KR20200119311A - 인플라마좀 활성화를 억제하기 위한 cd59 - Google Patents

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비니트 쿠마
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Abstract

세포 또는 염증-이환된 눈에서 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 가용성 CD59 단백질을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함으로써 대상체의 세포 또는 대상체의 염증-이환된 눈에서 인플라마좀 활성화를 억제하기 위한 방법 및 키트가 제공되며, 조성물은 인플라마좀 활성화를 억제한다.

Description

인플라마좀 활성화를 억제하기 위한 CD59
관련 출원
이 출원은 2018 2월 12일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/629,435; 및 2018년 3월 2일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/637,460에 대한 우선권의 이익을 주장한다.
정부 지원
본 발명은 국립 보건원에서 수여하는 보조금 번호 EY021805에 따라 정부의 지원을 받아 만들어졌다. 정부는 발명에 대한 특정 권리를 가고 있다.
보체는 타고난 면역계의 중요한 구성요소이며, 이의 역할은 특히 자가면역 질환, 암, 허혈/재관류 손상을 포함하는 다양한 염증 질환에서 설명되었다(Morgan, B. P., et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14, 857-877). 보체에 대한 역할은 또한 종래에 자가면역 포도막염의 실험 모델(EAU)로 설명되었다(An, F., et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 3778-3782; Copland, D. A., et al. (2010) Clin. Exp. Immunol. 159, 303-314; Read, R. W., et al. (2006) Exp. Eye Res. 82, 389-394; Zhang, L., et al. (2016) J. Leukoc. Biol. 99, 447-454). 보체의 활성화를 EAU에서 T 세포 매개된 병리와 연결하는 메카니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 보체의 활성화는 세포 막 상의 막 공격 복합체(MAC)의 어셈블리로 종결되어 기공의 형성을 발생시킨다. 아용해 수준에서 기공의 형성은 원형질막을 통한 이온 변화 및 사이토카인의 방출을 촉진한다. 결과적으로, MAC의 증착은 세포 용해로 이어진다. EAU의 병태생리에서 MAC의 역할은 아직 결정되지 않았다. MAC의 증착 후 세포내로의 Ca2+의 진입은 일차 폐 인간 상피 세포에서 NLRP3 인플라마좀을 활성화하는 것으로 알려져있다(Triantafilou, K., et al.(2013) J. Cell Sci. 126, 2903-2913).
NLRP3 인플라마좀은 연령 관련 황반변성, 심근병증, 관절염, 만성 신장 질환, 신경퇴행성 질환 등을 포함하는 다양한 염증성 질환에 연루되어 있다(Amin, J., et al.(2017) Brain pathol. 27, 192-204). 마우스에서 지질다당류(LPS)의 투여는 MAC 관련 IL-1β 성숙으로 이어진다(Laudisi, F., et al. (2013) J. Immunol. 191, 1006-1010). 인플라마좀이 보체에 의해 고도로 조절되며 조직 손상 또는 질병의 해결 동안 필요하지만, 비조절된 인플라마좀은 숙주 조직에 심각한 염증 및 손상으로 이어질 수 있다(Latz, E., et al. (2013) Nat. Rev. Immunol.13, 397-411). NLRP3 인플라마좀의 활성화는, 단백질 NLRP3의 증가된 발현을 포함하는 초기 프라이밍 신호 및 프로-IL-1β의 성숙 IL-1β로의 카스파제-1-매개된 절단을 발생시키는 인플라마좀 단백질 복합체의 형성에 필요한 후속 활성화 신호를 필요로 하는 2-단계 프로세스에 의해 제어된다(Broz, P., et al. (2016) Nat. Rev. Immunol. 16, 407-420). 비조절된 IL-1β 발현은 베체트병, 보그-고야나기-하라다 병, 류마티스 질환, 자가면역 갑상선 질환, 인슐린-의존성 당뇨병, 통풍, 가족성 지중해 열 및 크라이오피린-관련 주기적 증후군을 포함하는 자가면역 및 자가-염증 질환의 발병으로 이어질 수 있다(Dinarello, C. A., et al. (2013) Semin. Immunol. 25, 469-484; Gabay, C., et al. (2010) Nat. Rev. Rheumatol. 6, 232-241; Jesus, A. A., et al. (2014) Annu. Rev. Med. 65, 223-244). 또한, IL-1β는 골수 세포에 의해 망막에서 활동적으로 분비되며, 이는 EAU에서 IL-1R 시그널링의 잠재적인 병원성 역할을 나타냄이 확립되었다(Wan, C.K., et al.(2016) J. Immunol. 196, 543-546). 그러나, IL-1β가 EAU에서 어떻게 조절되는지에 대한 자세한 메카니즘에 대한 지식은 아직 파악하기 어렵다.
포도막염은 미국에서 전체 실명의 약 10% 내지 약 15%를 차지하는 눈의 포도막 및 망막 층의 만성 안구 염증성 질환이다(Durrani, O. M., et al. (2004) Ophthalmologica 218, 223-236). 포도막염은 외부 생물학적 제제가 면역 반응을 유발하는 경우 감염성으로서 또는 자가 면역 반응이 유발되는 경우 비-감염성으로서 분류된다. 포도막염에 대한 임상 치료는 코르티코스테로이드, 면역억제 약물 또는 단일클론 항체를 사용하였으나, 이러한 접근법은 성공이 제한적이며 심각한 부작용과 관련이 있다(Knickelbein, J.E, et al. (2017) Handb. Exp. Pharmacol. 242, 231-268; Prete, M. et al. (2016) Clin. Exp. Med. 16, 125-136). 따라서, 포도막염에 대한 효과적인 치료법을 개발하기 위한 충족되지 않은 임상적 필요가 존재한다.
개요
막 독립성(가용성) CD59 단백질로 인플라마좀 관련 장애를 앓고 있는 개체를 치료하기 위한 방법, 조성물 및 키트가 본원에 설명되어 있다. 막 독립성 CD59 단백질은 투여된 핵산으로부터 또는 단백질의 직접 투여로부터 발현될 수 있다. 인플라마좀 관련 장애를 치료하는데 사용하기 위한 막 독립성 CD59 단백질 또는 이의 조성물을 인코딩하는 핵산이 고려된다. 인플라마좀 관련 장애를 치료하는데 사용하기 위한 막 독립성 CD59 단백질 또는 이의 조성물이 또한 고려된다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 관련 장애는 대상체의 눈에 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 관련 장애는 포도막염, 알레르기성 결막염, 안검염, 만성 결막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 안구 흉터 유사 천포창, 점막 천포창, 익상편 공막염, 스티븐스-존슨 증후군, 일스병, 베체트병, 사르코이드증, 전신 홍반 루푸스, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 보그-고야나기-하라다병, 교감 눈염증 및 사르코이드증을 포함한다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 관련 장애는 포도막염을 포함한다. 가용성/막 독립성 CD59를 인코딩하는 단백질 또는 핵산은 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대해 양성 결과를 나타낸 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 양성 결과는 대상체의 눈에 존재한다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP). 특정 구현예에서, NALP는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)이다.
본원의 본 발명의 양태는 대상체의 염증-이환된 눈의 세포에서 인플라좀 활성화를 억제하기 위한 방법을 제공하며, 방법은 염증-이환된 눈의 세포에서 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 조성물은 인플라마좀 활성화를 억제한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "막 독립성"은 세포 막 또는 세포-막-결합 구조 예컨대, 막-결합된 단백질에 결합하는 기능 및 능력이 결여된 변형된 GPI 앵커를 갖거나 GPI 앵커가 결여된 CD59 아미노산 서열을 나타낸다. 방법의 구현예는 막 독립성 CD59가 MAC 기능과 무관하게 인플라마좀 활성화를 억제함을 제공한다.
방법의 구현예에서, 조성물은 막 공격 복합체(MAC)의 기능과 무관하게 인플라마좀 활성화를 억제한다. 방법의 구현예에서, 대상체는 하기로부터 선택된 적어도 하나의 질병을 갖는다: 포도막염, 알레르기성 결막염, 안검염, 만성 결막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 당뇨 망막병, 안구 흉터 유사 천포창, 점막 천포창, 익상편 공막염, 스티븐스-존슨 증후군, 일스병, 베체트병, 사르코이드증, 전신 홍반 루푸스, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 보그-고야나기-하라다병, 건선, 면역 용혈 빈혈, 저혈소판자색반병, 알츠하이머병, 다발 경화증, 심근 경색증, 죽상경화 혈관병, 미세혈관합병증, 갑상선염, 염증성 장질환, 기관 이식 거부, 막성 콩팥염, 교감 눈염증 및 사르코이드증.
방법의 구현예에서, 포도막염은 하기로부터 선택된 적어도 하나이다: 앞포도막염, 중간 포도막염, 뒤포도막염 및 범포도막염. 방법의 구현예는 대상체로부터 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함한다. 방법의 구현예에서, 샘플은 하기로부터 선택된 적어도 하나이다: 눈물, 혈액, 소변, 눈 분비물, 가래 및 점액.
방법의 구현예는 투여 전에 눈의 망막 기능 및 인플라마좀 활성 마커 중 적어도 하나를 눈에서 측정하는 것을 추가로 포함한다. 방법의 구현예는 투여 후에 눈의 망막 기능 및 인플라마좀 활성 마커 중 적어도 하나를 눈에서 측정하는 것을 추가로 포함한다.
방법의 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된 적어도 하나이다:
카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+. 방법의 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP). 방법의 구현예에서, NALP는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)이다.
방법의 구현예에서, 망막 기능 또는 인플라마좀 활성 마커의 측정은 하기로부터 선택된 적어도 하나의 절차를 수행하는 것을 추가로 포함한다: 눈 검사, 광 간섭 단층 촬영(OCT), 결막 인상 세포학(CIT), RTPCR, ELISA 및 PCR.
방법의 구현예는 조성물을 포도막염을 치료하기에 충분한 투여량으로 투여하는 것을 추가로 포함한다. 방법의 구현예는 투여 전에 바이러스 벡터에서 뉴클레오티드 서열을 조작하는 것을 추가로 포함한다. 방법의 구현예는 네이키드 핵산으로서 뉴클레오티드 서열을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
방법의 구현예에서, 바이러스 벡터는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 바이러스의 유전자 조작된 게놈이다: 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스 및 렌티바이러스. 방법의 구현예에서, 렌티바이러스는 레트로바이러스이다.
방법의 구현예는 번역된 CD59 단백질의 글리코실 포스파티딜 이노시톨(GPI) 앵커링 도메인의 기능 손실을 발생시키는 적어도 하나의 돌연변이를 갖도록 막 독립성 CD59 단백질을 조작하는 것을 추가로 포함한다. 방법의 구현예는 글리코실 포스파티딜 이노시톨(GPI) 앵커링 도메인의 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드를 결실시킴으로써 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 조작하는 것을 추가로 포함한다.
방법의 구현예에서, 투여는 조성물을 안구 주입하는 것을 추가로 포함한다. 방법의 구현예에서, 투여는 조성물을 국소 적용하는 것을 추가로 포함한다. 방법의 구현예에서, 안구 주입은 망막하 주입, 유리체 주입, 안구내 주입, 결막하 주입 및 테논하 주입으로 구성된 군으로부터 선택된다. 방법의 구현예에서, 안구 주입은 눈의 외부 층에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
방법의 구현예는 추가의 치료제를 눈에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 방법의 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다: 항-종양제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항-마이코박테리아제, 항-진균제, 항-증식제 및 항-아폽토틱 제제. 방법의 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 성장 인자, 항-염증 제제, 혈관수축제, 콜라게나제 억제제, 스테로이드, 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 아스코르베이트, 안지오텐신, 칼레티쿨린, 테트라사이클린, 피브로넥틴, 콜라겐, 트롬보스폰딘, 전환 성장 인자(TGF), 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF 결합 단백질(IGFBP), 상피세포 성장 인자(EGF), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), neu 분화 인자(NDF), 간세포 성장 인자(HGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 헤파린-결합 EGF(HBEGF), 트롬보스폰딘, 폰 빌레브란트 인자-C, 헤파린, 헤파린 설페이트 및 히알루론산.
본원에서 본 발명의 양태는 대상체의 염증-이환된 눈에서 인플라마좀의 활성을 억제하기 위한 키트를 제공하며, 키트는 하기를 포함한다: 막-의존성 CD59 단백질 및/또는 상기 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 약학적 조성물로서, 조성물은 대상체의 염증-이환된 눈에서 인플라마좀을 억제하기에 충분한 투여량으로 존재하는 약학적 조성물; 사용 설명서; 및 용기.
본원의 본 발명의 양태는 대상체에서 포도막염을 치료하기 위한 키트를 제공하며, 키트는 하기를 포함한다: 막-독립성 CD59 단백질 및/또는 상기 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 약학적 조성물로서, 대상체에서 포도막염을 치료하기에 충분한 투여량으로 존재하는 약학적 조성물; 사용 설명서; 및 용기.
본원에서 본 발명의 양태는 대상체의 염증-이환된 눈의 세포에서 인플라마좀 활성화를 억제하기 위한 방법을 제공하며, 방법은 염증-이환된 눈의 세포에서 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 상기 조성물은 인플라마좀 활성화를 억제하며, 대상체는 대상체의 염증-이환된 눈에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성을 위한 양성 결과를 나타내었다. 방법의 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+. 방법의 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP). 방법의 특정 구현예에서, NALP는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)이다. 방법의 특정 구현예에서, 방법은 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물의 투여 후 눈에서 인플라마좀 활성 마커를 측정하는 것을 추가로 포함한다. 방법의 특정 구현예에서, 대상체는 포도막염, 알레르기성 결막염, 안검염, 만성 결막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 안구 흉터 유사 천포창, 점막 천포창, 익상편 공막염, 스티븐스-존슨 증후군, 일스병, 베체트병, 사르코이드증, 전신 홍반 루푸스, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 보그-고야나기-하라다병, 교감 눈염증 및 사르코이드증으로 진단되었거나 이들을 앓고 있는 의심된다. 특정 구현예에서, 대상체는 포도막염으로 진단되었거나 이들을 앓고 있는 것으로 의심되었다. 본원에 기술된 대상체의 염증-이환된 눈에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대한 양성 결과는 포도막염, 알레르기성 결막염, 안검염, 만성 결막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 안구 흉터 유사 천포창, 점막 천포창, 익상편 공막염, 스티븐스-존슨 증후군, 일스병, 베체트병, 사르코이드증, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 보그-고야나기-하라다병, 교감 눈염증 또는 사르코이드증으로 진단되지 않거나 이를 앓고 있지 않은 개체의 눈에서의 적어도 하나의 인플라마좀 활성의 발현 또는 활성과 비교하여 증가된 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성을 나타낸다. 대안적으로, 대상체의 염증-이환된 눈에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성은 조직학적 스코어에 의해 결정된다.
본원에 기술된 특정 양태는 염증-이환된 대상체의 세포에서 인플라마좀 활성화를 억제하기 위한 방법이며, 상기 방법은 (a) 염증-이환된 대상체의 세포에서 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하거나; (b) 가용성 CD59 단백질을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 상기 조성물은 인플라마좀 활성화를 억제한다. 특정 구현예에서, 조성물은 막 공격 복합체(MAC)의 기능과 무관하게 인플라마좀 활성화를 억제한다. 특정 구현예에서, 대상체는 알츠하이머병, 다발 경화증, 심근 경색증, 죽상경화 혈관병, 미세혈관합병증, 갑상선염, 염증성 장질환, 기관 이식 거부, 막성 콩팥염, 교감 눈염증 및 사르코이드증으로부터 선택된 적어도 하나의 인플라마좀 관련 질병을 갖는다. 특정 구현예에서, 방법은 대상체로부터 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 샘플은 하기로부터 선택된 적어도 하나이다: 혈액, 혈장, 혈청, 말초혈 단핵 세포, 뇌척수액 또는 소변. 특정 구현예에서, 방법은 투여 전에 대상체에서 인플라마좀 활성 마커를 측정하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 투여 후에 대상체에서 인플라마좀 활성 마커를 측정하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된 적어도 하나이다: 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+. 특정 구현예에서, 방법은 인플라마좀 관련 질병을 치료하기에 충분한 투여량으로 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스 및 렌티바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 바아러스의 유전자 조작된 게놈이다. 특정 구현예에서, 렌티바이러스는 레트로바이러스이다. 특정 구현예에서, 투여는 조성물을 정맥내 주입하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 조성물을 국소적으로 적용하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 방법은 추가적인 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 추가적인 치료제는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다: 항-종양제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항-마이코박테리아제, 항-진균제, 항-증식제 및 항-아폽토틱 제제. 특정 구현예에서, 추가적인 치료제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 성장 인자, 항-염증제, 혈관수축제, 콜라게나제 억제제, 스테로이드, 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 아스코르베이트, 안지오텐신, 칼레티쿨린, 테트라사이클린, 피브로넥틴, 콜라겐, 트롬보스폰딘, 전환 성장 인자(TGF), 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF 결합 단백질(IGFBP), 상피세포 성장 인자(EGF), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), neu 분화 인자(NDF), 간세포 성장 인자(HGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 헤파린-결합 EGF(HBEGF), 트롬보스폰딘, 폰 빌레브란트 인자-C, 헤파린, 헤파린 설페이트 및 히알루론산. 또 다른 양태에서, 본원에 기술된 것은 대상체의 염증-이환된 세포에서 인플라마좀의 활성을 억제하기 위한 키트이며, 이러한 키트는 (a) (i) 막-독립성 CD59 단백질 및/또는 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (ii) 가용성 CD59 단백질을 포함하는 약학적 조성물로서, 대상체의 염증-이환된 세포에서 인플라마좀을 억제하는데 충분한 투여량으로 존재하는 약학적 조성물; (b) 사용 설명서; 및 (c) 용기를 포함한다.
본원에 기술된 또 다른 양태는 알츠하이머병, 다발 경화증, 심근 경색증, 죽상경화 혈관병, 미세혈관합병증, 갑상선염, 염증성 장질환, 기관 이식 거부, 막성 콩팥염, 교감 눈염증 및 사르코이드증으로부터 선택된 적어도 하나의 질병을 치료하기 위한 방법이며, 방법은 (a) (i) 세포로부터 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (ii) 가용성 CD59 단백질을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 조성물은 인플라마좀 활성화를 억제한다. 또 다른 양태에서, 본원에 기술된 것은 염증-이환된 대상체의 세포에서 인플라마좀 활성화를 억제하기 위한 방법이며, 방법은 (a) 대상체에서 인플라마좀 활성 마커를 측정하는 단계; 및 (b) 인플라마좀 활성 마커가 양성인 경우, 대상체에 (i) 염증-이환된 대상체의 세포에서 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (ii) 가용성 CD59 단백질을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며; 조성물은 인플라마좀 활성화를 억제한다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+. 특정 구현예에서, 방법은 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 가용성 CD59 단백질을 포함하는 조성물의 투여 후 대상체에서 인플라마좀 활성 마커를 측정하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 기술된 또 다른 양태는 염증-이환된 대상체의 세포에서 인플라마좀 활성화를 억제하기 위한 방법이며, 방법은 (a) 염증-이환된 대상체의 세포에서 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (b) 가용성 CD59 단백질을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 조성물은 인플라마좀 활성화를 억제하며, 대상체는 염증-이환된 대상체에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성을 위한 양성 결과를 나타내었다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP). 특정 구현예에서, NALP는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)이다. 특정 구현예에서, 방법은 (a) 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (b) 가용성 CD59 단백질을 포함하는 조성물의 투여 후 대상체에서 인플라마좀 활성 마커를 측정하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 포도막염, 알레르기성 결막염, 안검염, 만성 결막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 안구 흉터 유사 천포창, 점막 천포창, 익상편 공막염, 스티븐스-존슨 증후군, 일스병, 베체트병, 사르코이드증, 전신 홍반 루푸스, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 보그-고야나기-하라다병, 교감 눈염증 및 사르코이드증으로 진단되었거나 이들을 앓고 있는 것으로 의심된다. 특정 구현예에서, 대상체는 포도막염으로 진단되었거나 이를 앓고 있는 것으로 의심된다. 특정 구현예에서, 염증-이환된 대상체에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대한 양성 결과는 알츠하이머병, 다발 경화증, 심근 경색증, 죽상경화 혈관병, 미세혈관합병증, 갑상선염, 염증성 장질환, 기관 이식 거부, 막성 콩팥염, 교감 눈염증 및 사르코이드증으로 진단되지 않거나 이를 앓고 있지 않은 대상체에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성과 비교하여 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 증가된 발현 또는 활성이다. 특정 구현예에서, 염증-이환된 대상체에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성을 위한 양성 결과는 조직학적 스코어에 의해 결정된다.
도 1a - 도 1f는 MAC 매개된 NLRP3 인플라마좀 활성화가 EAU에서 IL-1β 생성을 증가시킴을 입증하는 일련의 현미경 사진 및 막대 그래프이다. 값은 평균 ± SEM으로 표시된다. GCL, 신경절 세포 층; INL, 내부 핵 층; ONL, 외부 핵 층; OS, 외부 세그먼트, 스케일 바 - 100 μm.
도 1a는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(왼쪽 열) C5b9 항체(중간 열)로 염색된 망막 냉동 절편의 일련의 현미경 사진이며, 이는 마우스의 정상 대조군 망막과 비교하여 EAU 망막에서 증가된 MAC 형성을 나타낸다. C9-/- EAU 마우스 망막(하단 줄)은 음성 C5b9 단백질인 것으로 관찰되었으며, 따라서 MAC에 대해 관찰되었다.
도 1b는 EAU 망막(중간 막대) 및 대조군 조직에서 ELISA에 의해 측정된 IL-1β 단백질 생성의 막대 그래프이다. EAU 망막에서 IL-1β 단백질의 생성은 ELISA에 의해 대조군 망막의 112%, RT-PCR에 의해 45배 증가한 것으로 관찰되었다. 정상 대조군 망막과 비교하여 C9-/- EAU 망막에서 37% 더 높은 IL-1β 단백질 수준 및 IL-1β 단백질 및 MRNA 각각 3.8배 증가가 관찰되었다.
도 1c는 EAU 망막(중간 막대) 및 대조군 조직에서 RT-PCR에 의해 측정된 IL-1β mRNA 생성의 막대 그래프이다. EAU 망막에서 IL-1β mRNA의 수준은 정상 대조군 망막보다 4464% 더 높은 것으로 관찰되었다. C9-/- EAU 망막에서 IL-1β mRNA 수준은 정상 대조군 망막보다 285% 더 높은 것으로 관찰되었다.
도 1d는 마우스의 정상 대조군 망막과 비교하여 EAU 망막에서 200% 더 높은 NLRP3 단백질 수준이 관찰되었음을 보여주는 웨스턴 블롯 및 막대 그래프의 사진이다. 마우스의 정상 대조군 망막과 비교하여 약간 더 높은 NLRP3 단백질 수준이 C9-/- EAU 망막에서 관찰되었다.
도 1e는 마우스의 정상 대조군 망막과 비교하여 EAU 망막에서 80% 더 높은 카스파제 1(p20) 단백질 수준이 관찰되었음을 보여주는 웨스턴 블롯 및 막대 그래프의 사진이다. 마우스의 정상 대조군 망막과 비교하여 C9-/- EAU 망막에서 30% 더 많은 양의 카스파제 1(p20) 단백질 수준이 관찰되었다.
도 1f는 마우스의 정상 대조군 망막과 비교하여 EAU 망막에서 44% 더 많은 ASC 단백질을 보여주는 웨스턴 블롯 및 막대 그래프의 사진이다. C9-/- EAU 마우스 망막에서 ASC 수준은 정상 대조군 망막과 비교하여 약간 증가된 것으로 관찰되었다. 웨스턴 블롯 및 RT-PCR 값은 β-액틴으로 정규화되었다.
