JP2006524194A - ガングリオシドｎ−グリコリルｇｍ３を認識する組み換え抗体及び断片と、腫瘍の診断及び治療におけるその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、本質的に、免疫原性の減少した免疫グロブリンの遺伝子工学による産生、より詳細にはガングリオシドＮ−グリコリル−ＧＭ３を含有するが、他のＮ−グリコリル型若しくはＮ−アセチル型ガングリオシドも硫酸グリコシドも含有しない抗原を認識するモノクローナル抗体に関する。特に、本発明は、ガングリオシドＮ−グリコリルＧＭ３又は同誘導体断片に対する組み換えモノクローナル抗体をコードするペプチド配列に関する。本発明は、さらに上述した抗体又はその断片を含有する医薬品組成物並びに乳癌及びメラノーマに対する同組成物の診断的又は治療的使用に関する。

Description

本発明は、免疫学の分野に関し、特に遺伝子工学技術を用いて免疫原性の減少した、癌治療に使用するための免疫グロブリンを得ることに関する。本発明は、特にＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシドを含有し、かつＮ−グリコリル若しくはＮ−アセチルなどの他の関連するガングリオシドも硫酸化糖脂質も含有しない抗原を認識するモノクローナル抗体又は誘導される断片をコードするペプチド配列に関する。

ガングリオシドは、シアル酸を含有するスフィンゴ糖脂質であり、脊椎動物の原形質膜に存在する（Ｓｔｕｌｔｓ ＣＬＭら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １７９：１６７〜２１４頁、１９８９年）。これらの分子の一部は、抗原又は腫瘍マーカーに関連する腫瘍として文献において報告され（Ｈａｋａｍｏｒｉ ＳＨ：Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３：６４６〜６５３頁、１９９１年）、癌の診断及び治療における抗ガングリオシド抗体の使用について記載されている（Ｈｏｕｇｔｏｎ ＡＮら、ＮＡＳ ＵＳＡ ８２：１２４２〜１２４６頁、１９８５年；ＺｈａｎｇＳら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７３：４２〜４９頁、１９９７年）。哺乳類細胞内のより一般的なシアル酸として、Ｎ−アセチル（ＮＡｃ）及びＮ−グリコリル（ＮＧｃ）が挙げられる（Ｃｏｒｆｉｅｌｄ ＡＰら、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｍｏｎｏｇｒ １０：５〜５０頁、１９８２年）。一般にＮＧｃは、ヒト及びニワトリの正常組織において発現されないが、他の脊椎動物では広く分布する（Ｌｅｅｄｅｎ ＲＷら、シアル酸の生物学的役割（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ．）Ｒｏｓｅｍｂｅｒｇ Ａ及びＳｈｅｎｇｔｒｕｎｄ ＣＬ（Ｅｄｓ）．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１〜４８頁、１９７６年、Ｋａｗａｉ Ｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１：１２４２〜１２４６頁、２００１年）。しかしながら、文献からの報告では、抗ＮＧｃ抗体は一部のヒト腫瘍及び腫瘍細胞系を認識することが示されている（Ｈｉｇａｓｈｉ Ｈら、Ｊｐｎ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７９：９５２〜９５６頁、１９８８年、Ｆｕｋｕｉ Ｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １６０：１１４９〜１１５４頁、１９８９年）。ＧＭ３（ＮＧｃ）ガングリオシド濃度の上昇が、ヒト乳癌内に認められ（Ｍａｒｑｕｉｎａ Ｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６：５１６５〜５１７１頁、１９９６年）、これによってこの分子を癌治療に対する標的として使用することが極めて興味深いものになっている。

出願特許ＥＰ０９７２７８２Ａ１には、受託番号ＥＣＡＣＣ９８１０１９０１でブダペスト条約により寄託されたハイブリドーマによって産生されるマウスモノクローナル抗体が記載されている。このモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプを有し、低密度リポタンパク（ＶＬＤＬ）と疎水的にコンジュゲートしたＮＧｃＧＭ３ガングリオシドで、Ｆｒｅｕｎｄアジュバントの存在下でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫することによって産生された。該抗体はＮＧｃＧＭ３ガングリオシドに優先的に結合し、ヒト乳房及びメラノーマ腫瘍において発現される抗原を認識する（ＣａｒｒＡら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９：３：２４１〜２４７頁、２０００年）。この抗体は、該配列を有する細胞に対して強い細胞溶解活性を示した。これは治療手段になりうると考えられる特性である、

さらに、腫瘍によって誘発される新血管形成は、腫瘍成長の制御における主要なパラメータの１つであることは知られている。これによって抗原過程の阻害に関する新たな治療上の武器の探索を目指す直接的研究が行われる。この過程に関する１４Ｆ７抗体の効果に関しては実験的証拠がある。該証拠は、マトリックスゲルアッセイ（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｖｏｌ．４、１１３〜１２１頁、２００１年；Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．１８、７８３〜７９０頁、１９９８年）において認められている。マトリックスゲルは、基底膜タンパク質の混合物であり、内皮細胞を取り囲む細胞外マトリックスである。新血管形成過程におけるその有用性は、新たな血管の発達中における内皮細胞−マトリックス間相互作用の生理的重要性に発する。同様にラミニンなどのこのゲル成分は、この過程に関する重要なマーカーであると考えられる。

このモデル種は、腫瘍に直結する事象を調節し、ひいてはその成長と転移に影響を及ぼす医薬の評価を可能にする、腫瘍が誘発する血管新生に関連する機序の研究においても利用されている。

マウス１４Ｆ７などの非ヒトモノクローナル抗体における同利用は、特に反復治療計画ではヒトへの治療に不利益をもたらすことが確実である。たとえば、マウスモノクローナル抗体は比較的短い血液半減期を有する。さらに同抗体は、ヒトへの使用時にエフェクター機能などの重要な免疫学的特性を失う。

そしてもっと重要となりうることは、マウスモノクローナル抗体は、ヒトに注入される際に免疫原性を示すほど大量なアミノ酸配列を含有する。多数の研究によると、患者に出現する外来抗体の投与後における免疫応答はかなり強く、初期治療後の抗体治療効果を実質上取り除く可能性があることが示されている。さらに、マウスモノクローナル抗体を用いて患者に治療を施した後でさえ、対象外マウス抗体を用いたそれ以降の治療がＨＡＭＡ応答として知られる交叉反応性に起因して奏効しないどころか危険性を示す可能性があると考えられる（Ｋｈａｚａｅｌｉ、Ｍ．Ｂ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １５：４２〜５２頁、１９９４年）。

Ｍａｔｅｏら（米国特許第５７１２１２０号）は、マウス抗体の免疫原性を低下させるための方法について記載している。Ｍａｔｅｏらによって示された方法（Ｍａｔｅｏ Ｃら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９：６：４６３〜４７１頁、２０００年）による修飾抗体は、抗原に対する元の抗体の認識能及び結合能を保持し、免疫原性の低下を招き、その治療的有用性を高める。この方法により、キメラ抗体と比較した場合に少数の突然変異を伴い、免疫原性の低下を示す修飾抗体が得られる。

