JP5697027B2 - マウス網膜上への細胞膜傷害複合体（ｍａｃ）生成のヒト化モデル、並びに、黄斑変性の処置のための組成物とキットと方法 - Google Patents

Description

本願は、米国特許商標局に、２００８年２月１５日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６１／０６６，０６２と、２００８年２月１９日に出願されたＮｏ．６１／０６６，２８８と、２００８年３月２５日に出願されたＮｏ．６１／０７０，６５０と、の利益を請求する。これらの出願は、全て、引用することによって本書に完全に含まれる。

本発明は、国立衛生研究所ＥＹ０１４９９１，ＥＹ０１３８３７から認可されることによって、部分的に支持されている。政府は、発明について一定の権利がある。

加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を有している被験者を処置するための方法と組成物、ヒト黄斑変性（ＭＤ）をアッセイする方法、ヒトＭＤの処置薬剤の潜在力をアッセイするための方法とキット、とをここで提供する。

加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、シャープさと、中心視野と、を徐々に壊す、加齢による病気であり、高齢者の失明を引き起こすものである（下記、非特許文献１）。黄班は、網膜の中央にある特別な組織であって、目の後ろ側の感光性組織であり、光又は画像を電気インパルスへと変換するものである。

ＡＭＤは、ウェット又はドライのいずれかに分類される（Inana等による発明、下記特許文献１）。ウェットＡＭＤは、黄班下側の網膜裏側での異常血管の成長によって、特徴付けられる。これら新しい血管は、もろく、しばしば血と体液とを漏らす。血と体液とは、目の後ろで黄班を通常の位置から盛り上げ、中心視野の欠損を生じる。ウェットＡＭＤは、レーザ手術、レーザ光処置、目への注入、によって処置される。しかしながら、これらの処置は、ウェットＡＭＤを治すものではなく、むしろ、その処置は、病気の進行を遅くする、というものである。ドライＡＭＤは、病気に冒された目の中心視野が徐々にぼやけるという、黄班の感光細胞の緩やかな崩壊によって、特徴付けられる。時間と共に、黄班機能と、中心視野とは、徐々に失われていく。かなり進行した段階(advanced stage)のドライＡＭＤのための処置について知られている方法は無く、視野損失は、不可避のものである。抗酸化物質と亜鉛との特別な高用量処方は、中くらいにまで進んでいる段階のＡＭＤが、かなり進行した段階のＡＭＤへと進むことを防ぐ、ということが示されている。

Klein等による論文Ophthalmology１１４、p２５３−２６２、２００７年 米国特許Ｎｏ．７，３０９，４８７号公報

ヒト黄班変性（ＭＤ）、をアッセイ（即ち、予後診断又は診断）する方法、ＡＭＤ処置を行なう、処置薬の潜在力を確認するための、３つ以上の化学物質相互のアッセイの方法と、ＡＭＤを有している披見体を処置する方法と、の必要性がある。

発明のある観点によれば、本明細書では、被験者の加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を処置するための方法であって、網膜のＡＭＤ処置の場所に、ＣＤ５９タンパク質組成物に、被験者の網膜色素上皮（ＲＰＥ）を接触させる工程を、含んでいる方法が、与えられている。

方法の関連する実施例において、ＲＰＥ接触が、ＣＤ５９タンパク質をコードする遺伝子を伴う核酸ベクター、ＣＤ５９タンパク質、又は、裸核酸から直接発現されたＣＤ５９、のグループから選択された少なくとも１つの組成物を届けるものである。

前記何れかの方法の関連する実施例において、ベクターが、ウィルスベクター又はプラスミドであり、例えば、ウィルスベクターが、アデノウィルスと、アデノ随伴ウィルスと、ヘルピスウィルスと、レンチウィルスと、からなるグループから選択された少なくとも１つのウィルスの遺伝子組換えの行なわれた遺伝子から得られたものである。例えば、レンチウィルスがレトロウィルスである。

方法の種々の実施例において、タンパク質と核酸との送達が、静脈注射、眼内注射、筋肉注射、皮下注射、腹腔内注射、からなるグループから選択された少なくとも１つの注入経路によるものである。方法のある実施例において、黄班変性がドライである。

発明のある側面では、モデル細胞システムないでヒトＭＤの及ぶ範囲をアッセイするための方法、又は、黄班変性（ＭＤ）の予後診断又は診断のための血清補体成分をアッセイするモデル細胞システム内で行なう方法であって、第１サンプル細胞をサンプル血清に曝露し、結果として生じる溶解を測定し、そして、血清にそれほど曝露していない、換言すれば同一の第２サンプルである対照細胞に対し、溶解の及ぶ範囲を比較し、この結果、第２サンプルのものと比較された第１サンプル内の溶解の及ぶ範囲がＭＤの予後診断又は診断の尺度になっている、方法を与える。

発明のある側面では、モデル細胞システム内でヒトＭＤ用の治療薬をアッセイする方法であって、第１サンプル細胞を血清に接触し、結果として生じる溶解を測定し、第２サンプル、換言すれば、対照細胞と同一である細胞を血清とヒトＣＤ５９タンパク質のソースとに接触し、結果として生じる溶解を測定し、少なくとも１つの第３サンプル細胞を治療候補化合物、換言すれば、血清と同一のものに接触し、この結果、溶解を測定し、第１、第２サンプルの溶解の及ぶ範囲と比較された、第３サンプルの溶解の及ぶ範囲が、候補化合物による保護の基準であり、これによってヒトＭＤの処置における効果に有効な治療薬をアッセイするようになっている、方法を与える。

前記方法に関連する実施例において、更に、血清に接触する前に、細胞又は組織を、ＣＤ５９タンパク質を発現する能力のある遺伝子を有している組換えベクターに接触させることを含んでいる、方法。溶解が、プロピジウムヨウ化物の摂取と、細胞選別と、によって測定された、ものである。前記方法の関連する実施例において、細胞が肝細胞である。関連する実施例において、細胞がマウス由来である。前記方法の関連する実施例において、ＣＤ５９のソースが、ヒトである。前記方法の関連する実施例において、血清が正常なヒト血清である。代わりに、血清が罹患被験者からのものであり、例えば、罹患被験者がＭＤを有している。

発明のある観点では、黄班変性の存在又は進行を診断又は予後診断する方法であって、網膜上の細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）沈着又は網膜の及ぶ範囲を測定する工程を備えているものが、与えられる。発明の関連する実施例において、ＭＡＣ沈着の及ぶ範囲の測定が、ヒトＭＡＣに対して特異的な抗体によって免疫組織化学によって解析される。

発明のある観点では、黄班変性を処置するための医薬組成物であって、ＣＤ５９タンパク質、又は、インビボのＣＤ５９タンパク質の発現のソース、を備えており、前記組成物が、黄班変性処置への効率の良い投与に関し、眼への送達のために処方されている、医薬組成物が与えられる。組成物の種々の関連する実施例において、ＣＤ５９タンパク質又はＣＤ５９タンパク質の発現のソースが、ＣＤ５９タンパク質をコードする遺伝子を備えている核酸ベクター、ＣＤ５９タンパク質をコードする遺伝子を備えているウィルスベクター、ＣＤ５９タンパク質、のグループから少なくとも１つ選択されたものである。

組成物の関連する実施例において、眼への送達のために処方された組成物が、注射、点眼、軟膏からなるグループから少なくとも１つ選択されたものである。組成物の関連する実施例において、注射が、眼内注射、結膜下注射、テノン嚢下注射からなるグループから少なくとも１つ選択されたものである。関連する実施例において、組成物が、更に、抗癌、抗ウィルス、抗バクテリア、抗マイコバクテリア、抗真菌、抗増殖性、抗アポトーシスからなるグループから少なくとも１つの選択された薬剤である。関連する実施例において、ＣＤ５９タンパク質が溶解性タンパク質として、発現されたものである。関連する実施例において、ＣＤ５９タンパク質がグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定領域をコードする欠損を含んでいる。

発明のある観点では、眼組織又は細胞上のＭＡＣ沈着をアッセイし、沈着を阻害する薬を選ぶ（スクリーニングする）ためのキットであって、抗ＭＡＣ抗体、容器、正常なヒト血清を用いるための使用説明書を備えているキットを、与える。関連する実施例において、キットが、更に抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体、及び、又は正常なヒト血清を備えている。他の関連する実施例において、キットが、更に、正の対照として、ＣＤ５９タンパク質を備えており、ＣＤ５９タンパク質が、溶解性の形態、又は、膜結合型の形態のものであり、後者は、例では、リポソームに組み込まれた調製物である。他の関連するキットの実施例において、抗体、血清、ＣＤ５９タンパク質の少なくとも１つが、親液性のものである。

発明のある観点では、黄班変性（ＭＤ）の予後診断又は診断のための血清補体成分をアッセイするモデル細胞システムの方法であって、被験者からの血清に、検出可能にラベル付けされた細胞を接触させ、接触された細胞に対する、細胞外及び／又は細胞内で検出可能な薬剤の量を測定する工程と、細胞内の、細胞外及び／又は細胞内で検出可能な薬を、血清に曝露していない、換言すれば、同一の、検出可能にラベル付けされた対照細胞のものと比較する工程と、を備えており、この結果、接触された細胞内の、細胞外及び／又は細胞内で検出可能な薬剤の量が、対照細胞のものと比較し、血清に接触された細胞内の、細胞外の検出可能にラベル付けされた薬剤の量の多さが、ＭＤの予後診断又は診断の指標である、とする工程と、を含んでいる方法、を与えている。

発明のある観点では、モデル細胞システム内でヒト黄班変性（ＭＤ）における効果に有効な治療薬をアッセイする方法であって、被験者からの血清に、検出可能にラベル付けされた第１サンプル細胞を接触させ、細胞外及び／又は細胞内で検出可能な薬剤の量を測定し、換言すれば同一の検出可能にラベル付けされた第２サンプル対照細胞を、血清とヒトＣＤ５９タンパク質のソースとに接触させ、細胞外及び／又は細胞内の検出可能な薬剤の量を測定する工程と、少なくとも１つの、検出可能にラベル付けされた第３細胞を、治療候補化合物、換言すれば、血清と同一のものに接触し、細胞外及び／又は細胞内の検出可能な薬の量剤を測定し、この結果、第１サンプルと第２サンプルとの細胞外及び／又は細胞内の薬の量と比較された、第３サンプルの細胞外及び／又は細胞内の薬の量が、候補組成物によって保護される量であり、細胞外の検出可能にラベル付けされた薬の量の多さが、ＭＤの指標であり、これによって、ヒトＭＤの処置における効果に有効な治療薬をアッセイする工程と、を含んでいる方法、を与えている。

前記方法の種々の変形例において、検出可能な薬が、検出可能なタンパク質を発現する能力のある遺伝子を有している組換えベクターと、蛍光剤と、比色分析剤と、酵素剤と、放射性剤と、からなるグループから少なくとも１つ選択された組成物である。例えば、検出可能なタンパク質は、緑色蛍光タンパク質と、エクオリンと、シアン蛍光タンパク質と、ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質と、強化緑色蛍光タンパク質と、黄色蛍光タンパク質と、からなるグループから少なくとも１つ選択されたタンパク質である。他の実施例において、検出可能な薬剤が、タンパク質でないものであり、例えば、インドシアニン・グリーンと、ドキソルビシンと、リボフラビンと、クロロフィルと、ポルフィリンと、からなるグループから少なくとも１つ選択された薬剤である。他の実施例において、検出可能な薬が、例えば、βガラクトシダーゼ、又は、アルカリホスファターゼ、の酵素である。

前記方法の実施例において、細胞が、肝細胞であり、例えば、細胞は、マウス由来のものである。前記方法の実施例において、ＣＤ５９タンパク質のソースがヒトである。前記方法のある実施例において、血清が、正常なヒト血清である。代わりに、血清が、罹患被験者からのものである。一般に、被験者が、ＭＤの診断又は予後診断を必要としている。他の実施例において、ＣＤ５９タンパク質が溶解性のものである。他の実施例において、タンパク質は、膜結合型のものである。