도 2a - 도 2b는 EAU에서 망막 기능에 대한 MAC 형성의 효과를 보여주는 일련의 망막전위도(ERG) 파형 및 선 그래프이다. 본원의 예에서 얻은 데이터는 EAU가 광수용체에 광범위한 손상을 일으켜 정상 대조군 망막과 비교하여 망막 기능을 손상시킨다는 것을 나타낸다.
도 2a는 정상, EAU 및 C9-/- EAU 군의 일련의 ERG 반응이다. 암 적응(암순응) 및 광 적응(광순응) 반응은 정상, EAU 및 C9-/- EAU 마우스 망막에서 분석되었다. 암 적응 ERG에 있어서, -20dB(데시벨)(0.025 cds/m2), -10dB(0.25 cds/m2) 및 0dB(2.5 cds/m2) 플래쉬 광 강도가 사용되었다. 광-적응 ERG에 있어서, 0dB(2.5 cds/m2) 및 1dB(3.15 cds/m2) 플래쉬 광 강도가 사용되었다.
도 2b는 강도에 대해 플로팅된 암 및 광-적응 a-파 ERG 진폭 및 b-파 ERG 진폭의 일련의 선 그래프이다. 암-적응 ERG에 있어서, -20db, -10dB 및 0dB 플래쉬 광 강도가 사용되었다. 광-적응 ERG에 있어서, 0dB 및 1dB 플래쉬 광 강도가 사용되었다. 값은 평균 ± SEM으로 표시된다. EAU 대비 * p <0.05, #p <0.05.
도 3a - 도 3f는 C9-/- 마우스가 EAU로부터 보호되지 않음을 보여주는 일련의 현미경 사진 및 점도표이다. 본원의 예에서 마우스는 2.5 mg/mL 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 함유하는 0.2 mL의 완전 프로인트 애주번트(CFA) 에멀젼 중의 200 μg의 IRBP(1-20) 펩티드로 피하 면역화시켰다. 동시에 마우스에 복강내 주입을 통해 100 μl 인산염 완충 염수(PBS)에 희석된 1.5 μg 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis) 독소를 주입하였다. 24일 후에 안저 EAU 중증도를 정상, EAU 및 C9-/- EAU 마우스 사이에서 분석하였다. 국소 병변, 선형 병변, 혈관염, 망막 출혈, 침윤 및 망막 박리를 검사하였다. 이러한 발견의 중증도에 따라 EAU 임상 스코어는 0-4 등급으로 등급을 매겼다.
도 3a는 망막 염증성 침윤(흰색 화살표 머리), 혈관염(흰색 화살표) 및 망막 주름(검정색 화살표)을 보여주는 EAU 및 C9-/- EAU 군의 안저 이미지의 일련의 현미경 사진이다.
도 3b - 도 3f는 각각 개체의 전체 임상 스코어, 혈관 구조 스코어, 세포 침윤 스코어, 시신경 유두 스코어 및 구조적 손상 스코어의 점 도표이다. 혈관 구조 스코어(도 3c), 세포 침윤 스코어(도 3d), 시신경 유두 스코어(도 3e) 및 구조적 손상 스코어(도 3f)의 조합이 계산되고, 개체의 전체 임상 스코어(도 3b)로서 플롯팅된다. 값은 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 4a - 도 4e는 EAU, 정상 대조군 및 C9-/- EAU 마우스로부터 조직의 망막 이미징 및 조직학의 일련의 현미경 사진 및 막대 그래프이다.
도 4a는 정상 대조군 마우스가 아닌 EAU 및 C9-/- EAU 마우스에서 망막 주름(빨간색 화살표) 및 유리체 세포 침윤(흰색 화살표)을 보여주는 수평 OCT 스캔의 일련의 현미경 사진이다.
도 4B는 EAU 유도 후 24일에 채취하고 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 파라핀 매립된 눈으로부터 얻은 망막 절편(5 μm)의 일련의 현미경 사진이다. 유리체(V)에서 염증성 면역 세포의 침윤은 검정색 화살표로 표시되며; 검정색 별표는 망막(R) 박리를 나타내며; 망막 주름은 흰색 화살표로 표시된다.
도 4c - 도 4e는 본원의 예에 기재된 바와 같이 각각 세포 침윤, 혈관염 및 광수용체 손상을 개별적으로 스코어링한 EAU 병상의 중증도 정도를 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 값은 평균 ± SEM으로 표시된다. RPE-CH, RPE 및 맥락막; R, 망막; V, 유리체; GCL, 신경절 세포 층; INL, 내부 핵 층; ONL, 외부 핵 층; OS, 외부 세그먼트; OpN, 시신경, 스케일 바 100 μm.
도 5a - 도 5f는 가용성 CD59가 EAU에서 NLRP3 인플라마좀 활성화 및 IL-1β 생성을 억제함을 보여주는 일련의 현미경 사진 및 막대 그래프이다.
도 5a는 AAVCAGsCD59 또는 대조군 AAVCAGGFP가 주입되고 C5b9 항체 또는 DAPI로 염색된 EAU 마우스의 눈의 망막 냉각 절편의 일련의 현미경 사진이다.
도 5b는 ELISA에 의해 측정된 IL-1β 단백질 수준의 막대 그래프이다. AAVCAGsCD59가 주입된 EAU 마우스의 망막에서 IL-1β 단백질 수준은 AAVCAGGFP를 주입한 대조군 EAU 마우스의 망막보다 40% 낮은 것으로 관찰되었다.
도 5c는 RT-PCR에 의해 측정된 IL-1β mRNA 수준의 막대 그래프이다. AAVCAGsCD59를 주입한 EAU 마우스의 망막에서 IL-1β 단백질 수준은 대조군 AAVCAGGFP를 주입한 EAU 마우스의 망막보다 70% 낮은 것으로 관찰되었다.
도 5d는 대조군 AAVCAGGFP가 주입된 EAU 마우스의 망막과 비교하여 AAVCAGsCD59가 주입된 EAU 마우스의 망막에서 60% 더 적은 NLRP3 단백질 양을 보여주는 웨스턴 블롯 및 막대 그래프의 사진이다.
도 5e는 대조군 AAVCAGGFP가 주입된 EAU 마우스의 망막보다 AAVCAGsCD59가 주입된 EAU 마우스의 망막에서 60% 더 적은 카스파제 1(p20) 단백질을 보여주는 웨스턴 블롯 및 막대 그래프의 사진이다.
도 5f는 AAVCAGsCD59가 주입된 EAU 마우스의 망막 및 대조군 AAVCAGGFP가 주입된 EAU 마우스의 망막에서 유사한 ASC 단백질 수준을 보여주는 웨스턴 블롯 및 막대 그래프의 현미경 사진이다. 웨스턴 블롯 및 RT-PCR 값은 β-액틴으로 정규화된다. 값은 평균 ± SEM으로 표시된다. GCL, 신경절 세포 층; INL, 내부 핵 층; ONL, 외부 핵 층; OS, 외부 세그먼트, 스케일 바 - 100 μm.
도 6a - 도 6b는 가용성 CD59가 EAU에서 망막 기능을 개선시킴을 보여주는 일련의 망막전위도(ERG) 파형 및 선 그래프이다.
도 6a는 AAVCAGsCD59 또는 대조군 AAVCAGGFP가 주입된 EAU 마우스에서의 ERG 반응 세트이다. 암 적응(암순응) 및 광 적응(광순응) 반응 둘 모두는 AAVCAGsCD59 또는 대조군 AAVCAGGFP가 주입된 EAU 마우스의 망막에서 분석하였다. 암-적응 ERG에 있어서, -20dB(0.025 cds/m2), -10dB(0.25 cds/m2) 및 0dB(2.5 cds/m2) 플래쉬 광 강도를 사용하였다. 광-적응 ERG에 있어서, 0dB(2.5 cds/m2) 및 1dB(3.15 cds/m2) 플래쉬 광 강도를 사용하였다.
도 6b는 강도에 대해 플로팅된 암 및 광-적응 a-파 및 b-파 ERG 진폭을 보여주는 일련의 선 그래프이다. 암-적응 ERG에 있어서, -20db, -10dB 및 0dB 플래쉬 광 강도를 사용하였다. 광-적응 ERG에 있어서, 0dB 및 1dB 플래쉬 광 강도를 사용하였다. C57BL/6J 대조군으로부터의 ERG 반응은 도 2a에 제시된다. 값은 평균 ± SEM으로 표시된다. *p<0.05, #p<0.05 vs AAVCAGGFP.
도 7a - 도 7f는 가용성 CD59가 EAU에서 임상 스코어의 중증도를 약화시킴을 보여주는 일련의 현미경 사진 및 점도표이다. 안저 EAU 중증도는 PBS, AAVCAGsCD59 및 AAVCAGGFP가 주입된 EAU 마우스에서 분석하였다. EAU 임상 스코어는 0-4 등급으로 등급이 매겨졌다.
도 7a는 망막 염증성 침윤(흰색 화살표 머리), 혈관염(흰색 화살표) 및 유두부종(흰색 별표)을 보여주는 PBS, AAVCAGsCD59 또는 AAVCAGGFP가 주입된 마우스의 안저 이미지의 일련의 현미경 사진이다.
도 7b - 도 7f는 각각 개별 전체 임상 스코어, 혈관 구조 스코어, 세포 침윤 스코어, 시신경 유두 스코어 및 구조적 손상 스코어의 점 도표이다. 혈관 구조 스코어, 세포 침윤 스코어, 시신경 유두 스코어 및 구조적 손상 스코어의 조합을 계산하고 개별 전체 임상 스코어로서 플롯팅하였다. AAVCAGsCD59가 주입된 EAU 마우스 군의 망막은 대조군 AAVCAGGFP가 주입된 마우스 군의 망막과 비교하여 세포 침윤, 혈관 구조 및 구조적 손상 및 전체 임상 스코어에 대한 통계적으로 유의하게 개선된 개별 스코어를 갖는 것으로 관찰되었다. 시신경 유두 스코어(도 7e)의 차이는 대조군 AAVCAGGFP가 주입된 EAU 마우스와 비교하여 AAVCAGsCD59가 주입된 EAU 마우스에 대해 통계적으로 유의하지 않은 것으로 관찰되었다. PBS 및 AAVAGGFP가 주입된 눈 사이의 차이는 통계적으로 무의미한 수준이었다. 값은 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 8a - 도 8e는 EAU 마우스에서 OCT 변화 및 망막 조직학적 스코어에 대한 CD59의 효과를 보여주는 일련의 현미경 사진 및 막대 그래프이다.
도 8a는 AAVCAGGFP 또는 대조군 AAVCAGsCD59 또는 대조군 PBS가 주입된 EAU 마우스의 망막에서 망막 주름(빨간색 화살표) 및 망막에서 유리체 세포 침윤(흰색 화살표)을 보여주는 수평 OCT 스캔의 일련의 현미경 사진이다.
도 8b는 EAU 유도 후 24일에 파라핀 매립되고 헤마톡실린과 에오신으로 염색된, 눈으로부터 얻은 망막 절편(5 μm)의 일련의 현미경 사진이다. 유리체(V)에서 염증성 면역 세포의 침윤은 검정색 화살표로 표시되며; 망막(R) 박리는 검정색 별표로 표시되며; 망막 주름은 흰색 화살표로 표시된다.
도 8c - 도 8e는 본원의 예에 기재된 바와 같이 각각 세포 침윤, 혈관염 및 광수용체 손상을 개별적으로 스코어링한 EAU 병상의 중증도 정도를 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 값은 평균 ± SEM으로 표시된다. RPE-CH, RPE 및 맥락막; R, 망막; V, 유리체; GCL, 신경절 세포 층; INL, 내부 핵 층; ONL, 외부 핵 층; OS, 외부 세그먼트; OpN, 시신경, 스케일 바 100 μm.
도 9는 EAU 망막에서 MAC의 상승을 보여주는 막대 그래프이다. EAU 마우스의 망막에서 MAC 형광 강도의 양은 마우스의 정상 대조군 망막과 비교하여 MAC 형성에서 70% 더 높은 것으로 관찰되었다. 값은 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 10a - 도 10d는 EAU 망막에서 Th1 및 Th17 세포의 분화에 대한 MAC의 효과를 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 바로 절개된 망막은 대조군, EAU 및 C9-/- EAU 망막에서 ELISA 및 RT-PCR을 사용하여 IL-17 및 IFN-γ의 mRNA 및 단백질 수준에 대해 정량화되었다.
도 10a는 대조군 정상 마우스의 망막에서의 IFN-γ 단백질 발현 수준보다 각각 EAU 마우스의 망막에서 각각 IFN-γ 단백질 수준이 102%이며, MRNA가 200배 더 높음을 보여주는 막대 그래프이다. C9-/- EAU 망막에서 IFN-γ 단백질 발현 수준은 대조군 정상 마우스의 망막에서의 IFN-γ 단백질 발현 수준보다 14% 더 높은 것으로 관찰되었다.
도 10b는 EAU 마우스의 망막에서 IFN-γ mRNA 수준이 대조군 정상 마우스의 망막에서 IFN-γ mRNA 수준과 비교하여 200배 더 높았고 단백질이 정상의 102%임을 보여주는 막대 그래프이다. C9-/- EAU 망막에서 IFN-γ mRNA 수준은 대조군 정상 마우스의 망막에서의 IFN-γ mRNA 수준과 비교하여 1315% 더 높은 것으로 관찰되었다.
도 10c는 EAU 마우스의 망막에서 IL-17 단백질 수준이 정상 대조군 망막에서의 IL-17 단백질 수준보다 99% 더 높은 것으로 관찰되었음을 보여주는 막대 그래프이다. C9-/- EAU 마우스의 망막에서 IL-17 단백질 수준은 정상 대조군 마우스의 망막에서의 IL-17 단백질 수준과 비교하여 단지 44% 더 높은 것으로 관찰되었다.
도 10d는 EAU 마우스 및 C9-/- EAU 마우스의 망막에서 IL-17 mRNA 수준을 보여주는 막대 그래프이다. 정상 대조군 망막의 IL-17 mRNA 수준은 검출 한계 미만으로 유지되었다. 각 실험은 2 내지 3회 반복하였다. 값은 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 11a - 도 11c는 EAU 마우스의 배수 림프절(DLN)에서 Th1 및 Th17 세포의 IFN-γ 또는 IL-17의 양의 일련의 산점도 및 막대 그래프이다. DLN 세포를 EAU 유도 24일 후 EAU 및 C9-/- EAU 마우스로부터 수집하였다.
도 11a는 CD4+ 세포에 대해 플롯팅된 IL-17A 및 IFN-γ에 대해 염색된 DLN으로부터의 세포에 대한 일련의 산점도이다.
도 11b 및 도 11c는 정상 대조군 마우스와 비교하여 EAU 마우스에서 배수 림프절로부터 IL-17 및 IFN-γ 양성 CD4+ 세포의 현저한 증가를 보여주는 막대 그래프이다. EAU 마우스 대비 C9-/- EAU 마우스에서 배수 림프절로부터의 IL-17 양성 CD4+ 세포 및 IFN-γ 양성 CD4+ 세포의 백분율 차이는 유의하지 않은 것으로 관찰되었다. 각 실험은 3회 반복하였다. 값은 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 12는 MAC 형성이 EAU 망막에서 AAVCAGsCD59의 단일 유리체내 주입에 의해 억제됨을 보여주는 막대 그래프이다. AAVCAGsCD59 망막이 주입된 EAU 마우스의 망막에서 MAC 형광 강도의 양은 대조군 AAVCAGGFP가 주입된 EAU 마우스의 망막에서의 양과 비교하여 MAC 형성에서 45% 감소하였다. 값은 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 13a - 도 13d는 가용성 CD59가 EAU 망막에서 Th1 및 Th17 세포의 분화를 억제함을 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 새로 절개된 망막은 AAVCAGsCD59 및 대조군 AAVCAGGFP이 주입된 EAU 마우스에서 ELISA 및 RT-PCR을 사용하여 IL-17 및 IFN-γ의 mRNA 및 단백질 수준에 대해 정량화되었다.
도 13a는 대조군 AAVCAGGFP가 주입된 EAU 마우스의 IFN-γ 단백질 수준과 비교하여 AAVCAGsCD59가 주입된 EAU 마우스의 망막에서 IFN-γ 단백질 수준이 25% 더 적음을 보여주는 막대 그래프이다.
도 13b는 대조군 AAVCAGGFP가 주입된 EAU 마우스의 IFN-γ mRNA 수준과 비교하여 AAVCAGsCD59가 주입된 EAU 마우스의 망막에서 IFN-γ mRNA 발현 수준이 47% 더 적음을 보여주는 막대 그래프이다.
도 13c는 대조군 AAVCAGGFP가 주입된 EAU 마우스의 IL-17 단백질 수준과 비교하여 AAVCAGsCD59가 주입된 EAU 마우스의 망막에서 IL-17 단백질 수준이 35% 더 적음을 보여주는 막대 그래프이다.
도 13d는 대조군 AAVCAGGFP가 주입된 EAU 마우스의 IL-17 mRNA 수준과 비교하여 AAVCAGsCD59가 주입된 EAU 마우스의 망막에서 IL-17 mRNA 수준이 10% 더 적음을 보여주는 막대 그래프이다. IL-17 및 IFN-γ의 mRNA 양의 차이는 통계적으로 유의하지 않은 것으로 관찰되었다. 각 실험은 2 내지 3회 반복하였다. 값은 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 14a - 도 14c는 3.5 x 109 게놈 복사체/μl의 AAVCAGsCD59 또는 AAVCAGGFP(1 μl)를 주입하고, 1주 후 EAU로 자극하고, 24일 동안 유지시킨 6주령 C57Bl/6J 마우스의 망막을 보여주는 현미경 사진 및 웨스턴 블롯이다.
도 14a는 마우스 망막에서 GFP의 발현을 나타내는 안저 이미지이다.
도 14b는 신경절 세포 층(상단 줄), 경증 EAU 마우스로부터의 망막에서 내부 망상 층 및 내부 핵 층(중간 열), 및 광수용체 및 망막 색소 상피 세포에서 GFP 발현을 나타내는 중증 EAU 마우스로부터의 망막(하단 줄)에서 GFP의 강력한 발현을 나타내는 AAVCAGFP 주입 군의 망막 냉동 절편 이미지이다. 상단 줄: 대조군 AAVCAGsCD59
도 14c는 AAVCAGsCD59의 단일 유리체내 주입 후 마우스 망막으로부터 sCD59의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다. 약어: GCL, 신경절 세포 층; INL, 내부 핵 층; ONL, 외부 핵 층; OS, 외부 세그먼트: RPE, 망막 색소 상피 세포.
상세한 설명
막 독립성(가용성) CD59 단백질로 인플라마좀 관련 장애를 앓고 있는 개체를 치료하기 위한 방법, 조성물 및 키트가 본원에 설명되어 있다. 막 독립성 CD59 단백질은 투여된 핵산으로부터 또는 단백질의 직접 투여로부터 발현될 수 있다. 인플라마좀 관련 장애를 치료하는데 사용하기 위한 막 독립성 CD59 단백질 또는 이의 조성물을 인코딩하는 핵산이 고려된다. 인플라마좀 관련 장애를 치료하는데 사용하기 위한 막 독립성 CD59 단백질 또는 이의 조성물이 또한 고려된다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 관련 장애는 대상체의 눈에 존재한다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 관련 장애는 포도막염, 알레르기성 결막염, 안검염, 만성 결막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 안구 흉터 유사 천포창, 점막 천포창, 익상편 공막염, 스티븐스-존슨 증후군, 일스병, 베체트병, 사르코이드증, 전신 홍반 루푸스, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 보그-고야나기-하라다병, 교감 눈염증 및 사르코이드증을 포함한다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 관련 장애는 포도막염을 포함한다. 가용성/막 독립성 CD59를 인코딩하는 핵산 또는 단백질은 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대해 양성 결과를 나타낸 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 양성 결과는 대상체의 눈에 있다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP). 특정 구현예에서, NALP는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)이다.
망막 간광수용체-결합 단백질(IRBP)로부터 유래된 펩티드로의 마우스의 면역화는 인간 포도막염에서 관찰된 임상 및 조직학적 특징과 유사한 T-세포 매개된 자가면역 질환을 발생시킨다(Caspi, R. R., et al. (1988) J. Immunol 140, 1490-1495; Chan, C. C., et al. (1990) J. Autoimmun. 3, 247-255). 이러한 자가면역 포도막염의 이러한 실험 모델(EAU)은 포도막염의 연구 및 이러한 질병의 치료 개발을 위한 접근법으로서 사용되며, 본원의 예에서 사용된다.
MAC가 EAU의 발병기전에 관여할 수 있는 잠재적 메카니즘을 더 이해하고 EAU의 발달에서 NLRP3 활성화 및 IL-1β의 생성의 중요성을 밝히기 위해, MAC 증착을 EAU 망막에서 조사하였으며, MAC는 NLRP3 인플라마좀의 활성화 및 IL-1β의 후속 방출에 필수적일 수 있다.
MAC는 C5b, C6, C7, C8 및 12개 이하의 C9 분자 중 각각 하나의 분자를 함유한다. C9-/- 마우스는 기능하는 MAC을 조립할 수 없으므로 이러한 마우스는 EAU로부터 부분적으로 보호될 수 있다. 본원의 예에서, EAU는 대조군 C57BL/6J 마우스 및 C9-/- 마우스에서 유도되었으며, 대조군 마우스에서의 EAU 병상을 C9-/- 마우스에서의 EAU 병상과 비교하였다. EAU에서 C9를 억제하는 치료적 잠재력은 사전형성된 C5b-8 복합체 내로의 C9의 혼입을 방지하는 단백질인 가용성 CD59를 발현하는 아데노-관련 바이러스(AAV)(AAVCAGsCD59)를 사용하여 유전자 치료 접근법으로 조사하였다. AAVCAGsCD59-주입된 마우스에서 EAU의 발달은 안저 이미지화, 스펙트럼 도메인 광 간섭 단층 촬영(SD-OCT), 망막 조직병리학 및 면역조직화학에 의해 모니터링되었다. 망막 기능은 망막전위도(ERG)에 의해 정량화되었으며, NLRP3 인플라마좀 활성화는 웨스턴 블롯, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA) 및 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 측정되었다. 본원의 예에서 관찰된 결과는 EAU의 발달에서 NLRP3 인플라마좀 및 IL-1β 생성의 활성화제로서 MAC에 대한 직접적인 역할을 처음으로 연관시킨다. 본원의 예의 데이터는 가용성 CD59의 AAV-매개된 발현이 포도막염의 치료를 위한 잠재적인 유전자 치료법임을 처음으로 입증한다.
본원의 예에서, EAU에서 NLRP3 인플라마좀의 활성화에서 MAC의 직접적인 역할을 조사하였다. 본원의 예로부터의 데이터는 MAC가 EAU 망막에 증착되어, NLRP3 인플라마좀의 활성화 및 IL-1β의 증가된 생성을 발생시킴을 입증한다. 예는 C9 -/- EAU 마우스가 이들의 망막에 MAC를 형성하지 못하고 동시에 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 약화시켰음을 추가로 입증하며, 이는 EAU에서 NLRP3 인플라마좀의 활성화와 MAC의 증착과 사이의 연결을 나타낸다. C9-/- 마우스가 EAU 병리학적 표현형을 구제하지 못하더라도 MAC로의 C9 혼입 억제인자인 sCD59의 AAV-매개된 전달은 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 포함하는 EAU 병리학적 표현형의 많은 측면을 예기치 않게 약화시킨다.
