CN115433284A

CN115433284A - 一种针对转铁蛋白受体1的纳米抗体及其应用

Info

Publication number: CN115433284A
Application number: CN202210761940.7A
Authority: CN
Inventors: 张进; 李健; 张雨婷; 万双燕
Original assignee: Jiangxi Jingmeirui Biomedical Co ltd; Shenzhen Jingdan Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Jiangxi Jingmeirui Biomedical Co ltd; Shenzhen Jingdan Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2022-06-29
Filing date: 2022-06-29
Publication date: 2022-12-06

Abstract

本发明公开了一种高亲和针对转铁蛋白受体1(TfR1)的纳米抗体及其应用。所述纳米抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3。本发明还公开了包含所述纳米抗体的重链抗体、编码所述纳米抗体或重链抗体的核酸、包含所述核酸的重组表达载体、包含所述核酸或重组表达载体的转化体以及包含所述纳米抗体或重链抗体的重组融合蛋白。本发明还公开了所述纳米抗体、重链抗体或重组融合蛋白用于免疫检测或者测定转铁蛋白受体1的方法。本发明提供的抗TfR1的纳米抗体对转铁蛋白受体具有高度特异的抗原识别能力和高度的亲和力，具有独特的抗原决定簇识别位点，能够有效地穿越血脑屏障到达脑内部。

Description

一种针对转铁蛋白受体1的纳米抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高亲和针对转铁蛋白受体1(TfR1)的纳米抗体及其应用。

背景技术

血脑屏障是一种大脑血管、细胞以及其他组成大脑组织之间的保护性屏障，能为大脑提供一种防御机制，有效地阻止血液中的外来病原体和毒素等，进而维持中枢神经系统的稳态。同时，血脑屏障也限制许多治疗性抗体和候选药物的转运，从而大大降低其疗效。因此，设计一种高效地通过血脑屏障的方法是治疗大脑疾病和中枢神经疾病如阿尔茨海默氏症、多发性硬化和黏多糖贮积症II型(MPS II，又名亨特综合征)等的一个关键障碍。

近年来，研究者们发现利用非侵入式技术(内源性胞吞过程)介导跨越血脑屏障，例如吸附介导的转胞吞作用，载体介导的转胞吞作用和受体介导的转胞吞作用。受体介导的转胞吞作用是目前研究最广泛且最有效的一种介导生物大分子药物穿越血脑屏障递送的途径。该作用包括配体识别其在脑微血管和毛细血管内皮细胞膜上同源的受体而介导内吞、配体/受体复合物的细胞内转运以及配体外排。在脑部血管内皮细胞表面普遍表达的靶标有多种，例如转铁蛋白受体(Transferrin recptor or CD71，TfR)、胰岛素受体(insulingrowth factor recptor or CD220)和胰岛素样生长因子受体(insulin-like growthfactor recptor)，它们均介导相应配体分子跨越血脑屏障，这些受体分子被认为在穿越血脑屏障的药物递送方面具有广阔前景。

单克隆抗体是通过激活和加强人体自身免疫系统来抵御病毒细胞的入侵，此类抗体具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点。相应地，研究者们已经开发了多种能够与介导配体跨越血脑屏障靶点结合的抗体及配体，包括单特异性和双特异性抗体等。其中，转铁蛋白受体1(TfR1)是最具代表性的一种转胞吞作用受体，也是大脑递送方法中研究最广泛的靶蛋白。目前已经研发了许多针对TfR的抗体分子，包括称为OX26(首个通过受体介导的胞吞作用穿过血脑屏障的TfR抗体)、8D3、sFab和单链抗体等等。然而，单克隆分子具有较大的分子尺寸、结构复杂，在跨膜转运中效率较低。此外，单克隆抗体的制备成本高及不稳定性限制了它的生产及在临床应用上的推广。

纳米抗体是目前已知最小的可结合抗原的抗体分子，其是通过驼类和软骨鱼类等动物体内含有的天然缺失轻链的重链抗体可变区(variabledomain of the heavy chainof heavy-chainantibody，VHH)得到的，分子量约为15kDa，10纳米的直径。和传统抗体相比，纳米抗体分子量小、结构简单，但依然具有完整的抗原识别能力，一般可以通过噬菌体筛选得到完整抗体序列，这使其在基础医学研究、疾病诊断以及治疗方面具有广阔的应用前景。因此，获得高纯度抗转铁蛋白受体1(TfR1)的纳米抗体能够大大促进穿越血脑屏障关键性问题的解决，实现有效的药物递送系统的构建，也为针对中枢神经系统疾病药物开发带来新的机遇。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：现有技术中抗转铁蛋白受体1(TfR1)的抗体存在具有较大的分子尺寸、结构复杂，在跨膜转运中效率较低，且制备成本高、不稳定等缺陷，从而本发明提供了一种抗TfR1的高亲和力纳米抗体。本发明提供的抗TfR1的纳米抗体只包含一个重链可变区(VHH,Variable Domain of Heavy Chain Antibody)。本发明还提供了抗TfR1的纳米抗体的编码基因及含有该纳米抗体编码序列的表达载体，以及含有该表达载体的宿主细胞。本发明还提供了抗TfR1的纳米抗体可变区可与具有治疗潜力的大分子药物构建一种重组融合蛋白的应用，所述纳米抗体在穿越血脑屏障药物递送的应用。所述纳米抗体通过直接偶联法(Biacore)测试抗TfR1纳米抗体的亲和力测试。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体，其包含重链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:67所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:68所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:69所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:71所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:72所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:73所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:74所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:75所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:76所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:77所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:78所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:79所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:80所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:81所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:82所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:83所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:84所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:85所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:86所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:87所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:88所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:89所示的纳米抗体或其功能活性变体；或，

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:90所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:91所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:92所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述功能活性变体的氨基酸序列与原序列相比，具有至少90％、至少95％或者至少99％的序列同一性，且所述功能活性变体维持与原序列相同的抗原结合功能。

本文中的术语“纳米抗体”，又称为“单域抗体”，只包含一个重链可变区VHH，分子量约为15kDa，直径约10纳米，其保留了全部的抗原结合能力，是最小的保留完整抗原结合片段。

术语“转铁蛋白受体1(TfR1)”包括由细胞天然表达的TFR1的任何变体或同种型。本发明的纳米抗体可特异性结合TFR1。TFR1或其任何变体或同种型可从天然表达它们的细胞或组织中分离而得，或使用本领域通用以及本文所述的那些技术通过重组技术产生。

本发明所列CDR的氨基酸序列按照IMGT定义规则确定的。但是，本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standardconformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal ofMolecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department ofHealth and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(Universityof Bath),Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(万维网imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinitypropagation clustering)的North CDR定义。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”应理解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。各种编号系统其对应CDR是本领域技术人员熟知的，如表1所示：

表1抗体CDR定义方法

	Kabat	AbM	Chothia	Contact	IMGT
						HCDR1	H31–H35	H26–H35	H26–H32	H30–H35	H26–H35
HCDR2	H50–H65	H50–H58	H52–H56	H47–H58	H51–H57
						HCDR3	H95–H102	H95–H102	H95–H102	H93–H101	H93–H102

备注：表1中，Haa-Hbb指从抗体重链的N端开始，按照其对应的编码规则从第aa位至第bb位的氨基酸序列。例如，表1第二行第二列的H31–H35指从抗体重链可变区N端开始，按照Kabat编码规则从第31位至第35位残基所确定的氨基酸序列；其它依次类推。

如下进行序列之间序列同一性的计算。为确定两个氨基酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置处的氨基酸残基。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum62评分矩阵。还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12、空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。额外地或备选地，可以进一步使用本发明所述的蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。

如技术方案之一所述的纳米抗体，所述重链可变区包含框架区FR1、FR2、FR3和FR4；所述FR1如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:41所示；

所述FR2如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:42或SEQ ID NO:46所示；

所述FR3如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:43或SEQ ID NO:47所示；

所述FR4如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:44或SEQ ID NO:48所示。

在本发明的优选实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；或，

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

或者，在一些实施方案中，

所述纳米抗体为重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的纳米抗体；

所述纳米抗体为重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示的纳米抗体；

所述纳米抗体为重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示的纳米抗体；

所述纳米抗体为重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示的纳米抗体；

所述纳米抗体为重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的纳米抗体；

所述纳米抗体为重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示的纳米抗体；

所述纳米抗体为重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示的纳米抗体；

所述纳米抗体为重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:56所示的纳米抗体；

所述纳米抗体为重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示的纳米抗体；

所述纳米抗体为重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示的纳米抗体；

所述纳米抗体为重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的纳米抗体；或，

所述纳米抗体为重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的纳米抗体。

术语“可变区”指抗体重链中涉及抗体结合抗原的域。VH包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。其中，术语“互补决定区”或“CDR”指可变结构域内主要促成与抗原结合的区域；“框架”或“FR”是指除CDR残基之外的可变结构域残基。VH包含3个CDR区：HCDR1、HCDR2和HCDR3。每个VH由从氨基末端排到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

如技术方案之一所述的纳米抗体，所述纳米抗体为单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体，或所述纳米抗体为由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。

术语“双特异性抗体”、“多特异性抗体”按其最广义使用，分别指具有两个或多个表位特异性的抗体。

术语“表位”指能够与抗体特异性结合的抗原上的区域(area或region)。表位可以由连续氨基酸串(线性表位)形成或包含非连续氨基酸(构象表位)，例如因抗原的折叠(即通过蛋白质性质的抗原的三级折叠)而变成空间接近。构象表位和线性表位的差别在于：在变性溶剂的存在下，抗体对构象表位的结合丧失。表位包含处于独特空间构象的至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，或8-10个氨基酸。筛选结合特定表位的抗体(即那些结合相同表位的)可以使用本领域例行方法来进行，例如但不限于丙氨酸扫描、肽印迹(见Meth.Mol.Biol.248(2004)443-463)。

术语“特异性结合”是指抗体以比针对其他抗原或表位更高的亲和力结合至某个抗原或该抗原内的表位。通常，抗体以约1×10^-7M或更小(例如约1×10^-8M或更小、约1×10^- ⁹M或更小、约1×10^-10M或更小、约1×10^-11M或更小，或者约1×10^-12M或更小)的平衡解离常数(KD)结合抗原或抗原内的表位。可使用标准程序来测量KD，例如通过直接偶联法(Biacore)测试。

本发明的抗体包括单克隆抗体(缩写mAb或Ab)，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：一种重链抗体，所述重链抗体包含如技术方案之一所述的纳米抗体，所述重链抗体还包含重链恒定区CH2和/或CH3。

在本发明的优选实施方案中，所述重链恒定区源自人源抗体的重链恒定区。

术语“重链抗体(heavy chain antibody,HcAb)”，是存在于骆驼和鲨鱼类动物体内，轻链天然缺失，只有重链组成的新型抗体分子。重链抗体和普通的抗体相比虽然缺失了轻链，但是依然保留结合抗原的能力。与具有重链和轻链4条多肽链组成的常规抗体分子不同，重链抗体由两条同源的重链肽段组成，重链分子只包含可变区、CH2区和CH3区，相对分子质量为90kDa，远小于常规的IgG抗体分子(150kDa)。

在一些实施方案中，所述恒定区包括不改变抗体可变区结构和功能的恒定区变体。现有技术中已公开多种此类恒定区变体，例如抗体的重链恒定区的Fc具有238、265、269、270、297、327和329(采用EU编号系统)中的一个或更多个氨基酸的替代(美国专利No.6,737,056)，或者抗体的重链恒定区的Fc具有234、235、265、329(采用EU编号系统)处的一个或更多个氨基酸的替代，或者抗体的重链恒定区的Fc具有238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434(采用EU编号系统)处的一个或更多个氨基酸的替代(参见美国专利No.7,371,826)等等。这些突变已被证实使得抗体具有新的性能，但不改变抗体可变区的功能。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三为：一种分离的核酸，所述核酸编码如技术方案之一所述的靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体或如技术方案之二所述的重链抗体。

如本领域已知，在本发明中“核酸”是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或者能够通过DNA或RNA聚合酶掺入链的任何底物。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之四为：一种重组表达载体，其包含如技术方案之三所述的分离的核酸。

在本发明的较佳实施方案中，所述重组表达载体的骨架为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。

在本发明的更佳实施方案中，所述质粒的骨架为pET28a。

术语“重组表达载体”意指基因修饰的寡核苷酸或聚核苷酸构筑体，当构筑体包含编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列，并且载体在足以使mRNA、蛋白质、多肽、或肽在细胞内表达的条件下与细胞接触时，所述构筑体准许由宿主细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽。本公开的载体总体上不是天然存在的。然而，载体的部分可以是天然存在的。本发明的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于如下DNA和RNA：其可以是单链或双链的，合成的或部分地从天然来源中获得，并且其可以含有天然、非天然或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在或非天然存在的核苷酸间连接，或这两种类型的连接。在示范性方面中，改变的核苷酸或非天然存在的核苷酸间连接不阻碍载体的转录或复制。

本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，其能够用于转化或转染将一种或多种所关注的基因或序列递送入任何合适的宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。合适的载体包括经过设计用于扩展和扩增或用于表达或以上两项的那些载体，载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的DNA或RNA表达载体、包囊化于脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之五为：一种转化体，其包含如技术方案之三所述的分离的核酸或如技术方案之四所述的重组表达载体；

在本发明的较佳实施方案中，所述转化体的宿主细胞为原核细胞；

在本发明的更佳实施方案中，所述原核细胞为大肠杆菌；

在本发明的具体实施方案中，所述大肠杆菌为Escherichia coli BL21 Rosetta株。

如本文所使用，术语“宿主细胞”是指可以含有本文所描述的核酸或载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如植物、动物、真菌或海藻；或宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。

可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因编辑(CRISPR-Cas系统、ZFN系统或TALEN系统)、转座子(Sleeping Beauty或PiggyBAC)、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下，将细胞在培养基中培育并且筛选适宜的活性。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法，根据使用的特定表达载体和宿主细胞变动或优化。另外，可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物，选出已经稳定将DNA掺入至其染色体中的细胞。标记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性(例如，抗生素)或重金属(如铜)抗性等。可选择标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。也可能需要额外元件以便最佳合成mRNA。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之六为：一种制备如技术方案之一所述的靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体或如技术方案之二所述的重链抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)扩增如技术方案之三所述的分离的核酸；

(2)将步骤(1)获得的核酸连接于如技术方案之四所述的重组表达载体；

(3)将步骤(2)获得的重组表达载体转导入如技术方案之五所述的转化体中；

(4)诱导步骤(3)获得的转化体，收获表达的所述抗体；

在本发明的较佳实施方案中，步骤(4)所述的诱导为加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。

在本发明的优选的实施方案中，步骤(1)所述的编码基因为了适应在宿主细胞大肠杆菌中表达，在不改变抗TfR1的纳米抗体的氨基酸序列的前提下，将核苷酸序列进行优化。

在本发明的具体实施方案中，培养所述转化体的温度为37℃，初始的pH为7.5，200rpm，培养菌液OD₆₀₀为0.6-0.8之间以IPTG诱导表达抗TfR1的纳米抗体。采用本发明所述的方法，诱导表达条件：菌液于摇床上培养直至OD₆₀₀为0.6-0.8之间，加入IPTG，30℃，200rpm条件下，诱导培养5小时；胞外分泌蛋白可达到1-10mg/L，分子大小为12.5KDa。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之七为：一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包含如技术方案之一所述的靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体或如技术方案之二所述的重链抗体。

术语“重组融合蛋白”或“融合蛋白”，是指利用基因工程技术将本发明所述纳米抗体或重链抗体与其他生物活性蛋白融合所得的产物。

在本发明的较佳实施方案中，所述重组融合蛋白还包含具有治疗潜力的大分子药物。

在本发明的更佳实施方案中，所述大分子药物为抗体。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之八为：一种抗体药物偶联物，其包含小分子药物或标签，以及如技术方案之一所述的靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体或如技术方案之二所述的重链抗体。

术语“抗体药物偶联物”(ADC)指与一种或多种化学合成分子(包括但不限于小分子药物或标签)偶联的抗体修饰物。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之九为：一种药物组合物，其包含如技术方案之一所述的靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体或如技术方案之二所述的重链抗体、如技术方案之七所述的重组融合蛋白和/或如技术方案之八所述的抗体药物偶联物，以及药学上可接受的载体；

在本发明的较佳实施方案中，所述药物组合物还含有其它药剂。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之十为：一种试剂盒，其包括如技术方案之一所述的靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体或如技术方案之二所述的重链抗体、如技术方案之七所述的重组融合蛋白、如技术方案之八所述的抗体药物偶联物和/或技术方案之九所述的药物组合物。

在本发明的较佳实施方案中，所述试剂盒还包括(i)施用抗体或抗体药物偶联物或药物组合物的装置；和/或(ii)使用说明。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之十一为：一种套装药盒，其包含药盒A和药盒B，其中：

所述药盒A含有如技术方案之一所述的靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体或如技术方案之二所述的重链抗体、如技术方案之七所述的重组融合蛋白、如技术方案之八所述的抗体药物偶联物和/或如技术方案之九所述的药物组合物；

在本发明的较佳实施方案中，所述药盒B含有还含有其它药剂。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之十二为：如技术方案之一所述的靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体或如技术方案之二所述的重链抗体、如技术方案之七所述的重组融合蛋白、如技术方案之八所述的抗体药物偶联物和/或如技术方案之九所述的药物组合物在制备递送穿越血脑屏障的药物中的应用。

在本发明的优选实施方案中，所述药物为针对大脑疾病或中枢神经系统疾病的药物。

在本发明的更优选实施方案中，所述中枢神经系统疾病为阿尔茨海默氏症、多发性硬化或黏多糖贮积症II型。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之十三为：一种免疫检测或者测定转铁蛋白受体1的方法，其包括使用如技术方案之一所述的靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体或如技术方案之二所述的重链抗体和/或如技术方案之七所述的重组融合蛋白。

在本发明的优选实施方案中，所述检测为非诊断目的的检测，例如在实验室中检测转铁蛋白受体1存在与否；或作为阳性抗体来筛选其它抗TfR1抗体；或与其它抗TfR1抗体竞争结合，检测抗体之间是否存在竞争即抗原表位是否相同或相似等应用场景。

本发明提供的技术方案之十四为：一种诊断、治疗和/或预防针对大脑疾病或中枢神经系统疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的如技术方案之一所述的靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体或如技术方案之二所述的重链抗体、如技术方案之七所述的重组融合蛋白、如技术方案之八所述的抗体药物偶联物、如技术方案之九所述的药物组合物，或者如技术方案之十一所述的套装药盒。

在本发明的优选实施方案中，所述中枢神经系统疾病为阿尔茨海默氏症、多发性硬化或黏多糖贮积症II型，但不限制于此。

如本发明所用，术语“有效量”表示引发例如研究者或临床医师所追求的组织、系统、动物或人的生物学或药学响应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”表示，与没有接受该量的相应受试者相比，引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量，或者使疾病或病况的进展速率降低的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。

本发明提供的技术方案之十五为：一种联合疗法，其包括分别向有需要的患者施用如技术方案之一所述的靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体或如技术方案之二所述的重链抗体、如技术方案之七所述的重组融合蛋白、如技术方案之八所述的抗体药物偶联物、如技术方案之九所述的药物组合物，或者如技术方案之十一所述的套装药盒，和第二治疗剂。

在本发明的优选实施方案中，所述第二治疗剂包含其他药剂。

本发明提供的技术方案之十六为：作为药物的如技术方案之一所述的靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体或如技术方案之二所述的重链抗体、如技术方案之七所述的重组融合蛋白、如技术方案之八所述的抗体药物偶联物或如技术方案之九所述的药物组合物。

在一些技术方案中，所述药物用于诊断、预防和/或治疗针对大脑疾病或中枢神经系统疾病。

在一些技术方案中，所述中枢神经系统疾病为阿尔茨海默氏症、多发性硬化或黏多糖贮积症II型，但不限制于此。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明提供的抗TfR1的纳米抗体对转铁蛋白受体具有高度特异的抗原识别能力，具有高度的亲和力(可达到KD＝1.43e-13)，并且具有独特的抗原决定簇识别位点(一些隐匿于裂隙或空腔里的抗原决定簇)，能够躲避在穿越血脑屏障的过程中被富集到脑内皮细胞的溶酶体中降解，有效地穿越血脑屏障到达脑内部。相对于传统哺乳类动物抗体来说，抗TfR1的纳米抗体的具有免疫原性相对较低和易人源化的特点，因此作为靶向递送系统具有独特的优势。之后可构建出一种重组融合蛋白，它将具有治疗潜力的大分子药物与抗TfR1的纳米抗体可变区融合在一起，利用转铁蛋白受体介导的转胞吞作用帮助穿越血脑屏障，从而提高大分子药物在大脑中的水平。

此外，抗TfR1的纳米抗体由于仅有重链，其亲水性和单多肽性质增加，且没有糖基化，抗TfR1的纳米抗体的制造较单克隆抗体容易，可在大肠杆菌表达系统中高质量稳定、大量地生产，这样可以避免细胞生产的高成本和长周期的问题；同时有效避免传统抗体的批次间差异问题，适合工业化大规模生产。抗TfR1的纳米抗体内部有二硫键的存在，使其抗热能力增强，如处于极端温度和pH环境中可稳定存在，其生产不受苛刻条件的限制，此外，其对强变性剂的耐受性也较强。

本发明提供的方法简便、高效，降低了纯化的成本，避免细胞生产的高成本和长周期的问题；同时有效避免传统抗体的批次间差异问题，为工业化制备抗TfR1的纳米抗体奠定了基础。最后，本发明提供了上述的纳米抗体在制备穿越血脑屏障药物递送中的应用，为针对中枢神经系统疾病药物开发带来新的机遇。

附图说明

图1为分子筛结果。

图2为转铁蛋白受体1的SDS-PAGE结果。

图3为抗TfR1的纳米抗体的SDS-PAGE结果。

图4为TfR1-NT-Nb的分子互作结果。

图5为其他TfR1-NT-Nb的分子互作结果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

纳米抗体的开发不同于传统单克隆抗体通过杂交瘤制备的方法，它通过免疫羊驼并通过羊驼体内自身的抗体成熟阶段来得到抗体基因，然后通过噬菌体展示筛选技术来从羊驼抗体库中筛选得到最适合的抗体序列。整个流程主要包括抗原制备、羊驼免疫、淋巴细胞提取、纳米抗体文库构建、噬菌体库构建、特异性噬菌体筛选、大肠杆菌表达、抗体纯化、亲和力测试等步骤。

实施例1转铁蛋白受体1(TfR1)的蛋白表达及纯化

1，将TfR1片段(120-760AA，氨基酸序列见SEQ ID NO:93)构建至pfastbac载体中，并用昆虫细胞sf9进行表达。

2，以转速为8700rpm，离心20分钟，收集细胞培养上清液。准备洁净的2L锥形瓶(在离心之前预冷摇床)，向每个锥形瓶中加入适量Ni-beads，再将适量上清液倒入锥形瓶中，置于摇床80rpm，4℃结合1小时。

3，选用镍柱进行蛋白纯化，镍柱使用前用50倍柱体积含有50mM Tris HCl，300mMNaCl，10mM咪唑，pH＝7.5的缓冲液对柱子进行平衡；再将上述步骤中的结合液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mM、30mM、50mM的咪唑浓度的缓冲液进行漂洗；再用3-5倍柱体积含300mM的咪唑浓度的缓冲液进行洗脱；后续使用分子筛进行进一步的纯化，凝胶层析柱的型号为：SuperdexTM 200Increase 10/300GL，凝胶层析的缓冲液为：50mM Tris HCl，300mMNaCl。

出峰位置即为目的蛋白分子量大小所在位置，收集出峰体积的液体，得到目的蛋白，置于液氮中保存。分子筛结果如图1所示。转铁蛋白受体1的SDS-PAGE结果如图2所示。

SEQ ID NO:93

RRLYWDDLKRKLSEKLDSTDFTGTIKLLNENSYVPREAGSQKDENLALYVENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKEIKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSGVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQNVKHPVTGQFLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELIERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDVELNLDYERYNSQLLSFVRDLNQYRADIKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFGNAEKTDRFVMKKLNDRVMRVEYHFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLPALLENLKLRKQNNGAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF

实施例2抗TfR1的纳米抗体完整序列的获得

一、羊驼免疫：

1.挑选羊驼：选择体型适中、身体健康强壮、无受伤不适症状且精神状态良好的羊驼。将挑选好的羊驼先预养至少1周以适应新的饲养条件，使后期的实验能顺利进行。

2.准备抗原：见实施例1。

3.免疫羊驼：将制备好的TfR1抗原用液氮速冻，并保存至液氮中，以备羊驼免疫时用。使用GERBU LQ免疫刺激佐剂与抗原以1：1的比例形成混合物，每次在羊驼颈部淋巴结附近分左右两侧注射，每侧分2点注射，每点注射0.5mL。一只羊驼每次免疫TfR1抗原量保持在1-2mg之间，体积在1mL以下。在每次免疫后对羊驼进行观察，确认其状态良好及无不适反应。根据经验，每1-2周对动物进行免疫可对大部分抗原有良好的免疫反应。因此，我们选择每隔2周进行免疫一次，一共进行7次免疫。

4.采血：在第6次和第7次免疫后5-7天，使用EDTA涂层的采血管从羊驼颈部静脉进行采血，每次采血25-30mL，分3个采血管收集，采血后倒置两次以抑制凝血。

5.血清分离：在第4次、第5次和第6次免疫前进行采血用于免疫评价，使用EDTA涂层的采血管从羊驼颈部静脉进行采血，每次采血5mL，采血后倒置两次以抑制凝血；随后在25℃，400g条件下离心30分钟，取上层血清，-80度保存。

6.分离淋巴细胞：采血后对立马进行淋巴细胞分离实验可以有效阻止溶血问题以达到最好的分离效果。取一支15mL的离心管，预先加入3mL细胞分离液，用移液枪小心吸取3mL血液样本，缓慢加入预先加入细胞分离液得15mL离心管中，以防止血液和细胞分离液混匀。随后在25℃，400g条件下离心30分钟，观察离心管中血液分离情况，此时离心管中由上至下分为4层，第一层为血浆层(黄色)，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。用200μL移液器小心吸取出第二层环状乳白色淋巴细胞层至新的15mL离心管中，枪头悬于淋巴细胞层上方1-2mm即可开始吸，一边吸一边水平移动枪头，约吸取3-4次才能基本上吸完。上层血清保存在新的离心管中，-80度保存。在装有淋巴细胞的离心管中加入室温放置的10mL PBS缓冲液，混匀，在25℃，400g条件下离心20分钟。弃去上清液，以室温放置的5mL PBS缓冲液重悬所得细胞，在25℃，400g条件下离心20分钟。必要时重复上述步骤。弃去上清液，根据细胞数目，每10⁷个淋巴细胞用1mL Trizol溶解，-80度保存。

二、构建噬菌体

1.RNA提取：将上述所得Trizol溶解的外周血淋巴细胞转移至1.5mL的EP管中，震荡几秒混匀，室温静置10十分钟，加入1/5体积的氯仿，握住EP管用力震荡15秒(10次)，此时溶液应为粉红色的浑浊液体，室温静置5分钟；在4℃，12000g条件下离心15分钟，离心后分为3层，RNA在上层水相，DNA在中间层，蛋白质在下层有机相；用200uL移液器小心吸取上清液(水相)转移到新的EP管，约吸取3次才能基本上吸完，吸的时候枪头随着液面往下移动，切勿吸到中间层白色物质；向新的EP管中加入0.5-1倍体积的异丙醇，上下颠倒摇匀，室温静置10分钟；在4℃，12000g条件下离心10分钟，擦干净管壁的水雾后，在管底或者邻近的侧壁可见一小片白色片状沉淀；弃去上清，加入1倍体积的75％乙醇(新鲜配置)清洗沉淀，此过程需要轻摇EP管或手指弹管壁，使得沉淀在酒精中浮起来，在4℃，7500g条件下离心5分钟；小心弃去上清，以10uL的枪头小心吸掉沉淀周围大部分残留液体，室温下适度干燥沉淀，待沉淀开始变透明时(不要等到彻底变透明)，立即加入适量的无RNA酶水，吹打溶解。

2.反转录cDNA：采用Primer Script RT试剂盒将上一步得到的RNA进行逆转录制备cDNA。先利用Nanodrop 2000进行RNA核酸浓度的测定。将核酸量为500ng RNA的体积加入到新的0.2mL微量反应管中，加补足适量的无RNA酶水至总体积为3.5μL，再加入0.5μL gDNAEraser和1μL 5×gDNA Eraser Buffer。经过离心混匀后，置于逆转录机中进行逆转录，反应条件为：42℃反应2分钟，85℃反应5分钟。反应完成后，取出微量反应管置于冰上，加入0.5μL Prime Script RT enzyme Mix1、2μL 5×Prime Script Buffer2、0.5μL RT Primemix和2μL RNase Free H₂O。经过离心混匀后，置于逆转录机中进行逆转录，反应条件为：37℃反应15分钟，85℃反应5秒。反应结束后，将所得cDNA置于-80℃冰箱中保存。

3.扩增抗体片段：使用Taq DNA Polymerase Hot Start酶进行特定的抗体片段(所有免疫球蛋白重链VHS和VHHs的可变域)PCR扩增。PCR反应体系为：cDNA模板2μL，上引物(AlpVh-L)2μL，下引物(call002)2μL，10×Taq Buffer 5μL，dNTP 4μL，Taq酶0.25μL，ddH₂O补足至总体积为50μL。PCR的反应条件为：98度3分钟；95度30秒，57度30秒，68度40秒，每个循环增加2秒，重复22个循环；68度5分钟。将得到的PCR扩增产物跑1％琼脂糖凝胶电泳，并使用天根DNA纯化回收试剂盒进行胶回收。使用Taq DNA Polymerase Hot Start酶对胶回收后的DNA片段再次进行特定的抗体片段PCR扩增。PCR反应体系为：DNA模板2μL，上引物(VHH-FP)2μL，下引物(VHH-RP)2μL，10×Taq Buffer 5μL，dNTP 4μL，Taq酶0.25μL，ddH₂O补足至总体积为50μL。PCR的反应条件为：98度3分钟；95度50秒，55度30秒，72度40秒，重复12个循环；72度10分钟。将得到的PCR扩增产物跑1％琼脂糖凝胶电泳，并使用天根DNA纯化回收试剂盒进行胶回收。

4.克隆至噬菌体质粒：将上一步PCR扩增得到特定的抗体DNA和噬菌体载体分别进行酶切。酶切体系为：特定的抗体DNA 12μg/载体3μg，10×BglI Buffer 3μL,BglI 4.5μL,ddH₂O补足至总体积至30μL。酶切反应条件为：37度，3-4小时。将酶切产物跑1％琼脂糖凝胶电泳，并使用天根DNA纯化回收试剂盒进行胶回收。之后进行酶连反应。酶连反应体系为：特定的抗体DNA80ng，噬菌体载体200ng，T4连接酶2μL，10×连接Buffer 5μL，ddH₂O补足至总体积为至50μL。酶连反应条件为：4度，过夜。将连接产物跑1％琼脂糖凝胶电泳，并使用天根DNA纯化回收试剂盒进行胶回收。

5.转化SS320：将连接产物进行电击转化后构建含有纳米抗体片段的大肠杆菌文库。将电转杯置于冰上预冷，噬菌体电感受态细胞SS320从-80℃拿出，迅速插入冰水中水浴5分钟直至菌块融化，之后使用提前预冷的枪头加入1μL上一步得到的连接产物，并用手拨打EP管底轻轻混匀，将EP管中混合物转移至预冷好的1mm电转杯中，轻敲电转杯，让混合物流至电转杯底部；使用电转仪进行电击转化，之后立即向电转杯中加入1mL不含抗生素的SOC培养基，将菌液从电转杯中快速取出至1.5mL EP管中，在恒温摇床中37℃，200rpm培养60分钟。将菌液在4,000rpm的条件下离心2分钟，弃去部分培养液，悬浮菌体后将其涂布到含有10μg/mL四环素和含有100μg/mL氨苄抗性的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开，将平板置于室温直至液体被吸收，后将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。将上一步过夜生长后的培养板上的细胞用LB培养基和涂布棒冲洗刮下，加入20％的甘油后保存在-80度。

6.噬箘体文库构建

6.1噬菌体扩增：将上一步刮下的数目约为10⁹个细胞转移到100mL预先加入含有10μg/mL四环素和含有100μg/mL氨苄抗性的2×YT液体培养液中，以使初始OD₆₀₀为0.1，在恒温摇床中37℃，250rpm培养直至OD₆₀₀达到0.5。按照辅助噬菌体M13KO7：细菌细胞数目为20:1的比例加入辅助噬菌体，继续在恒温摇床中37℃，250rpm继续培养30分钟。加入终浓度为50μg/mL卡那霉素和0.2mM IPTG，在恒温摇床中30℃，250rpm，过夜培养。

6.2纯化噬菌体文库：将过夜培养的细胞在4℃，13000rpm的条件下离心5分钟，取上清转移到新的离心管中，加入1/4体积4℃预冷的5×PEG8000/NaCl，充分混匀，在冰上孵育30分钟。在4℃，13000rpm的条件下离心10分钟，弃去上清，并在纸上倒置2分钟，后加入1mL PBS缓冲液重悬沉淀。再次加入250μL 5×PEG8000/NaCl后，充分混匀，冰上孵育10分钟，在4℃，13000rpm的条件下离心15分钟，弃去上清，并加入1mL PBS缓冲液重悬沉淀得到噬菌体库。

三、抗体筛选：

1.包被免疫管：将TfR抗原从-80℃冰箱中取出，冰上放置解冻；在免疫管中加入100μg抗原和2mL PBS，4℃缓慢旋转过夜。

2.封闭：取500μL上述得到的噬菌体库，加入1mL 3％BSA中，室温旋转孵育2h。同时弃去免疫管内的液体，往包被好的免疫管中加入2-3mL 3％BSA，室温旋转孵育2小时。

3.抗原和噬菌体孵育：弃去免疫管内的液体，加入2mLPBST缓冲液(含有0.01％Tween20的PBS)室温清洗免疫管3次，每次5分钟。将封闭后的噬菌体文库加入到封闭后的免疫管中，添加PBS直至2-3mL，室温旋转孵育1小时。

4.清洗：弃去免疫管内的液体，用2mLPBST室温清洗免疫管20次，每次5分钟。

5.洗脱：往免疫管中加入1mL 100mM Trimethymime，室温孵育10分钟，加入1MTris-HCl中和Trimethymime，将最后1.5mL的洗脱噬菌体转移到新的离心管中。将洗脱的噬菌体按照扩增和纯化噬菌体文库扩增后再重复筛选过程2次，逐次减半包被免疫管的抗体量，得到3次筛选后的洗脱噬菌体。

6.ELISA鉴定：将上一步筛选得到的噬菌体稀释10⁶倍后，取100μL加入到OD₆₀₀为0.5的SS320菌液中，37度培养30分钟后涂布含有四环素和氨苄霉素的2×YT培养板上，37度过夜培养第二天得到单克隆菌落。挑选96个单克隆菌落到含有四环素和氨苄霉素的2×YT培养液的96孔细胞培养板上，37度培养3-4小时后往培养孔中加入卡那霉素和20:1的辅助噬菌体，30度过夜培养。第二天将过夜培养后的细胞液离心，获得上清液。将过夜包被抗原和用3％BSA封闭过后的96孔ELISA板中加入上一步获得的噬菌体上清液，室温孵育1小时。用含有0.05％吐温的PBS清洗3次后，用噬菌体抗体抗体作为一抗，用相应的二抗TMB显色后在波长450读取每个孔的吸光值。选取吸光值读数最高的SS320菌落送去测序，得到抗体的基因序列，如下所示。

SEQ ID NO:1(C277-1-11)：

SEQ ID NO:2(C277-1-15)：

SEQ ID NO:3(C277-1-45)：

SEQ ID NO:4(C277-1-54)：

SEQ ID NO:5(C277-2-83)：

SEQ ID NO:6(C277-3-77)：

其中，上述抗体的CDR序列(按照IMGT定义规则确定)用“加粗+下划线”的格式表示，具体地，C277-1-11的HCDR1如SEQ ID NO:1自N端第26～33位所示、HCDR2如SEQ ID NO:1自N端第51～58位所示以及HCDR3如SEQ ID NO:1自N端第97～110位所示。

C277-1-15的HCDR1如SEQ ID NO:2自N端第26～33位所示、HCDR2如SEQ ID NO:2自N端第51～58位所示以及HCDR3如SEQ ID NO:2自N端第97～108位所示。

C277-1-45的HCDR1如SEQ ID NO:3自N端第26～33位所示、HCDR2如SEQ ID NO:3自N端第51～58位所示以及HCDR3如SEQ ID NO:3自N端第97～109位所示。

C277-1-54的HCDR1如SEQ ID NO:4自N端第26～33位所示、HCDR2如SEQ ID NO:4自N端第51～57位所示以及HCDR3如SEQ ID NO:4自N端第96～101位所示。

C277-2-83的HCDR1如SEQ ID NO:5自N端第26～33位所示、HCDR2如SEQ ID NO:5自N端第51～61位所示以及HCDR3如SEQ ID NO:5自N端第100～111位所示。

C277-3-77的HCDR1如SEQ ID NO:6自N端第26～33位所示、HCDR2如SEQ ID NO:6自N端第51～58位所示以及HCDR3如SEQ ID NO:6自N端第97～110位所示。

纳米抗体的CDR序列及其序列编号如表2所示：

表2

纳米抗体的框架区序列及其序列编号如表3所示：

表3

实施例3一种针对抗TfR1的纳米抗体的表达和纯化方法

包括如下步骤：

(1)构建抗TfR1的纳米抗体蛋白表达质粒。

(2)将抗TfR1的纳米抗体蛋白表达质粒转化。

(3)诱导培养表达抗TfR1的纳米抗体蛋白，操作包括：取菌液到含有50μg/ml Kan⁺抗生素的LB液体培养基中，摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到含有50μg/ml Kan⁺抗生素的LB液体培养基中，摇床上培养直至OD₆₀₀为0.6-0.8之间，加入IPTG，30℃，200rpm条件下，诱导培养5小时。

(4)纯化抗TfR1的纳米抗体蛋白，操作包括：以6000rpm的转速将菌液离心15min，收集诱导表达的菌体，以缓冲液：菌重＝10mL:1g的比例重悬于含有50mM Tris HCl，300mMNaCl，10mM咪唑，pH＝7.5的缓冲液中；之后将重悬液进行高压破碎，以12000rpm的转速离心35min，取上清；选用镍柱进行蛋白纯化，镍柱使用前用50倍柱体积含有50mM Tris HCl，300mM NaCl，10mM咪唑，pH＝7.5的缓冲液对柱子进行平衡；再将离心获得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mM、30mM、50mM的咪唑浓度的缓冲液进行漂洗；再使用3-5倍柱体积含300mM的咪唑浓度的缓冲液进行洗脱。将含有目的蛋白300mM咪唑的洗脱液用分子筛进行进一步的纯化，凝胶层析柱的型号为：Superdex^TM 200Increase 10/300GL，凝胶层析的缓冲液为：50mM Tris HCl，300mM NaCl。出峰位置即为目的蛋白分子量大小所在位置，收集出峰体积的液体，得到抗TfR1的纳米抗体，置于液氮中储存备用。抗TfR1的纳米抗体的SDS-PAGE结果如图3所示。

进一步地，所述步骤(3)详细过程是：取100μL菌液到100mL含有50μg/ml Kan⁺抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到1L含有50μg/ml Kan⁺抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养直至OD₆₀₀为0.6-0.8之间。加入IPTG，使终浓度为0.67mM，30℃，200rpm条件下，诱导培养5小时。

进一步地，所述步骤(1)是：将编码抗TfR1的纳米抗体的基因克隆到pET-28a载体中，构建表达质粒。

进一步地，所述步骤(2)详细过程是：

将5μg重组质粒冻干粉于12000rpm离心5min，加入30μL去离子水，振荡溶解，12000rpm离心10min。取2μl上清液转化到Escherichia coli BL21 Rosetta(DE3)感受态菌株中，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入500μL的LB液体培养基，37℃，150rpm，摇床培养1h，取30μL培养液涂布到含有50μg/ml Kan⁺抗生素LB固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养过夜；挑选出单一菌落，加入到含有50μg/ml Kan⁺抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养8小时。

实施例4大肠杆菌表达抗TfR1的纳米抗体蛋白的亲和力测定

用直接偶联法(Biacore)测试抗TfR1的纳米抗体与转铁蛋白受体1(TfR1-NT)的亲和力。转铁蛋白受体1通过自制。

1，固定：将TfR1-NT(抗原)固定于CM5芯片上，使用pH＝4.0/4.5/5.0/5.5的醋酸钠溶液分别将抗原稀释成20μg/mL的样品液，上样进行预富集，结合时间为180秒，流速为10μL/min。根据预富集结果选择pH＝4.5的醋酸钠稀释抗原进行固定，按照固定程序进行操作，总结合时间为420秒，流速为10μL/min。

2，抗体筛选实验：浓度梯度为800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125nM，所有分析物(纳米抗体)均使用PBS-N buffer(PBS，1/20000TWEEN 20)进行稀释，使用仪器自带的模板，并设置参数如下：结合时间120秒，解离时间180秒，流速30μL/min，数据收集频率10Hz。按照程序进行分析，每次进样分析后使用10mM NaOH进行再生，再生后进行下一个分析物(纳米抗体)分析。

对抗TfR1的纳米抗体与TfR1-NT的亲和力进行测试。TfR1-NT-Nb分子互作结果如图4所示，通过直接偶联法测得抗铁蛋白受体1的纳米抗体C277-1-11亲和力为KD＝1.43e-13，纳米抗体C277-1-15亲和力为KD＝9.91e-13；纳米抗体C277-1-45亲和力为KD＝1.47e-13，纳米抗体C277-1-54亲和力为KD＝2.69e-12，纳米抗体C277-2-83亲和力为KD＝1.84e-12，纳米抗体C277-3-77亲和力为KD＝1.11e-12。

实施例5其它抗体的亲和力测定

在实施例2中，发明人还筛选到了抗TfR1的纳米抗体C277-1-1、C277-1-5、C277-1-16、C277-1-17、C277-1-19、C277-1-34、C277-1-47、C277-2-24、C277-2-34、C277-2-71、C277-3-39和C277-3-54，其氨基酸序列及序列编号具体如表4所示。

表4

其中，上述抗体的CDR序列(按照IMGT定义规则确定)用“加粗+下划线”的格式表示。纳米抗体的CDR序列及其序列编号如表5所示。

表5

用与实施例4中相同的方法对这些抗TfR1的纳米抗体与TfR1-NT的亲和力进行测试，TfR1-NT-Nb分子互作结果如图5所示，通过直接偶联法测得抗铁蛋白受体1的纳米抗体C277-1-1亲和力为KD＝2.17e-09，纳米抗体C277-1-5亲和力为KD＝4.04e-10，纳米抗体C277-1-16亲和力为KD＝3.33e-10，纳米抗体C277-1-17亲和力为KD＝7.56e-09，纳米抗体C277-1-19亲和力为KD＝8.90e-12，纳米抗体C277-1-34亲和力为KD＝1.31e-11，纳米抗体C277-1-47亲和力为KD＝1.64e-11，纳米抗体C277-2-24亲和力为KD＝1.25e-10，纳米抗体C277-2-34亲和力为KD＝1.23e-09，纳米抗体C277-2-71亲和力为KD＝1.72e-11，纳米抗体C277-3-39亲和力为KD＝9.98e-12，纳米抗体C277-3-54亲和力为KD＝5.80e-12。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳晶蛋生物医药科技有限公司

江西晶美瑞生物医药有限公司

<120> 一种针对转铁蛋白受体1的纳米抗体及其应用

<130> P22012841C

<160> 93

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 135

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-1-11

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ala

20 25 30

Gly Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Ser Asp Gly Gly Lys Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asp Gly Pro Val Tyr Val Arg Ser Ala Pro Pro Arg Gly Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Ile Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro

115 120 125

Gln Asp Gly Gln Ala Gly Gln

130 135

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-1-15

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr His His Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Leu Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Asn Ala Pro Asn Leu Arg Val Asn Gly Met Asn Pro Trp Gly Asn Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp

115 120 125

Gly Gln Ala Gly Gln

130

<210> 3

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-1-45

<400> 3

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Glu Thr Ile Phe Asn Gly Tyr

20 25 30

Gly Met Gly Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Thr Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ile Thr His Tyr Ile Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Ser Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Arg Ala Tyr Trp Asn Ser Pro Gln Pro Asn Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ala Ala His His Ser Glu Asp Pro His

115 120 125

Gly Gln Ala Gly Gln

130

<210> 4

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-1-54

<400> 4

Pro Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Met Phe Arg Phe Tyr

20 25 30

Gly Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ala Asp Gly Ile Ala Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Ser Glu Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Thr Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ser Glu Leu Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ile Ser

100 105 110

Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln Ala Gly Gln

115 120 125

<210> 5

<211> 135

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-2-83

<400> 5

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Gly Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile Lys Ala Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Thr

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Lys

65 70 75 80

Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Asn Tyr Leu Ala Trp Arg Asn Ala Pro Leu Gly Ser Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Pro Ala His His Ser Glu Asp

115 120 125

Pro His Gly Gln Ala Gly Gln

130 135

<210> 6

<211> 134

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-3-77

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Gly Asp Asp

20 25 30

Gly Met Arg Trp Tyr Arg Gln His Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Asn Gly Gly Gly Lys Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asp Arg Pro Tyr Cys Val Arg Ala Pro Pro Thr Asp Tyr Cys Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gln Pro Lys Asn His Pro His

115 120 125

Glu Thr Ala Arg Pro Ala

130

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-11 HCDR1

<400> 7

Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ala Gly

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-11 HCDR2

<400> 8

Ile Ser Ser Asp Gly Gly Lys Thr

1 5

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-11 HCDR3

<400> 9

Asp Gly Pro Val Tyr Val Arg Ser Ala Pro Pro Arg Gly Asn

1 5 10

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-15 HCDR1

<400> 10

Gly Phe Met Phe Ser Asn Tyr Gly

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-15 HCDR2

<400> 11

Ile Thr Gly Ser Thr Gly Ala Thr

1 5

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-15 HCDR3

<400> 12

Asn Ala Pro Asn Leu Arg Val Asn Gly Met Asn Pro

1 5 10

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-45&C277-1-16 HCDR1

<400> 13

Glu Thr Ile Phe Asn Gly Tyr Gly

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-45&C277-1-16 HCDR2

<400> 14

Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ile Thr

1 5

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-45 HCDR3

<400> 15

Asn Arg Ala Tyr Trp Asn Ser Pro Gln Pro Asn Asp Tyr

1 5 10

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-54 HCDR1

<400> 16

Gly Ser Met Phe Arg Phe Tyr Gly

1 5

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-54 HCDR2

<400> 17

Ile Ser Ala Asp Gly Ile Ala

1 5

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-54 HCDR3

<400> 18

Asn Ser Glu Leu Asn Tyr

1 5

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-2-83&C277-3-39 HCDR1

<400> 19

Gly Phe Ser Phe Ser Asn Phe Gly

1 5

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-2-83 HCDR2

<400> 20

Ile Lys Ala Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ile Thr

1 5 10

<210> 21

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-2-83 HCDR3

<400> 21

Asn Tyr Leu Ala Trp Arg Asn Ala Pro Leu Gly Ser

1 5 10

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-3-77 HCDR1

<400> 22

Gly Ile Thr Phe Gly Asp Asp Gly

1 5

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-3-77 HCDR2

<400> 23

Ile Ser Asn Gly Gly Gly Lys Thr

1 5

<210> 24

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-3-77 HCDR3

<400> 24

Asp Arg Pro Tyr Cys Val Arg Ala Pro Pro Thr Asp Tyr Cys

1 5 10

<210> 25

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-11 FR1

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-11 FR2

<400> 26

Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10 15

Gly

<210> 27

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-11 FR3

<400> 27

Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 28

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-11 FR4

<400> 28

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Ile Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro

1 5 10 15

Lys Pro Gln Asp Gly Gln Ala Gly Gln

20 25

<210> 29

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-15 FR1

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 30

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-15 FR2

<400> 30

Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10 15

Gly

<210> 31

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-15 FR3

<400> 31

His His Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Leu Glu Asp

20 25 30

Thr Gly Val Tyr Phe Cys

35

<210> 32

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-15 FR4

<400> 32

Trp Gly Asn Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro

1 5 10 15

Lys Pro Gln Asp Gly Gln Ala Gly Gln

20 25

<210> 33

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-45 FR1

<400> 33

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser

20 25

<210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-45 FR2

<400> 34

Met Gly Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Thr Gln Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10 15

Thr

<210> 35

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-45 FR3

<400> 35

His Tyr Ile Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Ser Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 36

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-45 FR4

<400> 36

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ala Ala His His Ser Glu

1 5 10 15

Asp Pro His Gly Gln Ala Gly Gln

20

<210> 37

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-54 FR1

<400> 37

Pro Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser

20 25

<210> 38

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-54 FR2

<400> 38

Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gln Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10 15

Thr

<210> 39

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-54 FR3

<400> 39

Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Thr Lys Ser Glu Val Tyr Leu Gln Met Thr Gly Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

35

<210> 40

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-54 FR4

<400> 40

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ile Ser Glu Pro Lys Thr Pro

1 5 10 15

Lys Pro Gln Asp Gly Gln Ala Gly Gln

20 25

<210> 41

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-2-83 FR1

<400> 41

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser

20 25

<210> 42

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-2-83 FR2

<400> 42

Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 43

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-2-83 FR3

<400> 43

Asp Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp

1 5 10 15

Ala Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 44

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-2-83 FR4

<400> 44

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Pro Ala His His Ser Glu

1 5 10 15

Asp Pro His Gly Gln Ala Gly Gln

20

<210> 45

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-3-77 FR1

<400> 45

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 46

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-3-77 FR2

<400> 46

Met Arg Trp Tyr Arg Gln His Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10 15

Gly

<210> 47

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-3-77 FR3

<400> 47

Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 48

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-3-77 FR4

<400> 48

Trp Gly Arg Gly Thr Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gln Pro Lys Asn His

1 5 10 15

Pro His Glu Thr Ala Arg Pro Ala

20

<210> 49

<211> 134

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-1-1

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Glu Ile Ala Ser Gly Gly Thr Lys Thr Asn Asp Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Val Leu Val Arg Asn Gly Ser Pro Val Phe Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His Ser Glu Asp Pro

115 120 125

His Gly Gln Ala Gly Gln

130

<210> 50

<211> 136

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-1-5

<400> 50

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ala Thr His Tyr Val Glu Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Met Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Trp Cys

85 90 95

Asn Ala Pro Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Asn Arg Val Asp Asp Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys

115 120 125

Pro Gln Asp Gly Gln Ala Gly Gln

130 135

<210> 51

<211> 134

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-1-16

<400> 51

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Glu Thr Ile Phe Asn Gly Tyr

20 25 30

Gly Met Gly Trp Tyr Arg Gln Gln Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ile Thr His Tyr Ile Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Ser Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Arg Ala Tyr Trp Asn Ser Ala Pro His Asn Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln

115 120 125

Asp Gly Gln Ala Gly Gln

130

<210> 52

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-1-17

<400> 52

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Asn Asp Phe Arg Ile Ser

20 25 30

Val Met Gly Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Pro Gly Ser Thr Ile Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Asp Glu Glu Gln Asp Trp His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln Ala Gly

115 120 125

Gln

<210> 53

<211> 135

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-1-19

<400> 53

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Met Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ser Phe Arg Ser Ser

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Thr Ser Gly Gly Glu His Thr Gly Tyr Ala Asp Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Glu Lys Phe Thr Ala Leu Ser Ser Arg Ala Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro

115 120 125

Gln Asp Gly Gln Ala Gly Gln

130 135

<210> 54

<211> 135

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-1-34

<400> 54

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Asp Arg Ile Tyr

20 25 30

Arg Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ala Gly Asn Gly Pro Ile Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asn Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Val Phe Gly Ser Asp Pro Asp Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro

115 120 125

Gln Asp Gly Gln Ala Gly Gln

130 135

<210> 55

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-1-47

<400> 55

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Arg Phe Asp Gly Phe

20 25 30

Leu Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Val Ile Thr Thr Leu Gly Asp Phe Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Thr Cys

85 90 95

Asn Ala His Ala Pro Thr Val Pro Pro Thr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp

115 120 125

Gly Gln Ala Gly Gln

130

<210> 56

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-2-24

<400> 56

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Thr Gly Ile Tyr

20 25 30

Ala Val Gly Trp His Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Thr Lys Ser Gly Ala Thr Gly Tyr Gly Asp Ala Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr

85 90 95

Met Asn Tyr Asn Gly Gly Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Glu Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln Ala Gly Gln

115 120 125

<210> 57

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-2-34

<400> 57

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala His Thr Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Ala

20 25 30

Thr Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile Thr Glu Pro Gly Ser Arg Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Ala

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Ala Pro Leu Leu Gly Leu Gln Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Ile

100 105 110

Ser Ala Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln Ala Gly Gln

115 120 125

<210> 58

<211> 131

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-2-71

<400> 58

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Ser Ser Leu Pro Ala Met

20 25 30

Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ser

35 40 45

Ile Gly Lys Glu Gly Thr Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Met Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Asn Ala Lys Asn Thr Thr Tyr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Arg Gly Pro Asn Ser Pro Lys Asn Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln

115 120 125

Ala Gly Gln

130

<210> 59

<211> 134

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-3-39

<400> 59

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Gly Met Thr Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Ser Ala Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asp Cys Pro Val Cys Gly Arg Ser Pro Pro Ala Ser Cys Tyr Trp Gly

100 105 110

Thr Gly Thr Pro Val Ser Pro Ser Ser Gln Pro Lys Asn Pro His Ala

115 120 125

Gln Asp Gly Gln Ala Gly

130

<210> 60

<211> 130

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 纳米抗体C277-3-54

<400> 60

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Thr Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His

20 25 30

His Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Leu Thr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Thr Asp Ser Val Gln

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Val Gly Ile Asn Tyr Phe Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Gly Gln Ala

115 120 125

Gly Gln

130

<210> 61

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-1&C277-1-5 HCDR1

<400> 61

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly

1 5

<210> 62

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-1 HCDR2

<400> 62

Ile Ala Ser Gly Gly Thr Lys Thr

1 5

<210> 63

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-1 HCDR3

<400> 63

Asn Ala Val Leu Val Arg Asn Gly Ser Pro Val Phe Asp Ser

1 5 10

<210> 64

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-5 HCDR2

<400> 64

Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ala Thr

1 5

<210> 65

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-5 HCDR3

<400> 65

Asn Ala Pro Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Asn Arg Val Asp Asp

1 5 10 15

<210> 66

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-16 HCDR3

<400> 66

Asn Arg Ala Tyr Trp Asn Ser Ala Pro His Asn Asp Tyr

1 5 10

<210> 67

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-17 HCDR1

<400> 67

Thr Asn Asp Phe Arg Ile Ser Val

1 5

<210> 68

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-17 HCDR2

<400> 68

Ile Ser Pro Gly Ser Thr Ile Thr

1 5

<210> 69

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-17 HCDR3

<400> 69

Asn Asp Glu Glu Gln Asp Trp His

1 5

<210> 70

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-19 HCDR1

<400> 70

Gly Phe Ser Phe Arg Ser Ser Trp

1 5

<210> 71

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-19 HCDR2

<400> 71

Ile Thr Ser Gly Gly Glu His Thr

1 5

<210> 72

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-19 HCDR3

<400> 72

Ala Arg Gly Glu Lys Phe Thr Ala Leu Ser Ser Arg Ala Ser

1 5 10

<210> 73

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-34 HCDR1

<400> 73

Gly Arg Ile Asp Arg Ile Tyr Arg

1 5

<210> 74

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-34 HCDR2

<400> 74

Ala Gly Asn Gly Pro Ile Thr

1 5

<210> 75

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-34 HCDR3

<400> 75

Asn Val Phe Gly Ser Asp Pro Asp Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 76

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-47 HCDR1

<400> 76

Gly Phe Arg Phe Asp Gly Phe Leu

1 5

<210> 77

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-47 HCDR2

<400> 77

Ile Thr Thr Leu Gly Asp Phe Thr

1 5

<210> 78

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-1-47 HCDR3

<400> 78

Asn Ala His Ala Pro Thr Val Pro Pro Thr Ser Tyr

1 5 10

<210> 79

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-2-24 HCDR1

<400> 79

Glu Arg Ile Thr Gly Ile Tyr Ala

1 5

<210> 80

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-2-24 HCDR2

<400> 80

Ile Thr Lys Ser Gly Ala Thr

1 5

<210> 81

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-2-24 HCDR3

<400> 81

Tyr Met Asn Tyr Asn Gly Gly Ile

1 5

<210> 82

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-2-34 HCDR1

<400> 82

Gly Phe Thr Phe Ser Val Ala Thr

1 5

<210> 83

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-2-34 HCDR2

<400> 83

Ile Thr Glu Pro Gly Ser Arg Thr

1 5

<210> 84

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-2-34 HCDR3

<400> 84

Gly Ala Pro Leu Leu Gly Leu

1 5

<210> 85

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-2-71 HCDR1

<400> 85

Ala Ser Ser Leu Pro Ala Met Gly

1 5

<210> 86

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-2-71 HCDR2

<400> 86

Lys Glu Gly Thr Gly Thr

1 5

<210> 87

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-2-71 HCDR3

<400> 87

Tyr Cys Asn Arg Gly Pro Asn Ser Pro Lys Asn Ser

1 5 10

<210> 88

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-3-39 HCDR2

<400> 88

Ile Ser Ser Ala Gly Gly Ile Thr

1 5

<210> 89

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-3-39 HCDR3

<400> 89

Asp Cys Pro Val Cys Gly Arg Ser Pro Pro Ala Ser Cys Tyr

1 5 10

<210> 90

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-3-54 HCDR1

<400> 90

Gly Phe Thr Phe Ser Asp His His

1 5

<210> 91

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-3-54 HCDR2

<400> 91

Ile Leu Thr Asn Gly Asp Thr

1 5

<210> 92

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> C277-3-54 HCDR3

<400> 92

Ala Arg Gly Val Gly Ile Asn Tyr Phe Tyr

1 5 10

<210> 93

<211> 641

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TfR1片段氨基酸序列

<400> 93

Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu

1 5 10 15

Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser

20 25 30

Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu

35 40 45

Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg

50 55 60

Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser

65 70 75 80

Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn

85 90 95

Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys

100 105 110

Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr

115 120 125

Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr

130 135 140

Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val

145 150 155 160

Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu

165 170 175

Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro

180 185 190

Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser

195 200 205

Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu

210 215 220

Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr

225 230 235 240

Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu

245 250 255

Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly

260 265 270

Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp His Tyr Val Val Val Gly Ala

275 280 285

Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr

290 295 300

Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met Phe Ser Asp Met Val Leu Lys

305 310 315 320

Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala

325 330 335

Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu

340 345 350

Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala

355 360 365

Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr

370 375 380

Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn Val Lys His Pro Val Thr Gly

385 390 395 400

Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu

405 410 415

Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro

420 425 430

Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly

435 440 445

Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu

450 455 460

Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu Val Ala Gly Gln Phe Val Ile

465 470 475 480

Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn

485 490 495

Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp

500 505 510

Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly

515 520 525

Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala

530 535 540

Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys Lys Leu Asn Asp Arg Val Met

545 550 555 560

Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser

565 570 575

Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser Gly Ser His Thr Leu Pro Ala

580 585 590

Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn

595 600 605

Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln

610 615 620

Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu

625 630 635 640

Phe

Claims

1.一种靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体，其包含重链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其特征在于，

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:8所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:11所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:14所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:17所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:20所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:23所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:62所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:64所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:14所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:67所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:68所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:69所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:71所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:72所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:73所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:74所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:75所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:76所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:77所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:78所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:79所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:80所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:81所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:82所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:83所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:84所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:85所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:86所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:87所示的纳米抗体或其功能活性变体；

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:88所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:89所示的纳米抗体或其功能活性变体；或，

所述纳米抗体为HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:90所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:91所示且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:92所示的纳米抗体或其功能活性变体；

2.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述重链可变区包含框架区FR1、FR2、FR3和FR4；

所述FR1如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:41所示；

所述FR2如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:46所示；

所述FR3如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:47所示；

所述FR4如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:48所示；

优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；或，

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；或者，

3.如权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体，或所述纳米抗体为由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。

4.一种重链抗体，其特征在于，所述重链抗体包含如权利要求1～3任一项所述的纳米抗体，所述重链抗体还包含重链恒定区CH2和/或CH3；优选地，所述重链恒定区源自人源抗体的重链恒定区。

5.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1～3任一项所述的靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体或如权利要求4所述的重链抗体。

6.一种重组表达载体，其特征在于，其包含如权利要求5所述的分离的核酸；

较佳地，所述重组表达载体的骨架为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体；

更佳地，所述质粒的骨架为pET28a。

7.一种转化体，其特征在于，其包含如权利要求5所述的分离的核酸或如权利要求6所述的重组表达载体；

较佳地，所述转化体的宿主细胞为原核细胞；

更佳地，所述原核细胞为大肠杆菌；

进一步更佳地，所述大肠杆菌为Escherichia coli BL21 Rosetta株。

8.一种重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白包含如权利要求1～3任一项所述的靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体或如权利要求4所述的重链抗体；

较佳地，所述重组融合蛋白还包含大分子药物；

更佳地，所述大分子药物为抗体。

9.如权利要求1～3任一项所述的靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体，如权利要求4所述的重链抗体，和/或如权利要求8所述的重组融合蛋白在制备递送穿越血脑屏障的药物中的应用；

优选地，所述药物为针对大脑疾病或中枢神经系统疾病的药物；

更优选地，所述中枢神经系统疾病为阿尔茨海默氏症、多发性硬化或黏多糖贮积症II型。

10.一种免疫检测或者测定转铁蛋白受体1的方法，其包括使用如权利要求1～3任一项所述的靶向转铁蛋白受体1的纳米抗体，如权利要求4所述的重链抗体，和/或如权利要求8所述的重组融合蛋白；

优选地，所述检测为非诊断和/或治疗目的的检测。