CN109970870B - 人源靶向补体抑制物蛋白mCR2-CD59及应用 - Google Patents

人源靶向补体抑制物蛋白mCR2-CD59及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种补体受体2变异体与补体抑制剂CD59的融合蛋白和所述融合蛋白在制备自身免疫性疾病治疗药物中的应用。所述补体受体2变异体是经过计算机模建、氨基酸置换后获得的分子改构体，比其野生序列有更高的配体结合与解离速率，具有更好的配体结合力。生物学分布实验证明，本发明提供的融合蛋白进入类风湿关节炎小鼠模型后可快速在关节炎部位高度聚集，具有显著的抗黏附/抗炎靶向抑制效应。在对MRL/lpr红斑狼疮小鼠的治疗中，所述融合蛋白能够显著提升小鼠的存活率，治疗组小鼠的蛋白尿、肾小球积分、间质炎症、血管炎和新月体/坏死等症状得到明显改善。

Description

人源靶向补体抑制物蛋白mCR2-CD59及应用
技术领域
本发明公开了一种融合蛋白，属于多肽技术领域。
背景技术
补体系统由30余种可溶性蛋白分子组成，是天然免疫系统的一部分，其组成成分包括补体固有成分、多种调节因子和补体受体等30多种分子。补体系统可通过3条既相对独立又相互联系的途径被激活，从而发挥调理吞噬、裂解细胞、介导炎症、免疫调节和清除免疫复合物等多种生物学效应，包括增强吞噬作用，增强吞噬细胞的趋化性，增加血管的通透性，中和病毒，细胞溶解作用，免疫反应的调节作用等。补体激活和其在靶结构上的沉积也可以间接地引起细胞或组织破坏，在补体途径中的各个点产生介导组织损害的补体激活产物。宿主组织上不适当的补体激活在许多自身免疫疾病和炎性疾病的病理学中起重要作用，并且也是造成与例如心肺炎症和移植排斥后的生物不相容性有关的许多病状的原因。补体抑制是治疗这些免疫介导的疾病和症状的潜在治疗方式。
补体激活的途径有3个，即经典途径、旁路途径和甘露聚糖结合凝集途径。参与补体经典激活途径的成分包括C1-C9。按其在激活过程中的作用，人为地分成三组，即识别单位(Clq、Clr、Cls)、活化单位(C4、C2、C3)和膜攻击单位(C5-C9)，分别在激活的不同阶段即识别阶段、活化阶段和膜攻击阶段中发挥作用。这3个阶段一般在靶细胞膜的3个不同部位进行。补体在激活过程中C2、C3、C4、C5均分别裂解成2个或2个以上的片段，分别标以a、b等符号，如C3a、C3b、C3c等。其中C2b、C3b、C4b、C5b直接或间接结合在靶细胞上，以固相的形式参与溶细胞过程，C3a、C5a游离在液相。补体在激活过程中，C5、C6、C7经活化后还可聚合成C567，并与C3a、C5a一起发挥特殊的生物学功能。旁路激活途径与经典激活途径不同之处在于激活是越过了C1、C4、C2三种成分，直接激活C3继而完成C5至C9各成分的连锁反应，还在于激活物质并非抗原抗体复合物而是细菌的细胞壁成分—脂多糖，以及多糖、肽聚糖、磷壁酸和凝聚的IgA和IgG4等物质。旁路激活途径在细菌性感染早期，尚未产生特异性抗体时，即可发挥重要的抗感染作用。甘露聚糖结合凝集途径由血浆中甘露聚糖结合凝集素(Mannan-Binding Lectin，MBL)直接识别多种病原微生物表面的N-氨基半乳糖或甘露糖，进而依次活化MASP-1、MASP-2、C4、C2、C3，形成和经典途径相同的C3与C5转化酶，激活补体级联酶促反应的活化途径。MBL激活途径的主要激活物为表面含有甘露糖基、岩藻糖和N-氨基半乳糖的病原微生物。以上三种途径均能产生C3转化酶，C3分子被C3转化酶裂解为过敏毒素C3a以及具有调理作用的C3b，C3b分子能与糖蛋白表面的胺基与羟基共价连接，这种共价作用由C3b分子内部的硫酯基所介导。因而，C3b分子可吸附于侵入体内的微生物表面，再与补体受体1(CR1/CD35)结合，在血清H因子和I因子的作用下水解形成iC3b，iC3b随后被裂解为C3d。C3d片段是补体C3的不能再酶解的最小片段。结合C3d分子的微生物能与II型补体受体(CR2/CD21)结合。
补体激活产生的各种C3激活片段作为各种C3受体的配体起到补体调理素的作用。补体受体2(CR2)是其中的一种补体受体，作为一种跨膜蛋白，CR2通过在滤泡树突状细胞(FDC)、B细胞和一些T细胞上的表达并与免疫复合物的结合对于上述细胞尤其是成熟B细胞的存活以及高亲和力B细胞的选择起重要作用。CR2是C3结合蛋白家族的成员，并且由15-16个短共有重复(SCR)结构域(C3结合蛋白家族的特征性结构单元)组成，C3结合位点包含在2个N末端SCR中。不同于补体激活抑制剂(DAF，MCP，CR1和Crry)，CR2不是补体抑制剂，并且其不结合C3b。CR2的天然配体是iC3b，C3dg和C3d，其是结合CR2两个N末端SCR结构域的C3b的细胞结合裂解片段。C3的裂解最初引起C3b的产生及其在激活细胞表面上的沉积。C3b片段参与酶复合物的产生，该酶复合物扩大补体级联。在细胞表面上，特别是当在含有补体激活调节剂的宿主表面(即，大多数宿主组织)上沉积C3b时，C3b快速转化为失活的iC3b。即使在不存在膜结合的补体调节剂的情况下，也形成相当高水平的iC3b。随后，iC3b被血清蛋白酶消化为膜结合片段C3dg和C3d，但是这个过程相对慢。因此，CR2的C3激活片段配体一旦产生后就相对长寿，并且以高浓度存在于补体激活位点。CR2因此能充当将效应分子带到补体激活位点的有效靶向载体。
