JP2019503686A - 四価抗ｐｓｇｌ−１抗体とその使用 - Google Patents

四価抗ｐｓｇｌ−１抗体とその使用 Download PDF

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Abstract

本発明で提供するのは、ヒトＰＳＧＬ−１に特異的に結合する四価抗体である。二価抗体とは異なり、これらの四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含み、その各モノマーは、２つの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、２つの重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む。このフォーマットにより、ＰＳＧＬ−１に対する架橋剤／ＦｃＲ発現細胞非依存性四価抗体であって、二価のＰＳＧＬ−１抗体よりも有効性が向上している四価抗体が可能になる。これらの四価抗体は、様々な診断方法及び治療方法（Ｔ細胞媒介炎症性疾患の治療、移植及び輸血が挙げられるが、これらに限らない）で用いることができる。
【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１６年１月８日に提出した米国特許仮出願第６２／２７６，８０６号に基づく優先権の利益を主張するものであり、この仮出願は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
配列表のコンピューター可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：６０６５９２００１３４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０１７年１月３日、サイズ：７０ＫＢ）であるＡＳＣＩＩテキストファイルでの提出物の内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
本発明で提供するのは、ヒトＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）に特異的に結合する四価抗体と、その抗体に関連するポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、方法、医薬組成物、キット及び使用である。これらの四価抗体は、様々な診断方法と治療方法（Ｔ細胞媒介炎症性疾患の治療、移植及び輸血が挙げられるが、これらに限らない）で使用できる。
感染または損傷に対する炎症応答は、白血球が血管壁に接着することによって開始する（ＭｃＥｖｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００（３）：４８５−４９２）。セレクチンは、炎症の際に、最初の白血球と内皮細胞との相互作用と、白血球と血小板との相互作用を媒介する糖タンパク質のファミリーである。Ｌ−セレクチンと、Ｅ−セレクチンと、Ｐ−セレクチンからなるセレクチンファミリーは、ＮＨ２末端レクチンドメインに続いて、ＥＧＦ様ドメインと、一連のコンセンサスリピートと、膜貫通ドメインと、短い細胞質尾部を含む。セレクチンのレクチンドメインは、細胞接着を促すために、特異的な複合糖質リガンドと相互作用する。大半の白血球上で発現するＬ−セレクチンは、いくつかの内皮細胞上と他の白血球上のリガンドに結合する。サイトカイン活性化内皮細胞上で発現するＥ−セレクチンは、大半の白血球上のリガンドに結合する。活性化血小板上と内皮細胞上で発現するＰ−セレクチンも、大半の白血球上のリガンドに結合する。
Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（「ＰＳＧＬ−１」）は、ＳＥＬＰＬＧまたはＣＤ１６２（分化クラスター１６２）としても知られているが、このリガンドは、３つのすべてのセレクチンに対するヒトムチン型糖タンパク質リガンドである（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎ，Ｇａｂｒｉｅｌａ，２００４，Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．，１７（９）：５７９−５８５、ＭｃＥｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００（３）：４８５−４９２）。ＰＳＧＬ−１は、ジスルフィド結合によるホモ二量体であり、１２０−ｋＤのサブユニットを２つ有し、単球と、リンパ球と、顆粒球の表面と、いくつかのＣＤ３４＋幹細胞で発現する。ＰＳＧＬ−１は、多くの炎症性障害において、病的な白血球動員に寄与する可能性が高い。ＰＳＧＬ−１は、セレクチンの接着性相互作用を促すからである。加えて、ＰＳＧＬ−１には、Ｔ細胞において独自の調節的役割があることが示されている。ＰＳＧＬ−１が欠損したマウスでは、増殖応答と自己免疫の増強が見られることから、ＰＳＧＬ−１が、Ｔ細胞応答のダウンレギュレーションにおいて重要な役割を果たすことが示唆されている（Ｋｒｙｓｔｌｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１８８：１６３８−１６４６、Ｕｒｚａｉｎｑｕｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ２０１３；７１：６５０、Ｐｅｒｅｚ−Ｆｒｉａｓ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２０１４ Ｎｏｖ；６６（１１）：３１７８−８９．、Ａｎｇｉａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；１９１（１１）：５４８９−５００）。
抗ＰＳＧＬ−１抗体がいくつか開発されている（例えば、国際公開第２００５／１１０４７５号、同第２００３／０１３６０３号及び同第２０１２／１７４００１号、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎ，Ｇａｂｒｉｅｌａ，２００４，Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．，１７（９）：５７９−５８５、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００４；１０４（１０）：３２３３−４２、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；３５（７）：２２３９−４９、ならびに米国特許第７，６０４，８００号を参照されたい）。既存のＰＳＧＬ−１アゴニスト抗体のいくつかは、後期活性化Ｔ細胞のアポトーシスを優先的に誘導するが、他のＰＳＧＬ−１発現細胞のアポトーシスは誘導しないので、このような抗体は、抗炎症性治療剤として、または移植及び／もしくは輸血で用いるためのものとして有用である場合がある。しかしながら、インビボでの有効性が既存の抗体よりも高い改良型抗ＰＳＧＬ−１抗体に対するニーズが存在する。
本明細書で引用されている文献、特許及び特許出願はいずれも、参照により、あらゆる目的において、その全体が本明細書に援用される。
国際公開第２００５／１１０４７５号 国際公開第２００３／０１３６０３号 国際公開第２０１２／１７４００１号 米国特許第７，６０４，８００号明細書
ＭｃＥｖｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００（３）：４８５−４９２ Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎ，Ｇａｂｒｉｅｌａ，２００４，Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．，１７（９）：５７９−５８５ Ｋｒｙｓｔｌｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１８８：１６３８−１６４６ Ｕｒｚａｉｎｑｕｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ２０１３；７１：６５０ Ｐｅｒｅｚ−Ｆｒｉａｓ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２０１４ Ｎｏｖ；６６（１１）：３１７８−８９ Ａｎｇｉａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；１９１（１１）：５４８９−５００ Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００４；１０４（１０）：３２３３−４２ Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；３５（７）：２２３９−４９
このニーズを満たすために、本発明で提供するのは、ヒトＰＳＧＬ−１に特異的に結合する四価抗体と、その抗体に関連するポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、方法、医薬組成物、キット及び使用である。本開示には、ヒトＰＳＧＬ−１に特異的に結合する四価抗体の効能と有効性が、従来の（例えば二価の）抗ＰＳＧＬ−１抗体よりも高いことが示されている。したがって、これらの四価抗体は、とりわけ、Ｔ細胞の機能に関連する診断方法及び／または治療方法、使用、ならびに組成物（Ｔ細胞媒介炎症性疾患の治療、輸血及び／または移植など）で利用できる。
したがって、一態様では、本発明で提供するのは、ヒトＰＳＧＬ−１に特異的に結合する四価抗体であって、２つのモノマーからなる二量体を含み、その二量体の各モノマーが、（ａ）２つの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインであって、その２つのＶＬドメインのそれぞれが、ＣＤＲ−Ｌ１と、ＣＤＲ−Ｌ２と、ＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインと、（ｂ）２つの重鎖可変（ＶＨ）ドメインであって、その２つのＶＨドメインのそれぞれが、ＣＤＲ−Ｈ１と、ＣＤＲ−Ｈ２と、ＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｃ）抗体Ｆｃドメインとを含む一本鎖ポリペプチドを含み、その２つのＶＬドメインのそれぞれが、その２つのＶＨドメインのうちの対応するＶＨドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成し、その２つのＶＨ−ＶＬ結合ユニットのそれぞれが、ヒトＰＳＧＬ−１に対して特異的である四価抗体である。いくつかの実施形態では、２つのＶＨドメインのうちの少なくとも１つは、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、２つのＶＨドメインのそれぞれは、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、２つのＶＨドメインのうちの１つまたは両方が、配列番号２３のアミノ酸配列、または配列番号２３に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２つのＶＨドメインのうちの１つまたは両方が、配列番号２９のアミノ酸配列、または配列番号２９に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２つのＶＬドメインのうちの少なくとも１つが、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、２つのＶＬドメインのそれぞれは、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、２つのＶＬドメインのうちの１つまたは両方が、配列番号２４のアミノ酸配列、または配列番号２４に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２つのＶＬドメインのうちの１つまたは両方が、配列番号３０のアミノ酸配列、または配列番号３０に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２本の一本鎖ポリペプチドのそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）２つのＶＬドメインのうちの第１のＶＬドメインと、（ｂ）第１のリンカー配列と、（ｃ）２つのＶＨドメインのうちの第１のＶＨドメインと、（ｄ）第２のリンカー配列と、（ｅ）２つのＶＬドメインのうちの第２のＶＬドメインと、（ｆ）第３のリンカー配列と、（ｇ）２つのＶＨドメインのうちの第２のＶＨドメインと、（ｈ）第４のリンカー配列と、（ｉ）抗体Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１、第２及び第３のリンカー配列はそれぞれ、配列番号２５のアミノ酸配列のリピートを２回以上含む。いくつかの実施形態では、第１及び第３のリンカー配列は、同じ配列を有し、配列番号２５のリピートを２回含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカー配列は、配列番号２５のリピートを５回含む。いくつかの実施形態では、第４のリンカー配列は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２本の一本鎖ポリペプチドのそれぞれは、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２本の一本鎖ポリペプチドのそれぞれは、配列番号２のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、２本の一本鎖ポリペプチドのそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）２つのＶＨドメインのうちの第１のＶＨドメインと、（ｂ）第１のリンカー配列と、（ｃ）２つのＶＬドメインのうちの第１のＶＬドメインと、（ｄ）第２のリンカー配列と、（ｅ）２つのＶＬドメインのうちの第２のＶＬドメインと、（ｆ）第３のリンカー配列と、（ｇ）２つのＶＨドメインのうちの第２のＶＨドメインと、（ｈ）第４のリンカー配列と、（ｉ）抗体Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、２本の一本鎖ポリペプチドのそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）２つのＶＬドメインのうちの第１のＶＬドメインと、（ｂ）第１のリンカー配列と、（ｃ）２つのＶＨドメインのうちの第１のＶＨドメインと、（ｄ）第２のリンカー配列と、（ｅ）２つのＶＨドメインのうちの第２のＶＨドメインと、（ｆ）第３のリンカー配列と、（ｇ）２つのＶＬドメインのうちの第２のＶＬドメインと、（ｈ）第４のリンカー配列と、（ｉ）抗体Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１、第２または第３のリンカー配列は、配列番号２５のアミノ酸配列のリピートを２回以上含む。いくつかの実施形態では、第１、第２または第３のリンカー配列は、配列番号３３、３４、３５または３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第３のリンカー配列は、配列番号２５のリピートを５回含む同じ配列を有する。いくつかの実施形態では、第２のリンカー配列は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第４のリンカー配列は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２本の一本鎖ポリペプチドのそれぞれは、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２本の一本鎖ポリペプチドのそれぞれは、配列番号４のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、２本の一本鎖ポリペプチドのそれぞれは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２本の一本鎖ポリペプチドのそれぞれは、配列番号６のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
別の態様では、本発明で提供するのは、ヒトＰＳＧＬ−１に特異的に結合する四価抗体であって、２つのモノマーからなる二量体を含み、その二量体の各モノマーが、抗体重鎖と抗体軽鎖を含み、その抗体軽鎖が、（ｉ）２つの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインであって、その２つのＶＬドメインのそれぞれが、ＣＤＲ−Ｌ１と、ＣＤＲ−Ｌ２と、ＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインと、（ｉｉ）第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、（ｉｉｉ）軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含み、その抗体重鎖が、（ｉ）第２の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、（ｉｉ）第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）ドメインと、抗体ヒンジ領域と、第２の重鎖定常領域（ＣＨ２）ドメインと、第３の重鎖定常領域（ＣＨ３）ドメインとを含む重鎖定常領域を含み、その第１及び第２のＶＨドメインがそれぞれ、ＣＤＲ−Ｈ１と、ＣＤＲ−Ｈ２と、ＣＤＲ−Ｈ３を含み、その２つのＶＬドメインのそれぞれが、第１及び第２のＶＨドメインのうちの対応するＶＨドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成し、その２つのＶＨ−ＶＬ結合ユニットのそれぞれが、ヒトＰＳＧＬ−１に対して特異的である四価抗体である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＶＨドメインのうちの少なくとも１つが、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＶＨドメインはそれぞれ、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列、または配列番号２３に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のＶＨドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列、または配列番号２９に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＶＬドメインのうちの少なくとも１つは、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＶＬドメインはそれぞれ、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のＶＬドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列、または配列番号２４に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列、または配列番号３０に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）第１のＶＨドメインと、（ｂ）第１のリンカー配列と、（ｃ）２つ以上のＶＬドメインのうちの第１のＶＬドメインと、（ｄ）第２のリンカー配列と、（ｅ）２つ以上のＶＬドメインのうちの第２のＶＬドメインと、（ｆ）ＣＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＬドメインは、κＣＬドメインである。いくつかの実施形態では、第１のリンカー配列は、配列番号２５のリピートを５回含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカー配列は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖は、配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号７に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖は、配列番号８のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）２つのＶＬドメインのうちの第１のＶＬドメインと、（ｂ）ＣＬドメインと、（ｃ）第１のリンカー配列と、（ｄ）第１のＶＨドメインと、（ｅ）第２のリンカー配列と、（ｆ）２つのＶＬドメインのうちの第２のＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＬドメインは、κＣＬドメインである。いくつかの実施形態では、第１のリンカー配列は、配列番号２５のリピートを２回含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカー配列は、配列番号２５のリピートを５回含む。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖は、配列番号１０のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、抗体重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）第２のＶＨドメインと、（ｂ）第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）ドメインと、抗体ヒンジ領域と、第２の重鎖定常領域（ＣＨ２）ドメインと、第３の重鎖定常領域（ＣＨ３）ドメインとを含む重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体重鎖は、配列番号１１のアミノ酸配列、または配列番号１１に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体重鎖は、配列番号１２のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
別の態様では、本発明で提供するのは、ヒトＰＳＧＬ−１に特異的に結合する四価抗体であって、２つのモノマーからなる二量体を含み、その二量体の各モノマーが、抗体重鎖と抗体軽鎖を含み、その抗体軽鎖が、（ｉ）第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、（ｉｉ）第１の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、（ｉｉｉ）軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含み、その抗体重鎖が、（ｉ）第２の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、（ｉｉ）第２の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、（ｉｉｉ）第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）ドメインと、抗体ヒンジ領域と、第２の重鎖定常領域（ＣＨ２）ドメインと、第３の重鎖定常領域（ＣＨ３）ドメインとを含む重鎖定常ドメインを含み、その第１及び第２のＶＬドメインのそれぞれが、ＣＤＲ−Ｌ１と、ＣＤＲ−Ｌ２と、ＣＤＲ−Ｌ３を含み、その第１及び第２のＶＨドメインのそれぞれが、ＣＤＲ−Ｈ１と、ＣＤＲ−Ｈ２と、ＣＤＲ−Ｈ３を含み、その第１及び第２のＶＬドメインのそれぞれが、第１及び第２のＶＨドメインのうちの対応するＶＨドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成し、その２つのＶＨ−ＶＬ結合ユニットのそれぞれが、ヒトＰＳＧＬ−１に対して特異的である四価抗体である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＶＨドメインのうちの少なくとも１つは、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＶＨドメインはそれぞれ、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のＶＨドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＶＬドメインのうちの少なくとも１つは、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＶＬドメインはそれぞれ、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のＶＬドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）第１のＶＨドメインと、（ｂ）第１のリンカー配列と、（ｃ）第１のＶＬドメインと、（ｄ）ＣＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＬドメインは、κＣＬドメインである。いくつかの実施形態では、第１のリンカー配列は、配列番号２５のリピートを５回含む。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体軽鎖は、配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、抗体重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）第２のＶＨドメインと、（ｂ）第２のリンカー配列と、（ｃ）第２のＶＬドメインと、（ｄ）第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）ドメインと、抗体ヒンジ領域と、第２の重鎖定常領域（ＣＨ２）ドメインと、第３の重鎖定常領域（ＣＨ３）ドメインとを含む重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカー配列は、配列番号２５のリピートを５回含む。いくつかの実施形態では、抗体重鎖は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体重鎖は、配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、ヒト抗体Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、このヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＩｇＧ４ヒンジ領域と比べて、ＩｇＧ４のシャッフリングを低減させるその１つ以上のアミノ酸置換を含むヒンジ領域配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、２２８位のアミノ酸（ＥＵインデックスによる番号付け）におけるセリンのプロリンへの置換を含むヒンジ領域配列を含む。上記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体ヒンジ領域は、２２８位のアミノ酸（ＥＵインデックスによる番号付け）におけるセリンのプロリンへの置換を含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、その四価抗体と共通するＶＨドメインまたはＶＬドメインを１つ以上有する従来の（例えば二価の）抗体と比べて、標的細胞（例えば、ヒトＰＳＧＬ−１またはそのエピトープを発現している細胞）におけるアポトーシスの誘導を増強させる。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、その四価抗体と共通するＶＨドメインまたはＶＬドメインを１つ以上有する従来の（例えば二価の）抗体と比べて、（例えばトランスビボ動物モデルにおいて）ＤＴＨの阻害を増強させる。
別の態様では、本発明で提供するのは、上記の実施形態のいずれか１つの四価抗体をコードする単離ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、この単離ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含む。別の態様では、本発明で提供するのは、上記の実施形態のいずれかの単離ポリヌクレオチドを含むベクターである。別の態様では、本発明で提供するのは、上記の実施形態のいずれかのポリヌクレオチド及び／または上記の実施形態のいずれかのベクターを含む宿主細胞である。別の態様では、本発明で提供するのは、四価抗体の作製方法であって、上記の実施形態のいずれかの宿主細胞を培養して、四価抗体を産生させるようにすることを含む方法である。いくつかの実施形態では、この方法は、宿主細胞から四価抗体を回収することをさらに含む。
別の態様では、本発明で提供するのは、上記の実施形態のいずれか１つの四価抗体と、製薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物である。別の態様では、本発明で提供するのは、上記の実施形態のいずれか１つの四価抗体と、任意の製薬学的に許容可能な担体とを含むキットである。いくつかの実施形態では、このキットは、四価抗体を投与して、Ｔ細胞媒介炎症性疾患または状態を治療することに関する説明を含む添付文書をさらに含む。いくつかの実施形態では、このキットは、輸血もしくは移植の前、輸血もしくは移植と同時、及び／または輸血もしくは移植の後に四価抗体を投与することに関する説明を含む添付文書をさらに含む。別の態様では、本発明で提供するのは、上記の実施形態のいずれか１つの四価抗体であって、Ｔ細胞媒介炎症性疾患または状態の治療で用いる四価抗体である。別の態様では、本発明で提供するのは、上記の実施形態のいずれか１つの四価抗体であって、輸血または移植の必要な個体の治療で用いる四価抗体である。別の態様では、本発明で提供するのは、Ｔ細胞媒介炎症性疾患または状態を治療するための医薬を製造する際に、上記の実施形態のいずれか１つの四価抗体を使用することである。別の態様では、本発明で提供するのは、輸血または移植の必要な個体を治療するための医薬を製造する際に、上記の実施形態のいずれか１つの四価抗体を使用することである。別の態様では、本発明で提供するのは、Ｔ細胞媒介炎症性疾患または状態の治療方法であって、その治療を必要とする対象に、上記の実施形態のいずれか１つの四価抗体を治療有効量投与することを含む方法である。別の態様では、本発明で提供するのは、輸血または移植の必要な個体の治療方法であって、その個体に、上記の実施形態のいずれか１つの四価抗体を治療有効量、輸血もしくは移植の前、輸血もしくは移植と同時、及び／または輸血もしくは移植の後に投与することを含む方法である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞媒介炎症性疾患は、自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞媒介炎症性疾患は、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、クローン病、強直性脊椎炎、Ｉ型糖尿病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、乾癬は、尋常性乾癬、慢性尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬または乾癬性紅皮症である。いくつかの実施形態では、移植は、骨髄、腎臓、心臓、肝臓、ニューロン組織、肺、膵臓、皮膚及び腸からなる群から選択した組織の移植である。いくつかの実施形態では、輸血は、白血球、赤血球及び血小板のうちの１つ以上を含む輸血である。
本明細書に記載されている様々な実施形態の特性のうちの１つ、いくつかまたはすべてを組み合わせて、本発明の別の実施形態を形成してよいことを理解すべきである。本発明の上記の態様とその他の態様は、当業者には明らかであろう。
いくつかの実施形態による例示的な四価抗体を示している概略図が示されている。（１）２つの一本鎖ダイアボディで構成された二量体がＦｃドメインに融合したもの（ｓｃＤｂ２−Ｆｃ）（（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号３３）、ＧＧＧＧＳＡＡＡ（配列番号２６）及び（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号３４）／（ＧＧＧＧＳ）２Ｇ（配列番号３５）／（ＧＧＧＧＳ）２ＧＧ（配列番号３６）というリンカー配列が示されている）と、（２）２つのタンデム一本鎖可変断片ユニットからなる二量体をそれぞれ有する２つの異なるフォーマット（ｔａＦｖ２−Ｆｃ）（両方の形態において、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号３３）、ＡＳＴＧＳ（配列番号２７）、ＧＧＧＧＳＡＡＡ（配列番号２６）という同一のリンカー配列が示されている）と、（３）一本鎖可変断片に基づく３つの異なるフォーマット（ｓｃＦｖ−ＩｇＧ）（ｓｃＦｖ２−ＬＣ−ＩｇＧ４ｐリンカー配列の（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号３３）及びＡＳＴＧＳＧ４Ｓ（配列番号２８）と、ＬＣ−ｓｃＦｖ２−ＩｇＧ４ｐリンカー配列の（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号３４）及び（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号３３）と、ｓｃＦｖ４−ｃｒｌＧ４ｐリンカー配列の（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号３３）が示されている）の例示的な形態が示されている。 いくつかの実施形態による例示的な四価抗体を示している概略図が示されている。３つのｓｃＦｖベースのフォーマットの別の実例が示されており、可変断片には、網掛けが施されており、Ｖ２ ｓｃＦｖが示されている。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、クマシーブルー染色によって、例示的な四価抗体の分子量と基本的な構造を検証した結果が示されている。非還元条件が示されている。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、クマシーブルー染色によって、例示的な四価抗体の分子量と基本的な構造を検証した結果が示されている。非還元条件が示されている。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、クマシーブルー染色によって、例示的な四価抗体の分子量と基本的な構造を検証した結果が示されている。還元条件が示されている。
本発明で提供するのは、ヒトＰＳＧＬ−１に特異的に結合する四価抗体である。特定の四価抗ＰＳＧＬ−１抗体は、インビトロでもトランスビボでも、親抗ＰＳＧＬ−１抗体と比べて、有効性が向上しているという、本明細書に記載の知見に本開示は少なくとも部分的に基づいている。これらの四価抗体は、遅延型過敏症（ＤＴＨ）のトランスビボモデルにおいて、親抗ＰＳＧＬ−１抗体よりもアポトーシスを誘導する効能が高く、有効性が向上している。さらに、本発明で提供するのは、この四価抗体に関連する単離ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、キット、使用及び方法である。例えば、本開示の四価抗体は、Ｔ細胞媒介炎症性疾患を治療するのに、または輸血もしくは移植の前、輸血もしくは移植と同時及び／または輸血もしくは移植の後に投与するのに用いることができる。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含み、その二量体の各モノマーは、（ａ）２つの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインであって、その２つのＶＬドメインのそれぞれが、ＣＤＲ−Ｌ１と、ＣＤＲ−Ｌ２と、ＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインと、（ｂ）２つの重鎖可変（ＶＨ）ドメインであって、その２つのＶＨドメインがそれぞれ、ＣＤＲ−Ｈ１と、ＣＤＲ−Ｈ２と、ＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｃ）抗体Ｆｃドメインを含む一本鎖ポリペプチドを含み、その２つのＶＬドメインのそれぞれは、その２つのＶＨドメインのうちの対応するＶＨドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成し、その２つのＶＨ−ＶＬ結合ユニットのそれぞれは、ヒトＰＳＧＬ−１に対して特異的である。別の実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含み、その二量体の各モノマーは、抗体重鎖と抗体軽鎖を含み、その抗体軽鎖は、（ｉ）２つの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインであって、その２つのＶＬドメインのそれぞれが、ＣＤＲ−Ｌ１と、ＣＤＲ−Ｌ２と、ＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインと、（ｉｉ）第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、（ｉｉｉ）軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含み、その抗体重鎖は、（ｉ）第２の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、（ｉｉ）第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）ドメインと、抗体ヒンジ領域と、第２の重鎖定常領域（ＣＨ２）ドメインと、第３の重鎖定常領域（ＣＨ３）ドメインとを含む重鎖定常領域を含み、その第１及び第２のＶＨドメインはそれぞれ、ＣＤＲ−Ｈ１と、ＣＤＲ−Ｈ２と、ＣＤＲ−Ｈ３を含み、その２つのＶＬドメインのそれぞれは、第１及び第２のＶＨドメインのうちの対応するＶＨドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成し、その２つのＶＨ−ＶＬ結合ユニットのそれぞれは、ヒトＰＳＧＬ−１に対して特異的である。別の実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含み、その二量体の各モノマーは、抗体重鎖と抗体軽鎖を含み、その抗体軽鎖は、（ｉ）第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、（ｉｉ）第１の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、（ｉｉｉ）軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含み、その抗体重鎖は、（ｉ）第２の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、（ｉｉ）第２の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、（ｉｉｉ）第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）ドメインと、抗体ヒンジ領域と、第２の重鎖定常領域（ＣＨ２）ドメインと、第３の重鎖定常領域（ＣＨ３）ドメインを含む重鎖定常領域を含み、第１及び第２のＶＬドメインのそれぞれは、ＣＤＲ−Ｌ１と、ＣＤＲ−Ｌ２と、ＣＤＲ−Ｌ３を含み、第１及び第２のＶＨドメインのそれぞれは、ＣＤＲ−Ｈ１と、ＣＤＲ−Ｈ２と、ＣＤＲ−Ｈ３を含み、第１及び第２のＶＬドメインのそれぞれは、第１及び第２のＶＨドメインのうちの対応するＶＨドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成し、その２つのＶＨ−ＶＬ結合ユニットのそれぞれは、ヒトＰＳＧＬ−１に対して特異的である。
Ｉ．定義
「抗体」は、糖鎖、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどのような標的に、その免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を通じて、特異的に結合できる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、この用語には、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体のみならず、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）を含むポリペプチドと、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデム一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ユニット（タンデムｓｃＦｖは、ｔａＦｖという）と、その変異体またはその他の構成体、抗体部分を含む融合タンパク質と、その免疫グロブリン分子のいずれかの他の改変構成体であって、抗原認識部位を含む改変構成体も含まれる。
本明細書で使用する場合、「四価」抗体とは、４つの抗体ＶＨ−ＶＬ結合ユニットを含む抗体であって、各ＶＨ−ＶＬ結合ユニットが、抗体ＶＨドメインと抗体ＶＬドメインを含む抗体を指すことができる。本明細書で使用する場合、四価抗体の「モノマー」に言及するときには、一本鎖ポリペプチドと複数鎖ポリペプチドの両方を含めてよい。例えば、モノマーとは、一本鎖ポリペプチドを指しても、抗体重鎖−軽鎖ユニットであって、その重鎖と軽鎖が、別のポリヌクレオチドによってコードされ、及び／または別のポリペプチドの会合体から形成されるユニットを指してもよい。
抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはそのサブクラス）のようなあらゆるクラスの抗体が含まれ、抗体は、いずれかの特定のクラスのものである必要はない。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの主なクラスには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという５つのクラスがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。この異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ及びμという。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造と３次元構造は周知である。
本開示の抗体にはさらに、あるポリペプチドに対する親和性であって、その抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって付与される親和性を有する二重特異性分子、多特異性分子、キメラ分子、ヒト化分子及び組み換え構築分子が含まれるように意図されている。抗体重鎖の可変ドメインまたは抗体軽鎖の可変ドメインのいずれかである単一ドメイン抗体は周知である。例えば、Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：４８４−４９０，２００３を参照されたい。抗体重鎖の可変ドメインまたは抗体軽鎖の可変ドメインのいずれかを含み、抗体の６つの天然の相補性決定領域のうちの３つを含む抗体の作製方法も、当該技術分野において知られている。例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２，２００１を参照されたい。
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体からなる抗体を指し、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、わずかな量で存在し得る考え得る天然の変異体を除き、同一である。モノクローナル抗体は概して、特異性が高く、単一の抗原部位に対するものである。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られるような抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法によって抗体を作製する必要があると解釈すべきではない。例えば、本開示に従って使用するモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５で初めて説明されたハイブリドーマ法によって作製しても、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組み換えＤＮＡ法によって作製してもよい。モノクローナル抗体は、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４に記載されている技法を用いて作製したファージライブラリーから単離してもよい。
本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」とは、第１の種の可変領域または可変領域の一部と、第２の種の定常領域とを有する抗体を指す。インタクトなキメラ抗体は、２コピーのキメラ軽鎖と２コピーのキメラ重鎖を含む。キメラ抗体の作製は、当該技術分野において知られている（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３２７３−３２７７、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。典型的には、これらのキメラ抗体においては、軽鎖と重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物のうちの１種に由来する抗体の可変領域を模しており、定常部分は、別の種に由来する抗体における配列と相同である。このようなキメラ形態の明らかな利点の１つは、例えば、利便的なことに、入手しやすいハイブリドーマ、またはヒト以外の宿主生物のＢ細胞を、例えばヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせたものを用いて、現在知られている供給源から可変領域を得ることができるという点である。この可変領域には、調製が容易であるという利点があり、その供給源に特異性が影響されない一方で、ヒトのものである定常領域は、抗体を注射したときに、ヒト以外の供給源の定常領域の場合よりも、ヒト対象から免疫応答を惹起する可能性が低い。しかしながら、この定義は、この特定的な例に限定しない。いくつかの実施形態では、可変領域及び／または定常領域において、アミノ酸修飾が施されている。
本明細書で使用する場合、「ヒト化」抗体とは、ヒト以外の免疫グロブリンに由来する最小配列を含む特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくは抗体のその他の抗原結合部分配列など）である形態のヒト以外の（例えばマウス）抗体を指す。大部分では、ヒト化抗体は、そのレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラットまたはウサギのようなヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基のうち、所望の特異性、親和性及び能力を有する残基に置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、ヒト以外の対応する残基に置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体でも、導入するＣＤＲまたはフレームワーク配列でも見られないが、抗体の性能をさらに向上及び最適化する目的で含める残基を含んでもよい。概して、ヒト化抗体は、実質的にすべてまたは少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、その可変ドメインにおいては、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト以外の免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応しており、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は最適には、免疫グロブリン定常領域または定常ドメイン（例えばＦｃドメイン）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域または定常ドメインの少なくとも一部も含むことになる。抗体は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されているようにして改変したＦｃ領域を有してもよい。その他の形態のヒト化抗体は、元の抗体から改変されている１つ以上のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ）を有し、これらのＣＤＲは、元の抗体の１つ以上のＣＤＲ「に由来する」１つ以上のＣＤＲともいう。
本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、及び／または当該技術分野において知られているかもしくは本明細書に開示されている、ヒト抗体の作製技法のうちのいずれかを用いて作製した抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。このような例の１つは、マウス軽鎖ポリペプチドとヒト重鎖ポリペプチドとを含む抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において知られている様々な技法を用いて作製できる。一実施形態では、ヒト抗体は、ファージライブラリーから選択し、そのファージライブラリーは、ヒト抗体を発現するものである（Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０９−３１４、Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ，（ＵＳＡ）９５：６１５７−６１６２、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１）。ヒト抗体は、その内在免疫グロブリン遺伝子を部分的または完全に不活化したトランスジェニック動物、例えばマウスに、ヒト免疫グロブリン座を導入することによって作製することもできる。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号及び同第５，６６１，０１６号に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することによって調製してもよい（このようなＢリンパ球は、個体から回収したものであっても、インビトロで免疫したものであってもよい）。例えば、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５及び米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい。
抗体の「可変領域」（本明細書では、「可変ドメイン」という用語を同義的に用いることがある）とは、抗体軽鎖（ＶＬ）の可変領域または抗体重鎖（ＶＨ）の可変領域単独またはこれらを組み合わせたものを指す。重鎖と軽鎖の可変領域（それぞれＶＨドメインとＶＬドメイン）はそれぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変領域としても知られている）によって連結されている４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって近接した状態で保たれており、他方の鎖のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを割り出すには、（１）異種間における配列多様性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（５ｔｈ ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ））と、（２）抗原抗体複合体の結晶学的調査に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ． Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８））という少なくとも２つの技法がある。本明細書で使用する場合、ＣＤＲとは、いずれかのアプローチまたは両方のアプローチを組み合わせたものによって定義されるＣＤＲを指すことができる。
本明細書では、いくつかのＨＶＲ描写法が使用されているとともに、含まれている。Ｋａｂａｔの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列多様性に基づいており、最も広く用いられている（Ｋａｂａｔｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａは、構造的ループの位置に言及する（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭのＨＶＲは、ＫａｂａｔのＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａの構造的ループを折衷したものであり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで使用されている。「コンタクト」ＨＶＲは、利用可能な複合体の結晶構造の解析に基づいている。これらの各ＨＶＲの残基を下に示す。
可変ドメインにおける残基（概ね、軽鎖の１〜１０７位の残基と、重鎖の１〜１１３位の残基）に言及しているときには、Ｋａｂａｔの番号付け体系が概ね用いられている（例えば、Ｋａｂａｔｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。免疫グロブリン重鎖定常領域における残基に言及しているときには、「ＥＵの番号付け体系」、すなわち「ＥＵインデックス」が概ね用いられている（例えば、上記のＫａｂａｔらの文献または及びＥｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９６９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３：７８−８５で報告されているＥＵインデックス）。
「Ｆｖ」とは、本明細書で使用する場合、完全な抗原認識部位と抗原結合部位を含む最小抗体断片を指してよい。この断片は典型的には、強力に非共有結合性会合した１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインとの二量体からなる。これらの２つのドメインが折り畳まれると、抗原結合用のアミノ酸残基をもたらすとともに、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖とＬ鎖のそれぞれに３つのループ）が作られる。しかしながら、１つの可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖ半部）にも、抗原を認識して、その抗原に結合する能力がある。ただし、結合部位全体よりも親和性は低い。
抗体の「定常領域」（本明細書では、「定常ドメイン」という用語を同義的に用いることがある）とは、抗体軽鎖の定常領域（ＣＬ）または抗体重鎖の定常領域（ＣＨ）単独またはこれらを組み合わせたものを指す。抗体の定常領域は概して、構造的な安定性と、その他の生体機能（抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移行及び補体結合など）をもたらすが、抗原への結合には関与しない。定常領域の遺伝子におけるアミノ酸配列と、対応するエキソン配列は、その由来元である種に依存している。しかしながら、アミノ酸配列における多様性であって、アロタイプをもたらす多様性は、種内の特定の定常領域においては、比較的限られている。各鎖の可変領域は、連結ポリペプチド配列によって、定常領域に結合されている。この結合配列は、軽鎖遺伝子における「Ｊ」配列と、重鎖遺伝子における「Ｄ」配列と「Ｊ」配列が組み合わさったものによってコードされる。抗体アイソタイプに応じて、重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及び／またはＣＨ４ドメインを含むことがある。特定の実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインを含む。
「Ｆｃ領域」という用語（本明細書では、「Ｆｃドメイン」という用語を同義的に用いることがある）は、本明細書では、天然型配列のＦｃ領域とバリアントＦｃ領域を含め、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義する目的で使用する。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は、様々であってよく、いくつかの実施形態、Ｆｃ領域は、ヒンジ領域の１つ以上のアミノ酸を含んでよい。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、ＥＵの２１６位のアミノ酸残基から、そのカルボキシル末端までに及ぶように定義されている。本開示の抗体で用いるのに適する天然型配列のＦｃ領域としては、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が挙げられる。
「一本鎖Ｆｖ」（「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略記される）は、ＶＨ抗体ドメインとＶＬ抗体ドメインを１本のポリペプチド鎖に連結したものを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓＦｖは、抗原結合のために所望の構造を形成できる。ｓＦｖの論評については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
「ダイアボディ」という用語は、Ｖドメインが、鎖内対合ではなく、鎖間対合することによって、二価断片、すなわち、２つの抗原結合部位を有する断片が得られるように、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に短いリンカー（例えば、約５〜１２個の残基）を有するｓＦｖ断片（上の段落を参照されたい）を構築することによって調製した抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、２つの「交差」ｓＦｖ断片からなるヘテロ二量体であって、２つの抗体のＶＨドメインとＶＬドメインが、異なるポリペプチド鎖に存在するヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）にさらに詳細に説明されている。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一率（％）」は、候補配列と参照ポリペプチド配列をアラインメントし、必要な場合、ギャップを導入して、配列同一率が最大になるようにし、あらゆる保存的置換を配列同一性の部分から除外した後、候補配列内のアミノ酸残基のうち、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一であるアミノ酸残基の割合（％）として定義する。アミノ酸配列同一率（％）を割り出すためのアラインメントは、当該技術分野における技術範囲内である様々な方法で、例えば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェア（ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）というソフトウェアなど）を用いて行うことができる。当業者は、比較する配列の完全長にわたってアラインメントを最大にするのに必要ないずれかのアルゴリズムを含め、配列をアラインメントするための適切なパラメーターを割り出すことができる。
本明細書で使用する場合、「抗体依存性細胞媒介性細胞障害性」及び「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球またはマクロファージ）が、標的細胞上の結合抗体を認識した後、その標的細胞を溶解させる細胞媒介性反応を指す。目的の分子のＡＤＣＣ活性は、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを用いて評価できる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）とＮＫ細胞が挙げられる。この代わりに、またはこれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），９５：６５２−６５６に開示されているような動物モデルで評価してもよい。
「補体依存性細胞障害性」及び「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的が溶解されることを指す。補体活性化経路は、同種抗原と複合体を形成した分子（例えば抗体）に補体系の第１の構成要素（Ｃ１ｑ）が結合することによって開始する。補体の活性化を評価するには、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを行ってよい。
「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では、いずれかの長さのアミノ酸のポリマーを指す目的で、同義的に用いられている。このポリマーは、直鎖であっても、分岐鎖であってもよく、修飾アミノ酸を含んでよく、アミノ酸以外のものによって中断されていてもよい。これらの用語には、天然においてまたは介入によって修飾された（例えば、ジスルフィド結合の形成、糖鎖付加、脂質化、アセチル化、リン酸化、またはいずれかの他の操作もしくは修飾（標識構成要素とのコンジュゲーションなど））アミノ酸ポリマーも含まれる。この定義には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含むポリペプチドと、当該技術分野において知られているその他の修飾体も含まれる。本開示のポリペプチドは、四価抗体に基づいているので、そのポリペプチドは、一本鎖または会合鎖として存在し得ることが理解される。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、本明細書で同義的に使用する場合、いずれかの長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、及び／もしくはそれらの類似体、またはＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込むことのできるいずれかの基質であることができる。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド（メチル化ヌクレオチドなど）とその類似体を含んでよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリー前または後に行ってよい。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド以外の構成要素によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識構成要素とのコンジュゲーションなどによってさらに修飾されていてよい。その他のタイプの修飾としては、例えば、「キャップ」、天然のヌクレオチドのうちの１つ以上の類似体への置換、インターヌクレオチド修飾、例えば、非電荷結合を有する修飾（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）と、荷電結合を有する修飾（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）のようなペンダント部分を含むもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含むもの、アルキル化物質を含むもの、修飾結合部を有するもの（例えば、αアノマー核酸など）、非修飾形態のポリヌクレオチド（複数可）が挙げられる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかが、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置き換えられていたり、標準的な保護基によって保護されたり、もしくは追加のヌクレオチドへの追加の結合部を作製するために活性化されたりしていてもよく、または固体支持体にコンジュゲートされていてもよい。５’末端と３’末端ＯＨは、リン酸化するか、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。その他のヒドロキシルが、標準的な保護基に誘導体化されていてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボース、２’−Ｏ−アリル−リボース、２’−フルオロ−リボース、２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖（アラビノース、キシロース、リキソースなど）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び脱塩基ヌクレオシド類似体（メチルリボシドなど）を含め、当該技術分野において概ね知られている類似形態のリボースまたはデオキシリボース糖も含むことができる。１つ以上のホスホジエステル結合が、代替的な連結基に置き換えられていてよい。これらの代替的な連結基としては、ホスフェートが、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置き換えられている実施形態であって、ＲまたはＲ’がそれぞれ独立して、Ｈ、またはエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルを任意に含む置換もしくは非置換のアルキル（１〜２０Ｃ）である実施形態が挙げられるが、これらに限らない。ポリヌクレオチド内のすべての結合が同じである必要はない。上記の記述は、ＲＮＡとＤＮＡを含め、本明細書で言及されているすべてのポリヌクレオチドに適用される。
本明細書で使用する場合、「ベクター」とは、宿主細胞において、目的の遺伝子または配列を１つ以上送達して、所望どおりに発現させることができるコンストラクトを意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミドベクター、コスミドベクターまたはファージベクター、カチオン縮合剤と結合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、及び特定の真核細胞（プロデューサー細胞など）が挙げられるが、これらに限らない。
本明細書で使用する場合、「発現調節配列」とは、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現調節配列は、プロモーター（構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターなど）、またはエンハンサーであることができる。発現調節配列は、転写される核酸配列に機能可能に連結している。
本明細書で使用する場合、薬物、化合物または医薬組成物の「有効投与量」または「治療有効量」は、有益な成果、所望の成果及び／または治療の成果をあげるのに十分な量である。予防用途では、有益な成果または所望の成果には、リスクの除去もしくは軽減、重症度の低下、または疾患の発症（疾患の生化学的な症状、組織学的な症状及び／もしくは行動上の症状、ならびに疾患の発現中に現れるその合併症及び中間的な病理上の表現型を含む）の遅延のような成果が含まれる。治療用途では、有益な成果または所望の成果には、疾患に起因する１つ以上の症状の軽減、疾患に罹患している者のクオリティオブライフの向上、疾患の治療に必要なその他の薬剤の用量の低下、標的化による、別の薬剤の効果の向上、疾患の進行の遅延及び／または生存期間の延長のような臨床的な成果が含まれる。移植を待っている個体を治療する場合、例えば、薬物の有効量は、その個体における同種抗体及び／またはＰＲＡのレベルをある程度低下させることができるものである。移植または輸血を受けている個体を治療する場合、薬物の有効量は、移植または輸血と関連する症状または状態（移植片拒絶反応など）のうちの１つ以上をある程度緩和する作用を有することができるものである。有効量は、１回以上の投与で投与することができる。本開示の目的においては、薬物、化合物または医薬組成物の有効量は、直接または間接的に予防的処置または治療的処置を行うのに十分な量である。有効投与量は、１回以上の投与で投与することができる。本開示の目的においては、薬物、化合物または医薬組成物の有効投与量は、直接または間接的に予防的処置または治療的処置を行うのに十分な量である。臨床状況で分かるように、薬物、化合物または医薬組成物の有効投与量は、別の薬物、化合物または医薬組成物と併せて実現させてもさせなくてもよい。したがって、１つ以上の他の薬剤と併せると、所望の成果が得られる可能性があるか、または得られる場合、１つ以上の治療剤を投与する状況において「有効投与量」を検討してもよいとともに、単剤を有効量で投与するように検討してもよい。
本明細書で使用する場合、「と併せて」とは、一方の治療法に加えて、他方の治療法を行うことを指す。したがって、「と併せて」とは、一方の治療法を個体に行う前、行っている間または行った後に、他方の治療法を行うことを指す。
本明細書で使用する場合、「治療」または「治療する」は、有益な成果または所望の成果（所望の臨床成果を含む）を得るためのアプローチである。有益な成果、所望の成果及び／または臨床上の治療成果としては、炎症または自己免疫の１つ以上の症状（例えば、Ｔ細胞媒介炎症性疾患に起因する症状）の軽減または阻止、良好な患者転帰が得られる可能性の向上及び／もしくは医療に関連する（例えば、移植もしくは輸血に関連する）１つ以上の禁忌もしくは有害な転帰の緩和、疾患に起因する症状の軽減、疾患に罹患している者のクオリティオブライフの向上、疾患の治療に必要な他の薬剤の用量の低減、疾患の進行の遅延、ならびに／または個体の生存期間の延長のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限らない。
本明細書で使用する場合、「疾患の発現の遅延」とは、疾患（がんなど）の発現を遅らせたり、妨げたり、ゆっくりにしたり、遅くしたり、安定化したり、及び／または延期することを意味する。この遅延は、疾患の履歴及び／または治療する個体に応じて、様々な時間長の遅延になることがある。当業者には明らかなように、十分または有意な遅延には、実際には、個体が疾患を発現しないという点で、予防を含めることができる。例えば、Ｔ細胞媒介炎症性疾患のような炎症性疾患の症状を遅延できる。
「個体」または「対象」は、哺乳動物、より望ましくはヒトである。哺乳動物としては、家畜、競技用動物、ペット（ネコ、イヌまたはウマなど）、霊長類動物、マウス及びラットも挙げられるが、これらに限らない。
本明細書で使用する場合、「特異的に認識する」または「特異的に結合する」という用語は、測定可能かつ再現可能な相互作用（標的と抗体（例えば、完全長抗体、抗体断片または抗体ＶＨ−ＶＬ結合ユニット）との間の引力または結合であって、生体分子を含む不均一分子集団の存在下で、標的の存在を決定する引力または結合など）を指す。例えば、エピトープに特異的または優先的に結合する抗体、抗体断片または抗体ＶＨ−ＶＬ結合ユニットは、その標的の他のエピトープまたは標的ではないエピトープに結合する場合よりも高い親和性で、高い結合活性で、容易に、及び／または長い持続期間で、このエピトープに結合する抗体である。この定義を読むことによって、例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体、抗体断片または抗体ＶＨ−ＶＬ結合ユニットは、第２の標的に特異的または優先的に結合してもしなくてもよいことも理解される。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的結合である必要はない（ただし、排他的結合を含むことができる）。標的に特異的に結合する抗体、抗体断片または抗体ＶＨ−ＶＬ結合ユニットの結合定数は、約１０３Ｍ−１もしくは約１０４Ｍ−１以上、場合によっては約１０５Ｍ−１もしくは約１０６Ｍ−１、別のケースでは、約１０６Ｍ−１もしくは約１０７Ｍ−１、約１０８Ｍ−１〜約１０９Ｍ−１、または約１０１０Ｍ−１〜約１０１１Ｍ−１以上であってよい。様々なイムノアッセイ形態を用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体、抗体断片または抗体ＶＨ−ＶＬ結合ユニットを選択できる。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するのには、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが慣例的に用いられている。例えば、特異的な免疫反応性を割り出すのに使用できるイムノアッセイ形態と条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
「添付文書」とは、医薬の商用包装物に慣例として含まれている説明であって、適応症、用法、用量、投与、禁忌、その商用包装物と組み合わせる他の医薬及び／またはその医薬の使用に関する注意などに関する情報を含む説明を指す。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形形態には、文脈上明らかに別に解すべき場合を除き、複数形への言及が含まれる。例えば、「抗体」への言及は、１つの抗体から多くの抗体（モル量など）までの言及であり、当業者に知られているその等価物が含まれるなどである。
本明細書において「約」の付された値またはパラメーターに言及している際には、その値またはパラメーター自体に向けられている実施形態が含まれる（かつ記載されている）。例えば、「約Ｘ」に言及している記述には、「Ｘ」の記述が含まれる。
本明細書に記載されている、本開示の態様と変形形態には、態様及び変形形態「からなる」こと及び／または態様及び変形形態「から本質的になる」ことが含まれることが理解される。
ＩＩ．四価抗体
本開示の特定の態様は、ヒトＰＳＧＬ−１に特異的に結合する四価抗体に関するものである。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含む。下に記載されているように、このモノマーは、当該技術分野において知られているいずれかの手段（抗体Ｆｃドメインもしくは領域間の野生型相互作用、抗体Ｆｃドメインもしくは領域間の改変もしくは変異型相互作用（例えば、本明細書に記載されているヒンジ領域変異を用いるもの）、またはその他の人工的な共有結合性もしくは非共有結合性相互作用（例えば、架橋もしくはリンカー）が挙げられるが、これらに限らない）を用いて結合されていてよい。例示的な四価抗体及び抗体形態は、下に説明されているとともに、図１Ａ及び１Ｂに示されている。
ヒトＰＳＧＬ−１は、セレクチンＰリガンド、ＳＥＬＰＧ、ＣＬＡ、ＣＤ１６２またはＰＳＧＬ１と称することもある。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、例えばＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑの遺伝子ＩＤ番号６４０４によって説明されているようなヒトＳＥＬＰＧ遺伝子によってコードされるポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、１５または１６個の１０量体リピートを含むヒトＰＳＧＬ−１ポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合するとともに、配列番号３２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する。配列番号３１のアミノ酸配列は、完全長ヒトＰＳＧＬ−１（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号ＡＡＡ７４５７７．１、ＧＬ９０２７９７）を示しており、配列番号３２のアミノ酸配列は、これよりも短い４０２個のアミノ酸のヒトＰＳＧＬ−１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号ＸＰ＿００５２６９１３３）を示している。具体的な実施形態では、本明細書に記載されている四価抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、または当該技術分野において知られているかもしくは本明細書に記載されているその他の抗原結合アッセイによって割り出されるように、ヒトＰＳＧＬ−１に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、本開示のＶＨドメインとＶＬドメインは、ＶＨ−ＶＬ結合ユニット（例えば、ヒトＰＳＧＬ−１のエピトープのようなエピトープに特異的に結合するＶＨ−ＶＬ結合ユニット）を形成する。本明細書に記載されているように、ＶＨ−ＶＬ結合ユニットは、野生型ＶＨ−ＶＬ相互作用を用いて、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間で形成してもよく、またはＶＨ−ＶＬ結合ユニットは、１つ以上の変異または化学結合（例えば、配列番号２９のＶＨドメインと配列番号３０のＶＬドメインにおいてシステイン置換によって導入されるｖＨ４４−ｖＬ１００ジスルフィド結合のようなジスルフィド結合）を用いて、さらに安定化してもよい。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含み、その二量体の各モノマーは、一本鎖ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の一本鎖ポリペプチド、重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドは、リンカー配列を含む。様々なリンカー配列を好適に用いて、例えば、ＶＨ−ＶＬ結合ユニットのＶＨドメインとＶＬドメインを連結したり、ＶＨ−ＶＬ結合ユニットのＶＨドメインもしくはＶＬドメインを、別のＶＨ−ＶＬ結合ユニットのＶＨドメインもしくはＶＬドメインに連結したり、またはＶＨ−ＶＬ結合ユニットのＶＨドメインもしくはＶＬドメインを抗体定常領域（ＦｃドメインもしくはＦｃ領域）に連結したりしてよい。いくつかの実施形態では、本開示のリンカーは、ドメインまたは領域間に存在してよい。いくつかの実施形態では、本開示の２つのドメインまたは領域は、リンカーなしで連結してよく、または２つのドメインまたは領域を連結したリンカーを除去してもよい。様々なリンカーを用いて、このような一本鎖断片を結合することは、Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０：４２３−４３３に記載されている。いくつかの実施形態では、本開示のリンカー配列は、１〜５０個のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、本開示のリンカー配列は、５〜１２個のアミノ酸を含む。例示的なリンカー配列は、本明細書に記載されており、図１Ａに示されている。いくつかの実施形態では、本開示のリンカー配列は、ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）のアミノ酸配列のリピートを１回以上含む。いくつかの実施形態では、本開示のリンカー配列は、ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）のアミノ酸配列のリピートを２回、３回、４回または５回含む。いくつかの実施形態では、本開示のリンカー配列は、配列番号３３、３４、３５または３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のリンカー配列は、ＧＧＧＧＳＡＡＡ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のリンカー配列は、ＡＳＴＧＳ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のリンカー配列は、ＡＳＴＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つの一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）からなる二量体を含み、これらのｓｃＤｂは、任意に応じて、Ｆｃドメインのような抗体定常領域に融合されていてもよい。
いくつかの実施形態では、二量体の各モノマーは、（ａ）２つの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインであって、その２つのＶＬドメインのそれぞれが、ＣＤＲ−Ｌ１と、ＣＤＲ−Ｌ２と、ＣＤＲ−Ｌ３を含み、その２つのＶＬドメインが、ヒトＰＳＧＬ−１に対して特異的であるＶＬドメインと、（ｂ）２つの重鎖可変（ＶＨ）ドメインであって、その２つのＶＨドメインのそれぞれが、ＣＤＲ−Ｈ１と、ＣＤＲ−Ｈ２と、ＣＤＲ−Ｈ３を含み、その２つのＶＨドメインが、ヒトＰＳＧＬ−１に対して特異的であるＶＨドメインと、（ｃ）抗体Ｆｃドメインを含む一本鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、２つのＶＬドメインのそれぞれが、２つのＶＨドメインのうちの対応するＶＨドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成する。
特定の実施形態では、２本の一本鎖ポリペプチドのそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）２つのＶＬドメインのうちの第１のＶＬドメインと、（ｂ）第１のリンカー配列と、（ｃ）２つのＶＨドメインのうちの第１のＶＨドメインと、（ｄ）第２のリンカー配列と、（ｅ）２つのＶＬドメインのうちの第２のＶＬドメインと、（ｆ）第３のリンカー配列と、（ｇ）２つのＶＨドメインのうちの第２のＶＨドメインと、（ｈ）第４のリンカー配列と、（ｉ）抗体Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＬドメインは、第２のＶＨドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成し、第１のＶＨドメインは、第２のＶＬドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成する。
いくつかの実施形態では、第１、第２及び第３のリンカー配列はそれぞれ、配列番号２５のアミノ酸配列のリピートを２回以上含む。いくつかの実施形態では、第１、第２または第３のリンカー配列は、配列番号３３、３４、３５または３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第３のリンカー配列は、同じ配列を有し、配列番号２５のリピートを２回含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカー配列は、配列番号２５のリピートを５回含む。いくつかの実施形態では、第４のリンカー配列は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのタンデム一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ユニット（タンデムｓｃＦｖは、ｔａＦｖという）からなる二量体を含み、この二量体は、任意に応じて、重鎖定常ドメインのＦｃドメインのような抗体定常ドメインに融合してもよい。
特定の実施形態では、２本の一本鎖ポリペプチドのそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）２つのＶＨドメインのうちの第１のＶＨドメインと、（ｂ）第１のリンカー配列と、（ｃ）２つのＶＬドメインのうちの第１のＶＬドメインと、（ｄ）第２のリンカー配列と、（ｅ）２つのＶＬドメインのうちの第２のＶＬドメインと、（ｆ）第３のリンカー配列と、（ｇ）２つのＶＨドメインのうちの第２のＶＨドメインと、（ｈ）第４のリンカー配列と、（ｉ）抗体Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＬドメインは、第１のＶＨドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成し、第２のＶＨドメインは、第２のＶＬドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成する。別の実施形態では、２本の一本鎖ポリペプチドのそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）２つのＶＬドメインのうちの第１のＶＬドメインと、（ｂ）第１のリンカー配列と、（ｃ）２つのＶＨドメインのうちの第１のＶＨドメインと、（ｄ）第２のリンカー配列と、（ｅ）２つのＶＨドメインのうちの第２のＶＨドメインと、（ｆ）第３のリンカー配列と、（ｇ）２つのＶＬドメインのうちの第２のＶＬドメインと、（ｈ）第４のリンカー配列と、（ｉ）抗体Ｆｃドメインを含む重鎖定常ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、第１及び第３のリンカー配列は、配列番号２５のリピートを５回含む同じ配列を有する。いくつかの実施形態では、第２のリンカー配列は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第４のリンカー配列は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含み、その二量体の各モノマーは、抗体重鎖と抗体軽鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、（ｉ）２つの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインであって、その２つのＶＬドメインのそれぞれが、ＣＤＲ−Ｌ１と、ＣＤＲ−Ｌ２と、ＣＤＲ−Ｌ３を含み、その２つのＶＬドメインが、ヒトＰＳＧＬ−１に対して特異的であるＶＬドメインと、（ｉｉ）第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、（ｉｉｉ）軽鎖定常（ＣＬ）ドメインとを含む軽鎖、及び／または（ｉ）第２の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、（ｉｉ）第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）ドメインと、抗体ヒンジ領域と、第２の重鎖定常領域（ＣＨ２）ドメインと、第３の重鎖定常領域（ＣＨ３）ドメインとを含む重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＶＨドメインはそれぞれ、ＣＤＲ−Ｈ１と、ＣＤＲ−Ｈ２と、ＣＤＲ−Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＶＨドメインは、ヒトＰＳＧＬ−１に対して特異的である。いくつかの実施形態では、２つのＶＬドメインのそれぞれは、第１及び第２のＶＨドメインのうちの対応するＶＨドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成する。
特定の実施形態では、抗体軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）第１のＶＨドメインと、（ｂ）第１のリンカー配列と、（ｃ）２つ以上のＶＬドメインのうちの第１のＶＬドメインと、（ｄ）第２のリンカー配列と、（ｅ）２つ以上のＶＬドメインのうちの第２のＶＬドメインと、（ｆ）ＣＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＬドメインは、κＣＬドメインである。別の実施形態では、ＣＬドメインは、λＣＬドメインである。いくつかの実施形態では、第１のＶＬドメインは、第１のＶＨドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成し、第２のＶＨドメインは、第２のＶＬドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成する。
いくつかの実施形態では、第１のリンカー配列は、配列番号２５のリピートを５回含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカー配列は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）２つのＶＬドメインのうちの第１のＶＬドメインと、（ｂ）ＣＬドメインと、（ｃ）第１のリンカー配列と、（ｄ）第１のＶＨドメインと、（ｅ）第２のリンカー配列と、（ｆ）２つのＶＬドメインのうちの第２のＶＬドメインとを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＬドメインは、κＣＬドメインである。別の実施形態では、ＣＬドメインは、λＣＬドメインである。
いくつかの実施形態では、第１のリンカー配列は、配列番号２５のリピートを２回含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカー配列は、配列番号２５のリピートを５回含む。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）２つのＶＨドメインのうちの第２のドメインと、（ｂ）第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）ドメインと、抗体ヒンジ領域と、第２の重鎖定常領域（ＣＨ２）ドメインと、第３の重鎖定常領域（ＣＨ３）ドメインとを含む重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、重鎖定常２（ＣＨ２）ドメインと重鎖定常３（ＣＨ３）ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＬドメインは、第１のＶＨドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成し、第２のＶＨドメインは、第２のＶＬドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成する。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、（ｉ）第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、（ｉｉ）第１の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、（ｉｉｉ）軽鎖定常（ＣＬ）ドメインとを含む軽鎖、及び／または（ｉ）第２の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、（ｉｉ）第２の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、（ｉｉｉ）第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）ドメインと、抗体ヒンジ領域と、第２の重鎖定常領域（ＣＨ２）ドメインと、第３の重鎖定常領域（ＣＨ３）ドメインとを含む重鎖定常領域を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＶＬドメインのそれぞれは、ＣＤＲ−Ｌ１と、ＣＤＲ−Ｌ２と、ＣＤＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＶＬドメインは、ヒトＰＳＧＬ−１に対して特異的である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＶＨドメインのそれぞれは、ＣＤＲ−Ｈ１と、ＣＤＲ−Ｈ２と、ＣＤＲ−Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＶＨドメインは、ヒトＰＳＧＬ−１に対して特異的である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＶＬドメインのそれぞれは、第１及び第２のＶＨドメインのうちの対応するＶＨドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成する。
いくつかの実施形態では、抗体軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）第１のＶＨドメインと、（ｂ）第１のリンカー配列と、（ｃ）第１のＶＬドメインと、（ｄ）ＣＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＬドメインは、κＣＬドメインである。別の実施形態では、ＣＬドメインは、λＣＬドメインである。
いくつかの実施形態では、第１のリンカー配列は、配列番号２５のリピートを５回含む。
いくつかの実施形態では、抗体重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）２つのＶＨドメインのうちの第２のドメインと、（ｂ）第２のリンカー配列と、（ｃ）２つのＶＬドメインのうちの第２のドメインと、（ｄ）第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）ドメインと、抗体ヒンジ領域と、第２の重鎖定常領域（ＣＨ２）ドメインと、第３の重鎖定常領域（ＣＨ３）ドメインとを含む重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、重鎖定常２（ＣＨ２）ドメインと、重鎖定常３（ＣＨ３）ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、第２のリンカー配列は、配列番号２５のリピートを５回含む。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、（ｉ）ＳＦＧＭＨ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｉｉ）ＹＩＮＧＧＳＳＴＩＦＹＡＮＡＶＫＧ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｉｉｉ）ＹＡＳＹＧＧＧＡＭＤＹ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３から選択した１つ以上のＣＤＲを含む１つ以上のＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３とを含む１つ以上のＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体であり、各モノマーは、２つのＶＨドメインを含み、各ＶＨドメインは、（ｉ）ＳＦＧＭＨ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｉｉ）ＹＩＮＧＧＳＳＴＩＦＹＡＮＡＶＫＧ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｉｉｉ）ＹＡＳＹＧＧＧＡＭＤＹ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３から選択した１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体であり、各モノマーは、２つのＶＨドメインを含み、各ＶＨドメインは、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む１つ以上のＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのＶＨドメインを含むモノマーを含み、各ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む１つ以上のＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのＶＨドメインを含むモノマーを含み、各ＶＨドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む１つ以上のＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのＶＨドメインを含むモノマーを含み、各ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む。いくつかの実施形態では、同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるＶＨ配列は、参照配列に対する置換（例えば保存的置換）、挿入または欠失を含むが、その配列を含む抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体は、ヒトＰＳＧＬ−１に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、配列番号２３において、合わせて１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／または欠失されている。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む１つ以上のＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのＶＨドメインを含むモノマーを含み、各ＶＨドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む。いくつかの実施形態では、同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるＶＨ配列は、参照配列に対する置換（例えば保存的置換）、挿入または欠失を含むが、その配列を含む抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体は、ヒトＰＳＧＬ−１に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、配列番号２９において、合わせて１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／または欠失されている。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、（ｉ）ＲＳＳＱＳＩＶＨＮＤＧＮＴＹＦＥ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｉｉ）ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号２１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｉｉｉ）ＦＱＧＳＹＶＰＬＴ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択した１つ以上のＣＤＲを含む１つ以上のＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、（ｉ）ＲＳＳＱＳＩＶＨＮＤＧＮＴＹＦＥ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｉｉ）ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号２１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｉｉｉ）ＦＱＧＳＹＶＰＬＴ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む１つ以上のＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体であり、各モノマーは、２つのＶＬドメインを含み、各ＶＬドメインは、（ｉ）ＲＳＳＱＳＩＶＨＮＤＧＮＴＹＦＥ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｉｉ）ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号２１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｉｉｉ）ＦＱＧＳＹＶＰＬＴ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択した１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体であり、各モノマーは、２つのＶＬドメインを含み、各ＶＬドメインは、（ｉ）ＲＳＳＱＳＩＶＨＮＤＧＮＴＹＦＥ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｉｉ）ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号２１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｉｉｉ）ＦＱＧＳＹＶＰＬＴ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む１つ以上のＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのＶＬドメインを含むモノマーを含み、各ＶＬドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む１つ以上のＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのＶＬドメインを含むモノマーを含み、各ＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む１つ以上のＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのＶＬドメインを含むモノマーを含み、各ＶＬドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む。いくつかの実施形態では、同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるＶＬ配列は、参照配列に対する置換（例えば保存的置換）、挿入または欠失を含むが、その配列を含む抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体は、ヒトＰＳＧＬ−１に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、配列番号２４において、合わせて１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／または欠失されている。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む１つ以上のＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのＶＬドメインを含むモノマーを含み、各ＶＬドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む。いくつかの実施形態では、同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるＶＬ配列は、参照配列に対する置換（例えば保存的置換）、挿入または欠失を含むが、その配列を含む抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体は、ヒトＰＳＧＬ−１に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、配列番号３０において、合わせて１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／または欠失されている。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号１、３または５のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む一本鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含み、各モノマーは、２本の一本鎖ポリペプチドを含み、各一本鎖ポリペプチドは、配列番号１、３または５のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む。いくつかの実施形態では、同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である一本鎖ポリペプチド配列は、参照配列に対する置換（例えば保存的置換）、挿入または欠失を含むが、その配列を含む抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体は、ヒトＰＳＧＬ−１に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、配列番号１、３または５において、合わせて１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／または欠失されている。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２本の一本鎖ポリペプチドを含み、各一本鎖ポリペプチドは、配列番号１、３または５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号２、４または６のポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖ポリペプチドに対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む一本鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含み、各モノマーは、２本の一本鎖ポリペプチドを含み、各一本鎖ポリペプチドは、配列番号２、４または６のポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖ポリペプチドに対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む。いくつかの実施形態では、同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である一本鎖ポリペプチド配列は、参照配列に対する置換（例えば保存的置換）、挿入または欠失を含むが、その配列を含む抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体は、ヒトＰＳＧＬ−１に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、配列番号２、４または６のポリヌクレオチド配列によってコードされる一本鎖ポリペプチドにおいて、合わせて１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／または欠失されている。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２本の一本鎖ポリペプチドを含み、各一本鎖ポリペプチドは、配列番号２、４または６のポリヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号７、９または１３のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含み、各モノマーは、重鎖と軽鎖を含み、各軽鎖は、配列番号７、９または１３のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む。いくつかの実施形態では、同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である軽鎖ポリペプチド配列は、参照配列に対する置換（例えば保存的置換）、挿入または欠失を含むが、その配列を含む抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体は、ヒトＰＳＧＬ−１に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、配列番号７、９または１３において、合わせて１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／または欠失されている。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含み、各モノマーは、重鎖と軽鎖を含み、各軽鎖は、配列番号７、９または１３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号８、１０または１４のポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖ポリペプチドに対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含み、各モノマーは、重鎖と軽鎖を含み、各軽鎖は、配列番号８、１０または１４のポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖ポリペプチドに対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む。いくつかの実施形態では、同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である軽鎖ポリペプチド配列は、参照配列に対する置換（例えば保存的置換）、挿入または欠失を含むが、その配列を含む抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体は、ヒトＰＳＧＬ−１に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、配列番号８、１０または１４のポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖ポリペプチドにおいて、合わせて１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／または欠失されている。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含み、各モノマーは、重鎖と軽鎖を含み、各軽鎖は、配列番号８、１０または１４のポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号１１または１５のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含み、各モノマーは、重鎖と軽鎖を含み、各重鎖は、配列番号１１または１５のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む。いくつかの実施形態では、同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である重鎖ポリペプチド配列は、参照配列に対する置換（例えば保存的置換）、挿入または欠失を含むが、その配列を含む抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体は、ヒトＰＳＧＬ−１に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、配列番号１１または１５において、合わせて１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／または欠失されている。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含み、各モノマーは、重鎖と軽鎖を含み、各重鎖は、配列番号１１または１５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、配列番号１２または１６のポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖ポリペプチドに対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含み、各モノマーは、重鎖と軽鎖を含み、各重鎖は、配列番号１２または１６のポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖ポリペプチドに対する配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である配列を含む。いくつかの実施形態では、同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である重鎖ポリペプチド配列は、参照配列に対する置換（例えば保存的置換）、挿入または欠失を含むが、その配列を含む抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体は、ヒトＰＳＧＬ−１に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、配列番号１２または１６のポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖ポリペプチドにおいて、合わせて１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／または欠失されている。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つのモノマーからなる二量体を含み、各モノマーは、重鎖と軽鎖を含み、各重鎖は、配列番号１２または１６のポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖ポリペプチドを含む。
本開示には、本明細書に記載されている抗体またはポリペプチドの特性に有意な影響を及ぼさない機能的等価抗体と、活性及び／または親和性が向上または低下しているバリアントを含め、本明細書に記載されている抗体またはポリペプチドの修正形態が含まれる。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野において日常的に実施されているものであり、本明細書で詳細に説明する必要はない。修飾ポリペプチドの例としては、機能的活性または化学的類似体の用途の有害な変化を有意には引き起こさない、アミノ酸残基の保存的置換、アミノ酸の１つ以上の欠失または付加を有するポリペプチドが挙げられる。
アミノ酸配列の挿入としては、１つの残基から、１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さに及ぶ、アミノ及び／またはカルボキシル末端融合と、１つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、またはエピトープタグに融合した抗体が挙げられる。抗体分子のその他の挿入バリアントとしては、抗体の血清中半減期を延長する酵素またはポリペプチドが、抗体のＮ末端またはＣ末端に融合したものが挙げられる。
置換バリアントでは、抗体分子における少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されているとともに、その位置に、異なる残基が挿入されている。置換型変異誘発の際に特に重要な部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲの改変も想定されている。保存的置換は、下記の表に、「保存的置換」の見出しで示されている。このような置換により、生物学的活性が変化する場合には、さらに大きな変化（下記の表で「例示的な置換」として示されているか、またはアミノ酸クラスを参照して、下にさらに説明されているような変化）を導入して、その産物をスクリーニングしてよい。
抗体の生物学的特性の実質的な修正は、（ａ）置換区域におけるポリペプチド主鎖の構造、例えば、シートもしくはヘリックスコンフォメーション、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさの維持に及ぼす作用の点で有意に異なる置換を選択することによって行う。天然の残基は、以下のように、共通する側鎖の特性に基づく群に分類される。
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）非荷電極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性（負荷電）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性（正荷電）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ
非保存的置換は、これらのクラスのメンバーの１つを別のクラスに置き換えることによって行う。
また、抗体の適切なコンフォメーションの維持に関与しないいずれかのシステイン残基を、一般的にはセリンで置換して、その分子の酸化安定性を向上させるとともに、異常な架橋を防いでよい。逆に、特に、抗体が、Ｆｖ断片のような抗体断片の場合には、システイン結合（複数可）を抗体に付加して、その安定性を向上させてもよい。例示的なシステイン変異は、本明細書に記載されている（例えば、配列番号２９のＧ４４ＣというＶＨドメイン変異、または配列番号３０のＱ１００ＣというＶＬドメイン変異）。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、抗体Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。特定の実施形態では、抗体Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。
いくつかの実施形態では、抗体の重鎖定常領域及び／または軽鎖定常領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、修飾されている。例えば、実施例に記載されている抗体のアミノ酸残基を修飾してよい。いくつかの実施形態では、抗体のＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣ活性を向上または低下させるために、抗体のＦｃ領域が修飾されている。Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４（２００１）、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：４８７−４９０（２００２）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、二量体の形成及び／または安定性を向上させるか、または二量体の不均一性（例えばシャッフリング）を低下させるために、抗体のＦｃ領域が修飾されている。ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域において、Ｋａｂａｔの番号付け（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）を用いた場合は２４１位、ＥＵインデックス（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９６９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６３（１）：７８−８５）を用いた場合は２２８位におけるセリンがプロリンに変異すると、鎖内ジスルフィド結合の形成がかなり低減され、ＩｇＧ４「ハーフ抗体」分子が低減され、かつ、ＩｇＧ４分子の不均一性／シャッフリングが低減される（Ｂｌｏｏｍ ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，６：４０７−４１５、Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３０（１）：１０５−１０８））ことが示されている。このヒンジ変異により、ＩｇＧ４のシャッフリングが低減され、インビボでのＩｇＧ４分子の半減期が延長される場合があるという公の報告もある（Ｌａｂｒｉｊｎ，ｅｔ ａｌ，２００９，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２７：７６７−７７１、Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ，ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ３８：８４−９１）。Ｆａｂアームの交換反応には、コアヒンジではなく、ＩｇＧ４のＣＨ３ドメインが主に関与していることがＶａｎ ｄｅｒ Ｎｅｕｔ Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎらにより報告された（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｎｅｕｔ Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ ｅｔ ａｌ，２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１７：１５５４−１５５７（「Ｖａｎ ｄｅｒ Ｎｅｕｔ Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ」）の１５５５ページ、２列目を参照されたい）。Ｖａｎ ｄｅｒ Ｎｅｕｔ Ｋｏｌｆｓｃｈａｔｅｎでは、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインをＩｇＧ４のＣＨ３ドメインに置き換えたところ、ＩｇＧ１のＦａｂアーム交換が活性化した一方で、ＩｇＧ４のＣＨ３ドメインを置き換えたところ、ＩｇＧ４のＦａｂアーム交換が阻止されたことが報告された（１５５５ページと図２Ｄを参照されたい）。
具体的な実施形態では、本発明で提供するのは、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合するとともに、ＩｇＧ４ヒンジ領域に１つ以上のアミノ酸置換を含む四価抗体であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、前記ＰＳＧＬ−１への特異的結合を保持しており、前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＩｇＧ４ヒンジ領域を含む抗体よりも、ＩｇＧ４のシャッフリングが低減される四価抗体である。具体的な実施形態では、ＩｇＧ４ヒンジ領域は、１つのアミノ酸置換のみを含む。「ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域」の例は、Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３０（１）：１０５−１０８に定められているように、ＩｇＧ４抗体の重鎖上の領域のうち、ＣＨＩドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域である。
具体的な実施形態では、ＩｇＧ４のシャッフリングの低減は、本明細書に記載の抗体であって、ヒンジ領域に１つ以上のアミノ酸置換を含む抗体から作られたハーフ抗体分子またはアーム交換の量が、前記１つ以上のアミノ酸置換を含まないＩｇＧ４ヒンジ領域を含むＩｇＧ４分子から作られたハーフ抗体分子またはアーム交換の量よりも減少したことを検出することによって割り出す。当該技術分野において周知のいずれかのアッセイを用いて、ハーフ抗体の産生と二重特異性抗体分子を検出できる。例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｎｅｕｔ Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ ｅｔ ａｌ，２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１７：１５５４−１５５７を参照されたい（例えば、二重特異性抗体の産生を検出するアッセイ）。
具体的な実施形態では、本発明で提供するのは、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合するとともに、ＥＵインデックスに従って番号付けした場合、重鎖の２２８位のアミノ酸位（Ｋａｂａｔの番号付けを用いた場合には、２４１位としても知られている）におけるセリンのプロリンへのアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む四価抗体である。
修飾には、グリコシル化ポリペプチド及び非グリコシル化ポリペプチドと、その他の翻訳後修飾（例えば、異なる糖による糖鎖付加、アセチル化及びリン酸化など）を有するポリペプチドが含まれる。抗体は、その定常領域内の保存された位置でグリコシル化される（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｕｎｄ，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１１１−１２８、Ｗｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，ＴｉｂＴＥＣＨ １５：２６−３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１−１３１８、Ｗｉｔｔｗｅ ａｎｄ Ｈｏｗａｒｄ，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４１７５−４１８０）と、糖タンパク質部分間の分子内相互作用に影響を及ぼし、この分子内相互作用は、その糖タンパク質のコンフォメーションと、提示される３次元表面に影響を及ぼし得る（Ｈｅｆｆｅｒｉｓ及びＬｕｎｄの上記文献、Ｗｙｓｓ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ，１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４０９−４１６）。オリゴ糖は、特異的認識構造に基づき、所定の糖タンパク質を特定の分子に導く役割を果たすこともある。抗体の糖鎖付加は、抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすことも報告されている。特に、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）（バイセクトＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼ）をテトラサイクリンによる制御で発現させたＣＨＯ細胞において、ＡＤＣＣ活性が向上したことが報告された（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０）。
抗体の糖鎖付加は典型的には、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型とは、アスパラギン残基の側鎖に糖鎖部分が結合することを指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−トレオニン及びアスパラギン−Ｘ−システイン（Ｘは、プロリン以外のいずれかのアミノ酸である）は、糖鎖部分のアスパラギン側鎖への酵素的結合の際の認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のうちのいずれかがポリペプチドに存在すると、潜在的な糖鎖付加部位が作られる。Ｏ−結合型糖鎖付加とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースという糖のうちの１つが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンに結合することを指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用されることがある。
抗体への糖鎖付加部位の付加は、利便的なことに、アミノ酸配列を改変して、その配列が、上記のトリペプチド配列のうちの１つ以上を含むようにすることによって行う（Ｎ−結合型糖鎖付加部位の場合）。この改変は、元の抗体の配列に１つ以上のセリンもしくはトレオニン残基を付加するか、または元の抗体の配列を１つ以上のセリンもしくはトレオニン残基によって置換することによって行ってもよい（Ｏ−結合型糖鎖付加部位の場合）。
抗体の糖鎖付加パターンは、元となるヌクレオチド配列を改変せずに改変してもよい。糖鎖付加は主に、抗体を発現させる目的で使用する宿主細胞によって左右される。組み換え糖タンパク質、例えば治療剤候補としての抗体を発現させる目的で使用する細胞種は、ネイティブ細胞であることはまれであるので、抗体の糖鎖付加パターンの多様性を予測できる（例えば、Ｈｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９０６２−９０７０を参照されたい）。
宿主細胞の選択に加えて、抗体の組み換え産生の際に糖鎖付加に影響を及ぼす要因としては、増殖形態、培地調合、培養密度、酸素供給、ｐＨ、精製スキームなどが挙げられる。オリゴ糖の産生に関与する特定の酵素を導入するかまたは過剰発現させることを含め、特定の宿主生物で行われる糖鎖付加パターンを改変するための様々な方法が提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号、同第５，５１０，２６１号及び同第５，２７８，２９９号）。糖鎖付加または特定のタイプの糖鎖付加は、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２またはエンドグリコシダーゼＦ３を用いて、糖タンパク質から酵素的に除去できる。加えて、組み換え宿主細胞を遺伝子操作して、特定のタイプの多糖の処理に異常が生じるようにできる。これらの技法及び類似の技法は、当該技術分野において周知である。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、当該技術分野において知られている結合技法（酵素的手段、酸化置換及びキレート化が挙げられるが、これらに限らない）を用いて修飾されている。修飾は、例えば、イムノアッセイ用の標識を結合させるためにも用いることもできる。
本開示の四価抗体またはポリペプチドは、治療剤または標識のような作用物質にコンジュゲート（例えば連結）してもよい。治療剤の例は、放射性部分、細胞毒素及び化学療法分子である。
本開示の四価抗体（またはポリペプチド）は、蛍光分子、放射性分子、酵素または当該技術分野において知られているいずれかの他の標識のような標識に連結してよい。本明細書で使用する場合、「標識」という用語は、検出することができるいずれかの分子を指す。特定の実施形態では、抗体は、放射性標識したアミノ酸を導入することによって標識してよい。特定の実施形態では、マーカーを付したアビジン（例えば、光学的方法または比色方法によって検出できる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出できるビオチン部分を抗体に結合してよい。特定の実施形態では、目的の抗体に後で結合する別の試薬に標識を導入または結合してよい。例えば、標識を、目的の抗体に後で特異的に結合する抗体に導入または結合してよい。特定の実施形態では、標識またはマーカーも治療剤であることができる。ポリペプチドと糖タンパク質を標識する様々な方法は、当該技術分野において知られており、これらの方法を使用してよい。特定の一般的クラスの標識としては、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識及び放射性標識が挙げられるが、これらに限らない。ポリペプチド用の標識の例としては、放射線同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉまたは１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニドリン光体またはフィコエリトリン（ＰＥ））、酵素標識（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、ペニシリナーゼまたはルシフェラーゼ）、化学発光物質、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメインまたはエピトープタグ）が挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、標識は、立体障害性の可能性を低下させるために、様々な長さのスペーサーアームによって結合されている。
本明細書の説明に基づき、本開示の四価抗体は、当該技術分野において知られている様々なインビトロアッセイ及びインビボアッセイに従って試験してよい。このようなアッセイとしては、例えば、四価抗体もしくはその断片が、目的のエピトープもしくはポリペプチド（例えば、ヒトＰＳＧＬ−１もしくはそのエピトープ）に結合する能力に対する結合アッセイ、または四価抗体もしくはその断片の１つ以上の機能特性に対する機能アッセイを挙げてよい。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、ヒトＰＳＧＬ−１に対する結合活性について試験してよい。いくつかの実施形態では、四価抗体のヒトＰＳＧＬ−１またはそのエピトープへの結合は、インビトロ結合アッセイで試験してよい。様々な結合アッセイが当該技術分野において知られている。このような結合アッセイは、細胞ベースのアッセイ（例えば、四価抗体が、ヒトＰＳＧＬ−１またはそのエピトープを発現している細胞に結合する能力を試験する）であっても、ポリペプチドベース（例えば、四価抗体が、ヒトＰＳＧＬ−１またはそのエピトープに結合する能力を試験する）であってもよい。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、ヒトＰＳＧＬ−１を発現している細胞（例えば、下に例示されているようなＳｐ２細胞）への結合について、フローサイトメトリー、ＦＲＥＴ、組織化学的アッセイなどによって試験する。その他の好適な結合アッセイとしては、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）解析、間接結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、免疫沈降法、ゲル電気泳動及びクロマトグラフィー（例えばゲルろ過）が挙げられるが、これらに限らない。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、ＰＳＧＬ−１の機能に関する１つ以上の機能アッセイで試験してよい。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、ヒトＰＳＧＬ−１を発現している細胞（複数可）におけるアポトーシスの誘導について試験してよい。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、標的細胞（例えば、ヒトＰＳＧＬ−１またはそのエピトープを発現している細胞）において、その四価抗体と共通するＶＨドメインまたはＶＬドメインを１つ以上有する従来の（例えば二価の）抗体（例えば親抗体）よりも、アポトーシスの誘導を増強させる。本明細書に示されているように、本開示の四価抗体は、標的細胞においてアポトーシスを誘導する効能が、共通のＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインを有する親抗体よりも高かった。アポトーシスアッセイは、当該技術分野において説明されており、当業者は容易に行うことができる（例えば、Ｍｕｐｐｉｄｉ，Ｊ．，Ｐｏｒｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．Ｍ．２００４．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｆｏｒｍｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．５９：３．１７．１−３．１７．３６を参照されたい）。アポトーシスを検出する目的で選択されるアッセイ（例えば、アネキシンＶまたはプロピジウムアイオダイド染色）は、上記の文献に例示されている。「誘導する」または「誘導」という用語は、コントロールレベルを上回るアポトーシスの開始または増大を意味する。活性化Ｔ細胞のアポトーシスは、コントロール（例えば、本明細書に記載されている抗体の非存在下または非特異的抗体の存在下での活性化Ｔ細胞のアポトーシス）と比べて、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％またはそれを超える比率で誘導できる。
本明細書に記載のアッセイであって、ＰＳＧＬ−１活性に関するアッセイで用いるのに適するＴ細胞とＴ細胞株は、容易に入手可能であり（例えば、ＡＲＲ、ＤＵ．５２８、Ｊｕｒｋａｔ、Ｈ−ＳＢ２、ＲＰＭＩ８４０２、ＣＭＬ−Ｔ１、Ｋａｒｐａｓ４５、ＫＥ−３７／ＳＫＷ−３、ＳＵＰ−Ｔ１、ＳＵＰ−Ｔ３、ＭＯＬＴ３／４、Ｐ１２−Ｉｃｈｉｋａｗａ、ＰＦ−３８２、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｋ−Ｔｌ、ＴＡＬＬ−１、ＭＯＬＴ１６／１７、ＴＡＬＬ−１０４、ＤＮＤ−４１、Ｌｏｕｃｙ、ＭＯＬＴ１３、Ｐｅｅｒ／Ｂｅｌ３、ＨＵＴ７８／Ｈ９、ＨＵＴ１０２、ＭＴ−１、ＤＥＬ、ＪＢ６、Ｋａｒｐａｓ２９９、ＳＵ−ＤＨＬ１、１２Ｈ５、３Ｄ０５４．８、３ＤＯ１１．１０、８Ｄ０５１．１５もしくは３Ｄ０１８．３）、または、当該技術分野において知られている方法を用いて容易に同定できる（例えば、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ａ．Ｍ．２００３．Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ａｎｄ Ｂ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．５５：３．５Ａ．ｌ−３．５Ａ．ｉ ｌ、Ｈａｔｈｃｏｃｋ，Ｋ．２００１．Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｂｙ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．００：３．３．１−３．３．５、Ｈｏｒｇａｎ，Ｋ．，Ｓｈａｗ，Ｓ．ａｎｄ Ｂｏｉｒｉｖａｎｔ，Ｍ．２００９．Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．８５：７．４．１−７．４．９及びＫａｎｏｆ，Ｍ．Ｅ．２００１．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．００：７．３．１−７．３．５を参照されたい）。特定的な実施形態では、細胞増殖アッセイで用いる細胞または細胞株は、ＰＳＧＬ−１を内因性発現または組み換え発現できる。細胞生存能アッセイで用いる細胞または細胞株は、ＰＳＧＬ−１を内因性発現または組み換え発現できるとともに、ＰＳＧＬ−１リガンドまたは抗ＰＳＧＬ−１抗体の結合に応答して、細胞生存能を変化させることができる。アポトーシスアッセイで用いる細胞または細胞株は、ＰＳＧＬ−１を内因性発現または組み換え発現できるとともに、ＰＳＧＬ−１リガンドまたは抗ＰＳＧＬ−１抗体の結合に応答して、アポトーシスを変化させることができる。好ましくは、その細胞または細胞株は、ヒトのものである（例えば、ＡＲＲ、ＤＵ．５２８、Ｊｕｒｋａｔ、Ｈ−ＳＢ２、ＲＰＭＩ８４０２、ＣＭＬ−Ｔｌ、Ｋａｒｐａｓ４５、ＫＥ−３７／ＳＫＷ−３、ＳＵＰ−Ｔｌ、ＳＵＰ−Ｔ３、ＭＯＬＴ３／４、Ｐ１２−Ｉｃｈｉｋａｗａ、ＰＦ−３８２、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｋ−Ｔｌ、ＴＡＬＬ−１、ＭＯＬＴ１６／１７、ＴＡＬＬ−１０４、ＤＮＤ−４１、Ｌｏｕｃｙ、ＭＯＬＴ１３、Ｐｅｅｒ／Ｂｅｌ３、ＨＵＴ７８／Ｈ９、ＨＵＴ１０２、ＭＴ−１、ＤＥＬ、ＪＢ６、Ｋａｒｐａｓ２９９またはＳＵ−ＤＨＬ１）。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、遅延型過敏症（ＤＴＨ）の阻害について試験してよい。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、（例えば、トランスビボ動物モデルにおいて、）その四価抗体と共通するＶＨドメインまたはＶＬドメインを１つ以上有する従来の（例えば二価の）抗体（例えば親抗体）よりも、ＤＴＨの阻害を増強させる。本明細書に示されているように、本開示の四価抗体は、トランスビボマウス足蹠腫脹モデルにおいて、共通のＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインを有する親抗体よりも、ＤＴＨを阻害する効能が高かった。ＤＴＨアッセイは、当該技術分野において説明されているとともに、下に例示されており、当業者は容易に行うことができる。いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、ＤＴＨ阻害効能が、コントロール（例えば、従来の抗体または二価の抗体（親抗体など）によるＤＴＨ阻害）よりも、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、またはこれを上回る比率で向上させることができる。
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞及び抗体の作製
本開示は、本明細書に記載されている四価抗体及び／またはポリペプチドのうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも提供する。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列を含む。いくつかの実施形態では、このポリヌクレオチドは、単離ポリヌクレオチド（例えば、宿主細胞または１つ以上の異なるポリヌクレオチドから単離したポリヌクレオチド）である。
本発明で提供するのは、本明細書に記載されている四価抗体またはポリペプチド構成要素（例えば、一本鎖ポリペプチド、抗体重鎖及び／または抗体軽鎖のようなモノマー）のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５及び１７〜３１から選択したポリペプチド配列をコードする。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６から選択したポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、１つ以上のイントロンを含む。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、イントロン、例えば、ｃＤＮＡまたはプロセッシングされたｍＲＮＡ配列を含まない。
遺伝暗号の縮重により、本明細書に記載されているようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が多く存在することは当業者には明らかである。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、いずれかのネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対する相同性が最小となる。したがって、コドン使用の相違により様々であるポリヌクレオチドは、本開示によって明確に想定されている。さらに、本発明で示すポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のアレルは、本開示の範囲内である。アレルは、ヌクレオチドの欠失、付加及び／または置換のような１つ以上の変異により改変される内在遺伝子である。得られるｍＲＮＡとタンパク質は、構造または機能が改変されていることがある（ただし、必ずしもその必要はない）。アレルは、標準的な技法（ハイブリダイゼーション、増幅及び／またはデータベース配列との比較など）を用いて同定できる。
また、本発明で提供するのは、例えば、コドン／ＲＮＡの最適化、異種のシグナル配列への置換、ｍＲＮＡ不安定性エレメントの除去によって最適化されているポリヌクレオチドである。コドンの変化を導入すること、及び／またはｍＲＮＡにおける阻害領域を除去することによって、組み換え発現用に、四価抗体またはそのポリペプチドをコードする最適化核酸を作製する方法は、例えば、米国特許第５，９６５，７２６号、同第６，１７４，６６６号、同第６，２９１，６６４号、同第６，４１４，１３２号及び同第６，７９４，４９８号に記載されている最適化方法を適宜に適合させることによって行うことができる。例えば、ＲＮＡ内の潜在的なスプライス部位と不安定性エレメント（例えば、Ａ／ＴまたはＡ／Ｕリッチエレメント）は、その核酸配列によってコードされるアミノ酸の改変なしに変異させて、組み換え発現用のＲＮＡの安定性を向上させることができる。改変では、例えば、同じアミノ酸に対する代替的なコドンを用いて、遺伝暗号の縮重を利用する。いくつかの実施形態では、保存的変異、例えば、元のアミノ酸と類似の化学的構造、化学的特性及び／または機能を持つ類似のアミノ酸をコードするように、１つ以上のコドンを改変するのが望ましい場合もある。このような方法は、最適化されていないポリヌクレオチドによってコードされる抗ＰＳＧＬ−１四価抗体またはそのポリペプチドの発現よりも、抗ＰＳＧＬ−１四価抗体またはそのポリペプチドの発現を増大できる。さらに、ポリヌクレオチド配列は、宿主細胞における好ましいコドン使用、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉコドン使用またはＣＨＯコドン使用に適合するように設計できる。
本明細書に記載されている四価抗体またはそのポリペプチドをコードする最適化ポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載されている四価抗体またはそのポリペプチドをコードする非最適化ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできる。具体的な実施形態では、本明細書に記載されている四価抗体またはそのポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列は、本明細書に記載されている四価抗体またはそのポリペプチドをコードする非最適化ポリヌクレオチド配列に、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。具体的な実施形態では、本明細書に記載されている四価抗体またはそのポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列は、本明細書に記載されている四価抗体またはそのポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列に、高いストリンジェンシー、中度のストリンジェンシーまたは低めのストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件に関する情報は、説明されており、例えば、米国特許出願公開第２００５／００４８５４９号（例えば、７２〜７３段落）（参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
本開示のポリヌクレオチドは、化学合成、組み換え法またはＰＣＲを用いて得ることができる。ポリヌクレオチドの化学合成方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書で詳細に説明する必要はない。当業者は、本発明で示す配列と市販のＤＮＡ合成装置を用いて、所望のＤＮＡ配列を作製できる。
組み換え方法を用いてポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドを好適なベクターに挿入でき、そして、本明細書にさらに論じられているように、複製と増幅のために、そのベクターを好適な宿主細胞に挿入できる。ポリヌクレオチドは、当該技術分野において知られているいずれかの手段によって、宿主細胞に挿入できる。細胞は、直接的な取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ接合またはエレクトロポレーションによって、外来ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換する。導入したら、外来ポリヌクレオチドは、非組み込み型ベクター（プラスミドなど）として細胞内に保持することも、宿主細胞ゲノムに組み込むこともできる。このようにして増幅したポリヌクレオチドは、当該技術分野において周知の方法によって、宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）を参照されたい。
あるいは、ＰＣＲにより、ＤＮＡ配列を増幅可能である。ＰＣＲ技術は、当該技術分野において周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号及び同第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４）に記載されている。
本開示は、本明細書に記載されているポリペプチド（抗体を含む）のうちのいずれかをコードする核酸配列を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）も提供する。好適なクローニングベクターは、標準的な技法に従って構築することができ、または、当該技術分野において入手可能な大量のクローニングベクターから選択してよい。選択するクローニングベクターは、使用するつもりの宿主細胞によって変わる場合があり、有用なクローニングベクターには概して、自己複製する能力があり、特定の制限エンドヌクレアーゼの標的を１つ有する場合があり、及び／またはそのベクターを含むクローンを選択する際に利用できるマーカーの遺伝子を有することがある。好適な例としては、プラスミドと、細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ ＳＫ＋）及びその誘導体、ｍｐｌ８、ｍｐｌ９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにシャトルベクター（ｐＳＡ３及びｐＡＴ２８など）が挙げられる。これらのベクターと多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような供給業者から入手可能である。
発現ベクターは概して、本開示によるポリヌクレオチドを含む複製可能なポリヌクレオチドコンストラクトである。発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの一体部分としてのいずれかで、宿主細胞において複製可能であることができる。好適な発現ベクターとしては、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド及び国際公開第８７／０４４６２号に開示されている発現ベクター（複数可）が挙げられるが、これらに限らない。ベクターの構成要素としては概して、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子及び好適な転写調節エレメント（プロモーター、エンハンサーまたはターミネーターなど）のうちの１つ以上を挙げてよいが、これらに限らない。発現（すなわち翻訳）には、通常、１つ以上の翻訳調節エレメント（リボソーム結合部位、翻訳開始部位または終止コドンなど）も必要である。
抗体とその抗体に由来するポリペプチドの作製方法は、当該技術分野において知られているとともに、本明細書に開示されている。十分に確立された方法を用いて、抗ＰＳＧＬ抗体（例えば、ヒトＰＳＧＬ−１に特異的に結合する抗体）を同定してよく、その抗体の可変ドメイン（例えば、ＶＨドメイン及び／またはＶＬドメイン）を本開示の四価抗体で用いてよい。例示的な抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体と、そのような抗体をスクリーニング、作製及び精製する方法は、国際公開第２０１２／１７４００１号に記載されている。
さらなる抗ヒトＰＳＧＬ−１抗体は、当該技術分野において知られている方法（国際公開第２０１２／１７４００１号及び上記の文献に記載されている方法など）を用いて同定してよい。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５），Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に記載されているようなハイブリドーマ技術を用いて調製できる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスターまたはその他の適切な宿主動物を典型的には、免疫剤（例えば、ヒトＰＳＧＬ−１またはその断片を発現する細胞）で免疫して、その免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。続いて、ポリエチレングリコールのような好適な融合剤を用いて、そのリンパ球を不死化細胞株と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３１）。不死化細胞株は通常、形質転換哺乳動物細胞、特に、齧歯動物、ウサギ、ウシまたはヒト由来のミエローマ細胞である。通常、ラットまたはマウスミエローマ細胞株を用いる。ハイブリドーマ細胞は、未融合の不死化細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を望ましくは含む好適な培養培地で培養してよい。例えば、親細胞に、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）が欠損している場合には、ハイブリドーマ用の培養培地は典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、これらの物質が、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する。
所望の不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による、抗体の安定な高レベル発現を後押しし、ＨＡＴ培地のような培地に対する感受性を有する細胞である。より望ましい不死化細胞株は、例えば、カリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ及びバージニア州マナサスのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できるマウスミエローマ株である。ヒトモノクローナル抗体の産生用では、ヒトミエローマ細胞株とマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株も説明されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８４），１３３：３００１、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１−６３）。
続いて、ハイブリドーマ細胞を培養する培養培地におけるモノクローナル抗体の存在についてアッセイできる。この抗体は、形質細胞腫細胞、多発性骨髄腫細胞、大腸癌細胞、大腸腫瘍細胞、胃癌細胞、胃腫瘍細胞、食道癌細胞または食道腫瘍細胞から得たかまたはこれらの細胞表面に発現しているＯＲＰ１５０ポリペプチドに対する特異的結合（ＯＲＰ１５０ポリペプチドの細胞外ドメインのエピトープに対する結合など）を有するかについてスクリーニングしてよい。がん細胞またはＯＲＰ１５０ポリペプチド（もしくはＯＲＰ１５０ポリペプチドの細胞外ドメインを含むその断片）をスクリーニングに用いてよい。例えば、ＲＰＭＩ８２２６細胞、Ｕ２６６細胞、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞、Ｌ３６３細胞、Ｃｏｌｏ２０５細胞、ＤＬＤ−１細胞、ＨＴ２９細胞、ＳＮＵ−１細胞、Ｋａｔｏ−ＩＩＩ細胞またはＣＥ１４６Ｔ細胞をスクリーニングに用いてよい。配列番号１７の６７３〜８００位、７０１〜８００位、６７３〜７５２位または７２３〜７３２位のアミノ酸を含むポリペプチドもスクリーニングに用いてよい。
いくつかの実施形態では、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法またはインビトロ結合アッセイ（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）によって割り出す。このような技法とアッセイは、当該技術分野において知られている。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｕｎｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｌｌａｒｄ （１９８０），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０によって割り出すことができる。
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、そのクローンを限界希釈手順によってサブクローニングして、標準的な方法によって成長させてよい（Ｇｏｄｉｎｇの上記文献）。この目的に適する培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、インビボで、哺乳動物の腹水として成長させてよい。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞を培養することによって作製でき、ハイブリドーマ細胞によって分泌された抗体をさらに単離または精製してよい。抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなど）によって培養培地または腹水から単離または精製してよい。
本開示の四価抗体またはポリペプチドは、抗体またはポリペプチドのライブラリーをスクリーニングして、例えば、ある細胞の細胞表面に発現したヒトＰＳＧＬ−１に結合する抗体またはポリペプチドを選択することによって作製してよい。当該技術分野において知られている抗体ファージディスプレイライブラリーを用いてよい。いくつかの実施形態では、ライブラリーの抗体（例えば、ファージに提示される抗体）は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片である。いくつかの実施形態では、ライブラリーの抗体（例えば、ファージに提示される抗体）は、単一ドメイン抗体である。例えば、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含んでよい。いくつかの実施形態では、ライブラリーの抗体は、ヒト抗体である。同定した抗体はさらに、当該技術分野において知られているとともに、本明細書に記載されている方法を用いて、その抗体が細胞死（例えばアポトーシス）を誘導したり、及び／またはヒトＰＳＧＬ−１に結合したりする能力について試験してもよい。
本開示の四価抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号及び同第６，３３１，４１５号に記載されているような組み換えＤＮＡ法によって作製できる。例えば、本開示の四価抗体（またはその構成要素である１本のポリペプチド、重鎖ポリペプチドもしくは軽鎖ポリペプチド）のいずれかの可変領域または定常領域をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離及び配列決定できる。本開示のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源としての役割を果たす。単離したら、ＤＮＡを発現ベクターに導入でき、そして、そのベクターをトランスフェクションしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはミエローマ細胞などの宿主細胞に、そのベクターをトランスフェクションして、その組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成する。このＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列で相同なマウス配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号）、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって改変することもできる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、キメラ二価抗体を作るために、本開示の抗体の定常ドメインで置換することも、本開示の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインで置換することもできる。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体は、２つの発現ベクターから発現させる。例えば、各発現ベクターは、本開示の二量体の一方のモノマー（例えば、一本鎖ポリペプチド、抗体重鎖ポリペプチドまたは抗体軽鎖ポリペプチド）を発現してよい。あるいは、本開示の二量体の両方のモノマーを１つの発現ベクターから発現させる。
通常、発現ベクターは、宿主細胞と適合する種に由来する転写調節配列と翻訳調節配列を有する。加えて、ベクターは通常、形質転換細胞において表現型選択を可能にする特定の遺伝子（複数可）を有する。
真核細胞用の多種多様な組み換え宿主−ベクター発現系が知られており、それらを本開示で使用できる。例えば、真核微生物の中では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、すなわち一般的なパン酵母が最も広く用いられているが、多くの他の株（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなど）が利用可能である。ＡＴＣＣから入手可能である、多細胞生物に由来する細胞株（Ｓｐ２／０またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）など）も宿主として用いてよい。真核細胞形質転換に適する典型的なベクタープラスミドは、例えば、ｐＳＶ２ｎｅｏ及びｐＳＶ２ｇｐｔ（ＡＴＣＣ）、ｐＳＶＬ及びｐＳＶＫ３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ならびにｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）である。
本開示において有用な真核宿主細胞は、例えば、ハイブリドーマ細胞、ミエローマ細胞、形質細胞腫細胞またはリンパ腫細胞である。しかしながら、他の真核宿主細胞を好適に用いてもよい。ただし、哺乳動物宿主細胞が、タンパク質発現のための転写ＤＮＡ配列と翻訳ＤＮＡ配列を認識でき、リーダー配列の切断と、タンパク質の分泌によって、リーダーペプチドを処理でき、タンパク質の翻訳後修飾、例えば糖鎖付加をもたらすことができることを条件とする。
したがって、本開示は、本明細書に開示されているＤＮＡコンストラクトを含む組み換え発現ベクターによって形質転換されるとともに、本開示の四価抗体またはポリペプチドを発現できる宿主細胞（例えば真核宿主細胞）を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の形質転換宿主細胞は、本開示のポリヌクレオチド、または本開示のモノマー、二量体もしくは四価抗体を発現するポリヌクレオチドと、抗体もしくはポリペプチドの発現を指示するように、コードＤＮＡ配列に関連付けられて配置されている転写調節配列及び翻訳調節配列とを含む少なくとも１つのＤＮＡコンストラクトを含む。
目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的で、異種のＤＮＡを過剰発現できるいずれの宿主細胞も用いることができる。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞及びＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限らない。国際公開第８７／０４４６２号も参照されたい。哺乳動物以外の好適な宿主細胞としては、原核生物（Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓなど）及び酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅまたはＫ．ｌａｃｔｉｓなど）が挙げられる。
本開示で用いる宿主細胞は、様々な方法で、当該技術分野において周知の標準的なトランスフェクション手順によって形質転換してよい。用いてよい標準的なトランスフェクション手順には、エレクトロポレーション法、プロトプラスト融合及びカルシウム−ホスフェート沈殿法がある。このような技法は概して、Ｆ．Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．（１９８６），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：７０３−７０６、Ｇ．Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９８７），１５：１３１１−１３２５、Ｄ．Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９），７９：７８６２−７８６５及びＶ．Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：８２５−８２９に記載されている。目的のポリヌクレオチドを含むベクターは、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、カルシウムホスフェート、ＤＥＡＥ−デキストランまたはその他の物質を用いるトランスフェクション、マイクロプロジェクタイルボンバードメント、リポフェクション、及び感染（例えば、そのベクターが、ワクシニアウイルスのような感染性物質である場合）を含め、数多くの適切な手段のうちのいずれかによって、宿主細胞に導入できる。導入ベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、宿主細胞の特徴に左右されることが多い。
２つの発現ベクターの場合、その２つの発現ベクターは、宿主細胞に１つずつ別々にまたは一緒に（コトランスファーまたはコトランスフェクション）導入できる。
本開示は、抗体またはポリペプチドの作製方法であって、その抗体またはポリペプチドをコードする発現ベクター（複数可）を含む宿主細胞を培養することと、当業者に周知の方法によって、その培養液から抗体またはポリペプチドを回収することを含む方法も提供する。
さらに、所望の抗体は、トランスジェニック動物で産生できる。好適なトランスジェニック動物は、適切な発現ベクターを卵にマイクロインジェクションすることと、その卵を偽妊娠雌に導入することと、所望の抗体を発現する子孫を選択することを含む標準的な方法に従って得ることができる。
本開示は、ヒトＰＳＧＬ−１に特異的に結合するキメラ四価抗体も提供する。例えば、その四価抗体の可変領域と定常領域は、別の種のものである。いくつかの実施形態では、重鎖と軽鎖の両方の可変領域は、本明細書に記載されているマウス抗体のものである。本開示のキメラ抗体は、当該技術分野において十分に確立された技法によって調製できる。例えば、米国特許第６，８０８，９０１号、米国特許第６，６５２，８５２号、米国特許第６，３２９，５０８号、米国特許第６，１２０，７６７号及び米国特許第５，６７７，４２７号（それぞれ、参照により、本明細書に援用される）を参照されたい。概して、キメラ抗体は、その抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを得て、真核宿主細胞に導入すると本開示のキメラ抗体を発現する発現ベクターに、そのｃＤＮＡを挿入することによって調製できる。望ましくは、いずれの可変重鎖配列または可変軽鎖配列も容易に発現ベクターに挿入できるように、発現ベクターは、機能的に完全な定常重鎖配列または定常軽鎖配列を有する。
本開示は、ヒトＰＳＧＬ−１に特異的に結合するヒト化四価抗体を提供する。このヒト化抗体は典型的には、ＣＤＲの残基が、ヒト以外の種（マウス、ラットまたはウサギなど）のＣＤＲの残基であって、所望の特異性、親和性及び能力を有する残基と置き換えられているヒト抗体である。いくつかのケースでは、このヒト抗体のＦｖフレームワーク残基は、ヒト以外の対応する残基に置き換えられている。
モノクローナル抗体をヒト化するには、４つの一般的な工程が存在する。（１）出発抗体の軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインのヌクレオチドと予測アミノ酸配列を割り出すことと、（２）ヒト化抗体を設計すること、すなわち、ヒト化プロセスにおいて、どの抗体フレームワーク領域を用いるかを決定することと、（３）実際のヒト化方法／技法と、（４）ヒト化抗体のトランスフェクションと発現が存在する。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、同第５，８０７，７１５号、同第５，８６６，６９２号、同第６，３３１，４１５号、同第５，５３０，１０１号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、同第５，５８５，０８９号、同第６，１８０，３７０号及び同第６，５４８，６４０号を参照されたい。例えば、定常領域を操作して、ヒト定常領域にさらに近づけて、抗体をヒトでの臨床試験と治療で用いる場合に、免疫応答を回避してよい。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号及び同第５，８６６，６９２号を参照されたい。
抗体は、抗原に対する高い親和性とその他の有益な生物学的特性を保った状態でヒト化することが重要である。この目的を達成するために、ヒト化抗体は、親配列とヒト化配列の３次元モデルを用いて、親配列と様々な概念的ヒト化生成物を解析するプロセスによって調製できる。３次元免疫グロブリンモデルは広く入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択した免疫グロブリン配列候補の考え得る３次元コンフォメーション構造を例示及び提示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの提示を検証することにより、免疫グロブリン配列候補の機能における、残基の考えられる役割を解析可能になり、すなわち、免疫グロブリン候補がその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基を解析可能になる。このようにして、ＦＲ残基を選択して、コンセンサス配列からインポート配列まで組み合わせて、所望の抗体特性（標的抗原（複数可）に対する親和性の向上など）を実現するようにできる。概して、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接、かつ最も実質的に関与する。ヒト化抗体は、抗体の１つ以上の特性を改善するために、ヒンジ領域においても改変部を含んでよい。
別の代替形態では、抗体は、ファージディスプレイ技術によって、スクリーニングして、組み換え作製してよい。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，５８０，７１７号、同第５，７３３，７４３号、同第６，２６５，１５０号及びＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５（１９９４）を参照されたい。あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３（１９９０））を用いて、非免疫ドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体と抗体断片をインビトロで作製できる。この技法に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子をインフレームで、繊維状バクテリオファージ（Ｍ１３またはｆｄなど）のメジャーコートタンパク質遺伝子またはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかにクローニングし、ファージ粒子の表面に、機能的抗体断片として提示させる。この線維状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的特性に基づき選択することによっても、その特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択される。すなわち、ファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、様々なフォーマットで行うことができる。概説は、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３，５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。ファージディスプレイには、Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源を用いることができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）では、免疫マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小ランダムコンビナトリアルライブラリーから、多種多様な抗オキサゾロン抗体が単離された。Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）またはＧｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されている技法に本質的に従って、非免疫ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーを構築できるとともに、多種多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を単離できる。天然の免疫応答では、抗体遺伝子は、高い比率で変異を蓄積する（体細胞超変異）。導入される変化のいくつかは、親和性の向上をもたらすことになり、親和性の高い表面免疫グロブリンを示すＢ細胞が優先的に複製され、後の抗原チャレンジの際に分化する。この天然のプロセスは、「鎖シャフリング」として知られている技法を用いることによって模倣できる。Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９−７８３（１９９２））。この方法では、ファージディスプレイにより得られた「初代」ヒト抗体の親和性は、重鎖Ｖ領域遺伝子及び軽鎖Ｖ領域遺伝子を、非免疫ドナーから得たＶドメイン遺伝子の天然のバリアント（レパートリー）のレパートリーと順次置換することにより向上させることができる。この技法により、ｐＭ〜ｎＭの範囲の親和性を有する抗体及び抗体断片の作製が可能になる。大量のファージ抗体レパートリー（「全ライブラリーの母体」としても知られている）を作製するための方策は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３）によって記載されている。遺伝子シャッフリングを用いて、齧歯動物抗体からヒト抗体を誘導することもでき、この場合、そのヒト抗体は、出発齧歯動物抗体と同程度の親和性と特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも称されるこの方法によると、ファージディスプレイ技法により得られた齧歯動物抗体の重鎖Ｖドメイン遺伝子または軽鎖Ｖドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーに置き換えられ、齧歯動物−ヒトキメラが作られる。抗原に基づく選択により、機能的抗原結合部位を再現できるヒト可変領域が単離され、すなわち、エピトープが、パートナーの選択を決定（インプリント）する。残存する齧歯動物Ｖドメインを置き換えるために、このプロセスを繰り返すと、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開された国際公開第９３／０６２１３号を参照されたい）。この技法は、ＣＤＲの移植によって齧歯動物抗体をヒト化する従来のものとは異なり、齧歯動物由来のフレームワークまたはＣＤＲ残基を有さない完全にヒト型の抗体をもたらす。上記の考察はヒト化抗体に関するものであるが、考察した一般的原理は、例えばイヌ、ネコ、霊長動物、ウマ、及びウシで使用するために抗体をカスタマイズするのに適用可能であることは明らかである。
特定の実施形態では、抗体は、完全ヒト抗体である。抗原に特異的に結合する、ヒト以外の抗体を用いて、その抗原に結合する完全ヒト抗体を作製できる。例えば、ヒト以外の抗体の重鎖と、異なるヒト軽鎖を発現する発現ライブラリーとを共発現させる鎖交換法を当業者は用いることができる。続いて、１本のヒト軽鎖と、１本のヒト以外の重鎖とを含む得られたハイブリッド抗体を抗原結合についてスクリーニングする。そして、抗原結合に関与する軽鎖をヒト抗体重鎖のライブラリーと共発現させる。得られたヒト抗体を抗原結合について、もう一度スクリーニングする。このような技法は、米国特許第５，５６５，３３２号にさらに説明されている。加えて、抗原を用いて、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物に接種できる。例えば、米国特許第５，６６１，０１６号を参照されたい。
本開示は、二重特異性抗体も提供する。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原（異なるエピトープを含む）に対して結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗体は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合する２つ以上の異なるＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、この２つ以上の異なるＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインは、ＰＳＧＬ−１の同じエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、２つ以上の異なるＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインは、ＰＳＧＬ−１の異なるエピトープに特異的に結合し、これらのエピトープは、重複するエピトープであってもなくてもよい。
二重特異性抗体（少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体）は、本明細書に開示されている抗体を用いて調製できる。二重特異性抗体の作製方法は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０を参照されたい）。従来は、二重特異性抗体の組み換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対と、特異性の異なる２本の重鎖との共発現をベースとしていた（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０５，５３７−５３９）。いくつかの実施形態では、二重特異性四価抗体は、上に例示されている方法を用いて作製してよい。
二重特異性抗体を作製するアプローチの１つによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。いくつかの実施形態では、この融合は、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。いくつかの実施形態では、融合体の少なくとも１つに、軽鎖の結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在する。免疫グロブリン重鎖融合体と、所望に応じて、免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡを別個の発現ベクターに挿入し、好適な宿主生物にコトランスフェクションする。これにより、構築の際に用いる３つのポリペプチド鎖の不均等な比率によって、最適な収量を得られる実施形態において、これらの３つのポリペプチド断片の相互比率を調節する際の優れた柔軟性が得られる。しかしながら、少なくとも２つのポリペプチド鎖を等しい比率で発現させると、高い収率が得られるとき、または比率が特に重要ではないときには、１つの発現ベクターに、２つまたは３つすべてのポリペプチドのコード配列を挿入することも可能である。
共有結合した２つのモノマーまたは抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体も、本開示の範囲内である。このような抗体は、免疫系細胞を不要な細胞にターゲティングしたり（米国特許第４，６７６，９８０号）、ＨＩＶ感染を治療したり（国際公開第９１／００３６０号及び同第９２／２００３７３号、ならびにＥＰ０３０８９号）するのに用いられている。ヘテロコンジュゲート抗体は、いずれかの利便的な架橋法を用いて作製してもよい。好適な架橋剤と技法は、当該技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されている。
本開示の特定の態様は、抗体可変ドメイン及び／または抗体断片、例えば、本明細書に記載されている四価抗体の構成要素として用いてよい抗体可変ドメイン及び／または抗体断片に関するものである。抗体断片は、抗体の活性結合領域（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ断片など）を含んでよい。当該技術分野において知られている様々な方法を用いて、例えば、本明細書に記載されている概念に基づき、当該技術分野において知られている標準的な組み換え技法によって、本開示の四価抗体に組み込んでよい抗体断片を作製及び／または単離してよい。
一本鎖Ｆｖ断片は、Ｉｌｉａｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４０９：４３７−４４１に記載されているようになどして作製してよい。様々なリンカーを用いて、このような一本鎖断片を結合することは、Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０：４２３−４３３に記載されている。抗体の組み換え産生及び操作のための様々な技法は、当該技術分野において周知である。このような断片は、当該技術分野において十分に確立されている技法を用いて、本明細書に記載されているモノクローナル抗体から作製できる（Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８６），ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１：６６３−６９ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。
抗体断片の調製方法は、当該技術分野において周知である。例えば、抗体断片は、抗体をペプシンで酵素的に切断して、Ｆ（ａｂ’）２と称される１００Ｋｄの断片をもたらすことによって作製できる。この断片は、チオール還元剤と、任意に応じて、ジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基に対するブロック基を用いて、さらに切断して、５０ＫｄのＦａｂ’一価断片を作製できる。あるいは、パパインを用いる酵素的切断によって、２つの一価Ｆａｂ断片とＦｃ断片が直接作られる。これらの方法は、例えば、米国特許第４，０３６，９４５号及び同第４，３３１，６４７号、ならびに本明細書に含まれている参照文献（これらの特許は、参照により、本明細書に援用される）によって説明されている。また、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９６０），Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０、Ｐｏｒｔｅｒ（１９５９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９、Ｓｍｙｔｈ（１９６７），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１：４２１−４２６を参照されたい。あるいは、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用の発現ベクターまたは真核生物用の発現ベクターに挿入し、そのベクターを原核生物または真核生物に導入して、Ｆａｂを発現させることによって作製できる。
ＩＶ．方法及び使用
本開示の特定の態様は、本明細書に記載されている四価抗体の方法及び使用に関するものである。これらの方法と使用は少なくとも部分的に、本明細書に記載されているような四価抗体の特性（エピトープ結合ドメイン数の増加、インビトロ及び／もしくはインビボにおける架橋依存性が低下する可能性、アポトーシス（例えば、ヒトＰＳＧＬ−１発現細胞のアポトーシス）を誘導する効能の差、ならびに／またはインビボもしくはトランスビボでの有効性の向上が挙げられるが、これらに限らない）に基づいている。
本明細書に記載されているように、ＰＳＧＬ−１は、炎症とＴ細胞の生態に関与することが知られている。ヒトＰＳＧＬ−１に特異的に結合する本開示の四価抗体は、とりわけ、Ｔ細胞の機能に関連する疾患（例えばＴ細胞媒介炎症性疾患）を有する個体、または免疫学的反応のような炎症状態を引き起こすことができるか、このような炎症状態を事前に管理する医療処置（例えば、移植または輸血）を必要とする個体を治療するのに使用できる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法によって治療する障害または疾患は、Ｔ細胞媒介炎症性疾患であってよい。本明細書に記載されている四価抗体を用いて治療できるか、または本明細書に記載されている四価抗体を用いて、その症状のうちの１つ以上を改善もしくは予防してよい障害及び疾患の非限定的な例としては、乾癬、クローン病、強直性脊椎炎、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症及び乾癬性関節炎を含む）、真性糖尿病、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性ループスエリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、シェーグレン症候群、アフター性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、ぜんそく、アレルギー性ぜんそく、皮膚ループスエリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい反転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ぶどう膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ぶどう膜炎、間質性肺線維症、アトピー性アレルギーなどのアレルギー、ＡＩＤＳ、ならびにＴ細胞性腫瘍（白血病またはリンパ腫など）が挙げられる。いくつかの実施形態では、この疾患は、自己免疫疾患である。
別の実施形態では、本明細書に記載されている方法に従って治療する疾患または障害は、尋常性乾癬である。尋常性乾癬（ｐｌａｑｕｅ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）または尋常性乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）は、乾癬の最も一般的な形態であり、境界明瞭な盛り上がった紅斑性の皮膚斑が銀色の鱗屑によって覆われた状態によって特徴付けられる。四肢の伸筋面、腰仙区域及び頭皮に影響を及ぼす病変の好発が見られる。対応する組織病理学的な所見としては、真皮及び表皮の重大な炎症性細胞浸潤、拡張血管数の増加、角化細胞の分化異常による、表皮の大幅な肥厚、ならびに角化症が挙げられる。尋常性乾癬患者のおよそ３分の１が、中程度または重度の疾患と分類され、その結果、単なる局所治療を超えた療法の対象候補となる。
別の実施形態では、本明細書に記載されている方法に従って治療する障害は、慢性尋常性乾癬である。尋常性慢性乾癬の症状としては、体のいずれかの部分（膝、肘、腰仙領域、頭皮及び爪が挙げられるが、これらに限らない）の皮膚に、コインのサイズ以上の盛り上がった発赤斑が１つまたは複数できることが挙げられるが、これらに限らない。
別の実施形態では、本明細書に記載されている方法に従って治療する障害は、滴状乾癬である。滴状乾癬の症状としては、連鎖球菌感染のような感染後に、皮膚に、鱗屑を伴う水滴形状の斑が拡大することが挙げられるが、これらに限らない。
別の実施形態では、本明細書に記載されている方法に従って治療する疾患または障害は、逆乾癬である。逆乾癬の症状としては、腋窩、鼠径部、乳房の下、ならびに生殖器及び臀部周囲の皮膚ひだという体の部分のうちの１つ以上で、尋常性乾癬に伴う鱗屑とは異なり、滑らかで、通常は湿潤区域の皮膚が発赤及び炎症を起こすことが挙げられるが、これらに限らない。
別の実施形態では、本明細書に記載されている方法に従って治療する疾患または障害は、膿疱性乾癬である。膿疱性乾癬の症状としては、サイズと位置が様々であるが、大半は、手と足に見られる膿疱が挙げられるが、これらに限らない。
別の実施形態では、本明細書に記載されている方法に従って治療する疾患または障害は、乾癬性紅皮症である。乾癬性紅皮症の症状としては、皮膚の周期的で広範な激しい発赤と、小さい鱗屑ではなく、シート状の鱗屑の落屑が挙げられるが、これらに限らない。皮膚の発赤と落屑には、激しいかゆみと痛み、心拍数の増加及び体温の変動が伴うことが多い。
別の実施形態では、本明細書に記載されている方法に従って治療する疾患または障害は、関節リウマチである。関節リウマチの症状としては、疲労感、食欲不振、微熱、リンパ節の腫れ、だるさ、手首、肘、肩、臀部、ひざ、足首、足指、あご、手、足、手指及び／もしくは頸部の関節痛、朝のこわばり、呼吸時の胸痛（胸膜炎）、目の痛み、目のかゆみ、眼脂、皮膚の下の結節、手足のしびれ、刺痛、または灼熱痛が挙げられる。
別の実施形態では、本明細書に記載されている方法に従って治療する疾患または障害は、クローン病である。クローン病の症状は、けいれん性の腹痛（腹部痛）、発熱、疲労感、食欲不振、便通痛（しぶり）、持続性の水様性下痢、意図しない体重減少、便秘、目の炎症、フィステル（通常、直腸区域の周辺のフィステルが原因で、膿汁、粘液または便が排出されることがある）、関節痛、肝臓炎症、口内炎、直腸出血、血便、皮膚のしこりまたは腫れ物（潰瘍）、及び歯肉の腫れであるが、これらに限らない。
別の実施形態では、本明細書に記載されている方法に従って治療する疾患または障害は、強直性脊椎炎である。強直性脊椎炎の症状としては、下背部及び臀部、脊柱ならびに／または頸部の頻回の痛みとこわばり、肋骨、肩甲骨、臀部、大腿部及びかかとに広がる痛みと圧痛、目の炎症（虹彩毛様体炎及びぶどう膜炎）、発赤、眼痛、失明、フローター及び光恐怖症、疲労感、ならびに悪心が挙げられるが、これらに限らない。
別の実施形態では、本明細書に記載されている方法に従って治療する疾患または障害は、真性糖尿病である。真性糖尿病の症状としては、体重減少、多尿症（頻尿）、多渇症（口渇増大）、多食症（空腹増大）、心血管疾患、糖尿病性網膜障害、糖尿病性神経障害、高浸透圧性非ケトン状態及び糖尿病性ケトアシドーシスが挙げられるが、これらに限らない。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体または組成物は、移植の前、移植と同時、及び／または移植の後に、個体に投与してよい。例えば、下にさらに詳細に記載されているように、移植が完了する前に、移植が完了するのと同時に、または移植が完了した後に、本開示の四価抗体または組成物を投与して、良好な治療転帰の可能性を高めたり、不良な転帰の可能性を低下させたり、及び／または症状もしくは不良な転帰が出るのを緩和もしくは予防したりしてよい。
本明細書で使用する場合、移植を必要とする個体の治療とは、治療的処置と、予防的または防止的手段（例えば、良好な治療転帰（移植片の生存、移植片の機能など）の可能性を高めること、または不良な転帰（治療に対する不良な応答、もしくは良好に治療（移植など）を行える可能性を低下させる状態など）の可能性を低下させることのうちの１つ以上を指してよい。治療としては、障害もしくは状態と関連する状態及び症状、ならびに／または疾患もしくは状態の治療選択肢を個体が利用するのを妨げたり制限したりする問題もしくは状態（感作、過感作、既存抗体検査（ＰＲＡ）結果レベルが高い、及び／または移植を待っている個体における移植片の有用性を制限する既存同種抗体の存在など）の緩和または予防を挙げてよいが、これらに限らない。治療の必要な者としては、すでに障害または状態に罹患している者と、疾患または状態を予防すべき者が挙げられる。疾患または状態の治療は、障害もしくは状態と関連する免疫媒介性のイベントを抑制したり、障害もしくは状態の症状を改善したり、障害もしくは状態の重症度を低下させたり、障害もしくは状態の進行の経過を変化させたり、及び／または基礎的な障害もしくは状態を改善もしくは治癒したりできる。
例えば、移植を待っている個体の奏功な治療としては、同種抗体のレベルを低下させること、既存抗体検査結果（ＰＲＡ）を低下させること、個体がより多くの交差適合ドナーを得られるようにすること、個体が移植を受ける可能性もしくは確率を向上させること、個体の予測移植待機期間を短縮すること、個体を脱感作すること、移植関連症状もしくは状態（下記のような免疫媒介性イベントなど）のリスクを低下させること、またはこれらをいずれかに組み合わせたものが挙げられるが、これらに限らない。
例えば、移植を受けた個体の奏功な治療としては、移植した器官または組織を長期間保護または維持することが挙げられるが、これらに限らず、この保護または維持には、器官移植と関連する１つ以上の症状または望ましくない状態（症状または状態の機能的または組織学的な徴候によって測定した場合の免疫媒介性イベント（ドナー特異的同種抗体（ＤＳＡ）の産生、ＧＶＨＤ、抗体媒介性拒絶反応（ＡＭＲ）、超急性移植片拒絶反応、慢性移植片拒絶反応、移植不全及び移植片喪失が挙げられるが、これらに限らない）など）を制御、逆転、緩和、遅延または予防することが含まれる。障害または状態（例えば移植片拒絶反応）を制御できる治療としては、障害または状態（例えば移植片拒絶反応）の機能的または組織学的な徴候が観察された後に開始する場合には、疾患プロセスの進行を遅らせる治療を挙げてよい。さらに、疾患または状態（例えば移植片拒絶反応）を逆転できる治療としては、障害または状態（例えば移植片拒絶反応）の機能的または組織学的な徴候が現れた後に開始する場合には、疾患プロセスを逆転させるとともに、機能的及び組織学的な所見を正常に近い状態に戻す治療を挙げてよい。障害または状態（例えば移植片拒絶反応）の「進行を遅延させる」ことができる治療としては、障害または状態（例えば移植片拒絶反応）の発現を延期したり、妨害したり、遅くしたり、遅らせたり、安定化したり及び／または延ばしたりすることを挙げてよい。この遅延は、治療する疾患及び／または個体の履歴に応じて、様々な時間長の遅延であることができる。当業者には明らかなように、十分または有意な遅延は、実際には、個体、例えば、障害または状態を発現するリスクのある個体が、障害または状態を発現しないという点で、予防を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本開示の移植は、１つ以上の組織または器官（骨髄、腎臓、心臓、肝臓、ニューロン組織、肺、膵臓、皮膚、ならびに腸（例えば、小腸及び／または大腸と、それらのいずれかの副組織）が挙げられるが、これらに限らない）の移植であってよい。
加えて、本発明の四価抗体は、健常な個体または特定の障害もしくは疾患を有さない個体で見られる活性化Ｔ細胞の増殖及び／または数よりも、活性化Ｔ細胞の増殖及び／または数が増大することに（完全または部分的に）関連または起因する特定の障害及び疾患を予防及び／または治療するのに有用である。本明細書に記載されている四価抗体を用いて予防及び／または治療できる障害及び疾患の非限定的な例としては、移植片対宿主病と、骨髄移植、肝臓移植、腎臓移植またはいずれかの器官もしくは組織の移植などの移植拒絶反応（同種異系組織または異種組織を用いた場合の移植拒絶反応を含む）の症例が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示の四価抗体または組成物は、輸血の前、輸血と同時及び／または輸血の後に個体に投与してよい。例えば、下にさらに詳細に記載されているように、輸血が完了する前、輸血が完了するのと同時、または輸血が完了した後に、本開示の四価抗体または組成物を投与して、良好な治療転帰の可能性を高めたり、不良な転帰の可能性を低下させたり及び／または生じている症状を緩和もしくは予防したりしてよい。
本明細書で使用する場合、輸血を必要とする個体の治療とは、治療的処置と、予防的または防止的手段（例えば、良好な治療転帰（血液成分／細胞の置換または補充など）の可能性を高めること、または不良な転帰（治療に対する不良な応答、治療の無効果、もしくは免疫学的な反応、または良好に治療（輸血など）を行える可能性を低下させる状態など）の可能性を低下させること）のうちの１つ以上を指してよい。治療としては、障害もしくは状態と関連する状態及び症状、及び／または障害もしくは状態の治療選択肢を個体が利用するのを妨げたり制限したりする問題もしくは状態を緩和または予防することを挙げてよいが、これらに限らない。治療の必要な者としては、すでに障害または状態に罹患している者と、障害または状態を予防すべき者が挙げられる。疾患または状態の治療は、障害もしくは状態と関連する免疫媒介性のイベントを抑制したり、障害もしくは状態の症状を改善したり、障害もしくは状態の重症度を低下させたり、障害もしくは状態の進行の経過を変化させたり、及び／または基礎的な障害もしくは状態を改善もしくは治癒したりできる。
いくつかの実施形態では、輸血は、白血球、赤血球及び血小板のうちの１つ以上を含む輸血である。いくつかの実施形態では、輸血は、全血または１つ以上の血液製剤（白血球、赤血球、血小板、新鮮凍結血漿、クリオプレシピテートもしくは血液凝固因子、抗体、及び／または代用血液が挙げられるが、これらに限らない）を含む。輸血（例えば、血液または血液製剤の輸血）によって治療してよい例示的な状態としては、出血または失血、ヘマトクリットまたはヘモグロビンの低下（例えば貧血）、鎌状赤血球症、サラセミア、外科手術中または後の血液補充、心疾患、外傷性損傷、１つ以上の血液因子の欠乏（例えば、血友病、フォンビルブランド病、低フィブリノゲン血症、または第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子もしくは第ＸＩ因子の欠乏など）、フィブリノゲンの補充を必要とする状態（例えば、肝疾患、輸血など）、骨髄不全、血小板機能障害、血小板減少症、免疫不全（例えば、治療または疾患によるもの）などが挙げられるが、これらに限らない。輸血に関連する実施、投与量、応答、適応及び調製の説明は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓに見ることができる。
本明細書に記載されている方法による四価抗体またはポリペプチドの投与は、例えば、レシピエントの生理的状態、投与目的が治療であるか予防であるか、及び当業者に知られているその他の要因に応じて、持続投与であることも、間欠投与であることもできる。抗体またはポリペプチドの投与は、所定の期間にわたり本質的に持続しても、一連の投与間隔で行ってもよい。
本明細書に記載されている投与用量と投与頻度の四価抗体またはその医薬組成物は、副作用を最小限にしながら、予防及び／または治療方法に従って投与する。本明細書に記載されている四価抗体であって、特定の対象に投与すべき四価抗体またはその医薬組成物の正確な用量は、医療施術者であれば、治療を必要とする対象に関連する要因に鑑みて割り出すことができる。考慮できる要因としては、疾患状態の重症度、対象の全身健康状態、対象の年齢及び体重、食事、投与の時間及び頻度、他の治療剤または薬物との組み合わせ（複数可）、反応感度、ならびに療法に対する耐性／応答性が挙げられる。抗体もしくは抗体由来の抗原結合断片が十分なレベルが供給されるか、または所望の作用が維持されるように、本明細書に記載されている四価抗体またはその医薬組成物の投与量と投与頻度は、時間の経過とともに調節できる。
製剤で用いる正確な用量も、投与経路と、炎症性障害または疾患の重症度に左右されることになるとともに、医療施術者の判断と、各患者の状況に従って決定する必要がある。
有効な用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から導き出した用量応答曲線から推定できる。
一実施形態では、本明細書に記載されている組成物のいずれかは、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射もしくは筋肉内注射による投与、または経口投与、粘膜投与、吸入投与、舌下投与などのようなその他の形態の投与用に調合する。非経口投与は、一実施形態では、皮下注射、筋肉内注射または静脈内注射のいずれかによって特徴付けられ、本発明で想定されている。注射剤は、液体溶剤もしくは懸濁剤、注射前に液体に溶解もしくは懸濁するのに適する固体形態、または乳剤のいずれかとして、従来の形態で調製できる。注射剤、液剤及び乳剤は、１つ以上の賦形剤も含む。好適な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールである。加えて、所望に応じて、投与する医薬組成物は、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解促進剤及びその他の同様の作用剤のような無毒の補助物質を少量含むこともできる。その他の投与経路としては、腸内投与、脳内投与、経鼻投与、動脈内投与、心臓内投与、骨内注入、髄腔内投与、静脈内注入、皮下埋入、皮下注射、筋肉内投与、直腸内投与、膣内投与、胃内投与、気管内投与、肺内投与及び腹腔内投与を挙げてよい。非経口投与用調製剤としては、すぐに注射できる滅菌液剤、使用直前に溶媒と組み合わせるようになっている滅菌乾燥可溶性生成物（凍結乾燥粉末など）が挙げられ、すぐに注射できる滅菌懸濁剤と、使用直前にビヒクルと組み合わせるようになっている滅菌乾燥不溶性生成物と、滅菌乳剤が含まれる。これらの溶剤は、水性であることも非水性であることもできる。静脈内投与する場合、好適な担体としては、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水、ならびにグルコース、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのような増粘剤と可溶化剤を含む溶液、ならびにこれらの混合物が挙げられる。
別の実施形態では、本開示は、本開示の抗体またはポリペプチドであって、検出可能な標識、治療剤または細胞障害剤のような他の分子にコンジュゲートした抗体またはポリペプチドを含む組成物の投与も想定している。これらの作用剤としては、放射線同位体、毒素、トキソイド、炎症性物質、酵素、アンチセンス分子、ペプチド、サイトカイン及び化学療法剤を挙げてよいが、これらに限らない。抗体をこのような分子とコジュゲートする方法は概して、当業者に知られている。例えば、国際公開第９２／０８４９５号、同第９１／１４４３８号、同第８９／１２６２４号、米国特許第５，３１４，９９５号及びＥＰ３９６，３８７を参照されたい。
一実施形態では、この組成物は、細胞障害剤にコンジュゲートした抗体またはポリペプチドを含む。細胞障害剤としては、細胞に有害であるいずれかの物質を挙げることができる。抗体または断片にコンジュゲートできる例示的なクラスの細胞障害剤としては、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン及びこれらの類似体またはホモログを挙げてよいが、これらに限らない。
Ｖ．医薬組成物
本開示は、本明細書に記載されている四価抗体またはポリペプチドと、製薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。この医薬組成物は、例えば、本開示の方法、使用及び／またはキットで使用できる。
製薬学的に許容可能な担体または賦形剤は、当該技術分野において知られており、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形状もしくは粘度を持たせたり、または希釈剤としての役割を果たしたりできる。好適な賦形剤としては、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、封入剤、緩衝剤及び皮膚浸透促進剤が挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、本明細書に記載されている四価抗体は、液体医薬組成物中のものである。製薬学的に投与可能な液体組成物は、例えば、本明細書に記載されている抗体を、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコール、エタノールなどのような担体で溶解するか、分散させるかまたは別段に混合することで、溶液または懸濁液を形成することによって調製できる。所望に応じて、投与する医薬組成物は、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤及びｐＨ緩衝剤などのような無毒の補助物質を少量含むこともできる。賦形剤と、非経口用薬物と非経口用以外の薬物を送達するための製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に示されている。
本明細書に記載されている四価抗体を好適な量含む滅菌非経口用液剤または懸濁剤のように、投与単位形態でヒトと動物に投与するために、医薬組成物を提供する。この四価抗体は、一実施形態では、単位投与形態または複数回投与形態で調合及び投与する。単位投与形態とは、本明細書で使用する場合、当該技術分野において知られているように、ヒト及び動物の対象に適するとともに、個別に包装された物理的に別個の単位を指す。各単位用量には、必要な製剤用担体、ビヒクルまたは希釈剤と併せて、所望の治療効果をもたらすのに十分な抗体または抗体由来の抗原結合断片が所定量含まれる。単位投与形態の例としては、アンプルとシリンジが挙げられる。単位投与形態は、分割して投与することも、複数投与することもできる。複数回投与形態は、単位投与形態を分割して投与するように、同じ単位投与形態が複数、１つの容器に包装されているものである。複数回投与形態の例としては、バイアル、または数パイントもしくは数ガロンのボトルが挙げられる。すなわち、複数回投与形態は、包装の際に、複数回分の単位用量を分割せずに入れたものである。
医薬組成物中の四価抗体の濃度は、例えば、抗体または抗体由来の抗原結合断片の物理化学的な特徴、投与スケジュール、投与量、及び当業者に知られているその他の要因に左右されることになる。いくつかの実施形態では、医薬組成物により、四価抗体は、体重１キログラムに対して１日当たり約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇの用量で供給される。医薬品投与単位形態は、投与単位形態当たり、約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇ及び／またはその他の任意の必須成分を組み合わせたものが供給されるように調製できる。
いくつかの実施形態では、本開示は、医薬としての使用及び／または医薬を製造するための使用の関連かを問わず、本明細書に記載されている方法のいずれかで用いる四価抗体と組成物（本明細書に記載されている医薬組成物など）を提供する。
ＶＩ．キット
本開示の特定の態様は、本開示の四価抗体を含むキットまたは製品に関するものである。任意に応じて、本明細書に記載されているキットは、製薬学的に許容可能な担体（本明細書に記載されている例示的な担体など）を１つ以上含んでよい。いくつかの実施形態では、本開示のキットは、本開示の医薬組成物を含む。本明細書に記載されているキットは、例えば、本開示の方法または使用で使用できる。
キットは任意に応じて、緩衝剤及び説明的な情報のような追加の構成要素を供給してよい。通常、このキットは、容器と、その容器上または容器に付随のラベルまたは添付文書（複数可）を含む。容器は、単位用量、バルク包装体（例えば、複数回用量包装体）または副単位用量であってよい。本開示のキットに供給される説明は典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれている紙葉）に書かれた説明文であるが、機械読み取り可能な説明（例えば、磁気ディスクまたは光記憶ディスクに記録した説明）も許容可能である。
いくつかの実施形態では、キットは、四価抗体を投与してＴ細胞媒介炎症性疾患を治療することに関する説明を含む添付文書をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、輸血もしくは移植の前、輸血もしくは移植と同時及び／または輸血もしくは移植の後に四価抗体を投与することに関する説明を含む添付文書をさらに含む。
本開示のキットは、好適な包装体に入っている。好適な包装体としては、バイアル、ボトル、ジャー、可撓性の包装体（例えば、密封マイラーまたはプラスチックバッグ）などが挙げられるが、これらに限らない。吸入器、経鼻投与器具（例えば噴霧器）または注入器具（ミニポンプなど）のような特定の器具と組み合わせて用いる包装体も想定されている。キットは、滅菌アクセスポートを有してよい（例えば、容器は、皮下用注射針によって穿孔できるストッパーを有する静脈内投与用液剤バッグまたはバイアルであってよい）。容器は、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下用注射針によって穿孔できるストッパーを有する静脈内投与用液剤バッグまたはバイアルであってよい）。その組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書に記載されている四価抗体またはポリペプチドである。容器は、第２の製薬学的活性剤をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、キットは、治療（例えば、輸血または移植）において有用ないずれかの他の物質または器具をさらに含んでよく、１つ以上の容器、チューブ材、滅菌剤、滅菌器具、カニューレ、シリンジなどが挙げられるが、これらに限らない。
下記の実施例を参照することによって、本発明への理解がさらに深まる。しかしながら、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書に記載されている実施例と実施形態は、例示するためのものに過ぎず、これらに鑑み、様々な修正または変更が当業者に示唆されることになるとともに、それらの修正または変更は、本願の趣旨及び範囲と、添付の特許請求の範囲に含まれることになることが理解される。
実施例１：抗ＰＳＧＬ−１四価抗体の作製と特徴付け
Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）は、骨髄系細胞集団、リンパ球細胞集団、樹状細胞集団及びＣＤ３４＋幹細胞集団を含む広範な造血細胞で発現する（例えば、Ｓｐｅｒｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３５（２）：５２３−３１を参照されたい）。ＰＳＧＬ−１に対して特異的であり、Ｔ細胞においてアポトーシスを誘導できるいくつかのマウス抗体は、すでに同定されている。これらのマウス抗体のうち、Ｐ−セレクチンとＰＳＧＬ−１との相互作用（Ｔ細胞と好中球を標的の炎症組織に効率的に局在化するのに必要である）に干渉しない抗体（ｈ１５Ａ７）を臨床開発のために選択し、ＩｇＧ４モノクローナル抗体を含むヒト化κ軽鎖に改変して、ＰＳＧＬ−１発現細胞でのＡＤＣＣとＣＤＣを最小限にした（例えば、米国特許第７，６０４，８００号を参照されたい）。その後、ｈ１５Ａ７をさらに操作して、ｈ１５Ａ７のヒンジ領域にＳＥＲ２２８ＰＲＯという変異を有するｈ１５Ａ７Ｈを作製した（国際公開第２０１２／１７４００１号）。この変異は、抗体シャッフリング（インビボでのＩｇＧ４抗体間の分子間交換）を低減する目的で導入した。インビトロでの調査により、ｈ１５Ａ７／ｈ１５Ａ７Ｈは、後期活性化Ｔ細胞のアポトーシスを優先的に誘導したが、他のＰＳＧＬ−１発現細胞では誘導しなかったことが示された。理論に束縛されるものではないが、ｈ１５Ａ７Ｈの作用機序は、インビトロでの抗体架橋剤と、おそらくはインビボでのＦｃＲ発現細胞によって媒介される、ヒトＰＳＧＬ−１分子の架橋に少なくとも部分的に依存するようであると考えられる。
下記の実施例では、ｈ１５Ａ７Ｈに由来する架橋剤／ＦｃＲ発現細胞非依存性四価抗体のいくつかの開発について説明されている（図１Ａ及び１Ｂ）。理論に束縛されるものではないが、四価抗体は、臨床開発、例えば、Ｔ細胞媒介炎症性疾患の治療において、ｈ１５Ａ７Ｈを上回る利点を有することができる。これらの結果から、四価のｈ１５Ａ７Ｈ抗体の有効性が、インビトロとトランスビボの両方において、親ｈ１５Ａ７Ｈ抗体よりも高いことが示されている。
方法
細胞及び試薬
１０％のＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、カタログ番号２６１４０−０７９）と、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、カタログ番号１５１４０）と、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、カタログ番号１１３６０）とを添加した９０％ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、カタログ番号１１９６５−０９２（商標））で、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５８１（商標））とＳｐ２／０−ｈＰＳＧＬ−１を培養した。
ｈ１５Ａ７Ｈ抗体は、国際公開第２０１２／１７４００１号で説明されているものであった。この試験で用いたｈ１５Ａ７Ｈ四価抗体は、Ｆｌｐ−Ｉｎ ＣＨＯ安定細胞株から作製し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、カタログ番号２１６００−０６９）／０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＪＴ Ｂａｋｅｒ（登録商標）Ｘ２５１−０７）に維持した。無関係なアイソタイプコントロール抗体としてのヒトＩｇＧ４ｐ／κは、Ｆｌｐ−Ｉｎ ＣＨＯ細胞から作製した。１２Ｈ５．５は、ｈ１５Ａ７／ｈ１５Ａ７Ｈに対するマウスＩｇＧ１抗イディオタイプ抗体である。
動物
６〜８週齢の雌Ｂ６マウスを台湾の台北のＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄから得た。すべてのマウスは、特定病原体未感染条件下で維持した。すべての動物試験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従って行った。
抗ＰＳＧＬ−１四価抗体バリアントの構築
ｓｃＤｂ２−Ｆｃ
ｓｃＤｂ２−Ｆｃ（図１Ａ、左）には、インビボでのハーフ抗体の交換を最小限にするために、ヒンジ領域に変異を有するヒトＩｇＧ４ ＦｃのＮ末端に並列で融合した一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）のドメインを２つ含めた。各ｓｃＤｂドメインには、ＶＬ−ＶＨ−ＶＬ−ＶＨのドメイン配列のみならず、ＶＨとＶＬとの間のリンカーの（Ｇ４Ｓ１）５（配列番号３３）と、ＶＬとＶＨとの間の２つの同じリンカー（例えば、配列番号３４）も含めた。最適化のために、長さの異なる前記リンカーを持ついくつかのｓｃＤｂ−Ｆｃを作製した。
ｔａＦｖ２−Ｆｃ
ｔａＦｖ２−Ｆｃ（図１Ａ、中央）には、インビボでのハーフ抗体の交換を最小限にするために、ヒンジ領域に変異を有するヒトＩｇＧ４ ＦｃのＮ末端に並列で融合したタンデム一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ユニット（タンデムｓｃＦｖは、ｔａＦｖという）を２つ含めた。ｔａＦｖを構築するのに用いたｓｃＦｖには、ｖ２（ＶＨ−ＶＬ）、ｖ３（ＶＬ−ＶＨ）及びｖ４（ＶＬ−ＶＨ）という型を含む３つの異なる種類が存在し、ＶＨとＶＬとの間には、リンカーの（Ｇ４Ｓ１）５（配列番号３３）を含めた。これらの中でも、ｖ２とｖ４は、ＶＨ４４−ＶＬ１００のジスルフィド結合の形成によって構造を拘束した。ＶＨ４４−ＶＬ１００のジスルフィド結合は、コンフォメーションの安定性を向上させるために、ＶＬ−ＶＨ及びＶＨ−ＶＬの両方の配向でｓｃＦｖに導入した（配列番号２９及び３０を参照されたい）。各ｔａＦｖは、抗ＰＳＧＬ−１ ｓｃＦｖの連続したｖ２−ｖ３または連続したｖ４−ｖ２を有しており、その２つのｓｃＦｖの間にリンカーのＡＳＴＧＳ（配列番号２７）を有していた。
ｓｃＦｖ−ＩｇＧ
抗ＰＳＧＬ−１ ｓｃＦｖのジスルフィド拘束型ｖ２を用いて、ｓｃＦｖ４−ｃｒＩｇＧ４ｐ、ｓｃＦｖ２−ＬＣ−ＩｇＧ４ｐ及びＬＣ−ｓｃＦｖ２−ＩｇＧ４ｐを含む３つのｓｃＦｖ−ＩｇＧ４ｐバリアントを作製した（図１Ａ、右）。ｓｃＦｖ４−ｃｒＩｇＧ４ｐは、リンカーのない状態で、ＩｇＧ４ｐ（ｃｒＩｇＧ）のκ軽鎖及び重鎖の両方の定常領域のＮ末端に並列で融合した４つのｓｃＦｖユニットを有していた。ｓｃＦｖ２−ＬＣ−ＩｇＧ４ｐは、間のリンカーのＡＳＴＧＳＧ４Ｓ（配列番号２８）によってｈ１５Ａ７Ｈ ＩｇＧのκ軽鎖のＮ末端に並列で融合した２つのｓｃＦｖユニットを有していたのに対して、ＬＣ−ｓｃＦｖ２−ＩｇＧ４ｐは、間のリンカーの（Ｇ４Ｓ）２（配列番号３４）によってｈ１５Ａ７Ｈ ＩｇＧのκ軽鎖のＣ末端に並列で融合した２つのｓｃＦｖユニットを有していた。抗体の発現のために、ＬＣ−ｓｃＦｖ２ ＩｇＧ４ｐ及びｓｃＦｖ２−ＬＣ ＩｇＧ４ｐのフォーマットの軽鎖を、インタクトなｈ１５Ａ７Ｈ重鎖配列をコードするｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクターに別々にサブクローニングした。図１Ｂには、これらの四価抗体フォーマットの別の図が示されており、可変断片には、網掛けが施されている。
四価抗体の発現のために、すべての四価抗体のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、カタログ番号：Ｖ６０１０−２０）にクローニングした。
抗ＰＳＧＬ−１四価抗体バリアントを発現する安定な細胞株の作製
抗ＰＳＧＬ１四価抗体バリアントをＦｌｐ−Ｉｎ ＣＨＯ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、カタログ番号：Ｒ７０８−０７）において、安定に発現及び産生させた。ベンダーから供給されている標準的な手順に従って、四価抗体バリアントのｃＤＮＡ配列をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、カタログ番号：Ｖ６０１０−２０）に挿入し、ｐＯＧ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、カタログ番号Ｖ６００５−２０）とコトランスフェクションした。樹立された細胞株の培養上清を回収し、プロテインＡセファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（商標）、カタログ番号：１７−５２８０−０４）で精製した。精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥとサイズ排除クロマトグラフィーの両方で解析して、抗体の品質を確保した。
還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）
精製した抗ＰＳＧＬ−１四価抗体を１０％還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルと非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでは、２μｇの抗体を５×ＳＤＳサンプル緩衝液（３００ｎＭのトリス、ｐＨ６．８、１０％のＳＤＳ、５０％のグリセロール、５％の２−メルカプトエタノール及び０．０６％のブロモフェノールブルー）と混合して、１０分、１００℃で煮沸してから充填した。非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでは、２μｇの抗体を５×非還元サンプル緩衝液（３００ｎＭのトリス、ｐＨ６．８、１０％のＳＤＳ、５０％のグリセロール及び０．０６％のブロモフェノールブルー）と混合して、１０分、１００℃で煮沸してから充填した。還元タンパク質試料と非還元タンパク質試料を同じＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに充填し、そのゲルで、電気泳動を行った。クマシーブルー染色を用いて、電気泳動後にゲル上のタンパク質を検出した。
抗ＰＳＧＬ−１四価抗体バリアントの結合アッセイ
ヒトＰＳＧＬ−１をトランスフェクションしたＳｐ２／０細胞（Ｓｐ２／０−ｈＰＳＧＬ１）をＰＳＧＬ−１発現細胞株として使用した。Ｓｐ２／０−ｈＰＳＧＬ１細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液（１％のＦＢＳを含むＰＢＳ）に再懸濁し、ピペットで９６ウェルプレートに入れた（１×１０５細胞／ウェル）。各ウェルに、ヒト化１５Ａ７Ｈ（ｈ１５Ａ７Ｈ）／四価抗体を含む上清を１００μｌ加え、これらを６０分、４℃でインキュベートした。細胞を３回、冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄してから、１μｇ／ｍｌの濃度で、マウス抗ヒトＩｇＧ４ ｐＦｃ’−ＰＥ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈカタログ番号９１９０−０９）１００μｌと６０分、４℃でインキュベートした。その後、細胞を３回、冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ解析によって解析した。すべてのフローサイトメトリー解析は、ＢＤ−ＬＳＲフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔというソフトウェアを用いて行った。
抗ＰＳＧＬ−１四価抗体バリアントのアポトーシスアッセイ
１×１０５個のＳｐ２／０−ｈＰＳＧＬ１細胞を９６ウェルプレートのウェルに播種した。滴定濃度の精製抗ＰＳＧＬ−１四価抗体とコントロール抗体のアリコートを新たに調製し、各ウェルに加えた。処理した細胞を３７℃で６時間維持してから、細胞アポトーシスアッセイのためにＦＡＣＳ解析を行った。
細胞アポトーシスアッセイでは、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＩＴＣ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｒｏｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＡＶＫ２５０）をメーカーの説明に従って使用した。簡潔には、処理した細胞を回収し、０．５μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣを含む１００μｌのアネキシンＶ結合緩衝液に室温で再懸濁した。１５分、遮光下でインキュベート後、細胞を２回、２００μｌのアネキシンＶ結合緩衝液で洗浄した。ＦＡＣＳ解析の前に、１つの試料当たり１μｌのプロピジウムアイオダイド（ＰＩ）を加えた。すべてのフローサイトメトリー解析は、ＢＤ−ＬＳＲフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔというソフトウェアを用いて行った。アネキシンＶ陽性細胞及び／またはＰＩ陽性細胞をアポトーシス細胞とみなした。
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離
良好な破傷風応答者として事前に検査した健常なドナーから全血５００ｍｌを採取した。その血液を１５００ｒｐｍで６分遠心分離した。上方の血漿層を破棄し、残りの血液を等体積のＰＢＳで希釈した。希釈した全血をＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐｌａｑｕｅ Ｐｌｕｓ、カタログ番号１７−１４４０−０２）層の上に慎重に加え、２４００ｒｐｍで１５分、室温で遠心分離した。単核球を含むバフィーコート層を回収し、ＰＢＳで３回洗浄し、血小板汚染を最小限に抑えた。その細胞をＰＢＳに再懸濁し、使用するまで氷上に維持した。
トランスビボ遅延型過敏症（ＤＴＨ）
ＰＢＳで透析した、０．２５ＬＦ価の破傷風トキソイド（ＴＴ、Ｋｕｏ Ｋｗａｎｇ、カタログ番号Ｋ４１０３−１１）またはＰＢＳとともに、８〜１０×１０６個のＰＢＭＣ細胞を最終体積５０μｌで、雌Ｂ６マウスの後ろ足蹠に注射した。すべての実験で、６〜８週のマウスを使用した。注射前と、注射の２４時間後に、ダイヤルシックネスゲージを用いて、足蹠の厚みを測定した。注射前の値を注射後の値から減じて、正味の足厚を得た。すべての測定値は、ミリメートル（ｍｍ）で記録した。ＰＢＭＣ及びＴＴの注射の１時間前に、示されている用量で、ＰＢＳで滴定したｈ１５Ａ７Ｈ及びｈ１５Ａ７Ｈ四価抗体をＢ６マウスに静脈内投与した。ＰＢＳをビヒクルコントロールとして用いた。１回の処理当たり２つまたは４つの足（１匹または２匹のマウス）を試験した。Ａｂ投与から２４時間後に、血漿試料を採取して、抗体バリアントの濃度を調べた。足厚の阻害率（％）を１００×（ビヒクルの足厚差−Ａｂの足厚差）／（ビヒクルの足厚差−ＰＢＭＣのみの足厚差）によって算出した。
マウス血漿中の抗体濃度を検出するためのＥＬＩＳＡ
９６ウェルマイクロタイタープレートを、ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（３０ｍＭのＮａ２ＣＯ３／１００ｍＭのＮａＨＣＯ３）中の０．５μｇ／ｍＬの抗イディオタイプ抗体１２Ｈ５．５で、４℃において一晩コーティングした。続いて、プレートを２００μＬ／ウェルのＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡで１時間、室温でブロックし、３回、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で洗浄してから、５０μＬ／ウェルの較正標準液または試料を加えた。まず、段階希釈の較正標準液を正常なマウス血漿において調製した。較正標準液または試料をアッセイ希釈剤（ＰＢＳ中の０．１％のＢＳＡと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で１０００倍に予め希釈して、アッセイ希釈剤において終濃度０．１％のマウス血漿を作製してから、上記のプレートに分注した。その後、必要に応じて、０．１％の正常なマウス血漿を含むアッセイ希釈剤を用いて、希釈液を調製した。１時間、室温でインキュベートし、５回、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄した後、二次抗体のマウス抗ヒトＩｇＧ４ ｐＦｃ’−ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈカタログ番号９１９０−０５、希釈率１：１５０００）を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間インキュベートした。続いて、プレートを５回、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄してから、発色のために、ＴＭＢ基質を加えた。０．５ＮのＨ２ＳＯ４によって反応を停止させ、吸光値を４５０ｎｍにおいて、マイクロタイタープレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＶＥＲＳＡｍａｘ）で測定した。
結果
ヒト化１５Ａ７Ｈ四価抗体の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
図２Ａ〜２Ｃに示されているように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクマシーブルー染色を用いて、非還元条件下と還元条件下で抗ＰＳＧＬ−１四価抗体の分子量と基本的な構造を確認した。非還元条件下のｈ１５Ａ７Ｈ Ｖ２−Ｖ３、Ｖ４−Ｖ２及びＬＨ１０−ｇ４ｐＦｃでは、約１５０ｋＤａの分子量で主要タンパク質バンドが得られた（図２Ａ）。同じ条件において、ｈ１５Ａ７Ｈ ｓｃＦｖ２−ＬＣ ＩｇＧ４ｐ、ＬＣ−ｓｃＦｖ２ ＩｇＧ４ｐ及びｓｃＦｖ４−ｃｒＩｇＧ４ｐでは、約２００ｋＤａの分子量で主要タンパク質バンドが得られた（図２Ｂ）。
還元条件下では、ｈ１５Ａ７Ｈ Ｖ２−Ｖ３、Ｖ４−Ｖ２及びＬＨ１０ ｇ４ｐＦｃにおいて、約７５ｋＤａの予測分子量で１本のバンドが見られたが、ｈ１５Ａ７Ｈ ｓｃＦｖ２−ＬＣとＬＣ−ｓｃＦｖ２では、いずれも、約５０ｋＤａの同程度の分子量で２本の主要バンドが見られた（図２Ｃ）。一方のバンドは、ｓｃＦｖ−ＬＣまたはＬＣ−ｓｃＦｖ融合タンパク質であり、もう一方は、野生型ｈ１５Ａ７Ｈ重鎖であった。ｓｃＦｖ４−ｃｒＩｇＧ４ｐでも、２本の主要バンドが見られ、一方は、ｓｃＦｖ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（約６２．５ｋＤａ）融合タンパク質を表しており、もう一方は、ｓｃＦｖ−κ−融合（約３７．５ｋＤａ）タンパク質であった（図２Ｃ）。コントロールとして、ｈ１５Ａ７Ｈによって、非還元ゲルでは、１５０ｋＤａの予測分子量で１本のバンドを（図２Ａ及び２Ｂ）、還元条件下では、２本の主要バンド（重鎖：５０ｋＤａ、軽鎖：２５ｋＤａ）を得た（図２Ｃ）。
ＳＰ２／Ｏ−ｈＰＳＧＬ−１及びＳＰ２／Ｏに対するヒト化１５Ａ７Ｈ四価抗体バリアントの結合
ｈ１５Ａ７Ｈ四価抗体の結合能力をヒトＰＳＧＬ−１ＳＰ２／Ｏ細胞で評価した。ｈ１５Ａ７Ｈ四価抗体は、ＳＰ２／Ｏ−ｈＰＳＧＬ−１には陽性結合したが、ｈＰＳＧＬ−１抗原の欠損した親ＳＰ２／Ｏ細胞には結合しなかった（下記の表Ａ）。加えて、野生型ｈ１５Ａ７Ｈと、すべてのｈ１５Ａ７Ｈ四価抗体では、ＳＰ２／Ｏ−ｈＰＳＧＬ−１において同程度の結合活性が見られた（表Ａ）。これらの結果から、ｈ１５Ａ７Ｈ四価抗体がｈＰＳＧＬ−１分子に対する結合反応性を保持していたことが示された。
ヒト化１５Ａ７Ｈ 四価抗体によって誘導された、ＳＰ２／Ｏ−ｈＰＳＧＬ−１細胞のインビトロアポトーシス
ｈ１５Ａ７Ｈまたは四価抗体とのインキュベーション後のＳＰ２／Ｏ−ｈＰＳＧＬ−１細胞において、アネキシンＶ及び／またはＰＩの染色によって、アポトーシスの誘導を評価した。下記の表Ｂに示されているように、親抗体のｈ１５Ａ７Ｈは、架橋剤の非存在下、０．５μｇ／ｍＬと０．０６２５μｇ／ｍＬの試験濃度において、ＳＰ２／Ｏ−ｈＰＳＧＬ−１細胞でアポトーシスを誘導しなかった。０．５μｇ／ｍＬの試験濃度では、すべてのｈ１５Ａ７Ｈ四価抗体が、アポトーシスを誘導した（１８〜３６％の範囲）。最も低い試験濃度（０．０６２５μｇ／ｍＬ）では、６つの四価ｈ１５Ａ７Ｈ抗体のうちの３つ（ＬＨ１０−ｇ４ｐＦｃ、Ｖ２−Ｖ３−ｇ４ｐＦｃ及びｓｃＦｖ２−ＬＣ−ＩｇＧ４ｐ）が、１２〜１６％の細胞でアポトーシスを誘導したが、ｈ１５Ａ７Ｈ Ｖ４−Ｖ２−ｇ４ｐＦｃ、ｓｃＦｖ４−ｃｒＩｇＧ４ｐ及びＬＣ−ｓｃＦｖ２−ＩｇＧ４ｐは、この低めの用量では、ＳＰ２／Ｏ−ｈＰＳＧＬ−１において、細胞死を誘導しなかった。これらのデータから、すべてのｈ１５Ａ７Ｈ四価抗体が、アポトーシス誘導能を有していたが、いくつかの四価抗体は、他よりも優れた効能のアポトーシス誘導能を有していたことが明白に示された。
ｈ１５Ａ７Ｈ及びｈ１５Ａ７Ｈ四価抗体が、Ｂ６マウスにおいてトランスビボＤＴＨ応答を阻害する有効性
上記のｈ１５Ａ７Ｈ及びｈ１５Ａ７Ｈ四価抗体が、Ｂ６マウスにおいてトランスビボＤＴＨ応答を阻害する有効性について試験した。ｈ１５Ａ７Ｈ抗体は、マウスに１０ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射し、四価抗体は、マウスに１ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射した。実験は、４人の異なるドナーから得たＰＢＭＣを用いて行い、阻害率（％）を算出して、インビボでの阻害有効性を評価した。
下記の表Ｃに示されているように、ｈ１５Ａ７Ｈ抗体は、１０ｍｇ／ｋｇの用量において、平均９３％で足蹠腫脹を阻害できた。この阻害作用は、低用量の１ｍｇ／ｋｇでは、２３％に低下した。１５Ａ７Ｈ四価抗体においては、ｈ１５Ａ７Ｈ ＬＨ１０−ｇ４ｐ Ｆｃ、Ｖ２−Ｖ３−ｇ４ｐＦｃ及びｓｃＦｖ２−ＬＣ−ＩｇＧ４ｐのようなバリアントは、１ｍｇ／ｋｇまたは０．３ｍｇ／ｋｇの用量でも、阻害するのに依然として有効であった（５９〜７６％の阻害率）。
ｉ．ｖ．投与から２４時間後に、ｈ１５Ａ７Ｈ及びｈ１５Ａ７Ｈ四価抗体の血漿レベルも測定した（表Ｄ）。Ｖ４−Ｖ２−ｇ４ｐＦｃ以外のすべての抗体において、血漿レベルは１ｍｇ／ｋｇにおいて６５１３〜９０２５ｎｇ／ｍＬ前後であったが、Ｖ４−Ｖ２−ｇ４ｐＦｃでは、インビボで２４時間循環後に検出不能であった。理論に束縛されるものではないが、表Ｂに示されているように、これらの結果から、ｈ１５Ａ７Ｈと四価バリアントにおける有効性の違いは主に、アポトーシス誘導能の差に起因し得ることが示されている可能性があると考えられる。
要約すると、これらのデータから、各種のｈ１５Ａ７Ｈ四価抗体は、インビトロにおけるアポトーシス誘導能が異なり、これらのアポトーシス誘導能は、トランスビボＤＴＨマウスモデルにおけるＤＴＨ応答の阻害能の違いと相関することが示されている。これらの四価抗体は、アポトーシスを誘導する効能が高いほど、トランスビボＤＴＨモデルにおいて、ｈ１５Ａ７Ｈよりも有効性が高くなる。これらの結果から、これらのｈ１５Ａ７Ｈ四価バリアントの一部が、さらなる臨床開発において、ｈ１５Ａ７Ｈを上回る潜在的な利点を有し得ることが示唆されている。
理解の明確化を目的として、上記の実施形態について、例示と実施例によって、ある程度詳細に説明してきたが、これらの説明と実施例は、本開示の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
配列
特に断りのない限り、いずれのポリペプチド配列も、Ｎ末端からＣ末端方向に示されている。いずれのポリヌクレオチド配列も、特に断りのない限り、５’から３’方向に示されている。各鎖の３つのＣＤＲには、下線が引かれており、リンカー領域は、小文字で示されている。
ｈ１５Ａ７Ｈ ＬＨ１０−ｇ４ｐＦｃのアミノ酸配列（配列番号１）
ｈ１５Ａ７Ｈ ＬＨ１０−ｇ４ｐＦｃのｃＤＮＡ配列（配列番号２）
ｈ１５Ａ７Ｈ Ｖ２−Ｖ３−ｇ４ｐＦｃのアミノ酸配列（配列番号３）
ｈ１５Ａ７Ｈ Ｖ２−Ｖ３−ｇ４ｐＦｃのｃＤＮＡ配列（配列番号４）
ｈ１５Ａ７Ｈ Ｖ４−Ｖ２−ｇ４ｐＦｃのアミノ酸配列（配列番号５）
ｈ１５Ａ７Ｈ Ｖ４−Ｖ２−ｇ４ｐＦｃのｃＤＮＡ配列（配列番号６）
ｈ１５Ａ７Ｈ ｓｃＦｖ２−ＬＣ−ＩｇＧ４ｐ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号７）
ｈ１５Ａ７Ｈ ｓｃＦｖ２−ＬＣ−ＩｇＧ４ｐ軽鎖のｃＤＮＡ配列（配列番号８）

ｈ１５Ａ７Ｈ ＬＣ−ｓｃＦｖ２−ＩｇＧ４ｐ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号９）
ｈ１５Ａ７Ｈ ＬＣ−ｓｃＦｖ２−ＩｇＧ４ｐ軽鎖のｃＤＮＡ配列（配列番号１０）
ｈ１５Ａ７Ｈ ｓｃＦｖ２−ＬＣ−ＩｇＧ４ｐ及びｈ１５Ａ７ ＬＣ−ＳｃＦｖ２−ＩｇＧ４ｐ重鎖のアミノ酸配列（配列番号１１）
ｈ１５Ａ７Ｈ ｓｃＦｖ２−ＬＣ−ＩｇＧ４ｐ及びｈ１５Ａ７ ＬＣ−ｓｃＦｖ２−ＩｇＧ４ｐ重鎖のｃＤＮＡ配列（配列番号１２）
ｈ１５Ａ７Ｈ ｓｃＦｖ４−ｃｒＩｇＧ４ｐ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１３）
ｈ１５Ａ７Ｈ ｓｃＦｖ４−ｃｒＩｇＧ４ｐ軽鎖のｃＤＮＡ配列（配列番号１４）
ｈ１５Ａ７Ｈ ｓｃＦｖ４−ｃｒＩｇＧ４ｐ重鎖のアミノ酸配列（配列番号１５）
ｈ１５Ａ７Ｈ ｓｃＦｖ４−ｃｒＩｇＧ４ｐ重鎖のｃＤＮＡ配列（配列番号１６）
ｈ１５Ａ７Ｈ ＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列（配列番号１７）
ｈ１５Ａ７Ｈ ＣＤＲ−Ｈ２のアミノ酸配列（配列番号１８）
ｈ１５Ａ７Ｈ ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列（配列番号１９）
ｈ１５Ａ７Ｈ ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号２０）
ｈ１５Ａ７Ｈ ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列（配列番号２１）
ｈ１５Ａ７Ｈ ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列（配列番号２２）
ｈ１５Ａ７Ｈ ＶＨのアミノ酸配列（配列番号２３）
ｈ１５Ａ７Ｈ ＶＬのアミノ酸配列（配列番号２４）
リンカー配列リピートのアミノ酸配列（配列番号２５）
Ｆｃとのリンカーのアミノ酸配列（配列番号２６）
ｔａＦｖリンカーのアミノ酸配列（配列番号２７）
ｓｃＦｖ軽鎖リンカーのアミノ酸配列（配列番号２８）
ｈ１５Ａ７Ｈ ＶＨ Ｇ４４Ｃのアミノ酸配列（配列番号２９）
ｈ１５Ａ７Ｈ ＶＬ Ｑ１００Ｃのアミノ酸配列（配列番号３０）
ヒトＰＳＧＬ−１のアミノ酸配列（配列番号３１）
短いヒトＰＳＧＬ−１バリアントのアミノ酸配列（配列番号３２）

Claims (70)

  1. ヒトＰＳＧＬ−１に特異的に結合する四価抗体であって、２つのモノマーからなる二量体を含み、前記二量体の各モノマーが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、
    （ａ）第１の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、
    （ｂ）第１のリンカー配列と、
    （ｃ）第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、
    （ｄ）第２のリンカー配列と、
    （ｅ）第２のＶＬドメインと、
    （ｆ）第３のリンカー配列と、
    （ｇ）第２のＶＨドメインと、
    （ｈ）第４のリンカー配列と、
    （ｉ）抗体Ｆｃドメインと、
    を含む一本鎖ポリペプチドを含み、
    前記第１及び前記第２のＶＬドメインのそれぞれが、ＣＤＲ−Ｌ１と、ＣＤＲ−Ｌ２と、ＣＤＲ−Ｌ３を含み、前記第１及び前記第２のＶＨドメインのそれぞれが、ＣＤＲ−Ｈ１と、ＣＤＲ−Ｈ２と、ＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記第１及び前記第２のＶＬドメインのそれぞれが、前記第１及び前記第２のＶＨドメインのうちの対応するＶＨドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成し、前記２つのＶＨ−ＶＬ結合ユニットのそれぞれが、ヒトＰＳＧＬ−１に対して特異的である前記四価抗体。
  2. 前記２つのＶＨドメインのうちの少なくとも１つが、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３とを含む、請求項１に記載の四価抗体。
  3. 前記２つのＶＨドメインのそれぞれが、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３とを含む、請求項２に記載の四価抗体。
  4. 前記２つのＶＨドメインのそれぞれが、配列番号２３のアミノ酸配列、または配列番号２３に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の四価抗体。
  5. 前記２つのＶＨドメインのそれぞれが、配列番号２９のアミノ酸配列、または配列番号２９に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の四価抗体。
  6. 前記２つのＶＬドメインのうちの少なくとも１つが、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３とを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の四価抗体。
  7. 前記２つのＶＬドメインのそれぞれが、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３とを含む、請求項６に記載の四価抗体。
  8. 前記２つのＶＬドメインのそれぞれが、配列番号２４のアミノ酸配列、または配列番号２４に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の四価抗体。
  9. 前記２つのＶＬドメインのそれぞれが、配列番号３０のアミノ酸配列、または配列番号３０に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の四価抗体。
  10. 前記第１、第２及び第３のリンカー配列がそれぞれ、配列番号２５のアミノ酸配列のリピートを２回以上含むか、または前記第１、第２もしくは第３のリンカー配列が、配列番号３３、３４、３５もしくは３６のアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の四価抗体。
  11. 前記第１及び前記第３のリンカー配列が、同じ配列を有し、配列番号２５のリピートを２回含む、請求項１０に記載の四価抗体。
  12. 前記第２のリンカー配列が、配列番号２５のリピートを５回含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の四価抗体。
  13. 前記第４のリンカー配列が、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の四価抗体。
  14. 前記２本の一本鎖ポリペプチドのそれぞれが、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の四価抗体。
  15. 前記２本の一本鎖ポリペプチドのそれぞれが、配列番号２のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１４に記載の四価抗体。
  16. ヒトＰＳＧＬ−１に特異的に結合する四価抗体であって、２つのモノマーからなる二量体を含み、前記二量体の各モノマーが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、
    （ａ）第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、
    （ｂ）第１のリンカー配列と、
    （ｃ）第１の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、
    （ｄ）第２のリンカー配列と、
    （ｅ）第２のＶＬドメインと、
    （ｆ）第３のリンカー配列と、
    （ｇ）第２のＶＨドメインと、
    （ｈ）第４のリンカー配列と、
    （ｉ）抗体Ｆｃドメインと、
    を含む一本鎖ポリペプチドを含み、
    前記第１及び前記第２のＶＬドメインのそれぞれが、ＣＤＲ−Ｌ１と、ＣＤＲ−Ｌ２と、ＣＤＲ−Ｌ３を含み、前記第１及び前記第２のＶＨドメインのそれぞれが、ＣＤＲ−Ｈ１と、ＣＤＲ−Ｈ２と、ＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記第１及び前記第２のＶＬドメインのそれぞれが、前記第１及び前記第２のＶＨドメインのうちの対応するＶＨドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成し、前記２つのＶＨ−ＶＬ結合ユニットのそれぞれが、ヒトＰＳＧＬ−１に対して特異的である前記四価抗体。
  17. 前記２つのＶＨドメインのうちの少なくとも１つが、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３とを含む、請求項１６に記載の四価抗体。
  18. 前記２つのＶＨドメインのそれぞれが、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３とを含む、請求項１７に記載の四価抗体。
  19. 前記２つのＶＨドメインのそれぞれが、配列番号２３のアミノ酸配列、または配列番号２３に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の四価抗体。
  20. 前記２つのＶＨドメインのそれぞれが、配列番号２９のアミノ酸配列、または配列番号２９に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の四価抗体。
  21. 前記２つのＶＬドメインのうちの少なくとも１つが、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３とを含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の四価抗体。
  22. 前記２つのＶＬドメインのそれぞれが、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３とを含む、請求項２１に記載の四価抗体。
  23. 前記２つのＶＬドメインのそれぞれが、配列番号２４のアミノ酸配列、または配列番号２４に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の四価抗体。
  24. 前記２つのＶＬドメインのそれぞれが、配列番号３０のアミノ酸配列、または配列番号３０に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の四価抗体。
  25. 前記第１及び前記第３のリンカー配列が、配列番号２５のリピートを５回含む同じ配列を有する、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の四価抗体。
  26. 前記第２のリンカー配列が、配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の四価抗体。
  27. 前記第４のリンカー配列が、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の四価抗体。
  28. 前記２本の一本鎖ポリペプチドのそれぞれが、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の四価抗体。
  29. 前記２本の一本鎖ポリペプチドのそれぞれが、配列番号４のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項２８に記載の四価抗体。
  30. ヒトＰＳＧＬ−１に特異的に結合する四価抗体であって、２つのモノマーからなる二量体を含み、前記二量体の各モノマーが、抗体重鎖と抗体軽鎖を含み、
    前記抗体軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、
    （ｉ）第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、
    （ｉｉ）第１のリンカー配列と、
    （ｉｉｉ）第１の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、
    （ｉｖ）第２のリンカー配列と、
    （ｖ）第２のＶＬドメインと、
    （ｖｉ）軽鎖定常（ＣＬ）ドメインと、
    を含み、
    前記抗体重鎖が、
    （ｉ）第２のＶＨドメインと、
    （ｉｉ）第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）ドメインと、抗体ヒンジ領域と、第２の重鎖定常領域（ＣＨ２）ドメインと、第３の重鎖定常領域（ＣＨ３）ドメインとを含む重鎖定常領域と、
    を含み、
    前記第１及び前記第２のＶＬドメインのそれぞれが、ＣＤＲ−Ｌ１と、ＣＤＲ−Ｌ２と、ＣＤＲ−Ｌ３を含み、前記第１及び前記第２のＶＨドメインのそれぞれが、ＣＤＲ−Ｈ１と、ＣＤＲ−Ｈ２と、ＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記第１及び前記第２のＶＬドメインのそれぞれが、前記第１及び前記第２のＶＨドメインのうちの対応するＶＨドメインとＶＨ−ＶＬ結合ユニットを形成し、前記２つのＶＨ−ＶＬ結合ユニットのそれぞれが、ヒトＰＳＧＬ−１に対して特異的である前記四価抗体。
  31. 前記第１及び前記第２のＶＨドメインのうちの少なくとも１つが、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３とを含む、請求項３０に記載の四価抗体。
  32. 前記第１及び前記第２のＶＨドメインがそれぞれ、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３とを含む、請求項３１に記載の四価抗体。
  33. 前記第１及び前記第２のＶＨドメインがそれぞれ、配列番号２３のアミノ酸配列、または配列番号２３に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の四価抗体。
  34. 前記第１及び前記第２のＶＨドメインがそれぞれ、配列番号２９のアミノ酸配列、または配列番号２９に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の四価抗体。
  35. 前記第１及び前記第２のＶＬドメインのうちの少なくとも１つが、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３とを含む、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の四価抗体。
  36. 前記第１及び前記第２のＶＬドメインがそれぞれ、（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３とを含む、請求項３５に記載の四価抗体。
  37. 前記第１及び前記第２のＶＬドメインがそれぞれ、配列番号２４のアミノ酸配列、または配列番号２４に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の四価抗体。
  38. 前記第１及び前記第２のＶＬドメインがそれぞれ、配列番号３０のアミノ酸配列、または配列番号３０に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の四価抗体。
  39. 前記ＣＬドメインが、κＣＬドメインである、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載の四価抗体。
  40. 前記第１のリンカー配列が、配列番号２５のリピートを５回含む、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の四価抗体。
  41. 前記第２のリンカー配列が、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項３０〜４０のいずれか１項に記載の四価抗体。
  42. 前記抗体軽鎖が、配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号７に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の四価抗体。
  43. 前記抗体軽鎖が、配列番号８のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項４２に記載の四価抗体。
  44. 前記抗体重鎖が、配列番号１１のアミノ酸配列、または配列番号１１に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項３０〜４３のいずれか１項に記載の四価抗体。
  45. 前記抗体重鎖が、配列番号１２のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項４４に記載の四価抗体。
  46. 前記抗体Ｆｃドメインが、ヒト抗体Ｆｃドメインである、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の四価抗体。
  47. 前記抗体Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、請求項４６に記載の四価抗体。
  48. 前記ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、１つ以上のアミノ酸置換を含まないＩｇＧ４ヒンジ領域と比べて、ＩｇＧ４のシャッフリングを低減させる前記１つ以上のアミノ酸置換を含むヒンジ領域配列を含む、請求項４７に記載の四価抗体。
  49. 前記ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインが、ＥＵインデックスによる番号付けで２２８位のアミノ酸におけるセリンのプロリンへの置換を含むヒンジ領域配列を含む、請求項４７または請求項４８に記載の四価抗体。
  50. 請求項１〜４９のいずれか１項に記載の四価抗体をコードする単離ポリヌクレオチド。
  51. 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含む、請求項５０に記載の単離ポリヌクレオチド。
  52. 請求項５０または請求項５１に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
  53. 請求項５０もしくは請求項５１に記載のポリヌクレオチド、または請求項５２に記載のベクターを含む宿主細胞。
  54. 四価抗体の作製方法であって、請求項５３に記載の宿主細胞を培養して、前記四価抗体が産生されるようにする前記方法。
  55. 前記四価抗体を前記宿主細胞から回収することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 請求項１〜４９のいずれか１項に記載の四価抗体と、製薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
  57. 請求項１〜４９のいずれか１項に記載の四価抗体と、任意の製薬学的に許容可能な担体とを含むキット。
  58. 前記四価抗体を投与して、Ｔ細胞媒介炎症性疾患を治療することに関する説明を含む添付文書をさらに含む、請求項５７に記載のキット
  59. 輸血もしくは移植の前、輸血もしくは移植と同時及び／または輸血もしくは移植の後に、前記四価抗体を投与することに関する説明を含む添付文書をさらに含む、請求項５７に記載のキット。
  60. Ｔ細胞媒介炎症性疾患の治療用である、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の四価抗体。
  61. 輸血または移植の必要な個体の治療用である、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の四価抗体。
  62. Ｔ細胞媒介炎症性疾患を治療するための医薬の製造で、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の四価抗体を使用すること。
  63. 輸血または移植の必要な個体を治療するための医薬の製造で、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の四価抗体を使用すること。
  64. Ｔ細胞媒介炎症性疾患の治療方法であって、Ｔ細胞媒介炎症性疾患の治療を必要とする対象に、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の四価抗体を治療有効量投与することを含む前記方法。
  65. 輸血または移植の必要な個体の治療方法であって、前記輸血もしくは移植の前、前記輸血もしくは移植と同時、及び／または前記輸血もしくは移植の後に、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の四価抗体を治療有効量、前記個体に投与することを含む前記方法。
  66. 前記Ｔ細胞媒介炎症性疾患が、自己免疫疾患である、請求項５８に記載のキット、請求項６０に記載の四価抗体、請求項６２に記載の使用、または請求項６４に記載の方法。
  67. 前記Ｔ細胞媒介炎症性疾患が、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、クローン病、強直性脊椎炎、Ｉ型糖尿病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群から選択されている、請求項５８に記載のキット、請求項６０に記載の四価抗体、請求項６２に記載の使用、または請求項６４に記載の方法。
  68. 前記乾癬が、尋常性乾癬、慢性尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬または乾癬性紅皮症である、請求項６７に記載のキット、四価抗体、使用または方法。
  69. 前記移植が、骨髄、腎臓、心臓、肝臓、ニューロン組織、肺、膵臓、皮膚及び腸からなる群から選択した組織の移植である、請求項５９に記載のキット、請求項６１に記載の四価抗体、請求項６３に記載の使用、または請求項６５に記載の方法。
  70. 前記輸血が、白血球、赤血球及び血小板のうちの１つ以上を含む輸血である、請求項５９に記載のキット、請求項６１に記載の四価抗体、請求項６３に記載の使用、または請求項６５に記載の方法。
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