ES2880731T3 - Anticuerpos anti-PSGL-1 tetravalentes y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo tetravalente que se une específicamente a PSGL-1 humano, en donde el anticuerpo tetravalente comprende un dímero de dos monómeros y en donde: (A) cada monómero del dímero comprende un polipéptido monocatenario que comprende, del extremo N al extremo C: (1) un primer dominio variable de cadena ligera (VL); (2) una primera secuencia enlazadora; (3) un primer dominio variable de cadena pesada (VH); (4) una segunda secuencia enlazadora; (5) un segundo dominio VL; (6) una tercera secuencia enlazadora; (7) un segundo dominio VH; (8) una cuarta secuencia enlazadora; y (9) un dominio Fc de anticuerpo, en donde cada uno del primer y del segundo dominios VL comprende (i) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (ii) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (iii) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; en donde cada uno del primer y del segundo dominios VH comprende (i) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (ii) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y (iii) una CDR- H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; en donde el primer dominio VL forma una unidad de unión VH-VL con el segundo dominio VH y el primer dominio VH forma una unidad de unión VH-VL con el segundo dominio VL y en donde cada una de las dos unidades de unión VH-VL es específica para PSGL-1 humano; (B) cada monómero del dímero comprende un polipéptido monocatenario que comprende, del extremo N al extremo C: (1) un primer dominio variable de cadena pesada (VH); (2) una primera secuencia enlazadora; (3) un primer dominio variable de cadena ligera (VL); (4) una segunda secuencia enlazadora; (5) un segundo dominio VL; (6) una tercera secuencia enlazadora; (7) un segundo dominio VH; (8) una cuarta secuencia enlazadora; y (9) un dominio Fc de anticuerpo, en donde cada uno del primer y del segundo dominios VL comprende (i) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (ii) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (iii) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; en donde cada uno del primer y del segundo dominios VH comprende (i) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (ii) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y (iii) una CDR- H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; en donde cada uno del primer y del segundo dominios VL forma una unidad de unión VH-VL con un dominio VH correspondiente del primer y del segundo dominios VH y en donde cada una de las dos unidades de unión VH-VL es específica para PSGL-1 humano; o (C) cada monómero del dímero comprende una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo; en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende, del extremo N al extremo C: (1) un primer dominio variable de cadena pesada (VH), (2) una primera secuencia enlazadora, (3) un primer dominio variable de cadena ligera (VL), (4) una segunda secuencia enlazadora, (5) un segundo dominio VL y (6) un dominio constante de cadena ligera (CL); y en donde la cadena pesada del anticuerpo comprende: (1) un segundo dominio VH y (2) una región constante de cadena pesada que comprende un primer dominio de región constante de cadena pesada (CH1), una región bisagra de anticuerpo, un segundo dominio de región constante de cadena pesada (CH2) y un tercer dominio de región constante de cadena pesada (CH3); en donde cada uno del primer y del segundo dominios VL comprende (i) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (ii) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (iii) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; en donde cada uno del primer y del segundo dominios VH comprende (i) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (ii) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y (iii) una CDR- H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; en donde cada uno del primer y del segundo dominios VL forma una unidad de unión VH-VL con un dominio VH correspondiente del primer y del segundo dominios VH y en donde cada una de las dos unidades de unión VH-VL es específica para PSGL-1 humano.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-PSGL-1 tetravalentes y usos de los mismos
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de EE.UU. con N.° de Serie 62/276.806, presentada el 8 de enero de 2016, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
Presentación del listado de secuencias en un archivo de texto ASCII
El contenido de la siguiente presentación en el archivo de texto ASCII se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad: un formulario legible por ordenador (CRF, por sus siglas en inglés) del Listado de Secuencias (nombre del archivo: 606592001340SEQLIST.TXT, fecha registrada: 3 de enero de 2017, tamaño: 70 KB).
Campo
Se proporcionan en el presente documento anticuerpos tetravalentes que se unen específicamente al ligando 1 de glucoproteína de P-selectina humana (PS-GL-1), así como a polinucleótidos, vectores, células hospedadoras, métodos, composiciones farmacéuticas, kits y usos relacionados con los mismos. Estos anticuerpos tetravalentes pueden encontrar uso en diversos métodos de diagnóstico y terapéuticos, incluyendo, sin limitación, el tratamiento de enfermedades inflamatorias mediadas por células T, trasplantes y transfusiones.
Antecedentes
Las respuestas inflamatorias a la infección o lesión se inician por la adherencia de los leucocitos a la pared vascular (McEver et al, 1997, J. Clin. Invest., 100 (3): 485-492). La selectina representa una familia de glucoproteínas que median las primeras interacciones leucocito-célula endotelial y leucocito-plaqueta durante la inflamación. La familia de la selectina, que consiste en L-selectina, E-selectina y P-selectina, comprende un dominio de lectina NH2-terminal, seguido de un dominio similar a EGF, una serie de repeticiones consenso, un dominio transmembrana y una cola citoplasmática corta. Los dominios de lectina de las selectinas interactúan con ligandos glucoconjugados específicos para facilitar la adhesión celular. La L-selectina, expresada en la mayoría de los leucocitos, se une a ligandos en algunas células endoteliales y otros leucocitos. La E-selectina, expresada en células endoteliales activadas por citocinas, se une a ligandos en la mayoría de los leucocitos. La P-selectina, expresada en plaquetas activadas y células endoteliales, también se une a ligandos en la mayoría de los leucocitos.
El ligando 1 de glucoproteína de P-selectina ("PSGL-1"), también conocido como SELPLG o CD162 (grupo de diferenciación 162) es un ligando de glucoproteína de tipo mucina humana para las tres selectinas (Constantin, Gabriela, 2004, Drug News Perspect., 17(9): 579-585; McEver et al., 1997, J. Clin. Invest., 100 (3): 485-492). El PSGL-1 es un homodímero unido por enlaces disulfuro con dos subunidades de 120 kD y se expresa en la superficie de monocitos, linfocitos, granulocitos, y en algunas células madre CD34+. Es probable que el PSGL-1 contribuya al reclutamiento de leucocitos patológicos en muchos trastornos inflamatorios ya que facilita las interacciones adhesivas de las selectinas. Además, se ha demostrado que PSGL-1 tiene un papel regulador único en las células T. Los ratones deficientes en PSGL-1 muestran respuestas proliferativas y autoinmunidad mejoradas, lo que sugiere que el PSGL-1 juega un papel importante en la regulación negativa de las respuestas de las células T (Krystle M. et al. J. Immunol.
2012; 188:1638-1646. Urzainqui et al. Ann Rheum Dis 2013;71:650; Perez-Frias A, et al. Arthritis Rheumatol. nov de 2014;66(11):3178-89.; Angiari et al. J Immunol. 2013; 191(11):5489-500).
Se han desarrollado diversos anticuerpos anti-PSGL-1 (véanse, por ejemplo, las Pub. de Solicitud Internacional N°. WO 2005/110475, WO 2003/013603 y WO 2012/174001; Constantin, Gabriela, 2004, Drug News Perspect., 17(9): 579-585, Chen et al. Blood. 2004;104(10):3233-42, Huang et al, Eur J Immunol. 2005;35(7):2239-49; y la Patente de EE.UU. N.° 7.604.800. Algunos de los anticuerpos de PSGL-1 agonistas existentes inducen preferentemente la apoptosis de células T activadas en fase tardía pero no otras células que expresan PSGL-1; por lo tanto, dichos anticuerpos pueden ser útiles como agentes terapéuticos antiinflamatorios o para su uso en trasplantes y/o transfusiones. Sin embargo, existe una necesidad de anticuerpos anti-PSGL-1 mejorados con mayor efectividad in vivo que los anticuerpos existentes.
Breve sumario
El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones. Satisfaciendo esta necesidad, se proporcionan en el presente documento anticuerpos tetravalentes que se unen específicamente a PSGL-1 humano, así como polinucleótidos, vectores, células hospedadoras, métodos, composiciones farmacéuticas, kits y usos relacionados con los mismos. La presente divulgación demuestra que los anticuerpos tetravalentes que se unen específicamente a PSGL-1 humano tienen mayor potencia y efectividad que los anticuerpos anti-PSGL-1 convencionales (por ejemplo, bivalentes). Como tales, estos anticuerpos tetravalentes pueden encontrar uso, entre otros, en métodos de diagnóstico y/o terapéuticos, usos y composiciones relacionadas con la función de las células T, tales como en el tratamiento de enfermedades inflamatorias mediadas por células T, transfusiones y/o trasplantes.
En consecuencia, en un aspecto, se proporciona en el presente documento un anticuerpo tetravalente que se une específicamente a PSGL-1 humano, comprendiendo el anticuerpo tetravalente un dímero de dos monómeros, en donde cada monómero del dímero comprende un polipéptido monocatenario que comprende: (a) dos dominios variables de cadena ligera (VL), en donde cada uno de los dos dominios VL comprende una CDR-L1, una CDR-L2 y una CDR-L3; (b) dos dominios variables de cadena pesada (VH), en donde cada uno de los dos dominios v H comprende una CDR-H1, una CDR-H2 y una CDR-H3; y (c) un dominio Fc de anticuerpo, en donde cada uno de los dos dominios VL forma una unidad de unión VH-VL con un dominio VH correspondiente de los dos dominios VH y en donde cada una de las dos unidades de unión VH-VL es específica para PSGL-1 humano. En algunas realizaciones, al menos uno de los dos dominios VH comprende: (i) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (i) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y (iii) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, cada uno de los dos dominios VH comprende: (i) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (i) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y (iii) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, uno o ambos de los dos dominios VH comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, uno o ambos de los dos dominios VH comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, al menos uno de los dos dominios VL comprende: (i) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (i) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (iii) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, cada uno de los dos dominios VL comprende: (i) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (i) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (iii) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, uno o ambos de los dos dominios VL comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, uno o ambos de los dos dominios VL comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, cada uno de los dos polipéptidos monocatenarios comprende, del extremo N al extremo C: (a) un primer dominio VL de los dos dominios VL; (b) una primera secuencia enlazadora; (c) un primer dominio VH de los dos dominios VH; (d) una segunda secuencia enlazadora; (e) un segundo dominio VL de los dos dominios VL; (f) una tercera secuencia enlazadora; (g) un segundo dominio VH de los dos dominios VH; (h) una cuarta secuencia enlazadora; y (i) el dominio Fc del anticuerpo. En algunas realizaciones, la primera, la segunda y la tercera secuencias enlazadoras comprenden cada una dos o más repeticiones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, la primera y la tercera secuencias enlazadoras tienen la misma secuencia y comprenden dos repeticiones de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, la segunda secuencia enlazadora comprende cinco repeticiones de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, la cuarta secuencia enlazadora comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, cada uno de los dos polipéptidos monocatenarios comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, cada uno de los dos polipéptidos monocatenarios está codificado por un polinucleótido que comprende la secuencia polinucleotídica de s Eq ID NO: 2. En algunas realizaciones, cada uno de los dos polipéptidos monocatenarios comprende, del extremo N al extremo C: (a) un primer dominio VH de los dos dominios VH; (b) una primera secuencia enlazadora; (c) un primer dominio VL de los dos dominios VL; (d) una segunda secuencia enlazadora; (e) un segundo dominio VL de los dos dominios VL; (f) una tercera secuencia enlazadora; (g) un segundo dominio VH de los dos dominios VH; (h) una cuarta secuencia enlazadora; y (i) el dominio Fc del anticuerpo. En algunas realizaciones, cada uno de los dos polipéptidos monocatenarios comprende, del extremo N al extremo C: (a) un primer dominio VL de los dos dominios VL; (b) una primera secuencia enlazadora; (c) un primer dominio VH de los dos dominios VH; (d) una segunda secuencia enlazadora; (e) un segundo dominio VH de los dos dominios VH; (f) una tercera secuencia enlazadora; (g) un segundo dominio VL de los dos dominios VL; (h) una cuarta secuencia enlazadora; y (i) el dominio Fc del anticuerpo. En algunas realizaciones, la primera, la segunda o la tercera secuencias enlazadoras comprenden dos o más repeticiones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, la primera, la segunda o la tercera secuencias enlazadoras comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, 34, 35 o 36. En algunas realizaciones, la primera y la tercera secuencias enlazadoras tienen la misma secuencia comprendiendo dos repeticiones de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, la segunda secuencia enlazadora comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, la cuarta secuencia enlazadora comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, cada uno de los dos polipéptidos monocatenarios comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, cada uno de los dos polipéptidos monocatenarios está codificado por un polinucleótido que comprende la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, cada uno de los dos polipéptidos monocatenarios comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, cada uno de los dos polipéptidos monocatenarios está codificado por un polinucleótido que comprende la secuencia polinucleotídica de s Eq ID NO: 6.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un anticuerpo tetravalente que se une específicamente a PSGL-1 humano, comprendiendo el anticuerpo tetravalente un dímero de dos monómeros, en donde cada monómero del dímero comprende una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo; en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende: (i) dos dominios variables de cadena ligera (VL), en donde cada uno de los dos dominios VL comprende una CDR-L1, una CDR-L2 y una CDR-L3, (ii) un primer dominio variable de cadena pesada (VH) y (iii) un dominio constante de cadena ligera (CL); en donde la cadena pesada del anticuerpo comprende: (i) un segundo dominio variable de cadena pesada (VH) y (ii) una región constante de cadena pesada que comprende un primer dominio de región constante de cadena pesada (CH1), una región bisagra de anticuerpo, un segundo dominio de región constante de cadena pesada (CH2) y un tercer dominio de región constante de cadena pesada (CH3); en donde el primer y el segundo dominios VH comprenden cada uno una CDR-H1, una CDR-H2 y una CDR-H3, en donde cada uno de los dos dominios VL forma una unidad de unión VH-VL con un dominio VH correspondiente del primer y el segundo dominios VH y en donde cada una de las dos unidades de unión VH-VL es específica para PSGL-1 humano. En algunas realizaciones, al menos uno del primer y el segundo dominios VH comprende: (i) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (i) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y (iii) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, el primer y segundo dominios VH comprenden cada uno: (i) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (i) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y (iii) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo dominios VH comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo dominios VH comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, al menos uno del primer y el segundo dominios VL comprende: (i) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO: 20; (i) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (iii) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, el primer y segundo dominios VL comprenden cada uno: (i) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (i) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (iii) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo dominios VL comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo dominios VL comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, la cadena ligera del anticuerpo comprende, del extremo N al extremo C: (a) el primer dominio VH; (b) una primera secuencia enlazadora; (c) un primer dominio VL de los dos o más dominios VL; (d) una segunda secuencia enlazadora; (e) un segundo dominio VL de los dos o más dominios VL; y (f) el dominio CL. En algunas realizaciones, el dominio CL es un dominio CL kappa. En algunas realizaciones, la primera secuencia enlazadora comprende cinco repeticiones de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, la segunda secuencia enlazadora comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28. En algunas realizaciones, la cadena ligera de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, la cadena ligera del anticuerpo está codificada por un polinucleótido que comprende la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, la cadena ligera del anticuerpo comprende, del extremo N al extremo C: (a) un primer dominio VL de los dos dominios VL; (b) el dominio CL; (c) una primera secuencia enlazadora; (d) el primer dominio VH; (e) una segunda secuencia enlazadora; y (f) un segundo dominio VL de los dos dominios VL. En algunas realizaciones, el dominio CL es un dominio CL kappa. En algunas realizaciones, la primera secuencia enlazadora comprende dos repeticiones de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, la segunda secuencia enlazadora comprende cinco repeticiones de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, la cadena ligera del anticuerpo está codificada por un polinucleótido que comprende la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, la cadena pesada del anticuerpo comprende, del extremo N al extremo C: (a) el segundo dominio VH; y (b) una región constante de cadena pesada que comprende un primer dominio de región constante de cadena pesada (CH1), una región bisagra de anticuerpo, un segundo dominio de región constante de cadena pesada (CH2) y un tercer dominio de región constante de cadena pesada (CH3). En algunas realizaciones, la cadena pesada de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, la cadena pesada del anticuerpo está codificada por un polinucleótido que comprende la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 12.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un anticuerpo tetravalente que se une específicamente a PSGL-1 humano, comprendiendo el anticuerpo tetravalente un dímero de dos monómeros, en donde cada monómero del dímero comprende una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo; en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende: (i) un primer dominio variable de cadena pesada (VH), (ii) un primer dominio variable de cadena ligera (VL) y (iii) un dominio constante de cadena ligera (CL); en donde la cadena pesada del anticuerpo comprende: (i) un segundo dominio variable de cadena pesada (VH), (ii) un segundo dominio variable de cadena ligera (VL) y (iii) un dominio constante de cadena pesada que comprende un primer dominio de región constante de cadena pesada (CH1), una región bisagra de anticuerpo, un segundo dominio de región constante de cadena pesada (CH2) y un tercer dominio de región constante de cadena pesada (CH3); en donde cada uno del primer y el segundo dominios VL comprende una CDR-L1, una CDR-L2 y una CDR-L3; en donde cada uno del primer y el segundo dominios VH comprende una CDR-H1, una CDR-H2 y una CDR-H3; en donde cada uno del primer y el segundo dominios VL forma una unidad de unión VH-VL con un dominio VH correspondiente del primer y el segundo dominios; y en donde cada una de las dos unidades de unión VH-VL es específica para PSGL-1 humano. En algunas realizaciones, al menos uno del primer y el segundo dominios VH comprende: (i) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO: 17; (i) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y (iii) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, el primer y segundo dominios VH comprenden cada uno: (i) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (i) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y (iii) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo dominios VH comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo dominios VH comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, al menos uno del primer y el segundo dominios VL comprende: (i) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO: 20; (i) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (iii) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, el primer y segundo dominios VL comprenden cada uno: (i) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (i) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (iii) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo dominios VL comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo dominios VL comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, la cadena ligera del anticuerpo comprende, del extremo N al extremo C: (a) el primer dominio VH; (b) una primera secuencia enlazadora; (c) el primer dominio VL; y (d) el dominio CL. En algunas realizaciones, el dominio CL es un dominio CL kappa. En algunas realizaciones, la primera secuencia enlazadora comprende cinco repeticiones de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, la cadena ligera del anticuerpo está codificada por un polinucleótido que comprende la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 14. En algunas realizaciones, la cadena pesada del anticuerpo comprende, del extremo N al extremo C: (a) el segundo dominio VH; (b) una segunda secuencia enlazadora; (c) el segundo dominio VL; y (d) la región constante de cadena pesada que comprende el primer dominio de región constante de cadena pesada (CH1), la región bisagra del anticuerpo, el segundo dominio de región constante de cadena pesada (CH2) y el tercer dominio de región constante de cadena pesada (CH3). En algunas realizaciones, la segunda secuencia enlazadora comprende cinco repeticiones de SEQ Id NO: 25. En algunas realizaciones, la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, la cadena pesada del anticuerpo está codificada por un polinucleótido que comprende la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 16.
En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, el dominio Fc del anticuerpo es un dominio Fc de anticuerpo humano. En algunas realizaciones, el dominio Fc del anticuerpo es un dominio Fc de IgG4 humana. En algunas realizaciones, el dominio Fc de IgG4 humana comprende una secuencia de la región bisagra que comprende una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado una reducción de la transposición de IgG4, en comparación con una región de bisagra de IgG4 que carece de una o más sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, el dominio Fc de IgG4 humana comprende una secuencia de la región bisagra que comprende una sustitución de serina a prolina en el aminoácido 228, numeración de acuerdo con el índice EU. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores, la región bisagra del anticuerpo comprende una sustitución de serina a prolina en el aminoácido 228, numeración de acuerdo con el índice EU. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación muestra una inducción mejorada de apoptosis en una célula diana (por ejemplo, una célula que expresa PSGL-1 humano o un epítopo del mismo) en comparación con un anticuerpo convencional (por ejemplo, bivalente) que tiene uno o más dominios VH o VL en común con el anticuerpo tetravalente. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación muestra una inhibición mejorada de DTH (por ejemplo, en un modelo animal trans vivo) en comparación con un anticuerpo convencional (por ejemplo, bivalente) que tiene uno o más dominios VH o VL en común con el anticuerpo tetravalente.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo tetravalente de una cualquiera de las realizaciones anteriores. En algunas realizaciones, el polinucleótido aislado comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16. En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un vector que comprende el polinucleótido aislado de cualquiera de las realizaciones anteriores. En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célula hospedadora que comprende el polinucleótido de cualquiera de las realizaciones anteriores y/o el vector de cualquiera de las realizaciones anteriores. En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un método para producir un anticuerpo tetravalente que comprende cultivar la célula hospedadora de cualquiera de las realizaciones anteriores de tal manera que se produzca el anticuerpo tetravalente. En algunas realizaciones, el método comprende además recuperar el anticuerpo tetravalente de la célula hospedadora.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo tetravalente de una cualquiera de las realizaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un kit que comprende el anticuerpo tetravalente de una cualquiera de las realizaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable opcional. En algunas realizaciones, el kit comprende además un prospecto que comprende instrucciones para la administración del anticuerpo tetravalente para tratar una enfermedad o afección inflamatoria mediada por células T. En algunas realizaciones, el kit comprende además un prospecto que comprende instrucciones para la administración del anticuerpo tetravalente antes, simultáneamente con y/o después de una transfusión o trasplante. En otro aspecto, se proporciona en el presente documento el anticuerpo tetravalente de una cualquiera de las realizaciones anteriores para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección inflamatoria mediada por células T. En otro aspecto, se proporciona en el presente documento el anticuerpo tetravalente de una cualquiera de las realizaciones anteriores para su uso en el tratamiento de un individuo que necesita una transfusión o un trasplante. En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un uso del anticuerpo tetravalente de una cualquiera de las realizaciones anteriores en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o afección inflamatoria mediada por células T. En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un uso del anticuerpo tetravalente de una cualquiera de las realizaciones anteriores en la fabricación de un medicamento para tratar a un individuo que necesita una transfusión o un trasplante. En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un método para tratar una enfermedad o afección inflamatoria mediada por células T, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo tetravalente de una cualquiera de las realizaciones anteriores. En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un método para tratar a un individuo que necesita una transfusión o un trasplante, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo tetravalente de una cualquiera de las realizaciones anteriores antes, simultáneamente con y/o después de la transfusión o trasplante. En algunas realizaciones, la enfermedad inflamatoria mediada por células T es una enfermedad autoinmunitaria. En algunas realizaciones, la enfermedad inflamatoria mediada por células T se selecciona del grupo que consiste en psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, espondilitis anquilosante, diabetes tipo I, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple y enfermedad de injerto contra hospedador (EICH). En algunas realizaciones, la psoriasis es psoriasis en placas, psoriasis crónica en placas, psoriasis gotosa, psoriasis inversa, psoriasis pustulosa o psoriasis eritrodérmica. En algunas realizaciones, el trasplante es un trasplante de un tejido seleccionado del grupo que consiste en médula ósea, riñón, corazón, hígado, tejido neuronal, pulmón, páncreas, piel e intestino. En algunas realizaciones, la transfusión es una transfusión que comprende uno o más de glóbulos blancos, glóbulos rojos y plaquetas.
