CN110423271A - 鸡cr2基因的克隆、蛋白的表达和纯化及其多克隆抗体的制备 - Google Patents

鸡cr2基因的克隆、蛋白的表达和纯化及其多克隆抗体的制备 Download PDF

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Abstract

本发明提供了鸡CR2基因的克隆、蛋白的表达和纯化及其多克隆抗体的制备。提供了ChCR2蛋白的氨基酸序列和基因序列，构建了含有不同标签的ChCR2原核表达载体，利用大肠杆菌原核表达系统表达ChCR2蛋白，并对蛋白进行纯化。纯化后的蛋白能够制备效价较高的多克隆抗体。ChCR2基因，在鸡免疫系统中的作用十分重大。CR2能将先天性补体介导的免疫应答与病原体和外来抗原联系起来，通过与共价附着于靶标的C3d结合而产生的适应性免疫应答，其导致的细胞信号传导现象，能极大程度降低B细胞活化的阈值。B细胞在免疫系统中的位置举足轻重，所以本发明发现的ChCR2无论是从基础研究还是临床运用上的意义都是十分重大的。

Description

鸡CR2基因的克隆、蛋白的表达和纯化及其多克隆抗体的制备
技术领域
本发明属于分子克隆技术领域，具体涉及一种鸡的新基因CR2(ChickenComplement Receptor 2，ChCR2)的克隆，蛋白的表达和纯化以及多克隆抗体的制备。
背景技术
补体受体2(CR2，complement receptor 2)即CD21，是补体C3裂解片段C3d、C3dg等的受体，是一种B细胞表面具有跨膜区的糖蛋白，主要表达在成熟的B细胞和滤泡树突状细胞表面。人类CD4+和CD8+T细胞亚群、星形胶质细胞和咽上皮细胞上也能发现CR2的存在。CR2在成熟B细胞上表达，但在前B细胞或未成熟B细胞上不表达，在活化B细胞分化为浆细胞时也没有发现。CR2是C3/C4结合蛋白结构家族的成员，由补体激活(RCA，regulators ofcomplement activation)基因簇的调节子编码。由RCA基因簇表达的蛋白质具有包含约60个氨基酸的紧凑重复β-折叠蛋白的特征，其被称为短同源重复序列(SCR，short consensusrepeats)或补体调节蛋白(CCP，complement control protein)模块。
人CR2一级序列由20个残基信号肽，15个SCR或16个SCR细胞外区域组成，分别包含951个氨基酸或1010个氨基酸，另外还有28个氨基酸残基的单通道跨膜区和34个氨基酸残基的细胞内区域。关于CR2的两种主要同种型，较短的15SCR同种型主要在B细胞上表达，而较长的16SCR同种型主要在滤泡树突细胞上表达，这是由于CR2基因的可变剪接产生的，这意味着成熟的CR2可观测到的长度可能为146kDa或148kDa。CR2的主要生理配体是C3d，分子量约为35kDa。除了C3d以外，CR2的配体还包括I型细胞因子，干扰素-α和低亲和力IgE受体，CD23(FcεRII)以及Epstein-Barr病毒(EBV)包膜蛋白gp350/220等。
CR2与其配体C3d之间的相互作用在B细胞的激活和启动免疫反应中起着不可或缺的作用。在B细胞表面，CR2与CD19以及CD81等分子相关联并形成B细胞共受体复合物，该复合物能够引起下游Syk和PI-3K等通路的激活。当存在大量抗原时，由B细胞共受体复合物和BCR的交联引起的信号传导现象是不明显的，因为单独的BCR复合物之间的交联足以产生相当的信号传导反应。然而，当抗原量不足时，例如在最初暴露于感染因子时，BCR与其共同受体复合物的共连接能够将B细胞活化的阈值降低10-1000倍。CR2作为补体受体是桥连先天免疫和获得性免疫的重要因子，在免疫系统中的作用举足轻重。人类、牛和鼠等哺乳动物的CR2基因鉴定并证实。但在鸟类中，CR2基因鲜有报道，尤其是家禽鸡的CR2基因还未曾被注释。
在本发明研究中，根据之前RNASeq的鉴定结果，首次通过PCR扩增得到了鸡的CR2基因，利用原核表达系统表达了ChCR2蛋白，通过纯化GST-ChCR2蛋白制备鼠抗ChCR2血清多抗。本发明研究不仅丰富了禽类的免疫学内容，而且为禽类的免疫系统的相关研究奠定了重要的基础。
发明内容
本发明的目的是根据CR2(CD21)在连接先天性补体介导的免疫系统和适应性免疫系统中的所发挥的关键作用，以及到目前为止鸡的CR2基因还尚未被注释，克隆得到鸡免疫系统的新基因ChCR2，不仅能够丰富禽类的免疫学内容，而且通过原核表达ChCR2蛋白并制备相应的多克隆抗体，还可以为禽类的免疫系统的相关研究提供基础。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种鸡的CR2蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种编码上述鸡的CR2蛋白的基因，所述基因编码如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种鸡的ChCR2的克隆载体或表达载体，所述克隆载体或表达载体含有如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。