図１Ａは、ＡｄＣＡＧＣＤ５９血清型５アデノウィルスベクターと、２つの対照アデノウィルスベクターであるＡｄＣＡＧＧＦＰとＡｄＥＭＰＴＹと、の構成を示す図である。前記ＡｄＣＡＧＣＤ５９血清型５アデノウィルスベクターは、チキン・ベータ・アクチン（ＣＡＧ）プロモーターの制御下でヒトＣＤ５９をコードしている遺伝子を含んでいる。前記ＡｄＣＡＧＧＦＰは、また、ＣＡＧプロモーターによって調節されたＧＦＰを発現するものであり、前記ＡｄＥＭＰＴＹは、負の対照ベクターである。使用されている記号でｐＡは、ポリアデニル化シグナルであり、ＣＡＧは、サイトメガロウィルス・チキン・βアクチン・βグロビン・プロモーターであり、Ψは、Ａｄパッケージシグナルであり、ＩＴＲは、アデノウィルス逆方向末端反復であり、Δは、消失であり、Ｅは、初期領域ラベルである。 図１Ｂは、ヒトＣＤ５９（頂部）への結合のため、かつ、対照タンパク質アクチン（底部）ために、モノクローナル抗体特異性を用いるウェスタンブロット法による写真であり、ＡｄＣＡＧＣＤ５９に接触した細胞の溶解物内のヒトＣＤ５９の有無を示している（マウス肝１ｃ１ｃ７細胞溶解物グループ、左チャネル内、およそ１８ｋＤでの暗帯）。ＣＤ５９シグナルは、対照ウィルスベクターに接触した細胞から、細胞溶解物内で検出されなかった（マウス肝１ｃ１ｃ７細胞溶解物グループ、中間、右チャネル）。内因性ヒトＣＤ５９は、また、胎生期網膜（９１１）細胞溶解物内で検出されなかった（９１１細胞溶解物グループ内のおよそ１８ｋＤでの淡い色の帯）。このシグナルは、ＡｄＣＡＧＣＤ５９に接触したマウス細胞からのシグナルに比べて、非常に弱かった（マウス肝１ｃ１ｃ７細胞溶解物グループ、左チャネル内、およそ１８ｋＤでの暗帯を、９１１細胞溶解物グループ内のおよそ１８ｋＤでの淡い色の帯と、比較する）。第２ウケスタンブロット法は、ハウスキーピング遺伝子βアクチンの発現のための対照であった。 図１Ｃは、（左側で）複数の細胞に接触したＡｄＣＡＧＣＤ５を示す１組の顕微鏡写真である。前記複数の細胞は、ｈＣＤ５９抗体（右に示されているＣＤ５９）に免疫染色されている。左頂部の顕微鏡写真は、２つの異なる拡大率（長さを示すバーが１００μｍのものと２０μｍのもの）で、細胞の微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）を用いて可視化されたものである。右の顕微鏡写真は、ＣＤ５９の発現と、細胞膜上の位置確認とのために、これらの細胞の面積組織化学検出を示している。全ての細胞の実質的な量又は可能性は、ＣＤ５９たんぱく質を発現するために、見出された。図１Ｃ（右側）は、左側の顕微鏡写真内のものに関係付けられている（対照ベクターＡｄＣＡＧＧＦＰに接触された）対照細胞の１組の顕微鏡写真である。これらのデータは、ＣＤ５９がそれらの細胞内で発現されていないものを示している。 図２は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターに接触された細胞内に発現されたヒトＣＤ５９の機能的活動を示している１組のグラフである。 図２Ａは、横座標が、細胞がインキュベートされている、血清（正常ヒト血清、以下、ＮＨＳ）濃度の関数であり、縦座標がベクターに接触していない対照細胞の溶解率を、示している折れ線グラフである。未処置対照細胞の溶解は、インキュベーション期間中の血清濃度の関数として観察された。最大細胞溶解によって得られた最も低い血清濃度は、１％（１／１００希釈、細胞溶解は、９６．０６％±０．８７％））である。この血清は、ここでは、次の実施例で用いられる。 図２Ｂ、Ｃ、Ｄは、横座標で示されている、（FL3-Hチャネル内に得られた）細胞のプロビジウムヨウ化物（ＰＩ）表示の範囲と、縦座標で示されている、細胞数とで、ヒト結成細胞溶解をアッセイした結果を示している細胞選別データを、印刷したものである。図２Ｂは、（非感染と示されている）未処置細胞内において、ＨＩ−ＮＨＳによって処置された細胞は、ＰＩ摂取量の低い位置へと選別されており、ＮＨＳによって処置された細胞は、ＰＩ摂取量のより大きな位置へと選別されている。 図２Ｃは、未処置細胞と同様に、選別された、ＡｄＣＡＧＧＦＰベクターに接触された細胞を示している。 図２Ｄは、ベクターＡｄＣＡＧＣＤ５９で処置された実質全ての細胞が、ＮＨＳ（ＨＩ−ＮＨＳ）で加熱不活性化によって処置されたように、同じ位置に選別されており、即ち、ＭＨＳに対する感受性が、ＡｄＡＧＣＤ５９による事前処置によって、実質又は完全に等しく減少されている。この例において、ＰＩは、非生体細胞、即ち、右側のピークによって、優先的に摂取される。ＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターに接触された細胞は、かなりの保護されており、即ち、補体媒介性細胞溶解が１２．２９％±０．１８％へと減少している。 図２Ｃは、対照ベクター（ＡｄＣＡＧＧＦＰ）に接触されたマウス細胞が、ヒト血清補体（細胞溶解は９５．２７％±０．０１％）に起因する、細胞溶解に対して影響を受けやすいものである、ことを示している。同様に、図２Ｂは、事前処置されていない、又は、ベクターに接触した、対照細胞が、ヒト補体と細胞溶解とに対して影響を受けやすいものである、ことを示している。これらのデータは、細胞が、アデノウィルスベクターに接触することよりも、むしろ、ＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターからのヒトＣＤ５９の発現に起因する。溶解から保護されている、ことを示している。 図２Ｅは、横座標が異なるグループの細胞、即ち、事前処置されていないベクターと、対照ベクターＡｄＣＡＧＧＦＰに接触された細胞と、ＡｄＣＡＧＣＤ５９に接触された細胞とで、横座標が細胞の溶解率である、棒グラフである。各棒は、細胞の異なる処置サンプルを、表している。このグラフ内のデータは、ＡｄＣＡＧＣＤ５９に接触された細胞が、かなり保護されており、補体媒介性細胞溶解が、１２．２９％±０．１８％である、ことを示している（右の棒グラフ）。対照ベクターＡｄＣＡＧＧＦＰで処置された細胞は、ヒト補体に対して影響を受けやすいものであり、細胞溶解が、９５．２７％±０．０１％である（中間位置の棒グラフ）。未処置細胞は、ヒト補体に対して影響を受けやすいものであり、また、細胞溶解が、９５％である（左側の棒グラフ）。これらのデータは、ＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターによる細胞のヒトＣＤ５９事前処置が、細胞が溶解することから保護している、ことを示している。 図２Ｆは、横軸が事前処置された細胞１つ当たりのウィルス粒子数、縦軸が機能多重度として事前処置された細胞の細胞溶解率、を示している折れ線グラフである。ＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターによって事前処置された細胞内において、細胞溶解は、多重度を増加することによって減少した。２５０ウィルス粒子（粒子／細胞）による処置は、細胞溶解を５０％以下に抑える、という結果を生じた。対照ベクターによって事前処置された細胞は、最も高い多重度であるが、完全な細胞溶解を示した。 図３Ａ、Ｂは、それぞれ、４枚の顕微鏡写真の組であって、マウス細胞が、ＮＨＳに曝露さられたときに、Ｃ５ｂ−９沈着に対して影響を受けやすい、ことを示している。 図３Ａは、１乃至１０分の間、３７度で、１０％のＮＨＳでインキュベートされ、その後、洗浄され、固定された、チャンバースライドで覆われた、ポリＤリシン上にあるマウス細胞を示している。左側の顕微鏡写真は、（１００μｍと２０μｍとの長さの格子によって示されている）異なる倍率でＤＩＣによって可視化されたものである。右側の顕微鏡写真は、（１００μｍと２０μｍの）異なる倍率で、抗ＭＡＣ抗体によって、そして、ＤＡＰＩによって、接触された細胞の結果を示している。ＤＡＰＩは、４’−６ジアミジノ−２−フェニルインドールの、化合物(compound)であり、該化合物は、二本鎖ＤＮＡを備えた蛍光錯体を形成している。これらの顕微鏡写真は、５分間のＮＨＳによる細胞のインキュベーションが、ＨＩ−ＮＨＳによってインキュベートされた対照細胞に比べて、細胞形態学上かなりの変化をもたらしている、ということを示している。ここで、（図３Ａ，左側の顕微鏡写真の）細胞は、（図３Ｂ左側の顕微鏡写真の）ＨＩ−ＮＨＳによって処置された細胞に比べて、拡張細胞質突起を失い、丸くなり、粒状物になっている。Ｃ５ｂ−９化合物上のネオエピトープを対象とする、モノクローナル抗体を用いる免疫組織化学的解析は、（図３Ｂの）ＨＩ−ＮＨＳによって処置された対照細胞に比べ、これらの細胞上のＭＡＣの沈着を確認する、（図３Ａの）ＮＨＳによって処置された細胞の境界で、より広範囲にわたる細胞膜染色を示した。 図３Ｂは、ＨＩ−ＮＨＳを用いる点を除いて、図３Ａのものと同様の実験結果を示している。データは、細胞が形態変化しないこと、即ち、ＨＩ−ＮＨＳは、ＮＨＳのような細胞に対する、幾つかの悪影響を有さない、ということを示している。 図３Ｃは、ＤＩＣによって撮られた１組の顕微鏡写真である。左側の顕微鏡写真は、細胞をＮＨＳに接触し、その後、トリパンブルーによって染色したものを示しており、右側の顕微鏡写真は、細胞をＨＩ−ＮＨＳに接触し、その後、トリパンブルーによって染色したものを示している。ＮＨＳ処置細胞の実質的な溶解数は、（左側の）トリパンブルー染色によって測定されたものと認められる。（右側の）正常な細胞形態であって、トリパンブルーを摂取していない細胞によって示されるように、実質的に溶解されていないことが、（右側の）ＨＩ−ＮＨＳ接触細胞によって認められる。更に、ＮＨＳに曝露されたこれらのものは、正常な細胞との関係において、突起を失うのに対し、ＨＩ−ＮＨＳによって処置された細胞は、正常な細胞形態を維持していた。画像は、血清試験後の各々の型のために３つの独立した実験結果を、表している。 図４Ａは、対照ベクターＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処置され、その後、３、５、７分の間とＮＨＳによってインキュベートされ、幾つかの方法によって可視化された、１組のマウス肝１ｃ１ｃ７細胞の顕微鏡写真である。上の行は、ＤＩＣによって可視化された細胞を示している。中間位置の行は、ＭＡＣ／ＤＡＰＩによってかしかされた同じ細胞を示している。下の行は、５分間のものの顕微鏡写真のハイライト部分の拡大図を示している。細胞は、５分後、そして、７分後といった、ＮＨＳインキュベーションの時間経過に伴う、正常な形態のものの溶解と消失と、の増加を示している。画像は、血清試験後の各々の型のために３つ（？２つのはず）の独立した実験結果を、表している。 図４Ｂは、図４Ａと同じ実験プロトコルによって、ＣＤ５９を発現している、ＡｄＣＡＧＣＤ５９によって事前処置された他のサンプル細胞の、１組の顕微鏡写真である。図４Ａのデータに比べ、ＣＤ５９ベクターによって事前処置された細胞は、正常な形態を保持しており、７分間のＮＨＳによるインキュベーションの後であっても、ＭＡＣ染色から保護されていた。画像は、血清実験の各タイプに対する３つの独立した実験結果を、表している。 図４Ｃは、ＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処置され、その後、トリパンブルーによって染色された細胞（左側）と、ＡｄＣＡＧＣＤ５９によって事前処置され、その後、トリパンブルーによって染色された細胞（右側）と、のＤＩＣによって撮られた、１組の顕微鏡写真である。 図４Ａ、Ｂ、Ｃは、ＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターによって、マウス肝１ｃ１ｃ７細胞を事前処置することが、ＭＡＣ沈着と溶解とから、これらの細胞を、かなり保護した、ということを示している（図４Ａ、図４Ｃ、右側の顕微鏡写真）。ＣＤ５９発現ベクターによって事前処置され、その後、５分間ＮＨＳに曝露された、細胞は、健常な形態特性を保持していた（図４Ｂ、上の行、中間位置の顕微鏡写真、下側、右の顕微鏡写真）。対照アデノウィルスベクターによって事前処置され、ＧＦＰを発現している、細胞は、５分間のＮＨＳ処置後、ＭＡＣ沈着に対して保護されていなかった（図４Ａ）。異常な形態変化は、細胞質突起の損失と、丸く、粒状の形状とを含んでいる、これらの細胞内に認められた（図４Ａ、上の行、中間位置と、下側右の顕微鏡写真）。ＭＡＣ免疫染色が、認められた（図４Ａ、中間位置の行、中心と、下部右の顕微鏡写真）。対照細胞の実質的な量の溶解が、トリパンブルー染色によって認められた（図４Ｃ、左側の顕微鏡写真）。 これらの顕微鏡写真は、更に、７分のＮＨＳ処理後、幾つかのＡｄＣＡＧＣＤ５９事前処置された細胞内で、ＭＡＣ染色の範囲が狭いことを示している（図４Ｂ、中間位置の行、右側の顕微鏡写真）。対照細胞が、７分のＮＨＳ処置の後、ＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処置された場合、ＭＡＣ染色（図４Ａ，中間位置の行、右側の顕微鏡写真）は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９によって処置された細胞内のもの（図４Ｂ、中間位置の行、右側の顕微鏡写真）に比べて、かなり強い。 図５は、細胞１つ当たりのベクターＡｄＣＡＧＣＤ５９粒子（ｖｐ／ｃｅｌｌ）であって、異なる細胞１つ当たりのベクター粒子での、５分間のＮＨＳによるものの生存率への、事前処置の細胞への影響を、２つの拡大率（距離バーを参照）で、示している１組の写真である。左側の列は、細胞が、１００ｖｐ／ｃｅｌｌ、５分のＮＨＳ処置によって処置され、４つの条件下で可視化したものである。中間位置の列は、細胞が、５００ｖｐ／ｃｅｌｌ、５分のＮＨＳ処置によって処置されたものである。右側の列は、細胞が、１０００ｖｐ／ｃｅｌｌ、５分のＮＨＳ処置によって処置されたものである。これらの顕微鏡写真は、ＭＡＣ免疫染色が、ＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターを伴うより高い多重度で事前処置された細胞内で減少された、ということを示している。より高いベクター多重度で事前処置された細胞が、更に、より高い率で正常の形態を示した。図５は、ヒトＭＡＣ沈着と、事前処置された細胞に用いられるＡｄＣＡＧＣＤ５９アデノウィルスの量と、の間の逆関数を示している。 図６は、（図中、抗ｍＥＭＭＰＲＩＮ抗体と表されている）補体活性抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体によって（＋）、又は、それによらず（−）、インキュベートされた、マウス眼杯（パネルＡ、Ｂ、Ｃ）と、一次マウスＲＰＥ細胞（パネルＤ、Ｅ）であって、その後に、図示されている分間、示されているように、ＮＨＳ又はＨＩ−ＮＨＳによって処置されたものの、１組の顕微鏡写真である。眼杯とＲＰＥ細胞とは、ヒトＭＡＣ沈着の検査を受ける。一次ＲＰＥ細胞は、ＤＡＰＩとラベル付けされている。画像は、（各状況のためｎは、４つの眼杯である）眼杯の組の各々と、一次ＲＰＥ細胞の組の各々と、について、少なくとも３つの独立した実験結果を、示している。 図６Ａは、抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体に接触し、その後、５０％ＮＨＳによって処置された、（平らな面に解剖によって開かれており、長さを示すバーが１ｍｍ）眼杯から認められた、ヒトＭＡＣ沈着免疫組織化学的データを示している。（右側の）顕微鏡写真１乃至３は、解剖によって開かれた細胞の２つの倍率（長さを示すバーが１００μｍと４００μｍ）で示すものである。広範囲に及ぶＭＡＣ免疫染色の眼杯細胞が認められ、渦巻き型で、種々のパターンの染色が現れたこれらの眼杯のＲＰＥ単分子層が、認められた。 図６Ｂは、図６Ａに示されているような、データを示しているが、しかし、ＨＩ−ＮＨＳを用いているものについて示している。広範囲に及ぶＭＡＣ免疫染色の認められた、ＮＨＳによってインキュベートされた細胞（図６Ａ）と比べて、マウス眼杯のＲＰＥ上では何のＭＡＣ免疫染色も認められなかった。 図６Ｃは、図６Ａ，Ｂに示されているような、データを示しているが、しかし、３７度で６０分、１００％のＮＨＳによってインキュベートされ、ＮＨＳ添加前に、抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体に接触されていなかったものについて示している。データは、染色が時折起きるもので、散乱しており、弱いものである、ということを示している。 図６Ｄは、次にＮＨＳによって処置される、抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体に接触された細胞のためのヒトＭＡＣ免疫化学の結果、ＤＩＣ、ＤＡＰＩによって解析された一次マウスＲＰＥ細胞を、示している。細胞は、２つの異なる倍率（長さを示すバーが３００μｍと７５μｍ）で示すものである。広範囲に及ぶＭＡＣ免疫染色が、眼杯（図６Ｂ）の認められたものと同様に、認められる。 図６Ｅは、図６Ｄに示されているような、一次マウスＲＰＥ細胞の結果を示しているが、しかし、３７度で７分、ＨＩ−ＮＨＳによってインキュベートされたものについて示している。ＮＨＳによってインキュベートされた細胞に比べて、少ない範囲に及ぶＭＡＣ免疫染色が、認められた。 図７は、適切なＣｙ３−共役二次抗体によって可視化された（図中、３番目の行にＲＰＥ６５と示されている）抗マウスＲＰＥ６５抗体を用いる二重抗体アッセイによって解析され、試された、ＲＰＥ細胞を示している１組の顕微鏡写真である。左側の列は、（一次）抗マウスＲＰＥ６５抗体によって染色された細胞の顕微鏡写真を示している。右側の列は、非一次（対照）と図示されており、一次抗ＲＰＥ６５抗体に接触していない対照細胞と、更に、二次抗体によって、処置されたものと、を示している。細胞は、それぞれ、ＤＩＣ，ＤＡＰＩによって、そして、（４番目の行に、ＲＰＥ６５／ＤＡＰＩと示されているように）ＲＰＥ６５とＤＡＰＩ染色とを重ねることによって、可視化されている。 図８は、（図８Ａの左側の列は）抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体と、４分間、５０％ＮＨＳと、をＲＰＥ細胞に接触させることによって得られたデータを示しており、（図８Ａの右側の列は）抗ＥＭＭＰＲＯＮと、７分間の５０％ＮＨＳと、をＲＰＥ細胞に接触させることによって得られたデータを示しており、（図８Ｂは）抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体と、７分間、５０％ＨＩ−ＮＨＳと、をＲＰＥ細胞に接触させることによって得られたデータを示しており、（図８Ｃは）７分間の５０％ＮＨＳをＲＰＥ細胞に接触させることによって得られたデータを示している、１組の顕微鏡写真である。一番上の列は、ＢＦによって可視化された細胞であり、二番目の列は、ＤＡＰＩによって染色された細胞であり、三番目の列は、抗ヒトＣ５ｂ−９抗体に接触した細胞であり、四番目の列は、ＤＡＰＩと、二番目と三番目の結果の抗体と、を1つにマージしたものである。 図８Ａは、（左側の列、三番目の行にあるように）抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体と、４分間の５０％ＮＨＳと、によって処置されたＲＰＥ細胞と、そして、その後、７分間のＮＨＳ処置の施されたものの、ＲＰＥ細胞上の広範囲に及ぶＭＡＣ免疫染色を示している。この図は、ＲＰＥ細胞の相当量が、（右の列、三番目の行にあるように）スライドから分離されたものを有する、ということを示している。図８Ａは、また、時折残留している高いコンフルエンス領域の細胞凝集であって、（左右の列、三番目の行にあるように）これらの領域が、ＭＡＣに対して強くポジティブなものである、ことを示している。 図８Ｂは、（三番目の行にあるように）抗ＭＡＣ抗体へと結合していない、ＨＩ−ＮＨＳ処理細胞を、示している。 図８Ｃは、７分間の５０％ＮＨＳをＲＰＥ細胞に接触させることによって得られたデータを示している。 図９は、１組の、マウス眼杯組織を示している顕微鏡写真と、マウス角膜組織の顕微鏡写真である。 図９Ａは、次に、（３７度、１５分、最終濃度５０％の）ＮＨＳの追加が行なわれる、抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体に接触した、（示されている平らな表面へと解剖した）眼杯組織を、示している。ＮＨＳに曝露された後、ＲＰＥ単分子層は、異なるＭＡＣ沈着量と、細胞損傷の種々の量と、に起因して、渦巻き型で、種々のパターンの染色が現れた。 図９Ｂは、次に、（３７度、１５分、最終濃度５０％の）ＨＩ−ＮＨＳの追加が行なわれる、抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体に接触した眼杯組織の結果を示している。ＨＩ−ＮＨＳに接触した細胞は、ＲＰＥ細胞と角膜内皮との中にＭＡＣ免疫染色の無いことを示している。 図９Ｃは、次に、（３７度、２０分、最終濃度５０％の）ＮＨＳの追加が行なわれる、抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体に接触した角膜組織の結果を示している。ＮＨＳに曝露された後、ＲＰＥ単分子層は、異なるＭＡＣ沈着量と、細胞損傷の種々の量と、に起因して、渦巻き型で、種々のパターンの染色が現れた。 図９Ｄは、ＮＨＳに接触した細胞は、ＲＰＥ細胞と角膜内皮との中にＭＡＣ免疫染色の無いことを示している。 図１０は、対照ベクターと、ｈＣＤ５９発現ベクターとの混合物によって事前処置された細胞の１組の顕微鏡写真である。 図１０Ａは、（4:1の比率で、合計１×１０^３ｖｐ／ｃｅｌｌの）ＡｄＥＭＰＴＹ＋ＡｄＣＡＧＧＦＰの混合物によって事前処置され、感染後３日で、抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体に７分間接触され、その後、洗浄し、固定された後、７分間、５０％のＮＨＳに接触された、一次マウスＲＰＥ細胞を示している。細胞は、（左側に）ＤＩＣを伴いながら、又は、（右側に）ＧＦＰ蛍光によって、認められている。 図１０Ｂは、ＡｄＣＡＧＣＤ５９＋ＡｄＣＡＧＧＦＰの混合物を除いて、図１０Ａに示されているような、事前処理された一次マウスＲＰＥ細胞を示している。ＡｄＣＡＧＧＦＰの使用は、（図１０Ａ、Ｂに矢印で示されているように）小水疱(vesicle)を明らかにした。データは、ｈＣＤ５９のアデノウィルス媒介性送達によって、ＭＡＣ関連の小水疱形成を阻止していることが示された。 図１１は、解剖された組織の１組の写真と、細胞データを解析するための、それらの組織の１組の顕微鏡写真である。 図１１Ａは、各々ＡｄＣＡＧＣＤ５９の網膜下注入によって、６日間事前処置された眼杯組織を示している。組織は、ＣＤ５９の発現のための免疫組織化学によって染色されており、ＧＦＰの組織蛍光は、直接検出される。 図１１Ｂは、対照ベクターＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処理される点を除いて、図１１Ａに示されているような、眼杯組織を示している。 図１１Ｃは、角膜組織がマウスから採取され、各々ＡｄＣＡＧＣＤ５９によって３日間、エクスビボで事前処置されたものを、示している。 図１１Ｄは、対照ベクターＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処置される点を除いて、図１１Ｃに示されているような、角膜組織を示している。 図１１Ａ乃至Ｃは、ＡｄＣＡＧＣＤ５９によって事前処理された後に、マウスＲＰＥと、角膜内皮と、によるヒトＣＤ５９の発現を、示している。ＡｄＣＡＧＣＤ５９と、ＡｄＣＡＧＧＦＰと、によって事前処理された角膜は、抗ＣＤ５９抗体によって可視化される。 図１２は、（９：１の比率で、３×１０^８ｖｐ／ｃｅｌｌの）図１２Ａに示されているように、対照ベクターＡｄＥＭＰＴＹ＋ＡｄＣＡＧＧＦＰの混合物と、図１２Ｂに示されているように、ベクターＡｄＣＡＧＣＤ５９＋ＡｄＣＡＧＧＦＰの混合物と、による注入によって事前処置された眼からのフラットマウントからの、１組の、写真、顕微鏡写真と、データの棒グラフと、である。 図１２Ｂは、ベクターＡｄＣＡＧＣＤ５９＋ＡｄＣＡＧＧＦＰの混合物による注入によって事前処置された眼からのフラットマウントからの、１組の、写真、顕微鏡写真と、データの棒グラフと、である。 細胞は、注入後６日間で、抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体に接触された後に、１５分、５０％ＮＨＳに接触されたものである。（各組の左側の）ＧＦＰは、（長さを表すバー１ｍｍの）注入部位で、蛍光を示しており、下側の顕微鏡写真は、注入部位の（長さを表すバーが４００μｍ、１００μｍの）２つの拡大図である。ＭＡＣは、抗ヒトＣ５ｂ−９抗体によるＭＡＣ染色を示しており、下側の顕微鏡写真は、注入部位の（長さを表すバーが４００μｍ、１００μｍと示されている）拡大図である。マージは、ＧＦＰとＭＡＣとの（長さを示すバーが１ｍｍの）解剖組織写真のオーバーレイである。 図１２Ａ、Ｂのデータは、対照ベクターの混合物によって事前処置された対照組織のＭＡＣ免疫染色が、相当量のものであり、対照細胞内のＭＡＣが、（図１２Ｂの）ＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰの混合物の注入を受け入れている組織内のＧＦＰ発現のエリアでのＭＡＣに比べて、比較的、かなり広範囲に及んでおり、そして強い、ということを示している。対照注入された眼杯のＧＦＰ発現エリアでのＲＰＥ細胞が、丸められた形状、正常な六角形形態の消失と、明確なセル境界の消失、によって示されるように、広範囲にわたって損傷されている（図１２Ａ、中間位置の行）ことが認められた。 図１２ＢのヒトＭＡＣの免疫組織化学は、他の眼杯に比べてヒトＣＤ５９発現に相関している、ＧＦＰ発現のエリアのＲＰＥ上で、かなり減少されていた。このエリアのＲＰＥ細胞は、明確な細胞境界と、正常な六角形の形態と、に損傷を受けていないことが認められた。 図１２Ｃは、７．５分（左側のグラフ）、又は、１５分（右側のグラフ）の何れかの血清に接触した眼杯組織を示している。血清は、ＨＩ−ＮＨＳ（白抜きの棒フラグ）、又は、ＮＨＳ（黒塗りの棒グラフ）である。４つのタイプの組織がある。非注入／アデノウィルスによって事前処置していないもので、ＨＩ−ＮＨＳに接触したもの（非注入、左から１番目の白抜きの棒グラフ）と、非注入／アデノウィルスによって事前処置されていないもので、ＮＨＳに接触したもの（非注入、左から２番目の黒塗りの棒グラフ）と、対照アデノウィルスの混合物によって注入が行なわれた組織で、ＮＨＳに接触したもの（ＥＭＰＴＹ＋ＧＦＰ、右から２番目の黒塗りの棒グラフ）と、ＡｄＣＡＧＣＤ５９＋ＡｄＣＡＧＧＦＰアデノウィルスの混合物によって注入された組織で、ＮＨＳに接触したもの（ＣＤ５９＋ＧＦＰ、右から１番目の黒塗りの棒グラフ）と、である。平均値の標準誤差^＊ｐ＜０．０１、^＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊ｐ＜０．０００１と表されているデータは、ＣＤ５９事前処置細胞がより低いレベルのＭＡＣを有している双方の処置期間を、示している。 図１２Ｄは、対照ベクター（ＡｄＥＭＰＴＹ＋ＡｄＣＡＧＧＦＰ）の混合物が注入され、抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体によって処置され、次に、注入後、６日間経過後に、３７度、１５分間、５０％ＮＨＳによって処置された、一次ＲＰＥ細胞の１組の顕微鏡写真である。画像は、３つの独立した結果の表示である。 図１２Ｅは、図１２Ｄに示したように、一次ＲＰＥ細胞を示しているが、しかし、（ＡｄＣＡＧＣＤ５９＋ＡｄＣＡＧＧＦＰ）ｈＣＤ５９発現ベクターの混合物が注入されたものについて示している。かなり少ないＭＡＣ沈着が、図１２Ｄ内の同等の細胞に比して認められた。 図１３Ａは、縦座標が、ＭＡＣ蛍光強度によるＧＦＰ発現のエリアでのＭＡＣ免疫蛍光の定量化であり、横座標が、ＲＰＥ細胞が事前処置される注入物質の性質である、ものを示している。ＮＨＳに接触した対照細胞は、５０００乃至１５０００の間で、中央値が約１００００の、ＭＡＣ蛍光強度を有している。対象的に、ＨＩ−ＮＨＳに接触した対照細胞は、２５００以下のＭＡＣ傾向強度を有していた。ＡｄＥＭＰＴＹとＡｄＣＡＧＧＦＰとの混合物によって事前処置されたＲＰＥ細胞は、６０００乃至１００００の間で、中央値が約９０００の、ＭＡＣ蛍光強度を有している。ＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰとの混合物によって事前処置され、そして、ＮＨＳに接触した、ＲＰＥ細胞は、２０００乃至１１０００の間で、１つの中心から離れた点に起因して、中央値が５０００以下の、ＭＡＣ蛍光強度を有している。このデータは、対照注入した眼杯組織（ｎ＝１０）のものとの比較において、ＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰの注入された眼杯組織（ｎ＝１０）についてのＭＡＣ蛍光強度の平均値で約５５％の総数減少を示しており、これは、統計的に有意なものである（ｐ＝０．００１４、図１３Ａ）。 図１３Ｂは、（縦座標が）注入位置の蛍光強度の定量化であり、（横座標が）個々の眼杯組織である、折れ線グラフである。ＧＦＰ発現エリアでの、ＧＦＰ蛍光とＭＡＣ免疫蛍光との強度は、（ＡｄＥＭＰＴＹ＋ＡｄＣＡＧＧＦＰ、左側の）対照ベクターの混合物、又は、（ＡｄＣＡＧＣＤ５９＋ＡｄＣＡＧＧＦＰ、右側）ｈＣＤ５９発現ベクターの注入された眼の眼杯についてのものを示している。血清処置の長さが、示されている。データ点は、左から右へとかけて、ＧＦＰ蛍光強度が増加する順に並べられている、１つの眼杯からのＧＦＰ又はＭＡＣ蛍光強度である。折れ線は、各組のデータの平均値である。ＮＨＳに接触した、ＡｄＣＡＧＣＤ５９＋ＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処置された眼杯上のＧＦＰとＭＡＣとの蛍光強度の間に、反比例が認められた。記号Ｎ．Ｓ．は、相異が、統計的に有意なものでないことを表している。 図１４は、（図１４Ａが）ＡｃＥＭＰＴＹとＡｄＣＡＧＧＦＰとの対照混合物、又は、（図１４Ｂが）ＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰとの混合物、によって事前処置されたＲＰＥ細胞の免疫化学データを示している、１組の写真、顕微鏡写真である。 示されたアデノウィルス混合物によって感染後６日で、細胞は、第１一次ヤギ抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体に接触され、その後、第１二次Ｃｙ３共役ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体に接触された。ＧＦＰは、注入位置の蛍光強度であり、注入部位で２つの倍率のものである。ＥＭＭＰＲＩＮは、ＥＭＭＰＲＩＮ免疫蛍光を示しており、以下のものは、注入位置で２つの倍率のものである。マージは、ＧＦＰとＥＭＭＰＲＩＮとのオーバーレイである。画像は、３つの独立した実験結果を、表している。図１４Ａ、Ｂのデータは、導入遺伝子発現のエリアと、眼杯の他の部分又は注入された眼杯と、の間のＥＭＭＰＲＩＮ免疫蛍光に、実質有意な違いの無いことを示している。 図４Ｃは、ＡｄＣＡＧＧＦＰの注入によって事前処置されたＲＰＥ細胞のデータを示している。３日後、細胞は、第１一次ヤギ抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体に接触され、その後、第１二次Ｃｙ３共役ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体に接触され、洗浄され、固定され、そして、第２一次マウス抗ｈＣＤ５９抗体によってインキュベートされ、その後、第２二次Ｃｙ２共役ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体によってインキュベートされた。細胞核は、ＤＡＰＩによってラベル付けされており、ＤＩＣ、ＧＦＰ、ＥＭＭＰＲＩＮによって可視化されている。画像は、３つの独立した実験結果を、表しているものである。 図１４Ｄは、ＡｄＣＡＧＣＤ５９と、上述したような免疫化学と、である点を除いて、図１４Ｃに示したような、注入によって事前処置されたＲＰＥ細胞の結果を示している。図１４Ｃ、Ｄのデータは、ｈＣＤ５９の発現に起因して、（ＧＦＰとの比較において）ＥＭＭＰＲＩＮ内に有意な違いが無いことが認められることを、示している。 図１５は、ＥＭＭＰＲＩＮ免疫染色前、（横座標に示すような）ベクターによって事前処置されたＲＰＥ細胞によるＥＭＭＰＲＩＮ免疫蛍光（縦座標）を示している棒グラフである。示されているＲＰＥ細胞は、対照であるが、事前処置されていないもの（左側の棒グラフ）と、対照ベクターの混合物によって事前処置されたもの（ＥＭＰＴＹ＋ＡｄＣＡＧＧＦＰ、中間位置の棒グラフ）と、ｈＣＤ５９発現ベクターとＧＦＰとの混合物によって事前処置されたもの（ＣＤ５９＋ＧＦＰ、右側の棒グラフ）と、である。各グループのために、３つの眼杯から（４０×対物レンズによって得られた）１２枚の画像が定量化されている。グラフは、図１４Ａ、Ｂに示されている実験結果から得られたデータを含んでいる。データは、平均値±標準誤差として表されている。データは、事前処置によってＥＭＭＰＲＩＮ染色上に何の効果も無いことを、示している。 図１６は、事前処置後３日の、一次マウスＲＰＥ細胞の１組の写真である。ＲＰＥ細胞は、ＡｄＣＡＧＧＦＰ（左側列）又は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９（右側列）によって事前処置されている。ＡｄＣＡＧＧＦＰ（ＢＦ写真、左側列）によって事前処置されたＲＰＥ細胞の色素沈着は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９（ＢＦ写真、右側列）によって事前処置された細胞の色素沈着と、同様のものであることが認められた。ＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処置され、ＤＡＰＩによって染色された、ＲＰＥ細胞（ＤＡＰＩ写真、左側列）は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９によって事前処置され、ＤＡＰＩによって染色された、ＲＰＥ細胞（ＤＡＰＩ細胞、右側列）と比べて、同じ量の蛍光を示した。ＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処置されたＲＰＥ細胞（ＧＦＰ写真、左側列）は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９によって事前処置されたＲＰＥ細胞（ＧＦＰ写真、右側列）と比べて、かなり強く緑色の蛍光を示した。ＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処置され、その後、抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体と、ＮＨＳと、によって事前処置されたＲＰＥ細胞（ＭＡＣ写真、左側列）は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９によって事前処置され、その後、同じ抗マウスＥＭＭＰＲＩＮと、ＮＨＳ処置と、によって事前処置され、抗ヒトＭＡＣ抗体によって検出されたＲＰＥ細胞（ＭＡＣ写真、右側列）と比べて、かなり強くＭＡＣ免疫蛍光を示した。 図１７Ａは、対照ＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処置され、その後、抗マウス抗体と、ＮＨＳと、によって事前処置された角膜からのセクションを示している１組の写真である。ＭＡＣでラベル化された写真は、この角膜の内皮上の抗ＭＡＣ抗体によるＭＡＣ免疫染色を示している。ＧＦＰでラベル化された写真は、角膜内皮上のＧＦＰ蛍光を示している。ＤＡＰＩでラベル化された写真は、角膜細胞のラベル化されたＤＮＡ蛍光を示している。マージでラベル化された写真は、前の写真のオーバーレイを示している。 図１７Ｂは、ＡｄＣＡＧＣＤ５９によって事前処置され、その後、図１７Ａ内の角膜と同様に、同じ抗マウスＥＭＭＰＲＩＮと、ＮＨＳ処置と、によって事前処置された、細胞を示している。ＭＡＣとラベル付けされている写真は、この角膜の内皮上のＭＡＣ免疫染色を示している。ＧＦＰとラベル付けされている写真は、これらの細胞によってＧＦＰ蛍光が無いことを示している。ＤＡＰＩとラベル付けされている写真は、角膜細胞の標識ＤＮＡ蛍光を示している。1つに“マージ”したとラベル付けされている写真は、前の写真のオーバーレイを示している。 図１７Ｃは、対照ＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処置された細胞を示している。ＥＭＭＰＲＩＮでラベル化された写真は、これらの細胞のＥＭＭＰＲＩＮ抗体免疫染色を示している。ＧＦＰでラベル化された写真は、これらの細胞による直接のＧＦＰ蛍光を示している。ＤＡＰＩでラベル化された写真は、これらの細胞の標識ＤＮＡ蛍光を示している。マージでラベル化された写真は、前の写真のオーバーレイを示している。 図１７Ｄは、ＡｄＣＡＧＣＤ５９によって事前処置された細胞を示している、１組の写真である。ＥＭＭＰＲＩＮでラベル化された写真は、これらの細胞のＥＭＭＰＲＩＮ抗体免疫染色を示している。ＧＦＰでラベル化された写真は、これらの細胞による直接のＧＦＰ蛍光を示している。ＤＡＰＩでラベル化された写真は、これらの細胞の標識ＤＮＡ蛍光を示している。マージでラベル化された写真は、前の写真のオーバーレイを示している。 これらの写真は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９によって事前処置された角膜の角膜内皮上のＭＡＣからの保護が、ＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰとに接触した角膜の間の角膜内皮のＥＭＭＰＲＩＮ免疫染色（図１７Ｃ、ＥＭＭＰＲＩＮ写真と、図１７Ｄ、ＥＭＭＰＲＩＮ写真との比較）について何の違いも示さなかった免疫組織化学のように、ＥＭＭＰＲＩＮ発現又は抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体結合の違いに起因していない、ということを示している。これらの写真は、更に、ＡｄＣＡＧＣＤ５９によって事前処置された角膜の角膜内皮上のＭＡＣ免疫染色（図１７Ｂ、ＭＡＣ写真）が、ＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処置された角膜の角膜内皮のＭＡＣ免疫染色（図１７Ａ、ＭＡＣ写真）と比べて、かなり減少していることを示している。 図１８は、ＡｄＣＡＧＧＦＰ又はＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターがエクスビボで注入され、ＥＭＭＰＲＩＮ抗体とＮＨＳ又はＨＩ−ＮＨＳとによって、処置されているものと、処置されていないものと、についての角膜の、１組の写真と棒グラフと、である。棒グラフは、ＭＡＣとＥＭＭＰＲＩＮとの蛍光強度の各々を示している。 図１８Ａは、ベクターによって事前処置されておらず、抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体によって接触し、その後、ＮＨＳ（上側の行）又はＨＩ−ＮＨＳ（下側の行）に接触した、対照角膜内のＥＭＭＰＲＩＮを示している。これらの角膜用の、ＭＡＣ染色（原色が赤、示されていない）と、ＤＡＰＩ（原色が青）と、ＤＬＣとが、認められた。明るいＭＡＣ免疫染色が、ＮＨＳによって処置された角膜の角膜内皮に認められ、ＨＩ−ＮＨＳによって処置された角膜内皮にごく僅かの染色が認められた。 図１８Ｂは、図１８Ａと同様に、免疫組織化学解析を示すものであるが、しかし、ＡｄＣＡＧＧＦＰ又はＡｄＣＡＧＣＤ５９によって３日の間事前処置された角膜（上の行、下の行、それぞれ１．５×１０^９ｖｐ）について示すものである。ＡｄＣＡＧＧＦＰアデノウィルスによって事前処置された角膜（上側）には、ＣＤ５９発現が見られなかったが、ＡｄＣＡＧＣＤ５９アデノウィルスによって事前処置された角膜（下側）には、強いＣＤ５９が認められた。 図１８Ｃは、ＡｄＣＡＧＧＦＰ（上側）又はＡｄＣＡＧＣＤ５９（下側）アデノウィルスによって事前処置され、２５μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体と、ＮＨＳ（上側）又はＨＩ−ＮＨＳ（下側）と、によって処置された角膜を、示している。図１８Ｃの棒グラフは、（横座標で）グループの各々がアデノウィルスによって事前処置されているものと、事前処置されていないものである、４つの角膜グループからの１２セクションの角膜内皮の（縦座標で）ＭＡＣ免疫蛍光の定量化を、示している。グループは、（事前処置されていない、図中、非感染と示されている）血清に接触した対照角膜と、血清に接触する前に、ＡｄＣＡＧＧＦＰアデノウィルスによって事前処置された（ＡｄＣＡＧＧＦＰ）角膜と、血清に接触する前に、ＡｄＣＡＧＣＤ５９によって事前処置された（ＡｄＣＡＧＣＤ５９）角膜と、を含んでいる。角膜グループは、その後、ＮＨＳ（黒塗りの棒グラフ）又はＨＩ−ＮＨＳ（白抜きの棒グラフ）の何れかに曝露される。グラフは、図１８Ａ、Ｃに示したデータを含んでいる。広範囲に及ぶＭＡＣ染色が、ＡｄＣＡＧＧＦＰアデノウィルスによって事前処置され、ＮＨＳに接触した角膜に認められた。^＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｎ．Ｓ、は有意なものではない。データは、ＣＤ５９によって事前処置された角膜内のＭＡＣが、対照角膜のものと同様に低いものであることを示している。 図１８Ｄは、ＡｄＣＡＧＧＦＰ（上側）又はＡｄＣＡＧＣＤ５９（下側）アデノウィルスによって事前処置され、ヤギ抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体によってのみ処置された、角膜を示している。これらの角膜は、図１８ｐ、Ｃのように、ＮＨＳ又はＨＩ−ＮＨＳによって処置されていない。ＥＭＭＰＲＩＮ発現と、ＧＦＰ蛍光と、ＤＡＰＩとＤＩＣとの染色とは、３００μｍの倍率でこれらの角膜のために、示されている。図１８Ｄの棒グラフは、各グループがベクター（横座標）によって処置されており、又は、処置されていない、４つの角膜グループからの１２セクションの角膜内皮上のＭＡＣ免疫蛍光の定量化（縦座標）を示している。グループは、ＮＨＳに接触する前にベクターによって事前処置されていない（非感染と示されている）角膜と、ＮＨＳによって処置される前にＡｄＣＡＧＧＦＰアデノウィルスによって事前処置された角膜と、ＮＨＳによって処置される前にＡｄＣＡＧＣＤ５９アデノウィルスによって事前処置された（ＡｄＣＡＧＣＤ５９）角膜と、を含んでいる。グラフは、図１８Ｄに示されている実験結果からのデータと、図示されていないデータと、を備えている。全ての角膜セクション上の細胞核は、ＤＡＰＩでラベル化されている。全ての画像は、各グループの感染又は処置について、４つの角膜から得られたセクションを表すものである。Ｎ．Ｓ．は、有意なものではない。データは、グループの角膜のＥＭＭＰＲＩＮ量内に、有意な違いが無いことを示している。 図１９は、抗ＣＤ５９抗体によって可視化されたサンプルを伴う、示されたような種々のベクター各々によって、事前処置された細胞のウェスタンブロット法による写真である。ヒトＣＤ５９は、ＡｄＣＡＧ_ｓＣＤ５９によって以前処置された細胞からの非感染媒体のサンプル内に認められ（略１６ｋＤの暗帯、右に示されたＣＡＧ_ｓＣＤ５９からの第２チャネル）、ベクターは、グリコシル・ホスファチジル・イノシトール（ＧＰＩ）リンカーが除去された、溶解性のＣＤ５９である。ＡｄＣＡＧ_ｓＣＤ５９は、ゆえに、上記サンプル、膜結合性のもの（ＡｄＣＡＧＣＤ５９／溶解物、右側の第１チャネル）に使用されたＣＤ５９コンストラクトの溶解性、分泌型を発現するように構成されている。（６乃至１４８ＫＤａの）分子量マーカーは、左側チャネルに示されている。細胞は、（ｐと示されている）プラスミド又は（Ａｄと示されている）アデノウィルスベクターによって、事前処置された。対照は、プラスミド又はベクターの何れかによって事前処置されていない（非注入と示されている）もの、ＣＤ５９コンストラクトに結合された細胞膜によって事前処置されたもの（ＣＡＧＣＤ５９）、又は、ＧＦＰ発現構成によって事前処置されたもの（ＣＡＧＧＦＰ）、である。サンプルは、その後、１００ｋＤａフィルター又は０．２μｍフィルターによって濾過されたもの、又は、濾過されていないもの、又は、溶解物である、媒体から得られた。ＣＤ５９シグナルは、事前処置されていない細胞（左から６番目のチャネル）からの溶解物内には検出されなかった。

