CN109575132A

CN109575132A - 人源抗补体C3d分子的单链抗体及其应用

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Publication number: CN109575132A
Application number: CN201811599439.5A
Authority: CN
Inventors: 唐晓敏; 杜兰英
Original assignee: Beijing Compmet Innovative Medicine Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Compmet Innovative Medicine Technology Co Ltd
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2038-12-26
Also published as: CN109575132B

Abstract

本发明公开了一种人源抗补体C3d分子的单链抗体，所述抗体的轻链和重链具有独特的CDR区，具有优异的抗原结合活性，亲和常数达到1.22×10^‑7mol/L，生物学分布实验证明，本发明提供的抗C3d单链抗体进入类风湿关节炎小鼠模型后可快速在关节炎部位高度聚集，而且三个ScFv治疗组的关节炎严重程度明显低于PBS组，且好转度具有明显的剂量依赖关系，证明其具有优异的抗黏附/抗炎靶向抑制效应。在对MRL/lpr红斑狼疮小鼠的治疗中，本发明提供的抗C3d单链抗体能够明显提升小鼠的存活率，而且治疗组的蛋白尿、肾小球积分、间质炎症、血管炎和新月体/坏死等症状明显得到改善，显示本发明提供的抗C3d单链抗体在制备自身免疫性疾病治疗药物中具有优异的应用前景。

Description

人源抗补体C3d分子的单链抗体及其应用

技术领域

本发明公开了一种多肽，更具体地，本发明公开了一种抗体。

背景技术

补体系统由30余种可溶性蛋白分子组成，是天然免疫系统的一部分。其组成成分包括补体固有成分、多种调节因子和补体受体等30多种分子。补体系统可通过3条既相对独立又相互联系的途径被激活，从而发挥调理吞噬、裂解细胞、介导炎症、免疫调节和清除免疫复合物等多种生物学效应，包括增强吞噬作用，增强吞噬细胞的趋化性；增加血管的通透性；中和病毒；细胞溶解作用；免疫反应的调节作用等。补体激活和其在靶结构上的沉积也可以间接地引起细胞或组织破坏。在补体途径中的各个点产生介导组织损害的补体激活产物。宿主组织上不适当的补体激活在许多自身免疫病和炎性疾病的病理学中起重要作用，并且也是造成与例如心肺炎症和移植排斥后的生物不相容性有关的许多病状的原因。补体抑制是治疗这些免疫介导的疾病和症状的潜在治疗方式。

补体活化的途径有3个，即经典途径、旁路途径和甘露聚糖结合凝集途径。补体在溶菌或溶血反应时被激活的过程中，11种成分可分为3个功能单位，即①识别单位：包括C1q、C1r、C1s；②活化单位：包括C2、C3、C4，③膜攻击单位：包括C5、C6、C7、C8和C9。同一功能单位的补体成分彼此间有化学亲和性，激活后可相互结合在一起，共同执行使细胞溶解这一生物学功能。因此，补体的经典激活途径可分为识别、活化和膜攻击3个阶段。这3个阶段一般在靶细胞膜的3个不同部位进行。补体在激活过程中C2、C3、C4、C5均分别裂解成2个或2个以上的片段，分别标以a、b等符号，如C3a、C3b、C3c等。其中C2b、C3b、C4b、C5b直接或间接结合在靶细胞上，以固相的形式参与溶细胞过程，C3a、C5a游离在液相。补体在激活过程中，C5、C6、C7经活化后还可聚合成C567.并与C3a、C5a一起发挥特殊的生物学功能。参与补体经典激活途径的成分包括C1-C9。按其在激活过程中的作用，人为地分成三组，即识别单位(Clq、Clr、Cls)、活化单位(C4、C2、C3)和膜攻击单位(C5-C9)，分别在激活的不同阶段即识别阶段、活化阶段和膜功击阶段中发挥作用。旁路激活途径与经典激活途径不同之处在于激活是越过了C1、C4、C2三种成分，直接激活C3继而完成C5至C9各成分的连锁反应，还在于激活物质并非抗原抗体复合物而是细菌的细胞壁成分—脂多糖，以及多糖、肽聚糖、磷壁酸和凝聚的IgA和IgG4等物质。旁路激活途径在细菌性感染早期，尚未产生特异性抗体时，即可发挥重要的抗感染作用。甘露聚糖结合凝集途径由血浆中甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin，MBL)直接识别多种病原微生物表面的N-氨基半乳糖或甘露糖，进而依次活化MASP-1、MASP-2、C4、C2、C3，形成和经典途径相同的C3与C5转化酶，激活补体级联酶促反应的活化途径。MBL激活途径的主要激活物为表面含有甘露糖基、岩藻糖和N-氨基半乳糖的病原微生物。以上三种途径均能产生C3转化酶，C3分子被C3转化酶裂解为过敏毒素C3a以及具有调理作用的C3b，C3b分子能与糖蛋白表面的胺基与羟基共价连接，这种共价作用由C3b分子内部的硫酯基所介导。因而，C3b分子可吸附于侵入体内的微生物表面，再与I型补体受体(CR1/CD35)结合，在血清H因子和I因子的作用下水解形成iC3b，iC3b随后被裂解为C3d。C3d片段是补体C3的不能再酶解的最小片段。结合C3d分子的微生物能与II型补体受体(CR2/CD21)结合。

Ⅱ型补体受体(CR2)主要分布于滤泡树突状细胞(FDC)、B细胞和一些T细胞表面。FDC是一类存在于外周淋巴器官生发中心的特殊树突状细胞，其在抗原提呈方面发挥重要作用，这种作用不依赖于MHCⅠ和MHCⅡ类分子，而依赖于FcR和补体受体(CR1、CR2)，可将抗原-抗体复合物和抗原-抗体-补体复合物长期(可达数周～数年)滞留或浓缩于FDC表面供B细胞识别。活化的B细胞与FDC表面的抗原结合，进而发生体细胞突变是B细胞亲和力成熟的关键步骤，因此FDC是激发体液免疫应答以及维持免疫记忆的重要细胞。B细胞表面的CR2与免疫复合物的结合对于成熟B细胞的存活以及高亲和力B细胞的选择起重要作用。

B细胞表面的CD21、CD19、CD81及CD225(Leu-13)以非共价键相联，形成B细胞的活化辅助受体。CD21的胞外区与结合于抗原的补体成分C3d结合，由CD19向胞浆传递刺激信号，可明显降低抗原激活B细胞的阈值。因此，结合有C3d分子的微生物抗原能同时与B细胞表面的IgM(mIgM)和CR2结合，同时激活B细胞活化的双信号，增强B细胞对抗原刺激的敏感性，并阻止细胞凋亡。此外，mIgM-CR2组成的复合物能够促进抗原的摄取和提呈。

另外，也有研究显示，系统性红斑狼疮(SLE)T细胞C3d阳性的比例显著高于正常人群。进一步研究显示，C3d片段定位在SLE患者T细胞的脂筏上，通过调节Ca⁺⁺流入反应和增加细胞因子的产生促进异常T细胞的功能。

因此，基于下调或者抑制补体激活治疗一些因补体激活所导致自身免疫性疾病成为本技术领域的一个新的尝试，目前研究显示在动物模型和体外研究中证实下调或者抑制补体激活对于治疗一些疾病适应症是有效的，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎等。鉴于CR2和作为其配体的C3d分子在补体激活途径及体液免疫和细胞免疫激活进程中所扮演的重要角色，研究者开始关注阻断或者竞争性抑制C3d分子与CR2的结合进而下调及抑制补体激活以阻断自身免疫性疾病病理进程。在抑制C3d与CR2结合的抑制剂的选择中，抗C3d抗体以抗原抗体结合的高度特异性而成为一种优先选择。然而通过抗C3d抗体抑制C3d与CR2结合仍然存在着一些技术上的难题，比如难以获得高度特异性的抗C3d抗体、现有技术制备的鼠源单克隆抗体或者嵌合抗体对人体所带来的免疫原性，以及抗体分子由于其空间构象的阻碍难以抵达一些病灶组织。这些技术问题不同程度限制了通过抗C3d抗体抑制补体激活的实际应用。

单链抗体是用基因工程方法制备的小分子抗体，是由弹性连接肽(一般为12-15个氨基酸)将抗体的重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)连接而成的重组抗体，其分子量只相当于原天然抗体的六分之一，但单链抗体含有全部的抗原结合位点，所以单链抗体最大程度地保留了抗体的抗原结合活性，是具有亲本抗体抗原结合活性的小片段，从而可以使其达到常规抗体难以达到的病灶组织。

在上世纪90年代出现的抗体库技术绕过了以往单抗研制过程中必需的杂交瘤途径，甚至不需要经过免疫，使人源化抗体的制备达到了一个全新的水平。更为重要的是，它使人们长期以来期望获得治疗性人源抗体的梦想成为了现实。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最为广泛的抗体库。噬菌体展示是由Smith(Science,1985,228(4705):1315-1317)首先建立起来的一种将外源蛋白基因与噬菌体的衣壳蛋白基因相融合后使外源蛋白表达呈现于噬菌体表面的技术。噬菌体抗体库就是利用了以上原理使不同特异性的抗体表达在不同的噬菌体表面而用抗原对它们进行筛选(Science,1989，246(4935)：1275-1281；PNAS,1991，88(18)：7978-7982，Human Antibodies，1997，8(4)：155-168)。用于构建噬菌体抗体库的靶细胞可以是杂交瘤细胞、免疫的人B细胞或未经免疫的人B细胞。未经免疫的人B淋巴细胞是目前应用最多的靶细胞，它库容量大，理论上含有所有的人源抗体基因。噬菌体抗体库的筛选就是模拟体内抗体亲和力成熟的过程，用固相化抗原吸附表面表达特异性抗体的噬菌体库，然后洗脱游离的噬菌体，用抗原吸附的噬菌体感染宿主菌增殖扩增后再进行多轮的“吸附－洗脱－扩增”直至筛选到特异的人源抗体。大容量抗体库的建立是获得高亲和力人源抗体的关键，如果构建的噬菌体抗体库容量大于10¹⁰，那就可能从中筛选得到高亲和力(≥10⁹M^－1)的特异性抗体。

本发明的目的就是通过噬菌体抗体库技术提供一种能够与C3d分子特异性结合的人源单链抗体，进而提供其在制备自身免疫性疾病治疗药物的应用。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种人源抗补体C3d分子的单链抗体，所述抗体轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2的第25-35、51-57和90-97位氨基酸序列所示，所述抗体重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.4的第30-35、50-66和99-108位氨基酸序列所示。

在一个优选的实施方案中，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在另一个优选的实施方案中，所述抗体轻链可变区与重链可变区以氨基酸序列如SEQ ID NO.6的所示柔性多肽连接。

其次，本发明还提供了一种编码上述单链抗体的基因编码序列，所述抗体的轻链可变区的基因编码序列由SEQ ID NO.1所示，所述抗体的重链可变区的基因编码序列由SEQID NO.3所示。

在一个优选的实施方案中，所述抗体轻链可变区的基因编码序列与重链可变区的基因编码序列由以核苷酸序列SEQ ID NO.5所示的柔性多肽基因编码序列连接。

再次，本发明还提供了一种能够表达上述单链抗体基因编码序列的载体。

在一个优选的实施方案中，所述载体为pEE14.1/V_H-Linker-V_L。

又次，本发明提供了一种含有上述载体的宿主细胞，所述细胞为CHO细胞。

最后，本发明提供了上述单链抗体在制备自身免疫性疾病治疗药物中的应用。

在一个优选的实施方案中，所述疾病为类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮。

本发明公开的抗C3d的单链抗体的轻链和重链具有独特的CDR区，在抗原结合能力上显示了优异的抗原结合活性，亲和常数达到1.22×10^-7mol/L。生物学分布实验证明，本发明的抗C3d单链抗体进入类风湿关节炎小鼠模型后可快速在关节炎部位高度聚集，证明本发明的抗C3d单链抗体ScFv对C3d具有特异的靶向性，而且ScFv三个治疗组的关节炎严重程度明显低于PBS组，且好转度具有明显的剂量依赖关系，证明其具有优异的抗黏附/抗炎靶向抑制效应，对机体的炎症反应具有很好的治疗作用。本发明公开的抗C3d单链抗体在MRL/lpr红斑狼疮小鼠的治疗中，能够明显提升小鼠的存活率，高剂量治疗组整个治疗过程能够完全保护MRL/lpr红斑狼疮小鼠，存活率为100％，而低剂量组即使在第24周也能保持在80％以上的存活率。而且治疗组的蛋白尿、肾小球积分、间质炎症、血管炎和新月体/坏死等症状得到明显改善，显示本发明提供的抗C3d的单链抗体在制备自身免疫性疾病治疗药物中具有优异的应用前景。

附图说明

图1.轻链和重链可变区基因扩增产物的1.2％琼脂糖电泳鉴定结果；

图2.C3d单链抗体基因扩增产物的1.2％琼脂糖电泳鉴定结果；

图3.C3d单链抗体的12％SDS-PAGE鉴定结果；

图4.C3d单链抗体的Western Blot鉴定结果；

图5.RA生物学分布实验结果；

图6.RA动物实验结果；

图7.靶向C3d的单链抗体治疗MRL/lpr小鼠的存活率对照图；

图8.靶向C3d的单链抗体治疗MRL/lpr小鼠的蛋白尿变化对照图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1、抗C3d单链抗体的制备

用下述方法筛选抗C3d单链抗体，具体方法包括以下步骤：

1.1cDNA的制备

收集50份健康人的外周血各20ml，分别用淋巴细胞分离液(天津血研所)分离单个核细胞。用Trizol试剂(Invitrogen公司)从分离的人外周血淋巴细胞中提取细胞的总RNA，后按照相同的比例混合。用cDNA反转录试剂盒(Takara公司)反转录出cDNA。以上步骤按照厂家提供的说明书进行。

1.2抗体轻链和重链可变区基因的扩增：用PCR方法，以反转录合成的cDNA为模板，在PCR反应体系中分别加入扩增轻链和重链可变区基因的引物。根据GenBank中人类抗体基因序列，分别设计PCR扩增抗体重链、轻链可变区所需的引物(见表1)。

表1.抗体轻链和重链可变区基因的扩增引物

表1中的简并碱基B＝C或G，D＝G或A,K＝G或T，M＝A或C，R＝A或G，S＝G或C，W＝A或T，Y＝C或T。

扩增体系为上游引物和下游引物各2μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTP终浓度为2.5mM，混匀后经100℃变性5min，加入2单位Taq DNA聚合酶。总反应体积为50μl。混匀后加矿物油。进行30个循环反应，每个循环条件是：94℃变性30s。55℃退火90s，72℃延伸90s，反应进行到最后一个循环后在72℃保温10min。反应结束后，分别从轻链和重链可变区基因扩增产物中取出3μl进行1.2％的琼脂糖电泳检测，检测结果如图1所示，经PCR扩增获得了324bp的轻链可变区基因和360bp的重链可变区基因，与预期结果相符，其余的用Sephagels^TMBandprep Kit(Pharmacia)回收纯化。

1.3单链抗体基因的连接：将回收的重链和轻链可变区基因中间通过一段Linker序列连接起来，形成ScFv基因。Linker序列的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和6所示。在抗体轻链和重链可变区基因的扩增引物5’端分别加上SfiI和NotI的酶切位点和数个保护碱基，3’端分别加上Linker序列(引物序列见表2)。

表2用于抗体轻链和重链可变区基因连接的扩增引物

PCR扩增体系为上游引物和下游引物各2μl，加入2.5mM的dNTP和3个单位的TaqDNA聚合酶，10×PCR缓冲液5μl，反应体积为50μl。进行30次PCR循环，每个循环条件为94℃变性1min，55℃退火2min，72℃延伸2min，反应进行到最后一个循环后在72℃保温10min。反应结束后从PCR扩增产物中取出3μL 1.2％的琼脂糖电泳检测，检测结果如图2所示，经PCR扩增获得了720bp的单链抗体基因，与预期结果相符，其余的用SephagelsTM Bandprep Kit回收纯化。

1.4单链抗体文库的构建及表达：将表达载体pCANTAB5E(Pharmacia)和回收后的单链抗体基因分别经Sfi 1和Not 1双酶切，在T4连接酶的作用下，将pCANTAB5E表达载体和单链抗体基因16℃连接过夜。将重组质粒转化大肠杆菌TG1感受态细胞，并把转化的细胞涂布在含100μg/mL氨苄青霉素LB培养板上，于37℃培养过夜。把生长在平板上的转化菌全部收集下来，用2×YTAG(含100μg/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖)稀释细胞悬液至OD₆₀₀＝0.2，37℃培养培养至对数生长期(约OD₆₀₀＝0.4)，加入2×10⁹pfu M13K07辅助噬菌体，37℃培养1小时，离心。用10mL2×YTAK(含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的2×YT)重悬沉淀细胞，37℃振荡培养过夜，离心后收集含有重组噬菌体的上清，即为单链抗体噬菌体表达文库。

1.5重组噬菌体抗体的筛选：用C3d抗原(上海史瑞克生物科技有限公司)包被聚乙烯培养皿，将含有重组噬菌体的上清与该培养皿中37℃孵育2小时。用PBS洗平皿20次，再用PBST(含0.05％Tween 20的PBS)洗平皿20次，弃PBST。加入10mL处于对数生长期TG1细胞，37℃培养1小时。离心，收集上清，进行下一轮筛选。重复“吸附-洗脱-繁殖”的筛选过程2次。在以M13K07辅助噬菌体超感染，就可以生成富集克隆的噬菌体表面呈现文库。

1.6单克隆重组噬菌体的筛选与鉴定：第三轮筛选后，用2×YT将TG1菌液做倍数稀释(原液、1:10、1:100、1:1000)，然后涂布在SOBAG固体培养基(分子克隆，第三版，黄培堂等译)上，30℃培养过夜。从平板上随机挑取94个单菌落，分别接种于100μl 2×YTAG(含100μg/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖)培养液中，30℃培养过夜。取20μl培养液，转接于200μl含5×10⁸pfu/mL M13K07的2×YTAG培养液中，37℃培养2小时。离心，用200μl 2×YTAK(含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的2×YT)重悬沉淀细胞，30℃培养过夜。离心、收集上清，即为单克隆重组噬菌体。

用C3d抗原包被酶联板，用0.5％BSA作为阴性对照，用羊抗M13噬菌体抗体作为阳性对照。1％BSA的37℃封闭1小时。把100μl重组噬菌体抗体上清和封闭液的等体积混合物加入到酶联板中，对照孔中加入M13噬菌体。37℃孵育1小时，PBST(含0.05％Tween 20的PBS)洗板3次，PBS洗板3次。每孔加入100μl羊抗M13噬菌体抗体IgG-HRP(1:2000)，37℃孵育1小时。PBST和PBS一次各洗板3次，加入新鲜配制的底物H₂O₂-OPD，室温反应20min，加入50μl2M H₂SO₄终止反应，在A₄₉₀处检测每孔的光吸收值。光吸收值为阴性对照的2.1倍以上的为阳性克隆，从中挑选出与C3d结合活性最强的阳性克隆。

1.7阳性克隆重组质粒的DNA序列分析：用T7DNA序列TAATACGACTCACTATAGGG测定该阳性重组质粒上抗C3d单链抗体的DNA序列，结果该基因具有序列表中SEQ ID NO：7的核苷酸序列，由729个碱基组成，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列，柔性多肽连接编码基因具有序列表中SEQ ID NO：5的DNA序列，重链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列，抗C3d单链抗体的DNA序列编码具有序列表中SEQ IDNO：4-SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列的蛋白质，将该抗体命名为V_H-Linker-V_L(亦称ScFv)。

1.8抗C3d单链抗体ScFv真核表达载体的构建及高效表达细胞株的筛选

为了得到在分子结构、理化特性和生物学功能方面更接近于天然的高等生物蛋白质分子，把步骤1.7获得的抗C3d单链抗体V_L-Linker-V_H融合基因克隆至高效真核表达载体pEE14.1(Lonza)中，得到携带抗C3d单链抗体V_H-Linker-V_L融合基因的重组表达载体，命名为pEE14.1/V_H-Linker-V_L。再利用脂质体将重组质粒pEE14.1/V_H-Linker-V_L转染至中国仓鼠卵巢细胞CHO中。转染24小时后，吸去培养基，加入10mL新鲜的选择性培养基DMEM+10％FCS+25μm MSX。在含5％CO₂的混合气体，湿度为98％的37℃培养箱中培养。2周后，出现大约1-2mm的克隆，用克隆环将出现的克隆转接至24孔板中，每孔加入1mL选择性培养基DMEM+10％FCS+25μm MSX继续培养。转化子生长至5天后，吸取上清。将该上清100μl加入到用C3d抗原包被的酶联板中，37℃孵育1小时，PBS洗板3次。每孔加入100μl HRP标记的二抗抗体IgG(1:2000)，37℃孵育1小时。PBS洗板3次，加入新鲜配制的底物H₂O₂-OPD，室温反应20min，加入50μl 2M H₂SO₄终止反应，在A₄₉₀处检测每孔的光吸收值。光吸收值为阴性对照的2.1倍以上的为阳性克隆，从中挑选出与C3d结合活性最强的阳性克隆，即为高效表达抗C3d单链抗体的CHO细胞株。

1.9抗C3d单链抗体的纯化

将高效表达的CHO细胞株放大培养，收获上清。将上清缓慢加入HiTrap N-hydroxysuccinimide column(Amersham Biosciences)中，纯化单链抗体。用0.01mol/L pH7.4的PBS洗脱，流速为1mL/min，至洗出液OD₂₈₀<0.02为止。加入0.1mol/L pH 2.4的甘氨酸-HCl缓冲液，流速为1mL/min，收集吸附下来的成分，立即以1mol/L碳酸钠中和，以免蛋白变性。经SDS-PAGE和Western Blot鉴定，结果如图3和图4所示，经表达获得了约26KD的目的蛋白，且该蛋白可与C3d特异结合，与预期结果相符，表明获得了纯度很高的抗C3d单链抗体。

实施例2、ELISA检测抗体结合活性

采用非竞争酶免疫实验法检测ScFv亲和力。具体步骤:按照2、1、0.5、0.25μg/mlC3d浓度包被ELISA板，加入2倍系列稀释的ScFv，二抗为HRP/anti-ScFv抗体，显色终止后，酶标仪450nm单波长测定光密度值(D)。采用Curve Expert 1.4软件，以D值和抗体浓度[Ab]计算出不同抗原稀释度下D值达到1/2D时所对应的抗体浓度。按照公式:Ka＝(n－1)/2×(n[Ab']－[Ab])，其中[Ab']和[Ab]分别代表抗原倍比稀释中两个不同浓度[Ag']和[Ag]下，在D值达到1/2D时对应的抗体浓度，n代表抗原[Ag']与[Ag]间的稀释倍数。结果为：本发明提供的ScFv亲和常数Kd(1/Ka)＝1.22×10^-7mol/L

实施例3.抗C3d单链抗体的生物学分布实验

采用Iodogen法将抗C3d单链抗体ScFv标记¹²⁵I，在涂布有200μg Iodogen的EP管中，依次加入现配制的50mmLo/L PBS(pH7.4)150μl、含1mg BSA溶解的ScFv 100μl(100μg))、Na¹²⁵I溶液15μl(185MBq)，室温下间断轻微摇动标记管15min。SEP-PAK C18柱分别用甲醇、双蒸水和0.1％三氟乙酸(TFA)各5mL依次洗涤使其活化；标记混合物上柱，0.1％TFA淋洗；60％的乙腈溶液洗脱，收集前1.5mL洗脱液。经冷冻干燥后，用含1mg/mL BSA的PBS溶液稀释、分装，-80℃冰箱贮存备用。雄性DBA/1J小鼠尾根部皮下注射0.1mL胶原Ⅱ和完全弗氏佐剂(均购于美国Sigma公司)，第21天加强一次建立类风湿关节炎(CIA)小鼠模型(模型建立参照C57BL/6小鼠CIA模型的建立及其监测体系的初步筛选，解放军医学杂志2004年6月第29卷第6期472-474)。试验和分组方法如下：①对照组尾静脉注射¹²⁵I-ScFv(2ug)，分别在24h、48h后断头处死，收集血液，取出组织器官，称重并测定其放射性(μCi)，结果换算为ID％/g组织。②关节炎组尾静脉注射¹²⁵I-ScFv(2ug)，分别在24h、48h、72h、96h后，采取同上处理、检测。③关节炎治疗组，尾静脉注射一次¹²⁵I-ScFv(0.25ug)，24h后，采取同上处理、检测。④关节炎治疗组，每天尾静脉注射一次¹²⁵I-ScFv(0.25ug)，连续7天、24h后，采取同上处理、检测。结果如图5所示，表明本发明的抗C3d单链抗体ScFv可在关节炎部位高度聚集(图5中图例说明的自上而下顺序的图例与图5中每一分组柱图中的自左向右顺序的亚柱图一一对应)。

实施例4、抗C3d单链抗体对类风湿关节炎(CIA)小鼠模型的治疗

利用类风湿关节炎(CIA)小鼠模型(同上)，从第21天开始试验，分组如下：①注射50μl PBS对照组。②ScFv治疗组，每天注射一次ScFv(0.25)mg，共注射7次。③ScFv治疗组，每天注射一次ScFv(0.25)mg，共注射4次。④ScFv治疗组，注射一次ScFv(0.25)mg。第23天开始临床评分，按一下标准对动物关节炎程度计分：0分，无关节炎；1分，轻微炎症和爪部发红；2分，严重红斑和肿胀，影响爪部功能；3分，爪部或关节变形、僵硬，失去功能。每只小鼠四肢最高总分为12分。结果如图6所示，从第23天开始，ScFv三个治疗组的关节炎严重程度明显低于PBS组。其中第②组(7次注射组)的评分是第④组(1次注射组)的1/3，是第①组(PBS对照组)的1/4以下。

以上实验结果证明本发明的抗C3d单链抗体ScFv对C3d具有特异的靶向性，具有更好地抗黏附/抗炎靶向抑制效应，对机体的炎症反应具有很好的治疗作用。

实施例5.靶向C3d的单链抗体对MRL/lpr红斑狼疮小鼠模型的治疗作用

MRL/lpr红斑狼疮小鼠模型最早是Murphy和Roths于1979年建立，由多个品系小鼠经过历经12代的复杂的杂交过程而成，该模型的小鼠基因的75％来自LG/J、12.6％来自AKR/J、12.1％来自C3H/Di及0.3％来自C57BL/6品系小鼠。MRL/lpr小鼠含有与细胞自发性程序性死亡有关的Fas基因隐性突变，出现淋巴细胞增生基因，导致T细胞增生，全身淋巴结肿大，以及侵蚀性关节炎，抗DNA、抗Sm、抗Su、抗核苷P抗体，高滴度ANA，高丙种球蛋白血症以及类风湿因子。该鼠最早发病于8周，此时血清中可检测到自身抗体。12周时可以观察到淋巴结炎。12－16周，MRL/lpr鼠开始产生包括抗双链DNA抗体在内的大量自身抗体。近16周龄时多器官受累，以及出现以严重蛋白尿为特征的稳定肾功能退化。16-24周龄鼠出现增殖性免疫复合物介导的肾小球肾炎，血管炎，并最终导致肾衰而死亡，死亡率可以达到50％。

5.1靶向C3d的单链抗体明显提高MRL/lpr红斑狼疮小鼠的存活率

本实施例将已经出现肾衰症状的16周的MRL/lpr鼠随机分为两组，第一组为治疗组，从第16-24周起每周接受高剂量0.4mg/W(n＝16)和低剂量0.2mg/W(n＝16)的ScFv，第二组(n＝20)为对照组，每周接受等量的PBS。两组的给药途径均为尾静脉注射。根据给药组和对照组的存活率评价靶向C3d的单链抗体对MRL/lpr红斑狼疮小鼠的保护率。实验结果如图7所示，接受靶向C3d的单链抗体治疗的小鼠，由于补体激活途径中的C3d被靶向C3d的单链抗体有效抑制，因此，MRL/lpr红斑狼疮小鼠的存活率明显提高，高剂量治疗组整个治疗过程能够完全保护MRL/lpr红斑狼疮小鼠，存活率为100％，而低剂量组即使在第24周也能保持在80％以上的存活率。

5.2靶向C3d的单链抗体明显改善MRL/lpr红斑狼疮小鼠蛋白尿症状将小鼠置于代谢笼里研究靶向C3d的单链抗体对MRL/lpr红斑狼疮小鼠尿白蛋白分泌的影响。从16周开始每两周收集一次小鼠的24小时尿液。为防止细菌生长，在收集管中加入氨苄青霉素、庆大霉素和氯霉素。使用已知浓度的小鼠白蛋白样品通过ELISA方法绘制标准曲线，并确定实验小鼠的尿白蛋白分泌情况，并使用生化仪测定小鼠尿液中的肌酐含量。最后的评价结果以每只实验小鼠24小时的尿白蛋白(mg)与肌酐(mg)比值表示。尿白蛋白肌酐比值偏高表示肾脏功能受到损害。如图8所示，接受靶向C3d的单链抗体治疗的治疗组(n＝10)在第22周和24周时，其平均的尿白蛋白肌酐比值在2.0左右，而对照组(n＝12)在5.5左右，治疗组的蛋白尿水平明显降低(P<0.01)，证明本发明提供的靶向C3d的单链抗体能够显著改善肾功能损伤症状。

5.3靶向C3d的单链抗体明显改善MRL/lpr红斑狼疮小鼠肾脏炎症实验结束后，切除小鼠肾脏纵向解剖为两半，其中一半进行免疫荧光分析，另一半10％中性甲醛固定，固体石蜡包埋切片，以苏木精-伊红染色法和过碘酸雪夫染色法对石蜡处理的肾脏组织切片进行染色，采用盲法分别对自切片观察到的肾小球炎症、增生、新月体形成、坏死症状进行评分，同时对肾间质的变化也进行评分。评分共分为0、1、2、3、4五级，0为无损伤，4为严重损伤。血管周围炎性渗出评价采用半定量方式，由两个独立观察者盲法对每张切片10个以上的血管进行评价。炎症的得分为0-3，0为无炎症，1为低于50％的血管由3层细胞围绕，2为大于50％的血管为3-6层围绕，3为最严重表现，多于6层的细胞环绕。评价结果如表3所示。

表3.MRL/lpr小鼠从16周到23周治疗后第24周治疗组和PBS对照组肾脏损害情况对比

分组	肾小球积分	间质炎症	血管周围炎症	新月体/坏死
					对照组	12.6±4.3	3.2±0.5	100％	50％
治疗组	6.5±2.2	2.1±0.4	65％	11％

从表中可以看出，靶向C3d的ScFv在MRL/lpr红斑狼疮小鼠中的治疗中减轻了肾脏的炎症反应。和对照组相比，治疗组的肾小球积分、间质炎症、血管炎和新月体/坏死等明显降低(P<0.05)。

序列表

<110> 北京康普美特创新医药科技有限责任公司

<120> 人源抗补体C3d分子的单链抗体及其应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 324

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atggccagct acgaactgac ccagccgccg agcgtgtcgg tggcgccggg tcagaccgcg 60

cgtatcacct gctcgggcga tgcgctgggc gataaatacg cgagctggta tcagcagaaa 120

ccgggtcagg caccggtgct ggtgatttac gaagattcta aacgcccgtc tggcatcccg 180

gaacgcttta gcggctcgaa ttcgggcaac accgcgaccc tgaccattag cggcacccag 240

gcggaggatg aggcggacta ttactgctcg tcgcgggatg gggggcagca tgtgtttggc 300

ggtggcacca aactgaccgt gctg 324

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ala Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro

1 5 10 15

Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asp Lys

20 25 30

Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val

35 40 45

Ile Tyr Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg Asp Gly Gly Gln

85 90 95

His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 3

<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

gaagtgcaat tggtggaaag cggtggcggt ctggtgcagc cgggtggcag cctgcgtctg 60

agctgcgcag cgagcggctt cacctttagc agctacgcga tgagctgggt gcgccaggca 120

ccgggtaaag gtctggaatg ggtgagcgcg attagcggta gcggcggcag cacctactat 180

gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatc tcgcgtgata actcgaaaaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg tgcggaagat accgcggtgt attattgcgc acgtggtatt 300

aatcctctgg gtgatgtcga tgactggggt cagggcactc tggtgaccgt gtcgagcgcg 360

<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ile Asn Pro Leu Gly Asp Val Asp Asp Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggctcg ggcggcggcg gctcg 45

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 729

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

gaagtgcaat tggtggaaag cggtggcggt ctggtgcagc cgggtggcag cctgcgtctg 60

agctgcgcag cgagcggctt cacctttagc agctacgcga tgagctgggt gcgccaggca 120

ccgggtaaag gtctggaatg ggtgagcgcg attagcggta gcggcggcag cacctactat 180

gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatc tcgcgtgata actcgaaaaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg tgcggaagat accgcggtgt attattgcgc acgtggtatt 300

aatcctctgg gtgatgtcga tgactggggt cagggcactc tggtgaccgt gtcgagcgcg 360

ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggctcg ggcggcggcg gctcgatggc cagctacgaa 420

ctgacccagc cgccgagcgt gtcggtggcg ccgggtcaga ccgcgcgtat cacctgctcg 480

ggcgatgcgc tgggcgataa atacgcgagc tggtatcagc agaaaccggg tcaggcaccg 540

gtgctggtga tttacgaaga ttctaaacgc ccgtctggca tcccggaacg ctttagcggc 600

tcgaattcgg gcaacaccgc gaccctgacc attagcggca cccaggcgga ggatgaggcg 660

gactattact gctcgtcgcg ggatgggggg cagcatgtgt ttggcggtgg caccaaactg 720

accgtgctg 729

Claims

1.一种人源抗补体C3d分子的单链抗体，其特征在于，所述抗体轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2的第25-35、51-57和90-97位氨基酸序列所示，所述抗体重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4的第30-35、50-66和99-108位氨基酸序列所示。

2.根据权利要求1所述的单链抗体，其特征在于，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求2所述的单链抗体，其特征在于，所述抗体轻链可变区与重链可变区以氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的柔性多肽连接。

4.一种编码权利要求1-3任一所述单链抗体的基因编码序列，其特征在于，所述抗体的轻链可变区的基因编码序列由SEQ ID NO.1所示，所述抗体的重链可变区的基因编码序列由SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求4所述的序列，其特征在于，所述抗体轻链可变区的基因编码序列与重链可变区的基因编码序列由以核苷酸序列SEQ ID NO.5所示的柔性多肽基因编码序列连接。

6.一种能够表达权利要求5所述单链抗体的基因编码序列的载体。

7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体为pEE14.1/V_H-Linker-V_L。

8.一种含有权利要求7所述载体的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为CHO细胞。

9.权利要求1-3任一所述的单链抗体在制备自身免疫性疾病治疗药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疾病为类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮。