ES2392511T3 - Moduladores de complemento dianas sobre el receptor 2 de complemento - Google Patents

Moduladores de complemento dianas sobre el receptor 2 de complemento Download PDF

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Medical University of South Carolina Foundation
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Abstract

Una composición que comprende un constructo, en la que el constructo comprende: (a) una CR2 o un fragmento de la misma, en el que el fragmento contiene al menos los dos primeros dominios de repeticiones de consenso cortas (SCR) N-terminales de la proteína CR2; y (b) un modulador de la actividad del complemento, en el que la modulación de la actividad del complemento comprende un inhibidor del complemento o fragmento del mismo, en el que dicho inhibidor del complemento se selecciona del factor acelerador del decaimiento (DAF), CD59 humana, CD59 de ratón, Crr y , proteína cofactor de membrana (MCP), receptor 1 del complemento (CR1) y un anticuerpo anti-C5, en el que el fragmento del mismo comprende SCRs 1-4 de DAF, SCRs 2-4 de DAF, CD59 humana soluble sin su anclaje de glucofosfatidilinositol, CD59 de ratón soluble sin su anclaje de glucofosfatidilinositol, SCRs 1-5 de Crr y , SCRs 1-4 de MCP, SCRs 1-4 de CR1, SCRs 8-11 de CR1, SCRs 15-18 de CR1 o el sitio de unión C1q de CR1.

Description

Moduladores de complemento dianas sobre el receptor 2 de complemento
I. Antecedentes de la invención
El complemento es un término colectivo para una serie de proteínas sanguíneas, y es un mecanismo efector principal del sistema inmunitario. La activación del complemento y su deposición sobre estructuras diana puede conducir a la lisis celular mediada por el complemento, o puede conducir indirectamente a la destrucción celular o tisular debido a la generación de moduladores poderosos de inflamación y el reclutamiento y activación de células efectoras inmunitarias. Los productos de la activación del complemento que median la lesión tisular se generan en diversos puntos en la ruta del complemento. La activación inapropiada del complemento en tejido hospedante desempeña un papel importante en la patología de muchas enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias, y es también responsable de muchos estados mórbidos asociados con bioincompatibilidad, por ejemplo inflamación postcardiopulmonar y rechazo de transplantes. La inhibición del complemento representa una modalidad terapéutica potencial para el tratamiento de tales enfermedades y estados mórbidos mediados inmunitariamente. Se ha demostrado que las proteínas inhibidoras del complemento, que inhiben sistémicamente el complemento, son eficaces en diversos modelos animales de enfermedad (y en unos pocos ensayos clínicos), pero los inhibidores del complemento que seleccionan como diana un sitio de enfermedad y la activación del complemento ofrecen ventajas potenciales significativas con respecto a la seguridad y eficacia.
En individuos sanos, la deposición del complemento en membranas celulares hospedantes es prevenida por proteínas inhibidoras del complemento expresadas en la superficie celular. Estas proteínas inhibidoras del complemento también son expresadas en la superficie de células tumorales, a menudo en niveles elevados, y se considera que son un factor contribuyente importante a la resistencia de las células tumorales a inmunoterapia mediada por anticuerpos monoclonales (anticuerpos monoclonales que seleccionan como dianas a células tumorales y activan el complemento).
El sistema del complemento comprende una colección de alrededor de 30 proteínas, y es uno de los mecanismos efectores principales del sistema inmunitario. La cascada del complemento es activada principalmente vía las rutas clásica (habitualmente dependiente de anticuerpos) o alternativa (habitualmente independiente de anticuerpos). La activación vía cualquier ruta conduce a la generación de C3 convertasa, que es el complejo enzimático central de la cascada. C3 convertasa escinde el C3 del suero en C3a y C3b, uniéndose este último covalentemente al sitio de activación y conduciendo a la generación posterior de C3 convertasa (bucle de amplificación). El producto de activación C3b (y también C4b generado sólo vía la ruta clásica) y sus productos de ruptura son opsoninas importantes, y están implicadas en promover la lisis de células diana mediada por células (mediante fagocitos y células NK) así como el transporte y solubilización del complejo inmunitario. Los productos de activación C3/C4 y sus receptores sobre diversas células del sistema inmunitario son también importantes a la hora de modular la respuesta inmunitaria celular. Las C3 convertasas participan en la formación de C5 convertasa, un complejo que escinde C5 para producir C5a y C5b. C5a tiene propiedades proinflamatorias y quimiotácticas poderosas, y puede reclutar y activar células efectoras inmunitarias. La formación de C5b inicia la ruta del complemento terminal, dando como resultado el ensamblaje secuencial de proteínas del complemento C6, C7, C8 y (C9)n para formar el complejo de ataque a la membrana (MAC o C5b-9). La formación de MAC en una membrana celular diana puede dar como resultado la lisis celular directa, pero también puede provocar la activación celular y la expresión/liberación de diversos moduladores inflamatorios.
Hay dos clases amplias de inhibidores del complemento de la membrana; inhibidores de la ruta de activación del complemento (inhiben la formación de C3 convertasa), e inhibidores de la ruta del complemento terminal (inhiben la formación de MAC). Los inhibidores membránicos de la activación del complemento incluyen el receptor 1 del complemento (CR1), el factor acelerador del decaimiento (DAF) y la proteína cofactor de membrana (MCP). Todos ellos tienen una estructura proteica que consiste en números variables de unidades que se repiten y alrededor de 60-70 aminoácidos denominadas repeticiones de consenso cortas (SCR) que son una característica común de las proteínas de unión a C3/C4. Se han identificado los homólogos de roedores de los inhibidores de la activación del complemento humanos. La proteína de roedor Crry es un inhibidor ampliamente distribuido de la activación del complemento que funciona de forma similar tanto a DAF como MCP. Los roedores también expresan DAF y MCP, aunque parece que Crry es funcionalmente el regulador más importante de la activación del complemento en roedores. Aunque no hay homólogo de Crry encontrado en humanos, el estudio de Crry y su uso en modelos animales es clínicamente relevante.
El control en la ruta del complemento terminal y la formación de MAC en membranas celulares hospedantes se produce principalmente a través de la actividad de CD59, una glucoproteína de 20 kD ampliamente distribuida unida a las membranas plasmáticas mediante un anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI). CD59 se une a C8 y a C9 en el ensamblaje de MAC, y evita la inserción membránica.
Actualmente están bajo investigación diversos tipos de proteínas inhibidoras del complemento para la terapia de enfermedad inflamatoria y estados mórbidos asociados con bioincompatibilidad. Dos de los inhibidores mejor caracterizados terapéuticamente del complemento humano son una forma soluble del receptor 1 de complemento (sCR1) y un anticuerpo monoclonal anti-C5. Estas proteínas inhibidoras sistémicamente activas han demostrado eficacia en diversos modelos animales de enfermedad, y más recientemente en ensayos clínicos (1-5, 6:#1037). mAb anti-C5 inhibe la generación de C5a y el MAC, mientras que sCR1 es un inhibidor de la activación del complemento y también inhibe la generación de productos de activación de C3. También se ha demostrado que las formas solubles del factor acelerador del decaimiento humano (DAF) y la proteína cofactor de membrana (MCP), inhibidores membránicos de la activación del complemento, son protectoras en modelos animales de inflamación y bioincompatibilidad (7-11). CD59 es un inhibidor membránico del complemento que bloquea el ensamblaje del MAC, pero no afecta a la generación de opsoninas del complemento o C3a y C5a. Se han producido formas solubles de CD59, pero su baja actividad funcional in vitro, particularmente en presencia de suero, indica que sCD59 tendrá poca o ninguna eficacia terapéutica (12-15).
Es probable que el suministro de inhibidores del complemento a sitios de activación del complemento y a la enfermedad mejore su eficacia. Puesto que el complemento desempeña un papel importante en la defensa del hospedante y en el catabolismo del complejo inmunitario, los inhibidores del complemento dirigidos contra dianas también pueden reducir efectos secundarios potencialmente serios, particularmente con inhibición del complemento a largo plazo. Recientemente, se preparó una forma modificada de sCR1 decorado con sialil Lewis x (sLex), y se mostró que se une a células endoteliales que expresan selectina P y E. Se demostró que sCR1sLex es un compuesto terapéutico más potente que sCR1 en modelos de roedores de enfermedad inflamatoria (16, 17). En estudios de viabilidad in vitro, se demostró que las proteínas de fusión anticuerpo-DAF (18) y anticuerpo-CD59 (19) son más eficaces protegiendo células seleccionadas como dianas que células no seleccionadas como dianas frente al complemento. La dianización membránica no específica de inhibidores del complemento recombinantes también se ha logrado acoplando inhibidores a péptidos que se insertan en la membrana (20, 21).
Los fragmentos de activación de C3 son opsoninas del complemento abundantes encontradas en un sitio de activación del complemento, y sirven como ligandos para diversos receptores de C3. Uno de tales receptores, el receptor 2 del complemento (CR2), una proteína transmembránica, desempeña un papel importante en la inmunidad humoral por medio de su expresión predominantemente en células B maduras y células dendríticas foliculares (22, 23). CR2 es un miembro de la familia de proteínas de unión a C3, y consiste en 15-16 dominios de repeticiones de consenso cortas (SCR), unidades estructurales que son características de estas proteínas, estando el sitio de unión a C3 contenido en las dos SCRs N-terminales (24, 25). CR2 no es un inhibidor del complemento y no se une a C3b, a diferencia de los inhibidores de la activación del complemento ((DAF, MCP, CR1 y Crry). Los ligandos naturales para CR2 son iC3b, C3dg y C3d, fragmentos de ruptura de C3b unidos a células que se unen a los dos dominios de SCR N-terminales de CR2 (26, 27). La escisión de C3 da como resultado inicialmente la generación y deposición de C3b sobre la superficie celular activante. El fragmento C3b está implicado en la generación de complejos enzimáticos que amplifican la cascada del complemento. Sobre una superficie celular, C3b se convierte rápidamente en iC3b inactivo, particularmente cuando se deposita sobre una superficie hospedante que contiene reguladores de la activación del complemento (es decir, la mayoría de los tejidos hospedantes). Incluso en ausencia de reguladores del complemento unidos a membrana, se forman niveles sustanciales de iC3b. iC3b es digerido subsiguientemente hasta los fragmentos unidos a membrana C3dg y después C3d mediante proteasas séricas, pero este proceso es relativamente lento (28, 29). De este modo, los ligandos de C3 para CR2 tienen una vida relativamente larga una vez que se generan, y estarán presentes en concentraciones elevadas en sitios de activación del complemento.
La patente US 6.458.360 describe proteínas fusionadas recombinantes solubles que son estables en el sistema circulatorio de mamíferos, que comprenden un polipéptido que contiene un sitio de reconocimiento de una molécula diana, tal como un sitio del receptor del complemento, unido al extremo N-terminal de una cadena inmunoglobulínica.
II. Sumario de la invención
Según los fines de esta invención, como se realiza y describe ampliamente aquí, esta invención, en un aspecto, se refiere a moduladores de la actividad del complemento dirigidos a CR2. En particular, la invención proporciona una composición que comprende un constructo, en la que el constructo comprende:
(a)
un CR2 o un fragmento del mismo, en el que el fragmento contiene al menos los dos primeros dominios de SCR N-terminales de la proteína CR2; y
(b)
un modulador de la actividad del complemento, en el que el modulador de la actividad del complemento comprende un inhibidor del complemento o su fragmento, en el que dicho inhibidor del complemento se selecciona de factor acelerador del decaimiento (DAF), CD59 humana, CD59 de ratón, Crry, proteína cofactor de membrana (MCP), receptor 1 del complemento (CR1) y un anticuerpo anti-CS, en el que el fragmento del mismo comprende SCRs 1-4 de DAF, SCRs 2-4 de DAF, CD59 humana soluble sin su anclaje de glicofosfatidilinositol, CD59 de ratón soluble sin su anclaje de glicofosfatidilinositol, SCRs 1-5 de Crry, SCRs 1-4 de MCP, SCRs 1-4 de CR1, SCRs 8-11 de CR1, SCRs 15-18 de CR1 o el sitio de unión a C1q de CR1.
Las ventajas adicionales de la invención se expondrán en parte en la descripción que sigue, y en parte serán obvias a partir de la descripción, o se pueden aprender mediante la práctica de la invención. Las ventajas de la invención llevarán a cabo y se obtendrán por medio de los elementos y combinaciones señaladas particularmente en las reivindicaciones anejas. Se entenderá que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son ejemplares y explicativas solamente, y no restrictivas de la invención, según se reivindica.
III. Breve descripción de los dibujos
Los dibujos que se acompañan, que se incorporan en esta memoria descriptiva y constituyen una parte de ella, ilustran varias realizaciones de la invención y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención.
La Figura 1 muestra un diagrama de ejemplos de proteínas de fusión de CR2-inhibidor del complemento.
La Figura 2 muestra el análisis de SDS-PAGE y de transferencia Western de proteínas de fusión recombinantes purificadas e inhibidores del complemento solubles. Los geles (10% de acrilamida) se tiñeron con azul de Coomassie. Las transferencias Western se desarrollaron usando anticuerpos frente a inhibidores del complemento como el anticuerpo primario.
La Figura 3 muestra la unión de proteínas de fusión recombinantes a células CHO opsonizadas con C3. Las células CHO sensibilizadas a anticuerpos se incubaron en suero deficiente en C6, se lavaron y se incubaron con inhibidor del complemento soluble (traza negra), o proteína de fusión con CR2 en el término N (traza gris claro) o el término C (traza gris oscuro) a 20 !g/ml. La unión celular de las proteínas recombinantes se detectó mediante citometría de flujo usando mAbs anti-DAF o anti-CD59. La incubación de células CHO con PBS en lugar de inhibidor del complemento dio un perfil de fluorescencia similar como sDAF y sCD59. Representativo de 3 experimentos separados.
La Figura 4 muestra el análisis de la interacción entre las proteínas de fusión de CR2 y C3d mediante resonancia plasmónica superficial. Las líneas sólidas indican concentraciones diferentes de proteínas de fusión de CR2. Las líneas discontinuas muestran curvas que se ajustan a un modelo de unión de Langmuir 1:1.
La Figura 5 muestra la lisis mediada por la inhibición del complemento mediante proteínas de fusión recombinantes sDAF y DAF. Células CHO sensibilizadas a anticuerpos (panel a) o eritrocitos de oveja (panel b) se incubaron con proteína recombinante y suero humano al 10% (células CHO) o suero humano al 0,33% (eritrocitos). Estas concentraciones dieron como resultado aproximadamente 90% de lisis de las células sin proteger. La lisis se determinó después de una incubación durante 45 min. a 37ºC. La lisis de valor de referencia determinada incubando células en suero inactivado por calor fue menor que 5%, y se restó. Media +/- SD, n = 4.
La Figura 6 muestra la lisis mediada por la inhibición del complemento por proteínas de fusión recombinantes sCD59 y CD59. Células CHO sensibilizadas a anticuerpos (panel a) o eritrocitos de oveja (panel b) se incubaron con proteína recombinante y suero humano al 10% (células CHO) o suero humano al 0,33% (eritrocitos). Estas concentraciones dieron como resultado una lisis de aproximadamente 90% de las células sin proteger. La lisis se determinó después de una incubación durante 45 min. a 37ºC. La lisis del valor de referencia, determinada incubando células en suero inactivado con calor, fue menor que 5%, y se restó. Media +/- SD, n = 4.
La Figura 7 muestra el efecto de proteínas de fusión recombinantes sobre la adhesión de células U937. Se sensibilizaron eritrocitos de oveja con anticuerpo IgM, y se incubaron en suero deficiente en C6. Los eritrocitos opsonizados con C3 se coincubaron con células U937 en presencia de 500 nM de proteína de fusión recombinante o PBS. Tras la incubación, el número medio de células U937 unidas por eritrocito se determinó mediante microscopía. Media +/- SD, n = 3.
La Figura 8 muestra la secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos predicha de CR2-DAF humana madura. Los aminoácidos subrayados representan secuencias de ligación entre CR2 y DAF.
La Figura 9 muestra la secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos predicha de CR2-CD59 humana madura. Los aminoácidos subrayados representan secuencias de ligación entre CR2 y CD59.
La Figura 10 muestra la secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos predicha de DAF-CR2 humana madura. Los aminoácidos subrayados representan las secuencias de ligación entre DAF Y CR2.
La Figura 11 muestra la secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos predicha de CD59-CR2 humana madura. Los aminoácidos subrayados representan las secuencias de ligación entre CD59 Y CR2.
La Figura 12 muestra la dianización de proteínas de fusión que contienen CR2 a células CHO revestidas con C3. El ligando de C3 se generó en células CHO incubando células en 10% de antisuero anti-CHO y 10% de suero humano sin C6 (para evitar la formación del complejo de ataque a la membrana y la lisis celular). Las células se lavaron y se incubaron con proteína de fusión (20 ug/ml, 4ºC, 30 min.). La unión se detectó mediante análisis citométrico de flujo usando anticuerpos contra el inhibidor del complemento apropiado (DAF o CD59). Línea negra: control (sin proteína de fusión); gris claro: CR2 en el término C; gris oscuro: CR2 en el término N.
La Figura 13 muestra el análisis de la unión de CR2-DAF a C3dg mediante resonancia plasmónica de superficie.
La Figura 14 muestra el análisis de la unión de CR2-CD59 a C3dg mediante resonancia plasmónica de superficie.
La Figura 15 muestra el análisis de la unión de DAF-CR2 a C3dg mediante resonancia plasmónica de superficie.
La Figura 16 muestra el análisis de la unión de CD59-CR2 a C3dg mediante resonancia plasmónica de superficie.
La Figura 17 muestra el efecto de DAF dianizado y sin dianizar sobre la lisis de células CHO mediada por el complemento. Se sensibilizaron células CHO al complemento con antisueros anti-CHO (10% de concentración, 4ºC, 30 min.) y se incubaron subsiguientemente con 10% de suero humano normal (NHS) (37ºC, 60 min.) en presencia de concentraciones variables de proteínas inhibidoras del complemento. Entonces se determinó la lisis celular mediante ensayo de exclusión con azul de tripán. Experimento representativo que muestra media +/- SD (n = 3). Se llevaron a cabo tres experimentos separados usando diferentes preparaciones de proteínas de fusión.
La Figura 18 muestra el efecto de CD59 dianizada y no dianizada sobre la lisis de células CHO mediada por el complemento. El ensayo se llevó a cabo como se describe en la leyenda para la Figura 17. Experimento representativo que muestra media +/- SD (n = 3). Se llevaron a cabo tres experimentos separados usando diferentes preparaciones de proteínas de fusión.
La Figura 19 muestra el efecto de DAF dianizada y no dianizada sobre la hemolisis mediada por el complemento. Se sensibilizaron eritrocitos (E) de oveja con anticuerpo anti-E de oveja, y se incubaron subsiguientemente con una dilución 1/300 de NHS (37ºC, 60 min.) en presencia de concentraciones variables de proteínas inhibidoras del complemento. La lisis celular se determinó midiendo la hemoglobina liberada (absorbancia a 412 nm). Experimento representativo que muestra media +/- SD (n = 3). Se llevaron a cabo dos experimentos separados usando diferentes preparaciones de proteínas de fusión.
La Figura 20 muestra el efecto de CD59 dianizada y no dianizada sobre la hemolisis mediada por el complemento. El ensayo se llevó a cabo como se describe en la leyenda para la Figura 19. Experimento representativo que muestra media +/- SD (n = 3). Se llevaron a cabo dos experimentos separados usando diferentes preparaciones de proteínas de fusión.
La Figura 21 muestra la secuencia nucleotídica y de aminoácidos predicha de CR2-Fc de IgG1 humano humana madura. Los aminoácidos subrayados representan secuencias de ligación entre CR2 y la región Fc. El plásmido de expresión contiene la región Fc genómica (bisagra-intrón-CH2-intrón-CH3).
La Figura 22 muestra el análisis de SDS-PAGE de la proteína de fusión CR2-Fc. CR2-Fc purificada se hizo pasar en condiciones no reductoras (línea 1) o reductoras (línea 2). El gel se tiñó mediante azul de Coomassie (para MW de marcadores en línea 3, véase la Figura 2).
La Figura 23 muestra la dianización de CR2-Fc a células CHO revestidas con C3. El ligando de C3 se generó como se describió (leyenda para la Figura 12). Las células se lavaron y se incubaron con CR2-Fc (20 ug/ml, 4ºC, 30 min.). La unión se detectó mediante análisis citométrico de flujo usando anticuerpos frente a Fc humano conjugado a FITC. El panel superior muestra los resultados de la incubación de CR2-Fc con células CHO revestidas con C3, y el panel inferior muestra los resultados de la incubación de CR2-Fc con células CHO de control.
La Figura 24 muestra el sensograma de resonancia plasmónica de superficie que muestra la unión de CR2-Fc a ligando de C3d inmovilizado sobre un chip.
La Figura 25 muestra la biodistribución de 125I-CR2-DAF y 125I-sDAF en ratones NZB/W F1 de 34 semanas. Se inyectaron proteínas radiomarcadas en la vena de la cola, y se determinó la biodistribución del radiomarcador después de 24 h. Cada proteína se inyectó en 2 ratones.
La Figura 26 muestra la formación de imágenes de CR2-DAF unida a glomérulos de ratones MRL/Ipr de 24 semanas. La unión glomerular de CD2-DAF (a) y sDAF (b) se analizó 24 horas después de la inyección de cada proteína en la vena de la cola. La figura muestra la tinción de inmunofluorescencia de secciones del riñón.
La Figura 27 muestra el constructo CD59-Crry de anticuerpo monocatenario. La figura muestra que el constructo comprende una cadena ligera variable (VL) y una cadena pesada variable (VH) de mAb K9/9. El constructo se preparó en el vector de expresión de levadura pPICZalph (Invitrogen).
La Figura 28 muestra la biodistribución de inhibidores del complemento y Ab monocatenario K9/9 en ratas. Las proteínas recombinantes yodadas se administraron 4 días después del tratamiento con PAN, y la radioactividad en los órganos se midió 48 h más tarde.
La Figura 29 muestra el aclaramiento de creatinina en ratas tratadas con PAN y que reciben la terapia indicada (n = 4, +/-SD).
La Figura 30 muestra la corteza renal teñida con PAS. La Figura 30A muestra el control sin PAN, la Figura 30B: tratamiento de PAN con PBS, la Figura 30C: tratamiento de PAN con Crry K9/9 dianizado, y la Figura 30D: tratamiento de PAN con sCrry.
La Figura 31 muestra la actividad inhibidora del complemento en suero tras la administración de proteínas recombinantes. Medida mediante lisis de eritrocitos de oveja sensibilizados. Se muestra el porcentaje de actividad inhibidora con relación a suero procedente de ratas de control.
IV. Descripción detallada
La presente invención se puede entender más fácilmente mediante referencia a la siguiente descripción detallada de realizaciones preferidas de la invención y los Ejemplos incluidos allí, y a las Figuras y su descripción previa y siguiente.
A. Definiciones
Como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones anejas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes plurales excepto que el contexto indique claramente otra cosa. De este modo, por ejemplo, la referencia a “un vehículo farmacéutico” incluye mezclas de dos o más de tales vehículos, y similares.
Los intervalos se pueden expresar aquí como de “alrededor de” un valor particular, y/o hasta “alrededor de” otro valor particular. Cuando se expresa tal intervalo, otra realización incluye desde el un valor particular y/o hasta el otro valor particular. De forma similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante uso del antecedente “alrededor de”, se entenderá que el valor particular forma otra realización. Se entenderá además que los puntos finales de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro punto final, como independientemente del otro punto final.
En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a un número de términos que se han de definir por tener los siguientes significados:
“Opcional” u “opcionalmente” significa que el suceso o circunstancia descrito subsiguientemente puede ocurrir o no, y que la descripción incluye casos en los que dicho suceso o circunstancia se produce y casos en los que no.
“Tratamiento” o “tratar” significa administrar una composición a un sujeto con una afección, en el que la afección puede ser una enfermedad patógena, enfermedad autoinmunitaria, cáncer o afección inflamatoria. El efecto de la administración de la composición al sujeto puede tener el efecto de, pero no se limita a, reducir los síntomas de la afección, una reducción en la gravedad de la afección, o la eliminación completa de la afección.
Aquí, “inhibición” o “inhibe” significa reducir la actividad. Se entiende que la inhibición puede significar una reducción ligera en la actividad hasta la eliminación completa de toda la actividad. Un “inhibidor” puede ser cualquiera que reduzca la actividad.
Aquí, “activación” o “activa” significa que incrementa la actividad. Se entiende que la activación puede significar un incremento en la actividad existente, así como la inducción de nueva actividad. Un “activador” puede ser cualquiera que incremente la actividad.
B. Inhibición del complemento y constructos activantes
Se describen composiciones que comprenden un constructo, en las que el constructo comprende CR2 y un modulador de la actividad del complemento.
CR2 consiste en una porción extracelular que consiste en 15 ó 16 unidades que se repiten conocidas como repeticiones de consenso cortas (SCRs). Los aminoácidos 1-20 comprenden el péptido líder, los aminoácidos 23-82 comprenden SCR1, los aminoácidos 91-146 comprenden SCR2, los aminoácidos 154-210 comprenden SCR3, los aminoácidos 215-271 comprenden SCR4. El sitio activo (sitio de unión a C3dg) está situado en SCR 1-2 (las 2 primeras SCRs N-terminales). Las unidades SCR están separadas por secuencias cortas de longitud variable que sirven como espaciadores. Se entiende que se puede usar cualquier número de SCRs que contienen el sitio activo. En una realización, el constructo contiene las 4 unidades SCR N-terminales. En otra realización, el constructo incluye las dos primeras SCRs N-terminales. En otra realización, el constructo incluye las tres primeras SCRs Nterminales.
