JP2001299367A - 内皮細胞の遺伝的変性 - Google Patents

内皮細胞の遺伝的変性

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 遺伝的に処理され、インビボでこれらの形質
を発現しうる内皮細胞を作成する。さらに、当該内皮細
胞の利用例として、人工血管への応用を行う。 【解決手段】 対象とするポリペプチドまたはタンパク
質および、場合によっては選択可能マーカーをコードす
る遺伝物質、例えばヒト副甲状腺ホルモンなどのホルモ
ン、第ＶＩＩＩ因子などのレセプター、ベータガラクト
シダーゼなどの酵素、および、天然に発生する内皮細胞
では作られない選択されたタンパク質などの選択可能マ
ーカを形質転換し、インビボで発現可能な内皮細胞を得
た。さらに、当該内皮細胞をライニングした血管を生体
移植する方法についても開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】後援 本書で記述される研究は、国立保健研究所、ハーワード
・ヒューズメディカルインスチチュート及びホワイトヘ
ッド生物医学研究所からの助成金により支援されたもの
である。
【０００２】背景技術 内皮は、縁部同士接合されその結果細胞の膜を形成して
いる平担化された透明な細胞の単層である。内皮細胞
は、胚の原中層細胞又は中胚葉からの発達中に源を発し
ている。これらの細胞は、前眼房内、脳や脊髄の表面上
及び漿膜の自由表面上に発生する。さらに、これらの細
胞は、心臓、血管及びリンパ腺のライニング膜を形成し
ている。
【０００３】近年開発された方法を用いて、種間遺伝的
組換えを達成することが可能である。異なる生物学的綱
に由来する遺伝子を、１つの選択された微生物の中で複
製し発現させることができる。従って、特定のウィルス
又はプラスミドレプリコン（複製単位）に遺伝子を連鎖
させることによってその他の生体綱の特徴である代謝又
は合成機能（例えばホルモン合成、タンパク質合成、窒
素固定）を特定する遺伝子を微生物内に導入することが
可能である。
【０００４】１９７０年後半以降、哺乳動物の体内にク
ローニングされたＤＮＡ配列を導入するための一般的方
法の開発に向かって進歩が見られた。しかしながら現在
のところ、選択された問題の遺伝物質を内皮細胞内に安
定した形で導入し、これらがそれを発現できるようにし
かくしてコードされたタンパク質又はポリペプチドを産
生する効果的な方法に対する必要性が存在する。
【０００５】発明の要約 ここで記述する発明は、遺伝的に処理された内皮細胞、
特に例えば問題の遺伝物質を含む組換え型ゲノムを有す
るレトロウィルスベクターを用いて、中に取り込まれた
この選択された問題の遺伝物質（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を
発現する遺伝的に処理された内皮細胞に関する。本発明
は同様に、このような遺伝物質を内皮細胞内に安定した
形で導入する方法及び遺伝的に処理された内皮細胞を用
いる方法にも関する。
【０００６】本発明の内皮細胞はその中に安定した形で
取り込まれた状態で、内皮細胞内での産生が望まれる１
つの産物（例えばタンパク質、ポリペプチド又は機能的
ＲＮＡ）をコードする問題の遺伝物質を有している。変
更された内皮細胞は、この取込まれた遺伝物質を発現す
る（コードされた産物を産生する）。この問題の遺伝物
質を、本書では「取込まれた遺伝物質」と呼ぶ。取込ま
れた遺伝物質は、問題のあらゆる選択されたＤＮＡ（例
えば、問題の産物をコードする遺伝子の一部分又は全
て）又は問題のＲＮＡであってよい。これは又、例え
ば、正常な内皮細胞の中に存在しこの細胞によって発現
されるＤＮＡ又はＲＮＡ；内皮細胞内に通常発生しない
ＤＮＡ又はＲＮＡ；通常内皮細胞中に発生するもののそ
れらの中で生物学的に有意なレベル（すなわちそれがコ
ードするタンパク質又はポリペプチドの正常な生理学的
効果を生み出すのに充分なレベル）では発現されないよ
うなＤＮＡ又はＲＮＡ；内皮細胞内に発生し、内皮細胞
内で発現されるように変更されたＤＮＡ又はＲＮＡ；及
び、内皮細胞内で単独で又は何らかの組合せの形で発現
すべく変更されうるあらゆるＤＮＡ又はＲＮＡでもあり
うる。本発明の内皮細胞は、同様に、選択可能な標識を
コードする遺伝物質を発現することもでき、かくして、
取込まれた遺伝物質を発現する細胞をインビトロ（生体
外）で識別し選択する手段を提供する。取込まれた遺伝
物質を含む内皮細胞を、「形質導入された内皮細胞」と
呼ぶ。
【０００７】特に、内皮細胞内で通常生物学的に有意な
レベルで発現されない問題のポリペプチド又はタンパク
質をコードする遺伝物質を含む遺伝物質を用いて内皮細
胞を安定した形で形質導入するためには、レトロウィル
スベクターが使用されてきた。このような形で導入され
る遺伝物質としては、優性の選択可能な標識をコードす
る遺伝物質も含まれていてよい。問題のポリペプチドを
単独でコードするＤＮＡ又は問題のポリペプチド及び優
性選択可能標識をコードするＤＮＡを含む遺伝物質が、
培養された内皮細胞内に導入された。これらの遺伝子が
取込まれた内皮細胞（すなわちレトロウィルスベクター
を使用して形質導入された内皮細胞）によるこれらの遺
伝子の発現も同様に実証されてきた。
【０００８】遺伝子はレトロウィルスベクターを用いて
内皮細胞内に導入されうることから、これらの遺伝子
は、レトロウィルスベクターの制御「上」にある（制御
を受けている）可能性がある；このような場合、問題の
遺伝子は、レトロウィルスプロモータから転写される。
代替的には、問題の遺伝物質の転写を担う付加的なプロ
モータ要素（組換え型レトロウィルス内に組込まれてい
るプロモータに加えて）をもつレトロウィルスベクター
を使用することができる。例えば、外部因子又はキュー
によって変調された付加的なプロモータが存在する構成
体を使用することができ、かくしてこの外部因子又はキ
ューを活性化することによって内皮細胞により産生され
つつあるポリペプチドのレベルを制御することが可能と
なる。例えば、熱ショックタンパク質というのは、プロ
モータが温度によって調節されている遺伝子によりコー
ドされるタンパク質のことである。金属含有タンパク質
メタロチオニンをコードする遺伝子のプロモータは、カ
ドミウム（Ｃｄ++）イオンに対する応答性をもつ。外部
キューにより影響されるこのプロモータ又はその他のプ
ロモータの取り込みも又、工学処理された内皮細胞によ
るポリペプチドの産生の調節を可能にする。
【０００９】内皮細胞は、インビトロ（生体外）又はイ
ンビボ（生体内）という２つの一般的セッティングの中
で形質導入を受けることができる。両方のセッティング
共、組換え型レトロウィルスベクター又はその他のベク
ターの使用を通してといったような、内皮細胞内への問
題の遺伝物質の転移のための方法の利用を必要とする。
インビトロ形質導入の場合、組織培養管内で成長させら
れた内皮細胞は、問題の遺伝物質をコードする組換え型
レトロウィルスといったようなベクターに露呈され、か
くして、形質導入された内皮細胞を産生する。このと
き、遺伝物質でインビトロで形質導入を受けた内皮細胞
はさまざまな既知の方法のうちの１つを用いて移植され
る。このような方法には、形質導入された内皮細胞でラ
イニングされた合成血管又は人工弁の移植又は形質導入
を受けた内皮細胞を収納するべく設計された装置又はマ
トリクスの移植などがあるが、これらに制限されるわけ
ではない。
【００１０】代替的には、１つの組織又は器官内で内皮
細胞に問題の遺伝物質を転移するための方法を適用する
ことによって、インビボで形質導入を行なうことが可能
である。インビボ形質導入の場合、組織又は器官内に存
在する内皮細胞は、例えば問題の遺伝物質をコードする
組換え型レトロウィルスに露呈される。このような方法
としては、特定の１器官、四肢又は血管の中への（例え
ばカテーテルを介しての）部位特異的投与が含まれる
が、これに制限されるわけではない。インビトロで形質
導入された内皮細胞とは異なり、インビボで形質導入さ
れたこれらの内皮細胞は、その次に続く移植のための方
法を必要としない。
【００１１】インビトロで形質導入された内皮細胞を移
植する方法も同様に本発明の主題である。インビトロで
形質導入された内皮細胞は、血管再建手術において使用
される補てつ移植片（例えばダクロンやゴアテックスな
どの合成材料で作られた血管）を改善するのに特に有用
である。例えば、生きた器官又は四肢を灌流させる疾患
のある動脈に置換するべく人工動脈移植片が往々にして
用いられる。しかしながら現在入手可能な移植片は通常
合成材料で作られており、数多くの合併症を伴い、その
中でも最悪のものは、高い率の再狭窄又は閉塞である。
動物実験は、移植片を移植前に自己由来の内皮細胞でラ
イニングすることが移植片の再狭窄とそれに付随する病
的結果を減少させることはできるが、それを防止するこ
とはできない。
【００１２】しかしながら、移植された移植片の状況下
でその性能を改善するような形で本発明の方法に従って
内皮細胞を変更することが可能である。その例として
は、管腔内の凝塊形成を防ぐため、血栓崩壊剤の分泌又
は発現、平滑筋の肥大による管腔狭窄を防ぐための平滑
筋増殖阻害因子の分泌及び、内皮細胞の増殖を刺激し移
植管腔の内皮細胞ライニングの程度又は持続時間を改善
するための内皮細胞マイトジュン又はオートクリン（ａ
ｕｔｏｃｒｉｎｅ）因子の発現及び／又は分泌などが含
まれる。
【００１３】類似の利用分野については、本発明の内皮
細胞は同様に、弁の表面の血栓形成力を低くすることに
よって塞栓形成の危険性を減少させるべく人工心臓弁の
表面を覆うのに使用することも可能である。
【００１４】本発明の方法によって形質導入された内皮
細胞又は形質導入された内皮細胞でライニングされた血
管移植片は同様に、疾病の予防又は治療において役立つ
ポリペプチド又はタンパク質の構成的合成及び送達を提
供するのにも利用できる。このようにして、ポリペプチ
ドは、人間の血流内に直接分泌される。これとは対照的
に、現在利用可能な方法には、望まれるポリペプチドの
非経口投与が関与している。
【００１５】さらに、分離されたポリペプチド（例えば
インシュリン）の場合に一般に必要であるように、固体
に投与する前にポリペプチドを大量に（そして往々にし
て高い費用をかけて）精製する必要は全く無い。本発明
に従って変更された内皮細胞は、通常産生される通りに
ポリペプチドホルモンを産生する。
【００１６】遺伝的に工学処理された内皮細胞の使用の
もう１つの利点は、特定の器官又は四肢に対し治療的レ
ベルの分泌産物の送達をターゲティングすることができ
るということにある。例えば、インビトロで形質導入さ
れた内皮細胞でランニングのほどこされた血管移植片を
特定の１器官又は四肢の中に移植することが可能であ
る；又、特定の四肢、器官又は血管の内皮細胞をインビ
ボで形質導入することも可能である。形質導入されて内
皮細胞の分泌産物は高濃度で灌流された組織へと送達さ
れ、かくして標的となった解剖学的場所に対する望まし
い効果を達成することになる。この産物は次に、心臓へ
の戻りの間に静脈循環内で非治療的レベルにまで希釈さ
れる。
【００１７】本発明の送達システムのもつもう１つの重
要な利点は、それが連続したシステムであることから、
ホルモンポリペプチドの短かい半減期が制限となること
はないという点にある。例えば、ヒト成長ホルモン（Ｈ
ＧＨ）の半減期は約１９分であり、副甲状腺ホルモンの
半減期は約２ １／２〜５分である。
【００１８】
【発明の実施の形態】問題の遺伝物質は、内皮細胞内に
取り込まれ、結果として得られる工学処理された内皮細
胞内で発現させられた。記述された方法に従って内皮細
胞内に取り込まれる問題の遺伝物質は、問題のあらゆる
選択されたＤＮＡ（例えば問題の産物をコードする遺伝
子の全て又は一部分）又は問題の産物をコードするあら
ゆる選択された遺伝子）又は問題のあらゆる選択された
ＲＮＡであってよい。例えば、これは、正常な内皮細胞
内に存在しその中で発現されるＤＮＡ又はＲＮＡ；内皮
細胞内で通常発生しないＤＮＡ又はＲＮＡ；通常２−内
皮細胞内に発生するもののその中で生物学的に有意なレ
ベル（それがコードするタンパク質又はポリペプチドの
正常な生理学的効果を生み出すのに充分なレベル）では
発現されないＤＮＡ又はＲＮＡ；内皮細胞内に発生しか
かる細胞内で発現されうるような形で変更されているＤ
ＮＡ又はＲＮＡ；及び単独で又は何らかの組合せた形で
内皮細胞内で発現されるよう変更可能なあらゆるＤＮＡ
又はＲＮＡであってよい。この問題の遺伝物質をここで
は、「取込まれた遺伝物質」と呼ぶ。
【００１９】本発明の内皮細胞は、取込まれた遺伝物質
を発現する。例えば、本発明の内皮細胞は、問題のポリ
ペプチド又はタンパク質をコードする遺伝物質（問題の
遺伝物質）を発現する。本発明の内皮細胞は同様に、選
択可能な標識をコードする遺伝子をも内含し発現するこ
とができる。取込まれた遺伝物質を発現する内皮細胞を
ここでは「形質導入された内皮細胞」と呼ぶ。
【００２０】通常内皮細胞内に存在しこれによって発現
されるＤＮＡである問題の遺伝物質は、内皮細胞内に取
り込まれることが可能で、その結果、内皮細胞は望まれ
るタンパク質、ポリペプチド又はＲＮＡを過剰産生する
ことができることになる。
【００２１】本書中に詳述するように、１つのホルモン
をコードする遺伝物質が、組換え型ゲノムを有するウィ
ルスを含む培地に内皮細胞を露呈することによって（す
なわちこれらの細胞を感染させることによって）、これ
らの細胞内に導入された。使用した培地は、組換え型ウ
ィルス産生細胞が増殖された培地を収獲することによっ
て得られたウィルス上清であった。すなわち、１０％の
仔ウシ血清（ＣＳ）及びペニシリン及びストレプトマイ
シンを伴うダルベッコの調整イーグル培地（ＤＭＥ）内
で集密的な密度まで組織培養にて産生細胞を増殖させ
た。新鮮な培地を付加し、ひきつづいて（例えば約１２
時間後）、培地を収獲した。集密的産生細胞の１０ｃｍ
のプレートから約１０ｍｌの培地を収穫した。収獲した
培地（又はウィルスストック）を０．４５ミクロンのミ
リポア・フィルタを通してろ過して離脱した産生細胞を
除去し、細胞を感染させるため直ちに使用した。或いは
又これは−７０℃で保存されている。培地を内皮細胞
（受容内皮細胞）亜集密的プレートから除去し、８ｍｃ
ｇ／ｍｌのポリブレン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むウィル
スストック（例、プレート１０ｃｍあたり５ｍｌ）で迅
速に交換した。その後（例えば約１２時間後）、これを
除去し新鮮培地と交換した。
【００２２】感染性ウィルスの組換え型ゲノムは、内皮
細胞内に取込まれている問題の遺伝物質を含む。組換
え，型ゲノムは同様に、優性選択可能標識をコードする
遺伝物質も有することができる。通常生物学的に有意な
レベルでは発現できないポリペプチドを発現する形質導
入された内皮細胞及び任意には優性の選択可能な標識
を、本書で記述する要領で作製した。
【００２３】１つのケースにおいて、組換え型ゲノム
は、ヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ）をコードする遺
伝物質を含んでいた。もう１つのケースでは、組換え型
ゲノムは同様に、優性の選択可能な標識をコードする遺
伝子（例えば、細菌中ではネオマイシン耐性を又哺乳動
物細胞内ではＧ４１８耐性をコードするｎｅｏ遺伝子）
をも含んでいた。その結果、内皮細胞は形質導入を受け
た、すなわち、問題の遺伝物質（この場合、ｈＰＴＨを
コードするＤＮＡ及び任意にはｎｅｏ遺伝子）は内皮細
胞内に安定した形で導入された。形質導入された内皮細
胞は、コードされたｈＰＴＨを単独で又はｎｅｏ耐性タ
ンパク質に加えて発現し、その結果細胞は選択可能な特
性をもつことになる。
【００２４】もう１つのケースでは、組換え型ゲノムは
問題の遺伝物質（例えば、凝固性第ＶＩＩＩ因子タンパ
ク質又は組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ））の
みを含み、優性な選択可能標識をコードする遺伝子（例
えば、ｎｅｏ遺伝子）を含んでいなかった。その結果、
形質導入された内皮細胞は、第ＶＩＩＩ因子タンパク質
又はｔＰＡを優性選択可能標識の無い状態で発現するこ
とになる。
【００２５】上述のように、内皮細胞は分泌産物（例え
ばヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ）（例１参照））、
組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）（例５参照）
