CN108713026A - 四价抗psgl-1抗体及其用途 - Google Patents

四价抗psgl-1抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本文提供了特异性结合至人PSGL‑1的四价抗体。与二价抗体不同，这些四价抗体含有两个单体的二聚体，其中每个单体包含两个轻链可变(VL)结构域和两个重链可变(VH)结构域。这种形式允许针对PSGL‑1的交联剂/FcR表达细胞非依赖性的四价抗体显示出与二价PSGL‑1抗体相比增强的功效。这些四价抗体可用于多种诊断性和治疗性方法中，包括但不限于治疗T细胞介导的炎性疾病、移植和输注。

Description

四价抗PSGL-1抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年1月8日提交的美国临时申请序列No.62/276,806的优先权权益，其通过引用整体并入本文。
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领域
本文提供了特异性结合至人P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)的四价抗体，以及与其相关的多核苷酸、载体、宿主细胞、方法、药物组合物、试剂盒和用途。这些四价抗体可用于多种诊断性和治疗性方法，包括但不限于治疗T细胞介导的炎性疾病、移植和输注。
背景
通过白细胞粘附到血管壁引发对感染或损伤的炎性响应(McEver等人,1997,J.Clin.Invest.,100(3):485-492)。选择素代表糖蛋白的家族，其在炎症期间介导第一白细胞-内皮细胞和白细胞-血小板相互作用。选择素家族，由L-选择素、E-选择素和P-选择素组成，包含NH2-末端凝集素结构域，后面是EGF-样结构域、一系列共有重复、跨膜结构域和短胞质尾。选择素的凝集素结构域与特定的糖缀合物配体相互作用，以促进细胞粘附。在大多数白细胞上表达的L-选择素结合至一些内皮细胞和其它白细胞上的配体。在细胞因子活化的内皮细胞上表达的E-选择素结合至大多数白细胞上的配体。在活化的血小板和内皮细胞上表达的P-选择素也结合至大多数白细胞上的配体。
P-选择素糖蛋白配体-1("PSGL-1")，也被称为SELPLG或CD162(分化簇162)是所有三种选择素的人粘蛋白型糖蛋白配体(Constantin,Gabriela,2004,Drug NewsPerspect.,17(9):579-585；McEver等人,1997,J.Clin.Invest.,100(3):485-492)。PSGL-1是具有两个120-kD的亚基的二硫化物键合的同二聚体，并且在单核细胞、淋巴细胞、粒细胞和一些CD34+干细胞的表面上表达。PSGL-1可能有助于许多炎性病症中的病理性白细胞募集，因为它促进了选择素的粘附性相互作用。此外，PSGL-1显示在T细胞中具有独特的调控作用。缺乏PSGL-1的小鼠显示出增强的增殖响应和自身免疫性，从而表明PSGL-1在下调T细胞响应方面起重要作用(Krystle M.等人J.Immunol.2012；188:1638-1646.Urzainqui等人Ann Rheum Dis 2013；71:650；Pérez-Frías A,等人Arthritis Rheumatol.2014年11月；66(11):3178-89.；Angiari等人J Immunol.2013；191(11):5489-500)。
已经开发了几种抗PSGL-1抗体(参见，如国际申请公开No.WO 2005/110475、WO2003/013603和WO 2012/174001；Constantin,Gabriela,2004,Drug News Perspect.,17(9):579-585，Chen等人Blood.2004；104(10):3233-42，Huang等人,Eur J Immunol.2005；35(7):2239-49；和美国专利No.7,604,800)。一些现有的激动性PSGL-1抗体优先地诱导晚期活化的T细胞的凋亡而不诱导其它PSGL-1表达细胞的凋亡；此类抗体可能因此可用作抗炎治疗剂，或用于移植和/或输注。然而，需要具有比现有抗体更佳的体内功效的改进的抗PSGL-1抗体。
出于所有目的，本文引用的所有公开、专利和专利申请在此均通过引用整体并入。
简述
为了满足这种需要，本文提供了特异性结合至人PSGL-1的四价抗体，以及与其相关的多核苷酸、载体、宿主细胞、方法、药物组合物、试剂盒和用途。本公开证明了特异性结合至人PSGL-1的四价抗体具有比常规(如，二价)抗PSGL-1抗体更佳的效力和功效。因此，这些四价抗体可尤其用于与T细胞功能相关的诊断性和/或治疗性方法、用途和组合物，诸如治疗T细胞介导的炎性疾病、输注和和/或移植。
因此，在一方面，本文提供了特异性结合至人PSGL-1的四价抗体，所述四价抗体包含两个单体的二聚体，其中二聚体的每个单体包含单链多肽，所述单链多肽包含：(a)两个轻链可变(VL)结构域，其中两个VL结构域中的每一个包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；(b)两个重链可变(VH)结构域，其中两个VH结构域中的每一个包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和(c)抗体Fc结构域，其中两个VL结构域中的每一个与两个VH结构域的相应VH结构域形成VH-VL结合单元，并且其中两个VH-VL结合单元中的每一个对人PSGL-1具有特异性。在一些实施方案中，两个VH结构域中的至少一个包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，两个VH结构域中的每一个包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，两个VH结构域中的一个或两个包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:23具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，两个VH结构域中的一个或两个包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:29具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，两个VL结构域中的至少一个包含：(i)CDR-L1，其包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，两个VL结构域中的每一个包含：(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，两个VL结构域中的一个或两个包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，两个VL结构域中的一个或两个包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:30具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，两个单链多肽中的每一个从N-末端至C-末端包含：(a)两个VL结构域中的第一VL结构域；(b)第一接头序列；(c)两个VH结构域中的第一VH结构域；(d)第二接头序列；(e)两个VL结构域中的第二VL结构域；(f)第三接头序列；(g)两个VH结构域中的第二VH结构域；(h)第四接头序列；和(i)抗体Fc结构域。在一些实施方案中，第一接头序列、第二接头序列和第三接头序列各自包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的两个或多个重复。在一些实施方案中，第一接头序列和第三接头序列具有相同的序列并且包含SEQ ID NO:25的两个重复。在一些实施方案中，第二接头序列包含SEQ ID NO:25的五个重复。在一些实施方案中，第四接头序列包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些实施方案中，两个单链多肽中的每一个包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，两个单链多肽中的每一个由包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，两个单链多肽中的每一个从N-末端至C-末端包含：(a)两个VH结构域中的第一VH结构域；(b)第一接头序列；(c)两个VL结构域中的第一VL结构域；(d)第二接头序列；(e)两个VL结构域中的第二VL结构域；(f)第三接头序列；(g)两个VH结构域中的第二VH结构域；(h)第四接头序列；和(i)抗体Fc结构域。在一些实施方案中，两个单链多肽中的每一个从N-末端至C-末端包含：(a)两个VL结构域中的第一VL结构域；(b)第一接头序列；(c)两个VH结构域中的第一VH结构域；(d)第二接头序列；(e)两个VH结构域中的第二VH结构域；(f)第三接头序列；(g)两个VL结构域中的第二VL结构域；(h)第四接头序列；和(i)抗体Fc结构域。在一些实施方案中，第一、第二或第三接头序列包含SEQ IN NO:25的氨基酸序列的两个或多个重复。在一些实施方案中，第一、第二或第三接头序列包含SEQ ID NO:33、34、35或36的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一接头序列和第三接头序列具有相同的序列，其包含SEQ IDNO:25的五个重复。在一些实施方案中，第二接头序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，第四接头序列包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些实施方案中，两个单链多肽中的每一个包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，两个单链多肽中的每一个由包含SEQ ID NO:4的多核苷酸序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，两个单链多肽中的每一个包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施方案中，两个单链多肽中的每一个由包含SEQ ID NO:6的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在另一方面，本文提供了特异性结合至人PSGL-1的四价抗体，所述四价抗体包含两个单体的二聚体，其中二聚体的每个单体包含抗体重链和抗体轻链；其中抗体轻链包含：(i)两个轻链可变(VL)结构域，其中两个VL结构域中的每一个包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，(ii)第一重链可变(VH)结构域，和(iii)轻链恒定(CL)结构域；其中抗体重链包含：(i)第二重链可变(VH)结构域，和(ii)重链恒定区，其包含第一重链恒定区(CH1)结构域、抗体铰链区、第二重链恒定区(CH2)结构域和第三重链恒定区(CH3)结构域；其中第一和第二VH结构域各自包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中两个VL结构域中的每一个与第一和第二VH结构域的相应VH结构域形成VH-VL结合单元，和其中两个VH-VL结合单元中的每一个对人PSGL-1具有特异性。在一些实施方案中，第一和第二VH结构域中的至少一个包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和第二VH结构域各自包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和/或第二VH结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:23具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和/或第二VH结构域包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:29具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和第二VL结构域中的至少一个包含：(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和第二VL结构域各自包含：(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和/或第二VL结构域包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:24具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和/或第二VL结构域包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:30具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体轻链从N-末端至C-末端包含：(a)第一VH结构域；(b)第一接头序列；(c)两个或多个VL结构域中的第一VL结构域；(d)第二接头序列；(e)两个或多个VL结构域中的第二VL结构域；和(f)CL结构域。在一些实施方案中，CL结构域是κCL结构域。在一些实施方案中，第一接头序列包含SEQ IDNO:25的五个重复。在一些实施方案中，第二接头序列包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体轻链包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体轻链由包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，抗体轻链从N-末端至C-末端包含：(a)两个VL结构域的第一VL结构域；(b)CL结构域；(c)第一接头序列；(d)第一VH结构域；(e)第二接头序列；和(f)两个VL结构域的第二VL结构域。在一些实施方案中，CL结构域是κCL结构域。在一些实施方案中，第一接头序列包含SEQ ID NO:25的两个重复。在一些实施方案中，第二接头序列包含SEQ ID NO:25的五个重复。在一些实施方案中，抗体轻链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体轻链由包含SEQ ID NO:10的多核苷酸序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，抗体重链从N-末端至C-末端包含：(a)第二VH结构域；和(b)重链恒定区，其包含第一重链恒定区(CH1)结构域、抗体铰链区、第二重链恒定区(CH2)结构域和第三重链恒定区(CH3)结构域。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQID NO:11的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链由包含SEQ ID NO:12的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在另一方面，本文提供了特异性结合至人PSGL-1的四价抗体，所述四价抗体包含两个单体的二聚体，其中二聚体的每个单体包含抗体重链和抗体轻链；其中抗体轻链包含：(i)第一重链可变(VH)结构域，(ii)第一轻链可变(VL)结构域和(iii)轻链恒定(CL)结构域；其中抗体重链包含：(i)第二重链可变(VH)结构域，(ii)第二轻链可变(VL)结构域和(iii)重链恒定结构域，其包含第一重链恒定区(CH1)结构域、抗体铰链区、第二重链恒定区(CH2)结构域和第三重链恒定区(CH3)结构域；其中第一和第二VL结构域中的每一个包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；其中第一和第二VH结构域中的每一个包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；其中第一和第二VL结构域中的每一个与第一和第二VH结构域的相应VH结构域形成VH-VL结合单元；并且其中两个VH-VL结合单元中的每一个对人PSGL-1具有特异性。在一些实施方案中，第一和第二VH结构域中的至少一个包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ IDNO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和第二VH结构域各自包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和/或第二VH结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和/或第二VH结构域包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和第二VL结构域中的至少一个包含：(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和第二VL结构域各自包含：(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ IDNO:21的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和/或第二VL结构域包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和/或第二VL结构域包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体轻链从N-末端至C-末端包含：(a)第一VH结构域；(b)第一接头序列；(c)第一VL结构域；和(d)CL结构域。在一些实施方案中，CL结构域是κCL结构域。在一些实施方案中，第一接头序列包含SEQ IDNO:25的五个重复。在一些实施方案中，抗体轻链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体轻链由包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，抗体重链从N-末端至C-末端包含：(a)第二VH结构域；(b)第二接头序列；(c)第二VL结构域；和(d)重链恒定区，其包含第一重链恒定区(CH1)结构域、抗体铰链区、第二重链恒定区(CH2)结构域和第三重链恒定区(CH3)结构域。在一些实施方案中，第二接头序列包含SEQ ID NO:25的五个重复。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链由包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
在以上实施方案中的任一个的一些实施方案中，抗体Fc结构域是人抗体Fc结构域。在一些实施方案中，抗体Fc结构域是人IgG4 Fc结构域。在一些实施方案中，人IgG4 Fc结构域包含铰链区序列，所述铰链区序列相较于缺乏一种或多种氨基酸取代的IgG4铰链区包含导致减少的IgG4改组(shuffling)的一种或多种氨基酸取代。在一些实施方案中，人IgG4 Fc结构域包含含有在根据EU索引编号的氨基酸228处的丝氨酸至脯氨酸取代的铰链区序列。在以上实施方案中的任一个的一些实施方案中，抗体铰链区包含在根据EU索引编号的氨基酸228处丝氨酸至脯氨酸取代。在一些实施方案中，本公开的四价抗体相较于具有与四价抗体共有的一个或多个VH或VL结构域的常规(如，二价)抗体在靶细胞(如，表达人PSGL-1或其表位的细胞)中展现出增强的凋亡诱导。在一些实施方案中，本公开的四价抗体相较于具有与四价抗体共有的一个或多个VH或VL结构域的常规(如，二价)抗体展现出增强的DTH抑制(如，在转移体内动物模型中)。
在另一方面，本文提供了编码以上实施方案中的任一个的四价抗体的分离的多核苷酸。在一些实施方案中，分离的多核苷酸包含选自由以下组成的组的多核苷酸序列：SEQID NO:2、4、6、8、10、12、14和16。在另一方面，本文提供了包含以上实施方案中的任一个的分离的多核苷酸的载体。在另一方面，本文提供了包含以上实施方案中的任一个的多核苷酸和/或以上实施方案中的任一个的载体的宿主细胞。在另一方面，本文提供了产生四价抗体的方法，其包括培养以上实施方案中的任一个的宿主细胞，使得产生四价抗体。在一些实施方案中，该方法还包括从宿主细胞回收四价抗体。
在另一方面，本文提供了药物组合物，其包含以上实施方案的任一个的四价抗体和药学上可接受的载剂。在另一方面，本文提供了试剂盒，其包含以上实施方案的任一个的四价抗体和任选的药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，该试剂盒还包括包装插页，其包括用于施用四价抗体以治疗T细胞介导的炎性疾病或疾患的说明书。在一些实施方案中，该试剂盒包括包装插页，其包括用于在输注或移植之前、同时和/或之后施用四价抗体的说明书。在另一方面，本文提供了用于治疗T细胞介导的炎性疾病或疾患的以上实施方案的任一个的四价抗体。在另一方面，本文提供了用于治疗需要输注或移植的个体的以上实施方案的任一个的四价抗体。在另一方面，本文提供了以上实施方案的任一个的四价抗体在制造用于治疗T细胞介导的炎性疾病或疾患的医药方面的用途。在另一方面，本文提供了以上实施方案的任一个的四价抗体在制造用于治疗需要输注或移植的个体的医药方面的用途。在另一方面，本文提供了治疗T细胞介导的炎性疾病或疾患的方法，该方法包括向需要其的受试者施用治疗有效量的以上实施方案中任一个的四价抗体。在另一方面，本文提供了用于治疗需要输注或移植的个体的方法，其包括在输注或移植之前、同时和/或之后向个体施用治疗有效量的以上实施方案的任一个的四价抗体。在一些实施方案中，T细胞介导的炎性疾病是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，T细胞介导的炎性疾病选自由以下组成的组：银屑病、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、克罗恩氏病(Crohn's disease)、强直性脊柱炎、I型糖尿病、溃疡性结肠炎、多发性硬化和移植物抗宿主病(GVHD)。在一些实施方案中，银屑病是斑块状银屑病、慢性斑块状银屑病、滴状银屑病、反转型银屑病、脓疱型银屑病或红皮病型银屑病。在一些实施方案中，移植是选自由以下组成的组的组织的移植：骨髓、肾脏、心脏、肝脏、神经元组织、肺、胰腺、皮肤和肠。在一些实施方案中，输注是包含白细胞、红细胞和血小板中的一种或多种的输注。
应理解，本文所述的各种实施方案的性质中的一种、一些或所有可以组合以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些和其它方面对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图简述