Ｈ要因を含む幾つかの補体調節タンパク質の多様性の解析は、過活動補体をＡＭＤの病因に関係させた(Ｈａｇｅｍａｎ等による論文、“Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ”、１０２：７２２７−７２３２、２００５年、Ｋｌｅｉｎ等による論文“Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０８：３８５−３８９、２００５年、Ｈａｉｎｅｓ等による論文、“Ｓｃｉｅｎｃｅ”、３０８：４１９−４１２、２００５年、Ｅｄｗａｒｄｓ等による論文、“Ｓｃｉｅｎｃｅ”、３０８：４２１−４２４、２００５年)。網膜下の黄色沈着である、ｄｒｕｓｅｎの免疫組織化学分析と、ＡＭＤからの網膜色素上皮（ＲＰＥ）とは、細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）を含む種々の調節タンパク質の存在を示した。しかしながら、ヒト、非ヒト補体システムの間の異種間の違いは、非ヒトシステム内のインビボでヒト補体調節タンパク質の効率を試験する能力を制限した。

試験管内、インビトロ及びインビボで、ヒトＭＡＣ沈着を測るためのヒト化マウスモデルが、ここに提供された。ここでの実施例は、ヒトＭＡＣによる攻撃から、網膜視細胞を育てている間隔神経網膜のすぐ外で色素沈着した細胞層である、マウスＲＰＥの、ヒトＣＤ５９による保護を測定するのに、このモデルを用いる。このモデルを使用することによって、外因的に送達されたヒト補体調節タンパク質ＣＤ５９の局在的な発現が、インビボでヒトＭＡＣ沈着からＲＰＥを保護することが見出された。ＣＤ５９によるＲＰＥの上記保護は、この保護がＡＭＤを防ぎ、処置できる、ということを示している。マウス網膜上でのＭＡＣ沈着のヒト化モデルは、インビボでのヒト補体タンパク質の安全で、迅速な試験を可能にするものである。

補体システムである、有機体の全体的な免疫システムの構成要素は、有機体内の病原体除去を手伝う生化学カスケードである。補体システムは、不活性チモーゲンとよばれている、血中での循環が見出された多数の低分子タンパク質を含んでいる。幾つかの誘因の１つによって刺激され、システム内のプロテアーゼは、特定のタンパク質を開裂し、サイトカインを放出し、更なる開裂のカスケード増幅を起こす。この生化学的カスケードの活性化は、ＭＡＣの活性化、即ち、病原体を殺傷する機能を、結果として生じる。

補体システムは、１組の異なるように活性化された経路へと分類される。即ち、古典的補体経路と、代替的補体経路と、マンノース結合レクチン経路とである。これらの経路は、プロテアーゼの同属の変形例、Ｃ３転換酵素を生成する。代替的経路と、マンノース結合レクチン経路とが、抗体なしにＣ３加水分解又は抗原（非特異的免疫反応）、によって活性化される一方で、古典的補体経路は、典型的には、活性化のための抗体（特異的免疫反応）を含んでいる。

これらの経路において、Ｃ３転換酵素は、成分Ｃ３を開裂し、活性化し、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂを生成し、更なる開裂と活性化事象とをカスケードする。上記活性化事象の１つは、成分Ｃ５ｂを起こすことである。Ｃ５ｂの活性化は、ＭＡＣ形式を結果として生じる、細胞膜攻撃経路を起こす。補体カスケードの細胞溶解最終生成物が、次々と、膜透過チャネルを形成し、標的細胞の浸透圧溶解を生じる。

ＭＡＣは、例えば、補体システムの活性化を結果として生じるような、侵入病原菌細胞の表面に、形成される。ＭＡＣは、標的細胞の原形細胞の外表面に結合される４つの補体システムタンパク質（Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８）の複合体であって、その後５番目のタンパク質（Ｃ９）が結合されたものである（Ｓｉｍｓ等による、米国特許第７，１６６，６５８号）。上記構成において１つに結合された補体タンパク質は、タンパク質の外面が、疎水性で、標的細胞の細胞膜の脂質二重層に結合され、内面が、親水性で、水が細胞を通ることを可能にしている。タンパク質は、細胞の膜を通るリングを作り、そして、リング構造は、膜を通るトンネルとして働き、そして、細胞を殺傷する細胞の内部環境を、迅速に崩壊する、細胞を通る分子の自由拡散を可能にする。

ＣＤ５９タンパク質
ここの実施例のデータは、ＣＤ５９が、ＭＡＣを抑制するように働き、網膜細胞の溶解を防いでいることを示している。ＣＤ５９は、ヒトの赤血球と、リンパ球と、血管内皮細胞とを含む細胞の膜に関連して見出された、膜結合糖タンパク質である。ＣＤ５９タンパク質は、ＭＡＣの機能の組み立てを抑制し、これゆえ、補体媒介活性化及び／又は溶解から細胞を保護している。

作用の任意の特定論理又は反応機構によって、制限されること無く、ここでは、細胞の原形質膜が、細胞表面タンパク質、例えば、ＣＤ５９によって、補体の効果から正常に保護される、と想定する。前記ＣＤ５９は、細胞膜Ｃ５ｂ−８に結合されるＣ９補体タンパク質上のＣ５ｂ−９ポアの活性化を防ぐものである（Ｈｏｌｇｕｉｎ等による論文“Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ”、８４、７１７、１９８９年、Ｓｉｍｓ等による論文“Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ”、２６４、１９２２８ １９２３５、１９８９年、Ｄａｖｉｅｓ等による論文“Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ”，１７０，６３７ ６５４，１９８９年、Ｒｏｌｌｉｎｓ等による論文“Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ”、１１４、３４７８ ３４８３、１９９０年、Ｈａｍｉｌｔｏｎ等による論文“Ｂｌｏｏｄ ７６”２５７２ ２５７７、１９９０年）。ＣＤ５９は、Ｃ５ｂ−８複合体のＣ８補体タンパク質に結合するように、Ｃ９補体タンパク質と競合し、それによって、Ｃ５ｂ−９細胞膜攻撃複合体の形成を減少又は防ぐ、機能を現す。ＣＤ５９は、これゆえ、終末補体ＭＡＣによって、細胞の活性化と、細胞の溶解と、の双方がされることを減少するように機能する。

成熟ヒトＣＤ５９タンパク質は、７７のアミノ酸から構成され、１８ｋＤの分子量を有している。前駆ヒトＣＤ５９タンパク質は、２１ｋＤの分子量を有している。前駆ヒトＣＤ５９と、成熟ヒトＣＤ５９と、他の哺乳類、例えば、ヒヒ、アフリカミドリザル、ヨザル、マーモセット、ＨＶＳ−１５、ブタ、ウサギ、ラット、マウスのＣＤ５９と、のアミノ酸配列は、Ｓｉｍｓ等による文献（米国特許第７，１６６，５６８号、２００７年１月２３日発行）に、示されている。

ＣＤ５９のタンパク質構成は、３つのループと、小さな４番目のらせん状ループとを伴う疎水性コアを有している、単一システインリッチ領域として特徴付けられている（Ｙｕ等による論文、“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８５（４）：７４５−７５３，１９９７年）。ジスルフィド結合システイン対は、これらのループの各々を接続している（Ｙｕ等による論文、１９９７年）。

ＣＤ５９をコードしている遺伝子の構造は、特徴付けられている（Ｆｏｄｏｒ等による米国特許第５，６２４，８３７号、１９９７年４月２９日発行）。遺伝子は、ヒトの染色体１１、特に染色体１１ｐ１３と１１ｐ１４の短腕に位置しており、（ヒト受入番号ａｎｄ１０７２７１のオンラインメンデル遺伝）、２０ｋｂに渡っている４つのエクソンから成っている（Ｐｅｔｒａｎｋａ等による論文、“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．”８９、７８７６−７８７９、１９９２年）。翻訳されていない第１エクソンは、コンセンサスＴＡＴＡ又はＣＡＡＴモチーフを欠くＧとＣにリッチなプロモーター領域によって、先行されている。第２エクソンは、タンパク質の疎水性リーダー配列をコードする。第３エクソンは、成熟したタンパク質のＮ末端部分をコードする。第４エクソンは、細胞膜へのグリコホスホイノシチド（glycophosphoinosital）なアンカー接着のために、疎水性配列を含んでいる、成熟したタンパク質の残部をコードしている。

ＭＡＣの成分を伴うＣＤ５９の物理的なつながりの解析は、ＣＤ５９のための別々の結合部位が、ヒトＣ８とヒトＣ９の各々のαチャネルの中に含まれていることを示した（Ｓｉｍｓ等による論文）。ヒトＣ９を伴うヒトＣＤ５９の相互関係のための結合部位は、成熟したヒトＣＤ５９の配列内のアミノ酸残基４２乃至５８として同定された。前記成熟したヒトＣＤ５９は、そのタンパク質のヒトアミノ酸残基３３４乃至４１８、に対応するヒトＣ９の領域に結合、より詳しくは、ヒトＣ９アミノ酸残基３５９乃至３８４、に相当する、Ｃ９の予測膜内挿入ドメインに対するＣ末端部へと、直ちに結合されている（Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｓｉｍｓ等によるＰＣＴ／ＵＳ９１／１７９４０“Ｃ９ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ”）。

活性表面は、アミノ酸残基側鎖に曝露されており、該アミノ酸残基側鎖は、Ｃ８／Ｃ９を結合するのに利用することができるものであり、公表されたＮＭＲデータとＣＤ５９分子の活性部分についての知識とからの、成熟ヒトＣＤ５９の溶液構造から同定されたものであり、前記活性部分は、４４位のヒスチジンと、４８位のアスパラギンと、４９位のアスパラギン酸と、５１位と５２位とのトレオニンと、５５位のアルギニンと、５８位のグルタミン酸と、である。ＣＤ５９のＮＭＲ構造は、Ｋｉｅｆｆｅｒ等による論文、“Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＤ５９”（細胞外領域、残基 １〜７０；ＮＭＲ、１０構造）、ＭＭＤＢ Ｉｄ：８９１、ＰＤＢ Ｉｄ：１ＥＲＨ； Ｋｉｅｆｆｅｒ等による論文、“Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＤ５９”（細胞外領域、残基 １〜７０；ＮＭＲ、抑制）、ＭＭＤＢ Ｉｄ：８９０、ＰＤＢ Ｉｄ：１ＥＲＧ； Ｆｌｅｔｃｈｅｒ等による論文、“ＣＤ５９ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ Ｗｉｔｈ Ｇｌｃｎａｃ−Ｂｅｔａ−１,４−（Ｆｕｃ−Ａｌｐｈａ−１，６）−Ｇｌｃｎａｃ−Ｂｅｔａ−１”（ＮＭＲ、１０構造）、ＭＭＤＢ Ｉｄ：４９８、ＰＤＢ Ｉｄ：１ＣＤＳ； Ｆｌｅｔｃｈｅｒ等による論文、“ＣＤ５９ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ Ｗｉｔｈ Ｇｌｃｎａｃ−Ｂｅｔａ−１，4−Ｇｌｃｎａｃ−Ｂｅｔａ−１”（ＮＭＲ、１０構造）、ＭＭＤＢ Ｉｄ：４９７、ＰＤＢ Ｉｄ：１ＣＤＲ、の沈着物内に記載されている。１ＣＤＳと１ＣＤＲとの沈着物は、Ｆｌｅｃｔｃｈｅｒ等による論文によって得られるものである。ＣＤ５９のアミノ酸配列は、同じ相対的位置にあるこれらの側鎖が、（Ｓｉｍｓ等による）ヒトＣＤ５９と同様の手法で機能し、上記変位が、方法、キット、ここでの医薬品組成物の範囲内にある、ということを表している。

このようにある実施例において、ＣＤ５９タンパク質は、保存配列改変を含んでいる。ここで用いられている“保存配列改変”は、アミノ酸改変を表すものであり、該アミノ酸改変は、アミノ酸配列を含んでいるＣＤ５９タンパク質の特徴に、かなり影響を及ぼし、又は、変える、ということはしないものであり、即ち、ＣＤ５９のアミノ酸配列は、同じ相対的位置にあるこれらの側鎖が、ヒトＣＤ５９と同様の手法で機能するであろう、ということをあらわしている。上記保存的な改変は、アミノ酸の置換、付加又は欠失を含んでいる。ＣＤ５９のアミノ酸配列の改変は、例えば、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲに基づく突然変異の、任意の周知技術を用いることによって達成される。上記技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等による論文“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、１９８９年と、Ａｕｓｕｂｅｌ等による論文“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８９年”に記載されている。

保存アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有しているアミノ酸残基に置き換えられるものの１つである。類似した側鎖を有しているアミノ酸残基のファミリーは、当業者において定められている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）と芳香族の側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を伴うアミノ酸を、含む。

ある実施例では、ＣＤ５９アミノ酸配列は、野生型配列と実質同一であるアミノ酸配列である。“実質同一”とは、ここでは、十分な又は最小限のアミノ酸残基を含んでいる第１アミノ酸配列として表している。前記アミノ酸残基は、第２アミノ酸配列内に整列しているアミノ酸残基と同一であり、この結果、第１、第２アミノ酸配列は、共通構造領域及び／又は共通機能活性を有することができる、ようになっている。例えば、アミノ酸配列は、少なくとも約６０％同一性、又は、少なくとも７５％、８５％、９５％、９６％、９８％、又は９９％同一性を有している、共通構造ドメインを含む。

配列間の配列同一性の計算は、以下のようにして実行される。２つのアミノ酸配列の％同一性を決定するため、配列は、最適比較目的のために位置合わせされる（例えば、ギャップが、最適アライメント用の第１、第２アミノ酸配列の一方又は双方に導入され得る）。アミノ酸位置又はヌクレオチド配列位置に対応する位置で、アミノ酸残基は、比較される。第１配列内の位置が、第２配列の対応位置で、同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められているとき、タンパク質は、その位置のものと同じであるとする。２つの配列間の％同一性は、ギャップの数を考慮に入れる、配列によって共通された同一位置の数と、２つの配列の最適アライメントのために導入される必要のあった、各ギャップの長さと、の関数である。

配列の比較と、２つの配列間の％同一性の測定とは、数学アルゴリズムを用いることによって達成された。２つのアミノ酸配列間の％同一性は、デフォルトのパラメータを用いる位置合わせソフトウェアを用いることによって定量される。適切なプログラムは、例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等による論文“Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３、１９９４年（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）によるＣＬＵＳＴＡＬと、Ｔａｔｕｓｏｖａ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎによる論文“ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ” １７４：２４７，１９９９年（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｈｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）によるＢＬ２ＳＥＱと、Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓによる論文“Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ” ２４：１５１５、１９９６年（ｉｇｓ−ｓｅｒｖｅｒ．ｃｎｒｓｍｒｓ．ｆｒ／〜ｃｎｏｔｒｅｄ）によるＳＡＧＡと、Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ等による論文“Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４：２９０、１９９８年（ｂｉｂｉｓｅｒｖ．ｔｅｃｈｆａｋ．ｕｎｉ−ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ．ｄｅ／ｄｉａｌｉｇｎ）が含まれる。

ベクター
ここでの発明の種々の実施例において、ＡＭＤを処置するための方法が、与えられている。該方法は、ＣＤ５９タンパク質のソース、又は、インビボでのＣＤ５９発現のソース、を含んでいる医薬組成物によって細胞又は組織に接触することを含んでいる。例えば、ＣＤ５９タンパク質は、組換えによって作られたタンパク質として投与される。“組換え体”という語は、例えば、微生物のような、遺伝子組換え生物の操作によって生成されたタンパク質を表すものである。

本発明によると、ＣＤ５９のソースは、ＣＤ５９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでおり、例えば、適切な宿主細胞内のＣＤ５９タンパク質の発現を仕向けるように、組換えＤＮＡ分子へと操作される。生物活性ＣＤ５９タンパク質を発現するため、ＣＤ５９タンパク質をコードしているヌクレオチド配列、又は、機能的に均等なものは、適切な発現ベクターへと挿入されている。即ち、ベクターは、必要な核酸を含んでおり、該核酸は、ＣＤ５９タンパク質アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列に操作可能にリンクされている、挿入されたコード配列の転写と翻訳との制限を行なう要素をコードしている。

方法は、当業者に周知なように、適切な転写、翻訳対照要素に操作可能にリンクされている、ＣＤ５９タンパク質をコードする配列を含んでいる、発現ベクターを構築するのに用いられる。これらの方法は、インビトロでの組換えＤＮＡ技術と、合成的技法と、インビボでの組換え、又は、遺伝子組換え、を含んでいる。上記技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等による論文“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、１９８９年、に記載されている。

種々の市販の発現ベクター／宿主(host)システムは、配列をコードしているＣＤ５９タンパク質を含み、発現するのに有益なものである。これらのものは、下記微生物等を含むが、これに限定されるものではない。即ち、組換え型バクテリオファージ、プラスミド、又は、コスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換されたバクテリアと、イースト表現ベクターによって形質転換さられたイーストと、ウィルス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス）に接触した昆虫細胞システムと、ウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス、ＣａＭＶと、タバコモザイクウィルス、ＴＭＴ）によってトランスフェクトされ、又は、細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉ、ｐＢＲ３２２又はｐＥＴ２５ｂプラスミド）によって形質転換された、植物細胞システムと、動物細胞システムとの内の１つの微生物である。Ａｕｓｕｂｅｌ等による論文“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８９年、を参照。

ウィルスベクターは、アデノウィルスベクターと、レンチウィルスベクターと、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターと、ヘルパー依存性アデノウィルスベクターと、を含むが、これに限定されるものではない。ウィルスベクターは、ここに示されているように、ＡＭＤの病因内のＭＡＣの有害作用を妨げる、ＣＤ５９タンパク質をコードする核酸配列を送達するものである。ベクターをパッケージングしているアデノウィルスは、アメリカのＴｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から市販のものである。アデノウィルスベクター構築し、アデノウィルスベクターを使用する、方法は、Ｋｌｅｉｎ等による論文“Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ”、１１４：２５３−２６２、２００７年と、ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ等による論文“Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ”、１８：８４５−８５４、２００３年と、に示されている。

アデノウィルスベクターは、真核生物遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ等による論文“Ｇｅｎｅ”、１０１：１９５−２０２、１９９１年）と、ワクチン開発（Ｇｒａｈａｍ等による論文“Ｍｅｔｈｏｄ ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７、（Ｍｕｒｒａｙ、Ｅｄ．）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ、１０９−１２８、１９９１年）と、に用いられていた。更に、組換えアデノウィルスベクターは、遺伝子治療用に用いられている（Ｗｕ等による米国特許Ｎｏ．７，２３５，３９１）。

組換えアデノウィルスベクターは、例えば、シャトル(shuttle)ベクターと、プロウィルスベクターとの間の相同的組換えから、生成される（Ｗｕ等による米国特許Ｎｏ．７，２３５，３９１）。ここでアデノウィルスベクターは、複製欠損なものであり、例えば、条件的な欠陥、アデノウィルスＥ１領域の欠損がある。そして、ＣＤ５９をコードしているポリヌクレオチドは、Ｅ１コード配列が除去される位置に導入された。ＣＤ５９遺伝子をコードしているポリヌクレオチドは、代替的に、Ｅ３領域に挿入され、又は、ヘルパー細胞株を用いているＥ４領域内に挿入される。

ヘルパー細胞株は、下記のヒト細胞等から得たものでも良い。即ち、２９３ヒト胚腎臓細胞、筋肉細胞、造血細胞、又は、他のヒト胚間葉又は上皮細胞である。代わりに、ヘルパー細胞は、例えば、ベロ細胞、又は、他のサル胚間葉又は上皮細胞といった、ヒトアデノウィルスに対して許容状態の他の哺乳類種の細胞から得たものでも良い。ヘルパー細胞株を用いる、これらの複製欠損アデノウィルスベクターの生成と、伝播とは、Ｇｒａｈａｍ等による論文“Ｊ．Ｇｅｎ”、Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９−７２、１９７７、に記載されている。

ベクターをパッケージングしているレンチウィルスのベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂｅｄ ＣＡ）によって市販されている。レンチウィルスベクターの生成を行なうための、ＨＩＶパッケージングシステムは、下記構築物を用いるように用意されている。即ち、Ｎａｌｄｉｎｉ等による論文“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．”７２：８４６３−８４７１、１９９８年、と、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ等による論文“Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ”、１５：８７１−８７５、１９９７年と、Ｄｕｌｌ等による論文“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．”７２：８４６３−８４７１、１９９８年と、である。

多くのベクター構築物が、第３世代のレンチウィルスのＳＩＮベクター・バックボーン（Ｄｕｌｌ等による論文“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．”７２：８４６３−８４７１、１９９８年）に基づく、システムを用いてパッケージングを行なうのに用いることができる。例えば、ベクターコンストラクトｐＲＰＬｓｉｎＣＭＶＧＦＰｐｒｅは、５’ＬＴＲを含んでいる。そこでは、ＨＩＶプロモーター配列が、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、Ｕ３プロモーター領域内での欠失を含んでいる、自己不活性化３’ＬＴＲ、ＨＩＶパッケージングシグナル、ＣＭＶプロモーターによって駆動されているオワンクラゲ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から成る標識遺伝子カセットにリンクされているＲＲＥ配列と、核外搬出を強化するように現れるウッドチャック肝炎ウィルスＰＲＥ要素と、に置き換えられている。ＧＦＰ標識遺伝子は、ＵＶ蛍光顕微鏡検査法又はフローサイトメトリーの、直接観察によって、核酸導入又は形質導入効果の定量化を可能にする（Ｋａｆｒｉ等による論文“Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．”、１７：３１４−３１７、１９９７年と、“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．”、３１：２０３７−２０４７、１９９９年）。

ＣＤ５９タンパク質とパッケージング細胞とをコードする遺伝子を含んでいるレトロウィルスベクターを構築するための、レトロウィルス核酸の操作は、周知技術を用いて達成することができる。Ａｕｓｕｂｅｌ等による論文、１９９２年、第１巻、セクションIII（ユニット９．１０．１−９．１４．３）と、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等による論文、１９８９年と、を参照。分子クローニングについては、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ. Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ. Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、Ｍｉｌｌｅｒ等による論文“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ.”、７：９８１−９９０、１９８９年と、Ｅｇｌｉｔｉｓ等による論文“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ.”、 ６：６０８−６１４、１９８８年、米国特許番号４，６５０，７６４、４，８６１，７１９、４，９８０，２８９、５，１２２，７６７、５，１２４，２６３と、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ８５／０５６２９、ＷＯ８９／０７１５０、ＷＯ９０／０２７９７、ＷＯ９０／０２８０６、ＷＯ９０／１３６４１、ＷＯ９２／０５２６６、ＷＯ９２／０７９４３、ＷＯ９２／１４８２９、ＷＯ９３／１４１８８を参照。

レトロウィルスベクターは、構築され、両種性パッケージングシステムを用いる、非感染形質導入ウィルス粒子（ビリオン）にパッケージングされる。上記パッケージングシステムの例は、例えば、下記文献にある。即ち、Ｍｉｌｌｅｒ等による論文“Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ.”、６：２８９５−２９０２、１９８６年と、Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ等による論文“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．”、６２：１１２０−１１２４、１９８８年と、Ｃｏｓｓｅｔ等による論文“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．”、６４：１０７０−１０７８、１９９０年と、米国特許番号４，６５０，７６４、４，８６１，７１９、４，９８０，２８９、５，１２２，７６７、５，１２４，２６３と、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ８５／０５６２９、ＷＯ８９／０７１５０、ＷＯ９０／０２７９７、ＷＯ９０／０２８０６、ＷＯ９０／１３６４１、ＷＯ９２／０５２６６、ＷＯ９２／０７９４３、ＷＯ９２／１４８２９、ＷＯ９３／１４１８８と、である。

“産生細胞”の生成は、レトロウィルスベクターをパッケージング細胞へと導入することによって得られる。上記レトロウィルスの例は、例えば、下記文献に見出すことができる。即ち、Ｋｏｒｍａｎ等による論文“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．”、８４：２１５０−２１５４、１９８７年と、Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ等による論文“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．”、１８：３５８７−３５９６、１９９０年と、米国特許番号４，４０５，７１２、４，９８０，２８９、５，１１２，７６７と、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ８５／０５６２９、ＷＯ９０／０２７９７、ＷＯ９２／０７９４３と、である。

ヘルペス・ウィルスパッケージングベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂｅｄ， ＣＡ）によって市販されている。例えば、ヘルペス・ウィルスは、水痘帯状疱疹ウィルス又は仮性狂犬病ウィルス等のαヘルペス・ウィルスと、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２等の単純ヘルペス・ウィルスと、エプスタイン・バー・ウィルス等のヘルペス・ウィルスと、がある。所望のヌクレオチドセグメント、例えば、大半のヘルペス・ウィルスになり得る、ヘルパーウィルスが無いときの、ＣＤ５９ヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列、によってパッケージングされ得る、空のヘルペス・ウィルス粒子を用意する方法は、例えば、Ｆｒａｅｆｅｌ等による論文（米国特許番号５，９９８，２０８、１９９９年１０月７日発行）に示されている。

ヘルペス・ウィルスＤＮＡベクターは、当業者に良く知られている技術を用いて構築することができる。例えば、ヘルペス・ウィルスの全ゲノムをコードしているＤＮＡセグメントは、大きなＤＮＡセグメントを持ち運べる多数のベクターの間で分割されたものである。前記大きなＤＮＡセグメントは、例えば、コスミド（Ｅｖａｎｓ等による論文“Ｇｅｎｅ”、７９， ９−２０、１９８９年)、酵母人工染色体（ＹＡＣＳ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等による論文“ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年）、又は、大腸菌Ｆ要素プラスミド（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｒ等による論文“Ｓｃｉｅｎｃｅ”、２４４：１３０７−１３１３、１９８９年）、である。

例えば、１組のコスミドは、隔離されており、エプスタイン・バー・ウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、仮性狂犬病ウィルス、ＨＳＶ−１を含んでいる種々のヘルペス・ウィルスの全ゲノムを表している重複クローンを含んでいる。Ｍ．ｖａｎ Ｚｉｊｌ等による論文、“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．”、６２，２１９１，１９８８、Ｃｏｈｅｎ等による論文“Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０，７３７６、１９９３年と、Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ等による論文“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．”、６７，７２９８、１９９３年と、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ等による論文“Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”、１９７，１１６、１９９３年と、を参照。

ＡＡＶは、パルボウィルス依存のものであり、他のウィルス（アデノウィルス又は多数のヘルペス・ウィルス群）との重感染に依存しており、これによって、培養細胞内に増殖感染をもたらすようになっている（Ｍｕｚｙｃｚｋａによる論文“Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ”、１５８：９７ １２９、１９９２年）。例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウィルスは、“興味ある”遺伝子、例えば、２つのＡＡＶ末端反復によって配置された（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ等による論文“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．”、６２（６）：１９６３、１９７３年、１９８８年、Ｓａｍｕｌｓｋｉ等による論文“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．”、６３：３８２２ ３８２８、１９８９年）、ＣＤ５９遺伝子、を含んでいるプラスミドと、末端反復の無い野生型ＡＡＶをコードする配列を含んでいる発現プラスミドと、に同時にトランスフェクトすることによって作られている。細胞は、また、ＡＡＶヘルパー機能のために必要なアデノウィルス遺伝子を持ち運んでいるアデノウィルス又はプラスミドに、接触又はトランスフェクトされる。上記方法で作られた組換えＡＡＶウィルスの蓄えは、（例えば、塩化セシウム密度遠心分離によって）組換えＡＡＶ粒子から物理的に分離されているべき、アデノウィルスを含んでいる。

ベクターをパッケージングしたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ＧｅｎｅＤｅｔｅｃｔ（Ａｕｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）によって市販されている。ＡＡＶは、高い頻度の統合(a high frequency of integration)を有するように示されており、分割されていない細胞を感染させるものであり、ゆえに、組織培養内の哺乳類細胞への遺伝子を送達するのに役立てるものである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５８：９７ １２９、１９９２年）。ＡＡＶは、感染力のために広範な宿主範囲を有している（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等による論文“Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ.、４：２０７２ ２０８１、１９８４年と、Ｌａｕｇｈｌｉｎ等による論文“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ.”、６０（２）：５１５ ５２４、１９８６年と、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ等による論文“Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．”、８（１０）：３９８８ ３９９６、１９８８年と、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ等による論文“J．Ｖｉｒｏｌ．”、６２（６）：１９６３ １９７３、１９８８年）。

ＡＡＶベクターを構築し、ＡＡＶベクターを使用する方法は、例えば、米国特許番号
５，１３９，９４１、４，７９７，３６８に記載されている。遺伝子送達でのＡＡＶの使用は、更に、ＬａＦａｃｅ等による論文“Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”、１６２（２）：４８３ ４８６、１９８８年と、Ｚｈｏｕ等による論文“Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ”、２１：９２８ ９３３、１９９３年と、Ｆｌｏｔｔｅ等による論文“Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”、７（３）：３４９ ３５６、１９９２年と、Ｗａｌｓｈ等による論文“Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ”、９４：１４４０ １４４８、１９９４年と、に記載されている。

組換えＡＡＶベクターは、インビトロ及びインビボでの、標識遺伝子の形質導入（Ｋａｐｌｉｔｔ等による論文“Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ”、８（２）：１４８ ５４、１９９４年と、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ等による論文“Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．”、8（１０）：３９８８ ３９９６、１９８８年と、Ｓａｍｕｌｓｋｉ等による論文“ＥＭＢＯ J．”、１０：３９４１ ３９５０、１９９１年と、ＳｈｅｌｌｉｎｇとＳｍｉｔｈとによる論文“Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”、１：１６５ １６９、１９９４年と、Ｙｏｄｅｒ等による論文“Ｂｌｏｏｄ”、８２ （Ｓｕｐｐ．）：１：３４７Ａ、１９９４年と、Ｚｈｏｕ等による論文“Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ”、２１：９２８ ９３３、１９９３年と、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等による論文“Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．”、５：３２５８ ３２６０、１９８５年と、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ等による論文“J．Ｖｉｒｏｌ．”、６２（６）：１９６３ １９７３、１９８８年）と、ヒト疾患内に取り込まれた遺伝子の形質導入（Ｆｌｏｔｔｅ等による論文“J．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”、７（３）：３４９ ３５６、１９９２年と、Ｏｈｉ等による論文“Ｇｅｎｅ”、８９（２）：２７９ ２８２、１９９０年と、Ｗａｌｓｈ等による論文“J．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ”、９４：１４４０ １，４４８、１９９４年と、Ｗｅｉ等による論文“Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”、１：２６１ ２６８、１９９４年)と、に用いられ、成功している。

抗体
本発明は、また、ヒトＭＡＣに特有の抗体を使用し、免疫組織化学によって網膜の上でＭＡＣ沈着の範囲を測定することによって、黄斑変性の存在または進行を診断又は予後診断することに関するものである。“抗体”という語は、ここでは、全ての抗体と、任意の抗原結合性フラグメント（即ち、“抗体結合部分”）又はこれらの単一の鎖、を含む物として表されている。自然に生成している“抗体”は、ジスルフィド結合によって相互接続されている、少なくとも２つの重鎖（Ｈ）と、２つの軽鎖（Ｌ）とを含んでいる糖タンパク質である。

ここで用いられているように、抗体“特にヒトＭＡＣに結合する抗体”は、５×１０^−９Ｍ又はそれ以下、２×１０^−９Ｍ又はそれ以下、１×１０^−１０Ｍ又はそれ以下、のＫ_Ｄを備えているヒトＭＡＣに結合する抗体を表すように意図されている。例えば、抗体は、モノクロ＾ナル又はポリクローナルのものである。ここで用いられている“モノクローナル抗体”又は“モノクローナル抗体組成物”は、単分子成分の抗体分子の生成を表すものである。モノクローナル抗体組成物は、ＭＡＣのため、又は、ＭＡＣの特定のエピトープに対する、特異的な、そして、親和性の単一結合を表している。抗体は、ＩｇＭ，ＩｇＥ、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４等のＩｇＧ、である。

また、組み替え抗体は、Ｍａｃアッセイに役に立つものである。ここで用いられている“組換えヒト抗体”は、動物（例えば、マウス）から分離された抗体等の、組換え手段によって、用意され、発現され、生成され、又は、分離された、全ての抗体を含むものである。ここでの方法を用いることによって組み替え抗体を発現するための哺乳類宿主細胞は、例えば、Ｐ．Ｊ． ＫａｕｆｍａｎとＰ．Ａ． Ｓｈａｒｐとによる論文“１９８２ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”、１５９：６０１−６２１に記載されている、ＤＨＦＲ選択可能な標識を用いた、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎによる論文“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ”、７７：４２１６−４２２０、１９８０年、に記載された、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含んでいるチャイニーズ・ハムスター・オーバーレイ（ＣＨＯ細胞）と、ＮＳＯ骨髄腫細胞と、ＣＯＳ細胞と、ＳＰ２細胞と、を含んでいる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞を用いるための、他の発現システムは、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６、ＥＰ３３８，８４１に示されている、ＧＳ遺伝子発現システムである。抗体を生成するため、抗体遺伝子をコードしている発現ベクターは、哺乳類宿主細胞へと導入され、宿主細胞は、宿主細胞内の抗体の発現と、宿主細胞が成長している培養媒体内への抗体の分泌と、を可能にするのに十分な期間、培養される。抗体は、標準タンパク質生成方法を用いて培養液から回収することができる。

種々の種類の標的への抗体の結合能力を評価するための標準アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、ＲＩＡ法を含め、よく知られている。交代の（例えば、結合親和性といった）結合反応速度は、また、Ｂｉａｃｏｒｅ解析によるもの等、よく知られている標準アッセイによって評価することができる。

抗血清の生成のため動物を選ぶときに考慮されるべき基準を含んでいる、抗体生産のための一般的な方法論は、Ｈａｒｌｏｗ等による論文“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｐｐ． ９３−１１７、１９８８年)に記載されている。例えば、ヤギ、犬、羊、マウス又はラクダ等の、適切なサイズの動物は、免疫反応をもたらすのに有効な、例えば、インタクトなタンパク質、又は、ヒトＭＡＣからのエピトープを含む、そのタンパク質等の、ある量の免疫原の投与によって免疫性が与えられる。プロトコルの例は、以下のようなものである。動物は、動物のサイズに応じた、１００μｇ乃至１００ｍｇの抗体を、背中に皮下注入され、３週間の後、動物のサイズに応じた、１００μｇ乃至１００ｍｇのアジュバント免疫原の腹腔内注射がなされる。例えば、フロイント不完全アジュバントの、アジュバントを伴う２週間毎の追加の腹腔内注射が、動物の血中に適切な抗体の力価が得られるまで、投与される。力価の一例は、少なくと、約１：５０００又は１：１００００、又は、それ以上の力価であり、即ち、希釈物が、検出可能に活性を有している、値を含んでいる。抗体は、例えば、ヒトＭＡＣを有しているカラムにおけるアフィニティ精製によって、精製される。

インビトロでの、ヒトリンパ球の免疫付与の技術は、モノクローナル抗体を生成するのに用いられている。体外での、ヒトリンパ球の免疫付与の技術は、当業者に周知である。Ｉｎａｉ等による論文“Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、９９（５）：３３５ ３６２、１９９３年５月と、Ｍｕｌｄｅｒ等による論文“Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．”、３６（３）：１８６ １９２、１９９３年と、Ｈａｒａｄａ等による論文“Ｊ， Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｅｄ”、２２（４）：１４５ １５、１９９３年と、Ｓｔａｕｂｅｒ等による論文“Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ”、１６１（２）：１５７ １６８、１９９３年と、Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒａｎ等による論文“Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ”、１１（６） ７２９ ７３９、１９９２年と、を参照。これらの技術は、抗原特異的ＩｇＧと、ＩｇＭモノクローナル抗体と、を含んでいる抗原反応性モノクローナル抗体を生産するのに用いられ得るものである。ヒトＭＡＣ用に親和性と特異性とを有している、その抗体又はフラグメントは、ここで与えられているＭＡＣ沈着用のアッセイの範囲内にある。

ここでの発明は、モデル細胞システム内の血清内の補体成分から隆起している黄班変性（ＭＤ）の及ぶ範囲をアッセイする方法の、ある実施例を与えるものである。該方法は、第１サンプル細胞を血清のサンプルへと曝露し、結果として生じる溶解を測定し、血清にそれほど曝露されておらず、換言すれば、実質同一の対照細胞の第２サンプルとの比較において、溶解の及ぶ範囲を比較し、この結果、第２サンプルとの比較において、第１サンプル内の溶解の及ぶ範囲が、補体を含んでいるＭＤを測る基準となるように、なっている、工程を含んでいる。

他の実施例において、発明は、モデル細胞システム内のヒト黄班変性（ＭＤ）の処置において、薬効に有力な治療薬をアッセイする方法を、与えている。該方法は、第１サンプル細胞を血清に接触し、結果として生じる溶解を測定し、換言すれば対照細胞である第２サンプルを血清とヒトＣＤ５９タンパク質のソースとに接触し、結果として生じる溶解を測定し、少なくとも１つの第３サンプル細胞を候補治療組成物(candidate therapeutic composition)、換言すれば血清と同一のものに接触し、溶解を測定し、この結果、第１サンプルと、第２サンプルと、のものとの比較において、第３サンプルの溶解の及ぶ範囲は、候補組成物による保護測定値であり、これによって、ヒトＭＤの処置における効果に有効な有力な治療薬をアッセイする、ことができるようになっている、工程を含んでいる。ＣＤ５９のソースは、次の様な、制限なしに純粋に分離されただけのＣＤ５９を含んでいる。即ち、自然ソースから精製されたもの、又は、組換えによって形成され、精製されたもの、あるいは、ウィルスベクター又は核酸ベクター等のベクター、インビボで、ＣＤ５９をコードし、ＣＤ５９を発現できるベクター、によって送達されたもの、である。ここでの例において、ＣＤ５９との接触は、ＣＤ５９遺伝子をコードしているベクターによって、細胞又は組織を、事前処置することによって得られる。

これらの方法の実施例において、細胞溶解は、プロビジウムヨウ化物（ＰＩ）摂取によって測定される。ＰＩは、例えば、Ｆｌｕｋａ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍｉｃａ（Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｅｒｌａｎｄ）によって市販されている。ＰＩは、ＤＮＡに結合したときに蛍光する挿入剤である。ＰＩは、膜非透過性で、概ね生存細胞から排除されたものであり、ゆえに、ＰＩは、通常、混合群内の非生存細胞の量を認識し、及び／又は、測定するのに用いられている。

他の実施例において、発明は、黄班変性（ＭＤ）の予後診断又は診断のために、血清補体成分をアッセイする、モデル細胞システムの方法を与えている。該方法は、被験者からの血清に検出可能にラベル付けされた細胞を接触し、接触された細胞用の、細胞外及び／又は細胞内の、検出可能な薬剤の量を測定し、細胞内にある、細胞外及び／又は細胞内の薬剤を、血清に曝露されておらず、換言すれば同一の、検出可能にラベル付けされた対照細胞と、比較し、この結果、接触された細胞内の、細胞外及び／又は細胞内の薬剤の量を、対照細胞と比較できるようにし、この結果、血清に接触された細胞外の検出可能にラベル付けされた薬剤の、より多くの量が、ＭＤの予後診断又は診断の指標である、ようになっている、工程を含んでいる。

他の実施例において、発明は、モデル細胞システム内のヒト黄班変性（ＭＤ）の処置における効果に有効な有力な治療薬をアッセイする方法を与えている。該方法は、被験者からの血清に第１サンプルの検出可能なラベル付けされた細胞を接触し、細胞外及び／又は細胞内の、検出可能な薬剤の量を測定し、血清とヒトＣＤ５９タンパク質ソースとに第２サンプル、換言すれば同一の、検出可能なラベル付けされた対照細胞と、接触し、細胞外及び／又は細胞内の、検出可能な薬剤の量を測定し、少なくとも１つの第３サンプルの検出可能にラベル付けされた薬剤を、少なくとも１つの候補治療組成物、換言すれば血清と同一のものに、接触し、細胞外及び／又は細胞内の、検出可能な薬剤の量を測定し、この結果、第１サンプルと第２サンプルとのものと比較された、第３サンプルの細胞外及び／又は細胞内の、検出可能な薬剤の量が、候補組成物による保護を測る基準になり、この結果、細胞外の検出可能にラベル付けされた薬剤の、より多くの量が、ＭＤの指標となり、これによって、ヒトＭＤの処置における効果に有効な有力な治療薬をアッセイできるようになっている、工程を含んでいる。

これらの方法の実施例において、検出可能な薬剤は、例えば、検出可能なタンパク質を発現する能力のある遺伝子を有している組換え可能なベクターと、蛍光剤と、比色分析剤と、酵素剤と、放射性剤と、である。

ある実施例において、検出可能なタンパク質は、蛍光タンパク質であり、例えば、緑色蛍光タンパク質と、エクオリンと、シアン蛍光タンパク質と、ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質と、強化緑色蛍光タンパク質と、黄色蛍光タンパク質と、である。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と、エクオリンとは、オワンクラゲ(Aequorea victoria)というクラゲから分離された生物発光組成物である。カルシウムイオンがエクオリンに結合されたとき、錯体は、アポ・エクオリンと、蛍光組成物と、に分解される。該蛍光組成物は、青色に発光する。合成エクオリンは、Ｓｅａｌｉｔｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｇａｒｔ、Ｇａ．）からＡＱＵＡＬＩＴＥL（登録商標）として市販されている。ＧＦＰは、可視スペクトルの低い緑部分で発光し、合成ＧＦＰは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から市販されている。

ＧＦＰのアミノ酸配列に対する突然変異は、派生的な、異なる色を蛍光するＧＦＰのアミノ酸配列を生成した。例えば、シアン蛍光タンパク質と、ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質と、強化緑色蛍光タンパク質と、黄色蛍光タンパク質と、である。合成シアン蛍光タンパク質と、合成ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質と、合成強化緑色蛍光タンパク質と、合成黄色蛍光タンパク質とは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から市販されている。

代わりの実施例において、検出可能な薬は、蛍光タンパク質でない蛍光薬である。例えば、インドシアニン・グリーンと、ドキソルビシンと、リボフラビンと、クロロフィルと、ポルフィリンとである。

インドシアニン・グリーン（ＩＣＧ）は、トリカルボシアニン色素であり、該色素は、約８００ｎｍ、約８２０ｎｍ、約８４０ｎｍ、又は、約８６０ｎｍでの、励起によって、発光する。ＩＣＧは、Ｈ．Ｗ．Ｓａｎｄｓ Ｃｏｒｐ．（Ｊｕｐｉｔｅｒ、ＦＬ）から市販されている。ドキソルビシンは、蛍光性のものであり、例えば、約５５０ｎｍ、６００ｎｍ又は６５０ｎｍの波長で発光する。ドキソルビシンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から市販されている。リボフラビンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から市販されており、蛍光性のものであり、例えば、約４５０ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６５０ｎｍ又は約７５０ｎｍの波長で発光する。クロロフィルＡは、緑光合成色素であり、該色素は、例えば、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、又は、約８００ｎｍの波長で、発光する。クロロフィルＡは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と、Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）などの供給者から市販されている。ポルフィリンは、４メチン架橋（＝ＣＨ−）を介して反対側でリンクしている４ピロールサブユニットから生成された複素環大員環（heterocyclic macrocycle）である。ポルフィリンの広範囲に及ぶ共役構造は、有色の化合物、即ち、約６００ｎｍ、又は、約６５０ｎｍ、又は、約７００ｎｍの波長で蛍光するものである。ポルフィリンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から市販されている。

他の代わりの実施例において、検出可能な薬剤は、酵素剤であり、該薬剤は、例えば、ヌクレオチドベクター上で発現され得る、βガラクトシダーゼ又はアルカリホスファターゼといった、タンパク質である。

βガラクトシダーゼは、ヒドロラーゼ酵素であり、該酵素は、βガラクトシドの加水分解を触媒してモノサッカライドする。発光性のβガラクトシダーゼ検出キットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から市販されている。アルカリホスファターゼは、ヌクレオチドとタンパク質とアルカロイドとを含んでいる、多くのタイプの分子、からフォスフェイトグループを除去する原因であるヒドラーゼ酵素である。発光性アルカリホスファターゼ検出キットは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から市販されている。

医薬組成物
本発明のある観点は、ＣＤ５９タンパク質又はＣＤ５９タンパク質発現のソースを含んでいる医薬組成物を与える。ある実施例において、これらの組成物は、随意に、更に、１又はそれ以上の追加の治療薬を含んでいる。ある実施例において、追加の治療薬、複数の治療薬は、次のグループから選択される。即ち、該グループは、成長因子、抗炎症剤、一酸化窒素とカルシウムチャネルブロッカーを含むが、これに限らない昇圧剤、コラゲナーゼインヒビター、局所用のステロイド、マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター、アスコルビン酸塩、アンギオテンシンII、アンギオテンシンIII、カルレティキュリン、テトラサイクリン、フィブロネクチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、ケラチン生成細胞成長因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰｓ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ｎｅｕ分化要因（ＮＤＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ヘパリン結合性ＥＧＦ（ＨＢＥＧＦ）、トロンボスポンジン、フォンウィルブラント要因C、ヘパリンとヘパリン硫酸塩と、ヒアルロン酸と、から成る。

他の実施例において、追加薬は、成分、組成物、生物学上の、又は、そのようなものであって、ＭＡＣ沈着から細胞を保護するＣＤ５９タンパク質の能力を、強化し、安定させ、相乗作用を与え、又は、同等のものに置き換わる、ものである。また、含まれている治療薬は、同時又は関連して発生する症状、疾病、又は、疾患を同時に処置するのに用いられる薬等、ＣＤ５９タンパク質を同時に、有益に、又は、便宜上、与えられるものでもよい。幾つかの実施例において、薬物は、限定するものではないが、抗腫瘍、抗ウイルス性、抗菌性、抗マイコバクテリウム、抗真菌性、抗増殖性、又は、抗アポトーシスの薬剤を含んでいる。発明の組成物内に含まれている薬品は、周知のものである。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’sによる論文“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”、９ｔｈ Ｅｄと、Ｈａｒｄｍａｎ等による論文、ｅｄｓ．、“ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ”、１９９６年と、を参照。これらの内容は、ここに引用することによって取り込まれる。

ここで用いられている、“薬学的に許容可能な担体”は、任意の、そして全ての、溶媒、希釈剤、又は、他の液状ビヒィクル、分散又は懸濁補助、界面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑剤、所望の薬形に適切なもの、を含んでいる。Ｇｅｎｎａｒｏよる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’s Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５年、は医薬組成物を処方するのに用いられている種々の担体を提供しており、それらの調整技術で知られている。薬学的に許容可能な担体として役に立つことができる幾つかの材料の例としては、限定するものではないが、処方者の判断によって、着色剤、解除剤、コーティング剤、防腐剤、そして、酸化防止剤が、組成物内に存在し得るのと同様に、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム等の、他の非毒性で相溶性ある滑剤と同様なものとして、例えば、ブドウ糖、蔗糖等の砂糖、例えば、カカオバター、座薬ワックス等の賦形剤、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブオイル、コーン油、大豆油等の油、プロピレングリコール等のグリコール、例えば、エチルオレイン酸塩、エチルラウリン酸塩等のエステル類、寒天、例えば、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム等の緩衝剤、アルギン酸、ピロゲンのない水、等張性食塩水、リンガー溶液、エチルアルコール、リン酸緩衝液を、含んでいる。

治療的に有効な服用
ここで与えられている方法によるＡＭＤ処置は、医薬組成物を備えている網膜色素細胞に接触することを含んでいる。前記医薬組成物は、例えば、活性剤として、ＣＤ５９タンパク質又はＣＤ５９タンパク質の発現のソースを有している、所望の結果を達成するのに必要な、量と時間、被験者に必要なだけの、治療的に有効な量の医薬組成物を投与するものである。

本発明の方法による、組成物は、ＡＭＤを処置するための有効な投与の量と、経路と、を用いて、投与されても良い。ゆえに、“ＡＭＤ処置に有効な量”とは、ここで用いられているように、ＡＭＤの症状を、有益に防ぎ、改善できるようにする、組成物の十分な量を表すものである。

正確な投与量は、処置されるべき患者の様子から個々の医者によって選択される。投与量と投与とは、活性薬剤の十分なレベルを与え、又は、所望の効果を維持するように、調整されている。考慮されても良い追加の要因は、病状を含んでいる。例えば、ＡＭＤの中間期又は末期、患者の年と体重と性別、投与の治療食と時間と周期、投与の経路、薬剤の組み合わせ、反応感度、処置に対する耐性／応答、である。長時間作用型医薬組成物は、特定の組成物の半減期、除去率によって、１時間毎、２時間毎、３乃至４時間毎、毎日、１日２回、３乃至４日毎、毎週、２週に１度、投与することとしてもよい。

発明の活性薬剤は、好ましくは、投与の簡便性と投与量の均一化とのため、投与ユニット形態内で調剤される。ここで用いられている“投与ユニット形態”は、処置されるべき患者のために、活性薬剤の物理的に分離しているユニットを表すものである。本発明の組成物の１日当たりの使用は、サウンドメディカル判断の範囲内で主治医によって決定されるだろう。任意の活性薬剤のため、処置上の有効な用量は、細胞培養アッセイ又は動物モデル、ここで与えられているように、普通はマウスであるが、ラット、ウサギ、犬、又は、豚の可能性もある動物モデル、によってはじめに評価される。ここで与えられている動物細胞モデルは、また、望ましい濃度、全投与量範囲、投与経路を得るために用いられる。前記情報は、その後、ヒト投与のための、有益な投与量、経路を定めるのに用いられ得る。

治療上の有効な投与量は、ＡＭＤの症状、状態を改善し、進行を防ぐ活性薬剤の量を表す。活性薬剤の、治療上の効果と毒性とは、細胞培養又は実験動物内での標準の製剤処方によって測定することができる。前記効果と毒性とは、例えば、ＥＤ５０（投与量が母集団の５０％の治療上の効果）とＬＤ５０（投与量が母集団の５０％の致死である）とのことである。治療上の効果に対する毒性の用量率は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の率で示すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が、好ましい。細胞培養アッセイと動物実験から得られるデータは、人用の投与量範囲を処方するのに用いることができる。

製品の毎日の投与量は、成人１日当たり、０．００１乃至１００ｍｇ等の広い範囲にわたって変えることができる。眼への投与のため、組成物は、好ましくは、処置されるべき患者に対する投与量の症状に応じた調節のため、活性成分の０．００１、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、又は、５００．０μｇを含んでいる溶液の形式で与えられる。

ユニット用量は、典型的には、約０．００１μｇ乃至約５００μｇの活性成分、好ましくは、０．１μｇ乃至１００μｇの活性成分、より好ましくは、１．０ｍｇ乃至１０ｍｇの活性成分を含んでいる。有効な薬物の量は、１日、体重比率、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ乃至２５ｍｇ／ｋｇの投与量レベルで与えられる。例えば、範囲は、１日、体重比率、約０．００１乃至１０ｍｇ／ｋｇ、又は、１日、体重比率、０．００１ｍｇ／ｋｇ乃至１ｍｇ／ｋｇである。組成物は、例えば、１日に１回乃至４回、又は、それ以上の回数で、レジメンで投与されても良い。

ＣＤ５９タンパク質の発現のソースの投与は、ある投与量のウィルスベクター又は核酸ベクターの投与のであり、この結果、処置されるべき細胞当たり、少なくとも約５０、１００、５００、１０００、又は、少なくとも約５０００の、粒子を含んでいる。細胞数は、ＡＭＤの当業者に周知の方法によって、処置に必要な網膜エリアから算出できる。

医薬組成物の投与
望ましい投与量内の適切な薬学的に許容可能な担体によって処方されたように、ここで与えられた医薬組成物は、人又は他の動物に、（溶液、軟膏又はドロップによって）眼に、経鼻的に、“頬側に、経口で、経直腸的に、非経口的に、嚢内に、膣内に、そして、腹腔内に、投与される。

眼への注入は、水を含む部分又は硝子体液への眼内注射、結膜下注射又はサブテノン嚢注射等の目の外層への注射、を含んでいる。

眼、口、又は他の全身投与のための液状の投薬形態は、限定するものではないが、薬学的に許容できる、エマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、エリキシル剤を含んでいる。活性薬剤に加え、液状の投与量形態は、一般によく知られている、次のような不活性希釈剤を含有していても良い。即ち、例えば、水、又は、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチル炭酸塩、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、（特に、綿実、落花生類、コーン、胚芽、オリーブ、キャスター、ゴマ油等の）油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、それらの混合物等の、他の溶液、可溶化剤、乳化剤である。不活性希釈剤に加えて、眼、口、又は、他の全身に送達された組成物は、また、湿潤剤等のアジュバントと、乳化し懸濁する薬剤と、を含んでいる。

