JPH07503121A - 内皮細胞の遺伝的変性 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｄ）　（ｃ）で形成された人工血管を哺乳動物の体内に導入する段階、を含む方 法。

内皮細胞の遺伝的変性 てコードされたタンパク質又はポリペプチドを産生ずる効果的な方法に対する必 要性が存在する。

発明の要約 ここで記述する発明は、遺伝的に処理された内皮細胞、特に例えば問題の遺伝物 質を含む組換え型ゲノムを有するレトロウィルスベクターを用いて、中に取り込 まれたこの選択された問題の遺伝物質（ＤＮＡ又はＲＮＡ　）を発現する遺伝的 に処理された内皮細胞に関する。

本発明は同様に、このような遺伝物質を内皮細胞内に安定した形で導入する方法 及び遺伝的に処理された内皮細胞を用いる方法にも関する。

本発明の内皮細胞はその中に安定した形で取り込まれた状態で、内皮細胞内ての 産生が望まれる１つの産物（例えばタンパク質、ポリペプチド又は機能的ＲＮＡ 　）をコードする問題の遺伝物質を有している。変更された内皮細胞は、この取 込まれた遺伝物質を発現する（コードされた産物を産生ずる）。この問題の遺伝 物質を、本書では「取込まれた遺伝物質Ｊと呼ぶ取込まれた遺伝物質は、問題の あらゆる選択されたＤＮＡ　（例えば、問題の産物をコードする遺伝子の一部分 又は全て）又は問題のＲＮＡであってよい。これは又、例えば、正常な内皮細胞 の中に存在しこの細胞によって発現されるＤＮＡ又はＲＮＡ　、内翠細胞内に通 常発生しないＤＮＡ又はＲＮＡ　、通常内皮細胞中に発生するもののそれらの中 で生物学的に存意なレベル（すなわちそれがコードするタンパク質又はポリペプ チドの正常な生理学的効果を生み出すのに充分なレベル）では発現されないよう なりＮＡ又はＲＮＡ　、内皮細胞内に発生し、内皮細胞内で発現されるように変 更されたＤＮＡ又はＲＮＡ　、及び、内皮細胞内で単独で又は何らがの組合せの 形で発現すべ（変更されつるあらゆるＤＮＡ又はＲ’ＮＡでもありうる。

本発明の内皮細胞は、同様に、選択可能な標識をコードする遺伝物質を発現する こともでき、か（して、取込まれた遺伝物質を発現する細胞をインビトロ（生体 外）で識別し選択する手段を提供する。

取込まれた遺伝物質を含む内皮細胞を、「形質導入された内皮細胞」と呼ぶ。

特に、内皮細胞内で通常生物学的に有意なレベルで発現されない問題のポリペプ チド又はタンパク質をコードする遺伝物質を含む遺伝物質を用いて内皮細胞を安 定した形で形質導入するためには、し）−〇ウィルスベクターか使用されてきた 。このような形で導入される遺伝物質としては、優性の選択可能な標識をコード する遺伝物質も含まれていてよい。問題のポリペプチドを単独でコードするＤＮ Ａ又は問題のポリペプチド及び優性選択可能標識をコードするＤＮＡを含む遺伝 物質が、培養された内皮細胞内に導入された。これらの遺伝子が取込まれた内皮 細胞（すなわちレトロウィルスベクターを使用して形質導入された内皮細胞）に よるこれらの遺伝子の発現も同様に実証されてきた。

遺伝子はレトロウィルスベクターを用いて内皮細胞内に導入されうることから、 これらの遺伝子は、レトロウィルスベクターの制御「上」にある（制御を受けて いる）可能性がある：このような場合、問題の遺伝子は、レトロウィルスプロモ ータから転写される。代替的には、問題の遺伝物質の転写を担う付加的なプロモ ータ要素（組換え型レトロウィルス内に組込まれているプロモータに加えて）を 部因子又はキューによって変調された付加的なプロモータが存在する構成体を使 用することができ、かくしてこの外部因子又はキューを活性化することによって 内皮細胞により産生されつつあるポリペプチドのレベルを制御することが可能と なる。例えば、熱シヨツクタンパク質というのは、プロモータが温度によって調 節されている遺伝子によりコードされるタンパク質のことである。金属含有タン パク質メタロチオニンをコードする遺伝子のプロモータは、カドミウム（Ｃｄ” ａイオンに対する応答性をもつ、外部キューにより影響されるこのプロモータ又 はその他のプロモータの取り込みも又、工学処理された内皮細胞によるポリペプ チドの産生の調節を可能にする。

内皮細胞は、インビトロ（生体外）又はインビボ（生体内）という２つの一般的 セッティングの中で形質導入を受けることかできる。

両方のセツティング共、組換え型レトロウィルスベクター又はその他のベクター の使用を通してといったような、内皮細胞内への問題の遺伝物質の転移のための 方法の利用を必要とする。インビトロ形質導入の場合、組織培養管内で成長させ られた内皮細胞は、問題の遺伝物質をコードする組換え型レトロウィルスといっ たようなベクターに露呈され、かくして、形質導入された内皮細胞を産生ずる。

このとき、遺伝物質でインビトロで形質導入を受けた内皮細胞はさまざまな既知 の方法のうちの１つを用いて移植される。このような方法には、形質導入された 内皮細胞でライニングされた合成血管又は人工弁の移植又は形質導入を受けた内 皮細胞を収納するべく設計された装置又はマトリクスの移植などがあるが、これ らに制限されるわけてはない。

代替的には、１つの組織又は器官内て内皮細胞に問題の遺伝物質器官内に存在す る内皮細胞は、例えば問題の遺伝物質をコードする組換え型レトロウィルスに露 呈される。このような方法としては、特定の１器官、四肢又は血管の中への（例 えばカテーテルを介しての）部位特異的投与が含まれるが、これに制限されるわ けではない。

インビトロで形質導入された内皮細胞とは異なり、インビボで形質導入されたこ れらの内皮細胞は、その次に続く移植のための方法を必要としない。

インビトロで形質導入された内皮細胞を移植する方法も同様に本発明の主題であ る。インビトロで形質導入された内皮細胞は、血管再建手術において使用される 補てつ移植片（例えばダクロンやボアテックスなとの合成材料で作られた血管） を改善するのに特に有用である。例えば、生きた器官又は四肢を潅流させる疾患 のある動脈に置換するへく人工動脈移植片が往々にして用いられる。しかしなか ら現在入手可能な移植片は通常合成材料で作られており、数多く　。

の合併症を伴い、その中でも最悪のものは、高い率の再狭窄又は閉塞である。動 物実験は、移植片を移植前に自己由来の内皮細胞でライニングすることが移植片 の再狭窄とそれに付随する病的結果を減少させることはできるか、それを防止す ることはできない。

しかしながら、移植された移植片の状況下でその性能を改善するような形で本発 明の方法に従って内皮細胞を変更することが可能である。その例としては、管腔 内の凝塊形成を防ぐため、血栓崩壊剤の分泌又は発現、平滑筋の肥大による管腔 狭窄を防ぐだめの平滑筋増殖阻害因子の分泌及び、内皮細胞の増殖を刺激し移植 管腔の内皮細胞ライニングの程度又は持続時間を改善するための内皮細胞マイト シュン又はオートクリン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）因子の発現及び／又は分泌なと が含まれる。

類似の利用分野については、本発明の内皮細胞は同様に、弁の表面の血栓形成力 を低くすることによって塞栓形成の危険性を減少させるべく人工心臓弁の表面を 覆うのに使用することも可能である。

本発明の方法によって形質導入された内皮細胞又は形質導入された内皮細胞でラ イニングされた血管移植片は同様に、疾病の予防又は治療において役立つポリペ プチド又はタンパク質の構成的合成及び送達を提供するのにも利用できる。この ようにして、ポリペプチドは、人間の血流内に直接分泌される。これとは対照的 に、現在利用可能な方法には、望まれるポリペプチドの非経口投与が関与してい る。

さらに、分離されたポリペプチド（例えばインシュリン）の場合に一般に必要で あるように、固体に投与する前にポリペプチドを大量に（そして往々にして高い 費用をかけて）精製する必要は全く無い。本発明に従って変更された内皮細胞は 、通常産生される通りにポリペプチドホルモンを産生ずる。

遺伝的に工学処理された内皮細胞の使用のもう１つの利点は、特定の器官又は四 肢に対し治療的レベルの分泌産物の送達をターゲティングすることができるとい うことにある。例えば、インビトロで形質導入された内皮細胞でランニングのほ どこされた血管移植片を特定の１器官又は四肢の中に移植することが可能である ：又、特定の四肢、器官又は血管の内皮細胞をインビボで形質導入することも可 能である。形質導入されて内皮細胞の分泌産物は高濃度で潅流された組織へと送 達され、かくして標的となった解剖学的場所に対する望ましい効果を達成するこ とになる。この産物は次に、心臓への戻りの間に静脈循環内で非治療的レベルに まで希釈される。

本発明の送達システムのもつもう１つの重要な利点は、それが連続したシステム であることから、ホルモンポリペプチドの短かい半減期が制限となることはない という点にある。例えば、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）の半減期は約１９分であ り、副甲状腺ホルモンの半減期は約２１７２〜５分である。

図面の簡単な説明 図１は、野生型マウス白血病ウィルス（レトロウィルス）ゲノムの概略図である 。

図２は、本発明において有用な組換え型ゲノムを各々存するレトロウィルスベク ターの概略図である。図２ａは、ｐＬＪ　、図２ｂはｐＥｍ。

図２０はＭＦＧであり、図２ｄはα−５ＧＣである。

図３は、図２ａに示されたｐＬＪベクター及びヒト副甲状腺ホルモン遺伝子を用 いた組換え型レトロウィルスベクターの構成の概略図である。

図４は、低密度リポタンパクレセプタ（ＬＤＬＲ）を発現するレトロウィルスに 感染し、螢光係識付けされたＬＤＬの摂取について分析されたウシの大動脈内皮 細胞の写真を含んでいる。図版Ａ−位相差下の未感染のウシ大動脈内皮細胞、図 版Ｂ−螢光照明下の未感染ウシ大動脈内皮細胞；図版Ｃ−位相差下の感染したウ シ大動脈内皮細胞：図版り一螢光照明下の感染したウシ大動脈内皮細胞。

図５は、ベーターガラクトシダーゼを発現するレトロウィルスに感染し、インサ イチュ（原位置）組織化学染色を用いてその発現について分析されたウシ大動脈 内皮細胞の写真を含んでいる。図版Ａ−ベータガラクトシダーゼ活性について染 色された未感染のウシ大動脈内皮細胞：図版Ｂ−ベータガラクトシダーゼ活性に ついて染色された未感染のウシ大動脈内皮細胞。

図６は、遺伝的に変更された内皮細胞のイヌ体内への移植を示す絵画的図である 。

図７は、ｔＰＡ遺伝子の変更、変更を容易にするのに用いられたオリゴヌクレオ チド及び、図２０に描かれているベクター−ＭＦＧ内への変更ｔＰＡ遺伝子の挿 入の概略図である。

図８は、第■因子関連抗原の発現により識別された内皮細胞の培養の写真である 。

図９ａは、ｔＰＡを発現するレトロウィルスに感染したイヌの内皮細胞の写真で ある。ｔＰＡを発現する細胞内には暗い細胞質染色が見られる。図９ｂはｔＰＡ レトロウィルスに感染していない対照細胞の写真である。

図１Ｏは、ＭＦＧ−ｔＰＡ及びα−５ＧＣ−ｔＰＡ組換え壓レトロウィルスの内 皮細胞内への安定した組込みを示す細胞性ゲノミックＤＮＡのサザンプロットの オートラジオグラフの写真である。

図１１は、ＭＦＧ−ｔＰＡ及びα−５ＧＣ−ｔＰＡ組換え型レトロウィルスから のＲＮＡ発現を示す細胞性ＲＮＡのノーザンプロットのオートラジオグラフの写 真である。

図１２は、ｔＰＡを発現するべく遺伝的に増大させられた内皮細胞でのライニン グを受けた合成移植片のイヌ体内への移植後の効力を示すヒストグラムである。

１１Ｋ１３ａは、第■因子ポリペプチドのダイヤグラムである。図１３ｂは、レ トロウィルスベクターを生成するためさまざまな構成体内で使用される制限酵素 部位を示す第■因子ｃＤＮＡのダイヤグラムである。

図１３ｃは、垂直線として欠失領域が示された状態の、レトロウィルスベクター 内に挿入された第■因子ｃＤＮＡの欠失誘導体のダイヤグラムである。図＋３ｄ は、Ｈ４ｎｄＩ［Ｉ部位とＰｓｔ　Ｉ部位の間のＢドメイン欠失の拡大図である 。重鎮と軽鎖の接合部におけるヌクレオチド配列は、ラインの上に記されており 、相応するアミノ酸番号はラインの下に記されている。

図１４は、組立てられた最終レトロウィルスベクター、ＭＦＧ−第■因子の図で ある。

図１５は、ＭＦＧ−第■因子レトロウィルスの内皮細胞内への安定した取込みを 示す、細胞性ゲノミックＤＮＡのサザンプロットのオートラジオグラフの写真で ある。

図１６は、α−５ＧＣ−ＬａｃＺ組換え盟レトロウィルスの図である。

図１７ａは、α−５ＧＣ−ＬａｃＺレトロウィルスでインビボで形質導入された 動脈の低倍率写真である。図１７ｂは、同じものの高倍率写真である。図１７ｃ は、形質導入を受けていない動脈の１セグメントである。

図１８は、レトロウィルスベクターα−３ＧＣの地図である。

図１９は、レトロウィルスベクターＭＦＧの地図である。

発明の詳細な説明 問題の遺伝物質は、内皮細胞内に取り込まれ、結果として得られる工学処理され た内皮細胞内で発現させられた。記述された方法に従って内皮細胞内に取り込ま れる問題の遺伝物質は、問題のあらゆる選択されたＤＮＡ　（例えば問題の産物 をコードする遺伝子の全て又は一部分）又は問題の産物をコードするあらゆる選 択された遺伝子）又は問題のあらゆる選択されたＲＮＡであってよい。例えば、 これは、正常な内皮細胞内に存在しその中で発現されるＤＮＡ又はＲＮＡ　、内 皮細胞内で通常発生しないＤＮＡ又はＲＮＡ　；通常２−内皮細胞内に発生する もののその中で生物学的に有意なレベル（それがコードするタンパク質又はポリ ペプチドの正常な生理学的効果を生み出すのに充分なレベル）では発現されない ＤＮＡ又はＲＮＡ　、内皮細胞内に発生しかかる細胞内で発現されうるような形 で変更されているＤＮＡ又はＲＮＡ　；及び単独で又は何らかの組合せた形で内 皮細胞内で発現されるよう変更可能なあらゆるＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。

この問題の遺伝物質をここでは、「取込まれた遺伝物質」と呼ぶ。

本発明の内皮細胞は、取込まれた遺伝物質を発現する。例えば、本発明の内皮細 胞は、問題のポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝物質（問題の遺伝物 質）を発現する。本発明の内皮細胞は同様に、選択可能な標識をコードする遺伝 子をも内含し発現することができる。取込まれた遺伝物質を発現する内皮細胞を ここでは「形質導入された内皮細胞」と呼ぶ。

通常内皮細胞内に存在しこれによって発現されるＤＮＡである問題の遺伝物質は 、内皮細胞内に取り込まれることが可能で、その結果、内皮細胞は望まれるタン パク質、ポリペプチド又はＲＮＡを過剰産生ずることができることになる。

本書中に詳述するように、１つのホルモンをコードする遺伝物質が、組換え型ゲ ノムを有するウィルスを含む培地に内皮細胞を露呈することによって（すなわち これらの細胞を感染させることによって）、これらの細胞内に導入された。使用 した培地は、組換え型ウィルス産生細胞が増殖された培地を収穫することによっ て得られたウィルス上清であった。すなわち、１０％の子ウシ血清（Ｇ３）及び ペニシリン及びストレプトマイシンを伴うダルベツコの調整イーグル培地（ＤＭ Ｅ）内で集密的な密度まで組織培養にて産生細胞を増殖させた。新鮮な培地を付 加し、ひきつづいて（例えば約１２時間後）、培地を収穫した。集密的産生細胞 の１０ｃｍのプレートから約１０ｍ１の培地を収穫した。収穫した培地（又はウ ィルスストック）を０．４５ミクロンのミリポア・フィルタを通してろ過して離 脱した産生細胞を除去し、細胞を感染させるため直ちに使用した。或いは又これ は一７０’Ｃて保存されている。培地を内皮細胞（受容内皮細胞）亜集密的プレ ートから除去し、８ｍｃｇ／ｍｌのポリブレン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むウィル スストック（例、プレート１０ｃｍあたり５　ｍｌ）で迅速に交換した。その後 （例えば約１２時間後）、これを除去し新鮮培地と交換した。

