CN111171148B

CN111171148B - 一种抗补体c3分子的人源化单链抗体及其应用

Info

Publication number: CN111171148B
Application number: CN202010085904.4A
Authority: CN
Inventors: 唐晓敏; 杜兰英
Original assignee: Beijing Kangpu Meite Innovation Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Kangpu Meite Innovation Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2020-02-11
Filing date: 2020-02-11
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2040-02-11
Also published as: WO2021159946A1; CN111171148A

Abstract

本发明公开了一种人源抗补体C3分子的单链抗体，所述抗体的轻链和重链具有独特的CDR区，具有优异的抗原结合活性，平衡解离常数K_D(m)达到2.06×10^‑11，在对MRL/lpr红斑狼疮小鼠的治疗中，本发明提供的抗C3单链抗体能够明显提升小鼠的存活率，而且治疗组的蛋白尿、肾小球积分、间质炎症、血管炎和新月体/坏死等症状明显得到改善，显示本发明提供的抗C3单链抗体在制备自身免疫性疾病治疗药物中具有优异的应用前景。

Description

一种抗补体C3分子的人源化单链抗体及其应用

技术领域

本发明公开了一种多肽，更具体地，本发明公开了一种抗体。

背景技术

补体系统由30余种可溶性蛋白分子组成，是天然免疫系统的一部分，其组成成分包括补体固有成分、多种调节因子和补体受体等30多种分子。补体系统可通过3条既相对独立又相互联系的途径被激活，从而发挥调理吞噬、裂解细胞、介导炎症、免疫调节和清除免疫复合物等多种生物学效应，包括增强吞噬作用，增强吞噬细胞的趋化性；增加血管的通透性；中和病毒；细胞溶解作用；免疫反应的调节作用等。虽然补体活化为抵抗潜在病原体提供了有价值的第一线防御力，但促进保护性炎症应答反应的补体激活也可能表现为对宿主的潜在威胁。补体激活和其在靶结构上的沉积也可以间接地引起细胞或组织破坏。在补体途径中的各个点产生介导组织损害的补体激活产物。宿主组织上不适当的补体激活在许多自身免疫病和炎性疾病的病理学中起重要作用。

补体激活的途径有3个，即经典途径、甘露聚糖结合凝集途径和旁路途径。补体经典激活途径是通过抗原-抗体复合物激活的，参与该途径的成分包括C1-C9，按其在激活过程中的作用，人为地分成三组，即识别单位(Clq、Clr、Cls)、活化单位(C4、C2、C3)和膜攻击单位(C5-C9)，分别在激活的不同阶段即识别阶段、活化阶段和膜攻击阶段中发挥作用。甘露聚糖结合凝集途径是经典途径的一个变化，由血浆中甘露聚糖结合凝集素(Mannan-Binding Lectin，MBL)直接识别多种病原微生物表面的N-氨基半乳糖或甘露糖，进而依次活化MASP-1、MASP-2、C4、C2、C3，形成和经典途径相同的C3与C5转化酶，激活补体级联酶促反应的活化途径。旁路激活途径是通过外来物质、死亡组织、细胞、细菌等激活的，旁路激活途径与经典激活途径不同之处在于激活是越过了C1、C4、C2三种成分，直接激活C3继而完成C5至C9各成分的连锁反应。C3活化后，在经典途径中涉及多种蛋白质，例如C1Q、C1r/C1s、C4和C2。经典途径C3转化酶由C3bC4b2a组成。在旁路途径活化中，补体系统产生的C3b可以与备解素和因子B结合，从而形成复合物“PC3bB”。然后，在该复合物内，因子D将因子B切割成Bb和Ba。该切割使得Ba由复合物中释放，并形成旁路途径C3转化酶PC3bBb。PC3bBb将C3切割成C3a和C3b，从而建立旁路途径的放大环路。此外，旁路途径除了在补体激活中作为独立途径而被广泛认可的作用以外，经典途径和甘露聚糖结合凝集途径还可以为引发旁路途径的补体激活提供放大环。在这种旁路途径介导的放大机制中，激活产生的C3转化酶C3bC4b2a将C3切割成C3a和C3b，并由此提供抗原形成旁路途径的的C3转化酶C3bBb中所需的C3b。

C3分子是连接3种补体激活途径的核心交汇点，是决定补体激活从上游向下游过渡，是否形成放大回路，以及产生终极的病理损害路径的关键分子。细胞内形式的C3前体蛋白是由1663个氨基酸残基组成的单链结构，在其氨基端具有22个氨基酸残基组成的信号肽。分泌形式的C3前体蛋白具有1641个氨基酸残基，经蛋白水解酶切割后分解为两个亚单位，α链和β链，成熟的C3分子为以二硫键连接的α链和β链共同构成。以上三种途径均能产生C3转化酶，C3分子在α链处被C3转化酶切割为两个活性片段：过敏毒素C3a以及具有调理作用的C3b。C3a是一种强效过敏毒素，意味可能导致各种临床疾病。C3a能激活中性粒细胞、单核细胞、血小板、肥大细胞和T细胞。在佐剂诱导的关节炎模型中已证明C3a对诱导脚爪浮肿至关重要。新形成的C3b加入已产生的C3转化酶可形成C5转化酶，后者可切割C5产生C5b和C5a。C5a也是一种过敏毒素，能引起平滑肌、血管紧张度和血管渗透性的改变。它还是中性粒细胞、单核细胞、血小板、内皮细胞和T细胞的强效趋化因子和激活剂。C5a介导的细胞激活通过诱导释放其它炎症介质，包括细胞因子、水解酶、花生四烯酸代谢产物和活性氧可显著放大炎症应答反应。切断C5产生的C5b则插入靶细胞表面的脂质双层中成为C6、C7、C8和C9沉积的核心，形成C5b-9复合物。C5b-9也称为膜攻击复合物(MAC)。现有证据显示在炎症中MAC可能起着重要作用，此外它还起着裂解细胞的孔形成复合物的作用。

虽然补体活化为抵抗潜在病原体提供了有价值的第一线防御力，但促进保护性炎症应答反应的补体激活也可能表现为对宿主的潜在威胁。例如，可将C3a和C5a过敏毒素招募到患病部位并激活中性粒细胞、单核细胞和血小板。这些激活的细胞不加选择地释放破坏性酶，可能引起器官损伤。因此，基于下调或者抑制补体激活治疗一些因补体激活所导致炎症性疾病成为本技术领域的一个新的尝试，目前研究显示在动物模型和体外研究中证实下调或者抑制补体激活对于治疗一些疾病适应症，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎等是有效的。已有几种作为重组蛋白的内源性可溶的补体抑制因子(C1-抑制因子；可溶的补体受体1或sCR1)在临床研究中得到了了评价。另外，已经上市了抑制补体级联反应中C5裂解的抗体药物(Thomas et al.,MolImmunol1996,33:1389)，即依库丽单抗(Eculizumab)。依库丽单抗是抑制末端补体成分活化的重组人源型单克隆抗体,其能特异性地键合到人末端补体蛋白C5，通过抑制人补体C5向C5a和C5b的裂解以阻断炎症因子C5a的释放及C5b-9的形成。临床前研究表明该抗体对C5有高度亲和力,能阻断C5a和C5b-9的形成,并保护哺乳动物细胞不受C5b-9介导的损伤。

鉴于C3分子在补体激活的3个途径中的核心作用，对于C3分子在补体活化进程中所扮演的病理角色，以及对C3的调控能否作为抑制补体过度活化导致疾病的调控手段也得到了相应的研究。既往的C3抗体仅仅作为评价C3在炎症性疾病中的手段，对于C3抗体在抑制补体激活途径中的效果还知之甚少。中国发明专利申请CN104220453A公开了一种人源化的嵌合抗C3b的抗体，该抗体可以抑制旁路途径依赖的兔红细胞溶解实验，但对经典途径依赖的抗体致敏的绵羊红细胞溶解实验没有抑制作用，同时，该抗体并不抑制备解素P与C3b的结合，以形成C3/C5转化酶。该申请的实验数据显示，抗C3的抗体与抗原的结合位点对于其在抑制补体激活途径中的具体作用靶分子和抑制效能起着关键作用。对于补体激活途径的选择性抑制固然可以在消除病理学损伤的同时也能够不完全消除机体免疫防御力，但是对于处于如上所述相互关联的补体三种激活途径并不能取得理想的抑制效果。通过抗C3抗体抑制补体激活仍然存在着一些技术上的难题，比如难以获得高度特异性的抗C3抗体、现有技术制备的鼠源单克隆抗体或者嵌合抗体对人体所带来的免疫原性，抗体分子由于其分子量的超限以及所形成的空间构象阻碍难以保证其抵达一些隐匿病灶组织。这些技术问题不同程度限制了通过抗C3抗体抑制补体激活的实际应用。本领域仍然需要针对特定适应症开发出具有针对性抑制效果的抗体药物。

