JP2024038469A - インフラマソームの活性化を阻害するためのｃｄ５９ - Google Patents

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Abstract

【課題】対象の細胞または対象の炎症を起こした眼におけるインフラマソームの活性化を阻害するための方法およびキットを提供する。【解決手段】対象の細胞または対象の炎症を起こした眼における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列、または可溶性ＣＤ５９タンパク質を含み、インフラマソームの活性化を阻害する組成物を対象に投与する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年２月１２日出願の米国仮特許出願第６２／６２９，４３５号；および２０１８年３月２日出願の米国仮特許出願第６２／６３７，４６０号の優先権の利益を主張する。
政府の支援
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により授与された助成金番号ＥＹ０２１８０５の下で米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
補体は自然免疫系の重要な要素であり、とりわけ自己免疫疾患、がん、虚血／再灌流障害などの様々な炎症性疾患でのその役割が説明されている（非特許文献１）。補体の役割は、自己免疫性ブドウ膜炎の実験モデル（ＥＡＵ）でも以前に記載されている（非特許文献２～５）。ＥＡＵにおける補体の活性化とＴ細胞媒介性の病態とを結びつけるメカニズムについてはほとんど知られていない。補体の活性化は、細胞膜での膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の組み立て（assembly）で終了し、結果的にポア形成をもたらす。溶解に至らない（ｓｕｂｌｙｔｉｃ）レベルで、ポア形成は原形質膜を通したイオン交換およびサイトカインの放出を促進する。結果として、ＭＡＣの沈着は細胞溶解につながる。ＥＡＵの病態生理におけるＭＡＣの役割はまだ不明である。ＭＡＣの沈着後の細胞へのＣａ２＋の侵入は、初代肺ヒト上皮細胞でＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化することが知られている（非特許文献６）。
ＮＬＲＰ３インフラマソームは、加齢性黄斑変性症、心筋症、関節炎、慢性腎臓病、神経変性疾患などの様々な炎症性疾患に関与しているとされている（非特許文献７）。マウスでのリポ多糖（ＬＰＳ）の投与は、ＭＡＣ関連ＩＬ－１β成熟を引き起こす（非特許文献８）。インフラマソームは補体によって高度に制御されており、組織損傷や疾患の回復時に必要であるが、無秩序なインフラマソームは、重度の炎症や宿主組織への損傷につながる可能性がある（非特許文献９）。ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化は２段階のプロセスによって制御され、それは、タンパク質ＮＬＲＰ３の発現の増加を伴う初期プライミングシグナルと、カスパーゼ１を介したｐｒｏ－ＩＬ－１βから成熟型ＩＬ－１βへの切断をもたらすインフラマソームタンパク質複合体の形成に必要な後続の活性化シグナルを必要とする（非特許文献１０）。無秩序なＩＬ－１β発現は、ベーチェット病、フォークト・小柳・原田病、リウマチ性疾患、自己免疫性甲状腺疾患、インスリン依存性糖尿病、痛風、家族性地中海熱、およびクリオピリン関連周期熱症候群などの自己免疫疾患および自己炎症性疾患の発症につながる可能性がある（非特許文献１１～１３）。さらに、ＩＬ－１βは、骨髄細胞によって網膜で活発に分泌されることが確立されており、ＥＡＵにおけるＩＬ－１Ｒシグナル伝達の潜在的な病因的役割を示している（非特許文献１４）。ただし、ＩＬ－１βがＥＡＵでどのように制御されているかについての詳細なメカニズムの知識は理解できないままである。
ブドウ膜炎は、目のブドウ膜および網膜層の慢性的な眼炎症性疾患であり、米国における全失明の約１０％～約１５％の原因となっている（非特許文献１５）。ブドウ膜炎は、外部の生物学的因子が免疫応答を誘起する場合は感染性として、また自己免疫反応が誘起される場合は非感染性として分類される。ブドウ膜炎の臨床治療は、コルチコステロイド、免疫抑制薬、またはモノクローナル抗体を使用して行われてきたが、これらのアプローチは限られた成功しか収めておらず、重大な副作用を伴なう（非特許文献１６および１７）。したがって、ブドウ膜炎の効果的な治療法を開発するという未だ満たされていない臨床的必要性がある。
Morgan, B. P., et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14, 857-877 An, F., et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 3778-3782 Copland, D. A., et al. (2010) Clin. Exp. Immunol. 159, 303-314 Read, R. W., et al. (2006) Exp. Eye Res. 82, 389-394 Zhang, L., et al. (2016) J. Leukoc. Biol. 99, 447-454 Triantafilou, K., et al. (2013) J. Cell Sci. 126, 2903-2913 Amin, J., et al. (2017) Brain pathol. 27, 192-204 Laudisi, F., et al. (2013) J. Immunol. 191, 1006-1010 Latz, E., et al. (2013) Nat. Rev. Immunol.13, 397-411 Broz, P., et al. (2016) Nat. Rev. Immunol. 16, 407-420 Dinarello, C. A., et al. (2013) Semin. Immunol. 25, 469-484 Gabay, C., et al. (2010) Nat. Rev. Rheumatol. 6, 232-241 Jesus, A. A., et al. (2014) Annu. Rev. Med. 65, 223-244 Wan, C. K., et al. (2016) J. Immunol. 196, 543-546 Durrani, O. M., et al. (2004) Ophthalmologica 218, 223-236 Knickelbein, J. E., et al. (2017) Handb. Exp. Pharmacol. 242, 231-268 Prete, M., et al. (2016) Clin. Exp. Med. 16, 125-136
本明細書に記載されているのは、膜非依存性（可溶性）ＣＤ５９タンパク質を用いてインフラマソーム関連障害を患う個体を処置するための方法、組成物、およびキットである。膜非依存性（membrane independent）ＣＤ５９タンパク質は、投与した核酸から発現させることができ、またはタンパク質の直接投与からであってもよい。インフラマソーム関連障害の処置に使用するための膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードする核酸またはその組成物が企図されている。インフラマソーム関連障害の処置に使用するための膜非依存性ＣＤ５９タンパク質またはその組成物も企図されている。ある実施形態では、インフラマソーム関連障害は、対象の眼におけるものである。ある実施形態では、インフラマソーム関連障害には、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎（pterygium scleritis）、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症（多発血管炎性肉芽腫症）、フォークト（Ｖｏｇｔ）・小柳・原田病、交感性眼炎、サルコイドーシスが含まれる。ある実施形態では、インフラマソーム関連障害はブドウ膜炎を含む。可溶性／膜非依存性ＣＤ５９をコードするタンパク質または核酸は、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示した対象に投与され得る。ある実施形態では、陽性結果は対象の眼におけるものである。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD）（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（NACHT, LRR and PYD domains-containing protein）（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される。ある実施形態では、ＮＡＬＰは、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である。
本明細書における本発明の一態様は、対象の炎症を起こした眼の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害する方法であって、炎症を起こした眼の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を対象に投与することを含み、その組成物がインフラマソームの活性化を阻害する方法を提供する。本明細書で使用される「膜非依存性」という用語は、ＧＰＩアンカーを欠くか、あるいは細胞膜または細胞膜関連構造（膜結合タンパク質など）に結合する機能および能力を欠く改変ＧＰＩアンカーを有するＣＤ５９アミノ酸配列を指す。この方法の実施形態は、膜非依存性ＣＤ５９が、ＭＡＣの機能とは無関係にインフラマソームの活性化を阻害することを提供する。
方法の実施形態において、組成物は、膜侵襲複合体（Membrane Attack Complex）（ＭＡＣ）の機能とは無関係にインフラマソームの活性化を阻害する。方法の実施形態において、対象は、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、糖尿病網膜症、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、乾癬、免疫性溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、微小血管障害、甲状腺炎、炎症性腸疾患、臓器移植片拒絶反応、膜性腎炎、交感性眼炎、およびサルコイドーシスから選択される少なくとも１つの状態を有する。
方法の実施形態において、ブドウ膜炎は、前部ブドウ膜炎、中部ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、および汎ブドウ膜炎から選択される少なくとも１つである。方法の実施形態は、対象からサンプルを得ることをさらに含む。方法の実施形態において、サンプルは、涙、血液、尿、眼分泌物（eye discharge）、痰、および粘液から選択される少なくとも１つである。
方法の実施形態は、投与の前に、眼の網膜機能およびインフラマソーム活性マーカーのうちの少なくとも１つを眼において測定することをさらに含む。方法の実施形態は、投与の後に、眼の網膜機能およびインフラマソーム活性マーカーのうちの少なくとも１つを眼において測定することをさらに含む。
方法の実施形態において、インフラマソーム活性マーカーは、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される少なくとも１つである。方法の実施形態において、インフラマソーム活性マーカーは、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される。方法の実施形態において、ＮＡＬＰは、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である。
方法の実施形態において、網膜機能またはインフラマソーム活性マーカーを測定することは、眼検査、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）、結膜インプレッションサイトロジー（ＣＩＴ）、ＲＴＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびＰＣＲから選択される少なくとも１つの手法を行うことをさらに含む。
方法の実施形態はさらに、ブドウ膜炎を処置するのに十分な投薬量で組成物を投与することを含む。方法の実施形態はさらに、投与の前に、ウイルスベクター中のヌクレオチド配列を操作することを含む。方法の実施形態はさらに、ヌクレオチド配列を裸の核酸として投与することを含む。
方法の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスからなる群より選択される少なくとも１つのウイルスの遺伝子操作されたゲノムである。方法の実施形態では、レンチウイルスはレトロウイルスである。
方法の実施形態は、翻訳されたＣＤ５９タンパク質のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカードメインの機能の喪失をもたらす少なくとも１つの変異を有するように膜非依存性ＣＤ５９タンパク質を操作することをさらに含む。この方法の実施形態は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカードメインの領域をコードするヌクレオチドを欠失させることにより、膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を操作することをさらに含む。
方法の実施形態において、投与はさらに、組成物を眼に注射することを含む。この方法の実施形態では、投与はさらに、組成物を局所適用することを含む。この方法の一実施形態では、眼注射は、網膜下注射、硝子体注射、眼内注射、結膜下注射、およびテノン嚢下注射からなる群より選択される。方法の実施形態において、眼注射はさらに、眼の外層に投与することを含む。
方法の実施形態は、追加の治療薬を眼に投与することをさらに含む。方法のいくつかの実施形態では、追加の治療薬は、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗マイコバクテリア剤、抗真菌剤、抗増殖剤、および抗アポトーシス剤からなる群より選択される少なくとも１つである。方法のいくつかの実施形態では、追加の治療薬は、成長因子、抗炎症剤、昇圧剤、コラゲナーゼ阻害剤、ステロイド、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、アスコルビン酸塩、アンジオテンシン、カルレティキュリン、テトラサイクリン、フィブロネクチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢＥＧＦ）、トロンボスポンジン、フォン・ヴィレブランド因子Ｃ、ヘパリン、ヘパリン硫酸、およびヒアルロン酸からなる群より選択される。
本明細書における本発明の一態様は、対象の炎症を起こした眼におけるインフラマソームの活性化を阻害するためのキットを提供し、そのキットは、膜非依存性ＣＤ５９タンパク質および／またはＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む医薬組成物であって、対象の炎症を起こした眼におけるインフラマソームを阻害するのに十分な投薬量である医薬組成物；使用説明書；および容器を含む。
本明細書における本発明の一態様は、膜非依存性ＣＤ５９タンパク質および／またはＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む医薬組成物であって、対象のブドウ膜炎を処置するのに十分な投薬量である医薬組成物；使用説明書；および容器を含む、対象におけるブドウ膜炎を処置するためのキットを提供する。
本明細書における本発明の一態様は、対象の炎症を起こした眼の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害する方法を提供し、その方法は、炎症を起こした眼の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を対象に投与することを含み、組成物はインフラマソームの活性化を阻害し、対象は、対象の炎症を起こした眼の細胞における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示している。この方法のある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される。この方法のある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される。この方法のある実施形態では、ＮＡＬＰは、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である。この方法のある実施形態では、方法は、膜非依存性ＣＤ５９の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物の投与の後に、インフラマソーム活性マーカーを眼において測定することをさらに含む。この方法のある実施形態では、対象は、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されているかまたはそれらに罹患している疑いがある。ある実施形態では、対象は、ブドウ膜炎と診断されているかまたはそれに罹患している疑いがある。本明細書に記載されている対象の炎症を起こした眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果は、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されていないまたはそれらに罹患していない個体の眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較して、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性が上昇していることを指す。あるいは、対象の炎症を起こした眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性は、組織学的スコアによって決定される。
本明細書に記載の特定の態様は、炎症を起こした対象の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害するための方法であり、この方法は、（ａ）炎症を起こした対象の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を対象に投与する；あるいは（ｂ）可溶性ＣＤ５９タンパク質を含む組成物を対象に投与することを含み、組成物はインフラマソームの活性化を阻害する。ある実施形態では、組成物は、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の機能とは無関係にインフラマソームの活性化を阻害する。ある実施形態では、対象は、アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、微小血管障害、甲状腺炎、炎症性腸疾患、臓器移植片拒絶反応、膜性腎炎、交感性眼炎、およびサルコイドーシスから選択される少なくとも１つのインフラマソーム関連状態を有する。ある実施形態では、方法は、対象からサンプルを得ることをさらに含む。ある実施形態では、サンプルは、血液、血漿、血清、末梢血単核細胞、脳脊髄液、または尿から選択される少なくとも１つである。ある実施形態では、方法は、投与の前に、対象においてインフラマソーム活性マーカーを測定することをさらに含む。ある実施形態では、方法は、投与の後に、対象においてインフラマソーム活性マーカーを測定することをさらに含む。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される少なくとも１つである。ある実施形態では、方法はさらに、インフラマソーム関連状態を処置するのに十分な投薬量で組成物を投与することを含む。ある実施形態では、膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスからなる群より選択される少なくとも１つのウイルスの遺伝子操作されたゲノムである。ある実施形態では、レンチウイルスはレトロウイルスである。ある実施形態では、投与はさらに、組成物を静脈内注射することを含む。ある実施形態では、方法はさらに、組成物を局所適用することを含む。ある実施形態では、方法は、追加の治療薬を投与することをさらに含む。ある実施形態では、追加の治療薬は、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗マイコバクテリア剤、抗真菌剤、抗増殖剤、および抗アポトーシス剤からなる群より選択される少なくとも１つである。ある実施形態では、追加の治療薬は、成長因子、抗炎症剤、昇圧剤、コラゲナーゼ阻害剤、ステロイド、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、アスコルビン酸塩、アンジオテンシン、カルレティキュリン、テトラサイクリン、フィブロネクチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢＥＧＦ）、トロンボスポンジン、フォン・ヴィレブランド因子Ｃ、ヘパリン、ヘパリン硫酸、およびヒアルロン酸からなる群より選択される。別の態様では、本明細書に記載されるのは、対象の炎症を起こした細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害するためのキットであって、このキットは、（ａ）（ｉ）膜非依存性ＣＤ５９タンパク質および／またはまたはＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；または（ｉｉ）可溶性ＣＤ５９タンパク質；を含む医薬組成物であって、対象の炎症を起こした細胞におけるインフラマソームを阻害するのに十分な投薬量である医薬組成物；（ｂ）使用説明書；および（ｃ）容器を含む。
本明細書に記載の別の態様は、アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、微小血管障害、甲状腺炎、炎症性腸疾患、臓器移植片拒絶反応、膜性腎炎、交感性眼炎、およびサルコイドーシスから選択される少なくとも１つの状態を処置する方法であり、その方法は、（ａ）（ｉ）細胞での膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；または（ｉｉ）可溶性ＣＤ５９タンパク質；を含む組成物を対象に投与することを含み、組成物はインフラマソームの活性化を阻害する。本明細書に記載される別の態様は、炎症を起こした対象の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害するための方法であり、その方法は、（ａ）対象においてインフラマソーム活性マーカーを測定する；および（ｂ）インフラマソーム活性マーカーが陽性である場合、（ｉ）炎症を起こした対象の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；または（ｉｉ）可溶性ＣＤ５９タンパク質；を含む組成物を対象に投与することを含み、組成物はインフラマソームの活性化を阻害する。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される。ある実施形態では、この方法は、膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列または可溶性ＣＤ５９タンパク質を含む組成物の投与の後に、対象においてインフラマソーム活性マーカーを測定することをさらに含む。
本明細書に記載される別の態様は、炎症を起こした対象の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害する方法であり、この方法は、（ａ）炎症を起こした対象の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；または（ｂ）可溶性ＣＤ５９タンパク質；を含む組成物を対象に投与することを含み、その組成物はインフラマソームの活性化を阻害し、対象は、炎症を起こした対象において少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示している。ある実施形態において、インフラマソーム活性マーカーは、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される。ある実施形態では、ＮＡＬＰは、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である。ある実施形態では、その方法は、（ａ）膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；または（ｂ）可溶性ＣＤ５９タンパク質；を含む組成物の投与の後に、対象においてインフラマソーム活性マーカーを測定することをさらに含む。ある実施形態では、対象は、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されているかまたはそれらに罹患している疑いがある。ある実施形態では、対象は、ブドウ膜炎と診断されているかまたはそれに罹患している疑いがある。ある実施形態では、炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果は、アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、微小血管障害、甲状腺炎、炎症性腸疾患、臓器移植片拒絶反応、膜性腎炎、交感性眼炎、およびサルコイドーシスと診断されていないまたはそれらに罹患していない対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である。ある実施形態では、炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果は、組織学的スコアによって決定される。
