JPH06503968A - 遺伝子治療のためのレトロウイルスのベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子治療のためのレトロウィルスのベクタ一本発明は、身体の遺伝子治療にお いて使用することができる新規なレトロウィルスのベクターに関する。これらの レトロウィルスのベクターは問題の遺伝子のための挿入部位を含み、そして広範 な種類のトランスフェクションされた細胞のタイプにおいて問題の遺伝子から誘 導されたタンパク質をコントロールしたレベルで発現することができる。本発明 の新規なレトロウィルスのベクターの１つのクラスは選択可能なマーカーを欠如 し、こうしてマーカー遺伝子生成物、例えば、抗体を同時に生成しないで種々の 疾患の状態の処置において、ヒトの身体の治療のために適当である。本発明のレ トロウィルスのベクターはある種のパンケージング細胞系において使用するため にことに通する。

背景 哺乳動物細胞を遺伝子操作する多数の方法が存在する９種々のポリペプチドを大 量に生産する必要性および哺乳動物細胞の中の種々の遺伝学的欠陥を補正する必 要性を含むい（つかの理由のために、哺乳動物細胞を遺伝子操作することに大き い関心がもたれている。

これらの方法は効率、外来遺伝子の発現のレベル、および全体の遺伝子操作法の 効率のような因子に関して互いに劇的に異なった。

とくに有用であることが証明された哺乳動物細胞を遺伝子操作する１つの方法は 、レトロウィルスのベクターによる。レトロウィルスのベクターおよびそれらの 使用は多数の刊行物に記載されており、このような刊行物は次のものを包含する ：　Ｍａｎ　ら、釦旦３３：１５３−１５９（１９８３）およびＣｏｎｅおよび Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ’、　ＵＳＡ ８１：６３４９−６３５３　（１９８４）。レトロウィルスのベクターはレトロ ウィルスを遺伝子操作することによって生産される。

レトロウィルスはＲＮＡウィルスである；すなわち、ウィルスのゲノムはＲＮＡ 　である。しかしながら、このゲノムのＲＮ＾はＤＮＡ　コピーに逆転写され、 このコピーは形質導入された細胞の染色体はＤＮＡの中に安定にかつ効率よく組 み込まれる。この安定に組み込まれたＤＮＡコピーはプロウィルスと呼ばれ、そ して娘細胞により他の遺伝子として遺伝される。第１図に示すように、野生型の レトロウィルスのゲノムおよびプロウィルスのＩ）ＮＡは３つのＰｓｉ遺伝子： 　ｇａｇ＋ｐｏｌおよびｅｎν遺伝子を有し：これらは２つの長い末端の反復（ ＬＴＲ）的ＤＮ＾ポリメラーゼ（逆転写酵素）をエンコードする；そしてｅｎｖ 遺伝子はウィルスのエンベロープ塘タンパク質をエンコードする。

５′および３′のＬＴＲはヴイリオンのＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促 進する働きをする。

ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）および粒子へのウ ィルスのＲＮＡの効率よい包膜に必要な配列（Ｐｓｉ部位）が、５’ＬＴＲ隣接 して存在するａ　Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，ｃ、Ｉ　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ ！ｉ嶋１ｙ１」１１凱」ニーＧｅｎｅ　ｈ１凹−特（卯、　Ｍ、　Ｉｎｏｕｙｅ 　（編）　、　１５５−１７３（１９８３）；　Ｍａｎｎ、　Ｒ，ら、釦旦、　 ３３：１５３−１５９　（１９８３）；　Ｃｏｎｅ、　Ｒ，Ｄ、およびＲ，Ｃ， Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａ ｌ　Ａｃ　ｄｃ　ｄ±−司Ｉジ工汎り１」ニー針】ニー８１：６３４９−６３５ ３　（１９８４）。

包膜（または感染性ヴイリオンへのレトロウィルスのＲＮＡのパンケージング） のために必要な配列がウィルスのゲノムから除去される場合、ゲノムのＲＮＡの 包膜を防止するｃｉｓ作用性欠陥が生ずる。

しかしながら、生ずる突然変異体はなおすべてのヴイリオンタンパク質の合成を 指令することができる。Ｍｕｌｌｉｇａｎおよび共同研究者らは、これらのＰｓ ｉ配列が欠失されたレトロウィルスのゲノム、ならびに染色体の中に安定に組み 込まれた突然変異体のゲノムを含有する細胞系を記載した。Ｍｕｌｌｉｇａｎ、 　Ｒ，Ｃ−＋　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉｕｌａｔｉｏｎｏｆ　Ｇｅ ｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓ旦ｏｎ、　Ｍ、　Ｉｎｏｕｙｅ　（Ｗ）　、１５５−１７３ 　（１９８３）；　Ｍａｎｎ。

Ｒ１ら、皿、　３３：１５３−１５９　（１９８３）；　Ｃｏｎｅ、　Ｒ，Ｄ、 およびＲｌＣ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ。

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｃａｄｅ ｍ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｕ、　Ｓ、　Ａ。

８１：６３４９−６３５３　（１９８４）。入手可能なレトロウィルスのベクタ ーについての追加の詳細およびそれらの使用は、次のものを含む特許および特許 刊行物の中に見いだすことができる：欧州特許出願（ＥＰＡ　）第０１７８２２ ０号、米国特許第４．４０５．７１２号、Ｇ１１ｂｏａ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ 　ｕｅＳ４：５０４−５１２　（１９８６）　（これはＮ２レトロウィルスのベ クターを記載している）。これらの特許および刊行物の教示を引用によってここ に加える。

レトロウィルスのベクターは哺乳動物細胞の修飾にとくに有用である。なぜなら 、レトロウィルスのベクターがターゲット細胞を「怒染」しそしてターゲット細 胞のゲノムの中に組み込む効率が高いからである。さらに、レトロウィルスのベ クターは広範な種類の種および組織からの哺乳動物細胞を怒染することができる レトロウィルスに基づ（ことができるので、レトロウィルスのベクターは高度に 有用である。

レトロウィルスのベクターは哺乳動物細胞のゲノムの中に挿入することができる ので、ヒトおよび動物における遺伝病の遺伝子治療において使用するためのとく に有望な候補である。典型的には、遺伝子治療は（１）新しい遺伝学的材料を患 者の細胞にｉｎ　ｖｉｖｏ添加するか、あるいは（２）体から患者の細胞を取り 出し、新しい遺伝学的材料を細胞に添加し、そしてこれらの細胞を体の中に再導 入する、すなわち、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ遺伝子治療を包含する。レトロウィルスの ベクターを使用して種々の細胞において遺伝子治療を実施する方法は、例えば、 次に記載されている：米国特許第４，８６８，１１６号、１９８９年９月１９日 発行、および米国特許第４，９８０，２８６号、１９９０年１２月２５日発行（ 上皮細胞）　、ｗｏ８９１０７１３６号、１９８９年８月１０日公開（肝細胞） 、欧州特許（ＥＰ）第３７８，５７６号、１９９０年７月２５日公開（線維芽細 胞）、および−０８９１０５３４５号、１９８９年６月１５日公開および罰／９ ０１０６９９７号、１９９０年６月２８日公開（内皮細胞）、それら開示をここ に引用によって加える。

種々の遺伝子治療技術について有用であるためには、適当なレトロウィルスのベ クターはこれまで入手可能でなかった特別の特性を必要とする。遺伝子治療にお いて患者の細胞のｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子操作に使用するベクターのこれらの特別 の要件の主要な要求の源は、「患者」の細胞のゲノムの中にベクターを組み込む ための選択を必要とするレトロウィルスのベクターを通常使用することができな いためである。例えば、典型的なレトロウィルスのベクター、例えば、Ｗｉｌｌ ｉａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３１０：４７６−４８０　（１９８４）に記載され ているＭＳＶＤＨＦＲ−ＮＥＯは、遺伝学的に修飾された細胞を検出するための マーカーとしてネオマイシン耐性を使用する。こうして、このようなネオマイシ ン耐性のレトロウィルスのベクターを使用すると、患者を高いレベルのネオマイ シンに暴露して、ｉｎ　ｖｉｖｏの遺伝子治療を通して細胞の遺伝学的修復を実 施することが要求されるであろ・）。そのうえ・ｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　ｖ ｉｔｒｏの両者の遺伝子治療において、ヒトの遺伝子の身体の治療を行うマーカ ー遺伝子の遺伝子生産物を細胞の中に生成することが望ましくないことがある。

例えば、サラセミアを治癒するためにヘモグロビン遺伝子の置換を行うネオマイ シンホスホトランスフェラーゼを血球の中に高いレベルで生成する治療学的理由 は存在しない。したがって、ゲノムの中に効率よく組み込み、問題の遺伝子生産 物を所望のレベルで発現しそして、マーカー生成物、例えば、抗体を同時に生成 または発現しないで、高い力価で生成されるレトロウィルスを開発することは望 ましいであろう。

発明の要約 本発明は、身体の遺伝子治療において使用することができる新規なレトロウィル スのベクターに関する。これらのレトロウィルスのベクターは問題の遺伝子のた めの挿入部位を含み、そして広範な種類のトランスフェクシヨンされた細胞のタ イプにおいて問題の遺伝子から誘導されたタンパク質を所望のレベルで発現する ことができる。

本発明の１つの面において、操作可能な組み合わせにおいて、問題のレトロウィ ルスから誘導された５　’　ＬＴＲおよび３　’　ＬＴＲ、および問題の遺伝子 のための挿入部位からなり、そしてレトロウィルスのベクターの中のｇａｇ＋　 ｅｎＶまたはｐｏｌ遺伝子の少なくとも１つが不完全であるか、あるいは欠陥の ある、レトロウィルスのベクターが提供される。ベクターは、好ましくは、スプ ライスドナ一部位およびスプライスアクセプタ一部位を含有し、そしてスプライ スアクセプタ一部位は問題の遺伝子が挿入されている部位から上流に位置する。