单链抗体(亦称ScFv)是用基因工程方法制备的小分子抗体，是由柔性多肽(一般为12-15个氨基酸)将抗体的重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)连接而成的重组抗体，其分子量只相当于原天然抗体的六分之一，但单链抗体含有全部的抗原结合位点，所以单链抗体最大程度地保留了抗体的抗原结合活性，是具有亲本抗体抗原结合活性的小片段，从而可以使其达到常规抗体难以达到的病灶组织。

在上世纪90年代出现的抗体库技术绕过了以往单抗研制过程中必需的杂交瘤途径，甚至不需要经过免疫，使人源化抗体的制备达到了一个全新的水平。更为重要的是，它使人们长期以来期望获得治疗性人源抗体的梦想成为了现实。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最为广泛的抗体库。噬菌体展示是由Smith(Science,1985,228(4705):1315-1317)首先建立起来的一种将外源蛋白基因与噬菌体的衣壳蛋白基因相融合后使外源蛋白表达呈现于噬菌体表面的技术。噬菌体抗体库就是利用了以上原理使不同特异性的抗体表达在不同的噬菌体表面而用抗原对它们进行筛选(Science,1989，246(4935)：1275-1281；PNAS,1991，88(18)：7978-7982，Human Antibodies，1997，8(4)：155-168)。用于构建噬菌体抗体库的靶细胞可以是杂交瘤细胞、免疫的人B细胞或未经免疫的人B细胞。未经免疫的人B淋巴细胞是目前应用最多的靶细胞，其库容量大，理论上含有所有的人源抗体基因。噬菌体抗体库的筛选就是模拟体内抗体亲和力成熟的过程，用固相化抗原吸附表面表达特异性抗体的噬菌体库，然后洗脱游离的噬菌体，用抗原吸附的噬菌体感染宿主菌增殖扩增后再进行多轮的“吸附－洗脱－扩增”直至筛选到特异的人源抗体。大容量抗体库的建立是获得高亲和力人源抗体的关键，如果构建的噬菌体抗体库容量大于10¹⁰，那就可能从中筛选得到高亲和力(≥10⁹M^－1)的特异性抗体。

本发明的目的就是通过噬菌体抗体库技术提供一种能够与C3分子特异性结合的人源单链抗体，进而提供其在制备自身免疫性疾病治疗药物的应用。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种抗补体C3分子的人源化单链抗体，所述单链抗体是由柔性多肽(Linker)将抗体的重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)连接而成的重组抗体，所述抗体轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1的第25-37、53-59和92-101位氨基酸序列所示，所述抗体重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3的第31-35、50-66和99-108位氨基酸序列所示。

在一个优选的实施方案中，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在另一个优选的实施方案中，所述抗体轻链可变区与重链可变区以氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的柔性多肽连接。

其次，本发明还提供了一种编码上述单链抗体的多核苷酸，编码所述抗体轻链可变区的多核苷酸的序列由SEQ ID NO.2所示，编码所述抗体重链可变区的多核苷酸的序列由SEQ ID NO.4所示。

在一个优选的实施方案中，编码所述抗体轻链可变区的多核苷酸与编码所述抗体重链可变区的多核苷酸由序列如SEQ ID NO.6所示的编码柔性多肽的多核苷酸连接。

再次，本发明还提供了一种编码上述单链抗体的多核苷酸的载体。

在一个优选的实施方案中，所述载体为pEE14.1/V_L-Linker-V_H。

又次，本发明提供了一种含有上述载体的宿主细胞，所述细胞为CHO细胞。

最后，本发明提供了上述单链抗体在制备自身免疫性疾病治疗药物中的应用。

在一个优选的实施方案中，所述疾病为类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮。

本发明公开的抗C3的单链抗体的轻链和重链具有独特的CDR区，在抗原结合能力上显示了优异的抗原结合活性，平衡解离常数K_D(m)达到2.06×10^-11。本发明公开的抗C3单链抗体在MRL/lpr红斑狼疮小鼠的治疗中，能够明显提升小鼠的存活率，高剂量治疗组整个治疗过程能够完全保护MRL/lpr红斑狼疮小鼠，存活率为100％，而低剂量组即使在第24周也能保持在80％以上的存活率。而且治疗组的蛋白尿、肾小球积分、间质炎症、血管炎和新月体/坏死等症状得到明显改善，显示本发明提供的抗C3的单链抗体在制备自身免疫性疾病治疗药物中具有优异的应用前景。

附图说明

图1.抗C3抗体的12％SDS-PAGE鉴定结果；

图2.抗C3抗体的Western Blot鉴定结果；

图3.抗C3抗体与靶抗原的相互作用动力学分析图；

图4.靶向C3的单链抗体治疗MRL/lpr小鼠的存活率对照图；

图5.靶向C3的单链抗体治疗MRL/lpr小鼠的蛋白尿变化对照图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明权利要求限定的保护范围构成任何限制。

实施例1、抗C3单链抗体的制备

用下述方法筛选和制备抗C3单链抗体，具体包括以下步骤：

1.1单链抗体噬菌体表达文库的构建及表达参见中国发明专利申请CN109575132A的实施例1，本申请引用CN109575132A的公开内容作为本申请的一部分并入到本申请说明书中。

1.2重组噬菌体抗体的筛选：用C3抗原(Complement Technology，Inc；货号：A113，序列登记号K02765)包被聚乙烯培养皿，将含有重组噬菌体的上清与该培养皿中37℃孵育2小时。用PBS洗平皿20次，再用PBST(含0.05％Tween 20的PBS)洗平皿20次，弃PBST。加入10mL处于对数生长期TG1细胞，37℃培养1小时。离心，收集上清，进行下一轮筛选。重复“吸附-洗脱-繁殖”的筛选过程2次。在以M13K07辅助噬菌体超感染，就可以生成富集克隆的噬菌体表面呈现文库。

1.3单克隆重组噬菌体的筛选与鉴定：第三轮筛选后，用2×YT将TG1菌液做倍数稀释(原液、1:10、1:100、1:1000)，然后涂布在SOBAG固体培养基(分子克隆，第三版，黄培堂等译)上，30℃培养过夜。从平板上随机挑取94个单菌落，分别接种于100μl 2×YTAG(含100μg/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖)培养液中，30℃培养过夜。取20μl培养液，转接于200μl含5×10⁸pfu/mL M13K07的2×YTAG培养液中，37℃培养2小时。离心，用200μl 2×YTAK(含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的2×YT)重悬沉淀细胞，30℃培养过夜。离心、收集上清，即为单克隆重组噬菌体。

用C3抗原包被酶联板，用0.5％BSA作为阴性对照，用羊抗M13噬菌体抗体作为阳性对照。1％BSA的37℃封闭1小时。把100μl重组噬菌体抗体上清和封闭液的等体积混合物加入到酶联板中，对照孔中加入M13噬菌体。37℃孵育1小时，PBST(含0.05％Tween 20的PBS)洗板3次，PBS洗板3次。每孔加入100μl羊抗M13噬菌体抗体IgG-HRP(1:2000)，37℃孵育1小时。PBST和PBS一次各洗板3次，加入新鲜配制的底物H₂O₂-OPD，室温反应20min，加入50μl 2MH₂SO₄终止反应，在A₄₉₀处检测每孔的光吸收值。光吸收值为阴性对照的2.1倍以上的为阳性克隆，从中挑选出与C3结合活性最强的阳性克隆。