图1A和1B提供了说明根据一些实施方案的示例性四价抗体的示意图。图1A说明了以下示例性形式：(1)二聚体，其由融合至Fc结构域的两个单链双抗体组成(scDb2-Fc)，示出了接头序列：(GGGGS)5(SEQ ID NO:33)、GGGGSAAA(SEQ ID NO:26)和(GGGGS)2(SEQ IDNO:34)/(GGGGS)2G(SEQ ID NO:35)/(GGGGS)2GG(SEQ ID NO:36)；(2)两种不同的形式，各自具有两个串联单链可变片段单元的二聚体(taFv2-Fc)，示出了两种形式的相同接头序列：(GGGGS)5(SEQ ID NO:33)、ASTGS(SEQ ID NO:27)、GGGGSAAA(SEQ ID NO:26)；和(3)基于单链可变片段的三种不同的形式(scFv-IgG)，其示出了：scFv2-LC-IgG4p接头序列(GGGGS)5(SEQ ID NO:33)和ASTGSG4S(SEQ ID NO:28)，LC-scFv2-IgG4p接头序列(GGGGS)2(SEQ IDNO:34)和(GGGGS)5(SEQ ID NO:33)，scFv4-crlG4p接头序列(GGGGS)5(SEQ ID NO:33)。图1B提供了其中可变片段加阴影且指出V2scFv的三种scFv-基形式的另一种说明。
图2A-2C显示了通过SDS-PAGE、然后考马斯亮蓝(Coomassie blue)染色证实的示例性四价抗体的分子量和基本结构。显示了非还原(图2A和2B)和还原(图2C)条件。
详述
本文提供了特异性结合至人PSGL-1的四价抗体。本公开至少部分基于本文所述的发现：某些四价抗PSGL-1抗体显示出在体外和转移体内相较于亲本抗PSGL-1抗体增强的功效。这些四价抗体在迟发型超敏反应(DTH)的转移体内模型中展现出比亲本抗PSGL-1抗体更高的凋亡诱导效力和增强的功效。本文还提供了与四价抗体相关的分离的多核苷酸、载体、宿主细胞、药物组合物、试剂盒、用途和方法。例如，本公开的四价抗体可用于治疗T细胞介导的炎性疾病或在输注或移植之前、同时和/或之后施用。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单体的二聚体，其中二聚体的每个单体包含单链多肽，所述单链多肽包含：(a)两个轻链可变(VL)结构域，其中两个VL结构域中的每一个包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；(b)两个重链可变(VH)结构域，其中两个VH结构域中的每一个包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和(c)抗体Fc结构域，其中两个VL结构域中的每一个与两个VH结构域的相应VH结构域形成VH-VL结合单元，和其中两个VH-VL结合单元中的每一个对人PSGL-1具有特异性。在其它实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单体的二聚体，其中二聚体的每个单体包含抗体重链和抗体轻链；其中抗体轻链包含：(i)两个轻链可变(VL)结构域，其中两个VL结构域中的每一个包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，(ii)第一重链可变(VH)结构域，和(iii)轻链恒定(CL)结构域；其中抗体重链包含：(i)第二重链可变(VH)结构域，和(ii)重链恒定区，其包含第一重链恒定区(CH1)结构域、抗体铰链区、第二重链恒定区(CH2)结构域和第三重链恒定区(CH3)结构域；其中第一和第二VH结构域各自包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中两个VL结构域中的每一个与第一和第二VH结构域的相应VH结构域形成VH-VL结合单元，并且其中两个VH-VL结合单元中的每一个对人PSGL-1具有特异性。在其它实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单体的二聚体，其中二聚体的每个单体包含抗体重链和抗体轻链；其中抗体轻链包含：(i)第一重链可变(VH)结构域，(ii)第一轻链可变(VL)结构域，和(iii)轻链恒定(CL)结构域；其中抗体重链包含：(i)第二重链可变(VH)结构域，(ii)第二轻链可变(VL)结构域，和(iii)重链恒定区，其包含第一重链恒定区(CH1)结构域、抗体铰链区、第二重链恒定区(CH2)结构域和第三重链恒定区(CH3)结构域；其中第一和第二VL结构域中的每一个包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；其中第一和第二VH结构域中的每一个包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；其中第一和第二VL结构域中的每一个与第一和第二VH结构域的相应VH结构域形成VH-VL结合单元；并且其中两个VH-VL结合单元中的每一个对人PSGL-1具有特异性。
I.定义
“抗体”是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合至靶标(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所用，该术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，而且还涵盖包含其片段的多肽(诸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)；单链可变片段(scFv)，单链双抗体(scDb)，串联单链可变片段(scFv)单元(串联scFv称为taFv)，和其突变体或其它构型；包含抗体部分的融合蛋白；和包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰的构型。
如本文所用，“四价”抗体可是指包含四个抗体VH-VL结合单元的抗体，其中每个VH-VL结合单元包含抗体VH结构域和抗体VL结构域。如本文所用，对四价抗体的“单体”的提及可包括单链多肽和多链多肽两者。例如，单体可以是指单链多肽，或者它可以指抗体重链-轻链单元，其中重链和轻链由单独的多核苷酸编码和/或由单独的多肽的缔合形成。
抗体包括任何类别的抗体，诸如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不必是任何特定类别的。根据其重链的恒定结构域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分配到不同的类别。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可进一步分为亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
本公开的抗体还意在包括双特异性、多特异性、嵌合、人源化和重组构建的分子，其具有由抗体的至少一个CDR区赋予的对多肽的亲和力。单结构域抗体是在本领域中是已知的，其是抗体重链的可变结构域或抗体轻链的可变结构域。参见，如，Holt等人,TrendsBiotechnol.21:484-490,2003。制备含有来自抗体的六个天然存在的互补决定区中的三个的包含抗体重链的可变结构域或抗体轻链的可变结构域的抗体的方法在本领域中也是已知的。参见，如,Muyldermans,Rev.Mol.Biotechnol.74:277-302,2001。
如本文所用，“单克隆抗体”是指基本上同质的抗体中的抗体，即除了可以少量存在的可能的天然存在的突变外，构成该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体通常针对单一抗原位点具有高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰词“单克隆”表示抗体的从基本上同质的抗体群获得的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler和Milstein,1975,Nature,256:495描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过诸如描述于美国专利No.4,816,567中的重组DNA方法制备。也可以使用例如McCafferty等人,1990,Nature,348:552-554中描述的技术产生的噬菌体文库分离单克隆抗体。
如本文所用，“嵌合抗体”是指具有来自第一物种的可变区或可变区的一部分和来自第二物种的恒定区的抗体。完整的嵌合抗体包含两个拷贝的嵌合轻链和两个拷贝的嵌合重链。嵌合抗体的产生是本领域已知的(Cabilly等人(1984),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:3273-3277；Harlow和Lane(1988),Antibodies:a Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory)。通常，在这些嵌合抗体中，轻和重链两者的可变区模拟来源于一个哺乳动物物种的抗体的可变区，而恒定部分与来源于另一物种的抗体中的序列同源。此类嵌合形式的一个明显优势是例如，可以使用来自非人宿主生物体的易于获得的杂交瘤或B细胞与来源于例如人细胞制剂的恒定区组合从目前已知的来源方便地衍生可变区。虽然可变区具有易于制备的优势并且特异性不受其来源的影响，但是当注入抗体时，相较于来源于非人来源的恒定区，来自人的恒定区不太可能引发人受试者的免疫响应。然而，该定义不限于该特定实例。在一些实施方案中，在可变和/或恒定区中进行氨基酸修饰。
如本文所用，“人源化”抗体是指作为特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如抗体的Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或其它抗原结合子序列)的非人(如，鼠)抗体的形式，其含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基被具有所需的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(诸如小鼠、大鼠或兔)的CDR(供体抗体)的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含既不在接受者抗体中也不在导入的CDR或框架序列中存在、但包括在内以进一步改进和优化抗体性能的残基。通常，人源化抗体将基本上包含至少一个且通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的全部或基本上全部的FR区，并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最佳地还包含免疫球蛋白恒定区或结构域(如，Fc结构域)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的一部分。抗体可以具有如WO 99/58572中所述经修饰的Fc区。其它形式的人源化抗体具有一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个)，其相对于原始抗体而言被改变，其也被称为“来源于”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。
如本文所用，“人抗体”意指具有与由人产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体，和/或已经使用本领域已知或本文公开的用于制备人抗体的任何技术制备。人抗体的这种定义包括包含至少一条人重链多肽或至少一条人轻链多肽的抗体。一个此类实例是包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术产生。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中噬菌体文库表示人抗体(Vaughan等人,1996,Nature Biotechnology,14:309-314；Sheets等人,1998,PNAS,(USA)95:6157-6162；Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.,227:381；Marks等人,1991,J.Mol.Biol.,222:581)。人抗体也可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物如小鼠中来制备，在所述小鼠中内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活。该方法描述于美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016中。可替代地，人抗体可以通过使人B淋巴细胞永生来制备，其产生针对靶抗原的抗体(此类B淋巴细胞可以从个体中回收或者可以在体外免疫)。参见，如，Cole等人,Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,1991,J.Immunol.,147(1):86-95；和美国专利No.5,750,373。
抗体的“可变区”(术语“可变结构域”在本文中可互换使用)是指单独或组合的抗体轻链(VL)的可变区或抗体重链(VH)的可变区。重链和轻链的可变区(分别为VH和VL结构域)各自由四个框架区(FR)组成，这四个框架区域由也被称为超变区的三个互补决定区(CDR)连接。每条链中的CDR由FR紧密靠近地保持在一起，并且来自另一条链的CDR有助于形成抗体的抗原结合位点。有至少两种确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版,1991,NationalInstitutes of Health,Bethesda MD))；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。如本文所用，CDR可以是指由任一种方法或两种方法的组合定义的CDR。
许多HVR描绘正在使用并且涵盖在本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列变异性并且是最常用的(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。Chothia相反指的是结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbMHVR代表Kabat HVR和Chothia结构环之间的折衷，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触(contact)”HVR基于可用的复杂晶体结构的分析。来自这些HVR中的每一个的残基如下所述。
当提及可变结构域中的残基(大概是轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(如，Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(如，在Kabat等人，同上报道的EU索引，或和Edelman,G.M.等人(1969)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63:78-85)。
如本文所用的“Fv”可指含有完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段通常由紧密的非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中发出六个高变环(各自来自H和L链的3个环)，其贡献用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力比整个结合位点低。
抗体的“恒定区”(术语“恒定结构域”在本文中可互换使用)是指单独或组合的抗体轻链(CL)的恒定区或抗体重链(CH)的恒定区。抗体的恒定区通常提供结构稳定性和其它生物功能，诸如抗体链缔合、分泌、经胎盘移动和补体结合，但不参与与抗原的结合。恒定区基因中的氨基酸序列和相应的外显子序列取决于它所来源的物种；然而，导致同种异型的氨基酸序列变化对于物种内的特定恒定区来说是相对有限的。每条链的可变区通过连接多肽序列连结至恒定区。键联序列由轻链基因中的“J”序列和重链基因中的“D”序列和“J”序列的组合编码。根据抗体同种型，重链恒定区可包含CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和/或CH4结构域。在某些实施方案中，重链恒定区包含CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
术语“Fc区”(术语“Fc结构域”在本文中可互换使用)在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化；在一些实施方案中，Fc区可以包含铰链区的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，人IgG重链Fc区被定义为从EU位置216处的氨基酸残基至其羧基末端的连续段。适用于本公开的抗体的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A，IgG2B)、IgG3和IgG4。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得sFv能够形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun,The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
术语“双抗体”是指通过以下方式制备的抗体片段：构建sFv片段(参见前段)，其中在VH和VL结构域之间具有短接头(如，约5-12个残基)，使得实现V结构域的链间而不是链内配对，从而得到二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个"交叉"sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更详细地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)"被定义为候选序列中在对齐序列并引入空位(如果有必要)以获得最大的序列同一性百分比并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分后与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式例如使用可公开获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件实现。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
如本文所用，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞或巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞的裂解。可以使用诸如在美国专利No.5,500,362或5,821,337中描述的体外ADCC测定来评估目标分子的ADCC活性。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。可替代地或另外地，可以如在动物模型(诸如Clynes等人,1998,PNAS(USA),95:652-656中公开的动物模型)中体内评估目标分子的ADCC活性。
“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”是指在补体的存在下裂解靶标。补体活化途径由补体系统的第一组分(C1q)与同同源抗原复合的分子(如，抗体)的结合引发。为了评估补体活化，可以进行CDC测定，如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods,202:163(1996)中所述。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，诸如与标记组分缀合。定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。应理解，因为本公开的多肽基于四价抗体，所以多肽可以作为单链或缔合链出现。
如本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和/或RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物中的任何基质(substrate)。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸及它们的类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后例如通过与标记组分缀合进一步修饰。其它类型的修饰包括，例如“帽”；用类似物取代一种或多种天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，诸如例如具有不带电的键联(如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺、氨基甲酸酯等)和具有带电荷的键联(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，含有悬垂部分的那些，诸如例如蛋白质(如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、ply-L-赖氨酸等)，具有嵌入剂(如吖啶、补骨脂素等)的那些，含有螯合剂的那些(如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)，含有烷基化剂的那些，含有经修饰的键联(如，α异头碳核酸等)；以及一种或多种未修饰形式的多核苷酸。此外，通常存在于糖中的任何羟基基团可以被例如膦酸酯基团、磷酸酯基团替代，被标准保护基团保护，或者被活化以制备至另外的核苷酸的另外的键联，或者可以缀合至固体支撑物。5’和3’末端OH可以被磷酸化或被胺或1至20个碳原子的有机封端基团取代。其它羟基也可以来源于标准保护基。多核苷酸还可以含有本领域通常已知的类似形式的核糖或脱氧核糖，包括例如2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基、2'-氟-或2’-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖(诸如阿拉伯糖、木糖、来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、非环状类似物、和无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键可以用可替代的连接基团替代。这些可替代的连接基团包括但不限于其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、“(O)NR2(“酰胺酯”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩醛”)替代的实施方案，其中每个R或R’独立地是H或任选地含有醚(-O-)键联、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)的取代或未取代的烷基(1-20C)。多核苷酸中并非所有的键联都需要相同。前面的描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