上述したことから、免疫原性の低下を示し、単純な経済的方法で得られ、かつヒト用の治療製剤にとって十分な結果を示す、治療用抗体の改良型が得られると推測される。

抗体断片の使用は、疾患の免疫診断においてかなり有用とされていることも知られる。その他（ヨーロッパ出願特許ＥＰ０７９６３３４Ａ１）に含まれるＩｒａ Ｐａｓｔａｎ氏は、Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原に関連する炭水化物を特異的に認識する抗体の可変領域を用いたＦｖ型一本鎖断片の構築について示す。同筆者は、該断片に基づいて該抗原を有する細胞を検出するための方法を開発し、これらの断片が抗原を含む細胞に対して発揮する阻害効果の証拠についてさらに提供する。

１４Ｆ７モノクローナル抗体の結合部位に関する知見は、種々の疾患の免疫療法における同抗原の可能性のために、実際的かつ理論的観点から見て興味深い。Ｓｏｕｒｉａｕ、Ｃら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１、８４５〜８５５頁、２００１年及びＣｈｅｓｔｅｒ、Ｋ．Ａ．ら、ｉｎ Ｄｉｓ．Ｍａｒｋｅｒｓ．１６、５３〜６２頁、２０００年によると、ｓｃＦｖ型の抗体断片を使用すると、腫瘍組織内への浸透性の向上などのその薬理特性を生かして、治療上、非常に有用であると考えられる。

ハイブリドーマ由来の繊維状ファージ上に暴露される抗体断片のミニライブラリーの構築によって、このレパートリー内で抗原に対する特異的認識能を有する分子の選択が可能になる。目的は、元の抗体の認識により小さい粒子サイズ及び細菌宿主による産生能を組み合わせる抗体断片を速やかに得ることである。この技術は、従来のクローニング技術によるハイブリドーマの可変領域の遺伝子の単離及び操作の際に得られる細菌中で、非機能性を示さない又は産生不可能な抗体断片の複数の変異体の顕現を可能にする（Ｒｏｏｖｅｒｓ、Ｒ．Ｃ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．７８、１４０７〜１４１６頁、１９９８年）。

繊維状ファージにおける抗体断片の提示に関する技術によって、抗体の結合部位に接近することに加え、その親和性を改善する目的を有する抗体に対し、修飾を施し（Ｃｈａｍｅｓ、Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１、５４２１〜５４２９頁、１９９８年、Ｌａｍｍｉｎｍａｋｉ、Ｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９１、５８９〜６０２頁、１９９９年、Ｐａｒｈａｍｉ−Ｓｅｒｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５９、４３〜５３頁、２００２年）、又はその特異性を調節する（Ｉｂａ、Ｙ．ら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｎ．、１１、３６１〜３７０頁、１９９８年、Ｍｉｙａｚａｋｉ、Ｃ．ら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｎ．１２、４０７〜４１５頁、１９９９年、Ｄａｒｖｅａｕ、Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．１５、２５〜２９頁、１９９２年）ための唯一の機会が提供される。

繊維状ファージにおける抗体断片の発現は、種々のＶＬの元の抗体ＶＨとの組み合わせ若しくはその逆を示す鎖の交換を可能にする（Ｌａｎｔｔｏ，Ｊ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８、３０３〜３１６頁、２００２年）ことから、抗原認識の下及び抗体の親和性に対するその影響下で機能する各鎖の役割に関する研究が可能になる（Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．、Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７、１７０９〜１７１９頁、１９９１年、Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ、Ｃ．Ｆ．、Ｌｅｒｎｅｒ、Ｒ．Ａ．方法：酵素学における方法への手引き（Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）２、１１９〜１２４頁、１９９１年）。鎖の交換によって、結合部位の特性が修飾され、さらにさまざまな種由来の免疫グロブリンの配列が組み合わされ、認識特異性を保存する同変異体が選択できる（Ｋｌｉｍｋａ、Ａ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８３、２５２〜２６０頁、２０００年、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、３６０７３〜３６０７８頁、２０００年、Ｒａｄｅｒ、Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５、８９１０〜８９１５頁、１９９８年、Ｂｅｉｂｏｅｒ、Ｓ．Ｗ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６、８３３〜８４９頁、２０００年）。

本発明は、親和性が変化しない元の抗原を認識し、患者に投与される場合に免疫原性の低下を招く、マウス１４Ｆ７モノクローナル抗体由来の修飾抗体について述べる。本発明の別の知見は、元（の抗体）とは異なるが、特異性、親和性及び認識性を保持した軽鎖の可変領域を含み、可溶性分子として細菌宿主によって発現されるだけでなく、繊維状ファージの表面上にも提示できる、該抗体に由来する断片を得たことである。１４Ｆ７抗体由来の断片は、治療的な武器として有用である。さらに、Ｍ１３繊維状ファージ表面上に存在する１４Ｆ７抗体のｓｃＦｖ型断片の発現によって、治療目的による結合部位の操作や、高親和性を有する変異体の取得が可能になる。

本発明の目的の１つは、１４Ｆ７配列を部分的に保存するにすぎないが、その特異性、親和性及び認識性を保持する抗体断片の特性決定である。

得られる修飾抗体とその断片のいずれもが、ＮＧｃＧＭ３抗原を発現する腫瘍細胞を特異的に認識することから該腫瘍の診断若しくは治療において使用され、それらの元となったマウス抗体に比べて免疫原性の低下を招くという利点を有する。

本発明の目的は、修飾された１４Ｆ７抗体又はそのＦｖ一本鎖断片を含む新たな治療効果のある組成についてである。ここで該抗体又は断片は、抗原を発現する腫瘍の部位決定若しくは治療に有用な放射性同位体に結合される場合がある。

さらに本発明の目的は、放射性同位体に結合した修飾された１４Ｆ７抗体若しくはその断片を含む医薬品組成物を用いてＮＧｃＧＭ３ガングリオシドを発現する腫瘍の放射免疫診断又は放射免疫治療を行うための方法を提供することである。

本発明では、重鎖及び軽鎖の超可変領域（ＣＤＲ）の以下の配列を特徴とする、寄託番号ＥＣＡＣＣ９８１０１９０１を有するハイブリドーマによって産生されるマウス１４Ｆ７モノクローナル抗体由来のキメラ抗体について記載する。
重鎖

軽鎖

好ましくは、該キメラ抗体は重鎖及び軽鎖の枠組み構造領域（ＦＲ）における以下の配列を特徴とする。
重鎖

軽鎖

さらにキメラ抗体は、ＩｇＧ１ヒト重鎖の定常領域及びＣｋヒト軽鎖の定常領域を含有することを特徴とする。

好ましい提示では、本発明は、重鎖及び軽鎖の枠組み構造領域が以下の突然変異のいずれかを含むことを特徴とする、寄託番号ＥＣＡＣＣ９８１０１９０１を有するハイブリドーマによって産生されるマウス１４Ｆ７モノクローナル抗体由来の修飾抗体について述べる。
重鎖

軽鎖

好ましくは、該修飾抗体は、ＩｇＧ１ヒト重鎖の定常領域及びＣｋヒト軽鎖の定常領域を含有することを特徴とする。

本発明の別の局面として、ハイブリドーマ（寄託ＥＣＡＣＣ９８１０１９０１）から得られる重鎖の可変領域の配列を含み、１４Ｆ７の認識特異性を保存する１４Ｆ７抗体由来のＦｖ一本鎖型断片について述べる。