1.4阳性克隆重组质粒的DNA序列分析：用T7 DNA序列TAATACGACTCACTATAGGG测定该阳性重组质粒上抗C3单链抗体的DNA序列，结果该基因具有序列表中SEQ ID NO：7的核苷酸序列，由762个碱基组成，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列，柔性多肽编码基因具有序列表中SEQ ID NO：6的DNA序列，重链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列；所述抗C3单链抗体编码基因的串联形式为SEQ ID NO：2-SEQ IDNO：6-SEQ ID NO：4，被命名为V_L-Linker-V_H。V_L-Linker-V_H编码抗C3单链抗体使其具有SEQID NO：1-SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：3串联氨基酸残基序列。通过进一步的序列分析，轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1的第25-37、53-59和92-101位氨基酸序列所示，重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3的第31-35、50-66和99-108位氨基酸序列所示。

1.5抗C3单链抗体ScFv真核表达载体的构建及高效表达细胞株的筛选

为了得到在分子结构、理化特性和生物学功能方面更接近于天然的高等生物蛋白质分子，把步骤1.4获得的抗C3单链抗体V_L-Linker-V_H融合基因克隆至高效真核表达载体pEE14.1(Lonza)中，得到携带抗C3单链抗体V_L-Linker-V_H融合基因的重组表达载体，命名为pEE14.1/V_L-Linker-V_H。再利用脂质体将重组质粒pEE14.1/V_L-Linker-V_H转染至中国仓鼠卵巢细胞CHO中。转染24小时后，吸去培养基，加入10mL新鲜的选择性培养基DMEM+10％FCS+25μm MSX。在含5％CO₂的混合气体，湿度为98％的37℃培养箱中培养。2周后，出现大约1-2mm的克隆，用克隆环将出现的克隆转接至24孔板中，每孔加入1mL选择性培养基DMEM+10％FCS+25μm MSX继续培养。转化子生长至5天后，吸取上清。将该上清100μl加入到用C3抗原包被的酶联板中，37℃孵育1小时，PBS洗板3次。每孔加入100μl HRP标记的二抗抗体IgG(1:2000)，37℃孵育1小时。PBS洗板3次，加入新鲜配制的底物H₂O₂-OPD，室温反应20min，加入50μl 2M H₂SO₄终止反应，在A₄₉₀处检测每孔的光吸收值。光吸收值为阴性对照的2.1倍以上的为阳性克隆，从中挑选出与C3结合活性最强的阳性克隆，即为高效表达抗C3单链抗体的CHO细胞株。

1.6抗C3单链抗体的纯化

将高效表达的CHO细胞株放大培养，收获上清。将上清缓慢加入HiTrap N-hydroxysuccinimide column(Amersham Biosciences)中，纯化单链抗体。用0.01mol/L pH7.4的PBS洗脱，流速为1mL/min，至洗出液OD₂₈₀<0.02为止。加入0.1mol/L pH 2.4的甘氨酸-HCl缓冲液，流速为1mL/min，收集吸附下来的成分，立即以1mol/L碳酸钠中和，以免蛋白变性。经SDS-PAGE和Western Blot鉴定，结果如图1和图2所示，经表达获得了约26KD的目的蛋白，且该蛋白可与C3特异结合，与预期结果相符，表明获得了纯度很高的抗C3单链抗体。

实施例2、抗C3单链抗体与C3配基相互作用动力学分析

抗C3单链抗体与C3配基相互作用动力学分析用表面细胞质基因组共振(SPR)检测系统进行检测。

2.1实验仪器与试剂

仪器：Reichert2SPR(Reichert公司)，芯片：SAM芯片(大分子检测)，(ReichertInc公司，PART NO:13206061)。

试剂：1xPBST 500ml(过滤，0.22uM滤膜过滤)，EDC(现用现配)，NHS(现用现配)，1MpH8.5乙醇胺(5-10ml)，10mM pH2.0 HCl(5-10ml)，10mM pH2.0甘氨酸(5-10ml)。

2.2.实验步骤

2.2.1预富集

2.2.1.1将蛋白用不同的pH醋酸钠稀释到10μg/mL，200μL。

表1.醋酸钠pH值选择表

2.2.1.1在某一通道中注射蛋白，25μL/min，2min。

2.2.1.2选择合适的pH条件(pH5.0)

