IT201900007060A1 - Cellule tumorali ingegnerizzate e loro usi - Google Patents

Description

Cellule tumorali ingegnerizzate e loro usi

SETTORE TECNICO

La presente invenzione riguarda un metodo per ottenere un linfocita T citotossico specifico per il tumore, una cellula tumorale umana ingegnerizzata che esprime CD80 e CD86, linfocita T citotossico specifici per il tumore ottenuto, relativi usi e relative composizioni.

STATO DELL’ARTE

L'instabilità genetica è una caratteristica distintiva delle cellule tumorali [1]. Può generare significative mutazioni nucleotidiche, inserzioni/delezioni (indel) e/o salti di lettura. Sia le mutazioni “driver” che “passenger” generano nuovi epitopi nel contesto dei cosiddetti neo-antigeni. Normalmente, essi sono presi di mira dalla risposta immunitaria adattativa, ma i difetti nella risposta immunitaria contro i neo-antigeni possono portare all'emergere di cellula tumorale [2, 3]. Le strategie più avanzate di immunoterapia anticancro hanno cercato di indurre risposte immunitarie specificamente dirette contro i neo-antigeni attraverso la generazione dei cosiddetti vaccini personalizzati [4, 5]. Ott e coll. hanno fornito prova che i vaccini a base di peptidi contro neo-antigeni tumorali provocano una risposta immunitaria cellulare ben rilevabile specifica per il melanoma. Sahin e coll. hanno dimostrato una forte risposta immunitaria anti-melanoma dopo la vaccinazione con mRNA sintetico, neo-antigene-specifico veicolati nelle cellule dendritiche. Questi protocolli vaccinali richiedono il sequenziamento comparativo di esomi di cellule normali e tumorali per identificare sia mutazioni puntiformi significative che indel. Attraverso algoritmi ad hoc, le mutazioni che più probabilmente sono associate con l'HLA dei pazienti sono evidenziate. Su questa base, sia i peptidi che le molecole di RNA sintetico che includono i neo-epitopi sono progettati, sintetizzati e veicolati ai pazienti insieme ad adiuvanti. I risultati di studi clinici pilota sono apparsi promettenti ma queste strategie presentano ostacoli pratici, economici e tecnici anche nella prospettiva di un'ampia applicazione clinica. Tra le limitazioni tecniche, si dovrebbe considerare che i dati della sequenza si riferiscono a una singola piccola biopsia. Quindi, non sarebbero rappresentativi dell'ampio spettro di mutazioni generate in tutte le cellule tumorali emergenti. Inoltre, il sequenziamento dell'esoma non può prendere in considerazione la formazione continua di neo-epitopi a causa di modificazione epigenetica, traslazionale e/o post-traduzionale potenzialmente presente in cellule tumorali. Inoltre, per ovvi motivi tecnici e di costo, solo una parte delle mutazioni può essere inclusa nei preparati del vaccino. Il superamento di queste limitazioni potrebbe rappresentare un significativo passo avanti verso strategie più efficienti, affidabili ed economicamente vantaggiose di vaccini anti-tumorali personalizzati.

Per indurre l'attivazione di linfociti T naïve, è richiesta l'espressione di molecole costimolatorie sulla membrana plasmatica delle cellule tumorali. Questo concetto è già stato alla base della generazione delle cosiddette artificiali (a)APCs [6]. Sono state descritte in precedenza aAPC sia basate su linee cellulari [7] che completamente artificiali. Tra le prime, le cellule umane K562 rappresentano il sistema più studiato. Queste cellule non esprimono né MHC né molecole stimolatorie/inibitorie [8]. La loro ingegnerizzazione con molecole MHC di classe I appropriate e costimolatorie è stata determinante per attivare/espandere i linfociti T specifici per antigeni HLA-compatibili [9]. Per esempio, è stato descritto che un clone di K562 ingegnerizzato per l'espressione di HLA-A.02, CD80 e CD83 ha espanso con successo linfociti T CD8<+ >specifici per Mart-1 da pazienti affetti da melanoma. Questo clone di cellule ha anche attivato cellule T naïve da donatori sani in presenza del relativo peptide. Tuttavia, la principale preoccupazione per l'uso di questa piattaforma cellulare nella clinica riguarda la natura maligna delle cellule K562. D'altra parte, sono state descritte aAPC basate su nanoparticelle sintetiche accoppiate sia con molecole stimolatorie sia co-stimolatorie [10-12]. Esse sono state utilizzate con successo per l'espansione dei linfociti T ex vivo nei protocolli di trasferimento di cellule T adottive.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

L'instabilità genetica intrinseca delle cellule tumorali porta alla produzione continua di proteine mutate denominate neo-antigeni specifici del tumore. Generalmente, essi sono riconosciuti dal sistema immunitario ospite come prodotti-non-self. Tuttavia, un'efficace risposta adattativa che elimini le cellule che esprimono un neo-antigene viene persa nelle malattie tumorali. Le strategie terapeutiche più avanzate mirano a indurre un'attivazione immunitaria specifica contro un neoantigene attraverso approcci personalizzati. Queste includono il sequenziamento dell'esoma delle cellule tumorali, la tipizzazione HLA, la sintesi e l'iniezione di peptidi/RNA con adiuvanti. Qui, gli inventori propongono un metodo innovativo per indurre una risposta immunitaria dei linfociti citotossici (CTL) CD8<+ >T contro i neo-antigeni tumorali aggirando i passaggi necessari nelle attuali strategie terapeutiche di vaccinazione personalizzata. Nella presente invenzione viene proposta una strategia volta a ottimizzare la risposta immunitaria antitumorale MHC di classe I ristretta. Gli inventori hanno presupposto che la rappresentazione più affidabile, completa e aggiornata degli epitopi dei neo-antigeni tumorali può essere offerta dalle stesse cellule tumorali.

Le cellule tumorali possono essere la fabbrica più efficiente e precisa dei peptidi derivati da neoantigeni tumorali associati ad MHC di classe I. Quindi, dotare le cellule tumorali di funzioni di presentazione dell'antigene professionali attiverebbe i linfociti T CD8<+ >verso una risposta contro antigeni tumorali non-self. Questo sarebbe un modo efficace per indurre una risposta immunitaria adattiva contro neo-antigeni tumorali guidata da MHC di classe I.

Per esplorare questa possibilità, cellule umane sia di adenocarcinoma che di melanoma sono state ingegnerizzate per esprimere entrambe le molecole co-stimolatorie CD80 e CD86. Linfociti HLA-compatibili sono stati quindi attivati attraverso la co-coltivazione con le cellule tumorali ingegnerizzate. La generazione di linfociti T CD8<+ >specifici per il tumore è stata testata attraverso l'analisi combinata dei marcatori di attivazione cellulare, la formazione di sinapsi immunologiche, la generazione di linfociti T CD8<+ >antigene-specifici e l'attività citotossica. I dati attuali indicano in modo coerente che le cellule tumorali dotate di funzioni di presentazione professionale dell'antigene possono generare una risposta immunitaria CTL specifica per il tumore. Questo risultato potrebbe aprire strade verso lo sviluppo di immunoterapie anti-tumorali innovative.

Qui gli inventori forniscono evidenza che l'ingegnerizzazione delle cellule tumorali umane con le molecole co-stimolatorie CD80 e CD86 è sufficiente per indurre l'attivazione delle cellule T CD8<+ >e generare linfociti T citotossici (CTL) che uccidono cellule tumorali omologhe. Questi risultati rappresentano una prova di principio probabilmente utile per sviluppare nuove immunoterapie contro il cancro.

Nella presente invenzione si mostra che l'attivazione di linfociti da donatore sano con cellule tumorali ingegnerizzate con CD80/CD86 con HLA-compatibile induce:

- Attivazione cellulare di sottopopolazioni di linfociti T CD4+ e CD8+, come indicato dalla induzione del recettore CD25 (IL-2R);

- Rilascio di granuli citotossici a seguito del riconoscimento di cellule bersaglio tumorali HLA-compatibili, come dimostrato dall'aumento del marcatore di degranulazione CD107a;

- Formazione di sinapsi immunologiche stabili tra linfociti T CD8+ e cellule bersaglio tumorali HLA-compatibili, con scambio di materiale della membrana plasmatica attraverso un fenomeno denominato trogocitosi;

- Generazione di linfociti T CD8+ inducibili specifici per l’antigene tumorale, come dimostrato dall'identificazione di linfociti T-CD8+ specifici per Mart-1 dopo l'attivazione con cellule tumorali ingegnerizzate che esprimono Mart-1 e

- Produzione di linfociti T CD8+ specifici per il tumore con una forte attività citotossica (linfociti T citotossici, CTL) specificamente diretti contro le cellule che sviluppano il tumore. Le cellule tumorali ingegnerizzate con CD80/CD86 inducono l'attivazione cellulare delle sottopopolazioni di linfociti T CD4+ e CD8+. Queste inducono il rilascio di granuli citotossici dopo il riconoscimento di cellule bersaglio tumorali HLA-compatibili e la formazione di sinapsi immunologiche stabili tra linfociti T CD8+ e cellule bersaglio tumorali HLA-compatibili, con scambio di materiale della membrana plasmatica attraverso un fenomeno denominato trogocitosi. Le cellule tumorali ingegnerizzate con CD80/CD86 generano linfociti T CD8+ inducibili specifici per l’antigene tumorale e inducono la produzione di linfociti T CD8+ specifici per il tumore con una forte attività citotossica (linfociti T citotossici, CTL) specificatamente diretti contro le cellule che sviluppano il tumore.

Pertanto, l'invenzione fornisce un metodo per ottenere un linfocita T citotossico specifico per il tumore comprendente contattare una cellula tumorale umana ingegnerizzata che esprime CD80 o una variante o una variante funzionale di esso e CD86 o una variante o una variante funzionale di esso con un linfocita T.

Preferibilmente, il linfocita T citotossico specifico per il tumore è un linfocita T CD8+, un linfocita T CD4+ o un linfocita CD8-/CD25+ che esprime fortemente CD107a.

Per "esprime fortemente", si intende un’espressione aumentata di CD107a di almeno 2 volte, 3 volte, 4 volte, 5 volte, 6 volte e fino a 10 volte rispetto all'espressione di linfociti T non stimolati (naturali). In una forma di attuazione preferita il linfocita T citotossico specifico per il tumore riconosce specificamente un antigene associato al tumore e/o riconosce e uccide specificamente cellule tumorali e/o induce una risposta immunitaria antitumorale ristretta all’MHC di classe I.

In una forma di attuazione preferita CD80 e CD86 sono espressi sulla membrana plasmatica della cellula tumorale umana.

In via preferenziale, la cellula tumorale umana che esprime CD80 e CD86 è ingegnerizzata da almeno un vettore, preferibilmente almeno un vettore retrovirale.

"Ingegnerizzato" significa che la cellula è stata geneticamente manipolata o modificata.

In una forma di attuazione preferita la cellula tumorale umana è una cellula di un tumore solido o ematopoietico. Preferibilmente la cellula tumorale umana non è una cellula del sarcoma di Kaposi. Preferibilmente il metodo dell'invenzione viene eseguito in assenza di fattori solubili esogeni. L'invenzione fornisce anche un linfocita T citotossico specifico per il tumore ottenibile dal metodo come sopra definito.

Preferibilmente il linfocita T citotossico specifico per il tumore ottenibile dal metodo è per uso medico, preferibilmente per uso nel trattamento e/o prevenzione del cancro, preferibilmente per uso in un metodo per indurre una risposta immunitaria di un linfocita T CD8+ citotossico contro almeno un antigene tumorale “non-self”.

L'invenzione fornisce anche un metodo per indurre una risposta immunitaria di un linfocita T CD8+ contro almeno un antigene tumorale “non-self” comprendente contattare una cellula tumorale umana ingegnerizzata che esprime CD80 e CD86 con un linfocita T, preferibilmente l’antigene tumorale “non-self“ è un neo-antigene.

L'invenzione fornisce anche un metodo per il trattamento e/o la prevenzione del cancro comprendente generare un linfocita T citotossico specifico per il tumore dal metodo dell'invenzione o indurre una risposta immunitaria di un linfocita T CD8+ citotossico contro almeno un antigene “non-self” tumorale dal metodo dell'invenzione.

L'invenzione fornisce anche una cellula tumorale umana ingegnerizzata che esprime CD80 e CD86, preferibilmente per uso medico, preferibilmente per l'uso nel trattamento e/o nella prevenzione del cancro.

Preferibilmente il linfocita T citotossico specifico per il tumore dell'invenzione o la cellula tumorale umana ingegnerizzata dell'invenzione sono per l’uso in combinazione con un ulteriore intervento terapeutico, preferibilmente l'ulteriore intervento terapeutico è radioterapia, chemioterapia o un agente terapeutico.

La chemioterapia può essere qualsiasi chemioterapia nota utilizzata nell’arte per esempio come descritto in https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/drugs e commentato in https://juniperpublishers.com/oajt/pdf/OAJT.MS.ID.555600.pdf (incorporato per riferimento).

L'agente terapeutico è un agente comunemente usato in combinazione con il trattamento del cancro come un agente anti-infiammatorio o anti-emetico. L'agente terapeutico è noto nell’arte.

Nella presente invenzione l'espressione di CD80 e CD86 può essere misurata con qualsiasi metodo noto, anche come qui descritto.

L'invenzione fornisce anche una composizione farmaceutica comprendente il linfocita T citotossico specifico per il tumore come definito sopra o la cellula tumorale umana ingegnerizzata che esprime CD80 e CD86 come definito sopra e eccipienti farmaceuticamente accettabili, preferibilmente la composizione farmaceutica comprende inoltre un agente terapeutico.

Preferibilmente la composizione farmaceutica è per l'uso nel trattamento e/o nella prevenzione del cancro.

Nella presente invenzione, la terapia può essere eseguita derivando le cellule tumorali da un soggetto, introducendo CD80 e CD86 ivi in vitro e somministrando dette cellule tumorali umane ingegnerizzate nello stesso o in un altro soggetto HLA-compatibile.

La presente invenzione si riferisce all'uso di una cellula tumorale umana ingegnerizzata che esprime CD80 e CD86 per indurre o modulare una risposta immunitaria nei confronti di un tumore o antigene tumorale, e a sua volta per applicazioni profilattiche e terapeutiche antitumorali/anticancro.

Se non diversamente definiti, i termini scientifici e tecnologici e la nomenclatura qui utilizzati hanno lo stesso significato di quello comunemente inteso da una persona di abilità ordinaria a cui appartiene questa invenzione. In generale, le procedure per le colture cellulari, la trasfezione, i metodi di biologia molecolare e simili, la purificazione degli anticorpi e simili, sono metodi comuni utilizzati nell’arte. Tali tecniche standard possono essere trovate in manuali di riferimento come ad esempio Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories), Ausubel et al. (1994, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York), Campbell 1984, in "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science Publisher, Amsterdam, The Netherlands), in Harlow et al. 1988 (in: Antibody-A Laboratory Manual, CSH Laboratories), Klein 1982 (in: Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, Wiley & Sons, N.Y.), in Immunology Today 10:254 (1989), e in Kanoff, M. E. 1991: Immunological studies in humans. In Current protocols in Immunology, Vol. 1. Wiley & Sons, New York, p. 7.1.

Al fine di fornire una comprensione chiara e coerente dei termini utilizzati nella presente descrizione, qui di seguito viene fornita una serie di definizioni.

Come qui usato, il termine "attivazione" o "stimolazione" nel contesto di una cellula immunitaria, si riferisce a qualsiasi modifica indotta nello stato basale o di riposo di una cellula immunitaria, ad esempio una cellula T. Esempi non limitanti di tali modifiche includono qualsiasi aumento in almeno uno dei seguenti: proliferazione cellulare, divisione cellulare, produzione di citochine (ad es., IFN-�, TNF-�, IL-2), risposta potenziata ad un antigene o su MHC, sintesi del DNA, linfochina, attività citotossica, aumento intracellulare del calcio, espressione dei recettori aumentata (ad es., recettore IL-2).

Il termine "immunopotenziamento" come usato qui si riferisce a una maggiore capacità del sistema immunitario di rispondere ad un antigene. Il termine "citochine" come usato qui si riferisce a un gruppo eterogeneo di proteine solubili che vengono rilasciate da un tipo di cellula per mediare un effetto biologico in un secondo tipo di cellula. Gli effetti biologici sono vari e comprendono proliferazione cellulare, differenziazione, crescita. Esempi non limitanti di citochine includono interleuchine (ad es., IL-12), interferoni (ad es., IFN-[alfa], [beta] e gamma), fattore di necrosi tumorale (ad esempio, TNF-[alfa], [beta] e simili). L'effetto biologico di una citochina è generalmente mediato dal suo legame al suo recettore. La citochina è spesso indicata come un "ligando" di un recettore. Il termine "ligando" è ben noto nel campo dell'immunologia e altri ligandi includono, ad esempio, anticorpi che legano un recettore. Per certezza, il termine "ligando" come usato qui viene utilizzato nel suo senso ampio per riferirsi a una molecola che può legarsi specificamente ad un’altra.

I termini “antigene” o “determinante antigenico” o (“frammento antigenico”) sono molto ben noti nell’arte. La forza di un antigene è spesso indicata come antigenicità o immunogenicità e si riferisce alla proprietà (che è spesso quantificabile) nel suscitare o indurre una risposta immunitaria.

Le sequenze nucleotidiche e aminoacidiche di CD80 umano sono ben note e descritte in Freeman et al. (1989) J. Immunol.143 (8): 2714-2722, Selvakumar et al. (1992) lmmunogenetics 36 (3): Freeman et al. J. Exp. Med.174 (3): Lanier et al. (1989) J. Immunol. 154:97-105 e GenBank codice d’accesso P33681. CD86 (B7.2) è stato descritto per la prima volta in Azuma, M. et al. 1993. Le informazioni della sequenza sono disponibili nel database GenBank come U04343.

CD80 umano è espresso come proteina di 288 aminoacidi (1-288) che viene processata in una proteina matura (35-288). CD80 è diviso in quattro regioni: la regione variabile (V), la regione costante (C), la regione transmembrana (tm) e la regione della coda citoplasmatica (ct). Gli amminoacidi 35-242 formano il dominio extracellulare della proteina. Gli amminoacidi 43-123 formano la regione V, denominata anche “dominio di tipo V simil immunoglobulina”. Gli amminoacidi 155-223 formano la regione C, denominata anche “dominio di tipo C2 simil immunoglobulina”. Gli amminoacidi 243-263 formano la regione transmembrana. Gli amminoacidi 264-288 formano la coda citoplasmatica. In un ulteriore aspetto, la presente invenzione si riferisce a una composizione (ad es. una composizione farmaceutica o vaccinale o immunogenica) comprendente il suddetto linfocita T citotossico specifico per il tumore o cellula tumorale umana ingegnerizzata che esprime CD80 e CD86 come molecola stimolante o variante di esso e un vettore o eccipiente farmaceuticamente accettabile. La presente invenzione si riferisce anche a un vettore comprendente una sequenza di acido nucleico che codifica per CD80 e CD86 secondo la presente invenzione.

Nel contesto dell'invenzione ci sono anche polipeptidi e acidi nucleici che sono omologhi o sostanzialmente identici a, in base alla sequenza, a un polipeptide o acido nucleico dell'invenzione (ad es. una molecola co-stimolatoria chimerica o antigene) e mantengono la funzione rilevante. “Omologia” e “omologo” si riferiscono alla somiglianza di sequenza tra due peptidi o due molecole di acido nucleico. L'omologia può essere determinata confrontando ogni posizione nelle sequenze allineate. Un grado di omologia tra acido nucleico o tra sequenze di aminoacido è una funzione del numero di nucleotidi identici o corrispondenti o aminoacidi in posizioni condivise dalle sequenze. Come il termine è qui usato, una sequenza di acido nucleico è "omologa" ad un'altra sequenza se le due sequenze sono sostanzialmente identiche e l'attività funzionale delle sequenze è conservata (come qui usato, il termine 'omologo' non inferisce una relazione evolutiva). Due sequenze di acido nucleico sono considerate sostanzialmente identiche se, quando allineate in modo ottimale (con gap consentiti), condividono almeno circa il 50% di somiglianza o identità nella sequenza, o se le sequenze condividono motivi funzionali definiti. In forme di realizzazione alternative, la somiglianza di sequenza in sequenze sostanzialmente identiche allineate in modo ottimale può essere di almeno 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%. Come qui usato, una determinata percentuale di omologia tra sequenze denota il grado di identità della sequenza in sequenze allineate in modo ottimale. Una sequenza "non correlata" o "non omologa" condivide meno del 40% di identità, anche se preferibilmente meno di circa il 25% di identità, con una sequenza di acido nucleico della presente invenzione.

Gli acidi nucleici sostanzialmente complementari sono acidi nucleici in cui il complemento di una molecola è sostanzialmente identico all'altra molecola. Due sequenze di acido nucleico o proteina sono considerate "sostanzialmente identiche" se, quando allineate in modo ottimale, condividono almeno circa 70% di identità nella sequenza. In forme di realizzazione alternative, l'identità di sequenza può ad esempio essere almeno 75%, almeno 80%, almeno 85%, almeno 90%, o almeno 95%. L'allineamento ottimale delle sequenze per i confronti di identità può essere effettuato utilizzando una varietà di algoritmi, come l'algoritmo di omologia locale di Smith e Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2. 482, l'algoritmo di allineamento di omologia di Needleman e Wunsch, 1970, J. MoI. Biol. 48:443, il metodo della ricerca di somiglianza di Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, e le implementazioni computerizzate di questi algoritmi (come GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, Wl, U.S.A.). L'identità della sequenza può essere determinata anche utilizzando l'algoritmo BLAST, descritto in Altschul et al., 1990, J. MoI. Biol. 215:403-10 (utilizzando le impostazioni predefinite pubblicate). Un software per l'esecuzione di analisi BLAST può essere disponibile attraverso il National Center for Biotechnology Information (attraverso Internet http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). L'algoritmo BLAST prevede innanzitutto l'identificazione di coppie di sequenze di punteggio elevato (HSPs) identificando brevi parole di lunghezza W nella sequenza “query” che corrispondono o soddisfano un punteggio di soglia T dal valore positivo quando allineati con una parola della stessa lunghezza in una sequenza del database. T è indicato come soglia del punteggio di parola di confronto. Le “hit” iniziali delle parole di confronto fungono da iniziatori per avviare ricerche per trovare HSPs più lunghi. Le “hit” di parole vengono estese in entrambe le direzioni lungo ogni sequenza fino a che il punteggio cumulativo di allineamento può essere aumentato. L'estensione delle “hit” di parole in ogni direzione viene interrotta quando vengono soddisfatti i seguenti parametri: il punteggio cumulativo di allineamento si reduce della quantità X del suo valore massimo raggiunto; il punteggio cumulativo va a zero o al di sotto, a causa dell'accumulo di uno o più allineamenti di residui con punteggio negativo; o la fine di una delle sequenze viene raggiunta. I parametri dell'algoritmo BLAST W, T e X determinano la sensibilità e la velocità dell'allineamento. Il programma BLAST può utilizzare come predefinita una lunghezza di parola (W) di 11, la matrice di punteggio BLOSUM62 (Henikoff e Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Aci. USA 89:10915-10919) allineamenti (B) di 50, aspettativa (E) di 10 (o 1 o 0,1 o 0,01 o 0,001 o 0,0001), M = 5, N = 4, e un confronto di entrambi i filamenti. Una misura della somiglianza statistica tra due sequenze utilizzando l'algoritmo BLAST è la più piccola probabilità di somma (P(N)), che fornisce un'indicazione della probabilità con cui una corrispondenza tra due sequenze di nucleotidi o di aminoacidi si verificherebbe per caso. In forme di realizzazione alternative dell’invenzione, le sequenze di nucleotidi o aminoacidi sono considerate sostanzialmente identiche se la più piccola probabilità di somma in un confronto delle sequenze di prova è inferiore a circa 1, preferibilmente inferiore a circa 0,1, più preferibilmente inferiore a circa 0,01, e il più preferibile inferiore a circa 0,001.

Un'indicazione alternativa che due sequenze di acido nucleico sono sostanzialmente complementari è che le due sequenze si ibridano tra loro in condizioni moderatamente stringenti, o preferibilmente stringenti. L'ibridazione a sequenze immobilizzate su filtro in condizioni moderatamente stringenti può, ad esempio, essere eseguita in 0,5 M NaHPO4, 7% di sodio dodecil solfato (SDS), 1 mM EDTA a 65°C e lavaggio in 0,2 x SSC/0,1% SDS a 42°C (vedere Ausubel, et al. (eds), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., e John Wiley & Sons, Inc., New York, a p. 2.10.3). In alternativa, l'ibridazione a sequenze immobilizzate su filtro in condizioni stringenti può, ad esempio, essere eseguita in 0,5 M NaHPO4, 7% SDS, 1 mM EDTA a 65<0>C e lavaggio in 0,1 x SSC/0,1% SDS a 68 °C (vedere Ausubel, et al. (eds), 1989, supra). Le condizioni di ibridazione possono essere modificate secondo metodi noti a seconda della sequenza di interesse (vedere Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York). Generalmente, le condizioni stringenti sono selezionate per essere circa 5 [grad.]C inferiori al punto di fusione termico per la sequenza specifica a forza ionica e pH definiti.

Il termine "vettore" è comunemente noto nell’arte e definisce ad es., un DNA plasmide, DNA fagico, DNA virale e simili, che può servire come un veicolo in cui l'acido nucleico della presente invenzione può essere clonato. Esistono numerosi tipi di vettori e sono ben noti nell’arte. In una forma di realizzazione particolare, il vettore è un vettore virale che può introdurre una molecola, ad es. una molecola co-stimolatoria chimerica, in una cellula o in un organismo vivente. In una forma di realizzazione il vettore virale è un vettore retrovirale, un vettore lentivirale, un vettore adenovirale o un vettore adeno-associato (AAV).

Vari geni e sequenze di acido nucleico dell'invenzione possono essere sequenze ricombinanti. Il termine "ricombinante" significa che qualcosa è stato ricombinato, in modo che quando fatto in riferimento ad un costrutto di acido nucleico il termine si riferisce a una molecola che è comprensiva di sequenze di acido nucleico che sono unite insieme o prodotte per mezzo di tecniche di biologia molecolare. Il termine "ricombinante" quando fatto in riferimento a una proteina o un polipeptide si riferisce a una molecola di proteina o polipeptide che si esprime utilizzando un costrutto di acido nucleico ricombinante creato per mezzo di tecniche di biologia molecolare. Il termine "ricombinante" quando fatto in riferimento alla composizione genetica si riferisce a un gamete o progenie o cellula o genoma con nuove combinazioni di alleli che non si sono verificati nei genomi genitoriali. I costrutti di acido nucleico ricombinante possono includere una sequenza nucleotidica che è legata a, o è manipolata per diventare legata a, una sequenza di acido nucleico a cui non è legata in natura, o a cui è legata in una posizione diversa in natura. Il riferimento ad un costrutto di acido nucleico come "ricombinante" indica quindi che la molecola di acido nucleico è stata manipolata usando l'ingegneria genetica, cioè attraverso l’intervento umano. I costrutti di acido nucleico ricombinante possono ad esempio essere introdotti in una cellula ospite per trasformazione. Tali costrutti di acido nucleico ricombinante possono includere sequenze derivate dalla stessa specie di cellula ospite o da diverse specie di cellula ospite, che sono state isolate e reintrodotte in cellule della specie ospite. Le sequenze dell'acido nucleico ricombinante del costrutto possono diventare integrate in un genoma della cellula ospite, sia come risultato della trasformazione originale delle cellule ospiti, sia come risultato di successivi eventi di ricombinazione e/o riparazione.

Il termine "espressione" definisce il processo mediante il quale un gene viene trascritto in mRNA (trascrizione), l'mRNA viene quindi tradotto (traduzione) in un polipeptide (o proteina) o più.

La terminologia "vettore di espressione" definisce un vettore o veicolo come descritto sopra ma progettato per consentire l'espressione di una sequenza inserita dopo la trasformazione o trasfezione in un ospite. Il gene clonato (sequenza inserita) è solitamente posto sotto il controllo di un elemento di controllo o sequenze regolatorie trascrizionali come le sequenze del promotore. Il posizionamento di un gene clonato sotto tali sequenze di controllo è spesso indicato come operativamente collegato a elementi o sequenze di controllo.

Una prima sequenza di acido nucleico è “operativamente collegata” con una seconda sequenza di acido nucleico quando la prima sequenza di acido nucleico viene posizionata in un rapporto funzionale con la seconda sequenza di acido nucleico. Ad esempio, un promotore è operativamente collegato a una sequenza codificante se il promotore influisce sulla trascrizione o espressione delle sequenze codificanti. In generale, le sequenze di DNA operativamente collegate sono contigue e, se necessario per unire due regioni codificanti proteine, nella stessa sequenza di lettura. Tuttavia, poiché per esempio gli “enhancer” generalmente funzionano quando sono separati dai promotori da diversi chilobasi e le sequenze introniche possono essere di lunghezze variabili, alcuni elementi polinucleotidici possono essere operativamente collegati, ma non contigui. "Elemento trascrizionale regolatorio" è un termine generico che si riferisce a sequenze di DNA, come segnali di inizio e di terminazione, “enhancer“, e promotori, segnali di “splicing“, segnali di poliadenilazione che inducono o controllano la trascrizione di sequenze codificanti la proteina con cui sono operativamente collegati.

Le sequenze operativamente collegate possono includere anche due segmenti trascritti sullo stesso trascritto di RNA. Così, due sequenze, come un promotore e una sequenza reporter, sono operativamente collegate se la trascrizione che inizia nel promotore produrrà un trascritto di RNA della sequenza reporter. Per essere "operativamente collegate" non è necessario che due sequenze siano immediatamente adiacenti l'una all'altra.

Le sequenze di controllo dell’espressione variano a seconda che il vettore sia progettato per esprimere il gene operativamente collegato in un ospite procariotico o eucariotico o entrambi (vettori “shuttle“) e può inoltre contenere elementi trascrizionali come elementi “enhancer“, sequenze di terminazione, elementi di specificità tissutale e/o siti di inizio e terminazione della traslazione.

Le espressioni procariotiche sono utili per la preparazione di grandi quantità della proteina codificata dalla sequenza di DNA di interesse. Questa proteina può essere purificata secondo protocolli standard che sfruttano le proprietà intrinseche della stessa, come la dimensione e la carica (ad es. elettroforesi su gel SDS, filtrazione su gel, centrifugazione, cromatografia a scambio ionico, ecc.). Inoltre, la proteina di interesse può essere purificata attraverso la cromatografia di affinità utilizzando anticorpi policlonali o monoclonali o un ligando specifico. La proteina purificata può essere utilizzata per applicazioni terapeutiche. Le proteine eucariotiche espresse procarioticamente spesso non sono glicosilate.

Il costrutto DNA (o RNA) può essere un vettore che comprende un promotore che è operativamente collegato a una sequenza di oligonucleotidi della presente invenzione, che è a sua volta, operativamente collegata a un gene eterologo, come il gene per la molecola “reporter“ di luciferasi. "Promotore" si riferisce a una regione regolatoria del DNA in grado di legare direttamente o indirettamente l'RNA polimerasi in una cellula e di iniziare la trascrizione di una sequenza codificante a valle (in direzione 3'). Ai fini della presente invenzione, il promotore è preferibilmente legato alla sua estremità 3' dal sito di inizio della trascrizione e si estende a monte (in direzione 5') per includere il numero minimo di basi o elementi necessari per avviare la trascrizione a livelli rilevabili superiori ai livelli di fondo. All'interno del promotore si trova un sito di iniziazione della trascrizione (convenientemente definito mediante mappatura con la nucleasi S1), così come domini di legame proteico (sequenze di consenso) responsabili del legame dell'RNA polimerasi. I promotori eucarioti spesso, ma non sempre, contengono "TATA " box e "CCAT" box. I promotori procarioti contengono sequenze di consenso a -10 e -35, che servono ad avviare la trascrizione e i prodotti di trascrizione contengono sequenze Shine-Dalgarno, che fungono da sequenze di legame al ribosoma durante l'inizio alla traduzione. Esempi non limitanti di vettori che possono essere utilizzati in conformità con la presente invenzione includono vettori adenovirali, vettori poxvirali, vettori derivati da VSV e vettori retrovirali. Tali vettori e altri sono ben noti nell’arte. Come usato qui, la designazione "derivato funzionale" o "variante funzionale" denota, nel contesto di un derivato funzionale di una sequenza se una sequenza di acido nucleico o aminoacido, una molecola che conserva un'attività biologica (sia funzione o strutturale) che è sostanzialmente simile a quella della sequenza originale. Questo derivato funzionale o equivalente può essere un derivato naturale o può essere preparato sinteticamente. Tali derivati includono sequenze di aminoacidi aventi sostituzioni, eliminazioni o aggiunte di uno o più aminoacidi, a condizione che l'attività biologica della proteina sia conservata. Lo stesso vale per i derivati di sequenze di acido nucleico che possono avere sostituzioni, eliminazioni o aggiunte di uno o più nucleotidi, a condizione che l'attività biologica della sequenza sia generalmente mantenuta. Quando si tratta di una sequenza proteica, l'aminoacido sostitutivo ha generalmente proprietà chimico-fisiche che sono simili a quella dell'aminoacido sostituito. Le proprietà chimico-fisiche simili includono, somiglianze in carica, ingombro, idrofobicità, idrofilicità e simili. Il termine "derivati funzionali" è inteso per includere "frammenti", "segmenti", "varianti", "analoghi" o "derivati chimici" dell'oggetto della presente invenzione. In una forma di realizzazione, il suddetto derivato, variante o frammento è un “derivato antigenico, variante o frammento" (ad es., che ha la capacità di indurre/suscitare una risposta immunitaria contro l'antigene parentale).

Così, il termine "variante" si riferisce qui a una proteina o molecola di acido nucleico che è sostanzialmente simile nella struttura e attività biologica alla proteina o acido nucleico della presente invenzione, ma non è limitato a una variante che conserva tutte le attività biologiche della proteina parentale, ad esempio.

I derivati funzionali della presente invenzione possono essere sintetizzati chimicamente o prodotti attraverso la tecnologia del DNA ricombinante. Tutti questi metodi sono ben noti nell’arte.

Come qui usato, "derivati chimici" è inteso per coprire ulteriori gruppi chimici non normalmente parte dell'oggetto dell'invenzione. Tali gruppi potrebbero influenzare la caratteristica fisico-chimica del derivato (ad es. solubilità, assorbimento, emivita, diminuzione di tossicità e simili). Tali gruppi sono esemplificati in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). I metodi di accoppiamento di questi gruppi chimico-fisichi a un polipeptide o a una sequenza di acido nucleico sono ben noti nell’arte. Come qui usato, il termine "purificato" si riferisce a una molecola che è stata separata da una componente cellulare. Così, per esempio, una "proteina purificata" è stata purificata a un livello non trovato in natura. Un composto è "sostanzialmente puro" quando è separato dai componenti che lo accompagnano naturalmente. Tipicamente, un composto è sostanzialmente puro quando è almeno 60%, più generalmente 75% o sopra il 90%, in peso, del materiale totale in un campione. Così, per esempio, un polipeptide che è sintetizzato chimicamente o prodotto dalla tecnologia ricombinante sarà generalmente sostanzialmente privo dei suoi componenti naturalmente associati. Una molecola di acido nucleico è sostanzialmente pura quando non è immediatamente contigua con (cioè, covalentemente legata a) le sequenze codificanti con cui è normalmente contigua nel genoma presente in natura dell'organismo da cui il DNA dell'invenzione è derivato. Un composto sostanzialmente puro può essere ottenuto, ad esempio, mediante estrazione da una fonte naturale; per espressione di una molecola di acido nucleico ricombinante codificante un composto polipeptide; o da sintesi chimica. La purezza può essere misurata utilizzando qualsiasi metodo appropriato come cromatografia a colonna, gel elettroforesi, HPLC, ecc. Come qui usato, i termini "molecola", "composto", o "agente" sono utilizzati in modo intercambiabile e generalmente si riferiscono a molecole o composti naturali, sintetici o semi-sintetici. Il termine "molecola" quindi denota per esempio sostanze chimiche, macromolecole, estratti di cellule o di tessuto (da piante o animali) e simili. Esempi non limitanti di molecole includono molecole di acido nucleico, peptidi, anticorpi, carboidrati e agenti farmaceutici. Gli agenti possono essere selezionati e individuati con una varietà di mezzi inclusi screening casuale, selezione razionale e progettazione razionale utilizzando per esempio metodi di modellazione di proteine o ligandi come la modellazione a computer. I termini "selezionato razionalmente" o "progettato razionalmente" sono intesi per definire composti che sono stati scelti in base alla configurazione per esempio di domini interagenti della presente invenzione (4-1 BB e 4-1 BBL per esempio). Come comprenderà una persona con ordinaria abilità, macromolecole con modifiche non presenti naturalmente sono anche nell'ambito del termine "molecola". Per esempio, peptidomimetici, ben noti nell'industria farmaceutica e generalmente indicati come analoghi peptici possono essere generati dalla modellazione come accennato in precedenza. Similmente, in una forma di realizzazione preferita, i polipeptidi della presente invenzione vengono modificati per migliorarne la stabilità. Va inteso che nella maggior parte dei casi questa modifica non dovrebbe alterare l'attività biologica del dominio di interazione. Le molecole identificate in accordo con gli insegnamenti della presente invenzione hanno un valore terapeutico in malattie o condizioni in cui la fisiologia o l'omeostasi della cellula e/o del tessuto è compromessa da un difetto nell'attivazione delle cellule T. Come definito sopra, il termine "ligando" comprende anche molecole come peptidi, anticorpi e carboidrati.