好ましくは、該Ｆｖ断片は、細菌宿主によって繊維状ファージ若しくは可溶性分子上に提示される抗体断片として産生可能な参照対象のハイブリドーマによって産生される軽鎖可変領域とは異なる、免疫が付与されていないマウス又はヒト由来の軽鎖可変領域を含む。

本発明は、さらに１４Ｆ７由来の断片を産生するキメラ抗体並びにヒト化抗体及び細菌クローンを発現する細胞系に関する。

さらに本発明は、本発明の組み換えモノクローナル抗体の１つ若しくはその断片を含有することを特徴とする悪性乳房腫瘍やメラノーマ腫瘍に加え、その転移及び再発における治療及び／又は部位決定及び同定を目的とした医薬品組成物、並びにその用途に適する賦形剤に関する。該抗体又は断片は、悪性腫瘍の部位決定及び／又は治療にとって有用な放射性同位体に結合できると考えられる。

最後に本発明は、悪性腫瘍の治療及び／又は部位決定及び同定に有用な医薬品組成物の製造における上記の組み換え抗体の使用に関する。以下に本発明の実施方法及び使用方法に関して詳細に述べる。

１．１４Ｆ７マウス抗体の可変領域に対するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によるｃＤＮＡの合成及び増幅
マウス１４Ｆ７抗体は、低密度のリポタンパクと疎水的にコンジュゲートされ、かつＦｒｅｕｎｄアジュバントの存在下で、ＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）ガングリオシドによって免疫が付与されたＢａｌｂ／ｃマウスによって得られる（ＥＰ０９７２７８２Ａ１、Ｃａｒｒ Ａら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９：３：２４１〜２４７頁、２０００年）。ＲＮＡは、製造業者の使用説明書に従ってＴＲＩＺＯＬ抽出法（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、ニューヨーク州）を用いてＮＧｃＧＭ３ガングリオシドを認識する１４Ｆ７モノクローナル抗体（マウスＩｇＧ１ Ｍａｂ）を産生する１０^６個のハイブリドーマ細胞から得られる。

製造業者の推奨に従って、試薬であるＡｃｃｅｓｓ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）セットを用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成とＶＨ及びＶＬの可変領域の増幅が実施された。つまり、ポリＡテイルにおいてＲＮＡとＶＨ及びＶＬの各可変領域の両末端に対応するオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズするように設計された２５ピコモルのｄＴオリゴヌクレオチドの存在下で、５μｇのＲＮＡから反応が行われた。６０℃で１０分間インキュベートしてから反応緩衝液中で０．２ｍＭの各デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、５μＬのＡＭＶ−逆転写酵素及び５μＬのＤＮＡポリメラーゼを含有する混合物を全体で５０μＬの容量になるように添加する。試料を４８℃で４５分間、９４℃で２分間インキュベートしてから４０サイクルにわたり９４℃（３０秒）、６０℃（１分）、６８℃（２分）の温度でＰＣＲを施し、最後に６８℃で７分間インキュベートする。

２．キメラ遺伝子の構築及び増幅されたｃＤＮＡの配列決定
ＶＨ及びＶＫのＰＣＲ産物は、ＶＨに対する制限酵素Ｅｃｏ ＲＶ−Ｎｈｅ Ｉ、ＶＫに対する制限酵素Ｅｃｏ ＲＶ−Ｓａｌ Ｉによって消化され、各々の発現ベクター内にクローニングされる（Ｃｏｌｏｍａ ＭＪら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５２：８９〜１０４頁、１９９２年）。ＶＨ領域は、ＩｇＧ１ヒト定常領域及び選択マーカーとしてＬ−ヒスチジノールに抵抗性を有する遺伝子を含んでいるＰＡＨ４６０４ベクター内でクローニングされる。ＶＫ領域は、ミコフェノール酸に抵抗性を有する遺伝子及び定常ヒトκ領域を保有するＰＡＨ４６２２ベクター内でクローニングされる。産生される遺伝子構築は、それぞれ１４Ｆ７ＶＨ−ＰＡＨ４６０４及び１４Ｆ７ＶＫ−ＰＡＧ４６２２と命名された。

両構築は、製造業者によって示されたプロトコルに従い、配列決定用試薬キットＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｎ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、ジデオキシヌクレオチド法によって配列決定される（Ｓａｎｇｅｒ Ｆら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７４：５４６３〜５４７０頁、１９７９年）。

３．キメラ抗体の発現
ＮＳＯ細胞は、酵素ＰｖｕＩで線形化された１０μｇの１４Ｆ７ＶＨ−ＰＡＨ４６０４及び１０μｇの１４Ｆ７ＶＫ−ＰＡＧ４６２２を用いて電気穿孔される。ＤＮＡをエタノールによって沈殿させ、５０μＬのＰＢＳ（リン酸緩衝液生理食塩水溶液）内で混合し、溶解させた。約１０^７個の細胞を半集密まで成長させ、遠心分離によって収集した。その後、細胞を０．５ｍＬのＰＢＳ中でエレクトロポレーショントレー内にあるＤＮＡとともに再懸濁させる。１０分後、氷中で細胞に２００Ｖ及び９６０Ｆのパルスを施し、１０分間氷中で保存した。細胞をＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ（ＤＭＥＭ−Ｆ１２）選択培地中の９６ウェルプレート内で１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び１０ｍＭのＬ−ヒスチジノールとともに培養する。選択培地に添加して１０日過ぎて、トランスフェクトされたクローンを可視化する。

キメラ免疫グロブリンの産生は、クローン上清からＥＬＩＳＡによって測定される。このために、ポリスチレンプレート（高結合、Ｃｏｓｔａｒ）を４℃で一晩中ｐＨ９．８の炭酸重炭酸緩衝液１００ｍＭ中でヤギ抗ヒトＩｇＧ血清によってコーティングする。次いでプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝液生理食塩水溶液、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）で洗浄し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−ＦＣＳで希釈された培地上清試料を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で再洗浄し、次いでペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトκ鎖血清中で、３７℃で１時間インキュベートする。その後プレートを同一の方法で洗浄し、基質のｏ−フェニレンジアミンを含有するｐＨ４．２のクエン酸−リン酸緩衝液溶液とともにインキュベートする。１５分後４９２ｎｍで吸光度を測定する。

キメラ抗体の抗原認識能は、ＮＧｃＧＭ３及びＮａｃＧＭ３ガングリオシドを用いた競合ＥＬＩＳＡによって検証される。つまり、ポリスチレンプレート（Ｐｏｌｙｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）をメタノール中で４μｇ／ｍＬのＮＧｃＧＭ３若しくはＮＡｃＧＭ３で５０μＬの溶液によってコーティングし、３７℃で１時間インキュベートする。次いでプレートをトリス−ＨＣＩ緩衝液中でｐＨ７．８〜８．０の２００μＬのウシ血清アルブミン溶液（ＢＳＡ）１％によって３７℃で１時間ブロッキングする。ＰＢＳで３回洗浄後、トリス−ＨＣＩ−ＢＳＡ１％中で希釈された試料をビオチニル化されたマウス１４Ｆ７抗体１ｍｇ／ｍＬの存在下で２μｇ／ｍＬ〜０．０１μｇ／ｍＬの濃度範囲で３７℃で２時間添加する。プレートをＰＢＳで洗浄後、同反応をストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともに３７℃で１時間進行させる。４９２ｎｍで吸光度を測定する。