図１Ａ～図１Ｆは、ＥＡＵにおいてＭＡＣ媒介性のＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化がＩＬ－１β産生を増加させることを示す一連の顕微鏡写真および棒グラフである。値は平均±ＳＥＭとして表す。ＧＣＬ：神経節細胞層；ＩＮＬ：内顆粒層；ＯＮＬ：外顆粒層；ＯＳ：外節；スケールバー：１００μｍ。図１Ａは、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（左の列）、Ｃ５ｂ９抗体（真ん中の列）で染色した網膜のクリオスタット切片の一連の顕微鏡写真であり、マウスの正常対照網膜と比較してＥＡＵ網膜におけるＭＡＣ形成の上昇を示している。Ｃ９－／－ＥＡＵマウスの網膜（最下段）は、Ｃ５ｂ９タンパク質が陰性であり、したがってＭＡＣがないことが観察された。 図１Ｂは、ＥＡＵ網膜（真ん中の棒）および対照組織におけるＥＬＩＳＡによって測定したＩＬ－１βタンパク質の産生の棒グラフである。ＥＡＵ網膜におけるＩＬ－１βタンパク質の産生は、ＥＬＩＳＡで測定して、対照網膜に対して１１２％の増加であり、またＲＴ－ＰＣＲにより４５倍多いことが観察された。正常対照網膜と比較して、Ｃ９－／－ＥＡＵ網膜では、３７％高いＩＬ－１βタンパク質レベル、およびＩＬ－１β ｍＲＮＡが３．８倍多いことが観察された。図１Ｃは、ＥＡＵ網膜（真ん中の棒）および対照組織においてＲＴ－ＰＣＲによって測定したＩＬ－１ ｍＲＮＡの産生の棒グラフである。ＥＡＵ網膜におけるＩＬ－１β ｍＲＮＡのレベルは、正常対照網膜におけるレベルよりも４４６４％高いことが観察された。Ｃ９－／－ＥＡＵ網膜のＩＬ－１β ｍＲＮＡレベルは、正常対照網膜より２８５％高いことが観察された。図１Ｄは、マウスの正常対照網膜と比較して、ＥＡＵ網膜で２００％超高いＮＬＲＰ３タンパク質レベルが観察されたことを示すウェスタンブロットの写真および棒グラフである。Ｃ９－／－ＥＡＵ網膜では、マウスの正常対照網膜と比較して、わずかに高いＮＬＲＰ３タンパク質レベルが観察された。 図１Ｅは、正常対照網膜と比較して、マウスのＥＡＵ網膜で８０％超高いカスパーゼ１（ｐ２０）タンパク質レベルが観察されたことを示すウェスタンブロットの写真および棒グラフである。Ｃ９－／－ＥＡＵ網膜では、マウスの正常対照網膜と比較して、３０％高いカスパーゼｌ（ｐ２０）タンパク質レベルが観察された。図１Ｆは、マウスの正常対照網膜と比較して、ＥＡＵ網膜でＡＳＣタンパク質が４４％多いことを示すウェスタンブロットの写真および棒グラフである。Ｃ９－／－ＥＡＵマウスの網膜のＡＳＣレベルは、正常な対照網膜と比較してわずかに上昇していることが観察された。ウェスタンブロットおよびＲＴ－ＰＣＲの値は、β－アクチンに対して正規化されている。 図２Ａ～図２Ｂは、ＥＡＵにおける網膜機能に対するＭＡＣ形成の影響を示す一連の網膜電図（ＥＲＧ）波形および折れ線グラフである。本明細書の実施例で得られたデータは、ＥＡＵが光受容体に広範な損傷をもたらし、これが正常な対照網膜と比較して網膜機能を損なわせることを示す。図２Ａは、正常群、ＥＡＵ群、およびＣ９－／－ＥＡＵ群の一連のＥＲＧ応答である。暗順応（暗所視）および明順応（明所視）の応答を、正常マウス、ＥＡＵマウスおよびＣ９－／－ＥＡＵマウスの網膜で分析した。暗順応ＥＲＧの場合、－２０ｄＢ（デシベル）（０．０２５ｃｄｓ／ｍ２）、－１０ｄＢ（０．２５ｃｄｓ／ｍ２）および０ｄＢ（２．５ｃｄｓ／ｍ２）のフラッシュ光強度を使用した。明順応ＥＲＧの場合、０ｄＢ（２．５ｃｄｓ／ｍ２）および１ｄＢ（３．１５ｃｄｓ／ｍ２）のフラッシュ光強度を使用した。 図２Ｂは、強度に対してプロットした、暗順応および明順応のａ波ＥＲＧ振幅およびｂ波ＥＲＧ振幅の一連の線グラフである。暗順応ＥＲＧの場合、－２０ｄｂ、－１０ｄＢおよび０ｄＢのフラッシュ光強度を使用した。明順応ＥＲＧの場合、０ｄＢおよび１ｄＢのフラッシュ光強度を使用した。値は平均±ＳＥＭとして表す。＊ｐ＜０．０５、＃ＥＡＵと比較してｐ＜０．０５。 図３Ａ～図３Ｆは、Ｃ９－／－マウスがＥＡＵから保護されないことを示す一連の顕微鏡写真およびドットプロットである。本明細書の実施例では、２．５ｍｇ／ｍＬの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む０．２ｍＬの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）エマルジョン中の２００μｇのＩＲＢＰ（１－２０）ペプチドでマウスを皮下免疫した。同時に、１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した１．５μｇの百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素を腹腔内注射によりマウスに注射した。２４日後に、正常マウス、ＥＡＵマウスおよびＣ９－／－ＥＡＵマウスの間で、眼底ＥＡＵの重症度を分析した。病巣病変、線形病変、血管炎、網膜出血、浸潤物、網膜剥離を調べた。これらの所見の重症度に応じて、ＥＡＵ臨床スコアを０～４のスケールで等級付けした。図３Ａは、網膜の炎症性浸潤物（白い矢印の頭）、血管炎（白い矢印）、および網膜ひだ（黒い矢印）を示す、ＥＡＵ群およびＣ９－／－ＥＡＵ群からの眼底画像の一連の顕微鏡写真である。図３Ｂは、個々の全体的な臨床スコアのドットプロットである。 図３Ｃ～図３Ｆはそれぞれ、血管系（vasculature）スコア、細胞浸潤（cellular infiltration）スコア、視神経乳頭（optic disc）スコア、および構造的損傷（structural damage）スコアのドットプロットである。血管系スコア（図３Ｃ）、細胞浸潤スコア（図３Ｄ）、視神経乳頭スコア（図３Ｅ）および構造的損傷スコア（図３Ｆ）の組合せを計算し、個々の全体的な臨床スコア（図３Ｂ）としてプロットする。値は平均±ＳＥＭとして表す。 図４Ａ～図４Ｅは、ＥＡＵマウス、正常対照マウス、およびＣ９－／－ＥＡＵマウスからの組織の網膜イメージングおよび組織学の一連の顕微鏡写真および棒グラフである。図４Ａは水平ＯＣＴスキャンの一連の顕微鏡写真であり、ＥＡＵマウスおよびＣ９－／－ＥＡＵマウスでは網膜ひだの形成（folding）（赤の矢印）および硝子体細胞浸潤物（白い矢印）を示すが、正常対照マウスでは示さない。図４Ｂは、ＥＡＵ誘導後２４日目に採取し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色したパラフィン包埋眼から得た網膜切片（５μｍ）の一連の顕微鏡写真である。硝子体（Ｖ）における炎症性免疫細胞の浸潤は、黒の矢印で示されている；黒のアスタリスクは網膜（Ｒ）剥離を表す；網膜ひだは白い矢印の頭で示されている。図４Ｃ～４Ｅはそれぞれ、本明細書の実施例に記載されるように、細胞浸潤、血管炎、および光受容体損傷を個別にスコアリングするＥＡＵ病理の重症度の程度を示す一連の棒グラフである。値は平均±ＳＥＭとして表す。ＲＰＥ－ＣＨ、ＲＰＥおよび脈絡膜；Ｒ、網膜；Ｖ、硝子体；ＧＣＬ、神経節細胞層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＯＮＬ、外顆粒層；ＯＳ、外節；ＯｐＮ、視神経、スケールバー＝１００μｍ。 図５Ａ～図５Ｆは、可溶性ＣＤ５９がＥＡＵにおけるＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化およびＩＬ－１βの産生を阻害することを示す一連の顕微鏡写真および棒グラフである。図５Ａは、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９または対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰのいずれかを注射したＥＡＵマウスの、Ｃ５ｂ９抗体またはＤＡＰＩで染色した眼の網膜クリオスタット切片の一連の顕微鏡写真である。 図５Ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定したＩＬ－１βタンパク質のレベルの棒グラフである。ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９を注射したＥＡＵマウスの網膜におけるＩＬ－１βタンパク質レベルは、ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射した対照ＥＡＵマウスの網膜におけるレベルよりも４０％低いことが観察された。図５Ｃは、ＲＴ－ＰＣＲにより測定したＩＬ－１β ｍＲＮＡのレベルの棒グラフである。ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９を注射したＥＡＵマウスの網膜におけるＩＬ－１β ｍＲＮＡレベルは、対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵマウスの網膜におけるレベルよりも７０％低いことが観察された。図５Ｄは、対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵマウスの網膜と比較して、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９を注射したＥＡＵマウスの網膜におけるＮＬＲＰ３タンパク質の量が６０％少ないことを示すウェスタンブロットの写真および棒グラフである。 図５Ｅは、対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵマウスの網膜と比較して、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９を注射したＥＡＵマウスの網膜におけるカスパーゼ１（ｐ２０）タンパク質が６０％少ないことを示すウェスタンブロットの写真および棒グラフである。図５Ｆは、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９を注射したＥＡＵマウスの網膜と対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵマウスの網膜とで同等のＡＳＣタンパク質レベルを示すウェスタンブロットの顕微鏡写真および棒グラフである。ウェスタンブロットおよびＲＴ－ＰＣＲ値は、β－アクチンに対して正規化されている。値は平均±ＳＥＭとして表す。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＯＮＬ、外顆粒層；ＯＳ、外節；スケールバー＝１００μｍ。 図６Ａ～図６Ｂは、可溶性ＣＤ５９がＥＡＵにおける網膜機能を改善することを示す一連の網膜電図（ＥＲＧ）波形および折れ線グラフである。図６Ａは、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９または対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵマウスにおける一連のＥＲＧ応答である。ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９または対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵマウスの網膜で、暗順応（暗所視）応答と明順応（明所視）応答の両方を分析した。暗順応ＥＲＧの場合、－２０ｄＢ（０．０２５ｃｄｓ／ｍ２）、－１０ｄＢ（０．２５ｃｄｓ／ｍ２）、および０ｄＢ（２．５ｃｄｓ／ｍ２）のフラッシュ光強度を使用した。明順応ＥＲＧの場合、０ｄＢ（２．５ｃｄｓ／ｍ２）および１ｄＢ（３．１５ｃｄｓ／ｍ２）のフラッシュ光強度を使用した。 図６Ｂは、強度に対してプロットした、暗順応および明順応のａ波ＥＲＧ振幅およびｂ波ＥＲＧ振幅の一連の線グラフである。暗順応ＥＲＧの場合、－２０ｄＢ、－１０ｄＢ、および０ｄＢのフラッシュ光強度を使用した。明順応ＥＲＧの場合、０ｄＢおよび１ｄＢのフラッシュ光強度を使用した。値は平均±ＳＥＭとして表す。＊ｐ＜０．０５、＃ＡＡＶＣＡＧＧＦＰと対比してｐ＜０．０５。 図７Ａ～図７Ｆは、可溶性ＣＤ５９がＥＡＵにおける臨床スコアの重症度を軽減することを示す一連の顕微鏡写真およびドットプロットである。眼底ＥＡＵの重症度は、ＰＢＳ、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９およびＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵマウスで分析した。ＥＡＵ臨床スコアは０～４のスケールで等級付けした。図７Ａは、ＰＢＳ、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９、またはＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したマウスの眼底画像の一連の顕微鏡写真であり、網膜の炎症性浸潤物（白い矢印の頭）、血管炎（白い矢印）、および乳頭浮腫（白いアスタリスク）を示す。 図７Ｂ～図７Ｆは、それぞれ、個々の全体的な臨床スコア、血管系スコア、細胞浸潤スコア、視神経乳頭スコア、および構造的損傷スコアのドットプロットである。血管系スコア、細胞浸潤スコア、視神経乳頭スコア、および構造的損傷スコアの組合せを計算し、個々の全体的な臨床スコアとしてプロットした。ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９を注射したＥＡＵマウス群の網膜は、対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したマウス群の網膜と比較して、統計的に有意に改善された細胞浸潤、血管系および構造的損傷の個々のスコアならびに全体的な臨床スコアを有することが観察された 視神経乳頭スコアの差（図７Ｅ）は、対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵマウスと比較して、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９を注射したＥＡＵマウスにおいて統計的に有意でないままであることが観察された。ＰＢＳを注射した眼とＡＡＶＡＧＧＦＰを注射した眼との差は統計的に有意でないままであった。値は平均±ＳＥＭとして表す。 図８Ａ～図８Ｅは、ＥＡＵマウスにおけるＯＣＴ変化および網膜組織学的スコアに対するＣＤ５９の効果を示す一連の顕微鏡写真および棒グラフである。図８Ａは、対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰまたはＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９または対照ＰＢＳを注射したＥＡＵマウスの網膜における網膜ひだ（retinal folding）（赤い矢印）および硝子体細胞浸潤物（白い矢印）を示す水平ＯＣＴスキャンの一連の顕微鏡写真である。図８Ｂは、ＥＡＵ誘導後２４日目のパラフィン包埋眼から得られ、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した網膜切片（５μｍ）の一連の顕微鏡写真である。硝子体（Ｖ）における炎症性免疫細胞の浸潤は黒い矢印で示す；網膜（Ｒ）剥離は黒いアスタリスクで示す；網膜ひだは白い矢印の頭で示す。図８Ｃ～図８Ｅはそれぞれ、本明細書の実施例に記載されるように、細胞浸潤、血管炎、および光受容体損傷を個別にスコアリングするＥＡＵ病理の重症度の程度を示す一連の棒グラフである。値は平均±ＳＥＭとして表す。ＲＰＥ－ＣＨ、ＲＰＥおよび脈絡膜；Ｒ、網膜；Ｖ、硝子体；ＧＣＬ、神経節細胞層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＯＮＬ、外顆粒層；ＯＳ、外節；ＯｐＮ、視神経、スケールバー＝１００μｍ。 図９は、ＥＡＵ網膜におけるＭＡＣの上昇を示す棒グラフである。ＥＡＵマウスの網膜におけるＭＡＣ蛍光強度の量は、マウスの正常対照網膜と比較して、ＭＡＣの形成が７０％多いことが観察された。値は平均±ＳＥＭとして表す。 図１０Ａ～図１０Ｄは、ＥＡＵ網膜におけるＴｈ１およびＴｈ１７細胞の分化に対するＭＡＣの影響を示す一連の棒グラフである。新たに解剖した網膜を、対照、ＥＡＵおよびＣ９－／－ＥＡＵ網膜においてＥＬＩＳＡおよびＲＴ－ＰＣＲを使用して、ＩＬ－１７およびＩＦＮ－γのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルについて定量化した。図１０Ａは、対照正常マウスの網膜におけるＩＦＮ－γタンパク質発現レベルよりも、ＥＡＵマウスの網膜におけるＩＦＮ－γタンパク質レベルが１０２％増加し、またｍＲＮＡが２００倍多いことを示す棒グラフである。Ｃ９－／－ＥＡＵ網膜におけるＩＦＮ－γタンパク質の発現レベルは、対照正常マウスの網膜におけるＩＦＮ－γタンパク質の発現レベルよりも１４％高いことが観察された。図１０Ｂは、ＥＡＵマウスの網膜におけるＩＦＮ－γ ｍＲＮＡレベルが、対照正常マウスの網膜におけるＩＦＮ－γ ｍＲＮＡレベルと比較して２００倍高く、タンパク質が正常の１０２％増加したことを示す棒グラフである。Ｃ９－／－ＥＡＵ網膜のＩＦＮ－γ ｍＲＮＡレベルは、対照正常マウスの網膜のＩＦＮ－γ ｍＲＮＡレベルよりも１３１５％高いことが観察された。図１０Ｃは、ＥＡＵマウスの網膜におけるＩＬ－１７タンパク質レベルが、正常対照網膜におけるＩＬ－１７タンパク質レベルよりも９９％高いことが観察されたことを示す棒グラフである。Ｃ９－／－ＥＡＵマウスの網膜のＩＬ－１７タンパク質レベルは、正常対照マウスの網膜のＩＬ－１７タンパク質レベルと比較して、４４％だけ高いことが観察された。図１０Ｄは、ＥＡＵマウスおよびＣ９－／－ＥＡＵマウスの網膜におけるＩＬ－１７ ｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。正常対照網膜におけるＩＬ－１７ ｍＲＮＡレベルは検出限界未満のままであった。各実験を２～３回繰り返した。値は平均±ＳＥＭとして表す。 図１１Ａ～図１１Ｃは、ＥＡＵマウスの流入領域リンパ節（ＤＬＮ）のＴｈ１およびＴｈ１７細胞におけるＩＦＮ－γまたはＩＬ－１７の量の一連の散布図および棒グラフである。ＤＬＮ細胞は、ＥＡＵおよびＣ９－／－ＥＡＵマウスからＥＡＵ誘導の２４日後に収集した。図１１Ａは、ＣＤ４＋細胞に関してプロットしたＩＬ－１７ＡおよびＩＦＮ－γについて染色されたＤＬＮからの細胞の一連の散布図である。 図１１Ｂおよび図１１Ｃは、正常対照マウスと比較して、ＥＡＵマウスにおいて、流入領域リンパ節からのＩＬ－１７陽性ＣＤ４＋細胞およびＩＦＮ－γ陽性ＣＤ４＋細胞が有意に増加したことを示す棒グラフである。ＥＡＵマウスと対比した、Ｃ９－／－ＥＡＵマウスにおける流入領域リンパ節からのＩＬ－１７陽性ＣＤ４＋細胞およびＩＦＮ－γ陽性ＣＤ４＋細胞の割合（％）の差は有意ではないことが観察された。各実験を３回繰り返した。値は平均±ＳＥＭとして表す。 ＥＡＵ網膜におけるＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９の単回硝子体内注射によりＭＡＣ形成が阻害されることを示す棒グラフである。ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９を注射したＥＡＵマウスの網膜におけるＭＡＣ蛍光強度の量は、対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵマウスの網膜における量と比較して、ＭＡＣの形成が４５％減少した。値は平均±ＳＥＭとして表す。 図１３Ａ～図１３Ｄは、可溶性ＣＤ５９が、ＥＡＵ網膜におけるＴｈ１およびＴｈ１７細胞の分化を阻害することを示す一連の棒グラフである。ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９または対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵマウスにおいて、ＥＬＩＳＡおよびＲＴ－ＰＣＲを使用して、新たに解剖した網膜においてＩＬ－１７およびＩＦＮ－γのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを定量化した。図１３Ａは、対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵマウスにおけるＩＦＮ－γタンパク質レベルと比較して、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９を注射したＥＡＵマウスの網膜におけるＩＦＮ－γタンパク質レベルが２５％少なかったことを示す棒グラフである。図１３Ｂは、対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵマウスにおけるＩＦＮ－γ ｍＲＮＡレベルと比較して、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９を注射したＥＡＵマウスの網膜におけるＩＦＮ－γ ｍＲＮＡの発現レベルが４７％少なかったことを示す棒グラフである。図１３Ｃは、対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵマウスにおけるＩＬ－１７タンパク質レベルと比較して、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９を注射したＥＡＵマウスの網膜におけるＩＬ－１７タンパク質レベルが３５％少なかったことを示す棒グラフである。図１３Ｄは、対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵマウスにおけるＩＬ－１７ ｍＲＮＡレベルと比較して、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９を注射したＥＡＵマウスの網膜におけるＩＬ－１７ ｍＲＮＡレベルが１０％少なかったことを示す棒グラフである。ＩＬ－１７およびＩＦＮ－γのｍＲＮＡ量の差は統計的に有意ではないことが観察された。各実験を２～３回繰り返した。値は平均±ＳＥＭとして表す。 図１４Ａ～図１４Ｃは、３．５×１０９ゲノムコピー／μｌのＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９またはＡＡＶＣＡＧＧＦＰ（１μｌ）を注射し、１週間後にＥＡＵを施して２４日間維持した６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの網膜を示す顕微鏡写真およびウェスタンブロットである。図１４Ａは、マウス網膜におけるＧＦＰの発現を示す眼底画像である。図１４Ｂは、ＡＡＡＶＣＡＧＦＰ注射群の網膜クリオスタット画像であり、軽度のＥＡＵマウスの網膜（中段）の神経節細胞層（ＧＣＬ）、内網状層および内顆粒層でＧＦＰの強い発現を示し、重度のＥＡＵマウスの網膜（下段）は、光受容体および網膜色素上皮でＧＦＰ発現を示す。上段：対照ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９。図１４Ｃは、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９の単回硝子体内注射後のマウス網膜からのｓＣＤ５９の発現を示すウェスタンブロットである。略語：ＧＣＬ、神経節細胞層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＯＮＬ、外顆粒層；ＯＳ、外節；ＲＰＥ、網膜色素上皮。
本明細書に記載されているのは、膜非依存性（可溶性）ＣＤ５９タンパク質を用いてインフラマソーム関連障害を患う個体を処置するための方法、組成物、およびキットである。膜非依存性ＣＤ５９タンパク質は、投与された核酸から発現させることができ、またはタンパク質の直接投与からであってもよい。インフラマソーム関連障害の処置に使用するための膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードする核酸またはその組成物が企図されている。インフラマソーム関連障害の処置に使用するための膜非依存性ＣＤ５９タンパク質またはその組成物も企図されている。ある実施形態では、インフラマソーム関連障害は、対象の眼におけるものである。ある実施形態では、インフラマソーム関連障害には、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、およびサルコイドーシスが含まれる。ある実施形態では、インフラマソーム関連障害はブドウ膜炎を含む。可溶性／膜非依存性ＣＤ５９をコードするタンパク質または核酸は、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示した対象に投与され得る。ある実施形態では、陽性結果は対象の眼におけるものである。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される。ある実施形態では、ＮＡＬＰは、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である。
光受容体間レチノイド結合タンパク質（retinal interphotoreceptor-binding protein）（ＩＲＢＰ）に由来するペプチドでマウスを免疫すると、ヒトブドウ膜炎で見られる臨床的および組織学的特徴に類似したＴ細胞性自己免疫疾患が生じる（Caspi, R. R., et al. (1988) J. Immunol 140, 1490-1495; Chan, C. C., et al. (1990) J. Autoimmun. 3, 247-255）。自己免疫性ブドウ膜炎のこの実験モデル（ＥＡＵ）が、ブドウ膜炎の研究およびこの疾患の治療法の開発のためのアプローチとして使用され、それが本明細書の実施例で使用される。
ＭＡＣがＥＡＵの病因に関与し得る潜在的なメカニズムをさらに理解し、ＥＡＵの発症におけるＮＬＲＰ３の活性化およびＩＬ－１βの産生の重要性を解明するために、ＭＡＣ沈着をＥＡＵ網膜で調べ、ＭＡＣがＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化およびそれに続くのＩＬ－１βの放出に必要である可能性があることを調べた。
ＭＡＣは、各１分子ずつのＣ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８と最大１２分子のＣ９を含む。Ｃ９－／－マウスは、機能的なＭＡＣを組み立てることができないため、そのようなマウスはＥＡＵから部分的に保護される可能性がある。本明細書の実施例では、対照Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＣ９－／－マウスにおいてＥＡＵを誘導し、対照マウスでのＥＡＵの病状をＣ９－／－マウスでのＥＡＵの病状と比較した。ＥＡＵにおいてＣ９を阻害することの治療可能性を、事前形成されたＣ５ｂ－８複合体へのＣ９の取込みを防ぐタンパク質である可溶性ＣＤ５９（ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９）を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用する遺伝子治療アプローチによって調べた。ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９注射マウスでのＥＡＵの発生は、眼底撮像（fundus imaging）、スペクトル領域光干渉断層撮影（ＳＤ－ＯＣＴ）、網膜の病理組織検査および免疫組織化学法によって監視した。網膜機能は網膜電図（ＥＲＧ）によって定量化し、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化は、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によって測定した。本明細書の実施例で観察された結果は、ＥＡＵの発生におけるＮＬＲＰ３インフラマソームおよびＩＬ－１β産生の活性化因子としてのＭＡＣの直接的な役割を初めて関連付ける。本明細書の実施例のデータは、可溶性ＣＤ５９のＡＡＶ媒介性発現がブドウ膜炎の処置のための潜在的な遺伝子治療であることを初めて実証する。
本明細書の実施例では、ＥＡＵでのＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化におけるＭＡＣの直接的な役割を調べた。本明細書の実施例からのデータは、ＭＡＣがＥＡＵ網膜に沈着し、それがＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化およびＩＬ－１βの産生増加をもたらすことを実証する。これらの実施例は、Ｃ９－／－ＥＡＵマウスが網膜上でＭＡＣを形成できず、それに付随してＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化がされたことを示し、これは、ＥＡＵにおけるＭＡＣの沈着とＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化との関連を示す。Ｃ９－／－マウスはＥＡＵの病理学的表現型を救済できないが、Ｃ９のＭＡＣへの取込みの阻害剤であるｓＣＤ５９のＡＡＶ媒介性送達は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を含むＥＡＵの病理学的表現型の多くの態様を予期外に軽減する。
補体系は自然免疫の主要な構成要素であり、多様な群の血漿および膜結合タンパク質で構成されている。これらの膜結合タンパク質は、病原体に対する防御、ならびに免疫および炎症プロセスの制御において中心的役割を果たす。宿主防御には病原体に対する補体の活性化が必要であるが、過剰に活性化された補体は宿主組織に損傷を与える可能性がある（Morgan, B. P., et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14, 857-877; Carroll, M. V., et al. (2011) Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 965-975）。したがって、補体制御タンパク質によって補体活性化と補体阻害とのバランスを保つ必要がある。過剰に活性化された無秩序な補体系はＭＡＣの形成で終わり、ＭＡＣの形成はＥＡＵを含む様々な眼疾患に関与することが示されている（An, F., et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 3778-3782; Copland, D. A., et al. (2010) Clin. Exp. Immunol. 159, 303-314; Read, R. W., et al. (2006) Exp. Eye Res. 82, 389-394; Gehrs, K. M., et al. (2010) Arch. Ophthalmol. 128, 349-358; Yanai, R., et al. (2012) Adv. Exp. Med. Biol. 946, 161-183）。しかしながら、ＥＡＵの病因におけるＭＡＣ沈着の直接の役割はまだ調べられていないままである。本明細書の実施例では、ＥＡＵにおいてＭＡＣが沈着し、それがＩＬ－１βの産生の増加をもたらしたことが観察された。しかしながら、ＭＡＣを形成する能力を欠くＣ９－／－ＥＡＵマウスは、結果として低減されたＩＬ－１βレベルを有することが観察された。
細胞膜でのＭＡＣ沈着は、最終的には溶解による細胞死をもたらすが、細胞膜上のｓｕｂｌｙｔｉｃ ＭＡＣは、細胞周期および増殖の制御、アポトーシス、サイトカインの産生、および下流のシグナル伝達カスケードの開始に関与している（Morgan, B. P., et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14, 857-877）。ＮＬＲＰ３インフラマソーム複合体は、主要調節サブユニットＮＬＲＰ３、アダプターサブユニットＡＳＣ、およびｐｒｏ－ＩＬ－１βを活性型ＩＬ－１βに変換するエフェクターサブユニットカスパーゼ－１からなる細胞質タンパク質群である（Latz, E., et al. (2013) Nat. Rev. Immunol.13, 397-411; Broz, P., et al. (2016) Nat. Rev. Immunol. 16, 407-420）。ＬＰＳでプライミングされたモデルでの最近の研究は、ｓｕｂｌｙｔｉｃ ＭＡＣ誘発性のポア形成が細胞内Ｃａ２＋の蓄積をもたらし、それが続いてＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化したことを示した（Triantafilou, K., et al. (2013) J. Cell Sci. 126, 2903-2913; Laudisi, F., et al. (2013) J. Immunol. 191, 1006-1010）。ＮＬＲＰ３インフラマソームは、以前にいくつかの眼疾患に関連づけられている（Devi, T. S., et al. (2012) Exp. Diab. Res. 2012, 438238; Tseng, W. A., et al. (2013) Invest Ophthalmol Vis Sci 54, 110-120）。本明細書の実施例における結果は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化の減弱が、ブドウ膜炎の処置のための新しい治療アプローチであることを実証した。本明細書の実施例は、ＥＡＵマウスモデルにおける、ＭＡＣおよびＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化の直接的な役割を初めて実証する。本明細書の実施例で得られたデータは、ＭＡＣが、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１およびＡＳＣサブユニットを直接活性化しかつそれらのタンパク質発現を増加させたことを実証する。これらの活性化されたサブユニットはＮＬＲＰ３インフラマソーム複合体を形成し、それは活性なＩＬ－１βを生成する。Ｃ９－／－ＥＡＵマウスはＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化せず、ＩＬ－１βは基底レベルに近いままであり、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化がＭＡＣ依存性経路であることを確認した。