一种鸡的CR2克隆载体或表达载体的制备方法，其包括以下步骤：
S1、分离鸡法氏囊淋巴细胞，提取基因组RNA，使用随机引物将RNA反转录为cDNA，用ChCR2引物扩增ChCR2全长基因；
S2、设计pET-32a-ChCR2-ΔTM的引物用于将ChCR2全长基因C端的跨膜区去掉，并在ChCR2-ΔTM基因片段两侧分别加入BamHI和SalI两个酶切位点，以S1中得到的ChCR2全长基因为模板；PCR扩增获得目的片段，之后利用BamHI和SalI对pET-32a载体进行酶切，利用同源重组的方法将目的片段连接到pET-32a载体上，获得质粒pET-32a-ChCR2-ΔTM。
如上所述的制备方法，优选地，还包括S3、设计ChCR2全长基因片段两侧分别加入BamHI和Hind III两个酶切位点的引物，扩增目的片断，之后分别用BamHI和Hind III酶切pGEX-6P-1载体，利用同源重组的方法将目的片段连接到载体上，获得质粒PGEX-6P-1-ChCR2-ΔTM。
如上所述的方法，优选地，在步骤S1中，所述ChCR2引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
如上所述的方法，优选地，在步骤S2中，所述pET-32a-ChCR2-ΔTM引物的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，PCR扩增得到ChCR2-ΔTM片段。
如上所述的方法，优选地，在步骤S3中，具体步骤为：以S1中得到的ChCR2全长基因为模板；采用序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物对，扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，PCR扩增得到ChCR2-ΔTM片段，即在ChCR2-ΔTM基因片段两侧分别加入BamH I和Hind III两个酶切位点，之后利用BamH I和Hind III对pGEX-6P-1载体进行酶切，利用同源重组的方法将目的片段连接到载体上，获得质粒pGEX-6P-1-ChCR2-ΔTM。
一种鸡的CR2蛋白的制备方法，将上述鸡的CR2原核表达载体，转入Transetta感受态细胞中，经IPTG诱导表达后，分别获得GST-ChCR2-ΔTM和His-ChCR2-ΔTM蛋白。
如上所述的制备方法，质粒pET-32a-ChCR2-ΔTM转入Transetta感受态细胞后，诱导表达His-ChCR2-ΔTM蛋白以包涵体的形式存在，纯化步骤：将IPTG诱导表达的菌液离心，加入适量含DDT的PBS重悬，在冰上进行超声波破碎，离心后取沉淀；用细胞刮将沉淀上层黄色的细胞碎片刮掉，留下白色包涵体；分别用预冷的washing buffer和Resuspensionbuffer洗涤包涵体；按30mg/ml将包涵体用6M盐酸胍4℃搅拌过夜溶解，离心取上清分装保存；用加了还原型/氧化型谷胱甘肽的复性液复性所提纯的包涵体，24h后利用浓缩杯浓缩，超滤管超滤至1ml左右；最后过分子筛纯化蛋白。
如上所述的制备方法，质粒pGEX-6P-1-ChCR2-ΔTM转入Transetta感受态细胞后，诱导表达CR2蛋白以可溶的形式存在，纯化步骤：将IPTG诱导表达的菌液离心，加入适量含DDT的PBS重悬，在冰上进行超声波碎，离心后取上清；使用Glutathione SepharoseTM 4Fast Flow树脂纯化上清中的蛋白；最后过分子筛纯化蛋白。
一种鸡的CR2蛋白多克隆抗体的制备，其包括如下步骤：将上述纯化获得的GST-ChCR2-ΔTM蛋白免疫BALB/c小鼠，接种方式为颈背部皮下多点注射，首免使用弗氏完全佐剂，分别于第三周和第五周进行二免和三免，二免和三免使用弗氏不完全佐剂，于加强免疫后三天取小鼠血清。
本发明的有益效果在于：
本发明是首次扩增到了鸡的CR2基因，并对其进行了初步的鉴定，这一发现不仅丰富了禽类的免疫学，也为禽类免疫系统的相关研究奠定了重要的基础。
本发明中采用了大肠杆菌原核表达系统，构建了具有不同标签的ChCR2质粒载体，并进行了蛋白的表达和纯化，不仅能够制备效价较高的多克隆抗体，而且还为之后单克隆抗体的制备以及ChCR2相关功能的研究奠定了基础。