感染性ウィルスの組換え型ゲノムは、内皮細胞内に取込まれている問題の遺伝物 質を含む。組換え型ゲノムは同様に、優性選択可能標識をコードする遺伝物質も 有することができる。通常生物学的に有意なレベルでは発現できないポリペプチ ドを発現する形質導入された内皮細胞及び任意には優性の選択可能な標識を、本 書で記述する要領で作製した。

１つのケースにおいて、組換え型ゲノムは、ヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ） をコードする遺伝物質を含んでいた。もう１つのケースでは、組換え型ゲノムは 同様に、優性の選択可能な標識をコードする遺伝子（例えば、細菌中ではネオマ イシン耐性を又哺乳動物細胞内ではＧ４１８耐性をコードする士遺伝子）をも含 んでいた。その結果、内皮細胞は形質導入を受けた・・・すなわら、問題の遺伝 物質（この場合、ｈＰＴＨをコードするＤＮＡ及び任意にはｎｅｏ遺伝子）は内 皮細胞内に安定した形で導入された。形質導入された内皮細胞は、コードされた ｈＰＴＨを単独で又はｎｅｏ耐性タンパク質に加えて発現し、その結果細胞は選 択可能な特性をもっことになる。

もう１つのケースでは、組換え型ゲノムは問題の遺伝物質（例えば、凝固性第■ 因子タンパク質又は組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ））のみを含み、優 性な選択可能標識をコードする遺伝子（例えば、ｎｅｏ遺伝子）を含んでいなか った。その結果、形質導入された内皮細胞は、第■因子タンパク質又はｔＰＡを 優性選択可能標識の無い状態で発現することになる。

上述のように、内皮細胞は、分泌産物（例えばヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＩ （Ｘ例！参照））、組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）（例５参照）及び ヒトの凝固性第■因子タンパク質（例６参照）に対しコードする遺伝子；膜レセ プタ（例えば低密度リポタンパクレセプタＣＬＤＬＲ））に対しコードする遺伝 子（例２参照；及び細胞間細菌性酵素（例えばベータガラクトシダーゼ））に対 しコードする遺伝子（例３参照）を用いて形質導入された。

内皮細胞の形質導入は、インビトロ又はインビボのいずれでも行なうことができ る。例えば、内皮細胞のインビボ形質導入は、特定の器官、四肢又は血管内に（ 例えば例８に記されているようにカテーテルを介して）組換え型レトロウィルス を部位特異的に投与することにより固体の体内に導入される組換え型レトロウィ ルスを用いて行なうことかできる。内皮細胞のインビボ形質導入はいくつかの利 点を有し、そのうちの１つは、形質導入を受けた内皮細胞を移植する方法が必要 で無いという点にある。インビトロで形質導入された内皮細胞は、培養血管から 切除された組織培養血管内でまず成長させられ、次に体内に導入又は移植される 。

インビトロで形質導入された内皮細胞は、いくつかの方法のうちの１つによって 被移植者の体内に導入できる。例えば、形質導入を受けた内皮細胞を人工血管の 管腔上に接種することができ、ここでこれらの細胞は血管の管腔を覆って集密性 に至るまで成長することになる。細胞は、天然血管の内股及び中膜に似ている充 分に組織立った構造である新生内膜と呼ばれるもののライニングを形成する（す なわち、平滑筋細胞のさらに深い層を伴う内皮細胞のカバリング）。このアプロ ーチの実施可能性は、自己由来のレトロウィルス形質導入を受けた内皮細胞が接 種された血管移植片をイヌの体内に移植した実験によって立証されている（例４ 参照）。

雑種の成人から収穫した外頚静脈を、２回の連続継代により１０〜１４日間イン ビトロで平板培養した内皮細胞の供給源として利用した。

各動物からの細胞を２つのアリコートに分割し、リポータ遺伝子、亜集密的密度 で小さな直径のダクロン移植片に接種し、細胞を収穫したイヌの体内に頚動脈問 直移植片として外科的に移植した：各々のイヌは、遺伝的に変更された細胞が接 種された移植片及び、擬似感染細胞が接種された対画性移植片を受けた。移植か ら５週間後に、移植片を収穫し分析した。

より詳細な特徴づけを可能にするべく、移植片の一部分の管腔表面から酵素的に 細胞を収穫した。細胞の一次培養を作成し、分析に先立ち約２〜３週間インビト ロで拡張させた。遺伝的に変更された内皮細胞を、サザン分析及びＩａｃＺ遺伝 子がコードするベクター発現されたベータガラクトシダーゼについての細胞化学 検定によって、この固体群の中で識別した。

移植片から収穫されインビトロで拡張された細胞の大部分（９５％未満）か、分 化された内皮機能を保持していた。しかしながら、ウィルス誘導ベータガラクト シダーゼを発現したか又はプロウィルス配列を含んでいた細胞の割合は、接種時 点で分析された培養に比べ２〜１０分の１に一貫して減少していた。この不一致 は一部分には、融着から又は間隙を通しての成長による内皮細胞を伴う移植片の 部分的再増殖によるものである。形質導入された細胞は少なくとも５週間移植片 の管腔上に存続し、形質導入された遺伝子は機能し続けた。

空間及び６膜空間といったような漿膜によりライニングされている体腔内に形質 導入された内皮細胞を導入することも可能である。この場合、内皮細胞は漿膜ラ イニングを接種し、腔内に産物を分泌する。このときこの産物はリンパ系を介し て吸収される。

内皮細胞の分離 を椎動物の数多くの種の毛細血管及び大きな血管（例えば動脈、静脈）からの内 皮細胞の分離及び維持は、文献中に充分に記述されてきている。例えば、ＭｃＧ ｕｉｒｅ及び０ｒｋｉｎは小動物の大きい血管からの内皮細胞を培養し継代する だめの単純な手順を記述している。

ＭｃＧｕｉｒｅ、　Ｒ，Ｗ及びＲ，Ｗ、　０ｒｋｉｎ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ ｕｅｓ、　５：　５４６−５５４（１９８７）。

往々にして子ウシの大動脈が内皮細胞の供給源である。大きな動脈からの内皮細 胞の分離のための代表的プロトコルについて以下で説明する。収穫されたばかり の大動脈の切片を、３７°Ｃで１５〜２０分間コラゲナーゼを含む溶液中で（例 、０．５ｍｇ　／ｍｌ）　、無菌状態に置く。

次に大動脈を２回培地（例えばＲＰＭＩ　１６４０）で２回洗い流し、管腔の内 皮細胞薄膜を、Ｂｏｏｙｓｅ　ｅｔａｌの方法に従って穏やかな撹拌により完全 培地（１５ｍｍの１（ｅｐｅｓ、ｐＨ７，４、ペニシリン／ストレプトマイシン 及び２０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ）内で除去する。Ｂｏｏｙｓｅ、　Ｆ 。

Ｍ　ｅｔａｌ、、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｄｉａｔｈ、Ｈａｅａ＋ｏｒｓｈ、　 ３４二　８２５−８３９（１９７５）　ｏ　細胞パッチは、組織培養フラスコの 完全培地内に移される。

細胞は、プレートを分割し場合によってこれをカバーするニブレートが集密的で ある場合、細胞は標準的な組織培養技術を用いて継代されうる。培養の純度は、 内皮細胞によって特異的に取り込まれる蛍光標識づけされたアセチル化ＬＰＬの 摂取によって評価される。

培養が純粋でない場合（すなわち平滑筋細胞又は線維芽細胞といったような内皮 細胞以外の細胞で汚染されている場合）、内皮細胞は、希釈を制限することによ りクローニングされ、純粋培養を生み出すため拡張させられる。内皮細胞の寿命 は培養内では制限されているが、解剖学的供給源及び供与動物に応じて著しく変 化する。ウシ大動脈内皮細胞は、少なくとも１５〜２０継代の間培養内に維持さ れた。

イヌ内皮細胞は、釘類静脈の外植されたセグメントから分離することができ、ヒ ト細胞は屓（さい）静脈又は伏在静脈のいずれかのセグメントから分離できる。

ヒト内皮細胞の純粋培養を再現可能な形で生み出すもののイヌの静脈からの内皮 細胞及び平滑筋の混合培養を産生ずることのできるコラゲナーゼ処理が関与する 公表された手順により、全ての細胞を血管壁から自由にすることができる。

（Ｈｕｎｔｅｒ、　Ｔ、Ｊ、　ｅｔ、ａｌ、、　Ｔｒａｍｓ　Ａｍ、　Ｓｏｃ、 　Ａｒｔｉｆ　Ｉｎｔｅｒｎ　Ｏｒｇａｎｓ。

２９：１７７１８２（１９８３）；　Ｗａｔｋｉｎｓ、　Ｍ、Ｔ、ｅｔａｌ、、 　Ｊ、　Ｓｕｒｇ、　Ｒｅｓ、、　３６：５８８−５９６、１９８４）。平滑筋 細胞の過剰成長に対する可能性を制限するため、イヌの内皮細胞を、平滑筋マイ トシュンが低い培地補足物である血漿由来の血清の中で培養することができる。

全ての培養は、訪問特異的アクチンアイソフオームを認識するモノクローナル抗 体で平滑筋細胞を識別し、第■因子関連抗原（Ｗａｇｎｅｒ、　Ｄ、Ｄ、、　ｅ ｔａｌ、、　Ｊ、Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．９５；３５５−３６０．１９８２）を認識 する抗血清ならびに上述のような標識づけされたアセチル化ＬＤＬで内皮細胞を 識別する免疫組織化学手順によって監視することができる。

レトロウィルスベクター レトロウィルスはＲＮＡウィルスである；すなわちウィルスゲノムはＲＮＡであ る。しかしながらこのゲノミックＲＮＡは、形質導入された細胞の染色体ＤＮＡ の中に安定した形で効率良く組み込まれるＤＮＡコピーの中に逆転写される。こ の安定した形で組込まれたＤＮＡコピーはプロウィルスと呼ばれ、その他のあら ゆる遺伝子と同様、娘細胞によって受け継がれる。図１に示されているように、 野生型レトロウィルスゲノム及びプロウィルスＤＮＡは３つの遺伝子、すなわち ２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列によりフランキングされたーｇａｇ、　ｐｏｌ 及びｅｎｖを有する。ｇａｇ遺伝子は内部構造（クヌレオカブシド）タンパク質 をコードする；ｐ０１遺伝子はＲＮＡ誘導ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を コードする；又ｅｎｖ遺伝子は、ウィルス性外被糖タンパク質をコードする。５ ′及び３′のＬＴＲは、ウィルス粒子ＲＮＡの転写及びポリアデニル化を促進す るのに役立つ。

５　’　ＬＴＲに隣接して存在するのは、ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマ結 合部位）及び粒子内へのウィルス性ＲＮＡの効果的な色層（Ｐｓ　ｉ部ｏｆ　ｔ ｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　（国立 科学アカデミ−会報）ｕ、ｓ、Ａ、ａ＋＋６３４９−６ａ５３ｃ１９ｓ４）。

色層（又は感染性ウィルス粒子内へのレトロウィルスＲＮＡのパッケージ“／グ ）のために必要な配列かウィルスゲノムから欠如している場合、結果は、ゲノミ ックＲＮＡの色層を防止するシス作用性欠損である。しかしながら、結果として 得られる突然変異体は、なおも全てのウィルス粒子タンパク質の合成を誘導する ことができる。

Ｍｕｌｌｉｇａｎ及び共同研究者は、これらのＰｓｉ配列が欠失させられたレト ロウィルスゲノムならびに、染色体内に安定した形で組み込まれた突然変異体ゲ ノムを含む細胞系統について記述している。Ｍｕｌｌｉｇａｎ。

Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｕｃｅｓ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８１：６３４９ −６３５３（１９８４）　ｏこれらの刊行物の教示は、本書中に参考として内含 されている。

Ｍｕｌｌｉｇａｎ及び共同研究者が記述しているように、Ｐｓｉ　２細胞系統は 、以下のような要領で構築された：すなわち、ウィルス粒子内へのウィルス性Ｒ ＮＡの色層に関与する領域又はゲノムが欠失している（図１のＰｓｉ配列）よう な突然変異体マウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）ゲノムを構築した。このゲノム をＤＮＡ同時トランスフェクションによりＮ１）１３Ｔ３細胞内に安定した形で 導入し、色層のために使用されるウィルスタンパク質の全てを産生じそれでも非 感染性粒子を出芽した安定したトランスフェクシントを分離した。ＭｕＬＶの突 然変異体を、Ｐｒ６５ｇａｇのためのコーティング配列を開始するＡＵＧと推定 のｅｎｖ　ｍＲＮＡ５′スプライス部位の間の感染性プロウィルスＤＮＡクロー ンから３５１個のヌクレオチドを欠失させることによって構築した。欠失は、Ｂ ａｔ　Ｉ部位からＰａｔ　Ｉ部位まで行ない、ＨｉｎｄＩ［ｒ部位を欠失箇所で 生成した。

ｐＭＯＶ、　（ｐＭＯＶＰｓｉ）は以下のように構築された：すなわち、３つの 精製されたＤＮＡフラグメントを合わせて連結させてｐＭＯＶＰｓｉを構築した 。第１のものは、ｐＭＯＶＰｓｉｔをＸｈｏ　Ｉで完全になるまで消化させその 後ＥｃｏＲＩで部分消化することによって得られた。Ｃｈｕｍｏ−Ｋｏｖ、　［ 。

ｅｔａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（ウィルス学ジャー ナル）　、４２：１０８８−＋０９８（１９８２）。ＭｕＬＶ内の２．ＯｕのＸ ｈｏ　Ｉ部位から、全てｐＢＲ３２２のものである３　’　ＬＴＲ，３’マウス フランキング配列を通って延びＥｃｏＲＩＩ部位て終わるフラグメントを、電気 泳動分離の後アガロースゲルから精製した。Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、　Ｂ及びＰ 、Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎ ａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　ＵＳＡ、　７６１：６１５ −６１９（１９７９）　、第２のフラグメントは、ＢａＩで完全になるまでｐＭ ＯＶＰｓ　ｉ　ｔを消化しその後ｐＢＲ３２２内のＢａｔ　Ｉ部位から５′マウ スフランキング配列及び５’ＬＴＲを通ってＭｕＬＶの０．７ｕにあるＢａ１１ 部位まで延びるフラグメントを精製することによって得られた。その後、Ｈｉｎ ｄＩＩＩリンカ−（共同研究）をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いてこのフラグメン トに平滑連結させ、余剰のＨｉｎｄＩＩ［及びＥｃｏＲＩでフラグメントを消化 した。ＬＴＲ含有フジグメントを電気泳動分離の後アガロースゲルから精製した 。最終連ｇａｎ、　Ｒ，Ｃ，及びＰ、Ｂｅｒｇ、　５ｃｉｅｕｃｅ、　２０９： １４２２−１４２７（１９８０）　。Ｉ）ＳＶ２−ｇａｇ／Ｉ）ＯｌをＸｈｏ　 Ｉ及びＨｉｎｄｌｌＩを用いて完全になるまで消化させ、電気兆動分離の後アガ ロースゲルから、ｔ（ｉｎｄＩＩＩ部位（ＭｕＬＶの１．Ｏｕでフラグメントを 精製した。これら３つのＤＮＡフラグメントを次に等モル量で合計ＤＮＡ　１１ 度５０μｇ／ｍｌで、リガーゼ緩衝液（５０ｍＭのトリス−Ｈａｔ　（ｐＨ７， ８）　、１０ｍＭのＭｇＣ１＊　、２０ｍＭのジチオトレイトール、１．０ｍＭ のＡＴＰ　、５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）中で混合し、１８時間１５ °ＣでＴ４　ＤＮＡリガーゼでインキュベートした。Ｅ、　Ｃｏ１１（大腸菌） ＨＢＩＯＩを連結されたＤＮＡでトランスフェクションさせ、アンピシリン耐性 トランスフェクシントを得た。一定数の形質転換体から得たプラスミドを、適切 な制限エンドヌクレアーゼでの消化及びアガロースゲルを通しての電気泳動に、 より望まれる構造についてスクリーニングした。Ｄａｕｉｓ、　Ｒ，Ｗ　ｅｔａ ｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（酵素学方法’）　６ ５；４０４−４１１（１９８０）。

染色体内に安定した形で組み込まれたＰｓｉ突然変異体を含む細胞系統を、ＸＧ ＰＲＴ発現が可能なＳＶ４０ハイブリッドベクターであるｐＳＶ２ｇｐｔどｐＭ ＯＶ−Ｐｓ　ｉの同時トランスフェクションによって作製した。Ｍｕｌｌｉｇａ ｎ。

Ｒ，Ｃ，及びＰ、Ｂｅｒｇ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２０９：４２２−１４２７（ １９８０）。このようにして得られたｇｐｔ＋コロニーからの細胞をクローニン グし、Ｐｓｉ−１゜Ｐｓド２及びＰｓｉ−３という３つの系統の形で確立した。

Ｍｕｌｌｉｇａｎ及び共同研究者によって記述されたＰｓｉ２細胞系統は、環境 栄養性（エコトロピック）モロニーマウス白血病ウィルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）ク ローンであるｐＭＯＶ−Ｐｓ　ｉでＮＩＨ３Ｔ３内皮細胞をトランスフェクショ ンすることによって作られた。ｐＭＯＶＰｓ　ｉは、全てのウィルス性遺伝子産 物を発現するが、ウィルスゲノムの色層に必要なものであるＰｓｉ配列か欠如し ている。ｐＭＯＶ−Ｐｓ　ｉ−は、マウス（及び密に関係するげっ歯頚）細胞上 にのみ存在するレセプタを認識する環境栄養性ウィルス外被糖タンパク質を発現 する。

もう１つの細胞系統は、Ｐｓｉ−２様のパッケージング細胞系統であるＰｓｉａ ｍ系統である。これらのＰｓｉ−ａｍ細胞系統は、変更されたｐＭＯＶ−Ｐｓｉ −ゲノムを含んでおり、この中では環境栄養性外被糖タンパク質は、両栄養性ウ ィルス４０７ＯＡから由来するエンベロープ配列で置換を伴う組換え型ウィルス の産生のために役立つ。Ｐｓｉ　ａｍ細胞系統を作製するのに用いられるレトロ ウィルスは、非常に広い哺乳動物宿主域（両栄養性宿主域）を有し、ヒトの細胞 を感染させるのに用いることができる。組換え型ゲノムがＰｓｉパッケージング 配列を有する場合、Ｐｓｉ−ａｍ細胞系統は、感染性レトロウィルス粒子内に組 換え型レトロウィルスゲノムをパッケージングすることができる。Ｃｏｎｅ。

その池の２つのパッケージング細胞系統は、ＰｓｉＣＲＩＰ及びＰｓｉＣＲＥと して知られている。これらの細胞系統は、それぞれ両栄養性及び環境栄養性の宿 主域をもつ高い力価の組換え型レトロウィルスを安定した形で産生ずるクローン を分離するのに存用であることが立証されている。これらの細胞系統については 、Ｄａｎｏｓ、　０．及びＲ，Ｃ。

細書第０７／　２３９．５４５の中に記述されている。この参考文献及び特許出 願明細書の教示は本書に参考として内含される。ＰｓｉＣＲＩＰ及びＰｓｉＣＲ Ｅは、ブダペスト条約の条文に基づきそれぞれＣＲＬ９８０８及びＣＲＬ９８０ ７という受入番号でＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｊｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ ｃｔｉｏｎ。

Ｒｏｃｋｕｉｌｌｅ、　ＭＤに寄託されている。

野生型レトロウィルスゲノムは、Ｃｏｎｅ及びＭｕｌｌｉｇａｎにより、細胞内 に新しい遺伝子を導入することのできるベクターとして使用するために変更され た。図２に示されているように、ｇａｇ、　ｐｏｌ及び工立つ。組換え型ゲノム の一部としてととまるレトロウィルス配列には１．ＴＲｓ、　ｔＲＮＡ結合部位 及びＰｓｉパッケージング部位が含まれる。

Ｃｅｐｋｏ、　Ｃｅｔａｌ、、　Ｃｅ１１．３７：１０５３−１０６２（１９８ ４）。

本発明の形質導入された内皮細胞を産出する上で用いられた付加的なベクター構 成か図２に表わされており、以下でこれについて記述する。

ｐ　Ｌ　Ｊ、このベクターの特性は、Ｋｏｒｍａｎ、　Ａ、Ｊ、ｅｔａｌ、、　 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏ ｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８４；２１５０（１９８７）中に記述さ れている。このベクターは、問題の遺伝子と±遺伝子などの優性選択可能標識と いう２つの遺伝子を発現することができる。

問題の遺伝子は、直接配位で、５’ＬＴＲに対してちょうと遠位のＢａｍＨＩ／ Ｓｍａ　１／Ｓａｌ　Ｉクローニング部位内へクローニングされ、一方ｎｅｏ遺 伝子は、クローニング部位よりさらに３′のところである（クローニング部位か ら３′のどころにある）内部プロモータ（ＳＶ４０からの）に対し遠位に置かれ ている。円、Ｊからの転写は２つの部位で開始さ才する：すなわち１）問題の遺 伝子の発現を担うものである５’ＬＴＲ及び２）ｎｅｏ遺伝子の発現を担う内部 ＳＶ４０プロモータである。ｐＬＪの構造は図２ａに示されている。

ベクターｐ＋、、＋は図２ａに示されている。ｐＬＪ内では、問題の遺伝物質は ちょつと５’ＬＴＲの後に挿入される。この遺伝物質の発現はびｅｎｖに対する コーティング配列全体は、発現された唯一の遺伝子である問題の遺伝子で置換さ れている。ｐＥｍベクターの構成要素について以下に記述する。５′フランキン グ配列、つまり５’ＬＴＲ及リンカ−と連結されており、ベクター内に存在する ＢａｍＨＩクローニング部位のもう１つの半分を形成する。ｐＢＲ３２２の旧ｎ ｄＩ［［／ＥｃｏＲＩはプラスミドバックボーンを形成する。このベクターは、 モロニーマウス白血病ウィルスの１株からのクローニングされた配列に由来する 、骨髄増殖性間膜ウィルスに由来する配列から、類似のベクターが構築された。

ｐＥｍの構造は図２ｂに示されている。

選択可能標識の無いベクターも又、問題の遺伝物質で内皮細胞を形質導入するの に用いることができる。このようなベクターは基本的に、このような標識が中に 存在する前述のベクターの単純化である。ベクターｐＥｍは図２ｂに示されてい る：示されているとおり、このベクターの主構成要素は５′と３　’　ＬＴＲ、 及び２つのＬＴＲの間に挿入された問題の遺伝物質である。

履Ｋ ＭＦＧベクター（ＡＴＣＣ受入番号６８７５０）にｐＥｍベクターに類似してい るものの、パッケージング細胞系統内の組換え型ゲノムの被包を増大させるため のＭＭＩ、■からのｇａｇ配列の１０３８の塩基対、ならびにスプライスアクセ プタ配列及び転写スタートを含むＭＯＶ−９に由来する３５０の塩基対を内含し ている。Ｎｅｏ　Ｊ及びＢａｍＨＩを含む１８塩基対のオリゴヌクレオチドかＭ ＯＶ−９配列に続き、相容性ある部位をもつ遺伝子の適当な挿入を可能にしてい る。ＭＭＬＶＬＴＲは転写を制御し７、結果として得られるｍＲＮＡは、未変性 ｇａｇ　ｈランスクリプトの真正５′未翻訳領域とそのすぐ後に続く挿入された 遺伝子のオープンリーディングフレームを含む。ＭＰＧの構造は、図２０に表わ されている。１ｉｌＰＧのさらに詳細な地図が、図１９に提供されている。

ＭＦＧは、Ｘｈｏ　Ｉ／Ｂａｍ）ＩＩ　Ｈ４ヒストンプロモータフラグメントに 対して半−ＧＡＧレトロウィルスベクター（半−ＧＡＧはＢｅｎｄｅｒ、　ｅｔ ａｌ、。

Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１：１６３９−１６４６に記述されている）のＸｈｏ　 Ｉ／Ｎｄｅ　Ｉを含む５’ＬＴＲを連結させることにより構築された。レトロウ ィルスベクターｐＥＭＢをＮｄｅ　Ｉ及びＢａｍｔ（Ｉで消化させ、適切な配位 で２つのＬＴＲを含み又ベクターのウィルス部分内にＨ４フラグメントをも含む 中間レトロウィルスベクターを産生ずるべくＨ４フラグメントにすでに連結され た半ＧＡＧフラグメントに対して、３’ＬＴＲ含有フラグメントを連結させた。

この中間ベクターを次にＮｄｅ　Ｉでの消化により線形化し、ベクターの１）８ ８２２部分内のＮｄｅ　Ｉ部位をポリメラーゼで充て分割させ、両方のＬＴＲと ｐＢＲ３２２配列）を含む大きなフラグメントを精製した。

Ｘｈｏ　ＩとＢａｍＨＩを有しかつ ＣＴＡＧＡＣＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＧ という配列も有するリンカ−を合成し、図２０及び１９の中に示されているよう な環状ベクターＭＦＧを形成するべく　（Ｎｄｅ　Ｉエツジの隣りにスプライス アクセプタ部位を含むＪｐＭＯＶ９がらのＮｄｅ　Ｉ／Ｘｂａ　Ｉフラグメント と透明化された中間ベクター上のＢａｍＨＩ部位の両方に対し連結させた。

王並勉 αＳＧＣベクター（ＡＴＣＣ受入番号６８７５５）は、ｔＰＡ遺伝子の発現を調 節するためのα−グロビン遺伝子からの転写プロモータ配列を利用する。プロモ ータ要素を含む６００の塩基対フラグメントは、付加的に転写開始のための配列 及び真正α−グロビンｍＲＮＡの５′未翻訳領域を含んでいる。サイトメガロウ ィルスからの転写エンハンサ−を含む３６０塩基対フラグメントがα−グロビン プロモータに先行し、この要素からの転写を強化するのに用いられる。付加的に 、ＭＭＬＶエンハンサは３’ＬＴＲから欠失させられる。この欠失は感染時点で ５′ＬＴＲに転移させられ、基本的に要素の転写活性化活性を失活させる。

α−５ＧＣの構造は図２ｄに示されている。α−５ＧＣのさらに詳しい記述は図 １８に提供されている。

内皮細胞内への遺伝物質の導入及び遺伝物質の発現の評価パッケージング細胞系 統によって産生された組換え製画栄養性レトロウィルスを、内皮細胞の感染に使 用する。上述のとおり、両栄養性レトロウィルスの組換え型ゲノムはさまざまな 構成要素を含みうるが、一般には２つのＬＴＲと、ｇａｇの代わりとしての第２ のプロモータ配列であるｐａｌ及びｅｎｖ配列で構成されている。場合によって は、選択可能標識をコードする遺伝子（例えばｎｅｏ）も含まれている。

問題の遺伝物質を内皮細胞内に導入するのに用いるべきウィルスストックには、 上述のように１ミルあたり８マイクログラム（ｍｃｇ／ｍｌ）のポリブレン（Ａ ｌｄｒｉｃｈ）が補足され、これが内皮細胞の培養へ付加される。ウィルスの力 価が高い場合（例えば約１０＠Ｃｆｕ／ｍｌ）、はぼ全ての内皮細胞が感染を受 けることになり、いかなる選択（例えば組換え型ゲノムを含むベクターが中に導 入された内皮細胞の選択）も必要とされない。力価が非常に低い場合、ｎｅｏな との選択可能標識をもつレトロウィルスベクターを用いることが必要である。

選択可能標識が用いられる場合、ウィルスに対する露呈の後細胞は集密性に達す るまで成長させられ選択培地（例えば抗生物質Ｇ４１８を含む培地）の中に分割 される。

ｎｅｏ遺伝子は、細菌内でネオマイシン耐性を又晴れ動物細胞内で抗生物質６４ １８耐性をコードするトランスポゾンＴｎ５に由来する細菌性遺伝子である。、 −のｌ１ｅＯ遺伝そ（」、優牲選択可能標識とし−Ｃ作用する：ｆ＠乳細胞中の その存在は細胞を、−・殻１：、細胞の死活をひき起こす抗生物質であるＧ４１ ８の存在丁て成長す５５細胞へと変換する。その結果、唾乳動物細胞内でのこｇ ）遺伝子の存在は、Ｇ４１８をなむ培地内で細胞を培養することによって決定す ることができる。１丁１：’）組換ズ、型ゲノムをイじヒる組換え望１−・ト１ ′ｌＩウィルスを、ｎｅ（＋ウィルスと呼ぶ。

ｎｅｏ遺伝′：Ｆ−をも−）組換え型レトロウィルスベクターはクローニー、ン ツｙ゛部位も存している。その結果、問題の遺伝物質をベクタ・−内に導入（７ １、ｎｅｏ遺伝子と共に内皮細胞内に取り込ませ、組換え型シ・トリウィルスで の形質導入を受（］た内皮細胞（組込：表れた遺伝物質せ有する内皮細胞と呼ぶ ）によ−）て発現さゼる１丁どか可能となる。

し）・ロウイル７、ベクター＝を用いて、内皮細胞内のほぼあらゆる問題の遺伝 子を発現することか可能であるはずである。３つの異なるクラスのタンパク質を コードする遺伝子を発現するレトロウィルス／ペクタ−か横築されてきた：すな わち分泌されたホルモ：ノ又はポリペプチド（例えばｈＰＴＨ，ｔＰＡ又は第■ 因子）、膜レセプタ（ＬＤＬ。

ｔ、Ｄ　１．、Ｒ膜レセプタ）及び細胞間酵素（ベーターガラクトシダーセ）で ある。内皮細胞内に取込まれたときの組換え型レトロウィルスベクターの効果的 な発現が立証されてきており、例中に詳述されている。

その他のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝物質の導入 その他のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子も同様に、適切なレト ロウィルスベクターを用いて内皮細胞内に導入することが可能である。例えば、 ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする遺伝子、凝固第■因子をコードする遺 伝子又はインシュリンをコードする遺伝子を、内皮細胞内に導入することができ る。このような遺伝子は、単独で又はｎｅｏ遺伝子といった選択可能標識と組合 わせた形て内皮細胞内に導入されうる。

これらの遺伝子ならびにその他の遺伝子は、ｈＰＴＨ遺伝子について上で記述し たのと同じ要領て内皮細胞内に導入させることができ、結果として得られた形質 導込された内皮細胞を体内の適切な部位内（−移植するかかかる部位」−に塗布 することが可能である。

内皮細胞を遺伝的に処理するか又は変更するためにはｌ／トロウィルス以外の賦 形剤を用いることも可能である。問題の遺伝子情報は、内皮細胞内て問題の遺伝 物質を発現できるあらゆるウィルスを用いて内皮細胞内に導入されうる。例えば ＳＶ４０、ヘルペスウィルス、アデノウィルス及びヒ）−ｆＬ頭頭巾ウィルスど をこの目的で使用することかできる。

被移植細胞内に安定した形で取り込まれないもののエビソーム的（二発現される （被移植細胞ゲノムから区別された又は分離した状態にととまる）ような形で、 問題の遺伝物質を内皮細胞内に導入する二とも同様に可能である。

さらに、問題の遺伝物質を内皮細胞内に導入するには、化学的又は物理的手段を 利用することができる。化学的手段の一例としては一般に用いられているリン酸 カルシウムトランスフェクション手順かあり、物理的手段の一例としては問題の 遺伝物質の細胞内への進入を可能にする電流に対し細胞を露呈する電気泳動法か ある。