４．Ｔエピトープのヒト化によるヒト化Ａｂ １４Ｆ７ｈＴの構築、Ｔエピトープの予測
１４Ｆ７の可変ドメイン配列は、ＡＭＰＨＩ Ｐｒｏｇｒａｍによって解析される（Ｍａｒｇａｌｉｔ Ｈら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３８：２２１３〜２２２９頁、１９８７年）。これによりＴ細胞の免疫原性に関与している、両親媒性ヘリックス構造を有する７番目若しくは１１番目のアミノ酸のセグメントが同定できる。これらのアルゴリズムは、この場合、マウス１４Ｆ７モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内のＴエピトープ提示に関与する断片について予測する。

−ヒト免疫グロブリンによる同一性解析
１４Ｆ７の可変ドメインのアミノ酸配列を報告されたヒト免疫グロブリンの可変領域配列と比較することで、解析対象のマウス分子との同一性が最も高いヒト免疫グロブリンが同定される。これに対し、ＢＬＡＳＴプログラムを介してインターネットで利用可能なＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースが使用できる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３３８９〜３４０２頁、１９９７年）。

−免疫原性の低下に対する解析
本方法の本質は、ＦＲにおける突然変異を最小限にしてＴエピトープ候補の破裂又はヒト化によって免疫原性の低下を得ることにある。これは抗原認識部位の三次元構造に関与する同位置以外の両親媒性ヘリックス構造を有する同セグメントでは特別である。

本方法によると、マウス免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬの可変領域配列は、同一性が最も高いヒト免疫グロブリンと比較され、マウスとヒトの間で配列決定上異なる残基は、ＦＲの領域内に存在する両親媒性領域内でのみ同定される（Ｋａｂａｔ Ｅ、免疫学的利益に関するタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、１９９１年）。これらの「マウス」の残基は、ヒト配列と同一位置に認められる残基によって抑制されやすいものとなる。

正準構造を担うＦＲの位置に存在する残基、すなわちベルニエ（Ｖｅｒｎｉｅｒ）ゾーン又は間期におけるＶＨ−ＶＬ間の相互作用に関与するゾーンに存在する残基は、抗体の可変ドメインの三次元構造に作用することによって抗原との結合に作用できると考えられることから突然変異を受ける可能性がない。三次元構造上に導入される置換の影響について、可変領域の分子モデリングによってさらなる情報を入手できる。

突然変異の解析において、両親媒性ヘリックス内のプロリン残基の存在などの因子又は特定のマウスの残基が最も同一性が高いヒト配列内の同一位置に認められないが他のヒト免疫グロブリンに常在するという事実を考慮することは可能であることから、最大の突然変異を含有するバージョンが得られる可能性がある。すなわちこの場合、ヒト配列と異なるあらゆるマウスの残基は変異を受けるが、他のバージョンは突然変異の種々の組み合わせによって取得できる。

１４Ｆ７のマウス配列上でＴエピトープ候補を同定し、またこれらのセグメント内でヒトの残基とは異なる残基を同定した後で、従来の部位特異的突然変異誘発法によって置換を行う。

−ＮＳＯ細胞内におけるヒト化１４Ｆ７ｈＴ抗体のクローニング及び発現
１４Ｆ７ｈＴ抗体のＶＨ及びＶＬ領域に対応する遺伝子構築は、一旦前述した方法によって得られると、キメラ抗体構築の場合において上記と同様に発現ベクターごとにクローニングされ、次の遺伝子構築すなわち１４Ｆ７ｈＴＶＫ−ＰＡＧ４６２２及び１４Ｆ７ｈＴＶＨ−ＰＡＨ４６０４が得られる。これらの遺伝子のＮＳＯ細胞へのトランスフェクションは、まさにキメラ抗体の場合の記載と同一条件下にある。ヒト化抗体を産生するクローンもまたＥＬＩＳＡによって検出される。

ヒト化抗体による抗原特異的な認識能は、ＮＧｃＧＭ３及びＮＡｃＧＭ３ガングリオシドを用いた競合ＥＬＩＳＡによって検証される。この方法は、キメラ抗体の場合の記載と一致する。

５．１４Ｆ７ハイブリドーマ由来の繊維状ファージ上での抗体断片ライブラリーの構築
メッセンジャーＲＮＡは、１４Ｆ７ハイブリドーマの細胞から単離され、相補的ＤＮＡが合成され、そして重鎖及び軽鎖の可変領域に対応する配列が広域スペクトルのマウス可変領域とハイブリダイズするように設計された２セットのオリゴヌクレオチドを用いて別々に増幅される。各々の増幅された重鎖の可変領域は、精製されて適切な酵素によって消化され、予め同酵素で消化済みの（繊維状ファージ表面上に一本鎖抗体を提示するように設計された）ファージミドｐＨＧ−１ｍベクターに連結される。結合反応の産物は精製され、電気穿孔によってＴＧ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の細菌内に導入される。形質転換された細菌は、わずかな多様性をもつ重鎖可変領域（すべてが１４Ｆ７ハイブリドーマ由来の領域に属する）のセミライブラリー（ｓｅｍｉ−ｌｉｂｒａｒｙ）を構成する。このセミライブラリーに対応するＤＮＡは精製され、（予め精製され適切な酵素によって消化された）軽鎖の可変領域の収集物に別々に連結される。最後にこれらの遺伝子構築は、電気穿孔によってＴＧ１株の細菌内に導入され、多種の独立ライブラリーに一致させる。それらの１つは軽鎖の可変領域によって構築される多様性が限られたミニライブラリーであり、１４Ｆ７ハイブリドーマ細胞からも得られる。鎖交換のライブラリーも得られ、ここではハイブリドーマ由来の重鎖の可変領域がマウス及びヒトのリンパ球から得られる軽鎖の可変領域の種々の収集物と結合される。

６．Ｎ−グリコリルＧＭ３に対する抗体断片を産生するクローンの単離及び特性決定
各ライブラリーのコロニーを無作為に採取することで、補助ファージＭ１３Ｋ０７を用いてそれらからファージが産生される。抗体断片を有するファージに対するＮ−グリコリルＧＭ３の認識は固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によって直接解析される。したがって、機能断片を産生するクローンは局在化される。各ライブラリーを形成する形質転換された細菌のすべての混合物由来の抗体断片を有するファージを産生することで、機能抗体断片に富む調製物が得られ、ライブラリーの多様性が探索される。得られるファージ混合物は、固体表面に結合される抗原Ｎ−グリコリルＧＭ３と接触状態に置き、結合能を有する抗体断片を含むファージは保持され、そしてその残りは徹底した洗浄によって除去される。結合ファージはｐＨ変化によって溶出され、増殖により、抗原上の新たな選択サイクルに対する出発物質として機能する新たなファージ混合物が得られる。さまざまな選択サイクルの経過後、コロニー由来のファージ上に提示される抗体断片の認識について解析される。したがって、初期ライブラリー内で希釈される機能断片を産生するさらなるクローンが同定される。

クローンによって産生される抗体断片の特性決定には、一群の関連ガングリオシを対象とするＥＬＩＳＡによる特異性の解析、免疫組織化学による腫瘍認識の研究、ファージ内のその提示といった状況以外での可溶性を示す機能性抗体断片としての産生能の評価、その可変領域の完全な配列決定などが含まれる。