Se entiende que existe variación de especie y de cepa para los péptidos, polipéptidos, proteínas, fragmentos proteicos y composiciones descritos. Se describen específicamente todas las variaciones de especies y de cepas para los péptidos, polipéptidos, proteínas, fragmentos proteicos y composiciones descritos.
También se describen composiciones en las que el constructo es una proteína de fusión.
Aquí, una “proteína de fusión” significa dos o más componentes que comprenden péptidos, polipéptidos o proteínas operablemente enlazados. CR2 se puede enlazar a inhibidores o activadores del complemento mediante cualquier secuencia de ligación de aminoácidos. Los ejemplos de ligadores son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de ligadores pueden incluir, pero sin limitarse a, (Gly4Ser)3 (G4S), (Gly3Ser)4 (G3S), SerGly4, y SerGly4SerGly4. Las secuencias de ligación también pueden consistir en secuencias de ligación “naturales” encontradas entre las unidades SCR con proteínas humanas (o de ratón), por ejemplo VSVFPLE, la secuencia de ligación entre SCR 2 y 3 de CR2 humano. Las proteínas de fusión también se pueden construir sin secuencias de ligación.
También se describen composiciones de la invención, en las que la proteína de fusión inhibe el complemento.
También se describen composiciones de la invención, en las que el modulador de la actividad del complemento comprende un inhibidor del complemento.
También se describen composiciones de la invención, por ejemplo, en las que el inhibidor del complemento es el factor acelerador del decaimiento (DAF) SEC ID NO: 1 (nucleótido) y SEC ID NO: 2 (aminoácido). Por ejemplo, el DAF puede ser DAF humano soluble que comprende los cuatro dominios de SCR sin anclaje glicofosfatidílico y región rica en serina-treonina. El DAF también puede ser DAF humano soluble que comprende los cuatro dominios de SCR y la región rica en serina-treonina pero sin el anclaje de glicofosfatidilo.
La región extracelular de DAF consiste en 4 unidades SCR en el término N seguido de una región rica en serina/treonina. Los aminoácidos 1-34 comprenden el péptido líder, los aminoácidos 35-95 comprenden SCR1, los aminoácidos 97-159 comprenden SCR2, los aminoácidos 162-221 comprenden SCR3, los aminoácidos 224-284 comprenden SCR4, y los aminoácidos 287-356 comprenden la región S/T. En una realización de la invención, la composición de la invención comprende todas las 4 unidades SCR. En otra realización de la invención, la composición comprende SCR2-4 de DAF.
Se describen composiciones de la invención, en las que el inhibidor del complemento comprende una proteína de fusión entre CD59 y otro inhibidor del complemento seleccionado del grupo que consiste en DAF, MCP, Crry y CR1. También se describen composiciones de la invención, en las que el inhibidor del complemento es una proteína de fusión de dos o más inhibidores del complemento.
También se describen composiciones de la invención, en las que la proteína de fusión comprende CR2-DAF (SEC ID NO: 6). También se describen composiciones de la invención en las que la proteína de fusión está codificada por un nucleótido que comprende SEC ID NO: 5.
También se describen composiciones de la invención, en las que la proteína de fusión comprende DAF-CR2 (SEC ID NO: 10). También se describen composiciones de la invención en las que la proteína de fusión está codificada por un nucleótido que comprende SEC ID NO: 9.
También se describen composiciones de la invención, en las que el inhibidor del complemento es CD59 humana (SEC ID NO: 3 (nucleótido) y SEC ID NO: 4 (aminoácido)). La CD59 humana puede ser CD59 humana soluble que comprende la proteína madura sin anclaje glicofosfatidílico.
También se describen composiciones de la invención, en las que la proteína de fusión comprende CR2-CD59 humana (SEC ID NO: 8). También se describen composiciones de la invención en las que la proteína de fusión está codificada por un nucleótido que comprende SEC ID NO: 7.
También se describen composiciones de la invención, en las que la proteína de fusión comprende CD59 humana-CR2 (SEC ID NO: 12). También se describen composiciones de la invención en las que la proteína de fusión está codificada por un nucleótido que comprende SEC ID NO: 10.
También se describen composiciones de la invención, en las que el inhibidor del complemento es CR1 (SEC ID NO: 13 (nucleótido) y SEC ID NO: 14 (aminoácido)). La región extracelular de CR1 puede comprender 30 unidades SCR. Es una realización de la invención que la composición pueda comprender toda la región extracelular de CR1. En otra realización de la invención, la composición comprende [el] un sitio activo de CR1. Los sitios activos de CR1 son los aminoácidos 1-46 que comprenden el péptido líder, los aminoácidos 47-300 que comprenden SCR-4 (sitio de unión a C4b, menor afinidad por C3b), los aminoácidos 497-750 que comprenden SCR8-11 (sitio de unión a C3b, menor afinidad por C4b), los aminoácidos 947-1200 que comprenden SCR15-18 (sitio de unión a C3b, menor afinidad por C4b), y los aminoácidos 1400-1851 que comprenden el sitio de unión a C1q. En una realización adicional de la invención, la composición de la invención puede comprender [una] cualquiera combinación o todos los sitios activos de CR1.
También se describen composiciones de la invención, en las que el inhibidor del complemento comprende los sitios activos de CR1, y en las que [el] un sitio activo comprende además un péptido líder que comprende los aminoácidos 6-46, los aminoácidos 47-300 que comprenden SCR-4 (sitio de unión a C4b, menor afinidad por C3b), los aminoácidos 497-750 que comprenden SCR8-11 (sitio de unión C3b, menor afinidad por C4b), los aminoácidos 9471200 que comprenden SCR15-18 (sitio de unión a C3b, menor afinidad por C4b), y los aminoácidos 1400-1851 que comprenden el sitio de unión a C1q. En una realización adicional de la invención, la composición de la invención puede comprender cualquier [una] combinación o todos los sitios activos de CR1.
También se describen composiciones de la invención, en las que el inhibidor del complemento es MCP (SEC ID NO: 15 (nucleótido) y SEC ID NO: 16 (aminoácido)). La región extracelular consiste en 4 unidades SCR seguidas de la región ser/thr. Los aminoácidos 1-34 comprenden el péptido líder, los aminoácidos 35-95 comprenden SCR1, los aminoácidos 96-158 comprenden SCR2, los aminoácidos 159-224 comprenden SCR3, los aminoácidos 225-285 comprenden SCR4, y los aminoácidos 286-314 comprenden la región S/T.
También se describen composiciones de la invención, en las que el inhibidor del complemento es Crry (SEC ID NO: 17). Crry puede ser Crry de ratón soluble que comprende los 5 dominios SCR N-terminales sin la región transmembránica.
También se describen composiciones de la invención, en las que el inhibidor del complemento es CD59 murino. El CD59 murino puede ser CD59 murino soluble que comprende la proteína madura sin anclaje glicofosfatidílico.
Se describen composiciones de la invención, en las que la proteína de fusión activa el complemento.
Se describen composiciones de la invención, en las que el constructo está en un vector.
Se describen células que comprenden el vector de la invención.
Los grupos reactivos que se pueden dianizar usando un agente de reticulación incluyen aminas primarias, sulfhidrilos, carbonilos, hidratos de carbono y ácidos carboxílicos, o se pueden añadir a las proteínas grupos activos. Los ejemplos de ligadores químicos son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir, pero no se limitan a, bismaleimidohexano, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, agentes de reticulación de ésteres de NHSmaleimida tales como MBS, Sulfo-MBS, SMPB, Sulfo-SMPB, GMBS, Sulfo-GMBS, EMCS, Sulfo-EMCS; agentes de reticulación de imidoésteres tales como DMA, DMP, DMS, DTBP; EDC [hidrocloruro de 1-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida], [2-(4-hidroxifenil)etil]-4-N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxamida, DTME: ditiobismaleimidoetano, DMA (adipimidato de dimetil·2 HCl), DMP (pimelimidato de dimetilo·2 HCl), DMS (suberimidato de dimetilo·2 HCl), DTBP (3,3’-ditiobispropionimidato de dimetilo·2 HCl), MBS, (éster de m-maleimidobenzoil-Nhidroxisuccinimida), Sulfo-MBS (éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida), Sulfo-SMPB (4-[pmaleimidofenil]butirato de sulfosuccinimidilo), GMBS (éster de N[·-maleimidobutiriloxi]succinimida), EMCS (éster de N-[ -maleimidocaproiloxi]succinimida), y Sulfo-EMCS (éster de N-[·-maleimidocaproiloxi]sulfosuccinimida).
C. Métodos para usar las composiciones
Actualmente están bajo investigación diversos tipos de proteínas inhibidoras del complemento para terapia de enfermedad inflamatoria y estados mórbidos asociados con bioincompatibilidad. Dos de los inhibidores mejor caracterizados terapéuticamente del complemento humano son una forma soluble del receptor 1 del complemento (sCR1) y un anticuerpo monoclonal anti-C5. Estas proteínas inhibidoras sistémicamente activas han mostrado eficacia en diversos modelos animales de enfermedad, y más recientemente en ensayos clínicos (1-5, 6:#1037 que incluye enseñanzas sobre la eficacia in vivo y resultados clínicos).
La composición de la invención se puede usar en métodos para tratar una afección afectada por el complemento en un sujeto. Se entiende que la administración de la composición del sujeto puede tener el efecto de, pero no se limita a, reducir los síntomas de la afección, una reducción en la gravedad de la afección, o la eliminación completa de la afección.
1. Métodos para usar las composiciones para inhibir el complemento
Se describe la composición de la invención para uso en métodos para tratar una afección afectada por el complemento en un sujeto, en la que la composición mostrará actividad del complemento. Se entiende que el efecto de la administración de la composición al sujeto puede tener el efecto de, pero no se limita a, reducir los síntomas de la afección, una reducción en la gravedad de la afección, o la eliminación completa de la afección.
Se describe la composición de la invención para uso en métodos para reducir daño mediado por el complemento, composición la cual inhibe el complemento.
La afección tratada puede ser una afección inflamatoria. La afección inflamatoria se puede seleccionar del grupo que consiste en asma, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, artritis reactiva, espondilartritis, vasculitis sistémica, diabetes mellitus dependiente de insulina, esclerosis múltiple, encefalomielitis alérgica experimental, síndrome de Sjögren, enfermedad de hospedante frente a injerto, enfermedad inflamatoria del intestino, incluyendo enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, lesión por reperfusión isquémica, infarto de miocardio, enfermedad de Alzheimer, rechazo de transplantes (alogénico y xenogénico); trauma térmico; cualquier inflamación inducida por complejo inmunitario, glomerulonefritis, miastenia grave, lupus cerebral, síndrome de Guillain-Barre, vasculitis, esclerosis sistémica, anafilaxis, reacciones al catéter, ateroma, infertilidad, tiroiditis, ARDS, síndrome de postbypass, hemodiálisis, reumatoide juvenil, síndrome de Behcet, anemia hemolítica, pénfigo, penfigoide ampolloso, apoplejía, aterosclerosis, y esclerodermia.
La afección puede ser una infección vírica. La infección vírica se puede seleccionar de la lista de virus que consiste en virus de la gripe A, virus de la gripe B, virus sincitial respiratorio, virus del Dengue, virus de fiebre amarilla, virus del Ébola, virus de Marburg, virus de la fiebre de Lassa, virus de la encefalitis equina oriental, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de St. Louis, virus de la fiebre del Valle de Murray, virus del Nilo occidental, virus de la fiebre del Valle del Rift, rotavirus A, rotavirus B, rotavirus C, virus de Sindbis, Hantavirus.
La afección puede ser una respuesta inflamatoria a un vector vírico. El vector vírico se puede seleccionar de la lista de virus que consiste en adenovirus, virus de la vacuna, virus adenoasociado, virus Ankara de la vacuna modificado, y citomegalovirus. Se entiende que se pueden usar otros vectores víricos para el suministro de la vacuna. Se describen específicamente todos y cada uno de los vectores víricos conocidos en la técnica.
Se entiende en la técnica que Candida expresa una proteína semejante a CR3 que tiene propiedades de unión similares como CR2. La proteína semejante a CR3 parece que está implicada en la patogénesis. Por lo tanto, una realización de la invención es el tratamiento de un sujeto con una infección fúngica, en el que el tratamiento bloquea la función de “CR3” fúngica así como inhibe el complemento, que comprende administrar a un sujeto la composición de la invención.
Se describen usos de la invención, en los que el inhibidor del complemento pueden potenciar el resultado de la terapia a base de apoptosis (por ejemplo, terapia génica con adenovirus que expresa el ligando Fas).
La apoptosis que se produce durante el desarrollo normal no es inflamatoria, y está implicada en la inducción de tolerancia inmunológica. Aunque la muerte celular apoptótica puede ser inflamatoria dependiendo de cómo se active y en qué tipos celulares (por ejemplo, agentes terapéuticos que ligan Fas son capaces de inducir inflamación), la muerte celular necrótica da como resultado una respuesta inflamatoria sostenida y poderosa mediada por contenidos celulares liberados y por citocinas proinflamatorias liberadas por fagocitos estimulados. Las células apoptóticas y las vesículas normalmente son aclaradas por fagocitos, evitando así las consecuencias proinflamatorias de la lisis celular. En este contexto, se ha demostrado que las células apoptóticas y los cuerpos apoptóticos fijan directamente el complemento, y que el complemento puede sostener una respuesta antiinflamatoria debido a la opsonización y fagocitosis potenciada de las células apoptóticas.
La inflamación está implicada en el reclutamiento no específico de células inmunitarias que puede influir en las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. La modulación de la activación del complemento durante la terapia tumoral a base de apoptosis para inhibir la captación fagocítica de células/cuerpos apoptóticos potencia la respuesta inmunitaria inflamatoria/innata en el entorno del tumor. Además, las células apoptóticas pueden ser una fuente de autoantígenos inmunógenos y cuerpos apoptóticos sin aclarar que da como resultado la autoinmunización. Además de crear un entorno inmunoestimulante mejorado, la modulación del complemento en un sitio en el que se ha inducido a las células tumorales a sufrir apoptosis aumenta o dispara adicionalmente la inmunidad específica frente a un tumor al cual el hospedante es normalmente tolerante.
Las composiciones descritas de la invención pueden actuar como antagonistas de CR2 y CR3. La actividad del complemento se puede inhibir vía la inhibición de CR2, que comprende administrar la composición de la invención a un sujeto. La actividad del complemento se puede inhibir vía la inhibición de CR3, que comprende administrar la composición de la invención a un sujeto. Puesto que un antagonista de CR2 puede modular la respuesta inmunitaria, un antagonista de CR3 puede tener un segundo mecanismo antiinflamatorio de acción puesto que CR3 es integrina que se une a ICAM1 endotelial. ICAM1 es expresado en sitios de inflamación, y está implicado en adhesión leucocitaria y diapedesis. Además, la expresión de ICAM1 está aumentada por productos de activación del complemento.
3. Métodos para usar las composiciones como herramientas de investigación
Las composiciones descritas se pueden usar en una variedad de formas como herramientas de investigación. Por ejemplo, las composiciones descritas se pueden usar para estudiar inhibidores de la activación del complemento.
Las composiciones descritas se pueden usar como herramientas de diagnóstico relacionadas con enfermedades asociadas con la activación del complemento, tales como cáncer, infecciones víricas, infecciones bacterianas, infecciones parasitarias, e infecciones fúngicas. Las proteínas de fusión con CR2 seleccionarán como diana un sitio de activación del complemento, y una proteína de fusión con CR2 marcada puede diagnosticar afecciones asociadas con la activación del complemento. Por ejemplo, un anticuerpo reactivo al tumor activaría el complemento sobre células tumorales, que entonces podrían seleccionar como diana a CR2. La CR2-Fc marcada podría amplificar entonces la señal tras la dianización del anticuerpo.
D. Composiciones
Se describen componentes a usar para preparar las composiciones descritas, así como las propias composiciones a usar en los métodos descritos aquí. Estos y otros materiales se describen aquí, y se entiende que cuando se describen composiciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales, que aunque puede que no se haga explícitamente referencia específica a cada una de las diversas combinaciones y permutaciones individuales y colectivas de estos compuestos, cada uno se contempla y se describe específicamente aquí. Por ejemplo, si se describe una CR2, DAF, CD59, CR1, MCP, Crry, particular, y/o se describe y se discute una combinación específica de los mismos, y/o se discute un número de modificaciones que se pueden hacer a un número de moléculas que incluyen CR2, DAF, CD59, CR1, MCP, Crry, y/o sus combinaciones, se contempla específicamente que todas y cada una de las combinaciones y permutaciones de CR2, DAF, CD59, CR1, MCP, Crry, o su combinación, y las modificaciones que son posibles, excepto que se indique específicamente lo contrario. De este modo, si se describe una clase de moléculas A, B y C, así como una clase de moléculas D, E y F, y se describe un ejemplo de una molécula de combinación A-D, entonces incluso si cada uno no está citado individualmente, cada uno está contemplado individual y colectivamente considerándose descritas las combinaciones A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E, y C-F. Igualmente, también se describe cualquier subconjunto o combinación. De este modo, por ejemplo, el subgrupo de A-E, B-F y C-E se consideraría descrito. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta solicitud, incluyendo, pero sin limitarse a, etapas en los métodos para obtener y usar las composiciones descritas. De este modo, si hay una variedad de etapas adicionales que se pueden llevar a cabo, se entiende que cada una de estas etapas adicionales se puede llevar a cabo con cualquier realización específica o combinación de realizaciones de los métodos descritos.
1. Similitudes de secuencias
Se entiende que, como se explica aquí, el uso de los términos homología e identidad significa lo mismo que similitud. De este modo, por ejemplo, si se usa el uso de la palabra homología entre dos secuencias no naturales, se entiende que no está indicando necesariamente una relación evolutiva entre estas dos secuencias, sino más bien está mirando las similitudes o relaciones entre sus secuencias de ácidos nucleicos. Muchos de los métodos para determinar la homología entre dos moléculas evolutivamente relacionadas se aplican de forma habitual a cualquiera de dos o más ácidos nucleicos o proteínas con el fin de medir la similitud de secuencias independientemente de si están evolutivamente relacionadas o no.
En general, se entiende que una manera para definir cualesquiera variantes y derivados conocidos, o aquellos que puedan surgir, de los genes y proteínas descritos aquí, es definiendo las variantes y derivados en términos de homología con secuencias conocidas específicas. Esta identidad de secuencias particulares descritas aquí también se explica en cualquier otra parte aquí. Por ejemplo, SEC ID NO: 25 expone una secuencia particular de una CR2, y SEC ID NO: 26 expone una secuencia particular de la proteína codificada por SEC ID NO: 25, una proteína CR2. Se describen específicamente variantes de estos y de otros genes y proteínas descritos aquí que tienen al menos una homología del 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por ciento con la secuencia señalada. Los expertos en la técnica entenderán fácilmente cómo determinar la homología de dos proteínas o ácidos nucleicos, tales como genes. Por ejemplo, la homología se puede calcular después de alinear las dos secuencias de manera que la homología esté en su nivel más elevado.
Otra manera de calcular la homología se puede llevar a cabo mediante algoritmos publicados. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación se puede llevar a cabo mediante algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda de similitud mediante el método de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.
Los mismos tipos de homología se pueden obtener para ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante los algoritmos descritos en Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306,1989 para al menos material relacionado con alineamiento de ácidos nucleicos. Se entiende que se puede usar típicamente cualquiera de los métodos, y que en ciertos casos los resultados de estos métodos pueden diferir, pero el experto entiende que, si se encuentra identidad con al menos uno de estos métodos, se podría afirmar que las secuencias tienen la identidad señalada, y se describirían aquí.
Por ejemplo, como se usa aquí, una secuencia citada por tener un porcentaje de homología particular con otra secuencia se refiere a secuencias que tienen la homología citada según se calcula mediante uno cualquiera o más de los métodos de cálculo descritos anteriormente. Por ejemplo, una primera secuencia tiene 80 por ciento de homología, como se define aquí, con una segunda secuencia si la primera secuencia se calcula que tiene 80 por ciento de homología con la segunda secuencia usando el método de cálculo de Zuker, incluso si la primera secuencia no tiene 80 por ciento de homología con la segunda secuencia según se calcula mediante cualquiera de los otros métodos de cálculo. Como otro ejemplo, una primera secuencia tiene 80 por ciento de homología, como se define aquí, con una segunda secuencia si se calcula que la primera secuencia tiene un 80 por ciento de homología con la secunda secuencia usando tanto el método de cálculo de Zuker como el método de cálculo de Pearson y Lipman, incluso si la primera secuencia no tiene 80 por ciento de homología con la segunda secuencia según se calcula mediante el método de cálculo de Smith y Waterman, el método de cálculo de Needleman y Wunsch, el método de cálculo de Jaeger, o cualquiera de los otros métodos de cálculo. Según todavía otro ejemplo, una primera secuencia tiene 80 por ciento de homología, como se define aquí, con una segunda secuencia si se calcula que la primera secuencia tiene 80 por ciento de homología con la segunda secuencia usando cada uno de los métodos de cálculo (aunque, en la práctica, los diferentes métodos de cálculo darán a menudo como resultados porcentajes de homología calculados diferentes).
2. Ácidos nucleicos
Hay una variedad de moléculas descritas aquí que se basan en ácidos nucleicos, incluyendo por ejemplo los ácidos nucleicos que codifican, por ejemplo, CR2, DAF, CD59, CR1, MCP, Crry, CR2-DAF, DAF-CR2, CR2-CD59, CD59-CR2, CR2-CR1, CR1-CR2, CR2-MCP, MCP-CR2, CR2-Crry, Crry-CR2, CR2-anti-C5, así como diversos ácidos nucleicos funcionales. Los ácidos nucleicos descritos están formados, por ejemplo, de nucleótidos, análogos nucleotídicos, o sustitutos nucleotídicos. Se explican aquí ejemplos no limitantes de estas y otras moléculas. Por ejemplo, se entiende que cuando un vector es expresado en una célula, el ARNm expresado estará formado típicamente por A, C, G y U. Igualmente, se entiende que, por ejemplo, si se introduce una molécula antisentido en una célula o entorno celular mediante, por ejemplo, suministro exógeno, es ventajoso que la molécula antisentido esté formada por análogos nucleotídicos que reduzcan la degradación de la molécula antisentido en el entorno celular.
a) Nucleótidos y moléculas relacionadas
Un nucleótido es una molécula que contiene un resto de base, un resto de azúcar y un resto de fosfato. Los nucleótidos se pueden enlazar juntos a través de sus restos de fosfato y sus restos de azúcar, creando un enlazamiento internucleosídico. El resto de base de un nucleótido puede ser adenin-9-ilo (A), citosin-1-ilo (C), guanin-9-ilo (G), uracil-1-ilo (U), y timidin-1-ilo (T). El resto de azúcar de un nucleótido es una ribosa o una desoxirribosa. El resto de fosfato de un nucleótido es fosfato pentavalente. Un ejemplo no limitante de nucleótido sería 3’-AMP (monofosfato de 3’-adenosina) o 5’-GMP (monofosfato de 5’-guanosina).
Un análogo nucleotídico es un nucleótido que contiene algún tipo de modificación ya sea en los restos de base, de azúcar o de fosfato. Las modificaciones al resto de base incluirían modificaciones naturales o sintéticas de A, C, G, y T/U, así como bases purínicas o pirimidínicas diferentes, tales como uracil-5-ilo (.psi.), hipoxantin-9-ilo (I), y 2aminoadenin-9-ilo. Una base modificada incluye, pero no se limita a, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8tioalquil, 8-hidroxil y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, uracilos y citosinas 5-halo particularmente 5-bromo, 5trifluorometilo y otros uracilos y citocinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Las modificaciones de base adicionales se pueden encontrar, por ejemplo, en la patente U.S. nº 3.687.808, Englisch et al., Angewandte Chemie, Edición International, 1991, 30, 613, y Sanghvi, Y. S., Capítulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B. ed., CRC Press, 1993. Ciertos análogos nucleotídicos, tales como pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5propiniluracilo y 5-propinilcitosina. 5-metilcitosina pueden incrementar la estabilidad de la formación del dúplex. A menudo, las modificaciones de base se pueden combinar, por ejemplo, con una modificación de azúcar, tal como 2’O-metoxietilo, para lograr propiedades únicas tales como estabilidad aumentada del dúplex. Hay numerosas patentes de los Estados Unidos, tales como 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121. 5.596.091; 5.614.617; y 5.681.941, que detallan y describen un intervalo de modificaciones de base.
Los análogos nucleotídicos también pueden incluir modificaciones del resto de azúcar. Las modificaciones al resto de azúcar incluirían modificaciones naturales de la ribosa y desoxirribosa, así como modificaciones sintéticas. Las modificaciones de azúcar incluyen, pero no se limitan a, las siguientes modificaciones en la posición 2’: OH; F; O-, S, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, en las que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo de C1 a C10, o alquenilo de C2 a C10 y alquinilo sustituidos o no sustituidos. Las modificaciones de azúcar en 2’ también incluyen, pero no se limitan a, -O[(CH2)n O]m CH3, -O(CH2), OCH3, -O(CH2), NH2, -O(CH2)n CH3, -O(CH2)n -ONH2, y -O(CH2)nON[(CH2)n CHO3)]2, en los que n y m son de 1 a alrededor de 10.