2.2.2蛋白固定

2.2.2.1 76.66mg EDC和11.52mg NHS溶解在1mL超纯水中，取200μL，活化左右两通道，10μL/min,7min。

2.2.2.2将抗原用合适的pH值醋酸钠稀释到50μg/mL，200μL，单独固定在某个通道。10μL/min,7min。

2.2.2.3如果一次固定量不够，重复注射抗体。

2.2.24取200μL 1M乙醇胺(pH8.5)，封闭左右两个通道，10μL/min,7min。

2.2.3抗体-抗原结合预实验

2.2.3.1将抗体用PBST稀释至100nM，25μL/min,结合3min，解离5min。

2.2.3.2 10mM pH2.0 HCl(或者10mM pH2.0甘氨酸)再生2min，解离2min。

2.2.4正式实验

2.2.4.1将抗体用PBST稀释至100nM，再2倍稀释，7个梯度，25μL/min,结合3min，解离5min。

2.2.4.2 10mM pH2.0 HCl(或者10mM pH2.0甘氨酸)再生2min，解离2min。

SPR检测结果如表2显示，动力学曲线如图3所示。检测显示，本发明提供的抗C3单链抗体的平衡解离常数K_D(m)达到2.06×10^-11，显示了优异的抗原结合效能。

表2.抗C单链抗体与C3结合的动力学参数

实施例3.抗C3单链抗体的体外抑制补体激活的实验

为测定对补体的抑制活性，60％～80％融合的CHO细胞用乙二胺四乙酸分开，用DMEM洗2次，然后重悬于DMEM中，使其终浓度为10⁶个细胞/mL。在细胞悬液中加入100mL/L兔抗CHO细胞膜抗血清，4℃作用30min，使细胞致敏。然后弃抗血清，细胞重悬于用DMEM稀释的NHS中，终体积为50μL或100μL。37℃作用60min，最后用胎盘兰染色排除法测量细胞成活力(活细胞与死细胞均计数)。单链抗体用DEME稀释后先加入到NHS中，再加入至CHO细胞悬液。终浓度以100g/L NHS可导致大约90％抗体致敏的对照CHO细胞溶解为准。补体介导的红细胞溶解抑制实验用抗体致敏的羊红细胞(EAs)进行测定。溶血试验在明胶佛罗那缓冲液(GVB⁺⁺)中进行，终体积为300μL，包含有2.5×10⁷EAs，NHS按照1∶300稀释。反应混合物在37℃孵育60min，最后加入300μL含10mmol/L EDTA-PBS溶液终止反应。离心，取上清，在413nm波长下用光谱成像仪对上清中的血红素进行定量检测。

单链抗体补体抑制物活性检测：补体介导的CHO细胞和红细胞溶解实验结果显示，在CHO细胞裂解抑制实验中，抗C3单链抗体抑制抗体致敏的CHO细胞和红细胞溶解效果明显(详见表3)，显示抗C3单抗能够有效抑制补体经典激活途径。

表3.能抑制50％细胞发生溶解的补体抑制物浓度

实施例4.靶向C3的单链抗体对MRL/lpr红斑狼疮小鼠模型的治疗作用

MRL/lpr红斑狼疮小鼠模型最早是Murphy和Roths于1979年建立，由多个品系小鼠经过历经12代的复杂的杂交过程而成，该模型的小鼠基因的75％来自LG/J、12.6％来自AKR/J、12.1％来自C3H/Di及0.3％来自C57BL/6品系小鼠。MRL/lpr小鼠含有与细胞自发性程序性死亡有关的Fas基因隐性突变，出现淋巴细胞增生基因，导致T细胞增生，全身淋巴结肿大，以及侵蚀性关节炎，抗DNA、抗Sm、抗Su、抗核苷P抗体，高滴度ANA，高丙种球蛋白血症以及类风湿因子。该鼠最早发病于8周，此时血清中可检测到自身抗体。12周时可以观察到淋巴结炎。12－16周，MRL/lpr鼠开始产生包括抗双链DNA抗体在内的大量自身抗体。近16周龄时多器官受累，以及出现以严重蛋白尿为特征的稳定肾功能退化。16-24周龄鼠出现增殖性免疫复合物介导的肾小球肾炎，血管炎，并最终导致肾衰而死亡，死亡率可以达到50％。