Breve descripción de los dibujos
Las FIGURAS 1A y 1B proporcionan esquemas que ilustran anticuerpos tetravalentes ilustrativos de acuerdo con algunas realizaciones. La FIGURA 1A ilustra los siguientes formatos ilustrativos: (1) un dímero compuesto por dos diacuerpos monocatenarios fusionados a un dominio Fc (scDb2-Fc), mostrando secuencias enlazadoras: (GGGGS)5 (SEQ ID NO: 33), GGGGSAAA (SEQ ID NO: 26) y (GGGGS)2 (SEQ ID NO: 34)/(GGGGS)2G (SEQ ID NO: 35)/(GGGGS)2GG (SEQ ID NO: 36); (2) dos formatos diferentes, teniendo cada uno un dímero de dos unidades de fragmentos variables de cadena sencilla en tándem (taFv2-Fc), mostrando secuencias enlazadoras idénticas para ambos formatos: (GGGGS)5 (SEQ ID NO: 33), ASTGS (SEQ ID NO: 27), GGGGSAAA (SEQ ID NO: 26); y (3) tres formatos diferentes basados en fragmentos variables monocatenarios (scFv-IgG), mostrando: secuencias enlazadoras scFv2-LC-IgG4p (GGGGS)5 (SEQ ID NO: 33) y ASTGSG4S (SEQ ID NO: 28), secuencias enlazadoras LC-scFv2-IgG4p (GGGGS)2 (SEQ ID NO: 34) y (GGGGS)5 (SEQ ID NO: 33), secuencias enlazadoras scFv4-crlG4p (GGGGS)5 (s Eq ID NO: 33). La FIGURA 1B proporciona otra ilustración de los tres formatos basados en scFv, con los fragmentos variables sombreados y V2 scFv indicados.
Las FIGURAS 2A-2C muestran la verificación de los pesos moleculares y las estructuras básicas de anticuerpos tetravalentes ilustrativos mediante SDS-PAGE seguido de tinción con azul Coomassie. Se muestran las condiciones no reductoras (FIGURAS 2A y 2B) y reductoras (FIGURA 2C).
Descripción detallada
Se proporcionan en el presente documento anticuerpos tetravalentes que se unen específicamente a PSGL-1 humano. La presente divulgación se basa, al menos en parte, en el descubrimiento descrito en el presente documento de que ciertos anticuerpos anti-PSGL-1 tetravalentes muestran una efectividad mejorada en comparación con el anticuerpo anti-PSGL-1 parental tanto in vitro como trans vivo. Estos anticuerpos tetravalentes mostraron una potencia más alta para la inducción de la apoptosis y una efectividad mejorada en un modelo trans vivo de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) que el anticuerpo anti-PSGL-1 parental. En el presente documento se proporcionan además polinucleótidos aislados, vectores, células hospedadoras, composiciones farmacéuticas, kits, usos y métodos relacionados con los anticuerpos tetravalentes. Por ejemplo, los anticuerpos tetravalentes de la presente divulgación pueden encontrar uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria mediada por células T, o su administración antes, simultáneamente con y/o después de una transfusión o trasplante.
En algunas realizaciones, los anticuerpos tetravalentes de la presente divulgación comprenden un dímero de dos monómeros, en donde cada monómero del dímero comprende un polipéptido monocatenario que comprende: (a) dos dominios variables de cadena ligera (VL), en donde cada uno de los dos dominios VL comprende una CDR-L1, una CDR-L2 y una CDR-L3; (b) dos dominios variables de cadena pesada (VH), en donde cada uno de los dos dominios VH comprende una CDR-H1, una CDR-H2 y una CDR-H3; y (c) un dominio Fc de anticuerpo, en donde cada uno de los dos dominios VL forma una unidad de unión VH-VL con un dominio VH correspondiente de los dos dominios VH y en donde cada una de las dos unidades de unión VH-VL es específica para PSGL-1 humano. En otras realizaciones, los anticuerpos tetravalentes de la presente divulgación comprenden un dímero de dos monómeros, en donde cada monómero del dímero comprende una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo; en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende: (i) dos dominios variables de cadena ligera (VL), en donde cada uno de los dos dominios VL comprende una CDR-L1, una CDR-L2 y una CDR-L3, (ii) un primer dominio variable de cadena pesada (VH) y (iii) un dominio constante de cadena ligera (CL); en donde la cadena pesada del anticuerpo comprende: (i) un segundo dominio variable de cadena pesada (VH) y (ii) una región constante de cadena pesada que comprende un primer dominio de región constante de cadena pesada (CH1), una región bisagra de anticuerpo, un segundo dominio de región constante de cadena pesada (CH2) y un tercer dominio de región constante de cadena pesada (CH3); en donde el primer y el segundo dominios VH comprenden cada uno una CDR-H1, una CDR-H2 y una CDR-H3, en donde cada uno de los dos dominios VL forma una unidad de unión VH-VL con un dominio VH correspondiente del primer y el segundo dominios VH y en donde cada una de las dos unidades de unión VH-VL es específica para PSGL-1 humano. En otras realizaciones, los anticuerpos tetravalentes de la presente divulgación comprenden un dímero de dos monómeros, en donde cada monómero del dímero comprende una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo; en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende: (i) un primer dominio variable de cadena pesada (VH), (ii) un primer dominio variable de cadena ligera (VL) y (iii) un dominio constante de cadena ligera (CL); en donde la cadena pesada del anticuerpo comprende: (i) un segundo dominio variable de cadena pesada (VH), (ii) un segundo dominio variable de cadena ligera (VL) y (iii) una región constante de cadena pesada que comprende un primer dominio de región constante de cadena pesada (CH1), una región bisagra de anticuerpo, un segundo dominio de región constante de cadena pesada (CH2) y un tercer dominio de región constante de cadena pesada (CH3); en donde cada uno del primer y el segundo dominios VL comprende una CDR-L1, una CDR-L2 y una CDR-L3; en donde cada uno del primer y el segundo dominios VH comprende una CDR-H1, una CDR-H2 y una CDR-H3; en donde cada uno del primer y el segundo dominios VL forma una unidad de unión VH-VL con un dominio VH correspondiente del primer y el segundo dominios; y en donde cada una de las dos unidades de unión VH-VL es específica para PSGL-1 humano.
I. Definiciones
Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a una diana, tales como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, ubicado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, el término no solo abarca anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también polipéptidos que comprenden fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv); fragmentos variables monocatenarios (scFv), diacuerpos monocatenarios (scDbs), unidades de fragmentos variables de cadena sencilla en tándem (scFv) (denominadas taFv para scFv en tándem) y mutantes u otras configuraciones de los mismos; proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo; y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno.
Como se usa en el presente documento, un anticuerpo "tetravalente" puede referirse a un anticuerpo que comprende cuatro unidades de unión de anticuerpos VH-VL, comprendiendo cada unidad de unión VH-VL un dominio VH de anticuerpo y un dominio VL de anticuerpo. Como se usa en el presente documento, las referencias a un "monómero" de un anticuerpo tetravalente pueden incluir tanto polipéptidos monocatenarios como polipéptidos de cadena múltiple. Por ejemplo, un monómero puede referirse a un polipéptido monocatenario, o puede referirse a una unidad de cadena pesada-cadena ligera de anticuerpo, donde la cadena pesada y la cadena ligera están codificadas por polinucleótidos separados y/o se forman a partir de la asociación de polipéptidos separados.
Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tales como IgG, IgA o IgM (o subclase de los mismos) y no es necesario que el anticuerpo sea de ninguna clase particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de anticuerpo del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
Los anticuerpos de la presente divulgación están destinados además a incluir moléculas biespecíficas, multiespecíficas, quiméricas, humanizadas y construidas de forma recombinante que tienen afinidad por un polipéptido conferida por al menos una región CDR del anticuerpo. Se conocen en la técnica anticuerpos de dominio único que son el dominio variable de una cadena pesada de anticuerpo o el dominio variable de una cadena ligera de anticuerpo. Véase, por ejemplo, Holt et al., Trends Biotechnol. 21:484-490, 2003. Los métodos para fabricar anticuerpos que comprenden el dominio variable de una cadena pesada de anticuerpo o bien el dominio variable de una cadena ligera de anticuerpo, que contiene tres de las seis regiones determinantes de complementariedad de origen natural de un anticuerpo, también se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Muyldermans, Rev. Mol. Biotechnol. 74:277-302, 2001.
Como se usa en el presente documento, "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales generalmente son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Adicionalmente, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo estando obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso de acuerdo con la presente divulgación pueden elaborarse mediante el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495, o puede prepararse mediante métodos de ADN recombinante tales como los descritos en la Pat. de EE.UU. N.° 4.816.567. Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse a partir de bibliotecas de fagos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554, por ejemplo.
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que tiene una región variable o parte de una región variable de una primera especie y una región constante de una segunda especie. Un anticuerpo quimérico intacto comprende dos copias de una cadena ligera quimérica y dos copias de una cadena pesada quimérica. La producción de anticuerpos quiméricos es conocida en la técnica (Cabilly et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3273-3277; Harlow y Lane (1988), Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory). Normalmente, en estos anticuerpos quiméricos, la región variable de las cadenas tanto pesadas como ligeras imita las regiones variables de anticuerpos derivados de una especie de mamífero, mientras que las porciones constantes son homólogas a las secuencias en anticuerpos derivados de otro. Una clara ventaja de tales formas quiméricas es que, por ejemplo, las regiones variables pueden derivar convenientemente de fuentes actualmente conocidas usando hibridomas o células B fácilmente disponibles de organismos hospedadores no humanos en combinación con regiones constantes derivadas de, por ejemplo, preparaciones de células humanas. Aunque la región variable tiene la ventaja de que es fácil de preparar y la especificidad no se ve afectada por su fuente, es menos probable que la región constante que es humana provoque una respuesta inmunitaria de un sujeto humano cuando se inyectan los anticuerpos que la región constante de una fuente no humana. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo en particular. En algunas realizaciones, las modificaciones de aminoácidos se realizan en la región variable y/o constante.
Como se usa en el presente documento, los anticuerpos "humanizados" se refieren a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) que son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los restos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tales como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes restos no humanos. Adicionalmente, el anticuerpo humanizado pueden comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las CDR o las secuencias marco importadas, pero se incluyen para refinar y optimizar aún más el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también de forma óptima al menos una porción de una región constante o dominio de inmunoglobulina (por ejemplo, un dominio Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Los anticuerpos pueden tener regiones Fc modificadas como se describe en el documento WO 99/58572. Otras formas de anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) que se han alterado con respecto al anticuerpo original, que también se denominan una o más CDR "derivadas de- una o más CDR del anticuerpo original.
Como se usa en el presente documento, "anticuerpo humano" significa un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o que se ha elaborado usando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos conocidas en la técnica o desveladas en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano incluye anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada humana o al menos un polipéptido de cadena ligera humana. Un ejemplo de este tipo es un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena ligera murina y de cadena pesada humana. Los anticuerpos humanos pueden prepararse usando diversas técnicas conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo humano puede seleccionarse una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Los anticuerpos humanos también pueden producirse mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes de inmunoglobulinas endógenos se han inactivado parcial o completamente. Este enfoque se describe en las Patentes de EE.UU. N.° 5.545.807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; y 5.661.016. Como alternativa, el anticuerpo humano puede prepararse inmortalizando linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (tales linfocitos B pueden recuperarse de un individuo o pueden haber sido inmunizados in vitro). Véase, por ejemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; y en la Patente de EE.UU. N.° 5.750.373.
Una "región variable" (la expresión "dominio variable" puede usarse indistintamente en el presente documento) de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) o la región variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH), sola o en combinación. Cada una de las regiones variables de la cadena pesada y ligera (dominios VH y VL, respectivamente) consiste en cuatro regiones marco (FR) conectadas por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR), también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad mediante las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos. Hay al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) una estrategia basada en la variabilidad de secuencia de especies cruzadas (es decir, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5.a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); y (2) una estrategia basada en estudios cristalográficos de complejos de antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol.
273:927-948)). Como se usa en el presente documento, una CDR puede referirse a las CDR definidas por cualquiera de los enfoques o por una combinación de ambos enfoques.
Varias delineaciones de HVR están en uso y se abarcan en el presente documento. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las más comúnmente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia se refiere, en cambio, a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las HVR de AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y se usan por el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las HVR "de contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los restos de cada una de estas HVR se indican a continuación.
Bucle Kabat AbM Chothia Contacto
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeración de Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeración de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
El sistema de numeración de Kabat se usa generalmente cuando se hace referencia a un resto en el dominio variable (aproximadamente los restos 1-107 de la cadena ligera y los restos 1-113 de la cadena pesada (por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). El "sistema de numeración EU" o "índice EU" se usa generalmente cuando se hace referencia a un resto en una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, el índice EU informado en Kabat et al., supra, y Edelman, G.M. et al. (1969) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63:78-85).
"Fv" como se usa en el presente documento puede referirse al fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión y reconocimiento de antígeno completo. Este fragmento consiste normalmente en un dímero de un dominio de la región variable de cadena pesada y uno de la ligera en asociación estrecha, no covalente. A partir del plegamiento de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de la cadena H y L) que aportan los restos de aminoácidos para la unión a antígeno y confieren al anticuerpo la especificidad de unión a antígeno. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.
Una "región constante" (la expresión "dominio constante" puede usarse indistintamente en el presente documento) de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena ligera del anticuerpo (CL) o la región constante de la cadena pesada del anticuerpo (CH), sola o en combinación. Una región constante de un anticuerpo generalmente proporciona estabilidad estructural y otras funciones biológicas tales como la asociación de cadenas de anticuerpos, secreción, movilidad transplacentaria y unión del complemento, pero no está implicada en la unión al antígeno. La secuencia de aminoácidos y las secuencias de exón correspondientes en los genes de la región constante es dependiente de la especie de la que deriva; sin embargo, las variaciones en la secuencia de aminoácidos que conducen a los alotipos son relativamente limitadas para regiones constantes particulares dentro de una especie. La región variable de cada cadena está unida a la región constante por una secuencia polipeptídica enlazadora. La secuencia enlazadora está codificada por una secuencia "J" en el gen de la cadena ligera y una combinación de una secuencia "D" y una secuencia "J" en el gen de la cadena pesada. Dependiendo del isotipo del anticuerpo, una región constante de cadena pesada puede incluir un dominio CH1, una región bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3 y/o un dominio CH4. En determinadas realizaciones, una región constante de cadena pesada comprende un dominio CH1, una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3.
La expresión "región Fc" (la expresión "dominio Fc" puede usarse indistintamente en el presente documento) se usa en el presente documento para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. Los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar; en algunas realizaciones, la región Fc puede incluir uno o más aminoácidos de la región bisagra. En algunas realizaciones, la región Fc de cadena pesada de IgG humana se define para estirarse desde un resto de aminoácido en la posición 216 de EU hasta el extremo carboxilo terminal del mismo. Las regiones Fc de secuencia nativa adecuadas para su uso en los anticuerpos de la presente divulgación incluyen IgG1 humana, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 e IgG4.
Los "Fv monocatenarios" también abreviados como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo Vh y Vl conectados en una única cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido de sFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión del sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo preparados mediante la construcción de fragmentos sFv (véase el párrafo anterior) con enlazadores cortos (por ejemplo, aproximadamente 5-12 restos) entre los dominios Vh y Vl de tal manera que se logra el emparejamiento intercatenario pero no intracatenario de los dominios V, dando como resultado un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "cruzados" en los cuales los dominios Vh y Vl de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas. Los diacuerpos se describen con mayor detalle en, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptido de referencia se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia de polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin tomar en consideración ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación para fines de determinación del porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de diversas maneras que se encuentran dentro de las capacidades de la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles de manera pública, tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se estén comparando.
Como se usa en el presente documento, "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, células citolíticas naturales (NK), neutrófilos o macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la célula diana. La actividad ADCC de una molécula de interés puede evaluarse usando un ensayo ADCC in vitro, tal como aquel descrito en la Patente de EE.UU. N.° 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células NK. Como alternativa o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como aquel desvelado en Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.
"Citotoxicidad dependiente del complemento" y "CDC" se refieren al lisado de una diana en presencia de complemento. La ruta de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) con una molécula (por ejemplo un anticuerpo) que forma un complejo con un antígeno análogo. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).
Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de manera natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje. En la definición también se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, debido a que los polipéptidos de la presente divulgación se basan en un anticuerpo tetravalente, los polipéptidos pueden producirse como cadenas individuales o cadenas asociadas.
"Polinucleótido", o "ácido nucleico", que se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases y/o sus análogos o cualquier sustrato que pueda incorporarse en un polímero mediante una ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, pueden impartirse modificaciones a la estructura de los nucleótidos antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación con un componente de marcaje. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "protecciones", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellas que contienen restos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellas que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellas que contienen alquilantes, aquellas con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido o polinucleótidos. Además, puede reemplazarse cualquiera de los grupos hidroxilo normalmente presentes en los azúcares, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse con grupos protectores convencionales o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales o pueden conjugarse a soportes sólidos. El OH 5' y 3' terminal puede fosforilarse o sustituirse con aminas o restos de grupo de protección orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivatizarse en grupos protectores convencionales. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que son normalmente conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alilo, 2'-fluoroo 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares a-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas, lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos de nucleósidos acíclicos y análogos abásicos tales como metil ribósidos. Pueden reemplazarse uno o más enlaces fosfodiéster por grupos enlazadores alternativos. Estos grupos enlazadores alternativos incluyen, pero no se limitan a, realizaciones en donde el fosfato se reemplaza con P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en donde cada R o R' son independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucleótido sean idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en el presente documento, incluyendo ADN y ARN.
Como se usa en el presente documento, "vector" significa una construcción que es capaz de administrar y expresar deseablemente uno o más gen o genes o secuencia o secuencias de interés en una célula hospedadora. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores víricos, vectores de expresión de ADN o ARN desnudo, plásmido, vectores de cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados a agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y determinadas células eucariotas, tales como células productoras.
Como se usa en el presente documento, "secuencia de control de la expresión" significa una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Una secuencia de control de la expresión puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. La secuencia de control de la expresión está unida operativamente a la secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir.
Como se usa en el presente documento, una "dosificación eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para efectuar resultados beneficiosos, deseados y/o terapéuticos. Para uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados tales como la eliminación o la reducción del riesgo, la disminución de la gravedad o el retraso del inicio de la enfermedad, incluyendo los síntomas bioquímicos, histológicos y/o de comportamiento de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para el uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos tales como la disminución de uno o más síntomas resultantes de la enfermedad, el aumento de la calidad de vida de aquellos que padecen la enfermedad, la disminución de la dosis de otras medicaciones necesarias para tratar la enfermedad, la potenciación del efecto de otra medicación tal como a través del direccionamiento, el retraso de la progresión de la enfermedad y/o la prolongación de la supervivencia. En el caso de tratar a una persona en espera de un trasplante, por ejemplo, una cantidad eficaz del fármaco puede reducir hasta cierto punto el nivel de aloanticuerpos y/o p Ra en el individuo. En el caso de tratar a una persona que recibe un trasplante o transfusión, una cantidad eficaz del fármaco puede tener el efecto en y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas o afecciones (tales como el rechazo del injerto) asociados al trasplante o la transfusión. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. Para los fines de la presente divulgación, una cantidad eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para llevar a cabo el tratamiento profiláctico o terapéutico tanto directa como indirectamente. Puede administrarse una dosificación eficaz en una o más administraciones. Para los fines de la presente divulgación, una dosificación eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para llevar a cabo el tratamiento profiláctico o terapéutico tanto directa como indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una dosificación eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede lograrse o no junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por lo tanto, puede considerarse una "dosificación eficaz" en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y puede considerarse que un único agente se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o más agentes diferentes, puede darse o se consigue un resultado deseable.
Como se usa en el presente documento, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento además de otra modalidad de tratamiento. Como tal, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento antes, durante o después de la administración de la otra modalidad de tratamiento al individuo.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" o "tratar" es un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo deseablemente resultados clínicos. Los resultados clínicos beneficiosos, deseados y/o terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: reducir o anular uno o más síntomas de inflamación o autoinmunidad (por ejemplo, que surgen de una enfermedad inflamatoria mediada por células T), aumentar la probabilidad de un resultado exitoso para el paciente y/o mitigar una o más contraindicaciones o resultados perjudiciales relacionados con un tratamiento médico (por ejemplo, relacionado con un trasplante o transfusión), disminuir los síntomas resultantes de la enfermedad, el aumento de la calidad de vida de aquellos que padecen la enfermedad, la disminución de la dosis de otras medicaciones necesarias para tratar la enfermedad, retrasar la progresión de la enfermedad, y/o prolongar la supervivencia de los individuos.
Como se usa en el presente documento, "retrasar el desarrollo de una enfermedad" significa diferir, impedir, ralentizar, retardar, estabilizar y/o posponer el desarrollo de la enfermedad (tal como cáncer). Este retardo puede ser de longitudes de tiempo variables, dependiendo de los antecedentes de la enfermedad y/o del individuo que se trate. Como es evidente para un experto en la materia, un retardo suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar prevención, en el sentido de que el individuo no desarrolla la enfermedad. Por ejemplo, puede retardarse un síntoma de una enfermedad inflamatoria, tal como una enfermedad inflamatoria mediada por células T.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero, más deseablemente un ser humano. Los mamíferos también incluyen, pero no se limitan a, animales de granja, animales para el deporte, mascotas (tales como gatos, perros o caballos), primates, ratones y ratas.