보체 시스템은 선천적 면역의 주요 구성 요소이며, 혈장 및 막-결합 단백질의 다양한 군으로 구성된다. 이러한 막-결합 단백질은 병원체에 대한 보호 및 면역 및 염증 과정의 조절에서 중심적인 역할을 한다. 숙주 방어를 위한 병원체에 대한 보체의 활성화가 필요하지만 과잉-활성화된 보체는 숙주 조직에 손상을 줄 수 있다(Morgan, B.P., et al.(2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14, 857-877; Carroll, M.V. et al. (2011) Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 965-975). 따라서, 보체 조절 단백질에 의한 보체 활성화와 보체 억제 사이의 균형을 유지하는 것이 필요하다. 과잉-활성화되고 조절되지 않은 보체 시스템은 MAC의 형성으로 종결되며, 이는 EAU를 포함한 다양한 안구 장애에 관여하는 것으로 나타났다(An, F., et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 3778-3782; Copland, D. A., et al. (2010) Clin. Exp. Immunol. 159, 303-314; Read, R. W., et al. (2006) Exp. Eye Res. 82, 389-394; Gehrs, K. M., et al. (2010) Arch. Ophthalmol. 128, 349-358; Yanai, R., et al. (2012) Adv. Exp. Med. Biol. 946, 161-183). 그러나, EAU의 발병기전에서 MAC 증착의 직접적인 역할은 조사되어야 한다. 본원의 예에서, MAC가 EAU에서 증착되어 IL-1β의 생성이 증가하는 것이 관찰되었다. 그러나, MAC 형성 능력이 결여되어 결과적으로 감소된 IL-1β 수준을 갖는 C9-/- EAU 마우스가 관찰되었다.
세포 막 상의 MAC 증착은 결국 용해에 의한 세포 사멸을 초래하지만, 세포 막 상의 아용해 MAC는 세포 주기 및 증식의 조절, 아폽토시스, 사이토카인 생성 및 다운스트림 신호 전달 캐스케이드의 개시와 관련이 있다(Morgan, B. P., et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14, 857-877). NLRP3 인플라마좀 복합체는 일차 조절 서브유닛 NLRP3, 어댑터 서브유닛 ASC 및 프로-IL-1β를 활성 IL-1β로 전환하는 이펙터 서브유닛 카스파제-1로 구성된 세포질 단백질의 군이다(Latz, E., et al. (2013) Nat. Rev. Immunol.13, 397-411; Broz, P., et al. (2016) Nat. Rev. Immunol. 16, 407-420). LPS-프라이밍된 모델에서의 최근 연구는 아용해 MAC-유도된 기공 형성이 세포내 Ca2+의 축적으로 이어지며, 이는 후속적으로 NLRP3 인플라마좀을 활성화시켰음을 보여주었다(Triantafilou, K., et al. (2013) J. Cell Sci. 126, 2903-2913; Laudisi, F., et al. (2013) J. Immunol. 191, 1006-1010). NLRP3 인플라마좀은 이전에 여러 안구 질환과 관련이 있었다(Devi, T. S., et al. (2012) Exp. Diab. Res. 2012, 438238; Tseng, W. A., et al. (2013) Invest Ophthalmol Vis Sci 54, 110-120). 본원의 예에서의 관찰은 NLRP3 인플라마좀의 활성화의 약화가 포도막염의 치료를 위한 신규한 치료적 접근법임을 입증하였다. 본원의 예는 EAU 마우스 모델에서 MAC 및 NLRP3 인플라마좀 활성화의 직접적인 역할을 처음으로 입증한다. 본원의 예에서 얻은 데이터는 MAC가 NLRP3, 카스파제-1 및 ASC 서브유닛의 단백질 발현을 직접적으로 활성화시키고 증가시켰음을 입증한다. 이러한 활성화된 서브유닛은 활성 IL-1β를 생성하는 NLRP3 인플라마좀 복합체를 형성한다. C9-/- EAU 마우스는 NLRP3 인플라마좀을 활성화시키지 않았으며, IL-1β는 기저 수준에 가깝게 유지되며, 이는 MAC-의존 경로로서 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 확인시켜 준다.
자가반응 이펙터 CD4+ T 세포는 EAU에서 발병기전과 관련된다. Th1 계통과 Th17 계통 둘 모두는 특히 EAU 발달에 책임이 있으며 포도막염 환자에서 보고되었다(Amadi-Obi, A., et al. (2007) Nat. Med. 13, 711-718; Caspi, R. R., et al. (1996) J. Immunol. 157, 2668-2675). 또한, IL-1β 신호 전달은 CD4+ T 세포의 Th17 세포로의 분화를 촉진한다(Chung, Y., et al.(2009) Immunity 30, 576-587). 최근 연구는 IL-1 신호 전달 경로를 차단하면 마우스에서 EAU를 잠재적으로 치료할 수 있음을 보여주었다(Wan, C.K., et al.(2016) J. Immunol. 196, 543-546). IL-1R 길항제 아나킨라(anakinra), 가용성 미끼 IL-1R 릴로나셉트(rilonacept) 및 IL-1b-중화 항체 카나키누맙(canakinumab)은 포도막염 치료용으로 승인되었다(Knickelbein, J. E., et al. (2017) Handb. Exp. Pharmacol. 242, 231-268). 그러나, 여러 부작용 및 짧은 작용 지속 기간으로 인해 사용이 제한된다. 본원의 예에서, IL-1β의 증가된 생성이 EAU에 이환된 마우스 망막에서 관찰되었으며; 그러나, EAU에 이환된 C9-/- 마우스 망막에서 더 낮은 IL-1β 수준이 관찰되었다. 또한, Th1 및 Th17 세포의 증가된 분화는 EAU에 이환된 마우스 망막에서 관찰되었으며; 그러나, 감소된 Th1 및 Th17 세포는 각각의 IL17 및 IFN-γ 단백질 및 mRNA 수준에 의해 나타나는 바와 같이 EAU에 이환된 C9-/- 망막에서 관찰되었다. 또한, 증가된 수준의 Th1 및 Th17 양성 CD4 세포는 EAU 마우스로부터의 DLN에서 관찰되었다. 그러나, Th1 및 Th17 양성 CD4 세포의 수준은 C9-/- EAU 마우스로부터의 DLN에서 변하지 않는 것으로 관찰되었다. 임의의 특정 이론 또는 작용 메카니즘에 의해 제한되지 않으면서, 여기에서 EAU 망막에서 Th1 및 Th17 세포의 MAC-유도된 IL-1β 생성 및 분화가 국소 효과임이 구상된다.
많은 보체 조절 단백질이 세포 표면에서 분비되거나 발견되어 숙주 조직에 대한 보체 매개 손상을 방지한다. 이러한 단백질은 인자 H, 붕괴 가속 인자(CD55), 막 보조인자 단백질(CD46) 및 프로텍틴(CD59)을 포함한다. 이러한 보체 조절 단백질의 감소된 활성 또는 결핍은 EAU 및 실험적 자가면역 앞포도막염을 포함하는 면역병리로 이어질 수 있다(Morgan, B. P., et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14, 857-877; An, F., et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 3778-3782; Carroll, M. V., et al. (2011) Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 965-975; Jha, P., et al. (2006) J. Immunol. 176, 7221-7231). 자가면역 포도막염은 전신 질환과 관련된 만성 및 다인성 질환이다. 다양한 연구에서 보체 활성화의 억제가 마우스에서 EAU 병리를 개선하는데 도움이 될 수 있음을 보여주었다(An, F., et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 3778-3782; Copland, D. A., et al. (2010) Clin. Exp. Immunol. 159, 303-314; Read, R. W., et al. (2006) Exp. Eye Res. 82, 389-394). 본원의 방법의 구현예는 sCD59를 EAU 마우스에 전달하기 위해 AAV를 이용하는 장기-작용 유전자 치료 접근법을 입증한다. 처음으로 AAVCAGsCD59가 EAU 망막에서 MAC 증착을 억제하는 것으로 입증된다. 본원의 예는 AAVCAGsCD59가 NLRP3 인플라마좀의 활성화 및 약화된 IL-1β 생성을 억제함을 입증한다.
또한, 본원의 예는 AAVCAGsCD59의 단일 유리체내 주입이 EAU 마우스에서 표현형 병상을 억제하였음을 입증한다. 이러한 마우스에서, EAU와 관련된 임상 징후는 감소된 염증, 더 적은 면역 세포 침윤 및 감소된 혈관염과 같이 현저하게 개선되었다. 본원의 예에서 얻은 데이터는 AAVCAGsCD59 주입이 두 암 적응 및 광 적응 ERG 둘 모두에서 EAU와 관련된 망막 기능의 손실을 개선시킴을 입증한다. 본원의 예에서 C9-/- 마우스는 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 유의하게 억제하는 것으로 관찰되었고 IL-1β의 상향조절을 감소시키는 것으로 관찰되었다. C9-/- EAU 마우스에서 개선된 조직학적 스코어 및 개선된 망막 기능의 경향이 관찰되었지만, ERG의 몇 가지 데이터 포인트를 제외하고는 그 차이가 통계학적 유의성의 유의한 수준에 도달하지 않은 것으로 관찰되었다.
예기치 않게, 본 발명자들의 연구는 AAVCAGsCD59가 아마도 C5b-8 복합체에의 C9의 혼입을 차단하는 것 이외의 방법으로 염증을 약화시킴을 시사하다. GPI-앵커링된 CD59는 종래에 CD2에 결합하여 T 세포 내에서 활성화 신호를 변환하는 것으로 보고되었다(Deckert, M. et al.(1995) Eur J Immunol. 25, 1815-22). CD59 가교는 T 세포 수용체 제타/ZAP-70 신호 전달 캐스케이드 및 인터루킨-2(IL-2) 합성을 유도한다. IL-2는 타입 1 당뇨병 및 혈관염을 포함하는 질병에서 면역 시스템을 조절하는데 성공적인 것으로 밝혀졌으며(Hartemann, A. et al.(2013) The Lancet. Diabetes & Endocrinology. 1, 295-305), 이는 sCD59가 MAC 독립적 방식으로 염증을 약화시킬 수 있다는 가설을 뒷받침한다. 포도막염을 분석하기 위해 본원에 사용된 EAU 모델은 경증 내지 중등증 EAU 발병과 관련된 불일치를 가지고 있다. 이러한 사소한 변화는 결과에 상당한 영향을 미칠 수 있다.
포도막염은 만성 염증성 질환이며, 많은 환자들이 재발에 직면하고 있으며, 그들 중 일부는 이용 가능한 치료법에 불응성이다. 전반적으로, 전신성 자가면역 질환(베체트병, 보그-고야나기 병 등) 환자에서 중증 및 진행된 단계의 포도막염을 관리하는데 있어 기존 치료법은 상당한 부작용과 단기적 효능으로 인해 여전히 제한적이다. 포도막염 관리를 위한 치료는 지난 수십년 동안 유의하게 발전하지 못하였다(Knickelbein, JE, et al.(2017) Handb. Exp. Pharmacol. 242, 231-268). 이러한 우려를 고려하여, 포도막염 환자에서 인플라마좀의 MAC 의존성 활성화의 지속적 억제와 같이 장기간 지속되는 치료법을 개발하는 것이 실용적이다. 따라서, AAVsCD59의 단일 유리체내 주입은 현재 치료법의 단기 효과에 비해 상당한 잠재력과 이점을 갖는다. AAV 의존 유전자 치료법이 동물 모델에서 안구 질환을 치료하는데 성공적인 것으로 나타났다(Adhi, M., et al.(2013) PLoS One 8, e79661; Ildefonso, C.J., et al.(2015) Hum. Gene Ther 26, 59-68). 또한, AAV-매개된 유전자 치료법은 노화-관련 황반 변성에 대한 인간 임상 시험으로 성공적으로 발전되었다(Mingozzi, F., et al.(2011) Nat. Rev. Genet. 12, 341-355).
본원의 예는 MAC가 EAU에서 NLRP3 인플라마좀 활성화 및 IL-1β 생성의 중요한 조절인자임을 입증하였다. MAC는 IL-1β 생성을 증가시킴으로써 Th1 및 Th17 세포의 분화에 중요한 역할을 한다. sCD59의 AAV-매개된 발현은 MAC 증착을 효율적으로 억제하고 후속하여 NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제하는 것으로 관찰되었다. AAVCAGsCD59의 단일 유리체내 주입은 마우스에서 EAU의 발병을 효율적으로 억제하는 것으로 관찰되었다.
CD59 단백질
CD59는 인간 적혈구, 림프구 및 혈관 내피 세포를 포함하는 세포 막과 관련된 것으로 발견된 막-결합 당단백질이다. CD59 단백질은 기능성 MAC의 어셈블리를 억제하여 보체-매개된 활성화 및/또는 용해로부터 세포를 보호하다.
임의의 특정 이론 또는 작용 메카니즘에 의해 제한되지 않으면서, 세포의 원형질 막은 C9 보체 단백질이 막 C5b-8에 결합시 C5b-9 기공의 활성화를 특이적으로 억제하는 세포-표면 단백질, 예를 들어 CD59에 의한 보체의 효과로부터 일반적으로 보호됨이 여기에서 구상된다(Holguin et al. 1989 J. Clin. Invest. 84: 7-17; Sims et al. 1989 J. Biol. Chem. 264: 19228-19235; Davies et al. 1989 J. Exp. Med. 170: 637-654; Rollins et al. 1990 J. Immunol. 144: 3478-3483; and Hamilton et al. 1990 Blood 76: 2572-2577). CD59는 C5b-8 복합체의 C8 보체 단백질에 결합하기 위해 C9 보체 단백질과 경쟁하며, 이에 의해 C5b-9 막 공격 복합체의 형성을 감소시키거나 방지한다. 따라서, CD59는 말단 보체 MAC에 의해 세포 활성화 및 세포 용해 둘 모두를 감소시키는 작용을 한다.
성숙한 인간 CD59 단백질은 77개 아미노산으로 구성되며 분자량은 18-21 kD이다. 전구체 인간 CD59 단백질은 25개 아미노산의 아미노-말단 신호 펩티드 및 26개 아미노산의 카르복실-말단 펩티드를 포함하며, 이는 막 앵커의 부착을 발생시킨다. 전구체 인간 CD59의 실례의 아미노산 서열, 성숙한 인간 CD59 및 다른 포유동물 예를 들어, 비비, 아프리카 녹색 원숭이, 올빼미 원숭이, 마모셋, HVS-15, 돼지, 토끼, 래트 및 마우스의 CD59 서열은 2007년 1월 23일 발행된 심스(Sims) 등의 미국 특허 번호 7,166,568(참조로 통합됨)에 제시되어 있다.
CD59의 단백질 구조는 단일 시스테인-풍부 도메인, 3개의 루프 및 작은 네 번째 나선형 루프가 있는 소수성 코어를 포함하다(Yu et al. 1997 Journal of Experimental Medicine 185(4):745-753).
CD59를 인코딩하는 유전자의 구조 및 서열이 특징화되었다(Fodor et al. U.S. patent number 5,624,837 issued April 29, 1997; 참조로 통합). 유전자는 인간의 크로모좀 11의 짧은 암, 특히 크로모좀 11p13 및 11p14에 위치하며(Online Mendelian Inheritance in Man accession number and 107271), 20 kb에 걸친 4개 엑손으로 구성된다(Petranka et al. 1992 Proc. Nat. Acad. Sci. 89: 7876-7879). 비번역된 첫 번째 엑손 앞에는 콘센서스 TATA 또는 CAAT 모티프가 결여된 G 및 G-풍부 프로모터 영역이 온다. 두 번째 엑손은 단백질의 소수성 리더 서열을 인코딩하고, 세 번째 엑손은 성숙 단백질의 N-말단 부분을 인코딩한다. 네 번째 엑손은 세포 막에 대한 글리코포스포이노시탈(GPI) 앵커 부착을 위한 소수성 서열을 포함하는, 성숙한 단백질의 나머지를 인코딩한다.
CD59는 인간 말초혈 백혈구, 적혈구 및 많은 세포주에서 발현되는 글리코실포스파티딜이노시톨-앵커링된 당단백질이다. 단백질은 조혈 및 비-조혈 세포 둘 모두, 예를 들어, 내피 세포, 말초 신경 섬유, 뉴런, 미세아교세포, 희소돌기아교세포, 별아교세포, 뇌실막 세포, 상피 세포, 침샘의 샘꽈리 세포, 기관지 상피 세포, 세뇨관 및 편평 상피 세포에서 발현된다. 각각 그 전체가 본원에 참조로 통합된 문헌 [Nose, M. et al. 1990 Immunology 70(2): 145-149; Vedeler, C. et al. 1994 Immunology 82(4): 542-547; and Hidestima, T. et al. 1990 Immunology 69(3): 396:401] 참조. CD59를 인코딩하는 cDNA는 문헌 [Sawada, R. et al. 1989 Nucleic Acids Res 17(16): 6728]에 보고되었다. CD59를 인코딩하는 CDNA는 또한 인간 T-세포 백혈병(YT) 및 인간 적백혈병(K562) 세포주로부터 클로닝되었으며, CD59는 COS 세포에서 일시적으로 발현되었다(Walsh, L.A. et al. 1990 Eur J. Immol 21(3): 847-850). 인간 CD59는 C 말단에 위치하는 26개 아미노산을 포함하며, 이는 77번 위치의 아미노산 아스파라긴에서 글리코실 포스파티딜 이노시톨 앵커(GPI 앵커)의 부착을 위한 신호 서열을 특정한다. CD59의 cDNA 서열은 그 전체가 본원에 참조로 통합된 1997년 4월 29일 발행된 포도르(Fodor) 등의 미국 특허 번호 5,624,837에 제시되어 있다.
CD59와 MAC의 구성 요소의 물리적 회합의 분석은 CD59에 대한 별도의 결합 부위가 인간 C8 및 인간 C9 각각의 α-사슬 내에 함유되어 있음을 보여준다. 인간 CD59와 인간 C9의 상호작용을 위한 결합 부위는 성숙한 인간 CD59의 서열에서 아미노산 잔기 42번 내지 58번으로서 확인되었으며, 이는 그 단백질의 인간 아미노산 잔기 334번 내지 418번, 더욱 특히 인간 C9 아미노산 잔기 359번 내지 384번에 상응하는 인간 C9 영역에 결합하며, 바로 C9의 예측된 막-삽입 도메인에 대한 바로 C-말단이다(Sims et al. PCT/US96/17940 filed November 8, 1996, 그 전체가 본원에 참조로 통합됨).
성숙 인간 CD59 분자의 활성 부분에 대한 지식 및 공개된 NMR 데이터로부터의 성숙한 인간 CD59의 용액 구조로부터 확인된, C8/C9에 결합할 수 있는 활성 표면 노출된 아미노산 잔기 측쇄는 44번 위치의 히스티딘, 48번 위치의 아스파라긴, 49번 위치의 아스파르트산, 51번 및 52번 위치의 트레오닌, 55번 위치의 아르기닌 및 58번 위치의 글루탐산이다. CD59에 대한 NMR 구조는 기탁 [Kieffer, et al., Human Complement Regulatory Protein CD59(Extracellular Region, Residues 1 70; NMR, 10 Structures), MMDB Id:891, PDB Id:1ERH; Kieffer et al., Human Complement Regulatory Protein CD59(Extracellular Region, Residues 1 70; NMR, Restrained), MMDB Id:890, PDB Id:1ERG; Fletcher et al., CD59 Complexed With Glcnac-Beta-1,4-(Fuc-Alpha-1,6)-Glcnac-Beta-1(NMR, 10 Structures), MMDB Id:498, PDB Id:1CDS; Fletcher et al., CD59 Complexed With Glcnac-Beta-1,4-Glcnac-Beta-1(NMR, 10 Structures), MMDB Id:497, PDB Id:1CDR]에 설명되어 있다. 1CDS 및 1CDR은 플래쳐(Fletcher) 등에 의해 기탁되어 있다. 동일한 상대 위치에서 이들 측쇄를 제공하는 CD59의 아미노산 서열은 인간 CD59와 유사한 방식으로 기능하며(Sims et al.), 이러한 변이체는 본원의 방법, 키트 및 약학적 조성물의 범위 내에 있다.
보체 활성화와 자가항체의 비정상 수준 간의 관계는 황반 변성 및 기타 병태와 같은 안구 질환과 관련하여 분석되었다. 2005년 12월 29일 공개된 하게만(Hageman) 등의 미국 특허 출원 번호 2005/0287601(참조로 통합됨)은 AMD 환자의 샘플에서 망막 단백질(RPE 및 맥락막 단백질)에 특이적인 자가항체의 존재를 측정함으로써 황반 변성을 진단할 것을 제안한다.
이론은 보체에 의한 알츠하이머병 및 연령-관련 황반 변성의 원인을 보체 시스템의 활성화 및 MAC의 형성을 억제하는 것의 방지와 연결시켰다. 2007년 8월 23일 공개된 디누(Dinu) 미국 특허 출원 번호 2007/0196367 A1(참조로 통합됨)은 알츠하이머병 및 AMD의 치료법으로서 보체를 억제함에 의한 잔해 형성 방지를 제안한다. 2007년 8월 30일이 공개된 파틸(Patil) 등의 미국 특허 출원 번호 2007/0203190 A1(참조로 통합됨)은 보체 활성화의 추정 억제제로서 하이드록실아민 화합물(예를 들어, TEMPOL-H, TEMPO-H, 및 OXANO-H) 또는 에스테르 유도체를 열거한다.
2005년 12월 1일 공개된 톰린슨(Tomlinson) 등의 미국 특허 출원 번호 2005/0265995(참조로 통합됨)는 아미노-말단의 보체 억제인자 Crry 및 CD59 각각을 래트 사구체 상피 세포 및 근위 관형 상피 세포에 결합하는 단일-사슬 항체(scFv)에 연결시킴으로써 생성되는 제제를 사용하여 래트에서 보체-유도된 단백뇨를 억제한다. 가용성 CD59는 이 참고 문헌에서 억제인자로서 효과가 없는 것으로 설명되어 있다. 문헌 [Bora et al. 2007 J. Immunol 178:1783-1790]은 재조합 방법을 사용하여 면역글로불린 G(IgG1)의 결합 암인 Fc를 CD59 단백질에 융합함으로써(rsCD59a-Fc) 막 표적화 조성물을 생성하며, 이러한 융합물을 마우스에 정맥내, 안구내(유리체내) 및 복강내 경로로 주입한다. CNV-양성 반점의 수는 유리체내 및 정맥내 경로와 비교하여 복강내 경로에 의해 융합 단백질로 처리된 대상체에서 감소되었다. Fc 관능성은 일반적으로 융합 단백질의 접촉시 및 비-특이적으로 투여 후 세포에 즉각적인 결합을 발생시킬 수 있다. 정제된 단백질의 투여는 프로테아제 및 펩티다제의 존재로 인해 대사 및 반감기에 대해 더욱 제한된다. 문헌 [Tomlinson et al. 2009 IOVS 50(7): 3056-3064]은 세포 상의 막 분자를 표적으로 하는 보체 수용체 2(CR2)의 단편에 인자 H의 N-말단 결합 도메인을 결합시킴으로써 생성된, 융합 단백질 보체 억제인자를 인코딩하는 플라스미드를 CNV 반점을 가진 동물에 정맥내 주입함으로써 마우스 모델의 CNV 반점 크기를 감소시켰다.