如本文所用，“载体”意指能够在宿主细胞中递送并且理想地表达一种或多种目的基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、囊封于脂质体中的DNA或RNA表达载体和某些真核细胞诸如生产细胞。
如本文所用，“表达控制序列”意指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子诸如组成型或诱导型启动子，或增强子。表达控制序列与待转录的核酸序列可操作地连接。
如本文所用，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“治疗有效量”是足以实现有益的、期望的和/或治疗性的结果的量。对于预防性使用，有益或期望的结果包括诸如消除或降低风险、减轻严重性或延迟疾病发作的结果，包括在疾病的发展过程中呈现的疾病的生化症状、组织学症状和/或行为症状、其并发症和中间病理表型。对于治疗性使用，有益或期望的结果包括如下临床结果，诸如减少由疾病引起的一种或多种症状、提高患有该疾病的人的生活质量、减少治疗该疾病所需的其它医药的剂量、增强另一种医药的效果(诸如经由靶向)、延缓疾病的进展和/或延长存活。在治疗等待移植的个体的情况下，例如有效量的药物可以在一定程度上降低个体中的同种抗体和/或PRA的水平。在治疗接受移植或输注的个体的情况下，有效量的药物在与移植或输注相关的一种或多种症状或疾患(诸如移植物排斥)和/或在一定程度上缓解所述症状或疾患方面具有作用。有效量可以在一次或多次施用中施用。出于本公开的目的，药物、化合物或药物组合物的有效量是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。有效剂量可以在一次或多次施用中施用。出于本公开的目的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接完成预防性或治疗性治疗的量。如在临床背景中所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可以与或可以不与另一种药物、化合物或药物组合物结合实现。因此，可以在施用一种或多种治疗剂的情况下考虑“有效剂量”，并且如果与一种或多种其它药剂结合可能或实现期望的结果，可以考虑以有效量给予单一药剂。
如本文所用，“与……结合”是指施用除了另一种治疗模式以外的一种治疗模式。因此，“与……结合”是指向个体施用其它治疗模式之前、期间或之后施用一种治疗模式。
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是用于获得包括期望的临床结果在内的有益或期望结果的方法。有益的、期望的和/或治疗性的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：减少或消除炎症或自身免疫的一种或多种症状(如，源自T细胞介导的炎性疾病)、增加成功的患者结果的可能性和/或减轻一种或多种禁忌症或与医疗相关(如，与移植或输注相关)的有害后果、减少由疾病引起的症状、提高患有该疾病的人的生活质量、减少治疗疾病所需的其它医药的剂量、延迟疾病的进展和/或延长个体的存活。
如本文所用，“延迟疾病的发展”意指迟缓、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推迟疾病(诸如癌症)的发展。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于疾病史和/或被治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会发展疾病。例如，可能延迟炎性疾病诸如T细胞介导的炎性疾病的症状。
“个体”或“受试者”是哺乳动物，更期望是人。哺乳动物还包括但不限于农场动物、运动动物、宠物(诸如猫、狗或马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。
如本文所用，术语“特异性识别”或“特异性结合”是指可测量和可再生的相互作用，诸如靶标与抗体(如全长抗体、抗体片段或抗体VH-VL结合单元)之间的吸引力或结合，其在存在包括生物分子在内的异质分子群的情况下确定靶标的存在。例如，特异性或优先地结合至表位的抗体、抗体片段或抗体VH-VL结合单元是以比其结合至靶标的其它表位或非靶标表位更佳的亲和力、亲合力、更容易和/或以更长的持续时间与该表位结合的抗体。通过阅读该定义还可以理解，例如特异性或优先结合至第一靶标的抗体、抗体片段或抗体VH-VL结合单元可以或可以不特异性或优先地结合至第二靶标。因此，“特异性结合”或“优先结合”不必然要求(尽管它可以包括)排他性结合。特异性结合至靶标的抗体、抗体片段或抗体VH-VL结合单元可具有大于或约103M-1或约104M-1的缔合常数，有时约105M-1或约106M-1，在其它情况下约106M-1或约107M-1、约108M-1至约109M-1、约1010M-1至约1011M-1或更高。多种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体、抗体片段或抗体VH-VL结合单元。例如，固相ELISA免疫测定常规用于选择与蛋白质特异性免疫反应的单克隆抗体。参见，如Harlow和Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPublications,New York，对可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述。
“包装插页”是指通常包括在医药的商业包装中的说明书，其含有医药的商业包装中通常包含的关于适应症的信息，所述医药的商业包装含有关于适应症、使用、剂量、施用、禁忌症、与包装产品组合的其它医药和/或有关使用此类医药的警告等的信息。
如本文和所附权利要求所用，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。例如，对“抗体”的提及是指对一种至多种抗体，诸如摩尔量的提及，并且包括本领域技术人员已知的等效物等。
本文中对“约”值或参数的提及包括(并描述)了针对该值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
应理解，本文描述的本公开的各方面和变化包括“组成”和/或“基本上由......组成”方面和变化。
II.四价抗体
本公开的某些方面涉及特异性结合至人PSGL-1的四价抗体。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单体的二聚体。如下所述，单体可以使用本领域已知的任何方法偶联，包括但不限于在抗体Fc结构域或区域之间的野生型相互作用，在抗体Fc结构域或区域之间的改变或突变的相互作用或区域(如，使用本文所述的铰链区突变)或其它人工共价或非共价相互作用(如，交联或接头)。示例性四价抗体和抗体形式在下面描述并在图1A和1B中示出。
人PSGL-1还可被称为选择素P配体、SELPG、CLA、CD162或PSGL1。在一些实施方案中，本公开的四价抗体结合至由人SELPG基因编码的多肽，所述基因例如如由NCBI RefSeqGene ID No.6404所述。在一些实施方案中，本公开的四价抗体结合至含有15或16个十聚体重复的人PSGL-1多肽。在一些实施方案中，本公开的四价抗体结合至包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本公开的四价抗体结合至包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，本公开的四价抗体结合至包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的多肽并且结合至包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的多肽。SEQ ID NO:31的氨基酸序列描绘了全长人PSGL-1，GenBankTM登录号AAA74577.1，GL902797，并且SEQ ID NO:32的氨基酸序列描绘了较短的402个氨基酸的人PSGL-1蛋白(GenBankTM登录号XP_005269133)。在特定的实施方案中，本文所述的四价抗体特异性结合至人PSGL-1，如例如通过ELISA或本领域已知或本文所述的其它抗原结合测定来测定。
在一些实施方案中，本公开的VH结构域和VL结构域形成VH-VL结合单元(如，其特异性结合表位，诸如人PSGL-1的表位)。如本文所述，可以使用野生型VH-VL相互作用在VH结构域和VL结构域之间形成VH-VL结合单元，或者可以使用一种或多种突变或化学键(如，二硫键，诸如分别在SEQ ID NO:29和30的VH和VL结构域中由半胱氨酸取代引入的vH44-vL100二硫键)进一步稳定VH-VL结合单元。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单体的二聚体，其中二聚体的每个单体包含单链多肽。
在一些实施方案中，本公开的单链、重链和/或轻链多肽包含接头序列。多条接头序列可适用于如连接VH-VL结合单元的VH和VL结构域，连接VH-VL结合单元的VH或VL结构域至另一个VH-VL结合单元的VH或VL结构域，或连接VH-VL结合单元的VH或VL结构域至抗体恒定区，诸如Fc结构域或区域。在一些实施方案中，本公开的接头可存在于结构域或区域之间。在一些实施方案中，本公开的两个结构域或区域可在无接头下连结，或可去除连结两个结构域或区域的接头。使用各种接头进行的此类单链片段的偶联描述于Kortt等人,1997,Protein Engineering,10:423-433中。在一些实施方案中，本公开的接头序列包含1-50个氨基酸。在某些实施方案中，本公开的接头序列包含5-12个氨基酸。示例性接头序列在本文描述并在图1A中列示。在一些实施方案中，本公开的接头序列包含GGGGS(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列的一个或多个重复。在一些实施方案中，本公开的接头序列包含GGGGS(SEQ IDNO:25)的氨基酸序列的两个、三个、四个或五个重复。在一些实施方案中，本公开的接头序列包含SEQ ID NO:33、34、35或36的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的接头序列包含GGGGSAAA(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的接头序列包含ASTGS(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的接头序列包含ASTGSGGGGS(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单链双抗体(scDb)的二聚体，其可任选地融合至抗体恒定区，诸如Fc结构域。
在一些实施方案中，二聚体的每个单体包含单链多肽，所述单链多肽包含：(a)两个轻链可变(VL)结构域，其中两个VL结构域中的每一个包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和其中两个VL结构域对人PSGL-1具有特异性；(b)两个重链可变(VH)结构域，其中两个VH结构域中的每一个包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且其中两个VH结构域对人PSGL-1具有特异性；和(c)抗体Fc结构域。在一些实施方案中，两个VL结构域中的每一个与两个VH结构域的相应VH结构域形成VH-VL结合单元。
在某些实施方案中，两个单链多肽中的每一个从N-末端至C-末端包含：(a)两个VL结构域中的第一VL结构域；(b)第一接头序列；(c)两个VH结构域中的第一VH结构域；(d)第二接头序列；(e)两个VL结构域中的第二VL结构域；(f)第三接头序列；(g)两个VH结构域中的第二VH结构域；(h)第四接头序列；和(i)抗体Fc结构域。在一些实施方案中，第一VL结构域与第二VH结构域形成VH-VL结合单元，并且第一VH结构域与第二VL结构域形成VH-VL结合单元。
在一些实施方案中，第一接头序列、第二接头序列和第三接头序列各自包含SEQID NO:25的氨基酸序列的两个或多个重复。在一些实施方案中，第一、第二或第三接头序列包含SEQ ID NO:33、34、35或36的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一接头序列和第三接头序列具有相同的序列并且包含SEQ ID NO:25的两个重复。在一些实施方案中，第二接头序列包含SEQ ID NO:25的五个重复。在一些实施方案中，第四接头序列包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个串联单链可变片段(scFv)单元(串联scFv称为taFv)的二聚体，其可任选地融合至抗体恒定结构域，诸如重链恒定结构域的Fc结构域。
在某些实施方案中，两个单链多肽中的每一个从N-末端至C-末端包含：(a)两个VH结构域中的第一VH结构域；(b)第一接头序列；(c)两个VL结构域中的第一VL结构域；(d)第二接头序列；(e)两个VL结构域中的第二VL结构域；(f)第三接头序列；(g)两个VH结构域中的第二VH结构域；(h)第四接头序列；和(i)抗体Fc结构域。在一些实施方案中，第一VL结构域与第一VH结构域形成VH-VL结合单元，和第二VH结构域与第二VL结构域形成VH-VL结合单元。在其它实施方案中，两个单链多肽中的每一个从N-末端至C-末端包含：(a)两个VL结构域的第一VL结构域；(b)第一接头序列；(c)两个VH结构域的第一VH结构域；(d)第二接头序列；(e)两个VH结构域的第二VH结构域；(f)第三接头序列；(g)两个VL结构域的第二VL结构域；(h)第四接头序列；和(i)包含抗体Fc结构域的重链恒定结构域。
在一些实施方案中，第一接头序列和第三接头序列具有包含SEQ ID NO:25的五个重复的相同的序列。在一些实施方案中，第二接头序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，第四接头序列包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单体的二聚体，其中二聚体的每个单体包含抗体重链和抗体轻链。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含轻链，所述轻链包含：(i)两个轻链可变(VL)结构域，其中两个VL结构域中的每一个包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，并且其中两个VL结构域对人PSGL-1具有特异性，(ii)第一重链可变(VH)结构域，和(iii)轻链恒定(CL)结构域；和/或重链，所述重链包含：(i)第二重链可变(VH)结构域，和(ii)重链恒定区，其包含第一重链恒定区(CH1)结构域、抗体铰链区、第二重链恒定区(CH2)结构域和第三重链恒定区(CH3)结构域。在一些实施方案中，第一和第二VH结构域各自包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，第一和第二VH结构域对人PSGL-1具有特异性。在一些实施方案中，两个VL结构域中的每一个与第一和第二VH结构域的相应VH结构域形成VH-VL结合单元。
在某些实施方案中，抗体轻链从N-末端至C-末端包含：(a)第一VH结构域；(b)第一接头序列；(c)两个或多个VL结构域中的第一VL结构域；(d)第二接头序列；(e)两个或多个VL结构域中的第二VL结构域；和(f)CL结构域。在一些实施方案中，CL结构域是κCL结构域。在其它实施方案中，CL结构域是λCL结构域。在一些实施方案中，第一VL结构域与第一VH结构域形成VH-VL结合单元，并且第二VH结构域与第二VL结构域形成VH-VL结合单元。
在一些实施方案中，第一接头序列包含SEQ ID NO:25的五个重复。在一些实施方案中，第二接头序列包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含轻链，所述轻链从N-末端至C-末端包含：(a)两个VL结构域中的第一VL结构域；(b)CL结构域；(c)第一接头序列；(d)第一VH结构域；(e)第二接头序列；和(f)两个VL结构域中的第二VL结构域。在一些实施方案中，CL结构域是κCL结构域。在其它实施方案中，CL结构域是λCL结构域。
在一些实施方案中，第一接头序列包含SEQ ID NO:25的两个重复。在一些实施方案中，第二接头序列包含SEQ ID NO:25的五个重复。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含重链，其从N-末端至C-末端包含：(a)两个VH结构域中的第二个；和(b)重链恒定区，其包含第一重链恒定区(CH1)结构域、抗体铰链区、第二重链恒定区(CH2)结构域和第三重链恒定区(CH3)结构域。在一些实施方案中，抗体Fc结构域包含重链恒定2(CH2)结构域和重链恒定3(CH3)结构域。在一些实施方案中，第一VL结构域与第一VH结构域形成VH-VL结合单元，并且第二VH结构域与第二VL结构域形成VH-VL结合单元。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含轻链，所述轻链包含：(i)第一重链可变(VH)结构域，(ii)第一轻链可变(VL)结构域，和(iii)轻链恒定(CL)结构域；和/或重链，所述重链包含：(i)第二重链可变(VH)结构域，(ii)第二轻链可变(VL)结构域，和(iii)重链恒定区，其包含第一重链恒定区(CH1)结构域、抗体铰链区、第二重链恒定区(CH2)结构域和第三重链恒定区(CH3)结构域。在一些实施方案中，第一和第二VL结构域中的每一个包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，第一和第二VL结构域对人PSGL-1具有特异性。在一些实施方案中，第一和第二VH结构域中的每一个包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，第一和第二VH结构域对人PSGL-1具有特异性。在一些实施方案中，第一和第二VL结构域中的每一个与第一和第二VH结构域的相应VH结构域形成VH-VL结合单元。
在一些实施方案中，抗体轻链从N-末端至C-末端包含：(a)第一VH结构域；(b)第一接头序列；(c)第一VL结构域；和(d)CL结构域。在一些实施方案中，CL结构域是κCL结构域。在其它实施方案中，CL结构域是λCL结构域。
在一些实施方案中，第一接头序列包含SEQ ID NO:25的五个重复。
在一些实施方案中，抗体重链从N-末端至C-末端包含：(a)两个VH结构域中的第二个；(b)第二接头序列；(c)两个VL结构域中的第二个；和(d)重链恒定区，其包含第一重链恒定区(CH1)结构域、抗体铰链区、第二重链恒定区(CH2)结构域和第三重链恒定区(CH3)结构域。在一些实施方案中，抗体Fc结构域包含重链恒定2(CH2)结构域和重链恒定3(CH3)结构域。
在一些实施方案中，第二接头序列包含SEQ ID NO:25的五个重复。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含一个或多个VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的一个或多个CDR：(i)CDR-H1，其包含氨基酸序列SFGMH(SEQ ID NO:17)；(ii)CDR-H2，其包含氨基酸序列YINGGSSTIFYANAVKG(SEQ ID NO:18)；和(iii)CDR-H3，其包含氨基酸序列YASYGGGAMDY(SEQ ID NO:19)。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含一个或多个VH结构域，所述VH结构域包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体是两个单体的二聚体，每个单体包含两个VH结构域，每个VH结构域包含选自以下的一个或多个CDR：(i)CDR-H1，其包含氨基酸序列SFGMH(SEQ ID NO:17)；(ii)CDR-H2，其包含氨基酸序列YINGGSSTIFYANAVKG(SEQ ID NO:18)；和(iii)CDR-H3，其包含氨基酸序列YASYGGGAMDY(SEQ ID NO:19)。在一些实施方案中，本公开的四价抗体是两个单体的二聚体，每个单体包含两个VH结构域，每个VH结构域包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含一个或多个VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含含有两个VH结构域的单体，每个VH结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含一个或多个VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含含有两个VH结构域的单体，每个VH结构域包含SEQID NO:29的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含一个或多个VH结构域，所述VH结构域包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含含有两个VH结构域的单体，每个VH结构域包含具有与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(如，保守性取代)、插入或缺失，但包含此序列的抗人PSGL-1抗体保留结合至人PSGL-1的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:23中总计1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含一个或多个VH结构域，所述VH结构域包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含含有两个VH结构域的单体，每个VH结构域包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(如，保守性取代)、插入或缺失，但包含此序列的抗人PSGL-1抗体保留结合至人PSGL-1的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:29中总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含一个或多个VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的一个或多个CDR：(i)CDR-L1，其包含氨基酸序列RSSQSIVHNDGNTYFE(SEQ IDNO:20)；(ii)CDR-L2，其包含氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO:21)；和(iii)CDR-L3，其包含氨基酸序列FQGSYVPLT(SEQ ID NO:22)。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含一个或多个VL结构域，所述VL结构域包含：(i)CDR-L1，其包含氨基酸序列RSSQSIVHNDGNTYFE(SEQID NO:20)；(ii)CDR-L2，其包含氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO:21)；和(iii)CDR-L3，其包含氨基酸序列FQGSYVPLT(SEQ ID NO:22)。在一些实施方案中，本公开的四价抗体是两个单体的二聚体，每个单体包含两个VL结构域，每个VL结构域包含选自以下的一个或多个CDR：(i)CDR-L1，其包含氨基酸序列RSSQSIVHNDGNTYFE(SEQ ID NO:20)；(ii)CDR-L2，其包含氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO:21)；和(iii)CDR-L3，其包含氨基酸序列FQGSYVPLT(SEQ IDNO:22)。在一些实施方案中，本公开的四价抗体是两个单体的二聚体，每个单体包含两个VL结构域，每个VL结构域包含：(i)CDR-L1，其包含氨基酸序列RSSQSIVHNDGNTYFE(SEQ ID NO:20)；(ii)CDR-L2，其包含氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO:21)；和(iii)CDR-L3，其包含氨基酸序列FQGSYVPLT(SEQ ID NO:22)。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含一个或多个VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含含有两个VL结构域的单体，每个VL结构域包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含一个或多个VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含含有两个VL结构域的单体，每个VL结构域包含SEQID NO:30的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含一个或多个VL结构域，所述VL结构域包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含含有两个VL结构域的单体，每个VL结构域包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(如、保守性取代)、插入或缺失，但包含此序列的抗人PSGL-1抗体保留结合至人PSGL-1的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:24中总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含一个或多个VL结构域，所述VL结构域包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含含有两个VL结构域的单体，每个VL结构域包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(如保守性取代)、插入或缺失，但包含该序列的抗人PSGL-1抗体保留结合至人PSGL-1的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:30中总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含单链多肽，所述单链多肽包含与SEQID NO:1、3或5的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单体的二聚体，每个单体包含两个单链多肽，每个单链多肽包含与SEQ ID NO:1、3或5的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的单链多肽序列相对于参考序列含有取代(如，保守性取代)、插入或缺失，但包含此序列的抗人PSGL-1抗体保留结合至人PSGL-1的能力。在一些实施方案中，在SEQ IDNO:1、3或5中总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单链多肽，每个多肽包含SEQ ID NO:1、3或5的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含单链多肽，所述单链多肽包含与由SEQID NO:2、4或6的多核苷酸序列编码的单链多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单体的二聚体，每个单体包含两个单链多肽，每个单链多肽包含与由SEQ IDNO:2、4或6的多核苷酸序列编码的单链多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的单链多肽序列相对于参考序列含有取代(如保守性取代)、插入或缺失，但包含此序列的抗人PSGL-1抗体保留结合至人PSGL-1的能力。在一些实施方案中，在由SEQ ID NO:2、4或6的多核苷酸序列编码的单链多肽中总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单链多肽，每个多肽由SEQ ID NO:2、4或6的多核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含轻链多肽，所述轻链多肽包含与SEQID NO:7、9或13的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单体的二聚体，每个单体包含重链和轻链，并且每条轻链包含与SEQ ID NO:7、9或13的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链多肽序列相对于参考序列含有取代(如保守性取代)、插入或缺失，但包含此序列的抗人PSGL-1抗体保留结合至人PSGL-1的能力。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:7、9或13中总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单体的二聚体，每个单体包含重链和轻链，并且每条轻链包含SEQ ID NO:7、9或13的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含轻链多肽，所述轻链多肽包含与由SEQID NO:8、10或14的多核苷酸序列编码的轻链多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单体的二聚体，每个单体包含重链和轻链，并且每条轻链包含与由SEQ IDNO:8、10或14的多核苷酸序列编码的轻链多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链多肽序列相对于参考序列含有取代(如保守性取代)、插入或缺失，但包含此序列的抗人PSGL-1抗体保留结合至人PSGL-1的能力。在一些实施方案中，在由SEQ ID NO:8、10或14的多核苷酸序列编码的轻链多肽中总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单体的二聚体，每个单体包含重链和轻链，并且每条轻链包含由SEQ ID NO:8、10或14的多核苷酸序列编码的轻链多肽。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含重链多肽，所述重链多肽包含与SEQID NO:11或15的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单体的二聚体，每个单体包含重链和轻链，并且每条重链包含与SEQ ID NO:11或15的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链多肽序列相对于参考序列含有取代(如保守性取代)、插入或缺失，但包含此序列的抗人PSGL-1抗体保留结合至人PSGL-1的能力。在一些实施方案中，在SEQ IDNO:11或15中总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单体的二聚体，每个单体包含重链和轻链，并且每条轻链包含SEQ IDNO:11或15的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含重链多肽，所述重链多肽包含与由SEQID NO:12或16的多核苷酸序列编码的重链多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单体的二聚体，每个单体包含重链和轻链，并且每条重链包含与由SEQ IDNO:12或16的多核苷酸序列编码的重链多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链多肽序列相对于参考序列含有取代(如保守性取代)、插入或缺失，但包含此序列的抗人PSGL-1抗体保留结合至人PSGL-1的能力。在一些实施方案中，在由SEQ ID NO:12或16的多核苷酸序列编码的重链多肽中总计1至10个氨基酸已经被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含两个单体的二聚体，每个单体包含重链和轻链，并且每条重链包含由SEQ ID NO:12或16的多核苷酸序列编码的轻链多肽。
本公开公开涵盖对本文所述的抗体或多肽(包括功能等效的抗体)的不显著影响其性质的修饰，和具有增强或降低的活性和/或亲和力的变型。多肽的修饰是本领域的常规实践，并且不需要在本文中详细描述。经修饰的多肽的实例包括具有不显著有害地改变化学类似物的功能活性或用途的保守性氨基酸残基取代、一种或多种的氨基酸缺失或添加的多肽。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫基残基的抗体或与表位标签融合的抗体。抗体分子的其它插入变型包括与增加抗体的血清半寿期的酶或多肽的抗体的N-或C-末端的融合。
取代变型在抗体分子中除去至少一个氨基酸残基并在其位置插入不同的残基。取代诱变的最感兴趣的位点包括超变区，但也考虑了FR改变。保守性取代显示在下表的“保守性取代”标题下。如果此类取代导致生物活性发生变化，则可以引入在下表中称为“示例性取代”或如在下文参考氨基酸类别进一步描述的更多实质性变化，并筛选产物。
氨基酸取代
抗体的生物性质的实质修饰是通过选择对维持以下方面的作用存在显著差异的取代来实现的：(a)取代区域中例如呈折叠或螺旋构象的多肽主链的结构，(b)靶位点处的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的大部分。天然存在的残基基于共同的侧链性质分为以下几组：
(1)非极性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)极性不带电荷：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性(带负电)：Asp、Glu；
(4)碱性(带正电)：Lys、Arg；
(5)影响链朝向的残基：Gly、Pro；和
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe、His
非保守性取代是通过将这些类别中的一个的成员交换为另一类别来完成的。
不参与维持抗体正确构象的任何半胱氨酸残基也可以通常用丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可以将一个或多个半胱氨酸键添加到抗体中以改善其稳定性，特别是在抗体是诸如Fv片段的抗体片段的情况下。本文描述了示例性半胱氨酸突变(如，SEQ ID NO:29的G44C VH结构域突变，或SEQ ID NO:30的Q100C VL结构域突变)。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体包含抗体Fc结构域。在一些实施方案中，抗体Fc结构域是人Fc结构域。在某些实施方案中，抗体Fc结构域是人IgG4 Fc结构域。
在一些实施方案中，修饰在抗体的重链恒定区和/或轻链恒定区中的一个或多个氨基酸残基。例如，可以修饰实施例中描述的抗体的氨基酸残基。在一些实施方案中，修饰抗体的Fc区以增强或降低抗体的ADCC和/或CDC活性。参见Shields等人,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)；Presta等人,Biochem.Soc.Trans.30:487-490(2002)。
在一些实施方案中，修饰抗体的Fc区以增强二聚体形成和/或稳定性，或减少二聚体异质性(如，改组)。已经证明，人IgG4的铰链区中的使用Kabat编号(Kabat等人1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH Publication No.91-3242)的位置241处或使用EU索引(Edelman等人,1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,63(1):78-85)的位置228处的丝氨酸至脯氨酸突变导致链内二硫键形成显著减少，从而导致IgG4"半-抗体"分子减少和减少的IgG4分子异质性/改组(Bloom等人1997,Protein Sci,6:407-415；Angal等人1993,MolecularImmunology,30(1):105-108))。还有公开的报道称这种铰链突变可以减少IgG4改组并增加IgG4分子的体内半寿期(Labrijn,等人,2009,Nat Biotechnol 27:767-771；Stubenrauch,等人,2010,Drug Metab Dispos 38:84-91)。Van der Neut Kolfschoten等人报道，IgG4的CH3结构域而不是核铰链主要参与Fab臂交换反应(参见Van der Neut Kolfschoten等人,2007,Science,317:1554-1557("Van der Neut Kolfschoten")，第1555页，第2栏)。Vander Neut Kolfschaten报道，用IgG1的CH3结构域交换IgG4的CH3结构域活化了IgG1的Fab臂交换，而交换IgG4的CH3结构域消除了IgG4的Fab臂交换(参见，第1555页和图2D)。
在一个特定的实施方案中，本文提供了特异性结合至PSGL-1并且在IgG4铰链区种含有一种或多种氨基酸取代的四价抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段保留特异性结合至所述PSGL-1并且其中IgG4改组相对于包含不含所述一种或多种氨基酸取代的IgG4铰链区的抗体减少。在一个特定的实施方案中，IgG4铰链区仅包含单个氨基酸取代。"人IgG4铰链区"的实例是CHI和CH2结构域之间的IgG4抗体重链上的区域，如Angal等人,1993,Molecular Immunology,30(1):105-108中所述。
在一个特定的实施方案中，IgG4改组的减少通过以下方式来确定：相较于由含有不包含一种或多种氨基酸取代的IgG4铰链区的IgG4分子产生的半抗体分子或臂交换的量，检测较低量的由在铰链区中含有所述的一种或多种氨基酸取代的本文所述的抗体产生的半抗体分子或臂交换。本领域熟知的任何测定均可用于检测半抗体产生和双特异性抗体分子。参见，如，Van der Neut Kolfschoten等人,2007,Science,317:1554-1557，例如用于检测双特异性抗体产生的测定。
在一个特定的实施方案中，本文提供了四价抗体，其特异性结合至PSGL-1并且包含人IgG4 Fc结构域，所述人IgG4 Fc结构域包含在根据EU索引编号的重链的氨基酸位置228(也被称为使用Kabat编号的位置241)处的丝氨酸至脯氨酸氨基酸取代。
修饰还包括糖基化和非糖基化的多肽，以及具有其它翻译后修饰，诸如例如用不同的糖进行的糖基化、乙酰化和磷酸化的多肽。抗体在其恒定区中的保守位置处被糖基化(Jefferis和Lund,1997,Chem.Immunol.65:111-128；Wright和Morrison,1997,TibTECH15:26-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白质的功能(Boyd等人,1996,Mol.Immunol.32:1311-1318；Wittwe和Howard,1990,Biochem.29:4175-4180)和糖蛋白的各部分之间的分子间相互作用，其可以影响糖蛋白的构象和呈现的三维表面(Hefferis和Lund，同上；Wyss和Wagner,1996,Current Opin.Biotech.7:409-416)。基于特异性的识别结构，寡糖还可用于将给定的糖蛋白靶向至某些分子。据报道，抗体的糖基化也影响抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。特别地，具有四环素调控的β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)(一种催化二等分GlcNAc形成的糖基转移酶)表达的CHO细胞，据报道具有提高的ADCC活性(Umana等人,1999,Mature Biotech.17:176-180)。
抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸和天冬酰胺-X-半胱氨酸，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸，是碳水化合物部分至天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因此，在多肽中存在这些三肽序列中的任何一个都会产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可能使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列使得其含有一种或多种上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)，可方便地实现将糖基化位点添加到抗体。也可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加或取代至原始抗体的序列(对于O-连接的糖基化位点)来进行改变。
也可以改变抗体的糖基化模式而不改变基础核苷酸序列。糖基化很大程度上取决于用于表达抗体的宿主细胞。由于用于将重组糖蛋白如抗体表达为潜在的治疗剂的细胞类型很少是天然细胞，所以可以预期抗体的糖基化方式的变化(参见，如，Hse等人,1997,J.Biol.Chem.272:9062-9070)。
除了对宿主细胞的选择之外，影响抗体重组产生过程中糖基化的因素包括生长模式、培养基配方、培养密度、氧合作用、pH、纯化方案等。已经提出了各种方法来改变在特定宿主生物体中实现的糖基化模式，包括引入或过量表达参与寡糖产生的某些酶(美国专利No.5,047,335；5,510,261；和5,278,299)。糖基化或某些类型的糖基化可以例如使用内切糖苷酶H(Endo H)、N-糖苷酶F、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2或内切糖苷酶F3从糖蛋白中酶促地去除。此外，重组宿主细胞可经遗传工程改造以在处理某些类型的多糖时存在缺陷。这些和类似的技术在本领域中是众所周知的。
在一些实施方案中，使用本领域已知的偶联技术修饰本公开的抗体，所述技术包括但不限于酶促方法、氧化取代和螯合。修饰可用于例如连接用于免疫测定的标记。
本公开的四价抗体或多肽可以缀合(例如，连接)至药剂，诸如治疗剂或标记。治疗剂的实例是放射性部分、细胞毒素和化学治疗性分子。
本公开的四价抗体(或多肽)可以与标记诸如荧光分子、放射性分子、酶或本领域已知的任何其它标记连接。如本文所用，术语“标记”是指可以检测的任何分子。在某一个实施方案中，可以通过掺入放射性标记的氨基酸来标记抗体。在某一个实施方案中，可以通过标记的亲和素(如含有荧光标记或酶促活性的链霉亲和素，其可通过光学或比色方法检测)检测的生物素部分可以连接至抗体。在某些实施方案中，可以将标记掺入或连接至另一种试剂，所述试剂继而结合至目标抗体。例如，可以将标记掺入或连接至抗体，所述抗体继而特异性结合目标抗体。在某些实施方案中，标记也可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法在本领域中是已知的并且可以使用。某些一般类别的标记包括但不限于酶促标记、荧光标记、化学发光标记和放射性标记。用于多肽的标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I或131I)；荧光标记(如，异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、镧系元素荧光粉或藻红素(PE))；酶促标记(如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、青霉素酶或或荧光素酶)；化学发光的生物素基团；由二级报告物识别的预定的多肽表位(如，亮氨酸拉链对序列，二抗的结合位点，金属结合结构域，或表位标签)。在某些实施方案中，标记通过各种长度的间隔子臂连接，以减少潜在的空间位阻。
基于本文的描述，本公开的四价抗体可以根据本领域已知的多种体外和体内测定进行测试。此类测定可以包括，如针对四价抗体或其片段结合目标表位或多肽(如，人PSGL-1或其表位)的能力的结合测定，或针对四价抗体或其片段的一种或多种功能性质的功能性测定。