本发明中扩增得到的ChCR2基因，在禽类的免疫系统中的作用十分重大。目前为止，人CR2的功能研究相对比较全面，CR2能将先天性补体介导的免疫应答与病原体和外来抗原联系起来，通过与共价附着于标靶的C3d结合而产生的适应性免疫应答，其导致细胞信号传导现象，能极大程度降低B细胞活化的阈值。B细胞在免疫系统中的位置举足轻重，所以本发明发现的ChCR2无论是从基础研究还是临床运用上的意义都是十分重大的。本发明得到了具有生物学活性的多克隆抗体，为之后进一步研究ChCR2的功能打下了重要的基础。CR2是在机体免疫反应过程中起着重要性和特殊性的分子，对机体早期产生的免疫应答反应起着重要的作用。ChCR2可能能够作为分子佐剂使用到疫苗中去，以增强对马立克氏病(MD)甚至其他禽类疾病的防控，为养禽业的可持续发展奠定基础。
附图说明
图1为本发明实例中利用RT-PCR方法扩增ChCR2基因鉴定结果(1113bp)；其中，泳道1：M：2kb DNA Marker；泳道2：从淋巴细胞中提取RNA，通过RT-PCR扩增得到ChCR2片段；泳道3：阴性对照。
图2为GST-ChCR2-ΔTM在16℃条件下的表达情况图；其中，泳道M.Marker，1.不加IPTG的菌液，2.不加IPTG的菌液超声裂解离心后上清，3.不加IPTG的菌液超声裂解离心后沉淀，4.加IPTG的菌液，5.加IPTG的菌液超声裂解离心后上清，6.加IPTG的菌液超声裂解离心后沉淀。
图3为His-ChCR2蛋白在16℃条件下的表达情况图；其中，泳道M.Marker，1.不加IPTG的菌液，2.不加IPTG的菌液超声裂解离心后上清，3.不加IPTG的菌液超声裂解离心后沉淀，4.加IPTG的菌液，5.加IPTG的菌液超声裂解离心后上清，6.加IPTG的菌液超声裂解离心后沉淀。
图4为本发明实例中利用Glutathione SepharoseTM 4Fast Flow树脂纯化表达在上清中的GST-ChCR2-ΔTM蛋白的结果图；其中，泳道1.上清，2.流穿液，3.纯化的GST-CR2-ΔTM蛋白。
图5为利用包涵体提取相关试剂对His-ChCR2ΔTM蛋白包涵体进行提取，复性和纯化的结果泳道1.菌体，2.上清，3.沉淀，4.纯化的His-CR2-ΔTM蛋白。
图6为利用ELISA方法检测抗GST-ChCR2-ΔTM蛋白的血清多抗的效价图，其中，纵坐标：OD450；横坐标：血清稀释度。
图7为利用间接免疫荧光方法检测免疫的小鼠血清多抗的结果图，其中A:HA单克隆抗体阳性对照；B:小鼠多克隆抗体阳性血清；C:小鼠多克隆抗体阴性血清。
图8为检测血清多抗的免疫印迹结果图，其中，A:His单克隆抗体，M.Marker,1.His-ChCR2-ΔTM蛋白；B:阳性血清M.Marker,1.His-ChCR2-ΔTM蛋白；C:阴性血清M.Marker,1.His-ChCR2-ΔTM蛋白。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1ChCR2基因的扩增，以及不同标签质粒的构建
利用RNASeq实验技术测定鸡脾脏淋巴细胞，得到数条未被注释的鸡的新基因，通过基因比对发现其中一条新基因与其他鸟类的CR2有80％以上的相似性，并且通过结构预测发现新基因的氨基酸序列具有CR2结构域；根据RNASeq测序结果，将测序得到的新基因与GenBank数据库进行比对，发现其中一条新的基因(ENSGALG00000030007)与GenBank登录的Gallus gallus mRNA for hypothetical protein，clone 31a4(GenBank:AJ720954.1)序列结果一致，该基因具有CR2的结构域，根据基因序列设计特异性引物ChCR2-F和ChCR2-R，送公司合成，通过RT-PCR扩增出ChCR2基因片段。具体为:分离鸡法氏囊淋巴细胞，提取基因组RNA，使用随机引物(随机引物是试剂盒里面带的)将RNA反转录为cDNA，用引物ChCR2-F和ChCR2-R扩增ChCR2全长基因，扩增程序为：95℃预变性2min，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，将扩增产物进行电泳获得结果如图1所示。
获得的基因片段SEQ ID NO.2：atggcccagtgcaaagctgacaaaacgtgggatcctcctgtgcccatctgtgagcaggtggtaaagtgtctacctcctccaagcatcatcaatggggaacacagtcatttctcagacacttttggtgtaggtgcaatcgtgcactaccgctgcaaaccgggcttcttcctcactggcaatgagtccatccgctgcacaccgcatgggatctggagccgtcctctacctcggtgtgaggctggctgtgtgagcccaggaattgggcatggaaaagtgattggatgggaacctctctacatgcctggaaacatcatcacaattgaatgcaacactgataatatctcaaaagtcctccacaagtcccagtgccgacctgggggcacatggtttcctccactccctgcctgtgacggagtgctgcactgctccaagcccccagatatcctccacgggggccacagtggcctgggaaaagcagttttcactcctggaacatctgtaaactacagctgtgagactggcttctccctcattggaatggcatccatttactgtacagagtctggagcctggagccatccttctcctgtctgtcaagtggtgaagtgtcttcaccctccagctatcaccaatgggaagctccaaggcaacacttcagacacttttttctatggagtatctgtgtcctacagctgtgattctggttattcactcactggggatgctttcatcacctgcacagcatcaggaacttggagccctcctcctcaatgcaaagagatcagttgtgtattccctgaagttcaaggcgttaagaaaaccacggctggaaaaacatacagatttgggactaacatcactcttgaatgtgatgacgggtacacgttggaaggcctcagtcagattcagtgccaggagaacttcagctgggaccctcccgtgccagcctgcaaactcacttcacccaggtctggctcagtagggctaggaattgcagctgcagtcgttctgcttctcctgggtgtgaccattggctggaaaattatctctaagaagaaggagggctactaccgtacatatgaaaactacaattacaaaacctctctggactag连接至平末端克隆载体pEASY-Blunt，获得pEASY-Blunt-ChCR2载体，以pEASY-Blunt-ChCR2载体为模板，分别使用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10引物扩增目的片段，扩增程序为：95℃预变性2min，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环。扩增产物分别利用EcoRI和KpnI，BamHI和SalI以及BamHI和Hind III将载体pCMV-HA，pET-32a和pGEX-6P-1进行酶切，条件为：37℃，2h。将扩增得到的目的片段利用同源重组的方法分别连接到酶切过的pCMV-HA，pET-32a和pGEX-6P-1载体中，成功构建相应的质粒载体，分别命名为pCMV-HA-ChCR2-ΔTM，pET-32a-ChCR2-ΔTM和PGEX-6P-1-ChCR2-ΔTM。
引物序列如下：
ChCR2-F(SEQ ID NO.3):ATGGCCCAGTGCAAAGCTGAC
ChCR2-R(SEQ ID NO.4):CTAGTCCAGAGAGGTTTTGTA
pCMV-HA-ChCR2-ΔTM-F(SEQ ID NO.5):
CGGGCCCAGGCCCTAGAATTCATGGCCCAGTGCAAAGCTGA
pCMV-HA-ChCR2-ΔTM-R(SEQ ID NO.6):
ATCGTATGGGTAGCCGGTACCTGAGCCAGACCTGGGTGAAG
pET-32a-ChCR2-ΔTM-F(SEQ ID NO.7):
GCCATGGCTGATATCGGATCCATGGCCCAGTGCAAAGCTGA
pET-32a-ChCR2-ΔTM-R(SEQ ID NO.8):
CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTGAGCCAGACCTGGGTGAAG
pGEX-6P-1-ChCR2-ΔTM-F(SEQ ID NO.9):
TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCATGGCCCAGTGCAAAGCTGA
pGEX-6P-1-ChCR2-ΔTM-R(SEQ ID NO.10):
ATGCGGCCGCTCGAGTCGACCTGAGCCAGACCTGGGTGAAG
将pET-32a-ChCR2-ΔTM和pGEX-6P-1-ChCR2-ΔTM分别转入Transetta感受态细胞中，经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE鉴定His-ChCR2-ΔTM和GST-ChCR2-ΔTM蛋白分别以包涵体和可溶的形式存在。实施例2蛋白的表达实验
将pET-32a-ChCR2-ΔTM和pGEX-6P-1-ChCR2-ΔTM分别转入Transetta感受态细胞中，挑取单个菌落，过夜摇菌。将过夜的新鲜菌液(含有GST-ChCR2ΔTM和His-ChCR2ΔTM质粒)按1：100的比例接种于50ml含Amp的LB液体培养基中，在37℃200r/min培养菌液至OD600为0.6-0.8时(吸光度值在600nm)，将IPTG按照终浓度为1.0mmol/L加入到菌液中，在16℃200r/min的条件下进行诱导表达，同时设立对照组(菌液中不加诱导剂)。将诱导表达的菌体，4℃、6000r/min离心10min，收集沉淀，加入含有DTT的PBS混匀，在冰上进行超声波破碎，4℃、12000rpm/min离心30min，分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳，确定重组蛋白的表达形式。
结果如图2所示是GST-ChCR2-ΔTM蛋白在16℃诱导表达时，其中，泳道M为10～180kDa的Protein Marker，泳道1.不加IPTG的菌液，泳道2.不加IPTG的菌液超声裂解离心后上清，泳道3.不加IPTG的菌液超声裂解离心后沉淀，泳道4.加IPTG的菌液，泳道5.加IPTG的菌液超声裂解离心后上清，泳道6.加IPTG的菌液超声裂解离心后沉淀。结果表明GST-ChCR2-ΔTM蛋白有部分表达于上清中也有部分以包涵体的形式存在；His-ChCR2-ΔTM蛋白在16℃条件下的表达情况如图3所示，其中，泳道M为10～180kDa的Protein Marker，泳道1.不加IPTG的菌液，泳道2.不加IPTG的菌液超声裂解离心后上清，泳道3.不加IPTG的菌液超声裂解离心后沉淀；泳道4.加IPTG的菌液，泳道5.加IPTG的菌液超声裂解离心后上清，泳道6.加IPTG的菌液超声裂解离心后沉淀。结果表明，His-CR2-ΔTM蛋白是以包涵体的形式存在。
实施例3蛋白纯化实验
GST-ChCR2-ΔTM可溶性蛋白的纯化：收集表达GST-ChCR2-ΔTM的Transetta感受态细胞，超声裂解取上清，将上清加入到处理好的Glutathione SepharoseTM 4 Fast Flow树脂填料中，4℃孵育6h，用10倍柱体积的PBS充分洗涤填料，最后用15ml还原性谷胱甘肽洗脱液将结合在填料上的蛋白洗脱下来，将洗脱液跑SDS-PAGE，分析纯化蛋白的纯度，最终的到较纯的GST-ChCR2-ΔTM蛋白，结果如图4所示，其中，1.上清，2.流穿液，3.纯化的GST-CR2-ΔTM蛋白。
His-ChCR2-ΔTM包涵体蛋白的纯化：收集表达His-ChCR2-ΔTM的Transetta感受态细胞，超声裂解取沉淀，用玻璃棒将包涵体沉淀上层黄色的细胞碎片拨掉，留下白色包涵体。用预冷20ml washing buffer悬浮，12000rpm，离心15min，如此重复此步骤一次。弃上清，用20ml Resuspension buffer进行悬浮，12000rpm，离心10-15min,弃上清，按30mg/ml将包涵体用6M盐酸胍4℃搅拌过夜溶解，12000rpm，离心10-15min，取上清进行复性。将样品逐滴加入到复性液中，4℃搅拌24-36h，随后进行浓缩换液，过分子筛纯化蛋白，最终的到较纯的His-ChCR2-ΔTM蛋白，结果如图5所示，其中1.菌体，2.上清，3.沉淀，4.纯化的His-CR2-ΔTM蛋白。
实施例4ChCR2-ΔTM多克隆抗体的制备
1、Balb/c小鼠的免疫。
取6只8周龄健康的雌性BABL/c小鼠，每隔两周按照如表1的免疫程序进行免疫。
表1 免疫程序
2、ELISA测定血清效价
四免后一周眼球采血，收集血清，使用间接ELISA方法测定血清效价。用纯化的His-ChCR2-ΔTM蛋白作为包被抗原，抗原的包被浓度为16μg/mL,包被条件为37℃2h+4℃过夜，测定小鼠的血清效价。结果表明，与阴性对照相比，6只小鼠的血清效价均能达到1:512000，结果如图6所示。
实施例5多克隆抗体的鉴定
利用间接免疫荧光实验进行鉴定。
将DF-1细胞(实验室存贮)以合适的浓度接种于24孔板中，置于5％CO2、37℃细胞培养箱中培养过夜；待细胞密度长至50％-70％时，用LipofectamineTM LTX and PLUSTMReagents转染试剂将pCMV-HA-CR2-ΔTM质粒转染至细胞内或者待细胞密度长至90％时用PBS洗涤细胞一次，轻轻吸弃，加入200μL 4℃预冷的3.7％多聚甲醛，室温固定6-8min，吸弃多聚甲醛，用PBS洗涤3次，每次5min；加入0.1％Triton X-100，室温放置10min，用PBS洗涤3次，每次5min；加入2％BSA，室温封闭30min，用PBS洗涤3次，每次5min；用2％BSA稀释实施例4中得到的小鼠的阴、阳性血清及HA单抗(小鼠阳性血清1:400，小鼠阴性血清1:400，HA单抗1:1000)，每孔加入200μL，放入湿盒，室温孵育1h，用PBS洗涤3次，每次5min；用2％BSA稀释Alexa-fluor-488标记的山羊抗鼠IgG(H+L)F(ab’)2二抗(1:1000)，每孔加入200μL，放入湿盒，避光，室温孵育1h，用PBS洗涤3次，每次5min；随后置于荧光显微镜下观察并拍照。