본원에 제공된 CD59 조성물은 기능성 GPI 앵커에 대한 일차 아미노산 서열이 결여되어 있다. 기능적으로 등가의 단백질은 막을 표적으로 하는 능력이 기능적으로 결함이 있으며 결여된 변형된 GPI 앵커 도메인 아미노산 서열을 포함한다. sCD59는 재조합 막-독립성 CD59(rmiCD59)의 예이다. 막-독립성 CD59를 수득하는 추가적인 방법은 막 회합의 억제인자를 제공하는 것과 같은 비-재조합 방법, 예를 들어 GPI 앵커가 결여되도록 생체내 또는 시험관내에서 CD59를 합성하는 방법을 포함한다. 막-독립성 CD59를 수득하는 방법은 본원의 예에 제시되어 있다. 분자의 핵산 서열 및 아미노산 서열을 변경하기 위한 추가적인 재조합 기술은 유전학 및 분자 생물학 분야에 잘 알려져있다.
다양한 구현예에서, 본원에 기재된 CD59 단백질은 가용성 CD59 단백질이다. 조성물은 CD59 단백질을 제공하고, 77번 위치에서 아미노산 아스파라긴을 인코딩하는 뉴클레오티드에서 GPI 앵커의 부착을 위한 신호 서열을 제거하도록 변형된 CD59의 전장 핵산을 포함한다. 대안적으로, CD59의 핵산 서열은 GPI 앵커 위치에서 변형된 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 수득하기 위해 점 돌연변이, 치환 또는 결실에 의해 변형되어 단백질이 세포의 막에 부착할 수 없게 된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "막 독립성"은 세포 막 또는 세포-막-회합된 구조 예컨대, 막-결합된 단백질에 결합하는 기능 및 능력이 결여된 변형된 GPI 앵커를 갖거나 GPI 앵커가 결여된 CD59 아미노산 서열을 나타낸다. GPI 앵커는 GPI 기능을 방해하기 위해 하나 이상의 돌연변이를 도입하기 위해 또는 GPI 앵커링 도메인을 제거하기 위해 재조합 DNA 기술을 통해 변형될 수 있다. 이들 하나 이상의 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 삽입, 하나 이상의 아미노산의 결실, 또는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다.
GPI 앵커링은 많은 유전자 생성물의 상호작용을 포함하는 소포체에서의 다단계 경로를 포함한다. CD59를 포함하는 많은 단백질은 GPI가 세포 표면에 발현되고 효과적으로 기능하기 위해 필요하다. 단백질 신호의 구조가 GPI 앵커의 부착을 위해 인코딩하는 메카니즘은 문헌[Orlean et al. 2007 JLR 48: 993-1011]에서 검토된다. GPI 부착은 단백질을 ER에 표적으로 하게 하는 소수성 N-말단 분비 신호, 및 C-말단 GPI 신호 앵커 서열을 함유하는 아미노산 서열을 포함한다. 단백질의 아미노 말단에 위치하며 생체내에서 절단되는 천연 CD59 분비 신호 이외에, 다른 분비 신호는 CD59 단백질에 적합하며, 본원의 방법의 범위 내에 있다. 여기에서 포유동물 세포에 사용하기에 적합한 일반적인 진핵 분비 신호는 예를 들어, 문헌 [Ding et al. U.S. patent number 6,733,997 B1 issued May 11, 2004; Tan et al. 2002 Protein Engineering 15(4): 337-345; and Tan et al. 1999 Biochim. Biophys. Acta 1452: 103-120]에 기술되며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
GPI가 연결되는 아미노산은 오메가(ω) 잔기로서 지칭되며, 오메가 잔기에 대한 아미노산 N-말단은 오메가-마이너스(ω-)로서 지칭되며, 오메가 잔기에 대한 아미노산 C-말단은 오메가-플러스(ω+)로서 지칭된다. GPI 앵커 서열은 유연한 링커 영역을 형성하는, 약 10개의 극성 아미노산(즉, ω-10 내지 ω-1의 스트레치) 예를 들어, 아르기닌, 라이신, 아스파르테이트, 글루타메이트, 아스파라긴, 또는 글루타메이트의 스트레치를 포함한다. ω 잔기는 글리신, 알라닌, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산 또는 시스테인 중 하나인 것으로 관찰되었다. 오메가 위치에서 아미노산을 인코딩하는 핵산의 치환 및 결실을 포함하는 돌연변이는 GPI 앵커의 부착을 감소 또는 제거하거나 GPI 앵커의 효과적인 관능성을 감소 또는 제거하는데 사용된다. 예를 들어, 이러한 변이는 소수성 류신(예를 들어, 핵산 CTG) 및 알라닌(예를 들어, 핵산 GCA)을 인코딩하는 핵산을 글루타민(예를 들어, 핵산 CAG) 및 글루탐산(예를 들어, 핵산 GAA), 또는 덜 소수성(즉, 더욱 친수성)인 아미노산인 글리신(예를 들어, 핵산 GGN)으로 치환하는 것을 포함한다. 대안적으로, 변형은 ω 잔기를 또 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함하며, 예를 들어 티로신 대신 글리신으로 치환하는 것을 포함한다.
CD59 유전자 서열의 전사를 조절하는데 유용한 다른 프로모터 서열은 본원의 벡터의 발현의 범위 내에 있다. 이들 프로모터는 예를 들어, 항시적 프로모터, 세포 주기-특이적 프로모터, 유비쿼터스 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 대사적으로 조절된 프로모터, 유도성 프로모터, 및 인간 및 동물을 포함하는 특정 대상체에서 발견되는 프로모터이다. 프로모터 및 프로모터 시스템의 예는 예를 들어, 문헌 [Evans et al. U.S. patent number 6,677,311 B1 issued January 13, 2004; Clark et al. U.S. patent number 7,109,029 B2 issued September 19, 2006; and Hallenbeck et al. U.S. patent number 5,998,205 issued December 7, 1999]에 제시되며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
GPI 앵커링에 관여하지 않는 CD59 단백질 부분의 나머지 아미노산 서열에서, 본원의 CD59 단백질의 범위는 보존적 서열 변형을 포함하는 것으로 구상된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열, 즉 인간 CD59와 유사한 방식으로 기능할 동일한 상대 위치에서 이들 측쇄를 제공하는 CD59의 아미노산 서열을 함유하는, CD59 단백질 또는 막-독립성 CD59의 특징에 유의하게 영향을 주거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. CD59의 아미노산 서열의 변형은 당업계에 공지된 임의의 기술, 예를 들어 부위-지정 돌연변이 유발 또는 PCR 기반 돌연변이 유발을 사용하여 달성된다. 이러한 기술은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, 1989, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1989, Molecular Biomethods Handbook, 2nd ed., J. M. Walker et al., Humana Press, 2008, and Handbook of Molec. and Cellul. Methods in Biol. and Med., 3rd ed., L. J. Ceske et al., CRC Press, 2011]에 기술되어 있다.
보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 규정되어 있다. 이러한 패밀리에는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산이 포함된다.
특정 구현예에서, CD59 아미노산 서열은 야생형 서열의 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이다. 용어 "실질적으로 동일한"은 제1 및 제2 아미노산 서열이 공동의 구조적 도메인 및/또는 공동의 기능적 활성을 가질 수 있도록 제2 아미노산 서열에서 정렬된 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 잔기를 충분한 또는 최소의 수로 함유하는 제1 아미노산 서열을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 예를 들어, 아미노산 서열은 적어도 약 60% 동일성, 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 공동의 구조 도메인을 함유한다. 특정 구현예에서, CD59 아미노산 서열은 야생형 서열의 것과 "동일한" 아미노산 서열이다. 동일한 서열은 CD59의 야생형 서열과 100% 동일성을 나타내는 서열이다. 특정 구현예에서, 동일한 서열은 하나 이상의 아미노산에 의해 N 또는 C-말단에 측면 인접될 수 있다. 예를 들어, 상기 하나 이상의 아미노산은 에피토프 태그, 정제 태그, 정제 태그가 제거될 수 있도록 도입된 절단 부위의 나머지, 또는 단백질의 안정성 또는 생체이용률을 개선하기 위한 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 언급된 양에 10% 이하로 가까운 수, 측정 또는 양을 지칭한다.
CD59 폴리펩티드는 인플라마좀 매개된 장애의 치료에 유용하다. 본원에 기재된 방법에 유용한 인간 CD59 폴리펩티드의 아미노산 서열은 다음 서열에 의해 제시된다: MGIQGGSVLFGLLLVLAVFCHSGHSLQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWKFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLENGGTSLSEKTVLLLVTPFLAAAWSLHP (SEQ ID NO: 1). CD59의 신호 서열은 세포에서 분비되기 전에 절단되며, 치료적 유용성에 있어서 불필요하다. 그러나, 신호 서열을 갖는 CD59를 인코딩하는 핵산은 CD59 폴리펩티드의 분비를 증가시키며, 따라서, 신호 서열은 핵산에 의해 인코딩된 CD59 폴리펩티드에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 본원에 기재된 방법에 유용한 신호 서열 절단된 인간 CD59 폴리펩티드는 하기 서열로 제시된다: LQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWKFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLENGGTSLSEKTVLLLVTPFLAAAWSLHP (SEQ ID NO: 2). 그러나, 정확한 신호 서열 끝은 SEQ ID NO: 1에 제시된 전장 CD59 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 방향 중 어느 하나에서 SEQ ID NO: 2의 첫 번째 류신으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 아미노산에 의해 SEQ ID NO: 2와 달라질 수 있다. N-말단 26개 아미노산의 추가 결실은 인간 CD59의 GPI 앵커링 도메인을 결실시킨다. 본원에 기재된 방법에 유용한 신호 서열 절단된 가용된 인간 CD59 폴리펩티드는 하기 서열로 제시된다: LQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWKFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLEN (SEQ ID NO: 3). 이러한 가용성 버전은 또한 이의 정확한 N-말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 아미노산에 의해 달라져서, 이의 N-말단으로부터의 추가의 결실 또는 이의 N-말단 단부의 복원을 발생시킬 수 있다. 특정 구현예에서, CD59의 가용성 버전은 GPI 부착에 필요한 잔기에 대한 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 2로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 잔기는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 70 또는 77에서 아스파라긴 중 어느 하나 또는 둘 모두이다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 유용한 CD59 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, 2 또는 3 중 어느 하나의 N-말단 단부, C-말단 단부 또는 이 두 단부 모두로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 아미노산의 결실을 포함한다. 본원에 기재된 방법과 함께 사용되는 CD59 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3 중 어느 하나에 제시된 것과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성될 수 있다. 추가로, 본원에 사용된 CD59 폴리펩티드는 정제 태그, 절단된 정제 태그의 나머지, 추가적인 보체 억제 폴리펩티드, 항-염증 폴리펩티드 또는 CD59 폴리펩티드의 안정성 또는 생체 이용률을 증가시키는 폴리펩티드를 포함하는 추가의 비-CD59 유래 서열을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 CD59 폴리펩티드를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 또한 인플라마좀 매개된 장애의 치료에 유용하다. 따라서, 본원에 기재된 CD59 폴리펩티드를 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 다수의 핵산이 또한 고려된다. 핵산은 대상체에게 투여하기에 적합한 바이러스 또는 플라스미드 벡터와 같은 재조합 벡터에 적합하게 포함될 수 있다. 이들 벡터는 인플라마좀 매개된 장애를 가진 개체에게 투여하기 위한 약학적 조성물에 추가로 포함될 수 있다.
SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같이 대상체에서 인플라마좀 장애를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드는 대상체의 눈에서 인플라마좀 장애를 치료하는 방법에 사용된다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 장애는 포도막염이다. 특정 구현예에서, 대상체는 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대해 양성 결과를 나타내었다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP). 특정 구현예에서, NALP는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대해 양성 결과를 나타낸 개체에게 인간 CD59 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다. CD59 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3 중 어느 하나에 제시된 것과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 복수의 핵산은 대상체에서 인플라마좀 장애를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 복수의 핵산은 대상체의 눈에서 인플라마좀 장애를 치료하는 방법에 사용된다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 장애는 포도막염이다. 특정 구현예에서, 대상체는 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대해 양성 결과를 나타내었다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP). 특정 구현예에서, NALP는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)이다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대해 양성 결과를 나타낸 개체에게 인간 CD59 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다. CD59 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3 중 어느 하나에 제시된 것과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP). 특정 구현예에서, NALP는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)이다. 특정 구현예에서, 양성 결과는 개체의 눈으로부터 얻어진다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대해 양성 결과를 나타낸 개체의 눈에 인간 CD59 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다. CD59 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3 중 어느 하나에 제시된 것과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP). 특정 구현예에서, NALP는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)이다. 특정 구현예에서, 양성 결과는 개체의 눈으로부터 얻어진다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 포도막염을 앓고 있는 개체에게 인간 CD59 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다. CD59 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3 중 어느 하나에 제시된 것과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 개체의 앓고 있는 눈에 투여된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대해 양성 결과를 나타낸 개체에게 인간 CD59 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 투여하는 것을 포함한다. 핵산은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3에 제시된 것과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CD59 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP). 특정 구현예에서, NALP는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)이다. 특정 구현예에서, 양성 결과는 개체의 눈으로부터 얻어진다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대해 양성 결과를 나타낸 개체의 눈에 인간 CD59 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 투여하는 것을 포함한다. 핵산은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3에 제시된 것과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CD59 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+. 특정 구현예에서, 인플라마좀 활성 마커는 하기로부터 선택된다: CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP). 특정 구현예에서, NALP는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)이다. 특정 구현예에서, 양성 결과는 개체의 눈으로부터 얻어진다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 포도막염을 앓고 있는 개체에게 인간 CD59 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 투여하는 것을 포함한다. 핵산은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3에 제시된 것과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 CD59 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산은 개체의 앓고 있는 눈에 투여된다.
서열 간의 서열 동일성의 계산은 다음과 같이 수행된다. 두 아미노산 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 최적 정렬을 위해 첫 번째 및 두 번째 아미노산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있음). 그 후, 해당 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치의 아미노산 잔기를 비교한다. 첫 번째 서열의 위치가 두 번째 서열의 해당 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되면, 단백질은 해당 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 동일성 퍼센트는 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다.
두 서열 간의 서열 비교 및 동일성 퍼센트 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행된다. 두 아미노산 서열 간의 동일성 퍼센트는 디폴트 매개변수를 사용하는 정렬 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결정된다. 적합한 프로그램은 예를 들어, CLUSTAL W (Thompson et al., Nuc. Acids Research 22:4673, 1994 (www.ebi.ac.uk/clustalw)), BL2SEQ (Tatusova and Madden, FEMS Microbiol. Lett. 174:247, 1999 (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html)), SAGA (Notredame and Higgins, Nuc. Acids Research 24: 1515, 1996 (igs-server.cnrs-mrs.fr/~cnotred)), 및 DIALIGN (Morgenstern et al., Bioinformatics 14: 290, 1998 (bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/dialign))을 포함한다.
벡터
용어 "재조합"은 유전적으로 변형된 유기체, 예를 들어 미생물의 조작에 의해 생성된 단백질을 지칭한다.
본 발명에 따르면, CD59의 공급원은 예를 들어, 적절한 숙주 세포에서 CD59 단백질의 발현을 지시하기 위해 재조합 DNA 분자내로 조작된 CD59 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 생물학적으로 활성인 CD59 단백질을 발현시키기 위해, CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 기능적 등가물은 적절한 발현 벡터, 즉 CD59 단백질 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되는, 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 조절하는 필수 핵산 인코딩 요소를 포함하는 벡터에 삽입된다.
당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 적절한 전사 및 번역 제어 요소에 작동가능하게 연결된 CD59 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터를 작제한다. 이러한 방법에는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합 또는 유전자 재조합이 포함된다. 이러한 기술은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, 1989, Molecular Biomethods Handbook, 2nd ed., J. M. Walker et al., Humana Press, 2008, and Handbook of Molec. and Cellul. Methods in Biol. and Med., 3rd ed., L. J. Ceske et al., CRC Press, 2011]에 기술되어 있다.
시판되는 다양한 발현 벡터/숙주 시스템은 CD59 단백질 인코딩 서열을 함유하고 발현시키는데 유용하다. 이는 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바쿨로바이러스)와 접촉된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 타바코 모자이크 바이러스, TMV)로 형질감염되거나 박테리아 발현 벡터(예를 들어, Ti, pBR322 또는 pET25b 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1989, Molecular Biomethods Handbook, 2nd ed., J. M. Walker et al., Humana Press, 2008, and Handbook of Molec. and Cellul. Methods in Biol. and Med., 3rd ed., L. J. Ceske et al., CRC Press, 2011] 참조.
바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 및 헬퍼-의존성 아데노바이러스 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바이러스 벡터는 본원에 나타낸 바와 같이 AMD의 발병기전에서 MAC의 해로운 작용을 방해하는 CD59 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 전달한다. 아데노바이러스 패키징 벡터는 아메리칸 타입 조직 컬쳐 콜렉션(American Type Tissue Culture Collection(Manassas, VA))으로부터 시중에서 입수가능하다. 아데노바이러스 벡터를 작제하고 아데노바이러스 벡터를 사용하는 방법은 문헌 [Klein et al. 2007 Ophthalmology 114:253-262 and van Leeuwen et al. 2003 Eur. J. Epidemiol. 18:845-854]에 제시되어 있다.
아데노바이러스 벡터는 진핵생물 유전자 발현(Levrero et al. 1991 Gene, 101:195-202) 및 백신 개발(Graham et al. 1991 Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols 7, (Murray, Ed.), Humana Press, Clifton, NJ, 109-128)에 사용되었다. 추가로, 재조합 아데노바이러스 벡터는 유전자 치료법에 사용된다(Wu et al. U.S. patent number 7,235,391 issued June 26, 2007, 이는 전체가 본원에 참고로 통합됨).
재조합 아데노바이러스 벡터는 예를 들어, 셔틀 벡터와 프로바이러스 벡터 사이의 상동성 재조합으로부터 생성된다(Wu et al., U.S. patent number 7,235,391 issued June 26, 2007; 참조로 통합됨). 본원에서 아데노바이러스 벡터는 복제 결함이 있으며, 예를 들어, 조건부 결함이고, 아데노바이러스 E1 영역이 결여되고, CD59를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 E1-코딩 서열이 제거된 위치에 도입된다. CD59 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 E3 영역에 대안적으로 삽입된다.
헬퍼 세포주는 293 인간 배아 신장 세포, 근육 세포, 조혈 세포 또는 다른 인간 배아 중간엽 또는 상피 세포와 같은 인간 세포로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 헬퍼 세포는 인간 아데노바이러스에 대해 허용되는 다른 포유동물 종의 세포, 예를 들어 Vero 세포 또는 다른 원숭이 배아 중간엽 또는 상피 세포로부터 유래될 수 있다. 헬퍼 세포주를 사용한 이러한 복제 결함 아데노바이러스 벡터의 생성 및 증식은 문헌 [Graham et al 1977 J. Gen. Virol. 36: 59-72]에 기술되어 있다.
렌티바이러스 벡터 패키징 벡터는 Invitrogen Corporation(Carlsbad CA)에서 시판된다. 렌티바이러스 벡터 생성을 위한 HIV-기반 패키징 시스템은 문헌 [Naldini et al. 1996 Science 272: 263-267; Zufferey et al. 1997 Nature Biotechnol. 15: 871-875; and Dull et al. 1998 J. Virol. 72: 8463-8471]에서 작제물을 사용하여 제조된다.
3세대 렌티바이러스 SIN 벡터 백본을 기반으로 하는 시스템을 사용하여 여러 벡터 작제물을 패키징할 수 있다(Dull et al. 1998 J. Virol. 72:8463-8471). 예를 들어, 벡터 작제물 pRRLsinCMVGFPpre는 HIV 프로모터 서열이 라우스 육종 바이러스(RSV)의 것으로 대체된 5 'LTR, U3 프로모터 영역의 결실을 포함하는 자가-비활성화 3' LTR, HIV 패키징 신호, CMV 프로모터에 의해 구동되는 에쿠오라(Aequora) 해파리 녹색 형광 단백질(GFP)로 구성된 마커 유전자 카세트에 연결된 RRE 서열, 및 핵 이출을 강화하는 것으로 보이는 우드척 간염 바이러스 PRE 요소를 포함한다. GFP 마커 유전자는 UV 형광 현미경의 직접 관찰 또는 유동 세포측정에 의해 형질감염 또는 형질도입 효율의 정량화를 허용한다(Kafri et al. 1997 Nature Genet. 17: 314-317; and Sakoda et al. 1999 J. Mol. Cell. Cardiol. 31: 2037-2047).
CD59 단백질 및 패키징 세포를 인코딩하는 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 작제하기 위한 레트로바이러스 핵산의 조작은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 달성된다. 하기 문헌 [Ausubel, et al., 1992, Volume 1, Section III (units 9.10.1-9.14.3); Sambrook, et al., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Miller, et al., Biotechniques. 7:981-990, 1989; Molecular Biomethods Handbook, 2nd ed., J. M. Walker et al., Humana Press, 2008; Handbook of Molec. and Cellul. Methods in Biol. and Med., 3rd ed., L. J. Ceske et al., CRC Press, 2011; Eglitis, et al., Biotechniques. 6:608-614, 1988; U.S. patent numbers 4,650,764, 4,861,719, 4,980,289, 5,122,767, and 5,124,263]; 및 PCT 특허 공개 번호 WO 85/05629, WO 89/07150, WO 90/02797, WO 90/02806, WO 90/13641, WO 92/05266, WO 92/07943, WO 92/14829, 및 WO 93/14188 참조 (이들 각각은 그 전체가 참조로 통합됨).
레트로바이러스 벡터는 양쪽성 패키징 시스템을 사용하여 비-감염성 형질도입 바이러스 입자(비리온)로 작제되고 패키징된다. 이러한 패키징 시스템의 예는 예를 들어, 문헌 [Miller et al. 1986 Mol. Cell Biol. 6 :2895-2902; Markowitz et al. 1988 J. Virol. 62:1120-1124; Cosset et al. 1990 J. Virol. 64: 1070-1078]; 미국 특허 번호 4,650,764, 4,861,719, 4,980,289, 5,122,767, and 5,124,263, 및 PCT 특허 공개 번호 WO 85/05629, WO 89/07150, WO 90/02797, WO 90/02806, WO 90/13641, WO 92/05266, WO 92/07943, WO 92/14829, 및 WO 93/14188에서 찾아볼 수 있다(이들 각각은 그 전체가 참조로 통합됨).
"생산자 세포"의 생성은 레트로바이러스 벡터를 패키징 세포에 도입함으로써 달성된다. 이러한 레트로바이러스 벡터의 예는 예를 들어, 문헌 [Korman et al. 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 2150-2154; Morgenstern et al. 1990 Nucleic Acids Res. 18: 3587-3596]; 미국 특허 번호 4,405,712, 4,980,289, and 5,112,767; 및 PCT 특허 공개 번호 WO 85/05629, WO 90/02797, 및 WO 92/07943에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 참조로 통합된다.
헤르페스바이러스 패키징 벡터는 Invitrogen Corporation(Carlsbad CA)에서 시판된다. 예시적인 헤르페스바이러스는 α-헤르페스바이러스 예컨대, 바리셀라-조스터 바이러스 또는 슈도레이비스 바이러스; 헤르페스 심플렉스 바이러스 예컨대, HSV-1 또는 HSV-2; 또는 헤르페스바이러스 예컨대, 엡스타인-바르 바이러스이다. 대부분의 헤르페스바이러스에 사용할 수 있는 헬퍼 바이러스의 부재하에 요망되는 뉴클레오티드 세그먼트, 예를 들어 CD59 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열로 패키징될 수 있는 빈 헤르페스바이러스 입자를 제조하기 위한 방법은 문헌[Fraefel et al. (U.S. patent number 5,998,208, issued December 7, 1999, 그 전체가 참조로 통합됨)]에 제시된다.