また、ベクターは、望ましくは、ｇａｇの転写プロモーターを含み、ｇａｇの転 写プロモーターは挿入部位の中に挿入されたヌクレオチド配列の転写体が生成さ れるように機能的に位置し、そして転写体はｇａｇの５′未翻訳領域からなる。

本発明の好ましいベクターは選択可能なマーカーを欠如し、こうして、マーカー 遺伝子生産物、例えば、抗生物質の薬物のマーカーは同時に生成または同時に発 現されないので、前記ベクターはヒトの身体の遺伝子治療においていっそう望ま しいものとなる。

本発明のベクターの中に組み込まれる問題の遺伝子は、問題のホルモン、酵素、 レセプターおよび薬物を生成する任意の遺伝子であることができる。

レトロウィルスのベクターは、最も適当には、ここに定義するような、ある種の パッケージング細胞と組み合わせて使用され、これらのパッケージング細胞はヒ トおよび動物の身体の遺伝子治療のために広範な種類の細胞のタイプにおいて使 用することができる。

本発明のとくに好ましいレトロウィルスのベクターは、第２Ｃ図および第３図に 描写されているような、ここにおいてｒＭＦＧ　Ｊと同定され、そしてそれを含 有するプラスミド、ことにＡＴＣＣ６８，７５４の同定特性を有するプラスミド ＭＦＧである。

本発明は、また、前述のものに類似するが、ＬＴＲ以外のエンハンサ−およびア ルファーグロビンの転写プロモーター配列をさらに含んで種々の問題の遺伝子の 発現をコントロールするレトロウィルスのベクターに関する。本発明のこの面は 、サイトメガロウィルスからのエンハンサ−の使用を特別に提供する。また、エ ンハンサ−配列が３　’　ＬＴＩ？から欠失され、こうしてゲノムの中にベクタ ーを組み込むとき５’ＬＴＲを不活性化するベクターが提供される。詳しくは、 ベクターα−８ＧＣを含有するα−グロビンのプロモーター、およびことに第４ 図に描写されているもの、およびことにＡＴＣＣＮｏ、６８，７５５の同定特性 を有するプラスミドα−８ＧＣが提供される。

本発明は、また、遺伝子の発現のための部位の中に挿入された発現のための遺伝 子を有するレトロウィルスのベクターを包含する。

特定の例は、これらの有用な生産物の発現のための部位の中に挿入されたヒトの 因子■またはｔＰＡのための遺伝子を含有するＭＦＧおよびα−５ＣＣを包含す る。

図面の説明 第１図は、野生型ネズミ白血病ウィルス（レトロウィルス）のゲノムの概略的表 示である。

第２図は、各々が組み換えゲノムを有する、本発明において有用なレトロウィル スのベクターの概略的表示である。第２ａ図はｐＬＪであり、そして第２ｂ図は ｐＨ−であり、そして第２Ｃ図はＭＦＧであり、そして第２ｄ図はα−３ＧＣで ある。

第３図は、レトロウィルスのベクターＭＦＧの路線図である。

第４図は、レトロウィルスのベクターα−５ＧＣの路線図である。

第５図は、ｔＰＡを発現するように遺伝学的に増強した内皮細胞でライニングし た合成移植片のイヌの中への移植後の効能を示すヒストグラムである。

第６図は、因子■のポリペプチドの線図である。第６ｂ図は因子■のｃＤＮＡの 線図であり、レトロウィルスのベクターの発生に使用した種々構成体の中に使用 した制限酵素の部位を示す。第６Ｃ図は、垂直の線として示す欠失された領域を もつレトロウィルスのベクターの中に挿入された因子■のｃＤＮＡの欠失誘導体 の線図である。第６ｄ図は、旧ｎｄｌ［［部位とＰｓｔ１部位との間のＢドメイ ンの拡大した線図である。重鎮および軽鎖の接合におけるヌクレオチド配列は線 の上に表示されており、そして対応するアミノ酸番号は線の下に表示されている 。

第７図は、アセンブリソゲした最終のレトロウィルスのベクター、１’１ＦＧ− 因子■の線図である。

第８図は、α−５ＧＣ−ＬａｃＺの組み換えレトロウィルスの線図である。

第９図（ａ）および第９図（ｂ）は、本発明のＭＦＧヘクターの構成の路線図を 表す。

第１０図は、ｔＰＡ遺伝子の修飾、この修飾を促進するために使用したオリゴヌ クレオチドおよびＭＦＧヘクターの中への修飾されたｔＰＡ遺伝子の挿入の概略 的表示である。

特定の態様の説明 本発明は、いくつかのレトロウィルスのベクターを提供する。提供されたレトロ ウィルスのベクターは、（１）問題のレトロウィルスから誘導された５′および ３′のＬＴＲ，ＬＴＲのための好ましいレトロウィルス源はモロニーネズミ白血 病ウィルスである、および（２）問題の遺伝子のための挿入部位を含有する。本 発明のレトロウィルスのベクターは完全なｇａｇ＋　ｅｎＶまたはｐｏｌ遺伝子 を含有しないので、レトロウィルスのベクターはターゲット細胞の中で独立に複 製することができない。好ましいレトロウィルスのベクターはｇａｇ解読配列の 一部分を含有し、好ましくは部分的ｇａｇ解読配列はスプライスドナ一部位およ びスプライスアクセプタ一部位を含み、問題の遺伝子のだめの部位特異的にスプ ライスアクセプタ一部位が密接しかつそれから上流に位置するように、部分的ｇ ａｇ配列がレトロウィルスのベクターの中に位置するように、前記部位は位置す る。本発明のベクターのとくに好ましいＭｌにおいて、ｇａｇプロモーターから 開始された転写体が未翻訳の５　’　ｇａｇ配列およびベクターの中の挿入部位 の中に挿入された核酸配列から生成された転写体を含有するように、ｇａｇ転写 プロモーターは位置する。問題のベクターは、好ましくは、選択可能なマーカー を含をしない。このようなベクターの好ましい態様は’ＭＦＧ　、と表示される ベクターである。

本発明の他の面は、３　’　ＬＴＲの中の機能エンハンサ−要素を欠如し、これ によりターゲット生物のゲノムの中に組み込んだとき５′ＬＴＲを不活性化する レトロウィルスのベクターを提供することである。

本発明の他の面は、本質的に前述した通りであるが、ベクターの挿入部位の中に 挿入された遺伝子の発現をコントロールするためにｇａｇプロモーターを利用す る代わりに、ヒトα−グロビンを使用する、レトロウィルスのベクターを提供す ることである。レトロウィルスのベクターａ−５ＧＣを特別に開示する。

本発明の他の面は、問題の遺伝子の発現を増加するためにアルファグロビン転写 プロモーターを使用するレトロウィルスのベクターの中に位置しないエンハンサ −配列を用いることである。エンハンサ−配列がアルファーグロビンの転写プロ モーターから上流に配置されたベクターはと（に重要である。本発明の他の面は 、このようなＬＴＲを含有しないベクターの中のサイトメガロウィルスから誘導 されたエンハンサ−配列を提供することである。

本発明の他の面は、レトロウィルスのベクターの中で挿入部位の中に挿入された 発現のための遺伝子を含有するレトロウィルスのベクター構成体を提供すること である。本発明のレトロウィルスのベクターの中に挿入するための遺伝子は、任 意の種々のホルモン、酵素、レセプターまたは他の薬物を含む。本発明は、ＭＦ Ｇおよびα−５ＧＣの挿入、すなわち、クローニング部位の中に挿入された（独 立に）　ｔＰＡおよび因子■から成る遺伝学的構成体を特別に提供することであ る。

この野生型レトロウィルスのゲノムは、ＣｏｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、前掲 、により、新しい遺伝子を細胞の中に挿入することができるベクターとして使用 するために修飾された。第２図に示すように、ｇａｇ。

ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子のすべては除去され、そしてｎｅｏ遺伝子を工ンコー ドするＤＮＡセグメントはそれらの場所に挿入された。ｎｅｏ遺伝子は優性の選 択可能なマーカーとして働く。組み換えゲノムの一部分を残すレトロウィルスの 配列は、ＬＴＲ，ｔＲＮＡ結合部位およびＰｓｉパッケージング部位を含む。Ｃ ｅｐｋｏ、　Ｃ，ら、Ｃｅ１ｌ　３７：１０５３−１０６２（１９８４）。

発現のための外来遺伝子の挿入のための部位を含有する多数のレトロウィルスの ベクターを教示することに加えて、本発明は、また、レトロウィルスのベクター が挿入部位の中に挿入された遺伝子、すなわち、発現のための外来遺伝子または 遺伝子を含有する遺伝学的構成体を堤供する。本発明のベクターの中に含めるた めの外来遺伝子は、種々のタンパク質をエンコードすることができる。問題のタ ンパク質は、種々のホルモン、成長因子、酵素、リンホカイン、サイトカイン、 レセプターなどを包含する。用語「外来遺伝子」は、外来遺伝子を含有するレト ロウィルスのベクターを挿入することができる細胞に対して内因性の核酸配列を 包含する。存在しないか、減少した量の中に生産されるか、あるいは遺伝病に悩 まされる個体の中で突然変異の形態で生産されるポリペプチドをエンコードする 遺伝子は、発現のための遺伝子として使用するためにとくに重要である。さらに 、ターゲント細胞から分泌されるポリペプチドをエンコードする外来遺伝子を使 用して、外来遺伝子によりエンコードされるタンパク質により全身的作用を得る ことは重要である。問題の特定の外来遺伝子は次のものを包含する：ヘモグロビ ン、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インター ロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、 インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキンｉｏ、インターロ イキン１１、など、酬−Ｃ３Ｆ　、　（、−Ｃ３Ｆ　、、Ｍ−Ｃ３Ｆ　、ヒト成 長因子、インスリン、因子■、因子■、ｔＰＡ　、　ＬＤＬレセプター、腫瘍壊 死因子、ＦＤＧＦ、　ＥＧＦ、　ＮＧＦ、ＥＰＯ、β−グロビンなど、ならびに これらのタンパク質の生物学的に活性な突然変異タンパク質。レトロウィルスの ベクターの中に挿入するための発現のための遺伝子は種々の種からのものである ことができる：しかしながら、問題の遺伝子のために好ましい種の源は、外来遺 伝子を含有するレトロウィルスのベクターをその中に挿入すべき種である。

典型的には、本発明のレトロウィルスのベクターは、核酸配列をパッケージング 細胞系の中にトランスフェクションすることによって使用される。パッケージン グ細胞系は、これをベクターに変換する過程においてレトロウィルスから欠失さ れたウィルスの遺伝子機能を含有する。こうして、ベクターの挿入部位の中に挿 入された発現のための遺伝子を含むか、あるいは含まない、本発明のレトロウィ ルスのベクターをパフケージング細胞系の中にトランスフェクションすると、所 望の遺伝学的構成体を含有する感染性ウィルス粒子が生成する。理想的には、パ ンケージング細胞系は高い力価の組み換えレトロウィルスを生産することができ る。本発明の遺伝学的構成体とともに使用するために好ましいパンケージング細 胞系は、Ｐｓｉ２　＋　Ｐｓｉ　−Ａ＋＊＋　Ｐｓｉ　ＣＲＩＰ、およびＰｓｉ 　ＣＲＥである。Ｐｓｉ２はレトロウィルスのベクターＭＦＧおよびα−３ＧＣ とともに使用するためにとくに好ましい。

Ｍｕｌｌｉｇａｎおよび共同研究者らにより記載されたＰｓｉ２は、ＮＩＨ３Ｔ ３内皮をｐＭＯＶ−Ｐｓｉｄｅ　）ランスフエクションすることによってつくり 、ｐＭＯＶ−Ｐｓｉ　はエコトロピックモロニーネズミ白血病ウィルス（Ｍｏ− 門ｕＬＶクローンである。　ｐＭＯＶＰｓｉはすべてのウィルスの遺伝子生産物 を発現するが、ウィルスのゲノムの包膜に必要であるＰｓｉ配列を欠如する。ｐ ＭＯＶ　−Ｐｓ　ｉは、マウス（および密接に関係する奮歯類）の細胞上にのみ 存在するレセプターを認識する、エコトロピックのウィルスのエンベロープ垢タ ンパク質を発現する。

他の細胞系はＰｓｉ　２様パツケージング細胞系であるＰｓｉ　ａｍ系統である 。これらのＰｓｉ−ａｍ細胞系は修飾されたｐＭＯＶ　−Ｐｓ　ｉゲノムを含有 し、ここにおいてエコトロピックエンへロープ垢タンパク質は両種性ウィルス４ ０７０　Ａから誘導されたエンベロープ配列で置換されている。Ｈａｒｔｌｅｙ 、　Ｊ、　’４．および−、　Ｐ、　Ｒｏｗｅ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉ ｒｏｌｏ　。

１９：１９−２５　（１９７６）。結局、それらは両種性宿主範囲をもつ組み換 えウィルスの生産に有用である。　Ｐｓｉ　ａｍ細胞系をつくるために使用され たレトロウィルスは非常に広い哺乳動物宿主範囲（両種性宿主範囲）を有し、そ してヒト細胞を感染させるために使用することができる。組み換えゲノムがＰｓ ｉパッケージング配列を有する場合、Ｐｓｉ　−ａｍ細胞系は組み換えレトロウ ィルスのゲノムを感染性レトロウィルス粒子の中にパンケージングすることがで きる。Ｃｏｎｅ、　Ｒ。

Ｄ、およびＭｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｃ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｃａｄｅｍ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｕ、　 Ｓ、Ａ、　８１：６３４９−６３５３　（１９８４）。

２つの他のパッケージング細胞系はＰｓｉ　ＣＲＩＰおよびＰｓｉ　ＣＲＥとし て知られている。これらの細胞系は、それぞれ、両種性およびエコトロピック宿 主範囲をもつ組み換えレトロウィルスを高い力価で安定に生産するクローンを分 離するために使用であることが示された。

これらの細胞系は、Ｄａｎｏｓ、　０．およびＲ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　す 胚μ咬国■ヨー止り英収順ル１」９す已堕ジニ可」彊順匹旦ｓ　Ｕ、４扛」工８ ５　：６４６０−６４６４（１９８８）および米国特許出願第０７／２３９，５ ４５号、１９９８年９月１日提出、に記載されている。この参考文献および特許 出願の教示を引用によってここに加える。Ｐｓｉ　ＣＲｆＰおよびＰｓｉ　ＣＲ Ｅは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＩｌｅｒｉｃａｎ　 Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（米国マリイランド州口、 クビレ）に、それぞれ、受は入れ番号ＣＲＬ９８０８およびＣＲＬ　９８０７で ブダヘスト条約の規定に従い受託された。

本発明のレトロウィルスのベクターは、次のものを限定なしに包含する広範な種 類の細胞のタイプにおいて使用することができる：上皮細胞、線維芽細胞、肝細 胞、内皮細胞、筋芽細胞、星状細胞、リンパ球細胞、メセンシャル（ｍｅｓｅｎ ｔｈｉａｌ）細胞など。次の特許および特許刊行物に開示されている細胞のタイ プはとくに重要である：米国特許第４，８６８，１１６号、１９８９年９月１９ 日発行、および米国特許第４．９８０，２８６号、１９９０年１２月２５日発行 （上皮細胞）、ＰＣＴ／ＵＳ８９１００４２２、匈０８９１０７１３６号、１９ ８９年８月ＩＯ日公開（肝細胞）、欧州特許（ＥＰ）第３７８，５７６号、１９ ９０年７月２５日公開（線維芽細胞）、およびＰＣＴ／ＵＳ８８１０４３８３　 、ＷＯ３９１０５３４５号、１９８９年６月１５日公開および−ｏ　／　９０　 ／　０６９９７号、１９９０年６月２８日公開（内皮細胞）、それら開示をここ に引用によって加える。

本発明のベクターは、次のものを限定なしに包含する種々の用途において使用す ることができる：癌、遺伝学的に基づく病気、心肺の疾患、内分泌学的疾患など 。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を限定 することを意図しない。

実施例１（ａ）〜（Ｃ）において、本発明のＭＦＧベクターを構成のための前駆 体を記載する。参考文献の開示はここに引用によって加える。

１施■土１ ５クツ≧が何１戊 ｐＭＯＶ　（ｐＭＯＶＰｓｉ）は次のようにして構成した＝３つの精製したＤＮ Ａ断片を一緒に結合したｐＭＯＶ　Ｐｓｉ−を構成した。ｐ門ＯＶ　Ｐｓｉ＋を Ｘｈｏｌで完全に消化し、次いでＥｃｏＲＩで部分的に消化することによって、 第１を得た。Ｃｈｕｗａｋｏｖ、　１．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ ｏ　、　４２：１０８８−１０９８（１９８２）。ＭｕＬＶの中の２．ＯＵにお けるＸｈｏ１部位から、３　’　ＬＴＲ，３’　？ウスのフランキング配列、ｐ Ｂ１１３２２のすべて、を通して延び、そしてＥｃｏＲ１部位において終わる断 片を、電気泳動の分離後にアガロースゲルから精製した。Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ 、　Ｂ、およびり、　Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ、　Ｐｒｏｃｅｅｄ−ｉｎ　ｓ　ｏｆ 　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｃａｄｅｍ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　 ＵＳＡ、　７６１：６１５−６１９（１９７９）、　ｐＭＯＶ　Ｐｓｉ＋をＢａ 目で完全に消化し、次いでｐＢＦ１３２２の中のＢａ１１部位から５′マウスの ｆｌｋ配列および５′を通してＭｕＬＶの０．７Ｕに位置するＢａ１１部位に延 びる断片を精製することによって、第２の断片を得た。次いで旧ｎｄＩ［［リン カ−（コラポレイティブ・リサーチ）をこの断片にＴ４ＤＮＡ　リガーゼに平滑 末端結合し、そしてこの断片を過剰のＨｉｎｄ［およびＥｃｏＲＩで消化した。

このＬＴＲを含有する断片を電気泳動で分離後にアガロースゲルから精製した。

最終の結合反応において存在する第３の断片は、ＭｕＬＶのｇａｇ／ｐｏｔ　ｆ ｉＩ域がｐＳＶ２の中にサブクローニングされているｐｓＶ２ｇａｇ／ｐａｌか ら得た。

Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｃ，、およびＰ、Ｂｅｒｇ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２ ０９：１４２２−１４２７　（１９８０）。

ｐＳＶ２　ｇａｇ　／ｐｏｌをＸｈｏｌおよび旧ｎｄｕｌで完全に消化し、そし て旧ｎｄ■部位（１，ＯＵのＭｕＬＶにおけるＰｓｔ１部位から変化した）から ２．０のＭｕＬＶにおけるＸｈｏＩに延びる断片を電気泳動で分離後にアガロー スゲルから精製した。次いで、これらの３つのＤＮＡ断片を等しい量で５０μｇ ／ｄの合計のＤＮＡ濃度においてリガーゼ緩衝液（５０ｓＭのトリス−ＨＣｌ　 （ｐＨ７，８）　、１０５１ＭのＭｇＣＩｚ、　２０ｗＭのジチオスレイトール 、１．０ＩＩＭの＾ｒｐ、　５ｏ　ｕ　ｇ／ｄのウシ血清アルブミン）の中で混 合し、そしてＴ４ＤＮＡ　リガーゼと１５“Ｃにおいて１８時間インキュベーシ ョンした。大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＨＢＩＯＩを結合したＤＮＡでトランス フェクションし、そしてアンピシリン耐性トランスフェクション体を得た。ある 数の形質転換体から得られたプラスミドＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ で消化し、そしてアガロースゲルで電気泳動させることによって所望の構造につ いてスクリーニングした。Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ。