补体激活的下调已经在动物模型和体外研究中被证实对于治疗几种疾病适应症是有效的，例如系统性红斑狼疮和肾小球肾炎、类风湿性关节炎、心肺分流和血液透析、器官移植中的超急性排斥、心肌梗塞、再灌注损伤以及成人呼吸窘迫综合症。此外，其它炎症状况和自身免疫病/免疫复合物病也与补体激活紧密相关，包括热损伤、重症哮喘、过敏性休克、肠炎、风疹、血管性水肿、血管炎、多发性硬化症、重症肌无力、膜增殖性肾小球肾炎和干燥综合症。
已有研究证明存在两大类的膜补体抑制剂：补体激活途径的抑制剂(抑制C3转化酶形成)和终末补体途径的抑制剂(抑制MAC形成)。补体激活的膜抑制剂包括补体受体1(CR1)，衰变加速因子(DAF)和膜辅因子蛋白(MCP)，这些抑制剂在补体级联的更早期起作用。CD59是一种终末补体途径的抑制剂，其最初分离自人红细胞表面，是分子量为18-20kDa的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的膜糖蛋白。与以上在补体级联的更早期起作用不同的是，CD59通过形成膜攻击复合物(MAC)来进行补体激活后抑制的。MAC形成是补体级联的最终事件之一，在细胞膜上形成小孔，这最终导致细胞的破坏。CD59结合C5b-8，干扰C9分子的后续聚合和MAC形成，从而达到防止补体级联活化导致的自体组织损伤的效果。
研究表明，未被靶向的CD59只有非常弱的补体抑制活性(SONG H，et al J ClinInvest 111:1875-1885)，将补体抑制剂靶向补体激活和疾病位点则成为充分发挥CD59补体抑制的有效方法。因为补体在宿主防御和免疫复合物分解代谢中起重要的作用，所以定向的补体抑制剂也可以减少特别是长期补体抑制带来的潜在严重的副作用。在体外可行性研究中，已证明与保护未靶向细胞相比，抗体-DAF和抗体-CD59融合蛋白更有效地保护靶向的细胞免受补体的破坏。鉴于CD59是一种终末补体途径的抑制剂，可以说是补体激活抑制的最后关隘，因此无论其单独发挥抑制作用还是和其它阶段的抑制剂联合发挥抑制作用，在临床应用上都具有重要的意义。CN100594037C分别报道了补体靶向因子补体受体2与补体抑制剂DAF和CD59融合对于抑制补体激活的有益效果。但是补体受体2与CD59融合蛋白在抑制补体活性的发挥上还存在着一定的技术问题，例如，在与补体受体2与DAF融合蛋白的对比中其抑制活性不高，而且CR2与CD59补体不同的融合方向也明显影响了CD59的抑制活性。现有技术出现的问题提示融合蛋白的序列乃至空间构象是影响补体抑制剂充分发挥活性的一个关键因素。因此对融合蛋白的改构尤其是对靶向因子CR2的改构以提高靶向效率降低非靶向损害就成为一种新的改进思路。
本发明拟通过计算机模建、氨基酸置换，对补体受体2进行进一步的分子改构，以提高补体受体2与配体结合的特异性，以及改善CR2与CD59融合蛋白作为一个整体的分子结构，进一步提高CR2-CD59融合蛋白作为靶向补体抑制剂对补体激活的抑制效应。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种补体受体2变异体与CD59的融合蛋白，所述补体受体2变异体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。所述补体受体2变异体在本发明中被定义为mCR2，所述补体受体2变异体与CD59的融合蛋白被定义为mCR2-CD59，而野生序列的补体受体2与CD59的融合蛋白被定义为CR2-CD59。
在一个优选的技术方案中，所述补体受体2变异体与CD59分子以柔性短肽SGGGGS连接。
更为优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
其次，本发明还提供了编码上述融合蛋白的核苷酸分子，所述核苷酸分子的序列如SEQ ID NO.4所述。
第三，本发明还提供了一种含有上述核苷酸分子的重组表达载体。
在一个优选的技术方案中，所述载体为pEE14.1-mCR2-CD59，其中pEE14.1是一种高效表达载体，编码mCR2-CD59的的核苷酸分子被克隆于pEE14.1之上。
第四，本发明还提供了一种含有上述表达载体的宿主工程细胞。
在一个优选的技术方案中，所述工程细胞为CHO-K1-pEE14.1-mCR2-CD59细胞，其中能够表达mCR2-CD59的重组表达载体pEE14.1-mCR2-CD59被转染入宿主细胞CHO-K1之中。
最后，本发明提供了前述的融合蛋白在制备自身免疫性疾病治疗药物中的应用。
在一个优选的技术方案中，所述疾病包括类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
本发明公开的mCR2是经过计算机模建、氨基酸置换后获得的分子改构体，比其野生序列(CR2)有较高的配体结合与解离速率，具有更好的配体结合力。补体介导的CHO细胞和红细胞溶解实验结果显示mCR2-CD59比CR2-CD59的抑制效果更为明显。抑制50％CHO细胞溶解，mCR2-CD59的浓度为34nmol/L，而CR2-CD59的浓度为88nmol/L，抑制效率提高了2倍。生物学分布实验证明，本发明提供的融合蛋白进入类风湿关节炎小鼠模型后可快速在关节炎部位高度聚集，证明本发明的补体受体2变异体对C3d具有特异的靶向性，mCR2-CD59比CR2-CD59具有更好的好转度，且具有明显的剂量依赖关系，证明mCR2-CD59具有优异的抗黏附/抗炎靶向抑制效应，对机体的炎症反应具有更有益的治疗作用。本发明公开的mCR2-CD59在MRL/lpr红斑狼疮小鼠的治疗中，能够明显提升小鼠的存活率，整个治疗过程能够完全保护MRL/lpr红斑狼疮小鼠，mCR2-CD59治疗组存活率为100％。而且mCR2-CD59治疗组的蛋白尿、肾小球积分、间质炎症、血管炎和新月体/坏死等症状得到明显改善，显示本发明提供的mCR2-CD59在制备自身免疫性疾病治疗药物中具有优异的应用前景。