及びヒトの凝固性第ＶＩＩＩ因子タンパク質（例６参
照）に対しコードする遺伝子；膜レセプタ（例えば低密
度リポタンパクレセプタ（ＬＤＬＲ））に対しコードす
る遺伝子（例２参照；及び細胞間細菌性酵素（例えばベ
ータガラクトシダーゼ））に対しコードする遺伝子（例
３参照）を用いて形質導入された。
【００２６】内皮細胞の形質導入は、インビトロ又はイ
ンビボのいずれでも行なうことができる。例えば、内皮
細胞のインビボ形質導入は、特定の器官、四肢又は血管
内に（例えば例８に記されているようにカテーテルを介
して）組換え型レトロウィルスを部位特異的に投与する
ことにより固体の体内に導入される組換え型レトロウィ
ルスを用いて行なうことができる。内皮細胞のインビボ
形質導入はいくつかの利点を有し、そのうちの１つは、
形質導入を受けた内皮細胞を移植する方法が必要で無い
という点にある。インビトロで形質導入された内皮細胞
は、培養血管から切除された組織培養血管内でまず成長
させられ、次に体内に導入又は移植される。
【００２７】インビトロで形質導入された内皮細胞は、
いくつかの方法のうちの１つによって被移植者の体内に
導入できる。例えば、形質導入を受けた内皮細胞を人工
血管の管腔上に接種することができ、ここでこれらの細
胞は血管の管腔を覆って集密性に至るまで成長すること
になる。細胞は、天然血管の内膜及び中膜に似ている充
分に組織立った構造である新生内膜と呼ばれるもののラ
イニングを形成する（すなわち、平滑筋細胞のさらに深
い層を伴う内皮細胞のカバリング）。このアプローチの
実施可能性は、自己由来のレトロウィルス形質導入を受
けた内皮細胞が接種された血管移植片をイヌの体内に移
植した実験によって立証されている（例４参照）。
【００２８】雑種の成犬から収獲した外頸静脈を、２回
の連続継代により１０〜１４日間インビトロで平板培養
した内皮細胞の供給源として利用した。各動物からの細
胞を２つのアリコートに分割し、リポータ遺伝子、ベー
タ−ガラクトシダーゼを含む複製不全レトロウィルスに
感染させるか、或いは又擬似感染させた。自己凝塊方法
により内皮細胞を亜集密的密度で小さな直径のダクロン
移植片に接種し、細胞を収穫したイヌの体内に頸動脈間
置移植片として外科的に移植した；各々のイヌは、遺伝
的に変更された細胞が接種された移植片及び、擬似感染
細胞が接種された対側性移植片を受けた。移植から５週
間後に、移植片を収獲し分析した。
【００２９】より詳細な特徴づけを可能にするべく、移
植片の一部分の管腔表面から酵素的に細胞を収獲した。
細胞の一次培養を作成し、分析に先立ち約２〜３週間イ
ンビトロで拡張させた。遺伝的に変更された内皮細胞
を、サザン分析及びｌａｃＺ遺伝子がコードするベクタ
ー発現されたベータガラクトシダーゼについての細胞化
学検定によって、この固体群の中で識別した。
【００３０】移植片から収穫されインビトロで拡張され
た細胞の大部分（９５％未満）が、分化された内皮機能
を保持していた。しかしながら、ウィルス誘導ベータガ
ラクトシダーゼを発現したか又はプロウィルス配列を含
んでいた細胞の割合は、接種時点で分析された培養に比
べ２〜１０分の１に一貫して減少していた。この不一致
は一部分には、融着から又は間隙を通しての成長による
内皮細胞を伴う移植片の部分的再増殖によるものであ
る。形質導入された細胞は少なくとも５週間移植片の管
腔上に存続し、形質導入された遺伝子は機能し続けた。
【００３１】代替的には、インビトロで形質導入された
内皮細胞をカテーテルを利用してインビボで血管上に移
植することができる。腹腔、胸膜空間及び心膜空間とい
ったような漿膜によりライニングされている体腔内に形
質導入された内皮細胞を導入することも可能である。こ
の場合、内皮細胞は漿膜ライニングを接種し、腔内に産
物を分泌する。このときこの産物はリンパ系を介して吸
収される。
【００３２】内皮細胞の分離 脊椎動物の数多くの種の毛細血管及び大きな血管（例え
ば動脈、静脈）からの内皮細胞の分離及び維持は、文献
中に充分に記述されてきている。例えば、ＭｃＧｕｉｒ
ｅ及びＯｒｋｉｎは小動物の大きい血管からの内皮細胞
を培養し継代するための単純な手順を記述している。Ｍ
ｃＧｕｉｒｅ，Ｒ．Ｗ及びＲ．Ｗ．Ｏｒｋｉｎ，Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，５：５４６−５５４（１９８
７）。
【００３３】往々にして仔ウシの大動脈が内皮細胞の供
給源である。大きな動脈からの内皮細胞の分離のための
代表的プロトコルについて以下で説明する。収穫された
ばかりの大動脈の切片を、３７℃で１５〜２０分間コラ
ゲナーゼを含む溶液中で（例、０．５ｍｇ／ｍｌ）、無
菌状態に置く。次に大動脈を２回培地（例えばＲＰＭＩ
１６４０）で２回洗い流し、管腔の内皮細胞薄膜を、Ｂ
ｏｏｙｓｅ ｅｔａｌの方法に従って穏やかな撹拌によ
り完全培地（１５ｍｍのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．４、ペニ
シリン／ストレプトマイシン及び２０％のウシ胎児血清
を含むＲＰＭＩ）内で除去する。Ｂｏｏｙｓｅ，Ｆ．Ｍ
ｅｔａｌ．，ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＤｉａｔｈ，Ｈａ
ｅｍｏｒｓｈ，３４：８２５−８３９（１９７５）。細
胞パッチは、組織培養フラスコの完全培地内に移され
る。
【００３４】細胞は、プレートを分割し場合によってこ
れをカバーする；プレートが集密的である場合、細胞は
標準的な組織培養技術を用いて継代されうる。培養の純
度は、内皮細胞によって特異的に取り込まれる蛍光標識
づけされたアセチル化ＬＰＬの摂取によって評価され
る。培養が純粋でない場合（すなわち平滑筋細胞又は線
維芽細胞といったような内皮細胞以外の細胞で汚染され
ている場合）、内皮細胞は、希釈を制限することにより
クローニングされ、純粋培養を生み出すため拡張させら
れる。内皮細胞の寿命は培養内では制限されているが、
解剖学的供給源及び供与動物に応じて著しく変化する。
ウシ大動脈内皮細胞は、少なくとも１５〜２０継代の間
培養内に維持された。
【００３５】イヌ内皮細胞は、外頸静脈の外植されたセ
グメントから分離することができ、ヒト細胞は臍（さ
い）静脈又は伏在静脈のいずれかのセグメントから分離
できる。ヒト内皮細胞の純粋培養を再現可能な形で生み
出すもののイヌの静脈からの内皮細胞及び平滑筋の混合
培養を産生することのできるコラゲナーゼ処理が関与す
る公表された手順により、全ての細胞を血管壁から自由
にすることができる。（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ．
ａｌ，．Ｔｒａｍｓ Ａｍ．Ｓｏｃ，ＡｒｔｉｆＩｎｔ
ｅｒｎ Ｏｒｇａｎｓ，２９：１７７１８２（１９８
３）；Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｍ．Ｔ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｓｕ
ｒｇ．Ｒｅｓ．，３６：５８８−５９６，１９８４）。
平滑筋細胞の過剰成長に対する可能性を制限するため、
イヌの内皮細胞を、平滑筋マイトジュンが低い培地補足
物である血漿由来の血清の中で培養することができる。
全ての培養は、筋間特異的アクチンアイソフォームを認
識するモノクローナル抗体で平滑筋細胞を識別し、第Ｖ
ＩＩＩ因子関連抗原（Ｗａｇｎｅｒ，Ｄ．Ｄ．，ｅｔａ
ｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９５；３５５−３６
０，１９８２）を認識する抗血清ならびに上述のような
標識づけされたアセチル化ＬＤＬで内皮細胞を識別する
免疫組織化学手順によって監視することができる。
【００３６】レトロウィルスベクター レトロウィルスはＲＮＡウィルスである；すなわちウィ
ルスゲノムはＲＮＡである。しかしながらこのゲノミッ
クＲＮＡは、形質導入された細胞の染色体ＤＮＡの中に
安定した形で効率良く組み込まれるＤＮＡコピーの中に
逆転写される。この安定した形で組込まれたＤＮＡコピ
ーはプロウィルスと呼ばれ、その他のあらゆる遺伝子と
同様、娘細胞によって受け継がれる。図１に示されてい
るように、野生型レトロウィルスゲノム及びプロウィル
スＤＮＡは３つの遺伝子、すなわち２つの長末端反復
（ＬＴＲ）配列によりフランキングされた−ｇａｇ，ｐ
ｏｌ及びｅｎｖを有する。ｇａｇ遺伝子は内部構造（ク
ヌレオカプシド）タンパク質をコードする；ｐｏｌ遺伝
子はＲＮＡ誘導ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）をコ
ードする；又ｅｎｖ遺伝子は、ウィルス性外被糖タンパ
ク質をコードする。５′及び３′のＬＴＲは、ウィルス
粒子ＲＮＡの転写及びポリアデニル化を促進するのに役
立つ。
【００３７】５′ＬＴＲに隣接して存在するのは、ゲノ
ムの逆転写（ｔＲＮＡプライマ結合部位）及び粒子内へ
のウィルス性ＲＮＡの効果的な包膜（Ｐｓｉ部位）のた
めに必要な配列である。Ｍｕｌｌｉｇｅｕ，Ｒ．Ｃ．，
のＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｇｅｖｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（遺伝子発現
の実験的操作）、Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ（ｅｄ）．１５５−
１７３（１９８３）；Ｍａｎｎ，Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｃ
ｅｌｌ（細胞）、３３：１５３−１５９（１９８３）；
Ｃｏｎｅ，Ｒ．Ｄ．及びＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．（国立
科学アカデミー会報）Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６３４９−６
３５３（１９８４）。
【００３８】包膜（又は感染性ウィルス粒子内へのレト
ロウィルスＲＮＡのパッケージング）のために必要な配
列がウィルスゲノムから欠如している場合、結果は、ゲ
ノミックＲＮＡの包膜を防止するシス作用性欠損であ
る。しかしながら、結果として得られる突然変異体は、
なおも全てのウィルス粒子タンパク質の合成を誘導する
ことができる。Ｍｕｌｌｉｇａｎ及び共同研究者は、こ
れらのＰｓｉ配列が欠失させられたレトロウィルスゲノ
ムならびに、染色体内に安定した形で組み込まれた突然
変異体ゲノムを含む細胞系統について記述している。Ｍ
ｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．，のＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ（ｅｄ）．１５５
−１７３（１９８３）；Ｍａｎｎ，Ｒ．，ｅｔａｌ．，
Ｃｅｌｌ，３３：１５３−１５９（１９８３），Ｃｏｎ
ｅ Ｒ．Ｄ．及びＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａ
ｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｕｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．
Ａ．，８１：６３４９−６３５３（１９８４）。これら
の刊行物の教示は、本書中に参考として内含されてい
る。
【００３９】Ｍｕｌｌｉｇａｎ及び共同研究者が記述し
ているように、Ｐｓｉ２細胞系統は、以下のような要領
で構築された：すなわち、ウィルス粒子内へのウィルス
性ＲＮＡの包膜に関与する領域又はゲノムが欠失してい
る（図１のＰｓｉ配列）ような突然変異体マウス白血病
ウィルス（ＭｕＬＶ）ゲノムを構築した。このゲノムを
ＤＮＡ同時トランスフェクションによりＮＩＨ３Ｔ３細
胞内に安定した形で導入し、包膜のために使用されるウ
ィルスタンパク質の全てを産生しそれでも非感染性粒子
を出芽した安定したトランスフェクタントを分離した。
ＭｕＬＶの突然変異体を、Ｐｒ６５ｇａｇのためのコー
ティング配列を開始するＡＵＧと推定のｅｎｖ ｍＲＮ
Ａ５′スプライス部位の間の感染性プロウィルスＤＮＡ
クローンから３５１個のヌクレオチドを欠失させること
によって構築した。欠失は、Ｂａｌ Ｉ部位からＰａｔ
Ｉ部位まで行ない、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を欠失箇所で
生成した。
【００４０】ｐＭＯＶ．（ｐＭＯＶＰｓｉ）は以下のよ
うに構築された：すなわち、３つの精製されたＤＮＡフ
ラグメントを合わせて連結させてｐＭＯＶＰｓｉを構築
した。第１のものは、ｐＭＯＶＰｓｉｔをＸｈｏ Ｉで
完全になるまで消化させその後ＥｃｏＲ Ｉで部分消化
することによって得られた。Ｃｈｕｍｏ−Ｋｏｖ，Ｉ．
ｅｔａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
（ウィルス学ジャーナル）、４２：１０８８−１０９８
（１９８２）。ＭｕＬＶ内の２．０ｕのＸｈｏＩ部位か
ら、全てｐＢＲ３２２のものである３′ＬＴＲ，３′マ
ウスフランキング配列を通って延びＥｃｏＲＩＩ部位で
終わるフラグメントを、電気泳動分離の後アガロースゲ
ルから精製した。Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ及びＰ．Ｇ
ｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，７６１：６１５−６１９（１９
７９）。第２のフラグメントは、ＢａＩで完全に；なる
までｐＭＯＶＰｓｉｔを消化しその後ｐＢＲ３２２内の
Ｂａｌ Ｉ部位から５′マウスフランキング配列及び
５′ＬＴＲを通ってＭｕＬＶの０．７ ｕにあるＢａｌ
Ｉ部位まで延びるフラグメントを精製することによっ
て得られた。その後、ＨｉｎｄＩＩＩリンカー（共同研
究）をＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いてこのフラグメント
に平滑連結させ、余剰のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ
でフラグメントを消化した。ＬＴＲ含有フラグメントを
電気泳動分離の後アガロースゲルから精製した。最終連
結反応内に存在する第３のフラグメントは、ＭｕＬＶの
ｇａｇ／ｐｏｌ領域がｐＳＶ２内にサブクローニングさ
れたｐＳＶ２ｇａｇ／ｐｏｌから得られた。Ｍｕｌｌｉ
ｇａｎ，Ｒ．Ｃ，及びＰ．Ｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｕｃｅ，
２０９：１４２２−１４２７（１９８０）。ｐＳＶ２ｇ
ａｇ／ｐｏｌをＸｈｏ Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて
完全になるまで消化させ、電気泳動分離の後アガロース
ゲルから、ＨｉｎｄＩＩＩ部位（ＭｕＬＶの１．０ ｕ
でＰｓｔ Ｉ部位から変化したもの）からＭｕＬＶの
２．０のＸｈｏ Ｉまで延びるフラグメントを精製し
た。これら３つのＤＮＡフラグメントを次に等モル量で
合計ＤＮＡ濃度５０μｇ／ｍｌで、リガーゼ緩衝液（５
０ｍＭのトリス−Ｈｃｌ〔ｐＨ７．８〕、１０ｍＭのＭ
ｇＣｌ2、２０ｍＭのジチオトレイトール、１．０ｍＭ
のＡＴＰ、５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）中で
混合し、１８時間１５℃でＴ４ ＤＮＡリガーゼでイン
キュベートした。Ｅ．Ｃｏｌｉ（大腸菌）ＨＢ１０１を
連結されたＤＮＡでトランスフェクションさせ、アンピ
シリン耐性トランスフェクタントを得た。一定数の形質
転換体から得たプラスミドを、適切な制限エンドヌクレ
アーゼでの消化及びアガロースゲルを通しての電気泳動
により望まれる構造についてスクリーニングした。Ｄａ
ｕｉｓ．Ｒ．Ｗ ｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（酵素学方法）６５；４０４−４
１１（１９８０）。
【００４１】染色体内に安定した形で組み込まれたＰｓ
ｉ突然変異体を含む細胞系統を、ＸＧＰＲＴ発現が可能
なＳＶ４０ハイブリッドベクターであるｐＳＶ２ｇｐｔ
とｐＭＯＶ−Ｐｓｉの同時トランスフェクションによっ
て作製した。Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．及びＰ．Ｂｅ
ｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９：４２２−１４２７（１
９８０）。このようにして得られたｇｐｔ＋コロニーか
らの細胞をクローニングし、Ｐｓｉ−１，Ｐｓｉ−２及
びＰｓｉ−３という３つの系統の形で確立した。
【００４２】Ｍｕｌｌｉｇａｎ及び共同研究者によって
記述されたＰｓｉ２細胞系統は、環境栄養性（エコトロ
ピック）モロニーマウス白血病ウィルス（Ｍｏ−ＭｕＬ
Ｖ）クローンであるｐＭＯＶ−ＰｓｉでＮＩＨ３Ｔ３内
皮細胞をトランスフェクションすることによって作られ
た，。ｐＭＯＶＰｓｉは、全てのウィルス性遺伝子産物
を発現するが、ウィルスゲノムの包膜に必要なものであ
るＰｓｉ配列が欠如している。ｐＭＯＶ−Ｐｓｉ−は、
マウス（及び密に関係するげっ歯類）細胞上にのみ存在
するレセプタを認識する環境栄養性ウィルス外被糖タン
パク質を発現する。
【００４３】もう１つの細胞系統は、Ｐｓｉ−２様のパ
ッケージング細胞系統であるＰｓｉａｍ系統である。こ
れらのＰｓｉ−ａｍ細胞系統は、変更されたｐＭＯＶ−
Ｐｓｉ−ゲノムを含んでおり、この中では環境栄養性外
被糖タンパク質は、両栄養性ウィルス４０７０Ａから由
来するエンベロープ配列で置換されている。Ｈａｒｔｌ
ｅｙ，Ｊ．Ｗ．及びＷ．Ｐ．Ｒｏｗｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９；１９−２５（１９７
６）。その結果、これらの細胞系統は、両栄養性宿主域
を伴う組換え型ウィルスの産生のために役立つ。Ｐｓｉ
ａｍ細胞系統を作製するのに用いられるレトロウィル
スは、非常に広い哺乳動物宿主域（両栄養性宿主域）を
有し、ヒトの細胞を感染させるのに用いることができ
る。組換え型ゲノムがＰｓｉパッケージング配列を有す
る場合、Ｐｓｉ−ａｍ細胞系統は、感染性レトロウィル
ス粒子内に組換え型レトロウィルスゲノムをパッケージ
ングすることができる。Ｃｏｎｅ，Ｒ．及びＭｕ１ｌｉ
ｇａｎ，Ｒ．Ｃ．Ｐｎｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．８１；６３４９−６３５３
（１９８４）。
【００４４】その他の２つのパッケージング細胞系統
は、ＰｓｉＣＲＩＰ及びＰｓｉＣＲＥとして知られてい
る。これらの細胞系統は、それぞれ両栄養性及び環境栄
養性の宿主域をもつ高い力価の組換え型レトロウィルス
を安定した形で産生するクローンを分離するのに有用で
あることが立証されている。これらの細胞系統について
は、Ｄａｎｏｓ，Ｏ．及びＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎの
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．８５：６４６０−６４６４（１９８８）及び１
９８８年９月１日付の米国特許出願明細書第０７／２３
９，５４５の中に記述されている。この参考文献及び特
許出願明細書の教示は本書に参考として内含される。Ｐ
ｓｉＣＲＩＰ及びＰｓｉＣＲＥは、ブダペスト条約の条
文に基づきそれぞれＣＲＬ９８０８及びＣＲＬ９８０７
という受入番号でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ
ｊｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｕｉｌｌ
ｅ，ＭＤに寄託されている。
【００４５】野生型レトロウィルスゲノムは，、Ｃｏｎ
ｅ及びＭｕｌｌｉｇａｎにより、細胞内に新しい遺伝子
を導入することのできるベクターとして使用するために
変更された。図２に示されているように、ｇａｇ，ｐｏ
ｌ及びｅｎｏ遺伝子は全て除去され、ｎｅｏ遺伝子をコ
ードするＤＮＡセグメントがその代りに挿入された。ｎ
ｅｏ遺伝子は優性の選択可能標識として役立つ。組換え
型ゲノムの一部としてとどまるレトロウィルス配列には
ＬＴＲｓ，ｔＲＮＡ結合部位及びＰｓｉパッケージング
部位が含まれる。Ｃｅｐｋｏ，Ｃ ｅｔａｌ．，Ｃｅｌ
ｌ，３７：１０５３−１０６２（１９８４）。
【００４６】本発明の形質導入された内皮細胞を産出す
る上で用いられた付加的なベクター構成が図２に表わさ
れており、以下でこれについて記述する。ｐＬＪ． こ
のベクターの特性は、Ｋｏｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．ｅｔａ
ｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｕ．Ｓ．Ａ．８４；２１５０（１９８７）中に記述され
ている。このベクターは、問題の遺伝子とｎｅｏ遺伝子
などの優性選択可能標識という２つの遺伝子を発現する
ことができる。問題の遺伝子は、直接配位で、５′ＬＴ
Ｒに対してちょうど遠位のＢａｍＨ Ｉ／Ｓｍａ Ｉ／
Ｓａｌ Ｉクローニング部位内へクローニングされ、一
方ｎｅｏ遺伝子は、クローニング部位よりさらに３′の
ところである（クローニング部位から３′のところにあ
る）内部プロモータ（ＳＶ４０からの）に対し遠位に置
かれている。ＰＬＪからの転写は２つの部位で開始され
る；すなわち１）問題の遺伝子の発現を担うものである
５′ＬＴＲ及び２）ｎｅｏ遺伝子の発現を担う内部ＳＶ
４０プロモータである。ｐＬＪの構造は図２に示されて
いる。
【００４７】ベクターｐＬＪは図２に示されている。ｐ
ＬＪ内では、問題の遺伝物質はちょうど５′ＬＴＲの後
に挿入される。この遺伝物質の発現はＬＴＲから転写さ
れ、ｎｅｏ遺伝子の発現は内部ＳＶ４０プロモータから
転写される。
【００４８】ｐＥｍ． この単一のベクター内では、野
生型ウィルスのｇａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖに対するコー
ティング配列全体は、発現された唯一の遺伝子である問
題の遺伝子で置換されている。ｐＥｍベクターの構成要
素について以下に記述する。５′フランキング配列、つ
まり５′ＬＴＲ及び４００ｂｐの隣接する配列（Ｂａｍ
Ｈ Ｉ部位まで）はＰＺＩＰからである；しかしながら
３′ＬＴＲから１５０ｂｐ上流のＣｌａ Ｉ部位は、合
成のＢａｍＨ Ｉリンカーと連結されており、ベクター
内に存在するＢａｍＨ Ｉクローング部位のもう１つの
半分を形成する。ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄＩＩＩ／Ｅｃ
ｏＲＩはプラスミドバックボーンを形成する。このベク
ターは、モロニーマウス白血病ウィルスの１株からのク
ローニングされた配列に由来する、骨髄増殖性間脱ウィ
ルスに由来する配列から、類似のベクターが構築され
た。ｐＥｍの構造は図３に示されている。
【００４９】選択可能標識の無いベクターも又、問題の
遺伝物質で内皮細胞を形質導入するのに用いることがで
きる。このようなベクターは基本的に、このような標識
が中に存在する前述のベクターの単純化である。ベクタ
ーｐＥｍは図３に示されている；示されているとおり、
このベクターの主構成要素は５′と３′ＬＴＲ、及び２
つのＬＴＲの間に挿入された問題の遺伝物質である。
【００５０】ＭＦＧ ＭＦＧベクター（ＡＴＣＣ受入番号６８７５０）はｐＥ
ｍベクターに類似しているものの、パッケージング細胞
系統内の組換え型ゲノムの被包を増大させるためのＭＭ
ＬＶからのｇａｇ配列の１０３８の塩基対、ならびにス
プライスアクセプタ配列及び転写スタートを含むＭＯＶ
−９に由来する３５０の塩基対を内含している。Ｎｃｏ
Ｉ及びＢａｍＨ Ｉを含む１８塩基対のオリゴヌクレ
オチドがＭＯＶ−９配列に続き、相客性ある部位をもつ
遺伝子の適当な挿入を可能にしている。ＭＭＬＶＬＴＲ
は転写を制御し、結果として得られるｍＲＮＡは、未変
性ｇａｇトランスクリプトの真正５′未翻訳領域とその
すぐ後に続く挿入された遺伝子のオープンリーディング
フレームを含む。ＭＦＧの構造は、図４に表わされてい
る。ＭＦＧのさらに詳細な地図が、図３２に提供されて
いる。
【００５１】ＭＦＧは、Ｘｈｏ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉ Ｈ
４ヒストンプロモータフラグメントに対して半−ＧＡＧ
レトロウィルスベクター（半−ＧＡＧはＢｅｎｄｅｒ，
ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６Ｉ：１６３９−１６４
６に記述されている）のＸｈｏ Ｉ／Ｎｄｅ Ｉを含む
５′ＬＴＲを連結させることにより構築された。レトロ
ウィルスベクターｐＥＭＢをＮｄｅ Ｉ及びＢａｍＨ
Ｉで消化させ、適切な配位で２つのＬＴＲを含み又ベク
ターのウィルス部分内にＨ４フラグメントをも含む中間
レトロウィルスベクターを産生するべくＨ４フラグメン
トにすでに連結された半ＧＡＧフラグメントに対して、
３′ＬＴＲ含有フラグメントを連結させた。この中間ベ
クターを次にＮｄｅ Ｉでの消化により線形化し、ベク
ターのｐＢ８２２部分内のＮｄｅ Ｉ部位をポリメラー
ゼで充てんし連結により破壊した。ベクターを次にＸｈ
ｏ Ｉで消化させ、Ｘｈｏ Ｉ部位をＮｄｅ Ｉリンカ
ーに接合させた。その後、ベクターをＢａｍＨ Ｉで分
割させ、両方のＬＴＲとｐＢＲ３２２配列）を含む大き
なフラグメントを精製した。
【００５２】Ｘｈｏ ＩとＢａｍＨ Ｉを有しかつ ＣＴＡＧＡＣＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＣＧ ＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＧ という配列も有するリンカーを合成し、図４及び３２の
中に示されているような環伏ベクターＭＦＧを形成する
べく〔Ｎｄｅ Ｉエッジの隣りにスプライスアクセプタ
部位を含むＪｐＭＯＶ９からのＮｄｅ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ
フラグメントと透明化された中間ベクター上のＢａｍＨ
Ｉ部位の両方に対し連結させた。
【００５３】αＳＧＣ．αＳＧＣベクター（ＡＴＣＣ受
入番号６８７５５）は、ｔＰＡ遺伝子の発現を調節する
ためのα−グロビン遺伝子からの転写プロモータ配列を
利用する。プロモータ要素を含む６００の塩基対フラグ
メントは、付加的に転写開始のための配列及び真正α−
グロビンｍＲＮＡの５′未翻訳領域を含んでいる。サイ
トメガロウィルスからの転写エンハンサーを含む３６０
塩基対フラグメントがα−グロビンプロモータに先行
し、この要素からの転写を強化するのに用いられる。付
加的に、ＭＭＬＶエンハンサは３′ＬＴＲから欠失させ
られる。この欠失は感染時点で５′ＬＴＲに転移させら
れ、基本的に要素の転写活性化活性を失活させる。α−
ＳＧＣの構造は図５に示されている。α−ＳＧＣのさら
に詳しい記述は図３１に提供されている。
【００５４】内皮細胞内への遺伝物質の導入及び遺伝物
質の発現の評価 パッケージング細胞系統によって産生された組換え型両
栄養性レトロウィルスを、内皮細胞の感染に使用する。
上述のとおり、両栄養性レトロウィルスの組換え型ゲノ
ムはさまざまな構成要素を含みうるが、一般には２つの
ＬＴＲと、ｇａｇの代わりとしての第２のプロモータ配
列であるｐｏｌ及びｅｎｖ配列で構成されている。場合
によっては、選択可能標識をコードする遺伝子（例えば
ｎｅｏ）も含まれている。
【００５５】問題の遺伝物質を内皮細胞内に導入するの
に用いるべきウィルスストックには、上述のように１ミ
ルあたり８マイクログラム（ｍｃｇ／ｍｌ）のポリブレ
ン（Ａｌｄｒｉｃｈ）が補足され、これが内皮細胞の培
養へ付加される。ウィルスの力価が高い場合（例えば約
１０6Ｃｆｕ／ｍｌ）、ほぼ全ての内皮細胞が感染を受
けることになり、いかなる選択（例えば組換え型ゲノム
を含むベクターが中に導入された内皮細胞の選択）も必
要とされない。力価が非常に低い場合、ｎｅｏなどの選
択可能標識をもつレトロウィルスベクターを用いること
が必要である。選択可能標識が用いられる場合、ウィル
スに対する露呈の後に細胞は集密性に達するまで成長さ
せられ、選択培地（例えば抗生物質Ｇ４１８を含む培
地）の中に分割される。
【００５６】ｎｅｏ遺伝子は、細菌内でネオマイシン耐
性を又哺乳動物細胞内で抗生物質Ｇ４１８耐性をコード
するトランスポゾンＴｎ５に由来する細菌性遺伝子であ
る。このｎｅｏ遺伝子は、優性選択可能標識として作用
する；哺乳細胞中のその存在は細胞を、一般に細胞の死
枯をひき起こす抗生物質であるＧ４１８の存在下で成長
する細胞へと変換する。その結果、哺乳動物細胞内での
この遺伝子の存在は、Ｇ４１８を含む培地内で細胞を培
養することによって決定することができる。この組換え
型ゲノムを有する組換え型レトロウィルスを、ｎｅｏウ
ィルスと呼ぶ。
【００５７】ｎｅｏ遺伝子をもつ組換え型レトロウィル
スベクターはクローニング部位も有している。その結
果、問題の遺伝物質をベクター内に導入し、ｎｅｏ遺伝
子と共に内皮細胞内に取り込ませ、組換え型レトロウィ
ルスでの形質導入を受けた内皮細胞（組込まれた遺伝物
質を有する内皮細胞と呼ぶ）によって発現させることが
可能となる。
【００５８】レトロウィルスベクターを用いて、内皮細
胞内のほぼあらゆる問題の遺伝子を発現することが可能
であるはずである。３つの異なるクラスのタンパク質を
コードする遺伝子を発現するレトロウィルスベクターが
構築されてきた：すなわち分泌されたホルモン又はポリ
ペプチド（例えばｈＰＴＨ，ｔＰＡ又は第ＶＩＩＩ因
子）、膜レセプタ（ＬＤＬ，ＬＤＬＲ用レセプタ）及び
細胞間酵素（ベータ−ガラクトシダーゼ）である。内皮
細胞内に取込まれたときの組換え型レトロウィルスベク
ターの効果的な発現が立証されてきており、例中に詳述
されている。
【００５９】その他のタンパク質又はポリペプチドをコ
ードする遺伝物質の導入 その他のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝
子も同様に、適切なレトロウィルスベクターを用いて内
皮細胞内に導入することが可能である。例えば、ヒト成
長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする遺伝子、凝固第ＩＸ
因子をコードする遺伝子又はインシュリンをコードする
遺伝子を、内皮細胞内に導入することができる。このよ
うな遺伝子は、単独で又はｎｅｏ遺伝子といった選択可
能標識と組合わせた形で内皮細胞内に導入されうる。
【００６０】これらの遺伝子ならびにその他の遺伝子
は、ｈＰＴＨ遺伝子について上で記述したのと同じ要領
で内皮細胞内に導入させることができ、結果として得ら
れた形質導入された内皮細胞を体内の適切な部位内に移
植するかかかる部位上に塗布することが可能である。
【００６１】内皮細胞内への問題の遺伝物質の導入のた
めのその他の賦形剤と手段 内皮細胞を遺伝的に処理するか又は変更するためにはレ
トロウィルス以外の賦形剤を用いることも可能である。
問題の遺伝子情報は、内皮細胞内で問題の遺伝物質を発
現できるあらゆるウィルスを用いて内皮細胞内に導入さ
れうる。例えばＳＶ４０、ヘルペスウィルス、アデノウ
ィルス及びヒト乳頭腫ウィルスなどをこの目的で使用す
ることができる。
【００６２】被移植細胞内に安定した形で取り込まれな
いもののエビソーム的に発現される（被移植細胞ゲノム
から区別された又は分離した状態にとどまる）ような形
で、問題の遺伝物質を内皮細胞内に導入することも同様
に可能である。
【００６３】さらに、問題の遺伝物質を内皮細胞内に導
入するには、化学的又は物理的手段を利用することがで
きる。化学的手段の一例としては一般に用いられている
リン酸カルシウムトランスフェクション手順があり、物
理的手段の一例としては問題の遺伝物質の細胞内への進
入を可能にする電流に対し細胞を露呈する電気泳動法が
ある。
【００６４】取込まれた遺伝物質を有する内皮細胞の利
用 血管移植片（グラフト又はインプラント）の性能の改善 重症の疾病状態の多くに、生命器官に供給を行なう動脈
の狭窄又は閉塞が関与している。このような疾病状態に
最も一般的に関わっている病理的メカニズムは、アテロ
ーム性動脈硬化症である。例として挙げられるのは、冠
状動脈疾患に起因する狭心症及び心筋梗塞；血管疾患に
起因する一過性脳虚血発作及び卒中；腎動脈狭窄に起因
する腎血管高血圧症、究極的には腎不全；及び末梢動脈
の血管疾患によってひき起こされ最も重症の場合には切
断という結果を招きうる下肢の跛行である。アテローム
性動脈硬化疾病巣に対する疾病素因を個体に与える作用
因子（例えば高血圧、喫煙）が除去されるのでないかぎ
り、これらの疾病状態の自然な成行きは通常アテローム
性動脈硬化疾病巣の進行であり、結果として永久的損傷
又は死を招く。
【００６５】進行したアテローム性動脈硬化症に対す