発明の医薬品組成物の局所的又は経皮的な投与のための投薬形態は、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル類、粉、溶液、スプレー、吸入器、又は、パッチ、を含む。活性薬剤は、無菌状態のもとで、薬学的に許容可能な担体と、所望される任意の必要な防腐剤または緩衝剤と、混合される。例えば、眼又は皮膚経路への投薬は、水滴、霧、エマルジョン、又は、クリームによって達成される。投与は、治療又は予防のためのものでも良い。発明は、眼科の装置、外科装置、聴能学装置、又は、開示した組成物（例えば、ガーゼの包帯、細長い片）を包む製品と、前記装置又は製品等を製造又は使用する方法と、含んでいる。これらの装置は、ここに記載された組成物を、塗布、含浸、接着されたものであり、換言すれば、該組成物によって処置を行なうことができるものである。

経皮パッチは、体への活性成分の制御された送達を与えることについて優位性を有している。前記投与形態は、適切な媒体内の成分を溶解又は配合することによって作られる。吸収促進薬は、また、皮膚を通る成分の流量を増加するのに用いられる。率は、率を制御する細胞膜を与えることによって、又は、ポリマーマトリクス又はジェル内の成分を散布することによって、制御することができる。

注射用製剤、例えば、無菌注射可能な水性又は油性の懸濁液は、適切な頒布又は湿潤剤と懸濁剤を用いるときに、当業者によって処方され得るものである。無菌注射可能な製剤は、また、無菌注射可能な溶液、懸濁液、例えば、１，３ブタンジオールのような、無毒で非経口で受容できる希釈剤又は溶剤内のエマルジョンである。受容できるビヒィクル及び溶剤の内、用いられ得るものは、水と、リンガー溶液と、Ｕ．Ｓ．Ｐ.と、生理食塩液と、である。更に、無菌の、固形油は、溶剤又は縣濁媒体として用いられ得る。この目的で、任意の無刺激性の固形油が、合成のモノグリセリド又はジグリセリドを含め、用いられ得る。更に、オレイン酸等の脂肪酸が、注射剤の製剤に用いられている。注射剤の処方は、使用前に、例えば、細菌保持フィルターを介するろ過、又は、無菌の水又は他の無菌注射可能な媒体内に溶解また散布され得る無菌個体組成物の形式で組み込まれている殺菌剤、によって殺菌される。活性薬剤の効果を持続させるため、皮下注射又は筋肉注射から薬剤の吸収を遅くすることが、しばしば望まれる。非経口で投与された活性剤の遅延された吸収は、おいるビヒィクル内の溶解又は縣濁剤によって得られる。注射物質の貯蔵形態は、ポリラクチド・ポリグルコリド等の生分解性ポリマー内に薬剤のマイクロカプセル化されたマトリックス(microencapsule matrices)を形成することによって作られている。ポリマーに対する活性薬剤の率と、用いられている特定のポリマーの特性と、に依存して活性薬剤を放出する率は、制御できる。他の生分解性のポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）と、ポリ（無水物）と、を含んでいる。貯蔵性注射剤の処方は、また、生体組織と相性の良いリポソーム、又は、マイクロエマルジョン内に薬剤を封入することによって、製剤される。

直腸又は膣内投与用の組成物は、好ましくは、座薬である。該座薬は、この発明の活性薬剤を、ココアバター、ポリエチレングリコール、又は、室温で固形で、体温で液体で、それ故、直腸又は膣内腔で溶け、活性薬剤を放出する、座薬ワックス等の、適切な刺激の無い賦形剤又はキャリヤに混合することによって、製剤することができる。

経口用固形投与形態は、カプセル、錠剤、ピル、粉末剤、粒剤を含む。前記固形投与形態において、活性薬剤は、少なくとも１つの、不活性の、薬学的に許容可能な、クエン酸ナトリウム又は第二リン酸カルシウム等の、賦形剤又は担体、及び／又は、（ａ）例えば、澱粉、蔗糖、ブドウ糖、マンニトール、ケイ酸等の、充填剤又は増量剤、（ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニールピロリジノン、蔗糖、アカシア等の、結合剤、（ｃ）グリセロール等の湿潤剤、（ｄ）例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカ澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩、炭酸ナトリウム等の崩壊剤、（ｅ）パラフィン等の溶液遅延剤、（ｆ）第四アンモニウム化合物等の吸収促進剤、（ｇ）例えば、セチルアルコール、グリセロールモノステアレート等の、湿潤剤、（ｈ）例えば、カオリン、ベントナイト粘土等の、吸収材、（ｉ）例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム等の、潤滑油、そして、それらの混合物等の、ものと混合される。

同様のタイプのものの固形組成物は、また、高分子量ポリエチレングリコールと同様のものと、同じように、乳糖のような賦形剤を用いている、柔らかい充填剤と硬い硬カプセルとして用いられても良い。錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル、顆粒の固形投与形態は、腸溶コーティング、放出制御コーティング、薬学的に処方されている技術で周知の他のコーティング等の、コーティング、シェルによって製剤され得る。そのような固形投与形態において、活性薬剤は、ショ糖又はでんぷん等の、少なくとも１つの不活性希釈剤と混合されても良い。前記投与形態は、また、通例、不活性希釈剤以外の、例えば、錠剤化している希釈剤と、ステアリン酸マグネシウムと微結晶性セルロース等の、他の錠剤化補助剤と、の薬剤を備えていても良い。カプセル、錠剤、ピルの場合、投与形態は、また、緩衝剤を備えていても良い。それらは、随意に乳白剤を含んでいても良く、また、好ましくは、随意に遅延手法によって、腸管のある部分で活性薬剤を放出する組成物とすることができる。使用できる包埋組成物の例は、重合物質とワックスとを含んでいる。

発明は、これで、完全に記載された。発明は、更に、下記実例と請求の範囲とによって説明される。これらの実例と請求項とは、説明のためのものであり、限定するものではない。

この作業の部分は、発明者、Ｋａｓｍｉｒ Ｒａｍｏ、Ｓｉｏｂｈａｎ Ｃａｓｈｍａｎ、Ｒａｊｅｎｄｒａ Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｇｈによる共著の“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Of Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｄｅｌｉｅｖｅｒｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ５９ ａｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＡＭＤ ｉｎ ａ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｔｔａｃｋ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ Ｍｕｒｉｎｅ ＲＰＥ”（Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ、２００８年９月、Ｖｏｌ．４９、ｐｐ．４１２６−４１３６）という題の公報において、公にされており、該公報は、ここに引用によって取り込まれる。

これで、発明は、完全に説明された。発明は、更に、下記実例と請求の範囲とによって例示される。当業者は、日常の実験によって、個々に記載された特定の処理に対する多数の均等物を、認識し、又は、突き止めることができるであろう。前記均等物は、本発明と請求の範囲に含まれるものである。本願で引用された交付済み特許、公開された特許出願を含んでいる全ての引用文献の内容は、引用することによって、ここに取り込まれている。

実例
ＣＤ５９タンパク質又はＣＤ５９タンパク質のインビボでの発現のソースを含む組成物は、ＡＭＤを処置するのに有効である、ということが下記実例によって示される。インビトロ及びインビボでのヒトＭＡＣ沈着の測定の、ヒト化マウスモデルは、下記実例に示されており、このモデルは、ヒトＣＤ５９タンパク質を発現するベクターによってヒトＭＡＣの有害な沈着から、マウスＲＰＥの保護を測定するのに用いることができる。

実例１：アデノウィルスベクター構成
ヒトＣＤ５９ｃＤＮＡは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得られ、ＸｈｏＩ部位（下線部分；５’ｃｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｇｇａｃａａｔｃａｃａａｔｇｇｇ3’、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1）を含んでいるフォワードプライマーと、ＥｃｏＲＶ部位（下線部分；５’ｃｃｃｃｃｇａｔａｔｃａａｃｇｇｇｇａｇｔｔｔｇｇｇａｇａａ３’、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を備えてるリバースプライマーと、を用いているＰＣＲ増幅から得られた。

ＰＣＲプロダクトは、ゲル精製され、ＸｈｏＩ/ＥｃｏＲＶ消化の後、（ｐＣＡＧＥＮのＳａＩＩ/ＢａｍＨＩフラグメントをＸｈｏＩ／ＢｇｌＩＩ消化ｐＳｈｕｔｔｌｅへとクローン化することによって構成された）ＸｈｏＩ/ＥｃｏＲＶ消化ｐＳｈＣＡＧへとクローン化し、ｐＳｈＣＡＧＣＤ５９を生成している。自動配列決定は、ＣＤ５９配列が、生成されたプラスミドへと導入されたことを確認した。このシャトルプラスミドは、その後、Ｋｌｅｉｎ等による論文“Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ”、１１４：２５３−２６２、２００７年と、ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ等による論文“Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．”，１８：８４５−８５４，２００３年と、の内で公にされたプロトコルを用いるアデノウィルスベクターを生成するのに用いられた。ｐＳｈＣＡＧＣＤ５９は、Ｐｍｅｌによって線形化され、ゲル精製され、大腸菌ＢＪ５１８３細胞の同時形質転換によって、ｐＡｄＥａｓｙ−１と組換えられた。組換えられたプラスミドは、ＰａｃＩによって直線化され、ヒト胚網膜芽細胞腫（９１１）細胞株へとトランスフェクトされ、結果として生じるベクター（ＡｄＣＡＧＣＤ５９）は、アデノウィルス精製キットＡｄｅｎｏｐｕｒｅ（Ｐｕｒｅｓｙｎ、Ｉｎｃ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）を用いて精製された。

対照ベクターＡｄＥＭＰＴＹは、ｐＡｄＥａｓｙ−１に、Ｐｍｅｌ直線化ｐＳＨＣＡＧを組換えることによって、同様に精製された。ＡｄＣＡＧＧＦＰ対照ベクターは、Ｊｏｈｎｓｏｎ等による論文“Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．”、７０：４４１−４４９、２０００年に記載されている。

実例２：培養細胞株と、アデノウィルス接触による、ＣＤ５９の事前処置
ヒト胚網膜芽培養細胞株９１１は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）によって補充されたダルベッコ・モディファイド・イーグル・培地（ＤＭＥＭ）内に維持され、マウスヘパトーマ培養細胞株ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、１０％ＦＢＳによって補充されたα―ＭＥＭ内に維持されている。細胞は、９５％空気雰囲気中、５％二酸化炭素の環境下、３７度で加湿インキュベータ内で培養された。

ウェスタンブロットアッセイ又はヒト血清細胞溶解アッセイのため、１．２×１０^６のｈｅｐａ―１ｃ１ｃ７細胞が、そして、ＣＤ５９免疫組織化学又はヒト血清ＭＡＣ沈着アッセイのため、２．５×１０^４ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞が、示されたように１細胞あたりに非常に多く感染ウィルス粒子のあるところで、ＡｄＣＡＧＧＦＰ又はＡｓＣＡＧＣＤ５９ベクターの何れかに接触され、又は、対照細胞は、それほど接触されなかった。細胞に接触しているアデノウィルスは、２％ＦＢＳの培地内で実行された。接触してから３日の後、細胞は、更にここでの実例に記載されているように、処置された。ここに記載された特定の条件下の間、ＣＤ５９によって細胞又は組織の有効な事前措置を得るための、培地、温度等の均等な条件は、ここの方法の範囲に含まれている。

一次マウスＲＰＥ細胞が、犠牲にされた６乃至１０週齢Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの眼から採取された。後述するように、前房、レンズ、網膜の各々が除去された後、眼杯組織は、３７度で、４０乃至５０分の間、１．５ｎｌのエッペンドルフ型チューブ内、２００μｌ、０．２５％トリプシンＥＤＴＡ内でインキュベートされた。眼杯組織は、その後、１０％ＦＢＳで補充されたα―ＥＭを含んでいる６０ｍｍ細胞培養皿へと移された。ＲＰＥ細胞は、ピペットの先でやさしく除去され、ＲＰＥシートは、２００μｌピペットを用いて吸引され、エッペンドルフチューブへと移された。複数回、媒体をピペット操作することによって、ＲＰＥシートを分散した後、細胞は、カウントされ、（一般に、１つの眼から得られる収率である）約３×１０^４細胞が、ポリＤリシン塗装チャンバースライドの１つのチャンバー内に播種された（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ＮＪ）。培養して１週間後、細胞は、ここに記載した実例に用いられた。アデノウィルスベクターに細胞を接触させることは、２％ＦＢＳの培地内で実行された。

実例３：ウェスタンブロットアッセイ
細胞は、５０ｍＭ、トリス塩酸、ｐＨ８．０／１５０ｍＭ、塩化ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム／２％（ｖ：ｖ）プロテアーゼ阻害カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含んでいる、１％トリトンＸ−１００内に、溶解された。細胞からの培地は、集められ、遠心分離され、残っている細胞残屑を除去するため、０．２２μｍフィルター又は図示されているような他のフィルターを通される。培地は、１０，０００ダルトン孔サイズのＢｉｏｍａｘ遠心分離フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて１０倍に濃縮される。溶解は、１５％トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ジェル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で、非還元状態下、ゲル電気泳動によって解析される。タンパク質は、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）細胞膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に移された。５％（ｗ：ｖ）スキムミルク（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）内でブロッキングしているとき、膜は、マウス抗ヒトＣＤ５９モノクローナル抗体（１：１０００ダルトン、Ｃｌｏｎｅ Ｍｅｍ−４３、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用い、次に、第２抗体西洋わさびペルオキシターゼ共役やぎ抗マウス抗体（１：１００００ダルトン、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を用いることによって、ヒトＣＤ５９を探索した。上述したように、ストリッピング、ブロッキングの後、同じ細胞膜が、マウス項βアクチンタンクローン抗体（１：５０００ダルトン、Ｃｌｏｎｅ ＡＣ−１５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いてβアクチンを探索した。第２検出は、上述したように実行された。

実例４：ヒト血清細胞溶解アッセイ
正常なヒト血清（ＮＨＳ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からの凍結乾燥形態で購入され、粉末の得られたヒト血漿のものと等量の血清を得るため、（メーカーの説明書によって）１ｍｌの冷たい滅菌脱イオン水でもどされる。４３ＣＨ_５０ユニット／ｍｌ、又は、７４ＣＨ_５０ユニット／ｍｌの溶血性力価を、それぞれ、有している（ＫａｂａｔとＭａｙｅｒとの方法を使用しているメーカーによって測定される）、結果として得られるヒト血清のロットは、等分され、−８０度で保存される。４３ＣＨ_５０ユニット／ｍｌの溶血性の力値を有する第１ロットは、ｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞による実験で用いられた。７４ＣＨ_５０ユニット／ｍｌの溶血性の力値を有する第２ロットは、他の実験に用いられた。

ヒト血清細胞溶解アッセイ用に、事前処置された細胞の単一の細胞縣濁液、即ち、全量５００μｌ内の、ベクターに接触していない対照細胞、又は、アデノウィルス接触ｈｅｐａ―１ｃ１ｃ７細胞、を含んでいるものが、使用された。次に行なう媒体の除去では、細胞が、１倍のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって２度洗浄され、短時間トリプシン処理（０．２５％トリプシンＥＤＴＡ、４乃至６分）を行なった後、０．５％ＦＢＳを含んでいる１倍のＰＢＳによって採取された。細胞は、４℃で遠心分離によって集められ、Ｃａ^２＋とＭｇ^２＋とを有する、よく冷えたゼラチンベローナル緩衝液（ＧＶＢ^＋＋、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｙｌｅｒ、ＴＸ）内で再懸濁された。細胞は、血球計によってカウントされ、５×１０^５細胞が、エッペンドルフチューブへと分注された。正常なヒト血清（ＮＨＳ）又は（５６℃、１時間）加熱によって不活性化された正常なヒト血清（ＨＩ−ＮＨＳ）は、細胞に加えられ、細胞懸濁液は、やさしい回転振動を伴いながら、３７℃で１時間インキュベートされた。細胞溶解は、プロビジウムヨウ化物（ＰＩ）除去法、次にＦＡＣＳ分析解析、によって測定される。

ＦＡＣＳの少し前、ＰＩの１μｌ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｆｌｕｋａ ＢｉｏＣｈｅｍｉｃａ、Ｂｕｃｈｅｓ Ｓｗｉｚｅｒｌａｎｄ）は、細胞縣濁液に加えられ、サンプル毎に２５０００事象が、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）.結果は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ＰｒｏＳｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を用いることによって解析され、％細胞溶解は、次の「数１」の式を用いて算出された。

実例５：細胞培養内でのＭＡＣ沈着アッセイ
マウスｈｅｐａ―１ｃ１ｃ７細胞は、３日間培養され、ポリＤリジン被覆・チャンバースライド（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）内で、ＡｄＣＡＧＧＦＰ（負の対照）又はＡｄＣＡＧＣＤ５９に接触させることによって事前処置され、１倍のＰＢＳによって２度洗浄された。細胞は、その後、１、３、５、７又は１０分間、３７度で、ＧＶＢ^＋＋（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｙｌｅｒ、ＴＸ）内で、１０％（ｖ：ｖ）ＮＨＳ又はＨＩ−ＮＨＳを使ってインキュベートされた。

一次マウスＲＰＥ細胞は、１時間、ＧＶＢ^＋＋（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｙｌｅｒ、ＴＸ）内で、２５μｇ／ｍｌやぎ抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）と共に、又は伴うこと無く、インキュベートされ、何れであっても洗浄され、（ＥＭＭＰＲＩＮ免疫組織化学用に）固定され、又は、ＭＡＣ沈着アッセイ用に処置され、次に、ＮＨＳ又はＨＩ−ＮＨＳ（最終濃度５０％）を加えることによって４又は７分間処置される。その後、細胞は、氷のように冷たい１倍のＰＢＳによって３度洗浄され、１５分、１倍のＰＢＳ内で、３．７％のホルムアルデヒド（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）によって固定された。細胞は、残っている固定剤を除去するため、１倍のＰＢＳによってその他に３度洗浄され、ここでの実例に記載しているように、免疫組織化学アッセイするときまで、４℃で、１倍のＰＢＳ内に貯蔵される。

実例６：免疫細胞化学／免疫組織化学
前記、固定された細胞又は組織は、優しく回転振動しつつ、２．５時間、６％（ｗ：ｖ）正常やぎ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を含んでいる１倍のＰＢＳ内で、（各々１：５０ダルトン、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡの）ヒトＣＤ５９（クローンＭ−４３）又はヒトＣ５ｂ−９（クローンａＥ１１）に対する一次マウスモノクローナル抗体によってインキュベートされた。第２検出は、暗室内で、１．５時間の間、Ｃｙ^３共役やぎ抗マウス抗体（１：４００ダルトン、Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を用いることによって実行された。

ＲＰＥ６５免疫染色用に、一次ＲＰＥ細胞は、１時間、６％（ｗ：ｖ）正常やぎ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）と、０．２５％（ｖ：ｖ）トリトンＸ−１００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏ−ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ、ＮＪ）と、を含んでいる１倍のＰＢＳ内で、事前ブロックされ、透過された。マウス抗ＲＰＥ６５抗体は、その後、適用され、そして、一次、二次の検出は、抗体と洗浄溶液とが０．２５％（ｖ：ｖ）トリトンＸ−１００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏ−ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ、ＮＪ）を含んでいることを除いて、前記のように、実行された。

マウスＥＭＭＰＲＩＮ染色用に、やぎ抗マウスＥＭＭＰＥＩＮ抗体の、処置され、固定された、細胞と組織とは、１時間、６％（ｗ：ｖ）正常ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を含んでいる１倍のＰＢＳ内でブロックされ、第２検出は、１．５時間、６％ｗ：ｖ）正常ロバ血清を含んでいる１倍のＰＢＳ内で、Ｃｙ^３共役ロバ抗やぎ抗体（１：４００ダルトン、Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を用いて実行された。

実例７：トリパンブルー排除アッセイ
細胞は、血清を除去するために洗浄された後、５分間、０．１％のトリパンブルー溶液内でインキュベートされることを除いて、前記実例内に記載されたように、細胞培養内でＭＡＣ沈着アッセイのために処置された。細胞は、その後、１倍のＰＢＳによって２度洗浄され、前記実例に記載したように固定される。

実例８：網膜下注射
マウス（Ｃ５７ＢＪ／６Ｊ）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入され、１２時間の明暗サイクルで、育てられ、保持される。マウスは、キシラジン（１０ｍｇ／ｍｌ）／ケタミン（１ｍｇ／ｍｌ）の腹腔内注入によって麻酔がなされた。網膜下注射は、５μｌのガラス製注射筒（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）に取り付けられた３２ゲージ注射器と共に、経強膜的、経脈絡膜的アプローチを用い、Ａｎｄｅｒｓｏｎによる“Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．”１３４：４１１−４３１、２００２年に記載されているように、実行された。１μｌの、９分のＡｄＥＭＰＴＹと１分のＡｄＣＡＧＧＦＰ（全部で３×１０^８ベクター粒子、対照）の対照混合物、又は、〜９分のＡｄＣＡＧＣＤ５９と１分のＡｄＣＡＧＧＦＰ（全部で３×１０^８ベクター粒子）の混合物は、各被験マウスに注入された。

実例９：ＲＰＥと角膜との上へのＭＡＣ沈着
注入による事前処置のための投与６日後、マウスは、ＣＯ_２吸収によって犠牲になり、目が採取され、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）とストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）とを含んでいる、１倍のＰＢＳ内に置かれた。円形の切開が、鋸状縁の後ろ１乃至２ｍｍ形成され、レンズを含んでいる完全な前房は、慎重に除去された。神経節の軸索を切るため、視神経の基部で、小さな切開を形成した後、網膜は、除去され、眼杯組織は、（ＣＤ５９免疫組織化学用に）一晩中、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）内の、４％パラホルムアルデヒドで直ちに固定され、又は、１時間、４℃で、冷たいＧＶＢ^＋＋（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｙｌｅｒ、ＴＸ）内に、２５μｇ／ｍｌのやぎ抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）によって、インキュベートされる。