5.1靶向C3的单链抗体明显提高MRL/lpr红斑狼疮小鼠的存活率

本实施例将已经出现肾衰症状的16周的MRL/lpr鼠随机分为两组，第一组为治疗组，从第16-24周起每周接受高剂量0.4mg/W(n＝26)和低剂量0.1mg/W(n＝26)的ScFv，第二组(n＝28)为对照组，每周接受等量的PBS。两组的给药途径均为尾静脉注射。根据给药组和对照组的存活率评价靶向C3的单链抗体对MRL/lpr红斑狼疮小鼠的保护率。实验结果如图4所示，接受靶向C3的单链抗体治疗的小鼠，由于补体激活途径中的C3被靶向C3的单链抗体有效抑制，因此，MRL/lpr红斑狼疮小鼠的存活率明显提高，高剂量治疗组整个治疗过程能够完全保护MRL/lpr红斑狼疮小鼠，存活率为100％，而低剂量组即使在第24周也能保持在80％以上的存活率。

5.2靶向C3的单链抗体明显改善MRL/lpr红斑狼疮小鼠蛋白尿症状

将小鼠置于代谢笼里研究靶向C3的单链抗体对MRL/lpr红斑狼疮小鼠尿白蛋白分泌的影响。从16周开始每两周收集一次小鼠的24小时尿液。为防止细菌生长，在收集管中加入氨苄青霉素、庆大霉素和氯霉素。使用已知浓度的小鼠白蛋白样品通过ELISA方法绘制标准曲线，并确定实验小鼠的尿白蛋白分泌情况，并使用Beckman生化仪(Beckman Coulter)测定小鼠尿液中的肌酐含量。最后的评价结果以每只实验小鼠24小时的尿白蛋白(mg)与肌酐(mg)比值表示。尿白蛋白肌酐比值偏高表示肾脏功能受到损害。如图5所示，接受靶向C3的单链抗体治疗的治疗组(0.1mg/W，n＝10)在第22周和24周时，其平均的尿白蛋白肌酐比值在4.0左右，而对照组(n＝12)在5.8左右，治疗组的蛋白尿水平明显降低(P<0.01)，证明本发明提供的靶向C3的单链抗体能够显著改善肾功能损伤症状。

5.3靶向C3的单链抗体明显改善MRL/lpr红斑狼疮小鼠肾脏炎症

实验结束后，切除小鼠肾脏纵向解剖为两半，其中一半进行免疫荧光分析，另一半10％中性甲醛固定，固体石蜡包埋切片，以苏木精-伊红染色法和过碘酸雪夫染色法对石蜡处理的肾脏组织切片进行染色，采用盲法分别对自切片观察到的肾小球炎症、增生、新月体形成、坏死症状进行评分，同时对肾间质的变化也进行评分。评分共分为0、1、2、3、4五级，0为无损伤，4为严重损伤。血管周围炎性渗出评价采用半定量方式，由两个独立观察者盲法对每张切片10个以上的血管进行评价。炎症的得分为0-3，0为无炎症，1为低于50％的血管由3层细胞围绕，2为大于50％的血管为3-6层围绕，3为最严重表现，多于6层的细胞环绕。评价结果如表4所示。

表4.MRL/lpr小鼠从16周到23周治疗后第24周治疗组和PBS对照组肾脏损害情况对比

分组	肾小球积分	间质炎症	血管周围炎症	新月体/坏死
					对照组(n＝26)	14.6±3.6	3.8±0.5	100％	75％
治疗组(n＝28)	6.5±3.0	2.4±0.3	60％	15％

从表中可以看出，靶向C3的ScFv在MRL/lpr红斑狼疮小鼠中的治疗中减轻了肾脏的炎症反应。和对照组相比，治疗组(0.1mg/W)的肾小球积分、间质炎症、血管炎和新月体/坏死等明显降低(P<0.05)。

