JPH06505867A - Ｌｐｓコアに対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＬＰＳコアに対するモノクローナル抗体本発明はグラム陰性細菌によりもたらさ れる感染病の予防、診断および処置に関し、より詳細にはグラム陰性細菌膜のリ ポ多糖類（ＬＰＳ；エンドトキシンとも呼ばれる）成分に対するモノクローナル 抗体（ＭＡｂ）を提供する。

腸内細菌は広範囲に存在するグラム陰性微生物の群であって、成る種の手術、抗 癌化学療法もしくは免疫抑制処置を受けた患者または各種の外傷、火傷もしくは 傷を受けた患者における重大かつしばしば致命的な感染をもたらす。病気の程度 は予備的、一時的および限られた細る重傷かつ生命に危機を及ぼすエンドトキシ ンアの症状（敗血症ショックとも呼ばれる）に至る範囲である。

重傷のグラム陰性袖菌症の約４２５．０００例が米国にて毎年発生し、約２５％ の全死亡率を伴う。これら感染の大多数は最も一般的な病原菌である大腸菌（イ ー・コリ）、次いでしばしばクレブシェラ・ニューモニアエ（Ｋｅｂｓｉｅｌｌ ｘ　ｐｎｅａｍｏｎｉａｅ）　、シュードモナス・エアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏ ａ＋＋＋ｎｘｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）　、プロテウス（Ｐｒｏｖｅｎｓ） 、エンテロバクタ−（Ｅｎｔｅ＋ｏｂｘｃｊｅ＋）およびセラチア（Ｓｅ＋ｒａ ｔｉａ）に起因する。グラム陰性細菌は全て、主成分としてリポ多糖類（Ｌ　Ｐ 　Ｓ）を含む特定種類の外膜を特徴とする。ＬＰＳは感染における重要な免疫学 的および生理病理学的役割を演じ、敗血症ショックの主たる原因である。

ＬＰＳ成分は種類毎に変化するが、一般に３種の構造領域：すなわち脂質部分が 外膜の外層に存在する脂質Ａ；オリゴ糖コア領域；および〇−特異性の外側領域 で構成されると第１図を参照して記載することができる。脂質Ａはほぼ全ての腸 内細菌において同じ基礎構造を有し、主たるエンドトキシン決定子である。コア 領域は細菌の属内で高度の類似性を示す。これは一般に限られた数の糖類で構成 される。内側コア領域はへプトースと２−ケト−３−デオキシ−オクトネート（ ＫＤｏ）残基で構成されるのに対し、外側コア領域はガラクトース、グルコース もしくはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基で構成され、これらは菌株に応じ 種々変化する。たとえば種々異なるイー・コリ菌株の外側コア構造Ｒ１〜Ｒ４を 第２図に示す。〇−特異性の外側領域（〇−特異性側鎖とも呼ばれる）は極めて 可変性であり、種類に特徴的な反復オリゴ糖単位で構成される。単一細胞の表面 におけるＬＰＳ分子は一定量のオリゴ糖単位を含まない。

〇−特異性側鎖の存在は、野生型細菌の培養にスムース特性を付与する。この理 由で、野生型細菌は一般にＯ−特異性側鎖を欠如したラフ突然変異体と対比して スムース細菌と称され、しばしばコア領域の１部およびその培養物はラフの特性 を示す。サルモネラからの種々異なる種類のラフ突然変異体は記号Ｒａ、Ｒｂ、 Ｒｅ、ＲｄおよびＲｅにより一般的に示される。第１図から見られるように、こ れら全ＣのＬＰＳは脂質Ａ構造を含むのに対し、Ｒａ突然変異体は完全なコア領 域を特徴とし、Ｒｂ突然変異体はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の不存在 を特徴とし、Ｒａ突然変異体はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基とガラクト ース残基との不存在を特徴とし、Ｒａ突然変異体は外側コアを構成する残基の不 存在を特徴とし、さらにＲｅ突然変異体は脂質Ａに結合した単一のＫＤＯ領域を 特徴とする。

ＬＰＳの毒性作用に対する処置は可能でないため、この種の感染を予防し或いは 抑制するための抗生物質療法に対する代案もしくは追加処置として免疫学的方法 に注目が集中している。現在の免疫療法は、慣用のポリクローナル抗血清および 高免疫血清を投与して、たとえば細菌細胞のオプソニン作用および食菌作用を増 大させることにより或いはＬＰＳの生物学的活性を中性化することにより、細菌 の愚作用に対する患者の自然防御作用を促進することを含む。しかしながら、抗 血清の効果はたとえば特定抗体の組成および力価など容易には基準化しえない多 数の因子に応じて変化する。

血清療法の限られた効能を解消するため、交差反応性ＭＡｂを使用することが提 案されている。交差反応性は、水平および垂直として説明しつる２種類が存在す る。垂直交差反応性とは、Ｍ　Ａ　ｂが〇−特異性側鎖の長さとは無関係に特定 細菌株のほぼ全てのスムースＬＰＳ分子と反応することを意味する。水平交差反 応性とは、ＭＡｂが異なるコア構造を有するＬＰＳと反応することを意味する。

これが必要である理由は、細菌症が実験的に診断された直後に数日間を要する病 原体の確認を待つことなく治療を開始せねばならないためである。

この種のＭＡｂは、大抵の腸内細菌が共有するＬＰＳ構造に位置する抗原決定子 、すなわち脂質Ａおよびコア領域を識別せねばならない。これらは周知のケーラ ー・アンド・ミルスタイン法によって得られ、この方法は特に一般にネズミをＬ ＰＳの内部抗原エピトープが抗体を生ぜしめるべく直ちに得られるようなイミュ ノゲンで免疫化することからなっている。適するイミュノゲンは腸内細菌の熱死 滅したラフ突然変異体、たとえばイー・コリの１部菌株を包含する。精製された ＬＰＳはイミュノゲンとして大して適していない。

細菌症を予防し或いは処置するのに有用であると予想されるＭＡｂは交差反応性 であるだけでなく、最も一般的な毒性細菌により生ずる感染に対しクロス−保護 性でなければならない。しかしながら、幾つかの科学文献、たとえばボラック等 、ジャーナル・インフエクシャス・ディシーズ（１９８９）、第１５９（２）巻 、第１６８頁には、上記慣用のイミュノゲンに対し発生した大多数の抗体は交差 反応が貧弱であって残念ながら感染を予防しないことが報告されている。ＭＡｂ はしばしば、スムースでなく寧ろラフのＬＰＳを含む結合実験に基づき反応性で あると記載されており、これらＭＡｂの保護性の欠如は、野生型のスムースＬＰ Ｓにおいて抗体が特異性であるエピトープが入手しえず、コア領域もしくはＯ− 特異性側鎖により妨げられるという事実に起因する。特に、ＬＰＳ分子の脂質Ａ 部分におけるエピトープを識別するＭＡｂは一般に有効でない。

今回、ＬＰＳ分子のコア領域におけるエピトープを識別する共に垂直および水平 の両交差反応性とクロス−保護性を有するモノクローナル抗体は、改変および改 良された免疫化およびスクリーニング過程によって得られることが判明した。こ の種のＭＡｂは最初にネズミ型で得られ、公知の組換ＤＮＡ技術によりキメラ型 （ネズミ可変領域、ヒト一定領域）またはヒューマナイズ型（ネズミ高可変領域 、ヒト骨格および一定領域）に変換することができる。

したがって本発明は、ＬＰＳ分子のコア領域におけるエピトープを識別すると共 に、異なるコア構造を有する少なくとも２種の異なるグラム陰性細菌株により生 ずるエンドトキセミアに対しクロス−保護性であるモノクローナル抗体を提供す る。

好ましくはＭＡｂは、イー・コリのＲｃココア造に既に存在すると共に完全コア にも存在するエピトープを識別する。

イー・コリにおいて、本発明のＭＡｂは好ましくは全ての一般的なスムース菌株 分離物と反応し、好ましくは全部で５種のコア型（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およ びに１２）のラフ突然変位菌株とも反応する。好ましくは、ＭＡｂは種々異なる サルモネラ菌株に対しても反応性である。

一般に単一種類のＬＰＳ　（一般に特定種類のＬＰＳを有する熱死滅した細菌） をイミュノゲンとして使用する従来技術に記載された免疫化法と対比し、本発明 のＭＡｂは免疫化すべき動物を複数種類のＬＰＳ分子に露呈する免疫化法により 産生させることができる。これは、物理的に混合した異なるＬＰＳ型のカクテル で免疫化するか或いは個々に異なるＬＰＳ型で順次に免疫化して行なうことがで きる。両者の場合、精製ＬＰＳ分子でなく熱死滅した細菌を用いるのが好適であ る。他の可能なイミュノゲンは熱以外の手段（たとえばホルムアルデヒド）によ り死滅させた細菌、および蛋白質キャリヤに結合したＬＰＳ分子を包含する。

免疫化すべき動物は好ましくはネズミであって、Ｂａ１ｂ−ｃ種とすることがで きる。しかしながら、種々異なる遺伝背景を有するネズミ、たとえばより広範な 免疫反応を示しうるニューシーラント・ブラックもしくはスイスウェブスタ一種 のネズミを使用するのが好適である。

イミュノゲンは静脈内または好ましくはたとえば足裏に皮下注射して投与するこ とができる。

第１の好適方法においてはネズミを種々異なる熱死滅した細菌の菌株、好ましく は完全コアを有するラフ菌株の単一カクテル、たとえばＲａイー・コリのＲ１、 Ｒ２、Ｒ３およびＲ４菌株の混合物で免疫化する。或いは、異なっても良い２種 もしくはそれ以上のこの種のカクテルを異なる場合に与えることもできる。たと えばイー・コリＲ２およびＲ３、並びにサルモネラ・ミネソタＲ６０の混合物を 注射し、次いで１週間後にイー・コリＲ１、Ｒ４および０１８ラフ菌株の混合物 を与え、次いで２種の注射をさらに１週間間隔で反復することができる。

第２の好適方法においては、ネズミを熱死滅した細菌の多数の異なるラフ菌株で 順次に免疫化し、１種のみの菌株を各１回で投与する。たとえばネズミをシュー ドモナスＰＡＣ６０５ラフ突然変異体で免疫化し、次いで１ケ月間隔にてイー・ コリＲ１、Ｒ２およびＲ３で免疫化することができる。

細胞融合をネズミ骨髄履細胞と免疫化された動物からの牌細胞との間で行なう前 に、好ましくは最初のスクリーニング工程を行なって、免疫化動物における免疫 反応の強度および複数性を動物の血清を試験して評価する。

強力な免疫反応を示す動物をブースター免疫化にかけて、これら強力反応の再免 疫化したネズミの牌細胞を細胞融合に用いて慣用のケーラー・ミルスタイン技術 によりハイブリドーマを作成する。好ましくはブースター免疫化は、たとえ主た る免疫化を第２の好適方法（順次の投与）により行ったとしても、異なるラフ型 イー・コリ菌株のカクテルによって行なう。

次いで、得られたハイブリドーマをこれらが産生ずる抗体の交差反応性につき下 記する標準ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法およびウェスタン・プロット法によりスクリーニン グする。

従来技術の方法と対比し、最初のスクリーニングは好ましくは異なるスムース型 およびラフ型ＬＰＳの一連の混合物を用いて行ない、広範囲のＬＰＳ分子と反応 するようなＭＡｂを選択する。このようにして、広範な交差反応性ＭＡｂを初期 のスクリーニング工程で既に同定することができる。たとえば各ハイブリドーマ 上澄液を、７種の異なるＬＰＳカクテルおよび比較を用いＥＬ　Ｉ　ＳＡ分析に て反応性につき次の方式で試験してスクリーニングすることができる： （１）スムース菌株：Ｅｃ０４＋０６＋０１６＋１８Ｋ （２）スムース菌株：Ｅｃ０１２＋０１５＋０８６（３）ラフ完全コア：ＥｃＲ １＋Ｒ４ （４）ラフ完全コア：　ＥｃＲ２＋ＥｃＲ３＋ＥｃＲ１２＋Ｓｍ　Ｒ６０ （５）Ｒｅコア：Ｅｃ　Ｊ５＋５ｔ８７８（６）　Ｒｃ　／　Ｒｄ　／　Ｒｅ　 Ｄア：Ｓｍ　Ｒ５＋３ｍ　Ｒ７＋Ｓｍ　Ｒ４＋Ｅｃ　Ｆ５１５＋Ｓｍ　Ｒ５９５ （７）脂質Ａ：Ｅｃ　Ｋ１２＆Ｓｍ　Ｒ５９５に由来（８）陰性比較：ＢＳＡ （Ｅｃ＝イー・コリ、Ｓｍ＝サルモネラ・ミネソタ、５ｔ＝Ｓ、チフィムリウム 、ＢＳＡ＝牛血清アルブミン）次いで、良好な交差反応性を有することが判明し たＭＡｂにつきざらにスクリーニングして、交差反応性であるだけでなくクロス −保護性であるものを選択する。これは次のインビトロでのビオアッセイを用い て行なうこ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）　、Ｉ　Ｌ−１およびＩ　Ｌ−６（インタロ ーフエロンーβ２とも呼ばれる）を包含する数種のモノキンは、グラム陰性敗血 症およびその付随エンドトキセミアに関連する多くの病理生理学的イベントを媒 介する。これらモノキンは、インビトロおよびインビボの両者でＬＰＳに応答し て大食細胞により分泌される。保護性の抗−ＬＰＳ抗体は、次の分析で示される ように大食細胞刺激を阻止する： ネズミ腹膜細胞は、蒸留水における０、３４Ｍ蔗糖での腹膜洗浄によって得られ る。腹膜細胞を０．２ｍｌの牛血溝フリー媒体に５×１０５細胞／ｍｌで接種し ［ＩＭＤＭ−ＡＴＬ、シュライニルおよびティース、イミュノロジカル・メソツ ズ、第１Ｉ巻、アカデミツク・プレス社（１９８１）、第２６３頁コ、次いで（ ｉ）ＬＰＳ。

たとえばイー・コリＲ１からのＬ　Ｐ　Ｓ　（０，０５ｎ　ｇ／ｍｌ）；イー・ コリＲ２（０，０５ｎｇ／ｍｌ）；イー・コリＲ３（０，０５ｎｇ／ｍｌ）およ びイー−］　ＩＪ　Ｒ４（０，０５ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下；並び ！、：（ｉｔ）最終濃度が０．０５ｎｇ　〜５０μｇ／ｍｌの範囲である精製さ れた内生酵素フリー抗体の存在下または不存在下で３７℃にて４時間培養する。

上澄液を回収し、次いで上澄液中に存在するＩ　Ｌ−６の量をＩＬ−６依存性ハ イブリドーマ細胞ライン８１３．２９　［アーデン等、ヨーロピアン・ジャーナ ル・イミュノロジー、１９８７、第１７巻、第１９１１頁］を用いて次のように 測定する： ８１３．２９細胞を血清フリー媒体に２．５Ｘ１０’細胞／ｍｌで接種し、ＩＬ −６の不存在下および培養上澄液の存在下もしくは不存在下で７２時間培養する 。培養物の１部（２００μｌ／穴１個）を平底面マイクロタイター板に分配する ８上澄液におけるＩ　Ｌ−６濃度を■Ｌ−６の標準曲線に対し計算する。

本明細書の目的で、ＭＡｂは上記分析にて５μｇ／ｍｌの濃度で試験した際に少 なくとも５０％のＩ　Ｌ−６分泌の減少を示せば所定のＬＰＳに対し保護性であ ると見なされ、精製ＬＰＳの濃度はラフＬＰＳにつき０．０５ｎ　ｇ　／　ｍ　 ｌであり、活性の低いスムース型については相応に高い。ＭＡｂは、異なるコア 構造を有する少なくとも２種のＬＰＳに対し保護性であればクロス−保護性であ る。好適なりロス−保護性ＭＡｂは、異なる細菌種類からのＬＰＳに対しクロス −保護性である。

本発明の好適ＭＡｂはＩｇＧアイソタイプである。

上記免疫化およびスクリーニング法を用い、異なる種類の数種のＬＰＳに対し交 差反応すると共に実質的なりロス−保護活性を示す多数の新規なネズミ抗−ＬＰ Ｓ抗体が見出され、さらにこれらモノクローナル抗体から誘導されると共に同じ 特性を有する他のＬＰＳ結合性分子を作成【うることが見出された。何故なら、 これらは結合特異性を決定する領域、すなわち高可変領域を共有するからである 。特に、本発明による４種の好適ネズミモノクローナル抗体を以下ＷＮＩ　２２ ２−５　（アイソタイプＩｇＧ２ａ）　、ＷＮｌ　５８−９　（Ｉ　ｇＧ２ｂ） 、Ｈｌ　６１−２　（ＩｇＧ１）および５Ｚ２７　１９．１６．０７　（ＩｇＧ ２ａ）と称する。これらのうち、最初の２種が特に好適である。

天然の免疫グロブリンもしくは抗体は、２個の同一重鎖と２個の同一軽鎖とで構 成されて各上側アームの末端に抗原結合性部位を有する一般にＹ字型の分子から なっている。残余の構造（特にＹの幹部）は、免疫グロブリンに関連したイフエ クタ機能を媒介する。種類ＩｇＧの抗体の一般的構造を第３Ａ図に図示する。重 鎮および軽鎖の両者は可変ドメインと一定部分とからなっている。

抗原結合部位は軽鎖の可変ドメイン（Ｖ、）と連携した重鎮の可変ドメイン（Ｖ Ｈ）で構成される。重鎮および軽鎖の可変ドメインは、第３Ｂ図に示した同じ一 般的構造を有する。

より詳細には、抗体の抗原結合特性は、高可変（ｈｙｐｅｒマｚ＋１ａｂｌｅ　 ）領域もしくは相補的決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる重鎮および軽鎖の可変ドメ インにおける３種の特定領域によって実質的に決定される。第３Ｂ図に示したよ うに、これら３種の高可変領域は４種の骨格領域（Ｆ　Ｒ）と交互に存在し、そ の配列は相対的に保持されて結合には直接関与しない。ＣＤＲはループを形成す ると共に、主としてβ−シート編成を有する骨格領域により近接保持される。重 鎮のＣＤＲは関連する軽鎖のＣＤＲと一緒に抗体分子の２種の抗原結合部位のそ れぞれを実質的に構成する。

何がＦＲもしくはＣＤ　Ｒ領域を構成するかに関する決定は一般に、同じ動物で 生じた多数の抗体のアミノ酸配列を比較して行なわれる。ＣＤＲおよびＦＲ領領 域同定する一般的規則を第１表に示す。

さらに、結合エネルギーに対し軽鎖可変ドメインによってもたらされる寄与は、 関連重鎮可変ドメインによるものと対比して低いことが最近判明し、さらに分離 した重鎮可変ドメインはそれ自身の抗原結合活性を有することも見出された。現 在では一般に単一ドメイン抗体と称するこの種の分子は、関連Ｖ、ドメインの不 存在下でも抗原結合部位を有すると見なすことができる。

上記に鑑み本発明：よ、配列内に高可変領域ｈｃＤＲ１、ｈＣＤＲ２およびｈＣ ＤＲ３を含む少なくとも１つのドメインから゛なる少なくとも１個の抗原結合部 位を有するＬＰＳ結合性分子およびその直接的均等物を提供しくドメインｈ２２ ２−５およびｈ５８−９）、前記ｈＣＤＲ１はアミノ酸配列Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔ ｙｒ　ＭｅｔＴｈ　ｒｔ有し；前記ｈＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｌｅｕ１１ｅ　Ａ ｒｇ　Ａｓｎ　Ｗ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　ＧｌｙＡｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　 Ｔｙｒ　５ｅｒＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｘ（ここでＷはＬｙｓもしくはＴｙｒ であり、ＸはＬｙｓもしくはＡｒｇである）を有し；前記ｈＣＤＲ３はアミノ酸 配列Ｇｌｎ　ＧｌｙＡｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＡｓｐＴｙｒを 有する。

ＷがＬｙｓであり、ＸがＬｙｓである高可変領域ｈｃＤＲ２（ｈ２２２−５）ま たはＷがＴｙｒでありかツＸがＡｒｇである高可変領域（ｈ５８−９）が好適で ある。

ＷがＬ　ｙ　ｓであり、ＷがＬｙｓである高可変領域ｈＣＤＲ２がより好適であ る。

本発明の第１面において、ＬＰＳ結合性分子は単一ドメインからなる抗原結合部 位を含む。

本発明の第２面において、ＬＰＳ結合性分子は＝（ａ）上記の高可変領域ｈｃＤ ＲＩ、ｈＣＤＲ２およびｈＣＤＲ３を配列内に含む第１ドメインと、（ｂ）高可 変領域ＩＣＤＲＩ、ｌＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を配列内に含む第２ドメイン（ ドメイン１２２２−５および１５８−９　［１２２５−５もしくは１５８−９は 軽鎖２２５−５もしくは軽鎖５８−９を示す］）と からなる少なくとも１個の抗原結合部位を含み、前記ＩＣＤＲＩはアミノ酸配列 Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｙ　ＺＡｓｎ　ｌｉｅ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　ＬｅｕＳｅ ｒ（ここでＹはＳｅｔもしくはＡｒｇであり、ＺはＧｉｎもしくはＬｅｕである ）を有し；前記ｌＣＤＲ２はアミノ酸配列Ｌｙｓ　Ａｌａ　５ｅｒＡｓｎ　Ｌｅ ｕ　Ｈ４ｓ　Ｔｈｒを有し；前記ｌＣＤＲ３はアミノ酸配列Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇ ｌｙＧｉｎ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｈｒを有する。さらにその直 接的均等物をも含む。

ＹがＳｅｔであり、ＺがＧｉｎである高可変領域１ｃＤＲＩ　（１２２２−５） またはＹがＡｒｇであり、ＺがＬｅｕである高可変領域（１５８−９）が好適で ある。

ＹがＳｅｔであり、２がＧｉｎである高可変領域ＬＣＤＲ１がより好適である。

特記しない限り以下ポリペプチド鎖は全てＮ−末端で開始すると共にＣ−末端に て終了するアミノ酸配列を有するものとして記載する。

抗原結合部位が第１および第２の両ドメインを含む場合、これらは同じポリペプ チド分子に位置することができ、或いは好ましくは各ドメインは異なる連鎖に存 在してもよく、第１ドメインは免疫グロブリン重鎮もしくはその断片の１部であ り、第２ドメインは免疫グロブリン軽鎖もしくはその断片の１部である。

ｒＬＰＳ結合性分子」と言う用語は、ＬＰＳに結合しうる任意の分子を意味する 。結合反応は、たとえば精製ＬＰＳもしくは熱処理細菌を用いるＥＬ　Ｉ　ＳＡ または精製ＬＰＳを用いるウェスタン・プロットのような標準法（定性分析）に よって示すことができ、無関係の原料（たとえば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）） の抗原を用いる陰性比較試験と対比する。上記分析の完全な説明につき下記に示 す。

１、ＥＬＩＳＡにおける精製ＬＰＳに対する結合の検出マイクロ測定板（平底面 ；マイクロ試験ＩＩＩ可撓性分析板；ベクトン・ディキンソン社、ファルコン３ ９１２）を被覆用緩衝液（ジエチレンバルビッール酸−Ｎａ塩　３０ｍＭ、酢酸 ナトリウム　３０ｍＭ、ＮａＣ１１１６ｍＭ　；　ｐＨ４，５）における２μｇ ／ｍｌの精製ＬＰＳで被覆する。５０μｌのＬＰＳ溶液を各穴に分配する。無関 係の蛋白（ＢＳＡＳＰＢＳ中２％（ｐ　Ｈ７゜２）１０．０２％ナトリウムアジ ド）を用いて非特異性結合を決定する。これらプレートを３７℃にて１時間培養 し、次いで加湿室内で４℃てに１晩培養する。プレートを洗浄溶液、すなわち燐 酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７，２と０．０５％ｖ　／　ｖのツイーン２０と ０．０２％のナトリウムアジドとで４回洗浄する。プレートを２５０μＩ／穴１ 個のＰＢＳ中２％ＢＳＡ／ナトリウムアジド０．０２％により室温にて３時間ブ ロックする。これらプレートを再び洗浄する。

抗体溶液をＰ　Ｂ　Ｓ／Ｂ　Ｓ　Ａ　２％／ナトリウムアジド０゜０２％中で種 々の希釈率、たとえば１μｇ／ｍｌ、１１００ｎ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび ｌｎｇ／ｍｌで作成する。５０μｌのこれら溶液を予備被覆されたプレートの穴 に分配する。培養を室温にて１晩行なう。４回の洗浄後、穴１個当り５０μｌの 正確な種類の特異性を有するビオチニル化された親和性の精製ヤギ抗−ネズミＩ ｇＧもしくはＩｇＭ、たとえばＷＮＩ　２２２−５については抗−ミズミＩｇＧ ２ａおよびＷＮＩ　５８−９については抗−ネズミ−ＩｇＧ２ｂまたは各種のＷ ＮＩ２２２”　（ｈｕｌｇＭ）　もしくはＷＮ　１　２２２　５　（ｈｌｌｌ、 に１）にっては抗−ヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＭ（ＰＢＳ２％ＢＳＡにおける最 終希釈率１／１０．ｏｏｏ：サウザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ社） を添加する。

培養を室温にて４時間行なう。４回洗浄した後、穴１個当り５０μｌのストレプ トアビジンアルカリホスファターゼ結合体（ジャクソン・イミュノ・リサーチ・ ラボラドリース社；最終希釈率ＰＢＳ中１／１０，０００．２％Ｂ　Ｓ　Ａ　） を添加し、培養を室温にて１時間行なう。４回洗浄した後、穴１個当り１００μ ｌのジェタノールアミン緩衝液（ジェタノールアミンＩＭＳＭｇＣ１−６８２０ ０，５ｍＭ５ｐＨ９，８）にて１　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌに希釈されたパラニトロ フェノールホスフェート（ＰＮＰＰ）を添加する。１時間の後、テイターテ・マ ルチスカン・ＥＬＩＳＡリーダー（ＭＣＣ／３４０、フローラプス社）を用いて ４０５ｎｍにて吸光度を測定する。

有利には、用いる精製ＬＰＳをスムース完全コア、ＲｂもしくはＲｃ　ＬＰＳか ら選択する。スムースＬＰＳの例はイー・コリ　０１１１Ｂ４　（ジフコ社）、 イー・コリ　０１２７Ｂ８　（ジフコ社）、イー・コリ　０１２８Ｂ１２　（ジ フコ社）、サルモネラ・チフィムリウムＢＯａｇＯ：４．５．１２　（ＳＨ４８ ０９）（ビオ−カルブ社）から抽出されたＬＰＳである。適する完全コアＬＰＳ ＳＲｂ　ＬＰＳおよびＲｃ　ＬＰＳはそれぞれＳ。

ミネソタ（リスト社）およびＳ、チフィムリウム５Ｌ６８４（シグマ社）から得 られる。

第１ＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＣおよびＩＩＤ表は、それぞれグラム陰性細菌の異なる 菌株から精製されたＬＰＳに対する抗体ＷＮＩ　２２２−５、ＷＮｌ　５８−９ 、Ｈｌ　６１−２および５Ｚ２７　１９．１６．０７の結合を表として示す。

２、熱死滅細菌に対する結合の検出 予備被覆したプレートを上記１に記載したと同様に、精製ＬＰＳでな（熱死滅細 菌（０，５Ｘ１０８細胞／ｍｌ）を用いて作成する。結合反応を上記１に記載し たように試験すると共に検出する。

有利には、細菌はスムース野生型細菌もしくはラフＲａ５ＲｂもしくはＲｃ突然 変異体である。

第１　ＩＩＡ、Ｉ　ｌｌＢ５　ｌｌＩＣおよびｌｌＩＤ表は、各グラム陰性菌株 の熱死滅細菌に対する抗体ＷＮＩ　２２２−５、ＷＮｌ　５８−９、Ｈｌ　６１ −２および５２２７　１９．１６．０７の結合をそれぞれ表として示す。

第１Ｉ表および第１ＩＩ表に示した細菌は最も一般的な臨床分離菌である。細菌 および／または対応ＬＰＳは市販されており、或いは１．ポクストン博士、ニシ ンバラ大学、細菌学部、スコツトランドまたはＨ，ブレード博士、フオルシュン クスインスチチュート・ポルスチル、ポルスチル、西ドイツ国から要求に応じ入 手できる。

第１Ｉ表および第１ＩＩ表から見られるように、本発明の抗体により識別するの に要する最小コア構造はＲｃ１０μｌの１　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌにおけるＬＰＳ 溶液を、１％（Ｗ　／　ｖ　）のデオキシコリン酸ナトリウム（ＤＯＣ）と２０ ％（Ｗ／Ｖ）のグリセリンと０．００１％のブロモフェノールブルーとを含有す る同容積の０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６，８）と混合し、次いで音波 処理する。作成した試料を電気泳動ゲル（４％積層ゲル；１４％操作ゲル）に充 填する。用いる電気泳動系は改変レムリ系（ＤＯＣ−ＰＡＧＥ　；コム口等、ケ ミカル・ファーマスーチカル・ブレチン（１９８８）、第３６巻、第１２１８頁 ）であって、ミニ・プロチアンＩＩシュアル・スラブ・セル装置（ビオラド・ラ ボラドリース社）を用いる。これら試料を、指示薬が分離ゲル中に侵入するまで １８ｍＡの電流で操作する。次いで電流を２５ｍＡまで増大させる。

ゲルのプロツチングを、気孔寸法０．４５μｍのニトロセルロース膜（ビオラド ・ラボラドリース社）および移動電気泳動セル（ミニ・トランスプロット・電気 泳動セル装置、ビオラド・ラボラドリース社）を用い６０Ｖにて２０分間行なう 。プロットをトリス緩衝塩水（ＴＢＳ：２０ｎＭトリスーＨＣｌ、０．１ｍＭ　 ＮａＣ１；ｐＨ７，５）１％ＢＳＡに室温にて１時間浸漬する。免疫プロットを 、ＴＴＢＳ　（ＴＢＳ、０．０５％ツイーン物を用い室温にて２時間にわたり展 開させる。

プロットをＴＴＢＳで２回洗浄し、さらに４５分間にわたり室温にてビオチニル 化ヤギ抗−ネズミＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ｂ抗体（サウザン・バイオテクノ ロジー・アソシエーツ社）と共にＴＴＢＳ／１％ＢＳＡにおける１／１０．００ ０の最終希釈率で培養する。２回洗浄した後、ＴＴＢＳ／ＢＳＡ　１％にて１／ １０，０００の希釈率で用いるストレプトアビジンアルカリホスファターゼ結合 体（ジャクソンーイミュノ・リサーチ・ラボラリドース社）を添加する。培養を 室温にて４５分間行なう。３回の洗浄’！、ＢＣＩ　Ｐ／ＮＢＴアルカリホスフ ァターゼ発色溶液を製造業者（ビオラド・ラボラドリース社）により指示された ように添加する。並行して、ゲルを４０％エタノールと５％酢酸とを含有する溶 液で１晩温置して固定させ、ツサイおよびフラッシュの方法［アニュアル・バイ オケミストリー（１９８２）、第１１９巻、第１１５頁］にしたがって銀染色す る。

この分析にて、本発明の抗体はスムース細菌またはラフ突然変異体のいずれかか ら抽出されたＬＰＳに対し結合反応を示す。ＷＮＩ　２２２−５、ＷＮｌ　５８ −９、Ｈｌ　６１−２および５Ｚ２７　１９．１６．０７に関する特定の実験を 第４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄ図にそれぞれ示す。スムース細菌から抽出された ＬＰＳ内容物を電気泳動により、〇−特異性側鎖の寸法に応じ、異なる分子量を 有するＬＰＳ分子に対応したバンドに分離させる。これらＬＰＳ分子は、〇−特 異性側鎖を持たないＬＰＳ分子から側鎖中に４０個もしくはそれ以上の単位を有 するＬＰＳ分子に至る範囲である。本発明の抗体はラフ反復単位と反応し、さら に〇−側鎖反復単位を有するこれら全てのＬＰＳ分子と反応する。このことは、 本発明のＬＰＳ結合性分子が特異性であるエピトープがＯ−特異性側鎖により妨 げられないことを示す。したがって、スムース細菌のＬＰＳ分子の大部分は本発 明のＬＰＳ結合性分子と反応することができる。

抗原結合性分子の例は免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、たとえばＢ−細胞もしくは ハイブリドーマにより産生される抗体およびキメラもしくはヒューマナイズ抗体 もしくはその断片、たとえばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、並びに単一鎖も しくは単一ドメイン抗体を包含する。

免疫グロブリン分子は異なるアイソタイプとすることができ、たとえばＩｇＧＳ ＩｇＭ、ＩｇＡもしくはＩｇＥ抗体であり、そのうちＩｇＧが好適である。

単一鎖抗体は、一般に１０〜３０個のアミノ酸（好ましくは１５〜２５個のアミ ノ酸）よりなるペプチドリンカにより共有結合した１ｇ分子の抗体重鎮および軽 鎖の可変ドメインで構成される。したがって、この種の構造は重鎮および軽鎖の 一定部分を含まず、小さいペプチドスペーサは全−足部分よりも抗原性が低いと 思われる。

「キメラ抗体」という用語は、重鎮もしくは軽鎖またはその両者の一定領域がヒ ト由来である一方、重鎮および軽鎖の両者の可変ドメインが非ヒト（たとえばネ ズミ）由来である抗体を意味する。「ヒューマナイズ抗体」という用語は、高可 変領域が非ヒト（たとえばネズミ）由来である一方、免疫グロブリン分子の他の 全ての部分、すなわち可変ドメインの一定領域および高度に保持された骨格領域 がヒト由来である抗体を意味する。

高可変領域は任意の種類の骨格領域、好ましくはネズミもしくはヒト由来の骨格 領域と結合することができる。

適する骨格領域は、文献［「免疫学的興味のある蛋白の配列Ｊ、Ｅ、Ａ、カバト 等、ＵＳデパートメント・オブ・ヘルスφアンド嗜ヒユーマンーサービス、パブ リック・ヘルス−サービス、ナショナル働インスチチュートφオブ・ヘルスコに 記載されている。しかしながら、好適な骨格部域はＷＮＩ　２２２−５またはＷ Ｎｌ　５８−９の領域であって、ＷＮＩ　２２２−５の領域が最も好適である。

配列同定（ＳｅＨｅｎｅｅ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ　）　Ｎ　ｏ　、１はＷＮＩ ２２２−５における重鎮可変ドメインの完全アミノ酸配列を示し、このドメイン はＮ−末端からの配列において上記したようなアミノ酸配列を有する高可変領域 ｈＣＤＲ１、ｈＣＤＲ２およびｈＣＤＲ３が分散した骨格領域ｈＦＤＲ１、ｈＦ ＤＲ２、ｈＦＤＲ３およびｈＦＤＲ４で構成される。ＷＮＩ　２２２−５のｈＣ ＤＲ２において、ＷはＬｙｓを示し、ＸもＬｙｓを示す。配列同定Ｎｏ、２はＷ Ｎｌ　５８−９における重鎮可変ドメインの完全アミノ酸配列を示し、このドメ インはＮ−末端からの配列において同様に上記したアミノ酸配列を有する高可変 領域ｈｃＤＲ１、ｈＣＤＲ２およびｈＣＤＲ３が分散した骨格領域ｈＦＲ１、ｈ ＦＲ２、ｈＦＲ３おｒ　ｒ　ｒ よびｈＦＲ４で構成される。ＷＮＩ　５８−９のｈｃ「 ＤＲ２において、ＷｔｔＴｙｒを示し、ＸはＡｒｇを示す。

ＦＲの後の記号ｒは、記号のないアミノ酸配列とほぼ同一のアミノ酸配列を示す 。記号を有する配列は、記号のない配列と対比して少なくとも１個の置換アミノ 酸を含む。

配列同定Ｎｏ、３はＷＮＩ　２２２−５における軽鎖可変ドメインの完全アミノ 酸配列を示し、このドメインは上記したようなアミノ酸配列を有する高可変領域 ＩＣＤＲＩ、ｌＣＤＲ２およびＩ　ＣＤＲ３が分散した骨格領域ＩＦＲ１、Ｉ　 ＦＲ２、ＩＦＲ３およびＩＦＲ４の配列で構成される。ＷＮＩ　２２２−５のｌ ＣＤＲ１において、ＹはＳｅｔを示し、ＺはＧｌｎを示す。配列同定Ｎｏ、４は ＷＮｌ　５８−９における軽鎖可変ドメインの完全アミノ酸配列を示し、これは 上記したと同様なアミノ酸配列を有する高可変領域ｌＣＤＲ１、ｌＣＤＲ２およ びｌＣＤＲ３が分散した骨格領域ＩＦＲＩ　、ＩＦＲ２、ＩＦＲ３ｒおよびＩＦ Ｒ４，の配列で構成される。

「 ＷＮｌ　５８−９のＩＣＤＲＩにおいてＹはＡｒｇを示し、ＺはＬｅｕを示す。

好適な重鎖骨格はＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、１に示したようなｈＦＲｌ、ｈＦＲ２、 ｈＦＲ３およびｈＦＲ４であり、好適な軽鎖骨格はＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、３に示 したしたがって本発明は、さらにＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、１またはＮｏ、２に示し たと実質的に同じアミノ酸配列を有するドメイン（位置１におけるアミノ酸から 出発すると共に位置１２０におけるアミノ酸で終了する）からなる或いは上記第 １ドメインとＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、３またはＮｏ、４に示したと実質的に同一の アミノ酸配列（位置１におけるアミノ酸から出発し、位置１０７におけるアミノ 酸で終了する）を有する第２ドメインとからなる少なくとも１個の抗原結合部位 を含むＬＰＳ結合性分子を提供する。

毒性抗原に対し発生するモノクローナル抗体は必然的に非ヒト系、たとえばネズ ミにて生ずる。この直接的な結果として、ヒトに投与した際にハイブリドーマに より産生される異種抗体は異種免疫グロブリンの一定部分により本質的に媒介さ れる望ましくない免疫反応を示す。

これは、明らかにこの種の抗体を長期間にわたり投与しえないので抗体の使用を 制限する。したがって、ヒトに投与した際に恐らく実質的な同種反応を示すと思 われる単一本鎖抗体またはキメラもしくはヒューマナイズモノクローナル抗体を 使用するのが特に好適である。

上記、に鑑み、本発明の一層好適なＬＰＳ結合性分子は、少なくとも： （ａ）（ｉ）配列内にＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、１もしくはＮｏ、２に示された高可 変領域ｈｃＤＲ１、ｈＣＤＲ２およびｈＣＤＲ３を含む可変ドメインおよび（ｉ 　ｉ）ヒト重鎮の一定部分もしくはその断片からなる１つの免疫グロブリン重鎮 もしくはその断片と、 （ｂ）　（ｉ）配列内にＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、３もしくはＮ０９４に示した高可 変領域ＩＣＤＲＩ、Ｉ　ＣＤＲ２および１ｃＤＲ３を含む可変ドメイン、および （ｉ　ｉ）ヒト軽鎖の一定部分もしくはその断片からなる１つの免疫グロブリン 軽鎖もしくはその断片とで構成されるキメラ抗−ＬＰＳ抗体、およびその直接的 な均等物から選択される。

或いは本発明のＬＰＳ結合性分子は、 （ａ）配列内にＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、１もしくはＮｏ。

２に示した高可変領域ｈｃＤＲ１、ｈＣＤＲ２およびｈＣＤＲ３を含む第１ドメ インと、 （ｂ）配列内にＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、３もしくはＮｏ。

４に示した高可変領域ｌＣＤＲ１、Ｉ　ＣＤＲ２およびｌＣＤＲ３を含む第２ド メインと、 （Ｃ）第１ドメインのＮ−末端および第２ドメインのＣ−末端に対し或いは第１ ドメインのＣ−末端および第２ドメインのＮ−末端に対し結合したベフチドリン カーと からなる抗原結合部位を含む単一鎖結合性分子、およびその直接的均等物から選 択することができる。

周知のように、１種もしくは数種のアミノ酸の欠失、付加もしくは置換のような アミノ酸配列における僅かな変化も、実質的に同一の性質を有する元蛋白の同型 をもたらしうる。たとえば「その直接的均等物」という用語は、 （ｉ）全体としての高可変領域がＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ。

１もしくはＮ００２に示した高可変領域ｈＣＤＲ１、ｈＣＤＲ２およびｈＣＤＲ ３と少なくとも８０％相同、好ましくは少なくとも９０％相同、より好ましくは 少なくとも９５％相同であり、かつ （ｉｔ）分子Ｘと同一の骨格領域を有するがＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、ＬもしくはＮ Ｏ１２に示したと同一の高可変領域ｈｃＤＲ１、ｈＣＤＲ２およびｈＣＤＲ３を 有する比較分子とほぼ同程度にＬＰＳ結合しつる単一ドメインＬＰＳ結合性分子 （分子Ｘ）、または（ｉ）全体としての高可変領域がＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ。

１、Ｎ００２、ＮＯ６３およびＮ００４に示した高可変領域ｈｃＤＲ１、ｈＣＤ Ｒ２、ｈＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ｌＣＤＲ２およびｌＣＤＲ３に対し少なくとも ８０％相同、好ましくは９０％相同、より好ましくは少なくとも９５％相同であ り、かつ （ｉｉ）分子Ｘ′と同一の骨格領域および一定部分を有するがＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎ ｏ、１、Ｎ００２、Ｎ００３およびＮｏ、４に示したと同一の高可変領域ｈ　Ｃ ＤＲ１、ｈＣＤＲ２、ｈＣＤＲ３、Ｉ　ＣＤＲ１、Ｉ　ＣＤＲ２およびｌＣＤＲ ３を有する比較分子とほぼ同程度にＬＰＳに結合しうる 結合部位１個当り少なくとも２個のドメインを有するＬＰＳ結合性分子（分子Ｘ ′）のいずれかを意味する。

１個のＬＰＳ結合性分子は、２個の分子が異なるＬＰＳ分子（たとえばイー・コ リＪ５から、およびサルモネラＲａ６０からのＬＰＳ）に対する競合ＥＬ　Ｉ　 ＳＡ結合分析において互いに効果的に競合することが示されれば、或いは２個の 分子の結合親和性がそれぞれの場合１００以下、好ましくは１０以下のファクタ ーで互いに相違すれば、はぼ同程度にＬＰＳに対し結合すると考えることができ る。

最も好ましくはキメラ抗−ＬＰＳ抗体は、少なくとも：（ａ）Ｓｅｑ、Ｉｄ、Ｎ ｏ、１に示したと実質的に同じアミノ酸配列（位置１のアミノ酸から出発すると 共に位置１２０のアミノ酸で終了する）を有する可変ドメインとヒト重鎖の一定 部分とからなる１つの重鎖；および （ｂ）Ｓｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、３に示したと実質的に同じアミノ酸配列（位置１の アミノ酸から出発すると共に位置１０７のアミノ酸で終了する）を有する可変ド メインとヒト軽鎖の一定部分とからなる１つの軽鎖で構成される。

ヒト重鎮の一定部分はγ　、γ２、γ３、γ４、μ、■ α　、α　、δもしくはε型、好ましくはγ型、より好ましくはγ１型とじつる のに対し、ヒト軽鎖の一定部分はにもしくはλ型、好ましくはに型とすることが できる。

これら全ての一定部分のアミノ酸配列はカバト等（上記）に示されている。

本発明のＬＰＳ結合性分子の結合体（たとえば酵素もしくは毒素結合体）も本発 明の範囲に包含され、さらに放射性同位元素もしくは蛍光標識で標識されたＬＰ Ｓ結合性分子も含まれる。

本発明のＬＰＳ結合性分子は、組換ＤＮＡ技術により産生させることができる。

この点に関し、結合性分子をコードする１種もしくはそれ以上のＤＮＡ分子を作 成し、適する制御配列の下に置き、次いで発現に適する宿主生物に移行させねば ならない。

したがって極めて一般的に、 （＋）本発明の単一ドメインＬＰＳ結合性分子、本発明の単一鎖ＬＰＳ結合性分 子、本発明のＬＰＳ結合性分子の重鎮もしくは軽鎖またはその断片をコードする ＤＮＡ分子、並びに （ｉｉ）組換手段により本発明のＬＰＳ結合性分子を産生させるための本発明に よるＤＮＡ分子の使用が提供される。

従来技術にしたがい、当業者はここに示した情報（すなわち高可変領域のアミノ 酸配列およびこれらをコードするＤＮＡ配列）が与えられれば、本発明のＤＮＡ 分子を合成することができる。可変ドメイン遺伝子を作成する方法はたとえばＥ ＰＡ　２３９　４００号に記載されており、簡単に要約すれば次の通りである： 何らかの特異性を有するＭＡｂの可変ドメインをコードする遺伝子をクローン化 させる。骨格領域および高可変領域をコードするＤＮＡセグメントを決定すると 共に、高可変領域をコードするＤＮＡセグメントを除去して、骨格領域をコード するＤＮＡセグメントを接合部にて適する制限部位と融合させる。Ｓｅｑ、Ｉｄ 、Ｎｏ、１、Ｎ００２、Ｎ０１３もしくはＮＯ３４に示した配列にしたがい、Ｄ ＮＡ合成により二本鎖合成ＣＤＲカセットを作成する。

これらカセットに付着性末端を与えて、骨格の結合部位にて接合しつるようにす る。免疫グロブリン可変ドメインをコードするＤＮＡを得る方法を第５図に示す 。

さらに、本発明のＭＡｂをコードするＤＮＡ構成物を得るには生産性ハイブリド ーマ細胞ラインからｍＲＮＡに到達する必要はない。たとえばＰＣＴ出願ＷＯ９ Ｑ１０７８６１号は、遺伝子のヌクレオチド配列に関する上記情報のみを示せ： ｆ組換ＤＮＡ技術によるＭＡｂの産生につき充分な指針を与える。この方法は多 数のオリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ法によるその拡大、および所望のＤＮＡ 配列を与えるためのその処理を含む。

適するプロモータと重鎮および軽鎖−足部分をコードする遺伝子とからなる発現 ベクターは一般的に入手できる。たとえば本発明のＤＮＡ分子が作成されれば、 これを適する発現ベクターに便利に移行させることができる。

単一鎖抗体をコードするＤＮＡ分子も、たとえばＷ２Ｂ　８／１６４９号に記載 されたような標準法により作成することができる。

上記に鑑み、ハイブリドーマにより自然に分泌されるネズミＭＡｂは好適種類の ＭＡｂでないため、ＷＮＩ２２２−５もしくはＷＮｌ　５８−９を産生ずるハイ ブリドーマにつき寄託されていないが本出願はこの発明を当業者により実施しう るよう充分明瞭かつ完全に開示していると考える。

本発明の特定具体例において、ＬＰＳ結合性分子を産生させる組換手段は下記す る第１および第２ＤＮＡ構成物を包含する。

第１　ＤＮＡ構成物は重鎮もしくはその断片をコードすると共に、 （ａ）交互の骨格領域とＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、１もしくはＮ０９２に示したアミ ノ酸配列のｈｃＤＲｌ、ｈｃＤＲ２およびｈＣＤＲ３を配列内に有する高可変領 域とからなる可変ドメインをコードする第１部分（この第１部分は可変ドメイン の第１アミノ酸をコードするコドンから始まりかつ可変ドメインの最終アミノ酸 をコードするコドンで終了する）、および（ｂ）重鎮の一定部分の第１アミノ酸 をコードするコドンで開始すると共に一定部分もしくはその断片の最終アミノ酸 をコードするコドンに続くナンセンスコドンで終了する重鎮−窓部分もしくはそ の断片をコードする第２部分 で構成される。

好ましくは、この第１部分は、位置１におけるアミノ酸で開始すると共に位置１ ２０のアミノ酸で終了するＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、１もしくはＮＯ１２に示したア ミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインをコードする。

より好ましくは第１部分は、位置１におけるヌクレオチドで開始すると共に位置 ３６１のヌクレオチドで終了するするＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、１もしくはＮｏ、２ に示したヌクレオチド配列を有する。さらに好ましくは第２部分はヒト重鎮の一 定部分、より好ましくはヒトγ１鎖の一定部分をコードする。この第２部分はゲ ノム由来のＤＮ断片（イントロンを含む）またはｃＤＮＡ断片（イントロンを含 まない）とすることができる。配列同定ＮＯ６１の配列が配列同定Ｎ００２の配 列よりも好適である。

第２ＤＮＡ構成物は軽鎖もしくはその断片をコードすると共に、 （ａ）交互の骨格領域とアミノ酸配列がＳｅｑ、Ｉｄ。

Ｎ００３もしくはＮｏ、４に示されたｌＣＤＲ１、ｌＣＤＲ２およびｌＣＤＲ３ を配列内に有する高可変領域とからなる可変ドメインをコードする第１部分（こ の第１部分は可変ドメインの第１アミノ酸をコードするコドンで開始すると共に 可変ドメインの最終アミノ酸をコードするコドンで終了する）、および（ｂ）軽 鎖の一定部分の第１アミノ酸をコードするコドンで開始すると共に一定部分もし くはその断片の最終アミノ酸をコードするコドンに続くナンセンスコドンる第２ 部分 で構成される。

好ましくは、この第１部分は、位置１におけるアミノ酸で開始すると共に位置１ ０７のアミノ酸で終了するＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、３もしくはＮ００４に示したア ミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインをコードする。

より好ましくは第１部分は、位置１のヌクレオチドで開始すると共に位置３３６ のヌクレオチドで終了するＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、３もしくはＮｏ４に示したヌク レオチド配列を有する。さらに好ましくは、第２部分はヒト軽鎖の一定部分、よ り好ましくはヒトに鎖の一定部分をコードする。

第１および第２ＤＮＡ構成物において、第１および第２部分は好ましくはイント ロンによって分離される。第１部分と第２部分との間に位置するイントロンには 、好ましくはエンハンサが挿入される。この遺伝子要素（これは転写されるが翻 訳されない）の存在が第２部分の効率的な転写に必要でちる。より好ましくは、 第１および第２ＤＮＡ構成物は重鎮遺伝子のエンハンサを含む。

第１もしくは第２ＤＮＡ構成物は有利には、第１部分の上流に位置すると共にリ ーダーペプチドをコードする第３部分を含む。このペプチドは宿主生物による連 鎖の分泌に必要であり、これら連鎖は宿主生物により発現され、次いで除去され る。好ましくは、第１ＤＮＡ構成物の第３部分は重鎮のリーダーペプチドをコー ドする。さらに、好ましくは第２ＤＮＡ構成物の第３部分は軽鎖のリーダーペプ チドをコードする。適するリーダーペプチドはカバト等（上記）に示されている 。１ｇ分子の重鎮および軽鎖をコードする遺伝子の構造を第３Ａ図に示す。

各ＤＮＡ構成物は適する制御配列の制御下に置かれ、特に適するプロモータの制 御下に置かれる。ＤＮＡ構成物が発現のため移される宿主生物に適する限り、任 意の種類のプロモータを使用することができる。しかしながら哺乳動物細胞にて 発現を生ぜしめる場合は、免疫グロブリン遺伝子のプロモータを使用するのが特 に好適である。

所望の抗体は細胞培養物またはトランスジェニック動物で産生させることができ る。適するトランスジェニック動物は、適する制御配列下に置かれた第１および 第２ＤＮＡ構成物を、妊娠した卵子に微小注入し、このように作成した卵子を適 する仮想妊娠の雌に移しかつ所望の抗体を発現する子孫を選択することを含む標 準法にしたがって得ることができる。

抗体鎖を細胞培養物で産生させる場合、有利にはこれらＤＮＡ構成物を一緒に或 いは別々に発現ベクターに挿入し、後者が好適である。より好ましくは、これら は２種の相違するが互いに適合性の発現ベクターにて別々にしたがって本発明は さらに、上記ＤＮＡ構成物の少なくとも一種を含む原核性もしくは真核性細胞ラ インにて複製しつる発現ベクターを提供する。

次の段階は、適する宿主生物への発現ベクターまたはＤＮＡ構成物を有するベク ターの移行である。ＤＮＡ構成物を２種の発現ベクターに別々に挿入する場合、 これらは別々に移行させることができ、すなわち一方の種類のベクターを細胞１ 個当り或いは同時に移行させ、後者の可能性が好適である。適する宿主生物は細 菌、酵母または哺乳動物細胞ラインとすることができ、哺乳動物が好適である。

より好ましくは、哺乳動物細胞ラインはリンパ球由来、たとえば骨髄腫、ハイブ リドーマもしくは通常の死滅化Ｂ−細胞であるが、内生抗体重鎮もしくは軽鎖を 発現しない。

さらに、宿主生物は細胞１個当り多数のベクターのコピーを有することが好まし い。宿主生物が哺乳動物細胞ラインであれば、この所望の目的は標準法にしたが いコピーの個数を増大させて到達することができる。増大法は一般に抗生物質に 対する耐性増加につき選択することからなり、この耐性は発現ベクターによりコ ードされる。

本発明の他面においては多重鎮ＬＰＳ結合性分子の産生方法も提供され、この方 法は（ｉ）本発明の第１および第２ＤＮＡ構成物で形質転換された生物を培養し 、（ｉｆ）この培養物から活性ＬＰＳ結合性分子を回収することからなっている 。

或いは、重鎮および軽鎖を別々に回収すると共にインビトロ・リフォールディン グの後に活性結合分子に再構成することもできる。再構成法は当業界で周知され ている。これら方法の例は特にＥＰＡ　１２０　６７４号またはＥＰＡ　１２５ 　０２３号に開示されている。

したがって、この方法はさらに、 （＋）本発明の第１ＤＮＡ構成物で形質転換される第１生物を培養すると共に前 記重鎮もしくはその断片を培養物から回収し、 （ｉｔ）本発明の第２ＤＮＡ構成物で形質転換される第２生物を培養すると共に 前記軽鎖もしくはその断片を培養物から回収し、 （ｔ　ｉ　ｉ）上記（ｉ）で得られた重鎮もしくはその断片と上記（ｉ　ｉ）で 得られた軽鎖もしくはその断片とからインビトロにて活性ＬＰＳ結合性分子を再 構成することからなっている。

同様に、単一鎖もしくは単一ドメインのＬＰＳ結合性分子の製造方法も提供され 、この方法は（ｉ）それぞれ本発明の単一鎖もしくは単一ドメインのＬＰＳ結合 性分子をコードするＤＮＡ構成物で形質転換される生物を培養すると共に、（ｉ 　ｉ）前記分子を培養物から回収することからなっている。

本発明の方法においては、ＤＮＡ構成物を発現ベクター中に挿入することが最も 好ましい。

本発明のＬＰＳ結合性分子は、上記インビトロＩＬ−６分析および次のインビボ のビオアッセイの両者で示されるようにグラム陰性エンドトキセミアのＬＰＳに 対し極めて良好な保護活性を示す。

ウサギ発熱物質モデル ウサギを秤量すると共に拘置箱に入れる。ＡＰＴ７５（自動発熱物質試験プロセ ッサ）からのプローブを各ウサギの直腸に挿入する。各ウサギの体温をプローブ 挿入の５分間後から最初の９５分間にわたり１５分間毎に監視して、基礎／初期 温度を確認する（基礎体温は最後の３回の測定値の平均であり、これらが０．３ °の変動範囲よりも大であれば試験を開始しない）。

次いでウサギに耳静脈からＬＰＳ結合性分子を注射し、次いで３０分間〜２時間 後に同じ耳静脈にＬＰＳを注射する。異なるイー・コリおよびサルモネラ（たと えばサルモネラ・アボルツス・エクイ）からのＬＰＳも使用することができる。

適するＬＰＳ結合性分子の量は、分子の種類に応じて決定すべきである。たとえ ばＷＮＩ　２２２−５は体重１ｋｇ当り１〜５ｍｇにて投与される。

注射するため、この抗体を発熱物質フリーの塩水で１ｍｇ／ｍｌにて作成し、Ｌ ＰＳを用いられるＬＰＳに応じ体重１ｋｇ当り１０〜１１００ｎにて注射する。

比較動物にはＬＰＳのみ或いは抗体のみを与える。これらウサギを注射から出発 して３００分間を越えない時間にわたり１５分間間隔で監視する。

抑制％は次のよう、こ測定される： 抑制％＝ｉｏｏ− （ＡｂおよびＬＰＳのΔＴ）−（ＡｂのみのΔＴ）（ＬＰＳのみのΔＴ） ×１００ ここで、Δ丁＝温度上昇 この分析にて本発明のＬＰＳ結合性分子は、陰性比較（ＬＰＳのみ）と対比し温 度上昇を顕著に減少させる。

ＬＰＳの種類に応じ、抑制％は５０％より相当高いレベルに達する。保護性ＭＡ ｂは、このインビボ分析にて１〜５ｍｇ／ｋｇの抗体投与量にて１０〜１１００ ｎ／ｋｇのＬＰＳ投与してから２４０分間後に発熱の少なくとも３０％抑制を与 えるものとして規定することができる。

したがって本発明は、 （ｉ）ヒトにおけるグラム陰性エンドトキセミアを予防もしくは処置するための 本発明によるＬＰＳ結合性分子の使用、 （ｉｔ）本発明によるＬＰＳ結合性分子の有効量を処置を必要とする患者に投与 することからなるヒトにおけるグラム陰性エンドトキセミアの予防もしくは処置 方法、 （ｉ　ｉ　＋）本発明のＬＰＳ結合性分子と医薬上許容しつるキャリヤもしくは 希釈剤とからなるヒトにおけるグラム陰性細菌の感染を予防もしくは処置するた めの医薬粗製物 を提供する。

これら説明において、適する投与量はたとえば用いるべき本発明の特定分子、宿 主、投与方式および処置する症状の性質および程度に応じて変化することは勿論 である。しかしながら、治療用途においては一般にたとえば２日毎に或いは１週 間に２回の反復間隔にて患者の危険性に応じ体重１ｋｇ当り約０．１〜約１５ｍ ｇの投与量で投与して満足しつる結果が得られることが示される。

本発明の分子は便利には非経口的、たとえば一般に静脈内でたとえば腕静脈また は他の抹消静脈に投与される。

典型的には、予防処置は本発明による分子を体重１ｋｇ当り約２０μｇ〜約５ｍ ｇの投与量にて１回投与することからなっている。

本発明の医薬組成物は常法で作成することができる。

本発明による組成物は好ましくは凍結乾燥型で提供される。直ちに投与するには 、これを適する水性キャリヤ、たとえば注射用の無菌水または無菌緩衝生理食塩 水に溶解させる。ポルス注射でなく輸液により投与するため多量の溶液を作成す ることが望ましいと思われれば、ヒト血清アルブミンまたは患者自身のヘパリン 処理された血液もしくは他の糖安定剤を処方の時点で食塩水に混入するのが有利 である。過剰のこの種の生理的に不活性な蛋白の存在は、輸液と共に使用する容 器およびチューブの壁面に対する吸着によるモノクローナル抗体の損失を防止す る。アルブミンを使用する場合、適する濃度は塩水溶液に対し０．５〜４．５重 量％である。

未標識または好ましくは放射性同位元素もしくは蛍光性マーカで標識された本発 明のＬＰＳ結合性分子を診断目的に使用して、グラム陰性細菌感染の性質、位置 および程度を決定したり或いは水、食品、生物液などにおけるＬＰＳもしくはグ ラム陰性細菌汚染の存在を分析的に検出することもできる。たとえば本発明の標 識されたＬＰＳ結合性分子は、外科割出または他の処置に関する局部感染位置を 想定するのに有用である。さらに本発明のＬＰＳ結合性分子を固相の支持体材料 に付着させて、生物液（たとえば血清）からＬＰＳ分子を除去するための親和性 クロマトグラフィー精製系の固相を形成すること第１図は各種のＲａ−Ｒｅラフ 突然変位体種類を示すサルモネラＬＰＳ分子の詳細な構造を示し、この図面にお いてＡｂ　ｅ＝アベクオース、Ａｃ＝アセチル、Ａｒａ＝４−アミノ−４−デオ キシ−し−アラビノース、Ｅｔｎ＝エタノールアミン、ＦＡ＝ヒドロキシ脂肪酸 、Ｇａ１＝Ｄ−ガラクトース、Ｇ１ｃ＝Ｄ−グルコース、ＧｌｃＮ＝Ｄ−グルコ サミン、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチル−ｄ−グルコサミン、Ｈｅｐ＝ヘプトース 、Ｋ　Ｄ　Ｏ＝　２−ケト−３−デオキシオフトン酸、Ｍａ　ｎ＝マンノース、 Ｐ＝ホスフェート、Ｒｈａ＝Ｌ−ラムノース、点線＝不完全置換である。

第２図は種々異なるイー・コリ菌株の外側コア構造Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およ びに１２を示し、第１図と同じ記号を使用する。

第３Ａ図はＩｇＧ分子、並びにそれぞれ（１）および（２）として示した重鎮お よび軽鎖をコードする遺伝子の構造を示す図面である。第３Ｂ図は骨格領域（Ｆ Ｒ）および高可変領域（ＣＤＲ）に対する重鎮もしくは軽鎖の可変ドメインの配 置を示す。

第４Ａ図は、ウェスタン・プロットにより決定される８種の異なるイー・コリ菌 株から得られた異なるＬＰＳ分子に対するモノクローナル抗体ＷＮＩ　２２２− ５の結合能力を示し、この図面はゲルのスポットを示す。菌株については第１ｔ 表および第１ＩＩ表に詳細に説明し、レーン番号は次のことを示す：Ｓｔ＝標準 、１＝イー・コリ　０１１１Ｂ４；２＝イー・コリ　０８６；３＝イー・コリ　 ０１８に−；４＝イー・コリ　０１６；５＝イー・コリ　０１５；６＝イー・コ リ　０１２；７＝イー・コリ　０６：および８＝イー・コリ　０４゜第４Ｂ図は 、ウェスタン・プロットにより決定される８種の異なる細菌株から得られた異な るＬＰＳ分子に対するＷＮｌ　５８−９の結合能力を示し、この図面はゲルのス ポットを示す。レーン番号は次のことを示す：Ｓｔ＝標準、１＝Ｓ、ミネソタ野 生型；２＝イー・コリ０１８；３＝イー・コリ　０１６；４＝イー・コリ　０１ ５：５＝イー・コリ　０１２；６＝イー・コリ　０６；７＝イー・コリ　０４； および８＝イー・コリ　０２゜第４Ｃ図は、ウェスタン・プロットにより決定さ れる８種の異なる細菌株から得られた異なるＬＰＳ分子に対するＨｌ　６１−２ の結合能力を示し、この図面はゲルのスポットを示す。レーン番号は次のことを 示す：Ｓｔ＝標準、１＝Ｓ、ミネソタ野生型：２＝イー・コリ　０１８に一；３ ＝イー・コリ　０４；４＝イー・コリ　０６；５＝イー・コリ　０１２；６＝イ ー・コリ　Ｏ１５；７＝イー・コリ　０１６；および８＝イー・コリ　０８６゜ 第４Ｄ図は、ウェスタン・プロットにより決定される８種の異なる細菌株から得 られた異なるＬＰＳ分子に対する５Ｚ２７　１９．１６．０７の結合能力を示し 、この図面はゲルのスポットを示す。レーン番号は次のことを示す：Ｓｔ＝標準 、１＝イー・コリ　０４．２＝イー・コリ　０１６；３＝イー・コリ　０１８に −，４＝に２３５；５＝ＲＢ；６＝ＲＢニア＝Ｒ３Ｂ；および８＝Ｒ４Ｂｏ 第５図は、互いに融合した４個の骨格領域を有するベクターへのＣＤＲカセット の挿入によりＣＤＲ置換体を作成するための手順を示す。

第６Ａおよび６Ｂ図は親発現ベクターｐＳＶ−２ネオおよびｐＳＶ−２ＤＨＦＲ を示す。両プラスミドは、ｐＢＲ３２２およびＳＶ４０のアンピシリン耐性遺伝 子（ａｍｐＲ）と複製オリジンとを含む（ｐＢＲ３２２ｏｒｉおよびＳＶ４０　 ｏ　ｒ）　。ｐＳＶ−２ネオはネオマイシン遺伝子（ネオ　）およびヒトγ１一 定部分（ｈｕＣγ１）をコードする遺伝子の存在を特徴とするのに対し、ｐＳＶ −２ＤＨＦＲはジヒドロホレートレダクターゼ（Ｄ　ＨＦ　Ｒ）遺伝子（メトト レキセート耐性）およびヒトに一定部分（ｈｕ　Ｃ）をコードする遺伝に 子が挿入されている。キメラ重鎖もしくは軽鎖を発現する最終ベクターはそれぞ れ、ｐＳＶ２−ネオ中へリーグ−ペプチド（Ｌ）をコードするＤＮＡ断片および ＷＮＩ２２２−５重鎮の可変ドメイン（ｖＤＪ４）をネズミ重鎖エンハンサと共 に挿入することにより、或いはｐＳＶ２−ＤＨＦＲ中へリーダーペプチド（Ｌ） をコードするＤＮＡ断片およびＷＮＩ　２２２−５軽鎖の可変ドメイン（ＶＪ、 ）をネズミ重鎮エンハンサと共に挿入することにより得られる。

第７図はクローン１ヒベクターｐブルースクリプトｌｌ５Ｋ−およびｐブルース クリプト　ＳＫ＋　（ストラタジーン）の図面である。

以下、実施例により本発明をさらに説明する。

ニューシーラント黒色ネズミを、Ｏ，１ｍｌにおける１０８個の熱死滅細菌で静 脈内免疫化した。４回の注射を次のように行なった： 第１週　ＥｃＲ２＋ＥｃＲ３＋ＳｍＲ６０第２週　ＥｃＲ１＋ＥｃＲ４＋ＥｃＯ １８ラフ菌株第３週　ＥｃＲ２＋ＥｃＲ３＋ＳｍＲ６０第４週　ＥｃＲ１＋Ｅｃ Ｒ４＋ＥｃＯ１８ラフ菌株抗体反応を尾の出血試料で監視し、ネズミをその強力 な複数反応特性に基づいて促進（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）につき試験した。

１ケ月後、１日離して６種の異なる菌株（１０８個の熱死滅細菌）のカクテルに よる２回の注射を行ない、第１回の注射は静脈内、第２回の注射は腹腔内に行な った。

（ｂ）融合 促進後の４日目に牌細胞を副出し、標準法を用いて非分泌性ネズミＢ細胞リンパ 球ＦＡＩ−０細胞ラインと融合させた。成長するハイブリドーマを含有した穴部 からの上澄液を、上記の異なるスムースおよびラフＬＰＳのカクテルを用いてス クリーニングし、交差反応性ＭＡｂを産生ずるハイブリドーマをクローン化した 。

得られたクローンの１種はＷＮＩ　２２２−５であってＩｇＧ２ａｋアイソタイ プのネズミＭＡｂを分泌した。

ＷＮＩ　２２２−５　ＭＡｂをＷＮＩ　２２２−５クローンのインビトロ発酵の 後に集めた培養上澄液から精製すると共に、洗剤での処理により発熱物質フリー にした。

ＷＮＩ　２２２−５の反応性パターンを第１ＩＡおよびＩ　Ｉ　ＩＡ表に示す。

実施例２：ネズミモノクローナル抗体ＷＮＩ　５８−９の作成 ＷＮｌ　５８−９は、実施例１に記載した融合から得られる他のクローンである 。その反応性パターンを第１ＩＢおよびＩＩＩＢ表に示す。

Ｂ　ａ　ｌ　ｂ　／　ｃネズミをＥｃＲｌ２、ＥｃＲ２およびＥｃＲ３のカクテ ルにより静脈内で免疫化した（１０８個の熱死滅細菌、１週間の間隔で４回の注 射）。抗体反応を尾の出血試料で監視し、ネズミをその強力な複数反応熱死滅細 菌）による２回の注射を行なった。第１回の注射は静脈内とし、第２回の注射は 腹腔内とした。４日目に、牌細胞を標準法によりＦＡＩ−〇細胞ラインと融合さ せた。

種々異なるラフＬＰＳの次のカクテルを用いて主たるスクリーニングを行なった ： （１）完全コア：ＥｃＲ２、ＥｃＲ３、ＥｃＲｌ２（２）完全コア：ＥｃＲｌ、 ＥｃＲ４、ＳｍＲ６０（３）Ｒｂ２　：　ＳｍＲ３４５ （４）Ｒｃ　：ＥｃＪ４．５ｔ８７８、ＳｍＲ５（５）Ｒｄ　：　ＳｍＲ７、Ｓ ｍＲ４ （６）Ｒｅ　：　ＥｃＲｌ２．５ｔＳＬ１１０２．５ｔＳＬ１１８１、ＳｍＲ５ ９５ （７）脂質Ａ　：ＥｃＲｌ２、ＳｍＲ５９５（８）陰性比較：ＢＳＡ 交差反応性ＭＡｂを産生ずるハイブリドーマをクローン化させ、得られたクロー ンの１種はＨｌ　６１−２であってＩｇＧ１にアイソタイプのネズミＭＡｂを分 泌する。Ｈｌ　６１−２　ＭＡｂを培養上澄液から精製し、これは第１ＩＣおよ びｌ１１０表に示す反応性ノ々ターンを与えた。

実施例４：ネズミモ、化乏−兄二二ナニ児」！伴二敷１ヨーじζ１−−二１９． −Ｂ　ａ　ｌ　ｂ　／　ｃ雌ネズミを０．１ｍｌにおける１０８個の熱死滅細菌 により６日間（０日目、１日目、２日目、７日目、８日目および９日目）のそれ ぞれにつき静脈内で免疫化した。各イミュノゲンを開始する間の２８日間隔にて 異なるイミュノゲンを用いた。使用したイミュノゲンは次の通りである： 第１回　６回の注射　Ｐ、エアルギノーサＰＡＣ第２回　〃　〃　ＥｃＲ１ 第３回　／／　／／　ＥＣＲ２ 第４回　”　〃Ｅ　ｃ　Ｒ３ １群につき５匹のネズミに同一の免疫化を施した。抗体反応を次の菌株からの精 製ＬＰＳ抗原に対し尾の出血試料で監視した： ＊　＊ Ｓ、チフィムリウム　Ｒａ　、Ｒｂ　、Ｒｃ”、ＲｄおよびＲｅ Ｓ、ミネソタ　脂質Ａ ＊零 イー・コリ　Ｒ１、Ｃ６１、Ｋ１２、 Ｒｅ（菌株Ｄ３１ｍ４） および脂質Ａ（Ｄ３１ｍ４　。

から） 本 Ｐ、エアルギノーサ　０６０５　標識した抗原に対する強力な抗体反応が４種 の異なる細菌により周期的に 免疫化した後に発現し、ネズ ミをその強力な複数反応特性 に基づいて促進につき選択し た。

最後の免疫化が完了してから６週間の後、選択したネズミをそれぞれイー・コリ Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびに１２の２×１０８個の熱死滅細菌のカクテルで 静脈内促進させた。膵臓を３日後に削出して融合させた。

融合は、標準法を用いてＮ５−０細胞ラインに対し行なった。

２種のＬＰＳカク１ルを用い、主たるスクリーニングを行なった： （１）Ｓ、ミネソタ　Ｒａ＋Ｒｃ＋Ｒｅ（２）イー・コリ　Ｃ６２＋に１２＋Ｒ ｅ２６０種のハイブリドーマ上澄液をスクリーニングし、両カクテルに対し強力 な反応を示す２０種をさらに成長させるべく選択した。次いで、これらをクロー ン化につき選択する前に１１種の異なるＬＰＳ抗原につき第２回のスクリーニン グにかけた。これらは次の通りである：Ｓ、チフィライウム　Ｒａ５Ｒｂ、Ｒｃ 、ＲｄおよびＲｅ Ｓ、ミネソタ　脂質Ａ イー・コリ　Ｒ１、Ｋ１２、Ｒｅ、脂質ＡＰ、エアルギノーサ　Ｃ６０５ ＳＺ２７　１９を含む多数のハイブリドーマは次の反応パターンを示した： 強カニＳ、チライムリウムＲａ；イー・：Ｉ　ＩＪ　Ｒ１弱　：Ｓ、チフィムリ ウムＲｂ、Ｒｃ　；Ｐ、エアルギノーサ　６０２ 陰性：Ｓ、チフィムリウムＲｄＳＲｅ　；イー・コリ脂質Ａ、に１２、Ｒｅ サブクローン化の後、クローン５Ｚ２７　１９．１６゜０７を分離した。これは ＩｇＧ２ａｋアイソタイプのネズミＭＡｂを産生じた。

この抗体の反応パターンを第１ＩＤおよびｌｌＩＤ表重鎮のアミノ末端配列はＧ ｌｕ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｇｌｙであると 決定された。これに基づき、予想されるリーダー配列および上記アミノ酸配列の 末端をコードするｍＲＮＡに相補的な上流プライマを、そのヌクレオチド配列が 次のようになるよう作成した： ａｌ　１ ５’　ＡＧＧτＧＴＣＧＡＣＴＣＣＧＡＧ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　 ＧＡＧ　ＴＣＴ　ＧＧ　３ｒＧｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　ＶａＬ　Ｇｌｕ 　Ｓｅｒ　Ｇｌｙネズネズ２ａ−窓部分の断片をコードするｍＲＮＡに相補的な 下流プライマも、そのヌクレオチド配列が５’　ＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣ ＡＣＴＧ　３’となるよう作成した。

これら上流および下流のプライマーを一緒に使用して、ＷＮＩ　２２２−５　ｍ ＲＮＡ作成からのＷＮＩ　２２２−５重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ断片を 拡大させた。拡大したＤＮＡ断片を次いで配列決定し、そのｖｌＤおよびＪセグ メントを決定した。

クローン化工程ＮＯ３２ ヌクレオチド配列５’　ＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＡＧＧＴＴ　３’　を有 するＪセグメントおよびＢｓｔＥＩＩに相補的な他の下流プライマーを作成した 。

ＢｓｔＥＩＩ制限部位を導入するため、天然に存在する元ＤＮＡ配列を僅かに改 変させた。

クローン化工程Ｎｏ、１で既に使用したＪ−特異性の下流プライマーと上流プラ イマーとを使用して、ＷＮＩ２２２−５　ｃＤＮＡ作成からのＷＮＩ　２２２− ５重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ断片を拡大させた。ＷＮｌ　５８−９の拡 大は、’ｖＶ　Ｎ　１　２２２−５の拡大と同様に行なった。拡大したＤＮＡ断 片をさらに５ａｌｌおよびＢｓｔＥＩＩで切断すると共に、同じ酵素で処理され た重鎮カセットにクローン化させた。

重鎮カセットは次のように作成する： ＲＦＴ２抗体〔ハインリッヒ等、ジャーナル・オブ・イミュノロジー（１９８９ ）、第１４３巻、第３５８９頁］の重鎮をコードする遺伝子のプロモータとリー ダー配列とからなる２、３ｋｂのＥｃｏＲＩ−３ａ　ｌ　ｌＤＮＡ断片をクロー ン化ベクターｐブルースクリプト■ＩＳＫ”（ストラフジーン）のポリリンカー 領域にクローン化させる。この挿入から下流にて、０．４ｋｂのＢｓｔＥＩＩ− ＢａｍＨＩ　ＤＮＡ断片はＪセグメントを含み、遺伝子の主イントロンの開始部 は抗−サイトメガロスウィルス抗体をコードする［ニューワーク等、ジャーナル ・クリニカル・インベスチゲーション（１９８８）、第８１巻、第１５１１頁］ 。

次いでＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ１断片を、ヒト重鎮エンハンサ（Ｅ　ｔｔ　）とヒ トγ１一定部分をコードする配列とを有するｐ　５Ｖ２−ネオ−Ｅμｍｈｃγ１ 　［ハインリッヒ等、上記］に移す。

実施例５のクローン化工程Ｎ０１１およびＮ００２を、次のプライマーを用いて 反復した： 上流プライマー： Ｍ１ｕ工 ５’ＡＧＧＴＡＣＧＣＧττＧＴＧＡＣＡτＣＣＡＧＡＴＧＡＡＣＣＡＧＴＣＴ ＣＣ３’Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　工１ｅ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　 Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。

に一定部分に特異性の下流プライマｍ：５’　ＧＣＡＣＡＣＧＡＣＴＧＡ ＧＧＣＣＡＣＣＴＣ３’ Ｊセグメントに特異性の下流プライマー：５’　ＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＡ ＡＧＣＴＴＧＧＴＧ　３’ 拡大したＤＮＡ断片をさらにＭｌｕｌおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断すると共に、 同じ酵素で処理された軽鎖カセットにクローン化させた。ＷＮＩ　２２２−５お よびＷＮｌ　５８−９を同様に処理した。

軽鎖カセットは次のように作成した：　ＲＦＴ２抗体［ハインリッヒ等、上記］ の軽鎖をコードする遺伝子のプロモータとリーダー配列とからなる１、３ｋｂの ＥｃｏＲＩ−ＭＩｕＩ　ＤＮＡ断片を、クローン化ベクターｐブルースクリプト ｌｌ５Ｋ’−（ストラタジーン）のポリリンカー領域にクローン化させた。この 挿入から下流で、ＲＦＴ２の軽鎖をコードする遺伝子のＪセグメントと主イント ロンの開始部とからなる０、４ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩ−ＺｂａＩ　ＤＮＡ断片を クローン化させた。

次いで、ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ断片を、次のように作成したｐｓｖ２−ＤＨＦＲ −Ｅｕ−ｈμｃにに移した：ネズミ重鎮エンハンサ［ハインリッヒ等、上記コを コードするｉ、ｉｋｂのＸｂａｌ−ＸｂａＩ断片を、ヒトに一定部分をコードす る５ｐｈＩ−ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片と共にファージＭ１３　ｍｐ１８　［ベー リンガー・マンハイム社］にサブクローン化させた。突然変異により制限部位を 破壊した後、ネズミ重鎮エンハンサ（Ｅμ）とヒトに一定部分（ｈμＣに）との 配列からなる充填したＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片を、ｐＳＶ２−ＤＨ ＦＲの充填ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ１部位にクローン化させた。

実施例５および６で得られた発現ベクターを、ビオラド・ラボラドリース社から の遺伝子パルサー装置を用いエレクトロポレーションによりネズミ骨髄腫細胞ラ イン５Ｐ２１０　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８１）に同時移行させた。この技術は 、安定な形質転換体を高頻度で形成することが知られる。Ｓ　Ｐ　２１０細胞ラ インは内生重鎮および軽鎖を産生ぜず、０．８ｍｇ／Ｌの濃度のゲンタマイシン （Ｇ　４１８）に対し敏感である。

５Ｐ２１０細胞を通常の増殖培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣ３＋５ｘｌＯ’β−メ ルカプトエタノール）にて増殖させ、対数増殖期で収穫すると共にエレクトロポ レーション緩衝液（ビオラド社）で洗浄した。細胞濃度を２×１０７細胞／　ｍ 　１に調整した。０．８ｍｌの細胞懸濁物に１５〜２０μｇの各プラスミドを添 加した。この混合物を氷上に置き、１０分間静置させた。次いで細胞を電気パル ス（２８０ボルト；２５μＦ）にかけ、再び１５分間静置させた。細胞を通常の 増殖培地に移し、ＣＯ２培養器にて３７℃で培養した。

３日間の培養の後、Ｇ　４１８耐性につき選択を開始した。細胞を、１．４ｍｇ ／ｍｌの６４１８を含有する新たな培地に再懸濁させた。培養物は、Ｇ　４１８ の存在下１−おける１０〜１４日間の培養の後に増殖細胞を与えた。２週間の培 養の後、融合培養物の上澄液をサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ（抗−ヒトに一軽鎖／ 上澄液／抗−ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体）におけるヒトＩｇＧ発 現につき試験した。

この試験は、完全抗体分子が全ての培養物にて５０〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲の 種々の濃度で分泌されることを示した。

ＤＨＦＲ遺伝子が拡大し、したがって多量の所望の抗体を分泌する細胞を選択す るため、メトトレキセート（ＭＴＸ）耐性に関する２種の選択法を下記するよう に行なった。この目的で６４１８耐性細胞保存物をそれぞれ分割し、手順Ａ（２ もしくは２．５のファクターによるＭＴＸ増加）または手順Ｂ（５のファクタに よるＭＴＸの増加）にしたがい拡大を進行させた。

Ｇ４１８−耐性細胞　Ｇ４１８−耐性細胞手順Ａ　手順Ｂ ｌ１００ｎ　ＭＴＸ　２００ｎＭ　ＭＴＸ２５０ｎＭ　ＭＴＸ　１μＭ　ＭＴＸ ５００ｎＭ　ＭＴＸ　５μＭ　ＭＴＸ １μＭ　ＭＴＸ　２５μＭ　ＭＴＸ ２．５μＭ　ＭＴＸ　１００μＭ　ＭＴＸ５μＭ　ＭＴＸ １０μＭ　ＭＴＸ ２５μＭ　ＭＴＸ ■ １００μＭ　ＭＴＸ 各拡大工程は、細胞を１．４ｍｇ／ｍｌの０４１８および選択濃度のＭＴＸが補 充された通常の増殖培地に２×１０５細胞／ｍｌの密度にて接種することからな りている。７２時間の培養の後、細胞と上澄液とを分離した。抗体分泌をＥＬＩ ＳＡまたは蛋白Ａカラムを用いるＨＰＬＣにより監視した。

保存物の大部分は、所定のＭＴＸ濃度にて最大の特異性抗体産生に達した。最も 良好に産生ずる保存物を希釈の制限によってクローン化させた。次いで、抗体を 蛋白Ａ親和性カラムでの溶出により培養上澄液から精製した。

配列同定Ｎ００１ 主題・ＷＮＩ　２２２−５抗体の免疫グロブリン重鎮可変ドメイン 配列型：ヌクレオチド配列およびその対応アミノ酸配列長さ：３６１ヌクレオチ ド 原料：ネズミハイブリドーマ アミノ酸配列の特徴： ｈＦＲｌ　：　ａ、ａ、　１〜３０ ｈｃＤＲ１：ａ、ａ、　３１〜３５ ｈＦＲ２：ａ、ａ、　３６〜４９ ｈＣＤＲ２：ａ、ａ、　５０〜６７ ｈＦＲ３：ａ、ａ、　６８〜１００ ｈＣＤＲ３：ａ、ａ、１０１〜１０９ ｈＦＲ４：ａ、ａ、１１０〜１２０ ＴＡＣＡＴＧ　ＡｃＣＴＧＧ　ＧＴＣＣＧＣＣＡＧ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＧＧＧ　 ＡＡＧ　ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＴＴＧ　１４４Ｔｙｒ　Ｍｅ【Ｔｈ ｒ　Ｔｒｐ　ＶａＬ　Ａｒｇ　ＧＬｒ＋　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇ１７　Ｌｙｓ　Ａ ｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｌａｕ３二　赫０　４５ Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　：ｌａ　Ｓａｒ　 Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｓａ【工Ｉｓ◇コ　７０　７５　８ ０ 主題＋ＷＮ１　５８−９抗体の免疫グロブリン重鎮可変ドメイン 配列型：ヌクレオチド配列およびその対応アミノ酸配列長さ：３６１ヌクレオチ ド 原料：ネズミハイブリドーマ アミノ酸配列の特徴： ｈＦＲ３：ａ、ａ、　６８〜１００ 「 ｈ’ＣＤＲ３：　ａ、ａ、１０１〜１０９ｈＦＲ４：ａ、ａ、１１０〜１２０ Ｔｖｒ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　ＶａＬ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ−一一一一■ｔ、Ｏ ４５ Ｔンｒ　Ｃｙｓ　ＶａＬ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｇｌｖ　Ａｒ　Ｇｌ・／　Ｔｖｒ　 Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ａｓｏ　Ｔｖｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇ１ｎ配列同定Ｎ０９３ 主題：ＷＮｌ　２２２−５抗体の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン 配列型、ヌクレオチド配列およびその対応アミノ酸配列長さ：３２１ヌクレオチ ド 原料：ネズミハイブリドーマ アミノ酸配列の特徴： ＩＦＲＩ　：　ａ、ａ、　１〜２３ ＩＣＤＲＩ：ａ、ａ、　２４〜３４ １ＦＲ２：ａ、ａ、　３５〜４９ １ＣＤＲ２：ａ、ａ、　５０〜５６ １ＦＲ３：ａ、ａ、　５７〜８８ １ＣＤＲ３：ａ、ａ、　８９〜９７ １ＦＲ４：ａ、ａ、　９８〜１０７ ＤＮＡおよびＡＡ配列 軽鎖： 配列同定ＮＯ３４ 主題：ＷＮｌ　５８−９抗体の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン 配列型：ヌクレオチド配列およびその対応アミノ酸配列長さ＝３６１ヌクレオチ ド 原料：ネズミハイブリドーマ アミノ酸配列の特徴： ＩＦＲ２：ａ、ａ、　３５〜４９ ｌＣＤＲ２：ａ、ａ、　５０〜５６ １ＦＲ３：ａ、ａ、　５７〜８８ 「 ｌＣＤＲ３：ａ、ａ、８９〜９７ １ＦＲ４：ａ、ａ、　９８〜１０７ ＡＴＣんμ　３２１ 領域　重鎖における位置　軽鎖における位置ＦＲＩ／ＦＲＩ　アミノ酸　アミノ 酸 １〜３０　１〜２３ ＣＤＲ２／ＣＤＲ２アミノ酸　アミノ酸３１〜３５　２４〜３４ Ｆ　Ｒ２／Ｆ　Ｒ２アミノ酸　アミノ酸「 ３６〜４９　３５〜４９ ＣＤＲ２／ＣＤＲ２アミノ酸　アミノ酸５０〜６７　５０〜５６ ＦＲ３／ＦＲＢ　アミノ酸　アミノ酸 「 ６８〜１００　５７〜８８ ＣＤＲ３アミノ酸　アミノ酸 １０１〜１２０　８９〜９７ ＦＲ４アミノ酸　アミノ酸 １１０〜１２０　９８〜１０７ 。。　。。＋　＋　＋　。　。。。、：やヤゆ；　１　；◆　本　＋　◆　＋　 −１−本　十　＋　◆　◆　◆　◆　＋。−ゆゆ−　、　：：　：：：　ｚ　： ：：　ｚ　：ｌ：：：　＋：：　：　：　：：４　：Ｈ、＋：：＋＋ヤ　；＋： 　＋−：：　：　：：　：　＋：：：　：壬＝＝＝＝；；　二：　：Ｈ：　：　 ：　：：：　、：：＋：：や　；漬　−−−−。　−一 ＼　。　−−。−ゆ　。　−。４− ａｔ　−１−−１−ＭＴ−４−１−＋　−ｂ　＋　−１−−＋−４＋　−１−１ −−◆　＋　４−　φ　＋　１　＋　＋　◆　◆　◆　◆　＋　◆　＋−ｈｌ　 ｌＦＩＧ、　３ａ ＦＲＩ　ＦＲ２ＦＲ３ＦＲ４ ＣＤＲＩ　ＣＤＲ２ＣＤＲ３ ＦＩＧ、　４ａ ＦＩＧ、　４ｂ ＦＩＧ、　４ｃ ＦＩＧ、　４ｄ Ｓｔ１２３４５６７８Ｓｔ ＦＩＧ、　５ 制限部位 ベク”ＦＲＩ　ＦＲ２ＦＲ３ＦＲ４″″−補正書の翻訳文提出書 （特許法１８４条の８） 平成５年　９月１３日

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. １．ＬＰＳ分子のコア領域におけるエピトープを識別すると共に、異なるコア構 造を有する少なくとも２種の異なるグラム陰性細菌株によって生じたエンドトキ セミアに対しクロスー保護性であることを特徴とするモノクローナル抗体。
2. ２．イー・コリのＲｃコア構造に完全に存在すると共に完全コアにも存在するエ ピトープを識別する請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体。
3. ３．ネズミである請求の範囲第１項または第２項に記載のモノクローナル抗体。
4. ４．ＩｇＧアイソタイプである請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のモノク ローナル抗体。
5. ５．請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハ イブリドーマ細胞ライン。
6. ６．（ａ）動物を複数タイプのＬＰＳ分子で免疫化し、（ｂ）動物からの脾細胞 を不死化細胞ラインと融合させてハイブリドーマを産生させ、 （ｃ）これらハイブリドーマをスクリーニングして交差反応性抗体を産生するも のを選択し、（ｄ）さらにハイブリドーマをスクリーニングして保護性抗体を産 生するものを選択し、 （ｅ）選択されたハイブリドーマを成長させると共に産生した抗体を分離する ことを特徴とする請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のモノクローナル抗体 の産生方法。
7. ７．動物を熱死滅したグラム陰性細菌の種々異なるラフ株のカクテルで免疫化す る請求の範囲第６項に記載の方法。
8. ８．動物を熱死滅したグラム陰性細菌の多数の異なるラフ株で順次に免疫化し、 １回には１種のみの菌株を投与する請求の範囲第６項に記載の方法。
9. ９．（ａ′）最初のスクリーニングを免疫化された動物の血清につき行なって、 その免疫反応の強度および複数性を試験し、強度の反応を有する動物を選択し、 これら動物にその脾細胞を除去する前にブースター免疫化を与える 追加工程を含む請求の範囲第６〜８項のいずれかに記載の方法。
10. １０．スクリーニング段階（ｃ）を、種々異なるスムースおよびラフのＬＰＳの 一連の混合物を用いるＥＬＩＳＡ分析にて行なう請求の範囲第６〜９項のいずれ かに記載の方法。
11. １１．配列内に高可変性領域ｈＣＤＲ１、ｈＣＤＲ２およびｈＣＤＲ３を含む少 なくとも１つのドメインからなる少なくとも１個の抗原結合部位を含み、前記ｈ ＣＤＲ１がアミノ酸配列Ａｓｐ　Ｔｙｒ　ＴｙｒＭｅｔ　Ｔｈｒを有し、前記ｈ ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｗ　ＡｒｇＡｓｎ　 Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ＧｌｕＴｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖ ａｌ　Ｘ（ここでＷがＬｙｓもしくはＴｙｒであり、ＸがＬｙｓもしくはＡｒｇ である）を有し； 前記ｈＣＤＲ３がアミノ酸配列　Ｇｌｎ　ＧｌｙＡｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｈ ｒ　Ｌｅｕ　ＡｓｐＴｙｒを有する ことを特徴とするＬＰＳ結合性分子またはその直接的均等物。
12. １２．ネズミもしくはヒト重鎖骨格領域と結合して分離重鎖可変ドメインを形成 した高可変領域ｈＣＤＲ１、ｈＣＤＲ２およびｈＣＤＲ３を配列内に含む請求の 範囲第１１項に記載の単一ドメイン抗体。
13. １３．（ａ）請求の範囲第１１項に記載の高可変領域ｈＣＤＲ１、ｈＣＤＲ２お よびｈＣＤＲ３を配列内に含む第１ドメインと、 （ｂ）高可変領域１ＣＤＲ１、１ＣＤＲ２および１ＣＤＲ３を配列内に含む第２ ドメインと からなり、前記１ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＡｒｇＡｌａ　Ｙ　Ｚ　Ａｓｎ　Ｉｌ ｅ　Ａｓｎ　ＩｌｅＴｒｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ（ここでＹはＳｅｒもしくはＡｒｇ であり、ＺはＧｌｎもしくはＬｅｕである）を有し； 前記１ＣＤＲ２がアミノ酸配列　Ｌｙｓ　ＡｌａＳｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｈｉ ｓ　Ｔｈｒを有し；前記１ＣＤＲ３がアミノ酸配列　Ｌｅｕ　ＧｌｎＧｌｙ　Ｇ ｌｎ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　ＡｒｇＴｈｒを有する 少なくとも１個の抗原結合部位を含む請求の範囲第１１項に記載のＬＰＳ結合性 分子およびその直接的均等物。
14. １４．高可変領域がネズミもしくはヒト骨格領域と結合した請求の範囲第１３項 に記載のＬＰＳ結合性分子。
15. １５．第１および第２ドメインが単一の共通ペプチド鎖の部分である請求の範囲 第１３項または第１４項に記載のＬＰＳ結合性分子。
16. １６．第１および第２ドメインがそれぞれＩｇ重鎖可変ドメインおよびＩｇ軽鎖 可変ドメインであって、１０〜３０個のアミノ酸よりなるペプチドリンカにより 共有結合される請求の範囲第１５項に記載の単一鎖抗体。
17. １７．第１ドメインが少なくともＩｇ分子の断片の重鎖の部分であり、第２ドメ インが少なくともＩｇ分子の断片の軽鎖の部分である請求の範囲第１３項または 第１４項に記載のＬＰＳ結合性分子。
18. １８．完全Ｉｇ分子である請求の範囲第１７項に記載のＬＰＳ結合性分子。
19. １９．ＩｇＧアイソタイプである請求の範囲第１８項に記載のＩｇ分子。
20. ２０．ネズミである請求の範囲第１８項または第１９項に記載のＩｇ分子。
21. ２１．可変ドメインがネズミであり、一定ドメインがヒトである請求の範囲第１ ８項または第１９項に記載のＩｇ分子。
22. ２２．骨格領域および一定ドメインがヒトである請求の範囲第１８項または第１ ９項に記載のＩｇ分子。
23. ２３．重鎮可変ドメインがＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．１またはＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ． ２に示した配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変ドメインがＳｅ ｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．３またはＳｃｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．４に示した配列と実質的に同じ アミノ酸配列を有する請求の範囲第２０項または第２１項に記載のＩｇ分子。
24. ２４．重鎖一定ドメインがヒトγ１型であり、軽鎖一定ドメインがヒトκ型であ る請求の範囲第２１項に属する第２３項に記載のＩｇ分子。
25. ２５．請求の範囲第１１項に記載の高可変領域ｈＣＤＲ１、ｈＣＤＲ２およびｈ ＣＤＲ３を配列内に含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ構成物。
26. ２６．重鎖もしくはその断片をコードし、かつ（ａ）交互に骨格と高可変領域と からなり、前記高可変領域が配列内にｈＣＤＲ１、ｈＣＤＲ２およびｈＣＤＲ３ を有し、そのアミノ酸配列が請求の範囲第１１項に記載された可変ドメインをコ ードする第１部分（この第１部分は可変ドメインの第１アミノ酸をコードするコ ドンで開始すると共に可変ドメインの最終アミノ酸をコードするコドンで終了す る）と、（ｂ）重鎖一定部分もしくはその断片をコードし、重鎖の一定部分の第 １アミノ酸をコードするコドンで開始すると共に一定部分もしくはその断片の最 終アミノ酸をコードするコドンに続くナンセンスコドンで終了する第２位部分と からなるＤＮＡ構成物。
27. ２７．第１部分がＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ　１またはＮｏ．２に示したアミノ酸配列 と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインをコードし、第２部分がヒ トγ１鎖の一定部分をコードする請求の範囲第２６項に記載のＤＮＡ構成物。
28. ２８．請求の範囲第１３項に記載の高可変領域１ＣＤＲ１、１ＣＤＲ２および１ ＣＤＲ３を配列内に含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ構成物。
29. ２９．軽鎖もしくはその断片をコードし、かつ（ａ）交互に骨格と高可変領域と からなり、前記高可変領域が配列内にｈＣＤＲ１、ｈＣＤＲ２およびｈＣＤＲ３ を有し、そのアミノ酸配列がＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．３もしくはＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎ ｏ．４に示された可変ドメインをコードする第１部分（この第１部分は可変ドメ インの第１アミノ酸をコードするコドンで開始すると共に可変ドメインの最終ア ミノ酸をコードするコドンで終了する）と、 （ｂ）軽鎖一定部分もしくはその断片をコードし、軽鎖の一定部分の第１アミノ 酸をコードするコドンで開始すると共に一定部分もしくはその断片の最終アミノ 酸をコードするコドンに続くナンセンスコドンで終了する第２位部分と からなるＤＮＡ構成物。
30. ３０．第１部分がＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．３もしくはＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．４に示 したアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインをコード し、第２部分がヒトκ鎖の一定部分をコードする請求の範囲第２９項に記載のＤ ＮＡ構成物。
31. ３１．適するプロモータと作用連携する請求の範囲第２５〜３０項のいずれかに 記載のＤＮＡ構成物を含む発現ベクター。
32. ３２．請求の範囲第３１項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
33. ３３．請求の範囲第３２項に記載の宿主細胞を培養し、発現した蛋白を分離する ことを特徴とする請求の範囲第１１〜２４項のいずれかに記載のＬＰＳ結合性分 子の製造方法。
34. ３４．薬物または診断助剤としての請求の範囲第１１〜２４項のいずれかに記載 のＬＰＳ結合性分子の使用。
35. ３５．医薬上許容しうる希釈剤もしくはキャリヤと組合せて請求の範囲第１１〜 ２４項のいずれか一項に記載のＬＰＳ結合性分子を含む医薬組成物。