眼杯組織は、その後、冷たいＰＢＳによって３度洗浄され、ＥＭＭＰＲＩＮ免疫組織化学用に固定される。ＭＡＣ沈着アッセイ用に、等量のＮＨＳ又はＨＩ−ＮＨＳ（最終濃度５０％）が、その後、１５分間、３７℃でインキュベートされる、眼杯へと加えられ、冷たいＰＢＳによって３回洗浄され、固定される。

角膜組織は、注射されていないマウスから採取され、虹彩は、除去され、角膜は、２％ＦＢＳを含む３００μｌのＤＭＥＭ内で培養された。角膜は、１．５×１０^９ベクター粒子のＡｄＣＡＧＧＦＰ（負の対照）又はＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターに接触された。採取／接触の後３日で、未処置角膜（負の対照）、ＡｄＣＡＧＧＦＰ事前処置された角膜（負の対照）、ＡｄＣＡＧＣＤ５９事前処置された角膜、の各々は、眼杯組織と同様に、抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体に混合され、各々は、（ＥＭＭＰＲＩＮ免疫組織化学のために）洗浄され、固定され、又は、（ＭＡＣ沈着アッセイ用に）２０分間、５０％ＮＨＳ又はＨＩ−ＮＨＳに接触され、その後、洗浄され、固定される。免疫組織化学の前に、組織は、残っている固定液を除去するため、各々、１倍のＰＢＳで、１０分間、３度洗浄される

実例１０：事前処置されたｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞ベクター内のベクター構造とヒトＣＤ５９発現
体内で、マウスＲＰＥと網膜とを事前処置するために、ヒトＣＤ５９（ｈＣＤ５９）を送達するため、チキンβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター（ＡＤＣＡＧＣＤ５９ヴェクター、図１Ａ）の制御下において、ｈＣＤ５９ｃＤＮＡを含んでいる第１代血清型５アデノウィルスが、製造された。２つの負のアデノウィルス対照ベクター、即ち、ＣＡＧプロモーターの制御下でＧＦＰを発現しているＡｄＣＡＧＧＦＰと、ＡｄＥＭＰＴＹとが、また、作られた（図１Ａ）。これらのベクターは、アデノウィルスの領域Ｅ１内で欠失部分を有するように、作られており、それ故、パッケージング細胞の外側に複製欠失が存在するものである。

ヒトＣＤ５９は、１８−２１ｋＤａグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカー膜タンパク質である。タンパク質の発現を解析するため、マウスｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞は、精製されたＡｄＣＡＧＣＤ５９又は対照ベクターの多くの１０００ベクター粒子（ｖｐ／ｃｅｌｌ）に、事前処置のために接触される。細胞溶解は、モノクローナル抗体を用いる、ウェスタンブロット法によって解析され、ｈＣＤ５９の存在は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９事前処置細胞の細胞溶解内に認められた（図１Ｂ）。ＣＤ５９タンパク質は、対照ベクター（ＡｄＣＡＧＧＦＰ、負の対照）、又は、ベクターによって事前処置されていない対照細胞（負の対照、図１Ｂ）に接触された細胞溶解内には、検出されなかった。

内因性のｈＣＤ５９が、ヒト胚網膜芽細胞種（９１１）細胞溶解内に検出された（図１Ｂ）。しかし、このシグナルは、ＡｄＣＡＧＣＤ５９接触マウス細胞からのシグナルに比べてて非常に弱い。９１１細胞溶解内で検出された内因性ｈＣＤ５９と、ＡｄＣＡＧＣＤ５９接触マウス細胞溶解内で検出された組換えｈＣＤ５９と、の間の電気泳動移動度の僅かなシフトは、タンパク質修飾での違い、例えば、２つの細胞株内でのタンパク質グリコシル化パターンの変形に、起因するものである。

細胞膜上のｈＣＤ５９の発現と局所化とを示し（図１Ｃ）、本質的に１００％の細胞を表した、抗ｈＣＤ５９抗体を用いて、マウスｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７に接触された非透過性ＡｄＣＡＧＣＤ５９の免疫染色は、タンパク質を発現していることを、示していた。染色剤は、負の対照ベクターに接触された細胞上では認められなかった。非処置細胞の免疫細胞化学を含む追加の対照と、細胞に接触したＡｄＣＡＧＣＤ５９の免疫細胞化学の間の第１抗体の漏れと、は結果として、これらの対照が負のものであることが認められた。

実例１１：ベクター接触によってｈＣＤ５９によるアデノウィルス事前処理が、マウス細胞を、ヒト補体薬用細胞溶解から保護する
ＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターから発現されたｈＣＤ５９の機能活性を試験するため、ヒト血清細胞溶解アッセイが、マウスｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７上で実行された。細胞懸濁は、細胞を補体へと曝露するため、（非補体特異的溶解用対照として）ＮＨＳ又はＨＩ−ＮＨＳによってインキュベートされる。％細胞溶解は、ＦＡＣＳ解析によって検出され、定量化されたように、ＰＩの摂取によって測定される。

対照未処置細胞の溶解の及ぶ範囲にある血清の濃度の効果は、最初に調べられる（図２Ａ）。マウスｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞は、ヒト補体を効率良く活性化した。結成は、０．５％（１−２００ダルトン）と同じほど低い血清濃度は、細胞の５０％以上を溶解することが認められた。細胞の溶解は、血清濃度に依存し、Ｓ字型の関数を表す（図２Ａ）。試験された最も低い血清濃度は、最大細胞溶解内で生じ、１％（１／１００ダルトン、細胞溶解は９６．０６％±０．８７％）である。この血清濃度は、アデノウィルスベクターによる接触によって、事前処置された細胞を伴う、次の細胞溶解の実例で用いられる。

細胞は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９、又は、負の対照ＡｄＣＡＧＧＦＰベクターの１００ｖｐ／ｃｅｌｌによって、事前処置され、接触して６５時間後に、細胞が採取され、ヒト血清細胞溶解の実験に用いられた。ここで用いられた量のアデノウィルス事前処置では、顕微鏡によって認められたように、又は、ＰＩ摂取によって検出され、その後、ＦＡＣＳされ、そして、ここに示したように、２つのベクターに接触した細胞から、そして、対照未処置細胞から、得られるデータを比較することによって、認められたように、細胞の毒性は、結果として生じなかった。ＨＩ−ＮＨＳ内でインキュベートされた、接触細胞の細胞溶解は、最小のものであり、ＨＩ−ＮＨＳによってインキュベートされた（対照）ベクターによって、事前処置されていない細胞のものと同様であった（図２Ｂ、Ｃ、Ｄ）。ＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターによって事前処置された細胞は、補体薬用細胞溶解が、１２．２９％±０．１８％に減少され（約８倍され）、かなり保護されている（細胞溶解が、殺細胞を示し、細胞生存の逆数を示している。図２Ｂ、Ｄ、Ｅ）。

対象的に、負の対照ＡｄＣＡＧＧＦＰベクターによって事前処置されたマウス細胞は、細胞の９５．２７％±０．０１％で認められた補体薬用細胞溶解の及ぶ範囲で、保護されておらず、即ち、ヒト補体に対して、依然感受性のものである（図２Ｃ、Ｅ）。同様に、未処置マウス細胞は、ヒト補体と、細胞溶解に対して感受性である、ということが認められた（図２Ａ、Ｂ、Ｅ）。対照ベクターＡｄＣＡＧＧＦＰによる事前処置は、一方で、認められた溶解の及ぶ範囲が、９５．２７％±０．０１％であるとき（図２Ｃ、Ｅ）、対照細胞用に認められたものと同様に（図２Ｂ、Ｅ）、細胞を保護しなかった。これらのデータは、保護が、それ自体、アデノウィルス事前処置に起因するものであるというよりも、ｈＣＤ５９の発現に起因する、ということを示している。

溶解からの細胞の保護は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターによって事前処置された細胞内のヒトＣＤ５９の発現によって、ここに、得られた。保護が、投与された多くのＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターに依存する、ということが認められる。２５０ｖｐ／ｃｅｌｌと５０００ｖｐ／ｃｅｌｌとのＡｄＣＡＧＣＤ５９を投与することは、それぞれ、細胞がそれぞれ５０％、７０％を超えることによって溶解することを抑制した。対象的に、ＡｄＣＡＧＧＦＰ事前処置された細胞は、投与されたベクターの多さによらず、溶解しやすい。ゆえに、ＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターからの組換えｈＣＤ５９発現は、ヒト補体薬用細胞溶解から、マウス細胞をかなり保護した。

実例１２：ｈＣＤ５９タンパク質が、ヒトＭＡＣ沈着からマウス細胞を保護する
前述の実例のデータは、正常なヒト血清マウスｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞のインキュベーションが、補体活性化と広範な細胞溶解を導き、この溶解が、組換えヒトＣＤ５９がこれらのセル内で発現したときに、有効に抑制される、ということを示している。

実例は、アデノウィルス事前処置マウス細胞によって発現された、組換えヒトＣＤ５９は、この目的のために明らかにされた、インビトロでの、ＭＡＣ沈着アッセイで、Ｃ５ｂ−９複合体の形成を阻害するか否か、について定めるために、実行された。

ポリＤリジン塗膜チャンバースライド内のマウス細胞は、１乃至１０分間、３７℃で、ＧＶＢ^＋＋内で１０％のＮＨＳ又はＨＩ−ＮＨＳによってインキュベートされ、次に、洗浄され、固定された。５分間のＮＨＳによる、これらの細胞のインキュベーションは、細胞形態内にかなりの変化を生じる（図３Ａ、細胞のＤＩＣ可視化）。細胞は、それらの細胞質突起を失い、丸くなり、粒状物になっている、という悪影響を示した。対象的に、これらの作用は、補体が不活性化されている、ＨＩ−ＮＨＳによってインキュベートされた細胞には認められなかった（図３Ｂ、細胞のＤＩＣ可視化）。

Ｃ５ｂ−９複合体上のネオエピトープを対象とするモノクローナル抗体を用いる免疫細胞化学アッセイは、これらの細胞上のＭＡＣ沈着を確認するＮＨＳに曝露されている細胞の縁で、広範囲の細胞膜染色を、明らかにした（図３Ａ）。ＨＩ−ＮＨＳに曝露されている細胞上には、ＭＡＣ染色は、ほとんど認められなかった（図３Ｂ）。対照サンプルは、ＮＨＳ接触された細胞の免疫細胞化学中の第１抗体の放出と同様に、（ヒト血清によってインキュベートされていない）未処置細胞の免疫細胞化学を含んでおり、これらのものは共に、得られた負のデータを制御するものである。ヒト血清内の補体へ曝露する条件下で、ＮＨＳに曝露された細胞の相当量の溶解は、また、トリパンブルー染色によって示された（図３Ｃ）。これらの細胞によるトリパンブルー摂取の無いことによって示されるように、ＨＩ−ＮＨＳに曝露された細胞上には溶解は認められなかった（図３Ｃ）。

１０００ｖｐ／ｃｅｌｌのＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターによって、マウスｈｅｐａ−１ｃ１ｃ７細胞を事前処置することは、これらの細胞がヒトＭＡＣ沈着と、結果として生じる溶解とから、かなりの保護されている、ということが見出された。次の５分間のＮＨＳへ曝露することは、これらの処置した細胞が、それらの正常の形態学上の特性を維持した（図４Ｂ、ＤＩＣ）。抗ＭＡＣ抗体を用いる免疫細胞化学では、ＭＡＣ沈着が略完全に無いことを示しており（図４Ｂ）、細胞溶解は、トリパンブルー染色の無い事によって示されたように、有効に抑制された。対象的に、ＧＦＰを発現している、負の対照ベクターによって事前処置された細胞は、次のＮＨＳに５分間曝露することによるＭＡＣ沈着から保護されていない。形態変化（図４Ａ、ＤＩＣ）と、ＭＡＣ免疫染色（図４Ａ）と、これらの細胞溶解（図４Ｃ）とは、未処置対照細胞に認められたのと同様なものであり（対照、図３Ａ、Ｃ）、即ち、ＭＡＣ沈着と細胞溶解の特性は、同様のものである。

ＭＡＣ染色は、７分間のＮＨＳ処置後、ＡｄＣＡＧＣＤ５９事前処置された細胞と同等なだけ現れ（図４Ｂ）、この数は、１０分の血清処置後に増加した、ことが認められた。７分のＮＨＳ処置後、ＡｄＣＡＧＧＦＰ事前処置された細胞のＭＡＣ染色は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９事前接触した細胞よりも、かなり強かった（図４Ｂ）。１０分の血清処置後、ほとんど全てのＡｄＣＡＧＣＤ５９事前処置された細胞は、完全な溶解に起因して細胞培養スライドから取り外され、一方、ＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターによって事前処置されたほんの僅かな細胞が、何らかの変化、又は、ＭＡＣ沈着を示した。更に、ＭＡＣ免疫発光のパターンは、細胞に対するより大きな損傷に相関する細胞境界をより詳しく描く強い点状の染色を伴って、細胞膜損傷の及ぶ範囲を示し（図３Ａ、図４Ａ、図５）、より拡散した染色が、傷の無い細胞に相関する細胞膜を通って広がっている。未処置対照細胞上及びＡｄＣＡＧＧＦＰ処置後の細胞上、のＭＡＣ沈着は、短時間で、点状である。ＭＡＣ沈着のより低い損傷レベルを示している、拡散染色は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９事前処置された細胞上で最初に見られた（図４Ｂ、図５）。

細胞が、多様性の低いＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターで事前処置されたとき、ＭＡＣ免疫染色の異なるパターンは、より簡単に認識された。５分間ＮＨＳに曝露した後、１００又は５００ｖｐ／ｃｅｌｌに接触した細胞は、１０００ｖｐ／ｃｅｌｌに接触された細胞との比較において、より一層のＭＡＣ染色を示した（図５、左下側顕微鏡写真内に特に拡大してある）。アデノウィルスを発現している多様性の低いｈＣＤ５９でさえ、細胞に接触することによる事前処置は、ＭＡＣ沈着から細胞をかなり保護できるようにした（比較のために図４Ａを参照）。

実例１３：マウスＲＰＥ、一次ＲＰＥ細胞、角膜内皮上でのヒトＭＡＣ沈着のモデル
ＭＡＣ沈着アッセイは、ＡＭＤ損傷の及ぶ範囲又はＡＭＤ用の潜在力をアッセイするためにマウス眼組織を使用する目的で、そして、ＡＭＤを処置又は防ぐためのスクリーン剤として用いるために、開発された。

眼杯組織は、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスから採取され、種々の濃度のＮＨＳ又はＨＩ−ＮＨＳに曝露された。抗ヒトＣ５ｂ−９抗体による免疫組織化学分析のあとには、適切なＣｙ３共役第２抗体がある。眼胚組織が５０％の高さの濃度のＮＨＳに接触されたときであっても、データは、ＲＰＥ上に何の蛍光シグナルを示さなかった。１００％のＮＨＳに接触することは、結果として、散在性の弱い染色を生じた（図６Ｃ）。得られた矛盾のある弱いシグナルは、何の改良目的のためにも役立たなかった。更に、ヒトＭＡＣ沈着からマウス眼組織を保護するためにｈＣＤ５９に送達されたアデノウィルスの潜在力を試験するため、角膜を用いるという試みは、また、失敗した。任意のＮＨＳ濃度の用いられるところでは、アデノウィルスによって有効に形質導入されたものであることが明らかな、角膜内皮上で何のＭＡＣ沈着も検出されなかった。その結果、強ＭＡＣ免疫染色は、いつも角膜内皮上で検出された。

ＭＡＣ沈着アッセイは、更に、ヒト血清に曝露した後に、マウスＲＰＥ細胞上にＭＡＣ沈着の無いことを調べるために、一次マウスＲＰＥ細胞上で実行され、その結果、眼組織上の細胞外マトリックスが、ＲＰＥ又は内皮細胞表面に接近可能な補体タンパク質によって相互作用しているか否かについて決定した。ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞標識、ＲＰＥ６５用の、典型的な色素、特徴的形態、ありふれた免疫染色の存在によって認識された（図７、上の横列が、細胞の照明された明視野を示し、３番目の横列が抗ＲＰＥ６５による染色を示す）。組織のように、弱く、一貫性のないＭＡＣ免疫染色が、５０％ＮＨＳに曝露することによって、０継代マウスＲＰＥ細胞上で認められた（図８Ｃ）。

ＮＨＳに曝露することによって、ＲＰＥと角膜内皮上に広範なＭＡＣ沈着が無いことは、非効率な補体活性に起因するものかもしれず、及び／又は、マウス補体調節タンパク質による強化された保護は、これらの細胞の表面上に発現された。マウスＲＰＥ上の補体活性が強化され得ることを確認するため、角膜内皮と同様にＲＰＥ上の豊富に発現された膜たんぱく質である、マウスＥＭＭＰＲＩＮの細胞外ドメインに対する抗体が、次に用いられた。やぎ内に生成された抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体は、ＭＡＣ染色用に用いられる第２抗体（Ｃｙ^３共役やぎ抗マウスＩｇＧとＩｇＭ）によって交差反応を起こさないように選択された。

抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体によるマウス眼胚組織又は角膜組織のインキュベーションは、その後、ＮＨＳ（３７℃で角膜組織２０分、眼杯１５分、最終濃度５０％）に曝露され、ＲＰＥ切開組織（図９Ａ）と角膜内皮（図９Ｃ）との広範で、明るいＭＡＣ免疫染色が得られた。この免疫染色は、補体活性化ＭＡＣ沈着の結果物であり、ＮＨＳよりもむしろ対照ＨＩ−ＮＨＳの追加によって、染色は除去され、ＭＡＣ免疫染色は、ＨＩ−ＮＨＳの使用によって認められなかった（図９Ｂ、Ｄ）。渦巻き型で、種々のパターンの染色が、しばしば現れたＮＨＳに接触されたＲＰＥ単分子層は、異なる量のＭＡＣ沈着と種々の量の細胞損傷に起因することが認められた。追加の負の対照は、抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体とＮＨＳの両方に接触された眼杯と角膜組織との免疫組織化学の間の、一次抗体の欠落と同様に、抗マウス抗体に接触されたが、しかし、ヒト血清に接触されていない、眼杯と角膜組織のＭＡＣ免疫染色を含み、そして、これらの対照による染色は、認められなかった。

同様の結果は、また、一次０継代マウスＲＰＥ細胞によって得られた（図８Ａ、Ｂ）。抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体によるインキュベーションと、４分間、５０％のＮＨＳに曝露することと、によって、細胞崩壊が、ＲＰＥ細胞上で認められた（図８Ａ）。７分間、ＮＨＳに曝露することによって、ほとんどの細胞が、スライドから剥離された。時折、高いコンフルエンスエリアの細胞凝集体のみが、残されていた（図８Ａ）。最小限の染色のみが、対照ＨＩ−ＮＨＳに曝露された細胞に認められた（図８Ｂ）。

実例１４：ＲＰＥ細胞膜の補体媒体小水疱形成
ＭＡＣ沈着と保護との作用を、更に、調べるため、一次（０継代）マウスＲＰＥ細胞は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９＋ＡＤＣＡＧＧＦＰ（それぞれ８００＋２００ｖｐ／ｃｅｌｌ）の混合物、又は、ＡｄＥＭＰＴＹ＋ＡｄＣＡＧＧＦＰ（それぞれ８００＋２００ｖｐ／ｃｅｌｌ）の対照混合物によって事前処置された。７分間のＮＨＳ処置後、洗浄と固定とが、細胞に施された。処置後３日後、これらの細胞は、ＭＡＣ沈着アッセイによって解析された。

細胞に関連付けられている多数のＧＦＰポジティブ水疱の発現が、認められた（図１０Ａ、Ｂ矢印）。細胞の試験は、多数のＧＦＰポジティブ水疱の発現を明らかにした。これらの水疱の数とサイズとは、ＡｄＣＡＧＣＤ５９＋ＡｄＣＡＧＧＦＰの混合物によって事前処置された細胞（図１０Ｂ）に比べて、ＡｄＥＭＰＲＹ＋ＡｄＣＡＧＧＦＰの混合物によって事前処置された細胞（図１０Ａ）の方が実質大きかった。この観察は、ここで認められた小水疱形成が、ＭＡＣ沈着の結果物であることを示している。更に、ＮＨＳによって接触した後、ＡｄＥＭＰＴＹ＋ＡｄＣＡＧＧＦＰの混合物によって事前処置された細胞は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９＋ＡｄＣＡＧＧＦＰの混合物によって事前処置された細胞の蛍光と比較して、減少したＧＦＰ蛍光を示した（図１０Ｂと図１０Ａとの比較）。ＡｄＥＭＰＴＹ＋ＡｄＣＡＧＧＦＰの混合物によって事前処置された細胞内の減少されたＧＦＰ蛍光は、ＧＦＰが、これらの対照細胞内で、細胞から漏れた、又は、細胞膜を横切りながら拡散したことを示している、これらの細胞の外側に認められた拡散グリーン蛍光内での随伴物の増加に関係付けられていた。

実例１５：アデノウィルスによって送達されたｈＣＤ５９によってＭＡＣ沈着から角膜組織と一次ＲＰＥ細胞を保護する
ヒトＭＡＣ沈着からマウスＲＰＥを保護するｈＣＤ５９事前処置の効果が評価された。マウスは、各アデノウィルスベクターの網膜下注射によってインビボに投与された。注射して６日後、ＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターの網膜下注射の後のマウスＲＰＥ上のｈＣＤ５９の発現は、抗ｈＣＤ５９抗体によって免疫組織化学によって認められた（図１１Ａ）。負の対照ＡｄＣＡＧＧＦＰによって注射された眼杯組織内には、ｈＣＤ59に対する染色は認められなかった（図１１Ｂ、上の横列）。むしろ、ＧＦＰ蛍光は、注射部位で可視化された（図１１Ｂ、底の横列）。