在一些实施方案中，可以测试本公开的四价抗体对人PSGL-1的结合活性。在一个实施方案中，可以在体外结合测定中测试四价抗体与人PSGL-1或其表位的结合。多种结合测定是本领域已知的。此类结合测定可以是基于细胞的测定(如，测试四价抗体结合表达人PSGL-1或其表位的细胞的能力)，或者它们可以是基于多肽的(如，测试四价抗体结合人PSGL-1或其表位的能力)。在一些实施方案中，通过流式细胞术、FRET、组织化学测定等，测试本公开的四价抗体与表达人PSGL-1的细胞(如，如下所示例的Sp2细胞)的结合。其它适合的结合测定可包括但不限于平衡方法(如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、BiacoreTM分析、间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、免疫沉淀、凝胶电泳和色谱(如，凝胶过滤)。
在一些实施方案中，可以测试本公开的四价抗体的针对PSGL-1功能的一种或多种功能性测定。在一些实施方案中，可以在表达人PSGL-1的一个或多个细胞中测试本公开的四价抗体的凋亡诱导。在一些实施方案中，本公开的四价抗体在靶细胞(如，表达人PSGL-1或其表位的细胞)中展现出与具有与四价抗体(如，亲本抗体)共有的一个或多个VH或VL结构域的常规(如，二价)抗体相比增强的凋亡诱导。如本文所证明，本公开的四价抗体展现出比具有共有VH和/或VL结构域的亲本抗体在诱导靶细胞中的凋亡方面更有效力。凋亡测定描述于本领域中，并可由本领域的技术人员容易地实施(参见，如Muppidi,J.,Porter,M.和Siegel,R.M.2004.Measurement of Apoptosis and Other Forms of CellDeath.Current Protocols in Immunology.59:3.17.1-3.17.36)。用于检测凋亡的选定测定(如，膜联蛋白V或碘化丙啶染色)在上文示例。术语"诱导(induce)"或"诱导(inducing)"意指启动或增加凋亡高于对照水平。活化的T细胞的凋亡可相较于对照(如在本文所述的抗体不存在下或在非特异性抗体存在下，活化的T细胞的凋亡)，被诱导约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％或更高。
适合用于本文所述的与PSGL-1活性相关的测定的T细胞和T细胞系是容易获得的(如，ARR、DU.528、Jurkat、H-SB2、RPMI 8402、CML-T1、Karpas45、KE-37/SKW-3、SUP-T1、SUP-T3、MOLT 3/4、P12-Ichikawa、PF-382、CCRF-CEM、HPB-ALL、K-Tl、TALL-1、MOLT 16/17、TALL-104、DND-41、Loucy、MOLT 13、Peer/Bel3、HUT 78/H9、HUT 102、MT-1、DEL、JB6、Karpas 299、SU-DHL1、12H5、3D054.8、3DO11.10、8D051.15或3D018.3)，或可以使用本领域已知的方法容易地鉴别(参见，如，Thornton,A.M.2003.Fractionation of T and B Cells UsingMagnetic Beads.Current Protocols in Immunology.55:3.5A.l-3.5A.i l.；Hathcock,K.2001.T Cell Enrichment by Cytotoxic Elimination of B Cells and AccessoryCells.Current Protocols in Immunology.00:3.3.1-3.3.5.，Horgan,K.,Shaw,S.和Boirivant,M.2009.Immunomagnetic Purification of T Cell Subpopulations.CurrentProtocols in Immunology.85:7.4.1-7.4.9.，及Kanof,M.E.2001.Purification of TCell Subpopulations.Current Protocols in Immunology.00:7.3.1-7.3.5)。在具体的实施方案中，用于细胞增殖测定的细胞或细胞系可以内源性或重组性地表达PSGL-1。用于细胞存活力测定的细胞或细胞系可以内源性或重组性地表达PSGL-1，并且响应于PSGL-1配体或抗PSGL-1抗体结合表现细胞存活力的变化。用于凋亡测定的细胞或细胞系可以内源性或重组地表达PSGL-1，并且响应于PSGL-1配体或抗PSGL-1抗体结合而表现凋亡的变化。优选地，细胞或细胞系是人(如ARR、DU.528、Jurkat、H-SB2、RPMI 8402、CML-Tl、Karpas45、KE-37/SKW-3、SUP-Tl、SUP-T3、MOLT 3/4、P12-Ichikawa、PF-382、CCRF-CEM、HPB-ALL、K-Tl、TALL-1、MOLT 16/17、TALL-104、DND-41、Loucy、MOLT 13、Peer/Bel3、HUT 78/H9、HUT 102、MT-1、DEL、JB6、Karpas 299或SU-DHL1)。
在一些实施方案中，可测试本公开的四价抗体的对迟发型超敏反应(DTH)的抑制。在一些实施方案中，本公开的四价抗体展现出相较于具有与四价抗体(如，亲本抗体)共有的一个或多个VH或VL结构域的常规(如，二价)抗体增强的DTH抑制(如在转移体内动物模型中)。如本文所证明，本公开的四价抗体于转移体内小鼠足跖肿胀模型中在抑制DTH方面展现出比具有共有的VH和/或VL结构域的亲本抗体更大的效力。DTH测定在本领域中描述并在下文举例说明，并且可由本领域技术人员容易地进行。在一些实施方案中，本公开的四价抗体可展现出DTH抑制的效力，其可相较于对照(如常规或二价抗体，诸如亲本抗体对DTH的抑制)增加约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％、约200％、约300％、约400％、约500％、约600％或更大。
III.多核苷酸、载体、宿主细胞和抗体产生
本公开还提供了多核苷酸，其包括编码本文所述的任何四价抗体和/或多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，多肽包含轻链和重链可变区的序列。在一些实施方案中，多核苷酸是分离的多核苷酸(如，从宿主细胞分离或从一种或多种不同的多核苷酸分离)。
本文提供了编码本文所述的四价抗体或多肽成分(如，单体诸如单链多肽、抗体重链和/或抗体轻链)中的任一种的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸编码选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15和17-31的多肽序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和16的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸包含一个或多个内含子。在其它实施方案中，本公开的多核苷酸不包含内含子，如cDNA或经加工的mRNA序列。
本领域普通技术人员应理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码如本文所述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。因此，由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸是本公开特别考虑的。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本公开的范围内。等位基因是内源基因，其由于核苷酸的一种或多种突变，诸如缺失、添加和/或取代而改变。所得的mRNA和蛋白可以但不必具有改变的结构或功能。可以使用标准技术(诸如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来鉴别等位基因。
本文还提供了如通过密码子/RNA优化、用异源信号序列替代和消除mRNA稳定性元件来优化的多核苷酸。通过在mRNA中引入密码子变化和/或消除抑制性区域进行的生成编码四价抗体或其多肽的经优化的核酸以用于重组表达的方法，可以通过相应地改进如美国专利No.5,965,726；6,174,666；6,291,664；6,414,132；和6,794,498中所述的优化方法来进行。例如，可以突变RNA内的潜在剪接位点和不稳定性元件(如，富A/T或A/U元件)而不改变由核酸序列编码的氨基酸，以增加用于重组表达的RNA的稳定性。所述改变利用遗传密码的简并性，如使用相同的氨基酸的替代密码子。在一些实施方案中，可能需要改变一个或多个密码子以编码保守性突变，如具有与原始氨基酸相似的化学结构和性质和/或功能的类似氨基酸。此类方法可以相对于由未经优化的多核苷酸编码的抗PSGL-1四价抗体或其多肽的表达增加抗PSGL-1四价抗体或其多肽的表达。此外，多核苷酸序列可以设计成与宿主细胞中的优选密码子使用(如大肠杆菌密码子使用或CHO密码子使用)相匹配。
编码本文所述的四价抗体或其多肽的经优化的多核苷酸序列可以与编码本文所述的四价抗体或其多肽的未经优化的多核苷酸序列杂交。在特定的实施方案中，编码本文所述的四价抗体或其多肽的经优化的核苷酸序列在高严格性条件下与编码本文所述的四价抗体或其多肽的未经优化的多核苷酸序列杂交。在一个特定的实施方案中，编码本文所述的四价抗体或其多肽的经优化的核苷酸序列在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下与编码本文所述的四价抗体或其多肽的未经优化的核苷酸序列杂交。已经描述了有关杂交条件的信息，参见，如美国专利申请公开No.US 2005/0048549(如，第72-73段)，其通过引用整体并入本文。
可以使用化学合成、重组方法或PCR获得本公开的多核苷酸。化学多核苷酸合成的方法在本领域中是公知的，并且在本文中不需要详细描述。本领域的技术人员可以使用本文提供的序列和商业DNA合成仪来产生所需的DNA序列。
为了使用重组方法制备多核苷酸，可以将包含所需序列的多核苷酸插入适合的载体中，并且可继而将载体引入适用于复制和扩增的宿主细胞中，如本文进一步讨论。可以通过本领域已知的任何方法将多核苷酸插入宿主细胞中。通过经由直接摄取、胞吞作用、转染、F-交配或电穿孔引入外源性多核苷酸来转化细胞。一旦引入，可以将外源性多核苷酸作为非整合的载体(诸如质粒)维持在细胞内或整合到宿主细胞基因组中。如此扩增的多核苷酸可以通过本领域熟知的方法从宿主细胞分离。参见，如，Sambrook等人(1989)。
可替代地，PCR允许复制DNA序列。PCR技术在本领域中是众所周知的，并且描述于美国专利No.4,683,195；4,800,159；4,754,065；和4,683,202，以及PCR:The PolymeraseChain Reaction,Mullis等人编辑,Birkauswer Press,Boston(1994)。
本公开还提供了载体(如，克隆载体或表达载体)，其包含编码本文所述的任何多肽(包括抗体)的核酸序列。适合的克隆载体可根据标准技术构建或可选自本领域可获得的大量克隆载体。虽然选择的克隆载体可能根据意在使用的宿主细胞而不同，但有用的克隆载体通常具有自我复制的能力，可能具有特定限制性内切核酸酶的单一靶标，和/或可携带可用于选择含有载体的克隆的标记的基因。适合的实例包括质粒和细菌病毒，如，pUC18、pUC19、Bluescript(如，pBS SK+)及其衍生物、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4，噬菌体DNA，和穿梭载体诸如pSA3和pAT28。这些和许多其它克隆载体可从商业供应商诸如BioRad、Strategene和Invitrogen获得。
表达载体通常是可复制的多核苷酸构建体，其含有根据本公开的多核苷酸。表达载体可以作为附加体或作为染色体DNA的组成部分在宿主细胞中复制。适合的表达载体包括但不限于质粒；病毒载体，包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒；粘粒和PCT公开No.WO87/04462中公开的一种或多种表达载体。载体组分通常可以包括但不限于以下一种或多种：信号序列；复制起点；一种或多种标记基因；和适合的转录控制元件(诸如启动子、增强子或终止子)。对于表达(即翻译)，通常还需要一个或多个翻译控制元件，诸如核糖体结合位点、翻译起始位点或终止密码子。
制备抗体和来源于抗体的多肽的方法在本领域中是已知的并在本文中公开。完善的方法可用于鉴别抗PSGL抗体(如，特异性结合至人PSGL-1的抗体)，其中可变结构域(如，VH和/或VL结构域)可用于本公开的四价抗体中。示例性抗人PSGL-1抗体，以及筛选、产生和纯化此类抗体的方法，描述于国际申请公开No.WO 2012/174001中。
另外的抗人PSGL-1抗体可使用本领域已知的方法鉴定，诸如国际申请公开No.WO2012/174001和上文中所述的那些方法。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术制备，诸如Kohler和Milstein(1975),Nature,256:495中所述的那些技术。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠或其它适当的宿主动物通常用免疫剂(如，表达人PSGL-1或其片段的细胞)免疫以引发产生或能够产生特异性结合至免疫剂的抗体的淋巴细胞。可替代地，淋巴细胞可以在体外免疫。然后使用适合的融合剂诸如聚乙二醇，将淋巴细胞与永生化的细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,(1986)第59-1031页)。永生化的细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、兔、牛或人来源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在适合的培养基中培养，所述培养基理想地含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常包含次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷(“HAT培养基”)，所述物质防止HGPRT缺陷型细胞的生长。
所需的永生化细胞系是那些有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持稳定的高水平抗体表达并且对培养基诸如HAT培养基敏感的细胞系。更合乎需要的永生化细胞系是鼠骨髓瘤系，其例如可以从Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,CA和American Type Culture Collection,Manassas,VA获得。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也被描述用于产生人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.(1984),133:3001；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York,(1987)
第51-63页)。
然后可以测定其中培养杂交瘤细胞的培养基是否存在单克隆抗体。可以筛选抗体与从血浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、结肠直肠癌、胃癌或食道癌或肿瘤细胞的细胞表面获得的或在其上表达的ORP150多肽的特异性结合(诸如结合至ORP150多肽的胞外结构域中的表位)。癌细胞或ORP150多肽(或含有ORP150多肽的胞外结构域的片段)可用于筛选。例如，RPMI8226、U266、NCI-H929、L363、Colo205、DLD-1、HT29、SNU-1、Kato-III或CE146T细胞可用于筛选。包含SEQ ID NO:17的氨基酸673-800、701-800、673-752或723-732的多肽也可用于筛选。
在一些实施方案中，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或体外结合测定，诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定。此类技术和测定在本领域中是已知的。单克隆抗体的结合亲和力可以，例如通过Munson和Pollard(1980),Anal.Biochem.,107:220的Scatchard分析测定。
在鉴定出所需的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆，并通过标准方法(Goding，同上)使其生长。适用于该目的的培养基包括例如杜尔贝科氏改良的伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)或RPMI-1640培养基。可替代地，杂交瘤细胞可以在体内作为哺乳动物中的腹水生长。
单克隆抗体可以通过培养杂交瘤细胞产生，并且由杂交瘤细胞分泌的抗体可以经进一步分离或纯化。抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化程序从培养基或腹水中分离或纯化，诸如例如，蛋白质A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱。
可以通过筛选抗体或多肽的文库以选择结合至如在细胞的细胞表面上表达的人PSGL-1结合的抗体或多肽，来产生本公开的四价抗体或多肽。可以使用本领域已知的抗体噬菌体展示文库。在一些实施方案中，文库中的抗体(如，展示于噬菌体上)是单链Fv(scFv)片段或Fab片段。在一些实施方案中，文库中的抗体(如，展示在噬菌体上)是单结构域抗体。例如，单结构域抗体可以包含重链可变结构域的全部或一部分，或抗体的轻链可变结构域的全部或一部分。在一些实施方案中，文库中的抗体是人抗体。可以使用本领域已知和本文描述的方法进一步测试经鉴定的抗体诱导细胞死亡(如，凋亡)和/或结合人PSGL-1的能力。
本公开的四价抗体可以通过重组DNA方法制备，诸如美国专利No.4,816,567和6,331,415中描述的那些方法。例如，编码任何本公开的四价抗体(或作为其组分的单个、重链或轻链多肽)的可变区或恒定区的DNA可以容易地使用常规程序(如，通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)进行分离和测序。本公开的杂交瘤细胞用作此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将表达载体转染至不以其它方式产生免疫球蛋白蛋白的宿主细胞诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。DNA也可以例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(美国专利No.4,816,567)或通过共价连结非免疫球蛋白多肽编码序列中的所有或一部分至免疫球蛋白编码序列进行修饰。可以用此类非免疫球蛋白多肽取代本公开的抗体的恒定结构域，或者可以用此类非免疫球蛋白多肽取代本公开的抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体。
在一个实施方案中，本公开的四价抗体由两个表达载体表达。例如，每个表达载体可以表达本公开的二聚体的一个单体(如，单链多肽或抗体重链或轻链多肽)。可替代地，本公开的二聚体的两个单体均由单个表达载体表达。
通常，表达载体具有转录和翻译调控序列，其来源于与宿主细胞相容的物种。此外，载体通常携带能够在转化细胞中提供表型选择的一个或多个特定基因。
用于真核细胞的各种各样的重组宿主-载体表达系统是已知的并且可以用于本公开中。例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是真核微生物中最常用的，尽管许多其它菌株，诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)也是可获得的。来源于多细胞生物的细胞系诸如可从ATCC获得的Sp2/0或中国仓鼠卵巢(CHO)也可用作宿主。适用于真核细胞转化的典型载体质粒例如，pSV2neo和pSV2gpt(ATCC)、pSVL和pSVK3(Pharmacia)、和pBPV-1/pML2d(International Biotechnology,Inc.)。
可用于本公开的真核宿主细胞是例如杂交瘤、骨髓瘤、血浆细胞瘤或淋巴瘤细胞。然而，其它真核宿主细胞可以适当地使用，条件是哺乳动物宿主细胞能够识别转录和翻译DNA序列用于表达蛋白质；通过裂解前导序列和分泌蛋白质来加工前导肽；和提供蛋白质的翻译后修饰，如糖基化。
因此，本公开提供了宿主细胞(如，真核宿主细胞)，其由包含本文公开的DNA构建体的重组表达载体转化并且能够表达本公开的四价抗体或多肽。在一些实施方案中，本公开的转化的宿主细胞包含至少一个DNA构建体，所述DNA构建体包含本公开的多核苷酸或表达本公开的单体、二聚体或四价抗体的多核苷酸，和与编码DNA序列相关定位以指导抗体或多肽的表达的转录和翻译调控序列。
能够过表达异源DNA的任何宿主细胞都可用于分离编码目标抗体、多肽或蛋白的基因。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。还参见PCT公开No.WO 87/04462。适合的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(诸如大肠杆菌或枯草杆菌(B.subtillis))和酵母(诸如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(S.pombe)或乳酸克鲁维酵母(K.lactis))。
本公开中使用的宿主细胞可以通过本领域熟知的标准转染程序以多种方式转化。在可以使用的标准转染程序中，有电穿孔技术、原生质体融合和磷酸钙沉淀技术。此类技术一般由F.Toneguzzo等人(1986),Mol.Cell.Biol.,6:703-706；G.Chu等人,Nucleic AcidRes.(1987),15:1311-1325；D.Rice等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979),79:7862-7865；和V.Oi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983),80:825-829描述。含有目标多核苷酸的载体可以通过许多适当的方法中的任一种引入至宿主细胞中，包括电穿孔、使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-右旋糖酐或其它物质的转染；微弹轰击；脂质体转染；和感染(如，其中载体是感染因子诸如痘苗病毒)。引入载体或多核苷酸的选择通常取决于宿主细胞的特征。
在两个表达载体的情况下，可以将两个表达载体一个接一个地分别或一起转移至宿主细胞中(共转移或共转染)。
本公开还提供了用于产生抗体或多肽的方法，该方法包括培养包含编码抗体或多肽的一个或多个表达载体的宿主细胞并通过本领域技术人员众所周知的方法从培养物中回收抗体或多肽。
此外，所需的抗体可以在转基因动物中产生。可以根据标准方法获得适合的转基因动物，所述方法包括将适当的表达载体微量注射到卵子中、将卵子转移到假孕雌性中并选择表达所需抗体的后代。
本公开还提供了特异性结合人PSGL-1的嵌合四价抗体。例如，四价抗体的可变区和恒定区来自不同的物种。在一些实施方案中，重链和轻链两者的可变区均来自本文所述的鼠抗体。本公开的嵌合抗体可以通过本领域确立的技术制备。参见，例如，美国专利No.6,808,901；美国专利No.6,652,852；美国专利No.6,329,508；美国专利No.6,120,767；和美国专利No.5,677,427，其各自在此通过引用并入。嵌合抗体通常可以通过获得编码抗体的重链和轻链的cDNA、将cDNA插入表达载体中来制备，所述表达载体在引入真核宿主细胞后表达本公开的嵌合抗体。合乎要求地，表达载体携带功能性完全恒定重链或轻链序列，使得任何可变重链或轻链序列可以容易地插入表达载体中。
本公开提供了特异性结合至人PSGL-1的人源化四价抗体。人源化抗体通常是人抗体，其中来自CDR的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种诸如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替代。在一些情况下，人抗体的Fv框架残基被相应的非人残基取代。
存在四种将单克隆抗体人源化的一般步骤。它们是：(1)确定起始抗体轻链和重链结构域的核苷酸和预测的氨基酸序列，(2)设计人源化抗体，即决定在人源化过程中使用哪个抗体框架区，(3)实际人源化方法/技术，和(4)转染和人源化抗体的表达。参见，例如美国专利No.4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089；6,180,370；和6,548,640。例如，如果抗体用于人临床试验和治疗中，恒定区可以经工程改造以更像人恒定区以避免免疫响应。参见，例如，美国专利No.5,997,867和5,866,692。
重要的是抗体被人源化以保持对于抗原的高亲和力和其它有利的生物性质。为了实现这一目标，人源化抗体可以通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。可获得计算机程序，其说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的起作用中的可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原能力的残基。以这种方式，可以从共有序列和导入序列中选择并组合FR残基，从而实现所需的抗体特征，诸如对一种或多种靶抗原增加的亲和力。通常，CDR残基直接且最基本地参与影响抗原结合。人源化抗体也可以在铰链区中含有修饰，以改善抗体的一种或多种特性。
在另一个替代方案中，可以通过噬菌体展示技术筛选抗体并重组制备抗体。参见，例如，美国专利No.5,565,332；5,580,717；5,733,743和6,265,150；和Winter等人,Annu.Rev.Immunol.12:433-455(1994)。可替代地，噬菌体展示技术(McCafferty等人,Nature 348:552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库产生人抗体和抗体片段。根据该技术，抗体V结构域基因被框内克隆到丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要的外壳蛋白基因中，和作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性质的选择也导致选择编码表现出那些性质的抗体的基因。因此，噬菌体模拟了B细胞的一些性质。噬菌体展示可以多种形式进行；对于综述，参见如，Johnson,Kevin S.和Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3,564-571(1993)。V-基因区段的几个来源可用于噬菌体展示。Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)从来源于免疫小鼠的脾脏的V基因的小随机组合文库分离了多种抗噁唑酮抗体。可以构建来自未免疫的人供体的V基因库，并且可基本上遵循Mark等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等人,EMBO J.12:725-734(1993)所述的技术，分离多种抗原(包括自体抗原)的抗体。在自然免疫响应中，抗体基因以高速率累积突变(体细胞超突变)。引入的一些变化将赋予更高的亲和力，并且在随后的抗原攻击期间优先复制和分化展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞。这种自然过程可以通过采用称为“链改组”的技术来模拟。Marks等人,Bio/Technol.10:779-783(1992))。在该方法中，可以通过用从未免疫供体获得的V结构域基因的天然存在的变型库(库)中依序地替换重链和轻链V区基因，来改善通过噬菌体展示获得的“一级”人抗体的亲和力。该技术允许产生具有pM-nM范围内的亲和力的抗体和抗体片段。Waterhouse等人,Nucl.Acids Res.21:2265-2266(1993)描述了用于制备极大型噬菌体抗体库(也被称为“所有库之母(the mother-of-all libraries)”)的策略。基因改组也可用于从啮齿动物抗体衍生人抗体，其中人抗体与起始啮齿动物抗体具有相似的亲和力和特异性。根据这种也被称为“表位印记”的方法，通过噬菌体展示技术获得的啮齿动物抗体的重链或轻链结构域基因被人V结构域基因库替换，从而产生啮齿动物-人嵌合体。对抗原的选择导致能够恢复功能性抗原结合位点的人可变区的分离，即表位控制(印记)伴侣的选择。当重复该过程以替换剩余的啮齿动物V结构域时，获得人抗体(参见PCT公开No.WO 93/06213，1993年4月1日公开)。与通过CDR移植的啮齿动物抗体的传统人源化不同，该技术提供完全人抗体，其没有啮齿动物来源的框架或CDR残基。显然，尽管上述讨论涉及人源化抗体，但所讨论的一般原理适用于定制抗体以供例如，在狗、猫、灵长类动物、马科动物和牛科动物中使用。
在某些实施方案中，抗体是完全人抗体。特异性结合抗原的非人抗体可用于产生结合至抗原的完全人抗体。例如，技术人员可采用链式交换技术，其中非人抗体的重链与表达不同人轻链的表达文库共表达。然后筛选含有一条人轻链和一条非人重链的所得杂合抗体的抗原结合。然后，参与抗原结合的轻链与人抗体重链的文库共表达。再次筛选所得人抗体的抗原结合。在美国专利5,565,332中进一步描述了诸如这一种的技术。此外，抗原可用于接种对人免疫球蛋白基因是转基因的动物。参见，如，美国专利5,661,016。
本公开还提供了双特异性抗体。双特异性抗体对至少两种不同的抗原(包括不同的表位)具有结合特异性。在一些实施方案中，本公开的双特异性抗体包含特异性结合PSGL-1的两个或多个不同的VH和/或VL结构域。在一些实施方案中，两个或多个不同的VH和/或VL结构域特异性结合PSGL-1的相同表位。在一些实施方案中，两个或多个不同的VH和/或VL结构域特异性结合PSGL-1的不同表位，所述表位可以是或可以不是重叠表位。
双特异性抗体(对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体)可使用本文公开的抗体制备。用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的(参见，如，Suresh等人，1986,Methods in Enzymology 121:210)。传统上，双特异性抗体的重组产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中所述两条重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello,1983,Nature 305,537-539)。在一些实施方案中，可以使用上文举例说明的方法产生双特异性四价抗体。
根据制备双特异性抗体的一种方法，将含所需的结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域融合到免疫球蛋白恒定结构域序列。在一些实施方案中，该融合物具有免疫球蛋白重链恒定结构域，其包含铰链区、CH2区和CH3区中的至少一部分。在一些实施方案中，含有轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)存在于融合物的至少一个中。将编码免疫球蛋白重链融合物和免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA插入分开的表达载体中，并共转染到适合的宿主生物体中。当在构造中使用的三条多肽链的不等比率提供最佳产率时，这在调整实施方案中三个多肽片段的相互比例方面提供了极大的灵活性。然而，当相同比率的至少两条多肽链的表达导致高产率或当比率没有特别重要时，可能在一个表达载体中插入两条或所有三条多肽链的编码序列。
包含两个共价连结的单体或抗体的异源缀合物抗体也在本公开的范围内。此类抗体已被用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利No.4,676,980)，并用于治疗HIV感染(PCT公开No.WO 91/00360和WO 92/200373；以及EP 03089)。异源缀合物抗体可以使用任何方便的交联方法制备。适合的交联剂和技术在本领域中是众所周知的，并且描述于美国专利No.4,676,980中。
本公开的某些方面涉及抗体可变结构域和/或抗体片段，如其可用作本文所述的四价抗体的组分。抗体片段可含有抗体的活性结合区，诸如Fab、F(ab’)2、scFv、Fv片段等。本领域已知的各种方法可以用于产生和/或分离抗体片段，所述抗体片段可以如通过本领域已知的标准重组技术基于本文描述的概念掺入本公开的四价抗体中。
可以生产单链Fv片段，诸如在Iliades等人,1997,FEBS Letters,409:437-441中描述。Kortt等人,1997,Protein Engineering,10:423-433中描述了使用各种接头的此类单链片段的偶联。用于重组生产和操作抗体的多种技术是本领域熟知的。此类片段可以使用本领域确立的技术从本文所述的单克隆抗体产生(Rousseaux等人(1986),MethodsEnzymol.,121:663-69Academic Press)。
制备抗体片段的方法是本领域熟知的。例如，抗体片段可以通过用胃蛋白酶酶促裂解抗体来产生，以提供表示为F(ab’)2的100Kd片段。该片段可以使用硫醇还原剂和任选地由二硫键联的裂解产生的巯基基团的封闭基团进一步裂解，以产生50Kd Fab’单价片段。可替代地，使用木瓜蛋白酶的酶促裂解直接产生两个单价Fab片段和Fc片段。这些方法例如由美国专利No.4,036,945和4,331,647及其中含有的参考文献描述，所述专利通过引用并入本文。此外，参见Nisonoff等人(1960),Arch Biochem.Biophys.89:230；Porter(1959),Biochem.J.73:119；Smyth(1967),Methods in Enzymology 11:421-426。可替代地，可以通过将编码抗体Fab的DNA插入用于原核生物的表达载体或用于真核生物的表达载体，并将载体引入原核生物或真核生物中以表达Fab来生产Fab。
IV.使用方法
本公开的某些方面涉及本文所述的四价抗体的方法和用途。这些方法和用途至少部分地基于如本文所述的四价抗体的性质，包括但不限于它们增加的表位结合结构域的数目、体外和/或体内交联后更小依赖性的潜力、用于诱导(如人PSGL-1表达细胞)凋亡的差异效力，和/或增强的体内或转移体内功效。
如本文所述，已知PSGL-1参与炎症和T细胞生物学。特异性结合人PSGL-1的本公开的四价抗体尤其可用于治疗患有与T细胞功能相关的疾病(如，T细胞介导的炎性疾病)的个体或需要医疗程序的个体，所述医疗程序可能导致炎性疾患诸如免疫反应或对于所述医疗程序事先管理此类疾患(如，移植或输注)。
在一些实施方案中，通过本文描述的方法治疗的病症或疾病可以是T细胞介导的炎性疾病。使用本文所述的本文所述的四价抗体可以治疗的病症和疾病或可以改善或预防的其一种或多种症状的非限制性实例包括银屑病、克罗恩氏病、强直性脊柱炎、关节炎(包括类风湿性关节炎、青少年性类风湿性关节炎、骨关节炎，和银屑病性关节炎)、糖尿病、多发性硬化、脑脊髓炎、重症肌无力、全身性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、斯耶格伦氏综合征(Sjogren’s Syndrome)、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、I型糖尿病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、哮喘、变应性哮喘、皮肤型红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药物疹、麻风病逆转反应、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、变应性脑脊髓炎、急性出血性坏死性脑病、特发性双侧进行性感觉神经听觉丧失、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血、特发性血小板减少、多软骨炎、韦格纳氏肉芽肿(Wegener’sgranulomatosis)、慢性活动性肝炎、史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnsonsyndrome)、特发性脂肪泻、扁平苔癣、格雷夫斯氏病(Graves’disease)、移植物抗宿主病(GVHD)、类肉瘤病、原发性胆汁性肝硬化、后部葡萄膜炎、肺间质纤维化、过敏症诸如特应性过敏症、AIDS和T细胞赘生物诸如白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，该疾病是自身免疫性疾病。
在另一个实施方案中，根据本文描述的方法治疗的疾病或病症是斑块状银屑病。斑块状银屑病或寻常型银屑病是最常见形式的银屑病，并且特征是由银色鳞片覆盖的边界清楚、凸起的红斑皮肤斑块。病变的偏好涉及四肢、腰骶部和头皮的伸面。相应的组织病理学发现包括真皮和表皮的显著炎性细胞浸润、增加数量的扩张血管以及角化细胞无序分化且角化过度的表皮显著增厚。大约三分之一的患有斑块状银屑病的患者被归类为患有中度或重度疾病，并因此不仅仅是局部治疗的疗法候选者。
在另一个实施方案中，根据本文描述的方法治疗的病症是慢性斑块状银屑病。斑块状慢性银屑病的症状包括但不限于包括但不限于膝盖、肘部、腰骶部、头皮和指甲在内的身体任何部位的单个或多个凸起的红色皮肤斑块，范围从硬币大小到较大。
在另一个实施方案中，根据本文描述的方法治疗的病症是滴状银屑病。滴状银屑病的症状包括但不限于皮肤上的水滴状鳞状斑块，随后是感染，诸如链球菌咽喉感染。
在另一个实施方案中，根据本文描述的方法治疗的疾病或病症是反转型银屑病。反转型银屑病的症状包括但不限于，在以下一个或多个身体部位上：腋窝、腹股沟、在乳房下面，以及生殖器和臀部周围的其它皮肤皱褶中的光滑、通常潮湿的皮肤区域，其红色且发炎，不同于与斑块状银屑病相关的鳞屑。
在另一个实施方案中，根据本文描述的方法治疗的疾病或病症是脓疱型银屑病。脓疱型银屑病的症状包括但不限于充满脓液的水疱，其大小和位置各不相同，但主要在手和脚上。
在另一个实施方案中，根据本文描述的方法治疗的疾病或病症是红皮病型银屑病。红皮病型银屑病的症状包括但不限于，皮肤周期性、广泛性、红肿发红并且薄片鳞片脱落，而不是较小的片状。皮肤发红和脱落常伴有严重的瘙痒和疼痛、心率增加且体温波动。
在另一个实施方案中，根据本文描述的方法治疗的疾病或病症是类风湿性关节炎。类风湿性关节炎的症状，包括但不限于疲劳，食欲不振，低热，腺体肿胀，无力，手腕、肘部、肩部、臀部、膝盖、脚踝、脚趾、下颌、手、脚、手指和/或颈部的关节疼痛，晨僵，呼吸时胸痛(胸膜炎)，眼睛灼热，瘙痒，和排出，皮下结节，麻木，刺痛或手脚灼热。
在另一个实施方案中，根据本文描述的方法治疗的疾病或病症是克罗恩氏病。克罗恩氏病的症状包括但不仅限于腹部(腹部区域)痉挛痛，发烧，疲劳，食欲不振，排便疼痛(里急后重)，持续性水样腹泻，无意体重减轻，便秘，眼部炎症，瘘管(通常在直肠区域周围，可能引起脓液、粘液或粪便排出)，关节疼痛，肝脏炎症，口腔溃疡，直肠出血和血便，皮肤肿块或疡(溃疡)和牙龈肿胀。
在另一个实施方案中，根据本文描述的方法治疗的疾病或病症是强直性脊柱炎。强直性脊柱炎的症状包括但不限于，经常在下背部和臀部、脊柱和/或颈部疼痛和僵硬；蔓延到肋骨、肩胛骨、臀部、大腿和脚跟的疼痛和压痛；眼睛炎症(虹膜睫状体炎和葡萄膜炎)，引起发红、眼痛、视力减退、飞蚊症和畏光；疲劳；和恶心。
在另一个实施方案中，根据本文描述的方法治疗的疾病或病症是糖尿病。糖尿病的症状包括但不限于，体重减轻，多尿(尿频)，烦渴(口渴增加)，多食(饥饿感增加)，心血管疾病，糖尿病性视网膜病变，糖尿病性神经病变，高渗性非酮症状态和糖尿病性酮症酸中毒。
在一些实施方案中，本公开的四价抗体或组合物可以在移植之前、同时和/或之后向个体施用。例如，如下面更详细描述，可以施用本公开的四价抗体或组合物以增加有利治疗结果的可能性、降低不利结果的可能性和/或减轻或预防症状或不利结果在完成移植之前、同时或之后发生。
如本文所用，治疗需要移植的个体可以指一种或多种治疗性治疗和防止性或预防性措施(如，增加有利治疗结果(诸如移植物存活、移植物功能)的可能性，或降低不利结果(诸如对治疗的不利响应)的可能性，或者减少有利治疗诸如移植物发生的可能性的条件)。治疗可包括但不限于减轻或预防与病症或疾患相关的疾患和症状，和/或干扰或限制个体获得病症或疾患的治疗选择的问题或疾患，诸如致敏、超敏、高群体反应性抗体(panelreactive antibodies，PRA)水平和/或预先存在的同种抗体的存在，其限制了移植物对等待移植的个体的可用性。需要治疗的那些个体包括已经患有病症或疾患的个体，以及待预防病症或疾患的那些个体。治疗病症或疾患可以抑制与病症或疾患相关的免疫-介导的事件，改善病症或疾患的症状，减轻病症或疾患的严重程度，改变病症或疾患进展的过程，和/或改善或治愈基本病症或疾患。
例如，等待移植的个体的成功治疗包括但不限于降低同种抗体水平，减少群体反应性抗体(PRA)，使个体具有更多交叉匹配相容的供体，增加个体接受移植的可能性或概率，缩短个体对移植预期的等待时间，使个体脱敏，降低移植相关症状或疾患的风险(诸如如下所述的免疫介导的事件)，或其任何组合。
例如，接受移植的个体的成功治疗包括但不限于，长期保护和维持移植的器官或组织，其包括控制、逆转、减轻、延迟或预防与器官移植相关的一种或多种症状或不期望的疾患，诸如免疫介导的事件，包括但不限于产生供体特异性同种抗体(DSA)、GVHD、抗体介导的排斥(AMR)、超急性移植物排斥、慢性移植物排斥，移植物衰竭和移植物丢失，如通过症状或疾患的功能性或组织学体征所测量。能够控制病症或疾患(例如，移植物排斥)的治疗可以包括在观察到病症或疾患的功能性或组织学体征(如，移植物排斥)后开始时减缓疾病过程进展的治疗。此外，能够逆转疾病或疾患(如，移植物排斥)的治疗可以包括当在疾病或疾患的功能性或组织学体征(如，移植物排斥)出现后开始时逆转疾病过程和返回功能性和组织学发现更接近正常的治疗。能够“延缓病症或疾患(例如，移植物排斥)的进展”的治疗可以包括拖延、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推迟病症或疾患(例如，移植物排斥)的发展。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可以包括预防，因为个体，如处于发展病症或疾患风险的个体，不会发展病症或疾患。
在一些实施方案中，本公开的移植可以是一种或多种组织或器官的移植，所述组织或器官包括但不限于骨髓、肾脏、心脏、肝脏、神经元组织、肺、胰腺、皮肤和肠(如，小肠和/或大肠以及其任何子-组织)。
此外，四价抗体可用于预防和/或治疗与活化的T细胞的增殖和/或数量增加(相对于在健康个体或没有特定病症或疾患的个体中发现的活化的T细胞的增殖和/或数量)相关或由其引起(全部或部分)的某些病症或疾患。使用本文所述的四价抗体可以预防和/或治疗的病症或疾患的非限制性实例包括移植物抗宿主病和移植物排斥病例(包括使用同种异体组织或异种组织的移植排斥)，诸如骨髓移植、肝脏移植、肾脏移植或任何器官或组织的移植。
在一个实施方案中，本公开的四价抗体或组合物可以在输注之前、同时和/或之后施用给个体。例如，如下面更详细描述，可以施用本公开的四价抗体或组合物以增加有利治疗结果的可能性、降低不利结果的可能性和/或减轻或预防在输注完成之前、同时或之后发生的症状，
如本文所用，治疗需要输注的个体可以指一种或多种治疗性治疗和防止性或预防性措施(例如，增加有利治疗结果的可能性，诸如替换或补充血液组分/细胞，或降低不利结果的可能性，诸如对治疗的不良响应、治疗无效或免疫反应，或者减少有利治疗(诸如输注)发生的可能性的条件)。治疗可包括但不限于减轻或预防与病症或疾患相关的疾患和症状，和/或干扰或限制个体获得病症或疾患的治疗选择的问题或条件。需要治疗的那些个体包括已经患有病症或疾患的那些个体，以及待预防病症或疾患的那些个体。治疗病症或疾患可以抑制与病症或疾患相关的免疫介导的事件，改善病症或疾患的症状，降低病症或疾患的严重程度，改变病症或疾患进展的过程，和/或改善或治愈基本病症或疾患。
在一些实施方案中，输注是包括白细胞、红细胞和血小板中的一种或多种的输注。在一些实施方案中，输注包括全血或一种或多种血液产品，包括但不限于白细胞、红细胞、血小板、新鲜冷冻血浆、冷冻沉淀或血液凝固因子、抗体和/或血液替代品。可以用输注(如，输注血液或血液产品)治疗的示例性疾患包括但不限于出血或失血、降低的血细胞比容或血红蛋白(如，贫血)、镰状细胞病、地中海贫血、手术程序期间或之后的血液补充、心脏病、创伤性损伤、一种或多种血液因子缺乏(如血友病、冯威勒布兰特疾病(von Willebranddisease)、低纤维蛋白原血症、或因子II、V、VII、IX、X或XI缺乏)、需要纤维蛋白原补充的疾患(如肝脏疾病、血液输注等)、骨髓衰竭、血小板功能障碍、血小板减少症、免疫缺陷(如，来自疗法或疾病)等。可以在美国红十字会输注实践指南纲要(American Red CrossCompendium of Transfusion Practice Guidelines)中找到与输注相关的实践、给药、响应、适应症和制备的描述。
根据本文所述的方法，四价抗体或多肽的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗性的还是预防性的以及技术人员已知的其它因素。抗体或多肽的施用可以在预选的时间段内基本上连续，或者可以是一系列间隔剂量。
本文所述的四价抗体或其药物组合物的施用剂量和频率根据用于预防和/或治疗同时使副作用最小化的方法施用。待施用给特定受试者的本文所述的四价抗体或其药物组合物的确切剂量可由从业者根据与需要治疗的受试者相关的因素来确定。可以考虑的因素包括疾病状态的严重程度，受试者的一般健康状况，受试者的年龄和体重，饮食，施用的时间和频率，与其它治疗性药剂或药物的一种或多种组合，反应敏感性，和对疗法的耐受性/响应。本文所述的四价抗体或其药物组合物的施用剂量和频率可随时间调整，以提供足够水平的抗体或抗体来源的抗原结合片段，或以维持所需效果。