以下の実施例では、用いられるすべての制限酵素又は修飾及び試薬や材料については、特に他になければ市販品から入手した。

（実施例１）
１４Ｆ７キメラモノクローナル抗体の入手
ＶＨに対するＥｃｏ ＲＶ−ＮｈｅＩやＶＫに対するＥｃｏ ＲＶ−Ｓａｌ Ｉといった制限酵素部位に特異的なオリゴヌクレオチドを用いたＶｅｎｔポリメラーゼ酵素によって、ｃＤＮＡの合成及びマウスの可変領域のＶＨ及びＶＫにおけるＰＣＲによる増幅を実施した。スイッチオリゴヌクレオチドを以下に示す。
ＶＨ：
オリゴヌクレオチド１（シグナルペプチドにおけるハイブリッド）：

ＶＫ：
オリゴヌクレオチド１（シグナルペプチドにおけるハイブリッド）：

ＶＨ及びＶＫのＰＣＲ産物をｔｅｈ制限酵素であるＶＨに対するＥｃｏ ＲＶ−Ｎｈｅ Ｉ及びＶＫに対するＥｃｏ ＲＶ−Ｓａｌ Ｉを用いて消化し、これら各々の発現ベクターすなわちＶＨ及びＶＫに対するＰＡＨ４６０４及びＰＡＧ４６２２の中でそれぞれクローニングした。哺乳類細胞において免疫グロブリンの発現のためにこれらのベクターを使用するが、同ベクターはＳｈｅｒｉｅ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（ＵＣＬＡ、カリフォルニア州、米国）によって提供された。ベクターＰＡＨ４６０４はヒトＩｇＧ１定常領域を含み、ＰＡＧ４６２２はヒト定常κ領域を含む（ＣｏｌｏｍａＪら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５２：８９〜１０４頁、１９９２年）。一旦１４Ｆ７のＶＨ及びＶＫ領域が先のベクター内でクローニングされていると、構築の１４Ｆ７ＶＨ−ＰＡＨ４６０４及び１４Ｆ７ＶＫ−ＰＡＧ４６２２が形成される。

製造業者によって示されたプロトコルに従い、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ配列決定用キット（Ａｍｅｒｓｈａｎ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたジデオキシヌクレオチド方法（Ｓａｎｇｅｒ Ｆら、ＤＮＡ鎖終結阻害物質によるＤＮＡ配列決定（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．）ＰＮＡＳ ＵＳＡ １９７９年；７４：５４６３〜５４７０頁）によって１２個の独立したクローンの配列を決定した。ＶＨ及びＶＫの配列は、Ｋａｂａｔ分類（Ｋａｂａｔ Ｅ、免疫学的利益に関するタンパク質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、１９９１年）によると、それぞれＩＩＢ及びＶサブグループと高度な関連性を有する（図１Ａ及びＢ）。

酵素ＰｖｕＩで線形化された１０μｇの１４Ｆ７ＶＨ−ＰＡＨ４６０４及び１０μｇの１４Ｆ７ＶＫ−ＰＡＧ４６２２を用いてＮＳ０細胞に対して電気穿孔した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、５０μＬのＰＢＳ中で混合し溶解させた。半集密になるまで成長した約１０^７個の細胞を遠心分離によって収集し、ＤＮＡｉｎｔｈｅエレクトロポレーショントレー内のＤＮＡとともに０．５ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁した。氷中で１０分後、細胞に２００Ｖ及び９６０Ｆのパルスを施し、氷中で１０分間インキュベートした。細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ（ＤＭＥＭ−Ｆ１２）選択培地内の９６ウェルプレート内で１０％ＦＣＳ及び１０ｍＭのＬヒスチジノールとともに培養した。トランスフェクトされたクローンを選択培地への添加の１０日後に可視化する。クローン上清を用い、キメラ免疫グロブリンの産生をＥＬＩＳＡによって測定する。このため、ｐＨ９．８の炭酸重炭酸緩衝液１００ｍＭ中で、ポリスチレンプレート（高結合、Ｃｏｓｔａｒ）をヤギ抗ヒトＩｇＧ血清（Ｓｉｇｍａ）によって４℃で一晩中コーティングする。次いでプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝液生理食塩水溶液、０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）によって洗浄し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−ＦＣＳ中で希釈された培養上清試料を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ中で再洗浄してからペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトκ鎖血清中で３７℃で１時間インキュベートする。その後、プレートを同様に洗浄し、基質ｏ−フェニレンジアミンを含有するｐＨ４．２のクエン酸−リン酸緩衝液溶液とともにインキュベートする。１５分後、４９２ｎｍで吸光度を測定する。

（実施例２）
ＮＧｃＧＭ３及びＮＡｃＧＭ３抗体に対する１４Ｆ７Ｑ抗体の反応性
競合ＥＬＩＳＡを用いて１４Ｆ７キメラ抗体（Ａｂ）の反応性を測定した。図２は、ＧＭ３ Ｎ−グリコリル型ガングリオシドでコーティングされたポリエステリン（ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｉｎｅ）プレート（Ｐｏｌｙｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）の認識性において、マウス１４Ｆ７と比較した場合のキメラ１４Ｆ７の特異性について示す。両Ａｂは、同様の濃度におけるマウスのビオチニル化された１４Ｆ７ Ａｂによる抗原認識の５０％阻害について示す。抗体のいずれかに対するＧＭ３のＮ−アセチル化変異体でプレートをコーティングすると、免疫反応性は全く認められなかった。対象外ＡｂとしてマウスＣ５ Ｍａｂを用いた。

（実施例３）
種々のバージョンのヒト化抗体の入手
ＶＨ及びＶＫの領域に対して、１４Ｆ７のＶＨ及びＶＫ配列を１４Ｆ７抗体の最も同一性の高いヒト配列が得られるヒト配列データベースと比較した（図１Ａ及び図１Ｂ）。さらに両配列において、両親媒性領域又はＴエピトープ候補を決定した。その後、マウスＶＨ及びＶＫ配列をヒト配列に変換するのに必要な突然変異をＴエピトープとヒト化する方法に従って測定した。筆者らは最大限実施可能な突然変異について以下に述べる。

ＶＨ領域の場合、５、９、１１、１２、１８、１９、２０、３８、４０、４２及び４８の位置において突然変異を導入した。この場合、アミノ酸Ｑ、Ｎ、Ｌ、Ａ、Ｍ、Ｋ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、Ｄ及びＩをアミノ酸Ｖ、Ａ、Ｖ、Ｖ、Ｖ、Ｒ、Ｖ、Ｒ、Ａ、Ｇ及びＶのそれぞれと置換した。１回目のＰＣＲにおいてオリゴヌクレオチド１、２、３及び４を用いてＰＣＲ産物（Ｋａｍｍａｎ Ｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７：５４０４〜５４１０頁、１９８９年）を重複させることによってこれらの突然変異を実施し、別のＰＣＲにおいてオリゴヌクレオチド２及び４のみを用いてこれらの結果を重複させた。使用したオリゴヌクレオチド配列を以下に示す。
重鎖の突然変異５、９、１１及び１２に対するオリゴヌクレオチド：

一旦先の突然変異の配列を決定して検証してから、１８、１９及び２０の位置における突然変異をこれらを保有するＤＮＡ内に導入することで、アミノ酸Ｖ、Ｒ、Ｖに対してＭ、Ｋ、Ｍをそれぞれ置換させる。

下記に該突然変異について示したオリゴヌクレオチド１、２、３及び４について示す。前述のように、ＰＣＲ産物を重複させた。
重鎖の突然変異１８、１９、及び２０に対するオリゴヌクレオチド：

同様に一旦先の突然変異の配列を決定して検証してから、突然変異Ｒ、Ａ、ＧをＤＮＡが運ぶ３８、４０及び４２位置に導入することで、アミノ酸Ｋ、Ｒ、Ｄをそれぞれ置換させる。

下記に該突然変異について記述したオリゴヌクレオチド１、２、３及び４を示す。前述のように、ＰＣＲ産物を重複させた。
重鎖の突然変異３８、４０、及び４２に対するオリゴヌクレオチド：

最後に先の突然変異の配列決定による検証後、４８の位置における突然変異をそれらを保有するＤＮＡ内に導入し、アミノ酸ＩをＶと置換させる。以下にこの突然変異に用いられるオリゴヌクレオチド１、２、３及び４について示す。ＰＣＲ産物を前述のように重複させた。
重鎖の突然変異４８に対するオリゴヌクレオチド：

すべてのこれらの突然変異を配列によって検証した。得られた遺伝子構築を１４Ｆ７ｈＴＶＨと命名した。

これらの置換がＶｅｒｎｉｅｒゾーンのアミノ酸に関与したか又は抗原認識における主要な位置であることから、重鎖の場合、ＶＨ１４Ｆ７と最も類似するヒト抗体の間には、突然変異が施されなかった種々のアミノ酸が存在する。

軽鎖に対し、位置３９、４０、４１、４２及び５８において突然変異を実施し、Ｒ、Ｔ、Ｈ、Ｅ及びＩをＫ、Ｐ、Ｇ、Ｑ及びＶのそれぞれと置換させた。突然変異を重鎖の場合と同じ方法で導入した。以下に用いられるオリゴヌクレオチド配列を示す。
軽鎖の突然変異３９、４０、４１、及び４２に対するオリゴヌクレオチド：

先の突然変異の配列決定によって検証後、位置５８における突然変異をそれらを保有するＤＮＡ内に導入し、アミノ酸ＩをＶと置換させる。以下に、この突然変異において用いられるオリゴヌクレオチド１、２、３及び４を示す。前述のように、ＰＣＲ産物を重複させた。
軽鎖の突然変異５８に対するオリゴヌクレオチド：

一旦突然変異を実施すると、配列によって検証した。

産生された遺伝子構築を１４Ｆ７ｈＴＶＫと命名した。

ＶＫ及びＶＨのヒト化領域をベクターＰＡＧ４６２２及びＰＡＨ４６０４内でクローニングし、構築の１４Ｆ７ｈＴＶＨ−ＰＡＨ４６０４及び１４Ｆ７ｈＴＶＫ−ＰＡＧ４６２２をそれぞれ形成した。Ｐｖｕ Ｉによる消化によって予め線形化済みのヒト化可変領域の１４Ｆ７ｈＴＶＨ−ＰＡＨ４６０４及び１４Ｆ７ｈＴＶＫ−ＰＡＧ４６２２を保有する１０μｇの各ベクターを用いて、ＮＳＯ細胞を電気穿孔した。エレクトロポレーション過程及び１４Ｆ７ｈＴヒト化抗体を発現するクローン検出は、キメラ抗体に対して示されるものと一致した。

（実施例４）
ｉｎ ｖｉｖｏ血管新生モデルにおける腫瘍成長の低下に対する１４Ｆ７ Ａｂの効果
メラノーマＢ１６腫瘍細胞系と血管新生誘導原としてのマトリックスゲルとの混合物をｉｎ ｖｉｖｏ血管新生モデルとして用いた。

Ｃ５７１ＢＬ６雄マウスの腹部正中線にマトリックスゲルと共に腫瘍系（Ｂ１６）を皮下移植し、腫瘍性血管新生過程の誘発を測定した。そのために、メラノーマＢ１６細胞をマトリックスゲル０．５ｍＬ及びヘパリン６４単位／ｍＬと混合し、対照群にはそれだけの混合物を割り当てて、或いは他の抗体との組み合わせて、これを動物の腹部領域内に皮下注入によって投与した。接種１５日後に動物を犠牲にし、真皮及び表皮の残基とともにゲルパールを抽出し、腫瘍サイズを肉眼で検査した。図３は、１４Ｆ７で処理されたマウスの腫瘍の腫瘤サイズがいかに大幅に減少したかについて示す。

新生血管を区別するために、ヘマトキシリン／エオシンで染色されるゲル及び抗ＰＥＣＡＭ Ｍａｂ（内皮マーカー）による免疫染色が施されるゲルに関し、病理組織学的解析を実施する。図４のＡ及びＢでは、処理されていない動物の腫瘍切片と比較した場合に、１４Ｆ７で処理された動物の組織切片において血管数の減少が認められる。

（実施例５）
１４Ｆ７ハイブリドーマ由来の繊維状ファージ上の抗体断片ライブラリーの構築
ＴｒｉＰｕｒｅ単離試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を用いて５．０×１０^６個の１４Ｆ７ハイブリドーマ細胞からメッセンジャーＲＮＡを単離し、Ｐｒｏ−ＳＴＡＲ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ＲＴ−ＰＣＲ試薬キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を用いて相補的ＤＮＡを合成した。以下に示される、すなわち９４℃で５０秒、５５℃で１分、７２℃で１分という条件で、ハイブリドーマ由来の重鎖及び軽鎖の可変領域を２６サイクル分のポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。このため、変性されたオリゴヌクレオチド用キットのすべての可能な組み合わせを用いた（多種多様なマウス可変領域とハイブリダイズするように設計した）。このことを以下の表に示す。

ＶＨ及びＶＬの増幅に用いられるオリゴヌクレオチド。変性位置をオリゴヌクレオチド配列における括弧内に示す。制限酵素部位の配列は下線で示される。

増幅された重鎖の可変領域を精製し、続いて制限酵素Ｓｆｉ Ｉ及びＡｐａＬＩを用いて消化させた。消化産物を精製し、ファゴミジウム（ｐｈａｇｏｍｉｄｉｕｍ）ベクターｐＨＧ−１ｍ（Ｈｅｂｅｒ ＢｉｏｔｅｃＳ．Ａ．、キューバ）（図５）のＤＮＡと連結した。産生される遺伝子構築とともに、Ｅ．ｃｏｌｉ株のＴＧ１の細菌をエレクトロポレーションによって形質転換した。形質転換された細菌群は、中程度のサイズの２．３×１０^４個のメンバーを有する１４Ｆ７ハイブリドーマ由来の重鎖可変領域のセミライブラリーに一致した。セミライブラリーのプラスミドＤＮＡを精製し、Ｎｏｔ Ｉ及びＳａｌ Ｉ酵素によって連続消化した。このＤＮＡを予め同一の酵素で消化した軽鎖可変領域の４つの収集物と別々に連結させた。ＴＧ１株の細菌をこれらの新たな遺伝子構築によって形質転換し、４つの独立したライブラリーを得た。これらの１つはそれぞれが１．６×１０^６個のサイズを有する１４Ｆ７ハイブリドーマ由来の重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含む多様性がわずかのミニライブラリーであった。他の３つは、予めマウス（κアイソタイプ）及びヒト（κ及びΛアイソタイプ）から得られる軽鎖の可変領域のさまざまな収集物を取り込んだ鎖交換ライブラリーであり、メンバーのサイズはそれぞれ１．０×１０７、１．４×１０^６、及び１．２×１０^６個であった。

（実施例６）
Ｎ−グリコリルＧＭ３に対する抗体断片を産生するクローンの単離
各ライブラリーから無作為に採取された９２個のクローン由来の抗体断片を運ぶファージを前述の手順に従って微量滴定プレートウェル内で産生した（Ｍａｒｋｓ、Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２、５８１〜５９７頁、１９９１年）。その特異性を１μｇ／ｍｌ Ｎ−グリコリルＧＭ３及びＮ−アセチルＧＭ３でコーティングされたポリ塩化ビニールプレート（Ｃｏｓｔａｒ、米国）上のＥＬＩＳＡにおいて評価した。結合したファージをペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、スウェーデン）とコンジュゲートした抗Ｍ１３モノクローナル抗体によって検出した。無作為に選別された個々のクローンの特性決定に加え、各ライブラリーに一致する１群の細菌によって産生されるファージ混合物由来のＮ−グリコリルＧＭ３に結合能を有するファージの選択を実施した。このため、参照の方法に従って、ファージを補助ファージＭ１３Ｋ０７を用いて産生し、ポリエチレングリコールとともに沈殿させることによって精製し、プラスチック表面（Ｉｎｍｕｎｏ ｔｕｂｅｓ、Ｎｕｎｃ、デンマーク）に結合したＮ−グリコリルＧＭ３に接触状態に置いた。チューブを十分に洗浄し、トリエチルアミン１００ｍｍｏｌ／ｌの存在下でファージを溶出させた。溶出液を中和し、Ｅ．ｃｏｌｉ株のＴＧ１細菌に感染させるのに用いた。感染させた細菌群から抗体を保有するファージを産生して再精製した。同ファージを前述したものと同一条件で新しい選択ラウンド用の出発物質として用いた。４回にわたる選択サイクル後、各ライブラリー由来のファージで感染させた細菌の９２個のコロニーを無作為に採取し、ライブラリーから無作為に採取されたクローンを評価するために前述と同様の形態でＮ−グリコリルＧＭ３の認識を実施した。

ライブラリーのクローンの直接解析から、３つの鎖交換ライブラリーにおける可変領域において認められた、Ｎ−グリコリルＧＭ３を認識する抗体断片を運ぶファージから産生するクローンを単離した。陽性のクローンは、１４Ｆ７ハイブリドーマ由来の可変領域によって単独で形成されるミニライブラリー内には１つも認められなかった。いくつかの選択サイクルの後、鎖交換ライブラリーからクローンを単離したところ、元の配列のミニライブラリー内には１つも認められなかった。以下の表は、Ｎ−グリコリルＧＭ３を認識する抗体断片を産生するクローン量及びそれが各ライブラリーから解析されたクローンの全数において表れる頻度について示す。１種類のクローンのみがＮ−アセチルＧＭ３との交叉反応性を示すファージを産生した。

（実施例７）
Ｎ−グリコリルＧＭ３を認識する１４Ｆ７由来の抗体断片の特性決定
１１個の抗体断片の可変領域を、挿入された抗体断片をコードする配列の５’及び３’末端をはさむｐＨＧ−１ｍベクターの領域内でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いた自動シーケンサーＡＬＦ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＩＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）によって完全な配列決定を実施した。すべての重鎖の可変領域の配列が１４Ｆ７に対して報告された配列に一致し、ＰＣＲにおいて変性オリゴヌクレオチドの使用によって導入されたと推定される枠組み構造１及び枠組み構造４の領域においてのみ変化が認められたことが確認された。配列をリセットした中で３つのＣＤＲには何の変異も認められなかった。それに対し、１１種類のクローンの軽鎖の可変領域の配列すべてが１４Ｆ７の配列と異なり、異なる配列の５群、すなわちマウス複製起点の２群、ヒト複製起点の１群（κアイソタイプ）及び他のヒト複製起点でΛアイソタイプ以外の２群に区分された。各配列群を代表する１種類のクローンを後の特性決定のために採取した。

選択されたクローンにおける軽鎖の可変領域間にみられる差異を示し、以下の表はそれらの元の同一性、それらの複製起点、アイソタイプ及びカバト（Ｋａｂａｔ）分類によるサブグループ内分類に関する。

クローンの軽鎖の可変領域間の差異及び１４Ｆ７抗体として最初に報告された差異を３つの相補的決定領域を含むすべての配列に沿って局在化し、以下に示す（図６）。

結合特異性は、コーティングとして、Ｎ−グリコリル ＧＭ３及びＮ−アセチル ＧＭ３に加え、種々のＮ−アセチル化ガングリオシド及び１種のＮ−グリコリル化ガングリオシドを含む１群の関連したガングリオシドの使用を特徴とする方法に準じてＥＬＩＳＡによって確認された。図７は、特性の決定された抗体断片を産生する５種類のクローンによる種々の抗原の認識について示す。標的抗原Ｎ−グリコリル ＧＭ３に対する結合のみを検出した。

クローンによる（ファージのコンテクスト外部の）可溶性の抗体断片の産生は、１ｍｍｏｌ／ｌのイソプロピル−チオガラクトピラノシドの存在下で誘発した。上清を収集し、ペリプラズマティック（ｐｅｒｉｐｌａｓｍａｔｉｃ）画分を確立された手順に従って採取した（ｄｅ Ｈａａｒｄ、Ｈ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、１８２１８〜１８２３０頁、１９９９年）。以下の修飾を除く記載の抗原と類似する該抗原でコーティングされたプレート上でＥＬＩＳＡにより、Ｎ−グリコリル ＧＭ３の認識活性を培養上清内及びペリプラズマティック画分内の両方で検出した。１０μｇ／ｍｌの（遺伝子構築内で抗体断片に融合されるｃ−ｍｙｃペプチドを対象とする）１Ｅ１０モノクローナル抗体及び抗マウス免疫グロブリンコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ、米国）を用い、結合抗体断片を検出した。製造業者の使用説明書に従い、マトリックスＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ ＨＣ Ｎｉｃｋｅｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ、米国）を用い、金属イオンに対する単一の親和性クロマトグラフィーにおいてペリプラズマティック画分から抗体断片を精製した。図８に、ＥＬＩＳＡによって測定された精製された可溶性を有する断片の活性について示す。

１４Ｆ７Ｍａｂの可変領域のＶＨ（ａ）及びＶＫ（ｂ）のアミノ酸配列及びそれぞれの最も同一性の高いヒト配列を示す図である。ＣＤＲには下線、両親媒性領域及びＴエピトープ候補には網掛けを施している。突然変異を施した可変領域のヒト化がもたらす配列についても示す。 競合ＥＬＩＳＡによって測定される１４Ｆ７Ｑ抗体の認識性を示す図である。Ｘ軸：抗体濃度Ｙ軸：４９２ｎｍで測定される吸光度ｉｏｒＣ５モノクローナル抗体を負の制御として用いた。 マウス腫瘍（メラノーマＢ１６腫瘍細胞系）の成長に関する１４Ｆ７モノクローナル抗体の効果を示す図である。 Ａ）１４Ｆ７モノクローナル抗体の血管形成に対する効果に関する免疫組織化学的研究について示す図である。矢印は免疫染色された血管を示す。Ｂ）１４Ｆ７モノクローナル抗体によって誘導された血管新生の阻害について示す図である。 ｐＨＧ−１ｍベクターを示す図である。 １４Ｆ７モノクローナル抗体のＶＬ領域及び選択されたＦｖ一本鎖断片のタンパク質配列を示す図である。各点は１４Ｆ７のＶＬ配列との同一性を示す。 抗体断片を運ぶファージによる認識特異性を示す図である。ファージ中で暴露された断片による１４Ｆ７ Ａｂのガングリオシドに対する結合の阻害が認められる。プレートはＮ−グリコリル ＧＭ３によってコーティングされ、ファージはウイルス粒子及びさまざまな濃度の１４Ｆ７とともにインキュベートされた。 可溶性の精製された断片によるＮ−グリコリルＧＭ３の認識性を示す図である。

【配列表】

Claims (26)

1. 以下に示す重鎖及び軽鎖の超可変領域（ＣＤＲ）の配列を特徴とする、マウス１４Ｆ７モノクローナル抗体に由来し、寄託ＥＣＡＣＣ９８１０１９０１のハイブリドーマによって産生される組み換え抗体。
   重鎖
   
   軽鎖
   
2. 前記１４Ｆ７抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ及び枠組み構造領域（ＦＲ）と、ＩｇＧ１ヒト重鎖の定常領域及びＣｋヒト軽鎖の定常領域とを含有し、前記ヒト重鎖、及び軽鎖の枠組み構造領域（ＦＲ）が以下の配列を有する１４Ｆ７抗体のキメラ変異体であることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
   重鎖
   
   軽鎖
   
3. 前記の重鎖及び軽鎖の枠組み構造領域（ＦＲ）内に点突然変異を含有することにより、免疫原性が減少した、１４Ｆ７モノクローナル抗体のヒト化変異体であることを特徴とする請求項１及び２に記載の抗体。
4. 以下の突然変異のいずれかを含有する重鎖及び軽鎖の枠組み構造領域を有する、前記１４Ｆ７モノクローナル抗体のヒト化変異体であることを特徴とする請求項３に記載の抗体。
   重鎖：
   
   軽鎖
   
5. マウス１４Ｆ７モノクローナル抗体の重鎖の可変領域の配列、及びあるマウス抗体の軽鎖の可変領域を含有することを特徴とする、マウス１４Ｆ７モノクローナル抗体に由来し、寄託番号ＥＣＡＣＣ９８１０１９０１のハイブリドーマによって産生される一本鎖Ｆｖ断片。
6. 前記軽鎖の可変領域が前記１４Ｆ７抗体自体であることを特徴とする請求項５に記載の一本鎖Ｆｖ断片。
7. 前記の重鎖及び軽鎖の超可変領域（ＣＤＲ）の配列が以下に示されるものであることを特徴とする請求項６に記載の一本鎖Ｆｖ断片。
   重鎖
   
   軽鎖
   
8. 前記１４Ｆ７抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ及び枠組み構造領域（ＦＲ）を含有し、重鎖及び軽鎖の前記枠組み構造領域（ＦＲ）が以下の配列を有することを特徴とする、請求項７に記載の一本鎖Ｆｖ断片。
   重鎖
   
   軽鎖
   
9. 重鎖及び軽鎖の前記枠組み構造領域（ＦＲ）に点突然変異を含有することにより、免疫原が減少した、請求項８に記載の一本鎖Ｆｖ断片。
10. 重鎖及び軽鎖の前記枠組み構造領域が以下の突然変異のいずれかを含有する、請求項９に記載の一本鎖Ｆｖ断片。
    重鎖
    
    軽鎖
    
11. １４Ｆ７モノクローナル抗体の重鎖の可変領域の配列、及び配列が以下の通りのある軽鎖可変領域を含有することを特徴とする、マウス１４Ｆ７モノクローナル抗体に由来し、請求項５に記載の寄託番号ＥＣＡＣＣ９８１０１９０１のハイブリドーマによって産生される一本鎖Ｆｖ断片。
    
12. マウス１４Ｆ７モノクローナル抗体の重鎖の可変領域の配列、及び配列が以下の通りのある軽鎖可変領域を含有することを特徴とする、マウス１４Ｆ７モノクローナル抗体に由来し、請求項５に記載の寄託番号ＥＣＡＣＣ９８１０１９０１のハイブリドーマによって産生される一本鎖Ｆｖ断片。
    
13. マウス１４Ｆ７モノクローナル抗体の重鎖の可変領域の配列、及びあるヒト抗体の軽鎖可変領域を含有することを特徴とする、マウス１４Ｆ７モノクローナル抗体に由来し、寄託番号ＥＣＡＣＣ９８１０１９０１のハイブリドーマによって産生される一本鎖Ｆｖ断片。
14. マウス１４Ｆ７モノクローナル抗体の重鎖の可変領域の配列、及び配列が以下の通りのある軽鎖可変領域を含有することを特徴とする、請求項１３に記載の一本鎖Ｆｖ断片。
    
15. マウス１４Ｆ７モノクローナル抗体の重鎖の可変領域の配列、及び配列が以下の通りのある軽鎖可変領域を含有することを特徴とする、請求項１３に記載の一本鎖Ｆｖ断片。
    
16. マウス１４Ｆ７モノクローナル抗体の重鎖の可変領域の配列、及び配列が以下の通りのある軽鎖可変領域を含有することを特徴とする、請求項１３に記載の一本鎖Ｆｖ断片。
    
17. 請求項１から４までのいずれかの組み換え抗体を発現することを特徴とする細胞系。
18. 請求項５から１６までのいずれかの一本鎖Ｆｖ断片を発現することを特徴とする細胞系。
19. 請求項１から４までのいずれかの組み換え抗体を含むことを特徴とする、悪性腫瘍を治療するための医薬品組成物。
20. 請求項５から１６までのいずれかの一本鎖Ｆｖ断片及び適切な賦形剤を含むことを特徴とする、悪性腫瘍を治療するための医薬品組成物。
21. 悪性乳房腫瘍、メラノーマ、並びにこれらの転移及び再発を治療するための請求項１９の医薬品組成物の使用。
22. 悪性乳房腫瘍、メラノーマ、並びにこれらの転移及び再発を治療するための請求項２０の医薬品組成物の使用。
23. 請求項１から４までのいずれかの組み換え抗体及び適切なマーカーを含むことを特徴とする、「ｉｎ ｖｉｖｏ」での悪性腫瘍の部位決定及び同定のための試薬。
24. 悪性乳房腫瘍、メラノーマ、並びにこれらの転移及び再発の「ｉｎ ｖｉｖｏ」での部位決定及び同定に対して用いることを特徴とする請求項２３に記載の試薬。
25. 請求項５から１６までのいずれかの一本鎖Ｆｖ断片及び適切なマーカーを含むことを特徴とする、「ｉｎ ｖｉｖｏ」での悪性腫瘍の部位決定及び同定のための試薬。
26. 悪性乳房腫瘍、メラノーマ、並びにこれらの転移及び再発の「ｉｎ ｖｉｖｏ」での部位決定及び同定に対して用いることを特徴とする請求項２５に記載の試薬。