ら、メリンス・Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｓ＋ｏｌｏｇｙ、　６５：４０ １−４１１　（１９８０）。

ｐＭＯＶ　−Ｐｓ　ｉおよびｐｓＶ２ｇｐｔ、　ＸＧ　ＰＲＴを発現することが できるＳＶ４０ハイブリッドベクターを同時形質転換することによって、染色体 の中に安定に組み込まれたＰｓｉ突然変異体を含有する細胞系をつくった。Ｍｕ ｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｃ，、およびＰ、　Ｂｅｒｇ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２０ ９：１４２２−１４２７（１９８０）。このようにして得られたｇｐｔ＋コロニ ーからの細胞をクローニングし、そして３つの系統に推定した：　Ｐｓｉ　１． 　Ｐｓｉ−２およびＰｓｉ−３゜ 大施斑上ユ亙Ｌ ｐＬＪ、このベクターの特性は、Ｋｏｒｍａｎ＋　＾、Ｊ、ら、Ｐｒｏｃｅｅｄ ｉｎｇｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｃａｄｅｍ　ｏｆ　５ｃｉ ｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ、　８４：２１５０　（１９８７）により記載された。この ベクターは２つの遺伝子を発現することができる二問題の遺伝子および優性の選 択可能なマーカー、例えば、ｎｏｅ遺伝子。問題の遺伝子を５′に対してちょう ど基部のＢａｍＨＩ／５ｒｓａｒ／５ａｌｌクローニング部位の中に直接の向き でクローニングし、同時に、ｎｅｏ遺伝子をクローニング部位より３′離れてい る（クローニング部位の３′に位置する）内部のプロモーター（ＳＶ４０から） に対して基部に配置する。ｐＬＪからの転写は２の部位において開始する：１） ５’ＬＴＲ１これは問題の遺伝子の発現のために要求される、および２）内部の ＳＶ４０プロモーター、これはｎｅｇ遺伝子の発現のために要求される。ｐＬＪ の構造は第２ａ図に表されている。

ベクターｐＬＪは第２ａ図に表されている。ｐＬＪにおいて、問題の遺伝物質は ５　’　ＬＴＲのちょうど後に挿入される。この遺伝物質の発現はＬＴＲから転 写され、そしてｎｅｏ遺伝子の発現は内部のＳＶ４０プロモーターから転写され る。

スＩＬＬＬ二と ｐＥ＋ｗ。この実施例において、野生型ウィルスのｇａｇ、ρｏｌおよびｅｎｖ のための全体の解読配列を、発現される唯一の遺伝子である問題の遺伝子で置換 する。ｐＥｍヘクターの成分を下に記載する。５′フランキング配列、５　’　 ＬＴＲおよび４００ｂｐの隣接する配列（Ｂａｍ８１部位まで）はｐＺｒｐから のものである。３′フランキング配列およびＬＴＩ？ばまたｐＺＩＰからのもの である；しかしながら、３’ＬＴＲから１５０ｂｐ上流のＣｌａｌ部位は合成り ａｍＨＩ　と結合されており、そしてベクターの中に存在するＢａＩＩＩＨＩ　 クローニング部位の他方の半分を形成する。ｐＢＲ３２２の旧ｎｄ　ＤＩＥ　／ 　ＥｃｏＲＩ断片はプラスミドの主鎖を形成する。

このベクターはモロニーネズミ白血病ウィルスの株からクローニングされた配列 から誘導される。類似のベクターは、骨髄増殖性肉腫ウィルスから誘導される配 列から構成された。ｐＥｍの構造は第２ｂ図に表されている。

また、選択可能なマーカーをもたないベクターを使用して、種々の細胞のタイプ 、例えば、問題の遺伝物質をもつ内皮細胞を形質導入することができる。このよ うなベクターは基本的には従来記載されたベクターの簡素化である、この中にこ のようなマーカーが存在する。ベクターｐＥｎ＋は第２ｂ図に表されている；表 されているように、このベクターの主な成分は５′および３′のＬＴＲであり、 そして問題の遺伝物質は２つのＬＴＩ？の間に挿入されている。

夫施■工 ＭＦＧヘク　−の ＡＴＣＣＮｏ、６８７５４の同定特性を有する肝ＧヘクターはρＥＭから誘導す るが、パンケージング細胞系の中の組み換えゲノムの包膜を増加するためにＭＭ ＬＶからのｇａｇ配列の１０３８ｂｐ、およびスプライスアクセプタ一部位およ び転写開始を含有するＭＯＶ〜９から誘導された３５０ｂｐを含有する。Ｎｃｏ ［およびＢａｍＨ１部位を含有する１８ｂｐのオリゴヌクレオチドは、Ｎ０Ｖ− ９の直ぐ後に存在し、そして適合性部位をもつ遺伝子の便利な挿入を可能とする 。ＭＭＬＶ　ＬＴＲは転写をコントロールし、そして生ずるｍＲＮＡは自然ｇａ ｇ転写体の真性の５′未翻訳領域を含有し、これに直ぐに引き続いて挿入された 遺伝子のオープンリーディングフレームが存在する。Ｉ’ｌＦＧの構造は第２Ｃ 図に表されている。

ＭＦＧのより詳細な地図は第１３図に記載されている。ＭＦＧの構成についての 詳細は第９図（ａ）および第９図（ｂ）に記載されている。

？ＩＦＧは、半分のＧＡＧレトロウィルスのベクター（半分のＧＡＧはＢｅｎｄ ｅｒら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１：１６３９−１６４６に記載されている）の χｈｏｔ／Ｎｄｅｌ断片を含有する５　’　ＬＴＲを、χｈｏＩ／ＢａｍＨＩ　 Ｈ４のヒストンプロモーター断片に結合することによって構成した。レトロウィ ルスのベクターｐＥＭをＮｄｅｌおよびＢａｔａＨＩで消化し、そして３　’　 ＬＴＲを含有する断片を既にＨ４断片に結合された半分のＧＡＧに結合して、適 切な向きに２つのＬＴＲを含有し、そしてまたベクターのウィルス部分内にＨ４ を含有する中間のレトロウィルスのベクターを生成した。次いで中間のベクター をＮｄｅ　Ｉで消化して線状にし、そしてこのベクターのｐＢＲ３２２部分の中 のＮｄｅ１部位をポリメラーゼによりフィルインし、そして結合により破壊した 。このベクターを引き続いてＸｈｏｌで消化し、そしてＸｈｏ１部位をＮｄｅｌ リンカ−に接合した。このベクターを引き続いてＢａ＋＊ＨＩで切断し、そして 両者のＬＴＲおよびｐＢＲ３２２配列を含有する大きい断片を精製した。

ＸｈｏｌおよびＢａｍＨＩを有しそして次の配列：ＣＴＡＧＡＣＴＧＣＣＡＴＧ ＧＣＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＣＣＴＡＧを存するリンカ−を合成し、 そして清浄化した（ｃｌｅａｒｅｄ）中間体のベクターおよびｐ門ＯＶ９からの Ｎｄｅｌ／Ｘｈｏｌ断片（Ｎｄｅｌのへりの次にスプライスアクセプタ一部位を 含有する）の両者に結合して、第２Ｃ図、第３図および第９図（ａ）〜第９図（ ｂ）に示されているような、円形のベクター、ＭＦＧを形成した。ベクターＭＦ Ｇを含有するプラスミドはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ ｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）受託され、 そして受け入れ番号６８．７５４を有する。

災施側−町 免二並（皇１−戒 α−５ＣＣヘクター（ＡＴＣＣ受は入れ番号６８７５５）は、α−グロビン遺伝 子バンクからの転写プロモーター配列を利用してｔｐ＾遺伝子の発現を調節する 。プロモーター要素を含有する６００塩基対の断片は、転写開始のための配列お よび真性のα−グロビンｍＲＮＡの５′未翻訳領域をさらに含有する。サイトメ ガロウィルス遊離転写エンハンサ−を含む３６０塩基対の断片はα−グロビンの プロモーターより前に存在し、そしてこの要素からの転写を増強するために使用 される。

さらに、ＭＭＬＶエンハンサ−は３　’　！、ＴＲから欠失される。この欠失は 感染のとき５’ＬＴＲに転移され、そしてこの要素の転写の活性化の活性を本質 的に不活性化する。α−３ＧＣの構造は第２ｄ図に表されている６α−５ＧＣの より詳細な記載は第４図に示されている。α−３ＧＣヘクターを含有するプラス ミドはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に受託され、そして受け入れ 番号６８．７５５を有する。

以下の実施例は、内皮細胞とともに本発明のレトロウィルスのベクターを使用す る実施例を提供する。理解されるように、他の細胞のタイプは同様によく適当で あり、限定なしに、上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞などを包含する。

組織のプラスミノゲンアクチベータ−（ｔＰＡ）は、血液のクロ・ントの線維素 溶解を促進する内皮細胞により通常分泌されるタンパク質である。ヒトｔｐ＾を エンコードする組み換えレトロウィルスのベクターを構成し、そしてイヌ内皮細 胞の形質導入に使用して、形質導入された内皮細胞からの治療的に関係するタン パク質のデリバリ−の増強を証明する。

組み換えレトロウィルスのベクターの中にクローニングするためのｔｐ＾遺伝子 の修飾を第１０図に示す、ヒト子宮のｔＰＡの解読配列は、インチグレイテッド ・ジェネティックス・インコーボレーテノド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｇｅｎｅ ｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、）、マサチェセツツ州フラミングハムから入手したｐＵＣに 基づ＜’５ａｌｌＤＮＡ断片内に含有されていた。もとのｃＤＮＡの塩基対６に おける５ＦａＮ１部位および塩基対２０９０におけるＢｇｌ１１部位に５ａｌＩ リンカ−を配置することによって、５ａｌＩ断片を誘導した。