附图说明
图1.mCR2-CD59序列变异示意图；
图2.CR2-CD59序列示意图；
图3.mCR2-CD59的12％SDS-PAGE鉴定图谱；
图4.mCR2-CD59的Western Blot鉴定图谱；
图5.mCR2-CD59在RA小鼠体内的生物学分布对照图；
图6.mCR2-CD59治疗RA小鼠的临床评分对照图；
图7.mCR2-CD59治疗MRL/lpr小鼠的存活率对照图；
图8.mCR2-CD59治疗MRL/lpr小鼠的蛋白尿变化对照图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
计算机模建
利用InsightⅡ软件包中的Builder程序,以从头搭建的方法展示短肽。利用分子对接(docking)的方法模拟CR2与C3d结合后所形成的复合物的结构,经分子力学与分子动力学优化,获得CR2/C3d复合物的稳定构象。对两者的结合位点进行分析,确定CR2与C3d结合的核心序列,并获得两者结合时氨基酸之间相互作用的方式及能量。根据分析结果,置换CR2的某些氨基酸,再次模建,获得CR2突变肽-C3d复合物的稳定构象。分析CR2突变肽与C3d之间相互作用的方式和能量,比较CR2突变前后与C3d结合时的亲和力大小。
初步进行了CR2与C3d复合物的模拟，并设计了如下的突变体，提高其与C3d的结合：
1、Thr86-----Ser；2、Phe130-----Tyr；3、Glu133-----Gln；4、Asp92-----Glu；5、Thr25-----Ser(CR2突变后的氨基酸序列(mCR2)如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，突变位点如图1所示，突变前的CR2野生序列(CR2)如图2所示)。
实施例1.mCR2-CD59融合蛋白与CR2-CD59融合蛋白的制备
1材料表达载体选用pEE14.1(Lonza biologics)；CHO细胞用于蛋白表达，其培养液为含10％胎牛血清的DMEM，购自Invitrogen公司。鼠抗CD59mAb 1H4和1A10，鼠抗人CR2mAb 171，抗羊红细胞IgM及所有二抗均购自Sigma公司。
2方法
2.1兔抗CHO细胞膜和人CD59的抗血清的制备按照文献Harlow,E.,and Lane,D.Antibodies:a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory.Cold SpringHarbor,New York,USA.1988:726.介绍的方法获得。
2.2表达重组体的构建及蛋白表达cDNA结构基因由编码CR2的4个N-端SCR单位与编码CD59编码胞外区的序列相连接而成。补体抑制物序列是编码成熟CD59蛋白序列的231个碱基(Swissprot登录号为AAA88793)。进行CR2与C3d复合物的计算机模拟，设计了如下的mCR2突变体，提高其与C3d的结合：1、Thr86-----Ser；2、Phe130-----Tyr；3、Glu133-----Gln；4、Asp92-----Glu；5、Thr25-----Ser。
然后将mCR2、CR2分别与补体抑制物CD59连接，mCR2、CR2在N-端时(mCR2-CD59、CR2-CD59)连接序列为SGGGGS。基因框架用PCR技术合成(融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。所有克隆步骤均在pEE14.1载体上进行(参见CN104940953A)。pEE14.1高效表达载体含有特殊的谷氨酰胺(GS)基因表达系统。GS酶负责用谷氨酰和胺作为底物合成谷氨酰胺。一些哺乳动物细胞系不含GS基因，所以在未加谷氨酰胺的环境下不能存活。对于这些细胞系而言，转染的GS基因可以作为一种筛选标记，能筛选出无谷氨酰胺培养基中生长的细胞。甲硫氨酸亚胺(Methionine sulphoximine，MSX)能抑制GS酶的活性，某些细胞系(CHO-K1)能产生内源性谷氨酰胺，就能在含有MSX的无谷氨酰胺培养基中生长，这种加有足量MSX能抑制GS酶活性的培养基提供筛选压力，从而筛选出所需要的细胞株。mCR2-CD59、CR2-CD59融合基因经PCR方法合成后与pEE14.1载体均经过经EcoRI、SmalI双酶切后连接，重组载体pEE14.1-mCR2-CD59及pEE14.1-CR2-CD59用FuGENE 6转染CHO-K1宿主细胞，转染后的宿主细胞被定义为CHO-K1-pEE14.1-mCR2-CD59，转染24小时后，换选择性DMEM培养基(不含谷氨酰胺)，并加入MSX至终浓度为50μM，约2周长出阳性克隆，而没有转染质粒的正常CHO细胞逐渐从瓶壁脱落，细胞裂解死亡。选择3株细胞，分别用有血清培养基及无血清培养基培养3天，收集细胞上清，部分经PEG20000浓缩5倍备用，其余-80℃保存。以ELISA方法检测mCR2-CD59、CR2-CD59的表达(mCR2-CD59氨基酸序列如SEQID NO.3所示和图1所示，CR2-CD59氨基酸序列如图2所示)。重组蛋白以分泌形式在CHO细胞中表达。采用无血清培养基培养的CHO细胞稳定表达株的表达量高于采用含血清的培养基培养的细胞。