ＭＡＣ沈着アッセイ用に、網膜下注射は、２つのグループのマウスに実行された。あるグループのマウスは、９：１の率のＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰベクターの混合物が注射された（ＡｄＣＡＧＧＦＰは、自然の蛍光による導入遺伝子の発現の注射部位とエリアの容易な認識を可能にするため、同時に注射された）。第２のグループのマウスは、また、９：１の率のＡｄＥＭＰＴＹとＡｄＣＡＧＧＦＰ（負の対照）の対照混合物が注射された。注射後６日、目は、採取され、眼杯組織は、注射されていない対照マウスからの眼杯組織に沿って、抗マウスＥＭＭＰＲＩＮとＮＨＳとに曝露された。

ＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰ（ｎ＝１０）の混合物の注射された眼組織のヒトＭＡＣの免疫組織化学は、眼杯組織の非接触残存エリアと比べて（ｈＣＤ５９発現を認定するのに用いられ、これと関連のあることが見出されている）ＧＦＰ発現のエリアでのＲＰＥ上の染色がかなり減少したことを示した（図１２Ｂについて、上横列の切開された組織を比較）。このエリアでのＲＰＥ細胞は、損傷を受けていない、定められていた細胞境界と、正常な６角形の形態とを、現していた（図１２Ｂについて、図１２Ａ内の細胞の顕微鏡写真を比較）。対象的に、注射された眼杯組織（ｎ＝１０）の負対照ベクター（ＡｄＥＭＰＴＹとＡｄＣＡＧＧＦＰベクターの混合物）の注射された組織のＧＦＰ発現エリアでのＭＡＣ免疫染色は、眼杯組織の非接触残存エリア（図１２Ａ）と同様であり、ＭＡＣ免疫染色は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰとの混合物の注射された眼杯組織のＧＦＰ発現のエリアで認められたＭＡＣ免疫染色よりも、かなり広くて強いものであった。さらに、負対照の注射された眼杯組織のＧＦＰ発現エリアでのＲＰＥ細胞は、丸くなった形状、６角形の形態の消失、定められていた細胞境界の消失、で示されているように、広範囲にわたり損傷を受けていた（図１２Ａについて、図１２Ｂ内の顕微鏡写真を比較）。

ＧＦＰ発現のエリアでのＭＡＣ免疫蛍光の定量化は、統計的に有意な違い（ρ＝０．００１４、図１３Ａ）として、負対照（ｎ＝１０）ｍｐ混合物の注射された眼杯組織との比較において、ＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰ（ｎ＝１０）の混合物の注入された眼杯組織上の平均ＭＡＣ免疫蛍光強度で、〜５５％の全体的な減少を明らかにした。これらの計算は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰとの混合物の注射された眼杯組織上の平均ＭＡＣ蛍光強度が、幾つかの眼杯組織が、ＧＦＰ発現によって、図の５５％が、これらサンプルの含有物によって影響を受けていたことが示されたように、ｈＣＤ５９発現が少ないという理由で、ＭＡＣ沈着からのかなりの保護が欠けたことによって、増加した。ＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰの混合物によって事前処置された、眼杯組織上のＧＦＰとＭＡＣ蛍光強度（図１３Ｂ）の間には、反比例関係が認められた。反比例関係が、ＣＤ５９の発現を取り込んでいる有効な治療方法がＭＡＣ沈着から組織を保護することを、示している。

眼杯は、その後、減少したＭＡＣがベクターの変換機能である可能性を解析するため、ＡｄＥＭＰＴＹとＡｄＣＡＧＧＦＰとの混合物と、ＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰとの混合物と、によって事前処置された。ＧＦＰレベル内の２つのグループ（グループ当たりｎ＝１０）の間の結果に有意な違いは認められなかった（図１３Ｂ）。ＡｄＥＭＰＴＹとＡｄＣＡＧＧＦＰとによって事前処置された眼杯と、ＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰとによって事前処置された眼杯とのＲＰＥ細胞形態は、同様のものであった（図１２Ｄ、Ｅ）。更に、ＡｄＥＭＰＴＹとＡｄＣＡＧＧＦＰとによって事前処置された眼杯のＭＡＣ染色は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰとによって事前処置された眼杯のものよりもかなり大きかった（図１２Ｄ、Ｅ）。

ＧＦＰ発現のエリアでのＭＡＣ免疫蛍光内の減少の定量化は、ＡｄＥＭＰＴＹ＋ＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処置された眼杯と比べて、ＡｄＣＡＧＣＤ５９＋ＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処置された眼杯上で７．５分間のＮＨＳ処置で約６８％（ｐ＝０．００１８）、１５分間のＮＨＳ処置で約５６％（ｐ＝０．０００７）の平均値を明らかにした（図１２Ｃ）。さらに、ＡｄＣＡＧＣＤ５９＋ＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処置された眼杯のＧＦＰとＭＡＣ蛍光強度との間の反比例関係が、ＡｄＥＭＰＴＹ＋ＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処置された眼杯のものと比べられた（図１３Ｂ）。このことは、更に、ＭＡＣ沈着からの保護が、ｈＣＤ５９発現のレベルの関数であることを示している。

ＡｄＣＡＧＣＤ５９と負対照とによって事前処置された眼杯間のＭＡＣ沈着の違いは、マウスＥＭＭＰＲＩＮ発現内の違い、及び／又は、抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体結合の違い、に起因するものである。この可能性を評価するため、ＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰとの混合物によって事前処置された眼杯組織上のマウスＥＭＭＰＲＩＮ、又は、負対照（ＡｄＥＭＰＴＹ＋ＡｄＣＡＧＧＦＰの混合物）によって事前処置された眼杯組織上のマウスＥＭＭＰＲＩＮ、に対する免疫組織化学が、実行された。抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体分析は、ＭＡＣ沈着アッセイとして、同じ手順を用いて実行された。そして、眼杯組織は、洗浄され、固定され、適切なＣｙ３共役抗体によってインキュベートされた。ＲＰＥ上のＥＭＭＰＲＩＮ免疫蛍内の違いは、導入遺伝子の発現エリアと、眼杯組織の他の部分との間、又は、注射されていない対照眼杯組織（対照）の他の部分との間には認められなかった（図１４Ａ、Ｂ）。さらに、ＥＭＭＰＲＩＮ免疫蛍光の違いは、負対照の事前処置された眼杯組織と比べて、ＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰとの混合物によって事前処置された眼杯組織の導入遺伝子の発現エリア間には、認められなかった（図１４Ａ、Ｂ）。これらのデータは、明確に、ヒトＭＡＣ沈着からのマウスＲＰＥの保護がアデノウィルスによって送達されたｈＣＤ５９のインビボでの発現に起因するものである、ということを示している。

ＥＭＭＰＲＩＮ免疫蛍光の違いは、２つの倍率で観察された、ＡｄＣＡＧＣＤ５９＋ＡｄＣＡＧＧＦＰの混合物の遺伝子導入発現のエリア、そして、対照注射された眼杯（図１４Ａ、Ｂ、図１５）内には、認められなかった。同様の結果が、一次マウスＲＰＥ細胞によって得られた（図１６）。０継代ＲＰＥ細胞は、約５００ｖｐ／ｃｅｌｌのＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクター又はＡｄＣＡＧＧＦＰベクターによって事前処置され、接触後３日、細胞は、抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体に接触され、次に、４分間５０％ＮＨＳに曝露された。免疫組織化学は、ＡｄＣＡＧＣＤ５９ベクターによって事前処置された細胞は、ＡｄＣＡＧＧＦＰベクターによって事前処置された細胞と比べて、ＭＡＣ免疫染色のかなりの減少を示した（図１６）。後者のもののＭＡＣ免疫蛍光のデータは、何のベクター（対照）にも接触していない一次マウスＲＰＥ細胞のものと同様であった。

免疫組織化学方法によってアッセイされた、ＡｄＣＡＧＧＦＰ（図１４Ｃ）又はＡｄＣＡＧＣＤ５９（図１４Ｄ）によって事前処置された一次マウスＲＰＥ細胞は、ｈＣＤ５９の発現が、結果として、一次マウスＲＰＥ細胞内のＥＭＭＰＲＩＮ発現レベルに何の変化も生じなかったことを、示した。

ＭＡＣ沈着からの保護は、マウスＥＭＭＰＲＩＮの免疫細胞化学が、対照とＡｄＣＡＧＣＤ５９とによって事前処置された細胞の間に違いが無いことを明らかにしたのと同様に、ＥＭＭＰＲＩＮ発現、及び／又は、抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体結合内の違いに起因しない。記載されたデータは、ＲＰＥ上の、一次ＲＰＥ細胞上のヒトＭＡＣ沈着の破壊作用と、ｈＣＤ５９の発現によるこれらの細胞のかなりの保護とを実例説明するものである。

実例１６：ベクター媒介でｈＣＤ５９を送達することによる、ＭＡＣ沈着からの角膜内皮の保護
ＭＡＣ沈着と、アデノウィルスによって送達されたｈＣＤ５９による保護とは、マウス角膜内皮を使用して更にアッセイされた。角膜内皮は、容易に使用できる組織であり、エクスビボ及びインビボで培養され、アデノウィルスと他のベクターによって事前処置された。さらに、角膜内皮を用いたここでのアッセイでは、効率化のための角膜内皮の均質な形質導入と、補体抑制因子のある薬等の他の因子の効率のよい測定とが示された。角膜内皮上のＭＡＣ沈着の調査は、更に、ＭＡＣ沈着を阻害するものを選別し、インビトロおよびインビボでのＲＰＥ内の試験を補完するのに用いられた。

エクスビボでｈＣＤ５９を角膜内皮に送達することは、更に、２０分間、抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体と５０％ＮＨＳとを混合することによって、ヒトＭＡＣ沈着からこれらの細胞を実質的に保護することが、ここで認められた（図１７Ｂ，また図１１Ｃを参照）。対象的に、対照マーカータンパク質ＧＦＰの送達は、ヒトＭＡＣ沈着から角膜内皮を保護できず、処置されていない角膜の角膜内皮上のＭＡＣ沈着の広がりと同様のものであると認識された（対照について、図９Ｃ）。ＮＨＳに接触された角膜の角膜内皮上のＧＦＰ発現は、例えば、ＭＡＣの沈着による損傷によって、内皮細胞の消失に起因して、断片化して現れた（図１７Ａ）。この断片化は、ＮＨＳに曝露されていない対照角膜には認められなかった（図１１Ｄ、図１７Ｃ）。データは、ＡｄＣＡＧＣＤ５９によるＭＡＣからの角膜内皮の保護が、免疫組織化学がＡｄＣＡＧＣＤ５９と対照ＡｄＣＡＧＧＦＰの各々によって事前処置された角膜内皮上のＥＭＭＰＲＩＮ免疫染色に違いが無いことを明らかにしたのと同様に、ＥＭＭＲＰＩＮ発現、及び／又は、抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体結合の違いに起因するものでないことを示した。

角膜を抗マウスＥＭＭＰＲＩＮ抗体に接触させ、次に、３７℃で２０分間、５０％ＮＨＳを加えたものに接触させることによって、角膜内皮上に、広い範囲に及ぶ、明るいＭＡＣ免疫染色が結果として得られた（図１８Ａ）。最小限の染色が、（３７℃で２０分間）５０％ＨＩ−ＮＨＳによって処置された角膜の内皮上に認められた。ヒトＭＡＣ沈着から角膜内皮を保護するため、ｈＣＤ５９の有効性を評価するため、角膜は、エクスビボで、ＡｄＣＡＧＣＤ５９又は対照ＡｄＣＡＧＧＦＰベクターによって事前処置された。

データは、その後、エクスビボで、ＡｄＣＡＧＣＤ５９に感染される、角膜内皮上のｈＣＤ５９の発現が、抗ｈＣＤ５９抗体を用いる免疫組織化学によって確認され、一方で、ｈＣＤ５９の染色は、対照（ＡｄＣＡＧＧＦＰ）によって事前処置された角膜上に認められなかった、ということを示した（図１８Ｂ）。データが、ＧＦＰによる事前処置に比べ、８６％のＭＡＣ免疫蛍光強度の減少（ｐ＜０．０００１、図１８Ｃ）を示したように、角膜内皮のｈＣＤ５９による事前処置は、ヒトＭＡＣ沈着からこれらの細胞がかなり保護された。前記ＧＦＰによる事前処置は、ＭＡＣ沈着レベルが、事前処置されていない対照角膜の角膜内皮上のものと同様であるレベルで、角膜内皮の保護に欠けた。さらに、ＮＨＳ処置後の角膜の角膜内皮上のＧＦＰ発現は、ＭＡＣの沈着による損傷に起因して内皮細胞の断片化された指標を表した。この断片化は、ＮＨＳに曝露されていないＡｄＣＡＧＧＦＰによって事前処置された角膜上には認められなかった（図１８Ｂ、Ｄ）

免疫組織化学データが、ＡｄＣＡＧＣＤ５９とＡｄＣＡＧＧＦＰとによって事前処置された、そして、事前処置されていない対照角膜の、角膜内皮上のＥＭＭＰＲＩＮ免疫染色に、違いがない、ことを示したように、ＡｄＣＡＧＣＤ５９によって事前処置された角膜の角膜内皮上のＭＡＣ沈着からの保護は、異なるＥＭＭＰＲＩＮ発現及び／又は抗ＥＭＭＰＲＩＮ抗体結合の違いには起因しない、ということを示した（図１８Ｄ）。

これらのデータは、さらに、ｈＣＤ５９の事前処置が、ＭＡＣ沈着から眼組織を保護する、ということを示している。角膜内皮上の保護は、ＲＰＥのものよりも高いことが認められた。エクスビボで事前処置された角膜の内皮の高く、より均質な形質導入、血清成分の修飾因子(modulator)、制御因子(regulator)の薬効、黄班変性に作用する他の考え得る薬等の、更なる因子が、この保護に作用するかもしれない。

実例１７：溶解性の分泌されたｈＣＤ５９コンストラクトと、ベクターに接触された細胞内のヒトＣＤ５９発現
前記実例で用いられているＣＤ５９コンストラクトは、ＧＰＩリンカーを通じて膜結合性タンパク質を発現するように、構成されていた。Ｃ末端２６アミノ酸の配列コードを欠いているヒトＣＤ５９は、（下線を付した）ＸｈｏＩ部分（５’ｃｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｇｇａｃａａｔｃａｃａａｔｇｇｇ３’、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）を含むフォワードプライマーと、（下線を付した）ＥｃｏＲＶ部分（５’ｔａａｇｇａｇａｔａｔｃｔｔａａｔｔｔｃａａｇｃｔｇｔｔｃｇｔｔａ３’、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）を含むリバースプライマーと、を用いるＰＣＲ増幅である。前記Ｃ末端２６アミノ酸は、７７位で、残基アミノ酸アスパラギンをコードしているヌクレオチドのＧＰＩアンカーのアッタチメントのシグナル配列を含んでいる。リバースプライマーは、ヒトＣＤ５９の溶解型をコードする配列を結果として生じているアスパラギン７７後の終止コドンを導入した。ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶによって消化(digested)されたＰＣＲ産物は、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶ消化ｐＳｈＣＡＧへとクローン化され、結果として生じるプラスミドｐＳｈＣＡＧｓＣＤ５９は、ここで記載されたように、アデノウィルスＡｄＣＡＧＣＤ５９を生成するのに用いられた。これゆえ、ＧＰＩシグナルは、溶解性の分泌されたバージョンを発現するコンストラクトを得るための組換え方法によって除去され、分析は、分泌されたバージョンが、網膜に広がりやすく、遺伝子導入ベクターに直接接触され、形質導入されることなく、細胞に対するＭＡＣ沈着からの保護を与えるような、治療薬として有益か否かを試験するために実行された。

この構成を評価するため、細胞は、プラスミド上又はアデノウィルス上に発現された、溶解性ＣＤ５９コンストラクトを保有するように用意され、成長され、媒体内の発現が測定された。図１９は、ウェスタンブロット法の写真である。右から２番目のチャネルは、溶解性の分泌された（ＧＰＩリンカー除去された）バージョンであり、写真上でＡｄＣＡＧｓＣＤ５９／未ろ過媒体、とラベル付けされている。レーンは、約１６ｋＤの多量のタンパク質の分泌を示している。右のＡｄＣＡＧｓＣＤ５９／未ろ過媒体に対して２つ向こう側のチャネル（即ち、ＡｄＣＡＧＣＤ５９、右から１番目のチャネル）は、アデノウィルスからのＣＤ５９の非溶解性形態のものである。膜結合型のシグナルは、とても弱い。というのは、このブロットで用いられた抗体は、膜結合形態よりも、溶解性形態を、ずっとよく検出したからである。シグナル強度は、同じペプチド型の間でのみ比較を行った。

ＧＰＩシグナルを有していない、ＣＤ５９発現の作用を評価するため、溶解性分泌ＣＤ５９タンパク質が、網膜を通って細胞外へと広がり、遺伝子導入ベクターによって直接形質変換されていない細胞上のＭＡＣ沈着に対する保護を与え、溶解性ＣＤ５９タンパク質が網膜細胞内と角膜内とに発現されるように、改変された。ゆえに、これらの細胞と組織とは、改善された治療薬として、溶解性分泌ＣＤ５９のインビボでの試験を行なうために用意され、この構成が膜結合形態よりもＭＡＣ沈着の改善により有効であるか、否かについて測定された。

実験は、溶解性分泌ＣＤ５９発現ベクターが、ＭＡＣ沈着に関連している、細胞形態変化と細胞溶解とから、組織と細胞との保護の程度を決定するために、実行された。溶解性分泌ＣＤ５９発現ベクターは、また、ウェットＡＭＤのモデルにおいて試験された。

これらの実験からの結果は、膜結合形態と比べて黄班変性用の治療薬として、ＣＤ５９の溶解形態の潜在的利点の指標になるだろう。追加の可能性は、異なる状況下で、又は、組み合わせによって、膜結合形態と、溶解性形態と、の両方の使用を含むものである。

Claims (19)

1. 溶解性ＣＤ５９タンパク質をコードする核酸の発現のソースを含む医薬組成物である、被験者中の黄班変性を処置するための前記組成物であって、
   前記ＣＤ５９タンパク質をコードする核酸がグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定領域をコードする核酸配列の欠損を含み、
   前記組成物が、黄班変性を処置するのに有効な量で黄斑変性に感染した眼への送達のために処方され、眼への送達が黄斑変性に感染した眼の細胞による溶解性ＣＤ５９タンパク質の発現及び分泌をもたらす、医薬組成物。
2. 溶解性ＣＤ５９タンパク質をコードする核酸の発現のソースが、溶解性ＣＤ５９タンパク質をコードする遺伝子を備えている核酸ベクター、溶解性ＣＤ５９タンパク質をコードする遺伝子を備えているウィルスベクター、溶解性ＣＤ５９タンパク質を発現する宿主システム、からなるグループから選択される少なくとも１つである、請求項１記載の組成物。
3. 眼への送達のために処方された組成物が、注射、点眼、軟膏からなるグループから選択される少なくとも１つである、請求項１記載の組成物。
4. 注射が、眼内注射、結膜下注射、サブテノン嚢注射からなるグループから選択される少なくとも１つである、請求項３記載の組成物。
5. 組成物が、更に、抗癌、抗ウィルス、抗バクテリア、抗マイコバクテリア、抗真菌、抗増殖性、抗アポトーシスからなるグループから選択される少なくとも１つの薬剤を含む、請求項１記載の組成物。
6. インビボの溶解性ＣＤ５９タンパク質をコードする核酸の発現のソースを含む医薬組成物と、
   前記ＣＤ５９タンパク質をコードする核酸がグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定領域をコードする核酸配列の欠損を含み、前記組成物が、黄班変性を処置するのに有効な量で黄斑変性に感染した眼への送達のために処方されている、眼への送達が黄斑変性に感染した眼の細胞による溶解性ＣＤ５９タンパク質の発現及び分泌をもたらし、
   容器と、使用説明書とを含む、黄班変性を処置するためのキット。
7. ＣＤ５９タンパク質が親液性である、請求項６記載のキット。
8. 組成物が、注射、点眼、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、および、パッチのグループの少なくとも１つから選択される投与経路のために処方される、請求項１記載の組成物。
9. 組成物が、抗癌、抗ウィルス、抗バクテリア、抗マイコバクテリア、抗真菌、抗増殖性、抗アポトーシスのグループから選択される少なくとも１つの薬剤をさらに含む、請求項１記載の組成物。
10. 可溶性ＣＤ５９タンパク質が、野生型のＣＤ５９アミノ酸配列に実質的に由来するアミノ酸配列を含む、請求項１記載の組成物。
11. ＣＤ５９タンパク質のアミノ酸配列が、野生型のＣＤ５９アミノ酸配列と、少なくとも８５％同一で、または、少なくとも９５％同一である、請求項１０記載の組成物。
12. ＣＤ５９タンパク質のアミノ酸配列が保存配列改変を含む、請求項１０記載の組成物。
13. 保存配列改変が、置換、付加、又は、欠失の少なくとも１つを含む、請求項１２記載の組成物。
14. 組成物が薬学的に許容可能な担体を含む、請求項１記載の組成物。
15. ＣＤ５９タンパク質をコードする核酸の発現のソースが、膜独立性のＣＤ５９タンパク質をコードする核酸を含む、請求項１記載の組成物。
16. 核酸が、ＣＤ５９タンパク質組成物を発現するためのシグナルに操作可能にリンクされ、それによって、細胞がＣＤ５９タンパク質を発現し、分泌する、請求項１５記載の組成物。
17. 溶解性ＣＤ５９タンパク質がヒト由来である、請求項１記載の組成物。
18. 溶解性ＣＤ５９タンパク質がヒト由来である、請求項６記載のキット。
19. 前記ウィルスベクターが、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルペスウィルス及びレンチウィルスからなる群から選択される少なくとも１つのウィルスの遺伝子組換ゲノム由来である、請求項２記載の組成物。

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