结果表明，与HA阳性对照相同，实施例4中免疫的小鼠血清(m Ab HA)可以特异性的与HA-ChCR2-ΔTM抗原进行结合如图7B所示，阳性对照结果如图7A所示，阴性的小鼠血清不能与HA-ChCR2-ΔTM抗原进行结合，结果如图7C所示。
利用免疫印迹实验进行验证。
将纯化的His-CR2-ΔTM蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后电转至PVDF膜上，用5％脱脂乳室温封闭2h，用PBS洗涤3次；使用小鼠阳性(1:4000)，阴性(1:4000)和His单抗(1:4000)作为一抗，室温孵育2h，PBST洗涤三次，每次10min；辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG作为二抗(1:10000)，常温孵育1h，PBST洗涤三次，每次10min，最后用ECL发光液曝光。
结果如图8所示，表明，与阳性对照相同(A)，免疫的小鼠血清可以特异性的与His-ChCR2-ΔTM蛋白进行结合B)，阴性的小鼠血清不能与His-ChCR2-ΔTM蛋白进行结合(C)。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> 鸡CR2基因的克隆、蛋白的表达和纯化及其多克隆抗体的制备
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 370
<212> PRT
<213> 鸡的CR2蛋白(ChCR2)
<400> 1
Met Ala Gln Cys Lys Ala Asp Lys Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Ile
1 5 10 15
Cys Glu Gln Val Val Lys Cys Leu Pro Pro Pro Ser Ile Ile Asn Gly
20 25 30
Glu His Ser His Phe Ser Asp Thr Phe Gly Val Gly Ala Ile Val His
35 40 45
Tyr Arg Cys Lys Pro Gly Phe Phe Leu Thr Gly Asn Glu Ser Ile Arg
50 55 60
Cys Thr Pro His Gly Ile Trp Ser Arg Pro Leu Pro Arg Cys Glu Ala
65 70 75 80
Gly Cys Val Ser Pro Gly Ile Gly His Gly Lys Val Ile Gly Trp Glu
85 90 95
Pro Leu Tyr Met Pro Gly Asn Ile Ile Thr Ile Glu Cys Asn Thr Asp
100 105 110
Asn Ile Ser Lys Val Leu His Lys Ser Gln Cys Arg Pro Gly Gly Thr
115 120 125
Trp Phe Pro Pro Leu Pro Ala Cys Asp Gly Val Leu His Cys Ser Lys
130 135 140
Pro Pro Asp Ile Leu His Gly Gly His Ser Gly Leu Gly Lys Ala Val
145 150 155 160
Phe Thr Pro Gly Thr Ser Val Asn Tyr Ser Cys Glu Thr Gly Phe Ser
165 170 175
Leu Ile Gly Met Ala Ser Ile Tyr Cys Thr Glu Ser Gly Ala Trp Ser
180 185 190
His Pro Ser Pro Val Cys Gln Val Val Lys Cys Leu His Pro Pro Ala
195 200 205
Ile Thr Asn Gly Lys Leu Gln Gly Asn Thr Ser Asp Thr Phe Phe Tyr
210 215 220
Gly Val Ser Val Ser Tyr Ser Cys Asp Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Gly
225 230 235 240
Asp Ala Phe Ile Thr Cys Thr Ala Ser Gly Thr Trp Ser Pro Pro Pro
245 250 255