解読配列は塩基対１３から塩基対１６９９に延びる。

このもとのクローンから、この特許の主要部の中に記載されるＭＦＧおよびα− ３ＧＧベクターの中に直接クローニングすることができる断片を誘導した。　５ ａｉｌフイルインをまず合成りａｓ＋ＨＩ　リンカ−の付加によりＢａ■ＨＩ断 片に転化し、次いで制限酵素Ｂｇｌｌｌで消化して、１０９塩基対のＢａｍＨＩ −ＢｇｌｌＩ断片および１９７５塩基対のＢｇｌ　ＩＩ　−Ｂａ＋ｗＨＴ断片を 生成する。ｔＰＡ解読配列のミッシング１００塩基対および翻訳開始コドンを再 びつくるために、２つの１０４塩基対のオリゴヌクレオチドを化学的に合成し、 そしてアニーリングして５′末端にＮｃｏ１部位および３′末端にＢａ１１１部 位をもつ断片をつくる。このオリゴヌクレオチドを部分的１９７５塩基対のｔｐ ＾遺伝子のＢｇｌ１１部位上に結合して、もとの分子の同一の解読配列をもつ２ ０７９塩基対のｔＰＡ遺伝子をつくるが、これはＮｃｏＩ−ＢａｍＨ［断片とし て容易に得ることができる。それをＭＦＧおよびα−５ＧＣベクターの中に直接 挿入した（生ずるベクターは、それぞれ、ＡＴＣＣの受け入れ番号６８７２７お よび６８７２９を与えられた）。これらの操作は標準の分子生物学の技術（Ｍｏ 　１ｅｃｕ　ｆａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ 、　Ｔ、　Ｍａｎａｔｉｓ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｓｈｃ−およびＪ、　Ｓａｍ ｂｒｏｏｋ）により実施し、そして第２図に線図で示されている。

ＭＦＧ−ｔＰＡおよびα−３ＧＣ−ｔＰＡをエンコードする絹み換えウィルスを 生産する細胞系は、両種性宿主範囲の組み換えレトロウィルスを生産することが できるＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎのＰｓｉパンケージング細胞系からつ くった（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄ ｃａｄｅｍｙｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８５：６４６０　（ １９８８）　）　、　１０μｇの特定のＤＮＡおよび１μｇのプラスミドｐＳＶ ２ｎｅｏを共沈させ、そして標準のリン酸カルシウムトランスフエクシゴン手順 によりパッケージンク細胞上にトランスフェクションした。安定にトランスフェ クションしたクローンを、８００ｕｇ／ａｆｌのＧ４１８を含有する選択培地の 中で１４日間増殖させた後分離した。２４時間培養の上澄み液を個々のクローン のコンフルエント単層から収獲し、そしてＮＩＨ３Ｔ３細胞の感染に使用した。

２４時間の暴露後、培養上澄み液を除去し、そして３Ｔ３細胞に通常の培地を供 給し、そしてさらに７２時間増殖させた。新鮮な培地をこれらの細胞上に６時間 の間装置し、そしてこれらの上澄み液を商業的に入手可能なヒトｔＰＡに対して 特異的なＥＬＩＳＡ（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄ−５、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇ ｎｏｓｔｉｃａ　Ｉｎｃ、−ニューヨーク州ニューヨーク）を使用してヒトｔＰ Ａについてアッセイした。このスクリーンから、ＭＦＧ　−ｔｐｎ　＆ｌｌみ換 えウィルスまたはα−５ＧＣ−ｔＰＡ　＆Ｉｌみ換えウィルスを生産するパッケ ージング細胞系のクローンを選抜しそして、それぞれ、ＭＦＧ　６８およびα− ９ＧＣ２２と表示した。

イヌ内皮細胞は、記載されているように、外部の頚静脈の１０ｃｍのセグメント からコラゲナーゼの消化により分離した（Ｔ、　Ｊ、　Ｈｕｎｔｅｒ＋Ｓ、　Ｐ 、　５ｃｈａ＋ｉｄｔ、　Ｈ，Ｖ、　５ｈａｒｐ、および（１９８３）　Ｔｒａ ｎｓ、　Ａｍ、　Ｓｏｃ。

紅旦ｆ、　Ｔｒｕμｍ」■註ｕ２９：１７７　）。細胞をフィブロネクチン被覆 した組織培養皿上で５％の血漿誘導ウマ血清、５０μｇ／ａｄの内皮細胞の成長 因子および１００　μｇ／ｄｉのヘパリンを含有するＭ１９９培地の中で増殖さ せた。細胞培養物の純度は、フォノ・ウィルブランドの因子の存在および平滑筋 の細胞に特異的なα−アクチンの不存在についての免疫化学的アッセイにより決 定した。形質導入の前日に、内皮細胞をヘパリンを含まない培地の中に５．５　 ＸＩＯ’細胞／Ｃ−で接種した０次の日に、内皮細胞を、８μｇ／ｉｄのポリブ レンを添加した各生産体細胞系から誘導された組み換えウィルスを含有する上澄 み液に、２４時間暴露した。ウィルスの上澄み液を除去し、分析に通常の培地を 供給し、そして増殖を分析前にさらに４８時間進行させた。

高分子量のゲノムＤＮＡおよび合計のＲＮＡを内皮細胞の培養物から標準の技術 により分離した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　−Ａ　Ｌａｂｏｒ　ｔｏ ｒＬＭａｎｕａＬ　Ｔ、門ａｎａｔｉｓ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｈｃ　、お よびＪ、　５ａｓｂｒｏｏｋ）。ＤＮＡおよびＲＮＡを、全体のｔＰＡのｃＤＮ Ａ断片から調製した３２Ｐ標識したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーシッン 分析により分析した。標準の技術は電気泳動分離、フィルターの転移、ハイブリ ダイゼーシヨン、洗浄、およびｓｚｐの標識つけについて使用した（Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　？、　 Ｍａｎａｔｉｓ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｈｃ、およびＪ、　Ｓａｍｂｒｏｏ ｋ）。形質導入されたイヌ内皮細胞の中のヒ）　ｔＰＡの生産は、種の特異的免 疫化学的染色で実証された。形質導入された細胞を３％のホルムアルデヒドの中 で１０分間室温において固定し、次いで０．１％のトリトンＸ−１００の中で５ 分間透過化した０次いで、固定された細胞の単層を順次にヒトｔＰＡに対するネ ズミモノクローナル抗体と、アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗マウス抗体と 、そして量後にアルカリ性ホスファターゼに対して特異的な色試薬とインキュベ ーションした。この手順はヒトｔＰＡを発現する細胞を特異的に染色し、そして 普通の光学顕微鏡により可視化することができる。さらに、形質導入された細胞 からのｔＰＡの分泌をコンフルエント細胞単層から決定した。新鮮な培地を細胞 の上に６時間の間装置し、除去し、そして遠心により清浄にし、そしてヒトｔＰ ＡＯ量を商業的に入手可能なＥＬＩＳＡ　（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄ−５，Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）で決定した。

形質導入プロセスの効率は、モック形譬導入された細胞またはＭＦＧ−ｔＰＡで 形質導入された細胞の集団の免疫化学的染色により示された。第５図に示すよう に、？ｆＦＧ　６８から収獲したウィルスの上澄み液に細胞を１回暴露した後、 細胞の本質的にすべてはヒトｔｐ＾を合成しており、これに対して対照において 細胞はまった（合成していない、これは形質導入された細胞についていずれかの タイプを選択しないで達成された。

免疫学的アンセイを実施して、形質導入された細胞から分泌されているｔＰＡＯ 量を決定した。下に示すように、ｌ’ｌＦＧ　６８またはα−５ＧＣ２２からの 組み換えウィルスで形質導入された細胞は大量のヒトｔＰＡを分泌した。同様な 条件下に、培養中のヒト内皮細胞は典型的にはほぼｌｏｇのｔｐ＾分泌する（Ｈ ａｎｓ９．　Ｍ、およびり、　Ｃｏ１１ｅｎ　（１９８７）Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃ ｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、１０９：９７−１０４　）。

表　ｌ 豊盗Ｚ旦！皿 未感染（７）Ｋ９ＥＣＯ，Ｏ ＭＦＧ６８　Ｋ９　ＥＣ１５０，１ α−５ＧＣ２２Ｋ９　ＥＣ３０２，８ 内皮細胞がＭＦＧ　６８およびα−５ＧＣ２２がらの組み換えウィルスで形質導 入されたことのそれ以上の確証として、ＤＮＡおよびＲＮＡを形質導入された細 胞から分離し、そして放射線標識したｔＰＡ遺伝子に対するハイブリダイゼーシ ョンにより分析した。ＤＮＡ分析のオートラジオグラフィーを実施した。ハイブ リダイゼーションは未感染の対照において検出されなかったが、２つの組み換え ウィルスで感染した細胞において適当な分子量の単一のハイブリダイゼーション する種が見られた。これが証明するように、遺伝情報はこれらの形質導入された 細胞のゲノムに転移された。

これらの細胞から分離された合計のＲＮＡのハイブリダイゼーション分析は、タ ンパク譬およびＤＮＡの結果を確証する。再び対照の細胞においてハイブリダイ ゼーションは検出されなかったが、形質導入された細胞から誘導されたＲＮＡに おいて、適当な大きさのハイブリダイゼーションのバンドを見ることができる。

ＭＦＧ　６８およびα−３ＧＣ２２の組み換えウィルスを生産する細胞からのＲ ＮＡを、また、対照として示す。

Ｗ　脈　植片の　面上の　訳されたｌ　されたイヌのｉｎ　ｖｉｖｏの 体重２０〜３２５　ｋｇの大人の雌の雑種のイヌの外部の頚静脈がら内皮細胞を 酵素的に収獲し、実験室において培養し、そして実施例■に記載するように純度 のための分析した。各動物から分離された細胞の半分を、前の節に記載するよう にＭＦＧ　−ｔＰＡ組み換えウィルスを生産するＭＦＧ　６８細胞系から収獲し たｔＰＡの上澄み液に２回暴露することによって形質導入した。他方の半分をモ ソク形賞導入した。各集団について実施した増殖曲線は、増殖特性の差を示した 。形質導入された細胞の各ハンチから誘導された培養の上澄み液についてＥＬＩ ＳＡの測定を実施して、ｔＰＡが増強された細胞から分泌されていることを確実 にした。次いでこれらの細胞を実験室においてほぼ１週間増殖させて、十分な数 の細胞を得た。

細胞を分離した各動物について、発泡テフロンから作られた２つの脈管移植片（ Ｗ、　Ｌ、　Ｇｏｒｅ　ａｎｄ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、　Ｉｎｃ、、アリシナ 州フラグスタッフ）に細胞を接種した。一方の移植片をモソク形賞導入された細 胞で接種し、そして他方を高いレベルのｔＰＡを分泌するように形質導入された 細胞で接種した。各移植片、０．４　ｃｍＸ１４ｃｍ、を１μｇ　／　ｃｄのフ ィフ゛：コネクチン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、ミソ゛リー 州セントルイス）で予備被覆し、次いで２２００．０００の内皮細胞／ｃｍで接 種した。次いで移植片を追加の７２時間の培養の間インキュベーションした。移 植の前に、末端を各移植片から切断しそして検査して細胞の被覆を確実にした。

細胞を収獲した同一のイヌを麻酔し、そして接種した移植片の１０１のセグメン トを大動脈−腸骨のバイパスとして移植した。各イヌに２つの対側の移植片を与 えた；一方は対照細胞を接種しそして他方は高いレベルのｔＰＡを分泌するよう に形質導入された細胞を接種した。移植後、移植片の性能をＢ−モードのスキャ ナーで毎日モニターし、このスキャナーは超音波で移植片を探し、そしてトンプ ラーＳ定（Ａｃｃｕｓｏｎ、　Ｉｎｃ、）により移植片を通る血液の流れを評価 した。

血栓の形成を減少する薬物を動物に投与しなかった。

６匹の異なる動物における移植片の性能の結果分析した。結果を第５図に示す。

前述の移植のモデルは極端に厳格なものであり、そして閉鎖性クロットの形成に より象、速な移植片の不合格に導く。正常の移植片の機能は充実の棒で示し、そ して不合格であるが、なお機能している移植片は縞のある棒で示す。第１の動物 において、対照移植片および増大したレベルのｔＰＡを分泌する形質導入された 細胞でライニングした移植片（実験）は移Ｍｉ後２４時間でクロ、トの形成のた めに不合格であった。他の５匹の動物のすべてにおいて、増大したレベルのｔｐ ＾を分泌する形質導入された細胞でライニングした移植片はモンク形質導入され たのみの細胞をもつ移植片より長く機能した。この差は２４時間から数カ月まで 変化した。これらの結果が証明するように、治療的効果は形質導入された内皮細 胞を使用してｉｎ　ｖｉｖｏで達成することができる。

ｘ　ノ　れた　か゛のヒト　■の 修飾されたヒト因子■遺伝子を含有するレトロウィルスのベクターであるＭＦＧ 　（ＡＴ（：Ｃの受け入れ番号６８７２６）で細胞を形質導入することよって、 内皮細胞を遺伝学的に増強してヒト因子■を生産した。

修飾された因子■はＡｔ、　Ａ２．　Ａ３．　ＣＩおよびｃ２ドメインのための 解読配列のすべてを含有するが、Ｄドメインはアミノ酸７４３から１４６８まで 欠失されている。Ｂドメインの除去およびレトロウィルスのベクターＭＦＧの中 への修飾された因子■の挿入を下に詳細に記載しそして第７図に描写する。

５′および３′の未翻訳配列をもたない全長のｃＤＮＡを、制限部位Ｎｃｏ！（ ５’　）とＸｈｏｌ（３’　）との間に挿入されたプラスミドベクターにおいて 得た。Ｂドメインを除去するために、因子■のｃＤＮＡをＢドメインの５′およ び３′の両者の側の配列をスパンする４断片においてプラスミドベクターの中に サブクローニングした。因子■のｃＤＮＡの第１断片を、プラスミドベクタ−ｐ ｔｌｃ９の中の制限部位Ｓ＋ｓａ　［とＰｓｔｌとの間にサブクローニングした 。このプラスミドベクターを５ａｌｌおよびＰｓｔｌで切断し、そして５′ホス フエートを仔つシ腸ホスファターゼを使用して除去した。全長のｃＤＮＡからの １５９１塩基対のＸｈｏｌ　（ヌクレオチド７２６３）　ＮｄｅＩ　（ヌクレオ チド５６７２　）断片、および３５９塩基対のＮｄｅｌ　（ヌクレオチド５６７ ２）　Ｐｓｔｌ　（ヌクレオチド５３１３）断片を分離し、そして５ａｉｌ／Ｐ ｓｔｒ消化したプラスミドベクターと結合した。

同一の翻訳のリーディングフレームでアミノ酸７４２−１６４９を接合するＢド メインをエンコードする配列の大部分を除去するために、１６８塩基対を包含す る５　’　）ｌｉｎｄ１部位および３　’　Ｐｓｔ１部位をもつオリゴヌクレオ チドを合成した。オリゴヌクレオチドは、アミノ酸７４２および引き続（軽鎖の 活性化ペプチドの第１アミノ酸であるアミノ酸１６４９をエンコードするヌクレ オチド２４２７におけるＨｉｎｄｎＩ部位から、ヌクレオチド５３１３における Ｐｓｔ１部位へ延びる。プラスミドベクターｐｌＪｃ９を制限酵素旧ｎｄｎｌお よびＰｓｔｌで消化し、そして５′ホスフエートを仔つシ腸ホスファターゼを使 用して除去した。オリゴヌクレオチドを４つの別々の鎖として合成し、キナーゼ 処理し、アニーリングし、そしてプラスミドベクターの）Ｉｉｎｄｌ［［とＰｓ ｔｌとの間で結合した。

サブクローニングしたＨｉｎｄｌＩ［／Ｐｓｔｌオリゴヌクレオチドをプラスミ ドベクターρｔｌｃ８の中のＰｓｔｌ／Ｘｈｏｌ断片に対して並置した。このプ ラスミドを発生させるために、新しいポリリンカーをｐｕｃ９プラスミドの主鎖 の中に挿入し、この新しいポリリンカーは使用した制限酵素部位５　’　５ｓａ ｌ　−ＢａｓＨＩ　−Ｘｈｏｌ−Ｐｓｔ［−ＨｌｎｄＩ［［−Ａｓｐ７１８−Ｎ ｃｏｌ　−１（ｐａｌ　３　’をエンコードした。このプラスミドベクターを制 限酵素ＢａｍＨＩおよび旧ｎｄｍで消化し、そして５′ホスフエートを仔つシ腸 ホスファターゼで除去した。Ｐｓｔｌ／Ｘｈｏｌサブクローンの部分的Ｐｓｔ［ ／Ｂａｓ＋ＨＩ消化物を使用して３′末端の因子■断片を分離し、そしてサブク ローニングしたオリゴヌクレオチドのＰｖｕｒ／Ｈｉｎｄｌｌｒ消化物を使用し て重鎮および軽鎖の接合断片を分離した。それらをプラスミドベクターｐＵｃ８ の中のＢａｓＨＩ部位とＨｉｎｄｌｆｆ部位との間に結合した。

ヌクレオチド２４２７および７２０５の間に因子■配列を含有するこのサブクロ ーンをＡｓ−７１８およびＨｉｎｄｌ［［で消化し、そして５′ホスフエートを 仔つシ腸ホスファターゼを使用して除去した。制限酵素部位Ａｓｐ７１Ｂ　（ヌ クレオチド１９６１）と旧ｎａｍ（ヌクレオチド２４２７　）との間の因子■を エンコードする断片を分離し、そしてヌクレオチド１９６１からヌクレオチド７ ２０５における翻訳停止コドンまでの因子■を含有するサブクローン（ｐＦ８３ ’デルタ）を発生させた。

修飾された因子■を含有するレトロウィルスのベクターの構成を、レトロウィル スのベクターＭＦＧの制限部位ＮｃｏｌとＢａ■ＨＩ　との間に因子■遺伝子を 挿入することによって実施した。因子■のサブクローニングｐＦ８３’デルタを ５ｅａｌで消化し、そしてオリゴヌクレオチドのリンカ−を使用してＢｇ１１１ 部位に変換した。Ａｓｐ７１８／ＢｇｌｌＩ断片を３′因子■サブクローンから 分離し、そして翻訳開始のための＾ＴＧを含有する５′因子■断片をＮｃｏｌ　 （ヌクレオチド１５１）　／　Ａｓｐ７１８断片（ヌクレオチド１９６１）とし て分離した。レトロウィルスのベクターＭＦＧをＮｃｏ　ＩおよびＢａ＋ｇ旧で 消化し、そして５′ホスフエートを仔つシ腸ホスファターゼで除去した。因子■ 断片をレトロウィルスのベクターの中に結合して最終の因子■レトロウィルス構 成体を生成した、第６図参照。

Ｂｅｓｔｗｉｃｋら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 　８５：５４０５−５４０８　（１９８＆））により記載されているように、レ トロウィルスのベクターＭＦＧ　／因子■を等しい数のエコトロピンクパッケー ジング細胞Ｐｓｉ　ＣＲＥおよび両種性パッケージング細胞ＣＲＩＰの中にトラ ンスフェクションすることによって、レトロウィルスの粒子を生産する細胞系を 発生させた。パッケージング細胞の２つの宿主範囲の間で起こる重感染の程度を モニターするために、生物学的に活性な因子■の生産をカビ・ダイアグノスチ力 ・コーチスト・フォー・ファクター■（ＫａｂｉＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ　Ｃａ ｏａｔｅｓｔ　ｆｏｒ　Ｆａｃｔｏｒ■）（Ｈｅｌｅｎａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ　、テキサス州ビーウモント）で測定し、そしてウィルスのＲＮＡの生産 を１２ＮＡ　ドツトプロット分析によ／）／Ｓ定した。トランスフェクション後 ２１日に、トランスフェクションされたパンケージング細胞を両種性パッケージ ング細胞系Ｐｓｉ　ＣＲＩＰ−ｔ（ＩＳと同時培養した。ＣＲＩＰ　ＨＩＳパッ ケージング細胞系は従来記載されたＣＲＩＰパンケージング細胞系の変異型であ る。ＣＲＩＰ　）ＩＩｓパフケージング細胞系はＰｓｉ　ＣＲＩＰパッケージン グ細胞系と同一であるが、ただしレトロウィルスのエンベロープ遺伝子をｐｓＶ ２−Ｈ１ｓプラスミドＤＮＡ、すなわち、異なる優性の選択可能なマーカー遺伝 子で同時トランスフェクションすることによって細胞の中に導入した。形質導入 性粒子の均質性両種性レトロウィルスのストックの分離のために、パンケージン グ細胞系を１＝１の比で培養した。両種性パッケージング細胞系ＣＲＩＰ　Ｈｌ ｓの重感染は安定性細胞系１（１ｓ　１９の発生に導き、）ＩＩｓ　２９は修飾 された因子■遺伝子を効率よく形１に導入する組み換えレトロウィルスを生産す る。レトロウィルスを生産する細胞系の抗生物質の選抜は、高い力価の組み換え レトロウィルスを生産する細胞系の分離に要求されない。細胞系のゲノムのＩ） ＮＡをサザンブロノトハイプリダイゼーション分析により特性決定して、生産体 の細胞系の中に存在するレトロウィルスのベクターの組み込まれたコピーの数を 決定した。レトロウィルスを生産する細胞系の中のコピー数はほぼ０．５であり 、したがって平均するとＣＩ？ＩＰ−ｉ（１ｓパツケージング細胞の５０％は修 飾された因子■遺伝子をもつレトロウィルスのベクターのコピーを含有する。レ トロウィルスのベクターおよび修飾された因子■遺伝子はパッケージング細胞系 の中にＤＮＡの欠失または置換を含まなくて無傷である。

レトロウィルスのベクターのコピー数は、レトロウィルスを生産する細胞系の連 続的継代で一定に止まる。組み換えレトロウィルスの最高の力価を得るために、 Ｈｌｓ　１９を選択ヒスチジンマイナス培地の中で４回継代し、次いで完全ＤＭ ＥＭ培地の中で４回継代した。レトロウィルス粒子を発生させるために、ＨＩＳ 　１９を５Ｘ１０’〜１×１０ｂ細胞でｌ０ＣＩの細胞培養皿の中で接種した。

接種後４８時間に、はぼ７０％のコンフルエンシイであり、新鮮な培地（ＤＭＥ Ｍ＋１０％の仔ウシ血清）を形質導入のための組み換えレトロウィルス源として ２４時間後に集めるためにプレートに添加した。

修飾された因子■遺伝子を頚静脈から分離されたイヌ内皮細胞の中に形質導入し た。５％の血漿誘導血清（ウマ）、ｌＯＯμｇ／ｄのヘパリンおよび５０μｇ／ Ｉ１１の内皮細胞の成長因子を有する完全門１９９培地の中で、内皮細胞を３　 Ｘ　１０５Ｓｌ［ｌ胞／　ｌ０ＣＩの皿で４〜６時間の間接種した。次いで細胞 を５％の血漿誘導血清および１００μｇ／ｄの内皮細胞の成長因子を有するＭ１ ９９培地の中で、形質導入プロセスの効率に悪影響を及ぼすヘパリンの不存在下 に、−夜インキユヘーションした。細胞を新鮮な上澄み液＋ポリブレン（８μｇ ／ｄ）に２４時間暴露した。ウィルスの上澄み液を除去した後、細胞を５％の血 漿誘導血清、１００μｇ／ｒｄの内皮細胞の成長因子を有するｈ１９９培地の中 に入れて、はぼ７０〜８０％のコンフルエンスに増殖させた。その時、培地を５ ％の加熱不活性化した胎児ウシ血清（６６°Ｃに２時間加熱した）および５０μ ｇ／−のＥＣＧＦを有するＭ１９９に変えた。２４時間のインキュヘーション後 、培地を集め、そしてカビ・コーチストにより生物学的に活性な因子■について アッセイした。

このレトロウィルスを生産する細胞系では、内皮細胞の５０％〜７５％はメロ／ ドブロット分析により分析した。因子■遺伝子はこの頻度において組み換えレト ロウィルスへの単一の暴露で、かつ形質導入された細胞の抗生物質の選抜なしに 、形質導入することができる。

形質導入された内皮細胞は、組み換えレトロウィルスのゲノムの無傷のコピー、 および欠失または再記！をもたない修飾された因子■遺伝子を含有する。遺伝学 的に増強された内皮細胞からの生物学的に活性な因子■の生産速度は４００ｎｇ ／　５　ＸＩＯ”細胞／２４時間であった。

！ＥＪｌ［Ｌｕ　の１ｎｖｉｖｏ／　導入前の実施例に記載するようにつくった 組み換えレトロウィルスのｍａａストックを使用して、内皮細胞のｉｎ　ｖｉｙ （＋形質導入を証明する予備的データをわれわれは得た。このアプローチは従来 発表された観察（Ｒｅｉｄｙ　ＨＡ、　Ｓｃｈｗａｒｔｚ　ＳＭ、　Ｌａｂ　Ｉ ｎｖｅｓｔ　４４：３０１−３０８　（１９８１））に基づき、これによると、 動脈表面への定められた損傷は内皮細胞の小さいストリンブを除去し、そしてこ の露出された区域は欠陥のへりからの新しい内皮細胞の増殖および内部成長によ り７２時間以内に治癒する。細胞分割は組み換えレトロウィルスによる有効な形 質導入のための要件であり、そして針金を使用する内皮の損傷は内皮細胞の増殖 を誘発するだめの潜在的に多数の方法の１つである。われわれの方法は内皮細胞 の増殖を誘発し、次いで増殖する細胞を組み換えレトロウィルスのベクターを含 有する上澄み液に直接暴露する、定められた損傷のＲｅ１ｄｙの技術を使用する 。われわれの最初の実験は正常部位で内皮細胞を首尾よく形質導入し、こうして 新しい遺伝学的配列を首尾よく導入する組織培養技術の必要性を回避するこの方 法の能力を記載する。

この方法は２つの外科的手順を要求し、第１の手順は血管を損傷しくここで右の 腸骨の動脈について記載した）そして内皮細胞の増殖を誘発する。第２手順は血 管表面上で複製する細胞に組み換えレトロウィルスをデリバリ−すると同時に、 増殖する細胞がレトロウィルス粒子へ暴露される間に近位の動脈管系からの血液 の流れ防止する。実施を簡素化するために、この手順を腸骨の動脈について記載 する。

ｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子転移を証明するために、α−５ＧＣベクターに基づく改良 されたベクターを用いる１９８７年に発表された（Ｐｒｉｃｅ　Ｊ、　Ｔｙｒｎ ｅｒＤ、　Ｃｅｐｋｏ　Ｃ，１９８７Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　８４：１５６０１６０）マーカー遺伝子の概念をわれわれは使 用した（第２ｄ図および第４図）。

β−ガラクトシダーゼをエンコードする１ａｃＺ遺伝子をα−３ＧＣベクターの 中に挿入して、第８図に表されているα−５ＧＣ−ＬａｃＺを発生させた。この 組み換え構成体をｔ　Ｃｒ１ｐパツケージング細胞系の中にトランスフェクショ ンし、そして高い力価のα−３ＧＣ−ＬａｃＺ＆［ｌみ換えレトロウィルスを生 産するｔ　Ｃｒ１ｐ細胞のクローンを実施例■に記載するように分離した。α− ５ＧＣ−ＬａｃＺ＆Ｉみ換えレトロウィルスのストックをｉｎ　ｖｉｖｏ形賞導 入賞導入に使用した。

実験動物（ウサギ）を麻酔（ケタミン／キシラジ）し、両方の鼠径部をそりそし て準備し、そして動物を手術テーブル上に配置した。

両側の垂直の鼠径部の切開を通して、総、浅および温存の大腿動脈を露出させた 。右（損傷すべき側）において、総大腿動脈からの小さい分岐を結合して、分離 した動脈セグメントからの流出が内部の腸骨の動脈を通してのみ確実に起こるよ うにした。必要に応じて、鼠径靭帯を分割し、そして血管を腹膜後膣の中に入れ てすべての側の分岐の完全なコントロールを確実にする。右の浅大腿動脈（ＳＦ Ａ）を温存分枝よりほぼ１．５ｃｍ−ドにおいて３−０の絹で結合し、ＳＦＡの コントロールはＳＦＡ／ｉ在接合において得られ、そして横方向の動脈切開をつ くった。細い針金（２０ゲージのイントラカス（Ｉｎ　ｔｒａｃａ　ｔｈ）のス タイレットを使用した）を二重にして弾力性を与えて血管壁との接触をｉｎ寞に し、総大腿動脈および腸骨動脈を通過させて、Ｒｅ１ｄｙらが記載する定めた損 傷を生成した。針金を除去し、２０ゲージのアンギオカス（ａｎｇｉｏｃａｔｈ ）を動脈切開で挿入し、そして下に横たわる筋肉に固定して、次の外科的手順に おける直ちのアクセスを可能にした。切開を層状に閉じ、そして動物を回復させ た。

２４時間後、α−５ＧＣ−ＬＡＣ−Ｚベクターのｃｒｉｐ生産体から収穫しそし て８μｇ／ｄの最終濃度にポリブレンを補充した上澄み液を含有する組み換えウ ィルスをｉｎ　ｖｉｖｏの形質導入のために使用した。