取込まれた遺伝物質を有する内皮細胞の利用重症の疾病状態の多くに、生命器官 に供給を行なう動脈の狭窄又は閉塞が関与している。このような疾病状態に最も 一般的に関わっている病理的メカニズムは、アテローム性動脈硬化症である。例 として挙げられるのは、冠状動脈疾患に起因する狭心症及び心筋梗塞：血管疾患 に起因する一過性脳虚血発作及び卒中；腎動脈狭窄に起因する腎血管高血圧症、 究極的には腎不全；及び末梢動脈の血管疾患によってひき起こされ最も重症の場 合には切断という結果を招きつる下肢の跋行である。アテローム性動脈硬化疾病 巣に対する疾病素因を個体に与える作用因子（例えば高血圧、喫煙が除去される のでないかぎり、これらの疾病状態の自然な成行きは通常アテローム性動脈硬化 疾病巣の進行であり、結果として永久的損傷又は死を招く。

進行したアテローム性動脈硬化症に対する、受入られ広く用いられている治療的 アプローチは、主要な狭窄又は閉塞の部位を、ダクロンやボアテックスといった 合成材料製の人工血管を用いてバイパスすることである。毎年３５００００以上 の血管移植片が移植されている。

このアプローチがもつ１つの主要な問題点は、人工血管がきわめて血栓形成性が 高く（凝塊を発達させる傾向をもつ）、このことが非常に高い再狭窄率を導いて いる。自己由来の内皮細胞を人工血管の管腔に接種することによってこの問題を 軽減することが可能であった。内皮細胞でライニングされた移植片の血栓形成性 はさらに低いものと推定される。変更された内皮細胞か特に育用となるのは、こ のような背景の下においてである。

内皮細胞は、それをライニングした補てつ用移植片という状況下でのその性能を 改善するべく本発明の方法に従って遺伝的に変更することができる。内皮細胞で ライニングされた補てつ用移植片を用いるための既存のプロトコルは、いくつか の重大なテクノロジー上の問題点によって複雑なものとなっているが、これらの 問題点の大部分は遺伝的に処理された内皮細胞の利用によって克服できるもので ある。

内皮化された移植片に伴う１つの問題点は、人工血管の管腔が補てつの壁と管腔 表面の間の平滑筋細胞の増殖のために漸進的に狭くなることにある。これを防止 する１つの方法は、平滑筋細胞の成長を抑制する産物を分泌する遺伝子を内皮細 胞内に導入することである。近年になって、開業細胞及び／又は上皮細胞の増殖 を制御する数多くのタイプのオートクリン：パラクリン成長因子が識別され、そ の遺伝子がクローニングされてきた。このような遺伝子は、本発明の方法を用い て内皮細胞内に導入することができる。結果として得られる形質導入された内皮 細胞は、細胞成長阻害因子を産生ずる。

内皮化された移植片プロトコルに伴うもう１つの技術的問題点は、補てつ用移植 片に対する内皮細胞の結合（平板培養）効率が比較的低いということにある。こ れを改善するためのこれまでの試みは、移植片表面の組成を変更することに向け られてきており、その成功は限りあるものであった。本発明の方法を用いると、 膜レセプタをコードする遺伝子を内皮細胞内に導入することが可能である。この とき人工血管の管腔をレセプタのためのリガンドでコーティングすることができ 、かくして膜レセプタ／リガンドの相互作用を通して管腔表面に対する内皮細胞 の結合は容易なものとなる。

本発明の遺伝的に処理された内皮細胞は、内皮細胞でライニングされた補てっ用 移植片の血栓形成性を低下させるのに用いることができる。凝塊形成のメカニズ ムは、血小板の付着とそれに続くフィブリン（線維素）の沈着及び凝塊の伝播で あると考えられている。

これは、（組織プラスミノーゲン活性化剤（ＴＰＡ）又はストレプトキナーゼと いった凝塊を溶解する作用因子などの）血栓形成作用因子を分泌する遺伝的に処 理された内皮細胞を移植片に接種することによって最小限にするかまたは場合に よっては削除することができる。

四肢又は器官に産物を送達するための変更内皮細胞の利用本発明は同様に、補て つを内含する動脈によって潅流された四肢又は器官にとって恩恵のある因子を分 泌する遺伝子を内皮細胞内に導入するために使用することもできる。例えば、一 般的な臨床上の問題点は人工血管の部位に対し遠位に小さい血管の広範な狭窄が 存在することである。これは、真性糖尿病に付随する血管疾患の特徴である。移 植片を用いたさらに大きい血管の再生は、患部である四肢又は器官に対する潅流 の不完全な再構成を導く。

危険にさらされた器官又は四肢に対する血管流を促進する１つの方法は、輸入背 金てを最大限に拡張させることである。経口又は非経口投与の薬剤でこれを行な おうとする試みは、はとんど治療的利益をもたらさず、しかも数多くの全身性副 作用が付随していた。これは、一部には、血管拡張剤が適切な組織にターゲツテ ィングされていないという事実によってひき起こされたものである。心房性ｎａ ｔｕｒｅｔｉｃ因子といった効力ある血管拡張剤を分泌するべく処理された内皮 細胞が、１つの代替的アプローチである。当該出願においては、患部である器官 又は四肢の近くの形質導入された内皮細胞をインビボ形質導入により移植又は生 成することができ、かくして、患部器官又は四肢はきわめて高い濃度の血管拡張 剤を含む動脈血での潅流を受けることになる。その結果、全体的な血管潅流は増 大する。しかしながら血管拡張剤は心臓に戻った時点で非薬学的レベルにまで希 釈され、従って全身性の非選択的な手法により投与されたときに起こる血管拡張 剤の多くの全身性副作用か未然に防かれることになる。

送達システムとしての変更内皮細胞の利用本発明は、生物学的に意義ある量では 内皮細胞内で通常再生されない選択されたポリペプチド及びタンパク質といった 選択された１つのタンパク質又はポリペプチドを産生ずるような形で内皮細胞を 遺伝的に処理し、これらを体の血流又はその他の部域（例えば中枢神経系）内に 分泌することを可能にする。このようにして形成された内皮細胞は、必要とされ る物質の（注射、輸液などによる）定期的投与を必要とする現在の養生法に置き 換わる連続した薬剤送達システムとして役立つことができる。

例えば、これは、現在のところ膵臓から分離され大量に精製され次にインシュリ ン再生又は利用が損なわれた人体の内部へと注入されなくてはならないインシュ リンの連続的送達を提供するのに使用することかできる。このようにして、イン シュリンを連続的薬剤送達システムを介して体内に導入でき、その結果日々のイ ンシュリン注射の必要性は全くなくなる。

遺伝的に処理された内皮細胞は同様に、凝固因子の産生のためにも利用できる。

血友病患者には、凝固に関与する第■因子と呼ばれるタンパク質が欠如している 。第■因子は現在注射によって投与されている。しかしながら、第■因子をコー ドする遺伝子をもつ形質導入された内皮細胞は、インビトロで第■因子を産生し 送達することができる。

内皮細胞内への問題の遺伝物質の取り込みは、遺伝性疾患の治療及び後天的疾患 の治療において特に価値あるものでありうる。遺伝性疾患の場合、このアプロー チは、遺伝的に変更された内皮細胞及び代謝シンクとして使用されうるその他の 細胞を提供するのに利用される。すなわちこのような内皮細胞は、患者体内に高 レベルで蓄積された潜在的に毒性のある物質を減成させるのに役立つ。例えば、 アデノシンデアミナーゼをコードする遺伝子を発現する形質導入された内皮細胞 を、有毒なプリンヌクレオシドの蓄積という結果をもたらす酵素アデノシンデア ミナーゼの欠損によってひき起こされた重症の遺伝形態の複合型免疫欠損を治療 するのに用いることかできる。本発明の内皮細胞は同様に、体が通常産生ずる産 物（例えば酵素又はホルモン）が産生されないか又は不充分な量しか作られない ような遺伝病の治療にも使用できる。ここでは、欠如しているか又は適切に産生 されない物質をコードする遺伝子で形質導入された内皮細胞を、この物質を充分 な量産生するために用いることができる。

例えば、遺伝型の気腫において欠如しているタンパク質つまり欠損タンパク質で あるアルファーｌアニドリブシンを産生ずるのにこれを用いることができる。

遺伝的に処理された内皮細胞（すなわち問題の遺伝物質で形質導入された内皮細 胞）の使用を通して治療を提供することのできる後天的疾患は数多く存在する。

例えば、慢性疾患に一般に存在し往々にして慢性腎不全を伴う貧血症（例えば血 液透析患者における）を治療するのに、このような細胞を用いることができる。

この場合、エリスロポイエチンをコードする遺伝子を中に取り込んでいる内皮細 胞は、エリスロボイチンを分泌しかくして赤血球形成（すなわち赤血球の産生） を増大させるべく骨髄を刺激することにより貧血症を補正する。

本発明の形質導入された内皮細胞は同様に、血栓の形成を防止する活性化剤とし て低い全身用量の組織プラスミノーゲン活性化剤を投与するのにも使用すること かできる。この場合、ｔＰＡをコードする遺伝物質を取り込んだ内皮細胞は、血 栓形成の予防が望まれる患者の体内での凝縮を阻害することになる。これは例え ば、冠状動脈疾患、脳血管疾患、末梢血管閉塞性疾患、肺塞栓症などにみられる 静脈（例えば、表在性）血栓症又は深静脈血栓症などの一般的障害に対する予防 として役に立つだろう。カルシトニンをコードするＤＮＡを含む内皮細胞は、骨 の代謝の進行性慢性障害であるパリエツト病の治療に用いることができる。現在 の治療は、カルシトニンの皮下投与に依存している。

インターロイキン（例えばＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３）を産生じ分泌するよ う工学処理された内皮細胞は、いくつかの状況の下で使用することができる。例 えば、現在使用されている療法（例えば化学療法）のいくつかがもたらす結果は 、往々にして骨髄の直接的抑制によってひき起こされる好中球減少（血中好中球 数の異常な低下）の誘発である。例えば、後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の 治療において用いられるＡＺＴならびにほぼ全ての化学療法剤の使用は好中球減 少を結果としてもたらす。この状態の結果として、数多くの生命を脅す感染症が もたらされる。これらの場合においては、例えばＩＬ−３をコードする遺伝物質 を含み従って［Ｌ−３を発現し分泌するような内皮細胞の移植を通してのｒＬ− ３の投与を、好中球数を増大させるのに使用することができる。さらに、血小板 の産生を刺激するトロンボボイエチンの投与は、血小板数が少ない数多くの状態 の治療に使用できる。この場合、トロンボボイエチンのための遺伝子で形質導入 された内皮細胞が血小板産生を刺激できる。

遺伝物質を取り込んだ内皮細胞のもう１つの関連利用分野は、ＡＩＤＳの治療で ある。免疫系を刺激するインターロイキン２及びインターロイキン３は、ＡＩＤ Ｓの治療において有効なものである可能性がある。これらの分子は、これら２つ のポリペプチド（現在周期的注入により投与されているもの）を産生ずるべく遺 伝的に処理された内皮細胞によって送達されうる。

本発明のもう１つの用途は、酵素欠損疾患の治療におけるものである。この場合 、内皮細胞内に導入された遺伝子によってコードされた産物は（ホルモンと同様 に）分泌されない；むしろ、それは、細胞内部に残る酵素である。患者に特定の １酵素か欠如していてさまざまなアミノ酸又はその他の代謝産物を代謝できない でいる遺伝病の数多くの症例が存在する。これらの酵素のための適正な遺伝子は 、形質導入された内皮細胞を介して導入されつる。例えば、冒された患者が酵素 アデノシンデアミナーゼを欠如しているような遺伝病が存在する。この酵素は、 尿酸へのプリンの減成に関与するものである。本発明を用いると、形質導入され た細胞が体内で存在する゛　部域を血液が通過するときにこれを解毒するのに充 分高いレベルで欠如している酵素を発現する形質導入された内皮細胞を産生ずる ことが可能となる。

本発明は又、獣医学の分野でも利用できる。例えば、そうでなければ周期的に（ 例えば毎回又はさらに頻度を減らして）注射することによって提供されることに なる薬剤及びホルモンなどの物質を動物に送達する上で、形質導入された内皮細 胞を使用することか可能である。本発明の変更された内皮細胞の使用は、動物の 体内に変更された細胞か存在することによって進行ベースでコードされたタンパ ク質か大量に提供され、かくして物質を毎日／周期的に投与する必要性かなくな るという利点をもつ。

ここで、制限的意味を全くもたない以下の例を用いて本発明を例ｐＬＪのＢａｍ ＨＩクローニング部位では、問題の遺伝物質を挿入することかできる。問題の遺 伝物質は、上述のようにＤＮＡであってよい。

特に、ヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ）をコードする遺伝子のコピーをこの部 位（例えばｐＬＪ内）に以下の要領で挿入した：　ｐＬＪプラスミドをＢａｍＨ Ｉで消化し、ひきつづき酵素子ウシ腸内ホスファターゼで処理した。これに続い て、アガロースゲル上で線形ベクターを分画しガラス玉を用いて精製した。さら に、ｐＢＲ３２２内へクローニングされたヒトＰＴＨの完全なｃＤＮＡを含む、 Ｈｅｎｄｙ　ｅｔａｌ、が記述しているプラスミドから、ヒトＰＴＨ遺伝子を含 むＢａｍＨＩフラグメントを調製した。Ｈｅｎｄｙ、　Ｇ、　Ｎ、　ｅｔａｌ、 　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓａ、　ＵＳＡ、　、　７８　 ：　７３６T−７３６９ （１９８＋）。図３参照。

全てコーディング配列である１７ｂｐの５′未未翻訳列及び１５５ｂｐのことに よって分離した。凹んだ末端を満たすべくリン酸塩中でデオキシヌクレオシド存 在下でＤＮＡポリメラーゼでフラグメントをインキュベートした。Ｔ４ＤＮＡリ ガーゼで平滑末端にＢａｍＨＩリンカ−を連結した。ＢａｍＨＩでこの連結混合 物を消化することによって真正Ｂａｍ）ｌ　Ｉ制限フラグメントを生成した。次 にこれを、ベクター構成においてｈＰＴＨの供給源として用いられるプラスミド であるｐＢＲ３２２の胆蝉工部位内にサブクローニングした。

Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で、等量のｐＬＪ線形バックボーンとＢａｍＨＩ　 ＰＴＨフラグメントを合わせて付加した。結果として得られた混合物を、２つの フラグメントの連結に適した条件の下で維持した。この連結混合物を細菌性ＨＢ ＩＯＩを形質転換するのに用い、次にこのＨＢＩＯＩを、カナマイシンを含む寒 天上で平板培養した。Ｍａｎｉａｔｉｓ。

Ｔ、ｅｔａｌ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（分子クローニング：実験室マニュアル）　、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｐ、ｐ。

られたコロニーを組換え型プラスミドについて分析した。

副甲状腺ホルモンは、体内のカルシウムの調節において１つの役割を果たすポリ ペプチドである。ｈＰＴＨ遺伝子は、ヒトの内皮細胞内に存在しているものの、 これらの細胞内で生物学的に意義あるレベルでは発現されない。ｈＰＴＨといっ たポリペプチドホルモン又は通常は内皮細胞によって生物学的に意義あるレベル で作られることのないその他の物質を作ることのできる内皮細胞を、個体上に植 えつけるか又は個体内に移植することができ、これらの細胞はホルモン又はその 他の物質のための連続的な合成及び送達システムとして役立つことができる。

ｈＰＴＨをコードするＤＮＡ及び選択可能標識（例えばｎｅｏ遺伝子）をコード するＤＮＡを含んでいた組換え型ウィルス構成体を産生ずるＰｓｉ　ａｍ細胞を 用いて、上述のとおりにウィルスストックを産生じた。

ウィルスストックを収穫した。　ｈＰＴＨ遺伝子を含むウィルスで形質導入され るべき内皮細胞を、このストックと共にインキュベートした。

この場合、Ｇ４１８を含む培地上で培養することによって形質導入された内皮細 胞を識別し選択するのに選択可能標識を用いる。ウィルス力価が充分に高い場合 、本質的に全ての内皮細胞が感染を受け、選択可能標識や適切な培地を用いての 選択は不必要である。

ｈＰＴＨ遺伝子を有する組換え型レトロウィルスで形質導入された内皮細胞のｈ ＰＴＨ遺伝子を発現する能力は、以下の要領でインビトロで評価された：ウシの 大動脈内皮細胞は、子ウシの大動脈からの外植片に由来するものであった。細胞 は、制限ある寿命を存し、二次培養と呼ばれる。ウシ大動脈内皮細胞を、上述の とおりにウィルスに感染させ、ネオマイシン内で選択しなかった。形質導入され たウシ大動脈内皮細胞を１０ｃｍの組織培養皿上に接種し、集密性をもつまで成 長させた。次に新鮮培地（１０％のＧ３及びペニシリン及びストレプトマイシン を伴うＤＭＥ）を付加した：この点を以下ゼロ時点と呼ぶ。

