けされたLDL（＊LDL）の摂取のため螢光顕微鏡の下で
視覚化させた。この実験の結果は、図４に示されてい
る。簡単に言うと、内因性LDLRのレベルは、未感染培養
（4B参照）中の＊LDL摂取の相対的欠如によって証明さ
れるように、低いものである。しかしながらLDLRウィル
スに感染した培養中、全ての細胞の約30％は検出可能な
量の＊LDLを取り込み、かくして外因性LDLR（4D参照）
の効果的な発現が証明されている。
例３ 形質導入された内皮細胞内のベータガラクトシダ
ーゼの産生 大腸菌からのベータガラクトシダーゼをコートする遺
伝子をpLJ内に挿入し、このベクターをPsi−am細胞系統
内にトランスフェクションさせ、その結果高力価のレト
ロウィルスストックが産生された。このベクターの構成
及び産生細胞系統の分離についてはPriceと共同研究者
により記述されている。Price,J.etal.,Proceedings of
National Academy of Sciences,UAS,84:156−160（198
7）。ベータガラクトシダーゼ遺伝子をコードするウィ
ルスのストックを、前述のとおりウシ大動脈内皮細胞を
感染させるのに用いた。インサイチュ組織化学染色を用
いてベータ−ガラクトシダーゼ発現について分析した。
前述のPrice,etal.を参照のこと。G418内での選択の前
後に培養を分析した。この実験で使用されたレトロウィ
ルスベクターは、G418に耐性を付与するneo遺伝子とベ
ータ−ガラクトシダーゼの両方を発現する。組織化学染
色を、Price,etal.によって記述されているとおりに行
なった。簡単に言うと、細胞培養を５分間PBS中の0.5％
のグルテルアルデヒド内で固定し、PBSで洗浄し、少な
くとも12時間反応混合物に露呈した。反応混合物は、ベ
ータガラクトシダーゼのための基質を含み、この基質は
加水分解されると青色に変わり細胞内に沈殿する。その
結果、ウィルスコード化ベータ−ガラクトシダーゼを発
現する細胞は全て青色に変わることになる。この実験の
結果は図５に示されている。ウィルスに露呈されていな
かった培養中ではいかなるベータ−ガラクトシダーゼ活
性も検出されない（図5A）；感染した培養は、約30％の
細胞内でベータガラクトシダーゼ活性を示す（図5B）。
これらの形質導入された細胞は、G418の存在下でこれら
をインキュベートすることによって選択される。
例4.インビボで移植された血管移植片の表面上での形質
導入された内皮細胞中のベータガラクトシダーゼの産生 内皮細胞の形質導入及び移植のための標準的プロトコ
ルの絵画的表示が図６に示されている。体重20〜25kgの
雑種の成犬の外頸静脈から酵素的に内皮細胞を収獲し
た。各動物からの細胞を２つのアリコートに分割した；
そのうち１つは複製欠損レトロウィルス（以下参照）に
感染させるべきものであり、もう１つは偽似感染させる
べきものであった、酵素的に収獲した細胞を用いて一次
培養を作製した。内皮細胞を、フィブロネクチンでコー
ティングしたフラスコに平板培養させ、10〜14日間にわ
たる２回の連続継代の間、５％の血漿由来のウマ血清、
ペニシリン、ストレプトマイシン、ヘパリン及びECGFが
補充されたM199培地中に維持した。
この期間中、３日に一度（１回の露出あたり18時間）
ポリブレン（８μg/ml）が補充された新鮮なウィルスス
トックに細胞を露呈した。２回目の継代が終わった時点
で、細胞を収獲し、アリコートを直接分析し、冷凍保存
するか或いは又Yatesの４段階方法の修正したもの（第
２段階と第３段階の間に自己由来の血液に0.75×106の
細胞が付加された）に従って6cm×4mmのダクロンTMニッ
トのドラフト（CR BARD.Billerica,MA）に接種するのに
利用した。動物を麻酔し、両方の頸動脈の6cmのセグメ
ントを記述した通りの接種された移植片で置換した。各
々の動物は、感染した内皮細胞の接種を受けた移植片
（インプラント）及び偽似感染した細胞で接種を受けた
対側性移植片（グラフト）を受け入れた。移植から５週
間後、動物を麻酔し、移植片（グラフト）を収獲し分析
した。
内皮細胞のゲノミックDNA内にリポータ遺伝子を安定
した形で導入するために、両栄養性宿主域をもつ複製欠
損レトロウィルスを用いた。細胞の細胞質を青色に染色
する酵素組織化学検定を利用してその発現産物ベータガ
ラクトシダーゼをインサイチュで検出することができる
ことから、リポータ遺伝子としてlacz遺伝子を用いた
（例３）。プロウィルス配列を検出するサザン分析及び
インサイチュで感染細胞を検出するウィルス発現ベータ
ガラクトシダーゼについての細胞化学染色によって、レ
トロウィルス感染の効率を見積った。
これらの研究で用いられる組換え型レトロウィルスは
２つある。BAGベクターについては、以前にPrice eta
l.,Proceedings of the National Academy of Science
s,UAS,84:156−160（1987）によって記述されている。L
acZ−遺伝子を含むBAGウィルスは、５′LTR（長末端反
復）からベータ−ガラクトシダーゼを、又原核生物内で
カナマイシン耐性及び真核生物内でG418（耐性）を付与
するSV40由来のプロモータから選択可能標識（neo）を
発現する。BAGウィルスに露呈された内皮細胞の約５〜1
5％が感染していた（表IIに要約されている）； アミノグリコシドG418で補足された培地内でのこれら
の培養の栽培は、形質導入された細胞について効果的に
選択を行なった。
LDLRcDNA配列を除く前述のBA−LDLRベクターに由来す
るBALベクターは、大腸菌ベータ−ガラクトシダーゼ遺
伝子に対するコーディング配列と置換された。LacZ−遺
伝子を含むより高い力価のBALウィルスは、ニワトリベ
ータ−アクチンから由来するプロモータからのベータガ
ラクトシダーゼを発現する。BALウィルスに露呈された
細胞の約50％を、サザン分析とベータ−ガラクトシダー
ゼに対するインサイチュ細胞化学染色により測定される
ように、形質導入した。
サザン分析においては、高分子量のDNAを分離し、ア
リコート（10μｇ）をKpn Iで消化させ、１％のアガロ
アースゲル上で分画させ、Zetakindへ移し、Feinberg及
びVoltの方法に従って高い比活性に標識付けされた1200
bpのCla I/EcoR Iフラグメントでプローブ探査した。位
相差及び螢光顕微鏡写真の両方によって培養された内皮
細胞の細胞化学的特徴づけを実証した。レトロウィルス
感染した内皮細胞を接種時及び移植された移植片からの
除去の後に、DIL−AC−LDLの摂取及びウィルス誘導のベ
ータガラクトシダーゼの発現について分析した。DIL−A
C−LDLが接種された、予備接種済みで移植後の細胞を、
位相差及び螢光顕微鏡写真を用いて評価した。ウィルス
誘導されたベータ−ガラクトシダーゼの発現について
も、予備接種済みの移植後の細胞を分析した。
接種の時点で、内皮細胞特異的機能（すなわちアセチ
ル化されたLDLの摂取及びフォン・ウィルブランド因子
の存在）について及び平滑筋細胞に特異的な抗原の存在
について培養を分析した。これらの分析は、各々の隔離
集団からの細胞の98％以上が機能中の内皮細胞であるこ
とを示していた。
実験システムは、移植片再増殖を研究するのに用いら
れた前述のイヌのモデルの修正したものであった。イヌ
１〜３は、BAG感染した未選択の内皮細胞での接種を受
けた移植片を受け、一方イヌ４〜７はまず最初にBAL感
染した未選択の内皮細胞での接種を受けた移植片を受け
た。これらの実験が進行中であった間に、イヌ４〜７か
らの内皮細胞をBAGウィルスにも感染させ、BAG形質導入
された細胞について選択するアミノグリコシダーゼであ
るG418の存在下又は不存在下で、培養内で拡張させた。
５週間後に、移植片を分析のため外植し、新しい移植片
をイヌ４〜７内に移植した（イヌ４′〜７′と呼ぶ）。
これらのイヌの各々は、BAGウィルスに感染しG418内で
選択された内皮細胞で接種された移植片及びBAG感染し
未選択の内皮細胞が接種された対側性移植片を受けた。
２番目の移植片セットを再び５週間後に外植した。
表IIは、これらの実験の結果を要約している。動物
４′〜７′は、動物４〜７について実施された第２の実
験を表わしている（本文参照）。BAG−Ｕは、形質導入
された細胞についてG418で選択されていないBAG感染し
た内皮細胞を表わす。BAG−Ｓは、形質導入された細胞
についてG418で選択されたBAG感染した内皮細胞を表わ
す。BALは、BAL感染した内皮細胞を表わす。MOCKは、擬
似感染した細胞を表わす。Ｅは、ベータ−ガラクトシダ
ーゼ染色によって測定されるような感染効率を表わす。
５週間後の移植片の効力（潜在能）は（Ｙ）有り又は
（Ｎ）無しで示されている。移植片の被度は、走査型電
子顕微鏡により測定されるように再増殖した表面の百分
率を表わす。
外植された移植片を分析すると、５週間後に22のうち
18が効力を持ちつづけていることがわかった。走査型電
子顕微鏡は、18のうち14の効力ある移植片の管腔表面上
に内皮様の形態をもつ細胞のライニングを立証した。内
皮細胞のライニングは、それが存在する場合、不完全
（全表面の50〜90％）であり、縮れたダクロン移植片の
ピークに沿って少量の細胞が見える状態で分布がよせ寄
め的である。各移植片の一部分を固定し、ウィルス由来
のベータガラクトシダーゼを発現する細胞について染色
し、750×の倍率の強力な解剖顕微鏡を通して視覚化し
た。効力のある状態にとどまり管腔細胞を保持した感染
内皮細胞での接種を受けた各移植片は、まさに血管の管
腔上にベータ−ガラクトシダーゼ陽性細胞を含む。偽似
（MOCK）感染した内皮細胞の接種を受けた対側性移植片
が陽性染色細胞を示すことは全く無い。
移植片のインサイチュ分析と、ウィルス形質導入され
た細胞について行なった。ウィルス発現されたベータガ
ラクトシダーゼを発現する細胞について、遺伝的に処理
された移植片の縦方向切片を分析した。移植片を縦方向
に切断し一部分を0.5％のグルテルアルデヒド内で５分
間固定し、PBS内で３度洗浄し、２時間ｘ−gal溶液中で
インキュベートし、Leitzの解剖顕微鏡で管腔表面を写
真撮影した。移植片を見開きで視覚化し、接種パターン
のいくつかの興味深い様相を観察した。形質導入された
細胞の密度は、縮んだ移植片の比較的深い表面の中で最
も大きかった。このことは、低出力下ではぎざぎざ状の
表面の割れ目をライニングする青い染色細胞の輪として
視覚化されており、走査型電子顕微鏡によって視覚化さ
れた表面の内皮細胞再増殖の変動と相関関係をもつ。さ
らに、遠位又は近位の融着に対する近接性との関係にお
ける形質導入された細胞の密度又はパターンの局所的変
動は全く無かった。最後に各々の場合において、ベータ
−ガラクトシダーゼについて陽性であった管腔細胞の割
合は、接種されたベータ−ガラクトシダーゼ陽性細胞の
調製物に比べ定性的に低いように思われた。
より詳細な特徴づけを可能にするため移植片の一部分
の管腔表面から細胞を酵素的に収獲した。細胞の一次培
養を作製し、分析に先立って約２−３週間インビトロで
拡張させた。ウィルス発現されたベータ−ガラクトシダ
ーゼについての組織化学検定及びサザン分析により、こ
の細胞個体群の中で遺伝的に変更された内皮細胞を識別
した。移植片から収獲されインビトロで拡張した細胞の
大部分は、分化した内皮機能を保持していた（95％未
満）。しかしながらウィルス誘導ベータ−ガラクトシダ
ーゼを発現するか又はプロウィルス配列を含んでいた細
胞の割合は、接種時点で分析された培養に比べて、一貫
して減少していた。この不一致は、一部には、融着から
又は間隙を通しての成長による外因性細胞をもつ移植片