動物を再び麻酔し、そして両方の切開を無菌の環境において再び開いた。前に露 出した右の腸骨血管を混乱させないで損傷を与えた区域の上の右の腸骨血管のコ ントロールを得るために、＃３フォガルティ（Ｆｏｇａｒｔｙ　”）バルーン塞 栓切除のカテーテルを左の浅大腿動脈の中の動脈切開を通して挿入し、大動脈分 岐に進行させ、そしてバルーンを膨張させて血流を遮る。右の温存大腿動脈を閉 塞する。組み換えウィルスを含有する上澄み液（１０ａｆ）を、右のＳＦＡの中 に前に配！したアンギオカスを通して手で注射して導入した。上澄み液は逆方向 に右の総大腿動脈から右の外部の腸骨動脈に流れ、そして右の内部の腸骨動脈の 中に入った。右の内部の腸骨動脈を去ることによって、上澄み液のだめの開いた 流出を可能とし、そして十分な１（ｌｄの上澄み液を設！できた。今日まで実施 された実験において、上澄み液を血管壁に４〜８分間暴露した。次いで左側およ び右側からのカテーテルを除去し、止血が得られ、そして切開を閉した。

１０〜１４日後、動物を殺す前に麻酔した。麻酔後かつ暴露前に、末端の血管の 直接の触診により評価した。腎臓下の大動脈および下の大静脈を外科的に露出し 、カニユーレ挿入し、そして下端の血管をヘパリン添加したリンゲル乳酸塩（２ Ｕ／Ｍｉ）で生理学的圧力（９０ｍＨｇ）でフランシュした。致死投与量のネン プタールを投与し、そして０．１Ｍのカコジレート中の０．５％のグルタルアル デヒドの中でその部位で動脈を１０分間潅流固定した。大動脈および両方の腸骨 動脈を連続的に切除し、そして１ｍＭのＭｇＣ＋□を含むリン酸塩緩衝液（ＰＢ Ｓ）の中ですすいだ。次いで血管をｘ−ｇａｌ基質の中で３７°Ｃにおいて１〜 １．５時間インキュベーションすることによって１ａｃＺ活性のための染色した 。この反応が完結したとき、ｘ−ｇａｌ溶液を洗浄除去し、そしてＰＢＳで置換 する。

２つの実験をこのプロトコルを使用して実施した。両者の実験において、細胞質 のパターンの選択的な強いブルーの染色により可視化したとき、動脈表面上の細 胞の中の１ａｃＺ遺伝子生産物のその部位の発現により示されるように、ｉｎ　 ｖｉｖｏの形質導入は１ｒ望であることが証明された。Ｒｅ１ｄｙらにより記載 された損傷のパターンおよび増殖と一致する強く染色されたブルーの線は、針金 で損傷し、α−５ＧＣ−ＬａｃＺ組み換えウィルスに暴露し、固定し、そして１ ａｃＺ活性について染色した、外部の腸骨動脈のセグメントの表面上に見いださ れる。

生物学的寄託 １９９１年１０月３日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ ｓｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）米国マリ イランド州ロックビレ（ＡＴＣＣ）に、ここに記載する因子■が挿入されたプラ スミドＭＦＧは受託された、ＡＴＣＣ受は入れ番号６８７２７を与えられ、ここ に記載する因子■が挿入されたプラスミドα−５ＧＣはＡＴＣＣ受は入れ番号６ ８７２８を与えられ、そしてここに記載するｔＰＡが挿入されたプラスミドα− ５ＧＣは＾ＴＣＣ受は入れ番号６８７２９を与えられた。１９９１年１０月９日 に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（＾ｍｅｒｉｃａｎＴｙｐ ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）米国マリイランド州ロックビレ（ ＡＴＣＣ）に、ここに記載するプラスミドＭＦＧは受託された、ＡＴＣＣ受は入 れ番号６８７５４を与えられ、ここに記載するプラスミドα−８ＧＣはＡＴＣＣ 受は入れ番号６８７５５を与えられた。これらの寄託は特許手続きの目的のため の微生物の寄託の国際的認識についてのブダペスト条約の規定および規則（ブダ ペスト条約）に従いなされた。これは受託口から３０年間の生存能力を有する培 養物の維持を保証する。これらの生物は、ブダペスト条約の規定に従い、そして 関係する米国特許の発行のとき制限されない入手可能性を保証する、出願人とＡ ＴＣＣとの合意に従い、ＡＴＣＣにより入手可能となるであろう、受託された株 の入手可能性は、政府の権力の下でその特許法に従い承認された権利に違反して 、実施のライセンスとして解釈すべきではない。

同等の実施態様 当業者は、ここに記載した発明の特定の実施Ｂ様と同等の多くの実施態様を認識 するか、あるいは日常の実験を越えない実験を使用して確証することができるで あろう。このような同等の実施！！様は次の請求の範囲により包含されることを 意図する。

ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、　５ 顕部　顕部　顕部　Ｉ癖　顕部　顕部 炭械　亥誂　亥桃　亥挑　亥桃　亥誂 ＦＩＧ、　６Ａ ＦＩＧ、　６Ｂ ＦＩＣ，６Ｃ ＦＩＧ、　８ ｇ■０♀口Ｑ３）−＜９ｕ（５♀〆一 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０２　 Ｃ８２１４−４８（Ｃ１２Ｎ　９／６４ Ｃ１２Ｒ１：９１） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ 、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、Ａ Ｔ、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ。

ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、ＭＣ，ＭＧ、ＭＷ、ＮＬ、 Ｎｏ、ＲＯ，ＳＤ、ＳＥ、５Ｕ（７２）発明者　ギルド、プレイトン　シー。

アメリカ合衆国、マサチューセッツ ０１７４２　、コンコード、リバーディル　ロード　１０９ ＦＩ （７２）発明者　ラフイールド、ロリ　エフ。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４１２３゜サン　フランシスコ、＃５．ビ ーチ　ストリート２２４９ （７２）発明者　コーエン、ローレンス　ケー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４６１１゜オークランド、キャボット　ド ライブ （７２）発明者　ロビンズ、ポール アメリカ合衆国、ペンシルバニア　１５２１６゜マウント　ゼバノン、オーバー ルック　ドライブ　５２７ （７２）発明者　ミュリガン、リチャード　シー。

アメリカ合衆国、マサチューセッツ ０２１３８　、ケンブリッジ、フランクリン　ストリート４４１

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．操作可能な組み合わせにおいて、問題のレトロウイルスから誘導された５′ ＬＴＲおよび３′ＬＴＲ、および問題の遺伝子のための挿入部位からなり、完全 なｇａｇ，ｅｎｖまたはｐｏ１遺伝子を含有しない、レトロウイルスのベクター 。
2. ２．前記ベクターは、さらに、ｇａｇの解読配列の一部分を含む、請求の範囲第 １項に記載のレトロウイルスのベクター。
3. ３．前記ｇａｇの解読配列は、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプ ター部位からなり、前記スプライスアクセプター部位は前記問題の遺伝子から上 流に位置する、請求の範囲第２項に記載のレトロウイルスのベクター。
4. ４．前記ベクターは、さらに、ｇａｇの転写プロモーターを含み、前記ｇａｇの 転写プロモーターは前記挿入部位の中に挿入されたヌクレオチド配列の転写体が 生成されるように機能的に位置し、前記転写体はｇａｇの５′未翻訳領域からな る、請求の範囲第３項に記載のレトロウイルスのベクター。
5. ５．前記ベクターは選択可能なマーカーを含有しない、請求の範囲第４項に記載 のレトロウイルスのベクター。
6. ６．前記ベクターはＡＴＣＣ６８，７５４の同定特性を有するＭＦＧである、請 求の範囲第５項に記載のレトロウイルスのベクター。
7. ７．前記ベクターは、さらに、前記挿入部位の中に挿入された発現のための遺伝 子を含む、請求の範囲第１項に記載のレトロウイルスのベクター。
8. ８．前記発現のための遺伝子は、ホルモン、酵素、レセプターおよび薬物から成 る群から選択される、請求の範囲第７項に記載のレトロウイルスのベクター。
9. ９．前記発現のための遺伝子は因子ＶＩＩまたはｔＰＡである、請求の範囲第８ 項に記載のレトロウイルスのベクター。
10. １０．前記ベクターは、さらに、アルファ　グロビンの転写プロモーターを含む 、請求の範囲第１項に記載のレトロウイルスのベクター。
11. １１．前記ベクターは、さらに、前記アルファーグロビンの転写プロモーターに 自然に接合したａ−グロビン遺伝子の５′来翻訳領域の一部分を含む、請求の範 囲第１０項に記載のレトロウイルスのベクター。
12. １２．前記ベクターは、エンハンサー配列を含み、前記エンハンサーは前記５′ または３′ＬＴＲの中に存在しない、請求の範囲第１１項に記載のレトロウイル スのベクター。
13. １３．エンハンサー配列は前記転写プロモーターから上流に位置する、請求の範 囲第１２項に記載のレトロウイルスのベクター。
14. １４．前記エンハンサー配列はサイトメガロウイルスのエンハンサー配列である 、請求の範囲第１３項に記載のレトロウイルスのベクター。
15. １５．前記ベクターはａ−ＳＧＣでありそしてＡＴＣＣＮｏ．６８７５５の同定 幽 特性を有する、請求の範囲第１４項記載のレトロウイルスのベクター。
16. １６．前記３′ＬＴＲは機能的エンハンサー配列を含有しない、請求の範囲第１ ０項に記載のレトロウイルスのベクター。
17. １７．前記ベクターは、さらに、前記挿入部位の中に挿入された発現のための遺 伝子を含む、請求の範囲第１０項に記載のレトロウイルスのベクター。
18. １８．前記発現のための遺伝子は、ホルモン、酵素、レセプターおよび薬物から 成る群より選択される、請求の範囲第１０項に記載のレトロウイルスのベクター 。
19. １９．前記発現のための遺伝子は因子ＶＩＩまたはｔＰＡである、請求の範囲第 １８項に記載のレトロウイルスのベクター。
20. ２０．請求の範囲第１及び１１に記載のレトロウイルスのベクターで形質転換さ れたパッケージング細胞系。