2.3重组蛋白的纯化利用亲和色谱法对细胞培养物上清中的蛋白进行纯化。按照操作手册，层析柱通过将抗CD59mAb(1H4)与HiTrap NHS活化的亲和柱偶联而成。将含重组蛋白培养上清的pH值调至8.0，以0.5mL/min的速率过柱。然后以6～8倍体积PBS洗柱子，重组蛋白以2～3倍柱体积的0.1mol/L甘氨酸(pH2.4)洗脱。将融合蛋白收集到1mol/L Tris缓冲液(pH8.0)中，并在PBS中透析。
2.4 SDS-PAGE和Western blot鉴定
纯化的蛋白在含100g/L的SDS-PAGE胶中进行。凝胶用考马斯亮蓝染色。Westernblot实验中用鼠抗CD59mAb 1H4对重组蛋白进行检测。
3.结果
从稳定转染的CHO细胞培养上清中分离到重组蛋白(mCR2-CD59、CR2-CD59)100～200μg/L，应用SDS-PAGE(图3)和Western blot(图4)进行鉴定。图3中泳道1为蛋白质分子量标记，泳道2为mCR2-CD59，泳道3为CR2-CD59。图4中，泳道2为mCR2-CD59，泳道3为CR2-CD59。图3和图4结果显示出现预期大小的目标片段。
本发明同时也按照上述方法表达了CR2及CR2突变体与另一种补体抑制剂DAF的融合蛋白(DAF序列参见Swissprot登录号为P08174)。
实施例2.CR2融合蛋白与C3配基相互作用动力学分析
CR2融合蛋白与生物素标记的C3dg(C3dg-生物素)相互作用的动力学分析用表面细胞质基因组共振(SPR)检测系统进行检测(BIAcore3000仪器)。按照每个流动细胞平均50mg/L的量，将人C3dg-生物素(Guthridge,J.M.,et al.Structural studies insolution of the recombinant N-terminal pair of short consensus/complementrepeat domains of complement receptor type 2(CR2/CD21)and interactions withits ligand C3dg.Biochemistry.2001,40(20):5931–5941.)以2μL/min的速度注射到BIAcore抗生物素蛋白链菌素传感器芯片上，作用20min，缓冲液是0.5×PBS(pH7.4)(含有0.5g/L Tween20)。从捕获的C3dg上获取的SPR信号产生BIAcore反应单位(范围是250到500)。以不加融合蛋白组作为对照。25℃，以25μL/min的流速，用0.5×PBST(0.5g/LTween20)洗涤后，通过检测CR2融合蛋白浓度(15.6～500nmol/L)来评估其亲和力。
动力学分析数据显示，1∶1最适合接合反应模型用球形检测参数。SPR检测结果显示，mCR2-CD59比其在CR2-CD59有较高的结合与解离速率(表1)。而且mCR2-CD59的亲和力比CR2-CD59高。在本实施例中，对CR2-DAF与C3dg-生物素结合的动力参数也进行了评价，发现经过CR2的分子改构，mCR2-CD59的亲和力高于CR2-DAF。
表1重组融合蛋白与C3dg-生物素结合的动力参数
Figure BDA0002039216070000091
实施例3.补体溶解实验
为测定对补体的抑制活性，60％～80％融合的CHO细胞用乙二胺四乙酸分开，用DMEM洗2次，然后重悬于DMEM中，使其终浓度为106个细胞/mL。在细胞悬液中加入100mL/L兔抗CHO细胞膜抗血清，4℃作用30min，使细胞致敏。然后弃抗血清，细胞重悬于用DMEM稀释的NHS中，终体积为50μL或100μL。37℃作用60min，最后用胎盘兰染色排除法测量细胞成活力(活细胞与死细胞均计数)。重组融合蛋白用DEME稀释后先加入到NHS中，再加入至CHO细胞悬液。终浓度以100g/L NHS可导致大约90％抗体致敏的对照CHO细胞溶解为准。补体介导的红细胞溶解抑制实验用抗体致敏的羊红细胞(EAs)进行测定。溶血试验在明胶佛罗那缓冲液(GVB++)中进行，终体积为300μL，包含有2.5×107EAs，NHS按照1∶300稀释。反应混合物在37℃孵育60min，最后加入300μL含10mmol/L EDTA-PBS溶液终止反应。离心，取上清，在413nm波长下用光谱成像仪对上清中的血红素进行定量检测。
融合蛋白补体抑制物活性检测：补体介导的CHO细胞和红细胞溶解实验结果显示，CR2-CD59比非靶向sCD59抑制效果明显，而mCR2-CD59比CR2-CD59的抑制效果更为明显。抑制50％CHO细胞溶解，mCR2-CD59的浓度为34nmol/L，CR2-CD59的浓度为88nmol/L，抑制效率提高了2倍，非靶向的sCD59需要507nmol/L，抑制效率提高了近15倍，抑制50％红细胞溶解，mCR2-CD59的浓度为27nmol/L，CR2-CD59的浓度为49nmol/L，抑制效率提高了近2倍，非靶向的sCD59需要221nmol/L，抑制效率提高了8倍(表2)。另外，在红细胞溶解抑制实验中，非靶向sCD59对红细胞的保护作用要比CHO细胞强。在本实施例中，对CR2-DAF也进行了补体溶解实验，发现经过CR2的分子改构，mCR2-CD59与C3dg-生物素结合的动力参数的亲和力高于CR2-DAF(见实施例2)，在抑制补体介导的CHO细胞和红细胞溶解实验中，比CR2-DAF具有更高的抑制效率，对CHO细胞溶解的抑制效率提高了近3倍(表2)。
表2能抑制50％细胞发生溶解的补体抑制物浓度
Figure BDA0002039216070000101
实施例4.mCR2–CD 59融合蛋白RA体内实验：
1.生物学分布实验
采用Iodogen法将mCR2-CD59、CR2-CD59和CD59分别标记125I，在涂布有200μgIodogen的EP管中，依次加入现配制的50mmLo/L PBS(pH7.4)150μl、含1mg BSA溶解的ScFv100μl(100μg)、Na125I溶液15μl(185MBq)，室温下间断轻微摇动标记管15min。SEP-PAK C18柱分别用甲醇、双蒸水和0.1％三氟乙酸(TFA)各5mL依次洗涤使其活化；标记混合物上柱，0.1％TFA淋洗；60％的乙腈溶液洗脱，收集前1.5mL洗脱液。经冷冻干燥后，用含1mg/mL BSA的PBS溶液稀释、分装，-80℃冰箱贮存备用。雄性DBA/1J小鼠尾根部皮下注射0.1mL胶原Ⅱ和完全弗氏佐剂(均购于美国Sigma公司)，第21天加强一次建立类风湿关节炎(CIA)小鼠模型(模型建立参照C57BL/6小鼠CIA模型的建立及其监测体系的初步筛选，解放军医学杂志2004年6月第29卷第6期472-474)。试验和分组方法如下：①对照组尾静脉注射125I--CD59(2ug)，分别在24h、48h后断头处死，收集血液，取出组织器官，称重并测定其放射性(μCi)，结果换算为ID％/g组织。②关节炎组尾静脉注射125I--CD59融合蛋白(2ug)，分别在24h、48h、72h、96h后，采取同上处理、检测。③mCR2-CD59关节炎治疗组，尾静脉注射一次125I-mCR2-CD59融合蛋白(0.25ug)，24h后采取同上处理、检测。④CR2-CD59关节炎治疗组，尾静脉注射一次125I-CR2-CD59融合蛋白(0.25ug)，24h后采取同上处理、检测。结果如图5所示，表明本发明的mCR2-CD59融合蛋白可在关节炎部位高度聚集，表现出比CR2-CD59融合蛋白更高的靶向效应(图5中图例说明的自上而下顺序的图例与图5中每一分组柱图中的自左向右顺序的亚柱图一一对应)。
2.类风湿关节炎(CIA)小鼠模型的治疗
利用类风湿关节炎(CIA)小鼠模型(同上)，从第21天开始试验，分组如下：①注射50μl PBS对照组(N＝20)。②CR2-CD59低剂量治疗组(N＝18)，每天注射一次CR2-CD59融合蛋白(0.25)mg。③CR2-CD59高剂量治疗组(N＝20)，每天注射两次CR2-CD59融合蛋白(0.25mg)。④mCR2-CD59低剂量治疗组(N＝18)，每天注射一次mCR2-CD59融合蛋白(0.25mg)。⑤mCR2-CD59高剂量治疗组(N＝18)，每天注射两次mCR2-CD59融合蛋白(0.25mg)。第23天开始临床评分，按以下标准对动物关节炎程度计分：0分，无关节炎；1分，轻微炎症和爪部发红；2分，严重红斑和肿胀，影响爪部功能；3分，爪部或关节变形、僵硬，失去功能。每只小鼠四肢最高总分为12分。结果如图6所示，从第23天开始，mCR2-CD59融合蛋白两个治疗组的关节炎严重程度明显低于PBS组。其中第⑤组(2次注射组)的评分是第④组(1次注射组)的2/3以下，是第③组(CR2-CD59两次注射组)的1/2以下，是第④组(CR2-CD59一次注射组)的1/3以下，是第①组(PBS对照组)的1/4以下。
以上实验结果证明本发明的mCR2-CD59融合蛋白对C3d具有特异的靶向性，具有更好地抗黏附/抗炎靶向抑制效应，对机体的炎症反应具有很好的治疗作用，显著高于CR2-CD59的治疗效果。
实施例5.mCR2-CD59与CR2-CD59在MRL/lpr红斑狼疮小鼠中的治疗作用
1.生存率的提高
MRL/lpr红斑狼疮小鼠模型最早是Murphy和Roths于1979年建立，由多个品系小鼠经过历经12代的复杂的杂交过程而成，该模型的小鼠基因的75％来自LG/J、12.6％来自AKR/J、12.1％来自C3H/Di及0.3％来自C57BL/6品系小鼠。MRL/lpr小鼠含有与细胞自发性程序性死亡有关的Fas基因隐性突变，出现淋巴细胞增生基因，导致T细胞增生，全身淋巴结肿大，以及侵蚀性关节炎，抗DNA、抗Sm、抗Su、抗核苷P抗体，高滴度ANA，高丙种球蛋白血症以及类风湿因子。该鼠最早发病于8周，此时血清中可检测到自身抗体。12周时可以观察到淋巴结炎。12－16周，MRL/lpr鼠开始产生包括抗双链DNA抗体在内的大量自身抗体。近16周龄时多器官受累，以及出现以严重蛋白尿为特征的稳定肾功能退化。16-24周龄鼠出现增殖性免疫复合物介导的肾小球肾炎，血管炎，并最终导致肾衰而死亡，死亡率可以达到50％。
MRL/lpr小鼠从16周到24周mCR2-CD59治疗组(n＝26)、CR2-CD59治疗组(n＝24)和PBS对照组(n＝26)的小鼠生存率的对比
本实施例将已经出现肾衰症状的16周的MRL/lpr鼠(上海斯莱克公司)随机分为三组，第一组(n＝26)从第16-24周起每周接受0.2mg mCR2-CD59，第二组(n＝24)从第16-24周起每周接受0.2mg CR2-CD59，第三组(n＝26)为对照组，从第16-24周起每周接受等量的PBS。三组的给药途径均为尾静脉注射。通过根据给药组(0.2mg mCR2-CD59/周),0.2mgCR2-CD59/周)和对照组(0.2mg PBS/周)评价mCR2-CD59和CR2-CD59靶向抑制补体激活的效应，以及对MRL/lpr红斑狼疮小鼠的保护率。
实验结果如图7所示，接受CR2-CD59治疗的小鼠，由于补体激活途径中的C3d被靶向C3d的CR2-CD59有效抑制，因此，MRL/lpr红斑狼疮小鼠的存活率明显提高，mCR2-CD59治疗组整个治疗过程能够完全保护MRL/lpr红斑狼疮小鼠，存活率为100％，CR2-CD59组即使在第24周也能保持在70％以上的存活率，和对照组相比，从19周起治疗组的小鼠生存率明显提高。