の部分的再増殖に起因するものである。
例5:遺伝的に変更されたイヌ及びヒトの内皮細胞による
tPAの発現の増大 上述の例で紹介されたデータは、レトロウィルスを媒
介にした遺伝子転移がウシ、イヌ及びヒトの内皮細胞に
容易に適用できるものであることを示している。このデ
ータは又、その結果細胞間の分泌されたタンパク質が適
切に発現されることをも示している。治療的に関連性あ
るタンパク質の発現のためにレトロウィルスを媒介とし
た遺伝子転移を使用することが、以下の節で示されてい
る。
組織プラスミノーゲン活性化剤（tPA）は、血液凝塊
の線維素溶解を促進する内皮細胞によって通常分泌され
るタンパク質である。ヒトtPAをコードする組換え型レ
トロウィルスベクターが構築され、形質導入された内皮
細胞からの治療的に関連性あるタンパク質の強化された
送達を立証するべくイヌの内皮細胞を形質導入するのに
用いられた。
図７には、組換え型レトロウィルスベクター内へのク
ローニングのためのtPA遺伝子の変更が示されている。
ヒトの子宮tPAのコーディング配列は、Integrated Gene
tics Inc.,Framingham MAから得たpUCベースのプラスミ
ドのSal I DNAフラグメントの中に含まれていた。Sal I
フラグメントは、もとのcDNAのベース対2090にあるBgl
II部位と塩基対６にあるSFaN I部位にSal Iリンカーを
置くことによって誘導された。コーディング配列は、塩
基対13から塩基対1699まで広がっている。
この当初のクローンから、当該特許の本文で記述した
MFG及びα−SCGベクターの中に直接クローニングできる
フラグメントを誘導した。まずSal Iフラグメントを、
合成BamH Iリンカーの付加によってBamH Iフラグメント
に変換し、次に制限酵素Bgl IIで消化して、BamH Iから
Bgl IIの109の塩基対のフラグメント及びBal IIからBam
H Iの1975の塩基対のフラグメントを生み出した。tPAコ
ーディング配列の欠如している100個の塩基対及び翻訳
出発コドンを再度作り出すために、２つの104塩基対の
オリゴヌクレオチドを化学的に合成しアニーリングして
５′末端にNco I部位を又３′末端にBgl II部位をもつ
フラグメントを作った。このオリゴヌクレオチドを部分
的な1975塩基対のtPA遺伝子のBal II部位へ連結させて
もとの分子と同じコーディング配列をもつ2079塩基対の
tPA遺伝子を生成するが、これはNco I〜BamH I fのフラ
グメントとしても容易に得ることができるものである。
これを直接MFG及びａ−SGCベクターに挿入した（結果と
して得られたベクターにはそれぞれATCC受入れ番号6872
6及び68729が与えられた）、これらの操作は、標準的な
分子生物学技術（Molecular Cloning−A Laboratry Man
ual,T.Maniatis,E.F.Frisch及びJ.Sambrook）によって
行なわれ、図７に概略的に示されている。
両栄養性宿主域の組換え型レトロウィルスを産生する
ことのできるDanos及びMulliganのPsi cripパッケージ
ング細胞系統から、MFG−tPA及びα−SCG−tPAをコード
する組換え型ウィルスを産生する細胞系統を作った〔Pr
oc.Natl.Acad.Sci,U.S.A.85:6460（1988）〕。10μｇの
特定されたDNAと１μｇのプラスミドpsV2neoを同時沈殿
させ、標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション
手順によりパッケージング細胞上にトランスフェクショ
ンした。安定した形でトランスフェクションを受けたク
ローンを、800μg/mlのG418を含む選択培地内で14日間
成長させた後に分離した。個々のクローンの集密的細胞
単層から、24時間培養上清を得、これをNIH 3T3細胞を
感染させるのに用いた。24時間の露出の後、培養上清を
除去し、3T3細胞に正規の培地を再補給し、さらに72時
間成長させた。これらの細胞上に６時間新鮮な培地を入
れ、これらの上清を、ヒトtPAに特異的な市販のELISAを
用いてヒトtPAについて検定した（Immunobind−5,Ameri
can Diagnostica Inc.,N.Y.,N.Y.）。このスクリーンか
ら、MFG−tPA組換え型ウィルス又はα−SGC−tPA組換え
型ウィルスのいずれかを産生するパッケージング細胞系
統のクローンを選択しそれぞれMFG68及びα−SGC22と呼
称した。
イヌの内皮細胞を、記述されているとおりに〔T.J.Hu
nter,S.P.Schmidt,W.V.Sharp,及び（1983）Trans.Am.So
c.Artif.Intern,Organs29:177〕コラゲナーゼ消化によ
り外頸静脈の10cmのセグメントから分離した。細胞を、
５％の血漿由来のウマ血清、50μg/mlの内皮細胞成長因
子及び100μg/mlのヘパリンを含むM199培地内でフィブ
ロネクチンコーティングされた組織培養皿上で繁殖させ
た。細胞培養の純度を、フォン・ウィルブランド因子の
存在及び平滑筋細胞特異α−アクチンの不在の場合につ
いて、免疫組織化学検定によって測定した。形質導入の
前日に、内皮細胞をヘパリン無しの培地内で5.5×103細
胞/cm2の割合で接種した。翌日、各々の産生細胞系統に
由来する組換え型ウィルスを含む上清に８μg/mlのポリ
ブレンを付加したものに対し、24時間、内皮細胞を露呈
した。ウィルス上清を除去し、細胞に正規培地を補給
し、分析に先立ってさらに48時間成長を遂行させた。
標準的な技術により内皮細胞の培養から高分子量のゲ
ノミックDNAと合計RNAを分離した（Molecular Cloning
−A Laboratory Manual T.Maniatis,E.F.Fritsch及びJ.