Como se usa en el presente documento, la expresión "reconoce específicamente" o "se une específicamente" se refiere a interacciones medibles y reproducibles tales como atracción o unión entre una diana y un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa, un fragmento de anticuerpo, o una unidad de unión de anticuerpo VH-VL) que es determinante de la presencia de la diana en presencia de una población heterogénea de moléculas que incluyen moléculas biológicas. Por ejemplo, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o unidad de unión VH-VL de anticuerpo que se une específica o preferentemente a un epítopo es un anticuerpo que se une a este epítopo con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de la que se une a otros epítopos de los epítopos diana o no diana. También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o unidad de unión VH-VL de anticuerpo que se une específica o preferentemente a una primera diana puede o puede no unirse específica o preferentemente a una segunda diana. Como tales, "unión específica" o "unión preferencial" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) unión exclusiva. Un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o unidad de unión VH-VL de anticuerpo que se une específicamente a una diana puede tener una constante de asociación mayor de o de aproximadamente 103 M-1 o aproximadamente 104 M-1, a veces aproximadamente 105 M-1 o aproximadamente 106 M-1, en otros casos aproximadamente 1°6 M_1 o aproximadamente 1°7 M_1, aproximadamente 101 M'1 a aproximadamente 1°9 M_1 o aproximadamente 101°M ’1 a aproximadamente 1011 M_1 o más alto. Puede usarse diversos formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o unidades de unión VH-VL de anticuerpos que son específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, se usan rutinariamente inmunoensayos ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayo que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad específica.
Un "prospecto" se refiere a las instrucciones que se incluyen habitualmente en los envases comerciales de medicamentos que contienen información sobre las indicaciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de medicamentos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones, otros medicamentos a combinar con el producto envasado y/o advertencias sobre el uso de dichos medicamentos, etc.
Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/una" y "el/la", incluyen referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a un "anticuerpo" es una referencia de uno a muchos anticuerpos, tales como cantidades molares, e incluye equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia y así sucesivamente.
La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se dirigen a ese valor o parámetro en sí. Por ejemplo, una descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".
Se entiende que aspecto y variaciones de la invención descrita en la presente divulgación incluyen "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en" aspectos y variaciones.
II. Anticuerpos tetravalentes
Determinados aspectos de la presente divulgación se refieren a anticuerpos tetravalentes que se unen específicamente a PSGL-1 humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un dímero de dos monómeros. Como se describe a continuación, los monómeros pueden acoplarse usando cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, interacciones de tipo silvestre entre dominios 0 regiones Fc de anticuerpos, interacciones alteradas o mutadas entre dominios o regiones Fc del anticuerpo (p. ej., usando una mutación de la región bisagra descrita en el presente documento) u otras interacciones covalentes o no covalentes artificiales (por ejemplo, reticulación o un enlazador). Los anticuerpos tetravalentes ilustrativos y los formatos de anticuerpos se describen a continuación y se ilustran en las FIGURAS 1A y 1B.
El PSGL-1 humano también puede denominarse ligando de selectina P, SELPG, CLA, CD162, o PSGL1. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación se une a un polipéptido codificado por el gen SELPG humano, por ejemplo, como se describe por RefSeq NCBI ID de Gen N.° 6404. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación se une a un polipéptido PSGL-1 humano que contiene 15 o 16 repeticiones de decámeros. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 representa PSGL-1 humano de longitud completa, número de registro de GenBank™ AAA74577.1, GL902797, y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 representa la proteína PSGL-1 humana de 402 aminoácidos más corta (número de registro de GenBank™ XP_005269133). En realizaciones específicas, un anticuerpo tetravalente descrito en el presente documento se une específicamente a PSGL-1 humano como se determina, por ejemplo, mediante ELISA u otro ensayo de unión a antígeno conocido en la técnica o descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, un dominio VH y un dominio VL de la presente divulgación forman una unidad de unión VH-VL (por ejemplo, que se une específicamente a un epítopo, tal como un epítopo de PSGL-1 humano). Como se describe en el presente documento, puede formarse una unidad de unión VH-VL entre un dominio VH y un dominio VL usando interacciones VH-VL de tipo silvestre o una unidad de unión VH-VL puede estabilizarse adicionalmente usando una o más mutaciones o uniones químicas (por ejemplo, un enlace disulfuro, tal como el enlace disulfuro vH44-vL100 introducido por sustituciones de cisteína en el dominio VH y VL de SEQ ID NO: 29 y 30, respectivamente).
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un dímero de dos monómeros, donde cada monómero del dímero comprende un polipéptido monocatenario.
En algunas realizaciones, un polipéptido monocatenario, de cadena pesada y/o de cadena ligera de la presente divulgación comprende una secuencia enlazadora. Puede usarse adecuadamente diversas secuencias enlazadoras, por ejemplo, para enlazar los dominios VH y VL de una unidad de unión VH-VL, para enlazar un dominio VH o VL de una unidad de unión VH-VL a un dominio VH o VL de otra unidad de unión VH-VL o para enlazar un dominio VH o VL de una unidad de unión VH-VL a una región constante de anticuerpo, tal como un dominio o región Fc. En algunas realizaciones, un enlazador de la presente divulgación puede estar presente entre dominios o regiones. En algunas realizaciones, pueden unirse dos dominios o regiones de la presente divulgación sin un enlazador o puede retirarse el enlazador que une dos dominios o regiones. El acoplamiento de dichos fragmentos monocatenarios usando diversos enlazadores se describe en Kortt et al., 1997, Protein Engineering, 10:423-433. En algunas realizaciones, una secuencia enlazadora de la presente divulgación comprende 1-50 aminoácidos. En determinadas realizaciones, una secuencia enlazadora de la presente divulgación comprende 5-12 aminoácidos. Las secuencias enlazadoras ilustrativas se describen en el presente documento y se ilustran en la FIGURA 1A. En algunas realizaciones, una secuencia enlazadora de la presente divulgación comprende una o más repeticiones de la secuencia de aminoácidos de GGGGS (SEQ ID NO: 25). En algunas realizaciones, una secuencia enlazadora de la presente divulgación comprende dos, tres, cuatro o cinco repeticiones de la secuencia de aminoácidos de GGGGS (SEQ ID NO: 25). En algunas realizaciones, una secuencia enlazadora de la presente divulgación comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, 34, 35 o 36. En algunas realizaciones, una secuencia enlazadora de la presente divulgación comprende la secuencia de aminoácidos de GGGGSAAA (SEQ ID NO: 26). En algunas realizaciones, una secuencia enlazadora de la presente divulgación comprende la secuencia de aminoácidos de ASTGS (SEQ ID NO: 27). En algunas realizaciones, una secuencia enlazadora de la presente divulgación comprende la secuencia de aminoácidos de ASTGSGGGGS (SEQ ID NO: 28).
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un dímero de dos diacuerpos monocatenarios (scDb), que puede opcionalmente fusionarse a una región constante de anticuerpo, tal como un dominio Fc.
En algunas realizaciones, cada monómero del dímero comprende un polipéptido monocatenario que comprende (a) dos dominios variables de cadena ligera (VL), en donde cada uno de los dos dominios VL comprende una CDR-L1, una CDR-L2 y una CDR-L3 y en donde los dos dominios VL son específicos para PSGL-1 humano; (b) dos dominios variables de cadena pesada (VH), en donde cada uno de los dos dominios VH comprende una CDR-H1, una CDR-H2 y una CDR-H3 y en donde los dos dominios VH son específicos para PSGL-1 humano; y (c) un dominio Fc de anticuerpo. En algunas realizaciones, cada uno de los dos dominios VL forma una unidad de unión VH-VL con un dominio VH correspondiente de los dos dominios VH.
En determinadas realizaciones, cada uno de los dos polipéptidos monocatenarios comprende, del extremo N al extremo C: (a) un primer dominio VL de dos dominios VL; (b) una primera secuencia enlazadora; (c) un primer dominio VH de dos dominios VH; (d) una segunda secuencia enlazadora; (e) un segundo dominio VL de dos dominios VL; (f) una tercera secuencia enlazadora; (g) un segundo dominio VH de dos dominios VH; (h) una cuarta secuencia enlazadora; y (i) un dominio Fc de anticuerpo. En algunas realizaciones, el primer dominio VL forma una unidad de unión VH-VL con el segundo dominio VH y el primer dominio VH forma una unidad de unión VH-VL con el segundo dominio VL.
En algunas realizaciones, la primera, la segunda y la tercera secuencias enlazadoras comprenden cada una dos o más repeticiones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, la primera, la segunda 0 la tercera secuencias enlazadoras comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, 34, 35 o 36. En algunas realizaciones, la primera y la tercera secuencias enlazadoras tienen la misma secuencia y comprenden dos repeticiones de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, la segunda secuencia enlazadora comprende cinco repeticiones de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, la cuarta secuencia enlazadora comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un dímero de dos unidades de fragmentos variables monocatenarios (scFv) en tándem (denominado taFv para scFv en tándem), que puede opcionalmente fusionarse a un dominio constante de anticuerpo, tal como un dominio Fc de un dominio constante de cadena pesada.
En determinadas realizaciones, cada uno de los dos polipéptidos monocatenarios comprende, del extremo N al extremo C: (a) un primer dominio VH de los dos dominios VH; (b) una primera secuencia enlazadora; (c) un primer dominio VL de los dos dominios VL; (d) una segunda secuencia enlazadora; (e) un segundo dominio VL de los dos dominios VL; (f) una tercera secuencia enlazadora; (g) un segundo dominio VH de los dos dominios VH; (h) una cuarta secuencia enlazadora; y (i) un dominio Fc de anticuerpo. En algunas realizaciones, el primer dominio VL forma una unidad de unión VH-VL con el primer dominio VH y el segundo dominio VH forma una unidad de unión VH-VL con el segundo dominio VL. En otras realizaciones, cada uno de los dos polipéptidos monocatenarios comprende, del extremo N al extremo C: (a) un primer dominio VL de los dos dominios VL; (b) una primera secuencia enlazadora; (c) un primer dominio VH de los dos dominios VH; (d) una segunda secuencia enlazadora; (e) un segundo dominio VH de los dos dominios VH; (f) una tercera secuencia enlazadora; (g) un segundo dominio VL de los dos dominios VL; (h) una cuarta secuencia enlazadora; y (i) el dominio constante de cadena pesada que comprende un dominio Fc de anticuerpo.
En algunas realizaciones, la primera y la tercera secuencias enlazadoras tienen la misma secuencia comprendiendo dos repeticiones de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, la segunda secuencia enlazadora comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, la cuarta secuencia enlazadora comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un dímero de dos monómeros, donde cada monómero del dímero comprende una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende una cadena ligera que comprende (i) dos dominios variables de cadena ligera (VL), en donde cada uno de los dos dominios VL comprende una CDR-L1, una CDR-L2 y una CDR-L3 y en donde los dos dominios VL son específicos para PSGL-1, (ii) un primer dominio variable de cadena pesada (VH) y (iii) un dominio constante de cadena ligera (CL); y/o una cadena pesada que comprende (i) un segundo dominio variable de cadena pesada (VH) y (ii) una región constante de cadena pesada que comprende un primer dominio de región constante de cadena pesada (CH1), una región bisagra de anticuerpo, un segundo dominio de región constante de cadena pesada (CH2) y un tercer dominio de región constante de cadena pesada (CH3). En algunas realizaciones, el primer y el segundo dominios VH comprenden cada uno una CDR-H1, una CDR-H2 y una CDR-H3. En algunas realizaciones, el primer y segundo dominios VH son específicos para PSGL-1 humano. En algunas realizaciones, cada uno de los dos dominios VL forma una unidad de unión VH-VL con un dominio VH correspondiente del primer y el segundo dominios VH.
En determinadas realizaciones, la cadena ligera del anticuerpo comprende, del extremo N al extremo C: (a) el primer dominio VH; (b) una primera secuencia enlazadora; (c) un primer dominio VL de los dos o más dominios VL; (d) una segunda secuencia enlazadora; (e) un segundo dominio VL de los dos o más dominios VL; y (f) el dominio CL. En algunas realizaciones, el dominio CL es un dominio CL kappa. En otras realizaciones, el dominio CL es un dominio CL lambda. En algunas realizaciones, el primer dominio VL forma una unidad de unión VH-VL con el primer dominio VH y el segundo dominio VH forma una unidad de unión VH-VL con el segundo dominio VL.
En algunas realizaciones, la primera secuencia enlazadora comprende cinco repeticiones de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, la segunda secuencia enlazadora comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende una cadena ligera que comprende, del extremo N al extremo C: (a) un primer dominio VL de los dos dominios VL; (b) el dominio CL; (c) una primera secuencia enlazadora; (d) el primer dominio VH; (e) una segunda secuencia enlazadora; y (f) un segundo dominio VL de los dos dominios VL. En algunas realizaciones, el dominio CL es un dominio CL kappa. En otras realizaciones, el dominio CL es un dominio CL lambda.
En algunas realizaciones, la primera secuencia enlazadora comprende dos repeticiones de SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, la segunda secuencia enlazadora comprende cinco repeticiones de SEQ ID NO: 25.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende una cadena pesada que comprende, del extremo N al extremo C: (a) el segundo de dos dominios VH; y (b) una región constante de cadena pesada que comprende un primer dominio de región constante de cadena pesada (CH1), una región bisagra de anticuerpo, un segundo dominio de región constante de cadena pesada (CH2) y un tercer dominio de región constante de cadena pesada (CH3). En algunas realizaciones, el dominio Fc del anticuerpo comprende un dominio constante de cadena pesada 2 (CH2) y un dominio constante de cadena pesada 3 (CH3). En algunas realizaciones, el primer dominio VL forma una unidad de unión VH-VL con el primer dominio VH y el segundo dominio VH forma una unidad de unión VH-VL con el segundo dominio VL.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende una cadena ligera que comprende (i) un primer dominio variable de cadena pesada (VH), (ii) un primer dominio variable de cadena ligera (VL) y (iii) un dominio constante de cadena ligera (CL); y/o una cadena pesada que comprende (i) un segundo dominio variable de cadena pesada (VH), (ii) un segundo dominio variable de cadena ligera (VL) y (iii) una región constante de cadena pesada que comprende un primer dominio de región constante de cadena pesada (CH1), una región bisagra de anticuerpo, un segundo dominio de región constante de cadena pesada (CH2) y un tercer dominio de región constante de cadena pesada (CH3). En algunas realizaciones, cada uno del primer y el segundo dominios VL comprende una CDR-L1, una CDR-L2 y una CDR-L3. En algunas realizaciones, el primer y segundo dominios VL son específicos para PSGL-1 humano. En algunas realizaciones, cada uno del primer y el segundo dominios VH comprende una CDR-H1, una CDR-H2 y una CDR-H3. En algunas realizaciones, el primer y segundo dominios VH son específicos para PSGL-1 humano. En algunas realizaciones, cada uno del primer y el segundo dominios VL forma una unidad de unión VH-VL con un dominio VH correspondiente del primer y el segundo dominios.
En algunas realizaciones, la cadena ligera del anticuerpo comprende, del extremo N al extremo C: (a) el primer dominio VH; (b) una primera secuencia enlazadora; (c) el primer dominio VL; y (d) el dominio CL. En algunas realizaciones, el dominio CL es un dominio CL kappa. En otras realizaciones, el dominio CL es un dominio CL lambda.
En algunas realizaciones, la primera secuencia enlazadora comprende cinco repeticiones de SEQ ID NO: 25.
En algunas realizaciones, la cadena pesada del anticuerpo comprende, del extremo N al extremo C: (a) el segundo de dos dominios VH; (b) una segunda secuencia enlazadora; (c) el segundo de dos dominios VL; y (d) una región constante de cadena pesada que comprende un primer dominio de región constante de cadena pesada (CH1), una región bisagra de anticuerpo, un segundo dominio de región constante de cadena pesada (CH2) y un tercer dominio de región constante de cadena pesada (CH3). En algunas realizaciones, el dominio Fc del anticuerpo comprende un dominio constante de cadena pesada 2 (CH2) y un dominio constante de cadena pesada 3 (CH3).
En algunas realizaciones, la segunda secuencia enlazadora comprende cinco repeticiones de SEQ ID NO: 25.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende uno o más dominios VH que comprenden una o más CDR seleccionadas de (i) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SFGMH (SEQ ID NO: 17); (i) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de YINGGSSTIFYANAVKG (SEQ ID NO: 18); y (iii) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de YASYGGGAMDY (SEQ ID NO: 19). En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende uno o más dominios VH que comprenden (i) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 17; (ii) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y (iii) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación es un dímero de dos monómeros, comprendiendo cada monómero dos dominios VH, comprendiendo cada dominio VH una o más CDR seleccionadas de (i) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SFGMH (SEQ ID NO: 17); (i) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de YINGGSSTIFYANAVKG (SEQ ID NO: 18); y (iii) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de YASYGGGAMDY (SEQ ID NO: 19). En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación es un dímero de dos monómeros, comprendiendo cada monómero dos dominios VH, comprendiendo cada dominio VH (i) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (i) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y (iii) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende uno o más dominios VH que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un monómero que comprende dos dominios VH, comprendiendo cada dominio VH la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende uno o más dominios VH que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un monómero que comprende dos dominios VH, comprendiendo cada dominio VH la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende uno o más dominios VH que comprenden una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un monómero que comprende dos dominios VH, comprendiendo cada dominio VH una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, la secuencia VH que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PSGL-1 humano que comprende esta secuencia retiene la capacidad de unirse a PSGL-1. En algunas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en SEQ ID NO: 23.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende uno o más dominios VH que comprenden una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un monómero que comprende dos dominios VH, comprendiendo cada dominio VH una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. En algunas realizaciones, la secuencia VH que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PSGL-1 humano que comprende esta secuencia retiene la capacidad de unirse a PSGL-1. En algunas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en SEQ ID NO: 29.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende uno o más dominios VL que comprenden una o más CDR seleccionadas de (i) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RSSQSIVHNDGNTYFE (SEQ ID NO: 20); (i) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de KVSNRFS (SEQ ID NO: 21); y (iii) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de FQGSYVPLT (SEQ ID NO: 22). En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende uno o más dominios VL que comprenden (i) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RSSQSIVHNDGNTYFE (SEQ ID No : 20); (i) una c Dr-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de KVSNRFS (SEQ ID NO: 21); y (iii) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de FQGSYVPLT (SEQ ID NO: 22). En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación es un dímero de dos monómeros, comprendiendo cada monómero dos dominios VL, comprendiendo cada dominio VL una o más CDR seleccionadas de (i) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RSSQSIVHNDGNTYFE (SEQ ID NO: 20); (i) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de KVSNRFS (SEQ ID NO: 21); y (iii) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de FQGSYVPLT (SEQ ID NO: 22). En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación es un dímero de dos monómeros, comprendiendo cada monómero dos dominios VL, comprendiendo cada dominio VL (i) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RSSQSIVHNDGNTYFE (SEQ ID NO: 20); (i) una c Dr -L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de KVSNRFS (SEQ ID NO: 21); y (iii) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de FQGSYVPLT (SEQ ID NO: 22).
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende uno o más dominios VL que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un monómero que comprende dos dominios VL, comprendiendo cada dominio VL la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende uno o más dominios VL que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un monómero que comprende dos dominios VL, comprendiendo cada dominio VL la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende uno o más dominios VL que comprenden una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un monómero que comprende dos dominios VL, comprendiendo cada dominio VL una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, la secuencia VL que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PSGL-1 humano que comprende esta secuencia retiene la capacidad de unirse a PSGL-1. En algunas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en SEQ ID NO: 24.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende uno o más dominios VL que comprenden una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un monómero que comprende dos dominios VL, comprendiendo cada dominio VL una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones, la secuencia VL que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PSGL-1 humano que comprende esta secuencia retiene la capacidad de unirse a PSGL-1. En algunas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en SEQ ID NO: 30.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un polipéptido monocatenario que comprende una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3 o 5. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un dímero de dos monómeros, comprendiendo cada monómero dos polipéptidos monocatenarios, comprendiendo cada polipéptido monocatenario una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3 o 5. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica monocatenaria tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PSGL-1 humano que comprende esta secuencia retiene la capacidad de unirse a PSGL-1. En algunas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en SEQ ID NO: 1, 3 o 5. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende dos polipéptidos monocatenarios, comprendiendo cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3 o 5.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un polipéptido monocatenario que comprende una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido monocatenario codificado por la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 2, 4 o 6. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un dímero de dos monómeros, comprendiendo cada monómero dos polipéptidos monocatenarios, comprendiendo cada polipéptido monocatenario una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido monocatenario codificado por la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 2, 4 o 6. En algunas realizaciones, la secuencia polipeptídica monocatenaria tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PSGL-1 humano que comprende esta secuencia retiene la capacidad de unirse a PSGL-1. En algunas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en el polipéptido monocatenario codificado por la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 2, 4 o 6. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende dos polipéptidos monocatenarios, cada uno codificado por la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 2, 4 o 6.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 9 o 13. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un dímero de dos monómeros, comprendiendo cada monómero una cadena pesada y una cadena ligera y comprendiendo cada cadena ligera una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 9 o 13. En algunas realizaciones, teniendo la secuencia polipeptídica de cadena ligera al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo antiPSGL-1 humano que comprende esta secuencia retiene la capacidad de unirse a PSGL-1. En algunas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en SEQ ID NO: 7, 9 o 13. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un dímero de dos monómeros, comprendiendo cada monómero una cadena pesada y una cadena ligera y comprendiendo cada cadena ligera la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 9 o 13.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un polipéptido de cadena ligera que comprende una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido de cadena ligera codificado por la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 8, 10 o 14. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un dímero de dos monómeros, comprendiendo cada monómero una cadena pesada y una cadena ligera y comprendiendo cada cadena ligera una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido de cadena ligera codificado por la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 8, 10 o 14. En algunas realizaciones, teniendo la secuencia polipeptídica de cadena ligera al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PSGL-1 humano que comprende esta secuencia retiene la capacidad de unirse a PSGL-1. En algunas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en el polipéptido de cadena ligera codificado por la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 8, 10 o 14. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un dímero de dos monómeros, comprendiendo cada monómero una cadena pesada y una cadena ligera y comprendiendo cada cadena ligera un polipéptido de cadena ligera codificado por la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 8, 10 o 14.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o 15. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un dímero de dos monómeros, comprendiendo cada monómero una cadena pesada y una cadena ligera y comprendiendo cada cadena pesada una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o 15. En algunas realizaciones, teniendo la secuencia polipeptídica de cadena pesada al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PSGL-1 humano que comprende esta secuencia retiene la capacidad de unirse a PSGL-1. En algunas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en SEQ ID NO: 11 o 15. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un dímero de dos monómeros, comprendiendo cada monómero una cadena pesada y una cadena ligera y comprendiendo cada cadena pesada la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o 15.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un polipéptido de cadena pesada que comprende una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido de cadena pesada codificado por la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 12 o 16. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un dímero de dos monómeros, comprendiendo cada monómero una cadena pesada y una cadena ligera y comprendiendo cada cadena pesada una secuencia que tiene al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido de cadena pesada codificado por la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 12 o 16. En algunas realizaciones, teniendo la secuencia polipeptídica de cadena pesada al menos el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-PSGL-1 humano que comprende esta secuencia retiene la capacidad de unirse a PSGL-1. En algunas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o eliminado en el polipéptido de cadena pesada codificado por la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 12 o 16. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un dímero de dos monómeros, comprendiendo cada monómero una cadena pesada y una cadena ligera y comprendiendo cada cadena pesada un polipéptido de cadena ligera codificado por la secuencia de polinucleótidos de Se Q ID NO: 12 o 16.