自己反応性エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＥＡＵの病因に関連付けられている。Ｔｈ１およびＴｈ１７系統の両方がＥＡＵの発症に特に関与しており、ブドウ膜炎の患者で報告されている（Amadi-Obi, A., et al. (2007) Nat. Med. 13, 711-718; Caspi, R. R., et al. (1996) J. Immunol. 157, 2668-2675）。さらに、ＩＬ－１βシグナル伝達はＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を促進する（Chung, Y., et al. (2009) Immunity 30, 576-587）。最近の研究では、ＩＬ－１シグナル伝達経路を遮断することで、マウスのＥＡＵを治療できる可能性があることが示されている（Wan, C. K., et al. (2016) J. Immunol. 196, 543-546）。ＩＬ－１Ｒアンタゴニストであるアナキンラ（anakinra）、可溶性デコイＩＬ－１Ｒであるリロナセプト（rilonacept）、およびＩＬ－１β中和抗体であるカナキヌマブ（canakinumab）は、ブドウ膜炎の治療に承認されている（Knickelbein, J. E., et al. (2017) Handb. Exp. Pharmacol. 242, 231-268）。しかしながら、多様な副作用と短い作用時間のため使用が限られている。本明細書の実施例では、ＥＡＵに罹患したマウスの網膜においてＩＬ－１β産生の増加が観察された；ただし、ＥＡＵに罹患したＣ９－／－マウスの網膜では、より低いＩＬ－１βレベルが観察された。さらに、Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞の高められた分化がＥＡＵに罹患したマウスの網膜で観察された；ただし、ＥＡＵに罹患したＣ９－／－マウスの網膜では、それぞれのＩＬ１７およびＩＦＮ－γのタンパク質およびｍＲＮＡレベルで示されるように、Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞の減少が観察された。さらに、Ｔｈ１およびＴｈ１７陽性ＣＤ４細胞のレベルの上昇が、ＥＡＵマウスからのＤＬＮで観察された。しかしながら、Ｃ９－／－ＥＡＵマウスからのＤＬＮでは、Ｔｈ１およびＴｈ１７陽性ＣＤ４細胞のレベルは変化しないままであることが観察された。特定の理論または作用機序に制限されることなく、ＥＡＵ網膜におけるＭＡＣ誘導ＩＬ－１β産生ならびにＴｈ１およびＴｈ１７細胞の分化は、局所効果であることが予測される。
多くの補体制御タンパク質が細胞表面に分泌されまたは見られ、宿主組織への補体媒介性損傷を阻止する。これらのタンパク質には、Ｈ因子、崩壊促進因子（decay accelerating factor）（ＣＤ５５）、膜補因子タンパク質（ＣＤ４６）、およびプロテクチン（ＣＤ５９）が含まれる。これらの補体制御タンパク質の活性の低下または欠損は、ＥＡＵおよび実験的自己免疫性前部ブドウ膜炎を含む免疫病態（immunopathology）を引き起こす可能性がある（Morgan, B. P., et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14, 857-877; An, F., et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 3778-3782; Carroll, M. V., et al. (2011) Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 965-975; Jha, P., et al. (2006) J. Immunol. 176, 7221-7231）。自己免疫性ブドウ膜炎は、全身性疾患に関連する慢性多因子性疾患である。様々な研究により、補体活性化の阻害がマウスのＥＡＵ病状の改善に役立つ可能性があることが示されている（An, F., et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 3778-3782; Copland, D. A., et al. (2010) Clin. Exp. Immunol. 159, 303-314; Read, R. W., et al. (2006) Exp. Eye Res. 82, 389-394）。本明細書に記載の方法の実施形態は、ＡＡＶを利用してｓＣＤ５９をＥＡＵマウスに送達する長時間作用型遺伝子治療アプローチを実証する。ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９がＥＡＵ網膜におけるＭＡＣ沈着を阻害することが初めて実証された。本明細書の実施例は、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９がＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を阻害し、ＩＬ－１β産生を減弱させたことを実証する。
さらに、本明細書の実施例は、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９の単回硝子体内注射がＥＡＵマウスにおける表現型病状を阻害したことを示している。これらのマウスでは、炎症の軽減、より少ない免疫細胞浸潤物、血管炎の軽減など、ＥＡＵに関連する臨床徴候が有意に改善された。本明細書の実施例で得られたデータは、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９の注射が、暗順応および明順応の両方のＥＲＧで、ＥＡＵに関連する網膜機能の喪失の改善をもたらすことを実証する。本明細書の実施例では、Ｃ９－／－マウスは、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を有意に阻害することが観察され、さらにＩＬ－１βのアップレギュレーションを低減することが観察された。組織学的スコアの改善と網膜機能の改善の傾向がＣ９－／－ＥＡＵマウスで観察されたが、ＥＲＧのいくつかのデータポイントを除いて、差異は統計的有意性の有意なレベルに達しないことが観察された。
予期外に、我々の研究は、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９が、Ｃ９のＣ５ｂ－８複合体への取込みを遮断する以外の様式で炎症を減弱させる可能性があることを示唆する。ＧＰＩアンカー型ＣＤ５９は、ＣＤ２に結合してＴ細胞内で活性化シグナルを伝達することが以前報告されている（Deckert, M. et al. (1995) Eur J Immunol.25, 1815-22）。ＣＤ５９クロスリンクは、Ｔ細胞受容体ゼータ（ζ）／ＺＡＰ－７０シグナル伝達カスケードおよびインターロイキン－２（ＩＬ－２）合成を誘導する。ＩＬ－２は、１型糖尿病や血管炎などの疾患において免疫系をうまく調整することが分かっており（Hartemann, A. et al. (2013) The Lancet. Diabetes & Endocrinology.1, 295-305）、それはｓＣＤ５９がＭＡＣ非依存的様式で炎症を減弱させ得るという仮説を支持する。ブドウ膜炎を分析するために本明細書で使用されるＥＡＵモデルには、軽度から中程度のＥＡＵの発生に関連する矛盾がある。これらのマイナーな変更は結果に大きな影響を与える可能性がある。
ブドウ膜炎は慢性炎症性疾患であり、多くの患者は再発のエピソードに直面し、それらの一部は利用可能な治療法に不応性である。全体的に、従来の治療法は、重大な副作用および短期有効性のため、全身性自己免疫疾患（ベーチェット病、フォークト（Ｖｏｇｔ）・小柳病など）の患者における重度で進行期のブドウ膜炎の管理に限定されている。ブドウ膜炎を管理するための処置は、過去数十年の間に大きくは進歩していない（Knickelbein, J. E., et al. (2017) Handb. Exp. Pharmacol. 242, 231-268）。これらの懸念を考慮すると、ブドウ膜炎患者におけるインフラマソームのＭＡＣ依存性活性化の継続的阻害などの長時間作用型の治療法を開発することは実用的である。したがって、ＡＡＶｓＣＤ５９の単回硝子体内注射は、現在の治療法の短期的効果に比べて、大きな可能性と利点がある。ＡＡＶ依存性遺伝子治療が動物モデルにおいて眼疾患の治療にうまく成功していることが示されている（Adhi, M., et al. (2013) PLoS One 8, e79661; Ildefonso, C. J., et al. (2015) Hum. Gene Ther. 26, 59-68）。さらに、ＡＡＶ媒介性遺伝子治療は、加齢性黄斑変性症のヒト臨床試験にうまく進んでいる（Mingozzi, F., et al. (2011) Nat. Rev.
本明細書の実施例は、ＭＡＣが、ＥＡＵにおけるＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化およびＩＬ－１β産生の重要な制御因子であることを実証した。ＭＡＣは、ＩＬ－１β産生を増加させることにより、Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞の分化に重要な役割を果たす。ｓＣＤ５９のＡＡＶ媒介性発現は、ＭＡＣ沈着を効果的に阻害し、その後ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を阻害することが観察された。ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９の単回硝子体内注射は、マウスにおいてＥＡＵの発生を効果的に阻害することが観察された。
ＣＤ５９タンパク質
ＣＤ５９は、ヒトの赤血球、リンパ球、血管内皮細胞などの細胞の膜に関連して見られる膜結合糖タンパク質である。ＣＤ５９タンパク質は、機能的ＭＡＣの組み立てを阻害し、したがって補体媒介性の活性化および／または溶解から細胞を保護する。
特定の理論または作用メカニズムに制限されることなく、細胞の原形質膜は通常、Ｃ９補体タンパク質が膜のＣ５ｂ－８に結合することによるＣ５ｂ－９ポアの活性化を特異的に阻害する例えばＣＤ５９などの細胞表面タンパク質によって、補体の影響から保護されると考えられている（Holguin et al. 1989 J. Clin. Invest. 84: 7-17; Sims et al. 1989 J. Biol. Chem. 264: 19228-19235; Davies et al. 1989 J. Exp. Med. 170: 637-654; Rollins et al. 1990 J. Immunol. 144: 3478-3483;およびHamilton et al. 1990 Blood 76: 2572-2577）。ＣＤ５９は、Ｃ５ｂ－８複合体中のＣ８補体タンパク質への結合についてＣ９補体タンパク質と競合し、それによってＣ５ｂ－９膜侵襲複合体の形成を低減しまたは妨げる。したがって、ＣＤ５９は、終末補体ＭＡＣによる細胞活性化および細胞溶解の両方を低減するように作用する。
成熟ヒトＣＤ５９タンパク質は、７７個のアミノ酸で構成され、分子量は１８～２１ｋＤである。前駆体ヒトＣＤ５９タンパク質は、２５アミノ酸のアミノ末端シグナルペプチドと、膜アンカーの結合をもたらす２６アミノ酸のカルボキシ末端ペプチドを含む。前駆体ヒトＣＤ５９、成熟ヒトＣＤ５９、および他の哺乳動物（例えばヒヒ、アフリカミドリザル、フクロウザル、マーモセット（marmoset）、ＨＶＳ－１５、ブタ、ウサギ、ラットおよびマウス）のＣＤ５９配列の例のアミノ酸配列が、Ｓｉｍｓらの２００７年１月２３日に発行された米国特許第７，１６６，５６８号（参照により組み込まれる）に示されている。
ＣＤ５９のタンパク質構造は、単一のシステインリッチドメイン、３つのループと小さな４番目の螺旋ループを有する疎水性コアを含む（Yu et al. 1997 Journal of Experimental Medicine 185(4): 745-753）。
ＣＤ５９をコードする遺伝子の構造および配列は特徴付けられている（Ｆｏｄｏｒらの１９９７年４月２９日に発行された米国特許第５，６２４，８３７号、参照により組み込まれる）。この遺伝子は、ヒトの第１１染色体の短腕、具体的には、染色体１１ｐ１３および１１ｐ１４（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎのアクセション番号１０７２７１）にあり、２０ｋｂにわたる４つのエクソンで構成されている（Petranka et al. 1992 Proc. Nat. Acad. Sci. 89: 7876-7879）。非翻訳第１エクソンの前には、コンセンサスＴＡＴＡまたはＣＡＡＴモチーフを欠くＧおよびＣリッチプロモーター領域がある。第２エクソンはタンパク質の疎水性リーダー配列をコードし、第３エクソンは成熟タンパク質のＮ末端部分をコードする。第４エクソンは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーの細胞膜への付着のための疎水性配列を含む、成熟タンパク質の残りの部分をコードする。
ＣＤ５９は、ヒト末梢血白血球、赤血球、および多くの細胞株で発現されるグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型糖タンパク質である。このタンパク質は、造血細胞および非造血細胞の両方で発現され、例えば内皮細胞、末梢神経線維、ニューロン、ミクログリア、オリゴデンドロサイト（または希突起膠細胞）、アストロサイト、上衣細胞、上皮細胞、唾液腺の腺房細胞、気管支上皮、尿細管および扁平上皮などで発現されている。それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれるNose, M. et al. 1990 Immunology 70(2): 145-149; Vedeler, C. et al. 1994 Immunology 82(4): 542-547;およびHidestima, T. et al. 1990 Immunology 69(3): 396:401を参照されたい。ＣＤ５９をコードするｃＤＮＡは、Sawada, R. et al. 1989 Nucleic Acids Res 17(16): 6728に報告されている。ＣＤ５９をコードするｃＤＮＡは、ヒトＴ細胞白血病（ＹＴ）およびヒト赤白血病（Ｋ５６２）細胞株からもクローニングされており、ＣＤ５９はＣＯＳ細胞で一過性発現されている（Walsh, L.A. et al. 1990 Eur J. Immol 21(3): 847-850）。ヒトＣＤ５９は、Ｃ末端に位置する２６アミノ酸を含み、それは７７位のアミノ酸アスパラギンでのグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー（ＧＰＩアンカー）の取り付けのためのシグナル配列を指定する。ＣＤ５９のｃＤＮＡ配列は、１９９７年４月２９日に発行されたＦｏｄｏｒらの米国特許第５，６２４，８３７号に示され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＭＡＣの構成要素とＣＤ５９との物理的結合の分析は、ＣＤ５９に対する別個の結合部位が、ヒトＣ８とヒトＣ９のそれぞれのα鎖内に含まれていることを示している。ヒトＣＤ５９のヒトＣ９との相互作用のための結合部位は、成熟ヒトＣＤ５９の配列のアミノ酸残基４２～５８として同定されており、それはヒトＣ９タンパク質のヒトアミノ酸残基３３４～４１８に対応するヒトＣ９の領域、より具体的には、Ｃ９の予測膜挿入ドメインのすぐＣ末端側であるヒトＣ９アミノ酸残基３５９～３８４に結合する（１９９６年１１月８日に出願されたＳｉｍｓらのＰＣＴ／ＵＳ９６／１７９４０号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
公開されたＮＭＲデータからの成熟ヒトＣＤ５９の溶液構造とＣＤ５９分子の活性部分の知識から特定された、Ｃ８／Ｃ９に結合するのに利用できる活性表面露出アミノ酸残基側鎖は、４４位のヒスチジン、４８位のアスパラギン、４９位のアスパラギン酸、５１および５２位のスレオニン、５５位のアルギニン、および５８位のグルタミン酸である。ＣＤ５９のＮＭＲ構造は、Ｋｉｅｆｆｅｒらによる寄託物、ヒト補体制御タンパク質ＣＤ５９（細胞外領域、残基１７０；ＮＭＲ、１０構造）、ＭＭＤＢ Ｉｄ：８９１，ＰＤＢ Ｉｄ：１ＥＲＨ；Ｋｉｅｆｆｅｒらによる寄託物、ヒト補体制御タンパク質ＣＤ５９（細胞外領域、残基１７０；ＮＭＲ、拘束）、ＭＭＤＢ Ｉｄ：８９０，ＰＤＢ Ｉｄ：１ＥＲＧ；Ｆｌｅｔｃｈｅｒらによる寄託物、Ｇｌｃｎａｃ－Ｂｅｔａ－１，４－（Ｆｕｃ－Ａｌｐｈａ－１，６）－Ｇｌｃｎａｃ－Ｂｅｔａ－１と複合体を形成したＣＤ５９（ＮＭＲ、１０構造）、ＭＭＤＢ Ｉｄ：４９８，ＰＤＢ Ｉｄ：１ＣＤＳ；Ｆｌｅｔｃｈｅｒらによる寄託物、Ｇｌｃｎａｃ－Ｂｅｔａ－１，４－Ｇｌｃｎａｃ－Ｂｅｔａ－１と複合体を形成したＣＤ５９（ＮＭＲ、１０構造）、ＭＭＤＢ Ｉｄ：４９７，ＰＤＢ Ｉｄ：１ＣＤＲに記載されている。Ｆｌｅｔｃｈｅｒらによる１ＣＤＳと１ＣＤＲの寄託物。同じ相対位置でこれら側鎖を提示するＣＤ５９のアミノ酸配列は、ヒトＣＤ５９と同様に機能し（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．）、そのようなバリアントは、本明細書の方法、キットおよび医薬組成物の範囲内である。
補体活性化と自己抗体の異常レベルとの関係は、黄斑変性症やその他の状態などの眼疾患に関して分析されている。Ｈａｇｅｍａｎらの２００５年１２月２９日に公開された米国特許出願公開第２００５／０２８７６０１号（参照により組み込まれる）は、ＡＭＤ患者からのサンプルにおいて網膜タンパク質（ＲＰＥおよび脈絡膜タンパク質）に特異的な自己抗体の存在を測定することにより黄斑変性を診断することを提案している。
理論は、補体によるアルツハイマー病および加齢性黄斑変性の原因作用と、補体系の活性化およびＭＡＣの形成を阻害する予防とを関連付けてきた。２００７年８月２３日に公開されたＤｉｎｕの米国特許出願公開第２００７／０１９６３６７号（参照により組み込まれる）は、アルツハイマー病およびＡＭＤの治療薬として、補体を阻害することにより細胞片（debris）の形成を防ぐことを提案している。２００７年８月３０日公開のＰａｔｉｌらの米国特許出願公開第２００７／０２０３１９０号（参照により組み込まれる）は、補体活性化の推定阻害剤としてヒドロキシルアミン化合物（例えば、ＴＥＭＰＯＬ－Ｈ、ＴＥＭＰＯ－Ｈ、およびＯＸＡＮＯ－Ｈ）またはエステル誘導体を記載している。
Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎらの２００５年１２月１日公開の米国特許出願公開第２００５／０２６５９９５号（参照により組み込まれる）は、補体阻害剤ＣｒｒｙおよびＣＤ５９のそれぞれを、ラット糸球体上皮細胞および近位尿細管上皮細胞に結合する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）にアミノ末端で連結させることにより作成した薬剤を使用して、ラットにおいて補体誘導性タンパク尿（complement-directed proteinuria）を阻害する。この参考文献では、可溶性ＣＤ５９は阻害剤として効果がないと記載されている。Ｂｏｒａら（Bora et al. 2007 J. Immunol 178: 1783-1790）は、組換え法を使用して、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ１）の結合アームＦｃをＣＤ５９タンパク質に融合させる（ｒｓＣＤ５９ａ－Ｆｃ）ことにより、膜ターゲティング組成物を作成し、この融合物を静脈内、眼内（硝子体内）および腹腔内経路でマウスに注射する。ＣＮＶ陽性スポットの数は、硝子体内および静脈内経路と比較して、腹腔内経路によって融合タンパク質で処置した対象において減少した。Ｆｃの官能性は、投与後に融合タンパク質が一般的かつ非特異的に細胞に接触すると即時の結合をもたらすことができる。精製タンパク質の投与は、プロテアーゼおよびペプチダーゼの存在による代謝および半減期によってさらに制限される。Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら（Tomlinson et al. 2009 IOVS 50(7): 3056-3064）は、細胞の膜分子を標的とする補体受容体２（ＣＲ２）の断片にＨ因子のＮ末端結合ドメインを連結することにより作成した融合タンパク質補体阻害剤をコードするプラスミドを、ＣＮＶスポットを有する動物に静脈内注射することにより、マウスモデルのＣＮＶスポットのサイズを縮小させた。
本明細書で提供されるＣＤ５９組成物は、機能的ＧＰＩアンカーの主要アミノ酸配列を欠く。機能的に同等のタンパク質には、機能的に欠陥があり、膜を標的とする能力を欠く改変ＧＰＩアンカードメインのアミノ酸配列が含まれる。ｓＣＤ５９は、組換え膜非依存性ＣＤ５９（ｒｍｉＣＤ５９）の例である。膜非依存性ＣＤ５９を得る追加の方法には、例えばＧＰＩアンカーが欠如するようにｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ５９を合成するなど、膜会合の阻害剤を提供するなどの非組換え方法が含まれる。膜非依存性ＣＤ５９を得る方法は、本明細書の実施例に示されている。分子の核酸配列およびアミノ酸配列を改変するためのさらなる組換え技術は、遺伝学および分子生物学の分野で周知である。
様々な実施形態において、本明細書に記載のＣＤ５９タンパク質は、可溶性ＣＤ５９タンパク質である。組成物は、ＣＤ５９タンパク質を提供し、７７位のアミノ酸アスパラギンをコードするヌクレオチドでＧＰＩアンカーの取り付けのためのシグナル配列を除去するように改変されたＣＤ５９の全長核酸を含む。あるいは、タンパク質が細胞の膜に付着できないように、ＣＤ５９の核酸配列を点突然変異、置換、または欠失によって改変して、ＧＰＩアンカー位置に改変アミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。
本明細書で使用される「膜非依存性」という用語は、ＧＰＩアンカーを欠くか、あるいは細胞膜または膜結合タンパク質などの細胞膜関連構造に結合する機能および能力を欠く改変ＧＰＩアンカーを有するＣＤ５９アミノ酸配列を指す。ＧＰＩアンカーを組換えＤＮＡ技術により改変して、ＧＰＩアンカードメインを除去することができ、あるいは１つまたは複数の変異を導入してＧＰＩ機能を破壊することができる。これらの１つまたは複数の変異は、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、１つまたは複数のアミノ酸の欠失、または１つまたは複数のアミノ酸の置換を含むことができる。
ＧＰＩアンカリングは、多数の遺伝子産物の相互作用を含む、小胞体における多段階経路を含む。ＣＤ５９を含む多くのタンパク質は、細胞表面で発現され、有効に機能するためにＧＰＩを必要とする。タンパク質シグナルの構造がＧＰＩアンカーの取り付けをコードするメカニズムは、Orlean et al. 2007 JLR 48: 993-1011に概説されている。ＧＰＩの付着は、タンパク質をＥＲに標的化する疎水性Ｎ末端分泌シグナルと、Ｃ末端ＧＰＩシグナルアンカー配列とを含むアミノ酸配列を必要とする。タンパク質のアミノ末端に位置し、ｉｎ ｖｉｖｏで切断される天然のＣＤ５９分泌シグナルに加えて、他の分泌シグナルもＣＤ５９タンパク質に適しており、本明細書に記載の方法の範囲内である。ここで哺乳動物細胞での使用に適した一般的な真核生物の分泌シグナルは、例えば、Ｄｉｎｇらの２００４年５月１１日発行の米国特許第６，７３３，９９７号；Tan et al. 2002 Protein Engineering 15(4): 337-345;およびTan et al. 1999 Biochim. Biophys. Acta 1452: 103-120に記載されており、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＧＰＩが連結されるアミノ酸はオメガ（ω）残基と呼ばれ、オメガ残基のＮ末端側のアミノ酸はオメガマイナス（ω－）と呼ばれ、オメガ残基のＣ末端側のアミノ酸はオメガプラス（ω＋）と呼ばれる。ＧＰＩアンカー配列は、柔軟なリンカー領域を形成する例えばアルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、またはグルタミン酸などの約１０個の極性アミノ酸（すなわち、ω－１０からω－１）のストレッチを含む。ω残基は、グリシン、アラニン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸、またはシステインのいずれかであることが確認されている。オメガ位置のアミノ酸をコードする核酸の置換および欠失などの変異を用いて、ＧＰＩアンカーの取り付けを低減または排除する、あるいはＧＰＩアンカーの有効な機能を低減または排除する。例えば、そのようなバリエーションには、疎水性のロイシンをコードする核酸（例えば、核酸ＣＴＧ）およびアラニンをコードする核酸（例えば、核酸ＧＣＡ）を、より疎水性が低い（つまり、より親水性が高い）アミノ酸であるグルタミンをコードする核酸（例えば、核酸ＣＡＧ）およびグルタミン酸をコードする核酸（例えば、核酸ＧＡＡ）、またはグリシンをコードする核酸（例えば、核酸ＧＧＮ）で置換することが含まれる。あるいは、バリエーションには、ω残基を別のアミノ酸で置換すること、例えば、グリシンをチロシンで置換することが含まれる。
ＣＤ５９の遺伝子配列の転写を調節するのに有用な他のプロモーター配列も本明細書のベクターの発現の範囲内である。これらのプロモーターは、例えば、構成的プロモーター、細胞周期特異的プロモーター、ユビキタスプロモーター、組織特異的プロモーター、代謝的に調節されるプロモーター、誘導性プロモーター、およびヒトおよび動物を含む特定の対象に見られるプロモーターである。プロモーターおよびプロモーターシステムの例は、例えば、Ｅｖａｎｓらの２００４年１月１３日発行の米国特許第６，６７７，３１１号；Ｃｌａｒｋらの２００６年９月１９日発行の米国特許第７，１０９，０２９号；およびＨａｌｌｅｎｂｅｃｋらの１９９９年１２月７日に発行された米国特許第５，９９８，２０５号に示されており、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＧＰＩアンカリングに関与しないＣＤ５９タンパク質の部分の残りのアミノ酸配列において、本明細書におけるＣＤ５９タンパク質の範囲は、保存的配列改変を含むことが想定される。本明細書で使用する場合、「保存的配列改変（conservative sequence modification）」という用語は、ＣＤ５９タンパク質またはそのアミノ酸配列を含む膜非依存性ＣＤ５９の特性に有意な影響を及ぼさないまたは変化させないアミノ酸改変、すなわちそれらの側鎖を同じ相対位置に提示するＣＤ５９のアミノ酸配列がヒトＣＤ５９と同様に機能するアミノ酸改変を指す。このような保存的改変には、アミノ酸の置換、付加および欠失が含まれる。ＣＤ５９のアミノ酸配列の改変は、当技術分野における任意の既知の技術、例えば、部位特異的変異導入またはＰＣＲベースの変異導入を使用して達成される。そのような技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, 1989, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1989, Molecular Biomethods Handbook, 2nd ed., J. M. Walker et al., Humana Press, 2008, and Handbook of Molec. and Cellul. Methods in Biol. and Med., 3rd ed., L. J. Ceske et al., CRC Press, 2011に記載されている。
保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で規定されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β－分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
ある実施形態では、ＣＤ５９アミノ酸配列は、野生型配列のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列である。「実質的に同一」という用語は、本明細書では、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有することができるように、十分なまたは最小限の数の第２のアミノ酸配列の位置合わせしたアミノ酸残基と同一であるアミノ酸残基を含む第１のアミノ酸配列を指すために使用される。例えば、少なくとも約６０％の同一性、または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、または９９％の同一性を有する共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列である。ある実施形態では、ＣＤ５９アミノ酸配列は、野生型配列のアミノ酸配列と「同一」であるアミノ酸配列である。同一の配列とは、ＣＤ５９の野生型配列と１００％の同一性を示すものである。ある実施形態において、同一の配列には、１つまたは複数のアミノ酸がＮまたはＣ末端に配置されてよい。例えば、１つまたは複数のアミノ酸は、エピトープタグ、精製タグ、精製タグの除去を可能にするために導入された切断部位の残り、またはタンパク質の安定性またはバイオアベイラビリティを改善するための１つまたは複数の改変を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、記載された量に１０％以下の差で近い数、測定値、または量を指す。
ＣＤ５９ポリペプチドはインフラマソーム媒介性障害（inflammasome mediated disorder）の処置に有用である。本明細書に記載の方法に有用なヒトＣＤ５９ポリペプチドのアミノ酸配列は、次の配列により示される：ＭＧＩＱＧＧＳＶＬＦＧＬＬＬＶＬＡＶＦＣＨＳＧＨＳＬＱＣＹＮＣＰＮＰＴＡＤＣＫＴＡＶＮＣＳＳＤＦＤＡＣＬＩＴＫＡＧＬＱＶＹＮＫＣＷＫＦＥＨＣＮＦＮＤＶＴＴＲＬＲＥＮＥＬＴＹＹＣＣＫＫＤＬＣＮＦＮＥＱＬＥＮＧＧＴＳＬＳＥＫＴＶＬＬＬＶＴＰＦＬＡＡＡＷＳＬＨＰ（配列番号１）。ＣＤ５９のシグナル配列は、細胞からの分泌前に切断され、治療的有用性に必要ではない。しかしながら、シグナル配列を有するＣＤ５９をコードする核酸は、ＣＤ５９ポリペプチドの分泌を高め、したがって、シグナル配列は、核酸によってコードされるＣＤ５９ポリペプチドに含めることが望ましい場合がある。本明細書に記載の方法に有用なシグナル配列切断ヒトＣＤ５９ポリペプチドは、次の配列により示される：ＬＱＣＹＮＣＰＮＰＴＡＤＣＫＴＡＶＮＣＳＳＤＦＤＡＣＬＩＴＫＡＧＬＱＶＹＮＫＣＷＫＦＥＨＣＮＦＮＤＶＴＴＲＬＲＥＮＥＬＴＹＹＣＣＫＫＤＬＣＮＦＮＥＱＬＥＮＧＧＴＳＬＳＥＫＴＶＬＬＬＶＴＰＦＬＡＡＡＷＳＬＨＰ（配列番号２）。しかしながら、正確なシグナル配列末端は、配列番号１に示される完全ＣＤ５９ポリペプチドのＮ末端方向またはＣ末端方向のいずれかで、配列番号２の最初のロイシンから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４アミノ酸が配列番号２とは異なっていてよい。Ｎ末端の２６アミノ酸をさらに欠失させると、ヒトＣＤ５９のＧＰＩアンカードメインが除去される。本明細書に記載の方法に有用なシグナル配列切断可溶性ヒトＣＤ５９ポリペプチドは、次の配列により示される：ＬＱＣＹＮＣＰＮＰＴＡＤＣＫＴＡＶＮＣＳＳＤＦＤＡＣＬＩＴＫＡＧＬＱＶＹＮＫＣＷＫＦＥＨＣＮＦＮＤＶＴＴＲＬＲＥＮＥＬＴＹＹＣＣＫＫＤＬＣＮＦＮＥＱＬＥＮ（配列番号３）。この可溶性バージョンも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４アミノ酸がその正確なＮ末端で変動することができ、そのＮ末端からのさらなる欠失またはそのＮ末端の修復をもたらしてもよい。ある実施形態では、ＣＤ５９の可溶性バージョンは、ＧＰＩの取り付けに必要な残基への１つまたは複数の変異を有する配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、その残基は、配列番号２のアミノ酸７０または７７のアスパラギンのいずれか一方または両方である。ある実施形態では、本明細書に記載の方法に有用なＣＤ５９ポリペプチドは、配列番号１、２、または３のいずれかの配列のＮ末端、Ｃ末端、または両末端からの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸の欠失を含む。本明細書に記載の方法で使用されるＣＤ５９ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のいずれかに示される配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるものであってよい。さらに、ここで使用されるＣＤ５９ポリペプチドは、精製タグ、切断された精製タグの残り、追加の補体阻害ポリペプチド、抗炎症性ポリペプチド、またはＣＤ５９ポリペプチドの安定性もしくはバイオアベイラビリティを高めるポリペプチドなどの、追加の非ＣＤ５９由来配列を含むことができる。本明細書に記載されるＣＤ５９ポリペプチドを含むかまたはそれからなるポリペプチドをコードする核酸も、インフラマソーム媒介性障害の処置に有用である。したがって、本明細書に記載のＣＤ５９ポリペプチドを含むかまたはそれからなるポリペプチドをコードする１つの核酸または複数の核酸も想定される。核酸は、対象への投与に適したウイルスベクターまたはプラスミドベクターなどの組換えベクターに適切に含めることができる。これらのベクターは、インフラマソーム媒介性障害を有する個体に投与するための医薬組成物に追加で含めることができる。
配列番号１、配列番号２、または配列番号３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるポリペプチドを、本明細書に記載の対象におけるインフラマソーム障害を処置する方法で使用することができる。ある実施形態では、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるポリペプチドを、対象の眼におけるインフラマソーム障害を処置する方法で使用する。ある実施形態では、インフラマソーム障害はブドウ膜炎である。ある実施形態では、対象は、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示している。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される。ある実施形態では、ＮＡＬＰは、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である。ある実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示した個体にヒトＣＤ５９ポリペプチドを投与することを含む。ＣＤ５９ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のいずれか１つに示される配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むことができる。
配列番号１、配列番号２、または配列番号３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるポリペプチドをコードする１つの核酸または複数の核酸を、対象におけるインフラマソーム障害を処置する方法で使用することができる。ある実施形態では、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるポリペプチドをコードする核酸または複数の核酸を、対象の眼におけるインフラマソーム障害を処置する方法で使用する。ある実施形態では、インフラマソーム障害はブドウ膜炎である。ある実施形態では、対象は、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示している。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される。ある実施形態では、ＮＡＬＰは、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である。
ある実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示した個体にヒトＣＤ５９ポリペプチドを投与することを含む。ＣＤ５９ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のいずれか１つに示される配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなることができる。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される。ある実施形態では、ＮＡＬＰは、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である。ある実施形態では、陽性結果は個体の眼から得られる。
ある実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示した個体の眼にヒトＣＤ５９ポリペプチドを投与することを含む。ＣＤ５９ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のいずれか１つに示される配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなることができる。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される。ある実施形態では、ＮＡＬＰは、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である。ある実施形態では、陽性結果は個体の眼から得られる。
ある実施形態では、本明細書に記載の方法は、ブドウ膜炎に罹患している個体にヒトＣＤ５９ポリペプチドを投与することを含む。ＣＤ５９ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のいずれか１つに示される配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなることができる。ある実施形態では、ポリペプチドは、個体の罹患した眼に投与される。
ある実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示した個体に、ヒトＣＤ５９ポリペプチドをコードする核酸を投与することを含む。核酸は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に示される配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤ５９ポリペプチドをコードすることができる。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される。ある実施形態では、ＮＡＬＰは、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である。ある実施形態では、陽性結果は個体の眼から得られる。
ある実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示した個体の眼に、ヒトＣＤ５９ポリペプチドをコードする核酸を投与することを含む。核酸は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に示される配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤ５９ポリペプチドをコードすることができる。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される。ある実施形態では、インフラマソーム活性マーカーは、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される。ある実施形態では、ＮＡＬＰは、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である。ある実施形態では、陽性結果は個体の眼から得られる。
ある実施形態では、本明細書に記載の方法は、ブドウ膜炎に罹患している個体に、ヒトＣＤ５９ポリペプチドをコードする核酸を投与することを含む。核酸は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に示される配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤ５９ポリペプチドをコードすることができる。ある実施形態では、核酸は、個体の罹患した眼に投与される。
配列間の配列同一性の計算は以下のように行われる。２つのアミノ酸配列の同一性の割合（％）を決定するには、最適な比較のために配列を整列させる（例えば、最適な整列のために、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列の一方または両方にギャップを導入してよい）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基を比較する。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、タンパク質はその位置で同一である。２つの配列間の同一性の割合（％）は、２つの配列の最適な整列のために導入する必要のあるギャップの数と各ギャップの長さを考慮して、配列が共有する同一の位置の数の関数である。
配列の比較および２つの配列間の同一性の割合（％）の決定は、数学的アルゴリズムを使用して行われる。２つのアミノ酸配列間の同一性の割合（％）は、デフォルトのパラメータを使用するアライメントソフトウェアプログラムを使用して決定される。適切なプログラムには、例えば、ＴｈｏｍｐｓｏｎらによるＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３，１９９４（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）；ＴａｔｕｓｏｖａおよびＭａｄｄｅｎによるＢＬ２ＳＥＱ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４：２４７，１９９９（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）；ＮｏｔｒｅｄａｍｅおよびＨｉｇｇｉｎｓによるＳＡＧＡ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：１５１５，１９９６（ｉｇｓ－ｓｅｒｖｅｒ．ｃｎｒｓ－ｍｒｓ．ｆｒ／～ｃｎｏｔｒｅｄ）；およびＭｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎらによるＤＩＡＬＩＧＮ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１４：２９０，１９９８（ｂｉｂｉｓｅｒｖ．ｔｅｃｈｆａｋ．ｕｎｉ－ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ．ｄｅ／ｄｉａｌｉｇｎ）が含まれる。
ベクター
「組換え」という用語は、遺伝子組み換え生物（例えば微生物）の操作によって産生されるタンパク質を指す。
本発明によれば、ＣＤ５９の供給源には、例えば、適切な宿主細胞におけるＣＤ５９タンパク質の発現を指示するように組換えＤＮＡ分子中に設計された、ＣＤ５９タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が含まれる。生物学的に活性なＣＤ５９タンパク質を発現させるために、ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列または機能的同等物を適切な発現ベクター（すなわち、ＣＤ５９タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、挿入コード配列の転写および翻訳を調節するエレメントをコードする必要な核酸を含むベクター）に挿入する。
当業者に周知の方法を使用して、適切な転写および翻訳調節エレメントに作動可能に連結されたＣＤ５９タンパク質をコードする配列を含む発現ベクターを構築する。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ組換えまたは遺伝子組換えが含まれる。そのような技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, 1989, Molecular Biomethods Handbook, 2nd ed., J. M. Walker et al., Humana Press, 2008, and Handbook of Molec. and Cellul. Methods in Biol. and Med., 3rd ed., L. J. Ceske et al., CRC Press, 2011に記載されている。
様々な市販の発現ベクター／宿主システムが、ＣＤ５９タンパク質をコードする配列を含めて発現させるのに有用である。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）と接触させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）でトランスフェクトされた、または細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉ、ｐＢＲ３２２、またはｐＥＴ２５ｂプラスミド）で形質転換された植物細胞システム；または動物細胞システムが含まれるが、これらに限定されない。
ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、およびヘルパー依存型アデノウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターは、本明細書に示されるように、ＡＭＤの病因におけるＭＡＣの有害作用を妨害するＣＤ５９タンパク質をコードする核酸配列を送達する。アデノウイルスパッケージングベクターは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナッサス）から市販されている。アデノウイルスベクターを構築する方法およびアデノウイルスベクターを使用する方法は、Klein et al. 2007 Ophthalmology 114: 253-262, およびvan Leeuwen et al. 2003 Eur. J. Epidemiol. 18: 845-854に示されている。
アデノウイルスベクターは、真核生物の遺伝子発現（Levrero et al. 1991 Gene, 101: 195-202）およびワクチン開発（Graham et al. 1991 Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols 7, (Murray, Ed.), Humana Press, Clifton, NJ, 109-128）で使用されてきた。さらに、組換えアデノウイルスベクターは遺伝子治療に使用される（Ｗｕらの２００７年６月２６日に発行された米国特許第７，２３５，３９１号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
組換えアデノウイルスベクターは、例えば、シャトルベクターとプロウイルスベクターの間の相同組換えにより作製する（Ｗｕらの２００７年６月２６日発行の米国特許第７，２３５，３９１号；参照により組み込まれる）。本明細書中のアデノウイルスベクターは複製欠損であり、例えば、条件付き欠損であり、アデノウイルスＥ１領域を欠き、Ｅ１コード配列が除去された位置にＣＤ５９をコードするポリヌクレオチドが導入される。あるいは、ＣＤ５９遺伝子をコードするポリヌクレオチドはＥ３領域に挿入される。
ヘルパー細胞株は、２９３ヒト胚性腎細胞、筋肉細胞、造血細胞、または他のヒト胚性間葉細胞もしくは上皮細胞などのヒト細胞に由来してよい。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスを許容する他の哺乳類種の細胞、例えばベロ（Ｖｅｒｏ）細胞または他のサル胚間葉細胞もしくは上皮細胞に由来してもよい。ヘルパー細胞株を使用したこれらの複製欠陥アデノウイルスベクターの産生および増殖は、Graham et al 1977 J. Gen. Virol. 36: 59-72に記載されている。
レンチウイルスベクターパッケージングベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）から市販されている。レンチウイルスベクター産生のためのＨＩＶベースのパッケージングシステムは、Naldini et al. 1996 Science 272: 263-267; Zufferey et al. 1997 Nature Biotechnol. 15: 871-875；およびDull et al. 1998 J. Virol. 72: 8463-8471に記載されている構築物を使用して調製される。
第３世代レンチウイルスＳＩＮベクターバックボーンに基づくシステムを使用してパッケージングするのに、多くのベクター構築物を利用できる（Dull et al. 1998 J. Virol. 72: 8463-8471）。例えば、ベクター構築物ｐＲＲＬｓｉｎＣＭＶＧＦＰｐｒｅは、ＨＩＶプロモーター配列がラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の配列に置き換えられた５’ＬＴＲ；Ｕ３プロモーター領域に欠失を含む自己不活性化３’ＬＴＲ；ＨＩＶパッケージングシグナル；ＣＭＶプロモーターによって駆動されるオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からなるマーカー遺伝子カセットに連結されたＲＲＥ配列；および核外輸送を強化すると思われるウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥエレメントを含む。ＧＦＰマーカー遺伝子は、ＵＶ蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーの直接観察によるトランスフェクションまたは形質導入の効率の定量化を可能にする（Kafri et al. 1997 Nature Genet. 17: 314-317;および Sakoda et al. 1999 J. Mol. Cell. Cardiol. 31: 2037-2047）。
ＣＤ５９タンパク質をコードする遺伝子を含むレトロウイルスベクターおよびパッケージング細胞を構築するためのレトロウイルス核酸の操作は当技術分野で知られている技法を使用して達成される。Ausubel, et al., 1992, Volume 1, Section III (units 9.10.1-9.14.3); Sambrook, et al., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Miller, et al., Biotechniques. 7:981-990, 1989; Molecular Biomethods Handbook, 2nd ed., J. M. Walker et al., Humana Press, 2008; Handbook of Molec. and Cellul. Methods in Biol. and Med., 3rd ed., L. J. Ceske et al., CRC Press, 2011; Eglitis, et al., Biotechniques. 6:608-614, 1988；米国特許第４，６５０，７６４号、同第４，８６１，７１９号、同第４，９８０，２８９号、同第５，１２２，７６７号、および同第５，１２４，２６３号；ならびに国際公開第８５／０５６２９号、国際公開第８９／０７１５０号、国際公開第９０／０２７９７号、国際公開第９０／０２８０６号、国際公開第９０／１３６４１号、国際公開第９２／０５２６６号、国際公開第９２／０７９４３号、国際公開第９２／１４８２９号、および国際公開第９３／１４１８８号（それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
レトロウイルスベクターを構築し、両種指向性（amphotropic）パッケージングシステムを使用して、非感染性の形質導入ウイルス粒子（ビリオン）にパッケージングする。そのようなパッケージングシステムの例は、例えば、Markowitz et al. 1988 J. Virol. 62:1120-1124; Cosset et al. 1990 J. Virol. 64: 1070-1078;米国特許第４，６５０，７６４号、同第４，８６１，７１９号、同第４，９８０，２８９号、同第５，１２２，７６７号、および同第５，１２４，２６３号、ならびに国際公開第８５／０５６２９号、国際公開第８９／０７１５０号、国際公開第９０／０２７９７号、国際公開第９０／０２８０６号、国際公開第９０／１３６４１号、国際公開第９２／０５２６６号、国際公開第９２／０７９４３号、国際公開第９２／１４８２９号、および国際公開第９３／１４１８８号に記載されており、それらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
「プロデューサー細胞」の作製は、レトロウイルスベクターをパッケージング細胞に導入することによって達成される。そのようなレトロウイルスベクターの例は、例えば、Korman et al. 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 2150-2154; Morgenstern et al. 1990 Nucleic Acids Res. 18: 3587-3596；米国特許第４，４０５，７１２号、同第４，９８０，２８９号、および同第５，１１２，７６７号；ならびに国際公開第８５／０５６２９号、国際公開第９０／０２７９７号、および国際公開第９２／０７９４３号に記載されており、それらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ヘルペスウイルスパッケージングベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から市販されている。ヘルペスウイルスの例は、水痘・帯状疱疹ウイルス（Varicella-Zoster virus）または仮性狂犬病ウイルス（pseudorabies virus）などのα－ヘルペスウイルス；ＨＳＶ－１またはＨＳＶ－２などの単純ヘルペスウイルス；あるいはエプスタイン・バーウイルス（Epstein-Barr virus）などのヘルペスウイルスである。ほとんどのヘルペスウイルスに有用なヘルパーウイルスの不在下で、目的のヌクレオチド断片（例えば、ＣＤ５９ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列など）と共にパッケージングされ得る空のヘルペスウイルス粒子を調製する方法は、Ｆｒａｅｆｅｌらの１９９９年１２月７日に発行された米国特許第５，９９８，２０８号（参照によりその全体が組み込まれる）に示されている。
ヘルペスウイルスＤＮＡベクターは、当業者によく知られている技術を使用して構築することができる。例えば、ヘルペスウイルスの全ゲノムをコードするＤＮＡ断片は、例えば、コスミド（Evans, et al., Gene 79, 9-20, 1989）、酵母人工染色体（ＹＡＣＳ）（Sambrook, J. et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)、または大腸菌F因子プラスミド(O'Conner et al. 1989 Science 244:1307-1313）などの大きなＤＮＡ断片を運ぶことができる多くのベクターに分割される。
例えば、エプスタイン・バーウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびＨＳＶ－１を含む様々なヘルペスウイルスの全ゲノムを表す重複クローンを含むコスミドのセットが単離されている。M. van Zijl et al. 1988 J. Virol. 62: 2191; Cohen et al. 1993 Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 90: 7376; Tomkinson et al. 1993 J. Virol. 67: 7298;およびCunningham et al. 1993 Virology 197: 116を参照のこと。
ＡＡＶは、培養細胞で増殖感染するために別のウイルス（アデノウイルス、またはヘルペスウイルス科のウイルス）との共感染に依存する依存性パルボウイルスである（Muzyczka 1992 Curr Top Microbiol Immunol, 158: 97 129）。例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスは、２つのＡＡＶ末端反復が隣接する目的遺伝子（例えば、ＣＤ５９遺伝子）を含むプラスミド(McLaughlin et al. 1988 J. Virol., 62(6): 1963-1973; Samulski et al. 1989 J. Virol, 63: 3822-3828)と、末端反復のない野生型ＡＡＶコード配列を含む発現プラスミドとをコトランスフェクションすることにより作製する。また、細胞を、ＡＡＶヘルパー機能に必要なアデノウイルス遺伝子を運ぶアデノウイルスまたはプラスミドと接触させるかまたはそれでトランスフェクションする。そのような方法で作製された組換えＡＡＶウイルスストックはアデノウイルスを含み、それを（例えば、塩化セシウム密度遠心分離によって）組換えＡＡＶ粒子から物理的に分離しなければならない。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）パッケージングベクターは、ＧｅｎｅＤｅｔｅｃｔ（オークランド、ニュージーランド）から市販されている。ＡＡＶは高い組込み頻度を有することが示されており、また非分裂細胞に感染するため、組織培養における哺乳動物細胞への遺伝子の送達に有用である（Muzyczka 1992 Curr Top Microbiol Immunol 158: 97-129）。ＡＡＶは感染性の広い宿主範囲を有する（Tratschin et al. 1984 Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081; Laughlin et al. 1986 J. Virol., 60(2): 515-524; Lebkowski et al. 1988 Mol. Cell. Biol. 8(10): 3988-3996; McLaughlin et al. 1988 J. Virol. 62(6):1963-1973）。
ＡＡＶベクターを構築する方法およびＡＡＶベクターを使用する方法は、例えば、２００７年６月２６日発行の米国特許第５，１３９，９４１号（Ｗｕら）および１９８９年１月１０日発行の米国特許第４，７９７，３６８号（Ｃａｒｔｅｒら）に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。遺伝子送達におけるＡＡＶの使用は、LaFace et al. 1988 Virology 162(2): 483 486; Zhou et al. 1993 Exp. Hematol, 21: 928-933; Flotte et al. 1992 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7(3): 349-356; およびWalsh et al. 1994 J. Clin. Invest 94: 1440-1448にさらに記載されている。
組換えＡＡＶベクターは、マーカー遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ形質導入(Kaplitt et al. 1994 Nat Genet., 8(2):148-154; Lebkowski et al. 1988 Mol. Cell. Biol. 8(10): 3988-3996; Samulski et al. 1991 EMBO J. 10: 3941-3950; Shelling and Smith 1994 Gene Therapy, 1: 165-169; Yoder et al. 1994 Blood, 82 (Supp.): 1: 347A; Zhou et al. 1993 Exp. Hematol 21: 928-933; Tratschin et al. 1985 Mol. Cell. Biol. 5: 3258-3260; McLaughlin et al. 1988 J. Virol. 62(6): 1963-1973)、およびヒトの疾患に関与する遺伝子の形質導入（Flotte et al. 1992 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7(3): 349-356; Ohi et al. 1990 Gene, 89(2): 279-282; Walsh et al. 1994 J. Clin. Invest. 94: 1440-1448;およびWei et al. 1994 Gene Therapy, 1: 261 268）にうまく使用されてきた。
ある実施形態において、ベクターは、非ウイルスベクター、例えば、ウイルス粒子に関係のない、ＣＤ５９遺伝子コード材料を標的細胞または組織に特異的に送達する合成遺伝子送達ビヒクルまたはベクターである。非ウイルスベクターの例には、リポソーム、ペプチド、ナノ粒子、エマルジョン、またはカプセル化された２つ以上の相系または他の適切な調製物が含まれる。したがって、ある実施形態では、方法、キット、または組成物は、搭載されて組織または細胞に接触させられる核酸を含む非ウイルスベクターを含む。例えば、膜を標的としない改変ＧＰＩアンカーを有する膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードする裸のＤＮＡ、またはＧＰＩアンカーを有しない膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードする遺伝子をリポソームに封入して、補体関連疾患の処置のために核酸が組織または細胞に効果的に送達されるようにリポソームを組織または細胞に接触させる。
抗体
本明細書で言及される「抗体」という用語は、抗体全体および任意の抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）またはこれらの一本鎖を含む。天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。
本明細書で使用する場合、「ヒトＭＡＣに特異的に結合する」抗体は、５×１０－９Ｍ以下、２×１０－９Ｍ以下、または１×１０－１０Ｍ以下のＫＤでヒトＭＡＣに結合する抗体を指すことが意図されている。例えば、抗体はモノクローナルまたはポリクローナルである。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、ＭＡＣまたはＭＡＣの特定エピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１またはＩｇＧ４など）である。
ＭＡＣアッセイにも有用なのは、組換え抗体である抗体である。本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語には、動物（例えば、マウス）から単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作製または単離されたすべての抗体が含まれる。本明細書の方法で使用される組換え抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞には、Urlaub and Chasin 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220に記載され、例えばR.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621に記載されているようにＤＨ ＦＲ選択可能マーカーとともに使用される、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞などのチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞で使用するための別の発現システムは、国際公開第８７／０４４６２号、国際公開第８９／０１０３６号、および欧州特許出願公開第３３８，８４１号に示されているＧＳ遺伝子発現システムである。抗体を産生するために、インタクトな目的タンパク質または目的タンパク質の一部をコードする発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入し、宿主細胞での抗体の発現または宿主細胞を増殖させた培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な時間、宿主細胞を培養する。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して培養培地から回収できる。
様々な種の標的に対する抗体の結合能力を評価するための標準的なアッセイは、当技術分野で知られており、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよびＲＩＡが含まれる。抗体の結合速度論（例えば、結合親和性）も、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析などの当該技術分野で知られている標準的なアッセイによって評価することができる。
抗血清の作成のために動物を選択する場合に考慮すべき基準を含む、抗体産生の一般的な方法論は、Harlow et al. (1988 Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 93-117)に記載されている。例えば、ヤギ、イヌ、ヒツジ、マウス、またはラクダなどの適切なサイズの動物を、免疫反応を生じさせるのに効果的なヒトＭＡＣ由来のエピトープを含む無傷のタンパク質またはその一部などの免疫原を投与することにより免疫する。例示的なプロトコルは以下の通りである。動物の背部に、動物のサイズに応じて１００μｇ～１００ｍｇの抗原を皮下注射し、３週間後に、動物のサイズに応じてアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバント）を含む１００μｇ～１００ｍｇの免疫原を腹腔内注射する。動物の血液中の抗体が適切な力価に達するまで、アジュバント（例えば、完全フロイントアジュバント）を２週間ごとにさらに腹腔内注射する。例示的な力価として、少なくとも約１：５０００の力価または１：１００，０００以上の力価（すなわち、検出可能な活性を有する希釈率）が挙げられる。抗体は、例えばヒトＭＡＣを含むカラムでのアフィニティー精製によって、精製される。
ヒトリンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫の技術がモノクローナル抗体を作製するために使用される。ヒトリンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫のための技術は、当業者によく知られている。例えば、Inai et al. May 1993 Histochemistry, 99(5): 335-362; Mulder et al. 1993 Hum. Immunol. 36(3): 186-192; Harada, et al. 1993 J. Oral Pathol. Med., 22(4): 145-152; Stauber, et al. 1993 J. Immunol. Methods 161(2): 157-168;およびVenkateswaran, et al. 1992 Hybridoma, 11(6): 729-739を参照されたい。これらの技術を使用して、抗原特異的ＩｇＧおよびＩｇＭモノクローナル抗体などの、抗原反応性モノクローナル抗体を作製できる。ヒトＭＡＣに対する親和性を有しかつヒトＭＡＣに特異的な任意の抗体またはそのフラグメントは、本明細書で提供されるＭＡＣ沈着のアッセイの範囲内である。
本明細書の例において、ＣＤ５９との接触は、ＣＤ５９遺伝子をコードするベクターを細胞または組織に注入することによって達成される。
本明細書の例において、細胞溶解は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取込みによって測定する。ＰＩは、例えば、Ｆｌｕｋａ ＢｉｏＣｈｅｍｉｃａ（Ｂｕｃｈｓ、スイス）から市販されている。ＰＩは、ＤＮＡに結合すると蛍光を発する挿入剤である。ＰＩは膜不透過性であり、一般に生存細胞から締め出され、したがって、ＰＩは一般に、混合集団における非生存細胞の量を特定および／または決定するために使用される。
本明細書の例およびある実施形態において、検出可能なタンパク質は、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、イクオリン、シアン蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質、強化緑色蛍光タンパク質、および黄色蛍光タンパク質である。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびイクオリンは、オワンクラゲ（Aequorea victoria）から分離された生物発光組成物である。カルシウムイオンがイクオリンに結合すると、複合体はアポイクオリンと発光組成物に分解され、青色光を発する。合成イクオリンは、Ｓｅａｌｉｔｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｇａｒｔ、ＧＡ）からＡＱＵＡＬＩＴＥ（登録商標）として市販されている。ＧＦＰは可視スペクトルの下側の緑色の部分で光を放出し、合成ＧＦＰはＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）から市販されている。
例えばシアン蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質、強化緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質などの異なる色の蛍光を発するＧＦＰの派生アミノ酸配列を生成するために、ＧＦＰのアミノ酸配列への変異が行われた。合成シアン蛍光タンパク質、合成ＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質、合成強化緑色蛍光タンパク質、および合成黄色蛍光タンパク質は、それぞれＣｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州マウンテンビュー）から市販されている。
別の実施形態では、検出可能な物質は、蛍光タンパク質ではない蛍光物質、例えば、インドシアニングリーン、ドキソルビシン、リボフラビン、クロロフィル、およびポルフィリンである。
インドシアニングリーン（ＩＣＧ）は、励起時に約８００ｎｍ、約８２０ｎｍ、約８４０ｎｍ、または約８６０ｎｍで発光するトリカルボシアニン色素である。ＩＣＧはＨ．Ｗ．Ｓａｎｄｓ Ｃｏｒｐ．（フロリダ州ジュピター）から市販されている。ドキソルビシンは蛍光性であり、例えば、約５５０ｎｍ、６００ｎｍ、または６５０ｎｍの波長で光を放出する。ドキソルビシンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から市販されている。リボフラビンはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から市販されており、蛍光性であり、例えば、約４５０ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６５０ｎｍ、または約７５０ｎｍの波長で光を放出する。クロロフィルＡは、例えば、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、または約８００ｎｍの波長で光を放出する緑色の光合成色素である。クロロフィルＡは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ミズーリ州セントルイス）およびＴｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ（カリフォルニア州サニーベール）などのサプライヤーから市販されている。ポルフィリンは、４つのメチンブリッジ（＝ＣＨ－）を介して両側で連結した４つのピロールサブユニットから作られた複素環式大環状分子である。ポルフィインの大きな共役構造により、化合物は有色であり、すなわち、例えば、約６００ｎｍ、または約６５０ｎｍ、または約７００ｎｍの波長で蛍光を発する。ポルフィリンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から市販されている。
他の代替の実施形態では、検出可能な物質は酵素剤であり、それは例えばβ－ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどのタンパク質であり、ヌクレオチドベクターで発現させることができる。
β－ガラクトシダーゼは、β－ガラクトシドの単糖への加水分解を触媒する加水分解酵素である。発光β－ガラクトシダーゼ検出キットはＣｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州マウンテンビュー）から市販されている。アルカリホスファターゼは、ヌクレオチド、タンパク質、アルカロイドなど、様々な種類の分子からリン酸基を除去するための加水分解酵素である。発光アルカリホスファターゼ検出キットは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から市販されている。
医薬組成物
本発明の一態様は、対象の炎症を起こした眼の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害するためにＣＤ５９タンパク質をコードする核酸、または可溶性ＣＤ５９タンパク質を使用する方法を提供する。様々な実施形態において、ＣＤ５９タンパク質は、膜非依存性（可溶性）ＣＤ５９タンパク質を含む。ある実施形態では、ＣＤ５９組成物は、静脈内投与用に処方される。ある実施形態において、組成物は、眼への投与のための眼科用製剤として配合され、網膜での局所的徐放を提供するために眼底への送達を高めるように配合されるか、または黄斑変性症を含む眼疾患に関与する血管および／または組織の効果的な処置を提供するように処方され得る。関連する実施形態では、医薬組成物は、ヒト対象、例えばヒト対象の循環または眼への投与のために十分な純度で処方される。ある実施形態において、これらの組成物は、任意選択で、１つまたは複数の追加の治療薬をさらに含む。ある実施形態では、追加の治療薬は、成長因子、抗炎症剤、一酸化窒素およびカルシウムチャネル遮断薬を含むがこれらに限定されない昇圧剤、コラゲナーゼ阻害剤、局所ステロイド、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、アスコルビン酸塩、アンジオテンシンＩＩ、アンジオテンシンＩＩＩ、カルレティキュリン、テトラサイクリン、フィブロネクチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経分化因子（ＮＤＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢＥＧＦ）、トロンボスポンジン、フォン・ヴィレブランド因子Ｃ、ヘパリンおよびヘパリン硫酸、およびヒアルロン酸からなる群より選択される。
他の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＤ５９タンパク質がＭＡＣ沈着から細胞を保護する能力を増強し、安定化させまたは相乗効果をもたすか、あるいは代替さえする化合物、組成物、生物学的薬剤などである。また、例えば、同じ、同時発生のまたは関連する症状、状態または疾患を処置するために使用される薬剤など、ＣＤ５９タンパク質と同時に有利にまたは好都合に提供され得る治療薬も含まれる。いくつかの実施形態では、薬物は、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗マイコバクテリア剤、抗真菌剤、抗増殖剤または抗アポトーシス剤を含んでいてよいが、それらに限定されない。本発明の組成物に含まれる薬物は、当技術分野でよく知られている。例えば、Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman, et al., eds., McGraw-Hill, 1996（参照によりその内容が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、所望の特定の剤形に適している、任意かつすべての溶媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、界面活性物質、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、潤滑剤などを含む。Remington's Pharmaceutical Sciences Ed. by Gennaro, Mack Publishing, Easton, PA, 1995は、医薬組成物を処方するのに使用される様々な担体、ならびにその調製のための既知の技術を提供する。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、グルコースおよびスクロースなどの糖；カカオバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、コーン油、大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性適合性潤滑剤が含まれるが、これらに限定されず、さらに、配合者の判断にしたがって、着色剤、放出剤、コーティング剤、防腐剤および抗酸化剤も組成物中に存在することができる。
治療的有効用量
本明細書で提供される方法による炎症を起こした眼の処置は、組織または細胞を医薬組成物と接触させること、例えば、ＣＤ５９タンパク質をコードする核酸またはＣＤ５９タンパク質の発現源を活性物質として有する医薬組成物の治療有効量を、所望の結果を達成するのに必要な量および時間、それを必要とする対象に投与することを含む。方法は、例えば、眼の組織または細胞をＣＤ５９タンパク質またはＣＤ５９タンパク質をコードするベクターと接触させることにより、ブドウ膜炎を処置することを含む。
本発明の方法による組成物は、ブドウ膜炎または他の補体関連疾患および状態を処置するために有効な任意の量および任意の投与経路を使用して投与することができる。したがって、本明細書で使用される表現「ブドウ膜炎を処置するのに有効な量」は、ブドウ膜炎の症状を有益に予防または改善するのに十分な組成物の量を指す。
正確な投薬量は、処置を受ける患者を考慮して、個々の医師によって選択される。投薬量および投与は、十分なレベルの活性物質を提供するかまたは所望の効果を維持するように調整される。考慮され得る追加の因子には、例えばブドウ膜炎の中間期または進行期などの病状の重症度；患者の年齢、体重、および性別；食事、投与時間および投与頻度；投与経路；薬物の組合せ；反応感受性；および治療への耐性／応答が含まれる。長時間作用型医薬組成物は、特定の組成物の半減期およびクリアランス速度に応じて、毎時、毎時２回、３～４時間ごと、毎日、１日２回、３～４日ごと、毎週、または２週間に１回投与され得る。
本発明の活性物質は、好ましくは、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために投薬単位形態で処方される。本明細書で使用される表現「投薬単位形態（dosage unit form）」は、治療される患者に適切な活性物質の物理的に別個の単位を指す。しかしながら、本発明の組成物の１日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。任意の活性物質について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイまたは動物モデル（本明細書で提供されるように、通常はマウスであるが、ラット、ウサギ、イヌ、またはブタ）のいずれかで推定することができる。ここで提供される動物細胞モデルは、望ましい濃度および総投与量範囲ならびに投与経路を達成するためにも使用される。このような情報を使用して、ヒトへでの投与に有用な用量および経路を決定できる。
治療的有効用量は、症状または状態を改善する、あるいはブドウ膜炎の進行を防ぐ活性物質の量を指す。活性物質の治療効果および毒性は、例えば、ＥＤ５０（その用量は集団の５０％で治療的に有効である）およびＬＤ５０（その用量は集団の５０％に対して致死的である）など、細胞培養または実験動物における標準的な製薬手順によって決定することができる。毒性用量の治療効果用量に対する比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータが、ヒトが使用するための投薬量の範囲を策定する際に使用される。
製品の１日の投薬量は、成人あたり０．００１～１００ｍｇ／日など、広範囲にわたって変化し得る。眼投与について、治療される患者への投薬量の症状調整のために、組成物は、好ましくは、０．００１、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、または５００．０μｇの活性成分を含む溶液の形態で提供される。
静脈内投与される可溶性ＣＤ５９タンパク質の用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ／用量～約１０ｍｇ／ｋｇ／用量、０．１ｍｇ／ｋｇ／用量～約５ｍｇ／ｋｇ／用量、または１．０ｍｇ／ｋｇ／用量～約５ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲であってよい。投与プロトコルには、毎日、週に２回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回の頻度が含まれる。
単位用量は、典型的には、約０．００１μｇ～約５００μｇの活性成分、好ましくは約０．１μｇ～約１００μｇの活性成分、より好ましくは約１．０μｇ～約１０μｇの活性成分を含む。薬物の有効量は、通常、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重／日～約２５ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量レベルで供給される。例えば、その範囲は、約０．００１～１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、または約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重／日～１ｍｇ／ｋｇ体重／日である。組成物は、例えば、１日当たり１回～４回またはそれ以上の回数のレジメンで投与され得る。単位用量は、例えば２回以上の分割用量で投与するなど、分割してもよい。
ＣＤ５９タンパク質の発現源としての投与は、その用量が、処置される細胞あたり少なくとも約５０、１００、５００、１０００、または少なくとも約５０００の粒子を含むような、ある用量のウイルスベクターまたは核酸ベクターの投与である。細胞数は、ブドウ膜炎または眼疾患を処置する当業者に既知の方法により、処置を必要とする網膜領域から計算することができる。
医薬組成物の投与
所望の投薬量で適切な薬学的に許容される担体と共に処方されると、本明細書に提供される医薬組成物は、眼（液剤、軟膏剤、または点眼剤のように）、鼻腔内、口腔内、経口、直腸内、非経口、大槽内（intracisternally）、膣内、または腹腔内などのように局所的に、ヒトおよび他の哺乳動物に投与される。
眼内注射には、房水または硝子体液への眼内注射、または結膜下注射またはテノン嚢下注射などによる眼の外層への注射が含まれる。
眼、経口、静脈内、または他の全身投与用の液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション（乳濁液）、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性物質に加えて、液体剤形は、当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１、３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含むことができる。不活性希釈剤に加えて、眼用組成物、経口組成物または他の全身送達される組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤などのアジュバントも含むことができる。
本発明の医薬組成物の局所または経皮投与用の剤形には、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、またはパッチが含まれる。活性物質は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体および必要に応じて任意の必要な保存剤または緩衝剤と混合される。例えば、眼または皮膚への投与経路は、水滴、ミスト、エマルション、またはクリームで達成される。投与は治療的であってもまたは予防的であってもよい。本発明は、開示される組成物を含む眼科用デバイス、外科用デバイス、聴覚学的デバイスまたは製品（例えば、ガーゼ包帯またはストリップ）、ならびにそのようなデバイスまたは製品を作製または使用する方法を含む。これらのデバイスを、本明細書に記載の組成物でコーティングし、含浸させ、結合させ、または他の方法で処理してもよい。
経皮パッチは、活性成分の身体への制御された送達を提供するという追加の利点がある。そのような剤形は、化合物を適切な媒体に溶解または分散させることによって作製することができる。吸収促進剤を使用して、皮膚を通過する化合物の流れを増加させることもできる。その速度は、速度制御膜を設けることによって、または化合物をポリマーマトリックスまたはゲルに分散させることによって、制御することができる。
注射用製剤、例えば、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、公知の技術にしたがって処方され得る。無菌の注射用製剤は、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液としてなど、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液、懸濁液または乳濁液であってよい。使用できる許容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定油が溶媒または懸濁媒体として慣例的に使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性固定油を使用することができる。さらに、注射剤の調製にはオレイン酸などの脂肪酸が使用される。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって、または使用前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体に溶解または分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって滅菌できる。活性物質の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射からの薬剤の吸収を遅くすることがしばしば望ましい。非経口投与された活性物質の遅延吸収は、薬剤を油性ビヒクルに溶解または懸濁することにより達成することができる。注射可能なデポ剤の形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に薬剤のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作られる。ポリマーに対する活性物質の比率および使用される特定ポリマーの性質に応じて、活性物質の放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が含まれる。注射用デポ製剤は、体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬剤を封入することによっても調製される。
直腸または膣投与用の組成物は、好ましくは、本発明の活性薬剤を例えばココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックスなどの適切な非刺激性の賦形剤または担体と混合することにより調製できる坐剤であり、それらは常温で固体であるが体温で液体であるため、直腸または膣腔で溶けて活性物質を放出する。
経口投与用の固体剤形には、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、および顆粒が含まれる。そのような固体剤形では、活性物質を、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの少なくとも１つの不活性な薬学的に許容される賦形剤または担体、および／またはａ）デンプン、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸などの充填剤または増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシアなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの保湿剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカ澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶解遅延剤（solution retarding agents）、ｆ）第４級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）セチルアルコールやモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、ｈ）カオリンやベントナイトクレイなどの吸着剤、ｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物などの潤滑剤と混合する。
同様のタイプの固体組成物を、乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、軟質および硬質充填ゼラチンカプセルの充填剤として使用することもできる。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、および顆粒の固体剤形は、腸溶コーティング、放出制御コーティング、および医薬製剤分野で周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製することができる。そのような固体剤形では、活性物質を、スクロースまたはデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合することができる。そのような剤形はまた、通常の慣例であるように、不活性希釈剤以外の追加の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースなどの打錠潤滑剤および他の打錠助剤も含むことができる。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、製剤は緩衝剤も含むことができる。それらは、任意選択で乳白剤を含んでもよく、腸管の特定部分においてのみまたは優先的に、必要に応じて遅延様式で、活性物質を放出する組成物であってもよい。使用できる包埋組成物の例には、ポリマー物質およびワックスが含まれる。
付録Ａとしてここに添付されたこの仕事の一部は、共著者および共同発明者であるＢｉｎｉｔ Ｋｕｍａｒ，Ｓｉｏｂｈａｎ Ｍ．ＣａｓｈｍａｎおよびＲａｊｅｎｄｒａ Ｋｕｍａｒ－Ｓｉｎｇｈによる「ブドウ膜炎のモデルにおけるＮＬＲＰ３インフラマソームの補体媒介性活性化およびＣＤ５９のＡＡＶ媒介性送達によるその阻害」というタイトルの原稿として公開するために準備されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
病気の監視および処置のための患者の選択
本明細書に記載のＣＤ５９核酸およびタンパク質組成物は、炎症性およびインフラマソーム関連疾患の処置に有用である。記載の組成物は、インフラマソーム活性をアッセイする試験の陽性結果に基づいて処置のために選択された個体に投与することができる。そのような試験は、インフラマソームの活性化の直接的な測定に限定されず、間接的な測定も含む。間接的な測定は、例えば、サイトカイン、ケモカイン、炎症を起こした組織または病変組織の細胞表面マーカー、特定の免疫型の細胞活性化、特定の免疫型の有無の測定であってよい。例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１βおよびＩＬ－１８などのサイトカインは、インフラマソームの活性化に応答して上昇する。したがって、選択された個体は、血漿、血清、血液、組織切片、ｍＲＮＡ、または病変組織の細胞抽出物におけるこれらサイトカインのレベルの上昇、または血液または病変組織から分離された免疫細胞による発現または分泌レベルの上昇を示す可能性がある。ＣＤ５９核酸またはタンパク質組成物による処置の選択基準は、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋の任意の１つまたは複数のレベルまたは活性の上昇であってよい。
サイトカインＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、またはＩＦＮ－γのレベルの上昇は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）、免疫組織化学法、関連細胞集団のフローサイトメトリー分析、または定量的ＲＴ－ＰＣＲによって評価することができる。カスパーゼおよびインフラマソームの活性化は、カスパーゼ１、カスパーゼ５、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）などの、活性化されたカスパーゼおよびインフラマソーム成分に特異的な抗体を使用した生検標本の免疫組織化学染色によって決定できる。Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞は、細胞表面マーカーＣＸＣＲ３もしくはＣＣＲ５、またはＴｈ１の場合は転写因子ＴＢＸ２１、または細胞表面マーカーＣＣＲ６およびＣＣＲ４のフローサイトメトリーを使用して、あるいはＴｈ１７の場合は転写因子ＲＯＲｇ／ｇｔの細胞内染色を使用して識別できる。
記載されているＣＤ５９核酸およびタンパク質組成物は、アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋梗塞、アテローム性血管疾患、微小血管障害、甲状腺炎、炎症性腸疾患、臓器移植片拒絶反応、膜性腎炎、交感性眼炎、サルコイドーシスなどのインフラマソーム関連障害の診断に基づいて処置のために選択された個体に投与される。ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、およびサルコイドーシスなどのインフラマソーム関連眼障害が含まれる。
特定の態様において、ＣＤ５９核酸またはタンパク質組成物は、炎症を軽減するまたはインフラマソーム関連疾患を解決するためのそのような組成物の少なくとも１回の投与に対する応答または別の処置に対する応答について個体を監視した後に投与することができる。この投与と監視（monitoring）のサイクルを、１、２、３、４、５、６、７、８、９回またはそれ以上、あるいは適切な臨床反応が達成されるまで、あるいはインフラマソーム活性が低下するまで繰り返すことができる。ある実施形態では、ＣＤ５９核酸およびタンパク質組成物を、１）インフラマソーム関連疾患を有するまたはインフラマソーム活性について陽性結果を有するとして選択された個体に投与し；２）その後、個体を監視し、インフラマソーム活性についての試験またはインフラマソーム関連疾患の診断基準によって決定される悪化、変化なし、または最適以下（sub-optimal）の応答に基づいて、個体に少なくとも１回または複数回の組成物の継続投与を与えることができる。ある実施形態では、ＣＤ５９核酸およびタンパク質組成物を、１）個体に投与し、２）その後、個体を監視し、インフラマソーム活性についての試験またはインフラマソーム関連疾患の診断基準によって決定される悪化、変化なし、または最適以下もしくはより大きい、の応答に基づいて、個体に少なくとも１回または複数回の組成物の継続投与を与えることができる。
本明細書では、ＣＤ５９ポリペプチド／核酸の方法および組成物を包含する以下の番号の実施形態が想定されている：
１．対象の炎症を起こした眼の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害する方法であって、炎症を起こした眼の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を対象に投与することを含み、組成物はインフラマソームの活性化を阻害する、方法。
２．組成物が、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の機能とは無関係にインフラマソームの活性化を阻害する、実施形態１に記載の方法。
３．対象が、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、およびサルコイドーシスから選択される少なくとも１つの状態を有する、実施形態１に記載の方法。
４．ブドウ膜炎が、前部ブドウ膜炎、中部ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、および汎ブドウ膜炎から選択される少なくとも１つである、実施形態３に記載の方法。
５．対象からサンプルを得ることをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
６．サンプルが、涙、血液、尿、眼分泌物、痰、および粘液から選択される少なくとも１つである、実施形態５に記載の方法。
７．投与の前に、眼の網膜機能およびインフラマソーム活性マーカーのうちの少なくとも１つを眼において測定することをさらに含む、実施形態１～６のいずれかに記載の方法。
８．投与の後に、眼の網膜機能およびインフラマソーム活性マーカーのうちの少なくとも１つを眼において測定することをさらに含む、実施形態１～７のいずれかに記載の方法。
９．インフラマソーム活性マーカーが、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される少なくとも１つである、実施形態７または８に記載の方法。
１０．網膜機能またはインフラマソーム活性マーカーを測定することが、眼検査、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）、結膜インプレッションサイトロジー、ＲＴＰＣＲ、ＥＬＩＳＡおよびＰＣＲから選択される少なくとも１つの手法を行うことをさらに含む、実施形態７または８に記載の方法。
１１．ブドウ膜炎を処置するのに十分な投薬量で組成物を投与することをさらに含む、実施形態３に記載の方法。
１２．投与の前に、ウイルスベクター中のヌクレオチド配列を操作することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
１３．ヌクレオチド配列を裸の核酸として投与することをさらに含む、実施形態１または１２に記載の方法。
１４．ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスからなる群より選択される少なくとも１つのウイルスの遺伝子操作されたゲノムである、実施形態１３に記載の方法。
１５．レンチウイルスがレトロウイルスである、実施形態１４に記載の方法。
１６．翻訳されたＣＤ５９タンパク質のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカードメインの機能の喪失をもたらす少なくとも１つの変異を有するように膜非依存性ＣＤ５９タンパク質を操作することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
１７．グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカードメインの領域をコードするヌクレオチドを欠失させることにより、膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を操作することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
１８．投与が、組成物を眼に注射することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
１９．投与が、組成物を局所適用することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
２０．眼注射が、網膜下注射、硝子体注射、眼内注射、結膜下注射、およびテノン嚢下注射からなる群より選択される、実施形態１８に記載の方法。
２１．眼注射が、眼の外層に投与することをさらに含む、実施形態１８に記載の方法。
２２．追加の治療薬を眼に投与することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
２３．追加の治療薬が、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗マイコバクテリア剤、抗真菌剤、抗増殖剤および抗アポトーシス剤からなる群より選択される少なくとも１つである、実施形態２２に記載の方法。
２４．追加の治療薬が、成長因子、抗炎症剤、昇圧剤、コラゲナーゼ阻害剤、ステロイド、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、アスコルビン酸塩、アンジオテンシン、カルレティキュリン、テトラサイクリン、フィブロネクチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢＥＧＦ）、トロンボスポンジン、フォン・ヴィレブランド因子Ｃ、ヘパリン、ヘパリン硫酸、およびヒアルロン酸からなる群より選択される、実施形態２２に記載の方法。
２５．対象の炎症を起こした眼におけるインフラマソームの活性化を阻害するためのキットであって、
ａ．膜非依存性ＣＤ５９タンパク質および／またはＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、対象の炎症を起こした眼におけるインフラマソームを阻害するのに十分な投薬量である医薬組成物；
ｂ．使用説明書；および
ｃ．容器
を含む、キット。
２６．対象のブドウ膜炎を処置するためのキットであって、
ａ．膜非依存性ＣＤ５９タンパク質および／またはＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、対象のブドウ膜炎を処置するのに十分な投薬量である医薬組成物、
ｂ．使用説明書、および
ｃ．容器
を含む、キット。
２７．ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片性硬化症、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、およびサルコイドーシスから選択される少なくとも１つの状態を処置する方法であって、
ａ）炎症を起こした眼の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；または
ｂ）膜非依存性ＣＤ５９タンパク質
を含む組成物を対象に投与することを含み、組成物はインフラマソームの活性化を阻害する、方法。
２８．対象の炎症を起こした眼の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害する方法であって、
ａ）インフラマソーム活性マーカーを眼において測定する；および
ｂ）インフラマソーム活性マーカーが陽性である場合に、炎症を起こした眼の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を対象に投与する
ことを含み、組成物はインフラマソームの活性化を阻害する、方法。
２９．インフラマソーム活性マーカーが、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される、実施形態２８に記載の方法。
３０．膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物の投与の後に、インフラマソーム活性マーカーを眼において測定することをさらに含む、実施形態２８または２９に記載の方法。
３１．炎症を起こした対象の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害する方法であって、
ａ．炎症を起こした対象の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を対象に投与する；または
ｂ．可溶性ＣＤ５９タンパク質を含む組成物を対象に投与する
ことを含み、組成物はインフラマソームの活性化を阻害する、方法。
３２．組成物が、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の機能とは無関係にインフラマソームの活性化を阻害する、実施形態３１に記載の方法。
３３．対象が、アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、微小血管障害、甲状腺炎、炎症性腸疾患、臓器移植片拒絶反応、膜性腎炎、交感性眼炎、およびサルコイドーシスから選択される少なくとも１つのインフラマソーム関連状態を有する、実施形態３１に記載の方法。
３４．対象からサンプルを得ることをさらに含む、実施形態３１に記載の方法。
３５．サンプルが、血液、血漿、血清、末梢血単核細胞、脳脊髄液、および尿から選択される少なくとも１つである、実施形態３４に記載の方法。
３６．投与の前に、対象においてインフラマソーム活性マーカーを測定することをさらに含む、実施形態３１～３５のいずれかに記載の方法。
３７．投与の後に、対象においてインフラマソーム活性マーカーを測定することをさらに含む、実施形態３１～３５のいずれかに記載の方法。
３８．インフラマソーム活性マーカーが、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される、実施形態３６または３７に記載の方法。
３９．インフラマソーム関連状態を処置するのに十分な投薬量で組成物を投与することをさらに含む、実施形態３８に記載の方法。
４０．膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスからなる群より選択される少なくとも１つのウイルスの遺伝子操作されたゲノムを含むベクターに担持される、実施形態３９に記載の方法。
４１．レンチウイルスがレトロウイルスである、実施形態４０に記載の方法。
４２．投与が、組成物を静脈内注射することをさらに含む、実施形態３１に記載の方法。
４３．投与が、組成物を局所適用することをさらに含む、実施形態３１に記載の方法。
４４．追加の治療薬を投与することをさらに含む、実施形態３１に記載の方法。
４５．追加の治療薬が、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗マイコバクテリア剤、抗真菌剤、抗増殖剤、および抗アポトーシス剤からなる群より選択される少なくとも１つである、実施形態４４に記載の方法。
４６．追加の治療薬が、成長因子、抗炎症剤、昇圧剤、コラゲナーゼ阻害剤、ステロイド、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、アスコルビン酸塩、アンジオテンシン、カルレティキュリン、テトラサイクリン、フィブロネクチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢＥＧＦ）、トロンボスポンジン、フォン・ヴィレブランド因子Ｃ、ヘパリン、ヘパリン硫酸、およびヒアルロン酸からなる群より選択される、実施形態４４に記載の方法。
４７．対象の炎症を起こした細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害するためのキットであって、
ｃ．（ｉ）膜非依存性ＣＤ５９タンパク質および／またはＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；または
（ｉｉ）可溶性ＣＤ５９タンパク質；
を含み、対象の炎症を起こした細胞におけるインフラマソームを阻害するのに十分な投薬量である、医薬組成物；
ｄ．使用説明書；および
ｅ．容器
を含む、キット。
４８．アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、微小血管障害、甲状腺炎、炎症性腸疾患、臓器移植片拒絶反応、膜性腎炎、交感性眼炎、およびサルコイドーシスから選択される少なくとも１つの状態を処置する方法であって、
細胞からの膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；または可溶性ＣＤ５９タンパク質；を含む組成物を対象に投与することを含み、組成物はインフラマソームの活性化を阻害する、方法。
ここで完全に説明された本発明は、以下の実施例および特許請求の範囲によってさらに例示されるが、これらは例示であり、さらに限定することを意味しない。
実施例１：マウス
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、およびＣ５７ＢＬ／６Ｊを背景とするＣ９－／－マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バーハーバー）から購入し、ボストンのタフツ大学医学部の動物施設で維持した。すべての動物試験プロトコルは、視覚研究における動物の使用に関するＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙの決議、およびアメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）の実験動物の管理と使用に関するガイドラインの推奨に準拠していた。
実施例２：ＡＡＶ構築物および硝子体内注射
グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリングシグナルが欠失されたヒトＣＤ５９またはプロテクチンの短縮形態（truncated form）を発現するＡＡＶ血清型２ベクター（ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９）を、Cashman, S. M., et al. (2011) PLoS One 6, e19078に記載されているプロトコルにより構築した。可溶性ＣＤ５９（ｓＣＤ５９）はニワトリβ－アクチンプロモーターから発現される。陰性対照として、緑色蛍光タンパク質を発現する同様のベクター（ＡＡＶＣＡＧＧＦＰ）を使用した。６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに３．５×１０９ゲノムコピー／μｌのＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９もしくはＡＡＶＣＡＧＧＦＰ、またはＰＢＳ（１μｌ）を注射し、１週間後に、本明細書の実施例に記載されるようにＥＡＵをマウスに施した。
実施例３：能動免疫によるＥＡＵの誘導
同じ遺伝的背景にある６週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＣ９－／－マウスを、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）株Ｈ３７ＲＡ（２．５ｍｇ／ｍＬ）を含む完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）１：１（ｖ/ｖ）の２００μｌ中に乳化させた２００μｇのヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）ペプチド１－２０（アミノ酸配列：ＧＰＴＨＬＦＱＰＳＬＶＬＤＭＡＫＶＬＬＤ、配列番号１；Ｂｉｏｍａｔｉｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，カナダ、オンタリオ州、ケンブリッジ）で免疫した。同時に、１００μｌのＰＢＳで希釈した１．５μｇの百日咳菌（Bordetella pertussis）毒素を腹腔内注射によりマウスに投与した（Agarwal, R. K., et al. (2012) Methods Mol. Biol. 900, 443-469）。
実施例４：免疫組織化学法
クリオスタット網膜切片（１０μｍ）をＰＢＳで１５分間再水和させ、ＰＢＳ中の６％ヤギ正常血清で１時間ブロッキングし、ウサギ抗ヒトＣ５ｂ－９一次抗体（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｔｙｌｅｒ，ＴＸ；希釈：１：８００、２％ヤギ正常血清を含むＰＢＳで希釈）と共にモイストチャンバー内で一晩インキュベートした。続いて、切片を洗浄し、Ｃｙ３にコンジュゲートした抗ウサギ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）中でインキュベートして、網膜切片におけるＣ５ｂ－９の場所を特定する。ＤＡＰＩを含むアンチフェード剤（褪色防止用封入剤）（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ－ＤＡＰＩ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）でスライドを封入して、核を対比染色し、ライカ共焦点顕微鏡で画像を取得した。セクション全体でのＣ５ｂ－９染色の強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ；Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して定量化した。
実施例５：ウェスタンブロット分析
マウスの網膜を採取し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、および１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、ならびにプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む氷冷ＲＩＰＡバッファー中においてホモジナイズした。各タンパク質サンプル（３５μｇ）を、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、およびＡＳＣに関してドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ａｎｙ ｋＤ（商標） Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）プレキャストゲル、Ｂｉｏｒａｄ、ＣＡ）により分離し、その後、ニトロセルロースメンブレンに転写した。０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０と混合したブロッキングバッファー（ＬＩ－ＣＯＲ、米国、ネブラスカ州リンカーン）でブロッキングした後、一次抗体としてのマウス抗ＮＬＲＰ３モノクローナル抗体、マウス抗カスパーゼ１モノクローナル抗体、およびウサギ抗ＡＳＣポリクローナル抗体（Ａｄｉｐｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サンディエゴ；希釈 １：５００）と共に、イムノブロットを４℃で一晩インキュベートした。適切な二次抗体とのインキュベーション後、免疫反応性バンドをＬＩ－ＣＯＲ－Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線スキャナー（ＬＩ－ＣＯＲ）を使用して視覚化した。ローディングコントロールとしてβ－アクチンを用いてブロットを再検出した。
実施例６：酵素結合免疫吸着アッセイ
２０μｇの網膜タンパク質上清を使用して、製造元の指示通り、マウスＩＬ－１β、ＩＦＮ－γ、およびＩＬ－１７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌｓ、ＮＪ）について、サンドイッチＥＬＩＳＡによってサイトカインを定量化した。上清を２重で添加し、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたモノクローナル抗体を用いて、測定中のサイトカインを明らかにした。サイトカインの濃度はｐｇ／ｍＬで表した。
実施例７：遺伝子発現
製造元のプロトコルにしたがって、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ、カリフォルニア州バレンシア）を使用して、マウスの網膜から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを「Ｎａｎｏｄｒｏｐ」において２６０ｎｍの吸光度により定量化し、１μｇのＲＮＡをＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いたｃＤＮＡ合成に使用した。
β－アクチン（Ｍｍ０２６１９５８０＿ｇ１）、ＩＬ－１β（Ｍｍ００４３４２２８＿ｍ１）、ＩＬ－１７（Ｍｍ００４３９６１９＿ｍ１）、およびＩＦＮ－γ（Ｍｍ０１１６８１３４＿ｍ１）用に事前に設計されたＴａｑＭａｎプライマーを使用して、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を行った。変性は９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間を４０サイクル行い、アニーリングおよび伸長は６０℃で６０秒間行った。最終的なＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、ＰＣＲ特異性を確認した。ＲＴ－ＰＣＲから得られたＣｔ値を、ｄｄＣｔ法を使用して同じサンプルのβ－アクチンからのＣｔ値に対して正規化し、遺伝子発現の倍数変化データを得た。ＩＬ－１７の遺伝子発現は半定量的に定量化した。
実施例８：フローサイトメトリー
流入領域リンパ節細胞をマウスから単離し、細胞を４０μｍのナイロンメッシュに通すことにより単一細胞懸濁液を得た。細胞内サイトカイン染色の前に、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）の存在下で、５０ｎｇ／ｍＬ ＰＭＡおよび５００ｎｇ／ｍＬのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）で流入領域リンパ節細胞を４時間刺激した。細胞を表面マーカーＣＤ４について染色し、その後、サイトカイン染色のためにＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）で固定した。細胞を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）中の細胞内標的（ＩＦＮγ、ＩＬ－１７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）に対する適切に希釈されたフルオロフォア標識抗体およびそれぞれのアイソタイプコントロールで染色した。フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、オレゴン州アッシュランド）で解析した。ゲートは適切なアイソタイプコントロールに基づいて設定した。示されている場合、陽性細胞のパーセンテージは、正常対照と対比したゲーティングされた集団のパーセンテージを表す。
実施例９：網膜電図
暗所視および明所視の網膜電図（ＥＲＧ）分析を使用して、桿体および錐体の機能の喪失を測定した。ＥＡＵ誘発の３週間後、ＢｉｇＳｈｏｔ ｇａｎｚｆｅｌｄ（ＬＫＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；メリーランド州ゲイザースバーグ）を備えたＵＴＡＳシステムを使用して、ＥＲＧ検査を記録した。一晩暗順応させた後、暗条件下でマウスをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔した。１％トロピカミドおよび２．５％フェニレフリン塩酸塩で瞳孔を拡張させた。ＥＲＧ活性コンタクトレンズ金電極を一滴の潤滑剤（ＧｅｎＴｅａｌ、Ａｌｃｏｎ、Ｉｎｃ．テキサス州フォートワース）で角膜の中心に静かに配置し、角膜の水和および良好な導電性を維持した。参照電極および接地電極を、それぞれ首の後ろおよび尾の付け根の近くに皮下挿入した。暗所視ＥＲＧは、０ｄＢ（５ｃｄｓ／ｍ２）、－１０ｄＢ（２５ｃｄｓ／ｍ２）、－２０ｄＢ（２５ｃｄｓ／ｍ２）で白色光の１０ミリ秒のフラッシュで誘発した。２分間の白色光漂白（bleach）後、同時の明所視ＥＲＧを調べた。明所視応答は、０ｄＢおよび１ｄＢ（３．１５ｃｄｓ／ｍ２）の強度での白色光のフラッシュで誘発した。１０回の応答を、各フラッシュ強度で平均した。ａ波の振幅はベースラインからａ波の負のピークまで測定し、ｂ波はａ波の負のピークからｂ波のピークまで測定した。
実施例１０：スペクトル領域光干渉断層撮影（ＯＣＴ）および眼底撮像
マウスをケタミンとキシラジンのカクテルで麻酔し、瞳孔を１％トロピカミドと２．５％フェニレフリンの滴下で拡張させた。眼の潤滑剤（ＧｅｎＴｅａｌ、Ａｌｃｏｎ、Ｉｎｃ．、テキサス州フォートワース）の局所適用により、角膜を湿らせたままにした。光干渉断層撮影（ＯＣＴ）画像は、Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｄｏｍａｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ Ｅｎｖｉｓｕ Ｒ２３００、ノースカロライナ州モリスビル）を使用して取得した。Chen, J., et al. (2013) PLoS One 8, e63904に記載されているように、平均化したシングルＢスキャンおよびボリュームスキャンを視神経頭を中心とした画像で取得した。
ＥＡＵの２４日後、眼底撮像を行い、画像はＭｉｃｒｏｎ ＩＩＩ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅおよびＳｔｒｅａｍＰｉｘソフトウェア（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，カリフォルニア州プレザントン）を使用して取得した。具体的には、浸潤物、血管周囲の炎症細胞浸潤（cuffing）、白い線状病変、網膜ジストロフィー、網膜下出血および網膜剥離などの生理学的および病理学的症状について眼を検査した。個々のスコアを、個々のパラメータ：網膜浸潤物、視神経乳頭の変化、血管分布、および構造的損傷：のそれぞれについて、２人の独立した観察者が盲検法で０－４のスケールで評価した。臨床スコアは、これら４つの基準のそれぞれのスコアを平均化することによって計算した（Xu, H., et al. (2008) Exp. Eye Res. 87, 319-326）。
実施例１１：病理組織検査
すべての群の組織学的検査用の目を免疫後２４日目に採取し、１０％緩衝ホルマリンで固定した。２日間の固定後、標本を段階的アルコールステップにより脱水し、パラフィンブロックに包埋した。視神経領域を含む６つの異なる平面で６つの垂直断面（５μｍ）を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ＥＡＵの詳細な重症度は、以前にCaspi, R. R., et al. (1988) J. Immunol 140, 1490-1495で説明されているように、光受容体損傷、浸潤、および血管炎について０－４のスケールで評価した。これらの基準に基づいて、光受容体損傷スコアは、光受容体喪失、網膜ひだ、および網膜剥離の複合スコアとして計算した。同様に、浸潤スコアは、肉芽腫、出血、ＤＦ結節および浸潤物の組合せで構成された。血管炎スコアは、血管周囲炎および血管周囲のＣＤ４細胞浸潤、血栓の形成、および網膜における罹患血管系の程度を表す。
実施例１２：統計分析
結果は平均±ＳＥＭとして示す。マン・ホイットニー検定を、臨床スコア、組織学的スコアおよびＦＡＣＳ分析に使用した。２つの群間の統計的差異は、対応のないｔ検定を使用して分析した。３つ以上の群間の比較のために、一元配置分散分析を行った。０．０５以下のｐ値を統計的に有意であると見なした。
実施例１３：ＥＡＵにおけるＭＡＣ堆積
補体の活性化の最後のステップは、細胞表面へのＭＡＣの沈着をもたらす。事前に形成されたＣ５ｂ－８複合体への複数のＣ９分子の動員が、ＭＡＣ（Ｃ５ｂ－９）の組み立てにおける最後の必要なステップである。したがって、Ｃ９欠損マウスは、機能的なＭＡＣ複合体を形成することができない。
ＭＡＣがＥＡＵの網膜細胞の表面に形成されるかどうかを決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスでのＥＡＵの誘導後２４日目に、Ｃ５ｂ－９に対する抗体で染色することにより凍結網膜切片を調べた。ＥＡＵマウスの網膜へのＭＡＣの沈着は、正常対照マウスの網膜へのＭＡＣ沈着と比較して７０％多いことが観察された。Ｃ９－／－ＥＡＵ網膜の表面へのＭＡＣ沈着は有意ではないことが観察された（図１Ａおよび図９）。得られたデータは、ＥＡＵにおいて補体が活性化され、反応が完了して網膜組織上にＭＡＣを形成することを示した。データは、Ｃ９－／－ＥＡＵマウスが網膜上にＭＡＣを形成できなかったことも示している。
実施例１４：ＥＡＵにおけるインフラマソームの活性化
細胞表面へのＭＡＣの沈着は、ポア（孔）の形成につながり、それは細胞内カルシウムの増加をもたらす。本明細書の実施例では、ＭＡＣの沈着が、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化およびそれに続くＩＬ－１βの分泌を引き起こすかどうかを調べた。
得られたデータは、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＥＡＵが、正常マウス対照よりも１１２％多いＩＬ－１βタンパク質、および対応する４５倍多いＩＬ－１β ｍＲＮＡをもたらすことを発見した。対照的に、Ｃ９－／－ＥＡＵマウスでは、３７％多いＩＬ－１βタンパク質、および対応する３．８倍多いＩＬ－１β ｍＲＮＡが観察された（図１ＢおよびＣ）。ウェスタンブロット分析は、ＥＡＵマウスで２００％多いＮＬＲＰ３タンパク質を示し、Ｃ９－／－ＥＡＵマウスは８％多いＮＬＲＰ３タンパク質を有していた（図１Ｄ）。
インフラマソーム複合体の重要な構成要素はカスパーゼ－１であり、これは一般に不活性型の前駆体（チモーゲン）の形で生じ、ＮＬＲＰ３複合体によって活性化され、タンパク質分解によって活性なｐ１０およびｐ２０サブユニットにされ、最終的な多量体インフラマソーム複合体を作成する。ウェスタンブロット分析は、ＥＡＵマウスの網膜において、正常よりも８０％高いカスパーゼ－１の活性化（ｐ２０）を示した；しかしながら、Ｃ９－／－ＥＡＵマウスの網膜では、正常と比較して、２５％高いカスパーゼ－１の活性化（ｐ２０）が観察された（図１Ｅ）。ＥＡＵマウスの網膜におけるインフラマソームアダプタータンパク質であるＡＳＣタンパク質の発現をウェスタンブロットにより測定した。ウェスタンブロット分析は、ＥＡＵマウスでは正常よりも４４％多いＡＳＣタンパク質が観察され、Ｃ９－／－ＥＡＵマウスでは正常よりも１８％多いＡＳＣタンパク質が観察されたことを示した（図１Ｆ）。
したがって、ＩＬ－１β、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ１、およびＡＳＣのそれぞれがＥＡＵで増加することが観察され、Ｃ９－／－ＥＡＵマウスはそのような増加から部分的に保護され、これは、ＭＡＣの沈着が、ＥＡＵでのインフラマソームの活性化における重要なプレイヤーであることを示している。
実施例１５：ＥＡＵにおける網膜機能に対するＭＡＣの役割
ＥＡＵマウスおよびＣ９－／－ＥＡＵマウスの網膜機能を、網膜電図（ＥＲＧ）を使用して測定した。ＥＡＵマウスの網膜機能は、対照のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較して、暗順応でのａ波の振幅が、－２０ｄＢ、－１０ｄＢ、および０ｄＢのフラッシュ強度でそれぞれ３３％、５０％、および４１％減少したことが観察された。Ｃ９－／－ＥＡＵマウスの網膜機能は、ａ波の振幅が、正常対照のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスよりも、－２０ｄＢ、－１０ｄＢ、および０ｄＢのフラッシュ強度でそれぞれ９％、４０％、および２７％少ないことが観察された（図２Ａおよび図２Ｂ）。
ＥＡＵマウスの暗順応でのｂ波の振幅は、対照のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較して、－２０ｄＢ、－１０ｄＢ、および０ｄＢのフラッシュ強度でそれぞれ４７％、５２％、および４９％減少したことが観察された。Ｃ９－／－ＥＡＵマウスは、暗順応でのｂ波の振幅が、対照のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較して、－２０ｄＢ、－１０ｄＢおよび０ｄＢのフラッシュ強度でそれぞれ具体的に３２％、３３％および１７％少ないことが観察された。暗順応ＥＲＧのａ波とｂ波の両方で差異が観察されたが、０ｄＢは統計的に有意（ｐ＜０．０５）であることが観察された（図２Ａおよび図２Ｂ）。
ＥＡＵマウスは、対照のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較して、明順応でのｂ波の振幅が０ｄＢおよび１ｄＢのフラッシュ強度でそれぞれ４４％および３７％減少したことが観察された。Ｃ９－／－ＥＡＵマウスは、対照のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較して、ｂ波の振幅が、０ｄＢおよび１ｄＢのフラッシュ強度でそれぞれ５％および１５％減少したことが観察された。明順応でのｂ波の振幅に差異が観察されたが、０ｄＢは統計的に有意（ｐ＜０．０５）であることが観察された（図２Ａおよび図２Ｂ）。
実施例１６：Ｃ９ －／－ ＥＡＵにおける網膜構造の有意な保護はない
ＥＡＵおよびＣ９－／－ＥＡＵマウスにおける網膜構造および疾患の病理学的重症度を、ＥＡＵの誘導後２４日目に眼底撮像、ＯＣＴ、および組織学的検査を使用して定量化した。Ｘｕ．Ｈ．らにより開発された臨床スコア基準（Xu, H., et al. (2008) Exp. Eye Res. 87, 319-326）に基づき、眼底撮像は、ＥＡＵマウスが重い炎症、具体的には対照群よりも１６倍高い全体的な臨床スコアを有することを示し、それには、対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較して、３８倍高い血管炎症、８倍多い免疫細胞の浸潤、１３倍大きい視神経乳頭の損傷、および３４倍大きい構造的損傷が含まれる。予期せぬことに、ブドウ膜炎を起こしているＣ９－／－マウスは、ＥＡＵマウスと統計的に同等の病理学的結果を有することが観察された（図３）。
免疫の２４日後、ＯＣＴイメージングおよび病理組織検査により観察されるように、ＥＡＵマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ対照マウスと比較して、硝子体および脈絡膜への重度の炎症性細胞浸潤、網膜血管炎、網膜浮腫、ならびに中等度から重度の網膜ひだおよび浸潤物を示すことが観察された（図４Ａおよび図４Ｂ）。対照マウス、ＥＡＵマウスおよびＣ９－／－ＥＡＵマウスの網膜からのパラフィン包埋切片において詳細な組織学的分析を行い、Caspi, R. R., et al. (1988) J. Immunol 140, 1490-1495に記載されている基準に基づきスコアを付けた。ＥＡＵマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ対照マウスよりも少なくとも約２７倍多い浸潤物（図４Ｃ）、血管炎の増加（図４Ｄ）、および７８倍大きな光受容体損傷（図４Ｄ）を有することが観察された。Ｃ９－／－ＥＡＵマウスの組織学的スコアは、ＥＡＵマウスと比較して、浸潤が２８％少なく、光受容体損傷が３５％少なく、血管炎が３１％減少したが、統計的に有意な差は観察されなかった（図４ＢおよびＣ）。
光受容体損傷スコアは、光受容体喪失、網膜ひだおよび網膜剥離の複合スコアとして、Caspi, R. R., et al. (1988) J. Immunol 140, 1490-1495に記載された基準に基づいて計算した。同様に、浸潤スコアは、肉芽腫、出血、ＤＦ結節および浸潤物の組合せで構成された。血管炎スコアは、血管周囲炎および血管周囲のＣＤ４細胞浸潤、血栓の形成、および網膜における罹患血管系の程度を表す。
実施例１７：ＥＡＵにおけるＭＡＣ沈着の可溶性ＣＤ５９媒介性阻害
本明細書の実施例で得られたデータは、Ｃ９の遺伝的欠陥によりＣ９－／－マウスがＭＡＣを形成することができず、またインフラマソームを活性化できず、ブドウ膜炎の特徴のいくつから防御されることを示している。しかしながら、Ｃ９－／－ＥＡＵマウスの網膜は、ＥＡＵに関連する組織学的病状から防御されないことが観察された。
ＣＤ５９は、ほとんどの有核細胞の膜上にあるＧＰＩアンカー型タンパク質である。ＣＤ５９の主な機能は、事前に形成されたＣ５ｂ－８複合体へのＣ９の動員を防ぐことである。ＧＰＩアンカーシグナルが欠失され、それが分泌されて網膜全体に拡散することを可能にする短縮型ＣＤ５９を発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９）は、Cashman, S. M., et al. (2011) PLoS One 6, e19078に記載されている。
マウスにＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９を硝子体内注射し、１週間後（導入遺伝子の最適レベルを可能にするため）、本明細書の実施例に記載されているようにマウスにＥＡＵを施した。陰性対照については、マウスにＡＡＶＣＡＧＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するウイルス）を硝子体内注射した。ＥＡＵの誘導後２４日目に、両方の組のマウスからの凍結網膜切片を、Ｃ５ｂ－９抗体で染色することにより調べた。ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを硝子体内注射し、その後ＥＡＵを施したマウスでは、神経節細胞層、内網状層、および内顆粒層で導入遺伝子が発現した（図１４Ｂ）。表現型的により重度のＥＡＵのマウスでは、ＲＰＥおよび光受容体でも導入遺伝子の発現が観察された（図１４Ｂ、下段）。ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵマウスと対比して、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９を注射したＥＡＵマウスにおいてＭＡＣ沈着が約４５％少ないことが観察された（図５Ａおよび図１２）。したがって、硝子体内注射されたＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９は、ＥＡＵマウスの網膜におけるＭＡＣの形成を阻害することが観察された。
実施例１８：ＥＡＵにおけるインフラマソームの可溶性ＣＤ５９媒介性阻害
本明細書の実施例において、Ｃ９－／－ＥＡＵマウスは、ＥＡＵの対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較して、インフラマソームの活性化が有意に減少することが観察された。ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９またはＡＡＶＣＡＧＧＦＰのいずれかを事前に注射したＥＡＵマウスにおけるＮＬＲＰ３／カスパーゼ－１媒介性のＩＬ－１βの分泌を、本明細書の実施例に記載のように測定した。
ＥＬＩＳＡおよびＲＴ－ＰＣＲで測定して、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９注射ＥＡＵマウスは、ＡＡＡＶＡＧｓＣＤ５９注射ＥＡＵマウスと比較して、ＩＬ－１βタンパク質が４０％少なく、ＩＬ－１β ｍＲＮＡが７０％少ないことが観察された（図５Ｂおよび図５Ｃ）。同様に、ＮＬＲＰ３タンパク質ならびにカスパーゼ１ ｐ２０のレベルは、対照のＡＡＶＣＡＧＧＦＰ注射ＥＡＵマウスと比較して、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９注射ＥＡＵマウスで６０％減少した（図５Ｄおよび図５Ｅ）。対照のＡＡＶＣＡＧＧＦＰ注射ＥＡＵマウスと比較したＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９注射ＥＡＵマウスにおけるＡＳＣの量の実質的な違いは観察されなかった（図５Ｆ）。したがって、得られたデータは、ｓＣＤ５９が、ブドウ膜炎においてＭＡＣ沈着を阻害することによりＮＬＲＰ３媒介性ＩＬ－１β産生を阻害することを示している。
実施例１９：ＥＡＵでのＴ細胞分化におけるＭＡＣ媒介性のＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化の役割
ＣＤ４＋浸潤Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γ産生細胞であるＴｈ１およびＩＬ－１７産生細胞であるＴｈ１７へと分化した状態または未分化状態のいずれかで網膜に入る。Ｔ細胞分化におけるＭＡＣの潜在的な役割を調べるために、ＥＡＵマウスおよびＣ９－／－ＥＡＵマウスの網膜におけるＩＦＮ－γおよびＩＬ－１７のレベルをそれぞれ測定した。
ＥＬＩＳＡを使用して、対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ網膜と比較して、ＥＡＵ網膜において１０２％増加した量のＩＦＮ－γタンパク質が観察された。対照的に、Ｃ９－／－ＥＡＵ網膜では、対照のＣ５７ＢＬ／６Ｊ網膜と比較して１４％少ないＩＦＮ－γタンパク質が観察された。ＲＴ－ＰＣＲデータは、対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ網膜と比較して、ＥＡＵ網膜およびＣ９－／－ＥＡＵ網膜のＩＦＮ－γ ｍＲＮＡがそれぞれ２００倍以上および１４倍以上増加していることを示した（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。同様に、ＩＬ－１７タンパク質の発現は、対照のＣ５７ＢＬ／６Ｊ網膜と比較して、ＥＡＵ網膜で９９％多いことが観察されたが、Ｃ９－／－ＥＡＵ網膜では、ＩＬ－１７タンパク質の発現は、対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ網膜と比較して４４％だけ多いことが観察された。ＥＡＵ網膜とＣ９－／－ＥＡＵ網膜で、ＩＬ－１７ ｍＲＮＡの発現レベル間の統計的差異は観察されなかった。ＩＬ－１７ ｍＲＮＡレベルは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ網膜で検出限界を下回ったままであることが観察された（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）。これらのデータは、ＭＡＣがＥＡＵのＴ細胞分化に役割を果たすことを示している。
対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＥＡＵマウス、およびＣ９－／－ＥＡＵマウスにおいて、ＥＡＵの２４日後に、Ｔｈ１ ＣＤ４＋細胞およびＴｈ１７ ＣＤ４＋細胞のレベルを流入領域リンパ節（ＤＬＮ）で測定した。対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと比較して、より多くの数のＩＬ－１７およびＩＦＮ－γ陽性ＣＤ４＋細胞がＥＡＵマウスのＤＬＮで観察された（図１１Ａ～図１１Ｃ）。ＥＡＵマウスとＣ９－／－ＥＡＵマウスの間で、ＤＬＮにおけるＩＦＮ－γおよびＩＬ－１７陽性ＣＤ４＋細胞レベルの統計的有意差は観察されなかった（図１１Ａ～図１１Ｃ）。これらのデータは、ＭＡＣがＥＡＵの網膜におけるＴ細胞分化に重要な役割を果たすこと、およびＭＡＣがＤＬＮで重要な役割を果たしていない可能性があることを示している。
実施例２０：ＥＡＵにおけるＴ細胞分化に対する可溶性ＣＤ５９の影響
ＥＡＵに罹患しているｓＣＤ５９を発現する眼でのＴ細胞分化に対する潜在的影響を調べるために、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９注射ＥＡＵマウスおよびＡＡＶＣＡＧＧＦＰ注射ＥＡＵマウスにおける、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１７のタンパク質およびｍＲＮＡのレベルを測定した。
ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１７のタンパク質レベルは、対照のＡＡＶＣＡＧＧＦＰ注射ＥＡＵ網膜と比較して、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９注射ＥＡＵ網膜においてそれぞれ２５％以上および３５％以上有意に少ない量であった（図１３Ａおよび図１３Ｃ）。さらに、新たに単離されたＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９注射ＥＡＵ網膜におけるＩＦＮ－γおよびＩＬ－１７のｍＲＮＡレベルは、対照のＡＡＶＣＡＧＧＦＰ注射ＥＡＵ網膜と比較して、それぞれ４７％および１０％低いことが観察された。ｍＲＮＡの差異は統計的に有意であるとは観察されなかった（図１３Ｂおよび図１３Ｄ）。
実施例２１：ＥＡＵにおける網膜機能の可溶性ＣＤ５９媒介性保護
ｓＣＤ５９がＥＡＵにおいて網膜機能を保護できるかどうかを決定するために、ブドウ膜炎を起こしているＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９注射マウスまたはＡＡＶＣＡＧＧＦＰ注射マウスでＥＲＧを行った。ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９注射ＥＡＵマウスは、対照のＡＡＶＣＡＧＧＦＰ注射マウスと比較して、－２０ｄＢ、－１０ｄＢ、および０ｄＢのフラッシュ強度でそれぞれ、４５％、４９％、および５１％大きな暗順応でのａ波振幅を有することが観察された。同様に、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９注射マウスの暗順応でのｂ波振幅は、対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵの対照の眼と比較して、－２０ｄＢ、－１０ｄＢ、および０ｄＢのフラッシュ強度でそれぞれ５５％、４８％、４０％大きいことが観察された（図６）。さらに、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９注射ＥＡＵの眼における、０ｄＢおよび１ｄＢのフラッシュ強度での明順応のｂ波振幅は、対照ＡＡＶＣＡＧＧＦＰを注射したＥＡＵの対照の眼と比較して、１２％および３９％保護された（図６）。ブドウ膜炎の網膜内層（inner retina）および網膜外層(outer retina)の網膜機能の保護において、組換えｓＣＤ５９の重要な潜在的に治療的な役割が観察された。
実施例２２：ＥＡＵにおける網膜構造および病状の可溶性ＣＤ５９媒介性保護
ｓＣＤ５９が網膜構造を保護し、ブドウ膜炎に関連する病状を軽減できるかどうかを決定するために、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９注射ＥＡＵマウスまたはＡＡＶＣＡＧＧＦＰ注射ＥＡＵマウスの眼底撮像を行った。Xu, H., et al. (2008) Exp. Eye Res. 87, 319-326に記載された採点基準に基づき、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９注射ＥＡＵマウスの全体的な臨床スコアは、対照のＡＡＶＣＡＧＧＦＰ注射ＥＡＵマウスと比較して、２２％低いと決定された。全体的な臨床スコアには、ＡＡＶＣＡＧＧＦＰ注射ＥＡＵマウス比較した、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９注射ＥＡＵマウスにおける、２４％少ない炎症性浸潤物の外観、２７％少ない構造的損傷、２２％低減された血管炎および血管の炎症細胞浸潤（cuffing）、ならびに１３％少ない視神経乳頭への損傷が含まれる（図７Ａ～図７Ｆ）。ＰＢＳビヒクル対照とＡＡＶＣＡＧＧＦＰ注射ＥＡＵ網膜との間に有意差は観察されなかった。血管、浸潤、および構造的損傷の各スコアは統計的に有意に異なる（ｐ＜０．０５）ことが観察されたが、視神経乳頭スコアは統計的有意性に達しなかった（ｐ＝０．ｌ）。したがって、得られたデータは、ｓＣＤ５９の発現が、ブドウ膜炎における網膜の炎症および免疫細胞の浸潤を低減させたことを示している。
ＥＡＵの進行および重症度は、ＯＣＴスキャンで記録および観察して、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９と比較して、ＡＡＶＣＡＧＧＦＰ注射ＥＡＵマウスで進んでいることが観察された（図８Ａ）。ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９注射ＥＡＵマウスまたは対照のＡＡＶＣＡＧＧＦＰ注射ＥＡＵマウスの網膜から採取したパラフィン切片の詳細な組織学的分析を実施した。同様に、Caspi, R. R., et al. (1988) J. Immunol 140, 1490-1495に記載されている基準に基づき、ＡＡＶＣＡＧｓＣＤ５９注射ＥＡＵマウスは、対照のＡＡＶＣＡＧＧＦＰ注射ＥＡＵマウスと比較して、浸潤物が約７６％少なく、光受容体損傷が６９％少なく、さらに血管炎が７８％少ないことが観察された（図８Ｂ～図８Ｅ）。光受容体損傷および浸潤の差は統計的に有意であることが観察された（それぞれｐ＝０．０３およびｐ＝０．０１）が、血管炎スコアは統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．２）。
実施例２３：可溶性ＣＤ５９タンパク質の組成物を用いたアテローム性動脈硬化症の個体の処置およびその後の監視
個体は、内膜中膜複合体厚（ＩＭＴ）の増加を示す超音波検査に基づきアテローム性動脈硬化症と診断され、その後に個体は静脈内注入により可溶性ＣＤ５９タンパク質を含む組成物を投与される。患者は、週１回の頻度で３回の継続投与を受ける。投与の後に、超音波検査で個体を再評価し、ＩＭＴに変化がないことを示すと、個体は週１回の頻度で静脈内投与によりＣＤ５９タンパク質の追加の４回の投与を受け、その後に再評価を受ける。フォローアップ時に、ＩＭＴの厚さは許容範囲に減少しており、さらなるＣＤ５９処置は行われない。
実施例２４：可溶性ＣＤ５９タンパク質の組成物を用いたサルコイドーシスの個体の処置およびその後の監視
個体は、サルコイドーシスと一致する症状を主治医に提示し、肺のＸ線がそのような診断と一致する成長を示し、生検サンプルが採取され、健康な組織対照との比較によって活性化カスパーゼ１のレベルの上昇が特定される。次に、静脈内注入により、可溶性ＣＤ５９タンパク質を含む組成物を個体に投与する。投与の後に、個人をＸ線で再評価し、サルコイドーシスの部分的な軽減を示す。患者に可溶性ＣＤ５９タンパク質組成物を再度投与し、Ｘ線による再評価により完全奏効が示され、さらなるＣＤ５９処置は行われない。
本明細書で使用される場合、「個体」、「患者」、または「対象」という用語は、記載された組成物および方法が処置に有用である少なくとも１つの疾患を有すると診断されている、それに罹患している疑いがある、またはそれを発症するリスクがある個体を指す。ある実施形態では、個体は哺乳動物である。ある実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラマ、アルパカ、またはヤクである。ある実施形態では、個体はヒトである。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明してきたが、そのような実施形態は単なる例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。多数のバリエーション、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者に思いつくであろう。本明細書に記載されている本発明の実施形態の様々な代替物が、本発明を実施する際に使用され得ることを理解されたい。
この明細書で言及されているすべての出版物、特許出願、発行済み特許、およびその他の文書は、個々の出版物、特許出願、発行済み特許、またはその他の文書が参照によりその全体が組み込まれていると明示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる文章に含まれる定義は、本開示における定義と矛盾する場合においてのみ除外される。
最後に、本発明の好ましい実施態様を項分け記載する。
［実施態様１］
対象の炎症を起こした眼の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害する方法であって、炎症を起こした眼の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を対象に投与することを含み、前記組成物はインフラマソームの活性化を阻害し、前記対象は、該対象の炎症を起こした眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示している、方法。
［実施態様２］
前記インフラマソーム活性マーカーが、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
前記インフラマソーム活性マーカーが、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される、実施態様１に記載の方法。
［実施態様４］
ＮＡＬＰが、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である、実施態様３に記載の方法。
［実施態様５］
前記膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物の投与の後に、インフラマソーム活性マーカーを眼において測定することをさらに含む、実施態様１～４のいずれかに記載の方法。
［実施態様６］
前記対象が、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されているかまたはそれらに罹患している疑いがある、実施態様１～５のいずれかに記載の方法。
［実施態様７］
前記対象が、ブドウ膜炎と診断されているかまたはそれに罹患している疑いがある、実施態様６に記載の方法。
［実施態様８］
前記対象の炎症を起こした眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されていないまたはそれらに罹患していない個体の眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、実施態様１～７のいずれかに記載の方法。
［実施態様９］
前記対象の炎症を起こした眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、ブドウ膜炎と診断されていないまたはそれに罹患していない個体の眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、実施態様８に記載の方法。
［実施態様１０］
前記対象の炎症を起こした眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、組織学的スコアによって決定される、実施態様１～９のいずれかに記載の方法。
［実施態様１１］
炎症を起こした対象の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害する方法であって、
ａ．対象においてインフラマソーム活性マーカーを測定する；および
ｂ．インフラマソーム活性マーカーが陽性である場合に、
（ｉ）炎症を起こした対象の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；または
（ｉｉ）可溶性ＣＤ５９タンパク質
を含む組成物を前記対象に投与する
ことを含み、前記組成物はインフラマソームの活性化を阻害する、方法。
［実施態様１２］
前記インフラマソーム活性マーカーが、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される、実施態様１１に記載の方法。
［実施態様１３］
前記インフラマソーム活性マーカーが、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される、実施態様１１に記載の方法。
［実施態様１４］
ＮＡＬＰが、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である、実施態様１３に記載の方法。
［実施態様１５］
前記インフラマソーム活性マーカーが対象の眼において測定される、実施態様１１～１４のいずれかに記載の方法。
［実施態様１６］
前記膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列または可溶性ＣＤ５９タンパク質を含む組成物の投与の後に、前記対象においてインフラマソーム活性マーカーを測定することをさらに含む、実施態様１１～１５のいずれかに記載の方法。
［実施態様１７］
前記対象が、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されているかまたはそれらに罹患している疑いがある、実施態様１１～１６のいずれかに記載の方法。
［実施態様１８］
前記対象が、ブドウ膜炎と診断されているかまたはそれに罹患している疑いがある、実施態様１７に記載の方法。
［実施態様１９］
陽性のインフラマソーム活性マーカーが、アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、微小血管障害、甲状腺炎、炎症性腸疾患、臓器移植片拒絶反応、膜性腎炎、交感性眼炎、ブドウ膜炎、またはサルコイドーシスと診断されていないまたはそれらに罹患していない対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、実施態様１１～１８のいずれかに記載の方法。
［実施態様２０］
前記陽性のインフラマソーム活性マーカーが、ブドウ膜炎と診断されていない対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、実施態様１９に記載の方法。
［実施態様２１］
前記炎症を起こした対象における陽性のインフラマソーム活性マーカーが、組織学的スコアによって決定される、実施態様１１～２０のいずれかに記載の方法。
［実施態様２２］
ａ．炎症を起こした対象の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；または
ｂ．可溶性ＣＤ５９タンパク質
を含む組成物を対象に投与することにより、炎症を起こした対象の細胞においてインフラマソームの活性化を阻害する方法であって、
前記組成物はインフラマソームの活性化を阻害し、
前記対象は、炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示している、方法。
［実施態様２３］
前記インフラマソーム活性マーカーが、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される、実施態様２２に記載の方法。
［実施態様２４］
前記インフラマソーム活性マーカーが、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される、実施態様２２に記載の方法。
［実施態様２５］
ＮＡＬＰが、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である、実施態様２４に記載の方法。
［実施態様２６］
前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、炎症を起こした対象の眼におけるものである、実施態様２２～２５のいずれかに記載の方法。
［実施態様２７］
前記対象が、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されているかまたはそれらに罹患している疑いがある、実施態様２２～２６のいずれかに記載の方法。
［実施態様２８］
前記対象がブドウ膜炎と診断されているかまたはそれに罹患している疑いがある、実施態様２７に記載の方法。
［実施態様２９］
前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、微小血管障害、甲状腺炎、炎症性腸疾患、臓器移植片拒絶反応、膜性腎炎、交感性眼炎、ブドウ膜炎、またはサルコイドーシスと診断されていないまたはそれらに罹患していない対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、実施態様２２～２８のいずれかに記載の方法。
［実施態様３０］
前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、ブドウ膜炎と診断されていない対象におけるインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、実施態様２９に記載の方法。
［実施態様３１］
前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、組織学的スコアによって決定される、実施態様２２～３０のいずれかに記載の方法。
［実施態様３２］
ａ．炎症を起こした対象の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；または
ｂ．可溶性ＣＤ５９タンパク質
を含む組成物を対象に投与することにより、ブドウ膜炎に罹患している対象の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害する方法であって、前記組成物はインフラマソームの活性化を阻害する、方法。
［実施態様３３］
前記対象が、炎症を起こした対象の眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示している、実施態様３２に記載の方法。
［実施態様３４］
前記インフラマソーム活性マーカーが、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される、実施態様３３に記載の方法。
［実施態様３５］
前記インフラマソーム活性マーカーが、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される、実施態様３３に記載の方法。
［実施態様３６］
ＮＡＬＰが、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である、実施態様３５に記載の方法。
［実施態様３７］
前記対象が、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されているかまたはそれらに罹患している疑いがある、実施態様３３～３６のいずれかに記載の方法。
［実施態様３８］
前記対象がブドウ膜炎と診断されているかまたはそれに罹患している疑いがある、実施態様３７に記載の方法。
［実施態様３９］
前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、微小血管障害、甲状腺炎、炎症性腸疾患、臓器移植片拒絶反応、膜性腎炎、交感性眼炎、ブドウ膜炎、またはサルコイドーシスと診断されていないまたはそれらに罹患していない対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、実施態様３３～３８のいずれかに記載の方法。
［実施態様４０］
前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、ブドウ膜炎と診断されていない対象におけるインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、実施態様３９に記載の方法。
［実施態様４１］
前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、組織学的スコアによって決定される、実施態様３３～４０のいずれかに記載の方法。
［実施態様４２］
炎症を起こした対象の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害する方法であって、炎症を起こした対象の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を対象に投与することを含み、前記組成物はインフラマソームの活性化を阻害し、前記対象は少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示している、方法。
［実施態様４３］
前記インフラマソーム活性マーカーが、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される、実施態様４２に記載の方法。
［実施態様４４］
前記インフラマソーム活性マーカーが、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される、実施態様４２に記載の方法。
［実施態様４５］
ＮＡＬＰが、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である、実施態様４４に記載の方法。
［実施態様４６］
前記対象が、対象の眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示している、実施態様４２～４５のいずれかに記載の方法。
［実施態様４７］
前記膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物の投与の後に、炎症を起こした対象においてインフラマソーム活性マーカーを測定することをさらに含む、実施態様４２～４６のいずれかに記載の方法。
［実施態様４８］
前記対象が、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されているかまたはそれらに罹患している疑いがある、実施態様４２～４７のいずれかに記載の方法。
［実施態様４９］
前記対象がブドウ膜炎と診断されているかまたはそれに罹患している疑いがある、実施態様４８に記載の方法。
［実施態様５０］
前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されていないまたはそれらに罹患していない対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、実施態様４２～４９のいずれかに記載の方法。
［実施態様５１］
前記対象の炎症を起こした細胞における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、ブドウ膜炎と診断されていないまたはそれに罹患していない対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、実施態様５０に記載の方法。
［実施態様５２］
前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、組織学的スコアによって決定される、実施態様４２～５１のいずれかに記載の方法。

Claims (52)

  1. 対象の炎症を起こした眼の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害する方法であって、炎症を起こした眼の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を対象に投与することを含み、前記組成物はインフラマソームの活性化を阻害し、前記対象は、該対象の炎症を起こした眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示している、方法。
  2. 前記インフラマソーム活性マーカーが、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記インフラマソーム活性マーカーが、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. ＮＡＬＰが、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物の投与の後に、インフラマソーム活性マーカーを眼において測定することをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記対象が、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されているかまたはそれらに罹患している疑いがある、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記対象が、ブドウ膜炎と診断されているかまたはそれに罹患している疑いがある、請求項６に記載の方法。
  8. 前記対象の炎症を起こした眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されていないまたはそれらに罹患していない個体の眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記対象の炎症を起こした眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、ブドウ膜炎と診断されていないまたはそれに罹患していない個体の眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記対象の炎症を起こした眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、組織学的スコアによって決定される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 炎症を起こした対象の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害する方法であって、
    ａ．対象においてインフラマソーム活性マーカーを測定する；および
    ｂ．インフラマソーム活性マーカーが陽性である場合に、
    （ｉ）炎症を起こした対象の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；または
    （ｉｉ）可溶性ＣＤ５９タンパク質
    を含む組成物を前記対象に投与する
    ことを含み、前記組成物はインフラマソームの活性化を阻害する、方法。
  12. 前記インフラマソーム活性マーカーが、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記インフラマソーム活性マーカーが、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される、請求項１１に記載の方法。
  14. ＮＡＬＰが、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記インフラマソーム活性マーカーが対象の眼において測定される、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列または可溶性ＣＤ５９タンパク質を含む組成物の投与の後に、前記対象においてインフラマソーム活性マーカーを測定することをさらに含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記対象が、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されているかまたはそれらに罹患している疑いがある、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記対象が、ブドウ膜炎と診断されているかまたはそれに罹患している疑いがある、請求項１７に記載の方法。
  19. 陽性のインフラマソーム活性マーカーが、アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、微小血管障害、甲状腺炎、炎症性腸疾患、臓器移植片拒絶反応、膜性腎炎、交感性眼炎、ブドウ膜炎、またはサルコイドーシスと診断されていないまたはそれらに罹患していない対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記陽性のインフラマソーム活性マーカーが、ブドウ膜炎と診断されていない対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記炎症を起こした対象における陽性のインフラマソーム活性マーカーが、組織学的スコアによって決定される、請求項１１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. ａ．炎症を起こした対象の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；または
    ｂ．可溶性ＣＤ５９タンパク質
    を含む組成物を対象に投与することにより、炎症を起こした対象の細胞においてインフラマソームの活性化を阻害する方法であって、
    前記組成物はインフラマソームの活性化を阻害し、
    前記対象は、炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示している、方法。
  23. 前記インフラマソーム活性マーカーが、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記インフラマソーム活性マーカーが、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される、請求項２２に記載の方法。
  25. ＮＡＬＰが、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、炎症を起こした対象の眼におけるものである、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記対象が、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されているかまたはそれらに罹患している疑いがある、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記対象がブドウ膜炎と診断されているかまたはそれに罹患している疑いがある、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、微小血管障害、甲状腺炎、炎症性腸疾患、臓器移植片拒絶反応、膜性腎炎、交感性眼炎、ブドウ膜炎、またはサルコイドーシスと診断されていないまたはそれらに罹患していない対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、ブドウ膜炎と診断されていない対象におけるインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、組織学的スコアによって決定される、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. ａ．炎症を起こした対象の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列；または
    ｂ．可溶性ＣＤ５９タンパク質
    を含む組成物を対象に投与することにより、ブドウ膜炎に罹患している対象の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害する方法であって、前記組成物はインフラマソームの活性化を阻害する、方法。
  33. 前記対象が、炎症を起こした対象の眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示している、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記インフラマソーム活性マーカーが、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記インフラマソーム活性マーカーが、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される、請求項３３に記載の方法。
  36. ＮＡＬＰが、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記対象が、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されているかまたはそれらに罹患している疑いがある、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記対象がブドウ膜炎と診断されているかまたはそれに罹患している疑いがある、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、微小血管障害、甲状腺炎、炎症性腸疾患、臓器移植片拒絶反応、膜性腎炎、交感性眼炎、ブドウ膜炎、またはサルコイドーシスと診断されていないまたはそれらに罹患していない対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、ブドウ膜炎と診断されていない対象におけるインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、組織学的スコアによって決定される、請求項３３～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 炎症を起こした対象の細胞におけるインフラマソームの活性化を阻害する方法であって、炎症を起こした対象の細胞における膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を対象に投与することを含み、前記組成物はインフラマソームの活性化を阻害し、前記対象は少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示している、方法。
  43. 前記インフラマソーム活性マーカーが、カスパーゼ１、カスパーゼ５、ＩＬ－１β、ＩＬ－β１７、ＩＬ－１８、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）、ＩＦＮ－γ、Ｔｈ１ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、Ｔｈ１７ Ｔ細胞マーカーまたはサイトカイン、およびＣＤ４＋から選択される、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記インフラマソーム活性マーカーが、アポトーシス関連スペック様カードタンパク質（ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ）、またはＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質（ＮＡＬＰ）から選択される、請求項４２に記載の方法。
  45. ＮＡＬＰが、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記対象が、対象の眼における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性について陽性結果を示している、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記膜非依存性ＣＤ５９タンパク質の発現および分泌のためのプロモーターに作動可能に連結された膜非依存性ＣＤ５９タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物の投与の後に、炎症を起こした対象においてインフラマソーム活性マーカーを測定することをさらに含む、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記対象が、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されているかまたはそれらに罹患している疑いがある、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記対象がブドウ膜炎と診断されているかまたはそれに罹患している疑いがある、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼炎、慢性結膜炎、上強膜炎、角膜炎、網膜炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、翼状片強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、イールズ病、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、フォークト・小柳・原田病、交感性眼炎、またはサルコイドーシスと診断されていないまたはそれらに罹患していない対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、請求項４２～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記対象の炎症を起こした細胞における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、ブドウ膜炎と診断されていないまたはそれに罹患していない対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性と比較した、少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性の上昇である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記炎症を起こした対象における少なくとも１つのインフラマソーム活性マーカーの発現または活性についての陽性結果が、組織学的スコアによって決定される、請求項４２～５１のいずれか一項に記載の方法。

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