Sambrook）。DNA及びRNAを、完全なtPAcDNAフラグメン
トから調製された32P標識付けされたDNAプローブを用い
て、ハイブリダイゼーション分析法により分析した。電
気泳動分離、フィルタートランスファ、ハイブリダイゼ
ーション、洗浄及び32P標識付けについては、標準的な
技術を用いた（Molecular Cloning−A Laboratory Manu
al T.Maniatis,E.F.Fritsch及びJ.Sambrook）。形質導
入されたイヌ内皮細胞内のヒトtPAの産生は、種特異的
免疫細胞化学染色を用いて立証された。形質導入された
細胞を10分間室温で３％のホルムアルデヒドの中で固定
し、次に５分間の0.1％のトリトンＸ−100の中で透過性
を付与した。固定した細胞単層を次に順番に、ヒトtPA
に対するマウスのモノクローナル抗体、アルカリ性ホス
ファターゼでコンジュゲートされたヤギの抗マウス抗
体、そして最後にアルカリ性ホスファターゼに特異的な
呈色試薬と共にインキュベートした。この手順は、ヒト
tPAを発現する細胞を特異的に染色し、従来の光学顕微
鏡によって視覚化されうる。さらに、形質導入された細
胞からのtPA分泌を、集密的細胞単層から測定した。新
鮮培地を６時間細胞上に置き、除去し、遠心分離によっ
て清澄化し、ヒトtPAの量を、市販のELISA（Immunobind
−5,American Diagnostica）を用いて測定した。
形質導入プロセスの有効性は、偽似形質導入又はMFG
−tPAで形質導入された細胞の個体群の免疫細胞化学染
色によって示されている。図９に示されているように、
MFG68から収獲されたウィルス上清に対する細胞の一回
の露呈の後、対照内では皆無であるのに対して、全ての
細胞がヒトtPAを合成している。これは、形質導入され
た細胞のいずれかのタイプの選択無しに達成された。
形質導入された培養から分泌されているtPAの量を測
定するため、免疫検定を行なった。以下で示すように、
MFG68又はα−SGC22からの組換え型ウィルスで形質導入
された細胞は、大量のヒトtPAを分泌した。類似の条件
下で、培養中のヒト内皮細胞は標準的に約1ngのtPAを分
泌する〔Hanss,M.、及びD.Collen（1987）,J.Lab,Clin,
Med,109;97104〕。
MFG68及びα−SGC22からの組換え型ウィルスで内皮細
胞が形質導入されたことのもう１つの確認として、DNA
及びRNAを形質導入された細胞から分離し、放射線標識
付けされたtPA遺伝子に対するハイブリダイゼーション
によって分析した。図10には、DNA分析のオートラジオ
グラムが示されている。未感染の対照においては、いか
なるハイブリダイゼーションも検出されなかったが、２
つの組換え型ベクターに感染した細胞中には、適切な分
子量の単一のハイブリッド形成種が見られた。このこと
は、遺伝的情報がこれらの形質導入された細胞のゲノム
に転移されたことを実証している。
これらの細胞から分離された合計RNAのハイブリダイ
ゼーション分析がタンパク質のDNAの結果を確認してお
り、これは図11に示されている。ここでも、対照細胞内
ではいかなるハイブリダイゼーションも検出されなかっ
たが、形質導入された細胞に由来するRNA内では、適切
なサイズのハイブリッド形成バンドが見られる。MFG68
及びα−SGC22の組換え型ウィルス産生細胞からのRNAが
同様に対照として示されている。
例6:血管移植片の表面上に移植された形質導入されたイ
ヌの内皮細胞のインビボ機能 体重20〜25kgの雑種の雌の成犬の外頸静脈から酵素的
に内皮細胞を収獲し、これを実験室内で培養し、例５に
記載されているとおりに純度について分析した。各々の
動物から分離した細胞の２分の１を、前節で記述したと
おりMFG−tPA組換え型ウィルスを産生するMFG68細胞系
統から収獲された上清に対する２回の露呈により形質導
入した。もう一方の半分は、擬似形質導入した。各々の
個体群に対して実施した成長曲線は、成長特性における
差を全く示さなかった。tPAが増大した細胞から分泌さ
れていたことを確かめるため形質導入細胞の各バッチに
由来する培養上清について、ELISA測定を行なった。次
に、充分な数の細胞を得るため約１週間実験室内でこれ
らの細胞を繁殖させた。
細胞を分離した各々の動物について、発泡テフロン
（W.L.Gore,and Associates.Inc.Flagstaff.Az）で作ら
れた２つの血管移植片に細胞を接種した。１つの移植片
には、擬似形質導入された細胞を接種し、もう１方の移
植片には、高レベルのtPAを分泌すべく形質導入された
細胞を接種した。0.4cm×14cmのサイズの各移植片を1.5
μg/cm2のフィブロネクチン（Sigma Chemical Corp.,S
t.houis MO）で予めコーティングし、次に2200,000個/c
mの内皮細胞を接種した。次に移植片を培養中でさらに7
2時間インキュベートした。移植に先立って、末端を各
移植片から切り離し、細胞被度を確認するべく検査し
た。
細胞を収獲したのと同じイヌを麻酔し、大動脈−回腸
バイパスとして、接種された移植片の10cmのセグメント
を移植した。各々のイヌは、２つの対側性移植片を受け
た;1つの移植片は、対照細胞が接種されたものであり、
もう一つの移植片は、高レベルのtPAを分泌すべく形質
導入された細胞が接種されたものであった。移植の後、
移植片の性能は、超音波で移植片を位置決定しドップラ
ー測定値（Accuson,Inc.）により移植片を通しての血液
流を評価するＢモードスキャナを用いて、毎日監視され
た。血栓の形成を減少するための薬剤は、全く動物に投
与されなかった。
６頭の異なる動物における移植片の性能の結果は図12
に示されている。上述の移植（片）モデルは、きわめて
緊縮性の高いものであり、閉塞性の凝塊形成により急速
に移植片を欠損に導く。正常な移植片の機能は、中実の
棒で示され、欠損したもののなおも機能している移植片
は斜線入り棒で示されている。最初の動物においては、
高くなったレベルのtPA（実験的）を分泌する形質導入
された細胞でライニングされた移植片及び対照の移植片
は、移植から24時間後の凝塊形成のために欠損した。そ
の他の５匹の動物全てにおいては、高くなったレベルの
tPAを分泌する形質導入された細胞でライニングされた
移植片は、単に擬似形質導入された細胞を伴う移植片に
比べ長く機能した。この差は24時間から数ヵ月にまで変
化した。これらの結果は、形質導入された内皮細胞を用
いてインビボで治療的効果を達成することができるとい
うことを実証している。
例７ 形質導入された内皮細胞からのヒト第VIII因子の
産生 変更されたヒト第VIII因子（ATCC受入番号No.68726）
を含むレトロウィルスベクターMFGで細胞を形質導入す
ることにより、ヒト第VIII因子を産生するため、内皮細
胞を遺伝的に増強させた。変更された第VIII因子cDNA
は、A1,A2,A3,C1及びC2ドメインのためのコーディング
配列の全てを含むが、Ｂドメインはアミノ酸743〜1648
まで欠失されている。Ｂドメインの除去及びレトロウィ
ルスベクターMFG内への変更因子第VIII遺伝子の挿入に
ついて、以下で詳述し、図13はこれを描いている。
５′及び３′の未翻訳配列無しの全長cDNAを、制限部
位Nco I（５′）とXho I（３′）の間に挿入されたプラ
スミドベクター内で得た。Ｂドメインの除去のため、因
子VIII cDNAを、Ｂドメインの５′及び３′部位の両方
の上の配列にまたがる４つのフラグメント内のプラスミ
ドベクターの中に第VIII因子cDNAをサブクローニングし
た。第VIII因子cDNAの第１のフラグメントを、プラスミ
ドベクターpUC9内の制限部位Sal IとPst Iの間でサブク
ローニングした。Sal IとPst Iでプラスミドベクターを
切断し、子ウシ腸内ホスファターゼを用いて５′ホスフ
ァターゼを除去した。全長cDNAからの1591の塩基対Xho
I（ヌクレオチド7263）からNde I（ヌクレオチド5672）
フラグメント及び359の塩基対Nde I（ヌクレオチド567
2）からPst I（ヌクレオチド5313）のフラグメントを分
離し、Sal I/Pst I消化されたプラスミドベクターを連
結させた。
同じ翻訳リーディングフレーム内でアミノ酸742〜164
9を接合するＢドメインをコードする配列の大部分を除
去するため、168の塩基対を網羅する５′Hind III部位
と３′Pst I部位を用いて４つのオリゴヌクレオチドを
合成した。これらのオリゴヌクレオチドは、軽鎖の活性
化ペプチドの最初のアミノ酸であるアミノ酸1649が後に
続くアミノ酸742をコードするヌクレオチド2427にあるH
ind III部位からヌクレオチド5313にあるPst I部位まで
広がっている。プラスミドベクターpUC9を制限酵素Hind
IIIとPst Iで消化させ、子ウシ腸内ホスファターゼを
用いて５′リン酸塩を除去した。オリゴヌクレオチドを
４つの別々の鎖として合成し、キーナーゼ化し、アニー
リングし、プラスミドベクターのHind III部位とPst I
部位の間で連結した。
サブクローニングされたHind III/Pst Iオリゴヌクレ
オチドを、プラスミドベクターpUCF8内のPst I/Xho Iフ
ラグメントに並置した。このプラスミドを生成するた
め、制限酵素部位５′Sma I−BamH I−Xho I−Pst I−H
ind III−Asp 718−Nco I−Hpa I 3′をコードする新し
いポリリンカーを用いて、pUC9プラスミドバックボーン
内に新しいポリリンカーを挿入した。プラスミドベクタ
ーを制限酵素BamH I及びHind IIIで消化させ、５′リン
酸塩を子ウシ腸内ホスファターゼで除去した。３′末端
第VIII因子フラグメントを分離するのにPst I/Xho Iサ
ブクローンの部分的Pst I/BamH I消化物を用い、サブク
ローニングされたオリゴヌクレオチドのPst I/Hind III
消化物を用いて重鎖及び軽鎖接合部フラグメントを分離
した。これらを、BamH IとHind III部位の間でプラスミ
ドベクターpUC F8内に連結させた。
ヌクレオチド2427及び7205の間に第VIII因子配列を含
むこのサブクローンを、Asp718及びHind IIIで消化さ
せ、子ウシ腸内ホスファターゼを用いて５′リン酸塩を
除去した。制限酵素部位Asp718（ヌクレオチド1961）と
Hind III（ヌクレオチド2427）の間の第VIII因子をコー
ドするフラグメントを分離し、ヌクレオチド1961からヌ
クレオチド7205にある翻訳停止コドンまでの第VIII因子
配列を含むサブクローン（pF83′デルタ）を生成するべ
くプラスミドベクター内に連結させた。
変更された因子VIII遺伝子を含むレトロウィルスベク
ターの構築は、レトロウィルスベクターMFGの制限部位
とNco IとBamH Iの間に第VIII因子遺伝子を挿入するこ
とによって行なった。第VIII因子サブクローンpF83′デ
ルタをSma Iで消化し、オリゴヌクレオチドリンカーを
用いてBgl II部位に変換した。３′第VIII因子サブクロ
ーンからAsp718/Bgl IIフラグメントを分離し、翻訳の
開始のためのATGを含む５′第VIII因子フラグメント
を、Nco I（ヌクレオチド151）/Asp718フラグメント
（ヌクレオチド1961）として分離した。Nco IとBamH I
でレトロウィルスベクターMFGを消化し、子ウシ腸内ホ
スファターゼを用いて５′リン酸塩を除去した。第VIII
因子フラグメントをレトロウィルスベクターに連結し
て、最終的な第VIII因子レトロウィルス構成体を生み出
した。図14参照。
レトロウィルス粒子を産生する細胞系統は、Bestwick
etal.（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988,85:5404−540
8）により記述れさているように同数の環境栄養性パッ
ケージング細胞Psi CRE及び両栄養性パッケージング細
胞PsiCRIP内へのレトロウィルスベクターMFG/第VIII因
子のトランスフェクションによって生成された。パッケ
ージング細胞の２つの宿主域の間に起こる重感染の程度
を監視するため、第VIII因子用のKabi Diagnostica Coa
test,Helena Laboratories Beaumont,Texasを用いて生
物学的に活性の第VIII因子の産生を測定し、RNAドット
ブロット分析によってウィルスRNAの産生を測定した。
トランスフェクション後21日目に、トランスフェクショ
ンを受けたバッケージング細胞の混合物を、両栄養性パ
ッケージング細胞系統PsiCRIP−HISと同時栽培した。Ps
iCRIPHISパッケージング細胞系統は、前述のPsiCRIPパ
ッケージング細胞系統の一変異体である。PsiCRIPHISパ
ッケージング細胞はPsiCRIPパッケージング細胞系統と
同一であるが、この場合、レトロウィルスエンベロープ
遺伝子は、異なる優性選択可能標識遺伝子であるpsV2−
HISプラスミドDNAでの同時トランスフェクションによっ
て細胞内に導入された、形質導入粒子の均質の両栄養性
レトロウィルスストックの分離のため、1:1の割合でパ
ッケージング細胞系統を培養した。両栄養性パッケージ
ング細胞系統PsiCRIPHISの重感染は、変更されたヒト第
VIII遺伝子を効果的に形質導入する組換え型レトロウィ
ルスを産生する安定した細胞系統HIS19の生成をもたら
した。高力価の組換え型レトロウィルスを産生する細胞
系統を分離するために、レトロウィルス産生細胞系統の
抗生物質による選択は必要とされなかった。細胞系統の
ゲノミックDNAは、産生細胞系統内に存在するレトロウ
ィルスベクターの組込まれたコピーの数を決定するため
のサザンブロットハイブリダイゼーション分析によって
特徴づけされた。レトロウィルス産生細胞系統内のコピ
ー数は約0.5であり、従って平均してPsiCRIP−HISパッ
ケージング細胞の50％が、変更第VIII因子遺伝子を伴う
レトロウィルスベクターのコピーを含んでいる。レトロ
ウィルスベクター及び変更第VIII因子遺伝子は、パッケ
ージング細胞系統内のDNAのいかなる欠失又は再配置も
無しに無傷である。レトロウィルスベクターのコピー数
は、レトロウィルス産生細胞系統の連続継代につれて、
一定にとどまる。最高の組換え型レトロウィルス力価を
得るためには、HIS19を、選択ヒスチジンマイナス培地
中で３継代、それに続いて補完されたDMEM培地中で４継
代に付した。レトロウィルス粒子の生成のためには、HI
S19を、10cmの細胞培養皿内に５×105〜１×106細胞の
割合で接種した。接種後48時間目に、約70％の集密性の
新鮮な培地（DMEM＋10％の子ウシ血清）を、形質導入の
ための組換え型レトロウィルスの供給源として24時間後
に収集するべく、プレートに対して付加した。
変更された第VIII因子を、頸静脈から分離されたイヌ
の内皮細胞内に形質導入した。４〜６時間、５％の血漿
由来の血清（ウマ）、100μg/mlのヘパリン及び500μg/
mlの内皮細胞成長因子を伴う完全M199培地中で10cmの皿
あたり３×1055細胞の割合で内皮細胞を接種した。次
に、形質導入プロセスの効率に不利な効果をもたらすヘ
パリンは無しに一晩、５％の血漿由来の血清、及び100
μg/mlの内皮細胞成長因子を伴うM199培地内で、細胞を
一晩インキュベートした。細胞を24時間、新鮮なウィル
ス上清にポリブレンを加えたもの（８μg/ml）に露呈し
た。ウィルス上清の除去の後、細胞を５％の血漿由来血
清、100μg/mlの内皮細胞成長因子を伴うM199培地の中
に入れ、約70−80％の集密性になるまで成長させた。こ
の時点で、培地を、５％の熱失活されたウシ胎児血清
（66℃で２時間加熱されたもの）及び50μg/mlのECGFを
伴うM199培地へと変えた。24時間のインキュベーション
の後、培地を収集しKabi Coatestによる生物学的に活性
な第VIII因子について検定をした。
このレトロウィルス産生細胞系統を用いて、サザンプ
ロット分析で測定されたように、50％〜75％の内皮細胞
が形質導入された。第VIII因子は、組換え型ウィルスに
対する唯一回の露呈で又、形質導入された細胞の抗生物
質選択無しで、この頻度で形質導入されうる。形質導入
された内皮細胞は、図15に示されているように欠失又は
再配置が全く無しで、組換え型レトロウィルスゲノム及
び変更された第VIII因子遺伝子の無傷コピーを含んでい
る。遺伝的に増強された内皮細胞からの生物学的に活性
な第VIII因子の産生速度は24時間、５×106細胞あたり4
00ngであった。
例8:内皮のインビボ形質導入 先行する例で記述されたとおりに作られた組換え型レ
トロウィルスの標準ストックを用いて、内皮細胞のイン
ビボ形質導入を実証する予備データを得た。このアプロ
ーチは、動脈表面に対する限定的な損傷が内皮細胞の小
片を除去し、この裸出した部域は欠損の縁部からの新し
い内皮細胞の増殖及び内殖によって72時間後に修復され
るという以前に公表された観察事実（Reidy MA,Schwart
z SM,Lab,Invest.44;301−308,1981）に基づくものであ
る。細胞分裂は、組換え型レトロウィルスによる有効な
形質導入のための必要条件であり、針金による内皮の損
傷は、内皮細胞の増殖を誘発する潜在的な数多くの方法
の１つである。我々の方法では、内皮細胞の増殖を誘発
するのに限定的損傷のReidyの技法が用いられ、次に増
殖中の細胞を直接、組換え型レトロウィルスベクターを
含む上清に露呈している。我々の最初の実験は、インサ
イチュで内皮細胞を成功裡に形質導入しかくして潜在的
に新しい遺伝子配列の成功裡の導入のための組織培養技
術の必要性を回避するというこの方法の可能性について
報告している。
この方法には２つの外科的処置が必要であり、そのう
ち第１の処置は血管の表面（ここで右回腸動脈について
記述する）を損傷し、内皮細胞の増殖を誘発する。第２
の処置では、血管表面上の複製中の細胞に対し組換え型
レトロウィルスを送達し、それと同時に増殖中の細胞が
レトロウィルス粒子に露出されている間近位動脈樹から
の血液の流れを防ぐ。簡略化のため、この処置について
は回腸動脈の場合に関して記述する。
インビボ遺伝子転移を実証するために、我々は、α−
SGCベクターに基づいて改良されたベクター（図2d及び1
8）と共に、1987年に公表された標識遺伝子の概念を用
いた（Price J.Turner D.Cepko C.1987 Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 84:156−160）（例３参照）。ベータガラク
トシダーゼをコードするlacZ遺伝子をα−SGCベクター
内に挿入して、図16に表わされているα−SGC−LacZベ
クターを生成した。この組換え型構成体をPsiCripパッ
ケージング細胞系統内にトランスフェクシッンし、高力
価のα−SGC−LacZ組換え型レトロウィルスを産生するP
siCrip細胞のクローンを例５に記した通りに分離した。
インビボ形質導入のためにαSGC−LacZ組換え型レトロ
ウィルスのストックを用いた。
実験動物（ウサギ）を麻酔し（ケタミン／キシラジ
ン）、両方のそけい部を剃り準備し、動物を手術台上に
載せた。両側垂直そけい部切除を通して、総、表在及び
深在大腿動脈が露出された。右側（損傷を加えるべき
側）で、総大腿動脈から離れた小さな分岐を、内回腸動
脈を通ってのみ起こることになる分離された動脈セグメ
ントからの流出を確実にするため連結した。必要な場合
は、そけい靱帯を分割し、全ての側方分岐を完全に制御
するべく後腹膜腔まで血管に追従した。深在出発点から
約1.5cm下で右表在大腿動脈（SFA）を３−０の絹糸で結