Gln Cys Lys Glu Ile Ser Cys Val Phe Pro Glu Val Gln Gly Val Lys
260 265 270
Lys Thr Thr Ala Gly Lys Thr Tyr Arg Phe Gly Thr Asn Ile Thr Leu
275 280 285
Glu Cys Asp Asp Gly Tyr Thr Leu Glu Gly Leu Ser Gln Ile Gln Cys
290 295 300
Gln Glu Asn Phe Ser Trp Asp Pro Pro Val Pro Ala Cys Lys Leu Thr
305 310 315 320
Ser Pro Arg Ser Gly Ser Val Gly Leu Gly Ile Ala Ala Ala Val Val
325 330 335
Leu Leu Leu Leu Gly Val Thr Ile Gly Trp Lys Ile Ile Ser Lys Lys
340 345 350
Lys Glu Gly Tyr Tyr Arg Thr Tyr Glu Asn Tyr Asn Tyr Lys Thr Ser
355 360 365
Leu Asp
370
<210> 2
<211> 1113
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcccagt gcaaagctga caaaacgtgg gatcctcctg tgcccatctg tgagcaggtg 60
gtaaagtgtc tacctcctcc aagcatcatc aatggggaac acagtcattt ctcagacact 120
tttggtgtag gtgcaatcgt gcactaccgc tgcaaaccgg gcttcttcct cactggcaat 180
gagtccatcc gctgcacacc gcatgggatc tggagccgtc ctctacctcg gtgtgaggct 240
ggctgtgtga gcccaggaat tgggcatgga aaagtgattg gatgggaacc tctctacatg 300
cctggaaaca tcatcacaat tgaatgcaac actgataata tctcaaaagt cctccacaag 360
tcccagtgcc gacctggggg cacatggttt cctccactcc ctgcctgtga cggagtgctg 420
cactgctcca agcccccaga tatcctccac gggggccaca gtggcctggg aaaagcagtt 480
ttcactcctg gaacatctgt aaactacagc tgtgagactg gcttctccct cattggaatg 540
gcatccattt actgtacaga gtctggagcc tggagccatc cttctcctgt ctgtcaagtg 600
gtgaagtgtc ttcaccctcc agctatcacc aatgggaagc tccaaggcaa cacttcagac 660
acttttttct atggagtatc tgtgtcctac agctgtgatt ctggttattc actcactggg 720
gatgctttca tcacctgcac agcatcagga acttggagcc ctcctcctca atgcaaagag 780
atcagttgtg tattccctga agttcaaggc gttaagaaaa ccacggctgg aaaaacatac 840
agatttggga ctaacatcac tcttgaatgt gatgacgggt acacgttgga aggcctcagt 900
cagattcagt gccaggagaa cttcagctgg gaccctcccg tgccagcctg caaactcact 960
tcacccaggt ctggctcagt agggctagga attgcagctg cagtcgttct gcttctcctg 1020
ggtgtgacca ttggctggaa aattatctct aagaagaagg agggctacta ccgtacatat 1080
gaaaactaca attacaaaac ctctctggac tag 1113
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggcccagt gcaaagctga c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctagtccaga gaggttttgt a 21
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgggcccagg ccctagaatt catggcccag tgcaaagctg a 41
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcgtatggg tagccggtac ctgagccaga cctgggtgaa g 41
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gccatggctg atatcggatc catggcccag tgcaaagctg a 41
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcgagtgcg gccgcaagct tgtgagccag acctgggtga ag 42
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttccaggggc ccctgggatc catggcccag tgcaaagctg a 41
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgcggccgc tcgagtcgac ctgagccaga cctgggtgaa g 41

Claims (10)

1.一种鸡的CR2蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码上述鸡的CR2蛋白的基因，其特征在于，所述基因编码如权利要求1所述蛋白的氨基酸序列，或所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种鸡的CR2的克隆载体或表达载体，其特征在于，所述克隆载体或表达载体含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
4.一种鸡的CR2克隆载体或表达载体的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
S1、分离鸡法氏囊淋巴细胞，提取基因组RNA，使用随机引物将RNA反转录为cDNA，用ChCR2上下游引物扩增获得ChCR2全长基因；
S2、设计pET-32a-ChCR2-ΔTM的引物用于将ChCR2全长基因C端的跨膜区去掉，并在ChCR2-ΔTM基因片段两侧分别加入BamH I和Sal I两个酶切位点，以S1中得到的ChCR2全长基因为模板，扩增获得目的片段，之后分别用BamH I和Sal I酶切pET-32a载体，利用同源重组的方法将目的片段连接到载体上，获得质粒pET-32a-ChCR2-ΔTM。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤：
S3、设计ChCR2全长基因片段两侧分别加入BamH I和Hind Ⅲ两个酶切位点的引物，扩增目的片断，之后分别用BamH I和Hind Ⅲ酶切pGEX-6P-1载体，利用同源重组的方法将目的片段连接到载体上，获得质粒pGEX-6P-1-ChCR2-ΔTM。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述ChCR2引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，pET-32a-ChCR2-ΔTM引物的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，具体步骤为:以S1中得到的ChCR2为模板，采用序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物对，扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，PCR扩增得到ChCR2-ΔTM片段，在ChCR2-ΔTM基因片段两侧分别加入BamH I和Hind Ⅲ两个酶切位点，获得质粒pGEX-6P-1-ChCR2-ΔTM。
9.一种鸡的CR2蛋白的制备方法，将权利要求4或5制备的鸡的CR2原核表达载体，转入Transetta感受态细胞中，经IPTG诱导表达后，分别获得GST-ChCR2-ΔTM和His-ChCR2-ΔTM蛋白。
10.一种抗ChCR2蛋白多克隆抗体的制备，其包括如下步骤：将获得权利要求9获得的鸡的GST-ChCR2-ΔTM蛋白免疫BALB/c小鼠，接种方式为颈背部皮下多点注射，首免使用弗氏完全佐剂，分别于第三周和第五周进行二免和三免，二免和三免使用弗氏不完全佐剂，于加强免疫后三天取小鼠血清。
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