２４時間経過後、培地を除去し、ヒトＰＴＨの産生について細胞を評価した。

無傷ｈＰＴＨを測定する放射性免疫検定法（Ｎｉｃｈｏｌｓ）を用いてｈＰＴＨ の存在についてアリコートを分析した。この技術は、血清中のヒト無傷副甲状腺 ホルモンの定量測定のためのＡｌｌｅｇｒｏ　”無傷ＰＴＨ／免疫検定システム 、Ｎ１ｃｈｏｌｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　Ｓａｎ　 ＪｕａｎＣａｐｉｓｔｒａｎｏ、　ＣＡ　（３６Ｂ−２１７０、発効７／８６改 訂）の中で記述されており、その教示は本書中に参考として内含されている。検 定は、血清ミリリットルあたり約１ナノグラム（ｎｇ／ｍｌ）の感度を有し、ウ シのＰＴＨと交差反応しないという点でヒトＰＴＨに対し特異的であることが示 されている。実験結果は、経時的にＲＩＡにより測定されるようにｈＰＴｌ（の 産生として報告されている。結果は表Ｉに示されている。

表■ 形質導入されたＢＡＥ細胞におけるｈＰＴＨの産生対照ＢＡＥ　”　＜１０ｐｇ ／１０６　／２４ｈ形質導入されたＢＡｔｉ’　６．３ｎｇ／　１０６　／　２ ４　ｈ＊ＢＡＥ＝ウソ大動脈内皮 本発明に従ったｈＰＴＨをコードするＤＮＡで形質導入されたウシ大動脈からの 内皮細胞は、受入れ番号ＣＲＬ　９６０１でＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に寄託された。

例２．形質導入された内皮細胞内のヒトＬＤＬレセプタの産生ヒトＬＤＬレセプ タ（ＬＤＬＲ）のためのｃＤＮＡをｐＥｍベクター内に挿入した。ＬＤＬＲのた めのｃＤＮＡは、以下の要領でｐＥＭ内への挿入用に調製された。Ｈｉｎｄｌ［ での消化によってベクターｐＴＺ１　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｘａ ｓＨｅａｌｔｌ　５ｃｉｅｎｃｅ　ＣｅｎｔｅｒのＧｏｌｄｓｔｅｉｎ博士から 得たもの）からＬＤＬＲｃＤＮＡを切除した。ＬＤＬＲコーディング配列の全て を含む２．６ｋｂのｔ（ｉｎｄＩ［［フラグメントをフレノウフラグメントで平 滑末端化し。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてｃＤＮＡに対しＢｃｌ　Ｉオリゴヌク レオチドリンカー（ＮＳＢから）を連結した。最後に、この連結混合物を余剰の 酵素Ｂｃｌ　ｒで消化し、アガロースゲル上でフラグメントを分画し、精製した 。これを、以下の要領でｐＥｍの匣暉」クローニング部位内に挿入した。

ｐＥｍをＢａｍＨＩで消化し、線形化されたプラスミドを子ウシ腸内ホスファタ ーゼで消化した。等量のリンカ−入りＬＤＬＲインサートとｐＥＭバックボーン と混合してＴ４ＤＮＡリガーゼで連結させた。ＨＢＩＯＩを形質転換させるため 連結混合物を使用し、適当なレトロウィルスベクターについてアンピシリン耐性 コロニーを分析した。ｌ）Ｅｍ−ＬＤＬＲヘクターをＰｓｉ−ａｍ細胞系統内に トランスフェクションし、組換え型ウィルスを大量に生産したクローンを識別し た。ＰＴＨについて記述されているようにウシ大動脈内皮細胞の培養を感染させ るためウィルスストックを用いた。

ＬＤＬＲ発現のインビトロ評価は、以下の要領で行なった：対照の又は形質導入 されたウシ大動脈内皮細胞の集密的プレートを、約８時間１０μｇ／ｍｌの濃度 で螢光標識（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈ　Ｉｎｃから得たもの）とコンジ ュゲートされたＬＤＬと共にインキニーベートさせた。

これに続いて、ＰＢＳで細胞を洗浄し、ＰＢＳ中０．５％のグルチルアルデヒド 内で固定させた。次にこれらの細胞を、螢光標識付けされたＬＤＬ（”ｔＤＬ　 ）の摂取のため螢光顕微鏡の下で視覚化させた。この実験の結果は、図４に示さ れている。簡単に言うと、内因性ＬＤＬＲのレベルは、未感染培養（４Ｂ参照） 中の”ＬＤＬ摂取の相対的欠如によって証明されるように、低いものである。し かしながらＬＤＬＲウィルスに感染した培養中、全ての細胞の約３０％は検出可 能な量の°ＬＤＬを取り込み、かくして外因性ＬＤＬＲ（４Ｄ参照）の効果的な 発現か証明されている。

大腸菌からのベータガラクトシダーゼをコートする遺伝子をｐＬＪ内に挿入し、 このベクターをＰｓｉ−ａｍ細胞系統内にトランスフェクションさせ、その結果 高力価のレトロウィルスストックが産生された。

このベクターの構成及び産生細胞系統の分離についてはＰｒ１ｃｅと共ガラクト シダーゼ遺伝子をコードするウィルスのストックを、前述に培養を分析した。こ の実験で使用されたレトロウィルスベクターれているとおりに行なった。簡単に 言うと、細胞培養を５分間ＰＢＳ中の０．５％のグルチルアルデヒド内で固定し 、ＰＢＳで洗浄し、少なくとも１２時間反応混合物に露呈した。反応混合物は、 ベータガラクトシダーゼのための基質を含み、この基質は加水分解されると青色 に変わり細胞内に沈殿する。その結果、ウィルスコード化ベーターガラクトシダ ーゼを発現する細胞は全て青色に変わることになる。

この実験の結果は図５に示されている。ウィルスに露呈されていなかった培養中 てはいかなるベーターガラクトシダーゼ活性も検出されない（図５Ａ）；感染し た培養は、約３０％の細胞内でベータガラクトシダーゼ活性を示す（図５Ｂ）。

これらの形質導入された細胞は、Ｇ４１８の存在下でこれらをインキュベートす ることによって選択される。

れた内皮細胞中のベータガラクトシダーゼの産生内皮細胞の形質導入及び移植の ための標準的プロトコルの絵画的表示が図６に示されている。体重２０〜２５ｋ ｇの雑種の成人の釘類静脈から酵素的に内皮細胞を収獲した。各動物からの細胞 を２つのアリコートに分割した：そのうち１つは複製欠損レトロウィルス（以下 参照）に感染させるべきものであり、もう１つは偽似感染させるべきものであっ た、酵素的に収獲した細胞を用いて一次培養を作製した。内皮細胞を、フィブロ ネクチンでコーティングしたフラスコに平板培養させ、ｌＯ〜１４日間にわたる ２回の連続継代の間、５％の血漿由来のウマ血清、ペニシリン、ストレプトマイ シン、ヘパリン及びＥＣＧＦが補充されたＭ１９９培地中に維持した。

この期間中、３日に一度（１回の露出あたり１８時間）ポリブレン（８μｇ／ｍ ｌ）が補充された新鮮なウィルスストックに細胞を露呈した。２回目の継代が終 わった時点で、細胞を収獲し、アリコートを直接分析し、冷凍保存するか或いは 又ＹａｔｅＳの４段階方法の修正したもの（第２段階と第３段階の間に自己由来 の血液に０．７５Ｘ１０″の細胞が付加された）に従って６ｃｍＸ４ｍｍのダク ロン１ニツトのドラフト（ＣＲＢＡＲＤ、Ｂ１１１ｅｒｉｃａ、ＭＡ）に接種す るのに利用した。動物を麻酔し、両方の頚動脈の６ｃｍのセグメントを記述した 通りの接種された移植片で置換した。各々の動物は、感染した内皮細胞の接種を 受けた移植片（インブラント）及び偽似感染した細胞で接種を受けた対価性移植 片（グラフト）を受け入れた。移植から５週間後、動物を麻酔し、移植片（グラ フト）を収獲し分析した。

内皮細胞のアノミックＤＮＡ内にリポータ遺伝子を安定した形で導入するために 、両栄養性宿主域をもつ複製欠損レトロウィルスを用いた。細胞の細胞質を青色 に染色する酵素組織化学検定を利用してその発現産物ベータガラクトシダーゼを インサイチュで検出することができることから、リポータ遺伝子として１ａｃｚ 遺伝子を用いた（例３）。プロウィルス配列を検出するサザン分析及びインサイ チュで感染細胞を検出するウィルス発現ベータガラクトシダーゼについての細胞 化学染色によって、レトロウィルス感染の効率を見積った。

これらの研究で用いられる組換え型レトロウィルスは２つある。

ＢＡＧベクターニツいては、以前にＰｒ１ｃｅ　ｅｔａｌ、、Ｐｒｏｃｅｅｄｉ ｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃ ｅｓ、ＵＡＳ、８４　：　１５６−１６０（１９８７）によって記述されている 。ＬａｃＺ−遺伝子を含むＢＡＧウィルスは、５　’　ＬＴＲ（長末端反復）か らベーターガラクトシダーゼを、又原核生物内でカナマイシン耐性及び真核生物 内でＧ４１８　（耐性）を付与するＳＶ４０由来のプロモータから選択可能標識 （ｎｅｏ）を発現する。ＢＡＧウィルスに露呈された内皮細胞の約５〜１５％が 感染していた（表■に要約されている）ニ アミノグリコシドＧ４１８で補足された培地内でのこれらの培養の栽培は、形質 導入された細胞について効果的に選択を行なった。

ＬＤＬＲｃＤＮＡ配列を除く前述のＢＡ−ＬＤＬＲベクターに由来するＢＡＬベ クターは、大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子に対するコーディング配列と 置換された。ＬａｃＺ−遺伝子を含むより高い力価のＢＡＬウィルスは、ニワト リベーターアクチンから由来するプロモータからのベータガラクトシダーゼを発 現する。ＢＡＬウィルスに露呈された細胞の約５０％を、サザン分析とベーター ガラクトシダーゼに対するインサイチュ細胞化学染色により測定されるように、 形質導入した。

サザン分析においては、高分子量のＤＮＡを分離し、アリコート（１０μｇ）を Ｋｐｎ　Ｉで消化させ、１％のアガロアースゲル上で分画させ、Ｚｅｔａｋｉｎ ｄへ移し、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ及びＶｏｌｔの方法に従って高い比活性に標識付け された１２００ｂｐのＣ１ａ　Ｉ　／　Ｅｃｏ　ＲＩフラグメントでプローブ探 査した。位相差及び螢光顕微鏡写真の両方によって培養された内皮細胞の細胞化 学的特徴づけを実証した。レトロウィルス感染した内皮細胞を接種時及び移植さ れた移植片からの除去の後に、ＤＩＬ−ＡＣ−ＬＤＬの摂取及びウィルス誘導の ベータガラクトシダーゼの発現について分析した。Ｄ　［Ｌ−ＡＣ−ＬＤＬ　か 接種された、予備接種済みで移植後の細胞を、位相差及び螢光顕微鏡写真を用い て評価した。ウィルス誘導されたベーターガラクトシダーゼの発現についても、 予備接種済みの移植後の細胞を分析した。

接種の時点で、内皮細胞特異的機能（すなわちアセチル化されたＬＤＬの摂取及 びフォノ・ウィルブランド因子の存在）について及び平滑筋細胞に特異的な抗原 の存在について培養を分析した。これらの分析は、各々の隔離集団からの細胞の ９８％以上が機能中の内皮細胞であることを示していた。

実験システムは、移植片再増殖を研究するのに用いられた前述のイヌのモデルの 修正したものであった。イヌ１〜３は、ＢＡＧ感染した未選択の内皮細胞での接 種を受けた移植片を受け、一方イヌ４〜７はまず最初にＢＡＬ感染した未選択の 内皮細胞での接種を受けた移植片を受けた。これらの実験が進行中であった間に 、イヌ４〜７からの内皮細胞をＢＡＧウィルスにも感染させ、ＢＡＧ形質導入さ れた細胞について選択するアミノグリコシダーゼである０４１８の存在下又は不 存在下で、培養内で拡張させた。５週間後に、移植片を分析のため外植し、新し い移植片をイヌ４〜７内に移植した（イヌ４′〜７′と呼ぶ）。これらのイヌの 各々は、ＢＡＧウィルスに感染しＧ４１８内で選択された内皮細胞で接種された 移植片及びＢＡＧ感染し未選択の内皮細胞が接種された対価性移植片を受けた。

２番目の移植片セットを再び５週間後に外植した。

表■は、これらの実験の結果を要約している。動物４′〜７′は、動物４〜７に ついて実施された第２の実験を表わしている（本文参照）。ＢＡＧ−Ｕは、形質 導入された細胞についてＧ４１８で選択されていないＢＡＧ感染した内皮細胞を 表わす。ＢＡＧ−Ｓは、形質導入された細胞について６４１８で選択されたＢＡ Ｇ感染した内皮細胞を表わす。ＢＡＬは、ＢＡＬ感染した内皮細胞を表わす。Ｍ ＯＣＫは、擬似感染した細胞を表わす。Ｅは、ベーターガラクトシダーゼ染色に よって測定されるような感染効率を表わす。５週間後の移植片の効力（潜在能） は（Ｙ）有り又は（Ｎ）無しで示されている。移植片の被層は、走査型電子顕微 鏡により測定されるように再増殖した表面の百分率を表わす。

動物＋　実験的移植片　対照移植片 感染　外植体　感染　外植体 ウィルス　Ｅ　効力　被層　ウィルス　Ｅ　効力　被層Ｉ　ＢＡＧ−Ｕ　１５　 Ｙ　５０−９０　ＭＯＣＫ　ＯＹ　５０−９０２　８ＡＧ−０５Ｙ　５０−９０ 　ＭＯＣＫ　ＯＹ　５０−９０３　ＢＡＧ−Ｕ　５　Ｙ　５０−９０　ＭＯＣＫ 　ＯＹ　５Ｏ−９０４ＢＡＬ　４Ｏ−６ＯＮ　−ＭＯＣＫ　ＯＮ　−５ＢＡＬ　 ４Ｏ−６０Ｙ　ＯＭＯＣＫ　ＯＹ　Ｏ６ＢＡＬ　４０−６０　Ｙ　５０−９０　 ＭＯＣＫ　ＯＹ　５０−９０７　ＢＡＬ　４０−６０　Ｙ　５（１−９０ＭＯＣ Ｋ　Ｑ　Ｙ　５０−９０４’ＢＡＧ−Ｓ　１００　Ｙ　５０−９０　ＢＡＧ−Ｕ 　ＩＯＮ　−５’ＢＡＧ−５１００Ｙ　ＯＢＡＧ−Ｕ　ＩＯＮ　−６’ＢＡＧ− ３１００Ｙ　ＯＢＡＧ−ＬＩ　ＩＯＹ　５０−９０７’ＢＡＧ−３１００Ｙ　５ ０−９０　ＢＡＧ−Ｕ　ＩＯＹ　０外植された移植片を分析すると、５週間後に ２２のうち１８が効力を持ちつづけていることがわかった。走査型電子顕微鏡は 、１８のうち１４の効力ある移植片の管腔表面上に内皮様の形態をもつ細胞のラ イニングを立証した。内皮細胞のライニングは、それが存在する場合、不完全（ 全表面の５０〜９０％）であり、縮れたダクロン移植片のピークに沿って少量の 細胞が見える状態で分布がよせ寄め的である。各移植片の一部分を固定し、ウィ ルス由来のベータガラクトシダーゼを発現する細胞について染色し、７５０×の 倍率の強力な解剖顕微鏡を通して視覚化した。効力のある状態にとどまり管腔細 胞を保持した感染内皮細胞での接種を受けた各移植片は、まさに血管の管腔上に ベーターガラクトシダーゼ陽性細胞を含む。偽像（ＭＯＣＫ）感染した内皮細胞 の接種を受けた対価性移植片が陽性染色細胞を示すことは全く無い。

移植片のインサイチュ分析と、ウィルス形質導入された細胞について行なった。

ウィルス発現されたベータガラクトシダーゼを発現する細胞について、遺伝的に 処理された移植片の縦方向切片を分析した。移植片を縦方向に切断し一部分を０ ．５％のグルチルアルデヒド内で５分間固定し、ＰＢＳ内で３度洗浄し、２時間 ｘ−ｇａｌ溶液中でインキュベートし、Ｌｅｉｔｚの解剖顕微鏡で管腔表面を写 真撮影した。

移植片を見開きで視覚化し、接種パターンのいくつかの興味深い様相を観察した 。形質導入された細胞の密度は、縮んだ移植片の比較的深い表面の中で最も大き かった。このことは、低出力下ではぎざぎざ状の表面の割れ目をライニングする 青い染色細胞の輪として視覚化されており、走査型電子顕微鏡によって視覚化さ れた表面の内皮細胞再増殖の変動と相関関係をもつ。さらに、遠位又は近位の融 着に対する近接性との関係における形質導入された細胞の密度又はパターンの局 所的変動は全く無かった。最後に各々の場合において、ベーターガラクトシダー ゼについて陽性であった管腔細胞の割合は、接種されたベーターガラクトシダー ゼ陽性細胞の調製物に比べ定性的に低いように思われた。

より詳細な特徴づけを可能にするため移植片の一部分の管腔表面から細胞を酵素 的に収獲した。細胞の一次培養を作製し、分析に先立って約２−３週間インビト ロで拡張させた。ウィルス発現されたベーターガラクトシダーゼについての組織 化学検定及びサザン分析により、この細胞個体群の中で遺伝的に変更された内皮 細胞を識別した。移植片から収獲されインビトロで拡張した細胞の大部分は、分 化した内皮機能を保持していた（９５％未満）。しかしながらウィルス誘導ベー ターガラクトシダーゼを発現するが又はプロウィルス配列を含んでいた細胞の割 合は、接種時点で分析された培養に比べて、−貫して減少していた。この不一致 は、一部には、融着から又は間隙を通しての成長による外因性細胞をもつ移植片 の部分的再増殖に起因するものである。

上述の例で紹介されたデータは、レトロウィルスを媒介にした遺伝子転移かウシ 、イヌ及びヒトの内皮細胞に容易に適用できるものであることを示している。こ のデータは又、その結果細胞間の分泌されたタンパク質が適切に発現されること をも示している。治療的に関連性あるタンパク質の発現のためにレトロウィルス を媒介とした遺伝子転移を使用することが、以下の節で示されている。

組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）は、血液凝塊の線維製溶解を促進する 内皮細胞によって通常分泌されるタンパク質である。ヒトｔＰＡをコードする組 換え型レトロウィルスベクターが構築され、形質導入された内皮細胞からの治療 的に関連性あるタンパク質の強化された送達を立証するべ（イヌの内皮細胞を形 質導入するのに用いられた。

図７には、組換え型レトロウィルスベクター内へのクローニングのためのｔＰＡ 遺伝子の変更が示されている。ヒトの子宮ｔＰＡのコーディング配列は、Ｉｎｔ ｅｇｒａｔｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ　ＭＡか ら得たｐＵＣベースのプラスミドのＳａｌ　Ｉ　ＤＮＡフラグメントの中に含ま れていた。５ａｌＩフラグメントは、もとのｃＤＮＡのベース対２０９０にある Ｂｇｌ　Ｉ［部位と塩基対６にある５ＦａＮ　Ｉ部位にＳａｌ　Ｉリンカ−を置 くことによって誘導された。コーディング配列は、塩基対１３から塩基対１６９ ９まで広がっている。

この当初のクローンから、当該特許の本文で記述したＭＦＧ及びα−５ＣＧヘク ターの中に直接クローニングできるフラグメントを誘導した。まず５ａｉｌフラ グメントを、合成りａｍＨＩリンカ−の付加によってＢａｍＨＩフラグメントに 変換し、次に制限酵素ＢｇｌＩＩで消化して、ＢａｍＨＩからＢｇｌＩＩの１０ ９の塩基対のフラグメント及びＢａ１ＩＩからＢａｍＨＩの１９７５の塩基対の フラグメントを生み出した。ｔＰＡコーディング配列の欠如している１００個の 塩基対及び翻訳出発コドンを再度作り出すために、２つの１０４塩基対のオリゴ ヌクレオチドを化学的に合成しアニーリングして５′末端にＮｃｏ　Ｉ部位を又 ３′末端にＢｇｌＩＩ部位をもつフラグメントを作った。このオリゴヌクレオチ ドを部分的な１９７５塩基対のｔＰＡ遺伝子のＢａ１ｍ部位へ連結させてもとの 分子と同しコーディング配列をもつ２０７９塩基対のｔＰＡ遺伝子を生成するか 、これはＮｃｏ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　ｆのフラグメントとしても容易に得ること ができるものである。これを直接ＭＦＧ及びａ−３ＧＣベクターに挿入した（結 果として得られたベクターにはそれぞれＡＴＣＣ受入れ番号６８７２６及び６８ ７２９が与えられた）、これらの操作は、標準的な分子生物学技術（Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｔ、Ｍ ａｎｉａｔｉｓ、Ｅ、Ｆ。

Ｆｒ１ｓｃｈ及びＪ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ）によって行なわれ、図７に概略的に 示されている。

両栄養性宿主域の組換え型レトロウィルスを産生ずることのできるＤａｎｏｓ及 びＭｕｌｌｉｇａｎのＰｓｉ　ｃｒｉｐパッケージング細胞系統から、ＭＦＧ− ｔＰＡ及びα−５ＣＧ−１ＰＡをコードする組換え型ウィルスを産生ずる細胞系 統を作った［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８５：６４ ６０（１９８８））　、　ｔ。

μｇの特定されたＤＮＡと１μｇのプラスミドｐｓＶ２ｎｅｏを同時沈殿させ、 標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション手順によりパッケージング細胞 上にトランスフェクションした。安定した形でトランスフェクションを受けたク ローンを、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む選択培地内で１４日間成長させた 後に分離した。個々のクローンの集密的細胞単層から、２４時間培養上清を得、 これをＮｒＨ３Ｔ３細胞を感染させるのに用いた。２４時間の露出の後、培養上 清を除去し、３Ｔ３細胞に正規の培地を再補給し、さらに７２時間成長させた。

これらの細胞上に６時間新鮮な培地を入れ、これらの上清を、ヒトｔＰＡに特異 的な市販のＥＬＩＳＡを用いてヒトｔＰＡについて検定した（Ｉｍｍｕｎｏｂｉ ｎｄ−５゜Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ　Ｉｎｃ、、Ｎ、Ｙ、、 Ｎ、Ｙ、）。このスクリーンから、ＭＦＧ−ｔＰＡ組換え型ウィルス又はα−５ ＧＣ−１ＰＡ組換え盟ウィルスのいずれかを産生するパッケージング細胞系統の クローンを選択しそれぞれＭＦＧ６８及びα−５ＧＣ２２と呼称した。

イヌの内皮細胞を、記述されているとおりに（Ｔ、　Ｊ、　Ｈｕｎｔｅｒ、　Ｓ 、　Ｐ。

Ｓｃｈｍｉｄｔ、　Ｗ、　Ｖ、　５ｈａｒｐ、及び（１９８３）Ｔｒａｎｓ、　 Ａｍ、　Ｓｏｃ、　Ａｒｔｉｆ、　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｏｒｇ≠獅■ ２９：ｌ７７）コラゲナーゼ消化により釘類静脈の１０ｃｍのセグメントから分 離した。細胞を、５％の血漿由来のウマ血清、５０μｇ／ｍｌの内皮細胞成長因 子及び１００μｇ／ｍｌのヘパリンを含むＭ１９９培地内でフィブロネクチンコ ーティングされた組織培養皿上で繁殖させた。細胞培養の純度を、フォノ・ウィ ルブランド因子の存在及び平滑筋細胞特異α−アクチンの不在の場合について、 免疫組織化学検定によって測定した。形質導入の前日に、内皮細胞をヘパリン無 しの培地内で５．５Ｘ１０”細胞／ａｍ”の割合で接種した。翌日、各々の産生 細胞系統に由来する組換え型ウィルスを含む上清に８μｇ／ｍｌのポリブレンを 付加したものに対し、２４時間、内皮細胞を露呈した。ウィルス上清を除去し、 細胞に正規培地を補給し、分析に先立ってさらに４８時間成長を遂行させた。

標準的な技術により内皮細胞の培養から高分子量のゲノミックＤＮＡと合計ＲＮ Ａを分離した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　ＭａｎｕａｌＴ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、Ｆ、Ｐｒ１ｔｓｃｈ及びＪ、Ｓ ａｍｂｒｏｏｋ）　ｏ　ＤＮＡ及びＲＮＡを、完全なｔＰＡｃＤＮＡフラグメン トから調製された８！Ｐ標識付けされたＤＮＡプローブを用いて、ハイブリダイ ゼーション分析法により分析した。

電気泳動分離、フィルタートランスファ、ハイブリダイゼーション、洗浄及びｓ ａｐ標識付けについては、標準的な技術を用いた（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ ｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ 、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ及びＪ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ）。形質導入されたイヌ内皮 細胞内のヒトｔＰＡの産生は、種特異的免疫細胞化学染色を用いて立証された。

形質導入された細胞を１０分間室温で３％のホルムアルデヒドの中で固定し、次 に５分間の０．１％のトリトンＸ−１００の中で透過性を付与した。固定した細 胞単層を次に順番に、ヒトｔＰＡに対するマウスのモノクローナル抗体、アルカ リ性ホスファターゼでコンジュゲートされたヤギの抗マウス抗体、そして最後に アルカリ性ホスファターゼに特異的な呈色試薬と共にインキュベートした。この 手順は、ヒトｔＰＡを発現する細胞を特異的に染色し、従来の光学顕微鏡によっ て視覚化されつる。

さらに、形質導入された細胞からのｔＰＡ分泌を、集密的細胞単層から測定した 。新鮮培地を６時間細胞上に置き、除去し、遠心分離によって清澄化し、ヒトｔ ＰＡの量を、市販のＥＬＩＳＡ　（［ｍｍｕｎｏｂｉｎｄ−５゜Ａｍｅｒｉｃａ ｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を用いて測定した。

形質導入プロセスの有効性は、偽像形質導入又はＭＦＧ−ｔＰＡで形質導入され た細胞の個体群の免疫細胞化学染色によって示されている。

図９に示されているように、ＭＦＧ６Ｂから収獲されたウィルス上清に対する細 胞の一回の露呈の後、対照内では皆無であるのに対して、全ての細胞がヒトｔＰ Ａを合成している。これは、形質導入された細胞のいずれかのタイプの選択無し に達成された。

形質導入された培養から分泌されているｔＰＡの量を測定するため、免疫検定を 行なった。以下で示すように、ＭＦＧ６８又はα−５ＧＣ２２からの組換え型ウ ィルスで形質導入された細胞は、大量のヒトｔＰＡを分泌した。類似の条件下で 、培養中のヒト内皮細胞は標準的に約１ｎｇ未感染　Ｋ９１１ＩＣＯ，Ｏ ＭＦＧ６８　Ｋ９　ＥＣＩ５０．１ α−３ＧＣ２２Ｋ９　ＥＣ３０２，８ ＭＦＧ６８及びα−５ＧＣ２２からの組換え型ウィルスで内皮細胞が形質導入さ れたことのもう１つの確認として、ＤＮＡ及びＲＮＡを形質導入された細胞から 分離し、放射線標識付けされたｔＰＡ遺伝子に対するハイブリダイゼーションに よって分析した。図１０には、ＤＮＡ分析のオートラジオダラムが示されている 。未感染の対照においては、いかなるハイブリダイゼーションも検出されなかっ たが、２つの組換え型ベクターに感染した細胞中には、適切な分子量の単一のハ イブリッド形成種が見られた。このことは、遺伝的情報がこれらの形質導入され た細胞のゲノムに転移されたことを実証している。

これらの細胞から分離された合計ＲＮＡのハイブリダイゼーション分析がタンパ ク質のＤＮＡの結果を確認しており、これは図１１に示されている。ここでも、 対照細胞内ではいかなるハイブリダイゼーションも検出されなかったが、形質導 入された細胞に由来するＲＮＡ内では、適切なサイズのハイブリッド形成バンド が見られる。ＭＰＧ６８及びα−５ＧＣ２２の組換え型ウィルス産生細胞からの ＲＮＡが同様に対照として示されている。

体重２０〜２５ｋｇの雑種の雌の成人の釘類静脈から酵素的に内皮細胞を収獲し 、これを実験室内で培養し、例５に記載されているとおりに純度について分析し た。各々の動物から分離した細胞の２分の１を、前節で記述したとおりＭＦＧ− ｔＰＡ組換え型ウィルスを産生するＭＦＧ６８細胞系統から収獲された上清に対 する２回の露呈により形質導入した。もう一方の半分は、擬似形質導入した。各 々の個体群に対して実施した成長曲線は、成長特性における差を全く示さなかっ た。ｔＰＡが増大した細胞から分泌されていたことを確かめるため形質導入細胞 の各バッチに由来する培養上清について、ＥＬＩＳＡ測定を行なった。次に、充 分な数の細胞を得るため約１週間実験室内でこれらの細胞を繁殖させた。

細胞を分離した各々の動物について、発泡テフロン（Ｗ、　Ｌ、　Ｇｏｒｅ。

ａｎｄ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、　Ｉｎｃ、Ｆｌａｇｓｔａｆｆ、Ａｚ　）で作 られた２つの血管移植片に細胞を接種した。１つの移植片には、擬似形質導入さ れた細胞を接種し、もう１方の移植片には、高レベルのｔＰＡを分泌すべ（形質 導入された細胞を接種した。０．４ｃｍＸ　１４ｃｍのサイズの各移植片を１． ５αｇ／ｃｍ”のフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ 、、Ｓｔ、ｈｏｕｉｓＭＯ）で予めコーティングし、次に２２００．０００００ ｃｍＯ内皮細胞を接種した。次に移植片を培養中でさらに７２時間インキュベー トした。移植に先立って、末端を各移植片から切り離し、細胞被層を確認するべ （検査した。

細胞を収獲したのと同じイヌを麻酔し、大動脈−回腸バイパスとして、接種され た移植片の１０ｃｍのセグメントを移植した。各々のイヌは、２つの対価性移植 片を受けた；１つの移植片は、対照細胞が接種されたものであり、もう一つの移 植片は、高レベルのｔＰＡを分泌すべく形質導入された細胞が接種されたもので あった。移植の後、移植片の性能は、超音波で移植片を位置決定しドツプラー測 定値（Ａｃｃｕｓｏｎ、　Ｉｎｃ、　）により移植片を通しての血液流を評価す るＢモードスキャナを用いて、毎日監視された。血栓の形成を減少するための薬 剤は、全く動物に投与されなかった。

６頭の異なる動物における移植片の性能の結果は図１２に示されている。上述の 移植（片）モデルは、きわめて緊縮性の高いものであり、閉塞性の凝塊形成によ り急速に移植片を欠損に導く。正常な移植片の機能は、中実の棒で示され、欠損 したもののなおも機能している移植片は斜線入り棒で示されている。最初の動物 においては、高くなったレベルのｔＰＡ　（実験的）を分泌する形質導入された 細胞でライニングされた移植片及び対照の移植片は、移植から２４時間後の凝塊 形成のために欠損した。その他の５匹の動物全てにおいては、高くなったレベル のｔＰＡを分泌する形質導入された細胞でライニングされた移植片は、単に擬似 形質導入された細胞を伴う移植片に比べ長く機能した。この差は２４時間から数 カ月にまで変化した。これ果を達成することができるということを実証している 。

例１−　形質導入された内皮細胞からのヒト第■因子の産生変更されたヒト第■ 因子（ＡＴＣＣ受入番号Ｔｈ　６８７２６）を含むレトロウィルスベクターＭＦ Ｇで細胞を形質導入することにより、ヒト第■因子を産生ずるため、内皮細胞を 遺伝的に増強させた。変更された第■因子ｃＤＮＡは、Ａ１．　Ａ２．　Ａ３． 　ＣＩ及びＣ２ドメインのためのコーディング配列の全てを含むが、Ｂドメイン はアミノ酸７４３〜１６４８まで欠失されている。Ｂドメインの除去及びレトロ ウィルスベクターＭＦＧ内への変更因子第■遺伝子の挿入について、以下で詳述 し、図１３はこれを描いている。