在该制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径，以及炎性病症或疾病的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。
有效剂量可以从来源于体外或动物模型测试系统的剂量响应曲线推断出来。
在一个实施方案中，本文描述的组合物中的任一种被配制用于通过腹膜内、静脉内、皮下或肌内注射，或其它形式的施用诸如经口、经粘膜、经由吸入、舌下等来施用。在一个实施方案中，肠胃外施用的特征在于皮下、肌内或静脉内注射，其也涵盖在本文中。注射剂可以以常规形式制备为液体溶液或悬浮液，适合于在注射前于液体中的溶液或悬浮液的固体形式，或者乳液。注射剂、溶液和乳液还含有一种或多种赋形剂。适合的赋形剂是，例如，水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。此外，如果需要，待施用的药物组合物还可含有少量无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其它此类试剂。其它施用途径可包括经肠施用、脑内施用、经鼻施用、动脉内施用、心内施用、骨内输注(infusion)、鞘内施用、静脉内输注、皮下植入或注射、肌内施用、直肠内施用、阴道内施用、胃内施用、气管内施用、肺内施用和腹膜内施用。用于肠胃外施用的制剂包括准备用于注射的无菌溶液，无菌干燥的可溶产品(诸如准备正好在使用前与溶剂组合的冻干粉)，包括准备用于注射的无菌悬浮液，准备正好在使用前与媒介物组合的无菌干燥不可溶产品，及无菌乳液。溶液可以是水性的或非水性的。如果静脉内施用，适合的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、水和含有增稠剂和增溶剂的溶液，诸如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物。
在另一个实施方案中，本发明还涵盖了包含与诸如可检测的标记或治疗剂或细胞毒性剂的其它分子缀合的本公开的抗体或多肽的组合物的施用。该药剂可包括但不限于放射性同位素、毒素、类毒素、炎性剂、酶、反义分子、肽、细胞因子和化疗剂。将抗体与此类分子缀合的方法通常是本领域技术人员已知的。参见，如，PCT公开WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利No.5,314,995；和EP 396,387。
在一个实施方案中，该组合物包含缀合至细胞毒性剂的抗体或多肽。细胞毒性剂可包括对细胞有害的任何药剂。可以与抗体或片段缀合的示例性类别的细胞毒性剂可包括但不限于紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、道诺霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物或同系物。
V.药物组合物
本公开还提供了包含本文所述的四价抗体或多肽和药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物。药物组合物可以用于如，本公开的方法、用途和/或试剂盒中。
药学上可接受的载剂或赋形剂是本领域已知的，并且是相对惰性的物质，其有助于药理学有效物质的施用。例如，赋形剂可以赋予形式或稠度，或用作稀释剂。适用的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于改变渗透压的盐、包封剂，缓冲剂和皮肤渗透增强剂。在某些实施方案中，本文描述的四价抗体在液体药物组合物中。液体药学上可施用的组合物例如可以通过将本文所述的抗体溶解、分散或以其它方式混合在载剂(诸如例如水、盐水、水性右旋糖、甘油、二醇、乙醇等)中从而形成溶液或悬浮液来制备。如果需要，待施用的药物组合物还可含有少量无毒辅助物质，诸如润湿剂、乳化剂、增溶剂和pH缓冲剂等。用于肠胃外和非肠胃外药物递送的赋形剂以及制剂示于Remington,The Science andPractice of Pharmacy第20版Mack Publishing(2000)中。
提供药物组合物用于以单位剂型施用给人和动物，诸如含有适合量的本文所述的四价抗体的无菌肠胃外溶液或悬浮液。在一个实施方案中，四价抗体以单位剂量形式或多剂量形式配制和施用。如本文所用的单位剂量形式是指适用于人和动物受试者并且如本领域已知那样单独包装的物理分散的单元。每个单位剂量含有足以与所需的药物载剂、媒介物或稀释剂组合产生所需的治疗作用的预定量的抗体或抗体来源的抗原结合片段。单位剂型的实例包括安瓿和注射器。单位剂型可以以其分数或倍数施用。多剂量形式是包装在待以分离的单位剂型施用的单个容器中的多个相同的单位剂量形式。多剂量形式的实例包括小瓶或品脱瓶或加仑瓶。因此，多剂量形式是多个单位剂量，其在包装中不分离。
药物组合物中四价抗体的浓度将取决于，如，抗体或抗体来源的抗原结合片段的物理化学特征、给药方案和施用量以及本领域技术人员已知的其它因素。在一些实施方案中，药物组合物提供的剂量为每千克体重每天约0.001mg至约100mg四价抗体。可以制备药物剂量单位形式以提供每剂量单位形式约0.001mg至约100mg和/或其它任选的必需成分的组合。
在一些实施方案中，本公开提供了四价抗体和组合物(诸如本文所述的药物组合物)，用于本文所述的任何方法中，无论是在作为医药的用途和/或用于制造医药的用途的情况下。
VI.试剂盒
本公开的某些方面涉及包含本公开的四价抗体的试剂盒或制品。任选地，本文所述的试剂盒可含有一种或多种药物上可接受的载剂，诸如本文所述的示例性载剂。在一些实施方案中，本公开的试剂盒包括本公开的药物组合物。本文所述的试剂盒可用于如本公开的的方法或用途中。
试剂盒可任选地提供另外的组分，诸如缓冲液和解释信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关联的一个或多个标签或包装插页。容器可以是单位剂量、散装包装(如多剂量包装)或亚单位剂量。本公开的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页上的书面说明书(如，试剂盒中包含的纸张)，但机器可读的说明书(如，磁性或光学存储盘上的说明书)也是可以接受的。
在一些实施方案中，试剂盒还包括包装插页，所述包装插页包含用于施用四价抗体以治疗T细胞介导的炎性疾病的说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包括包装插页，所述包装插页包含用于在输注或移植之前、同时和/或之后施用四价抗体的说明书。
本公开的试剂盒在适合的包装中。适合的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(如密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。还涵盖了与特定装置诸如吸入器、鼻部施用装置(如雾化器)或输注装置诸如微型泵组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器还可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文所述的四价抗体或多肽。容器还可以包括第二药物活性剂。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括在治疗(如，输注或移植)中有用的任何其它材料或装置，包括但不限于一个或多个容器、管、消毒剂或设备、套管、注射器等。
实施例
通过参考以下实施例将更全面地理解本发明。然而，它们不应该被解释为限制本发明的范围。应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且本领域技术人员将会根据所述实施例和实施方案提出各种修改或变化，并且将所述修改或变化包括在本申请的精神和范围内及所附权利要求范围内。
实施例1：抗PSGL-1四价抗体的产生和表征
P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)在广泛的造血细胞(包括骨髓细胞、淋巴细胞、树突细胞和CD34+干细胞群)上表达(参见，如,Spertini等人1996,J Cell Biol.135(2):523-31)。先前已经鉴定了几种对PSGL-1具有特异性且能够在T细胞中诱导凋亡的小鼠抗体。在这些小鼠抗体中，选择了不干扰为有效定位T细胞和嗜中性粒细胞以靶向炎性组织所需的P-选择素与PSGL-1之间的相互作用的抗体(h15A7)以用于临床开发并且将其修饰为含有IgG4单克隆抗体的人源化κ轻链，以最小化表达PSGL-1的细胞上的ADCC和CDC(参见，如美国专利No.7,604,800)。随后，将h15A7进一步工程改造以产生h15A7H，所述h15A7H在h15A7的铰链区中具有SER228PRO的突变(国际申请公开No.WO 2012/174001)。引入这种突变是为了减少抗体改组，即体内IgG4抗体之间的分子间交换。体外研究显示，h15A7/h15A7H优先诱导晚期活化的T细胞凋亡，但不诱导其它表达PSGL-1的细胞凋亡。不希望受理论束缚，认为h15A7H的作用机制似乎至少部分地依赖于人PSGL-1分子的交联，所述交联由抗体交联剂在体外和可能的FcR-表达细胞在体内介导。
下面给出的实施例描述了来源于h15A7H的几种交联剂/FcR表达细胞非依赖性四价抗体的开发(图1A和图1B)。不希望受理论束缚，四价抗体可能具有优于h15A7H用于临床开发的优势，如治疗T细胞介导的炎性疾病。这些结果表明，与在体外和转移体内的亲本h15A7H抗体相比，四价h15A7H抗体显示出增强的功效。
方法
细胞和试剂
将Sp2/0-Ag14(CRL-1581TM)和Sp2/0-hPSGL-1在补充有10％FBS(目录号26140-079)、100U/mL青霉素/100μg/mL链霉素(目录号15140)和1mM丙酮酸钠(目录号11360)的90％DMEM(目录号11965-092TM)中培养。
h15A7H抗体描述于国际申请公开No.WO 2012/174001中。在该研究中使用的h15A7H四价抗体由Flp-In CHO稳定的细胞系产生，通过蛋白A亲和色谱纯化，并维持在杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(目录号21600-069)/0.02％Tween-20(JTX251-07)中。作为无关同种型对照抗体的人IgG4p/κ由Flp-In CHO细胞产生。12H5.5是针对h15A7/h15A7H的鼠IgG1抗独特型抗体。
动物
6-8周龄的雌性B6小鼠获自BioLASCO Taiwan Co.,Ltd,Taipei,Taiwan。将所有小鼠维持在无特定病原体的条件下。所有动物研究均遵循机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的指导原则进行。
抗PSGL-1四价抗体变型的构建
scDb2-Fc
scDb2-Fc(图1A，左)包括与人IgG4 Fc的N-末端平行融合的单链双抗体(scDb)的2个结构域，其在铰链区具有突变以使体内半抗体交换最小化。每个scDb结构域不仅含有VL-VH-VL-VH的结构域序列，而且还含有在VH和VL之间的接头(G4S1)5(SEQ ID NO:33)和在VL和VH之间的两个相同的接头(如，SEQ ID NO:34)。为优化生成了具有不同长度的所述接头的几种scDb-Fc
taFv2-Fc
taFv2-Fc(图1A，中)包括与人IgG4 Fc的N-末端平行融合的2个串联单链可变片段(scFv)单元(串联scFv称为taFv)，其在铰链区具有突变以使体内半抗体交换最小化。有三种不同种类的scFv用于构建taFv，所述包括scFvv2(VH-VL)、v3(VL-VH)和v4(VL-VH)型，其在VH和VL之间含有接头(G4S1)5(SEQ ID NO:33)。其中，v2和v4受VH44-VL100二硫键形成的结构限制。将VH44-VL100二硫键以VL-VH和VH-VL两种取向引入scFv中以增加构象稳定性(参见SEQ ID NO:29和30)。每个taFv具有抗PSGL-1scFv的连续的v2-v3或者连续的v4-v2，其在两个scFv之间具有接头ASTGS(SEQ ID NO:27)。
scFv-IgG
抗PSGL-1scFv的二硫键-约束的v2型用于产生3种scFv-IgG4p变型(图1A，右)，包括scFv4-crIgG4p、scFv2-LC-IgG4p和LC-scFv2-IgG4p。scFv4-crIgG4p具有4个scFv单元，所述scFv单元与IgG4p(crIgG)的κ轻链和重链的两个恒定区的N末端平行融合而没有接头。scFv2-LC-IgG4p具有与h15A7H IgG的κ轻链的N-末端平行融合的2个scFv单元，其间具有接头(G4S)2(SEQ ID NO:28)，而LC-scFv2-IgG4p具有与h15A7H IgG的κ轻链的C-末端平行融合的2个scFv单元，其间具有接头(G4S)2(SEQ ID NO:34)。将LC-scFv2IgG4p和scFv2-LC IgG4p形式的轻链分别亚克隆到pcDNA5/FRT载体中，该载体编码用于抗体表达的完整h15A7H重链序列。图1B显示了这些具有加阴影的可变片段的四价抗体形式的另一个示意图。
将所有四价抗体的cDNA克隆到pcDNA5/FRT载体(InvitrogenTM，目录号：V6010-20)中，用于四价抗体表达。
表达抗PSGL-1四价抗体变型的稳定细胞系的产生
抗PSGL1四价抗体变型在Flp-In CHO细胞(InvitrogenTM,目录号：R708-07)中稳定表达和产生。按照由供应商提供的标准程序，将四价抗体变型的cDNA序列插入pcDNA5/FRT载体(InvitrogenTM,目录号：V6010-20)中。将所建立的细胞系的培养物上清液收集并用蛋白A琼脂糖珠(GE HealthcareTM,目录号：17-5280-04)纯化。用SDS-PAGE和尺寸排阻色谱两者分析经纯化的蛋白质以确保抗体的质量。
还原性和非还原性SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)
将经纯化的抗PSGL-1四价抗体在10％还原和非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。对于还原性SDS聚丙烯酰胺凝胶，将2μg抗体与5X SDS样品缓冲液(300nM Tris,pH6.8,10％SDS,50％甘油,5％2-巯基乙醇和0.06％溴酚蓝)混合并在100℃下煮沸10分钟，之后上样。对于非还原性SDS聚丙烯酰胺凝胶，将2μg抗体与5X非还原性样品缓冲液(300nM Tris,pH6.8,10％SDS,50％甘油和0.06％溴酚蓝)混合并在100℃下煮沸10分钟，之后上样。将还原性和非还原性蛋白样品上样到进行电泳的相同SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。在电泳后，考马斯蓝染色用于检测凝胶上的蛋白质。
抗PSGL-1四价抗体变型的结合测定
用人PSGL-1(Sp2/0-hPSGL1)转染的Sp2/0细胞用作表达PSGL-1的细胞系。将Sp2/0-hPSGL1细胞以1200rpm离心5分钟。将细胞沉淀重新混悬于FACS缓冲液(含有1％FBS的PBS)中并移液到96孔板(1x105个细胞/孔)中。向每个孔中加入100μl含有人源化15A7H(h15A7H)/四价抗体的上清液，并将这些物质在4℃下孵育60分钟。将细胞用冷FACS缓冲液洗涤三次，然后与1μg/ml浓度的100μl小鼠抗人IgG4pFc'-PE(SouthernBiotech目录号9190-09)在4℃下孵育60分钟。随后，将细胞用冷FACS缓冲液洗涤三次，并通过FACS分析进行分析。使用Cell Quest软件在BD-LSR流式细胞仪(Becton Dickinson)上进行所有流式细胞术分析。
抗PSGL-1四价抗体变型的凋亡测定
将1x105个Sp2/0-hPSGL1细胞接种到96孔板的各孔中。新鲜制备滴定浓度的经纯化的抗PSGL-1四价和对照抗体的等分式样，并将其加入每个孔中。将经处理的细胞在37℃保持6小时，之后进行用于细胞凋亡测定的FACS分析。
对于细胞凋亡测定，按照制造商的说明使用膜联蛋白-V-FITC凋亡检测试剂盒(Strong Biotech，目录号AVK250)。简而言之，将经处理的细胞收集并在室温下重悬于含有0.5μl膜联蛋白V-FITC的100μl膜联蛋白V结合缓冲液中。在黑暗中孵育15分钟后，用200μl膜联蛋白V结合缓冲液洗涤细胞两次。在FACS分析之前，每种样品加入1μl碘化丙啶(PI)。使用Cell Quest软件在BD-LSR流式细胞仪(Becton Dickinson)上进行所有流式细胞术分析。膜联蛋白V阳性和/或PI阳性细胞被认为是凋亡细胞。
人外周血单核细胞(PBMC)的分离
从之前作为良好破伤风响应者测试的健康供体收集500ml全血。将血液以1500rpm离心6分钟。弃去上部血浆层，并用等体积的PBS稀释残余血液。将稀释的全血小心地加到Ficoll(GE,Ficoll Plaque Plus,目录号17-1440-02)层上，并在室温下以2400rpm离心15分钟。将含有单核细胞的血沉棕黄层收集，并用PBS洗涤3次以使血小板污染最小化。将细胞重悬于PBS中并在使用前保持在冰上。
转移-体内迟发型超敏反应(DTH)
将8-10x 106个PBMC细胞连同0.25LF单位的PBS透析的破伤风类毒素(TetanusToxoid)(TT,Kuo Kwang,目录号K4103-11)或PBS以50μl的终体积注射至雌性B6小鼠的后足垫中。在所有实验中使用6～8周的小鼠。使用刻度盘厚度计在注射前和注射后24小时测量足垫厚度。从注射后的值减去预注射值以获得净爪厚度。所有测量值均以毫米(mm)记录。将在PBS中滴定的h15A7H和h15A7H四价抗体在PBMC和TT注射前1小时以指定剂量静脉内施用至B6小鼠中。PBS用作媒介物对照。测试每个处理2只或4只爪(1只或2只小鼠)。在Ab施用后24小时收集血液样品以检查抗体变型的浓度。如下计算爪厚度的抑制百分比：100X(Δ爪厚度媒介物-Δ爪厚度抗体)/(Δ爪厚度媒介物–Δ爪厚度仅PBMC)。
用于检测小鼠血浆中的抗体浓度的ELISA
将96孔微量滴定板用于ELISA涂覆缓冲液(30mM Na2CO3/100mM NaHCO3)中的0.5μg/mL抗独特型抗体12H5.5在4℃涂覆过夜。然后将板用200μL/孔的含0.5％BSA的PBS溶液在室温下封闭1小时，并用ELISA洗涤缓冲液(0.05％Tween20于PBS中)洗涤3次，然后添加50μL/孔的校准标准品或样品。首先在正常的小鼠血浆中制备连续稀释的校准标准品。将校准标准品或样品在测定稀释剂(于PBS中的0.1％BSA和0.05％Tween 20)中预稀释1000倍，以在分配到板上之前使测定稀释剂中小鼠血浆的最终浓度为0.1％。如果需要，使用含有0.1％正常小鼠血浆的测定稀释剂制备随后的稀释液。在室温下孵育1小时并用ELISA洗涤缓冲液洗涤5次后，以50μL/孔加入二抗小鼠抗人IgG4 pFc'-HRP(SouthernBiotech目录号9190-05；稀释度1:15000)并在室温下孵育1小时。然后用ELISA洗涤缓冲液洗涤板5次，接着添加TMB底物用于显色。用0.5N H2SO4终止反应，并在微量滴定板读数器(Molecular DeviceVERSAmax)中在450nm处测量吸光度值。
结果
人源化15A7H四价抗体的还原性和非还原性SDS-PAGE
如图2A-2C所示，SDS-PAGE之后考马斯蓝染色用于验证抗PSGL-1四价抗体在非还原性和还原性条件下的分子量和基本结构。在非还原性条件下，h15A7H V2-V3、V4-V2和LH10-g4pFc产生分子量约为150kDa的主要蛋白条带(图2A)。在相同条件下，h15A7H scFv2-LC IgG4p、LC-scFv2 IgG4p和scFv4-crIgG4p产生分子量约为200kDa的主要蛋白条带(图2B)。
在还原性条件下，h15A7H V2-V3、V4-V2和LH10 g4pFc显示出具有约75kDa的预期分子量的单条带，而h15A7H scFv2-LC和LC-scFv2两者均显示具有约50kDa的相似分子量的两个主要条带(图2C)。一个条带是scFv-LC或LC–scFv融合蛋白，并且另一个条带是野生型h15A7H重链。scFv4-crIgG4p还显示出两个主要条带，一个代表scFv-CH1-铰链-CH2-CH3(约62.5kDa)融合蛋白，并且另一个代表scFv-κ-融合(约37.5kDa)蛋白(图2C)。作为对照，h15A7H在非还原性凝胶中产生具有150kDa的预期分子量的单条带(图2A和2B)和在还原性条件下产生两个主要条带(重链：50kDa，轻链：25kDa)(图2C)。
人源化15A7H四价抗体变型与SP2/O-hPSGL-1和SP2/O的结合
在人PSGL-1 SP2/O细胞中评价h15A7H四价抗体的结合能力。h15A7H四价抗体与SP2/O-hPSGL-1阳性结合，但不与缺乏hPSGL-1抗原的亲本SP2/O细胞结合(下表A)。另外，野生型h15A7H和所有h15A7H四价抗体对SP2/O-hPSGL-1给出相似的结合活性(表A)。这些结果表明h15A7H四价抗体保留了对hPSGL-1分子的结合反应性。
表A.人源化15A7H四价抗体与SP2/O-hPSGL-1和SP2/O的结合活性(通过平均荧光强度测量)。
ND:未进行
由人源化15A7H四价抗体诱导的SP2/O-hPSGL-1细胞的体外凋亡
与h15A7H或四价抗体孵育后，通过对SP2/O-hPSGL-1细胞中膜联蛋白V和/或PI的染色来评价凋亡的诱导。如下表B中所示，亲本抗体h15A7H在没有交联剂的情况下在0.5和0.0625μg/mL的测试浓度下在SP2/O-hPSGL-1细胞中不诱导凋亡。在0.5μg/mL的测试浓度下，所有h15A7H四价抗体均诱导凋亡(范围为18-36％)。在测试的最低测试浓度(0.0625μg/mL)下，6个四价h15A7H抗体中的3个，LH10-g4pFc、V2-V3-g4pFc和scFv2-LC-IgG4p，在12-16％的细胞中诱导凋亡，而h15A7H V4-V2-g4pFc、scFv4-crIgG4p和LC-scFv2-IgG4p在这种较低剂量下不在SP2/O-hPSGL-1中诱导细胞死亡。这些数据清楚地表明，所有h15A7H四价抗体都具有凋亡诱导能力，但有些四价抗体以更高的效力凋亡诱导。
表B.由人源化15A7H四价抗体诱导的SP2/O-hPSGL-1细胞的体外凋亡。
SD：标准偏差
*T-检验P值<0.05(与用V4-V2-g4pFc、scFv4-crIgG4p和LC-scFv2-IgG4p处理比较)。
h15A7H和h15A7H四价抗体在B6小鼠中转移-体内DTH响应的抑制方面的功效
测试上述h15A7H和h15A7H四价抗体在B6小鼠中的转移体内DTH响应的抑制方面的功效。以10和1mg/kg的剂量将h15A7H抗体静脉内注射到小鼠中，而以1和0.3mg/kg的剂量将四价抗体静脉内注射到小鼠中。使用来自四个不同供体的PBMC进行实验，并计算抑制％以评价体内抑制功效。
如下表C所示，h15A7H抗体在10mg/kg的剂量下可以平均抑制足垫肿胀93％。在1mg/kg的低剂量下，将抑制作用降低至23％。对于15A7H四价抗体，变型诸如h15A7H LH10-g4p Fc、V2-V3-g4pFc和scFv2-LC-IgG4p即使在剂量为1或0.3mg/kg时仍保持有效抑制(59-76％抑制)。
表C.h15A7H和h15A7H四价抗体对转移-体内DTH的影响。
ND：未进行；SEM：标准平均误差
静脉内施用后24小时测量h15A7H和h15A7H四价抗体的血浆水平(表D)。除V4-V2-g4pFc外，所有抗体均显示在1mg/kg下血浆水平约为6513-9025ng/mL，而V4-V2-g4pFc在体内循环24小时后检测不到。不希望受理论束缚，认为这些结果可能表明h15A7H和四价变型之间的功效差异可能主要是由于凋亡-诱导能力的差异，如表B所示。
表D.B6小鼠中h15A7H和h15A7H四价抗体的血浆浓度。
BLQ：低于定量限；SEM：标准平均误差
总之，这些数据表明，各种h15A7H四价抗体在体外的凋亡诱导方面具有差异能力，这与转移体内DTH鼠模型中DTH响应的抑制能力有差异相关。对于凋亡诱导具有更高效力的那些四价抗体与转移-体内DTH模型中的h15A7H相比显示出增强的功效。这些结果表明，这些h15A7H四价变型中的一些可能比h15A7H具有潜在的优势，可用于进一步的临床开发。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和实施例详细地描述了前述实施方案，但是描述和实施例不应被解释为限制本公开的范围。
序列
除非另有说明，否则所有多肽序列都以N-末端至C-末端呈现。除非另有说明，否则所有多核苷酸序列均以5’至3’呈现。每条链中的三个CDR加下划线，并且接头区以小写字母显示。
h15A7H LH10-g4pFc的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)
h15A7H LH10-g4pFc的cDNA序列(SEQ ID NO:2)
h15A7H V2-V3-g4pFc的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)
h15A7H V2-V3-g4pFc的cDNA序列(SEQ ID NO:4)
h15A7H V4-V2-g4pFc的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)
h15A7H V4-V2-g4pFc的cDNA序列(SEQ ID NO:6)
h15A7H scFv2-LC-IgG4p轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)
h15A7H scFv2-LC-IgG4p轻链的cDNA序列(SEQ ID NO:8)
h15A7H LC-scFv2-IgG4p轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)
h15A7H LC-scFv2-IgG4p轻链的cDNA序列(SEQ ID NO:10)
h15A7H scFv2-LC-IgG4p和h15A7LC-ScFv2-IgG4p重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)
h15A7H scFv2-LC-IgG4p和h15A7LC-scFv2-IgG4p重链的cDNA序列(SEQ ID NO:12)
h15A7H scFv4-crIgG4p轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)
h15A7H scFv4-crIgG4p轻链的cDNA序列(SEQ ID NO:14)
h15A7H scFv4-crIgG4p重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)
h15A7H scFv4-crIgG4p重链的cDNA序列(SEQ ID NO:16)
h15A7H CDR-H1的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)
SFGMH
h15A7H CDR-H2的氨基酸序列(SEQ ID NO:18)
YINGGSSTIFYANAVKG
h15A7H CDR-H3的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)
YASYGGGAMDY
h15A7H CDR-L1的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)
RSSQSIVHNDGNTYFE
h15A7H CDR-L2的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)
KVSNRFS
h15A7H CDR-L3的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)
FQGSYVPLT
h15A7H VH的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSS
h15A7H VL的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGQGTKVEIK
接头序列重复的氨基酸序列(SEQ ID NO:25)
ggggs
与Fc的接头的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)
ggggsaaa
taFv接头的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)
astgs
scFv轻链接头的氨基酸序列(SEQ ID NO:28)
astgsggggs
h15A7H VH G44C的氨基酸序列(SEQ ID NO:29)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKCLEWVAYINGGSSTIFYANAVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSS
h15A7H VL Q100C的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGCGTKVEIK
人PSGL-1的氨基酸序列(SEQ ID NO:31)
较短的人PSGL-1变体的氨基酸序列(SEQ ID NO:32)

Claims (70)

1.一种特异性结合至人PSGL-1的四价抗体，所述四价抗体包含两个单体的二聚体，其中所述二聚体的每个单体包含单链多肽，所述单链多肽从N-末端至C-末端包含：
(a)第一轻链可变(VL)结构域；
(b)第一接头序列；
(c)第一重链可变(VH)结构域；
(d)第二接头序列；
(e)第二VL结构域；
(f)第三接头序列；
(g)第二VH结构域；
(h)第四接头序列；和
(i)抗体Fc结构域，
其中所述第一VL结构域和所述第二VL结构域中的每一个包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；其中所述第一VH结构域和所述第二VH结构域中的每一个包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；并且其中所述第一VL结构域和所述第二VL结构域中的每一个与所述第一VH结构域和所述第二VH结构域的相应VH结构域形成VH-VL结合单元，并且其中所述两个VH-VL结合单元中的每一个对人PSGL-1具有特异性。
2.如权利要求1所述的四价抗体，其中所述两个VH结构域中的至少一个包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的四价抗体，其中所述两个VH结构域中的每一个包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的四价抗体，其中所述两个VH结构域中的每一个包含：SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
5.如权利要求3所述的四价抗体，其中所述两个VH结构域中的每一个包含：SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的四价抗体，其中所述两个VL结构域中的至少一个包含：(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的四价抗体，其中所述两个VL结构域中的每一个包含：(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的四价抗体，其中所述两个VL结构域中的每一个包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
9.如权利要求7所述的四价抗体，其中所述两个VL结构域中的每一个包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与SEQ ID NO:30具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的四价抗体，其中所述第一接头序列、第二接头序列和第三接头序列各自包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的两个或多个重复，或所述第一、第二或第三接头序列包含SEQ ID NO:33、34、35或36的氨基酸序列。
11.如权利要求10所述的四价抗体，其中所述第一接头序列和所述第三接头序列具有相同的序列并且包含SEQ ID NO:25的两个重复。
12.如权利要求1-11中任一项所述的四价抗体，其中所述第二接头序列包含SEQ IDNO:25的五个重复。
13.如权利要求1-12中任一项所述的四价抗体，其中所述第四接头序列包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列。
14.如权利要求1-13中任一项所述的四价抗体，其中所述两个单链多肽中的每一个包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
15.如权利要求14所述的四价抗体，其中所述两个单链多肽中的每一个由包含SEQ IDNO:2的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
16.一种特异性结合至人PSGL-1的四价抗体，所述四价抗体包含两个单体的二聚体，其中所述二聚体的每个单体包含单链多肽，所述单链多肽从N-末端至C-末端包含：
(a)第一重链可变(VH)结构域；
(b)第一接头序列；
(c)第一轻链可变(VL)结构域；
(d)第二接头序列；
(e)第二VL结构域；
(f)第三接头序列；
(g)第二VH结构域；
(h)第四接头序列；和
(i)抗体Fc结构域，
其中所述第一VL结构域和所述第二VL结构域中的每一个包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；其中所述第一VH结构域和所述第二VH结构域中的每一个包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；并且其中所述第一VL结构域和所述第二VL结构域中的每一个与所述第一VH结构域和所述第二VH结构域的相应VH结构域形成VH-VL结合单元，并且其中所述两个VH-VL结合单元中的每一个对人PSGL-1具有特异性。
17.如权利要求16所述的四价抗体，其中所述两个VH结构域中的至少一个包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
18.如权利要求17所述的四价抗体，其中所述两个VH结构域中的每一个包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
19.如权利要求18所述的四价抗体，其中所述两个VH结构域中的每一个包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
20.如权利要求18所述的四价抗体，其中所述两个VH结构域中的每一个包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
21.如权利要求16-20中任一项所述的四价抗体，其中所述两个VL结构域中的至少一个包含：(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
22.如权利要求21所述的四价抗体，其中所述两个VL结构域中的每一个包含：(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
23.如权利要求22所述的四价抗体，其中所述两个VL结构域中的每一个包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
24.如权利要求22所述的四价抗体，其中所述两个VL结构域中的每一个包含：SEQ IDNO:30的氨基酸序列或与SEQ ID NO:30具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
25.如权利要求16-24中任一项所述的四价抗体，其中所述第一接头序列和所述第三接头序列具有包含SEQ ID NO:25的五个重复的相同的序列。
26.如权利要求16-25中任一项所述的四价抗体，其中所述第二接头序列包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列。
27.如权利要求16-26中任一项所述的四价抗体，其中所述第四接头序列包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列。
28.如权利要求16-27中任一项所述的四价抗体，其中所述两个单链多肽中的每一个包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
29.如权利要求28所述的四价抗体，其中所述两个单链多肽中的每一个由包含SEQ IDNO:4的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
30.一种特异性结合至人PSGL-1的四价抗体，所述四价抗体包含两个单体的二聚体，其中所述二聚体的每个单体包含抗体重链和抗体轻链；
其中所述抗体轻链从N-末端至C-末端包含：
(i)第一重链可变(VH)结构域，
(ii)第一接头序列，
(iii)第一轻链可变(VL)结构域，
(iv)第二接头序列，
(v)第二VL结构域，和
(vi)轻链恒定(CL)结构域；
其中所述抗体重链包含：
(i)第二VH结构域，和
(ii)重链恒定区，其包含第一重链恒定区(CH1)结构域、抗体铰链区、第二重链恒定区(CH2)结构域和第三重链恒定区(CH3)结构域；
其中所述第一VL结构域和所述第二VL结构域中的每一个包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；其中所述第一VH结构域和所述第二VH结构域中的每一个包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；并且其中所述第一VL结构域和所述第二VL结构域中的每一个与所述第一VH结构域和所述第二VH结构域的相应VH结构域形成VH-VL结合单元，并且其中所述两个VH-VL结合单元中的每一个对人PSGL-1具有特异性。
31.如权利要求30所述的四价抗体，其中所述第一VH结构域和所述第二VH结构域中的至少一个包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
32.如权利要求31所述的四价抗体，其中所述第一VH结构域和所述第二VH结构域各自包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
33.如权利要求32所述的四价抗体，其中所述第一VH结构域和所述第二VH结构域各自包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
34.如权利要求32所述的四价抗体，其中所述第一VH结构域和所述第二VH结构域各自包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
35.如权利要求30-34中任一项所述的四价抗体，其中所述第一VL结构域和所述第二VL结构域中的至少一个包含：(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
36.如权利要求35所述的四价抗体，其中所述第一VL结构域和所述第二VL结构域各自包含：(i)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(ii)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和(iii)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
37.如权利要求36所述的四价抗体，其中所述第一VL结构域和所述第二VL结构域各自包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
38.如权利要求36所述的四价抗体，其中所述第一VL结构域和所述第二VL结构域各自包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与SEQ ID NO:30具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
39.如权利要求30-38中任一项所述的四价抗体，其中所述CL结构域是κCL结构域。
40.如权利要求30-39中任一项所述的四价抗体，其中所述第一接头序列包含SEQ IDNO:25的五个重复。
41.如权利要求30-40中任一项所述的四价抗体，其中所述第二接头序列包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列。
42.如权利要求30-41中任一项所述的四价抗体，其中所述抗体轻链包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
43.如权利要求42所述的四价抗体，其中所述抗体轻链由包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
44.如权利要求30-43中任一项所述的四价抗体，其中所述抗体重链包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11具有至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
45.如权利要求44所述的四价抗体，其中所述抗体重链由包含SEQ ID NO:12的多核苷酸序列的多核苷酸编码。
46.如权利要求1-45中任一项所述的四价抗体，其中所述抗体Fc结构域是人抗体Fc结构域。
47.如权利要求46所述的四价抗体，其中所述抗体Fc结构域是人IgG4 Fc结构域。
48.如权利要求47所述的四价抗体，其中所述人IgG4 Fc结构域包含含有一种或多种氨基酸取代的铰链区序列，所述氨基酸取代导致相较于缺乏所述一种或多种氨基酸取代的IgG4铰链区减少的IgG4改组。
49.如权利要求47或权利要求48所述的四价抗体，其中所述人IgG4 Fc结构域包含铰链区序列，所述铰链区序列包含根据EU索引编号的氨基酸228处的丝氨酸至脯氨酸取代。
50.一种分离的多核苷酸，其编码如权利要求1-49中任一项所述的四价抗体。
51.如权利要求50所述的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸包含选自由以下组成的组的多核苷酸序列：SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和16。
52.一种载体，其包含如权利要求50或权利要求51所述的分离的多核苷酸。
53.一种宿主细胞，其包含如权利要求50或权利要求51所述的多核苷酸或者如权利要求52所述的载体。
54.一种产生四价抗体的方法，其包括培养如权利要求53所述的宿主细胞使得产生所述四价抗体。
55.如权利要求54所述的方法，其还包括从所述宿主细胞回收所述四价抗体。
56.一种药物组合物，其包含如权利要求1-49中任一项所述的四价抗体和药学上可接受的载剂。
57.一种试剂盒，其包括如权利要求1-49中任一项所述的四价抗体和任选的药学上可接受的载剂。
58.如权利要求57所述的试剂盒，其还包括包装插页，所述包装插页包含用于施用所述四价抗体以治疗T细胞介导的炎性疾病的说明书。
59.如权利要求57所述的试剂盒，其还包括包装插页，所述包装插页包含用于在输注或移植之前、同时和/或之后施用所述四价抗体的说明书。
60.如权利要求1-49中任一项所述的四价抗体，其用于治疗T细胞介导的炎性疾病。
61.如权利要求1-49中任一项所述的四价抗体，其用于治疗需要输注或移植的个体。
62.如权利要求1-49中任一项所述的四价抗体的用途，其用于制造治疗T细胞介导的炎性疾病所用的医药。
63.如权利要求1-49中任一项所述的四价抗体的用途，其用于制造治疗需要输注或移植的个体所用的医药。
64.一种治疗T细胞介导的炎性疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如权利要求1-49中任一项所述的四价抗体。
65.一种用于治疗需要输注或移植的个体的方法，其包括在输注或移植之前、同时和/或之后向所述个体施用治疗有效量的如权利要求1-49中任一项所述的四价抗体。
66.如权利要求58所述的试剂盒、如权利要求60所述的四价抗体、如权利要求62所述的用途或如权利要求64所述的方法，其中所述T细胞介导的炎性疾病是自身免疫性疾病。
67.如权利要求58所述的试剂盒、如权利要求60所述的四价抗体、如权利要求62所述的用途或如权利要求64所述的方法，其中所述T细胞介导的炎性疾病选自由以下组成的组：银屑病、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、强直性脊柱炎、I型糖尿病、溃疡性结肠炎、多发性硬化和移植物抗宿主病(GVHD)。
68.如权利要求67所述的试剂盒、四价抗体、用途或方法，其中所述银屑病是斑块状银屑病、慢性斑块状银屑病、滴状银屑病、反转型银屑病、脓疱型银屑病或红皮病型银屑病。
69.如权利要求59所述的试剂盒、如权利要求61所述的四价抗体、如权利要求63所述的用途或如权利要求65所述的方法，其中所述移植是选自由以下组成的组的组织的移植：骨髓、肾脏、心脏、肝脏、神经元组织、肺、胰腺、皮肤和肠。
70.如权利要求59所述的试剂盒、如权利要求61所述的四价抗体、如权利要求63所述的用途或如权利要求65所述的方法，其中所述输注是包括以下中的一种或多种的输注：白细胞、红细胞和血小板。
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