Otras modificaciones en la posición 2’ incluyen, pero no se limitan a: alquilo inferior de C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. También se pueden hacer modificaciones similares en otras posiciones en el azúcar, particularmente en la posición 3’ del azúcar en el nucleótido 3’ terminal o en oligonucleótidos enlazados 2’-5’ y en la posición 5’ del nucleótido 5’ terminal. Los azúcares modificados también incluirían aquellos que contienen modificaciones en el oxígeno del anillo que forma un puente, tales como CH2 y S. Los análogos de azúcar nucleotídicos también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos ciclobutílicos en lugar del azúcar pentofuranosilo. Hay numerosas patentes de los Estados Unidos que enseñan la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas, tales como 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920.
Los análogos nucleotídicos también se pueden modificar en el resto de fosfato. Los restos de fosfato modificados incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se pueden modificar de manera que el enlace entre dos nucleótidos contiene un fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosfotriéster, aminoalquilfosfotriéster, metil y otros alquilfosfonatos, incluyendo 3’-alquilenfosfonato y fosfatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos, incluyendo 3’aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, y boranofosfatos. Se entiende que este enlace de fosfato o de fosfato modificado entre dos nucleótidos puede ser a través de un enlace 3’-5’ o un enlace 2’-5’, y el enlace puede contener polaridad invertida tal como 3’-5’ a 5’-3’ o 2’-5’ a 5’-2’. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácidos libres. Numerosas patentes de los Estados Unidos enseñan cómo obtener y usar nucleótidos que contienen fosfatos modificados, e incluyen pero no se limitan a 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; y 5.625.050.
Se entenderá que los análogos nucleotídicos necesitan contener solamente una única modificación, pero también pueden contener múltiples modificaciones en uno de los restos o entre diferentes restos.
Los sustitutos nucleotídicos son moléculas que tienen propiedades funcionales similares a nucleótidos, pero que no contienen resto de fosfato, tal como un ácido nucleico peptídico (PNA). Los sustitutos nucleotídicos o moléculas que reconocerán ácidos nucleicos en una manera de Watson-Crick o Hoogsteen, pero que están enlazados juntos a través de un resto distinto del resto de fosfato. Los sustitutos nucleotídicos son capaces de conformarse en una estructura de tipo de doble hélice cuando interactúan con el ácido nucleico diana apropiado.
Los sustitutos nucleotídicos son nucleótidos o análogos nucleotídicos a los que se les ha sustituido el resto de fosfato y/o los restos de azúcar. Los sustitutos nucleotídicos no contienen un átomo de fósforo estándar. Los sustitutos para el fosfato pueden ser, por ejemplo, enlaces internucleosídicos alquílicos o cicloalquílicos de cadena corta, enlaces internucleosídicos mixtos de heteroátomo y alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); cadenas principales siloxánicas; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metilenformacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales amídicas; y otros que tienen partes de componentes N, O, S y CH2 mixtas. Numerosas patentes de los Estados Unidos describen cómo obtener y usar estos tipos de sustituciones de fosfato, e incluyen, pero no se limitan a, 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.
También se entiende en un sustituto nucleotídico que tanto los restos de azúcar como de fosfato del nucleótido se pueden sustituir, por ejemplo, mediante un enlace de tipo amida (aminoetilglicina) (PNA). Las patentes de los Estados Unidos 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262 enseñan cómo obtener y usar moléculas de PNA. (Véase también Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500).
También es posible enlazar otros tipos de moléculas (conjugados) a nucleótidos o análogos nucleotídicos para mejorar, por ejemplo, la captación celular. Los conjugados se pueden enlazar químicamente al nucleótido o a análogos nucleotídicos. Tales conjugados incluyen, pero no se limitan a, restos lipídicos tales como un resto de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992,660,306-309; Manoharan et al., Bioorg. : Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo dodecanodiol o restos undecílicos (Saison-Behmoaras et al.; EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-Ohexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido adamantanacético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), un resto palmitílico (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), o un resto hexilamino-carbonil-oxicolesterol u octadecilamina (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937. Numerosas patentes de los Estados Unidos enseñan la preparación de tales conjugados, e incluyen, pero no se limitan a, las patentes U.S. nos 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538;
5.578.717. 5.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241. 5.391.723; 5.416.203. 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923;
5.599.928 y 5.688.941.
Una interacción de Watson-Crick es al menos una interacción con la cara de Watson-Crick de un nucleótido, análogo nucleotídico, o sustituto nucleotídico. La cara de Watson-Crick de un nucleótido, análogo nucleotídico, o sustituto nucleotídico incluye las posiciones C2, N1 y C6 de un nucleótido, análogo nucleotídico, o sustituto nucleotídico a base de purina, y las posiciones C2, N3 y C4 de un nucleótido, análogo nucleotídico, o sustituto nucleotídico a base de pirimidina.
Una interacción de Hoogsteen es la interacción que tiene lugar en la cara de Hoogsteen de un nucleótido o análogo nucleotídico, que está expuesta en la ranura principal de un ADN dúplex. La cara de Hoogsteen incluye la posición N7 y grupos reactivos (NH2 u O) en la posición C6 de nucleótidos purínicos.
b) Secuencias
Hay una variedad de secuencias relacionadas con los genes de CR2, DAF, CD59, CR1, MCP, Crry, CR2-DAF, DAF-CR2, CR2-CD59, CD59-CR2, CR2-CR1, CR1-CR2, CR2-MCP, MCP-CR2, CR2-Crry o Crry-CR2, que tienen, por ejemplo, las secuencias como se describen aquí, o secuencias disponibles en la bibliografía.
Una secuencia particular expuesta en SEC ID NO: 25 usada aquí, como un ejemplo, se expone para ejemplificar las composiciones y métodos descritos. Se entiende que la descripción relacionada con esta secuencia es aplicable a cualquier secuencia relacionada con CR2, CR2-DAF, DAF-CR2, CR2-CD59, CD59-CR2, CR2-CR1, CR1-CR2, CR2-MCP, MCP-CR2, CR2-Crry o Crry-CR2, excepto que se indique específicamente de otro modo. Aquellos de pericia en la técnica entenderán cómo resolver discrepancias y diferencias de secuencias, y cómo ajustar las composiciones y métodos que se refieren a una secuencia particular a otras secuencias relacionadas (es decir, secuencias de CR2, DAF, CD59, CR1, MCP, Crry, CR2-DAF, DAF-CR2, CR2-CD59, CD59-CR2, CR2-CR1, CR1-CR2, CR2-MCP, MCP-CR2, CR2-Crry, Crry-CR2). Los cebadores y/o sondas se pueden diseñar para cualquier secuencia de CR2, DAF, CD59, CR1, MCP, Crry, CR2-DAF, DAF-CR2, CR2-CD59, CD59-CR2, CR2-CR1, CR1-CR2, CR2-MCP, MCP-CR2, CR2-Crry o Crry-CR2, dada la información descrita aquí y conocida en la técnica.
3. Suministro de las composiciones a las células
Hay un número de composiciones y métodos que se pueden usar para suministrar las presentes composiciones de proteínas de fusión, composiciones de inmunoconjugados y composiciones de ácidos nucleicos a células, ya sea in vitro o in vivo. Las composiciones de la invención se administran preferiblemente a un sujeto en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19ª ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995. Típicamente, se usa en la formulación una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable para hacer a la formulación isotónica. Los ejemplos de los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, disolución salina, emulsiones de agua:aceite, emulsiones de aceite:agua, y disolución de Ringer y disolución de dextrosa. El pH de la disolución es preferiblemente de alrededor de 5 a alrededor de 8, y más preferiblemente de alrededor de 7 a alrededor de 7,5. Otros vehículos incluyen preparaciones de liberación sostenida tales como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices las cuales están en forma de artículos conformados, por ejemplo películas, liposomas o micropartículas. Será manifiesto para las personas expertas en la técnica que ciertos vehículos pueden ser más preferibles dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración y la concentración de anticuerpo que se administra.
Las composiciones de la invención se pueden administrar al sujeto, paciente o célula mediante inyección (por ejemplo intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular), o mediante otros métodos tales como infusión, que aseguran su suministro al torrente sanguíneo en una forma eficaz. Se prefiere la inyección local o intravenosa.
Las dosis y calendarios eficaces para administrar las composiciones de la invención se pueden determinar empíricamente, y la realización de tales determinaciones está dentro de la pericia en la técnica. Los expertos en la técnica entenderán que la dosificación de las composiciones de la invención que se deben de administrar variarán dependiendo, por ejemplo, del sujeto que recibirá la composición, de la vía de administración, del tipo particular de composición usada u otros fármacos a administrar. Una dosis diaria típica de las composiciones de la invención usadas solas puede oscilar de alrededor de 1 !g/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal o más por día, dependiendo de los factores mencionados anteriormente.
a) Sistema de suministro a base de ácidos nucleicos
Hay un número de composiciones y métodos que se pueden usar para suministrar ácidos nucleicos a las células, ya sea in vitro o in vivo. Estos métodos y composiciones se pueden dividir enormemente en dos clases: sistemas de suministro a base de virus, y sistemas de suministro no basados en virus. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se pueden suministrar a través de un número de sistemas de suministro directos tales como electroporación, lipofección, precipitación con fosfato de calcio, plásmidos, vectores víricos, ácidos nucleicos víricos, ácidos nucleicos de fagos, fagos, cósmidos, o vía transferencia de material genético en células o vehículos tales como liposomas catiónicos. Los medios apropiados para la transfección, incluyendo vectores víricos, transfectantes químicos o métodos fisicomecánicos tales como electroporación y difusión directa de ADN se describen, por ejemplo, por Wolff,
J. A., et al., Science, 247, 1465-1468, (1990); y Wolff, J. A. Nature, 352, 815-818, (1991). Tales métodos son bien conocidos en la técnica y fácilmente adaptables para uso con las composiciones y métodos descritos aquí. En ciertos casos, los métodos se modificarán para funcionar especialmente con grandes moléculas de ADN. Además, estos métodos se pueden usar para seleccionar como dianas a ciertas enfermedades y poblaciones celulares usando las características de dianización del vehículo.
Los vectores de transferencia pueden ser cualquier construcción nucleotídica usada para suministrar genes a las células (por ejemplo, un plásmido), o como parte de una estrategia general para suministrar genes, por ejemplo como parte de retrovirus o adenovirus recombinante (Ram et al. Cancer Res. 53:83-88, (1993)).
Como se usa aquí, vectores plasmídicos o víricos son agentes que transportan los ácidos nucleicos descritos, tales como SEC ID NO: 25, a la célula sin degradación, e incluyen un promotor que produce la expresión del gen en las células en las que es suministrado. En algunas realizaciones, las CR2, DAF, CD59, CR1, MCP, Crry, CR2-DAF, DAF-CR2, CR2-CD59, CD59-CR2, CR2-CR1, CR1-CR2, CR2-MCP, MCP-CR2, CR2-Crry, o Crry-CR2, se suministran a partir de un virus o un retrovirus. Los vectores víricos son, por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados, virus de herpes, virus de la vacuna, virus de la polio, virus del SIDA, virus trófico neuronal, virus Sindbis y otros virus de ARN, incluyendo estos virus con la cadena principal del VIH. También se prefieren cualesquiera familias víricas que comparten las propiedades de estos virus que los hacen adecuados para uso como vectores. Los retrovirus incluyen el virus de la leucemia murina de Maloney, MMLV, y retrovirus que expresan las propiedades deseables de MMLV como un vector. Los vectores retrovíricos son capaces de portar una carga genética más grande, es decir, un transgén o gen marcador, que otros vectores víricos, y por esta razón son un vector usado habitualmente. Sin embargo, no son tan útiles en células no proliferantes. Los vectores adenovíricos son relativamente estables y fáciles de trabajar con ellos, tienen títulos elevados, se pueden suministrar en formulación de aerosol, y pueden transfectar a células que no se dividen. Los vectores poxvíricos son grandes y tienen varios sitios para insertar genes, son termoestables, y se pueden almacenar a temperatura ambiente. Una realización preferida es un vector vírico que se ha manipulado mediante ingeniería para suprimir la respuesta inmunitaria del organismo hospedante, provocada por los antígenos víricos. Los vectores preferidos de este tipo poseerán regiones codificantes para interleucina 8 ó 10.
Los vectores víricos pueden tener mayores capacidades de transacción (capacidad para introducir genes) que los métodos químicos o físicos para introducir genes en las células. Típicamente, los vectores víricos contienen genes tempranos no estructurales, genes tardíos estructurales, un transcrito de ARN polimerasa III, repeticiones terminales invertidas necesarias para la replicación y encapsidamiento, y promotores para controlar la transcripción y replicación del genoma vírico. Cuando se manipulan como vectores, los virus tienen típicamente uno o más de los genes tempranos eliminados, y se inserta en el genoma vírico un gen o casete de gen/promotor en lugar del ADN vírico eliminado. Los constructos de este tipo pueden llevar hasta alrededor de 8 kb de material genético extraño. Las funciones necesarias de los genes tempranos eliminados se suministran típicamente por líneas celulares que se han manipulado para expresar los productos génicos de los genes tempranos en trans.
(1) Vectores retrovíricos
Un retrovirus es un virus de animal que pertenece a la familia vírica de Retroviridae, incluyendo cualesquiera tipos, subfamilias, género o tropismos. Los vectores retrovíricos se describen, en general, por Verma, I.M., Retroviral vectors for gene transfer. En Microbiology-1985, American Society for Microbiology, p. 229-232, Washington, (1985). Los ejemplos de métodos para usar vectores retrovíricos para la terapia génica se describen en las patentes U.S. nos
4.868.116 y 4.980.286; las solicitudes PCT WO 90/02806 y WO 89/07136; y Mulligan, (Science 260:926-932 (1993)).
Un retrovirus es esencialmente un empaquetamiento que tiene empaquetado en él una carga de ácido nucleico. La carga de ácido nucleico lleva con ella una señal de empaquetamiento, que asegura que las moléculas hijas replicadas se empaquetarán eficientemente en la cubierta del empaquetamiento. Además de la señal de empaquetamiento, hay un número de moléculas que son necesarias en cis, para la replicación, y el empaquetamiento del virus replicado. Típicamente, un genoma retrovírico contiene los genes gag, pol y env que están implicados en la obtención de la cubierta proteica. Son los genes gag, pol y env que se sustituyen típicamente por el ADN extraño que se va a transferir a la célula diana. Los vectores retrovíricos contienen típicamente una señal de empaquetamiento para la incorporación en la cubierta del empaquetamiento, una secuencia que señala el inicio de la unidad de transcripción gag, elementos necesarios para la transcripción inversa, incluyendo un sitio de unión a cebador para unirse al cebador de ARNt de transcripción inversa, secuencias de repetición terminal que guían el cambio de hebras de ARN durante la síntesis de ADN, una secuencia rica en purina 5’ hasta la 3’ LTR que sirve como el sitio de cebado para la síntesis de la segunda hebra de la síntesis de ADN, y secuencias específicas cerca de los extremos de las LTRs que permite la inserción del estado de ADN del retrovirus para su inserción en el genoma del hospedante. La eliminación de los genes gag, pol y env permite que se inserte una secuencia extraña de alrededor de 8 kb en el genoma vírico, se transcriba de forma inversa y, al replicarse, se empaquete en una nueva partícula retrovírica. Esta cantidad de ácido nucleico es suficiente para el suministro de uno a muchos genes, dependiendo del tamaño de cada transcrito. Es preferible incluir marcadores seleccionables positivos o negativos junto con otros genes en el inserto.
Puesto que se ha eliminado la maquinaria de replicación y las proteínas de empaquetamiento en la mayoría de los vectores retrovíricos (gag, pol y env), los vectores se generan típicamente colocándolos en una estirpe celular de empaquetamiento. Una estirpe celular de empaquetamiento es una estirpe celular que se ha transfectado o transformado con un retrovirus que contiene la maquinaria de replicación y empaquetamiento, pero carece de cualquier señal de empaquetamiento. Cuando el vector que posee el ADN de elección se transfecta en estas estirpes celulares, el vector que contiene el gen de interés se replica y se empaqueta en nuevas partículas retrovíricas mediante la maquinaria proporcionada en cis por la célula auxiliar. Los genomas para la maquinaria no están empaquetados debido a que carecen de las señales necesarias.
2. Vectores adenovíricos
Se ha descrito la construcción de adenovirus defectuosos en la replicación (Berkner et al., J. Virology 61:1213-1220 (1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virology 57:267-274 (1986); Davidson et al., J. Virology 61:1226-1239 (1987); Zhang “Generation and identification of recombinant adenovirus by liposomemediated transfection and PCR analysis” BioTechniques 15:868-872 (1993)). El beneficio de usar estos virus como vectores es que están limitados en el grado en el cual se pueden extender a otros tipos celulares, puesto que se pueden replicar en una célula infectada inicial, pero son incapaces de formar nuevas partículas víricas infecciosas. Se ha demostrado que los adenovirus recombinantes logran una transferencia génica muy eficiente tras el suministro directo in vivo al epitelio de las vías respiratorias, hepatocitos, endotelio vascular, parénquima del SNC, y un número de otros sitios tisulares (Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580-1586 (1993); Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381-387 (1993); Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085-1092 (1993); Moullier, Nature Genetics 4:154-159 (1993); La Salle, Science 259:988-990 (1993); Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267:25129-25134 (1992); Rich, Human Gene Therapy 4:461-476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6:75-83 (1994); Guzman, Circulation Research 73:1201-1207 (1993); Bout, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994); Zabner, Cell 75:207-216 (1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 (1993); y Ragot, J. Gen. Virology 74:501-507 (1993)). Los adenovirus recombinantes logran la transducción génica mediante la unión a receptores de superficies celulares específicos, tras lo cual el virus se internaliza mediante endocitosis mediada por receptores, de la misma manera que el adenovirus de tipo salvaje o defectuoso en la replicación (Chardonnet y Dales, Virology 40:462-477 (1970); Brown y Burlingham, J. Virology 12:386-396 (1973); Svensson y Persson, J. Virology 55:442-449 (1985); Seth, et al., J. Virol. 51:650-655 (1984); Seth, et al., Mol. Cell. Biol. 4:1528-1533 (1984); Varga et al., J. Virology 65:6061-6070 (1991); Wickham et al., Cell 73:309-319 (1993)).
Un vector vírico puede ser aquel basado en un adenovirus al que se le ha eliminado el gen E1, y estos viriones se generan en una estirpe celular tal como la estirpe celular 293 humana. En otra realización preferida, se han eliminado ambos genes E1 y E3 del genoma adenovírico.
(3) Vectores víricos adenoasociados
Otro tipo de vector vírico se basa en un virus adenoasociado (AAV). Este parvovirus defectuoso es un vector preferido debido a que puede infectar muchos tipos celulares y no es patógeno para los seres humanos. Los vectores del tipo AAV pueden transportar alrededor de 4 a 5 kb, y se sabe que un AAV de tipo salvaje se inserta de forma estable en el cromosoma 19. Se prefieren los vectores que contienen esta propiedad de integración específica del sitio. Una realización especialmente preferida de este tipo de vector es el vector P4.1C producido por Avigen, San Francisco, CA, que puede contener el gen de timidina cinasa del virus del herpes simple, HSV-tk, y/o un gen marcador, tal como el gen que codifica la proteína fluorescente verde, GFP.
En otro tipo de virus AAV, el AAV contiene un par de repeticiones terminales invertidas (ITRs) que flanquean al menos un casete que contiene un promotor que dirige la expresión específica de células operablemente enlazado a un gen heterólogo. Heterólogo en este contexto se refiere a cualquier secuencia nucleotídica o gen que no es nativo al parvovirus AAV o B19.
Típicamente, las regiones codificantes de AAV y B19 se han suprimido, dando como resultado un vector seguro, no citotóxico. Las ITRs de AAV, o sus modificaciones, confieren capacidad infecciosa e integración específica del sitio, pero no citotoxicidad, y el promotor dirige la expresión específica de células. La patente de los Estados Unidos nº
6.261.834 describe material relacionado con el vector de AAV.
Los vectores de la presente invención proporcionan así moléculas de ADN que son capaces de integrarse en un cromosoma de mamífero sin toxicidad sustancial.
Los genes insertados en virus y retrovirus contienen habitualmente promotores, y/o potenciadores para ayudar a controlar la expresión del producto génico deseado. Un promotor es generalmente una secuencia o secuencias de ADN que funcionan cuando están en una localización relativamente fija con respecto al sitio de iniciación de la transcripción. Un promotor contiene elementos centrales requeridos para la interacción básica de ARN polimerasa y factores de transcripción, y puede contener elementos en dirección y elementos de respuesta.
(4) Vectores víricos de gran carga
Los experimentos genéticos moleculares con grandes virus del herpes humanos han proporcionado un medio mediante el cual se pueden clonar, propagar y establecer grandes fragmentos de ADN heterólogo en células permisivas para la infección con virus del herpes (Sun et al., Nature genetics 8: 33-41, 1994; Cotter y Robertson, Curr Opin Mol Ther 5: 633-644, 1999). Estos grandes virus de ADN (el virus del herpes simple (HSV) y el virus de Epstein-Barr (EBV), tienen el potencial de suministrar fragmentos de ADN heterólogo humano > 150 kb a células específicas. Los recombinantes del EBV pueden mantener grandes trozos de ADN en las células B infectadas como ADN episómico. Los clones individuales portados por insertos genómicos humanos hasta 330 kb parecieron genéticamente estables. El mantenimiento de estos episomas requiere una proteína nuclear de EBV específica, EBNA1, expresada constitutivamente durante la infección con EBV. Adicionalmente, estos vectores se pueden usar para la transfección, en la que se pueden generar transitoriamente in vitro grandes cantidades de proteína. Los sistemas de amplicones del virus del herpes también se están usando para empaquetar trozos de ADN > 220 kb y para infectar células que pueden mantener de forma estable ADN como episomas.
Otros sistemas útiles incluyen, por ejemplo, vectores del virus de la vacuna no replicantes restringidos a hospedantes y replicantes.
b) Sistemas no basados en ácidos nucleicos
Las composiciones descritas se pueden suministrar a las células diana de muchas maneras. Por ejemplo, las composiciones se pueden suministrar a través de electroporación, o a través de lipofección, o a través de precipitación con fosfato de calcio. El mecanismo de suministro escogido dependerá en parte del tipo de célula escogida como diana, y de si el suministro se produce, por ejemplo, in vivo o in vitro.
De este modo, las composiciones pueden comprender, además de las CR2, DAF, CD59, CR1, MCP, Crry, CR2-DAF, DAF-CR2, CR2-CD59, CD59-CR2, CR2-CR1, CR1-CR2, CR2-MCP, MCP-CR2, CR2-Crry, o Crry-CR2 descritas, o vectores por ejemplo, lípidos tales como liposomas, tales como liposomas catiónicos (por ejemplo, DOTMA, DOPE, DC-colesterol) o liposomas aniónicos. Los liposomas pueden comprender además proteínas para facilitar la selección como diana de una célula particular, si se desea. La administración de una composición que comprende un compuesto y un liposoma catiónico se puede administrar a la sangre aferente, hasta un órgano diana,
o se puede inhalar en las vías respiratorias hasta células diana del aparato respiratorio. Con respecto a los liposomas, véanse, por ejemplo, Brigham et al. Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1:95-100 (1989); Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7413-7417 (1987); Patente U.S. nº 4.897.355. Además, el compuesto se puede administrar como un componente de una microcápsula que se puede dirigir hacia tipos celulares específicos, tales como macrófagos, o en los que la difusión del compuesto o suministro del compuesto de la microcápsula se diseña para una tasa o dosificación específica.
En los métodos descritos anteriormente, que incluyen la administración y captación de ADN exógeno en las células de un sujeto (es decir, transducción o transfección génica), el suministro de las composiciones a las células puede ser vía una variedad de mecanismos. Como un ejemplo, el suministro puede ser vía un liposoma, usando preparaciones liposómicas comercialmente disponibles tales como LIPOFECTINA, LIPOFECTAMINA (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemania) y TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI), así como sus liposomas desarrollados según procedimientos estándar en la técnica. Además, el ácido nucleico o vector de esta invención se puede suministrar in vivo mediante electroporación, cuya tecnología está disponible de Genetronics, Inc. (San Diego, CA), así como por medio de una máquina de SONOPORATION (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ).
Los materiales pueden estar en disolución, en suspensión (por ejemplo, incorporados en micropartículas, liposomas,
o células). Estos se pueden dirigir hacia un tipo celular particular vía anticuerpos, receptores, o ligandos de receptores. Las siguientes referencias son ejemplos del uso de esta tecnología para dirigir proteínas específicas hacia tejido tumoral (Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz y McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); y Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)). Estas técnicas se pueden usar para una variedad de otros tipos celulares específicos. Los vehículos tales como liposomas “sigilosos” y otros liposomas conjugados a anticuerpos (incluyendo la dianización de carcinomas colónicos por fármacos mediados por lípidos), la dianización mediada por receptores de ADN a través de ligandos específicos de células, la dianización de tumores dirigida por linfocitos, y la dianización retrovírica terapéutica muy específica de células de glioma murinas in vivo. Las siguientes referencias son ejemplos del uso de esta tecnología para dirigir proteínas específicas hacia tejido tumoral (Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); y Litzinger y Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)). En general, los receptores están implicados en rutas de endocitosis, ya sea constitutiva o inducida por ligandos. Estos receptores se agrupan en canteras revestidas de clatrina, entran a la célula vía vesículas revestidas con clatrina, pasan a través de un endosoma acidificado en el que se clasifican los receptores, y entonces se reciclan a la superficie celular, se almacenan intracelularmente, o se degradan en lisosomas. Las rutas de internalización sirven a una variedad de funciones, tales como la captación de nutrientes, la eliminación de proteínas activadas, el aclaramiento de macromoléculas, la entrada oportunista de virus y toxinas, la disociación y degradación de ligando, y la regulación del nivel de receptor. Muchos receptores siguen más de una ruta intracelular, dependiendo del tipo celular, concentración del receptor, tipo de ligando, valencia del ligando, y concentración del ligando. Se han revisado los mecanismos moleculares y celulares de la endocitosis mediada por receptores (Brown y Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).
Los ácidos nucleicos que se suministran a las células que se van a integrar en el genoma de las células hospedantes, contienen típicamente secuencias de integración. Estas secuencias son a menudo secuencias relacionadas con virus, particularmente cuando se usan sistemas a base de virus. Estos sistemas de integración víricos también se pueden incorporar en ácidos nucleicos que se van a suministrar usando un sistema de suministro no basado en ácidos nucleicos, tal como un liposoma, de manera que el ácido nucleico contenido en el sistema de suministro se puede integrar en el genoma del hospedante.
Otras técnicas generales para la integración en el genoma del hospedante incluyen, por ejemplo, sistemas diseñados para promover la recombinación homóloga con el genoma del hospedante. Estos sistemas se basan típicamente en la secuencia que flanquea el ácido nucleico a expresar que tiene suficiente homología con una secuencia diana en el genoma de la célula hospedante en el que tiene lugar recombinación entre el ácido nucleico del vector y el ácido nucleico diana, haciendo que el ácido nucleico suministrado se integre en el genoma del hospedante. Estos sistemas y los métodos necesarios para promover la recombinación homóloga son conocidos por los expertos en la técnica.
C) In vivo/ex vivo
Como se describe anteriormente, las composiciones se pueden administrar en un vehículo farmacéuticamente aceptable, y se pueden suministrar a las células de los sujetos in vivo y/o ex vivo mediante una variedad de mecanismos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, captación de ADN desnudo, fusión liposómica, inyección intramuscular de ADN vía una pistola génica, endocitosis y similar).
Si se emplean métodos ex vivo, las células o tejidos se pueden retirar y mantener fuera del cuerpo según protocolos estándar bien conocidos en la técnica. Las composiciones se pueden introducir en las células vía cualquier mecanismo de transferencia génica, tal como, por ejemplo, suministro génico mediado por fosfato de calcio, electroporación, microinyección o proteoliposomas. Las células transducidas se pueden infundir entonces (por ejemplo, en un vehículo farmacéuticamente aceptable) o se pueden transplantar homotópicamente en el sujeto mediante métodos estándar para el tipo celular o de tejido. Se conocen métodos estándar para el transplante o infusión de diversas células en un sujeto.
4. Sistemas de expresión
Los ácidos nucleicos que se suministran a las células contienen típicamente sistemas que controlan la expresión. Por ejemplo, los genes insertados en sistemas víricos y retrovíricos contienen habitualmente promotores y/o potenciadores para ayudar a controlar la expresión del producto génico deseado. Un promotor es generalmente una secuencia o secuencias de ADN que funcionan cuando están en una localización relativamente fija con respecto al sitio de iniciación de la transcripción. Un promotor contiene elementos centrales requeridos para la interacción básica de ARN polimerasa y factores de transcripción, y puede contener elementos en dirección y elementos de respuesta.
a) Promotores y potenciadores víricos
Los promotores preferidos que controlan la transcripción procedentes de vectores en células hospedantes de mamífero se pueden obtener a partir de diversas fuentes, por ejemplo los genomas del virus tales como: polioma, virus 40 de simio (SV40), adenovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B, y lo más preferible, citomegalovirus, o procedentes de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo el promotor de beta-actina. Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40, que también contiene el origen de replicación vírico de SV40 (Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII E (Greenway, P.J. et al., Gene 18: 355-360 (1982)). Por supuesto, también son útiles aquí los promotores procedentes de la célula hospedante o especie relacionada.
Potenciador se refiere generalmente a una secuencia de ADN que funciona en una distancia no fija desde el sitio de iniciación de la transcripción, y puede estar en 5’ (Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 (1981)) o 3’ (Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983)) con respecto a la unidad de transcripción. Además, los potenciadores pueden estar en un intrón (Banerji, J.L. et al., Cell 33:729 (1983)) así como en la propia secuencia codificante (Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 (1984)). Habitualmente tienen una longitud entre 10 y 300 pb, y funcionan en cis. Los potenciadores funcionan para incrementar la transcripción a partir de promotores cercanos. Los potenciadores también contienen a menudo elementos de respuesta que median la regulación de la transcripción. Los promotores también pueden contener elementos de respuesta que median la regulación de la transcripción. Los potenciadores determinan a menudo la regulación de la expresión de un gen. Aunque ahora se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, fetoproteína e insulina), típicamente se usará para la expresión general un potenciador procedente de un virus de célula eucariota. Los ejemplos preferidos son el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y potenciadores adenovíricos.
El promotor y/o potenciador se puede activar específicamente mediante luz o sucesos químicos específicos que disparan su función. Los sistemas se pueden regular mediante reactivos tales como tetraciclina y dexametasona.
También hay formas de potenciar la expresión génica de vectores víricos mediante exposición a irradiación, tal como irradiación gamma, o fármacos quimioterapéuticos alquilantes.
En ciertas realizaciones, la región promotora y/o potenciadora puede actuar como un promotor y/o potenciador constitutivo para maximizar la expresión de la región de la unidad de transcripción a transcribir. En ciertos constructos, la región promotora y/o potenciadora es activa en todos los tipos celulares eucariotas, incluso si sólo se expresa en un tipo celular particular en un tiempo particular. Un promotor preferido de este tipo es el promotor de CMV (650 bases). Otros promotores preferidos son los promotores SV40, citomegalovirus (promotor de longitud completa), y el vector retrovírico LTF.
Se ha demostrado que todos los elementos reguladores específicos se pueden clonar y usar para construir vectores de expresión que son expresados selectivamente en tipos celulares específicos tales como células de melanoma. El promotor de la proteína acética fibrilar glial (GFAP) se ha usado para expresar selectivamente genes en células de origen glial.
Los vectores de expresión usados en células hospedantes eucariotas (células de levadura, hongos, de insecto, vegetales, de animales, humanas o células nucleadas) también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción que puede afectar a la expresión de ARNm. Estas regiones se transcriben como segmentos poliadenilados en la porción sin traducir del ARNm que codifica la proteína del factor tisular. Las regiones no traducidas de 3’ también incluyen sitios de terminación de la transcripción. Se prefiere que la unidad de transcripción también contenga una región de poliadenilación. Un beneficio de esta región es que incrementa la probabilidad de que la unidad transcrita será procesada y transportada como ARNm. La identificación y uso de señales de poliadenilación en constructos de expresión está bien establecida. Se prefiere que se usen en los constructos transgénicos señales de poliadenilación homólogas. En ciertas unidades de transcripción, la región de poliadenilación deriva de la señal de poliadenilación temprana de SV40, y consiste en alrededor de 400 bases. También se prefiere que las unidades transcritas contengan otras secuencias estándar solas o en combinación con las secuencias anteriores para mejorar la expresión o estabilidad del constructo.
b) Marcadores
Los vectores víricos pueden incluir secuencias de ácidos nucleicos que codifican un producto marcador. Este producto marcador se usa para determinar si el gen ha sido suministrado a la célula y, una vez suministrado, está siendo expresado. Los genes marcadores preferidos son el gen lacZ de E. coli, que codifica ∀-galactosidasa, y la proteína fluorescente verde.
En algunas realizaciones, el marcador puede ser un marcador seleccionable. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son dihidrofolato reductasa (DHFR), timidina cinasa, neomicina, análogo de neomicina G418, hidromicina, y puromidina. Cuando tales marcadores seleccionables se transfieren con éxito a una célula hospedante de mamífero, la célula hospedante de mamífero transformada puede sobrevivir si se coloca bajo presión selectiva. Hay dos categorías distintas ampliamente usadas de regímenes selectivos. La primera categoría se basa en un metabolismo de la célula y el uso de una estirpe celular mutante que carece de la capacidad para crecer independiente de un medio suplementado. Dos ejemplos son: células CHO DHFR- y células de ratón LTK-. Estas células carecen de la capacidad para crecer sin la adición de nutrientes tales como timidina o hipoxantina. Debido a que estas células carecen de ciertos genes necesarios para una ruta sintética nucleotídica sintética, no pueden sobrevivir excepto que se proporcionen en un medio suplementado los nucleótidos que faltan. Una alternativa a suplementar los medios es introducir un gen de DHFR o de TK intacto en las células que carecen de los genes respectivos, alterando así sus requisitos de crecimiento. Las células individuales que no se transformaron con el gen de DHFR o de TK no serán capaces de sobrevivir en los medios no suplementados.
La segunda categoría es la selección dominante, que se refiere a un esquema de selección usado en cualquier tipo celular y no requiere el uso de una estirpe celular mutante. Estos esquemas usan típicamente un fármaco para detener el crecimiento de la célula hospedante. Estas células que tienen un nuevo gen expresarían una proteína que proporciona resistencia a fármacos, y sobrevivirían a la selección. Los ejemplos de tal selección dominante usan los fármacos neomicina (Southern P. y Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982)), ácido micofenólico (Mulligan,
R.C. y Berg, P. Science 209: 1422 (1980)) o higromicina, (Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985)). Los tres ejemplos emplean genes bacterianos bajo el control eucariota para proporcionar resistencia al fármaco apropiado G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina, respectivamente. Otros incluyen el análogo de neomicina G418 y puramicina.
5. Péptidos
a) Variantes proteicas
Como se explica aquí, hay numerosas variantes de la proteína CR2, DAF, CD59, CR1, MCP, Crry, CR2-DAF, DAFCR2, CR2-CD59, CD59-CR2, CR2-CR1, CR1-CR2, CR2-MCP, MCP-CR2, CR2-Crry, y Crry-CR2, que se conocen y se contemplan aquí. Además, a las variantes de las cepas CR2, DAF, CD59, CR1, MCP, Crry, CR2-DAF, DAF-CR2, CR2-CD59, CD59-CR2, CR2-CR1, CR1-CR2, CR2-MCP, MCP-CR2, CR2-Crry, y Crry-CR2 funcionales conocidas, hay derivados de las proteínas CR2, DAF, CD59, CR1, MCP, Crry, CR2-DAF, DAF-CR2, CR2-CD59,
CD59-CR2, CR2-CR1, CR1-CR2, CR2-MCP, MCP-CR2, CR2-Crry, y Crry-CR2 que también funcionan en los métodos y composiciones descritos. Las variantes proteicas y derivados son bien comprendidos por los expertos en la técnica, y pueden implicar modificaciones de las secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, las modificaciones de secuencias de aminoácidos caen típicamente en una o más de tres clases: variantes sustitucionales, de inserción o 5 de supresión. Las inserciones incluyen fusiones amino y/o carboxil terminales, así como inserciones de intrasecuencias de restos de aminoácidos individuales o múltiples. Las inserciones normalmente serán inserciones más pequeñas que aquellas de las fusiones amino o carboxil terminales, por ejemplo del orden de uno a cuatro restos. Los derivados proteicos de fusión inmunógena, tales como los descritos en los ejemplos, se obtienen fusionando un polipéptido suficientemente grande para conferir inmunogenicidad a la secuencia diana mediante 10 reticulación in vitro o mediante cultivo celular recombinante transformado con ADN que codifica la fusión. Las supresiones se caracterizan por la eliminación de uno o más restos de aminoácidos de la secuencia proteica. Típicamente, no se eliminan más de alrededor de 2 a 6 restos en cualquier sitio en la molécula proteica. Estas variantes se preparan normalmente mediante mutagénesis específica al sitio de oligonucleótidos en el ADN que codifica la proteína, produciendo de ese modo ADN que codifica la variante, y después expresando el ADN en el 15 cultivo celular recombinante. Las técnicas para obtener mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidos, por ejemplo mutagénesis del cebador M13 y mutagénesis de PCR. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de restos individuales, pero pueden ocurrir en un número de diferentes localizaciones de una sola vez; las inserciones serán habitualmente del orden de alrededor de 1 a 10 restos de aminoácidos; y las supresiones oscilarán de alrededor de 1 a 30 restos. Las supresiones o inserciones se 20 realizan preferiblemente en pares adyacentes, es decir, una supresión de 2 restos o una inserción de 2 restos. Las sustituciones, supresiones, inserciones, o cualquier combinación de las mismas, se pueden combinar para llegar a un constructo final. Las mutaciones no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura, y preferiblemente no crearán regiones complementarias que podrían producir una estructura de ARNm secundaria. Las variantes sustitucionales son aquellas en las que al menos un resto se ha eliminado y se ha insertado un resto diferente en su 25 lugar. Tales sustituciones generalmente se realizan según las siguientes Tablas 1 y 2, y se denominan sustituciones
conservativas.
TABLA 1: Abreviaturas de aminoácidos
Aminoácido
Abreviaturas
alanina
Ala A
alosoleucina
AIle
arginina
Arg R
asparagina
Asn N
ácido aspártico
Asp D
cisteína
Cys C
ácido glutámico
Glu E
glutamina
Gln Q
glicina
Gly G
histidina
His H
isolelucina
Ile I
leucina
Leu L
lisina
Lys K
fenilalanina
Phe F
prolina
Pro P
ácido piroglutámico
pGlu
serina
Ser S
treonina
Thr T
tirosina
TyrY
Aminoácido
Abreviaturas
triptófano
Trp W
valina
Val V
TABLA 2: Sustituciones de aminoácido
Se conocen en la técnica otras sustituciones conservativas ejemplares de restos originales
Ala; Ser
Arg; Lys; Gln
As; Gln; His
Asp; Glu
Cys; Ser
Gln; Asn; Lys
Glu; Asp
Gly; Pro
His; Asn; Gln
Ile; Leu; Val
Leu; Ile; Val
Lys; Arg; Gln;
Met; Leu; Ile
Phe; Met; Leu; Tyr
Ser; Thr
Thr; Ser
Trp; Tyr
Tyr; Trp; Phe
Val; Ile; Leu
Se realizan cambios sustanciales en la función o identidad inmunológica seleccionando sustituciones que son menos conservativas que aquellas en la Tabla 2, es decir, seleccionando restos que difieren más significativamente en su 5 efecto sobre el mantenimiento (a) de la estructura de la cadena principal polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana,
o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se espera que produzcan los mayores cambios en las propiedades proteicas serán aquellas en las que (a) un resto hidrófilo, por ejemplo serilo o treonilo, se sustituye por un resto hidrófobo, por ejemplo leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o
10 prolina es sustituida por cualquier otro resto; (c) un resto que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo lisilo, arginilo o histidilo, es sustituido por un resto electronegativo, por ejemplo glutamilo o aspartilo; o (d) un resto que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanina, es sustituido por uno que no tiene una cadena lateral, por ejemplo glicina en este caso, (e) incrementando el número de sitios para la sulfatación y/o glucosilación.
Por ejemplo, la sustitución de un resto de aminoácido por otro que es biológica y/o químicamente similar es conocida
15 por los expertos en la técnica como sustitución conservativa. Por ejemplo, una sustitución conservativa sería sustituir un resto hidrófobo por otro, o un resto polar por otro. Las sustituciones incluyen combinaciones tales como, por ejemplo, Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe, Tyr. Tales variaciones conservativamente sustituidas de cada una de las secuencias descritas explícitamente están incluidas en los polipéptidos mosaico proporcionados aquí.
Para insertar sitios para N-glucosilación (Asn-X-Thr/Ser) u O-glucosilación (Ser o Thr), se puede emplear mutagénesis de sustitución o de supresión. También pueden ser deseables las supresiones de cisteína u otros restos lábiles. Las supresiones o sustituciones de sitios de proteolisis potenciales, por ejemplo Arg, se logra por ejemplo suprimiendo uno de los restos básicos, o sustituyendo uno por restos glutaminilo o histidilo.
Ciertas derivatizaciones post-traduccionales son el resultado de la acción de células hospedantes recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los restos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan frecuentemente de forma post-traduccional a los restos glutamilo y asparilo correspondientes. Como alternativa, estos restos se desamidan en condiciones suavemente ácidas. Otras modificaciones post-traduccionales incluyen la hidroxilación de prolina y silina, la fosforilación de grupos hidroxilo de restos de serilo o treonilo, la metilación de los grupos o-amino de las cadenas laterales de silina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco p. 79-86 [1983]), la acetilación de la amina N-terminal y, en algunos casos, la amidación del carboxilo C-terminal.
Se entiende que una forma para definir las variantes y derivados de las proteínas descritas aquí es a través de la definición de las variantes y derivados en términos de homología/identidad con secuencias conocidas específicas. Por ejemplo, SEC ID NO: 26 expone una secuencia particular de CR2 y SEC ID NO: 2 expone una secuencia particular de una proteína DAF. Se describen específicamente variantes de estas y otras proteínas aquí descritas que tienen al menos 70% o 75% u 80% u 85% o 90% o 95% de homología con la secuencia señalada. Los expertos en la técnica entenderán fácilmente cómo determinar la homología de dos proteínas. Por ejemplo, la homología se puede calcular después de alinear las dos secuencias de manera que la homología está en su nivel más elevado.
Otra manera de calcular la homología se puede llevar a cabo mediante algoritmos publicados. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación se puede realizar mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda de similitud mediante el método de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.
Los mismos tipos de homología se pueden obtener para ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante los algoritmos descritos en Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989, que incluyen al menos material relacionado con el alineamiento de ácidos nucleicos.
Se entiende que la descripción de mutaciones conservativas y homología se pueden combinar juntos en cualquier combinación, tales como realizaciones que tienen al menos 70% de homología con una secuencia particular en la que las variantes son mutaciones conservativas.
Puesto que esta memoria descriptiva explica diversas proteínas y secuencias proteicas, se entiende que también se describen los ácidos nucleicos que codifican esas secuencias proteicas. Esto incluiría todas las secuencias degeneradas relacionadas con una secuencia proteica específica, es decir, todos los ácidos nucleicos que tienen una secuencia que codifica una secuencia proteica particular, así como todos los ácidos nucleicos, incluyendo ácidos nucleicos degenerados, que codifican las variantes y derivados descritos de las secuencias proteicas. De este modo, aunque cada secuencia de ácido nucleico particular puede no estar escrita aquí, se entiende que todas y cada una de las secuencias está de hecho descrita y explicada aquí a través de la secuencia proteica descrita. Por ejemplo, una de las muchas secuencias de ácidos nucleicos que pueden codificar la secuencia proteica expuesta en SEC ID NO: 26 se expone en SEC ID NO: 25. Además, por ejemplo, un derivado conservativo descrito de SEC ID NO: 26 se muestra en SEC ID NO: 29, en el que la isoleucina (I) en la posición 9 se cambia a una valina (V). Se entiende que para esta mutación también se describen todas las secuencias de ácidos nucleicos que codifican este derivado particular de cualquiera de las secuencias descritas. También se entiende que aunque ninguna secuencia de aminoácidos indica qué secuencia de ADN particular codifica esa proteína en un organismo, en el que se describen aquí variantes particulares de una proteína descrita, la secuencia de ácido nucleico conocida que codifica esa proteína a partir de la que surge esa proteína es también conocida y se describe y explica aquí.
6. Anticuerpos
Un inhibidor del complemento puede ser un anticuerpo anti-C5.
a) Anticuerpos en general
El término “anticuerpos” se usa aquí en un sentido amplio, e incluye anticuerpos tanto policlonales como monoclonales. Además de moléculas de inmunoglobulina intactas, también se incluyen en el término “anticuerpos” los fragmentos o polímeros de esas moléculas inmunoglobulínicas, y versiones humanas o humanizadas de moléculas inmunoglobulínicas o sus fragmentos, como se describe aquí. Los anticuerpos se ensayan en busca de su actividad deseada usando los ensayos in vitro descritos aquí, o mediante métodos análogos, después de lo cual sus actividades terapéuticas y/o profilácticas in vivo se ensayan según los métodos de ensayo clínicos conocidos.
Como se usa aquí, el término “anticuerpo” engloba, pero no se limita a, inmunoglobulina completa (es decir, un anticuerpo intacto) de cualquier clase. Los anticuerpos nativos son habitualmente glucoproteínas heterotetrámeras, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Típicamente, cada cadena ligera está enlazada a una cadena pesada mediante un enlace de disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos inmunoglobulínicos. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro intracatenarios regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V(H)), seguido de un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V(L)) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de las cadenas ligera y pesada. Las cadenas ligeras de anticuerpos procedentes de cualquier especie vertebrada se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (k) y lambda (1), basado en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, a las inmunoglobulinas se les puede asignar diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas humanas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo IgG-1, IgG-2, IgG-3, e IgG-4; IgA-1 e IgA-2. Un experto en la técnica reconocería las clases comparables para ratón. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma, y mu, respectivamente.
El término “variable” se usa aquí para describir ciertas porciones de los dominios variables que difieren en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está habitualmente distribuida de forma uniforme a través de los dominios variables de los anticuerpos. Típicamente está concentrada en tres segmentos denominados regiones que determinan la complementariedad (CDRs) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de las cadenas ligeras como de las cadenas pesadas. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan el marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina b, conectadas por tres CDRs, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina b. Las CDRs en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión de los anticuerpos al antígeno (véase Kabat E. A. et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino que presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en toxicidad celular dependiente del anticuerpo.
La expresión “anticuerpo o sus fragmentos” engloba anticuerpos quiméricos y anticuerpos híbridos, con especificidades antigénicas o epitópicas duales o múltiples, y fragmentos, tales como scFv, sFv, F(ab’)2, Fab’, Fab y similares, incluyendo fragmentos híbridos. De este modo, los fragmentos de los anticuerpos pueden retener la capacidad para unirse a sus antígenos específicos. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden mantener la actividad de unión al complemento. Tales anticuerpos y fragmentos se pueden obtener mediante técnicas conocidas en la técnica, y se pueden cribar en busca de especificidad y actividad según los métodos expuestos en los Ejemplos y los métodos generales para producir anticuerpos y el cribado de anticuerpos en busca de especificidad y actividad (véase Harlow y Lane. Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, (1988)).
También están incluidos en el significado de “anticuerpo o fragmentos del mismo” los conjugados de fragmentos de anticuerpos y proteínas de unión a antígeno (anticuerpos monocatenarios) como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. nº 4.704.692.
Como se usa aquí, el término “anticuerpo” o “anticuerpos” también se puede referir a un anticuerpo humano y/o un anticuerpo humanizado. Muchos anticuerpos no humanos (por ejemplo, aquellos derivados de ratones, ratas, o conejos) son naturalmente antigénicos en seres humanos, y de este modo pueden dar lugar a respuestas inmunitarias indeseables cuando se administran a seres humanos. Por lo tanto, el uso de anticuerpos humanos o humanizados en los métodos de la invención sirve para reducir la oportunidad de que un anticuerpo administrado a un ser humano provoque una respuesta inmunitaria indeseable.
Opcionalmente, los anticuerpos se generan en otras especies y se “humanizan” para la administración en seres humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas inmunoglobulínicas o sus fragmentos (tales como Fc, scFv, sFv, Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2, u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen a antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos procedentes de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo, que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos del marco Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por restos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o del marco importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de consenso de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente al menos una porción de una región constante inmunoglobulínica (Fc), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)).
Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácidos no humanos se denominan a menudo como restos “importados”, que se toman típicamente de un dominio variable “importado”. La humanización se puede llevar a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo CDRs de roedor o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quiméricos (patente U.S. nº 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos restos de CDR y posiblemente algunos restos de FR se sustituyen por restos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a usar para obtener los anticuerpos humanizados es muy importante a fin de reducir la antigenicidad. Según el método de “mejor ajuste”, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda la librería de secuencias de dominios variables humanas conocidas. La secuencia humana que está más próxima a la del roedor se acepta entonces como el marco humano (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993) y Chothia et al., J. Mol. Biol.,
196:901 (1987)). Otro método usa un marco particular derivado de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).
Además es importante que los anticuerpos se humanicen con retención de afinidad elevada por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, según un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Hay normalmente modelos inmunoglobulínicos tridimensionales, y son familiares para los expertos en la técnica. Existen programas de ordenador que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias inmunoglobulínicas candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia inmunoglobulínica candidata, es decir, el análisis de los restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los restos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir de la secuencia de consenso y de importación, de manera que se logre la característica de anticuerpo deseada, tal como afinidad incrementada por el antígeno o antígenos diana. En general, los restos de CDR están implicados directamente y muy sustancialmente en la influencia sobre la unión al antígeno (véase el documento WO 94/04679, publicado el 3 de marzo de 1994).
Los fragmentos Fab producidos en la digestión del anticuerpo también contienen los dominios constantes de la cadena ligera y el primer dominio constante de la cadena pesada. Los fragmentos Fab’ difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos restos en el término carboxi del dominio de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. El fragmento F(ab’)2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab’ enlazados mediante un puente de disulfuro en la región bisagra. Fab’-SH es la designación aquí para Fab’, en el que el resto o restos de cisteína de los dominios constantes poseen un grupo tiol libre. Originalmente, los fragmentos de anticuerpos se produjeron como pares de fragmentos Fab’ que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
También se proporciona un paratopo inmunógenamente específico aislado o fragmento del anticuerpo. Un epítopo inmunógeno específico del anticuerpo se puede aislar a partir del anticuerpo completo mediante interrupción química
o mecánica de la molécula. Los fragmentos purificados así obtenidos se ensayan para determinar su inmunogenicidad y especificidad mediante los métodos enseñados aquí. Opcionalmente, los paratopos inmunorreactivos del anticuerpo se sintetizan directamente. Un fragmento inmunorreactivo se define como una secuencia de aminoácidos de al menos alrededor de dos a cinco aminoácidos consecutivos derivados de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo.
Un método para producir proteínas que comprenden los anticuerpos de la presente invención es enlazar dos o más péptidos o polipéptidos juntos mediante técnicas de química proteica. Por ejemplo, los péptidos o polipéptidos se pueden sintetizar químicamente usando equipo de laboratorio actualmente disponible usando química de Fmoc (9fluorenilmetiloxicarbonilo) o Boc (terc-butiloxicarbonilo) (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que un péptido o polipéptido que corresponde al anticuerpo de la presente invención, por ejemplo, se puede sintetizar mediante reacciones químicas estándar. Por ejemplo, un péptido o polipéptido se puede sintetizar y no escindir a partir de su resina de síntesis, mientras que el otro fragmento de un anticuerpo se puede sintetizar y subsiguientemente escindir de la resina, exponiendo de ese modo un grupo terminal que está funcionalmente bloqueado en el otro fragmento. Mediante reacciones de condensación de péptidos, estos dos fragmentos se pueden unir covalentemente vía un enlace peptídico en sus términos carboxilo y amino, respectivamente, para formar un anticuerpo, o fragmento del mismo (Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman y Co., N.Y. (1992); Bodansky M y Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY). Como alternativa, el péptido o polipéptido se sintetiza independientemente in vivo como se describe anteriormente. Una vez aislados, estos péptidos o polipéptidos independientes se pueden enlazar para formar un anticuerpo o fragmento del mismo vía reacciones de condensación de péptidos similares.
Por ejemplo, una ligación enzimática de segmentos peptídicos clonados o sintéticos permite que fragmentos peptídicos relativamente cortos se unan para producir fragmentos peptídicos más grandes, polipéptidos o dominios proteicos completos (Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991)). Como alternativa, la ligación química nativa de péptidos sintéticos se puede utilizar para construir sintéticamente péptidos o polipéptidos grandes a partir de fragmentos peptídicos más cortos. Este método consiste en una reacción química de dos etapas (Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)). La primera etapa es la reacción quimioselectiva de un alfa-tioéster de péptido sintético sin proteger con otro segmento peptídico sin proteger que contiene un resto Cys aminoterminal para dar un intermedio enlazado a tioéster como el producto covalente inicial. Sin un cambio en las condiciones de reacción, este intermedio sufre una reacción intramolecular rápida y espontánea para formar un enlace peptídico nativo en el sitio de ligación. La aplicación de este método de ligación química nativo a la síntesis total de una molécula proteica se ilustra mediante la preparación de interleucina 8 (IL-8) humana (Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101; Clark-Lewis I et al., J. Biol. Chem., 269:16075 (1994); Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991); Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)).
Como alternativa, los segmentos peptídicos sin proteger están enlazados químicamente, en los que el enlace formado entre los segmentos peptídicos como resultado de la ligación química es un enlace no natural (no peptídico) (Schnolzer, M et al. Science, 256:221 (1992)). Esta técnica se ha usado para sintetizar análogos de dominios proteicos, así como grandes cantidades de proteínas relativamente puras con actividad biológica completa (deLisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, Nueva York, p. 257-267 (1992)).
Los fragmentos polipeptídicos de la presente invención pueden ser proteínas recombinantes obtenidas clonando ácidos nucleicos que codifican el polipéptido en un sistema de expresión capaz de producir los fragmentos polipeptídicos del mismo, tales como un sistema de expresión adenovírico o baculovírico. Por ejemplo, se puede determinar el dominio activo de un anticuerpo a partir de un hibridoma específico que puede provocar un efecto biológico asociado con la interacción del anticuerpo con un receptor Fc. Por ejemplo, los aminoácidos que se encuentra que no contribuyen ni a la actividad ni a la especificidad de unión o afinidad del anticuerpo se pueden suprimir sin una pérdida en la actividad respectiva. Por ejemplo, en diversas realizaciones, los aminoácidos amino o carboxi-terminales se eliminan secuencialmente de la molécula no inmunoglobulínica o de la molécula inmunoglobulínica nativas o modificadas, y la actividad respectiva se evalúa en uno de los muchos ensayos disponibles. En otro ejemplo, un fragmento de un anticuerpo comprende un anticuerpo modificado en el que al menos un aminoácido se ha sustituido por el aminoácido de origen natural en una posición específica, y una porción de los aminoácidos aminoterminal o carboxiterminal, o incluso una región interna del anticuerpo, se ha sustituido por un fragmento polipeptídico u otro resto, tal como biotina, que puede facilitar la purificación del anticuerpo modificado.
Los fragmentos, ya sea que estén unidos a otras secuencias o no, incluyen inserciones, supresiones, sustituciones, u otras modificaciones seleccionadas de regiones particulares o restos de aminoácidos específicos, con la condición de que la actividad del fragmento no se vea alterada o impedida significativamente en comparación con el anticuerpo
o fragmento de anticuerpo no modificado. Estas modificaciones pueden proporcionar alguna propiedad adicional, tal como para eliminar o añadir aminoácidos capaces de enlazamiento de disulfuro, para incrementar su biolongevidad, para alterar sus características secretoras, etc. En cualquier caso, el fragmento debe poseer una propiedad bioactiva, tal como actividad de unión, regulación de unión en el dominio de unión, etc. Las regiones funcionales o activas del anticuerpo se pueden identificar mediante mutagénesis de una región específica de la proteína, seguido de la expresión y ensayo del polipéptido expresado.
Tales métodos son fácilmente manifiestos para un practicante experto en la técnica, y pueden incluir mutagénesis específica del sitio del ácido nucleico que codifica el antígeno (Zoller MJ et al. Nucl. Acids Res. 10:6487-500 (1982).
Para seleccionar anticuerpos que se unen selectivamente con una proteína particular, variante, o fragmento, se puede usar una variedad de formatos de inmunoensayos. Por ejemplo, habitualmente se usan inmunoensayos de ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos selectivamente inmunorreactivos con una proteína, variante proteica, o fragmento de la misma. Véase Harlow y Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, (1988), para una descripción de formatos de inmunoensayos y condiciones que se podrían usar para determinar la unión selectiva. La afinidad de unión de un anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Un kit de reactivo de anticuerpo puede comprender recipientes del anticuerpo monoclonal o su fragmento y uno o más reactivos para detectar la unión del anticuerpo o su fragmento a la molécula del receptor Fc. Los reactivos pueden incluir, por ejemplo, marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, u otros marcadores. Los reactivos también pueden incluir anticuerpos secundarios o terciarios, o reactivos para reacciones enzimáticas, en las que las reacciones enzimáticas producen un producto que se puede visualizar.
b) Anticuerpos humanos
Los anticuerpos humanos de la invención se pueden preparar usando cualquier técnica. Los ejemplos de técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos incluyen las descritas por Cole et al. (Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985) y por Boerner et al. (J. Immunol., 147(1):86-95, 1991). Los anticuerpos humanos de la invención (y sus fragmentos) también se pueden producir usando librerías de presentación de fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991).
Los anticuerpos humanos de la invención también se pueden obtener a partir de animales transgénicos. Por ejemplo, se han descrito ratones mutantes transgénicos que son capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en respuesta a la inmunización (véanse, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993)). Específicamente, la supresión homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (J(H)) en estos ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno, y la transferencia con éxito de la matriz del gen de anticuerpo de línea germinal humano en tales ratones mutantes de línea germinal da como resultado la producción de anticuerpos humanos con la exposición al antígeno. Los anticuerpos que tienen la actividad deseada se seleccionan usando complejos de coreceptor de Env-CD4 como se describen aquí.
c) Administración de anticuerpos
Los anticuerpos de la invención se administran preferiblemente a un sujeto en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19ª ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995. Típicamente, se usa una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación para hacer a la formulación isotónica. Los ejemplos del vehículo farmacéuticamente aceptable incluyen, pero no se limitan a, disolución salina, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. El pH de la disolución es preferiblemente de alrededor de 5 a alrededor de 8, y más preferiblemente de alrededor de 7 a alrededor de 7,5. Otros vehículos incluyen preparaciones de liberación sostenida, tales como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices las cuales están en forma de artículos conformados, por ejemplo películas, liposomas o micropartículas. Será manifiesto para los expertos en la técnica que ciertos vehículos pueden ser más preferibles dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración y concentración de anticuerpo a administrar.
Los anticuerpos se pueden administrar al sujeto, paciente o célula mediante inyección (por ejemplo intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular), o mediante otros métodos tales como infusión, que aseguren su suministro al torrente sanguíneo en una forma eficaz. Se prefiere la inyección local o intravenosa.
Las dosis eficaces y programas para administrar los anticuerpos se pueden determinar empíricamente, y la obtención de tales determinaciones está dentro de la pericia en la técnica. Los expertos en la técnica entenderán que la dosificación de anticuerpos que se debe de administrar variará dependiendo de, por ejemplo, el sujeto que recibirá el anticuerpo, la vía de administración, el tipo particular de anticuerpo usado, y otros fármacos administrados. La guía para seleccionar dosis apropiadas para anticuerpos se encuentra en la bibliografía sobre usos terapéuticos de anticuerpos, por ejemplo Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) capítulo 22 y p. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, Nueva York (1977) p. 365-389. Una dosis diaria típica del anticuerpo usado solo puede oscilar de alrededor de 1 !g/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal o más por día, dependiendo de los factores mencionados anteriormente.
Tras la administración de un anticuerpo para tratar, inhibir o prevenir una infección por VIH, la eficacia del anticuerpo terapéutico se puede evaluar de diversas maneras bien conocidas por el experto. Por ejemplo, un experto normal en la técnica entenderá que un anticuerpo de la invención es eficaz para tratar o inhibir una infección por VIH en un sujeto observando que el anticuerpo reduce la carga viral o evita un incremento adicional en la carga viral. Las cargas virales se pueden medir mediante métodos que son conocidos en la técnica, por ejemplo usando ensayos de reacción en cadena de la polimerasa para detectar la presencia de ácido nucleico de VIH, o ensayos de anticuerpos para detectar la presencia de proteína de VIH en una muestra (por ejemplo, pero sin limitarse a, sangre) de un sujeto
o paciente, o midiendo el nivel de niveles de anticuerpos anti-VIH circulante en el paciente. La eficacia del tratamiento con anticuerpos también se puede determinar midiendo el número de células T CD4+ en el sujeto infectado con VIH. Un tratamiento con anticuerpos que inhiba una disminución inicial o adicional en células T CD4+ en un sujeto o paciente positivo a VIH, o que dé como resultado un incremento en el número de células T CD4+ en el sujeto positivo a VIH, es un tratamiento con anticuerpos eficaz.
d) Enfoques de ácidos nucleicos para el suministro de anticuerpos
Las composiciones de la invención también se pueden administrar a pacientes o sujetos como una preparación de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN o ARN) que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, de manera que las propias células del paciente o del sujeto captan el ácido nucleico y producen y segregan la composición codificada (por ejemplo, CR2-DAF, DAF-CR2, CR2-CD59, CD59-CR2, CR2-CR1, CR1-CR2, CR2-MCP, MCP-CR2, CR2-Crry,
o Crry-CR2.
e) Suministro de ácidos nucleicos
En los métodos descritos anteriormente, que incluyen la administración y captación de ADN exógeno en las células de un sujeto (es decir, la transducción o transfección génica), los ácidos nucleicos de la presente invención pueden estar en forma de ADN o ARN desnudo, o los ácidos nucleicos pueden estar en un vector para suministrar los ácidos nucleicos a las células, con lo que el fragmento de ADN que codifica el anticuerpo está bajo la regulación transcripcional de un promotor, como entendería muy bien un experto normal en la técnica. El vector puede ser una preparación comercialmente disponible, tal como un vector adenovírico (Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval, Quebec, Canadá). El suministro del ácido nucleico o vector a las células puede ser vía una variedad de mecanismos. Como ejemplo, el suministro puede ser vía un liposoma, usando preparaciones liposómicas comercialmente disponibles tales como LIPOFECTINA, LIPOFECTAMINA (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemania) y TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI), así como otros liposomas desarrollados según procedimientos estándar en la técnica. Además, el ácido nucleico o vector de esta invención se puede suministrar in vivo mediante electroporación, cuya tecnología está disponible de Genetronics, Inc. (San Diego, CA), así como por medio de una máquina de SONOPORACIÓN (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ).
Como ejemplo, el suministro del vector puede ser vía un sistema vírico, tal como un sistema de vector retrovírico que puede empaquetar un genoma retrovírico recombinante (véanse, por ejemplo, Pastan et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 85:4486, 1988; Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6:2895, 1986). El retrovirus recombinante se puede usar entonces para infectar y de ese modo suministrar a las células infectadas ácido nucleico que codifica un anticuerpo ampliamente neutralizante (o fragmento activo del mismo) de la invención. El método exacto de introducir el ácido nucleico alterado en células de mamífero no está limitado por supuesto al uso de vectores retrovíricos. Existen ampliamente otras técnicas para este procedimiento, incluyendo el uso de vectores adenovíricos (Mitani et al., Hum. Gene Ther. 5:941-948, 1994), vectores víricos adeno-asociados (AAV) (Goodman et al., Blood 84:1492-1500, 1994), vectores lentivíricos (Naidini et al., Science 272:263-267, 1996), vectores retrovíricos pseudotipados (Agrawal et al., Exper. Hematol. 24:738-747, 1996). También se pueden usar técnicas de transducción física, tales como el suministro de liposomas y mecanismos mediados por receptores y otros mecanismos de endocitosis (véase, por ejemplo, Schwartzenberger et al., Blood 87:472-478, 1996). Esta invención se puede usar juntamente con cualquiera de estos u otros métodos de transferencia génica usados habitualmente.
Como ejemplo, si el ácido nucleico de la invención que codifica el constructo modulador del complemento se suministra a las células de un sujeto en un vector adenovírico, la dosis para la administración de adenovirus a seres humanos puede oscilar de alrededor de 107 a alrededor de 109 unidades formadoras de placas (pfu) por inyección, pero puede ser tan alta como 1012 pfu por inyección (Crystal, Hum. Gene Ther. 8:985-1001, 1997; Alvarez y Curiel, Hum. Gene Ther. 8:597-613, 1997). Un sujeto puede recibir una única inyección, o, si son necesarias inyecciones adicionales, se pueden repetir a intervalos de seis meses (u otros intervalos de tiempo apropiados, según lo determine el experto) durante un período indefinido y/o hasta que se ha establecido la eficacia del tratamiento.
La administración parenteral del ácido nucleico o vector de la presente invención, si se usa, está generalmente caracterizada por inyección. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como disoluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para la disolución de la suspensión en un líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Un enfoque más recientemente revisado para la administración parenteral implica el uso de un sistema de liberación lenta o de liberación sostenida, de manera que se mantenga una dosis constante. Véase, por ejemplo, la patente U.S. 3.610.795. Para una explicación adicional de formulaciones adecuadas y diversas vías de administración de compuestos terapéuticos, véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19ª ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995.
7. Vehículos farmacéuticos/suministro de productos farmacéuticos
Como se describe anteriormente, las composiciones también se pueden administrar in vivo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por “farmacéuticamente aceptable” se quiere decir un material que no es biológicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material se puede administrar a un sujeto, junto con el ácido nucleico o vector, sin provocar efectos biológicos indeseables o interactuar de manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido. El vehículo se seleccionaría naturalmente para minimizar cualquier degradación del ingrediente activo y para minimizar cualesquiera efectos secundarios adversos en el sujeto, como sería bien conocido por un experto en la técnica.
Las composiciones se pueden administrar oralmente, parenteralmente (por ejemplo intravenosamente), mediante inyección intramuscular, mediante inyección intraperitoneal, transdérmicamente, extracorpóreamente, tópicamente, o similar, aunque se prefiere típicamente la administración intranasal tópica o la administración mediante inhalante. Como se usa aquí, “administración intranasal tópica” significa el suministro de las composiciones en los conductos nasal y en la nariz a través de una o de ambas fosas nasales, y puede comprender el suministro mediante un mecanismo de pulverización o mecanismo de gotita, o a través de aerosolización del ácido nucleico o vector. Esto último es eficaz cuando se van a tratar simultáneamente un gran número de animales. La administración de las composiciones mediante inhalante puede ser a través de la nariz o la boca vía el suministro mediante un mecanismo de pulverización o de gotita. El suministro también puede ser directamente a cualquier área del sistema respiratorio (por ejemplo, pulmones) vía intubación. La cantidad exacta de las composiciones requeridas variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, edad, peso y estado general del sujeto, de la gravedad del trastorno alérgico que se trate, del ácido nucleico o vector particular usado, su modo de administración, y similar. De este modo, no es posible especificar una cantidad exacta para cada composición. Sin embargo, un experto normal en la técnica puede determinar una cantidad apropiada usando solamente experimentación habitual dadas las enseñanzas aquí.
La administración parenteral de la composición, si se usa, está generalmente caracterizada por inyección. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como disoluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para disolución de la suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Un enfoque más recientemente revisado para administración parenteral implica el uso de un sistema de liberación lenta
o de liberación sostenida, de manera que se mantenga una dosis constante. Véase, por ejemplo, la patente U.S.
3.610.795.
Los materiales pueden estar en disolución, en suspensión (por ejemplo, incorporados en micropartículas, liposomas,
o células). Estos se pueden dirigir hacia un tipo celular particular vía anticuerpos, receptores, o ligandos de receptores. Las siguientes referencias son ejemplos del uso de esta tecnología para dirigir proteínas específicas hacia tejido tumoral (Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz y McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); y Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)). Los vehículos tales como liposomas “sigilosos” y otros liposomas conjugados a anticuerpos (incluyendo la dianización de fármacos mediados por lípidos a carcinoma colónico), la dianización de ADN mediada por receptores a través de ligandos específicos de las células, la dianización de tumores dirigida por linfocitos, y la dianización retrovírica terapéutica muy específica de células de glioma murino in vivo. Las siguientes referencias son ejemplos del uso de esta tecnología para dirigir proteínas específicas hacia tejido tumoral (Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); y Litzinger y Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)). En general, los receptores están implicados en rutas de endocitosis, ya sea constitutiva o inducida por ligandos. Estos receptores se agrupan en canteras revestidas de clatrina, entran en la célula vía vesículas revestidas con clatrina, pasan a través de un endosoma acidificado en el que se clasifican los receptores, y entonces se reciclan a la superficie celular, se almacenan intracelularmente, o se degradan en lisosomas. Las rutas de internalización sirven a una variedad de funciones, tales como la captación de nutrientes, eliminación de proteínas activadas, aclaramiento de macromoléculas, entrada oportunista de virus y toxinas, disociación y degradación de ligando, y regulación del nivel de receptores. Muchos receptores siguen más de una ruta intracelular, dependiendo del tipo celular, de la concentración del receptor, del tipo de ligando, de la valencia del ligando, y de la concentración del ligando. Se han repasado los mecanismos moleculares y celulares de la endocitosis mediada por receptores (Brown y Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).
a) Vehículos farmacéuticamente aceptables
Las composiciones, incluyendo anticuerpos, se pueden usar terapéuticamente en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los vehículos farmacéuticos son conocidos por los expertos en la técnica. Estos serían muy típicamente vehículos estándar para la administración de fármacos a seres humanos, incluyendo disoluciones tales como agua estéril, disolución salina, y disoluciones tamponadas a pH fisiológico. Las composiciones se pueden administrar intramuscularmente o subcutáneamente. Otros compuestos se administrarán según procedimientos estándar usados por los expertos en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir vehículos, espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes tensoactivos, y similares, además de la molécula de elección. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir uno o más ingredientes activos, tales como agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, anestésicos, y similares.
La composición farmacéutica se puede administrar de muchas maneras, dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico, y del área a tratar. La administración puede ser tópicamente (incluyendo oftálmicamente, vaginalmente, rectalmente, intranasalmente), oralmente, mediante inhalación, o parenteralmente, por ejemplo mediante goteo intravenoso, inyección subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. Los anticuerpos descritos se pueden administrar intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutáneamente, intracavidad, o transdérmicamente.
Las preparaciones para administración parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, disoluciones emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo disolución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactado, o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y de nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer), y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, y gases inertes y similares.
Las formulaciones para administración tópica pueden incluir ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizaciones, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes, y similares.
Las composiciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o disoluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, sellos, o comprimidos. Pueden ser deseables espesantes, saborizantes, diluyentes, emulsionantes, auxiliares de la dispersión o aglutinantes.
Algunas de las composiciones se pueden administrar como una sal de adición de ácidos o de bases farmacéuticamente aceptable, formada mediante reacción con ácidos orgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociánico, ácido sulfúrico, y ácido fosfórico, y ácidos orgánicos tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, y ácido fumárico, o mediante reacción con una base inorgánica tal como hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, y bases orgánicas tales como mono-, di-, trialquil y arilaminas, y etanolaminas sustituidas.
b) Usos terapéuticos
Los intervalos de dosificación para la administración de las composiciones son aquellos suficientemente grandes para producir el efecto deseado en el que se ven afectados los síntomas del trastorno. La dosis no sería tan grande como para provocar efectos secundarios adversos, tal como reacciones cruzadas indeseadas, reacciones anafilácticas, y similares. Generalmente, la dosis variará con la edad, estado, sexo y grado de la enfermedad en el paciente, y puede ser determinada por un experto en la técnica. La dosis se puede ajustar por el médico individual en el caso de contraindicaciones. La dosis puede variar, y se puede administrar en una o más administraciones de dosis diarias, durante uno o varios días.
8.
Medios legibles por ordenador
Se entiende que los ácidos nucleicos y proteínas descritos se pueden representar como una secuencia que consiste en los nucleótidos de aminoácidos. Hay muchas maneras para presentar estas secuencias, por ejemplo el nucleótido guanosina se puede representar por G o g. Igualmente, el aminoácido valina se puede representar por Val o V. Los expertos en la técnica entienden cómo presentar y expresar cualquier secuencia de ácido nucleico o proteica en cualquiera de las diversas formas que existen, considerándose descrita aquí cada una de ellas. Se contempla específicamente aquí la presentación de estas secuencias en medios legibles por ordenador, tales como disquetes, cintas, chips, discos duros, discos compactos y discos de vídeo, comercialmente disponibles, u otros medios legibles por ordenador. También se describen las representaciones de código binario de las secuencias descritas. Los expertos en la técnica entienden qué medios legibles por ordenador. De este modo, los medios legibles por ordenador en los que se registran, almacenan o guardan las secuencias proteicas o ácidos nucleicos.
9.
Composiciones identificadas mediante cribado con composiciones descritas
a) Diseño de fármacos asistido por ordenador
Las composiciones descritas se pueden usar como dianas para cualquier técnica de formación de modelos moleculares para identificar la estructura de las composiciones descritas o para identificar moléculas potenciales o reales, tales como pequeñas moléculas, que interactúan de una manera deseada con las composiciones descritas. Los ácidos nucleicos, péptidos, y moléculas relacionadas descritos aquí se pueden usar como dianas en cualquier programa o enfoque de formación de modelos moleculares.
Se entiende que cuando se usan las composiciones descritas en técnicas de formación de modelos, se identificarán moléculas, tales como moléculas macromoleculares, que tienen propiedades deseadas particulares tales como inhibición o estimulación o la función de la molécula diana. También se describen las moléculas identificadas y aisladas cuando se usan las composiciones descritas, tales como CR2, DAF, CD59, CR1, MCP, Crry, CR2-DAF, DAF-CR2, CR2-CD59, CD59-CR2, CR2-CR1, CR1-CR2, CR2-MCP, MCPCR2 o CR2-Crry, Crry-CR2. De este modo, los productos producidos usando los enfoques de formación de modelos moleculares que implican las composiciones descritas, tales como CR2, DAF, CD59, CR1, MCP, Crry, CR2-DAF, DAF-CR2, CR2-CD59, CD59-CR2, CR2-CR1, CR1-CR2, CR2-MCP, MCP-CR2, CR2-Crry o Crry-CR2, también se consideran aquí descritos.
De este modo, una forma de aislar moléculas que se unen a una molécula de elección es a través de un diseño racional. Esto se logra mediante información estructural y formación de modelos por ordenador. La tecnología de formación de modelos por ordenador permite la visualización de la estructura atómica tridimensional de una molécula seleccionada, y el diseño racional de nuevos compuestos que interaccionarán con la molécula. El constructo tridimensional depende típicamente de datos procedentes de análisis cristalográficos de rayos X o formación de imágenes mediante RMN de la molécula seleccionada. La dinámica molecular requiere datos de campos de fuerza. Los sistemas gráficos por ordenador permiten la predicción de cómo un nuevo compuesto se enlazará a la molécula diana, y permiten la manipulación experimental de las estructuras del compuesto y la molécula diana hasta la especificidad de unión perfecta. La predicción de cuáles serán las interacciones moléculacompuesto cuando se hagan pequeños cambios en uno o ambos requiere un software de mecánica molecular y ordenadores computacionalmente potentes, habitualmente acoplado con interfaces fáciles para el usuario y conducidas por menús entre el programa de diseño molecular y el usuario.
Los ejemplos de sistemas de formación de modelos moleculares son los programas CHARMm y QUANTA, Polygen Corporation, Waltham, MA. CHARMm realiza las funciones de dinámica molecular y minimización de energía. QUANTA realiza la construcción, formación de modelos gráficos y el análisis de la estructura molecular. QUANTA permite la construcción interactiva, modificación, visualización y análisis del comportamiento de las moléculas entre sí.
Un número de artículos repasa la formación de modelos por ordenador de fármacos que interaccionan con proteínas específicas, tales como Rotivinen, et al., 1988 Acta Pharmaceutica Fennica 97, 159-166; Ripka, New Scientist 54-57 (16 de junio, 1988); McKinaly y Rossmann, 1989 Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29, 111-122; Perry y Davies, QSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design p. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis y Dean, 1989 Proc. R. Soc. Lond. 236, 125-140 y 141-162; y, con respecto a una enzima modelo para componentes de ácidos nucleicos, Askew, et al., 1989 J. Am. Chem. Soc. 111, 1082-1090. Otros programas de ordenador que criban y representan gráficamente compuestos químicos están disponibles de compañías tales como BioDesign, Inc., Pasadena, CA., Allelix, Inc, Mississauga, Ontario, Canadá, e Hypercube, Inc., Cambridge, Ontario. Aunque estos se diseñan principalmente para la aplicación a fármacos específicos para proteínas particulares, se pueden adaptar para diseñar moléculas que interaccionan específicamente con regiones específicas de ADN o ARN, una vez que se identifica esa región.
Aunque descrito anteriormente con referencia al diseño y generación de compuestos que podrían alterar la unión, también se podrían cribar librerías de compuestos conocidos, incluyendo productos naturales y compuestos químicos sintéticos, y materiales biológicamente activos, incluyendo proteínas, para compuestos que alteran la unión al sustrato o la actividad enzimática.
10. Kits
Se describen aquí kits que se obtienen para reactivos que se pueden usar en la práctica de los métodos descritos aquí. Los kits pueden incluir cualquier reactivo o composición de reactivos explicados aquí o que se entendería que se necesitan o son beneficiosos en la práctica de los métodos descritos. Por ejemplo, los kits podrían incluir cebadores para llevar a cabo las reacciones de amplificación explicadas en ciertas realizaciones de los métodos, así como los tampones y enzimas requeridos para usar los cebadores como se pretende. Por ejemplo, se describe un kit para evaluar el riesgo de un sujeto al cáncer, asma, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, artritis reactiva, espondiloartritis, vasculitis sistémica, diabetes mellitus insulinodependiente, esclerosis múltiple, encefalomielitis alérgica experimental, síndrome de Sjögren, enfermedad de hospedante frente a injerto, enfermedad inflamatoria del intestino, incluyendo enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, lesión por reperfusión isquémica, infarto de miocardio, enfermedad de Alzheimer, rechazo de transplantes (alogénico y xenogénico), trauma térmico, cualquier inflamación inducida por complejo inmunitario, glomerulonefritis, miastenia grave, esclerosis múltiple, lupus cerebral, síndrome de Guillain-Barre, vasculitis, esclerosis sistémica, anafilaxis, reacciones al catéter, ateroma, infertilidad, tiroiditis, ARDS, síndrome de post-bypass, hemodiálisis, reumatoide juvenil, síndrome de Behcet, anemia hemolítica, pénfigo, penfigoide ampolloso, apoplejía, aterosclerosis, y esclerodermia.
E. Métodos para obtener las composiciones
Las composiciones descritas aquí y las composiciones necesarias para llevar a cabo los métodos descritos se pueden obtener usando cualquier método conocido por los expertos en la técnica para ese reactivo o compuesto particular, excepto que se señale específicamente de otro modo.
Se describen métodos para obtener una composición que comprende un constructo, en los que el constructo comprende CR2 y un modulador del complemento. También se describen métodos para obtener una composición, en los que la composición es la composición de la invención.
1. Síntesis peptídica
Un método para producir las proteínas descritas, tales como SEC ID NO: 6, es enlazar juntos dos o más péptidos o polipéptidos mediante técnicas de química de proteínas. Por ejemplo, los péptidos o polipéptidos se pueden sintetizar químicamente usando equipo de laboratorio actualmente disponible usando química de Fmoc (9fluorenilmetiloxicarbonilo) o de Boc (terc-butiloxicarbonilo) (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que un péptido o polipéptido que corresponde a las proteínas descritas, por ejemplo, se puede sintetizar mediante reacciones químicas estándar. Por ejemplo, un péptido o polipéptido se puede sintetizar y no escindir de su resina de síntesis, mientras que el otro fragmento de un péptido o proteína se puede sintetizar y escindir subsiguientemente de la resina, exponiendo de ese modo un grupo terminal que está funcionalmente bloqueado en el otro fragmento. Mediante reacciones de condensación de péptidos, estos dos fragmentos se pueden unir covalentemente vía un enlace peptídico en sus términos carboxilo y amino, respectivamente, para formar un anticuerpo, o fragmento del mismo (Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman y Co., N.Y. (1992); Bodansky M y Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY) (que incluye material relacionado con la síntesis de péptidos). Como alternativa, el péptido o polipéptido se sintetiza independientemente in vivo como se describe aquí. Una vez aislados, estos péptidos o polipéptidos independientes se pueden enlazar para formar un péptido o fragmento del mismo vía reacciones de condensación de péptidos similares.
Por ejemplo, la ligación enzimática de segmentos peptídicos clonados o sintéticos permite que se unan fragmentos peptídicos relativamente cortos para producir fragmentos peptídicos más grandes, polipéptidos o dominios proteicos completos (Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991)). Como alternativa, la ligación química nativa de péptidos sintéticos se puede utilizar para construir sintéticamente grandes péptidos o polipéptidos a partir de fragmentos peptídicos más cortos. Este método consiste en una reacción química de dos etapas (Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)). La primera etapa es la reacción quimioselectiva de un tioéster de péptido sintético sin proteger con otro segmento peptídico sin proteger que contiene un resto Cys aminoterminal para dar un intermedio enlazado con tioéster como producto covalente inicial. Sin un cambio en las condiciones de reacción, este intermedio sufre una reacción intramolecular espontánea y rápida para formar un enlace peptídico nativo en el sitio de ligación (Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97101; Clark-Lewis I et al., J. Biol. Chem., 269:16075 (1994); Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991); Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)).
Como alternativa, los segmentos peptídicos sin proteger están enlazados químicamente, en los que el enlace formado entre los segmentos peptídicos como resultado de la ligación química es un enlace no natural (no peptídico) (Schnolzer, M et al. Science, 256:221 (1992)). Esta técnica se ha usado para sintetizar análogos de dominios proteicos, así como grandes cantidades de proteínas relativamente puras con actividad biológica completa (deLisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, Nueva York, p. 257-267 (1992)).
2. Procedimiento para obtener las composiciones
Se describen procedimientos para obtener las composiciones, así como para obtener los intermedios que conducen a las composiciones. Por ejemplo, se describen ácidos nucleicos en las SEC ID NO: 5. Hay una variedad de métodos que se pueden usar para obtener estas composiciones, tales como métodos químicos sintéticos y métodos de biología molecular estándar. Se entiende que los métodos para obtener estas y las otras composiciones descritas se describen específicamente.
Se describen moléculas de ácido nucleico producidas mediante el procedimiento que comprende enlazar de manera operativa un ácido nucleico que comprende la secuencia expuesta en SEC ID NO: 25 y una secuencia que controla la expresión del ácido nucleico.
También se describen moléculas de ácido nucleico producidas mediante el procedimiento que comprende enlazar de manera operativa una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que tiene 80% de identidad con una secuencia expuesta en SEC ID NO: 25, y una secuencia que controla la expresión del ácido nucleico.
Se describen animales no humanos producidos mediante el procedimiento de transfectar una célula en el animal con cualesquiera de las moléculas de ácidos nucleicos descritas aquí. Se describen animales no humanos producidos mediante el procedimiento de transfectar una célula en el animal con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas aquí, en el que el animal es un mamífero. También se describen animales no humanos producidos mediante el procedimiento de transfectar una célula en el animal con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas aquí, en el que el mamífero es ratón, rata, conejo, vaca, oveja, cerdo, o primate.
También se describen animales producidos mediante el procedimiento de añadir al animal cualquiera de las células descritas aquí.
F. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a aquellos expertos en la técnica una descripción y explicación completa de cómo se obtienen y se evalúan los compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos reivindicados aquí, y están destinados para ser puramente ejemplares de la invención y no pretenden limitar el alcance de lo que el Dr. Tomlinson considera su invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se podrían encontrar algunos errores y desviaciones. Excepto que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, la temperatura está en ºC o está a la temperatura ambiente, y la presión es la atmosférica o próxima a ella.
1. Ejemplo 1: Dianización de inhibidores del complemento mediada por el receptor 2 del complemento (CR2) hacia sitios de activación del complemento
a) Métodos
(1)
Estirpes celulares y ADN.
Todas las manipulaciones del ADN se llevaron a cabo en el vector de expresión de mamífero PBM, derivado de p118-mIgG1 (30) mediante supresión de la región codificante de Fc de IgG1 de ratón. Para la expresión proteica se usaron células de ovario de hámster chino (CHO), y se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (GIBCO Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) suplementado con 10% de FCS. Los clones de células CHO transfectados de forma estable se cultivaron en presencia de G418, y, para la expresión proteica recombinante, las células se cultivaron en suspensión en CHO-S-SFM II sin FCS (GIBCO). Se cultivaron células U937 en RPMI (GIBCO), 10% de FCS.
(2)
Anticuerpos, reactivos y suero.
El anticuerpo de conejo para DAF y CD59 humanas purificadas de membrana de células de CHO se preparó mediante técnicas estándar (31). Se describen mAb anti-DAF de ratón 1H4 (32), mAb anti-CD59 de rata YTH53.1
(33)
y mAb anti-CR2 humana de ratón 171 (se une a SCR 1-2) (34). IgM anti-eritrocitos de oveja se obtuvo de Research Diagnostic Inc. (Flanders, NJ). Todos los anticuerpos secundarios se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO). sCD59 recombinante purificada fue un regalo de Dr. B. P. Morgan (University of Wales, Cardiff, UK). El suero humano sin C6 se adquirió de Quidel (San Diego, CA), y el suero humano normal (NHS) se obtuvo de la sangre de voluntarios sanos en el laboratorio.
(3)
Construcción de plásmidos de expresión y expresión proteica.
En la Figura 1 se representan las proteínas de fusión recombinantes y los inhibidores solubles del complemento. Los constructos de ADNc se prepararon uniendo la secuencia CR2 que codifica las 4 unidades de SCR N-terminales (restos 1-250 de proteína madura, número de acceso Swissprot P20023) a las secuencias que codifican regiones extracelulares de DAF o CD59. Las secuencias de los inhibidores del complemento usadas codificaron los restos 1249 de la secuencia de la proteína DAF madura (número de acceso Swissprot P08174) y los restos 1-77 de la secuencia proteica de CD59 madura (número de acceso Swissprot P13987). Para unir las secuencias de CR2 a las secuencias de los inhibidores del complemento, se usaron secuencias ligadoras que codifican SS(GGGGS)3 y (GGGS)2 para proteínas de fusión que contienen CR2 en el término C y término N, respectivamente. Los constructos génicos se prepararon mediante metodología de PCR estándar (35). Todas las etapas de clonación se llevaron a cabo en el vector PBM, que también se usó para la expresión proteica (30). Para la expresión, los plásmidos se transfectaron en células CHO usando lipofectamina según las instrucciones del fabricante (GIBCO). Se seleccionaron clones transfectados de forma estable limitando la dilución como se describe (30), y la expresión proteica de los clones se cuantificó mediante ELISA.
(4)
Ensayos de ELISA y de proteínas.
La detección de las proteínas recombinantes y la determinación de la concentración proteica relativa en los sobrenadantes de cultivo se logró usando una técnica de ELISA estándar (31). Dependiendo de qué tipo de proteína recombinante se estaba evaluando, el anticuerpo de captura fue mAb 1H4 anti-DAF o mAb YTH53.1 anti-CD59. Los anticuerpos de detección primarios fueron anticuerpo policlonal de conejo anti-DAF o anti-CD59. En algunos ELISA, también se usó mAb A-3 anti-CR2 como anticuerpo de detección primario, y, aunque menos sensible, se obtuvieron datos similares. La concentración proteica de las proteínas recombinantes se determinó mediante absorbancia de UV o usando un kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce Chemical Company, Rockford I11).
(5)
Purificación de proteínas.
Las proteínas recombinantes se purificaron del sobrenadante de cultivo mediante cromatografía de afinidad. Las columnas de afinidad se prepararon acoplando mAb 1H4 anti-DAF o mAb YTH53.1 anti-CD59 a columnas de afinidad activadas con NHS HiTrap (Pharmacia Biotech, Nueva Jersey, USA), como se describe por el fabricante. Los sobrenadantes de cultivo que contienen proteínas recombinantes se ajustaron hasta pH 8,0 y se aplicaron a columnas de afinidad a un caudal de 0,5 ml/min. La columna se lavó con 6 a 8 volúmenes de columna de PBS, y las proteínas recombinantes se eluyeron con 2 a 3 volúmenes de columna de 0,1 M de glicina, pH 2,4. Las fracciones que contienen la proteína de fusión se recogieron en tubos que contienen 1 M de tampón de Tris, pH 8,0, y se dializaron frente a PBS.
(6)
SDS-PAGE y transferencia Western.
Las proteínas recombinantes purificadas se separaron en geles de acrilamida al 10% de SDS-PAGE (Bio-Rad Life Science, Hercules, CA) en condiciones no reductoras. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie. Para la transferencia Western, se siguieron procedimientos estándar (31). De forma breve, las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de polifluoruro de vinilideno, y las proteínas transferidas se detectaron por medio de mAb 1H4 anti-DAF o mAb YTH53.1 anti-CD59. Las membranas se desarrollaron con el kit de detección de ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). También se analizó CR2-CD59 mediante SDS-PAGE tras el tratamiento con glucanasa. CR2-CD59 (2 mg) se calentó a 95ºC durante 3 min en 15 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7,5) que contiene 0,1% de SDS, 10 mM de 2-mercaptoetanol y 5 nM de EDTA. Después de enfriar, CR2-CD59 se incubó con 3 U de N-glucanasa de Flavobacterium meningosepticum (EC 3.5.1.52, Sigma) durante 20 h a 37ºC en presencia de 1% de Nonidet P40 y 9,3 mM de PMSF.
(7)
Citometría de flujo.
La unión de las proteínas de fusión recombinantes a células opsonizadas con C3 se determinó mediante citometría de flujo. Las células de CHO se incubaron en 10% de antisuero anti-CHO (30 min/4ºC), se lavaron y se incubaron en 10% de NHS sin C6 (45 min/ 37ºC). Las células opsonizadas con C3 se lavaron entonces y se incubaron con 1 !M de proteína recombinante (60 min/4ºC). Después del lavado, las células se incubaron con 10 !g/ml de mAb 1H4 anti-DAF o mAb YTH53.1 anti-CD59, según sea apropiado (30 min/4ºC), seguido del anticuerpo secundario conjugado con FITC (1:100, 30 min/4ºC). Las células se lavaron entonces, se fijaron con 2% de paraformaldehído en PBS, y se analizaron usando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Todas las incubaciones y lavados se llevaron a cabo en DMEM.
(8)
Análisis de la unión de la proteína de fusión de CR2 al ligando de C3.
El análisis cinético de la interacción de las proteínas de fusión de CR2 con C3dg-biotina se llevó a cabo usando medidas de resonancia plasmónica de superficie (SPR) realizadas en un instrumento BIAcore 3000. C3dg-biotina humana, preparada como se describe (36), se unió a la superficie de chips sensores de estreptavidina (SA) de BIAcore inyectando C3dg-biotina a 50 !g/ml sobre la superficie de una celda de flujo del chip a 2 !l/minuto durante 20 minutos. El tampón de flujo fue 0,5X PBS + 0,05% de Tween 20. La señal de SPR de C3dg capturado generó unidades de respuesta de BIAcore que oscilan de 250-500. Las células de flujo revestidas con estreptavidina de control se hicieron pasar en ausencia de proteína. La unión se evaluó a lo largo de un intervalo de concentraciones de proteína de fusión de CR2 (15,6-500 nM) en 0,5X PBS, 0,05% de Tween 20 a 25ºC a un caudal de 25 !l/minuto. Las muestras de proteína de fusión de CR2 se inyectaron en alícuotas de 50 !l usando el comando kinject. La asociación de las proteínas de fusión con el ligando se monitorizó durante 120 segundos, después de lo cual se dejó que el complejo se disociara en presencia de tampón solamente durante 120 segundos adicionales. La superficie de unión se regeneró entre análisis de concentraciones diferentes de proteínas de fusión mediante un pulso de 10 segundos de 200 mM de carbonato de sodio (pH 9,5) a 50 !l/min. La unión de los fragmentos de las proteínas de fusión de CR2 a células de flujo inmovilizadas con C3d se corrigió para la unión a células de flujo de control. Los datos de la unión se ajustaron a un modelo de unión de Langmuir 1:1 usando el software de BIAevaluation Versión
3.1 (BIAcore), y se evaluaron para el mejor ajuste mediante los valores de #2 y residual bajo. Los perfiles de disociación cinética obtenidos se usaron para calcular velocidades de asociación y de disociación (ka y kd) y constantes de afinidad (KD) usando el programa de BIAevaluation Versión 3.1. Entre experimentos, la superficie de estreptavidina se regeneró con un pulso de 60 s de 50 mM de hidróxido sódico (pH 9,S) a 50 !l/minuto, y se volvió a aplicar C3dg-biotina como se describe anteriormente.
(9)
Ensayos de lisis del complemento.
Células de CHO a un confluencia de 60%-80% se despegaron con verseno (GIBCO), se lavaron dos veces, y se resuspendieron hasta 106/ml en DMEM. Las células se sensibilizaron con el complemento añadiendo 10% de antisuero de conejo anti-membrana celular de CHO a las células (30 min/4ºC). El antisuero se eliminó entonces, y las células se resuspendieron en NHS diluido en DMEM. Los volúmenes de ensayo finales fueron 50 o 100 !l. Después de 45 min a 37ºC, se determinó la viabilidad celular mediante exclusión con azul de tripán (tanto células vivas como muertas contadas) o liberación de 51Cr (37). Ambos ensayos dieron resultados similares. Para ensayar la actividad inhibidora del complemento de las proteínas recombinantes, las proteínas se diluyeron en DMEM y se añadieron a NHS antes de la adición a las células de CHO. Se usó una concentración final de 10% de NHS, lo que dio como resultado aproximadamente 90% de lisis de células de CHO sensibilizadas con el anticuerpo sin proteger. La inhibición de la hemólisis mediada por el complemento se determinó usando eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos (EA) (Advanced Research Technologies, San Diego, CA). Los ensayos hemolíticos se llevaron a cabo en tampón de veronal en gelatina (GVB++) (Advanced Research Technologies) en un volumen final de 300 !l que contiene 2,5 x 107 EA, NHS a una dilución final de 1/300 y concentraciones en incremento de proteína de fusión. Las mezclas de reacción se incubaron a 37ºC durante 60 min, y las reacciones se detuvieron mediante adición de 300 !l de PBS que contiene 10 mM de EDTA. Las células se eliminaron mediante centrifugación, y la lisis celular se ensayó mediante cuantificación espectrofotométrica de hemoglobina en el sobrenadante a 413 nm.
(10)
Adhesión de células U937 a eritrocitos.
Se llevaron a cabo ensayos de adhesión dependiente de CR3 a eritrocitos opsonizados con C3 esencialmente como se describe (38). De forma breve, se sensibilizaron eritrocitos de oveja recientes (SRBC) con una cantidad subaglutinante predeterminada de IgM de conejo anti-SRBC durante 30 min a 37°C en GVB (Advanced Research Technologies). Después de lavar dos veces, SRBC opsonizados con C3b se prepararon incubando SRBC sensibilizado con IgM con un volumen igual de una dilución 1:2 de suero humano deficiente en C6 en GVB (120 min/37ºC). Las células se lavaron dos veces, y los peletes se resuspendieron en GVB. La mayoría de C3 unido a los eritrocitos tras este tratamiento está en forma de productos de degradación iC3b o C3d (ligandos de CR2) debido a la semivida corta de C3b en el suero. Se añadieron células U937 (4 x 105 células en 200 !l) a 50 !l de SRBC opsonizados C3 con (2 x 106 células), y la mezcla se centrifugó (4min/40 x g) y se dejó a temperatura ambiente durante 90 min. Las células se examinaron entonces mediante microscopía de contraste de fases, y se determinó el número de células U937 adherentes a eritrocitos. Se puntuaron al menos 100 eritrocitos por muestra, y se calculó el número medio de células U937 unidas por eritrocito. Las determinaciones por triplicado se realizaron para cada experimento llevado a cabo. En algunas realizaciones, las células U937 se cultivaron durante 3 días en presencia de miristato-acetato de forbol 50 ng/ml (PMA) antes de cosechar, un tratamiento que da como resultado el aumento de CR3 (39, 40). Como controles, se usaron células incubadas con SRBC revestidos con IgM solos, o SRBC incubados directamente con suero humano deficiente en C6.
(11)
Estudios de biodistribución.
Se llevaron a cabo procedimientos estándar para determinar la distribución tisular de proteínas radiomarcadas inyectadas (41, 42). De forma breve, se inyectaron 1,7 μg de CR2-DAF marcada con 125 I (4,20 x 106 cpm/mg) o sDAF (4,84 x 106 cpm/mg) en la vena de la cola de ratones NZB/NZW F1 hembras de 34 semanas (Jackson Labs, Bar Harbor, ME). Después de 24 h, se tomó una muestra de sangre y se retiraron los órganos principales, se desprendió y se lavó con PBS que contiene 10 mM de EDTA, se pesó y se contó. La especificidad de la dianización se evaluó como porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido. Las proteínas se iodaron usando el método de iodógeno según las instrucciones del fabricante (Pierce Chemical Co.).
(12)
Microscopía de inmunofluorescencia.
Se inyectaron CR2-DAF o sDAF (270 !g) en la vena de la cola de ratones MRL/lpr de 24 semanas. Veinticuatro horas más tarde, los riñones se retiraron y se congelaron instantáneamente. Secciones criostáticas (5 μm) preparadas a partir de riñones congelados se fijaron en acetona y se procesaron para la microscopía de inmunofluorescencia indirecta. Se usó una mezcla equimolar de mAbs anti-DAF humana 1A10 y 1H6 de ratón como anticuerpos de detección primarios (concentración final, 10 !g/ml) con un anticuerpo secundario conjugado a FITC específico de Fc anti-IgG de ratón (F4143, Sigma-Aldrich). Se siguieron procedimientos estándar (49, incorporados aquí como referencia por su enseñanza de técnicas de tinción de anticuerpos), excepto que para reducir la tinción de fondo, muy probablemente provocada por complejos inmunitarios depositados en el riñón de ratón, el anticuerpo secundario marcado con FITC se diluyó 1:800 (10 veces la dilución recomendada). Se adquirieron imágenes digitales y se optimizaron con Adobe Photoshop usando ajustes idénticos.
b) Resultados.
(1)
Diseño, expresión y purificación de los constructos.
Las proteínas de fusión recombinantes contenían las cuatro unidades de SCR N-terminales de CR2 humana enlazadas al término N o C de formas solubles de CD59 o DAF humana (constructos representados en la Figura 1). Las proteínas recombinantes se purificaron a partir del sobrenadante de cultivo de clones de células de CHO trasfectados de forma estable, con rendimientos entre 100-200 !g/l. El análisis de las proteínas recombinantes purificadas mediante SDS-PAGE y transferencia Western reveló proteínas en el intervalo de pesos moleculares esperados (Figura 2), y, excepto para CR2-CD59, todas las proteínas migraron como una única banda. Las dos bandas observadas para CR2-CD59 fueron debidas a diferencias en la glucosilación, puesto que CR2-CD59 migró como una única banda tras el tratamiento con glucanasa.
(2)
Dianización de proteínas de fusión a células opsonizadas del complemento.
El ligando de C3 para CR2 se depositó sobre células de CHO mediante incubación de células de CHO con anticuerpo activante del complemento y suero sin C6 (para prevenir la formación de MAC y la lisis celular). Todas las proteínas de fusión que contienen CR2, pero no sCD59 o sDAF se unieron a células de CHO revestidas con C3 (Figura 3).
(3)
Análisis cinético de la interacción entre proteínas de fusión y el ligando C3dg..
Se determinó mediante medidas de resonancia plasmónica de superficie una comparación de la afinidad de las diferentes proteínas de fusión recombinantes para el ligando C3dg de CR2. Los experimentos se llevaron a cabo haciendo pasar concentraciones variables de las proteínas de fusión sobre chips de estreptavidina de Biacore que contienen C3dg-biotina capturada (aproximadamente 2000 unidades de respuesta). El análisis cinético de los datos mostró el mejor ajuste a un modelo de interacción de unión 1:1 (Langmuir) usando parámetros de ajuste global (Figura 4). Ambas proteínas de fusión con CR2 en el término N (CR2-DAF y CR2-CD59) mostraron perfiles de unión similares, con una velocidad rápida de asociación y una velocidad rápida de disociación. Por el contrario, la unión de las proteínas de fusión con CR2 en el término C (DAF-CR2 y CD59-CR2) mostró velocidades lentas de asociación y de disociación (Figura 4, Tabla 1). Sin embargo, las proteínas de fusión de CR2 del término N se unieron con la mayor afinidad (Tabla 1). Las proteínas de fusión de CD59 se unieron con una mayor afinidad que las proteínas de fusión de DAF. DAF soluble y sCD59 no se unieron a C3dg inmovilizado.
(4)
Actividad inhibidora del complemento de las proteínas de fusión.
La actividad inhibidora del complemento de los inhibidores del complemento dianizados y no dianizados se analizó midiendo su efecto sobre la lisis mediada por el complemento tanto de células de CHO como eritrocitos. En estos experimentos, las células sensibilizadas a anticuerpos y las proteínas recombinantes se incubaron en suero humano a una concentración que dio como resultado una lisis de 90-100% de las células sin proteger. Para ambos tipos celulares, los inhibidores del complemento dianizados fueron significativamente más eficaces que sus proteínas no dianizadas respectivas a la hora de inhibir la lisis mediada por el complemento. Las proteínas de DAF dianizadas fueron más eficaces como inhibidores que CD59 dianizada (Figuras 5 y 6). Las proteínas de fusión que contienen CR2 enlazado al término N de DAF y CD59 fueron inhibidores más eficaces que las proteínas de fusión de CR2 Cterminales. El inhibidor más potente de la lisis del complemento fue CR2-DAF, que requiere una concentración de 18 nM para una inhibición del 50% de la lisis de células de CHO. Por el contraste, sDAF no dianizadas requirió una concentración de 375 nM para la inhibición del 50% de la lisis de células de CHO, una diferencia de 20 veces (Figura 5a). sCD59 fue un inhibidor particularmente malo del complemento, y sólo proporcionó 25% de protección de la lisis de células de CHO a 500 nM, la concentración más elevada ensayada. Sin embargo, CR2-CD59 proporcionó una inhibición del 50% de la lisis de células de CHO a 102 nM, y fue más eficaz que sDAF sin dianizar (Figura 6a). La Tabla 4 compara las actividades inhibidoras de los diferentes inhibidores del complemento recombinantes. La mayor actividad inhibidora del complemento de las proteínas de fusión de CR2 del término N se correlacionó con la mayor afinidad de estas proteínas mostrada para el ligando de C3dg (Tabla 3).
Hubo algunas diferencias entre la eficacia relativa de los inhibidores del complemento a la hora de proteger células de CHO y eritrocitos de la lisis mediada por el complemento. Esto fue particularmente cierto para los inhibidores de DAF; sDAF fue significativamente más eficaz protegieron eritrocitos que las células de CHO del complemento, aunque DAF dianizada fue todavía más eficaz. También hubo poca diferencia en la actividad inhibidora de CR2-DAF y DAF-CR2 cuando los eritrocitos fueron las células diana para la lisis del complemento.
(5)
Efecto de proteínas de fusión de CR2 sobre la adhesión celular.
El receptor 3 del complemento es un receptor leucocítico implicado en la adhesión endotelial y diapedesis y la activación de mecanismos citolíticos celulares (fagocitosis y desgranulación). Puesto que CR2 y CR3 comparten el mismo ligando del complemento iC3b, se determinó si las proteínas de fusión de CR2 interfirieron con la unión de las células mediada por CR3. Para estos experimentos, se usaron U937, una extirpe celular promonocítica bien caracterizada (CR2-, CR3+) que se un a eritrocitos revestidos con iC3b en un mecanismo dependiente de CR3 (40). Todas las proteínas de fusión de CR2, pero no sDAF o sCD59, inhibieron significativamente la unión de células U937 a eritrocito de oveja opsonizados con C3 (P<0,01). Cada proteína de fusión de CR2 inhibió la unión de U937 en un grado similar a una concentración de 500 nM (figura 7). Se obtuvieron datos similares en un experimento usando células U937 que se estimularon con PMA, un tratamiento que dio como resultado el aumento de CR3 (39, 40). Para la opsonización del complemento de eritrocitos, se usó IgM para activar el complemento, puesto que IgG depositada sobre los eritrocitos se acoplaría a receptores Fcү expresados en células U937. Las células U937 también expresan CR4 (p150, 95, CD11c/CD18), un tercer receptor que comparte el ligando de Ci3b. Sin embargo, la unión de células U937 a eritrocitos opsonizados con C3 es independiente de CR4, probablemente debido a la asociación de CR4 con el citoesqueleto y su inmovilidad en la membrana (40).
(6)
Dianización de CR2-DAF a los riñones de ratones nefríticos.
Para determinar si una proteína de fusión de CR2 seleccionará como diana un sitio de activación del complemento y de enfermedad in vivo, se llevó a cabo un estudio de biodistribución de CR2-DAF y sDAF en ratones hembras NZB/W F1. Los ratones NZB/W F1 desarrollan una enfermedad autoinmunitaria espontánea que es muy similar a lupus eritematoso sistémico (SLE) humano, con la producción de autoanticuerpos y el desarrollo de glomerulonefritis grave mediada por complejo inmunitario que está asociada con la deposición del complemento desde 26 a 28 semanas (4, 52). La biodistribución de [125I]CR2-DAF y [125I]sDAF en ratones NZB/W F1 de 34 semanas se determinó a las 24 horas y a las 48 horas después de la inyección. Veinticuatro horas después de la inyección de [125I]CR2-DAF en la vena de la cola, se localizó en el riñón una proporción de radioactividad significativamente mayor que en los otros órganos que se examinaron (Figura 25a). A las 48 horas después de la inyección de [125I]CR2-DAF, hubo un nivel similar de radioactividad en el riñón como a las 24 horas, pero aumentó la radioactividad en el hígado y en el bazo, y disminuyó la radioactividad en la sangre (Figura 25b). El hígado y el bazo son sitios de aclaramiento del complejo inmunitario, y probablemente dan cuenta de la dianización incrementada de [125I]CR2-DAF a estos órganos en el punto de tiempo más tardío. [125I]CR2-DAF no mostró unión preferente en el riñón o en ningún otro órgano (Figura 25, a y b). En ratones prenefríticos NZB/W F1 de 8 semanas, no hubo signos de dianización de [125I]CR2-DAF hacia el riñón (Figura 25c). De interés adicional, [125I]CR2-DAF se aclaró mucho más rápidamente de la circulación que [125I]CR2-DAF, sugiriendo que el resto CR2 funciona para prolongar la semivida circulatoria de la proteína de fusión. Sin embargo, el nivel de [125I]CR2-DAF en la sangre de ratones más jóvenes a las 24 horas fue alrededor de la mitad que el registrado en los ratones más viejos, y la semivida circulatoria prolongada de [125I]CR2-DAF puede ser una consecuencia, al menos en parte, de su unión a complejos inmunitarios circulantes.
La dianización de CR2-DAF hacia el complemento depositado en el riñón también se examinó en otro modelo murino de SLE, mediante examen directo de secciones del riñón. Al igual que los ratones NZB/W F1 hembras, los ratones MRL/lpr desarrollan glomerulonefritis proliferativa grave con la deposición de complemento en asociación con depósitos inmunitarios glomerulares hacia las 24 semanas de edad (53, incorporado aquí por su enseñanza de este modelo de ratón). Se inyectaron CR2-DAF y sDAF en la vena de la cola de ratones MRL/lpr de 24 semanas, y se analizaron secciones de riñón 24 horas más tarde en busca de inmunorreactividad a DAF humana mediante microscopía de fluorescencia. Las secciones de riñón procedentes de un ratón inyectado con CR2-DAF presentaron un nivel elevado de tinción de DAF, con localización preferente en los glomérulos en un patrón idéntico al observado para complejos inmunitarios. No hubo evidencias de tinción de DAF en los glomérulos de un ratón inyectado con sDAF (Figura 26).
c) Conclusiones
Este estudio describe la generación y caracterización de proteínas que contienen DAF y CD59 humanas solubles que son dirigidas hacia un sitio de activación del complemento. Las proteínas dianizadas fueron significativamente más potentes inhibiendo el complemento que sus contrapartes no dianizadas. La dianización de CD59 y DAF se logró enlazando los inhibidores a un fragmento de CR2 humana que se une a productos de activación del complemento C3. Los ligandos de C3 para CR2 tienen una vida relativamente prolongada y se unen covalentemente, a menudo en grandes cantidades, en sitios de activación del complemento. De este modo, la dianización de la inhibición del complemento mediada por CR2 es de beneficio terapéutico para numerosas enfermedades o estados mórbidos asociados al complemento. Consistente con esta hipótesis, se mostró que CR2-DAF dianiza a los riñones de ratones NZB/W F1 nefríticos. Estos ratones producen autoanticuerpos con formación y deposición consiguiente de complejos inmunitarios en el riñón, dando como resultado la activación y deposición de complemento (2, 43). CR2 humana se une a ligandos de C3 humanos y de ratón con afinidades similares (44), y los estudios de biodistribución establecen que una proteína de fusión de CR2 retiene la función dianizadora in vivo. Este estudio establece la idoneidad de este enfoque para la inhibición de complemento humano. El enfoque de dianización también puede ser eficaz para otros inhibidores de la activación del complemento, tales como CR1 soluble, que está en ensayos clínicos y es un inhibidor del complemento más potente que DAF in vitro (9).
Las afinidades relativas por C3dg de las diferentes proteínas de fusión de CR2 recuerda a las afinidades de SCR 1-2 de CR2 y SCR 1-15 de CR2 por C3dg. Los valores de KD para las interacciones de SCR1-2 de CR2 y de SCR 1-15 de CR2 con C3dg fueron similares, pero SCR 1-2 de CR2 se asoció y se disoció mucho más rápidamente, indicando una contribución de los dominios de SCR adicionales a la afinidad global (36). El análisis de la estructura en disolución de otra proteína que contiene SCR, el factor H, indicó que los dominios de SCR están replegados sobre sí mismos, y las interacciones entre los dominios de SCR pueden modular las características de unión al ligando de C3 (45). Se predice que la variabilidad conformacional entre dominios de SCR resulta de diferentes longitudes de ligador (nativo), proporcionando ligadores más prolongados una mayor flexibilidad conformacional. En este contexto, los dominios de SCR de CR2 y DAF están enlazados con un ligador ser-gly relativamente largo, y esto puede permitir que las parejas de fusión se replieguen unas sobre otras dando como resultado interacciones SCR-SCR que pueden modular la afinidad de unión de CR2.
Se llevaron a cabo ensayos de lisis mediada por el complemento usando como dianas células de CHO sensibilizadas a anticuerpos o eritrocitos de oveja. Hubo diferencias notables en las actividades relativas de algunos de los inhibidores del complemento a la hora de proteger las diferentes células de la lisis mediada por el complemento. sDAF, DAF-CR2, y CD59-CR2 fueron significativamente más eficaces protegiendo eritrocitos de oveja que las células de CHO de la lisis mediada por el complemento. A diferencia de los eritrocitos, la lisis mediada por el complemento de células nucleadas no es debida completamente a desregulación osmótica coloidal, y se requiere la deposición de múltiples MACs en la membrana plasmática (46-48). La mayoría de los estudios previos que investigan la actividad inhibidora de inhibidores del complemento solubles (no dianizados) se han llevado a cabo usando eritrocitos como células diana para la lisis mediada por el complemento. Sin embargo, las células de CHO representan probablemente una diana fisiológicamente más relevante para estudios in vitro.
Diferentes mecanismos de daño mediado por el complemento están implicados en diversas afecciones, y diferentes enfermedades se pueden beneficiar de estrategias de inhibición que actúan en diferentes puntos en la ruta. Por ejemplo, si es aplicable para la enfermedad, un beneficio particular de bloqueo del complemento en una etapa tardía en la ruta sería que las funciones de defensa del hospedante y los mecanismos de homeostasia inmunitarios del complemento permaneciesen intactos. De este modo un inhibidor a base de CD59 proporcionaría ventajas con respecto a inhibidores de la activación del complemento en enfermedades en las que la ruta citolítica terminal está implicada principalmente en la patogénesis. Es improbable que CD59 soluble tenga beneficio terapéutico debido a su actividad muy mala in vitro, pero se mostró aquí que la dianización de CD59 mediada por CR2 aumentó significativamente su actividad inhibidora del complemento. De hecho, CR2-CD59 fue mas eficaz inhibiendo la lisis mediada por el complemento que sDAF, y sDAF ha mostrado eficacia terapéutica en vivo (8). Los análogos de CR2-CD59 de roedores también pueden ser herramientas útiles para estudiar los papeles relativos de productos de activación del complemento tempranos frente a la formación de MAC en la patogénesis de la enfermedad. Las contribuciones relativas de los diferentes productos de activación del complemento a la lesión tisular en muchos estados mórbidos están poco comprendidas y son controvertidas.
Las proteínas de fusión de CR2 inhibieron la unión de las células U937 a eritrocitos opsonizados con C3. Tanto CR2 como CR3 se unen a iC3b, y este dato indica que las proteínas de fusión de CR2 actúan como antagonistas de CR3, puesto que la unión de U937 a eritrocitos opsonizados con C3 depende de CR3 (40). Como molécula de adhesión, CR3 media la adhesión endotelial y diapédesis en sitios de inflamación vía su interacción de afinidad elevada con la molécula 1 de adhesión intercelular (ICAM-1). Como receptor del complemento, CR3 promueve y potencia la fagocitosis y desgranulación vía su interacción con iC3b. Tanto ICAM-1 como iC3b se unen a epítopos solapantes en CR3 (véase la revisión de Ross). De este modo, CR3 puede ser un determinante importante a la hora de promover daño tisular mediado por células en sitios de inflamación, y los anticuerpos que bloquean CR3 han mostrado eficacia en varias afecciones inflamatorias (véase el repaso de Ross). El efecto antagonista de CR2 sobre la unión de CR3 indica por lo tanto un segundo mecanismo antiinflamatorio de acción de las proteínas de fusión del inhibidor del complemento de CR2, que actúa sinérgicamente con inhibición del complemento.
La dianización de inhibidores del complemento a sitios de activación y enfermedad del complemento puede potenciar considerablemente su eficacia. De hecho, para estados mórbidos que se beneficiarían de la terapia a base de CD59, la dianización de CD59 al sitio de activación del complemento será un requisito. Una ventaja de la dianización mediada por CR2 con respecto a otros enfoques de dianización, tales como dianización mediada por anticuerpos, es que el resto de CR2 selecciona como diana cualquier sitio accesible de activación del complemento, y tiene una amplia aplicación terapéutica. Las proteínas de fusión de CR2 también pueden actuar como antagonistas de CR3, y esto puede representar un segundo beneficio terapéutico importante. Las proteínas de fusión del inhibidor del complemento de CR2 humano también tienen mucha menor probabilidad de ser inmunógenas que los inhibidores recombinantes que contienen regiones variables de anticuerpos. La capacidad predicha de inhibidores dianizados de la activación del complemento para proporcionar una concentración local eficaz con niveles bajos de inhibición sistémica también disminuye la probabilidad de comprometer los mecanismos de defensa del hospedante, particularmente con inhibición del complemento sistémica a largo plazo (esto es una consideración menos importante para inhibidores a base de CD59). Los inhibidores dianizados a CR2 también seleccionan como dianas a agentes infecciosos que activan el complemento.
2. Ejemplo 2: Inhibición y activación del complemento dianizado
a) Inhibidores del complemento (inflamación/bioincompatibilidad)
Los inhibidores de complemento son una promesa considerable para la terapia de muchas enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias, y estados mórbidos asociados con bioincompatibilidad. Actualmente no hay ningún inhibidor farmacéutico seguro y eficaz del complemento. La investigación se ha centrado enormemente en desarrollar inhibidores solubles basados en proteínas reguladoras del complemento unidas a la membrana celular. Se han producido formas recombinantes de CR1, MCP, DAF y Crry solubles mediante eliminación de regiones que se unen a la membrana, y se ha demostrado que todas las proteínas son eficaces reduciendo la inflamación y el daño tisular mediado por el complemento en diversos modelos de enfermedad. CR1 soluble y un anticuerpo que bloquea la función de la proteína del complemento C5 están en ensayos clínicos. Sin embargo, hay serias cuestiones que se refieren al uso clínico de inhibidores del complemento solubles administrados sistémicamente. El complemento desempeña un papel crucial tanto en la inmunidad innata como adaptativa, y la generación de C3b es crítica para la opsonización y aclaramiento mediado por leucocitos de muchos microorganismos patógenos. Además, se ha demostrado que el producto de la activación del complemento en fase fluida C5a es importante a la hora de controlar la infección, y puede ser importante en el aclaramiento de sustancias patógenas desde la circulación. Por lo tanto, es probable que la inhibición sistémica del complemento tenga consecuencias serias para el hospedante con respecto a su capacidad para controlar la infección. El complemento también es crucial para el catabolismo eficaz de complejos inmunitarios, y esto es una consideración particularmente importante en el uso de inhibidores del complemento para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y de complejos inmunitarios.
La dianización de inhibidores del complemento hacia sitios de activación y enfermedad del complemento también permite una concentración sérica eficaz mucho menor, y reduce significativamente el nivel de inhibición sistémica del complemento. Una mayor eficaz es un beneficio importante de los inhibidores del complemento dianizados, y la dianización también puede resolver el problema de una semivida corta de los inhibidores del complemento recombinantes solubles en la circulación.
Además de las consideraciones anteriores con respecto a la dianización de inhibidores del complemento, el bloqueo selectivo de diferentes partes de la ruta del complemento puede permitir la generación de productos beneficiosos de la activación del complemento, pero inhibe la generación de productos de la activación del complemento implicados en la patogénesis de la enfermedad. Por ejemplo, los inhibidores de la activación del complemento (tales como CR1, DAF, Crry) inhiben la generación de C3b, C5a y C5b-9. Los anticuerpos contra C5 inhiben la generación de C5a y C5b-9. Por otro lado, los inhibidores a base de CD59 no afectan a la generación de C3b y C5a, sino que bloquean solamente la formación de C5b-9 (véase la Figura 8). La ruta del complemento terminal y la generación de C5b-9 ha demostrado ser importante a la hora de promover inflamación, y está particularmente implicada en la progresión de algunas enfermedades del riñón (tales como glomerulonefritis por complejo inmunitario). De este modo, para ciertas enfermedades, un inhibidor a base de CD59 puede inhibir la patogénesis de la enfermedad sin interferir con la generación de productos tempranos de la activación del complemento que son importantes para la defensa del hospedante y el aclaramiento del complejo inmunitario. Sin embargo, CD59 soluble no es un inhibidor eficaz del complemento (a diferencia de los inhibidores de la activación DAF, CR1, MCP o Crry), y es improbable que tenga alguna aplicación clínica. Sin embargo, CD59 dirigida contra las células puede representar un compuesto terapéutico viable. Los datos que usan dianización de CD59 mediada por anticuerpos [Zhang et al., 1999, J.Clin.Invest., 103, 5561], y los datos presentados aquí con la dianización de CD59 mediada por CR2, muestran que CD59 dianizada hacia una membrana celular es significativamente más eficaz que CD59 sin dianizar soluble.
c) RESULTADOS-1
(1)
Proteína de fusión del inhibidor del complemento dianizada
Los ejemplos de proteínas de fusión humanas que se han expresado, purificado y caracterizado para dianización y evaluado para determinar la función inhibidora del complemento in vitro como se describe previamente incluyen los siguientes: CR2-DAF, CR2-CD59, DAF-CR2, y CD59-CR2. Las secuencias nucleotídicas y las secuencias de aminoácidos predichas de las proteínas de fusión humanas maduras se muestran en las Figuras 8-11.
(2)
EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN
Los constructos plasmídicos de ADNc que codifican las proteínas de fusión se transfectaron en células de CHO y clones que se expresan de forma estable aislados. Se seleccionaron clones que expresan los niveles más elevados de fusión. Los clones seleccionados se hicieron crecer en biorreactores, y las proteínas de fusión se aislaron del sobrenadante de cultivo mediante cromatografía de afinidad. Se prepararon columnas de afinidad usando anticuerpos anti-DAF y anti-CD59 conjugados con sefarosa. Las proteínas recombinantes se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western (Figura 2).
(3)
UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN A C3
LlGANDOS.
(a)
Citometría de flujo
Se llevaron a cabo experimentos de citometría de flujo como se describe previamente. Todas las proteínas de fusión que contienen CR2 se unieron a células de CHO revestidas con C3, según se analiza mediante citometría de flujo (Figura 12). sDAF y sCD59 no se unieron a células de CHO revestidas con C3.
(b)
ELISA
Se llevaron a cabo experimentos de ELISA como se describe previamente. En los experimentos de ELISA, se añadieron constructos que contienen CR2 a pocillos revestidos con C3dg purificado. La unión se detectó por medio de anticuerpos anti-inhibidor del complemento y anticuerpos secundarios conjugados a enzimas. Todos los constructos que contienen CR2, pero no sCD59 y sDAF, se unieron a C3d.
(c)
Resonancia de plasmones de superficie
C3dg biotinilado (ligando de CR2) se unió a chips de BIAcore revestidos con estreptavidina y se midió la cinética de unión de las proteínas de fusión que contienen CR2 (Figuras 13-16). sDAF y sCD59 no se unieron a C3dg capturado. Las proteínas de fusión con CR2 en el término N se unieron con la mayor afinidad. Las proteínas de fusión que contienen CD59 se unieron con una afinidad mayor que las proteínas de fusión correspondientes que contienen DAF.
(4)
FUNCIÓN INHIBIDORA DEL COMPLEMENTO DE LAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN
La actividad funcional de las proteínas de fusión e inhibidores del complemento no dianizados solubles se analizó midiendo el efecto de las proteínas sobre la lisis celular mediada por el complemento. Se usaron en ensayos usando células de ovario de hámster chino (CHO) (Figuras 17 y 18) y eritrocitos de oveja (E) (Figuras 19 y 20).
Los inhibidores del complemento dianizados proporcionaron significativamente más protección frente a la lisis mediada por el complemento que los inhibidores del complemento no dianizados solubles. Las proteínas de fusión que contienen CR2 en el término N fueron las más eficaces tanto para las proteínas de fusión que contienen DAF como CD59. Las proteínas de fusión de CR2 N-terminal también se unieron a D3d con una afinidad mayor que las proteínas de fusión de CR2 C-terminal en experimentos de BIAcore (véase anteriormente). CR2-DAF fue significativamente más eficaz que CR2-CD59 a la hora de proporcionar protección frente a la lisis mediada por el complemento en estos ensayos. Cabe señalar, sin embargo, que sCD59 no dianizada posee una actividad inhibidora del complemento muy débil incluso a concentración elevada (a diferencia de sDAF), y la dianización de CD59 a la superficie celular es un requisito para la función de CD59.
La eficacia relativa de inhibidores del complemento dianizados frente a los no dianizados para células de CHO y para E es diferente. Sin embargo, los eritrocitos se lisan “de una sola vez” (es decir, formación de un único MAC provoca la lisis de E), mientras que las células nucleadas (tales como CHO) poseen mecanismos de resistencia adicionales (tales como protección y desprendimiento de MACs) y requieren la deposición de múltiples MACs para la lisis. Estas diferencias dan cuenta probablemente de las diferencias en los datos de inhibición de la lisis, y probablemente las células de CHO representan la diana fisiológicamente más relevante para estos experimentos in vitro.
3. Ejemplo 3
a) Anticuerpo dianizado para inhibidores del complemento en un modelo de rata de lesión tubulointersticial aguda:
Se usó un panel de anticuerpos monoclonales de ratón anti-riñón de rata bien caracterizados (49, 50, incorporado aquí como referencia por su enseñanza con respecto a estos anticuerpos y sus secuencias). El ADN de la región variable de un total de 5 anticuerpos se aisló mediante técnicas de PCR estándar (35, incorporadas aquí como referencia por sus enseñanzas con respecto a PCR). Todos se clonaron con éxito y algunos se expresaron como anticuerpos monocatenarios. Todos los anticuerpos monocatenarios reconocieron in vitro una estirpe celular epitelial
o endotelial de riñón de rata. Uno de los mAbs, K9/9, se une a una glucoproteína identificada sobre la superficie celular epitelial, y tiene especificidad por la pared capilar glomerular y túbulos proximales in vivo (49). Este anticuerpo se escogió como un vehículo de dianización para la investigación de la inhibición del complemento dianizada mediada por sCrry y por CD59 en un modelo de rata de lesión túbulointersticial aguda. Aunque se demostró que mAb K9/9 induce daño glomerular en un estudio previo (49), el anticuerpo fue sólo patógeno cuando se administró junto con adyuvante de Freund. De hecho, la naturaleza patógena de mAb K9/9 (con adyuvante) no se reprodujo.
Hay una relación entre proteinuria y daño renal progresivo, y hay datos que apoyan la hipótesis de que la propia proteinuria da como resultado fibrosis intersticial e inflamación. No se conoce el mecanismo mediante el cual la proteinuria conduce a lesión nefrotóxica, pero hay pruebas de que el complemento desempeña un papel clave, y que el MAC es el mediador principal de la lesión tubulointersticial debido a proteinuria (se ha revisado recientemente el papel del complemento y de la proteinuria en lesión tubulointersticial (51, 52)). La caracterización previa de mAb K9/9 (véase anteriormente (49)) sugirió que el mAb selecciona como diana apropiadamente para una investigación en el uso terapéutico de inhibidores del complemento dianizados en un modelo de rata de lesión tubulointersticial inducida por proteinuria. La disponibilidad de un inhibidor que puede bloquear específicamente la formación de MAC permitiría una evaluación del papel de MAC en lesión tubulointersticial en condiciones clínicamente relevantes.
Se prepararon constructos plasmídicos que codifican el anticuerpo K9/9 monocatenario enlazado a Crry de rata o CD59 de rata (representados en la fig. 27). También se prepararon constructos que expresan Crry soluble de rata (sCrry) y K9/9 monocatenario (vehículo de dianización solamente). Todas las proteínas recombinantes se expresaron en el medio de cultivo a alrededor de 15 mg/litro mediante fermentación de Pichia en un fermentador de New Brunswick de 15 litros.
Las proteínas recombinantes se caracterizaron para la dianización y la actividad inhibidora del complemento in vitro como se describe anteriormente usando una estirpe de células epiteliales de rata como células diana. K9/9 monocatenario, K9/9-Crry y K9/9-CD59 se unieron específicamente a células epiteliales de rata in vitro. sCrry y K9/9-Crry inhibieron la deposición y lisis del complemento, y K9/9-CD59 inhibió la lisis mediada por el complemento. Ambos inhibidores del complemento dianizados, sCrry y el Ab monocatenario K9/9 se caracterizaron en el modelo de nefrosis de aminonucleósido puromicina (PAN) de rata (53, incorporado aquí como referencia por su enseñanza de sCrry y K9/9) (sCD59 no se evaluó, puesto que CD59 sin dianizar tiene sólo una actividad inhibidora del complemento muy pobre (54)). En primer lugar, para confirmar la dianización de las proteínas de fusión de K9/9 al riñón, se determinó la especificidad de unión in vivo mediante biodistribución de proteínas yodadas como se describe anteriormente (54, 41). Las proteínas de fusión de K9/9 y K9/9 monocatenario, pero no sCrry, seleccionaron específicamente como dianas a riñones de rata, y fue detectado a 48 h después de la administración (fig. 28). La biodistribución a 24 h después de la administración fue similar, y no hubo ningún radiomarcador restante en la sangre a 24 h.
En estudios terapéuticos, grupos de 4 ratas recibieron PAN (150 mg/kg) en el día 0, y PBS o inhibidor del complemento (40 mg/kg) en los días 4, 7 y 10. Se recogió orina (jaulas metabólicas) y sangre, y los animales se sacrificaron en el día 11. El tratamiento con PAN alteró significativamente la función renal según se mide mediante el aclaramiento de creatinina (fig. 29, segunda barra desde la izquierda). Hubo una ligera mejora, pero no significativa, en la función renal en ratas que recibieron terapia con sCrry. Sin embargo, el aclaramiento de creatinina mejoró significativamente en ratas tratadas con PAN que recibieron terapia con Crry o CD59 dianizada (p<0,01). No hubo diferencia significativa en el aclaramiento de creatinina entre ratas de control (no proteinúricas) y ratas tratadas con PAN que recibieron los inhibidores dianizados (fig. 29). Como se esperaba, la proteinuria inducida por PAN fue elevada en todas las ratas tanto si se trataron con inhibidores del complemento o no (tabla 1). Las secciones de riñón preparadas a partir de ratas tratadas con PAN y que no recibieron terapia mostraron dilatación de la luz tubular y degeneración de células epiteliales y tubulares, según se evaluó mediante la pérdida del borde de brocha (véase fig. 30b, también en el apéndice). Se observó una mejora mínima con terapia con sCrry (fig. 30d). Por el contrario, la dilatación y degeneración tubular se suprimió significativamente en ratas tratadas con PAN que recibieron Crry y CD59 dianizadas (fig. 30c muestra K9/9-Crry, pero la histología fue indistinguible con K9/9-CD59). Estos datos demuestran eficacia terapéutica de la inhibición del complemento en este modelo, demuestran un beneficio significativo de la inhibición del complemento dianizada frente a la no dianizada, y demuestran directamente un papel importante para el daño mediado por MAC en lesión tubulointersticial inducida por proteinuria. sCD59 no es un inhibidor eficaz, y este estudio demuestra que CD59 apropiadamente dianizada permite la inhibición específica del MAC en vivo.
En un experimento separado, se determinó la semivida circulatoria de proteínas recombinantes yodadas como se describe (54, 41, incorporado aquí como referencia para las técnicas ensayadas allí). Las semividas (t1/2) de las proteínas fueron según lo siguiente: sCrry: 19 min, K9/9-Crry: 23 min, K9/9-CD59, 29 min, K9/9 monocatenario: 21 min. Para determinar el efecto de las proteínas recombinantes sobre la inhibición del complemento sistémica, se inyectaron a ratas con proteínas a 40 mg/Kg, y se recogió sangre en los tiempos que corresponden a 1, 3, 5 y 7 x t1/2. La actividad inhibidora del complemento en el suero se determinó midiendo la actividad hemolítica (eritrocitos de oveja sensibilizados). Como se esperaba, K9/9-CD59 tuvo una actividad inhibidora mínima en el suero (sistema de ensayo no dianizado (fig. 31). En alrededor de 3 h (7 x t1/2) después de la inyección de sCrry y K9/9-Crry, hubo una actividad inhibidora del complemento mínima que queda en el suero. El t1/2 corto de los inhibidores dianizados y no dianizados, junto con datos de biodistribución y el hecho de que sCrry no es protectora, demuestra que los inhibidores del complemento unidos al riñón son eficaces inhibiendo localmente el complemento y durante un período prolongado.
Estos datos establecen el uso de inhibidores del complemento dianizados in vivo, y demuestran los beneficios importantes de la inhibición del complemento sistémica dianizada frente a no dianizada en un modelo de enfermedad. Aunque en estos estudios se usó un vehículo de dianización diferente (un fragmento de anticuerpo), se aplican los mismos principios para otros agentes de dianización, tales como CR2.
4. Ejemplo 4
Se describen aquí ejemplos de constructos de la presente invención obtenidos según la enseñanza aquí. La terminología usada tiene el siguiente significado: SCR = repeticiones de consenso cortas; LP = péptido líder. Los constructos tienen todos la fórmula básica de CR2-ligador-modulador del complemento o modulador del complemento-ligador-CR2. Las notaciones en paréntesis indican detalles con una sección particular de la composición. Por ejemplo, “(completa)” significa que toda la proteína madura se usa en el constructo, mientras que “(SCR2-4)” indica que SCR1 no es parte del constructo. Se entiende que un ligador puede ser un ligador químico, un péptido ligador natural, o secuencias ligadoras de aminoácidos (por ejemplo, (Gly4Ser)3). Se entiende que esta lista no es limitante, y sólo proporciona ejemplos de algunos de los constructos descritos en la presente solicitud.
CR2 (completa) -(Gly4Ser)3--DAF CR2 (completa) - (Gly4Ser)3- CD59 humana CR2 (completa) - (Gly4Ser)3--MCP CR2 (completa) - (Gly4Ser)3-CR1 CR2 (completa) - (Gly4Ser)3--Crry CR2 (completa) - (Gly4Ser)3-CD59 de ratón CR2 (completa) -(Gly4Ser)3-IgG1 Fc humana CR2 (completa) - (Gly4Ser)3-IgM Fc humana CR2 (completa) - (Gly4Ser)3-IgG3 Fc murina CR2 (completa) - (Gly4Ser)3-IgM Fc murina CR2 (completa) - (Gly4Ser)3--CVF CR2 (completa) - (Gly3Ser)4--DAF CR2 (completa) - (Gly3Ser)4-CD59 humana CR2 (completa) -(Gly3Ser)4--MCP CR2 (completa) -(Gly3Ser)4-CR1 CR2 (completa) - (Gly3Ser)4--Crry CR2 (completa) - (Gly3Ser)4-CD59 de ratón CR2 (completa) - (Gly3Ser)4-IgG1 Fc humana CR2 (completa) - (Gly3Ser)4-IgM Fc humana CR2 (completa) - (Gly3Ser)4-IgG3 Fc murina CR2 (completa) - (Gly3Ser)4-IgM Fc murina CR2 (completa) - (Gly3Ser)4-CVF CR2 (completa) - (Gly4Ser)3-DAF (SCRs 2-4) CR2 (completa) - (Gly3Ser)4-DAF (SCRs 2-4) CR2 (completa) - (Gly4Ser)3-CR1 (LP--SCR1-4-SCR8-11-SCR15-18) CR2 (completa) - (Gly4Ser)3-Crry (5 SCRs N-terminales) CR2 (completa) - VSVFPLE--DAF CR2 (completa) - VSVFPLE -CD59 humana CR2 (completa) - VSVFPLE --MCP CR2 (completa) - VSVFPLE -CR1 CR2 (completa) -VSVFPLE --Crry CR2 (completa) -VSVFPLE -CD59 de ratón CR2 (completa) - VSVFPLE -IgG1 Fc humana CR2 (completa) - VSVFPLE -IgM Fc humana CR2 (completa) - VSVFPLE -IgG3 Fc murina CR2 (completa) - VSVFPLE -IgM Fc murina CR2 (completa) -VSVFPLE -CVF CR2 (completa) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster --DAF CR2 (completa) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -CD59 humana CR2 (completa) -m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster --MCP CR2 (completa) -m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -CR1 CR2 (completa) -m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster --Crry CR2 (completa) -m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster-CD59 de ratón CR2 (completa) -m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -IgG1 Fc humana CR2 (completa) -m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -IgM Fc humana CR2 (completa) -m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -IgG3 Fc murina CR2 (completa) -m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -IgM Fc murina CR2 (completa) -m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -CVF CR2 (completa) -bismaleimidohexano --DAF CR2 (completa) -bismaleimidohexano -CD59 humana CR2 (completa) -bismaleimidohexano --MCP CR2 (completa) -bismaleimidohexano -CR1 CR2 (completa) -bismaleimidohexano --Crry CR2 (completa) -bismaleimidohexano -CD59 de ratón CR2 (completa) -bismaleimidohexano -IgG1 Fc humana CR2 (completa) -bismaleimidohexano -IgM Fc humana CR2 (completa) -bismaleimidohexano -IgG3 Fc murina CR2 (completa) -bismaleimidohexano -IgM Fc murina CR2 (completa) -bismaleimidohexano -CVF CR2 (SCR1-2) - (Gly4Ser)3--DAF CR2 (SCR1-2) - (Gly4Ser)3-CD59 humana CR2 (SCR1-2) - (Gly4Ser)3--MCP CR2 (SCR1-2) - (Gly4Ser)3-CR1 CR2 (SCR1-2) - (Gly4Ser)3--Crry CR2 (SCR1-2) - (Gly4Ser)3-CD59 de ratón CR2 (SCR1-2) - (Gly4Ser)3-IgG1 Fc humana CR2 (SCR1-2) - (Gly4Ser)3-IgM Fc humana CR2 (SCR1-2) - (Gly4Ser)3-IgG3 Fc murina CR2 (SCR1-2) - (Gly4Ser)3-IgM Fc murina CR2 (SCR1-2) - (Gly4Ser)3--CVF CR2 (SCR1-2) - (Gly3Ser)4--DAF CR2 (SCR1-2) - (Gly3Ser)4-CD59 humana CR2 (SCR1-2) - (Gly3Ser)4--MCP CR2 (SCR1-2) - (Gly3Ser)4-CR1 CR2 (SCR1-2) - (Gly3Ser)4--Crry CR2 (SCR1-2) - (Gly3Ser)4-CD59 de ratón CR2 (SCR1-2) - (Gly3Ser)4-IgG1 Fc humana CR2 (SCR1-2) - (Gly3Ser)4-IgM Fc humana CR2 (SCR1-2) - (Gly3Ser)4-IgG3 Fc murina CR2 (SCR1-2) - (Gly3Ser)4-IgM Fc murina CR2 (SCR1-2) - (Gly3Ser)4-CVF CR2 (SCR1-2) - (Gly4Ser)3-DAF (SCRs 2-4) CR2 (SCR1-2) - (Gly3Ser)4-DAF (SCRs 2-4) CR2 (SCR1-2) - (Gly4Ser)3-CR1 (LP--SCR1-4-SCR8-11-SCR15-18) CR2 (SCR1-2) - (Gly4Ser)3-Crry (5 SCRs N-terminales) CR2 (SCR1-2) - VSVFPLE--DAF CR2 (SCR1-2) - VSVFPLE -CD59 humana CR2 (SCR1-2) - VSVFPLE --MCP CR2 (SCR1-2) - VSVFPLE -CR1 CR2 (SCR1-2) - VSVFPLE --Crry CR2 (SCR1-2) - VSVFPLE -CD59 de ratón CR2 (SCR1-2) -VSVFPLE -IgG1 Fc humana CR2 (SCR1-2) - VSVFPLE -IgM Fc humana CR2 (SCR1-2) -VSVFPLE -IgG3 Fc murina CR2 (SCR1-2) - VSVFPLE -IgM Fc murina CR2 (SCR1-2) - VSVFPLE -CVF CR2 (SCR1-2) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster --DAF CR2 (SCR1-2) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -CD59 humana CR2 (SCR1-2) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster --MCP CR2 (SCR1-2) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -CR1 CR2 (SCR1-2) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster --Crry
CR2 (SCR1-2) -m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -CD59 de ratón
CR2 (SCR1-2) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -IgG1 Fc humana
CR2 (SCR1-2) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -IgM Fc humana
CR2 (SCR1-2) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -IgG3 Fc murina
CR2 (SCR1-2) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -IgM Fc murina
CR2 (SCR1-2) -m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -CVF
CR2 (SCR1-2) -bismaleimidohexano -DAF
CR2 (SCR1-2) -bismaleimidohexano -CD59 humana
CR2 (SCR1-2) -bismaleimidohexano -MCP
CR2 (SCR1-2) -bismaleimidohexano -CR1
CR2 (SCR1-2) -bismaleimidohexano --Crry
CR2 (SCR1-2) - bismaleimidohexano -CD59 de ratón
CR2 (SCR1-2) - bismaleimidohexano -IgG1 Fc humana
CR2 (SCR1-2) - bismaleimidohexano -IgM Fc humana
CR2 (SCR1-2) - bismaleimidohexano -IgG3 Fc murina
CR2 (SCR1-2) -bismaleimidohexano -IgM Fc murina
CR2 (SCR1-2) - bismaleimidohexano -CVF
CR2 (SCR1-3) - (Gly4Ser)3--DAF
CR2 (SCR1-3) - (Gly4Ser)3-CD59 humana
CR2 (SCR1-3) - (Gly4Ser)3--MCP
CR2 (SCR1-3) - (Gly4Ser)3-CR1
CR2 (SCR1-3) - (Gly4Ser)3--Crry
CR2 (SCR1-3) - (Gly4Ser)3-CD59 de ratón
CR2 (SCR1-3) -(Gly4Ser)3-IgG1 Fc humana
CR2 (SCR1-3) - (Gly4Ser)3-IgM Fc humano
CR2 (SCR1-3) - (Gly4Ser)3-IgG3 Fc murino
CR2 (SCR1-3) - (Gly4Ser)3-IgM Fc murino
CR2 (SCR1-3) - (Gly4Ser)3--CVF
CR2 (SCR1-3) - (Gly3Ser)4--DAF
CR2 (SCR1-3) - (Gly3Ser)4-CD59 humana
CR2 (SCR1-3) - (Gly3Ser)4--MCP
CR2 (SCR1-3) - (Gly3Ser)4-CR1
CR2 (SCR1-3) - (Gly3Ser)4--Crry
CR2 (SCR1-3) - (Gly3Ser)4-CD59 de ratón
CR2 (SCR1-3) - (Gly3Ser)4-IgGl Fc humana
CR2 (SCR1-3) - (Gly3Ser)4-IgM Fc humana
CR2 (SCR1-3) - (Gly3Ser)4-IgG3 Fc murina
CR2 (SCR1-3) - (Gly3Ser)4-IgM Fc murina
CR2 (SCR1-3) - (Gly3Ser)4-CVF
CR2 (SCR1-3) - (Gly4Ser)3-DAF (SCRs 2-4)
CR2 (SCR1-3) - (Gly3Ser)4-DAF (SCRs 2-4)
CR2 (SCR1-3) - (Gly4Ser)3-CR1 (LP--SCR1-4-SCR8-11-SCR15-18)
CR2 (SCR1-3) - (Gly4Ser)3-Crry (5 SCRs N-terminales)
CR2 (SCR1-3) - VSVFPLE --DAF
CR2 (SCR1-3) - VSVFPLE -CD59 humana
CR2 (SCR1-3) - VSVFPLE --MCP
CR2 (SCR1-3) - VSVFPLE -CR1
CR2 (SCR1-3) - VSVFPLE --Crry
CR2 (SCR1-3) - VSVFPLE -CD59 de ratón
CR2 (SCR1-3) - VSVFPLE -IgG1 Fc humana
CR2 (SCR1-3) -VSVFPLE -IgM Fc humana
CR2 (SCR1-3) -VSVFPLE -IgG3 Fc murina
CR2 (SCR1-3) - VSVFPLE -IgM Fc murina CR2 (SCR1-3) - VSVFPLE --CVF
CR2 (SCR1-3) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster --DAF
CR2 (SCR1-3) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster-CD59 humana
CR2 (SCR1-3) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster --MCP
CR2 (SCR1-3) — m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster—CR1
CR2 (SCR1-3) — m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster --Crry
CR2 (SCR1-3) — m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster—CD59 de ratón
CR2 (SCR1-3) — m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster—IgG1 Fc humana
CR2 (SCR1-3) — m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster-IgM Fc humana
CR2 (SCR1-3) — m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster —IgG3 Fc murina
CR2 (SCR1-3) — m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster—IgM Fc murina
CR2 (SCR1-3) — m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster—CVF CR2 (SCR1-3) -bismaleimidohexano --DAF CR2 (SCR1-3) -bismaleimidohexano-CD59 humana CR2 (SCR1-3) -bismaleimidohexano --MCP CR2 (SCR1-3) -bismaleimidohexano -CR1 CR2 (SCR1-3) -bismaleimidohexano --Crry CR2 (SCR1-3) - bismaleimidohexano -CD59 de ratón CR2 (SCR1-3) - bismaleimidohexano —IgG1 Fc humna CR2 (SCR1-3) - bismaleimidohexano —IgM Fc humana CR2 (SCR1-3) - bismaleimidohexano —IgG3 Fc murina CR2 (SCR1-3) - bismaleimidohexano —IgM Fc murina CR2 (SCR1-3) - bismaleimidohexano —CVF CR2 (SCR1-4) - (Gly4Ser)3--DAF CR2 (SCR1-4) - (Gly4Ser)3-CD59 humana CR2 (SCR1-4) - (Gly4Ser)3--MCP CR2 (SCR1-4) - (Gly4Ser)3-CR1 CR2 (SCR1-4) - (Gly4Ser)3--Crry CR2 (SCR1-4) - (Gly4Ser)3-CD59 de ratón CR2 (SCR1-4) - (Gly4Ser)3-IgG1 Fc humana CR2 (SCR1-4) - (Gly4Ser)3-IgM Fc humana CR2 (SCR1-4) - (Gly4Ser)3-IgG3 Fc murina CR2 (SCR1-4) - (Gly4Ser)3-IgM Fc murina CR2 (SCR1-4) - (Gly4Ser)3--CVF CR2 (SCR1-4) - (Gly3Ser)4--DAF CR2 (SCR1-4) - (Gly3Ser)4-CD59 humana CR2 (SCR1-4) - (Gly3Ser)4--MCP CR2 (SCR1-4) - (Gly3Ser)4-CR1 CR2 (SCR1-4) - (Gly3Ser)4--Crry CR2 (SCR1-4) - (Gly3Ser)4 CD59 de ratón CR2 (SCR1-4) - (Gly3Ser)4-IgG1 Fc humana CR2 (SCR1-4) -(Gly3Ser)4-IgM Fc humana CR2 (SCR1-4) - (Gly3Ser)4-IgG3 Fc murina CR2 (SCR1-4) - (Gly3Ser)4-IgM Fc murina CR2 (SCR1-4) - (Gly3Ser)4-CVF CR2 (SCR1-4) - (Gly4Ser)3-DAF (SCRs 2-4) CR2 (SCR1-4) - (Gly3Ser)4-DAF (SCRs 2-4) CR2 (SCR1-4) - (Gly4Ser)3-CR1 (LP--SCR1-4-SCR8-11-SCR15-18) CR2 (SCR1-4) - (Gly4Ser)3-Crry (5 SCRs N-terminales) CR2 (SCR1-4) - VSVFPLE--DAF CR2 (SCR1-4) - VSVFPLE -CD59 humana CR2 (SCR1-4) - VSVFPLE --MCP CR2 (SCR1-4) - VSVFPLE -CR1 CR2 (SCR1-4) - VSVFPLE --Crry CR2 (SCR1-4) - VSVFPLE -CD59 de ratón CR2 (SCR1-4) -VSVFPLE -IgG1 Fc humana CR2 (SCR1-4) - VSVFPLE —IgM Fc humana CR2 (SCR1-4) -VSVFPLE —IgG3 Fc murina CR2 (SCR1-4) - VSVFPLE -IgM Fc murina CR2 (SCR1-4) - VSVFPLE-CVF CR2 (SCR1-4) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster --DAF CR2 (SCR1-4) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster—CD59 humana CR2 (SCR1-4) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster --MCP CR2 (SCR1-4) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -CR1 CR2 (SCR1-4) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster --Crry CR2 (SCR1-4) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -CD59 de ratón CR2 (SCR1-4) -m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster-IgG1 Fc humana CR2 (SCR1-4) -m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -IgM Fc humana CR2 (SCR1-4) -m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster -IgG3 Fc murina CR2 (SCR1-4) ---m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida esther -IgM Fc murina CR2 (SCR1-4) -m-Maleimidobenzoil-N-hidoxisuccinimida éster-CVF CR2 (SCR1-4) - bismaleimidohexano --DAF CR2 (SCR1-4) -bismaleimidohexano -CD59 humana CR2 (SCR1-4) - bismaleimidohexano --MCP CR2 (SCR1-4) - bismaleimidohexano -CR1 CR2 (SCR1-4) - bismaleimidohexano --Crry CR2 (SCR1-4) - bismaleimidohexano -CD59 de ratón CR2 (SCR1-4) - bismaleimidohexano -IgG1 Fc humana CR2 (SCR1-4) - bismaleimidohexano -IgM Fc humana CR2 (SCR1-4) - bismaleimidohexano -IgG3 Fc murina CR2 (SCR1-4) - bismaleimidohexano -IgM Fc murina CR2 (SCR1-4) - bismaleimidohexano -CVF
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H. Secuencias
1.
DAF Secuencia nucleotídica corresponde a SEC ID nº 1 Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 2
2.
CD59 Secuencia nucleotídica corresponde a SEC ID nº 3 Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 4
3.
CR2-DAF Secuencia nucleotídica corresponde a SEC ID nº 5 Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 6
4.
CR2-CD59 humano Secuencia nucleotídica corresponde a SEC ID nº 7
Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 8
5.
DAF-CR2 Secuencia nucleotídica corresponde a SEC ID nº 9 Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 10
6.
CD59 humano-CR2 Secuencia nucleotídica corresponde a SEC ID nº 11 Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 12
7.
CR1 Secuencia nucleotídica corresponde a SEC ID nº 13 Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 14
8.
MCP Secuencia nucleotídica corresponde a SEC ID nº 15 Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 16
9.
Crry de ratón Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 17
10.
IgG1 Fc humana Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 18
11.
IgM Fc humana Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 19
12.
CR2-IgG1 Fc humana Secuencia nucleotídica corresponde a SEC ID nº 20 Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 21
13.
IgG3 Fc de ratón Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 22
14.
Factor de veneno de cobra Secuencia nucleotídica corresponde a SEC ID nº 23 Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 24
15.
CR2 humana Secuencia nucleotídica corresponde a SEC ID nº 25 Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 26
16.
CR2 de ratón Secuencia nucleotídica corresponde a SEC ID nº 27 Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 28
17.
CR2 humana Secuencia de aminoácidos corresponde a SEC ID nº 29
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> MUSC Foundation For Research Development
<120> Moduladores de complemento dianas sobre el receptor 2 de complemento
<130> 19113.0095P1 5 <150> 60/426,676
<151>
<160> 29
<170> FastSEQ para Windows Version 4.0
<210> 1 10 <211> 1041
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
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<212> PRT
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<212> ADN
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<212> PRT
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<211> 3039
<212> ADN
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<210> 27
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial:/nota = construcción sintética
<400> 29

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composición que comprende un constructo, en la que el constructo comprende:
    (a)
    una CR2 o un fragmento de la misma, en el que el fragmento contiene al menos los dos primeros dominios de repeticiones de consenso cortas (SCR) N-terminales de la proteína CR2; y
    (b)
    un modulador de la actividad del complemento, en el que la modulación de la actividad del complemento comprende un inhibidor del complemento o fragmento del mismo, en el que dicho inhibidor del complemento se selecciona del factor acelerador del decaimiento (DAF), CD59 humana, CD59 de ratón, Crry, proteína cofactor de membrana (MCP), receptor 1 del complemento (CR1) y un anticuerpo anti-C5, en el que el fragmento del mismo comprende SCRs 1-4 de DAF, SCRs 2-4 de DAF, CD59 humana soluble sin su anclaje de glucofosfatidilinositol, CD59 de ratón soluble sin su anclaje de glucofosfatidilinositol, SCRs 1-5 de Crry, SCRs 1-4 de MCP, SCRs 1-4 de CR1, SCRs 8-11 de CR1, SCRs 15-18 de CR1 o el sitio de unión C1q de CR1.
  2. 2.
    La composición de la reivindicación 1, en la que la CR2 o su fragmento comprende los cuatro dominios de SCR Nterminales de la proteína CR2.
  3. 3.
    La composición de la reivindicación 1 ó 2, en la que la CR2 comprende una proteína CR2 de longitud completa.
  4. 4.
    La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el constructo es una proteína de fusión.
  5. 5.
    La composición de la reivindicación 4, en la que la CR2 o su fragmento se fusiona al término N o al término C del inhibidor del complemento o su fragmento.
  6. 6.
    La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición comprende SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 8 SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 16 o SEC ID NO: 14.
  7. 7.
    La composición de la reivindicación 1, en la que el inhibidor del complemento o su fragmento es CD59 murina, CD59 murina sin su anclaje de glucofosfatidilinositol, CD59 humana sin su anclaje glucofosfatidilinositol, o CD59 humana.
  8. 8.
    La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para uso en un método para tratar una afección afectada por el complemento.
  9. 9.
    La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para uso en un método para tratar una infección vírica, una infección fúngica o una afección inflamatoria.
  10. 10.
    La composición de la reivindicación 9, en la que la afección inflamatoria es apoplejía o lesión por reperfusión isquémica.
  11. 11.
    Una secuencia nucleotídica que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 4.
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