５′及び３′の未翻訳配列無しの全長ｃＤＮＡを、制限部位Ｎｅｏ　Ｉ（５′） とＸｈｏＩ（３’）の間に挿入されたプラスミドベクター内で得た。Ｂドメイン の除去のため、因子■ｃＤＮＡを、Ｂドメインの５′及び３′部位の両方の上の 配列にまたがる４つのフラグメント内のプラスミドベクターの中に第■因子ｃＤ ＮＡをサブクローニングした。

第■因子ｃＤＮＡの第１のフラグメントを、プラスミドベクターｐＵｃ９内の制 限部位５ａｌＩとＰｓｔＩの間でサブクローニングした。５ａｌＩとＰｓｔＩで プラスミドベクターを切断し、子ウシ腸内ホスファターゼを用いて５′ホスフア ターゼを除去した。全長ｃＤＮＡからの１５９１の塩基対ＸｈｏＩ（ヌクレオチ ド７２６３）からＮｄｅＩ（ヌクレオチド５６７２）　フラグメント及び３５９ の塩基対ＮｄｅＩ（ヌクレオチド５６７２）からＰｓｔＩ（ヌクレオチド５３１ ３）のフラグメントを分離し、５ａｌＩ／ＰｓｔＩ消化されたプラスミドベクタ ーを連結させた。

同し翻訳リーディングフレーム内でアミノ酸７４２〜１６４９を接合するＢドメ インをコードする配列の大部分を除去するため、１６８の塩基対を網羅する５　 ’　ＨｉｎｄＩ［Ｉ部位と３’ＰｓｔＩ部位を用いて４つのオリゴヌクレオチド を合成した。これらのオリゴヌクレオチドは、軽鎖の活性化ペプチドの最初のア ミノ酸であるアミノ酸１６４９が後に続くアミノ酸７４２をコードするヌクレオ チド２４２７にあるＨｉｎｄＩ［Ｉ部位からヌクレオチド５３１３にあるＰｓｔ Ｉ部位まで広がっている。プラスミドベクター１）ＵＣ９を制限酵素旧ｎｄｌＩ ［とＰｓｔＩで消化させ、子ウシ腸内ホスファターゼを用いて５′リン酸塩を除 去した。オリゴヌクレオチドを４つの別々の鎖として合成し、キーナーゼ化し、 アニーリングし、プラスミドベクターのＨｉｎｄｎ［部位とＰｓｔＩ部位の間で 連結した。

サブクローニングされたＨｉｎｄｎ［／Ｐｓｔ　Ｉオリゴヌクレオチドを、プラ スミドベクターｐＵｃＦ８内のＰｓｔｌ／ＸｈｏＩフラグメントに並置した。こ のプラスミドを生成するため、制限酵素部位５’ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ　−Ｘｈ ｏＩ　−Ｐｓｔｌ　−ＨｌｎｄＩ［［−Ａｓｐ　７１８−ＮｃｏＩ　−Ｈｐａｌ 　３　’をコードする新しいポリリンカーを用いて、ｐＵｃ９プラスミドバック ボーン内に新しいポリリンカーを挿入した。プラスミドベクターを制限酵素Ｂａ ｍＨＩ及びＨｉｎｄｌ［Ｉで消化させ、５′リン酸塩を子ウシ腸内ホスファター ゼで除去した。３′末端第■因子フラグメントを分離するのにＰｓｔ　Ｉ　／Ｘ ｈｏ　Ｉサブクローンの部分的Ｐｓ　ｔ　Ｉ　／　ＢａｍＨＩ消化物を用い、サ ブクローニングされたオリゴヌクレオチドのＰｓｔ　Ｉ　／　ｔ（ｉｎｄ■消化 物を用いて重鎮及び軽鎖接合部フラグメントを分離した。これらを、ＢａｍＨＩ とＨｉｎｄＩ［Ｉ部位の間でプラスミドベクターｐｕｃ　ＦＢ内に連結させた。

ヌクレオチド２４２７及び７２０５の間に第■因子配列を含むこのサブクローン を、Ａｓｐ７１８及びＨｉｎｄＩ［Ｉで消化させ、子ウシ腸内ホスファターゼを 用いて５′リン酸塩を除去した。制限酵素部位Ａｓｐ７１８　（ヌクレオチド１ ９６１）と１（ｉｎｄＩ［（ヌクレオチド２４２７）の間の第■因子をコードす るフラグメントを分離し、ヌクレオチド１９６１からヌクレオチド７２０５にあ る翻訳停止コドンまでの第■因子配列を含むサブクローン（ｐＦ８３’デルタ） を生成するべくプラスミドベクター内に連結させデこ。

変更された因子■遺伝子を含むレトロウィルスベクターの構築は、レトロウィル スベクターＭＦＧの制限部位とＮｅｏ　ＩとＢａｍＨＩの間に第）■因子遺伝子 を挿入することによって行なった。第■因子すブクローンｐＦ８３　’デルタを Ｓｍａ　ｒで消化し、オリゴヌクレオチドリンカーを用いてＢｇｌｌＩ部位に変 換した。３′第■因子サブクローンからＡｓｐ７１８／ＢｇｌＩｒフラグメント を分離し、翻訳の開始のためのＡＴＧを含む５′第■因子フラグメントを、Ｎｃ ｏＩ（ヌクレオチド１５１）／Ａｓｐ７１８フラグメント（ヌクレオチド１９６ １）として分離した。Ｎｃｏ　１とＢａｍＨＩてレトロウィルスベクターＭＦＧ を消化し、子ウシ腸内ホスファターゼを用いて５′リン酸塩を除去した。第■因 子フラグメン１−をレトロウィルスベクターに連結して、最終的な第■因子レト ロウィルス構成体を生み出した。図１４参照。

レトロウィルス粒子を産生ずる細胞系統は、Ｂｅｓｔｗｉｃｋ　ｅｔａｌ、　（ Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　ｌ９８８．８５：５４０４−５４ ０８）により記述れさているように同数の環境栄養性パッケージング細胞Ｐｓｉ 　ＣＲＥ及び両栄養性パッケージング細胞ＰｓｉＣＲＩＰ内へのレトロウィルス ベクターＭＦＧ　／第■因子のトランスフェクションによって生成された。パッ ケージング細胞の２つの宿主域の間に起こる重感染の程度を監視するため、第■ 因子用のＫａｂｉ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ　Ｃｏａｔｅｓｔ、Ｈｅ１ｅｎａ　 ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＢｅａｕｍｏｎｔ、　Ｔｅｘａｓを用いて生物学的に 活性の第■因子の産生を測定し、ＲＮＡ　ドツトプロット分析によってウィルス ＲＮＡの産生を測定した。

トランスフェクション後２１日日に、トランスフェクションを受けたパッケージ ング細胞の混合物を、両栄養性パッケージング細胞系統ＰｓｉＣＲＩＰ−ｔ（Ｉ ｓ　ト同時栽培した。Ｐｓ　ｉＣＲＩＰＨＩｓパッケージング細胞系統は、前述 のＰｓｉＣＲＩＰパッケージング細胞系統の一変異体である。

ＰｓｉＣＲＩＰＦＩＩＳパッケージング細胞はＰｓｉＣＲＩＰパッケージング細 胞系統と同一であるが、この場合、レトロウィルスエンベロープ遺伝子は、異な る優性選択可能標識遺伝子であるｐｓＶ２−）（ＩｓプラスミドＤＮ’Ａでの同 時トランスフェクションによって細胞内に導入された、形質導入粒子の均質の両 栄養性レトロウィルスストックの分離のため、ｌ：１の割合でパッケージング細 胞系統を培養した。両栄養性パッケージング細胞系統ＰｓｉＣＲＩＰＨＩＳの重 感染は、変更されたヒト第■遺伝子を効果的に形質導入する組換え型レトロウィ ルスを産生ずる安定した細胞系統ＨＩＳ１９の生成をもたらした。高力価の組換 え型レトロウィルスを産生ずる細胞系統を分離するために、レトロウィルス産生 細胞系統の抗生物質による選択は必要とされなかった。細胞系統のゲノミックＤ ＮＡは、産生細胞系統内に存在するレトロウィルスベクターの組込まれたコピー の数を決定するためのサザンブロットハイプリダイゼーション分析によって特徴 づけされた。レトロウィルス産生細胞系統内のコピー数は約０．５であり、従っ て平均してＰｓｉＣＲＩＰ−ＨＩＳパッケージング細胞の５０％が、変更第■因 子遺伝子を伴うしｌ・ロウィルスベクターのコピーを含んでいる。レトロウィル スベクター及び変更第■因子遺伝子は、パッケージング細胞系統内のＤＮＡのい かなる欠失又は再配置も無しに無傷である。レトロウィルスベクターのコピー数 は、レトロウィルス産生細胞系統の連続継代につれて、一定にとどまる。最高の 組換え型レトロウィルス力価を得るためには、旧ＳＩ９を、選択ヒスチジンマイ ナス培地中で３継代、それに続いて補完されたＤＭＥＭ培地中で４継代に付した 。レトロウィルス粒子の生成のためには、旧Ｓ１９を、１０ｃｍの細胞培養皿内 に５　ＸＩＯ’　−Ｉ　ＸＩＯ’細胞の割合で接種した。接種後４８時間目に、 約７０％の集密性の新鮮な培地（ＤＭＥＭ＋ＩＯ％の子ウシ血清）を、形質導入 のための組換え型レトロウィルスの供給源として２４時間後に収集するべく、プ レートに対して付加した。

変更された第■因子を、頚静脈から分離されたイヌの内皮細胞内に形質導入した 。４〜６時間、５％の血漿由来の血清（ウマ）、１００μｇ／ｍｌのヘパリン及 び５００μｇ／ｍｌの内皮細胞成長因子を伴う完全Ｍ１９９培地中で１０ｃｍの 皿あたり３Ｘ１０’５細胞の割合で内皮細胞を接種した。次に、形質導入プロセ スの効率に不利な効果をもたらすヘパリンは無しに一晩、５％の血漿由来の血清 、及び１ｏｏμｇ／ｍｌの内皮細胞成長因子を伴うＭ１９９培地内で、細胞を一 晩インキユベートした。細胞を２４時間、新鮮なウィルス上清にポリブレンを加 えたもの（８μｇ／ｍｌ）に露呈した。ウィルス上清の除去の後、細胞を５％の 血漿由来血清、　１００μｇ／ｍｌの内皮細胞成長因子を伴うＭ１９９培地の中 に入れ、約７０−８０％の集密性になるまで成長させた。

この時点で、培地を、５％の熱失活されたウシ胎児血清（６６℃で２時間加熱さ れたもの）及び５０μｇ／ｍｌのＥＣＧＦを伴うＭ１９９培地へと変えた。２４ 時間のインキュベーションの後、培地を収集しＫａｂｉ　Ｃｏａｔｅｓｔによる 生物学的に活性な第■因子について検定をした。

このレトロウィルス産生細胞系統を用いて、サザンプロット分析で測定されたよ うに、５０％〜７５％の内皮細胞が形質導入された。第■因子は、組換え型ウィ ルスに対する唯一回の露呈で又、形質導入された細胞の抗生物質選択無しで、こ の頻度で形質導入されつる。

形質導入された内皮細胞は、図１５に示されているように欠失又は再配置が全く 無しで、組換え型レトロウィルスゲノム及び変更された第■因子遺伝子の無傷コ ピーを含んでいる。遺伝的に増強された内皮細胞からの生物学的に活性な第■因 子の産生速度は２４時間、５×１０＠細胞あたり４００μｇであった。

例８・内皮のインビボ形質導入 先行する例で記述されたとおりに作られた組換え型レトロウィルスの標準ストッ クを用いて、内皮細胞のインビボ形質導入を実証する予備データを得た。このア プローチは、動脈表面に対する限定的な損傷が内皮細胞の小片を除去し、この裸 出した部域は欠損の縁部からの新しい内皮細胞の増殖及び内植によって７２時間 後に修復されえ型レトロウィルスによる有効な形質導入のための必要条件であり 、針金による内皮の損傷は、内皮細胞の増殖を誘発する潜在的な数多くの方法の １つである。我々の方法では、内皮細胞の増殖を誘発するのに限定的損傷のＲｅ １ｄｙの技法が用いられ、次に増殖中の細胞を直接、組換え型レトロウィルスベ クター、を含む上清に露呈している。

我々の最初の実験は、インサイチュで内皮細胞を成功裡に形質導入しかくして潜 在的に新しい遺伝子配列の成功裡の導入のための組織培養技術の必要性を回避す るというこの方法の可能性について報告している。

この方法には２つの外科的処置が必要であり、そのうち第１の処置″は血管の表 面（ここで右回腸動脈について記述する）を損傷し、内皮細胞の増殖を誘発する 。第２の処置では、血管表面上の複製中の細胞に対し組換え型レトロウィルスを 送達し、それと同時に増殖中の細胞がレトロウィルス粒子に露出されている間近 位動脈樹からの血液の流れを防ぐ。簡略化のため、この処置については回腸動脈 の場合に関して記述する。

インビボ遺伝子転移を実証するために、我々は、α−８ＧＣベクターに基づいて 改良されたベクター（図２ｄ及び１８）と共に、１９８７年に公表された標識遺 伝子の概念を用いた（Ｐｒｉｃｅ　Ｊ、Ｔｕｒｎｅｒ　Ｄ、Ｃｅｐｋｏ　Ｃ。

１９８７　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４：１５６−１ ６０）　（例３参照）。ベータガラクトシダーゼをコードする１ａｃＺ遺伝子を α−５ＧＣベクター内に挿入して、図１６に表わされているα−３ＧＣ−Ｌａｃ Ｚベクターを生成した。

この組換え型構成体をＰｓｉＣｒｉｐパッケージング細胞系統内に細胞系区内エ フシランし、高力価のα−５ＧＣ−ＬａｃＺ組換え型レトロウィルスを産生する ＰｓｉＣｒｉｐ細胞のクローンを例５に記した通りに分離した。

インビボ形質導入のためにα５ＧＣ−ＬａｃＺ組換え型レトロウィルスのストッ クを用いた。

実験動物（ウサギ）を麻酔しくケタミン／キシラジン）、両方のそけい部を剃り 準備し、動物を手術台上に載せた。両側垂直そけい部切除を通して、総、表在及 び深夜大腿動脈が露出された。右側（損傷を加えるべき側）で、総大腿動脈から 離れた小さな分岐を、内回腸動脈を通ってのみ起こることになる分離された動脈 セグメントからの流出を確実にするため連結した。必要な場合は、そけい靭帯を 分割し、全ての側方分岐を完全に制御するべく後腹膜腔まで血管に追従した。深 夜出発点から約１．５ｃｍ下で右表在大腿動脈（ＳＦＡ）を３−〇の絹糸で結束 し、ＳＰＡの制御はＳＰＡ　／深夜接合部で得られ横方向動脈切開を作り上げた 。血管の壁との接触を確保するべく弾力性を提供するように２重になった細い針 金〔２０ゲージＩｎｔｒａｃａｔｈのスタイレット（探査針）を用いた〕を総大 腿動脈及び回腸動脈をさかのぼって上へ通過させて、Ｒｅ１ｄｙ　ｅｔａｔによ って記述された限定的損傷を生成した。針金を除去し、２０ゲージのａｎｇｉｏ ｃａｔｈを動脈切開内に挿入し、次の外科的処置の時点で直ちにアクセスできる ように下にある筋肉に固定した。切開を層状に閉じ、動物を回復させた。

２４時間後、α５Ｇ−Ｌａｃ−Ｚベクターのｃｒｉｐ産生体から収穫され８μｇ ／ｍｌの最終濃度になるまでポリブレンで補足された上清を含む組換え型ウィル スをインビボ転写のために用いた。再び動物を麻酔し、両方の切開を無菌環境内 で再度間いた。前に裸出された右回腸血管に対する外乱無く損傷された部域より 上の右回腸血管を制御できるようにするため＃　３　Ｐｏｇａｒｔｙ　”バルー ン塞栓切除カテーテルを左表在大腿動脈内の動脈切開を通して挿入し、大動脈分 岐まで通過させ、バルーンを血流を中断すべく膨張させた。右深夜大腿動脈は、 閉塞させた。組換え型レトロウィルスを含む上清（１０ｍｌ）を、右ＳＰＡ内に 前に置かれたａｎｇｉｏｃａｔｈを通しての手での注入により導入した。

上清は、右総大腿動脈から右外回腸動脈そして内回腸動脈内へとさか上った形で 流れた。上向回腸を開放状態に残すことにより、上溝のだめの流出が可能となり 、全１０ｍ１の上溝を点滴注入できた。これまでに行なわれた実験においては、 上溝は、４〜８時間の間血管の壁に露呈されていた。左側及び右側からのカテー テルを次に除去し、止血を行ない、切開部を閉じた。

１０〜１４日後、動物を麻酔してから安楽死させた。麻酔後、露呈前に、遠位血 管の直接触診により、潜在能を評価した。腎臓工大動脈及び工大静脈を外科的に 露出させ、カニユーレを挿入し、下肢の血管を生理圧力（９０ｍｍｈｇ、　）で ヘパリン化されたリンガ−乳酸塩Ｃ２１Ｉ／ｍｌ）で洗い流した。致死量のネム ブタルを投与し、動脈を１０分間０．１Ｍのカニジル酸塩中の０．５％のグルチ ルアルデヒド内でインシチュで潅流固定した。大動脈及び両回腸動脈を連続的に 切除し、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ　’）内で洗 い流した。

次に３７°Ｃで１〜１．５時間ｘ−ｇａ１基質中でのインキュベーションにより １ａｃＺ活性について血管を染色した。反応が完了した時点でｘ−ｇａｌ溶液を 洗い流しＰＢＳで置換し、写真撮影しこれを図１７に示した。

このプロトコルを用いて２つの実験を完了した。両方の実験共、細胞質パターン 内の選択的な強い染色（図１７）によって視覚化され証した。図１７Ａ及びＢは 、針金で損傷を受け、α５ＧＣ−ＬａｃＺ組換え型レトロウィルスに露呈され、 固定され１ａｃＺ活性について染色され、低倍率（図１７Ａ）及び高倍率（図１ ７Ｂ）で写真操影された外回腸動脈の１セグメントである。Ｒｅ１ｄｙ　ｅｔａ ｌ、によって記述された損傷及び増殖のパターンと一貫した強力に染色された青 色細胞のラインに留意されたい。図１７Ｃは、同じ様に固定され染色されたウィ ルスの部位に対し遠位の同じ動脈の低倍率での写真である。この部域は、控えめ で拡散したバックグラウンド染色しか示していない。

生物学的寄託 １９９１年ｌθ月３日、出願人は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ、、ＵＳＡ　（ＡＴＣＣ）に対して本書で記述した 第■因子の挿入を受けたプラスミドＭＦＧをＡＴＣＣ受入れ番号第６８７２６号 として、本書で記述したｔＰＡの挿入を受けたプラスミドＭＦＧをＡＴＣＣ受入 れ番号第６８７２７号として、本書で記述した第■因子の挿入を受けたプラスミ ドα−８ＧＣをＡＴＴＣ受入れ番号第６８７２８号として又、本書で記述したｔ ＰＡの挿入を受けたプラスミドα−３ＧＣをＡＴＣＣ受入れ番号第６８７２９号 として寄託した。１９９１年ＩＯ月９日、出願人は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ ｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ、、 ＵＳＡ　（ＡＴＣＣ）に対して、本書で記述したプラスミドＭＦＧをＡＴＣＣ受 入れ番号第６８７５４号として又本書で記述したプラスミドα−３’ＧＣをＡＴ ＣＣ受入れ番号第６８７５５号として寄託した。これらの寄託は、特許手続きを 目的とした微生物の寄託の国際的認定に関するブダペスト条約の規定ならびにそ れに基づく規則（［ブダペスト条約Ｊ）に基づいて行なわれたものである。これ により、寄託臼より起算して３０年間生存可能な培養の維持が保証される。これ らの生体は、ブダペスト条約の条件下でＡＴＣＣから入手可能であり、関連する 米国特許の発行時点で無制約の利用可能性を保証するＡＴＣＣと出願人の間の契 約に準拠する。寄託された株の利用可能性は、いずれかの政府当局がその特許法 に従って付与した権利を侵害して発明を実施することに対する許諾とみなされる べきもの当業者であれば、日常の実験以上のものを用いることなく、本書に特定 的に記述された発明の特定の実施態様の数多くの等価物を認識し、又それを確認 することができるだろう。このような等価物は、以下のクレームの範囲内に包含 されるべきものである。

ＦＩＧ、１ 日ａｒａＨＩ ＦＩＧ、４Ａ ＦＩＧ、４Ｄ ＦＩＧ、５Ｂ Ｆ善− ＦｉＩ！、９ｂ Ｆｉｇｕｒｅ　１０ 下記からのゲノムＤＮＡ Ｆｉｇｕｒｅ　１１ 下記からの全体のＲＮＡ １４〒 サブゲノムＥＮＡ　３．０ｋｂ ＦＩＧ、１２ 亥淋　亥械　亥械　殺淋　亥械　亥誂 ＦＩＧ、１３Ａ −９０ＫＤ　−−８０ＫＯ− Ｈ鎖　Ｌ　鎖 Ｆｉｇｕｒｅ　１５ ５．１５−嘲−−−・＠Ｉ＠１ ２．０３− Ｆ工Ｇ、１６ Ｆｉｇ、　１７ａ 補正書の翻訳文提出畜 （特許法第１８４条の８） 平成５年φ月３Ｄ日

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．問題の遺伝物質によりコードされるポリペプチド又はタンパク質をインビボ 発現させることができる、この問題の遺伝物質を中に取り込んだ形質導入された 内皮細胞において、前記遺伝物質がα−ＳＧＣ及びＭＦＣから成るグループの中 から選択されたレトロウイルスベクターを含む、形質導入された内皮細胞。
2. ２．問題の遺伝物質が、正常な内皮細胞の中に存在しかつこの細胞によって発現 されるＤＮＡ；通常内皮細胞内には発生しないＤＮＡ；内皮細胞内で通常発生す るもののその中で生物学的に有意なレベルでは発現されないＤＮＡ；及び内皮細 胞内で発現されうるように変更可能なあらゆるＤＮＡ、から成るグループの中か ら選択される、請求の範囲第１項に記載の形質導入された内皮細胞。
3. ３．少なくとも１つの選択可能な標識をコードするＤＮＡを付加的に含む、請求 の範囲第２項に記載の形質導入された内皮細胞。
4. ４．問題の遺伝物質が、治療上価値あるホルモン、レセプタ、酵素及びポリペプ チドから成るグループの中から選択されたタンパク質又はポリペプチドをコード する、請求の範囲第２項に記載の形質導入された内皮細胞。
5. ５．問題の遺伝物質が、ヒト副甲状腺ホルモン、組織プラスミノゲン活性化体、 第ＶＩＩＩ因子、低密度リボタンパクレセプタ又はべーターガラクトシダーゼを コードする、請求の範囲第４項に記載の形質導入された内皮細胞。
6. ６．問題の遺伝物質によってコードされたポリペプチド又はタンパク質をインビ ボ発現させることのできる、この問題の遺伝物質を中に取り込んでいる形質導入 されたヒト内皮細胞。
7. ７．問題の遺伝物質が、正常な内皮細胞の中に存在しかつこの細胞によって発現 されるＤＮＡ；内皮細胞内で通常発生するもののその中で生物学的に有意なレベ ルでは発現されないＤＮＡ；及び内皮細胞内で発現されうるように変更可能なあ らゆるＤＮＡ、から成るグループの中から選択される、請求の範囲第６項に記載 の形質導入されたヒト内皮細胞。
8. ８．少なくとも１つの優性選択可能標識をコードするＤＮＡを付加的に含む、請 求の範囲第７項に記載の形質導入されたヒト内皮細胞。
9. ９．問題の遺伝物質が、治療上価値あるホルモン、レセプタ、酵素及びポリペプ チドから成るグループの中から選択されたタンパク質又はポリペプチドをコード する、請求の範囲第７項に記載の形質導入されたヒト内皮細胞。
10. １０．問題の遺伝物質が、ヒト副甲状腺ホルモン、組織プラスミノゲン活性化体 、第ＶＩＩＩ因子、低密度リボタンパクレセプタ又はベータガラクトシダーゼを コードする、請求の範囲第９項に記載の形質導入されたヒト内皮細胞。
11. １１．天然に発生する内皮細胞によって作られない選択されたタンパク質をコー ドする取り込まれたＤＮＡ、及び選択可能な標識をコードするＤＮＡを含む、培 養された内皮細胞。
12. １２．問題の遺伝物質を中に取り込んだ形質導入された内皮細胞において、この 問題の遺伝物質がレトロウイルスベクタの一部として提供されたＲＮＡから逆転 写されている、問題の取り込まれたＤＮＡを発現することのできる形質導入され た内皮細胞。
13. １３．問題の遺伝物質を中に取り込んだ形質導入されたヒト内皮細胞において、 この問題の遺伝物質がレトロウイルスベクタの一部として提供されたＲＮＡから 逆転写されている、問題の取り込まれたＤＮＡを発現することのできる形質導入 されたヒト内皮細胞。
14. １４．少なくとも１つの問題のタンパク質又は少なくとも１つの問題のポリペプ チドをコードする問題の取り込まれた遺伝物質を発現する形質導入された内皮細 胞を作製する方法において；ａ）この遺伝物質がα−ＳＧＣ及びＭＦＧから成る グループの中から選択されたレトロウイルスベクターを含む、問題のＤＮＡを含 む組換え型ゲノムを有する感染性組換え型レトロウイルスを内含する培地と内皮 細胞を接触させる段階；及びｂ）形質導入された内皮細胞を産生するべく、組換 え型レトロウイルスによる内皮細胞の感染に適した条件の下に感染性組換え型レ トロウイルスを含む培地と内皮細胞を維持する段階；を含む方法。
15. １５．内皮細胞の感染がインビトロで起こる、請求の範囲第１４項に記載の方法 。
16. １６．内皮細胞の感染がインビボで起こる、請求の範囲第１４項に記載の方法。
17. １７．少なくとも１つの問題のタンパク質又は少なくとも１つの問題のポリペプ チドをコードする問題の取り込まれた遺伝物質を発現する形質導入された内皮細 胞を作製するインビボ方法において、ａ）内皮細胞の増殖を誘発するためのイン ビボ（生体内）で内皮組織を損傷させ、かくして増殖中の内皮細胞を産生する段 階；及びｂ）問題のＤＮＡを含む組換え型ゲノムをもつ感染性組換え型レトロウ イルスと増殖中の内皮細胞を接触させる段階を含む、インビボ方法。
18. １８．タンパク質又はポリペプチドを体に提供する方法において、このタンパク 質又はポリペプチドをコードする遺伝物質を用いてインビボで内皮細胞を形質導 入する段階を含む方法。
19. １９．タンパク質又はポリペプチドが、ホルモン、酵素、レセプタ及び薬物から 成るグループの中から選択される、請求の範囲第１８項に記載の方法。
20. ２０．タンパク質又はポリペプチドを体に提供する方法において、ａ）ホルモン 、酵素、レセプタ及び薬物をコードする遺伝物質のグループの中から選択されか つα−ＳＧＣ及びＭＦＧから成るグループの中から選択されたレトロウイルスベ クターで構成された遺伝物質を用いて、内皮細胞をインビトロで形質導入する段 階；ｂ）体内に形質導入された内皮細胞を導入するか又は、形質導入された内皮 細胞を体の表面に塗布する段階；を含む方法。
21. ２１．タンパク質又はポリペプチドを体に提供する方法において、ａ）ＭＦＧ及 びα−ＳＧＣから成るグループの中から選択されたレトロウイルスベクターを含 む組換え型ゲノムをもつ組換え型レトロウイルスを用いて、内皮細胞をインビト ロで感染させる段階；ｂ）形質導入された内皮細胞を体内に導入するか或いは又 体の表面に形質導入された内皮細胞を塗布する段階を含む方法。
22. ２２．タンパク質又はポリペプチドが、ホルモン、酵素、レセプタ及び薬物から 成るグループの中から選択される、請求の範囲第２１項に記載の方法。
23. ２３．組換λ型レトロウイルスを用いて内皮細胞をインビボで感染させることを 含む、タンパク質又はポリペプチドを体に提供する方法において、この組換え型 レトロウイルスがａ）このタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝物質； ｂ）両栄養性レトロウイルスから誘導されたＰｓｉパッケージング部位、ｔＲＮ Ａ結合部位及び長い末端反復配列、及びｃ）少なくとも１つの真核性プロモータ から成る組換え型ゲノムを有する方法。
24. ２４．タンパク質又はポリペプチドが、ホルモン、酵素、レセプタ及び薬物から 成るグループの中から選択されている、請求の範囲第２３項に記載の方法。
25. ２５．血栓崩壊タンパク質又はその一部分をコードする遺伝物質で形質導入され た内皮細胞を血管に適用することを含む、合成人工血管の血栓形成性を減少させ る方法。
26. ２６．遺伝物質が組織プラスミノーゲン活性化剤又はストレプトキナーゼをコー ドする、請求の範囲第２５項に記載の方法。
27. ２７．合成人工血管の内面をライニングする内皮細胞の集密的層を生成する方法 において、内皮細胞の増殖に適した条件の下で、内皮細胞マイトジェン（分裂促 進剤）をコードする取り込まれた遺伝物質を含む内皮細胞を血管の内面に塗布す る段階が含まれ、この遺伝物質がα−ＳＧＣ及びＭＦＧから成るグループの中か ら選択されたレトロウイルスベクターを含んでいる方法。
28. ２８．遺伝物質が内皮細胞成長因子をコードする、請求の範囲第２７項に記載の 方法。
29. ２９．合成血管の表面に対する内皮細胞の結合を強化する方法において、 ａ）リガンド支持表面を生み出すためリガンドを血管の表面に塗布する段階； ｂ）リガンドを結合する膜レセプタをコードする取り込まれた遺伝材料を含む内 皮細胞をリガンド支持表面上に接種する段階、及びｃ）リガンドと膜レセプタの 結合のために適切な条件下に血管を維持する段階、 を含む方法。
30. ３０．合成血管移植片の中での平滑筋細胞の成長を阻害する方法において、平滑 筋細胞の成長を阻害する産物をコードする組み込まれた遺伝物質を含む内皮細胞 を移植片に対し塗布する段階が含まれ、この遺伝物質にはα−ＳＧＣ及びＭＦＧ から成るグループの中から選択されたレトロウイルスベクターが含まれている方 法。
31. ３１．血管の内面上に問題の取り込まれた遺伝物質を発現する内皮細胞を有する 人工血管を製造する方法において、血管の内面を請求の範囲第１５項に記載の方 法によって作られた内皮細胞でライニングする段階を含む方法。
32. ３２．問題の取り込まれた遺伝物質を発現する内皮細胞でライニングされた人工 血管を製造する方法において、ａ）問題の遺伝物質から成る組換え型ゲノムを有 する感染性組換え型レトロウイルスを含む培地と、培養された内皮細胞を接触さ せる段階； ｂ）組換え型レトロウイルスによる内皮細胞の感染のために適切な条件の下で、 感染性組換え型レトロウイルスを含む培地と共に、培養された内皮細胞を維持す る段階；及びｃ）内皮細胞の維持のために適切な条件の下で、（ｂ）において感 染した内皮細胞を用いて人工血管の内面をライニングする段階、を含む方法。
33. ３３．哺乳動物体内の取り込まれた問題の遺伝物質を発現する内皮細胞でライニ ングされた人工血管を移植する方法において、ａ）問題の遺伝物質を有する感染 性組換え型レトロウイルスを含む培地と培養された内皮細胞を接触させる段階； ｂ）組換え型レトロウイルスによる内皮細胞の感染のために適切な条件の下で、 感染性組換え型レトロウイルスを含む培地と共に、培養された内皮細胞を維持す る段階； ｃ）内皮細胞の維持のために適切な条件の下で（ｂ）で感染した内皮細胞を用い て人工血管の内面をライニングする段階、及びｄ）（ｃ）で形成された人工血管 を哺乳動物の体内に導入する段階、を含む方法。