La presente divulgación abarca modificaciones a los anticuerpos o polipéptidos descritos en el presente documento, incluyendo anticuerpos funcionalmente equivalentes que no afectan significativamente sus propiedades y variantes que tienen actividad y/o afinidad mejorada o disminuida. La modificación de polipéptidos es una práctica rutinaria en la técnica y no es necesario describirla en detalle en el presente documento. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservativas de restos de aminoácidos, una o más deleciones o adiciones de aminoácidos que no cambian significativamente de manera perjudicial la actividad funcional o el uso de análogos químicos.
Las inserciones en secuencias de aminoácidos incluyen fusiones en el amino y/o carboxilo terminal que varían en longitud de un resto a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un resto metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a una etiqueta de epítopo. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo de una enzima o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.
Las variantes de sustitución tienen al menos un resto de aminoácido en la molécula de anticuerpo anti-GITR humanizado eliminado y un resto diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR. Las sustituciones conservativas se muestran en la tabla a continuación bajo el encabezado de "sustituciones conservativas". Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ilustrativas" en la tabla a continuación, o como se describe además a continuación en referencia a clases de aminoácidos, y explorarse los productos.
Sustituciones de aminoácidos
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Se logran modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura principal del polipéptido en la zona de la sustitución, por ejemplo, en forma de una conformación de hoja o de hélice, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) No polar: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) Polar sin carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) Ácido (cargado negativamente): Asp, Glu;
(4) Básico (cargado positivamente): Lys, Arg;
(5) Restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y
(6) Aromático: Trp, Tyr, Phe, His
Las sustituciones no conservativas se realizan intercambiando un miembro de una de estas clases por otra clase. Cualquier resto de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo también puede sustituirse, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar el reticulado aberrante. A la inversa, pueden añadirse enlace o enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad, particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv. En el presente documento se describen ejemplos de mutaciones de cisteína (por ejemplo, la mutación del dominio VH de G44C de SEQ ID NO: 29 o la mutación del dominio VL de Q100C de Se Q ID No : 30).
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación comprende un dominio Fc de anticuerpo. En algunas realizaciones, el dominio Fc del anticuerpo es un dominio Fc humano. En determinadas realizaciones, el dominio Fc del anticuerpo es un dominio Fc de IgG4 humana.
En algunas realizaciones, se modifican uno o más restos de aminoácidos en la región constante de la cadena pesada y/o la región constante de la cadena ligera del anticuerpo. Por ejemplo, los restos de aminoácidos de los anticuerpos descritos en los Ejemplos pueden modificarse. En algunas realizaciones, la región Fc de los anticuerpos se modifica para potenciar o reducir las actividades de ADCC y/o CDC de los anticuerpos. Véanse Shields et al., J. Biol. Chem.
276:6591-6604 (2001); Presta et al., Biochem. Soc. Trans. 30:487-490 (2002).
En algunas realizaciones, la región Fc de los anticuerpos se modifica para potenciar la formación y/o la estabilidad de dímeros, o para reducir la heterogeneidad de los dímeros (por ejemplo, transposición). Se ha demostrado que una mutación de Serina a Prolina en la posición 241 usando la numeración de Kabat (Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH N.° 91-3242) o en la posición 228 usando el índice EU (Edelman et al, 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63(1): 78-85) en la región bisagra de la IgG4 humana da como resultado una reducción considerable de la formación de enlaces disulfuro dentro de la cadena, lo que resulta en la reducción de moléculas de "medio anticuerpo" de IgG4 y una heterogeneidad/transposición reducida de moléculas de IgG4 (Bloom et al. 1997, Protein Sci, 6:407-415; Angal et al, 1993, Molecular Immunology, 30(1): 105-108)). También hay informes publicados de que esta mutación de bisagra puede disminuir la transposición de IgG4 y aumentar la semivida de las moléculas de IgG4 in vivo (Labrijn, et al, 2009, Nat Biotechnol 27:767-771; Stubenrauch, et al, 2010, Drug Metab Dispos 38:84-91). Van der Neut Kolfschoten et al, informaron que el dominio Ch3 de IgG4 y no la bisagra del núcleo está predominantemente implicado en la reacción de intercambio del brazo Fab (ver Van der Neut Kolfschoten et al, 2007, Science, 317: 1554-1557 ("Van der Neut Kolfschoten") en la página 1555, col. 2). Van der Neut Kolfschaten informó que el intercambio del dominio Ch3 de IgG1 por el dominio Ch3 de IgG4 activó el intercambio de brazo Fab por la IgG1, mientras que el intercambio del dominio Ch3 de IgG4 anuló el intercambio del brazo Fab por la IgG4 (véanse, p. 1555 y Figura 2D).
En una realización específica, se proporcionan en el presente documento anticuerpos tetravalentes, que se unen específicamente a PSGL-1 y que contienen una o más sustituciones de aminoácidos en la región bisagra de IgG4, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo retiene la unión específica a dicho PSGL-1 y en donde la transposición de IgG4 se reduce con respecto a un anticuerpo que comprende una región bisagra de IgG4 que no comprende dichas una o más sustituciones de aminoácidos. En una realización específica, la región de bisagra de IgG4 solo comprende una sustitución de un solo aminoácido. Un ejemplo de una "región de bisagra de IgG4 humana", es la región de la cadena pesada de un anticuerpo IgG4 entre los dominios Ch1 y Ch2, como se establece en Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 30(1): 105-108.
En una realización específica, se determina una reducción en la transposición de IgG4 detectando una cantidad menor de moléculas de medio anticuerpo o del intercambio de brazos producido a partir de un anticuerpo descrito en el presente documento que contiene una o más sustituciones de aminoácidos en la región bisagra, en comparación con la cantidad de moléculas de medio anticuerpo o de intercambio de brazos producidos a partir de una molécula de IgG4 que contiene una región de bisagra de IgG4 que no comprende dichas una o más sustituciones de aminoácidos. Puede usarse cualquier ensayo bien conocido en la técnica para detectar la producción de medio anticuerpo y moléculas de anticuerpos biespecíficas. Véase, por ejemplo, Van der Neut Kolfschoten et al, 2007, Science, 317: 1554-1557, para ejemplos de ensayos para detectar la producción de anticuerpos biespecíficos.
En una realización específica, se proporcionan en el presente documento anticuerpos tetravalentes que se unen específicamente a PSGL-1 e incluyen un dominio Fc de IgG4 humana que comprende una sustitución de aminoácidos de Serina a Prolina en la posición del aminoácido 228 de la cadena pesada numerada de acuerdo con el índice EU (también conocido como posición 241 usando numeración Kabat).
Las modificaciones también incluyen polipéptidos glucosilados y no glucosilados, así como polipéptidos con otras modificaciones postraduccionales, tales como, por ejemplo, glucosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación. Los anticuerpos se glucosilan en posiciones conservadas en sus regiones constantes (Jefferis y Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright y Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). Las cadenas laterales de oligosacáridos de las inmunoglobulinas afectan a la función de la proteína (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe y Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) y la interacción intramolecular entre porciones de la glucoproteína, que puede afectar la conformación y la superficie tridimensional presentada de la glucoproteína (Hefferis y Lund, anteriormente; Wyss y Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Los oligosacáridos también pueden servir para dirigir una glucoproteína dada a determinadas moléculas basándose en las estructuras de reconocimiento específicas. Se ha informado también que la glucosilación de anticuerpos altera la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En particular, las células CHO con expresión regulada con tetraciclina de la p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de GlcNAc bisectora, se informó que había mejorado la actividad de ADCC (Umana et al., 1999, Mature Biotech. 17:176-180).
La glucosilación de anticuerpos normalmente está ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono con la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina y asparagina-X-cisteína, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de carbohidrato con la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. La glucosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa con un hidroxiaminoácido, más frecuentemente serina o treonina, aunque también pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
Se realiza convenientemente adición de sitios de glucosilación al anticuerpo alterando la secuencia de aminoácidos de tal manera que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glucosilación ligados a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glucosilación ligados a O).
El patrón de glucosilación de los anticuerpos también puede alterarse sin alterar la secuencia de nucleótidos subyacente. La glucosilación depende en gran parte de la célula hospedadora usada para expresar el anticuerpo. Debido al tipo de célula usada para la expresión de glucoproteínas recombinantes, por ejemplo, anticuerpos, ya que la terapéutica potencial rara vez es la célula nativa, pueden esperarse variaciones en el patrón de glucosilación de los anticuerpos (véase, por ejemplo, Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070).
Además de la elección de las células hospedadoras, los factores que alteran la glucosilación durante la producción de anticuerpos recombinantes incluyen el modo de crecimiento, la formulación de medios, la densidad del cultivo, la oxigenación, el pH, los esquemas de purificación y similares. Se han propuesto diversos métodos para alterar el patrón de glucosilación conseguido en un organismo hospedador particular incluyendo introducir o sobreexpresar determinadas enzimas implicadas en la producción de oligosacáridos (Patentes de EE.UU. N.° 5.047.335; 5.510.261; y 5.278.299). La glucosilación, o determinados tipos de glucosilación, puede retirarse enzimáticamente de la glucoproteína, usando, por ejemplo, la endoglucosidasa H (Endo H), N-glucosidasa F, endoglucosidasa F1, endoglucosidasa F2 o endoglucosidasa F3. Además, la célula hospedadora recombinante puede modificarse mediante ingeniería genética para que sea defectuosa en el procesamiento de determinados tipos de polisacáridos. Estas técnicas y técnicas similares son bien conocidas en la técnica.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación se modifica usando técnicas de acoplamiento conocidas en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, medios enzimáticos, sustitución oxidativa y quelación. Pueden usarse modificaciones, por ejemplo, para la fijación de marcadores para inmunoensayo.
El anticuerpo o polipéptido tetravalente de la presente divulgación puede conjugarse (por ejemplo, enlazarse) a un agente, tal como un agente terapéutico o un marcador. Los ejemplos de agentes terapéuticos son restos radiactivos, citotoxinas y moléculas quimioterapéuticas.
El anticuerpo tetravalente (o polipéptido) de la presente divulgación puede unirse a un marcador tal como una molécula fluorescente, una molécula radiactiva, una enzima o cualquier otro marcador conocido en la técnica. Como se usa en el presente documento, el término "marcador" se refiere a cualquier molécula que pueda detectarse. En una determinada realización, un anticuerpo puede marcarse mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado. En una determinada realización, restos de biotina que pueden detectarse por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos) puede unirse al anticuerpo. En determinadas realizaciones, un marcador puede incorporarse o unirse a otro reactivo que, a su vez, se une al anticuerpo de interés. Por ejemplo, un marcador puede incorporarse 0 unirse a un anticuerpo que, a su vez, se une específicamente al anticuerpo de interés. En determinadas realizaciones, el marcaje o el marcador también puede ser terapéutico. Diversos métodos de marcaje de polipéptidos y glucoproteínas se conocen en la técnica y pueden usarse. Determinadas clases generales de marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores enzimáticos, fluorescentes, quimioluminiscentes y radiactivos. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionucleidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I o 131I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, isotocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, fósforos de lantánidos o ficoeritrina (PE)), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa, malato deshidrogenasa, penicilinasa o luciferasa), grupos biotinilo quimioluminiscentes, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales o etiquetas de epítopo). En determinadas realizaciones, las etiquetas se unen mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico.
Basándose en la descripción del presente documento, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación puede probarse de acuerdo con diversos ensayos in vitro e in vivo conocidos en la técnica. Dichos ensayos pueden incluir, por ejemplo, ensayos de unión dirigidos a la capacidad de un anticuerpo tetravalente o fragmento del mismo para unirse a un epítopo o polipéptido de interés (por ejemplo, PSGL-1 humano o un epítopo del mismo) o ensayos funcionales dirigidos a una o más propiedades funcionales de un anticuerpo tetravalente o fragmento del mismo.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación puede ensayarse para determinar la actividad de unión contra PSGL-1 humano. En algunas realizaciones, la unión de un anticuerpo tetravalente a PSGL-1 humano o un epítopo del mismo puede probarse en un ensayo de unión in vitro. Se conocen en la técnica diversos ensayos de unión. Dichos ensayos de unión pueden ser ensayos basados en células (por ejemplo, probar la capacidad de un anticuerpo tetravalente para unirse a una célula que expresa PSGL-1 humano o un epítopo del mismo), o pueden estar basados en polipéptidos (por ejemplo, probar la capacidad de un anticuerpo tetravalente para unirse a PSGL-1 humano o un epítopo del mismo). En algunas realizaciones, se prueba un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación para determinar su unión a una célula que expresa PSGL-1 humano (por ejemplo, una célula Sp2, como se ejemplifica a continuación) por citometría de flujo, FRET, ensayos histoquímicos y similares. Otros ensayos de unión adecuados pueden incluir sin limitación métodos de equilibrio (por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), análisis Biacore™, ensayo de unión indirecta, ensayo de inhibición competitiva, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), inmunoprecipitación, electroforesis y cromatografía en gel (por ejemplo, filtración en gel).
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación puede ensayarse para uno o más ensayos funcionales para la función de PSGL-1. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación puede probarse para la inducción de apoptosis en células que expresan PSGL-1 humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación muestra una inducción mejorada de apoptosis en una célula diana (por ejemplo, una célula que expresa PSGL-1 humano o un epítopo del mismo) en comparación con un anticuerpo convencional (por ejemplo, bivalente) que tiene uno o más dominios Vh o VL en común con el anticuerpo tetravalente (por ejemplo, un anticuerpo parental). Como se demuestra en el presente documento, los anticuerpos tetravalentes de la presente divulgación mostraron mayor potencia para inducir apoptosis en células diana que los anticuerpos parentales que tienen un dominio VH y/o VL común. Los ensayos de apoptosis se describen en la técnica y pueden llevarse a cabo fácilmente por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Muppidi, J., Porter, M. y Siegel, R. M. 2004. Measurement of Apoptosis and Other Forms of Cell Death. Current Protocols in Immunology. 59:3.17.1-3.17.36). Se ejemplifican ensayos seleccionados para detectar apoptosis (por ejemplo, tinción con Anexina V o yoduro de propidio) anteriormente. El término "inducir" o "inducción" significa el inicio o un aumento de la apoptosis por encima de un nivel de control. La apoptosis de las células T activadas puede inducirse en aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 100 %, aproximadamente el 125 %, aproximadamente el 150 % o más en comparación con un control (por ejemplo, apoptosis de células T activadas en ausencia de los anticuerpos descritos en este documento o en presencia de un anticuerpo no específico).
Las células T y las líneas de células T que son apropiadas para su uso en los ensayos descritos en el presente documento relacionados con la actividad de PSGL-1 están fácilmente disponibles (por ejemplo, ARR, DU.528, Jurkat, H-SB2, RPMI 8402, CML-T1, Karpas 45, KE-37/SKW-3, SUP-T1, SUP-T3, MOLT 3/4, P12-Ichikawa, PF-382, CCRF-CEM, HPB-ALL, K-T1, TALL-1, MOLT 16/17, TALL-104, DND-41, Loucy, MOLT 13, Peer/Bel3, HUT 78/H9, HUT 102, MT-1, DEL, JB6, Karpas 299, SU-DHL1, 12H5, 3D054.8, 3DO11.10, 8D051.15 o 3D018.3) o pueden identificarse fácilmente usando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Thornton, A. M. 2003. Fraccionamiento de células T y B usando perlas magnéticas. Current Protocols in Immunology. 55:3.5A. 1-3.5A. i1., Hathcock, K. 2001. T Cell Enrichment by Cytotoxic Elimination of B Cells and Accessory Cells. Current Protocols in Immunology. 00:3.3.1-3.3.5., Horgan, K., Shaw, S. y Boirivant, M. 2009. Immunomagnetic Purification of T Cell Subpopulations. Current Protocols in Immunology. 85:7.4.1-7.4.9. y Kanof, M. E. 2001. Purification of T Cell Subpopulations. Current Protocols in Immunology. 00:7.3.1-7.3.5). En realizaciones particulares, las células o líneas celulares para su uso en ensayos de proliferación celular pueden expresar PSGL-1, endógena o recombinantemente. Las células o líneas celulares para su uso en ensayos de viabilidad celular pueden expresar PSGL-1, endógena o recombinantemente, y ejercen cambios en la viabilidad celular en respuesta a la unión del ligando PSGL-1 o del anticuerpo anti-PSGL-1. Las células o líneas celulares para su uso en ensayos de apoptosis pueden expresar PSGL-1, endógena o recombinantemente, y ejercen cambios en la apoptosis en respuesta a la unión del ligando PSGL-1 o del anticuerpo anti-PSGL-1. Preferentemente las células o líneas celulares son humanas (por ejemplo, ARR, DU.528, Jurkat, H-SB2, RPMI 8402, CML-T1, Karpas 45, KE-37/SKW-3, SUP-T1, SUP-T3, MOLT 3/4, P12-Ichikawa, PF-382, CCRF-CEM, HPB-ALL, K-T1, TALL-1, MOLT 16/17, TALL-104, DND-41, Loucy, MOLT 13, Peer/Bel3, HUT 78/H9, HUT 102, MT-1, DEL, JB6, Karpas 299 o SU-DHL1).
En algunas realizaciones, puede ensayarse un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación para la inhibición de la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH). En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación muestra una inhibición mejorada de DTH (por ejemplo, en un modelo animal trans vivo) en comparación con un anticuerpo convencional (por ejemplo, bivalente) que tiene uno o más dominios VH o VL en común con el anticuerpo tetravalente (por ejemplo, un anticuerpo parental). Como se demuestra en el presente documento, los anticuerpos tetravalentes de la presente divulgación mostraron una mayor potencia en la inhibición de DTH en un modelo trans vivo de hinchazón de la almohadilla de la pata del ratón que los anticuerpos parentales que tienen un dominio VH y/o VL común. Los ensayos de DTH se describen en la técnica y se ejemplifican a continuación y pueden llevarse a cabo fácilmente por un experto en la materia. En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación puede mostrar una potencia de inhibición de DTH que puede aumentarse en aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 100%, aproximadamente el 125%, aproximadamente el 150%, aproximadamente el 200 %, aproximadamente el 300 %, aproximadamente el 400 %, aproximadamente el 500 %, aproximadamente el 600 % o más en comparación con un control (por ejemplo, inhibición de DTH por un anticuerpo convencional o bivalente, tal como el anticuerpo parental).
111. Polinucleótidos, vectores, células hospedadoras y producción de anticuerpos
La presente divulgación también proporciona polinucleótidos que comprenden un polinucleótido que codifica cualquiera de los anticuerpos y/o polipéptidos tetravalentes descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los polipéptidos comprenden las secuencias de las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada. En algunas realizaciones, el polinucleótido es un polinucleótido aislado (por ejemplo, aislado de una célula hospedadora o de uno o más polinucleótidos diferentes).
En el presente documento se proporcionan polinucleótidos que codifican cualquiera de los anticuerpos tetravalentes o constituyentes polipeptídicos (por ejemplo, monómeros tales como polipéptidos monocatenarios, cadenas pesadas de anticuerpos y/o cadenas ligeras de anticuerpos) descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, un polinucleótido de la presente divulgación codifica una secuencia polipeptídica seleccionada de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 y 17-31. En algunas realizaciones, un polinucleótido de la presente divulgación comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16. En algunas realizaciones, un polinucleótido de la presente divulgación comprende uno o más intrones. En otras realizaciones, un polinucleótido de la presente divulgación no comprende un intrón, por ejemplo, un ADNc o una secuencia de ARNm procesada.
Se aprecia por aquellos expertos en la materia que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como se describe en el presente documento. Algunos de estos polinucleótidos tienen homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. Por lo tanto, los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones se contemplan específicamente por la presente divulgación. Además, los alelos de los genes que comprenden las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en el presente documento están dentro del alcance de la presente divulgación. Los alelos son genes endógenos que se alteran como resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes pueden, pero no necesariamente, tener una estructura o función alterada. Los alelos pueden identificarse usando técnicas convencionales (tales como hibridación, amplificación y/o comparación de secuencias de bases de datos).