2.肾功能改善
将小鼠置于代谢笼里研究mCR2-CD59,CR2-CD59对MRL/lpr红斑狼疮小鼠尿白蛋白分泌的影响。从16周开始每两周收集一次小鼠的24小时尿液。为防止细菌生长，在收集管中加入氨苄青霉素、庆大霉素(Invitrogen Life Technologies)和氯霉素(Sigma-Aldrich)。使用已知浓度的小鼠白蛋白样品通过ELISA方法绘制标准曲线，并确定实验小鼠的尿白蛋白分泌情况，并使用生化仪测定小鼠尿液中的肌酐含量。最后的评价结果以每只实验小鼠24小时的尿白蛋白(mg)与肌酐(mg)比值表示。尿白蛋白肌酐比值偏高表示肾脏功能受到损害。如图8所示，MRL/lpr小鼠mCR2-CD59治疗组(n＝21)、CR2-CD59治疗组(n＝23)和PBS对照组(n＝24)蛋白尿情况对比：在第22周和24周时，与对照组相比，治疗组的蛋白尿水平明显降低(P<0.01)，mCR2-CD59治疗组(n＝21)比CR2-CD59治疗组(n＝23)蛋白尿水平更加降低(P<0.01)。证明本发明提供的mCR2-CD59更能够显著改善肾功能损伤症状。
3.肾脏的炎症反应减轻
实验结束后，切除小鼠肾脏纵向解剖为两半，其中一半进行免疫荧光分析，另一半10％中性甲醛固定，固体石蜡包埋切片，以苏木精-伊红染色法和过碘酸雪夫染色法对石蜡处理的肾脏组织切片进行染色，采用盲法分别对自切片观察到的肾小球炎症、增生、新月体形成、坏死症状进行评分，同时对肾间质的变化也进行评分。评分共分为0、1、2、3、4五级，0为无损伤，4为严重损伤。血管周围炎性渗出评价采用半定量方式，由两个独立观察者盲法对每张切片10个以上的血管进行评价。炎症的得分为0-3，0为无炎症，1为低于50％的血管由3层细胞围绕，2为大于50％的血管为3-6层围绕，3为最严重表现，多于6层的细胞环绕。评价结果如表3所示。
表3.MRL/lpr小鼠从16周到23周治疗后第24周治疗组和PBS对照组肾脏损害情况对比
分组 肾小球积分 间质炎症 血管炎 新月体/坏死
PBS对照组(n＝18) 12.6±3.6 3.8±0.7 100％ 70％
CR2-CD59治疗组(n＝20) 9.8±3.3 3.5±0.6 80％ 65％
mCR2-CD59治疗组(n＝20) 4.6±2.1 2.1±0.3 50％ 20％
mCR2-CD59比CR2-CD59对MRL/lpr红斑狼疮小鼠的治疗中更好地减轻了肾脏的炎症反应。和对照组相比，mCR2-CD59比CR2-CD59在肾小球积分、间质炎症、血管炎和新月体/坏死等更加明显降低(P<0.05)。
序 列 表
<110> 北京康普美特创新医药科技有限责任公司
<120> 人源靶向补体抑制物蛋白mCR2- CD59及应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 251
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ile Ser Cys Gly Ser Pro Pro Pro Ile Leu Asn Gly Arg Ile Ser Tyr
1 5 10 15
Tyr Ser Thr Pro Ile Ala Val Gly Ser Val Ile Arg Tyr Ser Cys Ser
20 25 30
Gly Thr Phe Arg Leu Ile Gly Glu Lys Ser Leu Leu Cys Ile Thr Lys
35 40 45
Asp Lys Val Asp Gly Thr Trp Asp Lys Pro Ala Pro Lys Cys Glu Tyr
50 55 60
Phe Asn Lys Tyr Ser Ser Cys Pro Glu Pro Ile Val Pro Gly Gly Tyr
65 70 75 80
Lys Ile Arg Gly Ser Ser Pro Tyr Arg His Gly Glu Ser Val Thr Phe
85 90 95
Ala Cys Lys Thr Asn Phe Ser Met Asn Gly Asn Lys Ser Val Trp Cys
100 105 110
Gln Ala Asn Asn Met Trp Gly Pro Thr Arg Leu Pro Thr Cys Val Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Gln Cys Pro Ala Leu Pro Met Ile His Asn Gly His
130 135 140
His Thr Ser Glu Asn Val Gly Ser Ile Ala Pro Gly Leu Ser Val Thr
145 150 155 160
Tyr Ser Cys Glu Ser Gly Tyr Leu Leu Val Gly Glu Lys Ile Ile Asn
165 170 175
Cys Leu Ser Ser Gly Lys Trp Ser Ala Val Pro Pro Thr Cys Glu Glu
180 185 190
Ala Arg Cys Lys Ser Leu Gly Arg Phe Pro Asn Gly Lys Val Lys Glu
195 200 205
Pro Pro Ile Leu Arg Val Gly Val Thr Ala Asn Phe Phe Cys Asp Glu