束し、SFAの制御はSFA/深在接合部で得られ横方向動脈
切開を作り上げた。血管の壁との接触を確保するべく弾
力性を提供するように２重になった細い針金〔20ゲージ
Intracathのスタイレット（探査針）を用いた〕を総大
腿動脈及び回腸動脈をさかのぼって上へ通過させて、Re
idy etalによって記述された限定的損傷を生成した。針
金を除去し、20ゲージのangiocathを動脈切開内に挿入
し、次の外科的処置の時点で直ちにアクセスできるよう
に下にある筋肉に固定した。切開を層状に閉じ、動物を
回復させた。
24時間後、αSG−Lac−Ｚベクターのcrip産生体から
収穫され８μg/mlの最終濃度になるまでポリブレンで補
足された上清を含む組換え型ウィルスをインビボ転写の
ために用いた。再び動物を麻酔し、両方の切開を無菌環
境内で再度開いた。前に裸出された右回腸血管に対する
外乱無く損傷された部域より上の右回腸血管を制御でき
るようにするため＃3FogartyTMバルーン塞栓切除カテー
テルを左表在大腿動脈内の動脈切開を通して挿入し、大
動脈分岐まで通過させ、バルーンを血流を中断すべく膨
張させた。右深在大腿動脈は、閉塞させた。組換え型レ
トロウィルスを含む上清（10ml）を、右SFA内に前に置
かれたangiocathを通しての手での注入により導入し
た。上清は、右総大腿動脈から右外回腸動脈そして内回
腸動脈内へとさか上った形で流れた。上内回腸を開放状
態に残すことにより、上清のための流出が可能となり、
全10mlの上清を点滴注入できた。これまでに行なわれた
実験においては、上清は、４〜８時間の間血管の壁に露
呈されていた。左側及び右側からのカテーテルを次に除
去し、止血を行ない、切開部を閉じた。
10〜14日後、動物を麻酔してから安楽死させた。麻酔
後、露呈前に、遠位血管の直接触診により、潜在能を評
価した。腎臓下大動脈及び下大静脈を外科的に露出さ
せ、カニューレを挿入し、下肢の血管を生理圧力（90mm
hg.）でヘパリン化されたリンガー乳酸塩（２μ/ml）で
洗い流した。致死量のネムブタルを投与し、動脈を10分
間0.1Mのカユジル酸塩中の0.5％のグルテルアルデヒド
内でインシチュで灌流固定した。大動脈及び両回腸動脈
を連続的に切除し、1mMのMgC12を含むリン酸緩衝生理食
塩水（PBS）内で洗い流した。次に37℃で１〜1.5時間ｘ
−gal基質中でのインキュベーションによりlacZ活性に
ついて血管を染色した。反応が完了した時点でｘ−gal
溶液を洗い流しPBSで置換し、写真撮影しこれを図17に
示した。
このプロトコルを用いて２つの実験を完了した。両方
の実験共、細胞質パターン内の選択的な強い染色（図1
7）によって視覚化されているように動脈の表面上の細
胞内のlacZ遺伝子産物のインサイチュ発現により示され
る通りインビボ形質導入が成功であることを実証した。
図17A及びＢは、針金で損傷を受け、αSGC−LacZ組換え
型レトロウィルスに露呈され、固定されlacZ活性につい
て染色され、低倍率（図17A）及び高倍率（図17B）で写
真撮影された外回腸動脈の１セグメントである。Reidy
etal.によって記述された損傷及び増殖のパターンと一
貫した強力に染色された青色細胞のラインに留意された
い。図17Cは、同じ様に固定され染色されたウィルスの
部位に対し遠位の同じ動脈の低倍率での写真である。こ
の部域は、控えめで拡散したバックグラウンド染色しか
示していない。
生物学的寄託 1991年10月３日、出願人は、American Type Culture
Collection,Rockville,MD.,USA（ATCC）に対して本書で
記述した第VIII因子の挿入を受けたプラスミドMFGをATC
C受入れ番号第68726号として、本書で記述したtPAの挿
入を受けたプラスミドMFGをATCC受入れ番号第68727号と
して、本書で記述した第VIII因子の挿入を受けたプラス
ミドα−SGCをATTC受入れ番号第68728号として又、本書
で記述したtPAの挿入を受けたプラスミドα−SGCをATCC
受入れ番号第68729号として寄託した。1991年10月９
日、出願人は、American Type Culture Collection,Roc
kville,MD.,USA（ATCC）に対して、本書で記述したプラ
スミドMFGをATCC受入れ番号第68754号として又本書で記
述したプラスミドα−SGCをATCC受入れ番号第68755号と
して寄託した。これらの寄託は、特許手続きを目的とし
た微生物の寄託の国際的認定に関するブダペスト条約の
規定ならびにそれに基づく規則（「ブダペスト条約」）
に基づいて行なわれたものである。これにより、寄託日
より起算して30年間生存可能な培養の維持が保証され
る。これらの生体は、ブダペスト条約の条件下でATCCか
ら入手可能であり、関連する米国特許の発行時点で無制
約の利用可能性を保証するATCCと出願人の間の契約に準
拠する。寄託された株の利用可能性は、いずれかの政府
当局がその特許法に従って付与した権利を侵害して発明
を実施することに対する許諾とみなされるべきものでは
ない。
等価物 当業者であれば、日常の実験以上のものを用いること
なく、本書に特定的に記述された発明の特定の実施態様
の数多くの等価物を認識し、又それを確認することがで
きるだろう。このような等価物は、以下のクレームの範
囲内に包含されるべきものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８７２８ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８７２９ (73)特許権者 999999999 ハワード ヒューズ メディカル イン スティテュート アメリカ合衆国，メリーランド 20817, ベゼスダ，ロックレッジ ドライブ 6701 (73)特許権者 999999999 ホワイトヘッド インスティテュート フォー バイオメディカル アメリカ合衆国，マサチューセッツ 02142，ケンブリッジ，ケンブリッジ センター ９ (74)上記２名の復代理人 999999999 弁理士 金本 恵子 (73)特許権者 999999999 ブリグハム アンド ウーマンズ ホス ピタル アメリカ合衆国，マサチューセッツ 02115，ボストン，フランシス ストリ ート 75 (74)上記１名の復代理人 999999999 弁理士 金本 恵子 （外６名） (72)発明者 ギルド，ブラッド アメリカ合衆国，マサチューセッツ 01742，コンコード，リバーデールロー ド109 (72)発明者 ラフィールド，ロリ エフ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94123，サンフランシスコ，＃５，ビー チ ストリート 2249 (72)発明者 コーエン，ローレンス ケー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611，オークランド，キャボット ド ライブ 5670 (72)発明者 キャロウ，アラン ディー. アメリカ合衆国，ミズーリ 63108，セ ント ルイス，ポートランド プレイス 15 (72)発明者 ビリニー，ルイス ケー. アメリカ合衆国，マサチューセッツ 02131，ボストン，モス ヒル ロード 74 (72)発明者 ウィルソン，ジェームズ エム. アメリカ合衆国，ミシガン 48103，ア ン アルボー，リバー パインズ ロー ド 3686 (72)発明者 ムリガン，リチャード シー. アメリカ合衆国，マサチューセッツ 02138，ケンブリッジ，フランクリン ストリート 441 (72)発明者 ロビンス，ポール アメリカ合衆国，ペンシルバニア 15216，マウント セバノン，オーバー ルック ドライブ 527 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/10 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】問題の遺伝物質によりコードされるポリペ
    プチド又はタンパク質をインビボ発現させることができ
    る、この問題の遺伝物質を中に取り込んだ形質導入され
    た培養内皮細胞であって、前記遺伝物質がα−SGC及びM
    FGから成るグループの中から選択されたレトロウイルス
    ベクターに含まれる、形質導入された培養内皮細胞。
  2. 【請求項２】問題の遺伝物質が、正常な内皮細胞の中に
    存在しかつこの細胞によって発現されるDNA;通常内皮細
    胞内には発生しないDNA;内皮細胞内で通常発生するもの
    のその中で生物学的に有意なレベルでは発現されないDN
    A;及び内皮細胞内で発現されうるように変更可能なあら
    ゆるDNA、から成るグループの中から選択される、請求
    の範囲第１項に記載の形質導入された培養内皮細胞。
  3. 【請求項３】少なくとも１つの選択可能な標識をコード
    するDNAを付加的に含む、請求の範囲第２項に記載の形
    質導入された培養内皮細胞。
  4. 【請求項４】問題の遺伝物質が、治療上価値あるホルモ
    ン、レセプタ、酵素及びポリペプチドから成るグループ
    の中から選択されたタンパク質又はポリペプチドをコー
    ドする、請求の範囲第２項に記載の形質導入された培養
    内皮細胞。
  5. 【請求項５】問題の遺伝物質が、ヒト副甲状腺ホルモ
    ン、組織プラスミノゲン活性化体、第VIII因子、低密度
    リポタンパクレセプタ又はベータ−ガラクトシダーゼを
    コードする、請求の範囲第４項に記載の形質導入された
    培養内皮細胞。
  6. 【請求項６】問題の遺伝物質を中に取り込んだ形質導入
    された培養内皮細胞であって、この問題の遺伝物質がレ
    トロウイルスベクターの一部として提供されたRNAから
    逆転写されており、前記レトロウイルスベクターがα−
    SGC及びMFGから成るグループの中から選択されている、
    取り込まれた問題のDNAを発現することのできる形質導
    入された培養内皮細胞。
  7. 【請求項７】問題の遺伝物質を中に取り込んだ形質導入
    された培養ヒト内皮細胞であって、この問題の遺伝物質
    がレトロウイルスベクターの一部として提供されたRNA
    から逆転写されており、前記レトロウイルスベクターが
    α−SGC及びMFGから成るグループの中から選択されてい
    る、取り込まれた問題のDNAを発現することのできる形
    質導入された培養ヒト内皮細胞。
  8. 【請求項８】少なくとも１つの問題のタンパク質又は少
    なくとも１つの問題のポリペプチドをコードする取り込
    まれた問題の遺伝物質を発現する形質導入された内皮細
    胞を作製するエクスビボ（生体外）方法であって； ａ） 問題のDNAを含む組換え型ゲノムを有する感染性
    組換え型レトロウイルスを内含する培地と内皮細胞とを
    接触させる段階、ここで、前記遺伝物質は、α−SGC及
    びMFGから成るグループの中から選択されたレトロウイ
    ルスベクターに含まれる；及び ｂ） 形質導入された内皮細胞を産生するべく、組換え
    型レトロウイルスによる内皮細胞の感染に適した条件の
    下に、感染性組換え型レトロウイルスを含む培地と内皮
    細胞とを維持する段階； を含む方法。
  9. 【請求項９】少なくとも１つの問題のタンパク質又は少
    なくとも１つの問題のポリペプチドをコードする取り込
    まれた問題の遺伝物質を発現する形質導入されたヒト以
    外の動物の内皮細胞を作製するインビボ方法であって、 該インビボ方法は ａ） 内皮細胞の増殖を誘発するためにインビボ（生体
    内）で内皮組織を損傷させ、かくして増殖中の内皮細胞
    を産生する段階；及び ｂ） 問題のDNAを含む組換え型ゲノムをもつ感染性組
    換え型レトロウイルスと増殖中の内皮細胞とを接触させ
    る段階 を含み、 ここで、前記組換え型ゲノムは、α−SGC及びMFGから成
    るグループの中から選択されるベクターに含まれてい
    る。
  10. 【請求項１０】合成人工血管の内面をライニングする内
    皮細胞の集密的層を生成する方法であって、該方法は、
    内皮細胞の増殖に適した条件の下で、内皮細胞マイトジ
    ェン（分裂促進剤）をコードする取り込まれた遺伝物質
    を含む内皮細胞を血管の内面に塗布する段階を含み、こ
    の遺伝物質はα−SGC及びMFGから成るグループの中から
    選択されたレトロウイルスベクターに含まれる。
  11. 【請求項１１】遺伝物質が内皮細胞成長因子をコードす
    る、請求の範囲第10項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】血管の内面上に取り込まれた問題の遺伝
    物質を発現する内皮細胞を有する人工血管を製造する方
    法であって、血管の内面を請求の範囲第８項に記載の方
    法によって作られた内皮細胞でライニングする段階を含
    む方法。
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