る、受入られ広く用いられている治療的アプローチは、
主要な狭窄又は閉塞の部位を、ダクロンやゴアテックス
といった合成材料製の人工血管を用いてバイパスするこ
とである。毎年３５００００以上の血管移植片が移植さ
れている。このアプローチがもつ１つの主要な問題点
は、人工血管がきわめて血栓形成性が高く（凝塊を発達
させる傾向をもつ）、このことが非常に高い再狭窄率を
導いている。自己由来の内皮細胞を人工血管の管腔に接
種することによってこの問題を軽減することが可能であ
った；内皮細胞でライニングされた移植片の血栓形成性
はさらに低いものと推定される。変更された内皮細胞が
特に有用となるのは、このような背景の下においてであ
る。
【００６６】内皮細胞は、それをライニングした補てつ
用移植片という状況下でのその性能を改善するべく本発
明の方法に従って遺伝的に変更することができる。内皮
細胞でライニングされた補てつ用移植片を用いるための
既存のプロトコルは、いくつかの重大なテクノロジー上
の問題点によって複雑なものとなっているが、これらの
問題点の大部分は遺伝的に処理された内皮細胞の利用に
よって克服できるものである。
【００６７】内皮化された移植片に伴う１つの問題点
は、人工血管の管腔が補てつの壁と管腔表面の間の平滑
筋細胞の増殖のために漸進的に狭くなることにある。こ
れを防止する１つの方法は、平滑筋細胞の成長を抑制す
る産物を分泌する遺伝子を内皮細胞内に導入することで
ある。近年になって、間葉細胞及び／又は上皮細胞の増
殖を制御する数多くのタイプのオートクリン：パラクリ
ン成長因子が識別され、その遺伝子がクローニングされ
てきた。このような遺伝子は、本発明の方法を用いて内
皮細胞内に導入することができる。結果として得られる
形質導入された内皮細胞は、細胞成長阻害因子を産生す
る。
【００６８】内皮化された移植片プロトコルに伴うもう
１つの技術的問題点は、補てつ用移植片に対する内皮細
胞の結合（平板培養）効率が比較的低いということにあ
る。これを改善するためのこれまでの試みは、移植片表
面の組成を変更することに向けられてきており、その成
功は限りあるものであった。本発明の方法を用いると、
膜レセプタをコードする遺伝子を内皮細胞内に導入する
ことが可能である。このとき人工血管の管腔をレセプタ
のためのリガンドでコーティングすることができ、かく
して膜レセプタ／リガンドの相互作用を通して管腔表面
に対する内皮細胞の結合は容易なものとなる。
【００６９】本発明の遺伝的に処理された内皮細胞は、
内皮細胞でライニングされた補てつ用移植片の血栓形成
性を低下させるのに用いることができる。凝塊形成のメ
カニズムは、血小板の付着とそれに続くフィブリン（線
維素）の沈着及び凝塊の伝播であると考えられている。
これは、（組織プラスミノーゲン活性化剤（ＴＰＡ）又
はストレプトキナーゼといった凝塊を溶解する作用因子
などの）血栓形成作用因子を分泌する遺伝的に処理され
た内皮細胞を移植片に接種することによって最小限にす
るかまたは場合によっては削除することができる。
【００７０】四肢又は器官に産物を送達するための変更
内皮細胞の利用 本発明は同様に、補てつ物を内含する動脈によって灌流
された四肢又は器官にとって恩恵のある因子を分泌する
遺伝子を内皮細胞内に導入するために使用することもで
きる。例えば、一般的な臨床上の問題点は人工血管の部
位に対し遠位に小さい血管の広範な狭窄が存在すること
である。これは、真性糖尿病に付随する血管疾患の特徴
である。移植片を用いたさらに大きい血管の再生は、患
部である四肢又は器官に対する灌流の不完全な再構成を
導く。
【００７１】危険にさらされた器官又は四肢に対する血
管流を促進する１つの方法は、輸入管全てを最大限に拡
張させることである。経口又は非経口投与の薬剤でこれ
を行なおうとする試みは、ほとんど治療的利益をもたら
さず、しかも数多くの全身性副作用が付随していた。こ
れは、一部には、血管拡張剤が適切な組織にターゲッテ
ィングされていないという事実によってひき起こされた
ものである。心房性ｎａｔｕｒｅｔｉｃ因子といった効
力ある血管拡張剤を分泌するべく処理された内皮細胞
が、１つの代替的アプローチである。当該出願において
は、患部である器官又は四肢の近くの形質導入された内
皮細胞をインビボ形質導入により移植又は生成すること
ができ、かくして、患部器官又は四肢はきわめて高い濃
度の血管拡張剤を含む動脈血での灌流を受けることにな
る。その結果、全体的な血管灌流は増大する。しかしな
がら血管拡張剤は心臓に戻った時点で非薬学的レベルに
まで希釈され、従って全身性の非選択的な手法により投
与されたときに起こる血管拡張剤の多くの全身性副作用
が未然に防がれることになる。
【００７２】送達システムとしての変更内皮細胞の利用 本発明は、生物学的に意義ある量では内皮細胞内で通常
再生されない選択されたポリペプチド及びタンパク質と
いった選択された１つのタンパク質又はポリペプチドを
産生するような形で内皮細胞を遺伝的に処理し、これら
を体の血流又はその他の部域（例えば中枢神経系）内に
分泌することを可能にする。このようにして形成された
内皮細胞は、必要とされる物質の（注射、輪液などによ
る）定期的投与を必要とする現在の養生法に置き換わる
連続した薬剤送達システムとして役立つことができる。
【００７３】例えば、これは、現在のところ膵臓から分
離され大量に精製され次にインシュリン再生又は利用が
損なわれた人体の内部へと注入されなくてはならないイ
ンシュリンの連続的送達を提供するのに使用することが
できる。このようにして、インシュリンを連続的薬剤送
達システムを介して体内に導入でき、その結果日々のイ
ンシュリン注射の必要性は全くなくなる。
【００７４】遺伝的に処理された内皮細胞は同様に、凝
固因子の産生のためにも利用できる。血友病患者には、
凝固に関与する第ＶＩＩＩ因子と呼ばれるタンパク質が
欠如している。第ＶＩＩＩ因子は現在注射によって投与
されている。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子をコードす
る遺伝子をもつ形質導入された内皮細胞は、インビトロ
で第ＶＩＩＩ因子を産生し送達することができる。
【００７５】内皮細胞内への問題の遺伝物質の取り込み
は、遺伝性疾患の治療及び後天的疾患の治療において特
に価値あるものでありうる。遺伝性疾患の場合、このア
プローチは、遺伝的に変更された内皮細胞及び代謝シン
クとして使用されうるその他の細胞を提供するのに利用
される。すなわちこのような内皮細胞は、患者体内に高
レベルで蓄積された潜在的に毒性のある物質を減成させ
るのに役立つ。例えば、アデノシンデアミナーゼをコー
ドする遺伝子を発現する形質導入された内皮細胞を、有
毒なプリンヌクレオシドの蓄積という結果をもたらす酵
素アデノシンデアミナーゼの欠損によってひき起こされ
た重症の遺伝形態の複合型免疫欠損を治療するのに用い
ることができる。本発明の内皮細胞は同様に、体が通常
産生する産物（例えば酵素又はホルモン）が産生されな
いか又は不充分な量しか作られないような遺伝病の治療
にも使用できる。ここでは、欠如しているか又は適切に
産生されない物質をコードする遺伝子で形質導入された
内皮細胞を、この物質を充分な量産生するために用いる
ことができる。例えば、遺伝型の気腫において欠如して
いるタンパク質つまり欠損タンパク質であるアルファ−
１アニトリプシンを産生するのにこれを用いることがで
きる。
【００７６】遺伝的に処理された内皮細胞（すなわち問
題の遺伝物質で形質導入された内皮細胞）の使用を通し
て治療を提供することのできる後天的疾患は数多く存在
する。例えば、慢性疾患に一般に存在し往々にして慢性
腎不全を伴う貧血症（例えば血液透析患者における）を
治療するのに、このような細胞を用いることができる。
この場合、エリスロポイエチンをコードする遺伝子を中
に取り込んでいる内皮細胞は、エリスロポイエチンを分
泌しかくして赤血球形成（すなわち赤血球の産生）を増
大させるべく骨髄を刺激することにより貧血症を補正す
る。
【００７７】本発明の形質導入された内皮細胞は同様
に、血栓の形成を防止する活性化剤として低い全身用量
の組織プラスミノーゲン活性化剤を投与するのにも使用
することができる。この場合、ｔＰＡをコードする遺伝
物質を取り込んだ内皮細胞は、血栓形成の予防が望まれ
る患者の体内での凝縮を阻害することになる。これは例
えば、冠状動脈疾患、脳血管疾患、末梢血管閉塞性疾
患、肺塞栓症などにみられる静脈（例えば、表在性）血
栓症又は深静脈血栓症などの一般的障害に対する予防と
して役に立つだろう。カルシトニンをコードするＤＮＡ
を含む内皮細胞は、骨の代謝の進行性慢性障害であるパ
ジェット病の治療に用いることができる。現在の治療
は、カルシトニンの皮下投与に依存している。
【００７８】インターロイキン（例えばＩＬ−１，ＩＬ
−２，ＩＬ−３）を産生し分泌するよう工学処理された
内皮細胞は、いくつかの状況の下で使用することができ
る。例えば、現在使用されている療法（例えば化学療
法）のいくつかがもたらす結果は、往々にして骨髄の直
接的抑制によってひき起こされる好中球減少（血中好中
球数の異常な低下）の誘発である。例えば、後天的免疫
不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療において用いられるＡＺ
Ｔならびにほぼ全ての化学療法剤の使用は好中球減少を
結果としてもたらす。この状態の結果として、数多くの
生命を脅す感染症がもたらされる。これらの場合におい
ては、例えばＩＬ−３をコードする遺伝物質を含み従っ
て１Ｌ−３を発現し分泌するような内皮細胞の移植を通
してのＩＬ−３の投与を、好中球数を増大させるのに使
用することができる。さらに、血小板の産生を刺激する
トロンボポイエチンの投与は、血小板数が少ない数多く
の状態の治療に使用できる。この場合、トロンボポイエ
チンのための遺伝子で形質導入された内皮細胞が血小板
産生を刺激できる。
【００７９】遺伝物質を取り込んだ内皮細胞のもう１つ
の関連利用分野は、ＡＩＤＳの治療である。免疫系を刺
激するインターロイキン２及びインターロイキン３は、
ＡＩＤＳの治療において有効なものである可能性があ
る。これらの分子は、これら２つのポリペプチド（現在
周期的注入により投与されているもの）を産生するべく
遺伝的に処理された内皮細胞によって送達されうる。
【００８０】本発明のもう１つの用途は、酵素欠損疾患
の治療におけるものである。この場合、内皮細胞内に導
入された遺伝子によってコードされた産物は（ホルモン
と同様に）分泌されない；むしろ、それは、細胞内部に
残る酵素である。患者に特定の１酵素が欠如していてさ
まざまなアミノ酸又はその他の代謝産物を代謝できない
でいる遺伝病の数多くの症例が存在する。これらの酵素
のための適正な遺伝子は、形質導入された内皮細胞を介
して導入されうる。例えば、冒された患者が酵素アデノ
シンデアミナーゼを欠如しているような遺伝病が存在す
る。この酵素は、尿酸へのプリンの減成に関与するもの
である。本発明を用いると、形質導入された細胞が体内
で存在する部域を血液が通過するときにこれを解毒する
のに充分高いレベルで欠如している酵素を発現する形質
導入された内皮細胞を産生することが可能となる。
【００８１】本発明は又、獣医学の分野でも利用でき
る。例えば、そうでなければ周期的に（例えば毎回又は
さらに頻度を減らして）注射することによって提供され
ることになる薬剤及びホルモンなどの物質を動物に送達
する上で、形質導入された内皮細胞を使用することが可
能である。本発明の変更された内皮細胞の使用は、動物
の体内に変更された細胞が存在することによって進行ベ
ースでコードされたタンパク質が大量に提供され、かく
して物質を毎日／周期的に投与する必要性がなくなると
いう利点をもつ。
【００８２】
【実施例】ここで、制限的意味を全くもたない以下の例
を用いて本発明を例示していく。例１ ．形質導入された内皮細胞内のヒト副甲状腺ホルモ
ンの産生 ｐＬＪのＢａｍＨ Ｉクローニング部位に、問題の遺伝
物質を挿入することができる。問題の遺伝物質は、上述
のようにＤＮＡであってよい。
【００８３】特に、ヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ）
をコードする遺伝子のコピーをこの部位（例えばｐＬＪ
内）に以下の要領で挿入した：ｐＬＪプラスミドをＢａ
ｍＨＩで消化し、ひきつづき酵素仔ウシ腸ホスファター
ゼで処理した。これに続いて、アガロースゲル上で線形
ベクターを分画しガラス玉を用いて精製した。さらに、
ｐＢＲ３２２内へクローニングされたヒトＰＴＨの完全
なｃＤＮＡを含む、Ｈｅｎｄｙ ｅｔａｌ．が記述して
いるプラスミドから、ヒトＰＴＨ遺伝子を含むＢａｍＨ
Ｉフラグメントを調製した。Ｈｅｎｄｙ，Ｇ．Ｎ．ｅ
ｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓａ．ＵＳ
Ａ．，７８：７３６５−７３６９（１９８１）。図６参
照。
【００８４】全てコーディング配列である１７ｂｐの
５′未翻訳配列及び１５５ｂｐの３′未翻訳配列を含む
ＰＴＨ ｃＤＮＡのサブフラグメントを、Ｄｄｅ Ｉ及
びＨｉｎｆ Ｉで初期プラスミドを消化し６００ｂｐの
フラグメントを分離することによって分離した。凹んだ
末端を満たすべくリン酸塩中でデオキシヌクレオシド存
在下でＤＮＡポリメラーゼでフラグメントをインキュベ
ートした。Ｔ４ＤＮＡリガーゼで平滑末端にＢａｍＨ
Ｉリンカーを連結した。ＢａｍＨ Ｉでこの連結混合物
を消化することによって真正ＢａｍＨ Ｉ制限フラグメ
ントを生成した。次にこれを、ベクター構成においてｈ
ＰＴＨの供給源として用いられるプラスミドであるｐＢ
Ｒ３２２のＢａｍＨ Ｉ部位内にサブクローニングし
た。
【００８５】Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で、等量のＰ
ＬＪ線形バックボーンとＢａｍＨＩ ＰＴＨフラグメン
トを合わせて付加した。結果として得られた混合物を、
２つのフラングメントの連結に適した条件の下で維持し
た。この連結混合物を細菌性ＨＢ１０１を形質転換する
のに用い、次にこのＨＢ１０１を、カナマイシンを含む
寒天上で平板培養した。Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔａ
ｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローング：実験
室マニュアル）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐ．Ｐ．２５０−２５１，
５０４：Ｂｏｌｉｖｅｒ，Ｆ．およびＫ．Ｂａｃｋｍａ
ｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥｎＺｙｍｏｌｏｇｙ中、
Ｒ．Ｗｕ（ｅｄ．）Ｖｏｌ．６８，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９７９）。結果として得られ
たコロニーを組換え型プラスミドについて分析した。
【００８６】副甲状腺ホルモンは、体内のカルシウムの
調節において１つの役割を果たすポリペプチドである。
ｈＰＴＨ遺伝子は、ヒトの内皮細胞内に存在しているも
のの、これらの細胞内で生物学的に意義あるレベルでは
発現されない。ｈＰＴＨといったポリペプチドホルモン
又は通常は内皮細胞によって生物学的に意義あるレベル
で作られることのないその他の物質を作ることのできる
内皮細胞を、個体上に植えつけるか又は個体内に移植す
ることができ、これらの細胞はホルモン又はその他の物
質のための連続的な合成及び送達システムとして役立つ
ことができる。
【００８７】ｈＰＴＨをコードするＤＮＡ及び選択可能
標識（例えばｎｅｏ遺伝子）をコードするＤＮＡを含ん
でいた組換え型ウィルス構成体を産生するＰｓｉ ａｍ
細胞を用いて、上述のとおりにウィルスストックを産生
した。ウィルスストックを収獲し、ｈＰＴＨ遺伝子を含
むウィルスで形質導入されるべき内皮細胞を、このスト
ックと共にインキュベートした。この場合、Ｇ４１８を
含む培地上で培養することによって形質導入された内皮
細胞を識別し選択するのに選択可能標識を用いる。ウィ
ルス力価が充分に高い場合、本質的に全ての内皮細胞が
感染を受け、選択可能標識や適切な培地を用いての選択
は不必要である。
【００８８】ｈＰＴＨ遺伝子を有する組換え型レトロウ
ィルスで形質導入された内皮細胞のｈＰＴＨ遺伝子を発
現する能力は、以下の要領でインビトロで評価された：
ウシの大動脈内皮細胞は、仔ウシの大動脈からの外植片
に由来するものであった。細胞は、制限ある寿命を有
し、二次培養と呼ばれる。ウシ大動脈内皮細胞を、上述
のとおりにウィルスに感染させたが、ネオマイシン内で
は選択しなかった。形質導入されたウシ大動脈内皮細胞
を１０ｃｍの組織培養皿上に接種し、集密性をもつまで
成長させた。次に新鮮培地（１０％のＣＳ及びペニシリ
ン及びストレプトマイシンを伴うＤＭＥ）を付加した；
この点を以下ゼロ時点と呼ぶ。２４時間経過後、培地を
除去し、ヒトＰＴＨの産生について細胞を評価した。
【００８９】無傷ｈＰＴＨを測定する放射性免疫検定法
（Ｎｉｃｈｏｌｓ）を用いてｈＰＴＨの存在についてア
リコートを分析した。この技術は、血清中のヒト無傷副
甲状腺ホルモンの定量測定のためのＡｌｌｅｇｒｏTM無
傷ＰＴＨ／免疫検定システム、Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｊｕ
ａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ，ＣＡ（３６Ｂ−２１７
０、発効７／８６改訂）の中で記述されており、その教
示は本書中に参考として内含されている。検定は、血清
ミリリットルあたり約１ナノグラム（ｎｇ／ｍｌ）の感
度を有し、ウシのＰＴＨと交差反応しないという点でヒ
トＰＴＨに対し特異的であることが示されている。実験
結果は、経時的にＲＩＡにより測定されるようにｈＰＴ
Ｈの産生として報告されている。結果は表Ｉに示されて
いる。
【００９０】 表Ｉ 形質導入されたＢＡＥ細胞におけるｈＰＴＨの産生 細胞 ＰＴＨの産生 対照ＢＡＥ* ＜１０ｐｇ／１０６／２４ｈ 形質導入されたＢＡＥ ６．３ｎｇ／１０６／２４ｈ ＊ＢＡＥ＝ウシ大動脈内皮 本発明に従ったｈＰＴＨをコードするＤＮＡで形質導入
されたウシ大動脈からの内皮細胞は、受入れ番号ＣＲＬ
９６０１でＡｍｅｎｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）
に寄託された。
【００９１】例２．形質導入された内皮細胞内のヒトＬ
ＤＬレセプタの産生 ヒトＬＤＬレセプタ（ＬＤＬＲ）のためのｃＤＮＡをｐ
Ｅｍベクター内に挿入した。ＬＤＬＲのためのｃＤＮＡ
は、以下の要領でｐＥＭ内への挿入用に調製された。Ｈ
ｉｎｄＩＩＩでの消化によってベクターｐＴＺ１（Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｈｅａｌｔｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ＣｅｎｔｅｒのＧｏｌｄｓｔｅｉｎ博
士から得たもの）からＬＤＬＲｃＤＮＡを切除した。Ｌ
ＤＬＲコーディング配列の全てを含む２．６ｋｂのＨｉ
ｎｄＩＩＩフラグメントをクレノウフラグメントで平滑
末端化し。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてｃＤＮＡに対し
ＢｃｌＩオリゴヌクレオチドリンカー（ＮＳＢから）を
連結した。最後に、この連結混合物を余剰の酵素Ｂｃｌ
Ｉで消化し、アガロースゲル上でフラグメントを分画
し、精製した。これを、以下の要領でｐＥｍのＢａｍＨ
Ｉクローニング部位内に挿入した。ｐＥｍをＢａｍＨ
Ｉで消化し、線形化されたプラスミドを仔ウシ腸ホス
ファターゼで消化した。等量のリンカー入りＬＤＬＲイ
ンサートとｐＥＭバックボーンと混合してＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで連結させた。ＨＢ１０１を形質転換させるため
連結混合物を使用し、適当なレトロウィルスベクターに
ついてアンピシリン耐性コロニーを分析した。ｐＥｍ−
ＬＤＬＲベクターをＰｓｉ−ａｍ細胞系統内にトランス
フェクションし、組換え型ウィルスを大量に生産したク
ローンを識別した。ＰＴＨについて記述されているよう
にウシ大動脈内皮細胞の培養を感染させるためウィルス
ストックを用いた。
【００９２】ＬＤＬＲ発現のインビトロ評価は、以下の
要領で行なった：対照の又は形質導入されたウシ大動脈
内皮細胞の集密的プレートを、約８時間１０μｇ／ｍｌ
の濃度で螢光標識（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈ
Ｉｎｃから得たもの）とコンジュゲートされたＬＤＬと
共にインキューベートさせた。これに続いて、ＰＢＳで
細胞を洗浄し、ＰＢＳ中０．５％のグルタルアルデヒド
内で固定させた。次にこれらの細胞を、螢光標識付けさ
れたＬＤＬ（*ＬＤＬ）の摂取のため螢光顕微鏡の下で
視覚化させた。この実験の結果は、図４に示されてい
る。簡単に言うと、内因性ＬＤＬＲのレベルは、未感染
培養（４Ｂ参照）中の*ＬＤＬ摂取の相対的欠如によっ
て証明されるように、低いものである。しかしながらＬ
ＤＬＲウィルスに感染した培養中、全ての細胞の約３０
％は検出可能な量の*ＬＤＬを取り込み、かくして外因
性ＬＤＬＲ（４Ｄ参照）の効果的な発現が証明されてい
る。
【００９３】例３ 形質再入された内皮細胞内のベータ
ガラクトシダーゼの産生 大腸菌からのベータガラクトシダーゼをコートする遺伝
子をｐＬＪ内に挿入し、このベクターをＰｓｉ−ａｍ細
胞系統内にトランスフェクションさせ、その結果高力価
のレトロウィルスストックが産生された。このベクター
の構成及び産生細胞系統の分離についてはＰｒｉｃｅと
共同研究者により記述されている。Ｐｒｉｃｅ，Ｊ．ｅ
ｔａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏ
ｎａｌＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＡ
Ｓ，８４：１５６−１６０（１９８７）。ベータガラク
トシダーゼ遺伝子をコードするウィルスのストックを、
前述のとおりウシ大動脈内皮細胞を感染させるのに用い
た。インサイチュ組織化学染色を用いてベータ−ガラク
トシダーゼ発現について分析した。前述のＰｒｉｃｅ，
ｅｔａｌ．を参照のこと。Ｇ４１８内での選択の前後に
培養を分析した。この実験で使用されたレトロウィルス
ベクターは、Ｇ４１８に耐性を付与するｎｅｏ遺伝子と
べータ−ガラクトシダーゼの両方を発現する。組織化学
染色を、Ｐｒｉｃｅ，ｅｔａｌ．によって記述されてい
るとおりに行なった。簡単に言うと、細胞培養を５分間
ＰＢＳ中の０．５％のグルタルアルデヒド内で固定し、
ＰＢＳで洗浄し、少なくとも１２時間反応混合物に露呈
した。反応混合物は、ベータガラクトシダーゼのための
基質を含み、この基質は加水分解されると青色に変わり
細胞内に沈殿する。その結果、ウィルスコード化ベータ
−ガラクトシダーゼを発現する細胞は全て青色に変わる
ことになる。この実験の結果は図１１〜１２に示されて
いる。ウィルスに露呈されていなかった培養中ではいか
なるベータ−ガラクトシダーゼ活性も検出されない（図
１１）；感染した培養は、約３０％の細胞内でベータガ
ラクトシダーゼ活性を示す（図１２）。これらの形質導
入された細胞は、Ｇ４１８の存在下でこれらをインキュ
ベートすることによって選択される。
【００９４】例４．インビボで移植された血管移植片の
表面上での形質導入された内皮細胞中のベータガラクト
シダーゼの産生 内皮細胞の形質導入及び移植のための標準的プロトコル
の絵画的表示が図１３に示されている。体重２０〜２５
ｋｇの雑種の成犬の外頸静脈から酵素的に内皮細胞を収
獲した。各動物からの細胞を２つのアリコートに分割し
た；そのうち１つは複製欠損レトロウィルス（以下参
照）に感染させるべきものであり、もう１つは偽似感染
させるべきものであった、酵素的に収獲した細胞を用い
て一次培養を作製した。内皮細胞を、フィブロネクチン
でコーティングしたフラスコに平板培養させ、１０〜１
４日間にわたる２回の連続継代の間、５％の血漿由来の
ウマ血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、ヘパリン
及びＥＣＧＦが補充されたＭ１９９培地中に維持した。
【００９５】この期間中、３日に一度（１回の露出あた
り１８時間）ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）が補充された
新鮮なウィルスストックに細胞を露呈した。２回目の継
代が終わった時点で、細胞を収獲し、アリコートを直接
分析し、冷凍保存するか或いは又Ｙａｔｅｓの４段階方
法の修正したもの（第２段階と第３段階の間に自己由来
の血液に０．７５×１０6の細胞が付加された）に従っ
て６ｃｍ×４ｍｍのダクロンTMニットのドラフト（ＣＲ
ＢＡＲＤ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に接種するの
に利用した。動物を麻酔し、両方の頸動脈の６ｃｍのセ
グメントを記述した通りの接種された移植片で置換し
た。各々の動物は、感染した内皮細胞の接種を受けた移
植片（インプラント）及び偽似感染した細胞で接種を受
けた対側性移植片（グラフト）を受け入れた。移植から
５週間後、動物を麻酔し、移植片（グラフト）を収獲し
分析した。
【００９６】内皮細胞のゲノミックＤＮＡ内にリポータ
遺伝子を安定した形で導入するために、両栄養性宿主域
をもつ複製欠損レトロウィルスを用いた。細胞の細胞質
を青色に染色する酵素組織化学検定を利用してその発現
産物ベータガラクトシダーゼをインサイチュで検出する
ことができることから、リポータ遺伝子としてｌａｃｚ
遺伝子を用いた（例３）。プロウィルス配列を検出する
サザン分析及びインサイチュで感染細胞を検出するウィ
ルス発現ベータガラクトシダーゼについての細胞化学染
色によって、レトロウィルス感染の効率を見積った。
【００９７】これらの研究で用いられる組換え型レトロ
ウィルスは２つある。ＢＡＧベクターについては、以前
にＰｒｉｃｅ ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＡＳ，８４：１５６−１６０
（１９８７）によって記述されている。ＬａｃＺ−遺伝
子を含むＢＡＧ ウィルスは、５′ＬＴＲ（長末端反
復）からベータ−ガラクトシダーゼを、又原核生物内で
カナマイシン耐性及び真核生物内でＧ４１８（耐性）を
付与するＳＶ４０由来のプロモータから選択可能標識
（ｎｅｏ）を、発現する。ＢＡＧウィルスに露呈された
内皮細胞の約５〜１５％が感染していた（表ＩＩに要約
されている）；アミノグリコシドＧ４１８で補足された
培地内でのこれらの培養の栽培は、形質導入された細胞
について効果的に選択を行なった。
【００９８】ＬＤＬＲｃＤＮＡ配列を除く前述のＢＡ−
ＬＤＬＲベクターに由来するＢＡＬベクターは、大腸菌
ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子に対するコーディング
配列と置換された。ＬａｃＺ−遺伝子を含むより高い力
価のＢＡＬウィルスは、ニワトリベータ−アクチンから
由来するプロモータからのベータガラクトシダーゼを発
現する。ＢＡＬウィルスに露呈された細胞の約５０％
を、サザン分析とベータ−ガラクトシダーゼに対するイ
ンサイチュ細胞化学染色により測定されるように、形質
導入した。
【００９９】サザン分析においては、高分子量のＤＮＡ
を分離し、アリコート（１０μｇ）をＫｐｎＩで消化さ
せ、１％のアガロアースゲル上で分画させ、Ｚｅｔａｂ
ｉｎｄへ移し、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ及びＶｏｌｔの方法に
従って高い比活性に標識付けされた１２００ｂｐのＣｌ
ａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントでプローブ探査した。位
相差及び螢光顕微鏡写真の両方によって培養された内皮
細胞の細胞化学的特徴づけを実証した。レトロウィルス
感染した内皮細胞を接種時及び移植された移植片からの
除去の後に、ＤＩＬ−ＡＣ−ＬＤＬの摂取及びウィルス
誘導のベータガラクトシダーゼの発現について分析し
た。ＤＩＬ−ＡＣ−ＬＤＬが接種された、予備接種済み
で移植後の細胞を、位相差及び螢光顕微鏡写真を用いて
評価した。ウィルス誘導されたベータ−ガラクトシダー
ゼの発現についても、予備接種済みの移植後の細胞を分
析した。
【０１００】接種の時点で、内皮細胞特異的機能（すな
わちアセチル化されたＬＤＬの摂取及びフォン・ウィル
ブランド因子の存在）について及び平滑筋細胞に特異的
な抗原の存在について培養を分析した。これらの分析
は、各々の隔離集団からの細胞の９８％以上が機能中の
内皮細胞であることを示していた。
【０１０１】実験システムは、移植片再増殖を研究する
のに用いられた前述のイヌのモデルの修正したものであ
った。イヌ１〜３は、ＢＡＧ感染した未選択の内皮細胞
での接種を受けた移植片を受け、一方イヌ４〜７はまず
最初にＢＡＬ感染した未選択の内皮細胞での接種を受け
た移植片を受けた。これらの実験が進行中であった間
に、イヌ４〜７からの内皮細胞をＢＡＧウィルスにも感
染させ、ＢＡＧ形質導入された細胞について選択するア
ミノグリコシダーゼであるＧ４１８の存在下又は不存在
下で、培養内で拡張させた。５週間後に、移植片を分析
のため外植し、新しい移植片をイヌ４〜７内に移植した
（イヌ４′〜７′と呼ぶ）。これらのイヌの各々は、Ｂ
ＡＧウィルスに感染しＧ４１８内で選択された内皮細胞
で接種された移植片及びＢＡＧ感染し未選択の内皮細胞
が接種された対側性移植片を受けた。２番目の移植片セ
ットを再び５週間後に外植した。
【０１０２】表ＩＩは、これらの実験の結果を要約して
いる。動物４′〜７′は、動物４〜７について実施され
た第２の実験を表わしている（本文参照）。ＢＡＧ−Ｕ
は、形質導入された細胞についてＧ４１８で選択されて
いないＢＡＧ感染した内皮細胞を表わす。ＢＡＧ−Ｓ
は、形質導入された細胞についてＧ４１８で選択された
ＢＡＧ感染した内皮細胞を表わす。ＢＡＬは、ＢＡＬ感
染した内皮細胞を表わす。ＭＯＣＫは、擬似感染した細
胞を表わす。Ｅは、ベータ−ガラクトシダーゼ染色によ
って測定されるような感染効率を表わす。５週間後の移
植片の効力（潜在能）は（Ｙ）有り又は（Ｎ）無しで示
されている。移植片の被度は、走査型電子顕微鏡により
測定されるように再増殖した表面の百分率を表わす。
【０１０３】 表ＩＩ 移植実験のまとめ 動物＋ 実験的移植片 対照移植片 感染 外植体 感染 外植体 ウィルス Ｅ 効力 被度 ウィルス Ｅ 効力 被度 1 BAG-U 15 Ｙ 50-90 MOCK 0 Ｙ 50-90 2 BAG-U 5 Ｙ 50-90 MOCK 0 Ｙ 50-90 3 BAG-U 5 Ｙ 50-90 MOCK 0 Ｙ 50-90 4 BAL 40-60 Ｎ - MOCK 0 Ｎ - 5 BAL 40-60 Ｙ 0 MOCK 0 Ｙ 0 6 BAL 40-60 Ｙ 50-90 MOCK 0 Ｙ 50-90 7 BAL 40-60 Ｙ 50-90 MOCK 0 Ｙ 50-90 4′ BAG-S 100 Ｙ 50-90 BAG-U 10 Ｎ - 5′ BAG-S 100 Ｙ 0 BAG-U 10 Ｎ - 6′ BAG-S 100 Ｙ 0 BAG-U 10 Ｙ 50-90 7′ BAG-S 100 Ｙ 50-90 BAG-U 0 Ｙ 0 外植された移植片を分析すると、５週間後に２２のうち
１８が効力を持ちつづけていることがわかった。走査型
電子顕微鏡は、１８のうち１４の効力ある移植片の管腔
表面上に内皮様の形態をもつ細胞のライニングを立証し
た。内皮細胞のライニングは、それが存在する場合、不
完全（全表面の５０〜９０％）であり、縮れたダクロン
移植片のピークに沿って少量の細胞が見える状態で分布
がよせ集め的である。各移植片の一部分を固定し、ウィ
ルス由来のベータガラクトシダーゼを発現する細胞につ
いて染色し、７５０×の倍率の強力な解剖顕微鏡を通し
て視覚化した。効力のある状態にとどまり管腔細胞を保
持した感染内皮細胞での接種を受けた各移植片は、まさ
に血管の管腔上にベータ−ガラクトシダーゼ陽性細胞を
含む。偽似（ＭＯＣＫ）感染した内皮細胞の接種を受け
た対側性移植片が陽性染色細胞を示すことは全く無い。
【０１０４】移植片のインサイチュ分析と、ウィルス形
質導入された細胞について行なった。ウィルス発現され
たベータガラクトシダーゼを発現する細胞について、遺
伝的に処理された移植片の縦方向切片を分析した。移植
片を縦方向に切断し一部分を０．５％のグルタルアルデ
ヒド内で５分間固定し、ＰＢＳ内で３度洗浄し、２時間
ｘ−ｇａｌ溶液中でインキュベートし、Ｌｅｉｔｚの解
剖顕微鏡で管腔表面を写真撮影した。移植片を見開きで
視覚化し、接種パターンのいくつかの興味深い様相を観
察した。形質導入された細胞の密度は、縮んだ移植片の
比較的深い表面の中で最も大きかった。このことは、低
出力下ではぎざぎざ状の表面の割れ目をライニングする
青い染色細胞の輪として視覚化されており、走査型電子
顕微鏡によって視覚化された表面の内皮細胞再増殖の変
動と相関関係をもつ。さらに、遠位又は近位の融着に対
する近接性との関係における形質導入された細胞の密度
又はパターンの局所的変動は全く無かった。最後に各々
の場合において、ベータ−ガラクトシダーゼについて陽
性であった管腔細胞の割合は、接種されたベータ−ガラ
クトシダーゼ陽性細胞の調製物に比べ定性的に低いよう
に思われた。
【０１０５】より詳細な特徴づけを可能にするため移植
片の一部分の管腔表面から細胞を酵素的に収獲した。細
胞の一次培養を作製し、分析に先立って約２−３週間イ
ンビトロで拡張させた。ウィルス発現されたベータ−ガ
ラクトシダーゼについての組織化学検定及びサザン分析
により、この細胞個体群の中で遺伝的に変更された内皮
細胞を識別した。移植片から収獲されインビトロで拡張
した細胞の大部分は、分化した内皮機能を保持していた
（９５％未満）。しかしながらウィルス誘導ベータ−ガ
ラクトシダーゼを発現するか又はプロウィルス配列を含
んでいた細胞の割合は、接種時点で分析された培養に比
べて、一貫して減少していた。この不一致は、一部に
は、融着から又は間隙を通しての成長による外因性細胞
をもつ移植片の部分的再増殖に起因するものである。
【０１０６】例５：遺伝的に変更されたイヌ及びヒトの
内皮細胞によるｔＰＡの発現の増大 上述の例で紹介されたデータは、レトロウィルスを媒介
にした遺伝子転移がウシ、イヌ及びヒトの内皮細胞に容
易に適用できるものであることを示している。このデー
タは又、その結果細胞間の分泌されたタンパク質が適切
に発現されることをも示している。治療的に関連性ある
タンパク質の発現のためにレトロウィルスを媒介とした
遺伝子転移を使用することが、以下の節で示されてい
る。
【０１０７】組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）
は、血液凝塊の線維素溶解を促進する内皮細胞によって
通常分泌されるタンパク質である。ヒトｔＰＡをコード
する組換え型レトロウィルスベクターが構築され、形質
導入された内皮細胞からの治療的に関連性あるタンパク
質の強化された送達を立証するべく、イヌの内皮細胞を
形質を入するのに用いられた。
【０１０８】図１４には、組換え型レトロウィルスベク
ター内へのクローニングのためのｔＰＡ遺伝子の変更が
示されている。ヒトの子宮ｔＰＡのコーディング配列
は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ ＭＡから得たｐＵＣベー
スのプラスミドのＳａｌＩＤＮＡフラグメントの中に含
まれていた。ＳａｌＩフラグメントは、もとのｃＤＮＡ
のベース対２０９０にあるＢｇｌＩＩ部位と塩基対６に
あるＳＦａＮＩ部位にＳａｌＩリンカーを置くことによ
って誘導された。コーディング配列は、塩基対１３から
塩基対１６９９まで広がっている。
【０１０９】この当初のクローンから、当該特許の本文
で記述したＭＦＧ及びα−ＳＣＧベクターの中に直接ク
ローニングできるフラグメントを誘導した。まずＳａｌ
Ｉフラグメントを、合成ＢａｍＨＩリンカーの付加によ
ってＢａｍＨＩフラグメントに変換し、次に制限酵素Ｂ
ｇｌＩＩで消化して、ＢａｍＨＩからＢｇｌＩＩの１０
９の塩基対のフラグメント及びＢａｌＩＩからＢａｍＨ
Ｉの１９７５の塩基対のフラグメントを生み出した。ｔ
ＰＡコーディング配列の欠如している１００個の塩基対
及び翻訳出発コドンを再度作り出すために、２つの１０
４塩基対のオリゴヌクレオチドを化学的に合成しアニー
リングして５′末端にＮｃｏＩ部位を又３′末端にＢｇ
ｌＩＩ部位をもつフラグメントを作った。このオリゴヌ
クレオチドを部分的な１９７５塩基対のｔＰＡ遺伝子の
ＢａｌＩＩ部位へ連結させてもとの分子と同じコーディ
ング配列をもつ２０７９塩基対のｔＰＡ遺伝子を生成す
るが、これはＮｃｏＩ〜ＢａｍＨＩｆのフラグメントと
しても容易に得ることができるものである。これを直接
ＭＦＧ及びａ−ＳＧＣベクターに挿入した（結果として
得られたベクターにはそれぞれＡＴＣＣ受入れ番号６８
７２６及び６８７２９が与えられた）、これらの操作
は、標準的な分子生物学技術（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ及び
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）によって行なわれ、図１４に概
略的に示されている。
【０１１０】両栄養性宿主域の組換え型レトロウィルス
を産生することのできるＤａｎｏｓ及びＭｕｌｌｉｇａ
ｎのＰｓｉ ｃｒｉｐパッケージング細胞系統から、Ｍ
ＦＧ−ｔＰＡ及びα−ＳＣＧ−ｔＰＡをコードする組換
え型ウィルスを産生する細胞系統を作った〔Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：６４
６０（１９８８）〕。１０μｇの特定されたＤＮＡと１
μｇのプラスミドｐｓＶ２ｎｅｏを同時沈殿させ、標準
的なリン酸カルシウムトランスフェクション手順により
パッケージング細胞上にトランスフェクションした。安
定した形でトランスフェクションを受けたクローンを、
８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む選択培地内で１４日
間成長させた後に分離した。個々のクローンの集密的細
胞単層から、２４時間培養上清を得、これをＮＩＨ ３
Ｔ３細胞を感染させるのに用いた。２４時間の露出の
後、培養上清を除去し、３Ｔ３細胞に正規の培地を再補
給し、さらに７２時間成長させた。これらの細胞上に６
時間新鮮な培地を入れ、これらの上清を、ヒトｔＰＡに
特異的な市販のＥＬＩＳＡを用いてヒトｔＰＡについて
検定した（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄ−５，Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，，
Ｎ．Ｙ．）。このスクリーンから、ＭＦＧ−ｔＰＡ組換
え型ウィルス又はα−ＳＧＣ−ｔＰＡ組換え型ウィルス
のいずれかを産生するパッケージング細胞系統のクロー
ンを選択しそれぞれＭＦＧ６８及びα−ＳＧＣ２２と呼
称した。
【０１１１】イヌの内皮細胞を、記述されているとおり
に〔Ｔ．Ｊ．Ｈｕｎｔｅｒ，Ｓ．Ｐ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，
Ｗ．Ｖ．Ｓｈａｒｐ，及び（１９８３）Ｔｒａｎｓ．Ａ
ｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｅｒｎ，Ｏｒｇａｎｓ
２９：１７７〕コラゲナーゼ消化により外頸静脈の１
０ｃｍのセグメントから分離した。細胞を、５％の血漿
由来のウマ血清、５０μｇ／ｍｌの内皮細胞成長因子及
び１００μｇ／ｍｌのヘパリンを含むＭ１９９培地内で
フィブロネクチンコーティングされた組織培養皿上で繁
殖させた。細胞培養の純度を、フォン・ウィルブランド
因子の存在及び平滑筋細胞特異α−アクチンの不在の場
合に二ついて、免疫組織化学検定によって測定した。形
質導入の前日に、内皮細胞をヘパリン無しの培地内で
５．５×１０3細胞／ｃｍ2の割合で接種した。翌日、各
々の産生細胞系統に由来する組換え型ウィルスを含む上
清に８μｇ／ｍｌのポリブレンを付加したものに対し、
２４時間、内皮細胞を露呈した。ウィルス上清を除去
し、細胞に正規培地を補給し、分析に先立ってさらに４
８時間成長を遂行させた。
【０１１２】標準的な技術により内皮細胞の培養から高
分子量のゲノミックＤＮＡと合計ＲＮＡを分離した（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．
Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）。ＤＮ
Ａ及びＲＮＡを、完全なｔＰＡｃＤＮＡフラグメントか
ら調製された32Ｐ標識付けされたＤＮＡプローブを用い
て、ハイブリダイゼーション分析法により分析した。電
気泳動分離、フィルタートランスファ、ハイブリダイゼ
ーション、洗浄及び32Ｐ標識付けについては、標準的な
技術を用いたくＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｔ．Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ）。形質導入されたイヌ内皮細胞内のヒトｔＰ
Ａの産生は、種特異的免疫細胞化学染色を用いて立証さ
れた。形質導入された細胞を１０分間室温で３％のホル
ムアルデヒドの中で固定し、次に５分間の０．１％のト
リトンＸ−１００の中で透過性を付与した。固定した細
胞単層を次に順番に、ヒトｔＰＡに対するマウスのモノ
クローナル抗体、アルカリ性ホスファターゼでコンジュ
ゲートされたヤギの抗マウス抗体、そして最後にアルカ
リ性ホスファターゼに特異的な呈色試薬と共にインキュ
ベートした。この手順は、ヒトｔＰＡを発現する細胞を
特異的に染色し、従来の光学顕微鏡によって視覚化され
うる。さらに、形質導入された細胞からのｔＰＡ分泌
を、集密的細胞単層から測定した。新鮮培地を６時間細
胞上に置き、除去し、遠心分離によって清澄化し、ヒト
ｔＰＡの量を、市販のＥＬＩＳＡ（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎ
ｄ−５，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）
を用いて測定した。
【０１１３】形質導入プロセスの有効性は、偽似形質導
入又はＭＦＧ−ｔＰＡで形質導入された細胞の個体群の
免疫細胞化学染色によって示されている。図１６〜１７
に示されているように、ＭＦＧ６８から収獲されたウィ
ルス上清に対する細胞の一回の露呈の後、対照内では皆
無であるのに対して、全ての細胞がヒトｔＰＡを合成し
ている。これは、形質導入された細胞のいずれかのタイ
プの選択無しに達成された。
【０１１４】形質導入された培養から分泌されているｔ
ＰＡの量を測定するため、免疫検定を行なった。以下で
示すように、ＭＦＧ６８又はα−ＳＧＣ２２からの組換
え型ウィルスで形質導入された細胞は、大量のヒトｔＰ
Ａを分泌した。類似の条件下で、培養中のヒト内皮細胞
は標準的に約１ｎｇのｔＰＡを分泌する〔Ｈａｎｓｓ，
Ｍ．、及びＤ．Ｃｏｌｌｅｎ（１９８７），Ｊ．Ｌａ
ｂ，Ｃｌｉｎ，Ｍｅｄ，１０９；９７１０４〕。
【０１１５】 表ＩＩＩ 細胞 ヒトｎｇ ｔＰＡ／１００万 細胞／６時間 未感染 K9 EC 0.0 ＭＦＧ６８ K9 EC 150.1 α−ＳＧＣ２２ K9 EC 302.8 ＭＦＧ６８及びα−ＳＧＣ２２からの組換え型ウィルス
で内皮細胞が形質導入されたことのもう１つの確認とし
て、ＤＮＡ及びＲＮＡを形質導入された細胞から分離
し、放射線標識付けされたｔＰＡ遺伝子に対するハイブ
リダイゼーションによって分析した。図１８には、ＤＮ
Ａ分析のオートラジオグラムが示されている。未感染の
対照においては、いかなるハイブリダイゼーションも検
出されなかったが、２つの組換え型ベクターに感染した
細胞中には、適切な分子量の単一のハイブリッド形成種
が見られた。このことは、遺伝的情報がこれらの形質導
入された細胞のゲノムに転移されたことを実証してい
る。
【０１１６】これらの細胞から分離された合計ＲＮＡの
ハイブリダイゼーション分析がタンパク質のＤＮＡの結
果を確認しており、これは図１９に示されている。ここ
でも、対照細胞内ではいかなるハイブリダイゼーション
も検出されなかったが、形質導入された細胞に由来する
ＲＮＡ内では、適切なサイズのハイブリッド形成バンド
が見られる。ＭＦＧ６８及びα−ＳＧＣ２２の組換え型
ウィルス産生細胞からのＲＮＡが同様に対照として示さ
れている。
【０１１７】例６：血管移植片の表面上に移植された形
質導入されたイヌの内皮細胞のインビボ機能 体重２０〜２５ｋｇの雑種の雌の成犬の外頸静脈から酵
素的に内皮細胞を収獲し、これを実験室内で培養し、例
５に記載されているとおりに純度について分析した。各
々の動物から分離した細胞の２分の１を、前節で記述し
たとおりＭＦＧ−ｔＰＡ組換え型ウィルスを産生するＭ
ＦＧ６８細胞系統から収獲された上清に対する２回の露
呈により形質導入した。もう一方の半分は、擬似形質導
入した。各々の個体群に対して実施した成長曲線は、成
長特性における差を全く示さなかった。ｔＰＡが増大し
た細胞から分泌されていたことを確かめるため形質導入
細胞の各バッチに由来する培養上清について、ＥＬＩＳ
Ａ測定を行なった。次に、充分な数の細胞を得るため約
１週間実験室内でこれらの細胞を繁殖させた。
【０１１８】細胞を分離した各々の動物について、発泡
テフロン（登録商標）（Ｗ．Ｌ．Ｇｏｒｅ，ａｎｄ Ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｓ．Ｉｎｃ．Ｆｌａｇｓｔａｆｆ．Ａ
ｚ）で作られた２つの血管移植片に細胞を接種した。１
つの移植片には、擬似形質導入された細胞を接種し、も
う１方の移植片には、高レベルのｔＰＡを分泌すべく形
質導入された細胞を接種した。０．４ｃｍ×１４ｃｍの
サイズの各移植片を１．５μｇ／ｃｍ2のフィブロネク
チン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｓ
ｔ．ｈｏｕｉｓ ＭＯ）で予めコーティングし、次に２
２００，０００個／ｃｍの内皮細胞を接種した。次に移
植片を培養中でさらに７２時間インキュベートした。移
植に先立って、末端を各移植片から切り離し、細胞被度
を確認するべく検査した。
【０１１９】細胞を収穫したのと同じイヌを麻酔し、大
動脈−回腸バイパスとして、接種された移植片の１０ｃ
ｍのセグメントを移植した。各々のイヌは、２つの対側
性移植片を受けた；１つの移植片は、対照細胞が接種さ
れたものであり、もう一つの移植片は、高レベルのｔＰ
Ａを分泌すべく形質導入された細胞が接種されたもので
あった。移植の後、移植片の性能は、超音波で移植片を
位置決定しドップラー測定値（Ａｃｃｕｓｏｎ，Ｉｎ
ｃ．）により移植片を通しての血液流を評価するＢモー
ドスキャナを用いて、毎日監視された。血栓の形成を減
少するための薬剤は、全く動物に投与されなかった。
【０１２０】６頭の異なる動物における移植片の性能の
結果は図２０に示されている。上述の移植（片）モデル
は、きわめて厳しいものであり、閉塞性の凝塊形成によ
り急速に移植片を欠損に導く。正常な移植片の機能は、
無地の棒で示され、欠損したもののなおも機能している
移植片は斜線入り棒で示されている。最初の動物におい
ては、高くなったレベルのｔＰＡ（実験的）を分泌する
形質導入された細胞でライニングされた移植片及び対照
の移植片は、移植から２４時間後の凝塊形成のために欠
損した。その他の５匹の動物全てにおいては、高くなっ
たレベルのｔＰＡを分泌する形質導入された細胞でライ
ニングされた移植片は、単に擬似形質導入された細胞を
伴う移植片に比べ長く機能した。この差は２４時間から
数ヵ月にまで変化した。これらの結果は、形質導入され
た内皮細胞を用いてインビボで治療的効果を達成するこ
とができるということを実証している。
【０１２１】例７ 形質導入された内皮細胞からのヒト
第ＶＩＩＩ因子の産生 変更されたヒト第ＶＩＩＩ因子（ＡＴＣＣ受入番号Ｎ
ｏ．６８７２６）を含むレトロウィルスベクターＭＦＧ
で細胞を形質導入することにより、ヒト第ＶＩＩＩ因子
を産生するため、内皮細胞を遺伝的に増強させた。変更
された第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡは、Ａ１，Ａ２，Ａ３，
Ｃ１及びＣ２ドメインのためのコーディング配列の全て
を含むが、Ｂドメインはアミノ酸７４３〜１６４８まで
欠失されている。Ｂドメインの除去及びレトロウィルス
ベクターＭＦＧ内への変更因子第ＶＩＩＩ遺伝子の挿入
について、以下で詳述し、図２１〜２４はこれを描いて
いる。
【０１２２】５′及び３′の未翻訳配列無しの全長ｃＤ
ＮＡを、制限部位ＮｃｏＩ（５′）とＸｈｏＩ（３′）
の間に挿入されたプラスミドベクター内で得た。Ｂドメ
インの除去のため、因子ＶＩＩＩｃＤＮＡを、Ｂドメイ
ンの５′及び３′部位の両方の上の配列にまたがる４つ
のフラグメント内のプラスミドベクターの中に第ＶＩＩ
Ｉ因子ｃＤＮＡをサブクローニングした。第ＶＩＩＩ因
子ｃＤＮＡの第１のフラグメントを、プラスミドベクタ
ーｐＵＣ９内の制限部位ＳａｌＩとＰｓｔＩの間でサブ
クローニングした。ＳａｌＩとＰｓｔＩでプラスミドベ
クターを切断し、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて５′
ホスファターゼを除去した。全長ｃＤＮＡからの１５９
１の塩基対ＸｈｏＩ（ヌクレオチド７２６３）からＮｄ
ｅＩ（ヌクレオチド５６７２）フラグメント及び３５９
の塩基対ＮｄｅＩ（ヌクレオチド５６７２）からＰｓｔ
Ｉ（ヌクレオチド５３１３）のフラグメントを分離し、
ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ消化されたプラスミドベクターを連
結させた。
【０１２３】同じ翻訳リーディングフレーム内でアミノ
酸７４２〜１６４９を接合するＢドメインをコードする
配列の大部分を除去するため、１６８の塩基対を網羅す
る５′ＨｉｎｄＩＩＩ部位と３′ＰｓｔＩ部位を用いて
４つのオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴ
ヌクレオチドは、軽鎖の活性化ペプチドの最初のアミノ
酸であるアミノ酸１６４９が後に続くアミノ酸７４２を
コードするヌクレオチド２４２７にあるＨｉｎｄＩＩＩ
部位からヌクレオチド５３１３にあるＰｓｔＩ部位まで
広がっている。プラスミドベクターｐＵＣ９を制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化させ、仔ウシ腸内ホス
ファターゼを用いて５′リン酸塩を除去した。オリゴヌ
クレオチドを４つの別々の鎖として合成し、キーナーゼ
化し、アニーリングし、プラスミドベクターのＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位とＰｓｔＩ部位の間で連結した。
【０１２４】サブクローニングされたＨｉｎｄＩＩＩ／
ＰｓｔＩオリゴヌクレオチドを、プラスミドベクターｐ
ＵＣＦ８内のＰｓｔＩ／ＸｈｏＩフラグメントに並置し
た。このプラスミドを生成するため、制限酵素部位５′
ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ−Ａｓｐ７１８−ＮｃｏＩ−ＨｐａＩ３′をコー
ドする新しいポリリンカーを用いて、ｐＵＣ９プラスミ
ドバックボーン内に新しいポリリンカーを挿入した。プ
ラスミドベクターを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化させ、５′リン酸塩を仔ウシ腸ホスファター
ゼで除去した。３′末端第ＶＩＩＩ因子フラグメントを
分離するのにＰｓｔＩ／ＸｈｏＩサブクローンの部分的
ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ消化物を用い、サブクローニング
されたオリゴヌクレオチドのＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ
消化物を用いて重鎖及び軽鎖接合部フラグメントを分離
した。これらを、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位の間
でブラスミドベクターｐＵＣ Ｆ８内に連結させた。
【０１２５】ヌクレオチド２４２７及び７２０５の間に
第因子配列を含むこのサブクローンを、Ａｓｐ７１８及
びＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、仔ウシ腸ホスファターゼ
を用いて５′リン酸塩を除去した。制限酵素部位Ａｓｐ
７１８（ヌクレオチド１９６１）とＨｉｎｄＩＩＩ（ヌ
クレオチド２４２７）の間の第ＶＩＩＩ因子をコードす
るフラグメントを分離し、ヌクレオチド１９６１からヌ
クレオチド７２０５にある翻訳停止コドンまでの第ＶＩ
ＩＩ因子配列を含むサブクローン（ｐＦ８３′デルタ）
を生成するべくプラスミドベクター内に連結させた。
【０１２６】変更された因子ＶＩＩＩ遺伝子を含むレト
ロウィルスベクターの構築は、レトロウィルスベクター
ＭＦＧの制限部位とＮｃｏＩとＢａｍＨＩの間に第ＶＩ
ＩＩ因子遺伝子を挿入することによって行なった。第Ｖ
ＩＩＩ因子サブクローンｐＦ８３′デルタをＳｍａＩで
消化し、オリゴヌクレオチドリンカーを用いてＢｇｌＩ
Ｉ部位に変換した。３′第ＶＩＩＩ因子サブクローンか
らＡｓｐ７１８／ＢｇｌＩＩフラグメントを分離し、翻
訳の開始のためのＡＴＧを含む５′第ＶＩＩＩ因子フラ
グメントを、ＮｃｏＩ（ヌクレオチド１５１）／Ａｓｐ
７１８フラグメント（ヌクレオチド１９６１）として分
離した。ＮｃｏＩとＢａｍＨＩでレトロウィルスベクタ
ーＭＦＧを消化し、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて
５′リン酸塩を除去した。第ＶＩＩＩ因子フラグメント
をレトロウィルスベクターに連結して、最終的な第ＶＩ
ＩＩ因子レトロウィルス構成体を生み出した。図２５参
照。
【０１２７】レトロウィルス粒子を産生する細胞系統
は、Ｂｅｓｔｗｉｃｋ ｅｔａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８，８５：５４
０４−５４０８）により記述れさているように同数の環
境栄養性パッケージング細胞Ｐｓｉ ＣＲＥ及び両栄養
性パッケージング細胞ＰｓｉＣＲＩＰ内へのレトロウィ
ルスベクターＭＦＧ／第ＶＩＩＩ因子のトランスフェク
ションによって生成された。パッケージング細胞の２つ
の宿主域の間に起こる重感染の程度を監視するため、第
ＶＩＩＩ因子用のＫａｂｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ
Ｃｏａｔｅｓｔ，Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ Ｂｅａｕｍｏｎｔ，Ｔｅｘａｓを用いて生物学的
に活性の第ＶＩＩＩ因子の産生を測定し、ＲＮＡドット
ブロット分析によってウィルスＲＮＡの産生を測定し
た。トランスフェクション後２１日目に、トランスフェ
クションを受けたパッケージング細胞の混合物を、両栄
養性パッケージング細胞系統ＰｓｉＣＲＩＰ−ＨＩＳと
同時栽培した。ＰｓｉＣＲＩＰＨｌＳパッケージング細
胞系統は、前述のＰｓｉＣＲＩＰパッケージング細胞系
統の一変異体である。ＰｓｉＣＲＩＰＨＩＳパッケージ
ング細胞は、異なる優性選択可能標識遺伝子であるｐｓ
Ｖ２−ＨＩＳプラスミドＤＮＡでの同時トランスフェク
ションによってレトロウィルスエンベロープ遺伝子が細
胞内に導入されたこと以外は、ＰｓｉＣＲＩＰパッケー
ジング細胞系統と同一である。形質導入粒子の均質の両
栄養性レトロウィルスストックの分離のため、１：１の
割合でパッケージング細胞系統を培養した。両栄養性パ
ッケージング細胞系統ＰｓｉＣＲＩＰＨＩＳの重感染
は、変更されたヒト第ＶＩＩＩ遺伝子を効果的に形質導
入する組換え型レトロウィルスを産生する安定した細胞
系統ＨＩＳ１９の生成をもたらした。高力価の組換え型
レトロウィルスを産生する細胞系統を分離するために、
レトロウィルス産生細胞系統の抗生物質による選択は必
要とされなかった。細胞系統のゲノミックＤＮＡは、産
生細胞系統内に存在するレトロウィルスベクターの組込
まれたコピーの数を決定するためのサザンブロットハイ
ブリダイゼーション分析によって特徴づけされた。レト
ロウィルス産生細胞系統内のコピー数は約０．５であ
り、従って平均してＰｓｉＣＲＩＰ−ＨＩＳパッケージ
ング細胞の５０％が、変更第ＶＩＩＩ因子遺伝子を伴う
レトロウィルスベクターのコピーを含んでいる。レトロ
ウィルスベクター及び変更第ＶＩＩＩ因子遺伝子は、パ
ッケージング細胞系統内のＤＮＡのいかなる欠失又は再
配置も無しに無傷である。レトロウィルスベクターのコ
ピー数は、レトロウィルス産生細胞系統の連続継代につ
れて、一定にとどまる。最高の組換え型レトロウィルス
力価を得るためには、ＨＩＳ１９を、選択ヒスチジンマ
イナス培地中で３継代、それに続いて補完されたＤＭＥ
Ｍ塔地中で４継代に付した。レトロウィルス粒子の生成
のためには、ＨＩＳ１９を、１０ｃｍの細胞培養皿内に
５×１０5〜１×１０6細胞の割合で接種した。接種後４
８時間目に、約７０％の集密性の新鮮な培地（ＤＭＢＭ
＋１０％の仔ウシ血清）を、形質導入のための組換え型
レトロウィルスの供給源として２４時間後に収集するべ
く、プレートに対して付加した。
【０１２８】変更された第ＶＩＩＩ因子を、頸静脈から
分離されたイヌの内皮細胞内に形質導入した。４〜６時
間、５％の血漿由来血清（ウマ）、１００μｇ／ｍｌの
ヘパリン及び５００μｇ／ｍｌの内皮細胞成長因子を伴
う完全Ｍ１９９培地中で１０ｃｍの血あたり３×１０5
５細胞の割合で内皮細胞を接種した。次に、形質導入
プロセスの効率に不利な効果をもたらすヘパリンは無し
に、一晩、５％の血漿由来の血清、及び１００μｇ／ｍ
ｌの内皮細胞成長因子を伴うＭ１９９培地内で、細胞を
一晩インキュベートした。細胞を２４時間、新鮮なウィ
ルス上清にポリブレンを加えたもの（８μｇ／ｍｌ）に
露呈した。ウィルス上清の除去の後、細胞を５％の血漿
由来血清、１００μｇ／ｍｌの内皮細胞成長因子を伴う
Ｍ１９９培地の中に入れ、約７０−８０％の集密性にな
るまで成長させた。この時点で、培地を、５％の熱失活
されたウシ胎児血清（６６℃で２時間加熱されたもの）
及び５０μｇ／ｍｌのＥＣＧＦを伴うＭ１９９培地へと
変えた。２４時間のインキュベーションの後、培地を収
集し、Ｋａｂｉ Ｃｏａｔｅｓｔにより、生物学的に活
性な第ＶＩＩＩ因子について検定をした。
【０１２９】このレトロウィルス産生細胞系統を用い
て、サザンプロット分析で測定されたように、５０％〜
７５％の内皮細胞が形質導入された。第ＶＩＩＩ因子
は、組換え型ウィルスに対する唯一回の露呈で又、形質
導入された細胞の抗生物質選択無しで、この頻度で形質
導入されうる。形質時入された内皮細胞は、図２６に示
されているように欠失又は再配置が全く無しで、組換え
型レトロウィルスゲノム及び変更された第ＶＩＩＩ因子
遺伝子の無傷コピーを含んでいる。遺伝的に増強された
内皮細胞からの生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子の産生
速度は２４時間、５×１０6細胞あたり４００ｎｇであ
った。
【０１３０】例８：内皮のインビボ形質導入 先行する例で記述されたとおりに作られた組換え型レト
ロウィルスの標準ストックを用いて、内皮細胞のインビ
ボ形質導入を実証する予備データを得た。このアプロー
チは、動脈表面に対する限定的な損傷が内皮細胞の小片
を除去し、この裸出した部域は欠損の縁部からの新しい
内皮細胞の増殖及び内殖によって７２時間後に修復され
るという以前に公表された観察事実（Ｒｅｉｄｙ Ｍ
Ａ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＳＭ，Ｌａｂ，Ｉｎｖｅｓｔ．
４４；３０１−３０８，１９８１）に基づくものであ
る。細胞分裂は、組換え型レトロウィルスによる有効な
形質導入のための必要条件であり、針金による内皮の損
傷は、内皮細胞の増殖を誘発する潜在的な数多くの方法
の１つである。我々の方法では、内皮細胞の増殖を誘発
するのに限定的損傷のＲｅｉｄｙの技法が用いられ、次
に増殖中の細胞を直接、組換え型レトロウィルスベクタ
ーを含む上清に露呈している。我々の最初の実験は、イ
ンサイチュで内皮細胞を成功裡に形質導入し、かくして
潜在的に新しい遺伝子配列の成功裡の導入のための組織
培養技術の必要性を回避するという、この方法の可能性
について報告している。
【０１３１】この方法には２つの外科的処置が必要であ
り、そのうち第１の処置は血管の表面（ここで右回腸動
脈について記述する）を損傷し、内皮細胞の増殖を誘発
する。第２の処置では、血管表面上の複製中の細胞に対
し組換え型レトロウィルスを送達し、それと同時に増殖
中の細胞がレトロウィルス粒子に露出されている間近位
動脈樹からの血液の流れを防ぐ。簡略化のため、この処
置については回腸動脈の場合に関して記述する。
【０１３２】インビボ遺伝子転移を実証するために、我
々は、α−ＳＧＣベクターに基づいて改良されたベクタ
ー（図２ｄ及び１８）と共に、１９８７年に公表された
標識遺伝子の概念を用いた（Ｐｒｉｃｅ Ｊ．Ｔｕｒｎ
ｅｒ Ｄ．Ｃｅｐｋｏ Ｃ．１９８７ Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：１５６−１６
０）（例３参照）。ベータガラクトシダーゼをコードす
るｌａｃＺ遺伝子をα−ＳＧＣベクター内に挿入して、
図２７に表わされているα−ＳＧＣ−ＬａｃＺベクター
を生成した。この組換え型構成体をＰｓｉＣｒｉｐパッ
ケージング細胞系統内にトランスフェクションし、高力
価のα−ＳＧＣ−ＬａｃＺ組換え型レトロウィルスを産
生するＰｓｉＣｒｉｐ細胞のクローンを例５に記した通
りに分離した。インビボ形質を入のためにαＳＧＣ−Ｌ
ａｃＺ組換え型レトロウィルスのストックを用いた。
【０１３３】実験動物（ウサギ）を麻酔し（ケタミン／
キシラジン）、両方のそけい部を剃り準備し、動物を手
術台上に載せた。両側垂直そけい部切除を通して、総、
表在及び深在大腿動脈が露出された。右側（損傷を加え
るべき側）で、総大腿動脈から離れた小さな分岐を、内
回腸動脈を通ってのみ起こることになる分離された動脈
セグメントからの流出を確実にするため連結した。必要
な場合は、そけい靱帯を分割し、全ての側方分岐を完全
に制御するべく後腹膜腔まで血管に追従した。深在出発
点から約１．５ｃｍ下で右表在大腿動脈（ＳＦＡ）を３
−０の絹糸で結束し、ＳＦＡの制御はＳＦＡ／深在接合
部で得られ横方向動脈切開を作り上げた。血管の壁との
接触を確保するべく弾力性を提供するように２重になっ
た細い針金〔２０ゲージＩｎｔｒａｃａｔｈのスタイレ
ット（探査針）を用いた〕を総大腿動脈及び回腸動脈を
さかのぼって上へ通過させて、Ｒｅｉｄｙ ｅｔａｌに
よって記述された限定的損傷を生成した。針金を除去
し、２０ゲージのａｎｇｉｏｃａｔｈを動脈切開内に挿
入し、次の外科的処置の時点で直ちにアクセスできるよ
うに下にある筋肉に固定した。切開を層状に閉じ、動物
を回復させた。
【０１３４】２４時間後、αＳＧ−Ｌａｃ−Ｚベクター
のｃｒｉｐ産生体から収穫され８μｇ／ｍｌの最終濃度
になるまでポリブレンで補足された上清を含む組換え型
ウィルスをインビボ転写のために用いた。再び動物を麻
酔し、両方の切開を無菌環境内で再度開いた。前に裸出
された右回腸血管に対する外乱無く損傷された部域より
上の右回腸血管を制御できるようにするため＃３ Ｆｏ
ｇａｒｔｙTMバルーン塞栓切除カテーテルを左表在大腿
動脈内の動脈切開を通して挿入し、大動脈分岐まで通過
させ、バルーンを血流を中断すべく膨張させた。右深在
大腿動脈は、閉塞させた。組換え型レトロウィルスを含
む上清（１０ｍｌ）を、右ＳＦＡ内に前に置かれたａｎ
ｇｉｏｃａｔｈを通しての手での注入により導入した。
上清は、右総大腿動脈から右外回腸動脈そして内回腸動
脈内へとさか上った形で流れた。上内回腸を開放状態に
残すことにより、上清のための流出が可能となり、全１
０ｍｌの上清を点滴注入できた。これまでに行なわれた
実験においては、上清は、４〜８時間の間血管の壁に露
呈されていた。左側及び右側からのカテーテルを次に除
去し、止血を行ない、切開部を閉じた。
【０１３５】１０〜１４日後、動物を麻酔してから安楽
死させた。麻酔後、露呈前に、遠位血管の直接触診によ
り、潜在性を評価した。腎臓下大動脈及び下大静脈を外
科的に露出させ、カニューレを挿入し、下肢の血管を生
理圧力（９０ｍｍｈｇ．）でヘパリン化されたリンガー
乳酸塩（２μ／ｍｌ）で洗い流した。致死量のネンブタ
ルを投与し、動脈を１０分間０．１Ｍのカコジル酸塩中
の０．５％のグルタルアルデヒド内でインサイチュで灌
流固定した。大動脈及び両回腸動脈を連続的に切除し、
１ｍＭのＭｇＣ１2を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）内で洗い流した。次に３７℃で１〜１．５時間ｘ−
ｇａｌ基質中でのインキュベーションによりｌａｃＺ活
性について血管を染色した。反応が完了した時点でｘ−
ｇａｌ溶液を洗い流しＰＢＳで置換し、写真撮影しこれ
を図２８〜３０に示した。
【０１３６】このプロトコルを用いて２つの実験を完了
した。両方の実験共、細胞質パターン内の選択的な強い
染色（図２８〜３０）によって視覚化されているように
動脈の表面上の細胞内のｌａｃＺ遺伝子産物のインサイ
チュ発現により示される通りインビボ形質導入が成功で
あることを実証した。図２８及び２９は、針金で損傷を
受け、αＳＧＣ−ＬａｃＺ組換え型レトロウィルスに露
呈され、固定されｌａｃＺ活性について染色され、低倍
率（図２８）及び高倍率（図２９）で写真撮影された外
回腸動脈の１セグメントである。Ｒｅｉｄｙ ｅｔａ
ｌ．によって記述された損傷及び増殖のパターンと一貫
した強力に染色された青色細胞のラインに留意された
い。図３０は、同じ様に固定され染色されたウィルスの
部位に対し遠位の同じ動脈の低倍率での写真である。こ
の部域は、控えめで拡散したバックグラウンド染色しか
示していない。
【０１３７】生物学的寄託 １９９１年１０月３日、出願人は、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．，ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に対し
て本書で記述した第ＶＩＩＩ因子の挿入を受けたプラス
ミドＭＦＧをＡＴＣＣ受入れ番号第６８７２６号とし
て、本書で記述したｔＰＡの挿入を受けたプラスミドＭ
ＦＧをＡＴＣＣ受入れ番号第６８７２７号として、本書
で記述した第ＶＩＩＩ因子の挿入を受けたプラスミドα
−ＳＧＣをＡＴＴＣ受入れ番号第６８７２８号として
又、本書で記述したｔＰＡの挿入を受けたプラスミドα
−ＳＧＣをＡＴＣＣ受入れ番号第６８７２９号として寄
託した。１９９１年１０月９日、出願人は、Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．，ＵＳＡ（ＡＴＣ
Ｃ）に対して、本書で記述したプラスミドＭＦＧをＡＴ
ＣＣ受入れ番号第６８７５４号として又本書で記述した
プラスミドα−ＳＧＣをＡＴＣＣ受入れ番号第６８７５
５号として寄託した。これらの寄託は、特許手続きを目
的とした微生物の寄託の国際的認定に関するブダペスト
条約の規定ならびにそれに基づく規則（「ブダペスト条
約」）に基づいて行なわれたものである。これにより、
寄託日より起算して３０年間生存可能な培養の維持が保
証される。これらの生体は、ブダペスト条約の条件下で
ＡＴＣＣから入手可能であり、関連する米国特許の発行
時点で無制約の利用可能性を保証するＡＴＣＣと出願人
の間の契約に準拠する。寄託された株の利用可能性は、
いずれかの政府当局がその特許法に従って付与した権利
を侵害して発明を実施することに対する許諾とみなされ
るべきものではない。
【０１３８】等価物 当業者であれば、日常の実験以上のものを用いることな
く、本書に特定的に記述された発明の特定の実施態様の
数多くの等価物を認識し、又それを確認することができ
るだろう。このような等価物は、以下のクレームの範囲
内に包含されるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】野生型マウス白血病ウィルス（レトロウィル
ス）ゲノムの概略図である。
【図２】本発明において有用な組換え型ゲノムを有する
レトロウィルスベクターｐＬＪの概略図である。
【図３】図２は、本発明において有用な組換え型ゲノム
を有するレトロウィルスベクターｐＥｍの概略図であ
る。
【図４】本発明において有用な組換え型ゲノムを有する
レトロウィルスベクターＭＦＧの概略図である。
【図５】本発明において有用な組換え型ゲノムを有する
レトロウィルスベクターα−ＳＧＣの概略図である。
【図６】図２に示されたｐＬＪベクター及びヒト副甲状
腺ホルモン遺伝子を用いた組換え型レトロウィルスベク
ターの構成の概略図である。
【図７】低密度リポタンパクレセプタ（ＬＤＬＲ）を発
現するレトロウィルスに感染し、螢光標識付けされたＬ
ＤＬの摂取について分析されたウシの大動脈内皮細胞
（位相差下の未感染のウシ大動脈内皮細胞）の写真を含
んでいる。
【図８】低密度リポタンパクレセプタ（ＬＤＬＲ）を発
現するレトロウィルスに感染し、螢光標識付けされたＬ
ＤＬの摂取について分析されたウシの大動脈内皮細胞
（螢光照明下の未感染ウシ大動脈内皮細胞）の写真を含
んでいる。
【図９】低密度リポタンパクレセプタ（ＬＤＬＲ）を発
現するレトロウィルスに感染し、螢光標識付けされたＬ
ＤＬの摂取について分析されたウシの大動脈内皮細胞
（位相差下の感染したウシ大動脈内皮細胞）の写真を含
んでいる。
【図１０】低密度リポタンパクレセプタ（ＬＤＬＲ）を
発現するレトロウィルスに感染し、螢光標識付けされた
ＬＤＬの摂取について分析されたウシの大動脈内皮細胞
（螢光照明下の感染したウシ大動脈内皮細胞）の写真を
含んでいる。
【図１１】ベータ−ガラクトシダーゼを発現するレトロ
ウィルスに感染し、インサイチュ（原位置）組織化学染
色を用いてその発現について分析された、未感染のウシ
大動脈内皮細胞の写真である。
【図１２】ベータ−ガラクトシダーゼを発現するレトロ
ウィルスに感染し、インサイチュ（原位置）組織化学染
色を用いてその発現について分析された、感染したウシ
大動脈内皮細胞の写真である。
【図１３】遺伝的に変更された内皮細胞を接種された頸
動脈介在グラフトのイヌ体内への移植を示す絵画的図で
ある。
【図１４】ｔＰＡ遺伝子の変更、変更を容易にするのに
用いられたオリゴヌクレオチド及び、図４に描かれてい
るベクター−ＭＦＧ内への変更ｔＰＡ遺伝子の挿入の概
略図である。
【図１５】第ＶＩＩＩ因子関連抗原の発現により識別さ
れた内皮細胞の培養の写真である。
【図１６】ｔＰＡを発現するレトロウィルスに感染した
イヌの内皮細胞の写真である。ｔＰＡを発現する細胞内
には暗い細胞質染色が見られる。
【図１７】図１６に対する、ｔＰＡレトロウィルスに感
染していない対照細胞の写真である。
【図１８】ＭＦＧ−ｔＰＡ及びα−ＳＧＣ−ｔＰＡ組換
え型レトロウィルスの内皮細胞内への安定した組込みを
示す細胞性ゲノミックＤＮＡのサザンブロットのオート
ラジオグラフの写真である。
【図１９】ＭＦＧ−ｔＰＡ及びα−ＳＧＣ−ｔＰＡ組換
え型レトロウィルスからのＲＮＡ発現を示す細胞性ＲＮ
Ａのノーザンブロットのオートラジオグラフの写真であ
る。
【図２０】ｔＰＡを発現するべく遺伝的に増大させられ
た内皮細胞でのライニングを受けた合成移植片のイヌ体
内への移植後の効力を示すヒストグラムである。
【図２１】第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのダイヤグラム
である。
【図２２】レトロウィルスベクターを生成するためさま
ざまな構成体内で使用される制限酵素部位を示す第ＶＩ
ＩＩ因子ｃＤＮＡのダイヤグラムである。
【図２３】垂直線として欠失領域が示された状態の、レ
トロウィルスベクター内に挿入された第ＶＩＩＩ因子ｃ
ＤＮＡの欠失誘導体のダイヤグラムである。
【図２４】ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＰｓｔ Ｉ部位の間の
Ｂドメイン欠失の拡大図である。重鎖と軽鎖の接合部に
おけるヌクレオチド配列は、ラインの上に記されてお
り、相応するアミノ酸番号はラインの下に記されてい
る。
【図２５】組立てられた最終レトロウィルスベクター、
ＭＦＧ−第ＶＩＩＩ因子の図である。
【図２６】ＭＦＧ−第ＶＩＩＩ因子レトロウィルスの内
皮細胞内への安定した取込みを示す、細胞性ゲノミック
ＤＮＡのサザンプロットのオートラジオグラフの写真で
ある。
【図２７】α−ＳＧＣ−ＬａｃＺ組換え型レトロウィル
スの図である。
【図２８】α−ＳＧＣ−ＬａｃＺレトロウィルスでイン
ビボで形質導入された動脈の低倍率写真である。
【図２９】α−ＳＧＣ−ＬａｃＺレトロウィルスでイン
ビボで形質導入された動脈の高倍率写真である。
【図３０】形質導入を受けていない動脈の１セグメント
である。
【図３１】レトロウィルスベクターα−ＳＧＣの地図で
ある。
【図３２】レトロウィルスベクターＭＦＧの地図であ
る。
フロントページの続き (71)出願人 501088707 ホワイトヘッド インスティチュート フ ォー バイオメディカル アメリカ合衆国，マサチューセッツ 02142，ケンブリッジ，ケンブリッジ セ ンター ９ (71)出願人 501088822 ブリグハム アンド ウーマンズ ホスピ タル アメリカ合衆国，マサチューセッツ 02115，ボストン，フランシス ストリー ト 75 (71)出願人 593025996 ニュー イングランド メディカル セン ター ホスピタルズ インコーポレイテッ ド アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ボ ストン ワシントンストリート 750 (72)発明者 ギルド，ブラッド アメリカ合衆国，マサチューセッツ 01742，コンコード，リバーデール ロー ド 109 (72)発明者 ラフィールド，ロリ エフ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94123, サン フランシスコ，＃５，ビーチ スト リート 2249 (72)発明者 コーエン，ローレンス ケー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611, オークランド，キャボット ドライブ 5670 (72)発明者 キャロウ，アラン ディー. アメリカ合衆国，ミズーリ 68108，セン ト ルイス，ポートランド プレイス 15 (72)発明者 ビリニー，ルイス ケー. アメリカ合衆国，マサチューセッツ 02131，ボストン，モス ヒル ロード 74 (72)発明者 ウィルソン，ジェームズ エム. アメリカ合衆国，ミシガン 48103，アン アルボー，リバー パインズ ロード 3686 (72)発明者 ムリガン，リチャード シー. アメリカ合衆国，マサチューセッツ 02138，ケンブリッジ，フランクリン ス トリート 441 (72)発明者 ロビンス，ポール アメリカ合衆国，ペンシルバニア 15216, マウント ゼバノン，オーバールック ド ライブ 527

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 問題の遺伝物質によってコードされたポ
    リペプチド又はタンパク質をインビボ発現させることの
    できる、この問題の遺伝物質を中に取り込んでいる形質
    導入されたヒト内皮細胞。
  2. 【請求項２】 問題の遺伝物質が、正常な内皮細胞の中
    に存在しかつこの細胞によって発現されるＤＮＡ；通常
    内皮細胞内には発生しないＤＮＡ；内皮細胞内で通常発
    生するもののその中で生物学的に有意なレベルでは発現
    されないＤＮＡ；及び内皮細胞内で発現されうるように
    変更可能なあらゆるＤＮＡ、から成るグループの中から
    選択される、請求の範囲第１項に記載の形質導入された
    ヒト内皮細胞。
  3. 【請求項３】 少なくとも１つの優性選択可能標識をコ
    ードするＤＮＡを付加的に含む、請求の範囲第２項に記
    載の形質導入されたヒト内皮細胞。
  4. 【請求項４】 問題の遺伝物質が、ホルモン、レセプ
    タ、酵素及び治療上価値あるポリペプチドから成るグル
    ープの中から選択されたタンパク質又はポリペプチドを
    コードする、請求の範囲第２項に記載の形質導入された
    ヒト内皮細胞。
  5. 【請求項５】 問題の遺伝物質が、ヒト副甲状腺ホルモ
    ン、組織プラスミノゲン活性化体、第ＶＩＩＩ因子、低
    密度リポタンパクレセプタ又はベータガラクトシダーゼ
    をコードする、請求の範囲第４項に記載の形質導入され
    たヒト内皮細胞。
  6. 【請求項６】 天然に発生する内皮細胞によっては作ら
    れない選択されたタンパク質をコードする取り込まれた
    ＤＮＡ、及び選択可能な標識をコードするＤＮＡを含
    む、培養された内皮細胞。
  7. 【請求項７】 問題の遺伝物質を中に取り込んだ形質導
    入された内皮細胞であって、この問題の遺伝物質がレト
    ロウイルスベクタの一部として提供されたＲＮＡから逆
    転写されている、取り込まれた問題のＤＮＡを発現する
    ことのできる形質導入された内皮細胞。
  8. 【請求項８】 問題の遺伝物質を中に取り込んだ形質導
    入されたヒト内皮細胞であって、この問題の遺伝物質が
    レトロウイルスベクタの一部として提供されたＲＮＡか
    ら逆転写されている、取り込まれた問題のＤＮＡを発現
    することのできる形質導入されたヒト内皮細胞。
  9. 【請求項９】 少なくとも１つの問題のタンパク質又は
    少なくとも１つの問題のポリペプチドをコードする取り
    込まれた問題の遺伝物質を発現する形質導入された内皮
    細胞を作製するインビボ方法であって、 ａ） 内皮細胞の増殖を誘発するためにインビボ（生体
    内）で内皮組織を損傷させ、かくして増殖中の内皮細胞
    を産生する段階；及び ｂ） 問題のＤＮＡを含む組換え型ゲノムをもつ感染性
    組換え型レトロウイルスと増殖中の内皮細胞とを接触さ
    せる段階；を含むインビボ方法。
  10. 【請求項１０】 タンパク質又はポリペプチドを体に提
    供する方法であって、このタンパク質又はポリペプチド
    をコードする遺伝物質を用いてインビボで内皮細胞を形
    質導入する段階を含む方法。
  11. 【請求項１１】 タンパク質又はポリペプチドが、ホル
    モン、酵素、レセプタ及び薬物から成るグループの中か
    ら選択される、請求の範囲第１０項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 組換え型レトロウイルスを用いて内皮
    細胞をインビボで感染させることを含む、タンパク質又
    はポリペプチドを体に提供する方法であって、この組換
    え型レトロウイルスが ａ） このタンパク質又はポリペプチドをコードする遺
    伝物質； ｂ） 両栄養性レトロウイルスから誘導されたＰｓｉパ
    ッケージング部位、ｔＲＮＡ結合部位及び長い末端反復
    配列；及び ｃ） 少なくとも１つの真核性プロモータ；から成る組
    換え型ゲノムを有する方法。
  13. 【請求項１３】 タンパク質又はポリペプチドが、ホル
    モン、酵素、レセプタ及び薬物から成るグループの中か
    ら選択されている、請求の範囲第１２項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 血栓崩壊タンパク質又はその一部分を
    コードする遺伝物質で形質導入された内皮細胞を血管に
    適用することを含む、合成人工血管の血栓形成性を減少
    させる方法。
  15. 【請求項１５】 遺伝物質が組織プラスミノーゲン活性
    化剤又はストレプトキナーゼをコードする、請求の範囲
    第１４項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 合成血管の表面に対する内皮細胞の結
    合を強化する方法であって、 ａ） リガンド支持表面を生み出すためリガンドを血管
    の表面に塗布する段階； ｂ） リガンドを結合する膜レセプタをコードする取り
    込まれた遺伝材料を含む内皮細胞をリガンド支持表面上
    に接種する段階；及び ｃ） リガンドと膜レセプタとの結合のために適切な条
    件下に血管を維持する段階；を含む方法。
  17. 【請求項１７】 取り込まれた問題の遺伝物質を発現す
    る内皮細胞でライニングされた人工血管を製造する方法
    であって、 ａ） 問題の遺伝物質から成る組換え型ゲノムを有する
    感染性組換え型レトロウイルスを含む培地と、培養され
    た内皮細胞とを接触させる段階； ｂ） 組換え型レトロウイルスによる内皮細胞の感染の
    ために適切な条件の下で、感染性組換え型レトロウイル
    スを含む培地と共に、培養された内皮細胞を維持する段
    階；及び ｃ） 内皮細胞の維持のために適切な条件の下で、
    （ｂ）において感染した内皮細胞を用いて人工血管の内
    面をライニングする段階；を含む方法。
  18. 【請求項１８】 取り込まれた問題の遺伝物質を哺乳動
    物体において発現する内皮細胞でライニングされた人工
    血管を移植する方法であって、 ａ） 問題の遺伝物質から成る組換えゲノムを有する感
    染性組換え型レトロウイルスを含む培地と培養された内
    皮細胞とを接触させる段階； ｂ） 組換え型レトロウイルスによる内皮細胞の感染の
    ために適切な条件の下で、感染性組換え型レトロウイル
    スを含む培地と共に、培養された内皮細胞を維持する段
    階； ｃ） 内皮細胞の維持のために適切な条件の下で（ｂ）
    で感染した内皮細胞を用いて人工血管の内面をライニン
    グする段階、及び ｄ） （ｃ）で形成された人工血管を哺乳動物の体内に
    導入する段階；を含む方法。
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