Per sicurezza, le sequenze e i polipeptidi utili per mettere in pratica l'invenzione includono senza essere limitati a questi mutanti, omologi, sottotipi, alleli e simili. Sarà chiaro alla persona di ordinaria competenza che se un dominio di interazione della presente invenzione, variante, derivato, o frammento di esso conserva la sua funzione in legame con il suo partner può essere prontamente determinato utilizzando gli insegnamenti e i saggi della presente invenzione e gli insegnamenti generali dell’arte.

Inoltre nel contesto della presente invenzione c’è la somministrazione in vivo di un acido nucleico dell'invenzione ad un soggetto, come i metodi di terapia genica.

Gli acidi nucleici possono essere veicolati a cellule in vivo utilizzando metodi come l'iniezione diretta di DNA, l'assorbimento del DNA mediato dal recettore, la trasfezione mediata da virus o la trasfezione non virale e la trasfezione basata sui lipidi, tutti questi possono comportare l'uso di vettori di terapia genica. L'iniezione diretta è stata utilizzata per introdurre il DNA nudo nelle cellule in vivo (vedere ad es., Acsadi et al. (1991) Nature 332:815-818; (1990) Science 247:1465-1468). Può essere utilizzato un apparecchio di veicolazione (ad es., un "gene gun") per iniettare DNA in cellule in vivo. Tale apparecchio può essere disponibile commercialmente (ad es., da BioRad). Il DNA nudo può anche essere introdotto in cellule complessando il DNA a un catione, come la polilisina, che è accoppiato ad un ligando per un recettore della superficie cellulare (vedere ad esempio Wu, G. e Wu, C. H. (1988) J. Biol. Chem. 263:14621; Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; e U.S. Pat. N. 5.166.320). Il legame del complesso DNA-ligando al recettore può facilitare l'assorbimento del DNA mediante endocitosi mediata dal recettore. Un complesso di DNA-ligando legato ai capsidi di adenovirus che distruggono gli endosomi, rilasciando così materiale nel citoplasma, può essere utilizzato per evitare la degradazione del complesso dai lisosomi intracellulari (vedere ad esempio Curiel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850; Cristiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2122-2126). I retrovirus difettivi sono ben caratterizzati per l'uso come vettori di terapia genica (per una recensione vedere Miller, A. D. (1990) Blood 76:271). I protocolli per produrre retrovirus ricombinanti e per infettare cellule in vitro o in vivo con tali virus possono essere trovati in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14 e in altri manuali di laboratorio standard. Esempi di retrovirus idonei includono pLJ, pZIP, pWE e pEM che sono ben noti a coloro esperti nella materia. Esempi di linee impacchettatrici di virus adatte includono .psi.Crip, .psi.Cre, .psi.2 e .psi.Am. I retrovirus sono stati utilizzati per introdurre una varietà di geni in molti tipi di cellule differenti, incluse cellule epiteliali, cellule endoteliali, linfociti, mioblasti, epatociti, cellule del midollo osseo, in vitro e/o in vivo (vedere per esempio Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991 ) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; U.S. Pat. No.

4,868,116; U.S. Pat. No.4,980,286; PCT Application WO 89/07136; PCT Application WO 89/02468; Domanda PCT WO 89/05345; e Domanda PCT WO 92/07573).

Il virus adeno-associato (AAV) può essere utilizzato come vettore di terapia genica per la veicolazione di DNA per scopi di terapia genica. AAV è un virus difettivo presente in natura che richiede un altro virus, come un adenovirus o un virus dell'herpes, come un virus helper per la replicazione efficiente e un ciclo di vita produttivo (Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro, and Immunol. (1992) 158:97-129). AAV può essere utilizzato per integrare il DNA in cellule che non si dividono (vedere ad esempio Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. MoI. Biol.7:349-356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; e McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62:1963-1973). Un vettore AAV come quello descritto in Tratschin et al. (1985) MoI. Cell. Biol. 5:3251-3260 può essere usato per introdurre il DNA nelle cellule (vedere ad esempio Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al. (1985) MoI. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al. (1988) MoI. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51:611-619; e Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790). I vettori lentivirali di terapia genica possono anche essere adattati per l'uso nell'invenzione.

Dalla descrizione e rivendicazioni allegate, il termine agente terapeutico deve essere preso in senso ampio in modo da includere anche una combinazione di almeno due tali agenti terapeutici. Inoltre, i segmenti di DNA o proteine secondo la presente invenzione possono essere introdotti in individui in numerosi modi. Come qui esemplificato, le cellule T periferiche possono essere isolate da un individuo afflitto o a rischio di soffrire di una malattia o di una condizione, trasfettate con un costrutto di DNA secondo l'invenzione e reintrodotte all'individuo afflitto in numerosi modi, inclusa l'iniezione endovenosa. In alternativa, il costrutto di DNA può essere somministrato direttamente all'individuo afflitto, ad esempio per iniezione nel timo. Il costrutto di DNA può anche essere veicolato attraverso un veicolo come un liposoma, che può essere progettato per essere indirizzato a un tipo di cellula specifico, e ingegnerizzato per essere somministrato attraverso diverse vie. Naturalmente, proteine o peptidi possono anche essere somministrati. Una persona di abilità ordinaria può adattare il metodo di trasfezione, tipo di cellule trasfettate, tipo di malattia o condizione, co-stimolo (generale o specifico), ecc per soddisfare particolari esigenze.

Le composizioni nell'ambito della presente invenzione dovrebbero contenere l'agente attivo (ad es. proteina di fusione, peptide, acido nucleico e molecola, o antigene, o anticorpo, o APC) in una quantità efficace per ottenere l’attivazione della cellula T profilattica e/o terapeutica desiderata al contempo evitando effetti collaterali avversi. Tipicamente, gli acidi nucleici in accordo alla presente invenzione possono essere somministrati a mammiferi (ad es. gli umani) in dosi che vanno da 0,005 a 1 mg per kg di peso corporeo al giorno del mammifero che viene trattato. Preparazioni farmaceuticamente accettabili e sali dell'agente attivo sono nell'ambito della presente invenzione e sono ben noti nell’arte (Remington's Pharmaceutical Science, XVI ed., Mack ed.). L'invenzione fornisce quindi inoltre una composizione comprendente un agente attivo e un vettore farmaceuticamente accettabile. Per la somministrazione di polipeptidi, antagonisti, agonisti e simili, la quantità somministrata deve essere scelta in modo da evitare effetti collaterali avversi. Il dosaggio sarà adattato dal medico in accordo con fattori convenzionali come l'entità della malattia e diversi parametri del paziente. Tipicamente, 0,001 a 50 mg/kg/die saranno somministrati al mammifero. In accordo con una forma di realizzazione della presente invenzione, e come qui esemplificato, le cellule T possono essere rimosse da un paziente (ad es. un paziente oncologico o paziente affetto da un virus [o suscettibile di essere infettato da un virus]), attivando queste cellule T in accordo con la presente invenzione e risomministrando queste cellule T attivate al paziente. Naturalmente, i passaggi noti per l'ulteriore coltivazione o proliferazione di queste cellule T potrebbero essere effettuati prima di testare la funzione di una cellula T attivata o di reiniettare la stessa in un paziente. Ad esempio, le citochine o altri mitogeni o molecole potrebbero essere aggiunte al mezzo di coltura.

Come qui usato, le composizioni dell'invenzione sono somministrate essenzialmente per via intatumorale o in colture di cellule tumorali ex vivo, può essere attraverso vie convenzionali conosciute nel campo, in come a una superficie della mucosa (ad es., oculare, intranasale, polmonare, orale, gastrica, intestinale, rettale, vaginale o delle vie urinarie), per una via parenterale (ad es., via sottocutanea, intradermica, intramuscolare, endovenosa o intraperitoneale), o somministrazione topica (ad es. tramite un cerotto). La scelta della via di somministrazione dipende da una serie di parametri, come l'adiuvante associato al polipeptide. Se si utilizza un adiuvante mucosale, la via intranasale o orale è preferita. Se viene utilizzata una formulazione lipidica o un composto di alluminio, la via parenterale è preferita con la via sottocutanea o intramuscolare essendo maggiormente preferite. Per l'uso in una composizione dell'invenzione, un polipeptide o derivato di esso possono essere formulati in o con liposomi, preferibilmente liposomi neutri o anionici, microsfere, ISCOMS o particelle virus-simili (VLP) per facilitare la veicolazione e/o migliorare la risposta immunitaria. Questi composti sono prontamente disponibili ad un esperto nell’arte; per esempio, vedere Liposomes: A Practical Approach, RCP New Ed, IRL press (1990).

Adiuvanti diversi dai liposomi e simili sono anche utilizzati e sono conosciuti nell’arte.

Un polinucleotide dell'invenzione può anche essere utile come terapia. Ci sono due vie principali, utilizzare un ospite virale o batterico come veicolo (vettore) di veicolazione genica o somministrare il gene in una forma libera, ad es. inserita in un plasmide. L'efficacia terapeutica o profilattica di un polinucleotide dell'invenzione viene valutata come descritto di seguito.

Di conseguenza, un ulteriore aspetto dell'invenzione fornisce (i) un vettore come un adenovirus, contenente una molecola di acido nucleico dell'invenzione, posto sotto il controllo di elementi necessari per l'espressione; (ii) una composizione di materia comprendente un vettore dell'invenzione, unitamente a un diluente o vettore; in particolare (iii) una composizione farmaceutica contenente una quantità terapeuticamente e/o profilatticamente efficace di un vettore dell'invenzione; (iv) una cellula (ad es. una cellula tumorale umana) trasfettata o trasformata con l'acido nucleico o vettore della presente invenzione; (v) un metodo per indurre una risposta immunitaria contro un tumore in un mammifero (ad es., un umano; in alternativa, il metodo può essere utilizzato in applicazioni veterinarie per il trattamento o la prevenzione della crescita tumorale o del cancro in animali nonumani), che comporta la somministrazione al mammifero di una quantità efficace di un vettore dell'invenzione per suscitare una risposta immunitaria protettiva o terapeutica contro un tumore; e in particolare, (v) un metodo per prevenire e/o trattare il cancro, che comporta la somministrazione di una quantità profilattica o terapeutica di un vettore dell'invenzione a un individuo che ha, o a rischio di sviluppare, il cancro. Inoltre, l'invenzione fornisce anche un uso di un vettore dell'invenzione nella preparazione di un medicamento per prevenire e/o trattare il cancro.

Come qui usato, un vettore esprime uno o più polipeptidi CD80 e CD86 o derivati dell'invenzione. L'invenzione fornisce inoltre una composizione comprendente diversi polipeptidi o derivati di essi dell’invenzione o vettori (ciascuno dei quali in grado di esprimere un polipeptide o un suo derivato dell'invenzione).

Il trattamento può essere effettuato in una singola dose o ripetuto ad intervalli. Il dosaggio appropriato dipende da vari parametri compresi da abili artigiani come la via di somministrazione o la condizione del mammifero da trattare (peso, età e simili). I vettori disponibili nell’arte includono vettori virali come adenovirus e poxvirus, nonché vettori batterici, ad es. Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, Bacillo di Calmette-Guerin (BCG) e Streptococcus.

Un esempio di un vettore adenovirus, così come un metodo per costruire un vettore di adenovirus in grado di esprimere una molecola di acido nucleico dell'invenzione, sono descritti nel brevetto U.S. No. 4,920,209. I vettori di poxvirus includono poxvirus vaccinico e canarino, descritti rispettivamente nel brevetto U.S. No.4,722,848 e nel brevetto U.S. No.5,364,773 (vedi anche, ad es., Tartaglia et al., Virology (1992) 188:217) per una descrizione di un vettore di virus vaccinico e Taylor et al., Vaccine (1995) 13:539 per una descrizione di un vettore del vaiolo canarino). I vettori di poxvirus in grado di esprimere un polinucleotide dell'invenzione sono ottenuti mediante ricombinazione omologa come descritto in Kieny et al., Nature (1984) 312:163 in modo che il polinucleotide dell'invenzione sia inserito nel genoma virale in appropriate condizioni di espressione in cellule mammifere. In generale, la dose di vettore virale, per uso terapeutico o profilattico, può essere da circa 1x10<4 >a circa 1x10<11>, vantaggiosamente da circa 1x10<7 >a circa 1x10<10>, preferibilmente di da circa 1x10<7 >a circa 1x10<9 >unità formanti placca per chilogrammo. Preferibilmente, i vettori virali vengono somministrati per via parenterale; ad esempio, in 3 dosi, a 4 settimane di distanza. È preferibile evitare di aggiungere un adiuvante chimico ad una composizione contenente un vettore virale dell'invenzione e così minimizzare la risposta immunitaria al vettore virale stesso.

La composizione comprendente un polipeptide o un vettore per vaccino o un linfocita T citotossico specifico per il tumore, o una cellula tumorale umana ingegnerizzata che esprime CD80 e CD86 o una variante o variante funzionale di essi della presente invenzione può contenere ulteriormente un adiuvante. Un numero di adiuvanti sono noti a coloro esperti nell’arte. Esempi di adiuvanti sono descritti di seguito. Di conseguenza, un ulteriore aspetto dell'invenzione fornisce (i) una composizione comprendente un polipeptide o acido nucleico o un linfocita T citotossico specifico per il tumore, o una cellula tumorale umana ingegnerizzata che esprime CD80 e CD86 o una variante o variante funzionale di essi dell'invenzione, unitamente a un diluente o a un vettore; (ii) una composizione farmaceutica comprendente una quantità terapeuticamente o profilatticamente efficace di un polipeptide o polinucleotide dell'invenzione; (iii) un metodo per indurre una risposta immunitaria contro un tumore in un mammifero mediante la somministrazione di una quantità immunogenicamente efficace di un polipeptide o polinucleotide o linfocita T citotossico specifico per il tumore, o una cellula tumorale umana ingegnerizzata che esprime CD80 e CD86 o una variante o variante funzionale di essi dell'invenzione per suscitare una risposta immunitaria protettiva contro un tumore; e in particolare, (iv) un metodo per prevenire e/o trattare un cancro, somministrando una quantità profilattica o terapeutica di un polipeptide o polinucleotide dell'invenzione a un individuo che ha, o a rischio di sviluppare, il cancro. Inoltre, l'invenzione fornisce anche un uso di un polipeptide o polinucleotide o linfocita T citotossico specifico per il tumore, o una cellula tumorale umana ingegnerizzata che esprime CD80 e CD86 o una variante o variante funzionale di essi dell'invenzione nella preparazione di un medicamento per prevenire e/o trattare il cancro. L'uso degli acidi nucleici dell'invenzione include la loro somministrazione a un mammifero come vaccino o agente immunogenico, per scopi terapeutici o profilattici. Tali acidi nucleici sono utilizzati sotto forma di DNA come parte di un plasmide che è incapace di replicare in una cellula di mammiferi e incapace di integrarsi nel genoma dei mammiferi. Tipicamente, tale molecola di DNA è posta sotto il controllo di un promotore adatto per l'espressione in una cellula di mammifero. Il promotore funziona sia in modo ubiquitario che in modo tessuto-specifico. Esempi di promotori non-tessuto specifici includono il promotore precoce di Citomegalovirus (CMV) (descritto nel brevetto U.S. No. 4,168,062) e il promotore del Virus del Sarcoma di Rous (descritto in Norton & Coffin, MoI. Cell Biol. (1985) 5:281). Un esempio di promotore tessuto-specifico è il promotore della desmina che guida l'espressione nelle cellule muscolari (Li et al., Gene (1989) 78:243, Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1991) 266:6562 and Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1993) 268:10403). L'uso di promotori è ben noto a coloro esperti nell’arte. I vettori utili sono descritti in numerose pubblicazioni, in particolare WO 94/21797 e Hartikka et al., Human Gene Therapy (1996) 7:1205. I polinucleotidi dell’invenzione che vengono utilizzati come vaccini codificano un precursore o una forma matura del polipeptide corrispondente. Nella forma di precursore, il “signal peptide” è o omologo o eterologo. In quest'ultimo caso, è preferita una sequenza leader eucariotica come la sequenza leader del fattore del plasminogeno di tipo di tessuto (tPA). Le tecniche standard di biologia molecolare per la preparazione e la purificazione dei polinucleotidi sono utilizzate nella preparazione di terapie polinucleotide dell'invenzione. Per l'uso come vaccino, un polinucleotide dell'invenzione è formulato secondo vari metodi descritti di seguito. Un metodo utilizza il polinucleotide in forma nuda, privo di qualsiasi mezzo di veicolazione. Un tale polinucleotide è semplicemente diluito in una soluzione fisiologicamente accettabile come salina sterile o salina sterile tamponata, con o senza un vettore. Quando è presente, il vettore è preferibilmente isotonico, ipotonico o debolmente ipertonico ed ha una forza ionica relativamente bassa, come quella fornita da una soluzione di saccarosio, ad es. una soluzione contenente il 20% di saccarosio.

Un metodo alternativo utilizza il polinucleotide in associazione con agenti che assistono nell'assorbimento cellulare. Esempi di tali agenti sono (i) sostanze chimiche che modificano la permeabilità cellulare, come la bupivacaina (vedere, ad es., WO 94/16737), (ii) liposomi per l'incapsulamento del polinucleotide, o (iii) lipidi cationici o microparticelle di silice, oro o tungsteno che si associano esse stesse con i polinucleotidi.

I liposomi anionici e neutri sono ben noti nell’arte (vedere, ad es., Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press (1990), per una descrizione dettagliata dei metodi per la produzione di liposomi) e sono utili per veicolare una vasta gamma di prodotti, inclusi polinucleotidi.

I lipidi cationici sono noti anche nell’arte e sono comunemente usati per la veicolazione di geni. Tali lipidi includono Lipofectina(TM) nota anche come DOTMA (N-[1-(2, 3-dioleilossi) propil]-N, N, N-trimetilammonio cloruro), DOTAP (1,2-bis (oleilossi)-3-(Trimetilammonio) propano), DDAB (dimetildioctadecilammonio bromuro), DOGS (dioctadecilamidologlicil Spermina) e derivati del colesterolo come DC-Choi (3 beta-(N-(N', N'-dimetil-aminometano)-carbamoil) colesterolo). Una descrizione di questi lipidi cationici può essere trovata in EP 187,702, WO 90/11092, brevetto U.S.

No. 5,283,185, WO 91/15501, WO 95/26356, e brevetto U.S. No. 5,527,928. I lipidi cationici per la veicolazione genica sono preferibilmente usati in associazione con un lipide neutro come DOPE (dioleil fosfatidiletanolamina), come descritto in WO 90/11092 come esempio.

Le formulazioni contenenti liposomi cationici possono opzionalmente contenere altri composti che facilitano la trasfezione. Un numero di essi sono descritti in WO 93/18759, WO 93/19768, WO 94/25608 e WO 95/02397. Includono derivati della spermina utili per facilitare il trasporto del DNA attraverso la membrana nucleare (vedere, ad esempio, WO 93/18759) e composti permeabilizzanti la membrana come GALA, Gramicidina S e sali biliari cationici (vedere, ad esempio, WO 93/19768). Le microparticelle d'oro o di tungsteno vengono utilizzate per la veicolazione genica, come descritto in WO 91/00359, WO 93/17706 e Tang et al. Nature (1992) 356:152. Il polinucleotide rivestito con microparticelle viene iniettato attraverso vie intradermiche o intraepidermiche utilizzando un dispositivo di iniezione senza ago ("gene gun"), come quelli descritti nel brevetto U.S. No.4,945,050, nel brevetto U.S. No. 5,015,580, e WO 94/24263.

La quantità di DNA da utilizzare in un recipiente del vaccino dipende, ad es., dalla forza del promotore utilizzato nel costrutto di DNA, dall'immunogenicità del prodotto genico espresso, dalla condizione del mammifero destinato alla somministrazione (ad es., il peso, l'età e salute generale del mammifero), la modalità di somministrazione e il tipo di formulazione. In generale, una dose terapeuticamente o profilatticamente efficace da circa 1 μg a circa 1 mg, preferibilmente, da circa 10 μg a circa 800 [mu]g e, più preferibilmente, da circa 25 μg a circa 250 μg, può essere somministrato agli adulti umani. La somministrazione può essere ottenuta in una singola dose o ripetuta ad intervalli. Anche se non è assolutamente necessario, tale composizione può anche contenere un adiuvante. In tal caso, è preferibile un adiuvante sistemico che non richieda la somministrazione concomitante al fine di esibire un effetto adiuvante, ad es. QS21, che è descritto nel brevetto U.S. No. 5,057,546. Il trattamento è ottenuto in una singola dose o ripetuto come necessario ad intervalli, come può essere determinato facilmente da un esperto nell’arte. Ad esempio, una dose attivante è seguita da tre dosi di richiamo a intervalli settimanali o mensili. Una dose appropriata dipende da vari parametri, inclusi il ricevente (ad es., adulto o neonato), il particolare antigene vaccinale, la via e la frequenza di somministrazione, la presenza/assenza o il tipo di adiuvante e l'effetto desiderato (ad es., protezione e/o trattamento), come può essere determinato da un esperto nell’arte. In una forma di realizzazione, un polipeptide dell'invenzione, somministrato come vaccino, viene somministrato attraverso una via mucosale in una quantità da circa 10 μg a circa 500 mg, preferibilmente da circa 1 mg a circa 200 mg. Per la via parenterale di somministrazione, la dose di solito non supera circa 1 mg, preferibilmente circa 100 μg - Quando usati come agenti vaccinali, i polipeptidi e i polinucleotidi dell'invenzione possono essere usati in sequenza come parte di un processo di immunizzazione a più stadi. Ad esempio, un mammifero è inizialmente attivato con un vettore vaccinale dell'invenzione come un adenovirus, ad es. attraverso la parenterale, e poi richiamato due volte con il polipeptide codificato dal vettore vaccinale, ad es. attraverso la via mucosale. In un altro esempio, i liposomi associati a un polipeptide o a un derivato dell'invenzione sono utilizzati anche per l’attivazione, con il richiamo essendo effettuato mediante la via mucosale utilizzando un polipeptide solubile o un derivato dell'invenzione in combinazione con un adiuvante mucosale (ad es. LT). Esempi di adiuvanti utili in qualsiasi delle composizioni vaccinali/immunogeniche sopra descritte sono i seguenti.

Gli adiuvanti per la somministrazione parenterale includono composti di alluminio, come idrossido di alluminio, fosfato di alluminio e idrossifosfato di alluminio. L'antigene viene precipitato con, o adsorbito su, il composto di alluminio secondo i protocolli standard. Altri adiuvanti, come il RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT), sono utilizzati nella somministrazione parenterale.

Gli adiuvanti per la somministrazione mucosale comprendono le tossine batteriche, ad es. la tossina del colera (CT), la tossina termolabile di E. coli (LT), la tossina A di Clostridium difficile e la tossina della pertosse (PT), o combinazioni, subunità, tossoidi o mutanti delle stesse, come una preparazione purificata della subunità B (CTB) della tossina nativa del colera. Sono adatti anche frammenti, omologi, derivati e fusioni a qualsiasi di queste tossine, purché conservino l'attività adiuvante. Preferibilmente, viene utilizzato un mutante con tossicità ridotta. I mutanti idonei sono descritti, ad es., in WO 95/17211 (mutante CT Arg-7-Lys), WO 96/06627 (mutante LT Arg-192-Gly), e WO 95/34323 (mutante PT Arg-9-Lys e Glu-129-Gly). Ulteriori mutanti LT che vengono utilizzati nei metodi e nelle composizioni dell'invenzione includono, ad esempio i mutant Ser-63-Lys, Ala-69Gly, Glu-110-ASP e Glu-112-Asp. Altri adiuvanti, come un monofosforil lipide A (MPLA) batterico di, ad es., E. coli, Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium, o Shigella flexneri; saponine, o microsfere di glicolide polilactido (PLGA), è utilizzato anche per la somministrazione attraverso la mucosa.

Gli adiuvanti utili sia per le somministrazioni mucosali che parenterali includono il polifosfazene (WO 95/02415), il DC-Chol (3 b’N’N'.N'-dimetilamminometano)-carbamoil) colesterolo; Brevetto U.S. No. 5,283,185 e WO 96/14831) e QS-21 (WO 88/09336).

Qualsiasi composizione farmaceutica dell'invenzione contenente un polipeptide, un derivato del polipeptide o un polinucleotide o una cellula citotossica specifica per il tumore o umana tumorale ingegnerizzata che esprime CD80 e CD86 dell'invenzione, è prodotta in un modo convenzionale. In particolare, è formulato con un diluente o vettore farmaceuticamente accettabile, ad es. acqua o una soluzione salina come tampone fosfato salino. In generale, un diluente o un vettore viene selezionato sulla base di modalità e via di somministrazione, e pratica farmaceutica standard. Come usato qui "vettore farmaceuticamente accettabile " o "eccipiente" include qualsiasi e tutti i solventi, mezzi di dispersione, i rivestimenti, agenti antibatterici e antimicotici, agenti isotonici e ritardanti l’assorbimento, e simili che sono fisiologicamente compatibili. In una forma di realizzazione, il vettore è adatto per la somministrazione parenterale. In alternativa, il vettore può essere adatto per la somministrazione endovenosa, intraperitoneale, intramuscolare, sublinguale o orale. I vettori farmaceuticamente accettabili includono soluzioni acquose sterili o dispersioni e polveri sterili per la preparazione estemporanea di soluzioni o dispersioni iniettabili sterili. L'uso di tali mezzi e agenti per le sostanze farmaceuticamente attive è ben noto nell’arte. Vettori o diluenti farmaceutici idonei, così come le necessità farmaceutiche per il loro uso in formulazioni farmaceutiche, sono descritti in Remington's Pharmaceutical Sciences, un testo di riferimento standard in questo campo e in USP/NF. Tranne nella misura in cui qualsiasi mezzo o agente convenzionale è incompatibile con il composto attivo, l'uso di esso nelle composizioni farmaceutiche dell'invenzione è contemplato. Composti attivi supplementari possono anche essere incorporati nelle composizioni. La composizione per il trattamento del cancro della presente invenzione può essere utilizzata in combinazione con farmaci chemioterapici esistenti o essere fatta come miscela con loro. Tale farmaco chemioterapico include, ad esempio, agenti alchilanti, nitrosouree, antimetaboliti, antibiotici antitumorali, alcaloidi derivati dalle piante, inibitori della topoisomerasi, medicinali per la terapia ormonale, antagonisti ormonali, inibitori dell'aromatasi, inibitori della P-glicoproteina, derivati complessi di platino, altri farmaci immunoterapeutici e altri agenti antitumorali. Inoltre, possono essere utilizzati insieme con medicinali per la ipo-leucositosi (neutrofila) che sono adiuvanti per il trattamento del cancro, medicinali per la trombopenia, farmaci antiemetici, e medicinali per il dolore del cancro per il recupero QDV del paziente o essere fatti come una miscela con loro. La composizione della presente invenzione e del(gli) altro(i) agente(i) (ad es. un agente chemioterapico) può essere somministrata in concomitanza o in sequenza.

La composizione per il trattamento del cancro della presente invenzione può essere utilizzata insieme a sostanza(e) immunopotenziativa(e) o essere fatta come miscela con loro. Tali sostanze immunopotenziative includono, ad esempio, varie citochine e un antigene tumorale, ecc. Citochine che stimolano le reazioni immunitarie includono, ad esempio, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, interferone-[beta] e gamma, IL-1, IL-2, IL-3, e IL-12, anticorpi anti-CD3 possono anche migliorare le reazioni immunitarie. La composizione della presente invenzione e sostanza(e) immunopotenziativa(e) (ad es. una citochina o una chemochina) può essere somministrata in concomitanza o in sequenza.

Il termine "trattare il cancro" o "trattamento del cancro" come qui usato comprende almeno una delle seguenti caratteristiche (risultati profilattici /terapeutici): alleviazione dei sintomi associati al cancro, una riduzione dell'entità del cancro (ad es. un riduzione della crescita tumorale), una stabilizzazione dello stato del cancro (ad es. un'inibizione della crescita tumorale), una prevenzione dell'ulteriore diffusione del cancro (ad es. una metastasi), una prevenzione dell'insorgenza o della recidiva di un cancro, un rinvio o ritardo della progressione del cancro (ad es. una riduzione della crescita tumorale) o un miglioramento dello stato del cancro (ad es. una riduzione della dimensione del tumore).

Una "quantità terapeuticamente efficace" si riferisce ad una quantità efficace, a dosaggi e per periodi di tempo necessario, per ottenere il risultato terapeutico desiderato sopra menzionato. Una quantità terapeuticamente efficace può variare a seconda di fattori come lo stato della malattia, età, sesso, e peso dell'individuo, e la capacità del composto di suscitare una risposta desiderata nell'individuo. I regimi posologici possono essere regolati per fornire la risposta terapeutica ottimale. Una quantità terapeuticamente efficace è anche una in cui qualsiasi effetto tossico o dannoso del composto sono controbilanciati dagli effetti terapeuticamente benefici. Una "quantità efficace profilatticamente" si riferisce ad una quantità efficace, a dosaggi e per periodi di tempo necessario, per ottenere il risultato profilattico desiderato, come prevenire o inibire l'insorgenza o la progressione del cancro e sintomi associati e la malattia. Una quantità profilatticamente efficace può essere determinata come descritto sopra per la quantità terapeuticamente efficace. Per ogni particolare soggetto, regimi di dosaggio specifici possono essere regolati nel tempo in base alle esigenze individuali e al giudizio professionale della persona che somministra o supervisiona la somministrazione delle composizioni.

I tumori a cui possono essere applicate le composizioni e i metodi della presente invenzione includono gonfiori e tumori veri, inclusi tumori benigni e maligni. Esempi specifici di tali tumori sono i gliomi come astrocitoma, glioblastoma, medulloblastoma, oligodendroglioma, ependimoma e papilloma del plesso coroideo; tumori cerebrali come meningioma, adenoma pituitario, neuroma, tumore congenito, tumore cerebrale metastatico; carcinoma a cellule squamose, linfoma, una varietà di adenomi e tumori faringei risultati da questi adenomi come cancro epifaringeo, cancro nasofaringeo e cancro ipofaringeo; cancro laringeo, timoma; mesotelioma come mesotelioma pleurico, mesotelioma peritoneale e mesotelioma pericardiale; tumori al seno come cancro del dotto toracico, carcinoma lobulare e cancro papillare; tumori polmonari come carcinoma a piccole cellule, adenocarcinoma, carcinoma a cellule squamose, carcinoma a grandi cellule e carcinoma adenosquamoso; carcinoma gastrico; carcinomi esofagei quali carcinomi esofagei cervicali, carcinomi esofagei toracici e carcinomi esofagei addominali; carcinomi dell’intestino crasso come carcinoma rettale, carcinoma del colon sigma (sigmoideo), carcinoma del colon ascendente, carcinoma del colon laterale, carcinoma del cieco e carcinoma del colon discendente; epatomi come carcinoma epatocellulare, carcinoma del dotto epatico intraepatico, blastoma epatocellulare e cistoadenocarcinoma del dotto epatico; carcinoma pancreatico; tumori ormone-dipendenti pancreatici come insulinoma, gastrinoma, adenoma produttore di VIP, carcinoma del dotto epatico extraepatico, carcinoma capsulare epatico, carcinoma perianale, carcinoma pelvico renale e uretale; carcinoma uretrale; tumori renali come il carcinoma a cellule renali (tumore di Grawitz), tumore di Wilms <1> (nefroblastoma) e angiomiolipoma renale; tumori testicolari o tumori delle cellule germinali come seminoma, carcinoma embrionale, cancro del sacco vitellino, coriocarcinoma e teratoma; cancro della prostata, cancro della vescica, carcinoma della vulva; isterocarcinomi come carcinoma della cervice uterina, tumore del corpo uterino e solenoma; isteromioma, sarcoma uterino, malattie dei villi, carcinoma della vagina; tumori delle cellule germinali ovariche come disgerminoma, tumore del vitellino, teratoma prematuro, cancro idermoide e tumori ovarici come cancro ovarico; melanomi come nevociti e melanoma; i linfomi cutanei come micosi fungoide, tumori cutanei come tumori endoepidermici che risultano da tumori della pelle, prodromo o simili e cancro spinocellulare, sarcomi dei tessuti molli come istiocitoma fibroso, liposarcoma, rabdomiosarcoma, leiomiosarcoma, sarcoma sinoviale, sarcoma fibroplastico (fibrosarcoma), neuroma, emangiosarcoma, fibrosarcoma, neurofibrosarcoma, peritelioma (emangiopericitoma) e sarcoma alveolare dei tessuti molli, linfomi come linfoma di Hodgkin e linfoma non-Hodgkin, mieloma, plasmocitoma, leucemia mielocitica acuta (mieloide) e leucemia mieloide cronica, leucemia come linfoma leucocitario delle cellule T adulte e leucemia linfocitica cronica, malattie mieloproliferative croniche come la pletora vera, trombocitemia essenziale e mielofibrosi idiopatica, allargamento del linfonodo (o gonfiore), tumore di effusione pleurica, tumore ascitico, altri vari tipi di adenomi, lipoma, fibroma, emangioma, mioma, fibromioma e endotelioma.

Come qui usato, l'espressione "antigene associata al tumore" o "TAA" si riferisce ad un antigene (ad es, un polipeptide o un frammento antigenico o una variante di esso) che è sovraespressa in una cellula/tessuto tumorale rispetto ad una corrispondente cellula/tessuto normale. L'iperespressione può essere, ad esempio, un aumento dell'espressione di un dato antigene in una cellula/tessuto tumorale rispetto ad una cellula/tessuto normale, ma anche l'espressione di un antigene in una cellula/tessuto tumorale che non lo esprimono in uno stato normale (cioè quando la cellula o il tessuto non è canceroso). Ad esempio, TAA includono oncoproteine note come HER-2/Neu e c-myc, proteine per la sopravvivenza come la survivina e il fattore di crescita derivato dall'epitelio della lente (LEDGF/p75), proteine regolatorie del ciclo cellulare come la Ciclina B1, antigeni di differenziazione e del cancro del testicolo come NY-ESO-1, antigene del cancro colorettale come l'antigene carcinoembrionale (CEA), la maggior parte degli antigeni della famiglia MAGE, melanA/MART-1, MUC1, proteina tumorale di Wilms (WT-1), STEAP e altri (vedere Novellini et al., 2005. Cancer Immunol Immunother. 54(3): 187-207 per un elenco dei TAA conosciuti).

In un ulteriore aspetto, l’invenzione fornisce una cellula ricombinante comprendente il summenzionato vettore. In un’ulteriore forma di realizzazione, la summenzionata cellula è una cellula che presenta un antigene (ad es. una cellula tumorale).

In un ulteriore aspetto, l'invenzione fornisce una composizione che comprende la cellula te sopra menzionata e un vettore o eccipiente farmaceuticamente accettabili.

In un altro aspetto, la presente invenzione fornisce un metodo per attivare una cellula T umana specifica per il tumore, detto metodo comprendente contattare detta cellula T con la suddetta cellula ricombinante. In una forma di realizzazione, il suddetto contattare viene eseguito ex vivo o in vivo.

Nell'ambito dell'invenzione ci sono le cellule (ad es. le cellule ospiti) trasfettate o trasformate con l'acido nucleico chimerico o il vettore dell'invenzione. I metodi di trasformazione/trasfezione delle cellule ospiti con acidi nucleici/vettori sono ben noti nell’arte e dipendono dal sistema ospite selezionato come descritto in Ausubel et al. (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994). I termini "trasformazione" e "trasfezione" si riferiscono alle tecniche per l'introduzione di acido nucleico estraneo in una cellula ospite, inclusi co-precipitazione con fosfato di calcio o cloruro di calcio, trasfezione mediate da destrano-DEAE, lipofezione, elettroporazione, microiniezione e trasfezione mediata da virus. Le cellule ospiti trasfettate o trasformate con l'acido nucleico chimerico o vettore dell'invenzione possono essere utilizzate come vaccino (ad es., vaccino cellulare autologo) al fine di indurre o aumentare una risposta immunitaria contro un epitopo antigenico o un antigene (ad es., STEAP) in un soggetto. Ad esempio, le cellule ospiti (ad es., le cellule dendritiche APCs) possono essere rimosse da un soggetto (ad es., un paziente oncologico), trasfettate o trasformate secondo la presente invenzione e ri-somministrate al paziente. Naturalmente, i passaggi noti per l’ulteriore coltivazione o modifica di queste cellule potrebbero essere effettuati prima di re-iniettarle/trapiantarle in un soggetto. Ad esempio, citochine/chemochine o mitogeni o molecole potrebbero essere aggiunti al mezzo di coltura.

In accordo con un'altra forma di realizzazione della presente invenzione, le cellule T (ad es., cellule T CD4+ e/o CD8+) possono essere rimosse da un soggetto (ad es., un paziente oncologico), attivate secondo la presente invenzione (ad es., mediante loro contatto con la cellula tumorale umana ingegnerizzata dell'invenzione) e ri-somministrate al paziente. Naturalmente, i passaggi noti per ulteriore coltivazione o proliferazione di queste cellule T potrebbero essere eseguiti prima di reiniettarle in un soggetto. Ad esempio, citochine o altri mitogeni o molecole potrebbero essere aggiunti al mezzo di coltura.

In una forma di realizzazione, la suddetta cellula T è derivata da un soggetto che soffre di cancro o a rischio di soffrire di cancro.

In un altro aspetto, la presente invenzione fornisce un kit o un pacchetto comprendente:

a) un agente selezionato tra (i) la suddetta composizione, (ii) il suddetto vettore, (iii) la suddetta cellula, e (iv) qualsiasi combinazione di (i) a (iii); e

b) le istruzioni per prevenire o curare il cancro o per indurre una risposta immunitaria immunologica o protettiva contro un tumore.

Sebbene varie forme di realizzazione dell'invenzione siano qui divulgate, molti adattamenti e modifiche possono essere fatti nell'ambito dell'invenzione secondo la comune conoscenza generale di coloro che sono esperti in questa materia. Tali modifiche includono la sostituzione di equivalenti noti per qualsiasi aspetto dell'invenzione al fine di ottenere lo stesso risultato sostanzialmente allo stesso modo. Gli intervalli numerici sono comprensivi dei numeri che definiscono l'intervallo. Nelle rivendicazioni, la parola "comprendente" viene utilizzata come termine aperto, sostanzialmente equivalente alla frase "includente, ma non limitato a". I seguenti esempi sono illustrativi di vari aspetti dell'invenzione e non limitano gli aspetti ampi dell'invenzione come qui divulgati.

L'invenzione verrà illustrata mediante esempi non limitativi in riferimento alle seguenti figure. Fig. 1 Espressione di CD80/CD86 in cellule ingegnerizzate mediante RV. A. Schema del vettore retrovirale che esprime CD80/CD86. Vengono mostrati i siti di restrizione unici presenti nel RV PINCO in cui sono stati inseriti entrambi i cDNA di CD80 e CD86. LTR: Long terminal repeats;�: sito di impacchettamento; ie-CMV: promotore CMV immediato-precoce. B. Analisi al FACS di cellule 293T due giorni dopo la trasfezione con il RV che esprime CD80/CD86. Come controllo, sono state analizzate anche cellule 293T trasfettate con RV vuoto (pannelli superiori). I risultati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. C. Analisi al FACS di cellule MCF-7 recuperate dopo la trasduzione con il RV esprimente CD80/CD86 (VSV-G). Come controllo, sono state analizzate anche cellule MCF-7 parentali (pannelli superiori). Sono mostrati i risultati ottenuti con un rappresentante di sei cloni di cellule MCF-7 selezionati. D. Analisi al FACS di cellule mSC recuperate dopo la trasduzione con il RV esprimente CD80/CD86 (VSV-G). Come controllo, sono state analizzate anche cellule mSC parentali (pannelli superiori). Sono mostrati i risultati ottenuti con un rappresentante di cinque cloni di cellule mSC selezionati. Nei pannelli B-D, le celle sono state marcate con isotipo IgG (linee nere), mAb anti-CD80 o anti-CD86 (linee rosse).

Fig. 2 Tipizzazione HLA di entrambe cellule MCF-7 e mSC. Analisi al FACS per l'espressione di HLA-A.02 (linee rosse) su cloni rappresentativi di cellule MCF-7 e mSC selezionati dopo la trasduzione con il RV esprimente CD80/CD86 (VSV-G). Come controllo, le cellule sono state anche marcate con un isotipo IgG (linee nere).

Fig. 3 Caratterizzazione fenotipica delle colture di PBL dopo attivaizione. Analisi fenotipica di entrambe le sottopopolazioni di linfociti T CD4<+ >T e CD8<+ >14 giorni dopo il recupero da co-colture con cellule MCF-7 irradiate parentali o ingegnerizzate con CD80/CD86. Strategia di gating: le cellule vitali sono state identificate mediante colorazione con colorante LIVE/DEAD ™ Fixable Near-IR Dead Cell. Attraverso la marcatura con DuraClone custom B38658, sono state quindi identificate entrambe le sottopopolazioni CD4 e CD8 positive tra le cellule CD3 positive. Infine, l'analisi combinata dell'espressione di entrambi CCR7 e CD45RA in ciascuna sottopopolazione ha permesso l'identificazione di linfociti T CD4<+ >e CD8<+ >naïve, della memoria centrale (c.m.), effettori della memoria (e.m.) e terminalmente differenziati (t.d.). Sono riportate le percentuali di cellule colorate positive per i diversi Abs. Sono mostrati i dati rappresentativi di tre esperimenti indipendenti.

Fig. 4 Analisi dell'espressione di CD25 in PBL attivati. Analisi al FACS di CD8/CD25 in PBL recuperati dopo attivazione con cellule MCF-7 (A) e mSC (B) parentali o esprimenti CD80/CD86. Nel pannello A, a sinistra sono riportati i dati originali di un esperimento rappresentativo. Sono indicate le percentuali di cellule CD25 positive rispetto alle sottopopolazioni CD8 positive e CD8 negative. I quadranti sono stati impostati sulla base della fluorescenza di fondo rilevata dopo la marcatura delle cellule con isotipi di IgG coniugati con entrambi FITC e PE. Sulla destra, sono mostrati i valori medi SD delle cellule doppie positive per CD8/CD25 calcolati su cinque esperimenti indipendenti. * p <0,05. Nel pannello B, sono mostrati i dati di un rappresentante di due esperimenti indipendenti condotti utilizzando PBL isolati da diversi donatori sani dopo la cocoltivazione con cellule mSC parentali o ingegnerizzate con CD80/CD86. Sono indicate le percentuali di cellule CD25 positive rispetto ad entrambe le sottopopolazioni CD8 positive e CD8 negative.

Fig. 5 Analisi dell'espressione di CD107a in PBL attivati dopo 5 ore di co-coltivazione con cellule bersaglio. Analisi al FACS di CD107a in PBL recuperati dopo attivazione con cellule MCF-7 (pannello A) e mSC (pannello B) parentali o esprimenti CD80/CD86 dopo 5 ore di co-coltura con cellule parentali o, nel caso dei PBL attivati con cellule ingegnerizzate con CD80/CD86, SiHa HLA-incompatibili. I risultati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti condotti con PBL isolati da diversi donatori sani. Sono indicate le percentuali di cellule CD107a positive relative ad entrambe le sottopopolazioni CD8 positive e CD8 negative.

Fig. 6 Analisi della trogocitosi in linfociti T CD8<+ >attivati. Analisi al FACS dei PBL recuperati dopo attivazione con cellule MCF-7 parentali o esprimenti CD80/CD86, e co-coltura con cellule MCF-7 parentali marcate con CM-Dil. Strategia di gating: le co-culture marcate con entrambi mAb anti-CD3 coniugato con APC e anti-CD8 coniugato con FITC sono state selezionate per l’espressione di CD3 (per identificare PBL), e quindi le sottopopolazioni CD8 positive sono state identificate all’interno delle cellule CD3 positive. Le cellule marcate con CD8 sono state infine valutate per la fluorescenza CM-Dil specifica. Nel pannello A, sono mostrati i dati originali di un esperimento rappresentativo. Sono indicate le percentuali di cellule positive CD8/CM-Dil. I quadranti sono stati impostati sulla base della fluorescenza di fondo rilevata dopo la marcatura cellulare con i rilevanti isotipi IgG. Nel pannello B sono mostrati i valori medi SD delle cellule doppie positive CD8/CM-Dil calcolati da tre esperimenti indipendenti in condizioni di duplicato. * p <0,05

Fig. 7 Rilevazione di linfociti T CD8<+ >specifici per Mart-1 all’interno di PBL attivati da cellule mSC ingegnerizzate con CD80/CD86. A. Analisi al microscopio a fluorescenza delle cellule mSC dopo marcatura intracitoplasmatica con isotipo IgG o mAb anti-Mart-1. Le barre di scala sono indicate. B. Analisi IFN-� Elispot per la presenza di linfociti T CD8<+ >specifici per Mart-1. Le B-LCL HLA-A.02 sono state trattate con 1 μg/mL di un nonamero Mart-1 HLA-A.02 ristretto o, come controllo, quantità equivalenti di uno non correlato. Dopo 5 ore, 4×10<4 >B-LCL sono state seminate in micropozzetti triplicati per IFN-� Elispot in presenza di 10<5 >PBL attivati con cellule mSC parentali o esprimenti CD80/CD86. Come controllo, sono stati seminati anche PBL da soli. Dopo incubazione di una notte, gli spot sono stati contati usando un lettore Elispot (A.EL.VIS. Elispot reader e Analysis software GmbH). Nella parte superiore, vengono mostrati i dati originali da un esperimento rappresentativo condotto in presenza o in assenza di entrambi peptide B-LCL e Mart-1. Nella parte inferiore, sono mostrati il numero medio SD di unità di formazione di spot (SFU)/10<5 >cellule calcolato da tre esperimenti indipendenti condotti utilizzando PBL di diversi donatori sani. * p <0,05.

Fig. 8 Attività CTL anti-tumorale di PBL attivati da cellule MCF-7 esprimenti CD80/CD86.

Saggio CTL eseguito con PBL attivati con cellule MCF-7 parentali o ingegnerizzate. I PBL sono stati coltivati in triplicato con o senza (Nil) cellule MCF-7 precedentemente marcate con CFSE in un rapporto cellulare di 5:1. Sei ore più tardi, la mortalità delle cellule bersaglio è stata valutata mediante analisi al FACS su marcatura con 7-AAD. Il pannello A mostra i dati originali da un esperimento rappresentativo in cui sono state incluse come controllo le condizioni comprendenti le cellule bersaglio SiHa HLA-A.02 negative. Le percentuali di cellule doppie positive CFSE/7-AAD sono indicate. Nel pannello B, sono indicati i valori medi SD dell'incremento di cellule bersaglio CFSE/7-AAD positive dopo incubazione con PBL attivati con cellule ingegnerizzate con CD80/CD86 rispetto al numero di cellule bersaglio doppie fluorescenti a seguito di incubazione con PBL attivati da quelle parentali. Sono stati effettuati tre esperimenti indipendenti usando PBL di diversi donatori sani. * p

<0,05

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Materiali e metodi

Recupero del vettore retrovirale

I cDNA che codificano sia CD80 che CD86 umani sono stati amplificati mediante trascrittasi inversa

(RT)-PCR utilizzando primer che includono i siti di restrizione appropriati.

CD80: sequenza nucleotidica cDNA (SEQ ID n. 1):

atggg ccacacacgg aggcagggaa catcaccatc caagtgtcca

tacctcaatt tctttcagct cttggtgctg gctggtcttt ctcacttctg ttcaggtgtt atccacgtga ccaaggaagt gaaagaagtg gcaacgctgt cctgtggtca caatgtttct gttgaagagc tggcacaaac tcgcatctac tggcaaaagg agaagaaaat ggtgctgact atgatgtctg gggacatgaa tatatggccc gagtacaaga accggaccat ctttgatatc actaataacc tctccattgt gatcctggct ctgcgcccat ctgacgaggg cacatacgag tgtgttgttc tgaagtatga aaaagacgct ttcaagcggg aacacctggc tgaagtgacg ttatcagtca aagctgactt ccctacacct agtatatctg actttgaaat tccaacttct aatattagaa ggataatttg ctcaacctct ggaggttttc cagagcctca cctctcctgg ttggaaaatg gagaagaatt aaatgccatc aacacaacag tttcccaaga tcctgaaact gagctctatg ctgttagcag caaactggat ttcaatatga caaccaacca cagcttcatg tgtctcatca agtatggaca tttaagagtg aatcagacct tcaactggaa tacaaccaag caagagcatt ttcctgataa cctgctccca tcctgggcca ttaccttaat ctcagtaaat ggaatttttg tgatatgctg cctgacctac tgctttgccc caagatgcag agagagaagg aggaatgaga gattgagaag ggaaagtgta cgccctgtat aacagtgtcc gcagaagcaa ggggctgaaa agatctgaag gtcccacctc catttgcaat tgacctcttc tgggaacttc ctcagatgga caagattacc ccaccttgcc ctttacgtat ctgctcttag gtgcttcttc acttcagttg ctttgcagga agtgtctaga ggaatatggt gggcacagaa gtagctctgg tgaccttgat caaggtgttt tgaaatgcag aattcttgag ttctggaagg gactttagag aataccagtg ttattaatga caaaggcact gaggcccagg gaggtgaccc gaattataaa ggccagcgcc agaacccaga tttcctaact ctggtgctct ttccctttat cagtttgact gtggcctgtt aactggtata tacatatata tgtcaggcaa agtgctgctg gaagtagaat ttgtccaata acaggtcaac ttcagagact atctgatttc ctaatgtcag agtagaagat tttatgctgc tgtttacaaa agcccaatgt aatgcatagg aagtatggca tgaacatctt taggagacta atggaaatat tattggtgtt tacccagtat tccatttttt tcattgtgtt ctctattgct gctctctcac tcccccatga ggtacagcag aaaggagaac tatccaaaac taatttcctc tgacatgtaa gacgaatgat ttaggtacgt caaagcagta gtcaaggagg aaagggatag tccaaagact taactggttc atattggact gataatctct ttaaatggct ttatgctagt ttgacctcat ttgtaaaata tttatgagaa agttctcatt taaaatgaga tcgttgttta cagtgtatgt actaagcagt aagctatctt caaatgtcta aggtagtaac tttccatagg gcctccttag atccctaaga tggctttttc tccttggtat ttctgggtct ttctgacatc agcagagaac tggaaagaca tagccaactg ctgttcatgt tactcatgac tcctttctct aaaactgcct tccacaattc actagaccag aagtggacgc aacttaagct gggataatca cattatcatc tgaaaatctg gagttgaaca gcaaaagaag acaacatttc tcaaatgcac atctcatggc agctaagcca catggctggg atttaaagcc tttagagcca gcccatggct ttagctacct cactatgctg cttcacaaac cttgctcctg tgtaaaacta tattctcagt gtagggcaga gaggtctaac accaacataa ggtactagca gtgtttcccg tattgacagg aatacttaac tcaataattc ttttcttttc catttagtaa cagttgtgat gactatgttt ctattctaag taattcctgt attctacagc agatactttg tcagcaatac taagggaaga aacaaagttg aaccgtttct ttaataa

sequenza aminoacidica cDNA CD80 (SEQ ID n. 2):

MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKE VATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIV ILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRI ICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLI KYGHLRVNQTFNWNTTKQEHFPDNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRR NERLRRESVRPV

sequenza nucleotidica cDNA CD86 (SEQ ID n. 3):

atg ggactgagta acattctctt tgtgatggcc

ttcctgctct ctggtgctgc tcctctgaag attcaagctt atttcaatga gactgcagac

ctgccatgcc aatttgcaaa ctctcaaaac caaagcctga gtgagctagt agtattttgg

caggaccagg aaaacttggt tctgaatgag gtatacttag gcaaagagaa atttgacagt

gttcattcca agtatatggg ccgcacaagt tttgattcgg acagttggac cctgagactt

cacaatcttc agatcaagga caagggcttg tatcaatgta tcatccatca caaaaagccc

acaggaatga ttcgcatcca ccagatgaat tctgaactgt cagtgcttgc taacttcagt

caacctgaaa tagtaccaat ttctaatata acagaaaatg tgtacataaa tttgacctgc

tcatctatac acggttaccc agaacctaag aagatgagtg ttttgctaag aaccaagaat

tcaactatcg agtatgatgg tattatgcag aaatctcaag ataatgtcac agaactgtac

gacgtttcca tcagcttgtc tgtttcattc cctgatgtta cgagcaatat gaccatcttc

tgtattctgg aaactgacaa gacgcggctt ttatcttcac ctttctctat agagcttgag

gaccctcagc ctcccccaga ccacattcct tggattacag ctgtacttcc aacagttatt

atatgtgtga tggttttctg tctaattcta tggaaatgga agaagaagaa gcggcctcgc

aactcttata aatgtggaac caacacaatg gagagggaag agagtgaaca gaccaagaaa

agagaaaaaa tccatatacc tgaaagatct gatgaagccc agcgtgtttt taaaagttcg

aagacatctt catgcgacaa aagtgataca tgtttttaa

sequenza aminoacidica cDNA CD86 (SEQ ID n. 4):

MGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSL SELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLY QCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEP KKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDK TRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIPWITAVLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYKC GTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCF

L'RNA totale è stato estratto da cellule dendritiche mature recuperate dopo 5 giorni di

stimolazione di monociti derivati dal sangue periferico umano con 10 ng/mL di IL-4 e 50 ng/mL di

GM-CSF, e ulteriore stimolazione per una notte con 10 ng/mL di LPS. Il cDNA CD80 è stato sub-

clonato nei siti Bam HI e Eco RI del vettore di trasferimento retrovirale PINCO [13], mentre il cDNA

CD86 è stato inserito nei siti Hind III e Not I dello stesso vettore (Fig. 1A). Il costrutto retrovirale è

stato infine sequenziato.

Colture cellulari

Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate da donatori sani mediante gradienti di densità Fycoll-Hypaque. I PBMC sono stati purificati da buffy coat ottenuti dal Centro Trasfusionale dell'Università di Roma "La Sapienza" come materiale di scarto derivante dalle procedure di isolamento di plasma/piastrine/globuli rossi isolate da sangue intero di donatori sani. Di conseguenza, alla legge italiana in materia (Decreto Legislativo del Ministero della Sanità Italiano del 25 gennaio 2001, pubblicato sulla Gazzetta Ufficiale del 3 aprile 2001) i consensi informati non sono necessari per ottenere tale materiale. Gli studi sono stati approvati dal comitato etico dell'Istituto Superiore di Sanità.

La frazione linfocitaria (PBL) è stata isolata mediante selezione negativa utilizzando un kit basato su immunomagnetica (Miltenyi). I PBL sono stati coltivati in terreno completo costituito da RPMI 1640 integrato con siero umano AB al 10% inattivato dal calore. La purezza delle popolazioni di cellule recuperate è stata saggiata mediante analisi FACS usando mAb anti-CD3 coniugato con PE (Becton Dickinson).

Le cellule HEK-293T (American Type Cell Collection, ATCC, CRL-11268), MCF-7 di adenocarcinoma mammario (ATCC HTB-22) [14], “packaging” PhoenixGP (ATCC CRL-3215) [15], SiHa (ATCC HTB-35), e le cellule di melanoma mSC sono state coltivate nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente il 10% di siero bovino fetale inattivato al calore. Le cellule di melanoma umano mSC sono state ottenute come descritto [16] da una biopsia tumorale fresca dopo intervento chirurgico e con il consenso informato. La linea cellulare linfoblastoide delle cellule B HLA-A.02 (B-LCL) è stata ottenuta da T. Bauer, Helmholtz Zentrum München, Germania, e coltivata in RPMI, 10% FCS.

Preparazione del vettore retrovirale e trasduzione

Il vettore di trasferimento retrovirale esprimente CD80/CD86 è stato co-transfettato nella linea di cellule di “packaging” PhoenixGP utilizzando il protocollo basato sulla Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) insieme a un vettore eucariotico promosso da CMV che esprime la proteina G del virus della stomatite vescicolare (VSV-G).

Sequenza del vettore pHCMV-VSV-G utilizzato (SEQ ID n. 5):

1 gagcttggcc cattgcatac gttgtatcca tatcataata tgtacattta tattggctca 61 tgtccaacat taccgccatg ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt 121 acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 181 ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 241 cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 301 actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 361 aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 421 acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag 481 tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt 541 gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac 601 aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc 661 agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc 721 catagaagac accgggaccg atccagcctc cggtcgaccg atcctgagaa cttcagggtg 781 agtttgggga cccttgattg ttctttcttt ttcgctattg taaaattcat gttatatgga 841 gggggcaaag ttttcagggt gttgtttaga atgggaagat gtcccttgta tcaccatgga 901 ccctcatgat aattttgttt ctttcacttt ctactctgtt gacaaccatt gtctcctctt 961 attttctttt cattttctgt aactttttcg ttaaacttta gcttgcattt gtaacgaatt 1021 tttaaattca cttttgttta tttgtcagat tgtaagtact ttctctaatc actttttttt 1081 caaggcaatc agggtatatt atattgtact tcagcacagt tttagagaac aattgttata 1141 attaaatgat aaggtagaat atttctgcat ataaattctg gctggcgtgg aaatattctt 1201 attggtagaa acaactacac cctggtcatc atcctgcctt tctctttatg gttacaatga 1261 tatacactgt ttgagatgag gataaaatac tctgagtcca aaccgggccc ctctgctaac 1321 catgttcatg ccttcttctc tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt tgttgtgctg 1381 tctcatcatt ttggcaaaga attcctcgac ggatccgcca tgaagtgcct tttgtactta 1441 gcctttttat tcattggggt gaattgcaag ttcaccatag tttttccaca caaccaaaaa 1501 ggaaactgga aaaatgttcc ttctaattac cattattgcc cgtcaagctc agatttaaat 1561 tggcataatg acttaatagg cacagcctta caagtcaaaa tgcccaagag tcacaaggct 1621 attcaagcag acggttggat gtgtcatgct tccaaatggg tcactacttg tgatttccgc 1681 tggtatggac cgaagtatat aacacattcc atccgatcct tcactccatc tgtagaacaa 1741 tgcaaggaaa gcattgaaca aacgaaacaa ggaacttggc tgaatccagg cttccctcct 1801 caaagttgtg gatatgcaac tgtgacggat gccgaagcag tgattgtcca ggtgactcct 1861 caccatgtgc tggttgatga atacacagga gaatgggttg attcacagtt catcaacgga 1921 aaatgcagca attacatatg ccccactgtc cataactcta caacctggca ttctgactat 1981 aaggtcaaag ggctatgtga ttctaacctc atttccatgg acatcacctt cttctcagag 2041 gacggagagc tatcatccct gggaaaggag ggcacagggt tcagaagtaa ctactttgct 2101 tatgaaactg gaggcaaggc ctgcaaaatg caatactgca agcattgggg agtcagactc 2161 ccatcaggtg tctggttcga gatggctgat aaggatctct ttgctgcagc cagattccct 2221 gaatgcccag aagggtcaag tatctctgct ccatctcaga cctcagtgga tgtaagtcta 2281 attcaggacg ttgagaggat cttggattat tccctctgcc aagaaacctg gagcaaaatc 2341 agagcgggtc ttccaatctc tccagtggat ctcagctatc ttgctcctaa aaacccagga 2401 accggtcctg ctttcaccat aatcaatggt accctaaaat actttgagac cagatacatc 2461 agagtcgata ttgctgctcc aatcctctca agaatggtcg gaatgatcag tggaactacc 2521 acagaaaggg aactgtggga tgactgggca ccatatgaag acgtggaaat tggacccaat 2581 ggagttctga ggaccagttc aggatataag tttcctttat acatgattgg acatggtatg 2641 ttggactccg atcttcatct tagctcaaag gctcaggtgt tcgaacatcc tcacattcaa 2701 gacgctgctt cgcaacttcc tgatgatgag agtttatttt ttggtgatac tgggctatcc 2761 aaaaatccaa tcgagcttgt agaaggttgg ttcagtagtt ggaaaagctc tattgcctct 2821 tttttcttta tcatagggtt aatcattgga ctattcttgg ttctccgagt tggtatccat 2881 ctttgcatta aattaaagca caccaagaaa agacagattt atacagacat agagatgaac 2941 cgacttggaa agtgataagg atccgtcgag gaattcactc ctcaggtgca ggctgcctat 3001 cagaaggtgg tggctggtgt ggccaatgcc ctggctcaca aataccactg agatcttttt 3061 ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac ttctggctaa 3121 taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga 3181 aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt ttagagtttg 3241 gcaacatatg cccatatgct ggctgccatg aacaaaggtt ggctataaag aggtcatcag 3301 tatatgaaac agccccctgc tgtccattcc ttattccata gaaaagcctt gacttgaggt 3361 tagatttttt ttatattttg ttttgtgtta tttttttctt taacatccct aaaattttcc 3421 ttacatgttt tactagccag atttttcctc ctctcctgac tactcccagt catagctgtc 3481 cctcttctct tatggagatc cctcgacgga tcggccgcaa ttcgtaatca tgtcatagct 3541 gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 3601 aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc 3661 actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 3721 cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 3781 gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 3841 atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 3901 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 3961 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 4021 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 4081 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 4141 taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 4201 cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 4261 acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 4321 aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 4381 atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 4441 atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 4501 gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 4561 gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 4621 ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 4681 ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt 4741 tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 4801 accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt 4861 atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 4921 cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 4981 tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 5041 tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 5101 gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 5161 agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 5221 aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 5281 gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac 5341 tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 5401 gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 5461 tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 5521 aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 5581 catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 5641 acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctaaattgt aagcgttaat 5701 attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc 5761 gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt 5821 ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa 5881 accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg 5941 tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga 6001 cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct 6061 agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat 6121 gcgccgctac agggcgcgtc ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 6181 tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 6241 ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgag 6301 cgcgcgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc accgcggtgg cggccgctct 6361 aga

Sequenza aminoacidica VSV-G (SEQ ID n. 6):

1 mkcllylafl figvnckfti vfphnqkgnw knvpsnyhyc psssdlnwhn dligtalqvk 61 mpkshkaiqa dgwmchaskw vttcdfrwyg pkyithsirs ftpsveqcke sieqtkqgtw 121 lnpgfppqsc gyatvtdaea vivqvtphhv lvdeytgewv dsqfingkcs nyicptvhns 181 ttwhsdykvk glcdsnlism ditffsedge lsslgkegtg frsnyfayet ggkackmqyc 241 khwgvrlpsg vwfemadkdl faaarfpecp egssisapsq tsvdvsliqd verildyslc 301 qetwskirag lpispvdlsy lapknpgtgp aftiingtlk yfetryirvd iaapilsrmv 361 gmisgttter elwddwapye dveigpngvl rtssgykfpl ymighgmlds dlhlsskaqv 421 fehphiqdaa sqlpddeslf fgdtglsknp ielvegwfss wkssiasfff iigliiglfl 481 vlrvgihlci klkhtkkrqi ytdiemnrlg k

Da 48 a 72 ore dopo, i surnatanti sono stati raccolti, chiarificati e concentrati mediante

ultracentrifugazione su un cuscino di saccarosio al 20% a 100.000 g, 2.5 ore, 4 °C. Le preparazioni

del vettore retrovirale (RV) sono state titolate misurando l'attività RT come descritto in precedenza

[17]. La loro efficienza di trasduzione è stata calcolata in termini di unità trasducenti (TU)/mL

trattando cellule 293T con diverse diluizioni del RV e valutando l'espressione di CD80 e CD86 sulla membrana plasmatica mediante citometria a flusso 72 ore dopo. L'attività di trasduzione dei presenti preparati RV variava da 10<5 >a 10<6 >TU/�L. Le trasduzioni di entrambe le cellule MCF-7 e mSC con il (VSV-G) RV sono state effettuate mediante spinoculazione a 400 g per 30 minuti a temperatura ambiente utilizzando 5 TU/cellula. L'adsorbimento del RV è stato prolungato per ulteriori 3 ore a 37 °C, e infine le cellule sono state lavate e ri-seminate con mezzo completo. Cloni di cellule altamente esprimenti CD80/CD86 sono stati selezionati da micropozzetti in cui 0,5 cellule/pozzetto erano state precedentemente seminate sette giorni dopo la trasduzione con RV.

Analisi con citometro a flusso e al microscopio a fluorescenza

La marcatura con tutti gli anticorpi (Ab) sono state eseguite incubando le cellule con diluizioni di Ab 1: 100 per 1 ora a 4 °C in 1×PBS più 1% FBS. Sono stati usati i seguenti Ab anti-umani: anti-CD80 e anti-CD86 coniugati con entrambi FITC e PE, anti-CD107a coniugato con PE, anti-CD3 mAb coniugati con APC dalla Becton Dickinson; mAb anti-HLA-A.02 coniugato con PE dalla BD; anti-CD25 coniugato con entrambi FITC e PE25, nonché mAb anti-CD8 coniugati con FITC-, PE e APC/Cy7 dalla eBioscience. Dopo incubazione con Ab, i campioni sono stati lavati due volte con 1×PBS e le cellule morte sono state colorate con 7-amminoactinomicina D (7-AAD).

DuraClone custom B38658 (Beckman Coulter) è un pannello di cinque anticorpi comprendente mAb anti-CD4 coniugato con FITC, anti-CCR7 coniugato con PE, anti-CD8 coniugato con PC5.5, anti-CD3 coniugato con PC7 e anti-CD45RA coniugato con APC. Le cellule vitali sono state identificate utilizzando il kit di colorazione LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell in base alle istruzioni del produttore. Tutti i campioni sono stati quindi valutati su un citometro a flusso Gallios e analizzati utilizzando il software Kaluza (Beckman Coulter).

Per l'analisi del microscopio a fluorescenza, le cellule sono state permeabilizzate tramite il protocollo basato su Cytofix-Cytoperm (BD Biosciences), e quindi marcate con un mAb anti-Mart-1 (clone 872719, R&D), o con un isotipo IgG. Successivamente, le cellule sono state incubate con IgG anti-topo coniugate con Alexa Fluor 488, e poi applicate su vetrino. I vetrini coprioggetto sono stati montati usando un mezzo di montaggio anti-sbiadimento contenente 4'-6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Infine, le cellule sono state analizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza Zeiss Axioskop 2 plus.

Saggio di attivazione

PBL HLA-A.02 sono stati messi in co-coltura in un rapporto di 4:1 con cellule tumorali parentali (parentali sono cellule intatte/wild-type/non ingegnerizzate, cioè lo stesso tipo di cellula ma non ingegnerizzato) o esprimenti CD80/CD86 precedentemente irraggiate con 8000 rad. Dopo 48 ore, i surnatanti contenenti i PBL sono stati raccolti, e sottoposti a una fase di adesione cellulare per eliminare le rimanenti cellule tumorali. I PBL sono stati poi coltivati per ulteriori due settimane in terreno completo in assenza di supplementi di citochine. Al termine, le cellule erano pronte per i successivi saggi.

Si nota che l'irraggiamento è utile da un punto di vista tecnico. Infatti, l’irraggiamento delle cellule tumorali ingegnerizzate consente di eseguire la co-coltura con i linfociti senza ulteriore manipolazione, evitando così la sovra-crescita della linea tumorale. D'altra parte, da un punto di vista biologico, l’irraggiamento non è essenziale, dato che la funzione di attivazione è operativa anche in presenza di divisione cellulare attiva.

Saggi di degranulazione e trogocitosi indotte dall'attivazione

La degranulazione indotta dall'attivazione è stata misurata valutando l'espressione del CD107a di membrana come descritto [18]. In breve, 2×10<5 >PBL recuperati da colture attivate sono stati cocoltivati per 5 ore con un numero uguale di cellule bersaglio, cioè, cellule MCF-7, mSC, o, come controllo, SiHa, in presenza di entrambi anti-CD107a coniugato con PE (BD-Pharmingen) e 0,7 μg/ml di monensina (GolgiStop, BD). Le popolazioni di cellule CD8<+ >isolate sono state quindi analizzate mediante FACS per la fluorescenza correlata al CD107a.

Per il saggio di trogocitosi, le cellule MCF-7 sono state marcate con il colorante fluorescente lipofilo CM-Dil (Molecular Probes) secondo le istruzioni del produttore con piccole modifiche. In dettaglio, 10<6 >cellule bersaglio sono state risospese in 1 mL di 1×PBS in presenza di CM-Dil 1 μM, e incubate per 5 minuti a 37 °C, seguito da un’incubazione ulteriore di 15 minuti a 4 °C. Terreno RPMI freddo contenente 10% di siero umano AB è stato aggiunto (volume 1:1) per 10 minuti a 4 °C per interrompere la marcatura. Quindi, le cellule sono state lavate tre volte con 1×PBS contenente 1% di siero umano AB. Dopo la risospensione in terreno completo, le cellule bersaglio marcate sono state co-coltivate con linfociti attivati (5×10<5 >per pozzetto in 200 μL di volume totale) in piastre a 96 pozzetti con fondo ad U in un rapporto 1:5. Dopo un'incubazione di 5 ore a 37 °C, le cellule sono state lavate due volte in 1×PBS contenente 0,5 mM di EDTA per assicurare la dissociazione cellulare, risospese in 1×PBS integrato con 0,5% di albumina di siero bovino, e colorate con gli Ab appropriati per l'analisi al FACS. Le cellule morte sono state colorate aggiungendo 7-AAD alla concentrazione finale di 1 μg/ml.

Saggio Elispot

I saggi IFN- γ Elispot sono stati effettuati utilizzando reagenti disponibili in commercio (Mabtech AB). Un totale di 10<5 >PBL delle colture attivate sono stati seminati in triplicato in presenza o in assenza di 4×10<4 >B-LCL HLA-compatibili pre-incubate per 5 ore con 1 μg/mL del peptide HLA-A.02 immunodominante ristretto Mart-1 (AAGIGILTV27-35 (SEQ ID n. 7)) [19], o uno non specifico HLA-A.02 ristretto. Come controllo, anche i PBL da soli sono stati seminati. Dopo incubazione per una notte, i pozzetti sono stati sviluppati e gli spot sono stati contati usando un lettore Elispot (A.EL.VIS. Elispot reader e Analysis software GmbH).

Saggio CTL

I PBL recuperati da colture attivate sono stati messi in co-coltura con cellule MCF-7 precedentemente marcate con carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE, Invitrogen, Thermo Fisher) seguendo le raccomandazioni del produttore. Le co-colture sono state fatte con un rapporto 5:1 cellule effettrici:target in 200 μL di RPMI addizionato con siero umano AB al 10% in piastre a 96 pozzetti con fondo ad U. Sei ore dopo, la mortalità delle cellule bersaglio è stata valutata mediante analisi al FACS delle cellule CFSE positive subito dopo l'aggiunta di 7-AAD alla concentrazione finale di 1 μg/mL.

Analisi statistica

Quando appropriato, i dati sono presentati come media deviazione standard (SD). In alcuni casi, è stato utilizzato il test U di Mann-Whitney. p <0,05 è stato considerato significativo.

ESEMPI

Isolamento e caratterizzazione di cellule tumorali ingegnerizzate con CD80/CD86

La corretta funzionalità del RV esprimente CD80/CD86 (Fig. 1A) è stata testata tramite transfezione transiente su cellule 293T. Due giorni dopo la trasfezione, l'espressione sulla membrana plasmatica di entrambi i transgeni è stata valutata mediante analisi al FACS (Fig. 1B). Successivamente, sono state generate particelle retrovirali pseudotipizzate con VSV-G mediante cotrasfezione su cellule Phoenix-GP con il RV esprimente CD80/CD86 e un vettore promosso da CMV esprimente VSV-G. Entrambe le cellule MCF-7 e mSC sono state quindi trasdotte dal RV. Sette giorni dopo, le cellule sono state clonate con il metodo della diluizione limite, e un numero di cloni è stato isolato e controllato per la co-espressione CD80/CD86. Gli inventori hanno identificato sei (per le cellule MCF-7) e cinque (per le cellule mSC) cloni di cellule doppi positivi CD80/CD86 con livelli di espressione dei transgeni simili. La Fig. 1C-D mostra il profilo FACS CD80/CD86 di cloni rappresentativi di cellule MCF-7 e mSC.

La co-coltivazione di cellule tumorali che esprimono CD80/CD86 con linfociti HLA-compatibile genera una sottopopolazione di linfociti T CD8<+ >attivata

Sia le cellule MCF-7 che mSC che co-esprimono CD80 e CD86 hanno mostrato di esprimere HLA-A.02 (Fig. 2). Queste sono state irradiate e quindi co-coltivate in un rapporto cellulare di 1:4 con PBL HLA-compatibili isolati da donatori sani. Dopo 2 giorni di co-coltura, i linfociti sono stati separati e coltivati in terreno completo in assenza di ulteriori fattori di crescita/citochine. Come controllo, sono state eseguite co-colture parallele in presenza di cellule tumorali parentali irradiate. Quattordici giorni dopo, le colture linfocitarie risultanti sono state analizzate in termini di vitalità complessiva e composizione della sottopopolazione dei linfociti. Gli inventori hanno notato in modo riproducibile un recupero inferiore di linfociti vitali in colture attivate con cellule tumorali parentali rispetto a quelle attivate con cellule ingegnerizzate con CD80/CD86 (dato non mostrato). Tuttavia, non sono state rilevate differenze significative nella composizione delle sottopopolazioni funzionali dei linfociti. La Fig. 3 mostra l'analisi fenotipica condotta su PBL attivati da cellule MCF-7. E’ stata osservata in modo riproducibile una preponderanza di linfociti T CD4<+>. Ogni sottopopolazione linfocitaria è stata anche analizzata per la composizione in cellule naïve, della memoria centrale, della memoria effettrici, e terminalmente differenziate mediante marcatura con mAb anti-CCR7 e anti-CD45 RA. Non sono state rilevate differenze importanti (Fig. 3), tranne un leggero aumento di linfociti T CD8<+ >terminale differenziati (cioè CD45RA<+>/CCR7-) all'interno delle culture attivate da cellule MCF-7 ingegnerizzate con CD80/CD86.

I PBL emergenti dalle colture attivate con cellule MCF-7 o mSC sono stati analizzati per l'espressione del marcatore di attivazione cellulare CD25 (cioè, il recettore della IL-2). Degno di nota, gli inventori hanno notato in modo riproducibile un notevole aumento di linfociti T CD8<+ >attivati nelle colture attivate da cellule tumorali che esprimono CD80/CD86 rispetto a quelle attivate con quelle parentali (Fig. 4A-B). Anche se meno marcato, è stato anche notato un aumento delle cellule CD8-/CD25<+>, possibilmente a causa di un parallelo aumento dei linfociti T CD4<+ >attivati Questi risultati hanno indicato che l'espressione di molecole co-stimolatorie sulla membrana plasmatica delle cellule tumorali è stata sufficiente ad attivare i linfociti T CD8<+>. Questa attivazione cellulare si è verificata in assenza di fattori solubili esogeni, suggerendo che il segnale 3, cioè lo stimolo indotto da citochine importante anche per la generazione di effettori CTL [20], potrebbe essere stato generato da una produzione di citochine spontanea.

Rilevamento di linfociti T CD8<+ >specifici per cellule tumorali in colture di PBL attivati

Il successo della presente strategia sperimentale si basava sull’emergenza di CTL specifici per il tumore dopo co-coltivazione con cellule tumorali ingegnerizzate. L'attività citolitica specifica per il tumore da parte dei linfociti T CD8<+ >è stata valutata in prima istanza mediante analisi FACS di CD107a/LAMP-1, cioè un marcatore di membrana cellulare di degranulazione [21]. A tal fine, i linfociti recuperati dopo attivazione delle colture sono stati co-coltivati con cellule bersaglio tumorali per cinque ore. Analizzando i PBL attivati con cellule MCF-7 o mSC, gli inventori hanno notato un aumento evidente, fino a 10 volte maggiore, dell'espressione di CD107a all'interno delle popolazioni di cellule T CD8<+ >attivate con cellule tumorali ingegnerizzate CD80/CD86 rispetto a quella attivata dalle parentali (Fig. 5). Un tale aumento non era più rilevabile quando cellule SiHa con HLA scorrelato erano usate come cellule bersaglio (Fig. 5), dimostrando la specificità degli effetti osservati.

In particolare, risultati simili sono stati ottenuti quando cellule tumorali ingegnerizzate con CD80/CD86 sono state utilizzate come cellule bersaglio (non mostrato). Gli inventori hanno riprodotto dati quantitativamente simili usando come bersaglio le cellule ingegnerizzate CD80/CD86 (cioè la stessa linea cellulare che è stata usata per indurre l’attivazione dei linfociti). Questa evidenza indica che, come previsto, l'espressione di CD80/CD86 sulla cellula bersaglio tumorale non influenza l'efficacia della risposta specifica T CD8<+ >contro la cellula tumorale stessa. Su questa base, i seguenti saggi sono stati effettuati utilizzando solo cellule bersaglio parentali.

È noto che i CTL specifici per il tumore possono catturare frammenti di membrana plasmatica da cellule tumorali esercitando l'attività citotossica attraverso un fenomeno denominato trogocitosi [22]. È stato dimostrato che la cattura della membrana è dipendente dal recettore delle cellule T [22-25], specifica per l'epitopo [25, 26], ed è esercitata dai cloni linfocitari dotati delle più elevate funzioni citotossiche [27]. Su questa base, gli inventori hanno cercato di identificare i linfociti T CD8<+ >che riconoscono gli epitopi associati alle cellule tumorali. A questo scopo, i linfociti T CD8<+ >sono stati isolati alla fine delle colture di attivazione e messi in co-coltura con cellule MCF-7 precedentemente marcate con CM-Dil, cioè una molecola con fluorescenza rossa specificamente intercalante all'interno dei doppi strati della membrana cellulare. Dopo 5 ore di incubazione, le co-culture sono state analizzate mediante FACS per la presenza di linfociti T CD8<+>/Dil<+>. Come rappresentato in fig.6, una percentuale significativamente più alta di linfociti T CD8<+ >rossi fluorescenti è stata riproducibilmente osservata nelle colture di linfociti attivati da MCF-7 esprimenti CD80/CD86 rispetto a quelle attivate con cellule MCF-7 parentali. Quindi, l’attivazione indotta dalle cellule tumorali ingegnerizzate è in grado di generare una popolazione CTL in grado di riconoscere e specificamente bersagliare le cellule tumorali.

Successivamente, gli inventori hanno cercato di stabilire se il priming indotto da cellule tumorali ingegnerizzate CD80/CD86 può generare linfociti T CD8<+ >che riconoscono specificamente un antigene associato al tumore (TAA). A tale scopo, gli inventori hanno sfruttato l'evidenza che le cellule mSC esprimono costitutivamente il TAA Mart-1 (Fig.7A). La generazione di linfociti T CD8<+ >specifici per Mart-1 in PBL attivati con cellule mSC è stata testata mediante saggio IFN-� Elispot (Fig. 7B). Gli inventori hanno notato che, in presenza del nonamero Mart-127-35 HLA-A.02 ristretto, un numero maggiore di unità formanti spot (SFU) è stato generato utilizzando PBL attivati con cellule tumorali ingegnerizzate rispetto a quelli attivati dalle parentali. Questo risultato indica che l’attivazione di PBL con cellule tumorali esprimenti Mart-1 dotate di funzioni di APC può portare alla generazione di linfociti T CD8<+ >specifici per Mart-1.

Tutti insieme, questi dati supportano l'idea che l'espressione di molecole co-stimolatorie sulla membrana plasmatica delle cellule tumorali sia sufficiente a generare linfociti T CD8<+ >funzionali specificamente mirati agli antigeni associati al tumore e, possibilmente, ai neo-antigeni.

I linfociti naïve sono educati dalle cellule tumorali ingegnerizzate con CD80/CD86 per generare CTL specifici per il tumore

Successivamente, gli inventori hanno cercato di determinare l'efficacia dei linfociti T CD8<+ >attivati in termini di uccisione cellule tumorali. A tal fine, gli inventori hanno allestito saggi di citotossicità utilizzando MCF-7 parentali come cellule bersaglio. I linfociti T CD8<+ >isolati da colture attivate con cellule MCF-7 parentali o esprimenti CD80/CD86 sono stati messi in co-coltura con cellule MCF-7 parentali marcate con CFSE in un rapporto 5:1. Sei ore dopo, le co-culture sono state marcate con 7-AAD, e quindi analizzate al FACS per valutare le percentuali delle cellule bersaglio morte. Come riportato in fig. 8A, sono state rilevate in modo statisticamente significativo più cellule bersaglio morte utilizzando i linfociti T CD8<+ >attivati da cellule MCF-7 ingegnerizzate con CD80/CD86 rispetto a quelli provenienti da co-colture attivate con cellule tumorali parentali. Al contrario, sono state notate solo differenze lievi e statisticamente non significative quando state utilizzate come bersaglio cellule tumorali umane HLA-scorrelate.

Utilizzando questi test di citotossicità, gli inventori dimostrano una caratteristica funzionale decisiva dei linfociti T CD8+ tumorali specifici già identificata attraverso i saggi CD107a, trogocitosi ed Elispot: la capacità di uccidere specificamente le cellule tumorali che, attraverso l’attivazione, li avevano precedentemente generati. La Figura 8A mostra i dati originali da uno degli esperimenti prodotti. L'insieme dei risultati ottenuti da esperimenti replicati è stato calcolato e riportato nella Figura 8B, dove è stata eseguita anche l'analisi statistica e confermato la significatività delle differenze osservate.

L'uso di cellule “HLA-scorrelate” come cellule bersaglio confermano la specificità d'azione dei CTL antitumorali indotti.

Questi risultati dimostrano che i linfociti T CD8<+ >attivati da cellule tumorali ingegnerizzate con CD80/CD86 possono distruggere le cellule tumorali da cui sono stati educati.

Discussione

Tradizionalmente, le strategie di vaccinazione contro il cancro sono state concepite per bersagliare i TAA precedentemente identificati [28]. Tuttavia, anche nei casi più favorevoli in cui il TAA è espresso esclusivamente dalle cellule tumorali, focalizzare l'attacco immunitario su un singolo bersaglio molecolare può facilmente portare all’evasione immunitaria attraverso il ben descritto meccanismo di “immunoediting” del cancro sintetizzato dalle "tre E", cioè, eliminazione, equilibrio e evasione [29]. Quindi, la progettazione di immunogeni contro più bersagli specifici è altamente auspicabile. In questo contesto, i neo-antigeni tumorali rappresentano bersagli di elezione per i vaccini terapeutici contro il cancro.

Il razionale della strategia proposta dagli inventori si basa sul presupposto che le cellule tumorali possano essere considerate la fabbrica più efficiente, accurata e aggiornata dei peptidi derivati da neo-antigeni mostrati spontaneamente dal complesso MHC di classe I. Dotare le cellule tumorali con funzioni APC offre la possibilità al sistema immunitario di riconoscere nuovi neoantigeni emergenti nel tempo come risultato dell'instabilità delle cellule tumorali. In questo modo, il sistema immunitario viene educato senza la necessità di identificare neo-epitopi, selezionare i peptidi mutati per l’associazione agli MHC, e produrre peptidi o RNA trascritto in vitro per l'immunizzazione, come avviene nelle strategie più avanzate di vaccinazione antitumorale personalizzata.

Al completamento dell’attivazione di colture, gli inventori hanno effettuato l'analisi delle diverse sottopopolazioni funzionali dei linfociti T CD4<+ >e CD8<+ >attivati dalle cellule tumorali parentali e cellule tumorali ingegnerizzate senza rivelare importanti variazioni quantitative. Quindi, l'espressione di molecole co-stimolatorie sulla membrana plasmatica delle APC derivate dai tumori non ha portato ad evidenti alterazioni dell'equilibrio omeostatico tra le diverse sottopopolazioni linfocitarie funzionali. L'unica variazione osservata dagli inventori riguardava la vitalità complessiva dei linfociti ricavati, che appariva riproducibilmente più alta nei PBL attivati da cellule esprimenti CD80/CD86 rispetto a quelli attivati dalle parentali. Questo evento è stato probabilmente la conseguenza di livelli più elevati di priming/attivazione cellulare, come indicato dall'aumento riproducibile dell'espressione di CD25 specialmente nei linfociti T CD8<+>.

Più importante, gli inventori hanno dimostrato che attivare PBL con cellule tumorali esprimenti CD80/CD86 può portare alla generazione di linfociti T CD8<+ >che riconoscono e distruggono specificamente le cellule tumorali. Questa conclusione è stata tratta osservando il forte aumento dell'espressione di CD107a sulla membrana plasmatica di linfociti T CD8<+ >attivati da cellule tumorali ingegnerizzate, così come i risultati ottenuti da entrambi i saggi di trogocitosi e di IFN- γ Elispot. Infine, i risultati dei saggi CTL hanno confermato chiaramente la generazione di CTL che uccidono specificamente le cellule bersaglio tumorali.

La strategia degli inventori implicherebbe la veicolazione del RV esprimente CD80/CD86 all'interno del microambiente dei tumori solidi. Si prevede che l'attivazione immunitaria antitumorale si verifichi anche ingegnerizzando una piccola parte delle cellule tumorali attraverso la veicolazione del RV esprimente CD80/CD86. La veicolazione intratumorale di vettori virali è una tecnica ben consolidata sia in ambito pre-clinico che clinico [30]. Si prevede che l'RV, dopo l'iniezione, bersagli preferibilmente le cellule tumorali in virtù della sua tendenza spontanea ad integrarsi solo nelle cellule che replicano attivamente [31]. La possibile diffusione del RV al di fuori dei distretti tumorali può essere fortemente limitata utilizzando soluzioni viscose come veicolo [32]. Inoltre, da un punto di vista della sicurezza, la possibilità che l'ingegnerizzazione mediata da RV porti a un danno genetico stabile e trasmissibile è alquanto improbabile dal momento che si prevede che la risposta immunitaria antitumorale uccida le cellule tumorali ingegnerizzate precedentemente utilizzate come APC.

LISTA DI SEQUENZE

<110> Istituto Superiore di Sanità

<120> Cellule tumorali ingegnerizzate e usi di esse

<130> A140543

<160> 7

<170> Version PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 2362

<212> DNA

<213> Sequenza Artificiale

<220>

<223> SINTETICA

<400> 1

atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt 60 cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtgttatcca cgtgaccaag 120 gaagtgaaag aagtggcaac gctgtcctgt ggtcacaatg tttctgttga agagctggca 180 caaactcgca tctactggca aaaggagaag aaaatggtgc tgactatgat gtctggggac 240 atgaatatat ggcccgagta caagaaccgg accatctttg atatcactaa taacctctcc 300 attgtgatcc tggctctgcg cccatctgac gagggcacat acgagtgtgt tgttctgaag 360 tatgaaaaag acgctttcaa gcgggaacac ctggctgaag tgacgttatc agtcaaagct 420 gacttcccta cacctagtat atctgacttt gaaattccaa cttctaatat tagaaggata 480 atttgctcaa cctctggagg ttttccagag cctcacctct cctggttgga aaatggagaa 540 gaattaaatg ccatcaacac aacagtttcc caagatcctg aaactgagct ctatgctgtt 600 agcagcaaac tggatttcaa tatgacaacc aaccacagct tcatgtgtct catcaagtat 660 ggacatttaa gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcaaga gcattttcct 720 gataacctgc tcccatcctg ggccattacc ttaatctcag taaatggaat ttttgtgata 780 tgctgcctga cctactgctt tgccccaaga tgcagagaga gaaggaggaa tgagagattg 840 agaagggaaa gtgtacgccc tgtataacag tgtccgcaga agcaaggggc tgaaaagatc 900 tgaaggtccc acctccattt gcaattgacc tcttctggga acttcctcag atggacaaga 960 ttaccccacc ttgcccttta cgtatctgct cttaggtgct tcttcacttc agttgctttg 1020 caggaagtgt ctagaggaat atggtgggca cagaagtagc tctggtgacc ttgatcaagg 1080 tgttttgaaa tgcagaattc ttgagttctg gaagggactt tagagaatac cagtgttatt 1140 aatgacaaag gcactgaggc ccagggaggt gacccgaatt ataaaggcca gcgccagaac 1200 ccagatttcc taactctggt gctctttccc tttatcagtt tgactgtggc ctgttaactg 1260 gtatatacat atatatgtca ggcaaagtgc tgctggaagt agaatttgtc caataacagg 1320 tcaacttcag agactatctg atttcctaat gtcagagtag aagattttat gctgctgttt 1380 acaaaagccc aatgtaatgc ataggaagta tggcatgaac atctttagga gactaatgga 1440 aatattattg gtgtttaccc agtattccat ttttttcatt gtgttctcta ttgctgctct 1500 ctcactcccc catgaggtac agcagaaagg agaactatcc aaaactaatt tcctctgaca 1560 tgtaagacga atgatttagg tacgtcaaag cagtagtcaa ggaggaaagg gatagtccaa 1620 agacttaact ggttcatatt ggactgataa tctctttaaa tggctttatg ctagtttgac 1680 ctcatttgta aaatatttat gagaaagttc tcatttaaaa tgagatcgtt gtttacagtg 1740 tatgtactaa gcagtaagct atcttcaaat gtctaaggta gtaactttcc atagggcctc 1800 cttagatccc taagatggct ttttctcctt ggtatttctg ggtctttctg acatcagcag 1860 agaactggaa agacatagcc aactgctgtt catgttactc atgactcctt tctctaaaac 1920 tgccttccac aattcactag accagaagtg gacgcaactt aagctgggat aatcacatta 1980 tcatctgaaa atctggagtt gaacagcaaa agaagacaac atttctcaaa tgcacatctc 2040 atggcagcta agccacatgg ctgggattta aagcctttag agccagccca tggctttagc 2100 tacctcacta tgctgcttca caaaccttgc tcctgtgtaa aactatattc tcagtgtagg 2160 gcagagaggt ctaacaccaa cataaggtac tagcagtgtt tcccgtattg acaggaatac 2220 ttaactcaat aattcttttc ttttccattt agtaacagtt gtgatgacta tgtttctatt 2280 ctaagtaatt cctgtattct acagcagata ctttgtcagc aatactaagg gaagaaacaa 2340 agttgaaccg tttctttaat aa 2362

<210> 2

<211> 288

<212> PRT

<213> Sequenza Artificiale

<220>

<223> SINTETICA

<400> 2

Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr 1 5 10 15

Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys 20 25 30

Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu 35 40 45

Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile 50 55 60

Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp 65 70 75 80

Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr

85 90 95

Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly 100 105 110

Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg 115 120 125

Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr 130 135 140

Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile 145 150 155 160

Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu

165 170 175

Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp 180 185 190 Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met 195 200 205

Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg

210 215 220

Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro

225 230 235 240

Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly

245 250 255

Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg

260 265 270

Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val

275 280 285

<210> 3

<211> 972

<212> DNA

<213> Sequenza Artificiale

<220>

<223> SINTETICA

<400> 3

atgggactga gtaacattct ctttgtgatg gccttcctgc tctctggtgc tgctcctctg 60 aagattcaag cttatttcaa tgagactgca gacctgccat gccaatttgc aaactctcaa 120 aaccaaagcc tgagtgagct agtagtattt tggcaggacc aggaaaactt ggttctgaat 180 gaggtatact taggcaaaga gaaatttgac agtgttcatt ccaagtatat gggccgcaca 240 agttttgatt cggacagttg gaccctgaga cttcacaatc ttcagatcaa ggacaagggc 300 ttgtatcaat gtatcatcca tcacaaaaag cccacaggaa tgattcgcat ccaccagatg 360 aattctgaac tgtcagtgct tgctaacttc agtcaacctg aaatagtacc aatttctaat 420 ataacagaaa atgtgtacat aaatttgacc tgctcatcta tacacggtta cccagaacct 480 aagaagatga gtgttttgct aagaaccaag aattcaacta tcgagtatga tggtattatg 540 cagaaatctc aagataatgt cacagaactg tacgacgttt ccatcagctt gtctgtttca 600 ttccctgatg ttacgagcaa tatgaccatc ttctgtattc tggaaactga caagacgcgg 660 cttttatctt cacctttctc tatagagctt gaggaccctc agcctccccc agaccacatt 720 ccttggatta cagctgtact tccaacagtt attatatgtg tgatggtttt ctgtctaatt 780 ctatggaaat ggaagaagaa gaagcggcct cgcaactctt ataaatgtgg aaccaacaca 840 atggagaggg aagagagtga acagaccaag aaaagagaaa aaatccatat acctgaaaga 900 tctgatgaag cccagcgtgt ttttaaaagt tcgaagacat cttcatgcga caaaagtgat 960 acatgttttt aa 972

<210> 4

<211> 323

<212> PRT

<213> Sequenza Artificiale

<220>

<223> SINTETICA

<400> 4

Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met Ala Phe Leu Leu Ser Gly

1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr

65 70 75 80

Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile

85 90 95

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100 105 110

Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala 115 120 125

Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn 130 135 140

Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu Pro 145 150 155 160

Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu Tyr

165 170 175

Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp 180 185 190

Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met 195 200 205

Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser Ser 210 215 220

Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His Ile 225 230 235 240

Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val Ile Ile Cys Val Met Val

245 250 255

Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp Lys Lys Lys Lys Arg Pro Arg Asn 260 265 270

Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu Arg Glu Glu Ser Glu Gln 275 280 285

Thr Lys Lys Arg Glu Lys Ile His Ile Pro Glu Arg Ser Asp Glu Ala 290 295 300

Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys Thr Ser Ser Cys Asp Lys Ser Asp 305 310 315 320 Thr Cys Phe

<210> 5

<211> 6363

<212> DNA

<213> Sequenza Artificiale

<220>

<223> SINTETICA

<400> 5

gagcttggcc cattgcatac gttgtatcca tatcataata tgtacattta tattggctca 60 tgtccaacat taccgccatg ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt 120 acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 180 ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 240 cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 300 actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 360 aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 420 acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag 480 tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt 540 gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac 600 aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc 660 agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc 720 catagaagac accgggaccg atccagcctc cggtcgaccg atcctgagaa cttcagggtg 780 agtttgggga cccttgattg ttctttcttt ttcgctattg taaaattcat gttatatgga 840 gggggcaaag ttttcagggt gttgtttaga atgggaagat gtcccttgta tcaccatgga 900 ccctcatgat aattttgttt ctttcacttt ctactctgtt gacaaccatt gtctcctctt 960 attttctttt cattttctgt aactttttcg ttaaacttta gcttgcattt gtaacgaatt 1020 tttaaattca cttttgttta tttgtcagat tgtaagtact ttctctaatc actttttttt 1080 caaggcaatc agggtatatt atattgtact tcagcacagt tttagagaac aattgttata 1140 attaaatgat aaggtagaat atttctgcat ataaattctg gctggcgtgg aaatattctt 1200 attggtagaa acaactacac cctggtcatc atcctgcctt tctctttatg gttacaatga 1260 tatacactgt ttgagatgag gataaaatac tctgagtcca aaccgggccc ctctgctaac 1320 catgttcatg ccttcttctc tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt tgttgtgctg 1380 tctcatcatt ttggcaaaga attcctcgac ggatccgcca tgaagtgcct tttgtactta 1440 gcctttttat tcattggggt gaattgcaag ttcaccatag tttttccaca caaccaaaaa 1500 ggaaactgga aaaatgttcc ttctaattac cattattgcc cgtcaagctc agatttaaat 1560 tggcataatg acttaatagg cacagcctta caagtcaaaa tgcccaagag tcacaaggct 1620 attcaagcag acggttggat gtgtcatgct tccaaatggg tcactacttg tgatttccgc 1680 tggtatggac cgaagtatat aacacattcc atccgatcct tcactccatc tgtagaacaa 1740 tgcaaggaaa gcattgaaca aacgaaacaa ggaacttggc tgaatccagg cttccctcct 1800 caaagttgtg gatatgcaac tgtgacggat gccgaagcag tgattgtcca ggtgactcct 1860 caccatgtgc tggttgatga atacacagga gaatgggttg attcacagtt catcaacgga 1920 aaatgcagca attacatatg ccccactgtc cataactcta caacctggca ttctgactat 1980 aaggtcaaag ggctatgtga ttctaacctc atttccatgg acatcacctt cttctcagag 2040 gacggagagc tatcatccct gggaaaggag ggcacagggt tcagaagtaa ctactttgct 2100 tatgaaactg gaggcaaggc ctgcaaaatg caatactgca agcattgggg agtcagactc 2160 ccatcaggtg tctggttcga gatggctgat aaggatctct ttgctgcagc cagattccct 2220 gaatgcccag aagggtcaag tatctctgct ccatctcaga cctcagtgga tgtaagtcta 2280 attcaggacg ttgagaggat cttggattat tccctctgcc aagaaacctg gagcaaaatc 2340 agagcgggtc ttccaatctc tccagtggat ctcagctatc ttgctcctaa aaacccagga 2400 accggtcctg ctttcaccat aatcaatggt accctaaaat actttgagac cagatacatc 2460 agagtcgata ttgctgctcc aatcctctca agaatggtcg gaatgatcag tggaactacc 2520 acagaaaggg aactgtggga tgactgggca ccatatgaag acgtggaaat tggacccaat 2580 ggagttctga ggaccagttc aggatataag tttcctttat acatgattgg acatggtatg 2640 ttggactccg atcttcatct tagctcaaag gctcaggtgt tcgaacatcc tcacattcaa 2700 gacgctgctt cgcaacttcc tgatgatgag agtttatttt ttggtgatac tgggctatcc 2760 aaaaatccaa tcgagcttgt agaaggttgg ttcagtagtt ggaaaagctc tattgcctct 2820 tttttcttta tcatagggtt aatcattgga ctattcttgg ttctccgagt tggtatccat 2880 ctttgcatta aattaaagca caccaagaaa agacagattt atacagacat agagatgaac 2940 cgacttggaa agtgataagg atccgtcgag gaattcactc ctcaggtgca ggctgcctat 3000 cagaaggtgg tggctggtgt ggccaatgcc ctggctcaca aataccactg agatcttttt 3060 ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac ttctggctaa 3120 taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga 3180 aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt ttagagtttg 3240 gcaacatatg cccatatgct ggctgccatg aacaaaggtt ggctataaag aggtcatcag 3300 tatatgaaac agccccctgc tgtccattcc ttattccata gaaaagcctt gacttgaggt 3360 tagatttttt ttatattttg ttttgtgtta tttttttctt taacatccct aaaattttcc 3420 ttacatgttt tactagccag atttttcctc ctctcctgac tactcccagt catagctgtc 3480 cctcttctct tatggagatc cctcgacgga tcggccgcaa ttcgtaatca tgtcatagct 3540 gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 3600 aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc 3660 actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 3720 cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 3780 gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 3840 atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 3900 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 3960 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 4020 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 4080 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 4140 taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 4200 cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 4260 acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 4320 aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 4380 atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 4440 atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 4500 gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 4560 gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 4620 ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 4680 ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt 4740 tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 4800 accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt 4860 atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 4920 cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 4980 tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 5040 tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 5100 gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 5160 agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 5220 aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 5280 gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac 5340 tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 5400 gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 5460 tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 5520 aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 5580 catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 5640 acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctaaattgt aagcgttaat 5700 attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc 5760 gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt 5820 ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa 5880 accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg 5940 tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga 6000 cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct 6060 agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat 6120 gcgccgctac agggcgcgtc ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 6180 tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 6240 ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgag 6300 cgcgcgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc accgcggtgg cggccgctct 6360 aga 6363

<210> 6

<211> 511

<212> PRT

<213> Sequenza Artificiale

<220>

<223> SINTETICA

<400> 6

Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys

1 5 10 15

Lys Phe Thr Ile Val Phe Pro His Asn Gln Lys Gly Asn Trp Lys Asn

20 25 30

Val Pro Ser Asn Tyr His Tyr Cys Pro Ser Ser Ser Asp Leu Asn Trp

35 40 45

His Asn Asp Leu Ile Gly Thr Ala Leu Gln Val Lys Met Pro Lys Ser

50 55 60

His Lys Ala Ile Gln Ala Asp Gly Trp Met Cys His Ala Ser Lys Trp

65 70 75 80

Val Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr Ile Thr His

85 90 95

Ser Ile Arg Ser Phe Thr Pro Ser Val Glu Gln Cys Lys Glu Ser Ile

100 105 110

Glu Gln Thr Lys Gln Gly Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gln 115 120 125

Ser Cys Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala Val Ile Val Gln 130 135 140

Val Thr Pro His His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Val 145 150 155 160

Asp Ser Gln Phe Ile Asn Gly Lys Cys Ser Asn Tyr Ile Cys Pro Thr

165 170 175

Val His Asn Ser Thr Thr Trp His Ser Asp Tyr Lys Val Lys Gly Leu 180 185 190

Cys Asp Ser Asn Leu Ile Ser Met Asp Ile Thr Phe Phe Ser Glu Asp 195 200 205

Gly Glu Leu Ser Ser Leu Gly Lys Glu Gly Thr Gly Phe Arg Ser Asn 210 215 220

Tyr Phe Ala Tyr Glu Thr Gly Gly Lys Ala Cys Lys Met Gln Tyr Cys 225 230 235 240

Lys His Trp Gly Val Arg Leu Pro Ser Gly Val Trp Phe Glu Met Ala

245 250 255

Asp Lys Asp Leu Phe Ala Ala Ala Arg Phe Pro Glu Cys Pro Glu Gly 260 265 270

Ser Ser Ile Ser Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Asp Val Ser Leu Ile 275 280 285

Gln Asp Val Glu Arg Ile Leu Asp Tyr Ser Leu Cys Gln Glu Thr Trp 290 295 300

Ser Lys Ile Arg Ala Gly Leu Pro Ile Ser Pro Val Asp Leu Ser Tyr 305 310 315 320 Leu Ala Pro Lys Asn Pro Gly Thr Gly Pro Ala Phe Thr Ile Ile Asn

325 330 335

Gly Thr Leu Lys Tyr Phe Glu Thr Arg Tyr Ile Arg Val Asp Ile Ala 340 345 350

Ala Pro Ile Leu Ser Arg Met Val Gly Met Ile Ser Gly Thr Thr Thr 355 360 365

Glu Arg Glu Leu Trp Asp Asp Trp Ala Pro Tyr Glu Asp Val Glu Ile 370 375 380

Gly Pro Asn Gly Val Leu Arg Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Phe Pro Leu 385 390 395 400

Tyr Met Ile Gly His Gly Met Leu Asp Ser Asp Leu His Leu Ser Ser

405 410 415

Lys Ala Gln Val Phe Glu His Pro His Ile Gln Asp Ala Ala Ser Gln 420 425 430

Leu Pro Asp Asp Glu Ser Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys 435 440 445

Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser 450 455 460

Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu 465 470 475 480

Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys

485 490 495

Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys 500 505 510

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> Sequenza Artificiale

<223> SINTETICA

<400> 7

Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5

Fig. 1 (2/2)

Claims (18)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per ottenere un linfocita T citotossico specifico per il tumore comprendente contattare una cellula tumorale umana ingegnerizzata che esprime CD80 e CD86 con un linfocita T.
2. 2. Il metodo della rivendicazione 1 in cui il linfocita T citotossico specifico per il tumore è un linfocita T CD8+, un linfocita T CD4+ o un linfocita CD8-/CD25+ o esprime fortemente CD107a.
3. 3. Il metodo della rivendicazione 1 o 2 in cui il linfocita T citotossico specifico per il tumore riconosce specificamente un antigene associato al tumore e/o riconosce e uccide specificamente cellule tumorali e/o provoca una risposta immunitaria antitumorale ristretta a MHC di classe I.
4. 4. Il metodo di una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni in cui CD80 e CD86 sono espressi sulla membrana plasmatica della cellula tumorale umana.
5. 5. Il metodo di una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni in cui la cellula tumorale umana che esprime CD80 e CD86 è ingegnerizzata da almeno un vettore, preferibilmente almeno un vettore retrovirale.
6. 6. Il metodo di una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni in cui la cellula tumorale umana è una cellula di un tumore solido o ematopetico.
7. 7. Il metodo di una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni essendo eseguito in assenza di fattori solubili esogeni.
8. 8. Un linfocita T citotossico specifico per il tumore ottenibile dal metodo come definito in una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni.
9. 9. Il linfocita T citotossico specifico per il tumore secondo la rivendicazione 8 per uso medico.
10. 10. Il linfocita T citotossico specifico per il tumore secondo la rivendicazione 9 per l'uso nel trattamento e/o nella prevenzione del cancro.
11. 11. Il linfocita T citotossico specifico per il tumore secondo la rivendicazione da 8 a 10 per l'uso in un metodo per indurre una risposta immunitaria di un linfocita T CD8+ citotossico contro almeno un antigene tumorale “non-self”.
12. 12. Un metodo per indurre una risposta immunitaria di un linfocita T CD8+ citotossico contro almeno un antigene tumorale “non-self” comprendente contattare una cellula tumorale umana ingegnerizzata che esprime CD80 e CD86 con un linfocita T, preferibilmente l'antigene tumorale “non-self” è un neo-antigene.
13. 13. Un metodo per il trattamento e/o la prevenzione del cancro comprendente generare un linfocita T citotossico specifico per il tumore dal metodo di una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 o indurre una risposta immunitaria di un linfocita T CD8+ citotossico contro almeno un antigene tumorale “non-self” dal metodo della rivendicazione 8.
14. 14. Una cellula tumorale umana ingegnerizzata che esprime CD80 e CD86.
15. 15. La cellula tumorale umana ingegnerizzata secondo la rivendicazione 14 per uso medico, preferibilmente per l'uso nel trattamento e/o nella prevenzione del cancro.
16. 16. Il linfocita T citotossico specifico per il tumore secondo la rivendicazione 8 o la cellula tumorale umana ingegnerizzata secondo la rivendicazione 14 per l'uso in combinazione con un ulteriore intervento terapeutico, preferibilmente l'ulteriore intervento terapeutico è radioterapia, chemioterapia o un agente terapeutico.
17. 17. Una composizione farmaceutica comprendente il linfocita T citotossico specifico per il tumore secondo la rivendicazione 8 o la cellula tumorale umana ingegnerizzata che esprime CD80 e CD86 secondo la rivendicazione 14 e eccipienti farmaceuticamente accettabili, preferibilmente la composizione farmaceutica comprende inoltre un agente terapeutico.
18. 18. La composizione farmaceutica per l'uso nel trattamento e/o nella prevenzione del cancro.