헤르페스바이러스 DNA 벡터는 숙련된 기술자에게 친숙한 기술을 사용하여 작제될 수 있다. 예를 들어, 헤르페스바이러스의 전체 게놈을 인코딩하는 DNA 세그먼트는 큰 DNA 세그먼트를 운반할 수 있는 많은 벡터, 예를 들어, 코스미드(Evans, et al., Gene 79, 9-20, 1989), 효모 인공 크로모좀(YACS) (Sambrook, J. et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) 또는 E. 콜라이 F 요소 플라스미드(O'Conner et al. 1989 Science 244:1307-1313)로 나눠진다.
예를 들어, 엡스타인-바르 바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 슈도라비에스 바이러스 및 HSV-1를 포함하는 다양한 헤르페스바이러스의 전체 게놈을 나타내는 중복 클론을 함유하는 일련의 코스미드가 분리되었다. 문헌 [M. van Zijl et al. 1988 J. Virol. 62: 2191; Cohen et al. 1993 Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 90: 7376; Tomkinson et al. 1993 J. Virol. 67: 7298; and Cunningham et al. 1993 Virology 197: 116] 참조.
AAV는 또 다른 바이러스(아데노 바이러스 또는 헤르페스 바이러스 패밀리의 구성원)로의 공동-감염에 의존하여 배양된 세포에서 증식성 감염(productive infection)을 겪는다는 점에서 의존성 파르보바이러스이다(Muzyczka 1992 Curr Top Microbiol Immunol, 158:97 129). 예를 들어, 재조합 AAV(rAAV) 바이러스는 2개의 AAV 말단 반복부에 측면 인접한 관심 유전자, 예를 들어, CD59 유전자를 함유하는 플라스미드(McLaughlin et al. 1988 J. Virol., 62(6): 1963-1973; Samulski et al. 1989 J. Virol, 63: 3822-3828) 및 말단 반복부 없이 야생형 AAV 코딩 서열을 함유하는 발현 플라스미드를 공동-형질감염시킴으로써 제조된다. 세포는 또한 AAV 헬퍼 기능에 필요한 아데노바이러스 유전자를 운반하는 플라스미드 또는 아데노바이러스와 접촉되거나 이로 형질감염된다. 이러한 방식으로 제조된 재조합 AAV 바이러스 스톡은 (예를 들어, 세슘 클로라이드 밀도 원심분리에 의해) 재조합 AAV 입자로부터 물리적으로 분리되어야 하는 아데노바이러스를 포함한다.
아데노-관련 바이러스(AAV) 패키징 벡터는 GeneDetect (Auckland, New Zealand)에서 시판된다. AAV는 통합 빈도가 높고, 비-분열 세포를 감염시켜 조직 배양에서 포유동물 세포 내로 유전자를 전달하는데 유용한 것으로 나타났다(Muzyczka 1992 Curr Top Microbiol Immunol 158:97-129). AAV는 감염성에 대한 광범위한 숙주 범위를 가지고 있다(Tratschin et al. 1984 Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Laughlin et al. 1986 J. Virol., 60(2):515-524; Lebkowski et al. 1988 Mol. Cell. Biol. 8(10):3988-3996; McLaughlin et al. 1988 J. Virol. 62(6):1963-1973).
AAV 벡터를 작제하고 AAV 벡터를 사용하는 방법은 예를 들어, 2007년 6월 26일에 발행된 미국 특허 번호 5,139,941(Wu et al.) 및 1989년 1월 10일에 발행된 4,797,368(Carter et al.)에 기술되어 있으며; 이들 각각은 참조로 포함된다. 유전자 전달에서 AAV의 사용은 문헌 [LaFace et al. 1988 Virology 162(2): 483 486; Zhou et al. 1993 Exp. Hematol, 21: 928-933; Flotte et al. 1992 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7(3): 349-356; and Walsh et al. 1994 J. Clin. Invest 94: 1440-1448]에 추가로 기술된다.
재조합 AAV 벡터는 마커 유전자의 시험관내 및 생체내 형질도입(Kaplitt et al. 1994 Nat Genet., 8(2):148-154; Lebkowski et al. 1988 Mol. Cell. Biol. 8(10): 3988-3996; Samulski et al. 1991 EMBO J. 10: 3941-3950; Shelling and Smith 1994 Gene Therapy, 1: 165-169; Yoder et al. 1994 Blood, 82 (Supp.): 1: 347A; Zhou et al. 1993 Exp. Hematol 21: 928-933; Tratschin et al. 1985 Mol. Cell. Biol. 5: 3258-3260; McLaughlin et al. 1988 J. Virol. 62(6): 1963-1973) 및 인간 질병과 관련된 유전자의 형질도입(Flotte et al. 1992 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7(3): 349-356; Ohi et al. 1990 Gene, 89(2): 279-282; Walsh et al. 1994 J. Clin. Invest. 94: 1440-1448; and Wei et al. 1994 Gene Therapy, 1: 261 268)에 성공적으로 사용되었다.
특정 구현예에서, 본원의 벡터는 비-바이러스 벡터, 예를 들어, 바이러스 입자와 관련되지 않으며, 표적 세포 또는 조직에 CD59 유전자 인코딩 물질을 특이적으로 전달하는 합성 유전자 전달 비히클 또는 벡터이다. 비-바이러스 벡터의 예는 리포좀, 펩티드, 나노입자, 에멀젼, 또는 캡슐화된 2개 이상의 상 시스템 또는 기타 적합한 제조물을 포함한다. 따라서, 특정 구현예에서, 방법, 키트 또는 조성물은 조직 또는 세포에 로딩되고 접촉된 핵산을 갖는 비-바이러스 벡터를 포함한다. 예를 들어, 막을 표적으로 하지 않는 변형된 GPI 앵커를 갖는 막-독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 네이키드 DNA, 또는 GPI 앵커를 갖지 않는 막-독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 유전자를 함유하는 리포좀은 리포좀에 캡슐화되며, 리포좀은 핵산이 보체-관련 질환의 치료를 위해 조직 또는 세포에 효과적으로 전달되도록 조직 또는 세포와 접촉된다.
항체
본원에 언급된 바와 같은 용어 "항체"는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합 부분") 또는 이들의 단일 사슬을 포함한다. 자연적으로 발생하는 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질이다.
본원에 사용된 바와 같은 "인간 MAC에 특이적으로 결합하는" 항체는 5 x 10-9 M 이하, 2 x 10-9 M 이하, 또는 1x 10-10 M 이하의 KD로 인간 MAC에 결합하는 항체를 나타내는 것으로 의도된다. 예를 들어, 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제조물을 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 MAC 또는 MAC의 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 항체는 IgG1 또는 IgG4와 같은 IgM, IgE, IgG이다.
또한 MAC 검정에 유용한 것은 재조합 항체인 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 "재조합 인간 항체"는 동물(예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 모든 항체를 포함한다. 본원의 방법에 사용된 재조합 항체를 발현하기 위한 포유 동물 숙주 세포는 문헌 [Urlaub and Chasin 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220]에 기술되고, 예를 들어, 문헌 [R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621]에 기술된 바와 같은 DH FR 선택가능 마커와 사용되는 dhfr-CHO 세포, NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위한 또 다른 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 제시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체를 생산하기 위해, 온전한 또는 관심 단백질의 일부를 인코딩하는 발현 벡터는 포유동물 숙주 세포에 도입되고, 숙주 세포는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로의 항체의 분비 또는 숙주 세포에서 항체의 발현을 허용하기에 충분한 기간 동안 배양된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA를 포함하는, 다양한 종의 표적에 대한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 검정은 당업계에 공지되어 있다. 항체의 결합 동력학(예를 들어, 결합 친화성)은 또한 Biacore 분석과 같은 당업계에 공지된 표준 검정에 의해 평가될 수 있다.
항혈청 생성을 위해 동물을 선택할 때 고려할 기준을 포함하여 항체 생성을 위한 일반적인 방법론은 문헌 [Harlow et al. (1988 Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 93-117)]에 기술되어 있다. 예를 들어, 염소, 개, 양, 마우스 또는 낙타와 같은 적절한 크기의 동물은 면역 반응을 생성하는데 효과적인, 인간 MAC로부터의 에피토프를 함유하는 온전한 단백질 또는 이의 일부와 같은 일정량의 면역원을 투여하여 면역화된다. 예시적인 프로토콜은 다음과 같다. 동물에는 동물의 크기에 따라 100 마이크로그램 내지 100 밀리그램의 항원을 등에 피하 주입하고, 3주 후 동물의 크기에 따라 애주번트, 예를 들어 프로인트 완전 애주번트와 100 마이크로그램 내지 100 밀리그램의 면역원을 복강내 주입하였다. 동물 혈액 중의 적절한 항체 역가가 달성될 때 까지, 애주번트 예를 들어, 프로인트 불완전 애주번트를 2주마다 추가적인 복강내 주입으로 투여한다. 예시적인 역가는 적어도 약 1:5000의 역가 또는 1:100,000 이상의 역가, 즉 검출가능한 활성을 갖는 희석을 포함한다. 항체는 예를 들어, 인간 MAC를 포함하는 칼럼에서 친화성 정제에 의해 정제된다.
인간 림프구의 시험관내 면역화 기술은 모노클로날 항체를 생성하는데 사용된다. 인간 림프구의 시험관내 면역화 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Inai et al. May 1993 Histochemistry, 99(5): 335-362; Mulder et al. 1993 Hum. Immunol. 36(3): 186-192; Harada, et al. 1993 J. Oral Pathol. Med., 22(4): 145-152; Stauber, et al. 1993 J. Immunol. Methods 161(2): 157-168; and Venkateswaran, et al. 1992 Hybridoma, 11(6): 729-739] 참조. 이러한 기술은 항원-특이적 IgG 및 IgM 모노클로날 항체를 포함하는 항원-반응성 모노클로날 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 인간 MAC에 대해 특이적이며, 친화성을 갖는 임의의 항체 또는 이의 단편은 본원에서 제공되는 MAC 증착에 대한 검정의 범위 내에 있다.
본원의 예에서, CD59와의 접촉은 세포 또는 조직에 CD59 유전자를 인코딩하는 벡터를 주입함으로써 달성된다.
본원의 예에서, 세포 용해는 프로피듐 아이오다이드(PI) 흡수에 의해 측정된다. PI는 예를 들어, Fluka BioChemica(Buchs, Switzerland)에서 시판된다. PI는 DNA에 결합할 때 형광을 발하는 삽입제이다. PI는 막 불침투성이며, 일반적으로 생 세포로부터 배제되며, 따라서 PI는 일반적으로 혼합 집단에서 비-생 세포의 양을 확인하고/거나 결정하는데 사용된다.
본원의 예 및 특정 구현예에서, 검출가능한 단백질은 형광 단백질, 예를 들어, 녹색 형광 단백질, 에쿠오린, 청록색 형광 단백질, DsRed 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질 및 황색 형광 단백질이다. 녹색 형광 단백질(GFP) 및 아쿠오린은 해파리 에쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria)로부터 분리된 생물발광 조성물이다. 칼슘 이온이 에쿠오린에 결합하는 경우, 복합체는 아포에쿠오린과 발광 조성물로 분해되어 청색광을 방출한다. 합성 에쿠오린은 AQUALITE®로서 Sealite, Sciences (Bogart, Ga.)에서 시판된다. GFP는 가시 스펙트럼의 아래쪽 녹색 부분에서 광을 방출하며, 합성 GFP는 Clontech(Mountain View, CA)에서 시판된다.
GFP의 아미노산 서열에 대한 돌연변이는 다양한 색을 형광하는 GFP, 예를 들어, 청록색 형광 단백질, DsRed 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질 및 황색 형광 단백질의 유도체 아미노산 서열을 생성하기 위해 만들어졌다. 합성 청록색 형광 단백질, 합성 DsRed 형광 단백질, 합성 강화 녹색 형광 단백질 및 합성 황색 형광 단백질은 각각 Clontech(Mountain View, CA)에서 시판된다.
대안적 구현예에서, 검출가능한 제제는 형광 단백질이 아닌 형광 제제, 예를 들어, 인도시아닌 그린, 독소루비신, 리보플라빈, 클로로필 및 포르피린이다.
인도시아닌 그린(ICG)은 여기시 약 800 nm, 약 820 nm, 약 840 nm 또는 약 860 nm에서 광을 방출하는 트리카르보시아닌 염료이다. ICG는 H.W. Sands Corp.(Jupiter, FL)에서 시판된다. 독소루비신은 형광성이며, 예를 들어 약 550 nm, 600 nm 또는 650 nm의 파장에서 광을 방출하다. 독소루비신은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 시판된다. 리보플라빈은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 시판되고, 예를 들어 약 450 nm, 약 550 nm, 약 650 nm 또는 약 750 nm의 파장에서 광을 방출하는 형광이다. 클로로필 A는 예를 들어 약 600 nm, 약 700 nm 또는 약 800 nm의 파장에서 광을 방출하는 녹색 광합성 안료이다. 클로로필 A는 Sigma Chemical (St. Louis, MO) 및 Turner Designs (Sunnyvale, CA)와 같은 공급업체로부터 시판된다. 포르피린은 4개의 메틴 브릿지(=CH-)를 통해 반대편에 연결된 4개의 피롤 서브유닛으로 만들어진 헤테로사이클릭 마크로사이클이다. 포르핀의 광범위한 컨쥬게이션된 구조는 화합물을 유채색 즉, 예를 들어 약 600 nm, 또는 약 650 nm 또는 약 700 nm의 파장에서 형광을 나타내게 한다. 포르피린은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)로부터 시판된다.
다른 대안적 구현예에서, 검출가능한 제제는 뉴클레오티드 벡터 상에서 발현될 수 있는 단백질, 예를 들어 β-갈락토시다제 또는 알칼리 포스파타제인 효소 제제이다.
β-갈락토시다제는 β-갈락토시드의 단당류로의 가수분해를 촉매하는 가수분해 효소이다. 발광 β-갈락토시다제 검출 키트는 Clontech(Mountain View, CA)에서 시판된다. 알칼리 포스파타제는 뉴클레오티드, 단백질 및 알칼로이드를 포함한 많은 유형의 분자로부터 포스페이트 기를 제거하는 가수분해 효소이다. 발광 알칼리 포스파타제 검출 키트는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO)에서 시판된다.
약학적 조성물
본 발명의 한 양태는 대상체에서 염증-이환된 눈의 세포에서 인플라마좀 활성화를 억제하기 위한 CD59 단백질을 인코딩하는 핵산, 또는 가용성 CD59 단백질을 사용하는 방법을 제공한다. 다양한 구현예에서, CD59 단백질은 막-독립성(가용성) CD59 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CD59 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다. 특정 구현예에서, 조성물은 눈에 투여하기 위한 안과용 제형으로 화합되고, 안저로의 전달을 향상시키고, 망막에서 국소적으로 지속 방출을 제공하기 위해 화합되거나, 황반 변성을 포함하는 안구 질환과 관련된 혈관 및/또는 조직의 효과적인 치료를 제공하도록 제형화될 수 있다. 관련 구현예에서, 약학적 조성물은 인간 대상체, 예를 들어 인간 대상체의 순환계 또는 눈에 투여하기에 충분히 순수하게 제형화된다. 특정 구현예에서, 이러한 조성물은 임의로 하나 이상의 추가 치료제를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 치료제 또는 치료제들은 성장 인자, 항-염증제, 산화 질소 및 칼슘 채널 차단제를 포함하나 이에 제한되지 않는 혈관 수축제, 콜라게나제 억제제, 국소 스테로이드, 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 아스코르베이트, 안지오텐신 II, 안지오텐신 III, 칼레티쿨린, 테트라사이클린, 피브로넥틴, 콜라겐, 트롬보스폰딘, 형질전환 성장 인자(TGF), 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF 결합 단백질(IGFBP), 표피 성장 인자(EGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), neu 분화 인자(NDF), 간세포 성장 인자(HGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 헤파린-결합 EGF(HBEGF), 트롬보스폰딘 , 폰 빌레브란트 인자-C, 헤파린 및 헤파린 설페이트 및 히알루론산으로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 추가 제제는 MAC 증착으로부터 세포를 보호하는 CD59 단백질의 능력을 강화, 안정화 또는 상승작용시키거나 심지어 대체하는 화합물, 조성물, 생물학적 약제 또는 기타 등등이다. 또한, CD59 단백질과 동시에 유익하게 또는 편리하게 제공될 수 있는 치료제, 예컨대 동일한, 동시의 또는 관련 증상, 질환 또는 질병을 치료하는데 사용되는 제제가 또한 포함된다. 일부 구현예에서, 약물은 비제한적으로 항-종양제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항-마이코박테리아제, 항-진균제, 항-증식제 또는 항-아폽토시스 제제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 약물은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman, et al., eds., McGraw-Hill, 1996] 참조(이의 내용은 본원에 참조로 통합됨).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 요망되는 특정 투여 형태에 적합한, 임의의 및 모든 용매, 희석제 또는 기타 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제 등을 포함하다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences Ed. by Gennaro, Mack Publishing, Easton, PA, 1995]은 약학적 조성물을 제형화하는데 사용되는 다양한 담체 및 이의 제조를 위한 공지된 기술을 제공한다. 약학적으로 허용되는 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 비제한적으로, 당, 예컨대 글루코스 및 수크로스; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약 왁스; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제, 예컨대 마그네슘 하이드록시드 및 알루미늄 하이드록시드; 알긴산; 발열원-비함유 물; 등장 염수; 링거액; 에틸 알콜; 및 인산염 완충액을 포함하며, 또한 비독성의 양립가능한 윤활제, 예컨대 소듐 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트뿐만 아니라 착색제, 이형제, 코팅제, 보존제 및 항산화제가 포뮬레이터의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다.
치료학적 유효량
본원에 제공된 방법에 의한 염증 이환된 눈의 치료는 조직 또는 세포를 약학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 예를 들어, CD59 단백질을 인코딩하는 핵산 또는 CD59 단백질의 발현 소스를 활성제로서 갖는 치료학적 유효량의 약학적 조성물을 원하는 결과를 달성하는데 필요한 시간과 양으로 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 방법은 안구 조직 또는 세포를 CD59 단백질 또는 CD59 단백질을 인코딩하는 벡터와 접촉시킴으로써 포도막염을 치료하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법에 따른 조성물은 포도막염 또는 다른 보체-관련 질환 및 질병을 치료하는데 효과적인 임의의 양 및 임의의 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 표현 "포도막염 치료에 효과적인 양"은 포도막염의 증상을 유익하게 예방하거나 개선하기에 충분한 조성물의 양을 지칭한다.
정확한 투여량은 치료할 환자의 관점에서 개별 의사에 의해 선택된다. 투여량 및 투여는 충분한 수준의 활성제(들)를 제공하거나 요망되는 효과를 유지하기 위해 조정된다. 고려될 수 있는 추가 인자는 질병 상태의 중증도, 예를 들어 포도막염의 중간 또는 진행된 단계; 환자의 연령, 체중 및 성별; 식이요법, 투여 시간 및 빈도; 투여 경로; 약물 조합; 반응 민감도; 및 치료에 대한 내성/반응을 포함한다. 장기간 작용하는 약학적 조성물은 특정 조성물의 반감기 및 제거율에 따라 매시간, 1시간마다 2회, 매 3 내지 4시간마다, 매일, 1일 2회, 3 내지 4일마다, 매주, 또는 2주마다 1회 투여될 수 있다.
본 발명의 활성제는 바람직하게는 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위한 투여 단위 형태로 제형화된다. 본원에 사용된 바와 같은 표현 "투여 단위 형태"는 치료할 환자에 적합한 물리적으로 분리된 활성제의 단위를 지칭한다. 그러나, 본 발명의 조성물의 총 일일 사용량은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 담당 의사에 의해 결정될 것임이 이해될 것이다. 임의의 활성제에 있어서, 치료학적 유효량은 본원에 제공된 바와 같이 세포 배양 검정 또는 동물 모델에서, 일반적으로 마우스에서 그러나 또한 가능하게는, 래트, 토끼, 개 또는 돼지에서 초기에 추정될 수 있다. 본원에 제공된 동물 세포 모델은 또한 바람직한 농도 및 총 투여 범위 및 투여 경로를 달성하는데 사용된다. 그 후, 이러한 정보는 인간에서 유용한 투여 용량 및 투여 경로를 결정하는데 이용될 수 있다.
치료학적 유효량은 포도막염의 증상 또는 상태를 개선하거나 이의 진행을 예방하는 활성제의 양을 지칭한다. 활성제의 치료 효능 및 독성, 예를 들어 ED50(용량은 집단의 50%에서 치료학적으로 효과적임) 및 LD50(용량은 집단의 50%에 치명적임)은 세포 배양 또는 실험 동물의 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 대 치료학적 효과의 용량 비는 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50 비율로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 약학적 조성물이 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 인간 사용을 위한 다양한 투여량을 제형화하는데 사용된다.
생성물의 일일 투여량은 성인 1인당 일일 0.001 내지 100 mg과 같이 광범위하게 다양할 수 있다. 안구 투여를 위해, 조성물은 바람직하게는, 치료할 환자에 대한 투여량의 증상 조절을 위한 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100.0, 250.0 또는 500.0 마이크로그램의 활성 성분을 함유하는 용액 형태로 제공된다.
정맥내 투여되는 가용성 CD59 단백질의 용량은 용량 당 킬로그램 당 0.01 밀리그램 내지 용량 당 킬로그램 당 약 10 밀리그램, 용량 당 킬로그램 당 0.1 밀리그램 내지 용량 당 킬로그램 당 약 5 밀리그램, 또는 용량 당 킬로그램 당 1.0 밀리그램 내지 용량 당 킬로그램 당 약 5 밀리그램의 범위일 수 있다. 투여 프로토콜은 매일, 주 2회, 주 1회, 매 2주 1회, 매 3주 1회 또는 매 4주 1회의 빈도를 포함한다.
단위 용량은 전형적으로 약 0.001 마이크로그램 내지 약 500 마이크로그램의 활성 성분, 바람직하게는 약 0.1 마이크로그램 내지 약 100 마이크로그램의 활성 성분, 더욱 바람직하게는 약 1.0 마이크로그램 내지 약 10 마이크로그램의 활성 성분을 함유한다. 유효량의 약물은 일반적으로 하루에 약 0.0001 mg/kg 체중 내지 약 25 mg/kg 체중의 투여량 수준으로 공급된다. 예를 들어, 범위는 하루에 약 0.001 내지 10 mg/kg 체중, 또는 하루에 약 0.001 mg/kg 내지 1 mg/kg 체중이다. 조성물은 예를 들어, 1일 1회 내지 4회 이상의 요법으로 투여될 수 있다. 단위 용량은 분할될 수 있으며, 예를 들어, 2회 이상의 분할 용량으로 투여될 수 있다.
CD59 단백질의 발현 소스로서의 투여는 바이러스 벡터 또는 핵산 벡터의 용량을 투여하는 것으로, 용량은 치료할 세포 당 적어도 약 50, 100, 500, 1000 또는 적어도 약 5000개의 입자를 포함한다. 세포 수는 포도막염 또는 눈 장애를 치료하는 분야의 숙련자에게 알려진 방법에 의해 치료가 필요한 망막 영역으로부터 계산될 수 있다.
약학적 조성물의 투여
요망되는 투여량으로 적절한 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화되는 바와 같이, 본원에 제공된 약학적 조성물은 인간 및 다른 포유동물에 국소적으로, 예컨대 안구(용액, 연고 또는 점적제와 같이), 비, 협측, 경구, 직장, 비경구, 수조내, 질내 또는 복강내 투여된다.
안구 주입은 안방수 또는 유리체액 내로의 안구내 주입, 또는 눈의 외층, 예컨대 결막하 주입 또는 테논낭하 주입을 포함한다.
안구, 경구, 정맥내 또는 기타 전신 투여를 위한 액체 투여 형태는 비제한적으로, 약학적으로 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성제(들)에 더하여, 액체 투여 형태는 당업계에 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예컨대 예를 들어, 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일(특히, 면화씨유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 안구, 경구 또는 기타 전신-전달 조성물은 또한 애주번트, 예컨대 습윤제, 및 유화제 및 현탁제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 국소 또는 경피 투여를 위한 투여 형태는 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 또는 패치를 포함한다. 활성제는 멸균 조건 하에서 약학적으로 허용되는 담체 및 필요에 따라 임의의 필요한 보존제 또는 완충제와 혼합된다. 예를 들어, 안구 또는 피부 투여 경로는 수성 점적, 미스트, 에멀젼 또는 크림으로 달성된다. 투여는 치료적일 수 있거나 예방적일 수 있다. 본 발명은 개시된 조성물(예를 들어, 거즈 붕대 또는 스트립)을 포함하는 안과 장치, 수술 장치, 청각 장치 또는 제품, 및 이러한 장치 또는 제품을 제조하거나 사용하는 방법을 포함한다. 이들 장치는 본원에 기재된 바와 같은 조성물로 코팅되거나, 함침되거나, 이에 결합되거나, 달리 처리될 수 있다.
경피 패치는 활성 성분을 신체에 전달하는 것을 제어하는 추가의 이점을 갖는다. 이러한 투여 형태는 적절한 매질에 화합물을 용해 또는 분배하여 만들 수 있다. 흡수 향상제는 또한 피부를 통한 화합물의 흐름을 증가시키는데 사용될 수 있다. 속도는 속도 제어 막을 제공하거나 중합체 매트릭스 또는 겔에 화합물을 분산시킴으로써 제어될 수 있다.
주사용 제조물, 예를 들어 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 제조물은 또한 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용 용액, 현탁액 또는 에멀젼, 예를 들어 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매로는 물, 링거액, U.S.P. 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균의 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이를 위해, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하는 임의의 완화성 지방유가 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산은 주사제의 제조에 사용된다. 주사용 제형은 예를 들어, 박테리아-보유 필터를 통한 여과에 의해 또는 사용 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사용 매질 중에 용해되거나 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물 형태의 멸균제를 혼입시킴으로써 멸균될 수 있다. 활성제의 효과를 연장하기 위해, 피하 또는 근육내 주사로부터 제제의 흡수를 늦추는 것이 종종 바람직하다. 비경구 투여된 활성제의 지연된 흡수는 오일 비히클에 제제를 용해시키거나 현탁시킴으로써 달성될 수 있다. 주사용 데포 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해성 중합체 중에 제제의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 활성제 대 중합체의 비율 및 사용된 특정 중합체의 특성에 따라, 활성제 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(안하이드라이드)를 포함한다. 데포 주사용 제형은 또한 신체 조직과 양립가능한 리포좀 또는 마이크로에멀젼 중에 제제를 포획시킴으로써 제조된다.
직장 또는 질 투여용 조성물은 바람직하게는, 본 발명의 활성제(들)를 주위 온도에서는 고체이나 체온에서는 액체여서 직장 또는 질강에서 용해되어 활성제(들)를 방출하는 적합한 비-자극성 부형제 또는 담체, 예컨대 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 좌약 왁스와 혼합시킴으로써 제조될 수 있는 좌약이다.
경구 투여용 고체 투여 형태는 캡슐, 정제, 알약, 분말 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 투여 형태에서, 활성제는 적어도 하나의 불활성의 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체, 예컨대 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트 및/또는 a) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및 실리식산, b) 결합제 예컨대, 예를 들어 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리디논, 수크로스 및 아카시아, c) 가습제, 예를 들어 글리세롤, d) 붕해제, 예컨대, 아가-아가, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트 및 탄산나트륨, e) 용액 지연제, 예컨대 파라핀, f) 흡수 촉진제, 예컨대 사차 암모늄 화합물, g) 습윤제, 예컨대 예를 들어 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트, h) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토, 및 i) 윤활제, 예컨대 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트 및 이들의 혼합물과 혼합된다.
유사한 유형의 고체 조성물은 또한 유당은 물론 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질-충전 겔라틴 캡슐의 충전제로서 사용될 수 있다. 정제, 당의정, 캡슐, 알약 및 과립의 고체 투여 형태는 장용 코팅, 방출 제어 코팅 및 약학적 제형화 분야에서 잘 알려진 기타 코팅과 같은 코팅 및 쉘로 제조될 수 있다. 이러한 고체 투여 형태에서 활성제(들)는 수크로스 또는 전분과 같은 적어도 하나의 불활성 희석제와 혼합될 수 있다. 이러한 투여 형태는 또한 일반적인 관례와 같이 불활성 희석제 이외의 추가 물질, 예를 들어 타정 윤활제 및 기타 타정 보조제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 및 미세결정질 셀룰로스를 포함할 수 있다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 투여 형태는 또한 완충제를 포함할 수 있다. 이들은 선택적으로 불투명화제를 포함할 수 있으며, 또한 활성제(들)만을 방출하거나 우선적으로 장관의 특정 부분에서 선택적으로 지연된 방식으로 활성제(들)를 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 포매 조성물의 예는 중합체 물질 및 왁스를 포함한다.
여기에 부록 A로 첨부된 이러한 작업의 일부는 공동 저자 및 공동 발명자 비닛 쿠마르(Binit Kumar), 시오반 M. 체스맨(Siobhan M. Cashman) 및 라젠드라 쿠마르-신(Rajendra Kumar-Singh)에 의한 "NLRP3 인플라마좀의 보체 매개된 활성화 및 포도막염 모델에서 CD59의 AAV 매개된 전달에 의한 이의 억제"라는 제목의 원고로서 공개될 준비가 되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
질병 모니터링 및 치료할 환자의 선택
본원에 기재된 CD59 핵산 및 단백질 조성물은 염증 및 인플라마좀 관련 질환의 치료에 유용하다. 기재된 조성물은 인플라마좀 활성을 검정하는 시험에 대한 양성 결과에 기초하여 치료를 위해 선택된 개체에 투여될 수 있다. 이러한 테스트는 인플라마좀 활성화의 직접 측정으로 제한되지 않으며, 또한 예컨대, 간접 측정에도 국한되지 않는다. 간접 측정은 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 염증이 있거나 병든 조직의 세포-표면 마커, 특정 면역 유형의 세포 활성화, 특정 면역 유형의 존재 또는 부재의 측정일 수 있다. 예를 들어, IL-1α, IL-1β 및 IL-18과 같은 사이토카인은 인플라마좀 활성화에 반응하여 상승한다. 따라서, 선택된 개체는 병든 조직의 혈장, 혈청, 혈액, 조직학적 절편, mRNA 또는 세포 추출물에서 이러한 사이토카인의 상승된 수준, 또는 혈액 또는 병든 조직으로부터 분리된 면역 세포에 의한 상승된 수준의 발현 또는 분비를 나타낼 수 있다. CD59 핵산 또는 단백질 조성물로 처리하기 위한 선택 기준은 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인 및 CD4+ 중 어느 하나 이상의 상승된 수준 또는 활성일 수 있다.
상승된 수준의 사이토카인 IL-1α, IL-1β, IL-β17, IL-18 또는 IFN-γ는 예를 들어 ELISA, AlphaLISA®, 면역조직화학, 관련 세포 집단의 유동 세포측정 분석 또는 정량적 RT-PCR에 의해 평가될 수 있다. 카스파제 및 인플라마좀 활성화는 활성화된 카스파제 및 인플라마좀 구성요소, 예컨대 카스파제 1, 카스파제 5, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP)에 특이적인 항체를 사용하여 생검 표본의 면역조직화학에 의해 결정될 수 있다. Th1 및 Th17 세포는 세포 표면 마커 CXCR3 또는 CCR5에 대한 또는 Th1의 경우 전사 인자 TBX21에 대한; 또는 세포 표면 마커 CCR6 및 CCR4에 대한 유동 세포측정 또는 Th17의 경우 전사 인자 RORg/gt에 대한 세포내 염색을 이용하여 확인될 수 있다.
기술된 CD59 핵산 및 단백질 조성물은 알츠하이머병, 다발 경화증, 심근 경색증, 죽상경화 혈관병, 미세혈관합병증, 갑상선염, 염증성 장질환, 기관 이식 거부, 막성 콩팥염, 교감 눈염증 및 사르코이드증과 같은 인플라마좀 관련 장애의 진단에 기초하여 치료를 위해 선택된 개체에 투여될 수 있다. 인플라마좀 관련 눈 장애, 예컨대 포도막염, 알레르기성 결막염, 안검염, 만성 결막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 눈 흉터 유사 천포창, 점막 천포창, 익상편 공막염, 스티븐스-존슨 증후군, 일스병, 베체트병, 사르코이드증, 전신 홍반 루푸스, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 보그-고야나기-하라다병, 교감 눈염증 및 사르코이드증이 포함된다.
특정 양태에서, CD59 핵산 또는 단백질 조성물은 개체가 염증을 감소시키거나 인플라마좀 관련 질환을 해결하기 위해 적어도 1회 용량의 이러한 조성물 또는 또 다른 치료에 대한 반응에 대해 모니터링한 후에 투여될 수 있다. 이러한 투여 및 모니터링 주기는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9회 이상 또는 적절한 임상 반응이 달성될 때까지 또는 인플라마좀 활성이 감소될 때까지 반복될 수 있다. 특정 구현예에서, CD59 핵산 및 단백질 조성물은 1) 인플라마좀 관련 질환 또는 인플라마좀 활성에 대한 양성 결과를 갖는 것으로 선택된 개체에게 투여될 수 있으며; 2) 그 후, 개체는 모니터링될 수 있으며, 인플라마좀 활성에 대한 테스트 또는 인플라마좀 관련 질환에 대한 진단 기준에 의해 결정된 바와 같은 악화, 변화 없음 또는 최적 이하 반응에 기초하여, 개체는 적어도 하나 이상의 후속 조성물 투여를 받을 수 있다. 특정 구현예에서, CD59 핵산 및 단백질 조성물은 1) 개체에게 투여될 수 있으며; 2) 그 후, 개체는 모니터링될 수 있으며, 인플라마좀 활성에 대한 테스트 또는 인플라마좀 관련 질환에 대한 진단 기준에 의해 결정된 바와 같은 악화, 변화 없음 또는 최적 이하 또는 그 이상의 반응에 기초하여, 개체는 적어도 하나 이상의 후속 조성물 투여를 받을 수 있다.
CD59 폴리펩티드/핵산의 방법 및 조성물을 포함하는 다음은 번호가 매겨진 구현예가 본원에서 구상된다:
1. 대상체의 염증-이환된 눈의 세포에서 인플라마좀 활성화를 억제하기 위한 방법으로서, 방법은 염증-이환된 눈의 세포에서 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 조성물은 인플라마좀 활성화를 억제하는, 방법.
2. 구현예 1에 있어서, 조성물이 막 공격 복합체(MAC)의 기능과 무관한 인플라마좀 활성화를 억제하는, 방법.
3. 구현예 1에 있어서, 대상체가 포도막염, 알레르기성 결막염, 안검염, 만성 결막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 안구 흉터 유사 천포창, 점막 천포창, 익상편 공막염, 스티븐스-존슨 증후군, 일스병, 베체트병, 사르코이드증, 전신 홍반 루푸스, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 보그-고야나기-하라다병, 교감 눈염증 및 사르코이드증으로부터 선택되는 적어도 하나의 질환을 갖는, 방법.
4. 구현예 3에 있어서, 포도막염이 앞포도막염, 중간포도막염, 후포도막염 및 범포도막염으로부터 선택되는 적어도 하나인, 방법.
5. 구현예 1에 있어서, 대상체로부터 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함하는 방법.
6. 구현예 5에 있어서, 샘플이 눈물, 혈액, 소변, 눈 분비물, 가래 및 점액으로부터 선택되는 적어도 하나인, 방법.
7. 구현예 1-6 중 어느 하나에 있어서, 투여 전에 눈의 망막 기능 및 인플라마좀 활성 마커 중 적어도 하나를 눈에서 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
8. 구현예 1-7 중 어느 하나에 있어서, 투여 후에 눈의 망막 기능 및 인플라마좀 활성 마커 중 적어도 하나를 눈에서 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
9. 구현예 7 또는 8에 있어서, 인플라마좀 활성 마커가 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+로부터 선택되는 적어도 하나인, 방법.
10. 구현예 7 또는 8에 있어서, 망막 기능 또는 인플라마좀 활성 마커를 측정하는 것이 눈 검사, 광 간섭 단층 촬영(OCT), 결막 인상 세포학(CIT), RTPCR, ELISA 및 PCR로부터 선택되는 적어도 하나의 절차를 수행하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
11. 구현예 3에 있어서, 포도막염을 치료하는데 충분한 투여량으로 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
12. 구현예 1에 있어서, 투여 전에 바이러스 벡터에서 뉴클레오티드 서열을 조작하는 것을 추가로 포함하는 방법.
13. 구현예 1 또는 12에 있어서, 뉴클레오티드 서열을 네이키드 핵산으로서 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
14. 구현예 13에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스 및 렌티바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이러스의 유전자 조작된 게놈인, 방법.
15. 구현예 14에 있어서, 렌티바이러스가 레트로바이러스인 방법.
16. 구현예 1에 있어서, 번역된 CD59 단백질의 글리코실 포스파티딜 이노시톨(GPI) 앵커링 도메인의 기능 손실을 발생시키는 적어도 하나의 돌연변이를 갖도록 막 독립성 CD59 단백질을 조작하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
17. 구현예 1에 있어서, 글리코실 포스파티딜 이노시톨(GPI) 앵커링 도메인의 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드를 결실시킴으로써 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 조작하는 것을 추가로 포함하는 방법.
18. 구현예 1에 있어서, 투여는 조성물을 안구 주사하는 것을 추가로 포함하는 방법.
19. 구현예 1에 있어서, 투여는 조성물을 국소 적용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
20. 구현예 18에 있어서, 안구 주입이 망막하 주입, 유리체 주입, 안구내 주입, 결막하 주입 및 테논하 주입으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
21. 구현예 18에 있어서, 안구 주사가 눈의 외부 층에 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
22. 구현예 1에 있어서, 추가의 치료제를 눈에 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
23. 구현예 22에 있어서, 추가적인 치료제가 항-종양제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항-마이코박테리아제, 항-진균제, 항-증식제 및 항-아폽토틱 제제로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 방법.
24. 구현예 22에 있어서, 추가적인 치료제가 성장 인자, 항-염증 제제, 혈관수축제, 콜라게나제 억제제, 스테로이드, 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 아스코르베이트, 안지오텐신, 칼레티쿨린, 테트라사이클린, 피브로넥틴, 콜라겐, 트롬보스폰딘, 전환 성장 인자(TGF), 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF 결합 단백질(IGFBP), 상피세포 성장 인자(EGF), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), neu 분화 인자(NDF), 간세포 성장 인자(HGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 헤파린-결합 EGF(HBEGF), 트롬보스폰딘, 폰 빌레브란트 인자-C, 헤파린, 헤파린 설페이트 및 히알루론산으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
25. 대상체의 염증-이환된 눈에서 인플라마좀의 활성을 억제하기 위한 키트로서, 키트는
a. 막-독립성 CD59 단백질 및/또는 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 약학적 조성물로서, 조성물은 대상체의 염증-이환된 눈에서 인플라마좀을 억제하기에 충분한 투여량으로 존재하는, 약학적 조성물;
b. 사용 설명서; 및
c. 용기를 포함하는, 키트.
26. 대상체에서 포도막염을 치료하기 위한 키트로서,
a. 막-독립성 CD59 단백질 및/또는 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 약학적 조성물로서, 조성물은 대상체에서 포도막염을 치료하기에 충분한 투여량으로 존재하는, 약학적 조성물;
b. 사용 설명서; 및
c. 용기를 포함하는, 키트.
27. 포도막염, 알레르기성 결막염, 안검염, 만성 결막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 안구 흉터 유사 천포창, 점막 천포창, 익상편 공막염, 스티븐스-존슨 증후군, 일스병, 베체트병, 사르코이드증, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 보그-고야나기-하라다병, 교감 눈염증 및 사르코이드증으로부터 선택되는 적어도 하나의 질환을 치료하기 위한 방법으로서, 방법은 대상체에
a) 염증-이환된 눈의 세포에서 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는
b) 막 독립성 CD59 단백질을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하며,
조성물은 인플라마좀 활성화를 억제하는, 방법.
28. 대상체의 염증-이환된 눈의 세포에서 인플라마좀 활성화를 억제하기 위한 방법으로서, 방법은
a) 눈에서 인플라마좀 활성 마커를 측정하는 단계; 및
b) 인플라마좀 활성 마커가 양성인 경우, 염증-이환된 눈의 세포에서 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하며, 조성물은 인플라마좀 활성화를 억제하는, 방법.
29. 구현예 28에 있어서, 인플라마좀 활성 마커가 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+로부터 선택되는, 방법.
30. 구현예 28 또는 29에 있어서, 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물의 투여 후 눈에서 인플라마좀 활성 마커를 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
31. 염증-이환된 대상체의 세포에서 인플라마좀 활성화를 억제하기 위한 방법으로서, 방법은
a. 염증-이환된 대상체의 세포에서 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계; 또는
b. 가용성 CD59 단백질을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하며;
조성물은 인플라마좀 활성화를 억제하는, 방법.
32. 구현예 31에 있어서, 조성물이 막 공격 복합체(MAC)의 기능과 무관하게 인플라마좀 활성화를 억제하는, 방법.
33. 구현예 31에 있어서, 대상체가 알츠하이머병, 다발 경화증, 심근 경색증, 죽상경화 혈관병, 미세혈관합병증, 갑상선염, 염증성 장질환, 기관 이식 거부, 막성 콩팥염, 교감 눈염증 및 사르코이드증으로부터 선택된 적어도 하나의 인플라마좀 관련 질환을 갖는, 방법.
34. 구현예 31에 있어서, 대상체로부터 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함하는 방법.
35. 구현예 34에 있어서, 샘플이 혈액, 혈장, 혈청, 말초 혈액 단핵 세포, 뇌척수액 및 소변으로부터 선택되는 적어도 하나인, 방법.
36. 구현예 31-35 중 어느 하나에 있어서, 투여 전에 대상체에서 인플라마좀 활성 마커를 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
37. 구현예 31-35 중 어느 하나에 있어서, 투여 후에 대상체에서 인플라마좀 활성 마커를 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
38. 구현예 36 또는 37에 있어서, 인플라마좀 활성 마커가 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+로부터 선택되는 적어도 하나인, 방법.
39. 구현예 38에 있어서, 인플라마좀 관련 질환을 치료하는데 충분한 투여량으로 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
40. 구현예 39에 있어서, 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스 및 렌티바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이러스의 유전자 조작된 게놈을 포함하는 벡터로 수송되는, 방법.
41. 구현예 40에 있어서, 렌티바이러스가 레트로바이러스인 방법.
42. 구현예 31에 있어서, 투여가 조성물을 정맥내 주사하는 것을 추가로 포함하는 방법.
43. 구현예 31에 있어서, 투여가 조성물을 국소 적용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
44. 구현예 31에 있어서, 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
45. 구현예 44에 있어서, 추가적인 치료제가 항-종양제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항-마이코박테리아제, 항-진균제, 항-증식제 및 항-아폽토틱 제제로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 방법.
46. 구현예 44에 있어서, 추가적인 치료제가 성장 인자, 항-염증 제제, 혈관수축제, 콜라게나제 억제제, 스테로이드, 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 아스코르베이트, 안지오텐신, 칼레티쿨린, 테트라사이클린, 피브로넥틴, 콜라겐, 트롬보스폰딘, 전환 성장 인자(TGF), 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), IGF 결합 단백질(IGFBP), 상피세포 성장 인자(EGF), 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), neu 분화 인자(NDF), 간세포 성장 인자(HGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 헤파린-결합 EGF(HBEGF), 트롬보스폰딘, 폰 빌레브란트 인자-C, 헤파린, 헤파린 설페이트 및 히알루론산으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
47. 대상체의 염증-이환된 세포에서 인플라마좀의 활성을 억제하기 위한 키트로서, 키트는
c. i. 막-독립성 CD59 단백질 및/또는 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는
ii. 가용성 CD59를 포함하는 약학적 조성물로서, 조성물은 대상체의 염증-이환된 눈에서 인플라마좀을 억제하기에 충분한 투여량으로 존재하는, 약학적 조성물;
d. 사용 설명서; 및
e. 용기를 포함하는, 키트.
48. 알츠하이머병, 다발 경화증, 심근 경색증, 죽상경화 혈관병, 미세혈관합병증, 갑상선염, 염증성 장질환, 기관 이식 거부, 막성 콩팥염, 교감 눈염증 및 사르코이드증으로부터 선택되는 적어도 하나의 질병을 치료하기 위한 방법으로서, 방법은
세포로부터 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 가용성 CD59 단백질을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 조성물은 인플라마좀 활성화를 억제하는, 방법.
이제 충분히 설명된 본 발명은 다음의 실시예 및 청구 범위에 의해 추가로 설명되며, 이는 예시적이며 추가 제한을 의미하지 않는다.
실시예
실시예 1: 마우스
C57BL/6J 배경의 C57BL/6J 및 C9-/- 마우스를 The Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)에서 구입하고, 터프츠 대학교 의과대학(Tufts University School of Medicine, Boston)의 동물 시설에서 유지 관리하였다. 모든 동물 연구 프로토콜은 시력 연구에서 동물 사용에 관한 시력 및 안과 결의를 위한 협회와 실험실 동물 관리 및 사용을 위한 국립 보건원 가이드의 권장 사항을 준수하였다.
실시예 2: AAV 작제물 및 유리체내 주입
글리코실-포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커링 신호가 결실된 절두된 형태의 인간 CD59 또는 프로텍틴을 발현하는 AAV 혈청형 2 벡터(AAVCAGsCD59)는 문헌 [Cashman, S. M., et al. (2011) PLoS One 6, e19078]에 기술된 프로토콜에 의해 작제하였다. 가용성 CD59(sCD59)는 닭 β-액틴 프로모터에서 발현시켰다. 음성 대조군으로서 녹색 형광 단백질(AAVCAGGFP)을 발현하는 유사한 벡터를 사용하였다. 6주령 C57Bl/6J 마우스에 3.5 x 109 게놈 복사체/μl의 AAVCAGsCD59 또는 AAVCAGGFP 또는 PBS(1μl)를 주사하고, 1주 후 마우스를 본원의 예에 기재된 바와 같이 EAU로 자극하였다.
실시예 3: 능동 면역화에 의한 EAU 유도
동일한 유전자 배경의 6주령 C57Bl/6J 및 C9-/- 마우스를 결핵균 균주 H37RA (2.5 mg/mL)를 함유하는 완전 프로인트 애주번트(CFA)와 200 μl 1:1 vo/vol로 에멀젼화된 200 μg의 인간 광수용체간 레티노이드-결합 단백질(IRBP) 펩티드 1-20(아미노산 서열: GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD, SEQ ID NO: 1; Biomatik Corporation, Cambridge, ON, Canada)로 면역화하였다. 100 ul PBS에 희석된 1.5 μg 보르데텔라 퍼투시스 독소를 복강내 주사를 통해 마우스에 동시에 투여하였다(Agarwal, R.K., et al.(2012) Methods Mol. Biol. 900, 443-469).
실시예 4: 면역조직화학
망막 냉동 절편(10 μm)을 PBS에서 15분 동안 재수화시키고, 1시간 동안 PBS 중의 6% 정상 염소 혈청으로 차단하고, 토끼 항-인간 C5B-9에 대한 일차 항체(Complement Technology, Inc., Tyler, TX; 희석: 1:800, 2% 정상 염소 혈청을 함유하는 PBS로 희석됨)와 습한 챔버에서 밤새 인큐베이션하였다. 후속하여, 절편을 세척하고, Cy3(Molecular Probes, Eugene, OR)에 컨쥬게이션된 항-토끼 이차 항체에서 배양하여 C5b-9를 망막 절편에 위치시켰다. 슬라이드를 DAPI(Vectashield-DAPI; Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 포함하는 안티-페이드 매질 중에서 탑재하여 핵을 대비염색하고, Leica 공초점 현미경으로 이미지를 얻었다. 전체 절편에서 C5b-9 염색의 강도는 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health; Bethesda, MD)를 사용하여 정량화하였다.
실시예 5: 웨스턴 블롯 분석
뮤린 망막을 채취하고, 프로테아제 억제제 칵테일과 함께 50mM Tris-HCl(pH 7.4), 250 mM NaCl 및 1% Nonidet P-40을 포함하는 빙-냉 RIPA 완충액에서 균질화하였다. 각 단백질 샘플(35 μg)을 NLRP3, 카스파제-1 및 ASC에 대해 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Any kDTM Mini-PROTEAN® 프리캐스트 겔, Biorad, CA)으로 분리한 다음 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 0.1% Tween-20과 혼합된 차단 완충액(LI-COR, Lincoln, NE, USA)으로 차단한 후, 면역블롯을 일차 항체로서 마우스 항-NLRP3 모노클로날, 마우스 항-카스파제1 모노클로날 및 토끼 항-ASC 폴리클로날(Adipogen Corporation, San Diego, CA; 희석:1:500)과 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 적절한 이차 항체와 인큐베이션한 후, LI-COR-Odyssey 적외선 스캐너(LI-COR)를 사용하여 면역반응 밴드를 가시화시켰다. 블롯은 로딩 대조군으로서 β-액틴으로 재-프로빙하였다.
실시예 6: 효소-결합 면역흡착 검정
사이토카인은 20 μg 망막 단백질 상청액을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 마우스 IL-1β, IFN-γ 및 IL-17(PeproTech, Rocky Hills, NJ)에 대한 샌드위치 ELISA로 정량화하였다. 상청액을 이중으로 첨가하고, 측정 중인 사이토카인은 호스래디쉬 퍼옥시다제에 컨쥬게이션된 모노클로날 항체로 드러나게 하였다. 사이토카인의 농도는 pg/mL로 기술하였다.
실시예 7: 유전자 발현
총 RNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy 미니 키트(QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 마우스 망막으로부터 분리하였다. RNA는 'Nanodrop'에서 260 nm 흡광도로 정량화하였으며, 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하는 cDNA 합성에 1μg RNA를 사용하였다.
베타-액틴(Mm02619580_g1), IL-1β(Mm00434228_m1), IL-17(Mm00439619_m1) 및 IFN-γ(Mm01168134_m1)에 대해 미리 설계된 TaqMan 프라이머를 사용하여 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행하였다. 변성은 95℃에서 10분 동안 이어서, 95℃에서 15초 동안의 40회 사이클에 의해 수행하고, 어닐링 및 확장은 60℃에서 60초 동안 수행하였다. 최종 PCR 생성물을 2% 아가로스 겔에서 전기영동하여 PCR 특이성을 확인하였다. RT-PCR에서 얻은 Ct 값을 ddCt 방법을 사용하여 동일한 샘플에서 b-액틴으로부터의 Ct 값으로 정규화하고, 유전자 발현의 배수-변화 데이터를 얻었다. IL-17에 대한 유전자 발현은 반-정량적으로 정량화하였다.
실시예 8: 유동 세포측정
배수 림프절 세포를 마우스에서 분리하고 세포를 40 μm 나일론 메쉬에 통과시켜 단일 세포 현탁액을 얻었다. 배수 림프절 세포는 세포내 사이토카인 염색 전에 GolgiStop (BD Biosciences, San Jose, CA)의 존재하에 4시간 동안 50 ng/mL PMA 및 500 ng/mL 이노마이신(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)으로 자극하였다. 세포를 표면 마커 CD4에 대해 염색한 다음 사이토카인 염색을 위해 Cytofix/Cytoperm 완충액(BD Biosciences, San Jose, CA)으로 고정하였다. 세포를 Perm/Wash 완충액(BD Biosciences, San Jose, CA) 중의 세포내 표적(IFNγ, IL-17; eBiosciences, Inc., San Diego, CA) 및 각각의 아이소타입 대조군에 대해 적절하게 희석된 형광단-표지 항체로 염색하였다. FACS Calibur (BD Biosciences)에서 유동 세포측정을 수행하고, FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Ashland, OR)로 데이터를 분석하였다. 게이트는 적절한 아이소타입 대조군을 기반으로 설정하였다. 표시된 경우, 양성 세포의 백분율은 정상 대조군에 대한 게이트된 집단 중의 백분율을 나타낸다.
실시예 9: 망막전위도
암순응 및 광순응 망막전위도(ERG) 분석을 이용하여 간상 및 추체 기능의 손실을 측정하였다. EAU 유도 3주 후 ERG 검사는 BigShot ganzfeld를 갖는 UTAS 시스템(LKC Technologies; Gaithersburg, MD)을 사용하여 기록하였다. 밤새 암 적응 후, 마우스를 암 조건 하에 케타민(100 mg/kg)/자일라진(10 mg/kg) 복강내 주사로 마취하였다. 동공은 1% 트로피카미드 및 2.5% 페닐에프린 하이드로클로라이드로 확장하였다. ERG 활성 콘택트 렌즈 골드 전극을 윤활제 점적(GenTeal, Alcon, Inc., Fort Worth, TX)이 있는 각막 중앙에 부드럽게 위치시켜 각막 수화 및 더욱 우수한 전기 전도도를 유지하였다. 기준 전극 및 접지 전극을 각각 목 뒤쪽과 꼬리 아래 근처에 피하 삽입하였다. 암순응 ERG는 0 dB (5 cds/m2), -10 dB (25 cds/m2), -20 dB (25 cds/m2)에서 10 msec 백색광 플래쉬로 도출되었다. 동시에 광순응 ERG는 2분 백색광 표백 후 검사하였다. 광순응 반응은 0 dB 및 1dB (3.15 cds/m2) 강도에서 백색광 플래쉬로 도출하였다. 각 플래쉬 강도에서 10개 반응을 평균화하였다. a-파의 진폭은 기준선으로부터 a-파의 음의 피크까지 측정하고, b-파는 a-파의 음의 피크로부터 b-파의 피크까지 측정하였다.
실시예 10: 스펙트럼 도메인 광 간섭 단층 촬영(OCT) 및 안저 이미징
마우스를 케타민 및 자일라진 칵테일로 마취시키고, 동공을 1% 트로피카미드 및 2.5% 페닐에프린의 점적으로 확장시켰다. 눈 윤활제(GenTeal, Alcon, Inc., Fort Worth, TX)를 국소 적용하여 각막을 촉촉하게 유지하였다. 광 간섭 단층 촬영(OCT) 이미지를 Bioptigen Spectral Domain Ophthalmic Imaging System (Bioptigen Envisu R2300, Morrisville, NC)을 사용하여 획득하였다. 평균 단일 B 스캔 및 부피 스캔을 문헌 [Chen, J., et al. (2013) PLoS One 8, e63904]에 기술된 바와 같이 시신경 헤드를 중심으로 하는 이미지로 얻었다.
EAU 24일 후, 안저 이미지화를 수행하고, Micron III 망막 이미징 현미경 및 StreamPix 소프트웨어(Phoenix Research Labs, Pleasanton, CA)를 사용하여 이미지를 캡처하였다. 구체적으로, 눈은 침윤, 혈관 주위의 커핑(cuffing), 백색 선형 병변, 망막 이영양증, 망막하 출혈 및 망막 박리와 같은 생리학적 및 병리학적 증상에 대해 검사하였다. 개별적 스코어는 하기 개별 매개변수 각각에 대한 0-4 등급으로 맹검 방식으로 2명의 독립적 관찰자에 의해 평가하였다: 망막 침윤, 시신경 유두 변화, 혈관 분포 및 구조 손상. 임상 스코어는 이들 네가지 기준 각각에 대한 스코어를 평균하여 계산하였다(Xu, H., et al. (2008) Exp. Eye Res. 87, 319-326).
실시예 11: 조직병리학
모든 군의 조직학적 검사를 위한 눈을 면역화 후 24일에 채취하고, 10% 완충된 포르말린에 고정시켰다. 이틀 동안 고정한 후, 표본은 등급별 알콜 단계에 의해 탈수하고 파라핀 블록에 내장시켰다. 6개의 수직 단면(5 μm)을 시신경 영역을 포함한 6개의 다른 평면에서 절단하고, 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. EAU의 상세한 중증도는 종래의 문헌 [Caspi, R. R., et al. (1988) J. Immunol 140, 1490-1495]에 기술된 바와 같이 광수용체 손상, 침윤 및 혈관염에 대해 0-4의 등급으로 평가하였다. 이러한 기준에 기초하여, 광수용체 손상 스코어는 광수용체 손실, 망막 주름 및 망막 박리의 조합 스코어로서 계산하였다. 유사하게는, 침윤 스코어는 육아종, 출혈, DF 결절 및 침윤의 조합으로 구성되었다. 혈관염 스코어는 혈관주위 염증 및 혈관구조 주위의 CD4 세포 침윤, 혈전 형성 및 망막에서 이환된 혈관구조의 정도를 나타낸다.
실시예 12: 통계 분석
결과는 평균 ± SEM으로 표시된다. 만-휘트니 테스트는 임상 스코어, 조직학적 스코어 및 FACS 분석에 사용되었다. 두 군 간의 통계적 차이는 독립표본 t-테스트를 이용하여 분석하였다. 2개 초과의 군 사이의 비교를 위해, 일원 ANOVA를 수행하였다. 0.05 이하의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 13: EAU의 MAC 증착
보체 활성화의 최종 단계는 세포 표면 상의 MAC 증착을 발생시킨다. 다중 C9 분자를 사전-형성된 C5b-8 복합체로 모집하는 것은 MAC(C5b-9) 어셈블리의 최종적인 필수 단계이다. 따라서, C9 결핍 마우스는 기능성 MAC 복합체를 형성할 수 없다.
MAC가 EAU에서 망막 세포의 표면에 형성되는지 여부를 결정하기 위해 냉동된 망막 절편을 C57B1/6J 마우스에서 EAU 유도 후 24일째에 C5b-9에 대한 항체로의 염색에 의해 검사하였다. EAU 마우스의 망막 상의 MAC 증착은 정상 대조군 마우스의 망막 상의 MAC 증착과 비교하여 70% 더 높은 것으로 관찰되었다. C9-/- EAU 망막 표면 상의 MAC 증착은 유의하지 않은 것으로 관찰되었다(도 1a 및 도 9). 얻은 데이터는 보체가 EAU에서 활성화되고, 반응은 망막 조직에서 MAC를 형성 완료에 도달함을 나타내었다. 데이터는 또한 C9-/- EAU 마우스가 망막 상에 MAC를 형성할 수 없었음을 나타낸다.
실시예 14: EAU에서 인플라마좀의 활성화
세포 표면 상의 MAC 증착은 기공 형성으로 이어지며, 이는 세포내 칼슘의 증가를 발생시킨다. 본원의 예에서, MAC의 증착이 NLRP3 인플라마좀의 활성화 및 IL-1β의 후속 분비를 촉발시켰는지의 여부를 검사하였다.
얻은 데이터는 C57Bl/6J 마우스에서 EAU가 정상 마우스의 대조군보다 112% 더 높은 IL-1β 단백질 및 상응하는 45배 더 높은 IL-1β mRNA를 유도함을 발견하였다. 대조적으로, C9-/- EAU 마우스는 37% 더 높은 IL-1β 단백질 및 상응하는 3.8배 더 높은 IL-1β mRNA를 달성하는 것으로 관찰되었다(도 1b 및 c). 웨스턴 블롯 분석은 EAU 마우스에서 200% 더 높은 NLRP3 단백질을 나타내었고, C9-/- EAU 마우스는 8% 더 높은 NLRP3 단백질을 가졌다(도 1d).
인플라마좀 복합체의 중요한 구성 요소는 카스파제-1이며, 이는 일반적으로 활성 p10 및 p20 서브유닛으로의 단백질 분해에 의해 NLRP3 복합체에 의해 활성화되어 최종 다량체 인플라마좀 복합체를 만드는 비활성 자이모겐 형태로 발생한다. 웨스턴 블롯 분석은 정상보다 EAU 마우스의 망막에서 80% 더 높은 카스파제-1(p20)의 활성화를 생산하였으며; 그러나, 정상과 비교하여 C9-/- EAU 마우스의 망막에서 25% 더 높은 카스파제-1(p20)의 활성화가 관찰되었다(도 1e). EAU 마우스의 망막에서 인플라마좀 어댑터 단백질인 ASC 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 웨스턴 블롯 분석은 EAU 마우스에서 44% 더 높은 ASC 단백질이 관찰되었고, 정상보다 C9-/- EAU 마우스에서 18% 더 높은 ASC 단백질이 관찰되었음을 나타냈다(도 1f).
따라서, IL1-β, NLRP3, 카스파제1 및 ASC 각각은 EAU에서 증가된 것으로 관찰되었으며, C9-/- EAU 마우스는 이러한 증가로부터 부분적으로 보호되어 MAC의 증착이 EAU에서 인플라마좀의 활성화에 중요한 역할을 함을 나타낸다.
실시예 15: EAU에서 망막 기능에 대한 MAC의 역할
EAU 및 C9-/- EAU 마우스의 망막 기능은 망막전위도(ERG)를 사용하여 측정하였다. EAU 마우스 망막 기능은 대조군 C57Bl/6J 마우스와 비교하여 각각 -20dB, -10dB 및 0dB의 플래쉬 강도에서 33%, 50% 및 41% 감소된 암 적응된 a-파 진폭을 갖는 것으로 관찰되었다. C9-/- EAU 마우스 망막 기능은 정상 대조군 C57Bl/6J 마우스보다 -20dB, -10dB 및 0dB의 플래쉬 강도에서 각각 특히 9%, 40% 및 27% 더 적은 a-파 진폭을 갖는 것으로 관찰되었다(도 2a 및 도 2b).
EAU 마우스에서 암 적응된 b-파 진폭은 대조군 C57Bl/6J 마우스와 비교하여 -20dB, -10dB 및 0dB의 플래쉬 강도에서 각각 47%, 52% 및 49% 감소하는 것으로 관찰되었다. C9-/- EAU 마우스는 대조군 C57Bl/6J 마우스와 비교하여 -20dB, -10dB 및 0dB의 플래쉬 강도에서 각각 특히 32%, 33% 및 17% 더 적은 암 적응된 b-파 진폭을 갖는 것으로 관찰되었다. a 파 및 b 파 암-적응된 ERG 둘 모두에서 차이가 관찰되었지만, 0dB는 통계적으로 유의미한 것으로 관찰되었다(p <0.05)(도 2a 및 도 2b).
EAU 마우스는 대조군 C57Bl/6J 마우스와 비교하여 0dB 및 1dB의 플래쉬 강도에서 각각 44% 및 37% 감소된 광 적응된 b-파 진폭을 갖는 것으로 관찰되었다. C9-/- EAU 마우스는 대조군 C57Bl/6J 마우스와 비교하여 0dB 및 1dB의 플래쉬 강도에서 각각 5% 및 15% 감소된 b-파 진폭을 갖는 것으로 관찰되었다. 광 적응된 b 파 진폭에서 차이가 관찰되었지만, 0dB는 통계적으로 유의미한 것으로 관찰되었다(p <0.05)(도 2a 및 도 2b).
실시예 16: C9 -/- EAU에서 망막 구조의 무의미한 보존
EAU 및 C9-/- EAU 마우스에서 질병의 망막 구조 및 병리학적 중증도를 EAU 유도 후 24일째에 안저 이미지화, OCT 및 조직학을 사용하여 정량화하였다. 문헌 [Xu, H., et al. (2008) Exp. Eye Res. 87, 319-326]에서 개발된 임상 스코어 기준을 기반으로 하여, 안저 이미지화는 EAU 마우스가 중증 염증, 특히 대조군 C57Bl/6J 마우스와 비교하여 38배 더 높은 혈관 염증, 8배 더 높은 면역 세포의 침윤, 13배 더 높은 시신경 유두에 대한 손상 및 34배 더 높은 구조 손상을 포함하여, 대조군 대비 16배 초과의 전체 임상 스코어를 가졌음을 나타내었다. 놀랍게도, 포도막염을 겪고 있는 C9-/- 마우스는 EAU 마우스와 통계적으로 동등한 병리학적 결과를 갖는 것으로 관찰되었다(도 3).
면역화 후 24일째에 EAU 마우스는 OCT 이미지화 및 조직병리학에 의해 관찰된 바와 같이 C57Bl/6J 대조군 마우스와 비교하여 유리체 및 맥락막으로의 중증의 염증 세포 침윤, 망막 혈관염, 망막 부종 및 중등증 내지 중증의 망막 주름 및 침윤을 나타내는 것으로 관찰되었다(도 4a 및 도 4b). 자세한 조직학적 분석은 대조군, EAU 및 C9-/- EAU 마우스 망막으로부터의 파라핀 내장 절편에서 수행하였으며, 문헌 [Caspi, R. R., et al. (1988) J. Immunol 140, 1490-1495]에 기술된 기준에 근거하여 스코어링하였다. EAU 마우스는 C57Bl/6J 대조군 마우스보다 적어도 약 27배 더 많은 침윤물(도 4c), 증가된 혈관염(도 4d) 및 78배 더 높은 광수용체 손상(도 4d)을 갖는 것으로 관찰되었다. C9-/- EAU 마우스의 조직학적 스코어가 EAU 마우스와 비교하여 28% 더 적은 침윤, 35% 더 낮은 광수용체 손상 및 31% 감소된 혈관염을 가졌지만, 그 차이는 통계학적으로 유의한 것으로 관찰되지 않았다(도 4b 및 c).
광수용체 손상 스코어는 문헌 [Caspi, R. R., et al. (1988) J. Immunol 140, 1490-1495]에 기술된 기준에 근거하여 광수용체 손실, 망막 주름 및 망막 박리의 조합 스코어로서 계산하였다. 유사하게는, 침윤 스코어는 육아종, 출혈, DF 결절 및 침윤의 조합으로 구성되었다. 혈관염 스코어는 혈관주위 염증 및 혈관구조 주위의 CD4 세포 침윤, 혈전 형성 및 망막에서 이환된 혈관구조의 정도를 나타낸다.
실시예 17: EAU에서 MAC 증착의 가용성 CD59 매개 억제
본원의 예에서 얻은 데이터는 C9-/- 마우스가 C9의 유전적 결함으로 인해 MAC를 형성할 수 없었으며, 또한 인플라마좀을 활성화시킬 수 없으며, 포도막염의 일부 특징으로부터 보호됨을 나타낸다. 그러나, C9-/- EAU 마우스의 망막은 EAU와 관련된 조직학적 병상으로부터 보호되지 않은 것으로 관찰되었다.
CD59는 대부분의 핵화된 세포 막에서 발견되는 GPI-앵커링된 단백질이다. CD59의 주요 기능은 C9가 미리 형성된 C5b-8 복합체로의 동원을 방지하는 것이다. GPI 앵커 신호가 결실되어 망막 전반에 걸쳐 분비되고 확산될 수 있게 하는 절두된 CD59(AAVCAGsCD59)를 발현하는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터는 문헌 [Cashman, S. M., et al. (2011) PLoS One 6, e19078]에 기술되어 있다.
마우스에 AAVCAGsCD59를 유리체내 주입하고, 1주 후(최적 수준의 전이유전자 발현 수준을 허용하기 위해) 마우스를 본원의 예에 기재된 바와 같이 EAU로 자극하였다. 음성 대조군에 있어서, 마우스에 AAVCAGGFP- EAU로 유사하게 자극된 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 바이러스를 유리체내 주입하였다. EAU의 유도 후 24일째에, 두 마우스 세트 모두로부터의 냉동된 망막 절편을 C5b-9 항체로 염색함으로써 검사하였다. EAU로 후속하여 자극된 마우스에서 AAVCAGGFP의 유리체내 주입은 신경절 세포 층, 내망상 층 및 속핵 층에서 전이유전자 발현으로 이어졌다(도 14b). 표현형적으로 더욱 중증의 EAU를 가진 마우스에서, 전이유전자 발현은 또한 RPE 및 광수용체에서 관찰될 수 있다(도 14b, 맨 아래 줄). AAVCAGsCD59-주입된 EAU 마우스는 AAVCAGGFP-주입된 EAU 마우스에 비해 약 45% 적은 MAC 증착을 갖는 것으로 관찰되었다(도 5a 및 도 12). 따라서, 유리체내 주입된 AAVCAGsCD59는 EAU 마우스의 망막에서 MAC 형성을 억제하는 것으로 관찰되었다.
실시예 18: EAU에서 인플라마좀의 가용성 CD59 매개된 억제
본원의 예에서, C9-/- EAU 마우스는 EAU 진행중인 대조군 C57Bl/6J 마우스와 비교하여 인플라마좀의 활성화의 현저한 감소를 갖는 것으로 관찰되었다. AAVCAGsCD59 또는 AAVCAGGFP가 미리 주입된 EAU 마우스에서 IL-1β의 NLRP3/카스파제-1 매개된 분비를 본원에 기술된 예에 따라 측정하였다.
AAVCAGsCD59-주입된 EAU 마우스는 ELISA 및 RT-PCR로 측정할 경우 AAVCAGsCD59-주입된 EAU 마우스와 비교하여 IL-1β 단백질이 40% 더 적고 IL-1β mRNA가 70% 더 적은 것으로 관찰되었다(도 5b 및 도 5c). 유사하게, NLRP3 단백질은 물론 카스파제 1 p20 수준은 대조군 AAVCAGGFP-주입된 EAU 마우스와 비교하여 AAVCAGsCD59-주입된 EAU 마우스에서 60% 감소하였다(도 5d 및 도 5e). 대조군 AAVCAGGFP-주입된 EAU 마우스와 비교하여 AAVCAGsCD59-주입된 EAU 마우스에서 ASC의 양 사이의 실질적인 차이는 관찰되지 않았다(도 5f). 따라서, 얻은 데이터는 sCD59가 포도막염에서 MAC 증착을 억제함으로써 NLRP3 매개된 IL-1β 생성을 억제함을 나타낸다.
실시예 19: EAU의 T 세포 분화에서 MAC 매개된 NLRP3 인플라마좀 활성화의 역할
CD4+ 침윤 T 세포는 분화 상태 또는 미분화 상태의 망막에 들어가 IFN-γ 생산 세포인 Th1과 IL-17 생산 세포인 Th17로 들어간다. T 세포 분화에서 MAC의 잠재적 역할을 조사하기 위해, EAU 및 C9-/- EAU 마우스 망막에서 IFN-γ 및 IL-17의 수준을 각각 측정하였다.