序列表

<110> 北京康普美特创新医药科技有限责任公司

<120> 一种抗补体C3分子的人源化单链抗体及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro

1 5 10 15

Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly

20 25 30

Ser Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly

65 70 75 80

Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Gly

85 90 95

Asp Met Leu Val Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 2

<211> 336

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atggccgata tcgttctgac tcaacctccg tctgtttctg gtgcaccggg tcaacgtgtt 60

actattagct gctctggcag ctctagcaat attggtagta actatgttag ctggtatcag 120

caactgccgg gtactgcacc gaaactgctg atttatgata ataaccagcg cccctcaggt 180

gttccggatc gttttagtgg cagcaaaagc ggtaccagcg ctagtctggc aattactggt 240

ctgcaaagcg aggatgaggc ggactattac tgctccgcct gggatggcga catgctggtg 300

cgtgtgtttg gcggtggcac caaactgacc gtgctg 336

<210> 3

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Pro Phe Tyr Val Gly Val Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 4

<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

gaagtgcaat tggtggaaag cggtggcggt ctggtgcagc cgggtggcag cctgcgtctg 60

agctgcgcag cgagcggctt cacctttagc agctacgcga tgagctgggt gcgccaggca 120

ccgggtaaag gtctggaatg ggtgagcgcg attagcggta gcggcggcag cacctactat 180

gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatc tcgcgtgata actcgaaaaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg tgcggaagat accgcggtgt attattgcgc acgtaatcct 300

ttttatgtgg gtgttttcga tgtctggggt cagggcactc tggtgaccgt gtcgagcgcg 360

<210> 5

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Ser Tyr Asn Val Tyr Tyr Thr Lys

1 5 10 15

Leu Ser Ser Ser Gly Ser

20

<210> 6

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggcagcggcg gctcgaccat aacttcgtat aatgtatact atacgaagtt atcgagctcg 60

ggcagc 66

<210> 7

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggccgata tcgttctgac tcaacctccg tctgtttctg gtgcaccggg tcaacgtgtt 60

actattagct gctctggcag ctctagcaat attggtagta actatgttag ctggtatcag 120

caactgccgg gtactgcacc gaaactgctg atttatgata ataaccagcg cccctcaggt 180

gttccggatc gttttagtgg cagcaaaagc ggtaccagcg ctagtctggc aattactggt 240

ctgcaaagcg aggatgaggc ggactattac tgctccgcct gggatggcga catgctggtg 300

cgtgtgtttg gcggtggcac caaactgacc gtgctgggca gcggcggctc gaccataact 360

tcgtataatg tatactatac gaagttatcg agctcgggca gcgaagtgca attggtggaa 420

agcggtggcg gtctggtgca gccgggtggc agcctgcgtc tgagctgcgc agcgagcggc 480

ttcaccttta gcagctacgc gatgagctgg gtgcgccagg caccgggtaa aggtctggaa 540

tgggtgagcg cgattagcgg tagcggcggc agcacctact atgcggatag cgtgaaaggc 600

cgttttacca tctcgcgtga taactcgaaa aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg 660

cgtgcggaag ataccgcggt gtattattgc gcacgtaatc ctttttatgt gggtgttttc 720

gatgtctggg gtcagggcac tctggtgacc gtgtcgagcg cg 762

Claims

1.一种抗补体C3分子的人源化单链抗体，其特征在于，所述抗体轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1的第25-37、53-59和92-101位氨基酸序列所示，所述抗体重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3的第31-35、50-66和99-108位氨基酸序列所示。

2.根据权利要求1所述的单链抗体，其特征在于，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求2所述的单链抗体，其特征在于，所述抗体轻链可变区与重链可变区以氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的柔性多肽连接。

4.一种编码权利要求1-3任一所述单链抗体的多核苷酸，其特征在于，编码所述抗体轻链可变区的多核苷酸的序列由SEQ ID NO.2所示，编码所述抗体重链可变区的多核苷酸的序列由SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述抗体轻链可变区的多核苷酸与编码所述抗体重链可变区的多核苷酸由序列如SEQ ID NO.6所示的编码柔性多肽的多核苷酸连接。

6.一种能够表达权利要求5所述的编码单链抗体的多核苷酸的载体。

7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体为pEE14.1/V_L-Linker-V_H。

8.一种含有权利要求7所述载体的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为CHO细胞。

9.权利要求1-3任一所述的单链抗体在制备自身免疫性疾病治疗药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疾病为类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮。