KR20060006937A - 엔 글리콜릴 지엠3 강글리오사이드를 인식하는 재조합 항체및 단편 그리고 종양의 진단 및 치료에서 사용 - Google Patents

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게르트루디스 로자스 도란테스
아리엘 타라베라 페레즈
에르네스토 모레노 프리아스
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센트로 데 인무노로지아 몰레큘라
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Abstract

본 발명은 유전 공학에 의하여 덜 면역원성인 면역글로블린의 생산에 관련된 것이다. 특히, N-글리콜릴 또는 N-아세틸 타입 강글리오사이드 또는 황산염 글리콜리피드를 포함하지 않으면서 N-글리콜릴 GM3 강글리오사이드를 포함하는 항원을 인식하는 단일 클론 항체에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 N-클리콜릴 GM3 강글리오사이드 또는 그것으로부터 유도된 단편을 인식하는 14F7 항체로부터 유도된 재조합 단일클론 항체를 코드화를 하는 펩티드 서열에 관한 것이다. 더 나아가, 본 발명은 상기 재조합 항체 또는 그것의 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 유방암 및 흑색종의 진단 및 치료를 위한 약학적 조성물의 사용에 관한 것이다.
N-글리콜릴 GM3 강글리오사이드, 쥐과 동물, 하이브리도마, 단일클론

Description

엔 글리콜릴 지엠3 강글리오사이드를 인식하는 재조합 항체 및 단편 그리고 종양의 진단 및 치료에서 사용{Recombinant antibodies and fragments recognising ganglioside N-glycolil-GM3 and use thereof in the diagnosis and treatment of tumors}
본 발명은 면역학 분야에 관한 것이고 그리고 특히 암 치료에 사용하기 위하여 유전 공학 기술을 사용하여 더 작은 면역성(immunogenic)의 면역글로블린을 얻는 것에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로 N-글리콜릴 또는 N-아세틸와 같은 관련 강글리오사이드 및 황산염 글리콜리피드(sulphates glycolipids)가 아닌 N-글리콜릴 GM3 강글리오사이드를 포함하는 항원을 인지하는 유도된 단일 클론의 항체 또는 단편으로 코드화가 된 펩티드 서열에 관한 것이다.
강글리오사이드는 시알산을 포함하는 당지질(glycosphingolipids)이고 그리고 강글리오사이드는 척추동물(vertebrates)의 원형질막에 존재한다(Stults CLM et. at, Methods Enzymololy 179:167-214, 1989). 이러한 분자들의 일부분이 종양 관련 항원 또는 종양 표시자로 문헌으로 보고가 되어 왔고(Hakamori SH: Curr Opin Immunol 3:646-653, 1991), 이후 그것이 암의 진단 및 치료에서 항 강글리오사이드 항체의 사용으로 기술되어 왔다(Hougton AN et.al, NAS USA 82: 1242-1246, 1985; Zhang S et al. Int J Cancer 73: 42-95, 1997). 포유동물 세포에서 더 일반적인 시알산은 N-아세틸(NAc) 및 N-글리콜릴(NGc)가 된다(Corfield Ap et. at, Cell Biol Monogr 10:5-50, 1982). 일반적으로 NGc는 인간 및 닭 정상 조직에서는 발현되지 않지만 다른 추골에 널리 분포한다(Leeden RW et. al, Biological Role of Sialic Acid. Rosemberg A and Shengtrund CL(Eds). Plenum Press, New York, 1-48, 1976, Kawai T et. al, Cancer Research 51: 1242-1246, 2001). 그러나 문헌의 보고는 항-NGc 항체가 일부 인간 종양 및 종양 세포 라인을 인식하는 것을 보여준다(Higashi H et.al, Jpn J. Cancer Res. 79:952-956,1988, Fukui Y et. al, Biochem Biophys Res Commun 160: 1149-1154, 1989). GM3(NGc) 강글리오사이드 수준의 증가는 인간 유방암에서 발견되었고(Marquina G et. al, Cancer Research 56:5165-5171, 1996), 이것은 암 치료를 위한 표적 세포로서 이러한 분자의 사용을 매우 흥미가 있는 것으로 만들었다. 출원된 특허 EP 0972782 A1은 접근 번호 ECACC 98101901로 부타페트스 조약에 따라 기탁된 하이브리도마에 의하여 생산된 쥐과동물 단일 클론 항체에 대하여 개시한다. 이러한 단일 클론 항체는 IgG1 이소타입(isotype)을 가지고 그리고 낮은 밀도 리포 단백질(VLDL)과 소수성으로 접합되는 NGcGM3 강글리오사이드를 이용하여 Balb/c 생쥐의 면역에 의하여 생성이 되고 그리고 프로인트 보조제(adjuvant)의 존재 아래에서 상기 항원은 우선적으로 NGcGM3 강글리오사이드와 결합하고 그리고 인간 유방 및 흑색종 종양(melanoma tumors)에서 발현된 항원을 인식한다(Carr A et. al, Hybridoma 19:3:241-247, 2000). 이러한 항체는 그것이 치료 도구가 될 수 있는 성질로서 상기 서열을 가지는 세포에 대하 여 강한 세포 용해(cytolitic) 활성을 보여주었다.
더욱이 종양에 의하여 유도된 혈관 신생은 종양 성장의 대조에서 주요한 매개 변수 중의 하나를 구성하는 것으로 알려져 있다. 이것은 항원 과정의 억제와 관련된 새로운 치료 무기를 위한 조사로 향해지는 직접적인 연구가 된다. 이러한 과정에 관한 14F7 항체의 효과에 대한 실험적인 증거가 존재한다. 상기 증거는 기질 겔 분석에서 발견이 되었다(Angiogenesis. Vol. 4, Pags. 113-121, 2001; Anti-Cancer Res. Vol. 18, Pags. 783-790, 1998). 기질 겔(matrix gel)은 기초 막의 단백질 및 내피 세포를 감싸고 있는 특별한 세포 기질의 혼합물이다. 혈관 신생 과정(neovascularization process)에서 이것의 유용성은 새로운 혈관의 발달 과정에서 내피-기질 상호 작용의 생리학적 중요성에 있다. 마찬가지로 라미닌(laminine)과 같은 이러한 겔의 성분은 이러한 과정의 중요한 표시자로 간주가 된다.
이러한 모델 형태는 또한 종양과 직접 관련이 되는 사건을 조절하고 이로 인하여 그것의 성장 및 전이에 영향을 미칠 수 있는 약제를 평가하는 것을 허용하는 종양 유도 혈관 신성과 관련된 구조의 연구에서 사용되어 왔다.
쥐과동물 14F7과 같은 인간이 아닌 단일 클론 항체에 대한 사용은 특히 반복적인 치료 계획에서 인간 치료를 위하여 몇 가지 불리한 점을 가진다. 예를 들어 쥐과동물 단일 클론 항체는 상대적으로 짧은 혈관 반 생명(half life)을 가진다. 추가적으로 그들은 인간에게 사용되는 경우 작동자 기능과 같은 중요한 면역학적 성질을 상실한다.
그리고 더 중요할 수 있는 것으로서, 쥐과동물 단일 클론 항체는 인간에 주 입되는 경우 면역이 되는 중요한 아미노산 서열을 포함한다. 많은 연구가 오래 항체의 투여 후 환자 내에서 생성된 면역 반응은 상당히 강할 수 있고 그리고 최초의 치료 후 항체의 치료 효과를 실질적으로 제거할 수 있다는 것을 보여주었다. 더욱이 심지어 쥐과동물 단일 클론 항체를 이용한 치료 투여 후에조차 관련성을 가지지 않은 쥐과동물 항체의 추후 치료는 효과를 가지지 못하고 그리고 심지어 HAMA 반응으로 알려진 교차 반응으로 인하여 위험할 수 있다(Khazaeli, M.B., et. al, Journal of Immunotherapy 15: 42-52, 1994).
Mateo, et. al(US Patent No. US 5 712 120)은 쥐과동물 항체에 대한 면역원성(immunogenicity)의 감소를 위한 절차를 개시하고 있다. Mateo et.al(Mateo C et. al, Hybridoma 19:6:463-471, 2000)에 의하여 개시된 방법에 의하여 수정된 항체는 최초 항체의 항원에 대한 인식 및 결합 능력을 유지하고 그리고 더 적은 면역원성을 초래하고, 그리고 이것은 치료의 유용성을 증가시킨다. 이러한 절차로서 키메릭 항체(chimeric antibody)와 비교할 때 면역원성의 감소를 보여주는 작은 수의 변이(mutations)를 가진 수정된 항체를 얻는다.
위에서 기술한 것으로부터 인간에 대한 사용을 위한 치료 제제를 제조하기에 적합하도록 만들어지고 그리고 간단한 경제적인 방법으로 얻어지는 더 작은 면역원성을 가지는 치료 항체의 변형을 얻는 것이 추론이 된다.
항원 단편의 사용이 질병의 면역 진단에서 매우 유용하다는 것이 또한 알려졌다. 다른 것 중 Ira Pastan(EP에 출원된 유럽 특허 0796334 A1)은 루이스(Lewis Y 항원)와 관련된 탄수화물을 특정적으로 인식하는 항원의 가변 영역을 이용하여 Fv 형태의 단일 사슬 단편을 구성하는 것에 대하여 개시한다. 상기 항원에 기초하여 발명자는 상기 항원을 유지하는 세포를 탐지하기 위한 방법을 개발하고 그리고 또한 이러한 단편이 항원을 유지하는 세포에 대하여 가지는 억제 효과의 증거를 제공한다.
14F7 단일 클론 항체의 결합 사이트에 대한 지식은 다양한 질병의 면역치료에서 이러한 항원의 잠재성으로 인하여 실질적 그리고 치료 관점에서 흥미로운 것으로 만든다. Souriau, C et. al(Expert Opin. Biol. Ther. 1, 845-855, 2001 및 Chester, K.A., et.al in Dis. Markers. 16, 53-62, 2000)은 scFv 형태의 항원 단편의 사용은 종양 조직 내로 더 좋은 침투와 같은 약학적 성질에 대한 이점을 가지면서 더 좋은 치료제로서 사용을 초래할 수 있다는 것을 보여주었다.
하이브리도마로부터 필라멘트형 파지(philamentous phages)에 노출된 항원 단편의 소형-라이브러리의 구성은 이러한 목록 범위 내에서 항원의 특이 인식의 능력을 가진 분자의 선택을 허용한다. 목적물이 더 작은 분자 크기 및 박테리아 숙주에 의하여 생산되는 능력을 가진 최초 항원의 인식을 결합하는 항원 단편을 빠르게 획득한다. 이러한 기술은 기능을 가지지 못하거나 또는 공지의 복제 기술에 의하여 하이브리도마의 가변 영역의 유전자의 분리 및 조작 과정에서 얻어지는 박테리아에서 생산될 수 없는 다수 개의 항원 단편의 변형체를 구별하는 것을 허용한다(Roovers, R. C. et. al, Br. J. Cancer. 78, 1407-1416, 1998).
선상의 파지(filamentous phages)에서 항원 단편을 재현하는 기술은 친화성을 향상시키는 목적물을 이용하여 항원에서 변형체를 도입시키기 위할 뿐만 아니라 항원의 결합 사이트에 접근하거나(Chames, P. et. al, J. Immunol. 161, 5421-5429, 1998, Lamminmaki, U et. al, J. Mol. Biol. 291, 589-602, 1999, Parhami-Seren et. al, J. Immunol. Methods. 259, 43-53, 2002) 또는 그것의 특이성을 조절할 수 있는(Iba, Y. et. al, Prot. Engn., 11, 361-370, 1998, Miyazaki, C. et. al, Prot. Engn. 12, 407-415, 1999, Darveau, R.P. et. al, J. Clin. Immunoassay. 15, 25-29, 1992) 특별한 기회를 제공한다.
선상의 파지에서 항원 단편의 발현은 사슬의 교환을 허용하고(Lantto, J. et. al, Methods Mol. Biol. 178, 303-316, 2002), 이것은 최초 항원 VH를 이용하여 서로 다른 VL들의 조합으로 되거나 또는 그 역으로 행해지고 그리고 이로 인하여 체인의 각각의 하나들이 항원의 인식 및 항원의 친화성에서 그것의 영향력에 대한 역할을 연구하는 것을 허용한다(Kabat, E. A., 쪄, T. T., J. Immunol. 147, 1709-1719, 1991, Barbas III, C. F., Lerner, R. A. Methods; A companion to Methods in Enzymology 2, 119-124, 1991). 사슬의 교환은 결합 사이트의 성질을 수정하고 그리고 또한 서로 다른 종으로부터 면역글루블린 서열을 결합하고 그리고 인식 특이성을 보존하는 이러한 변형체를 선택하는 것을 허용한다(Klimka, A. et. al, Br. J. Cancer. 83, 252-260, 2000, Steinberger, P. et. al, J. Biol. Chem. 275, 36073-36078, 2000, Rader, C. et. al, Proc, Natl. Acad. Sci. USA. 95, 8910-8915, 1998, Beiboer, S.W.H.et. al, J. Mol. Biol. 296, 833-849, 2000).
본 발명은 환자에게 투여된 경우 동일한 친화성을 가지고 최초 항원을 인식하고 그리고 더 작은 면역원성을 초래하는 쥐과동물 14F7 단일 클론 항체로부터 유도된 변형된 항체에 관한 것이다. 본 발명의 다른 발견은 최초의 것과는 서로 다른 경 사슬(light chain)의 가변 영역을 포함하지만 특이성, 친화성 및 인식에서 그것의 성질을 유지하고 그리고 선상의 파지 표면에서 표현될 뿐만 아니라 가용성 분자로서 박테리아 숙주에 의하여 발현이 될 수 있는 상기 항체로부터 유도된 단편을 얻는 것이었다. 14F7 항체로부터 유도된 단편은 치료 무기로서 유용하다.
추가로 M13 선상 파지의 표면 위에 14F7 항체의 scFv 형태 단편의 발현은 치료의 목적으로 결합 사이트를 조작하고 그리고 더 높은 친화성을 가지는 변형체를 얻는 것을 허용한다.
본 발명의 목적의 하나는 단지 부분적으로 14F7의 서열을 보존하지만, 그러나 그것의 특이성, 친화성 및 인식 성질을 유지하는 항체 단편을 제공하는 것이다.
얻어진 변형된 항체 및 단편 양쪽은 NGcGM3를 발현하는 종양 세포를 특이적으로 인식하고 그리고 이로 인하여 상기 종양의 진단 및 치료에서 사용될 수 있고 그리고 그들이 최초로 기원했던 쥐과동물 항체보다 더 작은 면역원성을 가지도록 만든다.
상기 항체 또는 단편이 항원을 발현하는 종양을 국소적으로 만들거나 또는 치료하기에 유용한 방사성 동위원소(radioactive isotope)에 결합이 될 수 있는 변형된 14F7 또는 그것의 Fv 단일 사슬 단편을 포함하는 새로운 치료 조성물이 본 발명의 목적이 된다.
본 발명의 또 다른 목적은 방사성 동위 원소에 결합된 변형된 14F7 항체 또는 그것의 단편을 포함하는 약학 조성물을 사용하여 NGcGM3을 발현하는 종양의 방사선 면역진단 또는 방사선 면역치료를 위한 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 14F7 Mab의 가변 영역 VH(a) 및 VK(b)의 아미노산 서열 및 각각의 가장 상동적인 인간 서열을 도시한 것이다. CDRs는 밑줄로 표시가 되고 그리고 암피페틱 영역 및 잠재 T 에피토프는 어두운 부분으로 표시가 되었다. 실행이 된 변이를 이용하여 가변 영역을 인간에게 적용을 시킨(humanization) 결과로서 나타나는 서열이 또한 도시되었다.
도 2는 경쟁 엘리사(competitive ELISA)에 의하여 측정이 된 14F7Q 항체의 인식을 도시한 것이다.
X 축: 항체 농도의 발현
Y 축: 492 nm에서 측정된 흡수
ior C5 단일 클론 항체가 음성 대조로서 사용이 되었다.
도 3은 쥐과동물 종양 성장(흑색종 B16 종양 세포 라인)에서 14F7 단일 클론항체의 효과를 도시한 것이다.
도 4의 A)는 혈관 형성에 대한 14F7 단일 클론 항체의 효과에 대한 면역통계학적 연구를 도시한 것이다. 화살표는 면역 얼룩을 표시한 혈관을 지시한다. 그리고 B)는 14F7 단일 클론 항체에 의하여 유도된 혈관신생성의 억제를 도시한 것이다.
도 5는 pHG-1m 벡터의 다이어그램을 도시한 것이다.
도 6은 14F7 단일 클론 항체의 VL 및 선택된 Fv 단일 사슬 단편의 단백질 서열을 도시한 것이다. 점들은 14F7의 VL 서열의 상동성을 나타낸다.
도 7은 항체 단편을 가지는 파지에 의한 인식 특이성을 도시한 것이다. 파지 내에 있는 노출된 단편에 의하여 14F7 Ab의 강글리오사이드에 대한 결합의 억제가 관찰되었다. 판은 N-글리콜릴 GM3로 코팅이 되었고 그리고 파지는 바이러스 입자 및 다양한 농도의 14F7을 이용하여 배양이 되었다.
도 8은 가용성 정제 단편에 의한 N-글리콜릴 GM3의 인식을 도시한 것이다.
본 발명에서 기탁 번호 ECACC 98101901를 가진 하이브리도마에 의하여 생산된 쥐과동물 14F7 단일 클론 항체로부터 유도된 키메릭 항체가 기술되고, 중 및 경 사슬의 초-가변 영역(CDRs)의 아래와 같은 서열에 의하여 특징이 지워진다:
중사슬 (HEAVY CHAIN)
CDR1 : SYWIH
CDR2 : YIDPATAYTESNQKFKD
CDR3 : ESPRLRRGIYYYAMDY
경사슬 (LIGHT CHAIN)
CDR1 : RASQSISNNLH
CDR2 : YASQSIS
CDR3 : QQSNRWPLT
우선적으로 상기 키메릭 항체는 중 및 경 사슬의 구조 영역(FRs)의 아래와 같은 서열에 의하여 특징이 지워진다:
중 사슬(HEAVY CHAIN)
FR1 : QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYSFT
FR2 : WLKQRPDQGLEWIG
FR3 : KAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCAR
FR4 : WGQGTTVTVSS
경 사슬
FR1 : DLVLTQSPATLSVTPGDSVSFSC
FR2 : WYQQRTHESPRLLIK
FR3 : GIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFC
FR4 : FGAGTKLELKRA
더욱이 키메릭 항체는 IgG1 인간 경 사슬의 고정 영역 및 Ck 인간 경 사슬의 고정 영역을 포함하는 것에 의하여 특징이 지워진다.
우선 표현에서, 본 발명은 기탁 번호 ECACC 98101901을 가진 하이브리도마에 의하여 생산이 된 쥐과동물 14F7 단일 클론 항체로부터 유도된 변형 항체에 관한 것으로서, 중 및 경 사슬의 구조 영역이 아래와 같은 변이의 임의의 것을 포함하는 것으로 특징이 지워진다:
중 사슬
포지션 5 : V 대신에 Q
포지션 9 : A 대신에 N
포지션11 : V 대신에 L
포지션12 : V 대신에 A
포지션18 : V 대신에 M
포지션19 : R 대신에 K
포지션20 : V 대신에 M
포지션38 : R 대신에 K
포지션40 : A 대신에 R
포지션42 : G 대신에 D
포지션48 : V 대신에 I
경 사슬
포지션39 : K 대신에 R
포지션40 : P 대신에 T
포지션41 : G 대신에 H
포지션42 : Q 대신에 E
포지션58 : V 대신에 I
바람직하게, 상기 변형 항체는 IgG1 인간 중 사슬의 고정 영역 및 Ck 인간 경사슬의 고정 영역을 포함하는 것에 의하여 특징이 지워진다.
본 발명의 다른 특징은 하이브로도마(기탁 번호 ECACC 98101901)로부터 얻어진 중 사슬의 고정 영역의 서열을 포함하고 그리고 14F7의 인식 특이성을 보존하는 14F7 항체로부터 유도된 Fv 단일 사슬 형태 단편에 관한 것이다.
바람직하게 상기 Fv 단편은 면역되지 않은 쥐과동물 또는 인간으로부터 유도되고 선상의 파지 또는 가용성 분자 위에 표현된 항체 단편으로 박테리아 숙주에 의하여 생산이 허용이 되는 언급된 하이브리도마에 의하여 생산된 경 사슬 가변 영역과는 다른 경 사슬 가변 영역을 포함한다.
본 발명은 또한 14F7로부터 유도된 단편을 생산하는 키메릭 및 인간 적용 항체 그리고 박테리아 클론을 발현하는 세포 라인에 관한 것이다.
추가로 본 발명은 본 발명의 재조합 단일클론 항체 또는 그것의 단편 중 하나를 포함하는 것에 의하여 특징이 지워지고 유해한 유방 및 흑색종 종양 그들이 전이 및 재발의 치료 및/또는 국소화 및 확인을 위한 약학적 조성물뿐만 아니라 그들의 적용을 위한 적당한 부형제에 관한 것이다. 상기 항체 또는 단편은 유해한 종양의 국소화 및/또는 치료에 유용한 방사성 동위 원소에 결합이 될 수 있다.
마지막으로 본 발명은 유해한 종양의 치료 및/또는 국소화 및 확인에 유용한 약학적 조성물을 제조하기 위한 기술된 재조합 항체의 사용에 관한 것이다.
본 발명을 실행하고 그리고 사용하는 방법의 상세한 기술이 아래에서 언급이 된다:
1. ADNc 합성 및 14F7 쥐과동물 항체의 가변 영역의 PCR ( 폴리머라제 연쇄 반응)에 의한 증폭
쥐과동물 14F7 항체가 낮은 밀도 리포 단백질과 소수성으로 접합하고 GM3(NeuGc) 강글리오사이드를 이용하고 그리고 프로이드 보조제가 존재하는 상태에서 면역 Balb/c 생쥐에 의하여 얻어졌다(EP 0972782 A1, Carr A et. al, Hybroma 19:3:241-247, 2000). RNA가 제조자의 지시에 따라 TRIZOL 추출 방법(GIBCO BRL, NY)을 사용하여 NGcGM3를 인식하는 14F7 단일클론 항체(쥐과동물 IgG1 Mab)를 생산하는 하이브리도마의 106 세포로부터 얻어졌다.
보조 DAN(DNAc)의 합성 및 VH 및 VL 가변 영역의 증폭이 일련의 반응시약을 사용하여 실행이 되었다: 제조자의 권장에 따른 접근 RT-PCR(Promega USA). 요약하면, 반응이 RNA에 폴리 A 테일 및 각각의 VH 및 VL 가변 영역의 말단의 해당 올리고뉴클레오티드 내에서 잡종화를 시키도록(hybridizing) 설계된 25 pmoles의 dT 올리고뉴클레오티드의 존재 아래에서 5 ㎍의 RNA로부터 실행이 되었다. 10분 동안 60 ℃에서 배양이 되고 그리고 이후 0.2 mM의 각각의 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), 1 mM MgSO4, 5 u의 AMV-역 전사제 및 5 u의 DNA 폴리머라제의 혼합물이 전체 부피가 50 ㎕가 되도록 반응버퍼에 첨가된다. 샘플은 45분 동안 48 ℃에서, 2 분 동안 94 ℃에서 배양이 되고 그리고 이후 94 ℃의 온도(30 초), 60 ℃의 온도(1분), 68 ℃(2분)의 온도에서, 68 ℃에서 7분 동안 최종 배양과 함께 40 사이클의 PCR에 따르도록 한다.
2. 케메릭 유전자의 구성 및 증폭된 DNAc 의 서열화
VH 및 VK의 PCR의 생산물이 VH를 위한 제한 효소 Eco RV- Nhe I 및 VK를 위한 제한 효소 Eco RV-Sal I를 이용하여 분해가 되고 그리고 각각의 발현 벡터가 복제된다(Coloma MJ et. al, J Immunol Methods 152:89-104, 1992). VH 영역이 PAH4604에서 복제가 되고 그리고 IgG1 인간 고정 영역 및 선택자로서 L-히스티디놀(L-histidinol)에 저항하는 유전자를 포함했다. VK 영역은 미코페놀 산에 저항하는 유전자 및 고정 인간 카파 영역을 가지는 벡터 PAG4622에서 복제된다. 결과로서 나타나는 유전자 구성은 14F7VH-PAH4604 및 14F7VK-PAG4622로 각각 명해졌다.
양쪽 구성이 제조자에 의하여 기술된 프로토콜에 따라 서열 반응시약 카트 T7 DNA 폴리머라제(Amershan-Pharmacia)를 사용하여 디데옥시뉴클레오티드 방법(Sanger F et. al, PANA USA 74:5463-5470, 1979)에 의하여 서열화되었다.
3. 키메릭 항체의 발현
NSO 세포가 효소 Pvu I을 이용하여 선형화가 된 10 ㎍의 14F7VH-PAH4604 및 10 ㎍의 14F7VH-PAG4622를 이용하여 일렉트로포레이팅(electroporated)이 되었다. DNAs가 에탄올을 이용하여 침전되고, 50 ㎕의 PBS(인산염 버퍼 염수 용액)에 혼합되어 용해되었다. 약 107 세포가 반 융합(confluence)으로 성장을 하고 그리고 원심분리에 의하여 수집이 되었다. 세포는 이후 일렉트로포레이션 트레이 내에서 DNA 와 함께 0.5 ㎖의 PBS에서 재-현탁(resuspend)이 되었다. 얼음에서 10분 동안 유지한 후 세포는 200 V 및 960F 펄스에 따르게 하고 그리고 10분 동안 얼음에 보관하였다. 세포는 10 %의 태아 장딴지 혈청(fetal calf serum : FCS) 및 10 mM의 L-히스티디놀을 이용하여 배양 매개체로 선택된 변형 둘베코(Modified Dulbecco : DMEM-F12)에서 96 웰 플레이트에서 배양이 된다.
형질 변환된 클론이 선택된 매개체를 추가하고 10일 지난 후 가시적으로 만들어졌다.
키메릭 면역글로블린의 생산이 클론 부유물(supernatant)로부터 엘리사(ELISA)에 의하여 결정이 되었다. 이를 위하여 폴리스티렌 판(고 결합, Costar)이 탄산염 중탄산염 버퍼 100 mM, pH 9.8에서 하룻밤 동안 4 ℃로 염소 항 인간 IgG 혈청으로 코팅이 되었다. 판이 이후 PBS-투윈(인산염 버퍼 염수 용액, 0.5 % 투윈-20, pH 7.5)을 이용하여 세척이 되고 그리고 PBS-투윈-FCS에서 희석이 된 배양 부유 샘플이 추가되고 그리고 37 ℃에서 한 시간 동안 배양이 되었다. 판이 다시 PBS-투윈에서 세척이 되고 그리고 이후 37 ℃에서 한 시간 동안 퍼록시다제(Jackson)와 접합이 된 염소 항 인간 카파 사슬 혈청에서 배양이 되었다. 이후 판은 동일한 방법으로 세척이 되고 그리고 기질로서 o-페닐렌디아민(o-fenilendiamine)을 포함하는 pH 4.2 구연산염-인산염 버퍼 용액을 이용하여 배양이 되었다. 15분 후 흡수가 492 nm에서 측정이 된다.
항원을 인식하는 키메릭 항체의 능력은 NGcGM3 및 NacGM3 강글리오사이드를 사용하는 경쟁 엘리사에 의하여 확인이 되었다. 요약하면, 폴리에스티렌 판 (Polysorp, Nunc)이 메탄올 내 4 ug/mL의 NGcGM3 또는 NAcGM3 상태의 50 uL의 용액으로 코팅이 되고 그리고 37 ℃에서 한 시간 동안 배양이 된다. 판은 이후 37 ℃에서 한 시간 동안 pH 7.8 -8.0의 트리스-HCl 버퍼에서 1 %의 보바인 혈청알부민 용액(BSA) 200 ul를 이용하여 차단이 된다. PBS를 이용한 세 번의 세척 후, 트리스-HCl-BSA 1% 내에서 희석화가 된 샘플이 2 시간 동안 37 ℃에서 바이티닐레이트가 된(biotinilated) 쥐과동물 14F7 항체 1 mg/mL의 존재 아래에서 2 ug/mL - 0.01 ug/mL의 농도 범위에서 첨가가 된다. 이후 판이 PBS를 이용하여 세척이 되고 그리고 반응이 37 ℃에서 1 시간 동안 스트렙타비딘-퍼록시다제 접합(Jackson)을 이용하여 진행이 된다. 흡수가 492 nm에서 측정이 된다.
4. T 에피토프의 모유화에 의하여 인간에게 적용된 Ab 14F7hT의 구성
T 에피토프의 예상
14F7의 가변 영역의 서열이 AMPHI 프로그램(Margalit H et. al, J Immunol 138: 2213-2229, 1987)을 이용하여 분석이 되고, 이것은 T 세포 면역원성과 관련이 되는 안피페틱(anphypatic) 헬릭스 구조를 가진 7 내지 11 아미노산의 세그멘트의 확인을 허용한다. 이러한 알고리즘은 이러한 경우 쥐과동물 14F7 단일 클론 항체의 중 및 경 사슬의 가변 영역에서 T 에피토프의 표현과 관련된 단편을 예상한다.
- 인간 면역글로블린의 상동성의 분석
14F7 가변 영역의 아미노산 서열은 쥐과동물 분자의 분석이 이루어지면서 가장 높은 상동성을 가진 인간 면역글로블린을 확인하기 위하여 보고가 된 인간 면역글로블린의 가변 영역의 서열이 비교되었다. 이를 위하여 블라스트 프로그램 (Altschul S F et. al, Nucleic Acids Res 25:3389-3402, 1997)을 통하여 인터넷으로 이용 가능한 SWISSPROT 데이터베이스가 이용될 수 있다.
- 면역원성의 감소를 위한 분석
방법의 핵심은 FRs에 있는 특이적인 변이의 최소화와 함께 항원 인식 사이트의 3차원 구조 내에 포함된 위치를 배제시키는 암피페틱 헬릭스 구조(amphipatic helix structure)를 가지는 세그멘트 내에서 가능한 T 에피토프의 탈장(rupture) 또는 인간 적용에 의하여 면역원성의 감소를 성취하는 데 있다.
본 발명의 방법에 따라 쥐과동물 면역글로블린의 가변 영역 VH 및 VL의 서열이 가장 높은 상동성을 가지는 인간의 면역글로블린과 비교가 되고 그리고 쥐과동물과 인간 서열 사이에 차이를 나타내는 나머지는 FRs의 영역 내에 있는 암피페틱 영역 내에서만 단지 확인이 되었다(Kabat E, Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health, 1991). 이러한 “쥐과동물” 잔여물은 인간의 동일한 서열 위치에서 발견되는 것들의 의하여 변이에 민감한 것들이다.
정준 구조(canonic structure)를 초래하는 FRs 위치에 존재하는 잔여물, 베니어 영역(Vernier) 내에 존재하는 것들 또는 VH-VL 상호상의 상호 작용에 참여하는 것들은 항원의 가변 영역의 3차원 구조에 영향을 미칠 수 있고 그리고 이로 인하여 항원에 대한 결합에 영향을 미치기 때문에 변이가 될 수 없다. 제3 구조에 대하여 제안된 치환의 영향에 관한 추가적인 정보는 가변 영역의 분자 모델링에 의하여 얻어질 수 있다.
변이의 분석에 있어서 암피페틱 헬릭스 내 플로린 잔여물의 존재 또는 몇 가지 쥐과동물 잔여물은 대부분의 상동적인 인간 서열 내에 동일한 위치에서 나타나지 않지만 다른 인간 면역글로블린에서 종종 나타난다는 사실과 같은 요소들은 변이의 최대를 포함하는 전환된 것을 얻는 것이 가능한 것으로 취급이 된다, 즉 인간 서열과 다른 모든 쥐과동물 잔여물이 변이가 되지만, 그러나 다른 전환된 것이 변이의 서로 다른 조합과 함께 얻어질 수 있다.
가능한 T 에피토프를 14F7의 쥐과동물 서열에서 확인하고 그리고 이러한 세그멘트 내부에서 인간의 것과는 서로 다른 잔여물을 확인한 후, 치환체들이 유도된 돌연변이의 공지된 기술에 의하여 만들어진다.
- NSO 세포 내에서 인간에게 적용된 14F7hT 항체의 복제 및 발현
일단 14F7hT 항체의 VH 및 VL 영역에 해당하는 유전자 구조가 위에서 기술한 방법에 의하여 얻어지면, 이들은 아래의 유전자 구조를 포함하고 키메릭 항체 구조의 경우 위에서 기술한 것과 유사하게 각각의 발현 벡터 내에서 복제가 된다: 14F7hTVK-PAG4622 및 14F7hTVH-PAH4604. 이러한 유전자의 NSO 세포에 대한 형질 전환은 정확하게 키메릭 항체를 위하여 기술된 동일한 조건 아래에서 행해진다. 인간에게 적용된 항체를 생산하는 클론들이 또한 ELISA에 의하여 탐지된다.
인간에게 적용된 항체에 의한 항원의 특이적 인식의 능력이 NGcGM3 및 NAcGM3 강글리오사이드를 사용하여 경쟁 ELISA에 의하여 확인이 된다. 이를 위한 절차는 키메릭 항체를 위하여 기술된 것과 동일하다.
5. 14F7 하이브리도마로부터 선상의 파아지에 대한 항체 단편 라이브러리의 구성
메신저 RNA가 14F7 하이브로도마의 세포로부터 분리가 되고, 보충 DNA가 합성이 되고 그리고 중 및 경 사슬의 가변 영역에 해당하는 서열이 쥐과동물 가변 영역의 넓은 스펙트럼을 이용하여 잡종화를 위하여 설계가 된 2개의 일련의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 별개로 증폭이 되었다. 각각의 증폭된 중 사슬의 가변 영역이 정제되고, 적당한 효소를 이용하여 분해가 되고 그리고 동일한 효소를 이용하여 이미 분해가 된 파지미드(phagemide) pHG-1m 벡터(선상의 파지의 표면에 단일 사슬 항체의 표현을 위하여 설계가 된)에 결합이 된다. 결합 반응의 생산물이 정제가 되고 그리고 TG1 E. coli 가닥의 박테리아 내에서 일렉트로포레이션에 의하여 도입이 되었다. 마지막으로 그들의 유전자 구조가 일렉트로포레이션에 의하여 TG1 가닥의 박테리아 내에 도입이 되었고 독립적인 라이브러리의 서로 다른 형태를 확신시켰다. 그들 중의 하나가 경 사슬의 가변 영역을 이용하여 구성이 되고 그리고 또한 14F7 하이브리도마의 세포로부터 얻어지는 제한된 다양성의 소형-라이브러리가 된다. 사슬 교환의 라이브러리가 또한 하이브리도마로부터 중 사살의 가변 영역이 쥐과동물 및 인간 림프구로부터 얻어지는 경 사슬의 가변 영역의 다양한 수집과 조합되는 되는 곳에서 얻어진다.
6. N-글리콜릴 GM3 에 대항하는 항체 단편을 생산하는 클론의 분리 및 특성화
각각의 라이브러리의 집락(colony)이 보조 파지(auxilliar phage) M13 K07을 사용하여 그들로부터 파지를 생산하기 위하여 임의로 취해진다. 항체 단편을 가지는 파지를 위한 N-글리콜릴 GM3의 인식이 고체상 면역효소 시험(ELISA)에 의하여 직접적으로 분석이 된다. 이로 인하여 기능적인 단편을 생산하는 클론이 국소화가 된다. 각각의 라이브러리를 형성하는 변형된 박테리아의 전체 혼합물로부터 항체 단편을 가지는 파지가 제조물이 기능적인 항체 단편 내에서 풍부해지도록 얻기 위하여 그리고 라이브러리의 다양성을 탐구하도록 하기 위하여 생산이 된다. 얻어진 파지 혼합물이 고체 표면에 결합이 된 항원 N-글리콜릴 GM3와 접촉하도록 위치시키고, 그리고 결합 능력을 가진 항체 단편을 가지는 파지가 유지되고 그리고 나머지는 배출 세척(exhaustive washings)에 의하여 제거된다. 결합된 파지가 pH 변화에 의하여 용출이 되고(elute) 그리고 항원에 대한 새로운 선택을 위하여 출발 물질로서 기능을 하는 새로운 파지 혼합물을 얻기 위하여 증식이 된다. 다양한 선택 사이클 후 집락으로부터 파지에 표현된 항체 단편의 인식이 분석이 된다. 이로 인하여 초기 라이브러리에서 희석이 된 기능적인 단편을 생산하는 추가적인 클론이 확인이 된다.
클론에 의하여 생산이 된 항체 단편의 특성은 관련된 강글리오사이트의 패널에 대항하여 ELISA에 의한 특이성의 분석, 면역통계학에 의한 종양 인식의 연구, 파지 내 그들의 표현의 내용물 외부에서 가용 기능성 항체 단편으로 생산될 수 있는 능력의 평가 및 그들의 가변 영역의 완전한 서열화를 포함한다.
실시 예:
아래의 실시 예에서 반응 시약뿐만 아니라 사용된 모든 제한 효소 또는 변형 그리고 물질은 달리 구체적으로 명시하지 않는 한 상업적 공급을 통하여 얻어졌다.
실시 예1. 14F7 키메릭 단일클론 항체의 획득
DNAc의 합성 및 VH 및 VK 쥐과동물 가변 영역의 PCR에 의한 증폭이 VH를 위한 제한 사이트 Eco RV-Nhe I 그리고 VK를 위한 제한 사이트 Eco RV-Sal I을 이용하여 특이적 강글리오사이트를 사용하여 벤트 폴리머라제 효소로서 실행이 되었다. 스위치 올리고뉴클레오티드는 아래와 같았다:
VH에 대하여:
올리고뉴클레오티드 1(신호 펩티드 내 하이브리드):
5′ggg gatatc cacc atg gaa agg cac tgg atc ttt ctc ttc ctg 3′
올리고뉴클레오티드 2(JH1 내 하이브리드):
5′ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3′
VK에 대하여:
올리고뉴클레오티드 1(신호 펩티드 내 하이브리드):
5′ggg gatatc cacc atg gt(at) t(tc)c (ta)ca cct cag (at)t(ac) ctt gga ctt 3′
올리고뉴클레오티드 2(VLJ5 내 하이브리드)
5′agc gtcgac tta cgt ttc agc tcc agc ttg gtc cc 3′
VH 및 VK의 PCRs의 생산물이 VH를 위한 제한 효소 Eco RV-Nhe I 그리고 VK를 위한 제한 효소 Eco RV-Sal I를 이용하여 분해가 되고 그리고 VH 및 VK 각각을 위한 각각의 발현 벡터 PAH4604 및 PAG4622 내에서 복제되었다. 이러한 벡터가 포유동물 내 면역글로블린의 발현을 위하여 사용이 되고 그리고 Sherie Morrison(UCLA, California, USA)에 의하여 기증이 되었다. 벡터 PAH4604는 포함된 인간 IgG1 고정 영역 및 인간 고정 카파 영역 PAG4622를 가진다(Coloma J et. al, J Immunol Methods 152:89-104, 1992). 일단 14F7의 VH 및 VK 영역이 위의 벡터 내에서 복제가 되면, 구성 14F7VH-PAH4604 및 14F7VK-PAG4622가 형성이 된다.
12개의 독립적인 클론이 제조자에 의하여 기술된 프로토콜에 따라 T7 DNA 폴리머라제 서열화 키트(Amershan-Pharmacia)를 사용하여 디데옥시뉴크레오티드 방법(Sanger F et al, DNA sequencing with chaiin-terminating inhibitors. PNAS USA 1979: 74:5463-5470). VH 및 VK 서열은 Kabat 분류(Kabat E, Sequences of proteins of immunological interist, Fifth Edition, National Institude of Health, 1991)에 따라 각각 IIB 및 V 서브 그룹(도 1A 및 B)과 높은 관련성을 가진다.
NSO 세포는 효소 Pvu I를 이용하여 선형화가 된 10 ug의 14F7VH-PAH4604 및 10 ug의 14F7VK-PAG4622를 이용하여 일렉트로포트레이트가 되었다. DNAs가 에탄올을 이용하여 침전이 되고 그리고 50 uL의 PBS에 혼합이 되고 용해가 되었다. 반 융합(semi confluence)이 원심 분리에 의하여 수집이 될 때까지 약 107 세포가 성장이 되고 그리고 일렉트로포레이션 트레이에서 DNA와 함께 0.5 ml의 PBS 내에서 재-현탁이 되었다. 얼음에 10분 동안 둔 후 세포는 200 V 및 960 F의 펄스에 따르도록 하고 그리고 10분 동안 얼음에서 배양이 되었다. 세포는 10 % FCS 및 10 mM의 L-히스티디놀을 이용하여 둘베코 변형(DMEM-F12) 선택 매개체로 96 웰 플레이트에서 배양이 되었다. 형질 전환된 클론이 선택 매개체를 첨가하고 10일 지난 후에 나타났 다. 키메릭 면역글로블린의 생산물은 클론 부유체를 사용하여 엘리사에 의하여 결정이 되었다. 이를 위하여 폴리에스티렌 판(고 결합, Coastar)가 하룻밤 동안 4 ℃에서 pH 9.8의 탄산염 중탄산염 버퍼 100 mM에서 염소 항 인간 IgG 혈청(Sigma)으로 코팅이 되었다. 이후 판이 PBS-투윈(인산염 버퍼 염수 용액, 0.5 % 투윈, pH 7.5)으로 세척이 되고 그리고 PBS-투윈-FCS에서 희석이 된 배양 부유 샘플이 첨가되고 37 ℃에서 1시간 동안 배양이 되었다. 판이 다시 PBS-투윈으로 세척이 되고 그리고 이후 37 ℃에서 한 시간 동안 퍼록시다제(Jackson)를 이용하여 접합이 된 염소 항 인간 카파 사슬 혈청에서 배양이 되었다. 이후 판은 동일한 방법으로 세척이 되고 그리고 o-페닐렌디아민 기질을 포함하는 pH 4.2의 구연산염-인산 버퍼 용액을 이용하여 배양이 되었다. 15분 후 흡수가 452 nm에서 측정이 되었다.
실시 예 2. NGcGM3 및 NAcGM3 항체에 대한 14F7Q 항체의 반응성.
14F7 키메릭 항체(Ab)의 반응성이 경쟁 엘리사에 의하여 결정이 되었다. 도 2는 GM3 N-글리콜리레이트가 된 강글리오사이드로 코팅이 된 폴리에스티렌 판(Polysorp Nunc)의 인식에서 쥐과동물 14F7과 비교가 된 키메릭 14F7의 특이성을 도시한 것이다. 양쪽 Abs는 쥐과동물 바이오틴일레이트가 된 14F7 Ab에 의하여 항원 인식의 유사한 농도 50% 억제를 보여준다. 한편 항체들의 어느 하나를 위한 GM3의 N-아세틸레이트가 된 변형체로서 판을 코팅을 하는 경우 아무런 면역 반응성이 관찰되지 않았다. 쥐과동물 C5 Mab가 비-상관성(irrelevant) Ab로 사용이 되었다.
실시 예 3. 인간에게 적용된 항체의 서로 다른 전환체 (versions)의 획득.
14F7 VH 및 VK 서열이 VH 및 VK 영역(도 1A 및 B)를 위한 14F7 항체의 가장 상동적인 인간 서열을 획득하는 인간 서열 데이터베이스와 비교가 되었다. 추가로 양쪽 서열에서 암피페틱 영역 또는 잠재적인 T 에피토프가 결정이 되었다. 이후 쥐과동물 VH 및 VK 서열을 인간 서열로 전환시키기 위한 변이가 T 에피토프의 모유화의 방법에 따라 결정이 되었다. 아래에서 실행이 될 수 있는 최대 가능 변이가 기술이 된다.
VH 영역의 경우 포지션 5, 9, 11, 12, 18, 19, 20, 38, 40, 42 및 48의 변이가 도입되었고, 상기에서 아미노산 Q, N, L, A, M, K, M, K, R, D 및 I가 각각 V, A, V, V, V, R, V, R, A, G 및 V를 위하여 치환이 되었다. 이러한 변이가 먼저 PCRs에서 올리고뉴클레오티드 1, 및 2, 그리고 3 및 4를 사용하여 PCR 생산물을 겹치는 것(Kamman M et. al, Nucleic Acids Research 17: 5404-5410, 1989)에 의하여 실행이 되었고, 결과물이 단지 올리고뉴클레오티드 2 및 4를 이용하여 다른 PCR에서 겹쳐졌다(overlapped). 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열은 아래와 같다:
중 사슬의 변이 5, 9, 11 및 12를 위한 올리고뉴클레오티드:
올리고뉴클레오티드 1 : 5′ gtc cag ctt gtg cag tct ggg gct gaa gtg gta aaa cct ggg 3′
올리고뉴클레오티드 2 : 5′ ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3′
올리고뉴클레오티드 3 : 5′ ccc agg ttt tac cac ttc agc ccc aga ctg cac aag ctg gac 3′
올리고뉴클레오티드 4 : 5′ ggg gatatc cacc atg gaa agg cac tgg atc ttt ctc ttc ctg 3′
일단 위의 변이가 서열화되고 그리고 확인이 되면, 18, 19 및 20 포지션에서 변이가 아미노산 V, R, V를 각각 M, K, M으로 치환하면서 이들이 수행했던 DNAs 내에 도입이 된다.
아래에서 상기 변이를 위하여 기술이 된 올리고뉴클레오티드 1 및 2, 그리고 3 및 4를 나타내었다. PCRs 생산물의 겹침(overlapping)이 위에서 기술된 것처럼 실행이 되었다.
중 사슬의 변이 18, 19 및 20을 위한 올리고뉴클레오티드:
올리고뉴클레오티드 1 : 5′ ggg gcc tca gtg agg gtg tcc tgc agg 3′
올리고뉴클레오티드 2 : 5′ ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3′
올리고뉴클레오티드 3 : 5′ cct gca gga cac cct cac tga ggc ccc 3′
올리고뉴클레오티드 4 : 5′ ggg gatatc cacc atg gaa agg cac tgg atc ttt ctc ttc ctg 3′
마찬가지로 일단 위의 변이가 서열화되고 그리고 확인이 되면, 변이 R, A, G가 각각 아미노산 K, R, D를 치환하면서 그들을 실행했던 DNAs 내 38, 40 및 42에 도입이 되었다.
아래에서 이러한 변이를 위하여 기술이 된 올리고뉴클레오티드 1 및 2. 그리 고 3 및 4를 나타내었다.
중 사슬의 변이 38, 40 및 42를 위한 올리고뉴클레오티드:
올리고뉴클레오티드 1 : 5′ cac tgg tta aga cag gca cct ggc cag ggt ctg 3′
올리고뉴클레오티드 2 : 5′ ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3′
올리고뉴클레오티드 3 : 5′ cag acc ctg gcc agg tgc ctg tct taa cca gtg 3′
올리고뉴클레오티드 4 : 5′ ggg gatatc cacc atg gaa agg cac tgg atc ttt ctc ttc ctg 3′
마지막으로 서열에 의하여 확인을 한 후, 포지션 48에 있는 이전의 변이가 V를 위한 아미노산 I로 치환하면서 그들을 가지는 DNAs 내로 도입이 되었다. 아래에서 이러한 변이에서 사용이 된 올리고뉴클레오티드 1 및 2, 그리고 3 및 4를 나타내었다. PCR 생산물의 겹침이 이전에 기술한 것처럼 실행이 되었다.
중 사슬의 변이 48을 위한 올리고뉴클레오티드:
올리고뉴클레오티드 1 : 5′ ctg gaa tgg gtt gga tac att 3′
올리고뉴클레오티드 2 : 5′ ggg gctagc tga gga gac ggt gac cgt ggt 3′
올리고뉴클레오티드 3 : 5′ aat gta tcc aac cca ttc cag 3′
올리고뉴클레오티드 4 : 5′ ggg gatatc cacc atg gaa agg cac tgg atc ttt ctc ttc ctg 3′
모든 이러한 변이가 서열에 의하여 확인이 되었다. 얻어진 유전적인 구성이 14F7hTVH로 명명이 되었다.
중 사슬의 경우 이러한 치환들이 베니어 존(Vernier zone)의 아미노산을 포함하거나 또는 항원 인식에서 키 포지션이 되기 때문에 VH14F7 및 수행이 되지 않은 가장 유사한 인간의 것 사이에서는 서로 다른 아미노산이 존재한다.
경 사슬의 경우 포지션 39, 40, 41, 42 및 58에서 변이가 실행이 되었고, K, P, G, Q 및 V에 대하여 각각 R, T, H, E, I로 치환을 하였다. 변이가 중 사슬과 동일한 방법으로 도입이 되었다. 사용된 올리고뉴클레오티드 서열이 아래에서 기술이 된다.
경 사슬의 변이 39, 40, 41 및 42를 위한 올리고뉴클레오티드.
올리고뉴클레오티드 1 : 5′ tat caa caa aaa cca ggt cag tct cca agg 3′
올리고뉴클레오티드 2 : 5′ agc gtcgac tta cgt ttc agc tcc agc ttg gtc cc 3′
올리고뉴클레오티드 3 : 5′ cct tgg aga ctg acc tgg ttt ttg ttg ata 3′
올리고뉴클레오티드 4 : 5′ ggg gatatc cacc atg gt(at) t(tc)c (ta)ca cct cag (at)t(ac) ctt gga ctt 3′
서열의 의하여 이전의 변이를 확인한 후 포지션 58에 변이가 V를 위하여 아미노산 I로 치환을 하면서 그들을 가진 DNAs 내로 도입이 되었다. 아래에서 이러한 변이에 사용이 된 올리고뉴클레오티드 1 및 2, 그리고 3 및 4를 나타내었다. PCRs 생산물의 겹침(overlapping)이 이전에 기술된 방법에 따라 실행이 되었다.
경 사슬의 변이 58을 위한 올리고뉴클레오티드.
올리고뉴클레오티드 1 : 5′ att tct ggg gtc ccc tcc agg 3′
올리고뉴클레오티드 2 : 5′ agc gtcgac tta cgt ttc agc tcc agc ttg gtc cc 3′
올리고뉴클레오티드 3 : 5′ cct gga ggg gac ccc aga aat 3′
올리고뉴클레오티드 4 : 5′ ggg gatatc cacc atg gt(at) t(tc)c (ta)ca cct cag (at)t(ac) ctt gga ctt 3′
일단 변이가 실행이 된 후 서열에 의하여 확인이 되었다.
VK 및 VH 인간에게 적용된 영역이 각각 구성 14F7hTVH-PAH4604 및 14F7hTVK-PAG4622를 형성하면서 벡터 PAG4622 및 PAH4604 내에서 복제가 되었다. NSO 세포가 Pvu I를 이용한 분해에 의하여 미리 선형화가 된 인간에게 적용된 가변 영역 14 F7hTVH-PAH4604 및 14F7hTVK-PAG4622를 가지는 10 ug의 각각의 벡터를 이용하여 일렉트로포레이트가 되었다. 일렉트로포레이션 과정 및 14F7hT 인간에게 적용된 항체를 발현하는 클론의 탐지는 키메릭 항체를 위하여 기술된 것과 동일하였다.
실시 예 4: 생체 내 혈관신생성 모델에서 종양 성장 감소에 대한 14F7 Ab 의 영향
혈관신생성 유도체(angiogenesis inductor)로서 기질 겔과 혼합된 흑색종 B16 종양 세포 라인이 생체 내 혈관 신생성을 위한 모델로서 사용이 되었다.
기질 겔을 이용하여 C57/BL6 수컷 생쥐의 중간 배쪽 라인(ventral line) 내에 종양 라인(B16)의 피하 주입을 하면서, 종양 혈관신생성 과정의 유도가 측정이 되었다. 이를 위하여 흑색종 B16 세포가 0.5 mL의 기질 겔(matric gel) 및 64 units/mL의 헤파린을 단독으로, 대조 그룹에서 또는 다른 항체와 결합하여 동물의 복강 영역에 피하 주사에 의하여 투여하기 위하여 혼합하였다. 주입한지 15일 후 동물이 희생이 되고 그리고 겔 진주(gel pearls)가 진피 및 표피를 따라 추출이 되고 그리고 종양의 크기가 거시적으로 시험이 되었다. 도 3은 14F7에 의하여 치료가 된 쥐과동물의 종양의 종양 질량의 크기가 급격하게 감소가 되었다는 것을 보여준다.
신혈관(neovessels)을 구별하기 위하여 조직 병리학적 분석이 헤탐토실린/에오신(hetamtoxilin/eosin)으로 얼룩이 진 겔에 대하여 실행이 되고 그리고 항 PECAM Mab(내피 표시자)를 이용하여 면역 얼룩을 함께 실행하였다. 치료되지 않은 동물의 종양 부분과 비교할 때 도 4 A 및 B에서 혈관의 수에 있어 감소가 14F7을 이용하여 치료가 된 동물의 종양 영역에서 관찰이 되었다.
실시 예 5: 14F7 하이브리도마로부터 선상의 파지에 대한 항체 단편 라이브러리의 구성
메신저 RNA가 5.0 × 106 14F7 하이브리도마 세포로부터 트리퓨어 분리 시약(Tripure Isolation Reagent)(Boehringer Mannheim, Germany)를 이용하여 분리되고 그리고 보조 DNA가 프로-스타 퍼스트 스트랜드 RT-PCR 반응시약 키트(Stratagene, USA)를 이용하여 합성이 되었다. 하이브리도마로부터 유도된 중 및 경 사슬의 가변 영역이 아래의 조건에서 26 사이클의 폴리머라제 사슬 반응에 의하여 증폭이 되었다: 94 ℃에서 50초, 55 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 1분. 이를 위하여 모든 가능한 퇴 화된 올리코뉴클레오티드 키트의 조합이 사용되었고(쥐과동물 가변 영역의 넓은 다양성을 가진 잡종화를 위하여 설계가 된), 이것을 아래의 표로 나타내었다:
VH 및 VL을 증폭하기 위하여 사용된 올리고뉴클레오티드. 퇴화된 포지션은 올리고뉴클레오티드의 서열에서 브래킷에서 나타난다. 제한 사이트의 서열이 밑줄로 표시되었다.
5´ VH Apa LI
5´... ttc tat tct cac agt gca cag (gc)ag gt(gt) cag ct(gt) ac(ag) cag tc(at) gga 3´
5´... ttc tat tct cac agt gca cag gc(ag) gt(ct) ca(ag) ctg cag cag ct(ct) ggg gc 3´
5´... ttc tat tct cac agt gca cag ga(ag) gtg aag ct(gt) (gc)t(gc) gag tct gg(ag) gga 3´
3´ VH Sfi I
5´... ga acc agt act cca ggc ctg agg ggc cgc aga gac agt gac cag agt ccc 3´
5´... ga acc agt act cca ggc ctg agg ggc cga gga gac ggt gac tga ggt tcc3´
5´... ga acc agt act cca ggc ctg agg ggc cga gga gac (gt)gt ga(gc) (ca)gt gga (gc)cc ... 3´
5´ VL Sal I
5´... gta ctc cag tcg acg aca ttg tg(ca) tg(at) t(ac)c agt ctc c...3´
5´... gta ctc cag tcg acg ata tcc aga tga c(ac)c a(ga)a ct(ac) c...3´
5´... gta ctc cag tcg ac(cg) aaa ttg t(tg)c tca ccc agt ctc c...3´
3´ VL Not I
5´... aag gaa aaa agc ggc cgc ttt (tc)a(tg) (tc)tc cag ctt ggt ... 3´
5´... aag gaa aaa agc ggc cgc ttt (tg)a(tg) ctc caa ctt gt(gt)... 3´
증폭된 중 사슬의 가변 영역이 정제되고 그리고 차후 제한 효소 Sfi I 및 ApaLI를 이용하여 분해가 되었다. 분해 생산물이 정제되고 그리고 파지매개체(phagomidium) 벡터 pHG-1m(Heber Biotec S.A., Cuba)의 DNA를 이용하여 결합이 되었다(도 2).
결과로서 나타나는 유전자 구성을 이용하여 E.coli 가닥의 TG1의 박테리아가 일렉트로포레이션에 의하여 변형이 되었다. 변형된 박테리아의 그룹이 중간 크기의 2.3 ×104 개수를 이용하여 14F7 하이브리도마로부터 유도된 중 사슬 가변 영역의 세미-라이브러리를 확신시켰다. 세미-라이브러리의 플라스미드 DNA가 정제가 되고 그리고 이후 Not I 및 Sal I 효소를 이용하여 분해가 되었다. 이러한 DNA가 이미 동일한 효소를 이용하여 분해가 된 경 사슬 가변 영역의 독립된 4개의 수집을 이용하여 결합이 되었다. TG1 가닥의 박테리아가 새로운 유전 구성을 이용하여 변형이 되고 그리고 4개의 독립된 라이브러리가 얻어졌다. 이들 중 하나가 1.6 ×106 개체를 가진 14F7 하이브리도마로부터 유도된 중 및 경 사슬의 양쪽 가변 영역을 포함하는 제한된 다양성의 미니-라이브러리가 되었다. 다른 세 개는 미리 쥐과동물(카파 이소타입) 및 인간(카파 및 람다 이소타입)으로부터 얻어진 경 사슬 가변 영역의 다양한 수집을 결합시킨 사슬 교환 라이브러리가 되었고, 그들 크기는 1.0 × 107, 1.4 × 107 그리고 1.2 ×107 개가 각각 되었다.
실시 예 6: N-글리콜릴 GM3 에 대항하는 항체 단편을 생산하는 클론의 분리
각각의 라이브러리로부터 임의로 취해진 92 클론으로부터 항체 단편을 가지는 파지가 미리 기술된 절차에 따라 마이크로티튤레이션 플레이트 웰에서 생산이 되었다(Marks, J. D. et. al, J. Mol. Biol. 222, 581-597. 1991). 그것의 특이성이 N-글리콜릴 GM3 및 N-아세틸 GM3 1 ug/ml로 코팅이 된 폴리비닐 염화 판(Costar, USA)에서 ELISA로 평가가 되었다. 결합이 된 파지가 퍼록시다제로 접합이 된 항-M13 단일클론 항체를 이용하여 탐지가 되었다(Amersham, Sweden). 임의로 취해진 개별적인 클론의 특성에 추가하여, 각각의 라이브러리를 확신시키는 박테리아 그룹에 의하여 생산이 된 파지의 혼합물로부터 N-글리콜릴 GM3에게 결합하는 능력을 가진 파지의 선택이 실행되었다. 이를 위하여 파지가 보조 파지 M13 K07을 사용하여 생산이 되었고, 그리고 이들이 플라스틱 표면(Inmuno tubes, Nunc, Denmark)에게 결합이 된 N-글리콜릴 GM3과 접촉하도록 두었다. 튜브가 광범위하게 세척이 되고 그리고 파지가 트리에틸라민(triethylamine) 100 mmol/l가 존재하는 상태에서 용출이 되었다. 용출이 중성화가 되고 그리고 E.coli 가닥의 TG1의 박테리아를 감염시키기 위하여 사용이 되었다. 감염된 박테리아의 그룹으로부터 항체를 가지는 파지가 생산이 되고 다시 정제되고 그리고 기술된 것과 동일한 조건에 근사하는 새로운 선택을 위한 출발 물질로서 사용이 되었다. 4번의 선택 사이클 후 각각의 라이브러리로부터 나타나는 파지로 감염이 된 박테리아의 92 집락이 임의로 취해지고 그리고 N-글리콜릴 GM3의 인식이 라이브러리로부터 임의로 취해진 클론의 평가를 위하여 기술한 것과 유사한 형태로 실행이 되었다.
라이브러리의 클론의 직접적인 분석으로부터 생산된 클론이 N-글리콜릴 GM3를 인식하는 항체 단편을 가지는 파지로부터 분리가 되었고, 그리고 세 개의 사슬 교환 라이브러리에서 가변적인 빈도로서 발견이 되었다. 양성 클론이 14F7 하이브리도마로부터 유도된 가변 영역에 의하여 배타적으로 형성된 미니-라이브러리로부터 발견이 되지 않았다. 선택 사이클 후 추가적인 클론이 사슬 교환 라이브러리로부터 분리가 되었고 그리고 어떤 것도 최초 서열의 미니-라이브러리 내에서 발견이 되지 않았다. 아래의 표는 N-글리콜릴 GM3를 인식하는 항체 단편을 생산하는 클론의 양 및 각각의 라이브러리로부터 분석이 된 클론의 전체 수를 나타내는 빈도를 보여준다. 단지 하나의 클론이 N-아세틸 GM3과 교차 반응을 나타내는 파지를 생산하였다.
라이브러리 양성 클론의 빈도 (직접 스크리닝) 양성 클론의 빈도(4 선택 사이클)
미니-라이브러리 하이브리도마 14F7 0/92 0/92
경 카파 쥐과동물 사슬의 교환 31/92(33.70%)* 52/92(56.52%)
경 카파 인간 사슬의 교환 2/92(2.17%) 8/92(17.39%)
경 람다 인간 사슬의 교환 4/92(4.35%) 12/92(13.04%)
N-아세틸 GM3과 교차 반응을 가지는 하나의 클론.
실시 예7. N- 글리콜릴 GM3 을 인식하는 14F7로부터 유도된 항체 단편의 특성화
11 항체 단편의 가변 영역이 삽입된 항체 단편을 코드화하는 서열의 말단 5´ 및 3´을 측면에 위치시키는 pHG-1m 벡터의 영역에서 잡종화를 시키는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 자동 서열자 ALF Express II(Pharmacia, Sweden)로서 완전히 서열화를 하였다. 모든 중 사슬의 가변 영역의 서열이 14F7을 위하여 보고가 된 하나에 해당한다는 것을 확신시켰고 그리고 변화는 단지 PCR에서 퇴화된 올리고뉴클레오티드의 사용에 의하여 가상적으로 도입이 된 구조 1 및 구조 4에서만 나타났다. 대조적으로, 11 클론의 경 사슬의 가변 영역의 서열은 14F7의 하나와는 완전하게 차이가 나고 그리고 서로 다른 서열의 5개 그룹으로 그룹화를 시키고, 이는 쥐과동물 기원 및 인간 기원의 하나(카파 이소타입) 및 람다 이소타입을 제외한 두 개의 다른 인간 기원이 된다. 각각의 서열 그룹을 나타내는 하나의 클론이 추후의 특성화를 위하여 취해졌다.
아래의 표는 최초의 동일성, 기원 및 이소타입 그리고 카배트 분류(Kabat classification)에 다른 서브 그룹에서 분류와 관련하여 선택된 클론의 경 사슬의 가변 영역들 사이의 차이를 보여준다.
VL 기원 이소타입 VL14F7로 동일성 서브그룹
AcM 14F7 쥐과동물 카파 - V
ScFv 2Am 쥐과동물 카파 59.46 % III
ScFv 3Fm 쥐과동물 카파 59.81 % V
ScFv 7Bhk 인간 카파 60.74 % I
ScFv 7Ahl 인간 람다 35.45 % I
ScFv 8Bhl 인간 람다 37.04 % III
클론의 경 사슬의 가변 영역들과 14F7 항체를 위하여 최초로 보고가 된 하나들 사이의 차이가 세 개의 보조 결정 영역을 포함하는 모든 서열을 타라 국소화가 되고 그리고 아래에 나타내었다(도 6).
Figure 112005060112931-PCT00001
Figure 112005060112931-PCT00002
결합의 특이성은 N-글리콜릴 GM3 및 N-아세틸 GM3에 추가하여 여러 가지 N-아세틸레이트가 된 강글리오사이드 및 하나의 N-글리콜릴레이트가 된 강글리오사이 드를 포함하는 관련 강글리오사이드의 패널을 코팅하는 것으로 사용하는 것에 의하여 기술된 방법에 따라 ELISA에 의하여 확신이 되었다. 도 7은 특징화가 된 항체 단편을 생산하는 5 클론에 의하여 서로 다른 항원을 인식하는 것을 보여준다.
단지 표적 항원 N-글리콜릴 GM3에 대한 결합만이 탐지가 되었다.
클론에 의한 가용성 항체 단편(파지의 내용물 외부)의 생산이 1 mmol/l에서 이소프로필-티오갈락토피라노사이드(isopropil-thiogalactopiranoside)의 존재에서 유도가 되었다. 부유물이 수집이 되었고 그리고 페리플라스미틱 부분(periplasmatic fractions)이 확립된 절차에 따라 얻어졌다(de Haard, H. J.Biol. Chem. 274, 18218-18230, 1999). N-글리콜릴 GM3의 인식 활성이 단지 아래의 변형을 이용하는 것을 제외하고 기술된 것과 유사한 상기 항원으로 코팅이 된 판에서 ELISA를 통하여 페리플라스미틱 부분에서 배양 부유물 양쪽에서 탐지가 되었다. 결합 항체 단편이 10 ug/ml에서 1E10 단일 클론 항체(항체 단편에게 유전적 구성으로 융합된 c-myc 펩티드에 대항하여 유도가 된) 및 항 쥐과동물 면역글로블린 접합체(Sigma, USA)를 사용하여 탐지되었다. 항체 단편이 제조자의 지시에 따라 기질 HIS-Select HC Nickel Affinify Gel(Sigma, USA)를 사용하여 금속 이온에 대한 단일 친화성 크로마토그래피로 페리플라스미틱 부분으로부터 정제되었다. 도 8은 정제된 가용성 단편의 ELISA에 의하여 결정이 된 활성을 보여준다.
본 발명에 따라 얻어진 변형된 항체 및 단편 양쪽은 NGcGM3를 발현하는 종양 세포를 특이적으로 인식하고 그리고 이로 인하여 상기 종양의 진단 및 치료에서 사 용될 수 있고 그리고 그들이 최초로 기원했던 쥐과동물 항체보다 더 작은 면역원성을 가지도록 만든다. 본 발명에 따른 항체 또는 단편이 항원을 발현하는 종양을 국소적으로 만들거나 또는 치료하기에 유용한 방사성 동위원소(radioactive isotope)에 결합이 될 수 있는 변형된 14F7 또는 그것의 Fv 단일 사슬 단편을 포함하는 새로운 치료 조성물이 될 수 있다. 본 발명은 방사성 동위 원소에 결합된 변형된 14F7 항체 또는 그것의 단편을 포함하는 약학 조성물을 사용하여 NGcGM3을 발현하는 종양의 방사선 면역진단 또는 방사성 면역치료를 위한 방법으로 사용이 가능하다.
<110> CENTRO DE INMUNOLOGIA MOLECULAR CENTRO DE INMUNOLOGIA MOLECULAR <120> ANTICUERPOS RECOMBINANTES Y FRAGMENTOS QUE RECONOCEN EL GANGLIOSIDO N-GLICOLIL GM3 Y SU USO PARA DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE TUMORES. <130> CU 92/2003 <160> 58 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(5) <400> 1 Ser Tyr Trp Ile His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(17) <400> 2 Tyr Ile Asp Pro Ala Thr Ala Tyr Thr Glu Ser Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(16) <400> 3 Glu Ser Pro Arg Leu Arg Arg Gly Ile Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(11) <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(7) <400> 5 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(9) <400> 6 Gln Gln Ser Asn Arg Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(30) <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Asn Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Met Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(14) <400> 8 Trp Leu Lys Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 9 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(32) <400> 9 Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Phe Met Tyr 1 5 10 15 Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(11) <400> 10 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 23 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(23) <400> 11 Asp Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Phe Ser Cys 20 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(15) <400> 12 Trp Tyr Gln Gln Arg Thr His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 13 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(32) <400> 13 Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Ser Ile Ile Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(12) <400> 14 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 43 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(43) <400> 15 ggggatatcc accatggaaa ggcactggat ctttctcttc ctg 43 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(30) <400> 16 ggggctagct gaggagacgg tgaccgtggt 30 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(48) <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(43) <400> 17 ggggatatcc accatggtat ttcctacacc tcagattacc ttggactt 48 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(35) <400> 18 agcgtcgact tacgtttcag ctccagcttg gtccc 35 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(42) <400> 19 gtccagcttg tgcagtctgg ggctgaagtg gtaaaacctg gg 42 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(30) <400> 20 ggggctagct gaggagacgg tgaccgtggt 30 <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(42) <400> 21 cccaggtttt accacttcag ccccagactg cacaagctgg ac 42 <210> 22 <211> 43 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(43) <400> 22 ggggatatcc accatggaaa ggcactggat ctttctcttc ctg 43 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(27) <400> 23 ggggcctcag tgagggtgtc ctgcagg 27 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(30) <400> 24 ggggctagct gaggagacgg tgaccgtggt 30 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(27) <400> 25 cctgcaggac accctcactg aggcccc 27 <210> 26 <211> 43 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(43) <400> 26 ggggatatcc accatggaaa ggcactggat ctttctcttc ctg 43 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(33) <400> 27 cactggttaa gacaggcacc tggccagggt ctg 33 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(30) <400> 28 ggggctagct gaggagacgg tgaccgtggt 30 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(33) <400> 29 cagaccctgg ccaggtgcct gtcttaacca gtg 33 <210> 30 <211> 43 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(43) <400> 30 ggggatatcc accatggaaa ggcactggat ctttctcttc ctg 43 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(21) <400> 31 ctggaatggg ttggatacat t 21 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(30) <400> 32 ggggctagct gaggagacgg tgaccgtggt 30 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(21) <400> 33 aatgtatcca acccattcca g 21 <210> 34 <211> 43 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(43) <400> 34 ggggatatcc accatggaaa ggcactggat ctttctcttc ctg 43 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(30) <400> 35 tatcaacaaa aaccaggtca gtctccaagg 30 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(35) <400> 36 agcgtcgact tacgtttcag ctccagcttg gtccc 35 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(30) <400> 37 ccttggagac tgacctggtt tttgttgata 30 <210> 38 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(48) <400> 38 ggggatatcc accatggtat ttcctacacc tcagattacc ttggactt 48 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(21) <400> 39 atttctgggg tcccctccag g 21 <210> 40 <211> 35 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(35) <400> 40 agcgtcgact tacgtttcag ctccagcttg gtccc 35 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(21) <400> 41 cctggagggg accccagaaa t 21 <210> 42 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(48) <400> 42 ggggatatcc accatggtat ttcctacacc tcagattacc ttggactt 48 <210> 43 <211> 50 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(50) <400> 43 ttctattctc acagtgcaca ggcaggtgtc agctgtacag cagtcatgga 50 <210> 44 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(51) <400> 44 ttctattctc acagtgcaca ggcaggtctc aagctgcagc agctctgggg c 51 <210> 45 <211> 53 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(53) <400> 45 ttctattctc acagtgcaca ggaaggtgaa gctgtgctgc gagtctggag gga 53 <210> 46 <211> 50 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(50) <400> 46 gaaccagtac tccaggcctg aggggccgca gagacagtga ccagagtccc 50 <210> 47 <211> 50 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(50) <400> 47 gaaccagtac tccaggcctg aggggccgag gagacggtga ctgaggttcc 50 <210> 48 <211> 54 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(54) <400> 48 gaaccagtac tccaggcctg aggggccgag gagacgtgtg agccagtgga gccc 54 <210> 49 <211> 40 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(40) <400> 49 gtactccagt cgacgacatt gtgcatgatt accagtctcc 40 <210> 50 <211> 40 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(40) <400> 50 gtactccagt cgacgatatc cagatgacac cagaactacc 40 <210> 51 <211> 39 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(39) <400> 51 gtactccagt cgaccgaaat tgttgctcac ccagtctcc 39 <210> 52 <211> 39 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(39) <400> 52 aaggaaaaaa gcggccgctt ttcatgtctc cagcttggt 39 <210> 53 <211> 39 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> prim_transcript <222> (1)..(39) <400> 53 aaggaaaaaa gcggccgctt ttgatgctcc aacttgtgt 39 <210> 54 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(111) <400> 54 Asp Ile Val Met Phe Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 55 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(107) <400> 55 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Val Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 56 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(107) <400> 56 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 57 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(111) <400> 57 Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ala Ser Gly Gly Pro Gly 1 5 10 15 Gln Ser Leu Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly 20 25 30 Tyr Asn His Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro His Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly 65 70 75 80 Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly 85 90 95 Ser Asn Asn Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 58 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(109) <400> 58 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Thr Val Ser Val Ala Leu Gly 1 5 10 15 Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr 20 25 30 Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile 35 40 45 Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn 85 90 95 His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105

Claims (26)

  1. 기탁 번호 ECACC 98101901을 가지는 하이브리도마에 의하여 생산된 쥐과동물 14F7 단일 클론 항체로부터 유도된 재조합 항체에 있어서,
    중 사슬
    CDR1 : SYWIH
    CDR2 : YIDPATAYTESNQKFKD
    CDR3 : ESPRLRRGIYYYAMDY
    경 사슬
    CDR1 : RASQSISNNLH
    CDR2 : YASQSIS
    CDR3 : QQSNRWPLT
    로 표시되는 중 및 경 사슬의 초 가변 영역(CDRs)의 서열에 의하여 특징을 가지는 재조합 항체.
  2. 제 1항에 있어서, CDRs 및 상기 14F7 항체의 중 및 경 사슬의 구조 영역(FRs) 및 IgG1 인간 중 사슬의 고정 영역 및 Ck 인간 경 사슬의 고정 영역을 포함하는 14F7 항체의 키메릭 변형체가 되는 것을 특징으로 하고, 중 및 경 사슬의 구조 영역(FRs)은 다음과 같은 서열:
    중 사슬
    FR1 : QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYSFT
    FR2 : WLKQRPDQGLEWIG
    FR3 : KAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCAR
    FR4 : WGQGTTVTVSS
    경 사슬
    FR1 : DLVLTQSPATLSVTPGDSVSFSC
    FR2 : WYQQRTHESPRLLIK
    FR3 : GIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFC
    FR4 : FGAGTKLELKRA
    로 표현이 되는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 면역원성을 감소시키기 위하여 중 및 경 사슬의 구조 영역(FRs)에서 점 변이(point mutations)를 포함하는 14F7 단일클론 항체의 인간에게 적용된 변형체(humanized variant)가 되는 것을 특징으로 하는 재조합 항체.
  4. 제 3 항에 있어서, 14F7 단일 클론항체의 인간에게 적용이 된 변형체로서 중 및 경 사슬의 구조 영역이 아래:
    중 사슬
    포지션 5 : V 대신에 Q
    포지션 9 : A 대신에 N
    포지션11 : V 대신에 L
    포지션12 : V 대신에 A
    포지션18 : V 대신에 M
    포지션19 : R 대신에 K
    포지션20 : V 대신에 M
    포지션40 : A 대신에 R
    포지션42 : G 대신에 D
    경 사슬
    포지션39: K 대신에 R
    포지션40 : P 대신에 T
    포지션41 : G 대신에 H
    포지션42 : Q 대신에 E
    와 같은 변이 중 임의의 것을 포함하는 재조합 항체.
  5. 기탁 번호 ECACC 98101901을 가진 하이브리도마에 의하여 생산이 된 쥐과 동물 14F7 단일 클론 항체로부터 유도된 단일 사슬 Fv 단편에 있어서,
    쥐과 동물 14F7 단일 클론 항체의 중 사슬 가변 영역의 서열 및 쥐과 동물 항체의 경 사슬의 가변 영역의 서열을 포함하는 Fv 단편.
  6. 제 5 항에 있어서, 경 사슬의 가변 영역이 14F7 항체 자체가 되는 것을 특징으로 하는 Fv 단편.
  7. 제 6 항에 있어서, 중 및 경 사슬의 초 가변 영역(CDRs)의 서열이 아래와 같이:
    중 사슬
    CDR 1 : SYWIH
    CDR 2 : YIDPATAYTESNQKFKD
    CDR 3 : ESPRLRRGIYYYAMDY
    경사슬
    CDR1 : RASQSISNNLH
    CDR2 : YASQSIS
    CDR3 : QQSNRWPLT
    가 되는 것을 특징으로 하는 Fv 단편.
  8. 제 7 항에 있어서, CDRs 및 상기 14F7 항체의 중 및 경 사슬의 구조 영역(FRs)를 포함하고, 그리고 경 및 중 사슬의 구조 영역(FRs)의 서열이 아래와 같이,
    중 사슬
    FR1 : QVQLQQSGNELAKPGASMKMSCRASGYSFT
    FR2 : WLKQRPDQGLEWIG
    FR3 : KAILTADRSSNTAFMYLNSLTSEDSAVYYCAR
    FR4 : WGQGTTVTVSS
    경 사슬
    FR1 : DLVLTQSPATLSVTPGDSVSFSC
    FR2 : WYQQRTHESPRLLIK
    FR3 : GIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFC
    FR4 : FGAGTKLELKRA
    로 표시되는 것을 특징으로 하는 Fv 단편.
  9. 제 8 항에 있어서, 면역원성을 감소시키기 위하여 중 및 경 사슬의 구조 영역(FRs)의 점 변이를 포함하는 Fv 단편.
  10. 제 9 항에 있어서, 경 및 중 사슬의 구조 영역이 아래:
    중 사슬
    포지션 5 : V 대신에 Q
    포지션 9 : A 대신에 N
    포지션11 : V 대신에 L
    포지션12 : R 대신에 A
    포지션18 : V 대신에 M
    포지션19 : R 대신에 K
    포지션20 : V 대신에 M
    포지션40 : A 대신에 R
    포지션42 : G 대신에 D
    경 사슬
    포지션39 : K 대신에 R
    포지션40 : P 대신에 T
    포지션41 : G 대신에 H
    포지션42 : Q 대신에 E
    와 같은 변이 중의 어느 하나를 포함하는 Fv 단편.
  11. 청구항 5에 따른 기탁 번호 ECACC 98101901을 가진 하이브로도마에 의하여 생산이 된 쥐과 동물 14F7 단일클론 항체로부터 유도된 단일 사슬 Fv 단편에 있어서, 14F7 단일클론 항체의 중 사슬의 가변 영역의 서열 및 서열이 아래와 같은:
    Fr1
    DIVMFQSPASLAVSLGQRATISC
    CDR1
    RASQSVSSSSYSYMH
    Fr2
    WYQQKPGQPPKLLIK
    CDR2
    YASNLES
    Fr3
    GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC
    CDR3
    QHSRDVPLTF
    Fr4
    GAGTKLEIK
    경 사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 Fv 단편.
  12. 청구항 5에 따른 기탁 번호 ECACC 98101901을 가진 하이브로도마에 의하여 생산이 된 쥐과 동물 14F7 단일클론 항체로부터 유도된 단일 사슬 Fv 단편에 있어서, 14F7 단일클론 항체의 중 사슬의 가변 영역의 서열 및 서열이 아래와 같은:
    Fr1
    DIQMTQTPSSLSASLGDRVTISC
    CDR1
    RASQDISNYLN
    Fr2
    WYQQKPDGTVKLLIV
    CDR2
    YTSRLHS
    Fr3
    GVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC
    CDR3
    QQGNTLPPTF
    Fr4
    GAGTKLELK
    경 사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 Fv 단편.
  13. 기탁번호 ECACC 98101901을 가진 하이브리도마에 의하여 생산이 된 쥐과 동물 14F7 단일클론 항체로부터 유도된 단일 사슬 Fv 단편에 있어서,
    쥐과 동물 14F7 단일 클론항체의 중 사슬의 가변 영역 및 인간 항체의 경 사슬 가변 영역의 서열을 포함하는 Fv 단편.
  14. 제 13 항에 있어서, 쥐과 동물 14F7 단일클론 항체의 중 사슬 가변 영역의 서열 및 서열이 아래와 같은:
    Fr1
    DIQMTQTPSSLSASVGDRVTITC
    CDR1
    RASQSISSFLN
    Fr2
    WYQQKPGKAPKLLIY
    CDR2
    AASNLQS
    Fr3
    GVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFAAYYC
    CDR3
    QQGYTTPLTF
    Fr4
    GQGTKLELK
    경 사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 Fv 단편.
  15. 제 13 항에 있어서, 쥐과 동물 14F7 단일클론 항체의 중 사슬 가변 영역의 서열 및 서열이 아래와 같은:
    Fr1
    QSVVTQPPSASGGPGQSLTISC
    CDR1
    TGTSSDVGGYNHVS
    Fr2
    WYQQHPGKAPKLMIY
    CDR2
    DVSKRPS
    Fr3
    GVPHRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEAVYYC
    CDR3
    SSYAGSNNLVF
    Fr4
    GGGTKVTVL
    경 사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 Fv 단편.
  16. 제 13 항에 있어서, 쥐과 동물 14F7 단일클론 항체의 중 사슬 가변 영역의 서열 및 서열이 아래와 같은:
    Fr1
    SSELTQDPAVSVALGQTVRITC
    CDR1
    QGDSLRSYYAS
    Fr2
    WYQQKPGQAPVLVIY
    CDR2
    GKNNRPS
    Fr3
    GIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYC
    CDR3
    NSRDSSGNHVVF
    Fr4
    GGGTKLTVL
    경 사슬 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 Fv 단편.
  17. 청구항 1 내지 청구항 4 중의 어느 하나의 재조합 항체를 발현하는 세포 라인.
  18. 청구항 5 내지 청구항 16 중의 어느 하나의 단일 사슬 Fv 단편을 발현하는 세포 라인.
  19. 청구항 1 내지 청구항 4 중의 어느 하나의 재조합 항체를 포함하는 악성 종양의 치료를 위한 약학 조성물.
  20. 청구항 5 내지 청구항 16 중의 어느 하나의 단일 사슬 Fv 단편 및 적절한 부형제를 포함하는 악성 종양을 치료하기 위한 약학적 조성물.
  21. 악성 유방 종양 및 흑색종 그리고 그들이 전이 및 재발의 치료를 위한 청구 항 19의 약학적 조성물의 용도.
  22. 악성 유방 종양 및 흑색종 그리고 그들이 전이 및 재발의 치료를 위한 청구항 20의 약학적 조성물의 용도.
  23. 청구항 1 내지 청구항 4 중의 어느 하나의 재조합 항원 및 적당한 표시자를 포함하는 악성 종양의 “생체 내” 국소화 및 확인을 위한 반응시약.
  24. 악성 유방 종양 및 흑색종 그리고 그들이 전이 및 재발의 “생체 내” 국소화 및 확인을 위하여 사용되는 청구항 23의 반응 시약.
  25. 청구항 5 내지 청구항 16 중의 어느 하나의 단일 사슬 Fv 단편 및 적당한 표시자를 포함하는 “생체 내” 유해한 종양의 국소화 및 확인을 위한 반응 시약.
  26. 악성 유방 종양 및 흑색종 그리고 그들의 전이 및 재발의 “생체 내” 국소화 및 확인을 위한 청구항 25에 따른 반응시약.
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