También se proporcionan en el presente documento polinucleótidos que están optimizados, por ejemplo, mediante optimización de codones/ARN, reemplazo con secuencias señal heterólogas y eliminación de elementos de inestabilidad de ARNm. Los métodos para generar ácidos nucleicos optimizados que codifican un anticuerpo tetravalente o polipéptido del mismo para la expresión recombinante introduciendo cambios de codones y/o eliminando regiones inhibidoras en el ARNm pueden llevarse a cabo adaptando los métodos de optimización descritos en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 5.965.726; 6.174.666; 6.291.664; 6.414.132; y 6.794.498, en consecuencia. Por ejemplo, los sitios de corte y empalme potenciales y los elementos de inestabilidad (por ejemplo, elementos ricos en A/T o A/U) dentro del ARN pueden mutarse sin alterar los aminoácidos codificados por las secuencias de ácido nuclei
Una secuencia de polinucleótidos optimizada que codifica un anticuerpo tetravalente o polipéptido del mismo descrito en el presente documento puede hibridar con una secuencia de polinucleótidos no optimizada que codifica un anticuerpo tetravalente o polipéptido del mismo descrito en el presente documento. En realizaciones específicas, una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica un anticuerpo tetravalente o polipéptido del mismo descrito en el presente documento hibrida en condiciones de rigurosidad con una secuencia de polinucleótidos no optimizada que codifica un anticuerpo tetravalente o polipéptido del mismo descrito en el presente documento. En una realización específica, una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica un anticuerpo tetravalente o polipéptido del mismo descrito en el presente documento hibrida en condiciones de alta rigurosidad, condiciones de hibridación de rigurosidad intermedia o menor a una secuencia de nucleótidos no optimizada que codifica un anticuerpo tetravalente o polipéptido del mismo descrito en el presente documento. Se ha descrito información sobre las condiciones de hibridación, véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° US 2005/0048549 (por ejemplo, párrafos 72-73), que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
Los polinucleótidos de la presente divulgación pueden obtenerse usando síntesis química, métodos recombinantes o PCR. Los métodos de síntesis química de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica y no es necesario describirlos en detalle en el presente documento. Un experto en la materia puede usar las secuencias proporcionadas en el presente documento y un sintetizador de ADN comercial para producir una secuencia de ADN deseada.
Para preparar polinucleótidos usando métodos recombinantes, puede insertarse un polinucleótido que comprende una secuencia deseada en un vector adecuado, y el vector a su vez puede introducirse en una célula hospedadora adecuada para su replicación y amplificación, como se analiza adicionalmente en el presente documento. Los polinucleótidos pueden insertarse en células hospedadoras por cualquier medio conocido en la técnica. Las células se transforman mediante la introducción de un polinucleótido exógeno por captación directa, endocitosis, transfección, apareamiento F o electroporación. Una vez introducido, el polinucleótido exógeno puede mantenerse dentro de la célula como un vector no integrado (tal como un plásmido) o integrado en el genoma de la célula hospedadora. El polinucleótido amplificado de esta manera puede aislarse de la célula hospedadora mediante métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989).
Como alternativa, la PCR permite la reproducción de secuencias de ADN. La tecnología de PCR es bien conocida en la técnica y se describe en las Pat. de EE.UU. N.° 4.683.195; 4.800.159; 4.754.065; y 4.683.202, así como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston (1994).
La presente divulgación también proporciona vectores (por ejemplo, vectores de clonación o vectores de expresión) que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos (incluidos los anticuerpos) descritos en el presente documento. Los vectores de clonación adecuados pueden construirse de acuerdo con técnicas convencionales o pueden seleccionarse de un gran número de vectores de clonación disponibles en la técnica. Si bien el vector de clonación seleccionado puede variar según la célula hospedadora que pretenda usarse, los vectores de clonación útiles generalmente tienen la capacidad de auto-replicarse, pueden poseer una única diana para una endonucleasa de restricción particular y/o pueden llevar genes para un marcador que puede usarse en la selección de clones que contienen el vector. Los ejemplos adecuados incluyen plásmidos y virus bacterianos, por ejemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por ejemplo, pBS SK+) y sus derivados, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, ADN de fagos y vectores lanzadera tales como pSA3 y pAT28. Estos y muchos otros vectores de clonación están disponibles de proveedores comerciales tales como BioRad, Strategene e Invitrogen.
Los vectores de expresión generalmente son construcciones de polinucleótidos replicables que contienen un polinucleótido de acuerdo con la presente divulgación. El vector de expresión puede replicarse en las células hospedadoras como episomas o bien como parte integral del ADN cromosómico. Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, vectores víricos, incluyendo adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, cósmidos y vector o vectores de expresión descritos en la publicación PCT N.° WO 87/04462. Los componentes del vector generalmente pueden incluir, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal; un origen de replicación; uno o más genes marcadores; y elementos de control de la transcripción adecuados (tales como promotores, potenciadores o terminador). Para la expresión (es decir, traducción), normalmente también se requieren uno o más elementos de control de traducción, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de inicio de la traducción o codones de parada.
Los métodos para preparar anticuerpos y polipéptidos derivados de los anticuerpos se conocen en la técnica y se desvelan en el presente documento. Pueden usarse métodos bien establecidos para identificar anticuerpos anti-PSGL (por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a PSGL-1 humano), de los cuales dominios variables (por ejemplo, los dominios VH y/o VL) pueden usarse en los anticuerpos tetravalentes de la presente divulgación. Los anticuerpos anti-PSGL-1 humanos ilustrativos, así como los métodos de cribado, producción y purificación de dichos anticuerpos, se describen en la Pub. de Solicitud internacional N.° WO 2012/174001.
Pueden identificarse anticuerpos anti-PSGL-1 humano adicionales usando métodos conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos en la Pub. de Solicitud Internacional N.° WO 2012/174001 y anteriormente. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando tecnología de hibridomas, tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein (1975), Nature, 256:495. En un método de hibridoma, un ratón, un hámster u otro animal hospedador apropiado, se inmuniza normalmente con un agente inmunizante (por ejemplo, una célula que expresa PSGL-1 humano o un fragmento del mismo) para provocar linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente al agente inmunizante. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos se fusionan después con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tales como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-1031). Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen de roedor, de conejo, bovino o humano. Habitualmente, se emplean líneas de células de mieloma de rata o de ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que contenga deseablemente una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células precursoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluye normalmente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas deseadas son aquellas que se fusionan de forma eficiente, mantienen estable el nivel de expresión elevado del anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más deseables son las líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, de the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CA y la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA. También se han descrito líneas de células de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. (1984), 133:3001; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) pp. 51-63).
El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma puede analizarse después para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales. El anticuerpo puede cribarse para tener una unión específica a un polipéptido ORP150 (tal como la unión a un epítopo en un dominio extracelular del polipéptido ORP150) obtenido o expresado en la superficie celular de las células de plasmocitoma, de mieloma múltiple, de cáncer colorrectal, gástrico o esofágico o tumorales. Las células cancerosas o un polipéptido ORP150 (o un fragmento del mismo que contiene un dominio extracelular de un polipéptido ORP150) pueden usarse para el cribado. Por ejemplo, pueden usarse células RPMI8226, U266, NCI-H929, L363, Colo205, DLD-1, HT29, SNU-1, Kato-III o CE146T para el cribado. También puede usarse para el cribado un polipéptido que comprende los aminoácidos 673-800, 701-800, 673-752 o 723-732 de SEQ ID NO: 17.
En algunas realizaciones, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tales como radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Dichas técnicas y ensayos se conocen en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por el análisis Scatchard de Munson y Pollard (1980), Anal. Biochem., 107:220.
Después de identificar las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución límite y crecer por procedimientos convencionales (Goding, anteriormente). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio Eagle modificado de Dulbecco o medio RPMI-1640. Como alternativa, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales pueden generarse cultivando las células de hibridoma y los anticuerpos secretados por las células de hibridoma pueden aislarse o purificarse adicionalmente. Los anticuerpos pueden aislarse o purificarse del medio de cultivo o del líquido ascítico mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos o polipéptidos tetravalentes de la presente divulgación pueden generarse seleccionando una biblioteca de anticuerpos o polipéptidos para seleccionar anticuerpos o polipéptidos que se unen al PSGL-1 humano, por ejemplo, expresado en la superficie celular de una célula. Pueden usarse bibliotecas de presentación de anticuerpos en fagos conocidas en la técnica. En algunas realizaciones, los anticuerpos en la biblioteca (por ejemplo, presentados en fagos) son fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) o fragmentos Fab. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la biblioteca (por ejemplo, mostrados en fagos) son anticuerpos de un solo dominio. Por ejemplo, un anticuerpo de un solo dominio puede comprender la totalidad o una porción del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la biblioteca son anticuerpos humanos. Los anticuerpos identificados pueden probarse adicionalmente para determinar su capacidad para inducir la muerte celular (por ejemplo, apoptosis) y/o unirse a PSGL-1 humano usando métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento.
Los anticuerpos tetravalentes de la presente divulgación pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante, tales como aquellos descritos en las Pat. de EE.UU. N.° 4.816.567 y 6.331.415. Por ejemplo, el ADN que codifica la región variable o constante de cualquiera de los anticuerpos tetravalentes de la presente divulgación (o polipéptidos de cadena única, pesada o ligera que son constituyentes de los mismos) puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la presente divulgación sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que después se transfectan en células hospedadoras tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina para sintetizar anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de la cadena ligera y pesada humana en lugar de las secuencias murinas homólogas (Pat. de EE.UU. N.° 4.816.567) o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido distinto de inmunoglobulina. Un polipéptido distinto de inmunoglobulina tal puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la presente divulgación o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación para crear un anticuerpo bivalente quimérico.
En algunas realizaciones, los anticuerpos tetravalentes de la presente divulgación se expresan a partir de dos vectores de expresión. Por ejemplo, cada vector de expresión puede expresar un monómero de un dímero de la presente divulgación (por ejemplo, un polipéptido monocatenario o polipéptido de cadena ligera o pesada de anticuerpo). Como alternativa, ambos monómeros de un dímero de la presente divulgación se expresan a partir de un único vector de expresión.
Normalmente el vector de expresión tiene secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción que derivan de una especie compatible con una célula hospedadora. Además, el vector normalmente lleva uno o más gen o genes específicos que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en células transformadas.
Se conoce una amplia diversidad de sistemas de expresión hospedador-vector recombinantes para células eucariotas y pueden usarse en la presente divulgación. Por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería común, es el más comúnmente usado entre los microorganismos eucariotas, aunque varias de otras cepas, tales como Pichia pastoris, están disponibles. Las líneas celulares derivadas de organismos multicelulares como Sp2/0 u ovario de hámster chino (CHO), que están disponibles de la ATCC, también pueden usarse como hospedadores. Los plásmidos vector típicos adecuados para transformaciones de células eucariotas son, por ejemplo, pSV2neo y pSV2 gpt (ATCC), pSVL y pSVK3 (Pharmacia) y pBPV-1/pML2d (International Biotechnology, Inc.).
Las células hospedadoras eucariotas útiles en la presente divulgación son, por ejemplo, células de hibridoma, de mieloma, de plasmacitoma o de linfoma. Sin embargo, pueden usarse adecuadamente otras células hospedadoras eucariotas siempre que las células hospedadoras de mamífero sean capaces de reconocer secuencias de ADN transcripcionales y traduccionales para la expresión de las proteínas; procesar el péptido líder por escisión de la secuencia líder y secreción de las proteínas; y proporcionar modificaciones postraduccionales de las proteínas, por ejemplo, glucosilación.
En consecuencia, la presente divulgación proporciona células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras eucariotas) que se transforman mediante vectores de expresión recombinantes que comprenden construcciones de ADN desveladas en el presente documento y que son capaces de expresar los anticuerpos o polipéptidos tetravalentes de la presente divulgación. En algunas realizaciones, las células hospedadoras transformadas de la presente divulgación comprenden al menos una construcción de ADN que comprende un polinucleótido de la presente divulgación, o un polinucleótido que expresa un monómero, dímero o anticuerpo tetravalente de la presente divulgación, y secuencias reguladoras de la transcripción y traducción que se colocan en relación con las secuencias de ADN codificantes para dirigir la expresión de anticuerpos o polipéptidos.
Cualquier célula hospedadora capaz de sobreexpresar ADN heterólogos puede usarse con el fin de aislar los genes que codifican el anticuerpo, polipéptido o proteína de interés. Los ejemplos no limitantes de células hospedadoras de mamíferos incluyen, pero no se limitan a células COS, HeLa y CHO. Véase también la Publicación PCT N.° WO 87/04462. Las células hospedadoras distintas de mamíferos incluyen procariotas (tales como E. coli o B. subtillis) y levaduras (tales como S. cerevisae, S. pombe o K. lactis).
Las células hospedadoras usadas en la presente divulgación pueden transformarse de diversas formas mediante procedimientos de transfección convencionales bien conocidos en la técnica. Entre los procedimientos de transfección convencionales que pueden usarse se encuentran las técnicas de electroporación, técnicas de fusión de protoplastos y precipitación de fosfato de calcio. Tales técnicas se describen de forma general por F. Toneguzzo et al. (1986), Mol. Cell. Biol., 6:703-706; G. Chu et al., Nucleic Acid Res. (1987), 15:1311-1325; D. Rice et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979), 79:7862-7865; y V. Oi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 80:825-829. Los vectores que contienen polinucleótidos de interés pueden introducirse en la célula hospedadora por cualquiera de varios medios apropiados, incluyendo electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato cálcico, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles; lipofección; e infección (por ejemplo, cuando el vector es un agente infeccioso tal como el virus vaccinia). La elección de introducir vectores o polinucleótidos depende a menudo de las características de la célula hospedadora.
En el caso de dos vectores de expresión, los dos vectores de expresión pueden transferirse a una célula hospedadora uno por uno por separado o juntos (cotransferencia o cotransfección).
La presente divulgación también proporciona un método para producir los anticuerpos o polipéptidos que comprende cultivar una célula huésped que comprende un vector o vectores de expresión que codifican los anticuerpos o polipéptidos, y recuperar los anticuerpos o polipéptidos del cultivo mediante métodos bien conocidos por un experto en la materia.
Adicionalmente, los anticuerpos deseados pueden producirse en un animal transgénico. Puede obtenerse un animal transgénico adecuado de acuerdo con métodos convencionales que incluyen microinyección en huevos de los vectores de expresión apropiados, transferir los huevos a hembras pseudoembarazadas y seleccionar un descendiente que exprese el anticuerpo deseado.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos tetravalentes quiméricos que se unen específicamente a PSGL-1 humano. Por ejemplo, las regiones variable y constante del anticuerpo tetravalente son de especies separadas. En algunas realizaciones, las regiones variables tanto de cadena pesada como de cadena ligera son de los anticuerpos murinos descritos en el presente documento. El anticuerpo quimérico de la presente divulgación puede prepararse mediante técnicas bien establecidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 6.808.901; la Pat. de EE.UU. N.° 6.652.852; la Pat. de EE.UU. N.° 6.329.508; la Pat. de EE.UU. N.° 6.120.767; y la Pat. de EE.UU. N.° 5.677.427, cada una de las cuales se incorpora de esta manera por referencia. En general, el anticuerpo quimérico puede prepararse obteniendo ADNc que codifica las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos, insertando los ADNc en un vector de expresión, que, tras introducirse en las células hospedadoras eucariotas, expresan el anticuerpo quimérico de la presente divulgación. De manera deseable, el vector de expresión lleva una secuencia de cadena ligera o pesada constante funcionalmente completa de modo que cualquier secuencia variable de cadena ligera o pesada puede insertarse fácilmente en el vector de expresión.
La presente divulgación proporciona un anticuerpo tetravalente humanizado que se une específicamente a PSGL-1 humano. El anticuerpo humanizado es normalmente un anticuerpo humano en el cual los restos de las CDR se reemplazan por restos de las CDR de una especie no humana tales como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco de Fv del anticuerpo humano se reemplazan por los correspondientes restos no humanos.
Hay cuatro etapas generales para humanizar un anticuerpo monoclonal. Estas son: (1) determinar la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos predicha de los dominios variables ligeros y pesados del anticuerpo de partida, (2) diseñar el anticuerpo humanizado, es decir, decidir qué región marco del anticuerpo usar durante el proceso de humanización, (3) las metodologías/técnicas de humanización reales y (4) la transfección y expresión del anticuerpo humanizado. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; 6.331.415; 5.530.l0 l; 5.693.761; 5.693.762; 5.585.089; 6.180.370; y 6.548.640. Por ejemplo, la región constante puede modificarse por ingeniería genética para que se parezca más a las regiones constantes humanas para evitar la respuesta inmunitaria si el anticuerpo se usa en ensayos clínicos y tratamientos en humanos. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 5.997.867 y 5.866.692.
Es importante que los anticuerpos se humanicen con la retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, pueden prepararse anticuerpos humanizados mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están comúnmente disponibles y son familiares para aquellos expertos en la materia. Se dispone de programas informáticos que ilustran y exponen posibles estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias seleccionadas de la inmunoglobulina candidata. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los restos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias consenso e importadas de tal manera que se logra la característica deseada del anticuerpo, de tal manera que se consigue una afinidad aumentada por el antígeno (o los antígenos) diana. En general, los restos de la CDR están directamente y más sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión al antígeno. Los anticuerpos humanizados también pueden contener modificaciones en la región bisagra para mejorar una o más características del anticuerpo.
En otra alternativa, los anticuerpos pueden cribarse y prepararse recombinantemente mediante tecnología de visualización en fagos. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743 y 6.265.150; y Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994). Como alternativa, la tecnología de visualización de fagos (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) puede usarse para producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable de inmunoglobulina (V) de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, se clonan genes de dominio V de anticuerpo en el marco de un gen de proteína mayor o menor de la envuelta de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se expresan como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra esas propiedades. Por lo tanto, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La presentación en fagos puede realizarse en diversos formatos; para una revisión véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Pueden usarse varias fuentes de segmentos de genes V para la presentación en fagos. Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) aislaron una serie de diversos anticuerpos dirigidos contra oxazolona a partir de una biblioteca combinatoria aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos para una serie diversa de antígenos (incluyendo auto antígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas en Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). En una respuesta inmunitaria natural, los genes de anticuerpos acumulan mutaciones a un ritmo elevado (hipermutación somática). Algunos de los cambios introducidos conferirán una mayor afinidad y las células B que muestran inmunoglobulina de superficie de alta afinidad se replican y diferencian preferentemente durante la exposición posterior al antígeno. Este proceso natural puede imitarse empleando la técnica conocida como "transposición de cadenas". Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). En este método, la afinidad de los anticuerpos humanos "primarios" obtenidos por presentación de fagos puede mejorarse reemplazando secuencialmente los genes de la región V de la cadena pesada y ligera con repertorios de variantes naturales (repertorios) de genes de dominio V obtenidos de donantes no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades en el intervalo pM-nM. Waterhouse et al. han descrito una estrategia para fabricar repertorios de anticuerpos de fagos muy grandes (también conocidos como "la madre de todas las bibliotecas"), Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993). La transposición génica puede usarse también para derivar anticuerpos humanos a partir de anticuerpos de roedor, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo roedor de partida. De acuerdo con este método, que también se denomina "impresión de epítopos", el gen del dominio V de cadena pesada o ligera de los anticuerpos de roedores obtenidos mediante la técnica de presentación en fagos se reemplaza por un repertorio de genes del dominio V humanos, creando quimeras roedor-humano. La selección del antígeno da como resultado el aislamiento de regiones variables humanas capaces de restaurar un sitio funcional de unión al antígeno, es decir, el epítopo gobierna (imprime) la elección del compañero. Cuando se repite el proceso para reemplazar el dominio V de roedor restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase la Publicación PCT N.° WO 93/06213, publicada el 1 de abril de 1993). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos de roedor mediante injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen estructura o restos de CDR de origen de roedor. Es evidente que aunque el análisis anterior se refiere a anticuerpos humanizados, los principios generales analizados son aplicables a la personalización de anticuerpos para su uso, por ejemplo, en perros, gatos, primates, equinos y bovinos.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano. Pueden usarse anticuerpos no humanos que se unen específicamente a un antígeno para producir un anticuerpo completamente humano que se una a ese antígeno. Por ejemplo, el experto en la materia puede emplear una técnica de intercambio de cadenas, en el cual la cadena pesada de un anticuerpo no humano se coexpresa con una biblioteca de expresión que expresa diferentes cadenas ligeras humanas. Los anticuerpos híbridos resultantes, que contienen una cadena ligera humana y una cadena pesada no humana, se exploran después para determinar la unión al antígeno. Las cadenas ligeras que participan en la unión del antígeno se coexpresan después con una biblioteca de cadenas pesadas de anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanos resultantes se examinan una vez más para determinar la unión al antígeno. Técnicas tales como esta se describen adicionalmente en la Patente de EE.UU. 5.565.332. Además, puede usarse un antígeno para inocular un animal que sea transgénico para genes de inmunoglobulina humana. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. 5.661.016.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos biespecíficos. Un anticuerpo biespecífico tiene especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes (incluyendo diferentes epítopos). En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico de la presente divulgación incluye dos o más dominios VH y/o VL diferentes que se unen específicamente a PSGL-1. En algunas realizaciones, los dos o más dominios VH y/o VL diferentes se unen específicamente al mismo epítopo de PSGL-1. En algunas realizaciones, los dos o más dominios VH y/o VL diferentes se unen específicamente a diferentes epítopos de PSGL-1, que pueden ser epítopos superpuestos o no.
Puede prepararse un anticuerpo biespecífico (un anticuerpo monoclonal que tiene especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes) usando los anticuerpos descritos en el presente documento. Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210). Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basó en la expresión simultánea de dos parejas de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, teniendo las dos cadenas pesadas diferentes especificidades (Millstein y Cuello, 1983, Nature 305, 537-539). En algunas realizaciones, puede producirse un anticuerpo tetravalente biespecífico usando los métodos ejemplificados anteriormente.
De acuerdo con un enfoque para producir anticuerpos biespecíficos, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias de dominio constante de la inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos una parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. En algunas realizaciones, la primera región constante de cadena pesada (CHI), que contiene el sitio necesario para la unión de cadenas ligeras, está presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo hospedador adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones en las que proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Es, sin embargo, posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado rendimientos elevados o cuando las proporciones no son de significancia particular.
Los anticuerpos heteroconjugados, que comprende dos monómeros o anticuerpos unidos covalentemente, también están dentro del alcance de la presente divulgación. Dichos anticuerpos se han usado para dirigir las células del sistema inmunológico a células no deseadas (patente de EE.UU. n.° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (publicaciones PCT n.° WO 91/00360 y WO 92/200373; y documento EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden fabricarse usando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes y técnicas de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen en la patente de EE.UU n.° 4.676.980.
Determinados aspectos de la presente divulgación se refieren a dominios variables de anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, que pueden usarse como constituyente de un anticuerpo tetravalente descrito en el presente documento. Los fragmentos de anticuerpos pueden contener la región de unión activa de los anticuerpos, tales como Fab, F(ab')2, scFv, fragmentos Fv y similares. Pueden usarse diversos métodos conocidos en la técnica para producir y/o aislar fragmentos de anticuerpos, que pueden incorporarse en un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes convencionales conocidas en la técnica basadas en los conceptos descritos en el presente documento.
Pueden producirse fragmentos Fv monocatenarios, tales como se describen en Iliades et al., 1997, FEBS Letters, 409:437-441. El acoplamiento de dichos fragmentos monocatenarios usando diversos enlazadores se describe en Kortt et al., 1997, Protein Engineering, 10:423-433. Se conocen bien en la técnica diversas técnicas para la producción y manipulación recombinantes de anticuerpos. Dichos fragmentos pueden producirse a partir de los anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento usando técnicas bien establecidas en la técnica (Rousseaux et al. (1986), en Methods Enzymol., 121:663-69 Academic Press).
Los métodos para preparar fragmentos de anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo puede producirse mediante escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento de 100 kD denominado F(ab')2. Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol y opcionalmente un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo resultantes de la escisión de enlaces disulfuro, para producir fragmentos monovalentes Fab' de 50 Kd. Como alternativa, una escisión enzimática usando papaína produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, por las Pat. de EE.UU. N.° 4.036.945 y 4.331.647 y las referencias contenidas en las mismas, cuyas patentes se incorporan en el presente documento por referencia. También, véase Nisonoff et al. (1960), Arch Biochem. Biophys.
89: 230; Porter (1959), Biochem. J. 73: 119; Smyth (1967), Methods in Enzymology 11: 421-426. Como alternativa, el Fab puede producirse insertando ADN que codifica Fab del anticuerpo en un vector de expresión para procariota o un vector de expresión para eucariota, e introduciendo el vector en un procariota o eucariota para expresar el Fab.
IV. Métodos y usos
Determinados aspectos de la presente divulgación se refieren a métodos y usos para los anticuerpos tetravalentes descritos en el presente documento. Estos métodos y usos se basan al menos en parte en las propiedades de los anticuerpos tetravalentes como se describe en el presente documento, incluyendo sin limitación su número aumentado de dominios de unión a epítopos, potencial para una menor dependencia de la reticulación in vitro y/o in vivo, potencia diferencial para inducir apoptosis (por ejemplo, de células que expresan PSGL-1 humano) y/o efectividad in vivo o trans vivo potenciada.
Como se describe en el presente documento, se sabe que el PSGL-1 está implicado en la inflamación y la biología de las células T. Los anticuerpos tetravalentes de la presente divulgación que se unen específicamente a PSGL-1 humano pueden encontrar uso, entre otros, en el tratamiento de personas con enfermedades relacionadas con la función de las células T (por ejemplo, una enfermedad inflamatoria mediada por células T), o personas que necesitan procedimientos médicos que pueden provocar afecciones inflamatorias como reacciones inmunológicas o para las que dichas afecciones se tratan de antemano (por ejemplo, un trasplante o transfusión).
En algunas realizaciones, un trastorno o enfermedad tratada por los métodos descritos en el presente documento puede ser una enfermedad inflamatoria mediada por células T. Los ejemplos no limitantes de trastornos y enfermedades que pueden tratarse, o uno o más de cuyos síntomas pueden mejorarse o prevenirse usando los anticuerpos tetravalentes descritos en el presente documento incluyen psoriasis, enfermedad de Crohn, espondilitis anquilosante, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis y artritis psoriásica), diabetes mellitus, esclerosis múltiple, encefalomielitis, miastenia grave, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), Síndrome de Sjogren, úlcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, diabetes tipo I, enfermedades inflamatorias del intestino, colitis ulcerosa, asma, asma alérgica, el lupus eritematoso cutáneo, esclerodermia, vaginitis, proctitis, erupciones por fármacos, reacciones de reversión de la lepra, eritema nodular leproso, uveítis autoinmunitaria, encefalomielitis alérgica, encefalopatía hemorrágica necrotizante aguda, hipoacusia neurosensorial progresiva bilateral idiopática, anemia aplásica, anemia de glóbulos rojos puros, trombocitopenia idiopática, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis activa crónica, síndrome de Stevens-Johnson, esprúe idiopático, liquen plano, enfermedad de Graves, enfermedad de injerto contra hospedador (EICH), sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveítis posterior, fibrosis pulmonar intersticial, alergias tales como alergia atópica, SIDA y neoplasias de células T tales como leucemias o linfomas. En algunas realizaciones, la enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria.
En otra realización, la enfermedad o trastorno tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento es psoriasis en placas. La psoriasis en placas o psoriasis vulgar es la forma más común de psoriasis y se caracteriza por unas placas cutáneas eritematosas elevadas agudamente demarcadas, cubiertas por escamas plateadas. Existe una predilección de las lesiones por implicar las superficies extensoras de las extremidades, la zona lumbosacra y el cuero cabelludo. Los hallazgos histopatológicos correspondientes incluyen una infiltración celular inflamatoria significativa de la dermis y la epidermis, aumento del número de vasos dilatados y un engrosamiento sustancial de la epidermis con diferenciación desordenada de queratinocitos e hiperqueratosis. Aproximadamente un tercio de los pacientes con psoriasis en placas se clasifican como con enfermedad moderada o grave y, en consecuencia, son candidatos para una terapia más allá del tratamiento tópico.
En otra realización, el trastorno tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento es psoriasis crónica en placas. Los síntomas de la psoriasis crónica en placas incluyen, pero no se limitan a, manchas de piel enrojecidas elevadas únicas o múltiples, que van desde tamaño de monedas a más grandes, en cualquier parte del cuerpo, incluyendo pero no limitado a las rodillas, codos, regiones lumbosacras, cuero cabelludo y uñas.
En otra realización, el trastorno tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento es psoriasis guttata. Los síntomas de la psoriasis guttata incluyen, pero no se limitan a, llamaradas de placas escamosas en forma de gota de agua en la piel, seguido de una infección, tal como una infección de garganta estreptocócica.
En otra realización, la enfermedad o trastorno tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento es psoriasis inversa. Los síntomas de la psoriasis inversa incluyen, pero no se limitan a, áreas lisas, generalmente húmedas de la piel que están enrojecidas e inflamadas, a diferencia de la descamación asociada con la psoriasis en placas, en una o más de las siguientes partes del cuerpo: axilas, zona genital, debajo de los senos y en otros pliegues de piel alrededor de los genitales y las nalgas.
En otra realización, la enfermedad o trastorno tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento es psoriasis pustulosa. Los síntomas de la psoriasis pustulosa incluyen, pero no se limitan a, ampollas llenas de pus que varían en tamaño y ubicación, pero mayoritariamente en las manos y los pies.
En otra realización, la enfermedad o trastorno tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento es psoriasis eritodérmica. Los síntomas de la psoriasis eritodérmica incluyen, pero no se limitan a, enrojecimiento ardiente, periódico, extendido de la piel y el desprendimiento de escamas en las sábanas, en lugar de copos más pequeños. El enrojecimiento y el desprendimiento de la piel a menudo van acompañados de picazón y dolor intensos, aumento de la frecuencia cardíaca y fluctuación de la temperatura corporal.
En otra realización, la enfermedad o trastorno tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento es artritis reumatoide. Los síntomas de artritis reumatoide, incluyen, pero no se limitan a, fatiga, pérdida de apetito, fiebre baja, glándulas inflamadas, debilidad, dolor en las articulaciones de las muñecas, codos, hombros, caderas, rodillas, tobillos, dedos de los pies, mandíbula, manos, pies, dedos y/o cuello, rigidez matutina, dolor de pecho al respirar (pleuresía), ardor de ojos, picazón y secreción, nódulos debajo de la piel, entumecimiento, hormigueo o ardor en las manos y los pies.
En otra realización, la enfermedad o trastorno tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento es enfermedad de Crohn. Los síntomas de la enfermedad de Crohn, pero no se limitan a, dolor abdominal tipo cólico (área del vientre), fiebre, fatiga, pérdida de apetito, dolor al defecar (tenesmo), diarrea persistente, líquida, pérdida de peso no intencional, estreñimiento, inflamación ocular, fístulas (generalmente alrededor del área rectal, pueden provocar drenaje de pus, moco o heces), dolor articular, inflamación del hígado, úlceras orales, sangrado rectal y heces con sangre, bultos o llagas en la piel (úlceras) y encías inflamadas.
En otra realización, la enfermedad o trastorno tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento es espondilitis anquilosante. Los síntomas de la espondilitis anquilosante incluyen, pero no se limitan a, dolor y rigidez frecuentes en la espalda baja y los glúteos, columna vertebral y/o cuello; y el dolor y la sensibilidad se extienden a las costillas, omóplatos, caderas, muslos y talones; inflamación del ojo (iridociclitis y uveítis), que provoca enrojecimiento, dolor ocular, pérdida de la visión, flotadores y fotofobia; fatiga; y náuseas.
En otra realización, la enfermedad o trastorno tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento es diabetes mellitus. Los síntomas de la diabetes mellitus incluyen, pero no se limitan a, pérdida de peso, poliuria (micción frecuente), polidipsia (aumento de la sed), polifagia (aumento del hambre), enfermedad cardiovascular, retinopatía diabética, neuropatía diabética, estado hiperosmolar no cetósico y cetoacidosis diabética.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente o composición de la presente divulgación puede administrarse al individuo antes, simultáneamente con y/o después de un trasplante. Por ejemplo, como se describe con mayor detalle a continuación, puede administrarse un anticuerpo tetravalente o una composición de la presente divulgación para aumentar la probabilidad de un resultado de tratamiento favorable, disminuir la probabilidad de un resultado desfavorable y/o mitigar o prevenir los síntomas o resultados desfavorables que se produjeron antes, simultáneamente con y/o después de que se haya completado el trasplante.
Como se usa en el presente documento, tratar a un individuo que necesita un trasplante puede referirse a uno o más de los tratamientos terapéuticos y medidas profilácticas o preventivas (por ejemplo, aumentar la probabilidad de un resultado de tratamiento favorable, tal como la supervivencia del injerto, función de injerto o disminuir la probabilidad de un resultado desfavorable, tal como una respuesta desfavorable al tratamiento, o una afección que reduce la probabilidad de que se produzca un tratamiento favorable, tal como un trasplante). El tratamiento puede incluir, sin limitación, mitigar o prevenir afecciones y síntomas asociados a un trastorno o afección, y/o problemas o afecciones que interfieren o limitan el acceso de una persona a las opciones de tratamiento de un trastorno o afección, tales como sensibilización, hipersensibilidad, alto nivel de anticuerpos reactivos de panel (PRA) y/o presencia de aloanticuerpos preexistentes que limitan la disponibilidad de injertos para un individuo que espera un trasplante. Los que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno o afección, así como aquellos en los que debe prevenirse el trastorno o afección. El tratamiento de un trastorno o afección puede suprimir los eventos inmunomediados asociados al trastorno o afección, mejorar los síntomas del trastorno o afección, reducir la gravedad del trastorno o afección, alterar el transcurso del trastorno o la progresión de la afección y/o mejorar o curar la afección o el trastorno básico.
Por ejemplo, el tratamiento exitoso de una persona en espera de un trasplante incluye, pero no se limita a, reducir el nivel de aloanticuerpos, reducir los anticuerpos reactivos de panel (PRA), permitir que el individuo tenga más donantes compatibles con compatibilidad cruzada, aumentar la probabilidad de que el individuo reciba un injerto, acortar el período de espera esperado del individuo para un injerto, desensibilizar al individuo, reducir el riesgo de síntomas o afecciones asociados al trasplante (tales como eventos inmunomediados como se describe a continuación), o cualquier combinación de los mismos.
Por ejemplo, el tratamiento exitoso de una persona que recibe un trasplante incluye, pero no se limita a, protección y mantenimiento del órgano o tejido trasplantado a largo plazo, que comprende controlar, revertir, mitigar, retrasar o prevenir uno o más síntomas o afecciones indeseables asociadas al trasplante de órganos, tales como eventos inmunomediados, incluyendo, pero no limitado a, producción de aloanticuerpos específicos del donante (DSA), EICH, rechazo mediado por anticuerpos (AMR), rechazo hiperagudo de injerto, rechazo crónico de injerto, fracaso del injerto y pérdida del injerto, medido por los signos funcionales o histológicos del síntoma o afección. Un tratamiento capaz de controlar un trastorno o afección (por ejemplo, Rechazo del injerto) puede incluir un tratamiento que ralentice la progresión del proceso de la enfermedad, cuando se inicia después de que se observan signos funcionales o histológicos del trastorno o afección (por ejemplo, rechazo del injerto). Además, un tratamiento capaz de revertir una enfermedad o afección (por ejemplo, rechazo del injerto) puede incluir un tratamiento que, cuando se inicia después de que hayan aparecido signos funcionales o histológicos de la enfermedad o afección (por ejemplo, rechazo del injerto), invierte el proceso de la enfermedad y devuelve los descubrimientos funcionales e histológicos más cercanos a la normalidad. Un tratamiento capaz de "retrasar la progresión" de un trastorno o afección (por ejemplo, rechazo del injerto) puede incluir aplazar, impedir, ralentizar, retardar, estabilizar y/o posponer el desarrollo del trastorno o afección (por ejemplo, rechazo del injerto). Este retardo puede ser de longitudes de tiempo variables, dependiendo de los antecedentes de la enfermedad y/o del individuo que se trate. Como es evidente para un experto en la materia, un retardo suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar prevención, en que el individuo, por ejemplo, una persona en riesgo de desarrollar el trastorno o la afección, no desarrolla el trastorno o la afección.
En algunas realizaciones, un trasplante de la presente divulgación puede ser un trasplante de uno o más tejidos u órganos que incluyen, sin limitación, médula ósea, riñón, corazón, hígado, tejido neuronal, pulmón, páncreas, piel e intestino (por ejemplo, intestino delgado y/o grueso, así como cualquier sub-tejido de los mismos).
Además, los anticuerpos tetravalentes son útiles para prevenir y/o tratar ciertos trastornos y enfermedades asociadas a o causadas (en su totalidad o en parte) por una proliferación aumentada y/o números de células T activadas en relación con la proliferación y/o números de células T activadas que se encuentran en individuos sanos o individuos que no padecen el trastorno o enfermedad en particular. Los ejemplos no limitantes de trastornos y enfermedades que pueden prevenirse y/o tratarse usando los anticuerpos tetravalentes descritos en este documento incluyen enfermedad de injerto contra hospedador y casos de rechazo de trasplante (incluyendo el rechazo de trasplante usando tejidos alogénicos o xenogénicos) tales como trasplante de médula ósea, trasplante de hígado, trasplante de riñón o el trasplante de cualquier órgano o tejido.
En algunas realizaciones, un anticuerpo tetravalente o composición de la presente divulgación puede administrarse al individuo antes, simultáneamente con y/o después de una transfusión. Por ejemplo, como se describe con mayor detalle a continuación, puede administrarse un anticuerpo tetravalente o una composición de la presente divulgación para aumentar la probabilidad de un resultado de tratamiento favorable, disminuir la probabilidad de un resultado desfavorable y/o mitigar o prevenir los síntomas que se produjeron antes, simultáneamente con y/o después de que se haya completado la transfusión.
Como se usa en el presente documento, tratar a un individuo que necesita una transfusión puede referirse a uno o más de los tratamientos terapéuticos y medidas profilácticas o preventivas (por ejemplo, aumentar la probabilidad de un resultado de tratamiento favorable, tales como el reemplazo o la suplementación de componentes/células sanguíneas, o la disminución de la probabilidad de un resultado desfavorable, tal como una respuesta desfavorable al tratamiento, ineficacia del tratamiento, o reacción inmunológica, o una afección que reduce la probabilidad de que se produzca un tratamiento favorable, tal como una transfusión). El tratamiento puede incluir, sin limitación, mitigar o prevenir afecciones y síntomas asociados a un trastorno o afección, y/o problemas o afecciones que interfieren o limitan el acceso de una persona a las opciones de tratamiento de un trastorno o afección. Los que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno o afección, así como aquellos en los que debe prevenirse el trastorno o afección. El tratamiento de un trastorno o afección puede suprimir los eventos inmunomediados asociados al trastorno o afección, mejorar los síntomas del trastorno o afección, reducir la gravedad del trastorno o afección, alterar el transcurso del trastorno o la progresión de la afección y/o mejorar o curar la afección o el trastorno básico.
En algunas realizaciones, la transfusión es una transfusión que comprende uno o más de glóbulos blancos, glóbulos rojos y plaquetas. En algunas realizaciones, la transfusión comprende sangre completa o uno o más productos sanguíneos, incluyendo sin limitación glóbulos blancos, glóbulos rojos, plaquetas, plasma congelado fresco, crioprecipitados o factores de coagulación sanguínea, anticuerpos y/o sustitutos de la sangre. Las afecciones ilustrativas que pueden tratarse con una transfusión (por ejemplo, transfusión de sangre o un producto sanguíneo) incluyen, sin limitación, hemorragia o pérdida de sangre, hematocrito o hemoglobina reducidos (por ejemplo, anemia), enfermedad de células falciformes, talasemia, suplementación de sangre durante o después de procedimientos quirúrgicos, cardiopatía, lesión traumática, deficiencia de uno o más factores sanguíneos (por ejemplo, hemofilia, enfermedad de Von Willebrand, hipofibrinogenemia o una deficiencia en el factor II, V, VII, IX, X o XI), afecciones que requieren suplementación de fibrinógeno (por ejemplo, hepatopatía, transfusión de sangre, etc.), insuficiencia de la médula ósea, trastornos de la función plaquetaria, trombocitopenia, inmunodeficiencia (por ejemplo, de una terapia o enfermedad) y similares. Las descripciones de prácticas, dosificación, respuestas, indicaciones y preparaciones relacionadas con las transfusiones pueden encontrarse, por ejemplo, en the American Red Cross Compendium of Transfusion Practice Guidelines.
La administración de un polipéptido o anticuerpo tetravalente de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, de la condición fisiológica del receptor, si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico, y otros factores conocidos por los médicos expertos. La administración de un anticuerpo o un polipéptido puede ser esencialmente continua durante un período de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis espaciadas.
La dosificación y frecuencia de administración de un anticuerpo tetravalente descrito en el presente documento o una composición farmacéutica del mismo se administra de acuerdo con los métodos para prevenir y/o tratar mientras se minimizan los efectos secundarios. La dosis exacta de un anticuerpo tetravalente descrito en el presente documento para administrar a un sujeto en particular o una composición farmacéutica del mismo puede determinarse por un médico, a la luz de factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. Los factores que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad del estado patológico, la salud general del sujeto, la edad y el peso del sujeto, la dieta, el momento y la frecuencia de administración, la combinación o combinaciones con otros agentes terapéuticos o fármacos, sensibilidades de reacción y tolerancia/respuesta a la terapia. La dosificación y frecuencia de administración de un anticuerpo tetravalente descrito en el presente documento o una composición farmacéutica del mismo pueden ajustarse con el tiempo para proporcionar niveles suficientes del anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno derivado del anticuerpo, o para mantener el efecto deseado.
La dosis precisa a emplearse en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad o trastorno y se decidirá según el criterio del facultativo y las circunstancias de cada paciente.
Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de las curvas dosis-respuesta obtenidas de sistemas de ensayo in vitro o con modelos animales.
En una realización, cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento se formula para la administración por inyecciones intraperitoneales, intravenosas, subcutáneas o intramusculares u otras formas de administración tales como oral, mucosal, mediante inhalación, por vía sublingual, etc. La administración parenteral, en una realización, se caracteriza por la inyección, ya sea por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa también se contempla en el presente documento. Los inyectables pueden prepararse en formas convencionales, ya sea en forma de soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en un líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Los inyectables, las soluciones y las emulsiones también contienen uno o más excipientes. Son excipientes adecuados, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol o etanol. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas a administrarse también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, estabilizantes, potenciadores de la solubilidad y otros agentes similares. Otras vías de administración pueden incluir, administración entérica, administración intracerebral, administración nasal, administración intraarterial, administración intracardíaca, infusión intraósea, administración intratecal, infusión intravenosa, implantación o inyección subcutánea, administración intramuscular, administración intrarrectal, administración intravaginal, administración intragástrica, administración intratraqueal, administración intrapulmonar y administración intraperitoneal. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones estériles listas para inyección, productos solubles secos estériles, tales como polvos liofilizados, listos para combinar con un disolvente justo antes de su uso, incluyendo suspensiones estériles listas para inyectarse, polvos insolubles secos estériles listos para combinar con un vehículo justo antes de su uso y emulsiones estériles. Las soluciones pueden ser acuosas o no acuosas. Si se administran por vía intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS), agua y soluciones que contengan agentes espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol y polipropilenglicol y mezclas de los mismos.
En otra realización, la presente divulgación también contempla la administración de una composición que comprende los anticuerpos o polipéptidos de la presente divulgación conjugados con otras moléculas, tales como marcadores detectables o agentes terapéuticos o citotóxicos. Los agentes pueden incluir, pero no se limitan a radioisótopos, toxinas, toxoides, agentes inflamatorios, enzimas, moléculas antisentido, péptidos, citocinas y agentes quimioterapéuticos. Los expertos en la materia generalmente conocen métodos para conjugar los anticuerpos con tales moléculas. Véase, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; la Pat. de EE.UU. N.° 5.314.995; y documento EP 396.387.
En una realización, la composición comprende un anticuerpo o polipéptido conjugado con un agente citotóxico. Los agentes citotóxicos pueden incluir cualquier agente que sea perjudicial para las células. Una clase ilustrativa de agentes citotóxicos que pueden conjugarse con los anticuerpos o fragmentos puede incluir, pero no se limitan a, paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenipósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina y análogos u homólogos de los mismos.
V. Composiciones farmacéuticas
La presente divulgación también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos o polipéptidos tetravalentes descritos en el presente documento y un vehículo o excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas pueden encontrar uso, por ejemplo, en los métodos, usos y/o kits de la presente divulgación.
Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables se conocen en la técnica y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o actuar como diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, entre otros, agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, tampones y potenciadores de la penetración cutánea. En determinadas realizaciones, un anticuerpo tetravalente descrito en el presente documento está en una composición farmacéutica líquida. Las composiciones líquidas farmacéuticamente administrables pueden, por ejemplo, prepararse disolviendo, dispersando o mezclando de otro modo un anticuerpo descrito en el presente documento en un vehículo, tales como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, glicoles, etanol y similares, para de este modo formar una solución o suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica a administrar también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes solubilizantes y agentes tamponadores del pH y similares. Los excipientes y las formulaciones para la administración de fármacos por vía parenteral y no parenteral se establecen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a Ed. Mack Publishing (2000).
Las composiciones farmacéuticas se proporcionan para su administración a seres humanos y a animales en formas de dosificación unitarias, tales como soluciones o suspensiones parenterales estériles que contienen cantidades adecuadas de un anticuerpo tetravalente descrito en el presente documento. El anticuerpo tetravalente, en una realización, se formula y se administra en formas de dosificación unitaria o formas de dosificación múltiple. Las formas de dosificación unitarias como se usa en el presente documento se refieren a unidades físicamente discretas adecuadas para sujetos humanos y animales y envasadas de manera individual, tal como se conoce en la técnica. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno derivado del anticuerpo suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el portador, vehículo o diluyente farmacéutico requerido. Los ejemplos de formas de dosis unitarias incluyen ampollas y jeringas. Las formas farmacéuticas unitarias pueden administrarse en fracciones o múltiplos de las mismas. Una forma farmacéutica múltiple es una pluralidad de formas de dosificación unitarias idénticas envasadas en un solo contenedor para su administración en una forma farmacéutica segregada. Los ejemplos de formas de dosis múltiples incluyen viales o botellas de pintas o galones. Por tanto, la forma de dosis múltiple es un múltiplo de dosis unitarias que no se segregan en su envase.
La concentración de anticuerpo tetravalente en la composición farmacéutica dependerá de, por ejemplo, las características fisicoquímicas del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno derivado del anticuerpo, la pauta posológica y la cantidad administrada, así como otros factores conocidos por los expertos en la materia. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionan una dosis de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 100 mg de anticuerpo tetravalente por kilogramo de peso corporal por día. Pueden prepararse formas unitarias de dosificación farmacéuticas para proporcionar de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 100 mg y/o una combinación de otros ingredientes esenciales opcionales por forma unitaria de dosificación.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona anticuerpos y composiciones tetravalentes (tales como las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento) para su uso en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, ya sea en el contexto de uso como medicamento y/o de uso para la fabricación de un medicamento.
VI. Kits
Determinados aspectos de la presente divulgación están relacionados con kits o artículos de fabricación que comprenden un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación. Opcionalmente, los kits descritos en el presente documento pueden contener uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como los vehículos ilustrativos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, un kit de la presente divulgación incluye una composición farmacéutica de la presente divulgación. Los kits descritos en el presente documento pueden resultar útiles, por ejemplo, en los métodos o usos de la presente divulgación.
Los kits pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales tales como tampones e información interpretativa. Normalmente, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto o prospectos en o asociado con el recipiente. Los recipientes pueden ser dosis unitarias, envases a granel (por ejemplo, envases multidosis) o dosis subunitarias. Las instrucciones suministradas en los kits de la presente divulgación son normalmente instrucciones escritas en una etiqueta o en un prospecto (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el kit), pero las instrucciones legibles por una máquina (por ejemplo, instrucciones en un disco de almacenamiento óptico u magnético) también son aceptables.
En algunas realizaciones, los kits incluyen además un prospecto que comprende instrucciones para la administración del anticuerpo tetravalente para tratar una enfermedad inflamatoria mediada por células T. En algunas realizaciones, los kits incluyen además un prospecto que comprende instrucciones para la administración del anticuerpo tetravalente antes, simultáneamente con y/o después de una transfusión o trasplante.
Los kits de la presente divulgación están en un envase adecuado. Los envases adecuados incluyen, pero no se limita a, viales, botellas, frascos, envases flexibles (por ejemplo, Mylar sellado o bolsas de plástico) y similares. También se contemplan envases para su uso en combinación con un dispositivo específico, tales como un inhalador, dispositivo de administración nasal (por ejemplo, un atomizador) o un dispositivo de infusión tal como una minibomba. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica). El envase también puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un polipéptido 0 anticuerpo tetravalente descrito en el presente documento. El recipiente puede comprender además un segundo agente farmacéuticamente activo. En algunas realizaciones, un kit puede incluir además cualquier otro material o dispositivo útil en un tratamiento (por ejemplo, una transfusión o un trasplante), incluyendo sin limitación uno o más recipientes, tubos, agentes o equipos esterilizantes, cánulas, jeringas y similares.
Ejemplos
La invención se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos.
No deberían, sin embargo, interpretarse como limitantes del alcance de la invención.
Ejemplo 1: Generación y caracterización de anticuerpos tetravalentes anti-PSGL-1
El ligando 1 de glucoproteína de P-selectina (PSGL-1) se expresa en una amplia gama de células hematopoyéticas, incluyendo poblaciones de células madre mieloides, linfoides, dendríticas y CD34+ (véase, por ejemplo, Spertini et al.
1996, J Cell Biol. 135(2):523-31). Se han identificado previamente varios anticuerpos de ratón específicos para PSGL-1 y capaces de inducir apoptosis en células T. Entre estos anticuerpos de ratón, un anticuerpo (h15A7) que no interfirió con la interacción entre P-selectina y PSGL-1, que se requiere para la localización eficiente de células T y neutrófilos para dirigirse a tejidos inflamatorios, se eligió para el desarrollo clínico y se modificó a un anticuerpo monoclonal IgG4 que contiene cadena ligera kappa humanizada para minimizar ADCC y CDC en las células que expresan PSGL-1 (véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 7.604.800). Posteriormente, h15A7 se modificó por ingeniería genética además para producir h15A7H, que tiene una mutación de SER228PRO en la región bisagra de h15A7 (Pub. de Solicitud Internacional. N.° WO 2012/174001). Esta mutación se introdujo para reducir la transposición de anticuerpos, el intercambio intermolecular entre anticuerpos IgG4 in vivo. Los estudios in vitro demostraron que h15A7/h15A7H inducía preferentemente la apoptosis de las células T activadas en etapa tardía, pero no de otras células que expresan PSGL-1. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que el mecanismo de acción de h15A7H parece depender, al menos en parte, de la reticulación de las moléculas de PSGL-1 humanas, que está mediada por un reticulante de anticuerpos in vitro y posiblemente células que expresan FcR in vivo.
El ejemplo que se presenta a continuación describe el desarrollo de varios anticuerpos tetravalentes independientes de células reticulantes/que expresan FcR derivados de h15A7H (FIGURAS 1A y 1B). Sin desear quedar ligados a teoría alguna, los anticuerpos tetravalentes pueden presentar ventajas sobre h15A7H para el desarrollo clínico, por ejemplo, tratamiento de enfermedades inflamatorias mediadas por células T. Estos resultados demuestran que los anticuerpos tetravalentes h15A7H muestran una efectividad mejorada en comparación con el anticuerpo h15A7H parental tanto in vitro como trans vivo.
Métodos
Células y reactivos
Sp2/0-Ag14 (ATCC®CRL-1581™) y Sp2/0-hPSGL-1 se cultivaron en 90% de DMEM (GIBCO®, N.° de Cat. 11965­ 092™) suplementado con FBS al 10% (GIBCO®, N.° de Cat. 26140-079), 100 U/ml de penicilina/100 pg/ml de estreptomicina (GIBCO®, N.° de Cat. 15140) y piruvato sódico 1 mM (GIBCO®, N.° de Cat. 11360).
El anticuerpo h15A7H se describió en la Pub. de Solicitud Internacional N.° WO 2012/174001. Los anticuerpos tetravalentes h15A7H usados en el estudio se produjeron a partir de una línea celular estable Flp-In CHO, se purificaron por cromatografía de afinidad de proteína A y se mantuvieron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (GIBCO® N.° de Cat. 21600-069)/Tween-20 al 0,02 % (JT Baker® X251-07). Se produjo IgG4p/K humana como anticuerpo de control de isotipo irrelevante a partir de células Flp-In CHO. 12H5.5 es un anticuerpo anti-idiotipo IgG1 murino contra h15A7/h15A7H.
Animales
Se obtuvieron ratones hembra B6 de 6-8 semanas de edad de BioLASCO Taiwan Co., Ltd, Taipei, Taiwán. Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. Todos los estudios en animales se realizaron siguiendo las directrices del Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales.
Construcción de variantes de anticuerpos tetravalentes anti-PSGL-1
scDb2-Fc
scDb2-Fc (FIGURA 1A, izquierda) incluyó 2 dominios de diacuerpos monocatenarios (scDbs) fusionados en paralelo a los N-terminales de Fc de IgG4 humana con una mutación en la región bisagra para minimizar el intercambio de medio anticuerpo in vivo. Cada dominio scDb contenía no solo una secuencia de dominio de VL-VH-VL-VH, sino también un enlazador (G4S-i)5 (SEQ ID NO: 33) entre VH y VL y dos enlazadores idénticos (por ejemplo, SEQ ID NO: 34) entre VL y VH. Se generaron varios scDb-Fcs con dichos enlazadores de diferente longitud para su optimización
taFv2-Fc
taFv2-Fc (FIGURA 1A, en el medio) incluía 2 unidades de fragmentos variables de cadena sencilla en tándem (scFv) (denominadas taFv para scFv en tándem) fusionadas en paralelo a los N-terminales de Fc de IgG4 humana con una mutación en la región bisagra para minimizar el intercambio de medios anticuerpos in vivo. Se usaron tres tipos diferentes de scFv para construir taFv, incluyendo versiones v2 (VH-VL), v3 (VL-VH) y v4 (VL-VH), que contienen un enlazador (G4S-i)5 (SEQ ID NO: 33) entre VH y VL. Entre ellos, v2 y v4 estaban constreñidos por la estructura por la formación del enlace disulfuro VH44-VL100. El enlace disulfuro VH44-VL100 se introdujo en scFv tanto en orientaciones VL-VH como VH-VL para aumentar la estabilidad conformacional (véanse SEQ ID NO: 29 y 30). Cada taFv tenía secuencial v2-v3 o secuencial v4-v2 de scFv anti-PSGL-1 con un enlazador ASTGS (SEQ ID NO: 27) entre los dos scFv.
scFv-IgG
La versión v2 restringida por disulfuro de scFv anti-PSGL-1 se usó para generar 3 variantes de scFv-IgG4p (FIGURA 1A, a la derecha), incluyendo scFv4-crIgG4 p, scFv2-LC-IgG4 p y LC-scFv2-IgG4 p. scFv4-crIgG4 p tenía 4 unidades scFv fusionadas en paralelo a los N-terminales de ambas regiones constantes de cadena ligera kappa y cadena pesada de IgG4p (crIgG) sin un enlazador. scFv2-LC-IgG4 p tenía 2 unidades scFv fusionadas en paralelo a los N-terminales de las cadenas ligeras kappa de h15A7H IgG con un enlazador ASTGSG4S (SEQ ID NO: 28) en el medio, mientras que LC-scFv2-IgG4 p tenía 2 unidades scFv fusionadas en paralelo a los C-terminales de las cadenas ligeras kappa de h15A7H IgG con un enlazador (G4S)2 (SEQ ID NO: 34) en el medio. Las cadenas ligeras de los formatos LC-scFv2 IgG4p y scFv2-LC IgG4p se subclonaron por separado en un vector pcDNA5/FRT que codificaba una secuencia de cadena pesada h15A7H intacta para la expresión del anticuerpo. La FIGURA 1B muestra otro diagrama de estos formatos de anticuerpos tetravalentes con los fragmentos variables sombreados.
Los ADNc de todos los anticuerpos tetravalentes se clonaron en el vector pcDNA5/FRT (Invitrogen™, N.° de Cat. V6010-20) para la expresión de anticuerpos tetravalentes.
Producción de líneas celulares estables que expresan variantes de anticuerpos tetravalentes anti-PSGL-1
Las variantes de anticuerpos tetravalentes anti-PSGLI se expresaron de manera estable y se produjeron en células Flp-In CHO (Invitrogen™, N.° de Cat: R708-07). Las secuencias de ADNc de variantes de anticuerpos tetravalentes se insertaron en el vector pcDNA5/FRT (invitrogen™, N.° de Cat: V6010-20) y se cotransfectaron con pOG44 (Invitrogen™, N.° de Cat. V6005-20) siguiendo el procedimiento convencional proporcionado por el proveedor. Los sobrenadantes del cultivo de las líneas celulares establecidas se recogieron y se purificaron con perlas de proteína A sefarosa (GE Healthcare™, N.° de Cat: 17-5280-04). Las proteínas purificadas se analizaron con SDS-PAGE y cromatografía de exclusión por tamaños para asegurar la calidad de los anticuerpos.
SDS-PAGE reductor y no reductor (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio)
Los anticuerpos tetravalentes anti-PSGL-1 purificados se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida SDS reductores y no reductores al 10 %. Para los geles de poliacrilamida SDS reductores, se mezclaron 2 |jg de anticuerpo con tampón de muestra 5X SDS (Tris 300 nM, pH 6 ,8 , SDS al 10 %, glicerol al 50 %, 2-mercaptoetanol al 5 % y azul de bromofenol al 0,06 %) y se hirvió durante 10 min a 100 °C antes de cargar. Para los geles de poliacrilamida SDS no reductores, se mezclaron 2 jg de anticuerpos con tampón de muestra no reductor 5X (Tris 300 nM, pH 6 ,8 , SDS al 10 %, glicerol al 50 % y azul de bromofenol al 0,06 %) y se hirvió durante 10 min a 100 °C antes de cargar. Las muestras de proteína reductora y no reductora se cargaron en los mismos geles de poliacrilamida-SDS donde se realizó la electroforesis. Se utilizó tinción con azul Coomassie para detectar proteínas en el gel después de la electroforesis.
Ensayo de unión de variantes de anticuerpos tetravalentes anti-PSGL-1
Se usaron células Sp2/0 transfectadas con PSGL-1 humano (Sp2/0-hPSGL1) como la línea celular que expresa PSGL-1. Las células Sp2/0-hPSGL1 se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 min. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón FACS (PBS que contenía FBS al 1 %) y se pipetearon en una placa de 96 pocillos (1x105 células/pocillo). A cada pocillo se le añadieron 100 pl de sobrenadantes que contenían anticuerpos tetravalentes/15A7H(h15A7H) humanizados y estos se incubaron durante 60 min a 4 °C. Las células se lavaron tres veces con tampón FACS frío y después se incubaron con 100 pl de IgG4 antihumana de ratón pFc'-PE (SouthernBiotech n.° de Cat. 9190-09) a una concentración de 1 pg/ml durante 60 min a 4 °C. Posteriormente, las células se lavaron tres veces con tampón FACS frío y se analizaron mediante análisis FACS. Todos los análisis de citometría de flujo se realizaron en un citómetro de flujo BD-LSR (Becton Dickinson) usando el software Cell Quest.
Ensayo de apoptosis de variantes de anticuerpos tetravalentes anti-PSGL-1
Se sembraron 1x105 células Sp2/0-hPSGL1 en los pocillos de placas de 96 pocillos. Se prepararon recientemente alícuotas de anticuerpos tetravalentes anti-PSGL-1 purificados y de control a concentraciones tituladas y se añadieron a cada pocillo. Las células tratadas se mantuvieron a 37 °C durante 6 horas antes del análisis FACS para el ensayo de apoptosis celular.
Para el ensayo de apoptosis celular, se usó un kit de detección de apoptosis anexina-V-FITC (Strong Biotech, N.° de Cat. AVK250) siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, las células tratadas se recogieron y se resuspendieron en 100 pl de tampón de unión de Anexina V que contenía 0,5 pl de Anexina V-FITC a temperatura ambiente. Después de 15 min de incubación en la oscuridad, las células se lavaron dos veces con 200 pl de tampón de unión a Anexina V. Antes del análisis FACS, se añadió 1 pl de yoduro de propidio (PI) por muestra. Todos los análisis de citometría de flujo se realizaron en un citómetro de flujo BD-LSR (Becton Dickinson) usando software Cell Quest. Las células positivas para anexina V y/o positivas para PI se consideran células apoptóticas.
Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC)
Se recolectaron 500 ml de sangre total de donantes sanos que previamente fueron evaluados como buenos respondedores al tétanos. La sangre se centrifugó a 1500 rpm durante 6 min. La capa de plasma superior se descartó y la sangre remanente se diluyó con un volumen equivalente de PBS. La sangre entera diluida se añadió cuidadosamente sobre una capa de Ficoll (GE, Ficoll Plaque Plus, n.° de Cat 17-1440-02) y se centrifugó a 2400 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente. La capa de capa leucocitaria que contenía células mononucleares se recogió y se lavó con PBS 3 veces para minimizar la contaminación plaquetaria. Las células se resuspendieron en PBS y se mantuvieron en hielo antes de su uso.
Hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) trans-vivo
8-10 x 106 células PBMC, junto con 0,25 unidades LF de toxoide tetánico dializado con PBS (TT, Kuo Kwang, n.° de Cat K4103-11) o PBS, se inyectaron en un volumen final de 50 pl en la almohadilla de la pata trasera de ratones B6 hembra. En todos los experimentos se usaron ratones de 6-8 semanas. El grosor de la almohadilla del pie se midió antes y 24 horas después de la inyección usando un medidor de espesor de dial. El valor preinyectado se restó del valor postinyección para obtener el grosor neto de la pata. Todos los valores de medición se registraron en milímetros (mm). Los anticuerpos tetravalentes h15A7H y h15A7H titulados en PBS se administraron por vía intravenosa a las dosis indicadas en ratones B6 una hora antes de la inyección de PBMC y TT. Se usó PBS como control de vehículo. Se probaron 2 o 4 patas (1 o 2 ratones) por tratamiento. Las muestras de plasma se recogieron 24 horas después de la administración de Ab para comprobar las concentraciones de variantes de anticuerpos. El porcentaje de inhibición del grosor de la pata se calculó de la siguiente manera: 100 X (A espesores de las patasveh - A grosor de la pataAb)/(A grosor de la pataveh - A grosor de la pataPBMC solamente).
ELISA para detectar la concentración de anticuerpos en plasma de ratón
Se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos con anticuerpo anti-idiotipo 12H5.5 a 0,5 pg/ml en tampón de recubrimiento ELISA (Na2CO3 30 mM/NaHCO3 100 mM) a 4 °C durante la noche. A continuación, las placas se bloquearon con 200 pl/pocillo de BSA al 0,5 % en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavó 3 veces con tampón de lavado ELISA (Tween20 al 0,05 % en PBS), seguido de la adición de 50 pl/pocillo de patrón de calibración o muestras. En primer lugar, se prepararon patrones de calibración a una dilución en serie en el plasma de ratón normal. El patrón de calibración o las muestras se pre-diluyeron 1000X en diluyente de ensayo (BSA al 0,1 % y Tween 20 al 0,05 % en PBS), para obtener una concentración final del 0,1 % de plasma de ratón en diluyentes de ensayo, antes de distribuir sobre las placas. Las diluciones posteriores, si fueran necesarias, se prepararon usando diluyentes de ensayo que contenían 0,1 % de plasma de ratón normal. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente y lavado 5 veces con tampón de lavado ELISA, el anticuerpo secundario anti-IgG4 humana de ratón pFc'-HRP (SouthernBiotech n.° de Cat. 9190-05; dilución 1:15000) se añadió a 50 pl/pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron después 5 veces con tampón de lavado ELISA, seguido de la adición de sustrato TMB para el desarrollo del color. Las reacciones se detuvieron con H2SO40,5 N y se midió un valor de absorbancia a 450 nm en un lector de placas de microtitulación (Molecular Device VERSAmax).
Resultados
S D S -P A G E re d u c to r y no re d u c to r d e a n tic u e rp o s te tra v a le n te s 15A 7H h u m a n iza d o s
Como se muestra en las F IG U R A S 2 A -2 C , se usó SDS-PAGE seguida de tinción con azul Coomassie para verificar el peso molecular y la estructura básica de los anticuerpos tetravalentes anti-PSGL-1 en condiciones reductoras y no reductoras. h15A7H V2-V3, V4-V2 y LH10-g4pFc en condiciones no reductoras produjeron una banda de proteína principal con un peso molecular de alrededor de 150 kDa (F IG U R A 2 A ). En las mismas condiciones, h15A7H scFv2-LC IgG4p, LC-scFv2lgG4 p y scFv4-crIgG4 p produjeron una banda de proteína principal con un peso molecular de alrededor de 200 kDa (F IG U R A 2 B ).
En condiciones reductoras, h15A7H V2-V3, V4-V2 y LH10 g4pFc mostraron una sola banda con el peso molecular esperado de alrededor de 75 kDa, mientras que tanto h15A7H scFv2-LC como LC-scFv2 mostraron dos bandas principales con peso molecular similar alrededor de 50 kDa (F IG U R A 2 C ). Una banda era la proteína de fusión scFv-LC o LC-scFv, y la otra era la cadena pesada de h15A7H de tipo silvestre. scFv4-crIgG4 p también mostró dos bandas principales, una que representa la proteína de fusión scFv-CH1-bisagra-CH2-CH3 (alrededor de 62,5 kDa) y la otra la proteína de fusión scFv-kappa (alrededor de 37,5 kDa) (F IG U R A 2 C ). Como control, el h15A7H dio una sola banda con un peso molecular esperado de 150 kDa en los geles no reductores (F IG U R A S 2 A y 2 B ) y dos bandas principales (cadena pesada: 50 kDa, cadena ligera: 25 kDa) en condiciones reductoras (F IG U R A 2 C ).
U nión d e v a ria n te s d e a n tic u e rp o s te tra v a le n te s h u m a n iza d o s 15A 7H a S P 2 /O -h P S G L -1 y S P 2 /O
La capacidad de unión de los anticuerpos tetravalentes h15A7H se evaluó en células PSGL-1 SP2/O humanas. El anticuerpo tetravalente h15A7H se unió positivamente al SP2/O-hPSGL-1, pero no a las células SP2/O parentales que carecen del antígeno hPSGL-1 (Tabla A a continuación). Adicionalmente, h15A7H de tipo silvestre y todos los anticuerpos tetravalentes h15A7H dieron una actividad de unión similar sobre SP2/O-hPSGL-1 (Tabla A). Estos resultados demostraron que los anticuerpos tetravalentes h15A7H retuvieron la reactividad de unión a la molécula de hPSGL-1.
T a b la A . Actividad de unión (medida por la intensidad de fluorescencia media) de anticuerpos tetravalentes 15A7H humanizados contra SP2/O-hPSGL-1 SP2/O.
Figure imgf000037_0001
A p o p to s is in vitro d e c é lu la s S P 2 /O -h P S G L -1 in d u c id a p o r a n tic u e rp o s te tra v a le n te s 15A 7H h u m a n iza d o s
La inducción de apoptosis se evaluó mediante tinción de Anexina V y/o PI en células SP2/O-hPSGL-1 después de la incubación con h15A7H o anticuerpo tetravalente. Como se muestra en la Tabla B a continuación, el anticuerpo parental, h15A7H, no indujo apoptosis en células SP2/O-hPSGL-1 a la concentración probada de 0,5 y 0,0625 pg/ml en ausencia de reticulante. A las concentraciones probadas de 0,5 pg/ml, todos los anticuerpos tetravalentes h15A7H indujeron apoptosis (en un intervalo del 18 al 36 %). A la concentración más baja probada (0,0625 pg/ml), 3 de cada 6 anticuerpos tetravalentes h15A7H, LH10-g4pFc, V2-V3-g4pFc y scFv2-LC-IgG4 p, indujeron apoptosis en el 12-16 % de las células, mientras que h15A7H V4-V2-g4pFc, scFv4-crIgG4 p y LC-scFv2-IgG4 p no indujeron la muerte celular en SP2/O-hPSGL-1 a esta dosis más baja. Estos datos demuestran claramente que todos los anticuerpos tetravalentes h15A7H poseen capacidad inductora de apoptosis, pero que algunos anticuerpos tetravalentes lo hacen con mayor potencia.
T l B. A i in vir l l P2 -hP L-1 in i r ni r r v l n 1 A7H h m niz .
Figure imgf000038_0001
E fe c tiv id a d d e los an tic u e rp o s te tra v a le n te s h 15A 7H y h15A 7H en la in h ib ic ió n d e re s p u e s ta trans-vivo DTH en ra to n es B6
Los anticuerpos tetravalentes h15A7H y h15A7H descritos anteriormente se probaron para determinar su efectividad en la inhibición de respuesta trans vivo DTH en ratones B6. El anticuerpo h15A7H se inyectó por vía intravenosa en ratones a dosis de 10 y 1 mg/kg, mientras que los anticuerpos tetravalentes se inyectaron por vía intravenosa en ratones a dosis de 1 y 0,3 mg/kg. Los experimentos se llevaron a cabo usando PBMC de cuatro donantes diferentes y se calculó el % de inhibición para evaluar la efectividad inhibitoria in vivo.
Como se muestra en la Tabla C a continuación, el anticuerpo h15A7H podría inhibir la hinchazón de la almohadilla plantar en una media del 93 % a la dosis de 10 mg/kg. El efecto de inhibición se redujo al 23 % con la dosis baja de 1 mg/kg. En cuanto a los anticuerpos tetravalentes 15A7H, variantes tales como h15A7H LH10-g4p Fc, V2-V3-g4pFc y scFv2-LC-IgG4 p se mantuvieron eficaces en la inhibición incluso a dosis de 1 o 0,3 mg/kg (con 59-76 % de inhibición).
T a b la C . Efecto de los anticuer os tetravalentes h15A7H ^ h15A7H sobre DTH Trans-vivo.
Figure imgf000038_0002
Los niveles en plasma de anticuerpos tetravalentes h15A7H y h15A7H también se midieron 24 horas después de la administración i.v. (Tabla D). Todos los anticuerpos mostraron niveles plasmáticos de alrededor de 6513-9025 ng/ml a 1 mg/kg, excepto V4-V2-g4pFc, que era indetectable después de 24 horas de circulación in vivo. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que estos resultados pueden indicar que la diferencia en la eficacia entre h15A7H y variantes tetravalentes podría deberse principalmente a las diferencias en la capacidad inductora de apoptosis, como se demuestra en la Tabla B.
^
Figure imgf000039_0001
En resumen, estos datos demuestran que diversos anticuerpos tetravalentes h15A7H poseen capacidades diferenciales en la inducción de apoptosis in vitro, que se correlacionan con capacidades diferenciales en la inhibición de una respuesta DTH en modelo murino de DTH trans vivo. Los anticuerpos tetravalentes con potencia más alta para la inducción de apoptosis mostraron una efectividad mejorada en comparación con h15A7H en el modelo DTH trans­ vivo. Estos resultados sugieren que algunas de estas variantes tetravalentes de h15A7H pueden tener ventajas potenciales sobre h15A7H para un desarrollo clínico adicional.
Aunque las realizaciones anteriores se han descrito en algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para fines de claridad de entendimiento, las descripciones y ejemplos no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente divulgación.
SECUENCIAS
Todas las secuencias de polipéptidos se presentan de N-terminal a C-terminal a menos que se indique de otro modo. Todas las secuencias de polinucleótidos se presentan de 5' a 3' a menos que se indique de otro modo. Las tres CDR de cada cadena están subrayadas y las regiones enlazadoras se muestran en minúsculas.
Secuencia de aminoácidos de h15A7H LH10-g4pFc (SEQ ID NO: 1)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTH
FTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGQGTKVEIKggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT
FSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYG
GGAMDYWGQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHND
GNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGQGTK
VEIKggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYINGGSSTIFYA NAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSggggsaaaESKYGPPC
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WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD
IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Secuencia de ADNc de h15A7H LH10-g4pFc (SEQ ID NO: 2)
GACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCT AGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAG CTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACAC TTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCT CTCACGTTCGGTCAAGGCACCAAGGTGGAAATCAAAggtggaggcggttcaggcggaggtggctctGAAGTGCAA CTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACT TTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTCGAGTGGGTCGCATACATTAATGGT GGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACC CTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGA GGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggtggaggcggttcaggcggaggt ggctctggcggtggcggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGACATTCAGATGACCCAATCTCCG AGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGAT GGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAAT CGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTG CAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTCAAGGCACCAAG GTGGAAATCAAAggtggaggcggttcaggcggaggtggctctGAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTA GTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGG GTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTCGAGTGGGTCGCATACATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCA AACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTG AGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGC CAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggaggcggaggttccgcggccgcaGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGC CCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAAC TGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTG CCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCC GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA
Secuencia de aminoácidos de h15A7H V2-V3-g4pFc (SEQ ID NO: 3)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKCLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsDIQMT
QSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTI SSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGCGTKVEIKastgsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYF EWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVP SRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGQGTKVEIKg gggsggggsggggsggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYI NGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSggggsa aaESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQVSLT CLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGK
Secuencia de ADNc de h15A7H V2-V3-g4pFc (SEQ ID NO: 4)
GAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT GGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGTCTCGAGTGGGTCGCATAC ATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCC AAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCT AGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggtggaggcggttca ggcggaggtggctctggcggtggcggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGACATTCAGATGACC CAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTA CATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAA GTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATC TCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTTGT GGCACCAAGGTGGAAATCAAAgcttcaaccggttcaGACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCG TCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTT GAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTC CCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTC GCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTCAAGGCACCAAGGTGGAAATCAAAggt ggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGAA GTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGA TTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTCGAGTGGGTCGCATACATT AATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAG AACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGT TACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggaggcggaggttccgcg gccgcaGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTC CTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTG AGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCG CGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG CAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACC TGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTAC AAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGG TGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCTGGGTAAATGA
Secuencia de aminoácidos de h15A7H V4-V2-g4pFc (SEQ ID NO: 5)
DIQMTQSP SSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTH FTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGCGTKVEIKggggsggggsggggsggggsggggsEVQLVESGGGLVQ PGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKCLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRA EDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSastgsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVR QAPGKCLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQG TLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsDIQMTQSP SSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQ KPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGCGTKVEIKggggsa aaESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQVSLT CLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGK
Secuencia de ADNc de h15A7H V4-V2-g4pFc (SEQ ID NO: 6 )
GACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCT AGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAG CTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACAC TTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCT CTCACGTTCGGTTGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAAggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggc ggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAG CCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGC CAGGCTCCAGGGAAGTGTCTCGAGTGGGTCGCATACATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCA GTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCT GAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGC ACCCTGGTCACAGTCTCCTCAgcttcaaccggttcaGAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAG CCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGC CAGGCTCCAGGGAAGTGTCTCGAGTGGGTCGCATACATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCA GTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCT GAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGC ACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatccggaggcgga ggttccggaggtggcggaagtGACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGG GTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAG AAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGT GGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGT TTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTTGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAAggaggcggaggttccgcg gccgcaGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTC CTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTG AGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCG CGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG CAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACC TGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTAC AAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGG TGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCTGGGTAAATGA
Secuencia de aminoácidos de h15A7H scFv2-LC-cadena ligera de IgG4p (SEQ ID NO: 7)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKCLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsDIQMT QSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTI SSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGCGTKVEIKastgsggggsDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHND GNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKyDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Secuencia de ADNc de h15A7H scFv2-LC-cadena ligera de lgG4p (SEQ ID NO: 8 )
GAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT GGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGTCTCGAGTGGGTCGCATAC ATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCC AAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCT AGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggtggaggcggttca ggcggaggtggctctggcggtggcggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGACATTCAGATGACC CAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTA CATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAA GTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATC TCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTTGT GGCACCAAGGTGGAAATCAAAgcttcaaccggttcaggaggtggcggaagtGACATTCAGATGACCCAATCTCCG AGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGAT GGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAAT CGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTG CAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTCAAGGCACCAAG GTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGA ACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCC CTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCG CCCGTCACAAAGAGC TTCAACAGGGGAGAGTG TTAG
Secuencia de aminoácidos de h15A7H LC-scFv2-cadena ligera de IgG4p (SEQ ID NO: 9)
DIQMTQSP SSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTH FTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGQGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECggggsg gggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKCLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTIS RDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsD IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHF TLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGCGTKVEIKAAAHHHHHHHHHH
------------------Secuencia de ADNc de h15A7H LC-scFv2-cadena ligera de IgG4p (SEQ ID NO: 10)
GACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCT AGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAG CTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACAC TTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCT CTCACGTTCGGTCAAGGCACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAA GTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGAC AGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTggtggaggcggttcaggc ggaggtggctctGAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGTCTCGAG TGGGTCGCATACATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCC AGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGT GCAAGATATGCTAGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggt ggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGAC ATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGT CAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTT CTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTC ACCCTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTC ACGTTCGGTTGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAAGCGGCCGCACATCATCATCATCATCACCACCACCACCACTAG
Secuencia de aminoácidos de h15A7H scFv2-LC-IgG4 p y h15A7 LC-ScFv2 -Cadena pesada de IgG4p (SEQ ID NO: 11)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGP SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPP CPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYP S DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Secuencia de ADNc de h15A7H scFv2-LC-lgG4 p y h15A7 LC-scFv2 -Cadena pesada de lgG4p (SEQ ID NO: 12) GAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT GGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTCGAGTGGGTCGCATAC ATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCC AAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCT AGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGC CCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG GACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACC TACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCA TGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACT CTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTC AACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTAC CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC AAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACC CTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGC GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC GACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGC TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA
Secuencia de aminoácidos de h15A7H scFv4-cadena ligera de crIgG4p (SEQ ID NO: 13)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKCLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsDIQMT QSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTI SSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGCGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Secuencia de ADNc de h15A7H scFv4-cadena ligera de crlgG4p (SEQ ID NO: 14)
GAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT GGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGTCTCGAGTGGGTCGCATAC ATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCC AAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCT AGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggtggaggcggttca ggcggaggtggctctggcggtggcggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGACATTCAGATGACC CAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTA CATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAA GTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATC TCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTTGT GGCACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTG AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTG GATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGC CTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Secuencia de aminoácidos de h15A7H scFv4-LC-cadena ligera de crIgG4p (SEQ ID NO: 15)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKCLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsDIQMT QSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTI SSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGCGTKVEIKASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKP SNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLP SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Secuencia de ADNc deh15A7H scFv4-cadena ligera de crlgG4p (SEQ ID NO: 16) GAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGAAGCTTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT GGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGTGTCTCGAGTGGGTCGCATAC ATTAATGGTGGCAGTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCC AAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCT AGTTACGGAGGGGGTGCTATGGACTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACAGTCTCCTCAggtggaggcggttca ggcggaggtggctctggcggtggcggatccggaggcggaggttccggaggtggcggaagtGACATTCAGATGACC CAATCTCCGAGCTCTTTGTCTGCGTCTGTAGGGGATAGGGTCACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTA CATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATGGTACCAACAGAAACCAGGAAAGGCACCCAAGCTTCTCATCTATAAA GTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACACACTTCACCCTCACCATC TCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCTCACGTTCGGTTGT GGCACCAAGGTGGAAATCAAAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACC TCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCA GGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTG GTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAG GTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCA TCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTG GTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAG AACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGAC AAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAG AAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA
Secuencia de aminoácidos de h15A7H CDR-H1 (SEQ ID NO: 17)
SFGMH
Secuencia de aminoácidos de h15A7H CDR-H2 (SEQ ID NO: 18)
YINGGSSTIFYANAVKG
Secuencia de aminoácidos de h15A7H CDR-H3 (SEQ ID NO: 19)
YASYGGGAMDY
Secuencia de aminoácidos de h15A7H CDR-L1 (SEQ ID NO: 20)
RSSQSIVHNDGNTYFE
Secuencia de aminoácidos de h15A7H CDR-L2 (SEQ ID NO: 21)
KVSNRFS
Secuencia de aminoácidos de h15A7H CDR-L3 (SEQ ID NO: 22)
FQGSYVPLT
Secuencia de aminoácidos de h15A7H VH (SEQ ID NO: 23)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de aminoácidos de h15A7H VL (SEQ ID NO: 24)
Secuencia de aminoácidos de la repetición de la secuencia del enlazador (SEQ ID NO: 25)
ggggs
Secuencia de aminoácidos del enlazador con Fc (SEQ ID NO: 26)
ggggsaaa
Secuencia de aminoácidos del enlazador taFv (SEQ ID NO: 27)
astgs
Secuencia de aminoácidos del enlazador de cadena ligera scFv (SEQ ID NO: 28)
astgsggggs
Secuencia de aminoácidos de h15A7H VH G44C (SEQ ID NO: 29)

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo tetravalente que se une específicamente a PSGL-1 humano, en donde el anticuerpo tetravalente comprende un dímero de dos monómeros y en donde:
(A) cada monómero del dímero comprende un polipéptido monocatenario que comprende, del extremo N al extremo C:
(1) un primer dominio variable de cadena ligera (VL);
(2) una primera secuencia enlazadora;
(3) un primer dominio variable de cadena pesada (VH);
(4) una segunda secuencia enlazadora;
(5) un segundo dominio VL;
(6) una tercera secuencia enlazadora;
(7) un segundo dominio VH;
(8) una cuarta secuencia enlazadora; y
(9) un dominio Fc de anticuerpo,
en donde cada uno del primer y del segundo dominios VL comprende (i) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (ii) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (iii) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; en donde cada uno del primer y del segundo dominios VH comprende (i) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (ii) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y (iii) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; en donde el primer dominio VL forma una unidad de unión VH-VL con el segundo dominio VH y el primer dominio VH forma una unidad de unión VH-VL con el segundo dominio VL y en donde cada una de las dos unidades de unión VH-VL es específica para PSGL-1 humano;
(B) cada monómero del dímero comprende un polipéptido monocatenario que comprende, del extremo N al extremo C:
(1) un primer dominio variable de cadena pesada (VH);
(2) una primera secuencia enlazadora;
(3) un primer dominio variable de cadena ligera (VL);
(4) una segunda secuencia enlazadora;
(5) un segundo dominio VL;
(6) una tercera secuencia enlazadora;
(7) un segundo dominio VH;
(8) una cuarta secuencia enlazadora; y
(9) un dominio Fc de anticuerpo,
en donde cada uno del primer y del segundo dominios VL comprende (i) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (ii) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (iii) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; en donde cada uno del primer y del segundo dominios VH comprende (i) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (ii) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y (iii) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; en donde cada uno del primer y del segundo dominios VL forma una unidad de unión VH-VL con un dominio VH correspondiente del primer y del segundo dominios VH y en donde cada una de las dos unidades de unión VH-VL es específica para PSGL-1 humano; o (C) cada monómero del dímero comprende una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo; en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende, del extremo N al extremo C:
(1) un primer dominio variable de cadena pesada (VH),
(2) una primera secuencia enlazadora,
(3) un primer dominio variable de cadena ligera (VL),
(4) una segunda secuencia enlazadora,
(5) un segundo dominio VL y
(6) un dominio constante de cadena ligera (CL); y
en donde la cadena pesada del anticuerpo comprende:
(1) un segundo dominio VH y
(2) una región constante de cadena pesada que comprende un primer dominio de región constante de cadena pesada (CH1), una región bisagra de anticuerpo, un segundo dominio de región constante de cadena pesada (CH2) y un tercer dominio de región constante de cadena pesada (CH3);
en donde cada uno del primer y del segundo dominios VL comprende (i) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (ii) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (iii) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; en donde cada uno del primer y del segundo dominios VH comprende (i) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; (ii) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; y (iii) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; en donde cada uno del primer y del segundo dominios v L forma una unidad de unión VH-VL con un dominio VH correspondiente del primer y del segundo dominios VH y en donde cada una de las dos unidades de unión VH-VL es específica para PSGL-1 humano.
2. El anticuerpo tetravalente de la reivindicación 1, en donde cada uno de los dos dominios VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 o 29 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 23 o 29; y en donde cada uno de los dos dominios VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 o 30 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 24 o 30.
3. El anticuerpo tetravalente de la reivindicación 1(A), en donde la primera, la segunda y la tercera secuencias enlazadoras comprenden cada una dos o más repeticiones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o la primera, la segunda o la tercera secuencias enlazadoras comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, 34, 35 o 36;
en donde opcionalmente la primera y la tercera secuencias enlazadoras tienen la misma secuencia y comprenden dos repeticiones de SEQ ID NO: 25;
en donde opcionalmente la segunda secuencia enlazadora comprende cinco repeticiones de SEQ ID NO: 25; en donde opcionalmente la cuarta secuencia enlazadora comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; y
en donde opcionalmente cada uno de los dos polipéptidos monocatenarios comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
4. El anticuerpo tetravalente de la reivindicación 1(B), en donde la primera y la tercera secuencias enlazadoras tienen la misma secuencia comprendiendo cinco repeticiones de SEQ ID NO: 25, la segunda secuencia enlazadora comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y/o la cuarta secuencia enlazadora comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26;
en donde opcionalmente cada uno de los dos polipéptidos monocatenarios comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3.
5. El anticuerpo tetravalente de la reivindicación 1(C), en donde el dominio CL es un dominio CL kappa, la primera secuencia enlazadora comprende cinco repeticiones de SEQ ID NO: 25 y/o la segunda secuencia enlazadora comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28;
en donde opcionalmente la cadena ligera de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7; y
en donde opcionalmente la cadena pesada de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 11.
6. El anticuerpo tetravalente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el dominio Fc del anticuerpo es un dominio Fc de anticuerpo humano.
7. El anticuerpo tetravalente de la reivindicación 6, en donde el dominio Fc del anticuerpo es un dominio Fc de IgG4 humana.
8. El anticuerpo tetravalente de la reivindicación 7, en donde el dominio Fc de IgG4 humana comprende una secuencia de región bisagra:
(1) que comprende una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado una transposición de IgG4 reducida, en comparación con una región bisagra de IgG4 que carece de una o más sustituciones de aminoácidos; o
(2) que comprende una sustitución de serina a prolina en el aminoácido 228, numeración de acuerdo con el índice EU.
9. Un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo tetravalente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde opcionalmente el polinucleótido aislado comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16.
10. Un vector que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 9.
11. Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido de la reivindicación 9.
12. Un método para producir un anticuerpo tetravalente que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 11 de tal manera que se produzca el anticuerpo tetravalente, en donde el método opcionalmente comprende además recuperar el anticuerpo tetravalente de la célula hospedadora.
13. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo tetravalente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. El anticuerpo tetravalente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria mediada por células T, en donde opcionalmente la enfermedad inflamatoria mediada por células T se selecciona del grupo que consiste en psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, espondilitis anquilosante, diabetes tipo I, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple, alergia, dermatitis atópica, asma, una neoplasia de células T y enfermedad de injerto contra hospedador (EICH).
15. El anticuerpo tetravalente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento de un individuo que necesita una transfusión o un trasplante, en donde opcionalmente la transfusión es una transfusión que comprende uno o más de glóbulos blancos, glóbulos rojos y plaquetas y en donde opcionalmente el trasplante es un trasplante de un tejido seleccionado del grupo que consiste en médula ósea, riñón, corazón, hígado, tejido neuronal, pulmón, páncreas, piel e intestino.
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