ELISA를 사용하여, 대조군 C57Bl/6J 망막과 비교하여 EAU 망막에서 102% 양의 IFN-γ 단백질이 관찰되었다. 대조적으로, 대조군 C57Bl/6J 망막과 비교하여 C9-/- EAU 망막에서 14% 더 적은 IFN-γ 단백질이 관찰되었다. RT-PCR 데이터는 대조군 C57Bl/6J 망막과 비교하여 각각 EAU 및 C9-/- EAU 망막에서 IFN-γ mRNA가 각각 200배 및 14배 넘게 증가하였음을 나타내었다(도 10a 및 도 10b). 유사하게, IL-17 단백질의 발현은 대조군 C57Bl/6J 망막과 비교하여 EAU 망막에서 99% 더 높은 것으로 관찰되었지만 IL-17 단백질의 발현은 대조군 C57Bl/6J 망막과 비교하여 C9-/- EAU 망막에서 단지 44% 더 높은 것으로 관찰되었다. IL-17 mRNA의 발현 수준 사이의 통계학적 차이는 EAU 및 C9-/- EAU 망막에서 관찰되지 않았다. IL-17 mRNA 수준은 C57Bl/6J 망막에서 검출 한계 아래로 유지되는 것으로 관찰되었다(도 10c 및 도 10d). 이러한 데이터는 MAC가 EAU에서 T 세포 분화에 역할을 한다는 것을 나타낸다.
Th1 CD4+ 세포 및 Th17 CD4+ 세포의 수준은 대조군 C57Bl/6J, EAU 및 C9-/- EAU 마우스에서 EAU 후 24일째에 배수 림프절(DLN)에서 측정하였다. 대조군 C57Bl/6J 마우스와 비교하여 EAU 마우스의 DLN에서 더 많은 수의 IL-17 및 IFN-γ 양성 CD4+ 세포가 관찰되었다(도 11a - 도 11c). EAU 및 C9-/- EAU 마우스 사이의 DLN에서 IFN-γ 및 IL-17 양성 CD4+ 세포 수준의 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 11a - 도 11c). 이러한 데이터는 MAC가 EAU에서 망막의 T 세포 분화에 중요한 역할을 하고 MAC가 DLN에서 중요한 역할을 하지 않을 수 있음을 나타낸다.
실시예 20: EAU에서 T 세포 분화에 대한 가용성 CD59의 영향
EAU를 겪는 sCD59-발현 눈에서 T 세포 분화에 대한 잠재적 효과를 조사하기 위해, AAVCAGsCD59-주입된 EAU 마우스 및 AAVCAGGFP-주입된 EAU 마우스에서 IFN-γ 및 IL-17 단백질 및 mRNA의 수준을 측정하였다.
IFN-γ 및 IL-17 단백질의 수준은 대조군 AAVCAGGFP-주입된 EAU 망막과 비교하여 AAVCAGsCD59-주입된 EAU 망막에서 양이 25% 및 35% 넘게 현저히 낮았다(도 13a 및 도 13c). 또한, 새로 분리된 AAVCAGsCD59-주입된 EAU 망막에서 IFN-γ 및 IL-17 mRNA의 수준은 대조군 AAVCAGGFP-주입된 EAU 망막과 비교하여 각각 47% 및 10% 더 낮은 것으로 관찰되었다. mRNA의 차이는 통계적으로 유의한 것으로 관찰되지 않았다(도 13b 및 도 13d).
실시예 21: EAU에서 망막 기능의 가용성 CD59 매개된 보존
sCD59가 EAU에서 망막 기능을 보존할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 포도막염을 겪고 있는 AAVCAGsCD59-주입된 또는 AAVCAGGFP-주입된 마우스에서 ERG를 수행하였다. AAVCAGsCD59 주입된 EAU 마우스는 대조군 AAVCAGGFP-주입된 마우스와 비교하여 -20dB, -10dB 및 0dB의 플래쉬 강도에서 각각 45%, 49% 및 51% 더 높은 암-적응된 a-파 진폭을 갖는 것으로 관찰되었다. 유사하게, AAVCAGsCD59 주입된 마우스에서 암-적응된 b-파 진폭은 대조군 AAVCAGGFP 주입된 EAU 대조군 눈과 비교하여 -20dB, -10dB 및 0dB 플래쉬 강도에서 각각 55%, 48% 및 40% 더 높은 것으로 관찰되었다(도 6). 또한, AAVCAGsCD59 주입된 EAU 눈에서 0dB 및 1dB 플래쉬 강도에서 광 적응된 b-파 진폭은 대조군 AAVCAGGFP 주입된 대조군 EAU 눈과 비교하여 12% 및 39% 보존되었다(도 6). 포도막염에서 내부 및 외부 망막의 망막 기능을 보존하는데 있어서 재조합 sCD59에 대해 잠재적으로 유의한 치료학적 역할이 관찰되었다.
실시예 22: 망막 구조의 가용성 CD59 매개된 보존 및 EAU에서의 병상
sCD59가 망막 구조를 보존하고 포도막염과 관련된 병상을 감소시킬 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, AAVCAGsCD59-주입된 또는 AAVCAGGFP-주입된 EAU 마우스의 안저 이미지화를 수행하였다. 문헌 [Xu, H., et al. (2008) Exp. Eye Res. 87, 319-326]에 기술된 스코어링 기준에 근거하여, AAVCAGsCD59 주입된 EAU 마우스에서 전체 임상 스코어가 대조군 AAVCAGGFP 주입된 EAU 마우스와 비교하여 22% 더 낮음이 결정되었다. 전체 임상 스코어에는 AAVCAGGFP-주입된 EAU 마우스와 비교하여 AAVCAGsCD59-주입된 EAU 마우스에서 24% 더 낮은 염증성 침윤, 27% 더 적은 구조적 손상, 22% 감소된 혈관염 및 혈관 커핑, 및 13% 더 적은 시신경 유두에 대한 손상의 출현이 포함된다(도 7a - 도 7f). PBS 비히클 대조군과 AAVCAGGFP-주입된 EAU 망막 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 혈관, 침윤 및 구조적 손상 스코어 각각은 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 관찰되었으나(p <0.05), 시신경 유두 스코어는 통계적 유의성에 도달하지 않았다(p = 0.1). 따라서, 얻은 데이터는 sCD59의 발현이 포도막염에서 망막 염증 및 면역 세포의 침윤을 감소시켰음을 나타낸다.
EAU 진행 및 중증도는 OCT 스캔에서 기록되고 관찰된 바와 같이 AAVCAGsCD59와 비교하여 AAVCAGGFP-주입된 EAU 마우스에서 더 높은 것으로 관찰되었다(도 8a). AAVCAGsCD59-주입된 EAU 마우스 또는 대조군 AAVCAGGFP-주입된 EAU 마우스의 망막에서 취한 파라핀 절편의 상세한 조직학적 분석을 수행하였다. 유사하게, 문헌 [Caspi, R. R., et al. (1988) J. Immunol 140, 1490-1495]에 기술된 기준에 근거하여, AAVC AGsCD59-주입된 EAU 마우스는 대조군 AAVCAGGFP-주입된 EAU 마우스와 비교하여 대략 76% 적은 침윤, 69% 적은 광수용체 손상 및 78% 적은 혈관염을 갖는 것으로 관찰되었다(도 8b - 도 8e). 광수용체 손상 및 침윤 차이는 통계적으로 유의한 것으로 관찰되었으나(각각 p = 0.03 및 p = 0.01), 혈관염 스코어는 통계적으로 유의하지 않았다(p = 0.2).
실시예 23: 가용성 CD59 단백질 조성물을 사용한 죽상경화증 개체의 치료 및 후속 모니터링
개체는 증가된 내중막 두께(IMT)를 나타내는 초음파 촬영에 기초하여 죽상경화성 혈관 질환으로 진단되고, 그 후 개체에는 정맥내 주입에 의해 가용성 CD59 단백질을 포함하는 조성물을 투여하였다. 환자에는 주 1회로 3회의 후속 용량을 투여하였다. 투여 후 개체를 초음파촬영에 의해 재평가하였으며, 이는 IMT에 변화가 없음을 나타내며, 그 후 개체에는 매주 추가 4회 용량의 CD59 단백질을 정맥내 투여하고 이어서 재평가하였다. 추적 검사에서 IMT 두께는 허용가능한 범위로 감소되고, 추가 CD59 처리는 투여되지 않는다.
실시예 24: 가용성 CD59 단백질 조성물을 사용한 사르코이드증 개체의 치료 및 후속 모니터링
개체는 사르코이드증과 일치하는 증상을 주치의에게 제시하고, 폐 X-레이는 그러한 진단과 일치하는 성장을 보이며, 생검 샘플을 채취하고, 건강한 조직 대조군 대비 증가된 수준의 활성화된 카스파제-1가 결정되었다. 그 후, 개체에는 정맥내 주입에 의해 가용성 CD59 단백질을 포함하는 조성물을 투여하였다. 투여 후 개체는 X-레이로 재평가하고, 이는 사르코이드증의 부분적 감소를 나타낸다. 환자에게 가용성 CD59 단백질 조성물을 두 번째로 투여하고, X- 레이에 의한 재평가는 완전한 반응을 나타내며, 추가 CD59 치료제는 투여하지 않았다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "개체", "환자" 또는 "대상체"는 기재된 조성물 및 방법이 치료에 유용한 적어도 하나의 질환이 진단되거나, 앓고 있는 것으로 의심되거나, 발병할 위험이 있는 개체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 개체는 포유 동물이다. 특정 구현예에서, 포유 동물은 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 라마, 알파카 또는 야크이다. 특정 구현예에서, 개체는 인간이다.
본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 제시되고 설명되었지만, 이러한 구현예는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명을 벗어나지 않으면서 당업자에게 수 많은 변형, 변경 및 대체가 가능할 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 발행된 특허 및 기타 문서는 각 개별 간행물, 특허 출원, 발행된 특허 또는 기타 문서가 그 전체가 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타내는 바와 같이 본원에 참조로 포함된다. 참조로 통합된 문맥에 포함된 정의는 본 명세서의 정의와 모순되는 범위에서 제외된다.
SEQUENCE LISTING <110> TRUSTEES OF TUFTS COLLEGE <120> METHODS OF INHIBITING INFLAMMASOME ACTIVATION <130> TUV-11225 <140> PCT/US2019/017512 <141> 2019-02-11 <150> 62/637,460 <151> 2018-03-02 <150> 62/629,435 <151> 2018-02-12 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Ile Gln Gly Gly Ser Val Leu Phe Gly Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Ala Val Phe Cys His Ser Gly His Ser Leu Gln Cys Tyr Asn Cys Pro 20 25 30 Asn Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr Ala Val Asn Cys Ser Ser Asp Phe 35 40 45 Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly Leu Gln Val Tyr Asn Lys Cys 50 55 60 Trp Lys Phe Glu His Cys Asn Phe Asn Asp Val Thr Thr Arg Leu Arg 65 70 75 80 Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe 85 90 95 Asn Glu Gln Leu Glu Asn Gly Gly Thr Ser Leu Ser Glu Lys Thr Val 100 105 110 Leu Leu Leu Val Thr Pro Phe Leu Ala Ala Ala Trp Ser Leu His Pro 115 120 125 <210> 2 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Leu Gln Cys Tyr Asn Cys Pro Asn Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr Ala 1 5 10 15 Val Asn Cys Ser Ser Asp Phe Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly 20 25 30 Leu Gln Val Tyr Asn Lys Cys Trp Lys Phe Glu His Cys Asn Phe Asn 35 40 45 Asp Val Thr Thr Arg Leu Arg Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys 50 55 60 Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe Asn Glu Gln Leu Glu Asn Gly Gly Thr 65 70 75 80 Ser Leu Ser Glu Lys Thr Val Leu Leu Leu Val Thr Pro Phe Leu Ala 85 90 95 Ala Ala Trp Ser Leu His Pro 100 <210> 3 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Leu Gln Cys Tyr Asn Cys Pro Asn Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr Ala 1 5 10 15 Val Asn Cys Ser Ser Asp Phe Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly 20 25 30 Leu Gln Val Tyr Asn Lys Cys Trp Lys Phe Glu His Cys Asn Phe Asn 35 40 45 Asp Val Thr Thr Arg Leu Arg Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys 50 55 60 Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe Asn Glu Gln Leu Glu Asn 65 70 75 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Pro Thr His Leu Phe Gln Pro Ser Leu Val Leu Asp Met Ala Lys 1 5 10 15 Val Leu Leu Asp 20

Claims (52)

  1. 대상체의 염증-이환된 눈의 세포에서 인플라마좀 활성화를 억제하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 염증-이환된 눈의 세포에서 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 상기 조성물은 인플라마좀 활성화를 억제하며, 상기 대상체는 대상체의 염증-이환된 눈에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성을 위한 양성 결과를 나타내는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 인플라마좀 활성 마커가 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사(speck-like) 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+로부터 선택되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 인플라마좀 활성 마커가 CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP)로부터 선택되는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, NALP가 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물의 투여 후 눈에서 인플라마좀 활성 마커를 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포도막염, 알레르기성 결막염, 안검염, 만성 결막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 안구 흉터 유사 천포창, 점막 천포창, 익상편 공막염, 스티븐스-존슨 증후군, 일스병, 베체트병, 사르코이드증, 전신 홍반 루푸스, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 보그-고야나기-하라다병, 교감 눈염증 및 사르코이드증으로 진단되었거나 이를 앓고 있는 것으로 의심되는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 대상체가 포도막염으로 진단되었거나 이를 앓고 있는 것으로 의심되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체의 염증-이환된 눈에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대한 양성 결과가 포도막염, 알레르기성 결막염, 안검염, 만성 결막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 안구 흉터 유사 천포창, 점막 천포창, 익상편 공막염, 스티븐스-존슨 증후군, 일스병, 베체트병, 사르코이드증, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 보그-고야나기-하라다병, 교감 눈염증 또는 사르코이드증으로 진단되지 않거나 이를 앓고 있지 않은 개체의 눈에서의 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성과 비교하여 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 증가된 발현 또는 활성인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 대상체의 염증-이환된 눈에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대한 양성 결과가 포도막염으로 진단되지 않거나 이를 앓고 있지 않은 개체의 눈에서의 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성과 비교하여 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 증가된 발현 또는 활성인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체의 염증-이환된 눈에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대한 양성 결과가 조직학적 스코어에 의해 결정되는, 방법.
  11. 염증-이환된 대상체의 세포에서 인플라마좀 활성화를 억제하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    a. 인플라마좀 활성 마커를 대상체에서 측정하는 단계; 및
    b. 인플라마좀 활성 마커가 양성인 경우,
    i. 염증-이환된 대상체의 세포에서 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는
    ii. 가용성 CD59 단백질을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계로서, 상기 조성물은 인플라마좀 활성화를 억제하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제11에 있어서, 인플라마좀 활성 마커가 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+로부터 선택되는, 방법.
  13. 제11항에 있어서, 인플라마좀 활성 마커가 CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP)로부터 선택되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, NALP가 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)인, 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 인플라마좀 활성 마커가 대상체의 눈에서 측정되는, 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 가용성 CD59 단백질을 포함하는 조성물의 투여 후 대상체에서 인플라마좀 활성 마커를 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제11항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포도막염, 알레르기성 결막염, 안검염, 만성 결막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 안구 흉터 유사 천포창, 점막 천포창, 익상편 공막염, 스티븐스-존슨 증후군, 일스병, 베체트병, 사르코이드증, 전신 홍반 루푸스, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 보그-고야나기-하라다병, 교감 눈염증 및 사르코이드증으로 진단되었거나 이를 앓고 있는 것으로 의심되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 대상체가 포도막염으로 진단되었거나 이를 앓고 있는 것으로 의심되는, 방법.
  19. 제11항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 양성 인플라마좀 활성 마커가 알츠하이머병, 다발 경화증, 심근 경색증, 죽상경화 혈관병, 미세혈관합병증, 갑상선염, 염증성 장질환, 기관 이식 거부, 막성 콩팥염, 교감 눈염증, 포도막염 또는 사르코이드증으로 진단되지 않거나 이를 앓고 있지 않은 대상체에서의 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성과 비교하여 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 증가된 발현 또는 활성인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 양성 인플라마좀 활성 마커가 포도막염으로 진단되지 않은 대상체에서의 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성과 비교하여 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 증가된 발현 또는 활성인, 방법.
  21. 제11항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 염증-이환된 대상체에서 양성 인플라마좀 활성 마커가 조직학적 스코어에 의해 결정되는, 방법.
  22. a. 염증-이환된 대상체의 세포에서 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는
    b. 가용성 CD59 단백질을 포함하는 조성물을 대상체에 투여함으로써 염증-이환된 대상체의 세포에서 인플라마좀 활성화를 억제하기 위한 방법으로서,
    상기 조성물은 인플라마좀 활성화를 억제하며,
    상기 대상체는 염증-이환된 대상체에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대해 양성 결과를 나타내는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 인플라마좀 활성 마커가 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+로부터 선택되는, 방법.
  24. 제22항에 있어서, 인플라마좀 활성 마커가 CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP)로부터 선택되는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, NALP가 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)인, 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 염증-이환된 대상체에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대한 양성 결과가 염증-이환된 대상체의 눈에 존재하는, 방법.
  27. 제22항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포도막염, 알레르기성 결막염, 안검염, 만성 결막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 안구 흉터 유사 천포창, 점막 천포창, 익상편 공막염, 스티븐스-존슨 증후군, 일스병, 베체트병, 사르코이드증, 전신 홍반 루푸스, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 보그-고야나기-하라다병, 교감 눈염증 및 사르코이드증으로 진단되었거나 이를 앓고 있는 것으로 의심되는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 대상체가 포도막염으로 진단되었거나 이를 앓고 있는 것으로 의심되는, 방법.
  29. 제22항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 염증-이환된 대상체에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대한 양성 결과가 알츠하이머병, 다발 경화증, 심근 경색증, 죽상경화 혈관병, 미세혈관합병증, 갑상선염, 염증성 장질환, 기관 이식 거부, 막성 콩팥염, 교감 눈염증, 포도막염 또는 사르코이드증으로 진단되지 않거나 이를 앓고 있지 않은 대상체에서의 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성과 비교하여 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 증가된 발현 또는 활성인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 염증-이환된 대상체에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대한 양성 결과가 포도막염으로 진단되지 않은 대상체에서의 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성과 비교하여 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 증가된 발현 또는 활성인, 방법.
  31. 제22항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 염증-이환된 대상체에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대한 양성 결과가 조직학적 스코어에 의해 결정되는, 방법.
  32. a. 염증-이환된 대상체의 세포에서 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는
    b. 가용성 CD59 단백질을 포함하는 조성물로서, 인플라마좀 활성화를 억제하는 조성물을 대상체에 투여함으로써 포도막염을 앓고 있는 대상체의 세포에서 인플라마좀 활성화를 억제하기 위한 방법.
  33. 제32항에 있어서, 대상체가 염증-이환된 대상체의 눈에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대해 양성 결과를 나타내는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 인플라마좀 활성 마커가 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+로부터 선택되는, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 인플라마좀 활성 마커가 CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP)로부터 선택되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, NALP가 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)인, 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포도막염, 알레르기성 결막염, 안검염, 만성 결막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 안구 흉터 유사 천포창, 점막 천포창, 익상편 공막염, 스티븐스-존슨 증후군, 일스병, 베체트병, 사르코이드증, 전신 홍반 루푸스, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 보그-고야나기-하라다병, 교감 눈염증 및 사르코이드증으로 진단되었거나 이를 앓고 있는 것으로 의심되는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 대상체가 포도막염으로 진단되었거나 앓고 있는 것으로 의심되는, 방법.
  39. 제33항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 염증-이환된 대상체에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대한 양성 결과가 알츠하이머병, 다발 경화증, 심근 경색증, 죽상경화 혈관병, 미세혈관합병증, 갑상선염, 염증성 장질환, 기관 이식 거부, 막성 콩팥염, 교감 눈염증, 포도막염 또는 사르코이드증으로 진단되지 않거나 이를 앓고 있지 않은 대상체에서의 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성과 비교하여 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 증가된 발현 또는 활성인, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 염증-이환된 대상체에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대한 양성 결과가 포도막염으로 진단되지 않은 대상체에서의 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성과 비교하여 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 증가된 발현 또는 활성인, 방법.
  41. 제33항 내지 제40항 중의 어느 한 항에 있어서, 염증-이환된 대상체에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대한 양성 결과가 조직학적 스코어에 의해 결정되는, 방법.
  42. 염증-이환된 대상체의 세포에서 인플라마좀 활성화를 억제하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 염증-이환된 대상체의 세포에서 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 상기 조성물은 인플라마좀 활성화를 억제하며, 상기 대상체는 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대한 양성 결과를 나타내는, 방법.
  43. 제42에 있어서, 인플라마좀 활성 마커가 카스파제 1, 카스파제 5, IL-1β, IL-β17, IL-18, CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP), IFN-γ, Th1 T-세포 마커 또는 사이토카인, Th17 T-세포 마커 또는 사이토카인, 및 CD4+로부터 선택되는, 방법.
  44. 제42항에 있어서, 인플라마좀 활성 마커가 CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 스펙크-유사 단백질(PYCARD/ASC), 또는 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질(NALP)로부터 선택되는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, NALP가 NACHT, LRR 및 PYD 도메인-함유 단백질 3(NLRP3)인, 방법.
  46. 제42항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체가 대상체의 눈에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대해 양성 결과를 나타내는, 방법.
  47. 제42항 내지 제46항 중의 어느 한 항에 있어서, 막 독립성 CD59 단백질의 발현 및 분비를 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 막 독립성 CD59 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물의 투여 후 염증 이환된 대상체에서 인플라마좀 활성 마커를 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  48. 제42항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포도막염, 알레르기성 결막염, 안검염, 만성 결막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 안구 흉터 유사 천포창, 점막 천포창, 익상편 공막염, 스티븐스-존슨 증후군, 일스병, 베체트병, 사르코이드증, 전신 홍반 루푸스, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 보그-고야나기-하라다병, 교감 눈염증 및 사르코이드증으로 진단되었거나 이를 앓고 있는 것으로 의심되는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 대상체가 포도막염으로 진단되었거나 이를 앓고 있는 것으로 의심되는, 방법.
  50. 제42항 내지 제49항 중의 어느 한 항에 있어서, 염증-이환된 대상체에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대한 양성 결과가 포도막염, 알레르기성 결막염, 안검염, 만성 결막염, 상공막염, 각막염, 망막염, 안구 흉터 유사 천포창, 점막 천포창, 익상편 공막염, 스티븐스-존슨 증후군, 일스병, 베체트병, 사르코이드증, 결절다발 동맥염, 베게너 육아종증, 보그-고야나기-하라다병, 교감 눈염증 또는 사르코이드증으로 진단되지 않거나 이를 앓고 있지 않은 개체에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성과 비교하여 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 증가된 발현 또는 활성인, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 대상체의 염증-이환된 세포에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대한 양성 결과가 포도막염으로 진단되지 않거나 이를 앓고 있지 않은 개체에서의 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성과 비교하여 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 증가된 발현 또는 활성인, 방법.
  52. 제42항 내지 제51항 중의 어느 한 항에 있어서, 염증-이환된 대상체에서 적어도 하나의 인플라마좀 활성 마커의 발현 또는 활성에 대한 양성 결과가 조직학적 스코어에 의해 결정되는, 방법.
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