210 215 220
Gly Tyr Arg Leu Gln Gly Pro Pro Ser Ser Arg Cys Val Ile Ala Gly
225 230 235 240
Gln Gly Val Ala Trp Thr Lys Met Pro Val Cys
245 250
<210> 2
<211> 753
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atttcttgtg gctctcctcc gcctatccta aatggccgga ttagttatta ttctaccccc 60
attgctgttg gttccgtgat aaggtacagt tgttcaggta ccttccgcct cattggagaa 120
aaaagtctat tatgcataac taaagacaaa gtggatggaa cctgggataa acctgctcct 180
aaatgtgaat atttcaataa atattcttct tgccctgagc ccatagtacc aggaggatac 240
aaaattagag gctcttcacc ctacagacat ggtgaatctg tgacatttgc ctgtaaaacc 300
aacttctcca tgaacggaaa caagtctgtt tggtgtcaag caaataatat gtgggggccg 360
acacgactac caacctgtgt aagtgtttac cctctccagt gtccagcact tcctatgatc 420
cacaatggac atcacacaag tgagaatgtt ggctccattg ctccaggatt gtctgtgact 480
tacagctgtg aatctggtta cttgcttgtt ggagaaaaga tcattaactg tttgtcttcg 540
ggaaaatgga gtgctgtccc ccccacatgt gaagaggcac gctgtaaatc tctaggacga 600
tttcccaatg ggaaggtaaa ggagcctcca attctccggg ttggtgtaac tgcaaacttt 660
ttctgtgatg aagggtatcg actgcaaggc ccaccttcta gtcggtgtgt aattgctgga 720
cagggagttg cttggaccaa aatgccagta tgt 753
<210> 3
<211> 334
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ile Ser Cys Gly Ser Pro Pro Pro Ile Leu Asn Gly Arg Ile Ser Tyr
1 5 10 15
Tyr Ser Thr Pro Ile Ala Val Gly Ser Val Ile Arg Tyr Ser Cys Ser
20 25 30
Gly Thr Phe Arg Leu Ile Gly Glu Lys Ser Leu Leu Cys Ile Thr Lys
35 40 45
Asp Lys Val Asp Gly Thr Trp Asp Lys Pro Ala Pro Lys Cys Glu Tyr
50 55 60
Phe Asn Lys Tyr Ser Ser Cys Pro Glu Pro Ile Val Pro Gly Gly Tyr
65 70 75 80
Lys Ile Arg Gly Ser Ser Pro Tyr Arg His Gly Glu Ser Val Thr Phe
85 90 95
Ala Cys Lys Thr Asn Phe Ser Met Asn Gly Asn Lys Ser Val Trp Cys
100 105 110
Gln Ala Asn Asn Met Trp Gly Pro Thr Arg Leu Pro Thr Cys Val Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Gln Cys Pro Ala Leu Pro Met Ile His Asn Gly His
130 135 140
His Thr Ser Glu Asn Val Gly Ser Ile Ala Pro Gly Leu Ser Val Thr
145 150 155 160
Tyr Ser Cys Glu Ser Gly Tyr Leu Leu Val Gly Glu Lys Ile Ile Asn
165 170 175
Cys Leu Ser Ser Gly Lys Trp Ser Ala Val Pro Pro Thr Cys Glu Glu
180 185 190
Ala Arg Cys Lys Ser Leu Gly Arg Phe Pro Asn Gly Lys Val Lys Glu
195 200 205
Pro Pro Ile Leu Arg Val Gly Val Thr Ala Asn Phe Phe Cys Asp Glu
210 215 220
Gly Tyr Arg Leu Gln Gly Pro Pro Ser Ser Arg Cys Val Ile Ala Gly
225 230 235 240
Gln Gly Val Ala Trp Thr Lys Met Pro Val Cys Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Leu Gln Cys Tyr Asn Cys Pro Asn Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr
260 265 270
Ala Val Asn Cys Ser Ser Asp Phe Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala
275 280 285
Gly Leu Gln Val Tyr Asn Lys Cys Trp Lys Phe Glu His Cys Asn Phe
290 295 300
Asn Asp Val Thr Thr Arg Leu Arg Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys
305 310 315 320
Cys Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe Asn Glu Gln Leu Glu Asn
325 330
<210> 4
<211> 1002
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
atttcttgtg gctctcctcc gcctatccta aatggccgga ttagttatta ttctaccccc 60
attgctgttg gttccgtgat aaggtacagt tgttcaggta ccttccgcct cattggagaa 120
aaaagtctat tatgcataac taaagacaaa gtggatggaa cctgggataa acctgctcct 180
aaatgtgaat atttcaataa atattcttct tgccctgagc ccatagtacc aggaggatac 240
aaaattagag gctcttcacc ctacagacat ggtgaatctg tgacatttgc ctgtaaaacc 300
aacttctcca tgaacggaaa caagtctgtt tggtgtcaag caaataatat gtgggggccg 360
acacgactac caacctgtgt aagtgtttac cctctccagt gtccagcact tcctatgatc 420
cacaatggac atcacacaag tgagaatgtt ggctccattg ctccaggatt gtctgtgact 480
tacagctgtg aatctggtta cttgcttgtt ggagaaaaga tcattaactg tttgtcttcg 540
ggaaaatgga gtgctgtccc ccccacatgt gaagaggcac gctgtaaatc tctaggacga 600
tttcccaatg ggaaggtaaa ggagcctcca attctccggg ttggtgtaac tgcaaacttt 660
ttctgtgatg aagggtatcg actgcaaggc ccaccttcta gtcggtgtgt aattgctgga 720
cagggagttg cttggaccaa aatgccagta tgttcaggag gaggaggttc cctgcagtgc 780
tacaactgtc ctaacccaac tgctgactgc aaaacagccg tcaattgttc atctgatttt 840
gatgcgtgtc tcattaccaa agctgggtta caagtgtata acaagtgttg gaagtttgag 900
cattgcaatt tcaacgacgt cacaacccgc ttgagggaaa atgagctaac gtactactgc 960
tgcaagaagg acctgtgtaa ctttaacgaa cagcttgaaa at 1002

Claims (10)

1.一种补体受体2变异体与CD59的融合蛋白，其特征在于，所述补体受体2变异体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述补体受体2变异体与CD59分子以柔性短肽SGGGGS连接。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所述。
4.一种编码权利要求3所述融合蛋白的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子的序列如SEQ ID NO.4所述。
5.一种含有权利要求4所述核苷酸分子的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述载体为pEE14.1-mCR2-CD59。
7.一种含有权利要求5或6所述表达载体的宿主工程细胞。
8.根据权利要求7所述的工程细胞，其特征在于，所述工程细胞为CHO-K1-pEE14.1-mCR2-CD59细胞。
9.权利要求1-3任一所述的融合蛋白在制备自身免疫性疾病治疗药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述疾病包括类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
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