JP2018506306A - 高収率の安定した発現細胞クローンおよびそれに得られた抗体分子の取得方法 - Google Patents
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Abstract
無タンパク質培地中の骨髄腫細胞株から高収量、安定発現細胞クローンを得るための方法が提供される。この方法は、組換え抗体の工業的製造のために使用され、３段階を含む：（１）低密度で細胞を静的に培養し、そして徐々に脂肪強化サプリメントを減少させ化学培養培地にして、タンパク質を含まない培地に適応させ；（２）高い密度で細胞を培養し、実験室規模の灌流発酵システムを利用してタンパク質フリー培地へ適応させ；そして（３）発酵終了後の細胞から高収量、安定発現細胞クローンをスクリーニングする。細胞クローンは、ヒト化抗ＮｅｕＧｃＧＭ３ １４Ｆ７組換え抗体を産生するために使用することが出来る。
Description
本発明は、バイオテクノロジーに関し、具体的には、治療用抗体を産生するために、灌流発酵プロセスに使用される安定した高生産性細胞クローンを選択する効率的な方法に関する。
治療用抗体は、市場へのバイオ医薬品の主要なカテゴリーを構成する（Walsh G、2014、Nature Biotechnology 2014,32：992-1000）。いくつかの治療用抗体は、癌、自己免疫疾患および他の慢性疾患の治療のための承認登録を得ており、そして数十の組換え抗体は、臨床開発の異なるフェーズにある（開発中の生物学的医薬品、Phrma Report 2013、www.phrma.org）。通常、患者は各用量で数百ミリグラムの治療用抗体を受けるため、現在世界中で生産能力の巨大な需要がある。
例えば、遺伝子増幅システム、細胞培養培地最適化、および高産生細胞クローンを選択するための方法など、工業的細胞株の生産性を高めるためのいくつかのアプローチが行われてきた。治療用抗体を産生するための組換え骨髄腫細胞株の遺伝的改変およびエピジェネティックな適応は、現在、非常に競争の激しい研究分野である（Barnesら、2000、Cytotechnology 32：109-123; Barnesら、2007、Biotechnol Bioeng 96：337-349）。
例えば、遺伝子増幅システム、細胞培養培地最適化、および高産生細胞クローンを選択するための方法など、工業的細胞株の生産性を高めるためのいくつかのアプローチが行われてきた。治療用抗体を産生するための組換え骨髄腫細胞株の遺伝的改変およびエピジェネティックな適応は、現在、非常に競争の激しい研究分野である（Barnesら、2000、Cytotechnology 32：109-123; Barnesら、2007、Biotechnol Bioeng 96：337-349）。
灌流発酵（Perfusion fermentation）に基づく生産プロセスは、高密度の細胞培養および発酵収穫における潜在的に高い抗体濃度を可能にする。しかしながら、長期間の高密度細胞培養は、抗体産生を実際に最適化するために安定した高産生クローンを必要とする。タンパク質を含まない培地、例えばPFHMII細胞培養培地（Hycloneからの参照）のような生物薬剤生産のために開発された。
組換え抗体産生ＮＳ０細胞クローンはうまくタンパク質を含まない培地中で増殖するようになってきた（2004/038010 A1 WO）。しかし、血清フリー培地への適応および無血清培地におけるさらなる長期発酵プロセスは、通常、細胞株の生産性の低下を伴う（Barnesら、2003、Biotechnol Bioeng 81：631-639; Barnesら、2004年、Biotechnol Bioeng 85：115-121）。タンパク質を含まない培地で増殖するのに適した安定した高生産性細胞クローンは、工業用不安定な組換え骨髄腫細胞株から回収することができる（CN104152415A）。
しかし実際には、いくつかの組換え骨髄腫細胞株では、無血清培地から無タンパク質培地への適応プロセスは不可能であるか、または長時間を要し、非生産細胞集団の出現による抗体産生の喪失を伴う。産業上の可能性を持つ細胞クローンの選択プロセスにおける革新が求められる。
バイオ医薬品、特に治療用抗体は、複雑な糖タンパク質分子である。生産プロセスの変更によって、製品の属性が変化する可能性がある。1996年4月、生物学的評価研究センター（CBER）、医薬品評価研究センター（CDER）でバイオテクノロジー製品由来の製品の比較可能性を実証するための比較可能性の概念が出現した。
www.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm122879.htm；活性物質としてバイオ由来のタンパク質を含む医薬品の比較可能性に関するEUガイドライン：品質問題（CPMP 2003年12月）
www.emea.europa.eu/pdfs /human/bwp/320700en.pdf;ICH Q5E：その製造プロセスの変化により影響を受けるバイオテクノロジー応用医薬品/生物学的製剤の比較EU：CMPM、2004年12月1日、CPMP/ICH/5721/03、運用開始日付で採用：2005年6月、厚生労働省：2005年4月26日採用、PFSB /ELD通知番号0426001; FDA：巻70、第125号官報に掲載、2005年6月30日; 37861〜2 www.ich.org/fileadmin / Public Web Site / ICH製品/ガイドライン/品質/ Q5E /ステップ4 / Q5EのGuideline.pdf ）。細胞株における変化は、生産プロセスにおける重要な改変の1つと考えられている。従って、工業的可能性を有する細胞株の選択は、生産プロセスの開発において絶対に必要とされるが、安定性および生産速度の要求される特性を有する選択された細胞のどれが適しているかは自明ではない。分泌された免疫グロブリンの変動が、その生物学的特性に影響を及ぼす可能性があるためである。各特異的抗体の同定属性の定義は、生産規模の変更または製造現場などの製造プロセスの改変に関連するさらなる比較可能性研究の前提条件である。
www.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm122879.htm；活性物質としてバイオ由来のタンパク質を含む医薬品の比較可能性に関するEUガイドライン：品質問題（CPMP 2003年12月）
www.emea.europa.eu/pdfs /human/bwp/320700en.pdf;ICH Q5E：その製造プロセスの変化により影響を受けるバイオテクノロジー応用医薬品/生物学的製剤の比較EU：CMPM、2004年12月1日、CPMP/ICH/5721/03、運用開始日付で採用：2005年6月、厚生労働省：2005年4月26日採用、PFSB /ELD通知番号0426001; FDA：巻70、第125号官報に掲載、2005年6月30日; 37861〜2 www.ich.org/fileadmin / Public Web Site / ICH製品/ガイドライン/品質/ Q5E /ステップ4 / Q5EのGuideline.pdf ）。細胞株における変化は、生産プロセスにおける重要な改変の1つと考えられている。従って、工業的可能性を有する細胞株の選択は、生産プロセスの開発において絶対に必要とされるが、安定性および生産速度の要求される特性を有する選択された細胞のどれが適しているかは自明ではない。分泌された免疫グロブリンの変動が、その生物学的特性に影響を及ぼす可能性があるためである。各特異的抗体の同定属性の定義は、生産規模の変更または製造現場などの製造プロセスの改変に関連するさらなる比較可能性研究の前提条件である。
１４Ｆ７は、腫瘍関連抗原Ｎ−グリコリル−ＧＭ３ガングリオシド［ＧＭ３（Ｎｅｕ５Ｇｃ）］に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である（特許番号ZL 99800261.5; Carrら、2000、Hybridoma 19,241-247）。この抗原は、乳癌（Marquinaら、1996、Cancer Res 56,5165-5171; Olivaら、2006、Breast Cancer Res Treat 96,115-121）、黒色腫（Osorioら、2008 、Cancer BiolTher 7,488-495）、非小細胞肺癌（van Cruijsenら、2009、BMC Cancer 9,180; Hayashiら、2013、Cancer Sci 104,43-47）、ウィルムス腫瘍（Scursoniら、2010、Pediatr Dev Pathol 13,18-23）、神経外胚葉腫瘍（Scursoniら、2011、Clin Dev Immunol 245181）、肉腫および甲状腺癌（Blancoら、2013、Journal of Biomarkers、602417）、消化器系（Blancoら、2011、ISRN Gastroenterol 645641）および尿生殖器系（Blancoら、2011、ISRN Pathology、953803）からの悪性腫瘍において検出されている。
１４Ｆ７ ｍＡｂは、補体非依存的にガングリオシドを発現する腫瘍細胞を死滅させることができる（Carrら、2002、Hybrid Hybridomics 21、463-468; Roque-Navarroら、2008、Mol Cancer Ther 7、2033-2041）。潜在的なヒトＴ細胞エピトープの修飾によって得られた（特許出願番号200480017457.8; Mateoら、2000、Hybridoma 19,463〜471）、１４Ｆ７ｈと命名されたこの抗体のヒト化バージョンは、マウスおよびキメラ抗体の特性を保持した（Fernandez-Marreroら、2011、Immunobiology 216、1239-1247）。ヒト化１４Ｆ７ｈｍＡｂは、ＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）発現腫瘍の治療に潜在的価値がある。
１４Ｆ７ ｍＡｂは、補体非依存的にガングリオシドを発現する腫瘍細胞を死滅させることができる（Carrら、2002、Hybrid Hybridomics 21、463-468; Roque-Navarroら、2008、Mol Cancer Ther 7、2033-2041）。潜在的なヒトＴ細胞エピトープの修飾によって得られた（特許出願番号200480017457.8; Mateoら、2000、Hybridoma 19,463〜471）、１４Ｆ７ｈと命名されたこの抗体のヒト化バージョンは、マウスおよびキメラ抗体の特性を保持した（Fernandez-Marreroら、2011、Immunobiology 216、1239-1247）。ヒト化１４Ｆ７ｈｍＡｂは、ＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）発現腫瘍の治療に潜在的価値がある。
しかしながら、抗体１４Ｆ７ｈ発現する組換えＮＳ０骨髄腫細胞株抗原ＧＭ３（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を発現し、そして分泌細胞傷害性抗体によって死滅するので、これらの細胞は高密度細胞培養において生存能力を失った。したがって、組換えヒト化抗体１４Ｆ７ｈは、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ酵素のノックダウンにより、Ｎ−グリコシル化−複合糖質に欠損したネズミＮＳ０骨髄腫細胞株において発現された（Fernandez-Marreroら、2011、Immunobiology 216、 1239-1247）。そのような細胞系は、無血清培地で増殖するために適応することが非常に困難であることが示された。
本発明では、灌流発酵生産プロセスで使用される安定した高生産性細胞クローンを開発するための新しいアプローチを確立した。このアプローチに続いて、抗ＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）モノクローナル抗体を産生する組換えＮＳ０骨髄腫細胞株から細胞クローンを回収した。そのような治療用抗体の識別属性も本発明に開示されており、これはこの生物医薬品の分子表現型を規定する。
[発明の詳細な説明]
この手順は、無血清培地から無タンパク質培地への適応プロセスが不可能であるか、または長期間かかるが、非生産細胞集団の出現による抗体産生の喪失を伴う組換え骨髄腫細胞株を含む。本発明における重要な革新的なステップは、安定な高生産細胞クローンの頻度を増加させる、高い細胞密度（８〜１０×１０６細胞／ｍｌ）に無タンパク質培地で増殖する適応プロセスである。
この手順は、無血清培地から無タンパク質培地への適応プロセスが不可能であるか、または長期間かかるが、非生産細胞集団の出現による抗体産生の喪失を伴う組換え骨髄腫細胞株を含む。本発明における重要な革新的なステップは、安定な高生産細胞クローンの頻度を増加させる、高い細胞密度（８〜１０×１０６細胞／ｍｌ）に無タンパク質培地で増殖する適応プロセスである。
本発明の方法は３つの段階からなる：
１．低密度静止細胞培養における合成培地への脂質強化サプリメントの段階的還元による無タンパク質培地への適応
２．実験室スケールでの灌流発酵システムを用いた高密度細胞培養における無タンパク質培地への適応
３．発酵終了時の細胞からの安定した高産生細胞クローンの選択。
第１段階は、３〜４ｇ／ＬのＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（細胞ブースト）（コレステロール、脂質および他の栄養素が豊富）を補充した無タンパク質細胞培養培地（ＰＦＨＭＩＩ）中で細胞株を解凍することによって実施した。最大細胞濃度（Ｘｖ）は０．９〜１．２×１０６細胞／ｍｌの範囲である。Ｘｖが一定値に達するまで連続継代を行った。各継代後の初期細胞濃度を０．４〜０．５×１０６細胞／ｍｌに調整した。７回の継代後、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔサプリメントは１〜２ｇ／Ｌに減少し、４回の追加継代後にＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔサプリメントは完全に除去された。その後、細胞を、無添加培地中で、サプリメントなしで６０日間以上増殖させた。約９５％の細胞生存率で１．５〜１．８×１０６細胞／ｍｌ間の値のＸｖに達した。
第２段階として、ＰＦＨＭＩＩ細胞培養培地中で６０日超増殖する細胞を、５リットルのバイオリアクターに播種した。灌流外部装置を用いて細胞濃度を０．５×１０６から１０×１０６細胞／ｍｌに成長させた。発酵プロセスは２４日間続けられた。０日目から１６日目まで、細胞生存率は９０％以上に維持されたが、１６日後に細胞生存率は８０％未満に低下した。細胞収穫物中の平均抗体濃度は３０〜４０ｍｇ／ｍｌであった。発酵終了時（タンパク質を含まない培地で５００時間以上増殖）の細胞を凍結し、液体窒素中で保存した（End Production Cell Bank、EPCB）。
１．低密度静止細胞培養における合成培地への脂質強化サプリメントの段階的還元による無タンパク質培地への適応
２．実験室スケールでの灌流発酵システムを用いた高密度細胞培養における無タンパク質培地への適応
３．発酵終了時の細胞からの安定した高産生細胞クローンの選択。
第１段階は、３〜４ｇ／ＬのＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（細胞ブースト）（コレステロール、脂質および他の栄養素が豊富）を補充した無タンパク質細胞培養培地（ＰＦＨＭＩＩ）中で細胞株を解凍することによって実施した。最大細胞濃度（Ｘｖ）は０．９〜１．２×１０６細胞／ｍｌの範囲である。Ｘｖが一定値に達するまで連続継代を行った。各継代後の初期細胞濃度を０．４〜０．５×１０６細胞／ｍｌに調整した。７回の継代後、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔサプリメントは１〜２ｇ／Ｌに減少し、４回の追加継代後にＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔサプリメントは完全に除去された。その後、細胞を、無添加培地中で、サプリメントなしで６０日間以上増殖させた。約９５％の細胞生存率で１．５〜１．８×１０６細胞／ｍｌ間の値のＸｖに達した。
第２段階として、ＰＦＨＭＩＩ細胞培養培地中で６０日超増殖する細胞を、５リットルのバイオリアクターに播種した。灌流外部装置を用いて細胞濃度を０．５×１０６から１０×１０６細胞／ｍｌに成長させた。発酵プロセスは２４日間続けられた。０日目から１６日目まで、細胞生存率は９０％以上に維持されたが、１６日後に細胞生存率は８０％未満に低下した。細胞収穫物中の平均抗体濃度は３０〜４０ｍｇ／ｍｌであった。発酵終了時（タンパク質を含まない培地で５００時間以上増殖）の細胞を凍結し、液体窒素中で保存した（End Production Cell Bank、EPCB）。
本発明の別の実施形態では、発酵終了時の細胞からの安定した高生産性細胞クローンを選択した。ＥＰＣＢからの解凍された細胞を、限界希釈法（Freshney R.、2010、動物細胞の培養：基本的な技術のマニュアルおよび特別な適用（第６版））によって細胞クローニングに供した。細胞培養上清中の分泌された抗体を、抗１４Ｆ７ｈ ＭＡｂ抗イディオタイプ抗体４Ｇ９を捕捉抗原として用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。細胞培養上清を１／５００に希釈した。平均値を越える吸光度の値を示すクローンをフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によるさらなる特徴付けのために選択した。細胞内免疫グロブリン染色は、ＦＩＴＣと結合した抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて行い、ＦＡＣＳによって計測した（Pluschkeら、2011、BMC Proceedings 5 、Suppl 8:P97）。各単離されたクローンについて、平均蛍光強度（ＭＦＩ）および陽性細胞の割合を決定した。驚くべきことに、評価されたクローンの８０％以上が優勢な抗体生産亜集団を示した。
スピナーフラスコおよび５Ｌバイオリアクターにおける動力学研究のために、９５％を超える抗体−生産亜集団およびより高いＭＦＩを有するクローンを選択し、細胞培養液中の細胞濃度（Ｘｖ）、細胞生存度（％）、比増殖速度（μ）および細胞培養上清のＩｇＧ濃度を評価した。細胞濃度は４〜５×１０６細胞／ｍｌ間に見出された。指数増殖期間の細胞生存率は約８５％であった。比増殖速度は、０．０１５〜０．０２５時間−１の間で変化した。ＩｇＧ濃度は７０〜１２０ｍｇ／Ｌの間で見出された。
スピナーフラスコおよび５Ｌバイオリアクターにおける動力学研究のために、９５％を超える抗体−生産亜集団およびより高いＭＦＩを有するクローンを選択し、細胞培養液中の細胞濃度（Ｘｖ）、細胞生存度（％）、比増殖速度（μ）および細胞培養上清のＩｇＧ濃度を評価した。細胞濃度は４〜５×１０６細胞／ｍｌ間に見出された。指数増殖期間の細胞生存率は約８５％であった。比増殖速度は、０．０１５〜０．０２５時間−１の間で変化した。ＩｇＧ濃度は７０〜１２０ｍｇ／Ｌの間で見出された。
本発明の別の実施形態では、安定な高プロデューサー細胞クローンの長期安定性を、連続細胞培養で３０，６０および９０日後に動態学的研究を行うことによって評価した。比増殖速度（μ）および比生産速度（ｑｐ）を決定した。
本発明のさらに別の実施形態では、選択された安定な高プロデューサー細胞クローンによる分泌された免疫グロブリンの同一性属性が決定された。そのような同一性属性の開示は、この治療用抗体１４Ｆ７ｈの分子表現型を操作上定義する：
本発明のさらに別の実施形態では、選択された安定な高プロデューサー細胞クローンによる分泌された免疫グロブリンの同一性属性が決定された。そのような同一性属性の開示は、この治療用抗体１４Ｆ７ｈの分子表現型を操作上定義する：
本発明のさらに別の実施形態において、１４Ｆ７ｈ組換え抗体のインビトロ及びインビボ抗腫瘍活性が評価された。
以下の実施例は、本発明を説明することを意図しているが、本発明の範囲を限定するものではない。最先端技術の方法の詳細な説明は提供されていない。
実施例１：低密度静止細胞培養における、合成培地への脂質に富むサプリメントの段階的減少によるタンパク質フリー培地への適応。
細胞株１４Ｆ７ｈｔｂ５８は、サプリメントＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ５の減少の工程は３６．５℃、５％ＣＯ２で撹拌シェーカー（８０ｒｐｍ）で、７５ｃｍ２Ｔフラスコで行った。サプリメントＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ５なしＰＦＨＭＩＩ細胞培養培地中での増殖に適合させた。４８〜７２時間ごとに、生存細胞の濃度および細胞生存率を決定した。細胞濃度は、すべての培養継代において０．４〜０．５×１０６細胞／ｍｌに調整した。
凍結した１４Ｆ７ｈｔｂ５８細胞を、３．５ｇ／ＬのＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ５を補充したＰＦＨＭＩＩで解凍した。解凍後、細胞生存率は７５％であり、次いでそれは９０％を超えて増加した（図１）。適応プロセスの間に、連続培養継代は行われ、９０％より高い細胞生存率のパーセンテージで、０．９から１．８×１０６細胞／ｍｌの範囲内の生存細胞の最大濃度を維持した。１１培養継代後、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ５の濃度は、ゼロに減少し、細胞生存率は９５％で、１．２〜１．８×１０６細胞／ｍｌであった。脂質およびコレステロールを含まないＰＦＨＭＩＩ細胞培養培地への適応プロセスは、およそ６０日間かかった。
細胞株１４Ｆ７ｈｔｂ５８は、サプリメントＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ５の減少の工程は３６．５℃、５％ＣＯ２で撹拌シェーカー（８０ｒｐｍ）で、７５ｃｍ２Ｔフラスコで行った。サプリメントＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ５なしＰＦＨＭＩＩ細胞培養培地中での増殖に適合させた。４８〜７２時間ごとに、生存細胞の濃度および細胞生存率を決定した。細胞濃度は、すべての培養継代において０．４〜０．５×１０６細胞／ｍｌに調整した。
凍結した１４Ｆ７ｈｔｂ５８細胞を、３．５ｇ／ＬのＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ５を補充したＰＦＨＭＩＩで解凍した。解凍後、細胞生存率は７５％であり、次いでそれは９０％を超えて増加した（図１）。適応プロセスの間に、連続培養継代は行われ、９０％より高い細胞生存率のパーセンテージで、０．９から１．８×１０６細胞／ｍｌの範囲内の生存細胞の最大濃度を維持した。１１培養継代後、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ５の濃度は、ゼロに減少し、細胞生存率は９５％で、１．２〜１．８×１０６細胞／ｍｌであった。脂質およびコレステロールを含まないＰＦＨＭＩＩ細胞培養培地への適応プロセスは、およそ６０日間かかった。
実施例２：実験室規模での灌流発酵システムを用いた高密度細胞培養におけるタンパク質培地への適応。
タンパク質フリーＰＦＨＭＩＩ細胞培養培地中での増殖に適応した１４Ｆ７ｈｔｂ５８細胞を０．４〜０．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で５Ｌ発酵槽に接種した。発酵槽操作パラメータは、ｐＨ６．９〜７．０；１０５ＲＰＭ；４０％の溶存酸素；３６．５〜３７．０℃；作業量３．５Ｌであった。Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバーを用いてトリパンブルー排除法（Ｓｉｇｍａ）により細胞生存率および細胞濃度を毎日モニターした。細胞濃度が２．５×１０６細胞／ｍｌでの値に達した後、灌流モードでの発酵操作が行われた。中空繊維カートリッジを潅流モードに使用し、０．３〜０．７ＶＶＤの希釈率を使用した。
発酵プロセス中、細胞生存率は９０％を超えて３８４時間まで維持され、次いでそれは８０％に減少した。抗体濃度は３０〜４０ｍｇ／Ｌの範囲であった。０．７ＶＶＤの希釈率を用いた場合、達した最大細胞濃度は９×１０６細胞／ｍｌであった（図２）。細胞は、培養７２時間後、０．８ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で発酵プロセスの終わりに採取し、ローラーボトルに播種し、細胞を１２×１０６細胞／バイアル（End Production Cell Bank、ＥＰＣ）で凍結した。解凍後、細胞生存率は９０％であり、培養９６時間後に細胞生存率は９７％であった。
タンパク質フリーＰＦＨＭＩＩ細胞培養培地中での増殖に適応した１４Ｆ７ｈｔｂ５８細胞を０．４〜０．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で５Ｌ発酵槽に接種した。発酵槽操作パラメータは、ｐＨ６．９〜７．０；１０５ＲＰＭ；４０％の溶存酸素；３６．５〜３７．０℃；作業量３．５Ｌであった。Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバーを用いてトリパンブルー排除法（Ｓｉｇｍａ）により細胞生存率および細胞濃度を毎日モニターした。細胞濃度が２．５×１０６細胞／ｍｌでの値に達した後、灌流モードでの発酵操作が行われた。中空繊維カートリッジを潅流モードに使用し、０．３〜０．７ＶＶＤの希釈率を使用した。
発酵プロセス中、細胞生存率は９０％を超えて３８４時間まで維持され、次いでそれは８０％に減少した。抗体濃度は３０〜４０ｍｇ／Ｌの範囲であった。０．７ＶＶＤの希釈率を用いた場合、達した最大細胞濃度は９×１０６細胞／ｍｌであった（図２）。細胞は、培養７２時間後、０．８ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で発酵プロセスの終わりに採取し、ローラーボトルに播種し、細胞を１２×１０６細胞／バイアル（End Production Cell Bank、ＥＰＣ）で凍結した。解凍後、細胞生存率は９０％であり、培養９６時間後に細胞生存率は９７％であった。
実施例３：発酵終了時の細胞からの安定した高産生細胞クローンの選択。
限界希釈法および５〜１０％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２１：１細胞培養培地を用いて、ＥＰＣから解凍した細胞を９６穴プレート中の１ウェルあたり単一細胞にクローニングした。培養プレートを５％ＣＯ２雰囲気中で３６．５℃でインキュベートした。クローニング効率は２％以下であった。細胞クローニングの２０日後、培養上清を採取して、サンドイッチ型ＥＬＩＳＡによってＩｇＧ濃度を評価した。抗イディオタイプ抗体４Ｇ９（３μｇ／ｍｌ）を捕捉抗原として用い、抗ヒト重鎖ヤギ抗体をプローブとしてアルカリホスファターゼに結合させた。全てのサンプルを１／５００に希釈し、上清の吸光度の中央値を決定した。中央値より高い吸光度値を有するクローンを選択した（２３Ｃ２，２３Ｅ９，３１Ｃ７，３１Ｅ７，３５Ｄ６，３５Ｄ８，７２Ｄ３，７２Ｆ６，７２Ｇ５，７３Ｅ５，７３Ｆ４）（図３）。選択されたクローンを、５〜１０％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２ １：１細胞培地中で２４ウェルプレートに展開した。Ｔ培養フラスコ中で、さらに細胞増殖を３６．５℃、５％ＣＯ２で撹拌シェーカー（８０ｒｐｍ）で、ＰＦＨＭＩＩ細胞培養培地を用いて行った。
細胞内ＩｇＧ含有量を、選択されたクローンにおけるフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって決定した。１：２００に希釈したＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）（Ｓｉｇｍａ）に結合した抗ヒトＩｇＧ抗体をプローブとして使用した。ラベリング効率を決定するために、４×１０５細胞／サンプルが分析された。９５％を超える高産生細胞亜集団を有するクローンを選択した（図４）。別の選択基準は、標準化された蛍光中央強度（ＦＭＩ）であり、クローン３５Ｄ６，７２Ｇ５および３１Ｅ７が選択された（図５）。
このようなクローンをローラーボトルで増殖させ、５Ｌバイオリアクター（３６．５〜３７℃、１００〜１０５ＲＰＭ、ｐＨ＜７、溶存酸素濃度４０％以上）でも動態研究を行った。クローン３１Ｅ７は、ローラーボトル及び５Ｌバイオリアクター中で両方の最高細胞濃度を示し、５×１０６細胞／ｍｌおよび４×１０６細胞の値をそれぞれ示した。生存細胞の積分が同様の結果を提供し、ローラーボトルで４．５×１０８細胞／ｍＬ＊ｈで、５Ｌバイオリアクター中２．５×１０８細胞／ｍＬ＊ｈであった。これらの値は、親細胞について得られたものよりも１．３〜１．４高かった（図６）。細胞生存率は、評価された全てのクローンについて増殖指数期において８５％より高かった（図６）。クローン３１Ｅ７は、ローラーボトル及び５Ｌバイオリアクター中で両方の最高成長特定率（＞０．０２５時間−１）を示した。５Ｌバイオリアクター中の全てのクローンについて抗体濃度が５０〜７０ｍｇ／Ｌであったが、クローン３１Ｅ７はローラーボトル中で最も高い抗体濃度を示した（図７Ａおよび７Ｂ）。
分泌された抗体の生物学的活性を評価するために、５Ｌバイオリアクターで実施された動的研究から試料を採取した。サンドイッチ型ＥＬＩＳＡを行った。ポリソーププレートを、ＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシドのメタノール溶液（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングした。二次抗体として、アルカリホスファターゼに結合した抗ヒト重鎖ヤギ抗体を使用した。全ての試料を１μｇ／ｍｌの抗体濃度に調整し、ＥＬＩＳＡ試験で１／１０に希釈した。すべての試験サンプルはガングリオシド抗原の認識を示したが、クローン３１Ｅ７および３５Ｄ６は陽性対照に対して７０〜８０％の間の値を示した（図８）。
細胞内ＩｇＧ含量は、表現型適応およびクローニングの過程に沿って発展した。ＰＦＨＭＩＩ＋Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ５で増殖する親細胞１４Ｆ７ｈｔＢ５８は、非産生細胞亜集団の存在のために二峰性分布を示した。ＰＦＨＭＩＩ培地中で高密度で増殖するように適応させた後、１４Ｆ７ｈｔＢ５８細胞を産生細胞亜集団（単峰性分布）で濃縮したが、クローン３１Ｅ７ではより狭い単一ピークが得られ、より均質な細胞亜集団を示した（図９）。実際、クローン３１Ｅ７は、親細胞よりも高い最大細胞濃度、生存細胞の積分および抗体産生率を有する（図１０）。
限界希釈法および５〜１０％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２１：１細胞培養培地を用いて、ＥＰＣから解凍した細胞を９６穴プレート中の１ウェルあたり単一細胞にクローニングした。培養プレートを５％ＣＯ２雰囲気中で３６．５℃でインキュベートした。クローニング効率は２％以下であった。細胞クローニングの２０日後、培養上清を採取して、サンドイッチ型ＥＬＩＳＡによってＩｇＧ濃度を評価した。抗イディオタイプ抗体４Ｇ９（３μｇ／ｍｌ）を捕捉抗原として用い、抗ヒト重鎖ヤギ抗体をプローブとしてアルカリホスファターゼに結合させた。全てのサンプルを１／５００に希釈し、上清の吸光度の中央値を決定した。中央値より高い吸光度値を有するクローンを選択した（２３Ｃ２，２３Ｅ９，３１Ｃ７，３１Ｅ７，３５Ｄ６，３５Ｄ８，７２Ｄ３，７２Ｆ６，７２Ｇ５，７３Ｅ５，７３Ｆ４）（図３）。選択されたクローンを、５〜１０％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２ １：１細胞培地中で２４ウェルプレートに展開した。Ｔ培養フラスコ中で、さらに細胞増殖を３６．５℃、５％ＣＯ２で撹拌シェーカー（８０ｒｐｍ）で、ＰＦＨＭＩＩ細胞培養培地を用いて行った。
細胞内ＩｇＧ含有量を、選択されたクローンにおけるフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって決定した。１：２００に希釈したＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）（Ｓｉｇｍａ）に結合した抗ヒトＩｇＧ抗体をプローブとして使用した。ラベリング効率を決定するために、４×１０５細胞／サンプルが分析された。９５％を超える高産生細胞亜集団を有するクローンを選択した（図４）。別の選択基準は、標準化された蛍光中央強度（ＦＭＩ）であり、クローン３５Ｄ６，７２Ｇ５および３１Ｅ７が選択された（図５）。
このようなクローンをローラーボトルで増殖させ、５Ｌバイオリアクター（３６．５〜３７℃、１００〜１０５ＲＰＭ、ｐＨ＜７、溶存酸素濃度４０％以上）でも動態研究を行った。クローン３１Ｅ７は、ローラーボトル及び５Ｌバイオリアクター中で両方の最高細胞濃度を示し、５×１０６細胞／ｍｌおよび４×１０６細胞の値をそれぞれ示した。生存細胞の積分が同様の結果を提供し、ローラーボトルで４．５×１０８細胞／ｍＬ＊ｈで、５Ｌバイオリアクター中２．５×１０８細胞／ｍＬ＊ｈであった。これらの値は、親細胞について得られたものよりも１．３〜１．４高かった（図６）。細胞生存率は、評価された全てのクローンについて増殖指数期において８５％より高かった（図６）。クローン３１Ｅ７は、ローラーボトル及び５Ｌバイオリアクター中で両方の最高成長特定率（＞０．０２５時間−１）を示した。５Ｌバイオリアクター中の全てのクローンについて抗体濃度が５０〜７０ｍｇ／Ｌであったが、クローン３１Ｅ７はローラーボトル中で最も高い抗体濃度を示した（図７Ａおよび７Ｂ）。
分泌された抗体の生物学的活性を評価するために、５Ｌバイオリアクターで実施された動的研究から試料を採取した。サンドイッチ型ＥＬＩＳＡを行った。ポリソーププレートを、ＮｅｕＧｃＧＭ３ガングリオシドのメタノール溶液（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングした。二次抗体として、アルカリホスファターゼに結合した抗ヒト重鎖ヤギ抗体を使用した。全ての試料を１μｇ／ｍｌの抗体濃度に調整し、ＥＬＩＳＡ試験で１／１０に希釈した。すべての試験サンプルはガングリオシド抗原の認識を示したが、クローン３１Ｅ７および３５Ｄ６は陽性対照に対して７０〜８０％の間の値を示した（図８）。
細胞内ＩｇＧ含量は、表現型適応およびクローニングの過程に沿って発展した。ＰＦＨＭＩＩ＋Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ５で増殖する親細胞１４Ｆ７ｈｔＢ５８は、非産生細胞亜集団の存在のために二峰性分布を示した。ＰＦＨＭＩＩ培地中で高密度で増殖するように適応させた後、１４Ｆ７ｈｔＢ５８細胞を産生細胞亜集団（単峰性分布）で濃縮したが、クローン３１Ｅ７ではより狭い単一ピークが得られ、より均質な細胞亜集団を示した（図９）。実際、クローン３１Ｅ７は、親細胞よりも高い最大細胞濃度、生存細胞の積分および抗体産生率を有する（図１０）。
実施例４：高産生細胞クローンの長期安定性試験。
クローン３１Ｅ７による抗体産生の安定性を、細胞培養において９０日間評価した。ローラーボトルにおける動力学的（kinetic）研究は、細胞融解の３０、６０および９０日後に行った。フローサイトメトリー研究を行うために試料を採取した。細胞培養において異なる時間を有する細胞の間に相違は見出されなかった。最大細胞濃度が３．５〜４．５×１０６細胞／ｍｌで変化し、細胞生存率は９０％以上で、抗体濃度が５０〜８０ｍｇ／Ｌの範囲であった（図１０）。成長特定速度（μ）は、０．０２５時間−１超を維持し、一方生産特定率（ＱＰ）は０．１８ｐｇ／細胞＊時間超であった（図１１）。細胞培養９０日後、クローン３１Ｅ７は、均一な高産生細胞集団示す同じＦＭＩで狭い単一ピークを示した（図１２）。
クローン３１Ｅ７による抗体産生の安定性を、細胞培養において９０日間評価した。ローラーボトルにおける動力学的（kinetic）研究は、細胞融解の３０、６０および９０日後に行った。フローサイトメトリー研究を行うために試料を採取した。細胞培養において異なる時間を有する細胞の間に相違は見出されなかった。最大細胞濃度が３．５〜４．５×１０６細胞／ｍｌで変化し、細胞生存率は９０％以上で、抗体濃度が５０〜８０ｍｇ／Ｌの範囲であった（図１０）。成長特定速度（μ）は、０．０２５時間−１超を維持し、一方生産特定率（ＱＰ）は０．１８ｐｇ／細胞＊時間超であった（図１１）。細胞培養９０日後、クローン３１Ｅ７は、均一な高産生細胞集団示す同じＦＭＩで狭い単一ピークを示した（図１２）。
実施例５：選択した安定した高生産細胞クローン３１Ｅ７によって分泌される免疫グロブリンの識別属性。
いくつかの識別属性は、後で分子の品質を評価し、生成物の一貫性および細胞系の安定性をモニターすることを可能にする基本的な分子特性をカバーするために定義される。一次構造は、天然およびジスルフィド架橋還元／アルキル化試料（グリコシル化および脱グリコシル化）のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析により、分子全体およびその個々の鎖の質量の決定によって研究される。さらに、分子のペプチドマッピングを用いてその一次構造をモニターし、可能性のある翻訳後修飾切断または配列変化を排除する（図１６）。
いくつかの識別属性は、後で分子の品質を評価し、生成物の一貫性および細胞系の安定性をモニターすることを可能にする基本的な分子特性をカバーするために定義される。一次構造は、天然およびジスルフィド架橋還元／アルキル化試料（グリコシル化および脱グリコシル化）のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析により、分子全体およびその個々の鎖の質量の決定によって研究される。さらに、分子のペプチドマッピングを用いてその一次構造をモニターし、可能性のある翻訳後修飾切断または配列変化を排除する（図１６）。
高次構造は、二次構造の分析のために遠紫外線ＣＤスペクトル（図１７に示すプロファイルを得た）及び構造およびタンパク質安定性の差を検出することを可能する固有の蛍光特性（Weichelら、2008、BioProcess International、June）を使用して2つのレベルで試験される。図１８はこの後者の試験で得られた結果を示す。この場合、発光極大は３３３ｎｍで得られた吸光度比330nm/350nmの値は１．２３であった。
グリコシル化は、ヒトＩｇＧ１抗体分子において起こる主要な翻訳後修飾であり、正常相ＨＰＬＣプロファイリングによって研究される。図１９は、三つの異なる試料について得られた結果を示しており、それらのグリコシル化パラメータは、表２に示す（Montesinoら、2012、バイオロジカル40：288から298）。これらのグリコシル化パラメータの挙動および分散を図２０に示す。
グリコシル化は、ヒトＩｇＧ１抗体分子において起こる主要な翻訳後修飾であり、正常相ＨＰＬＣプロファイリングによって研究される。図１９は、三つの異なる試料について得られた結果を示しており、それらのグリコシル化パラメータは、表２に示す（Montesinoら、2012、バイオロジカル40：288から298）。これらのグリコシル化パラメータの挙動および分散を図２０に示す。
分子の異質性は、２つの直交方法によって定義される。最初に、弱いカチオン交換（ＷＣＸ）を用いて、種々の荷電種を検出し、生成物のトランケーション、脱アミド化、いくつかのグリコシル化変異体などを検出することができる。抗体については、この方法の結果は主に、Ｃ末端リジン切断、ｈＩｇＧ１分子に見られる（Dionex Application Note 127、http://www.dionex-france.com/library/literature/application_notes_updates/AN127_LPN1047.pdf）。異なるサンプルについて得られたプロファイルを図２１に示し、表３をそれらの統合の結果を示す。さらに、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、分子の凝集状態をモニターする。図２２は異なる試料から得られたプロファイルを示し、表４はそれらの分析の結果を示す。
最後に、分子の機能は、フローサイトメトリーによって測定された標的細胞上のその抗原を認識する能力を研究することによって主に評価される。図２３は、異なる試料を用いて得られた用量−応答曲線の結果を示し、表５は、それらから計算されたＥＣ５０を示す。
実施例６：インビトロ及びインビボ抗腫瘍効果の評価。
Ｘ６３マウス骨髄腫細胞による抗原発現をフローサイトメトリーにより測定した。Ｘ６３マウス骨髄腫細胞は１００％１４Ｆ７ｈ ｍＡｂで染色された（図２４Ａ）。Ｘ６３細胞を１０μｇ／ｍＬの抗体とインキュベートし、続いてＦＩＴＣ結合ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体とインキュベートした。ハーセプチンｍＡｂ（抗ヒトＨｅｒ−２）をネガティブコントロールとして使用した。
Ｘ６３マウス骨髄腫細胞に１４Ｆ７ｈのｍＡｂによって誘導されるインビトロでの細胞毒性効果を評価した。Ｘ６３細胞は１４Ｆ７ｈのｍＡｂを１００μｇ／ｍＬで処理した。３７℃で６時間のインキュベーション後の細胞生存率はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取り込みによって評価し、フローサイトメトリー解析した。細胞毒性は、ＰＩ染色細胞のパーセンテージとして表現される。腫瘍細胞の５０％超は、処置の後に死亡した（図２４Ｂ）。ハーセプチンｍＡｂを陰性対照として使用した。
Ｘ６３マウス骨髄腫モデルにおける１４Ｆ７ｈ ｍＡｂのインビボ抗腫瘍効果を評価するために、０．２×１０６のＸ６３腫瘍細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに０日目に皮下に接種し、抗体を２〜５日目で静脈内（３００μｇ）に投与した（図２５Ａ）。１０６日目まで無腫瘍生存のカプラン−マイヤー曲線を図２５Ｂに示されている。腫瘍のない生存率の統計的に有意な増加が得られ、１４Ｆ７ｈ ｍＡｂで処置したマウスの６０％は追跡調査時間後に生存していた。ヒト化Ｔ１Ｈモノクローナル抗体（抗ヒトＣＤ６）を陰性対照として使用した。統計解析は、ログランク検定を用いて行った。
Ｘ６３マウス骨髄腫細胞による抗原発現をフローサイトメトリーにより測定した。Ｘ６３マウス骨髄腫細胞は１００％１４Ｆ７ｈ ｍＡｂで染色された（図２４Ａ）。Ｘ６３細胞を１０μｇ／ｍＬの抗体とインキュベートし、続いてＦＩＴＣ結合ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体とインキュベートした。ハーセプチンｍＡｂ（抗ヒトＨｅｒ−２）をネガティブコントロールとして使用した。
Ｘ６３マウス骨髄腫細胞に１４Ｆ７ｈのｍＡｂによって誘導されるインビトロでの細胞毒性効果を評価した。Ｘ６３細胞は１４Ｆ７ｈのｍＡｂを１００μｇ／ｍＬで処理した。３７℃で６時間のインキュベーション後の細胞生存率はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取り込みによって評価し、フローサイトメトリー解析した。細胞毒性は、ＰＩ染色細胞のパーセンテージとして表現される。腫瘍細胞の５０％超は、処置の後に死亡した（図２４Ｂ）。ハーセプチンｍＡｂを陰性対照として使用した。
Ｘ６３マウス骨髄腫モデルにおける１４Ｆ７ｈ ｍＡｂのインビボ抗腫瘍効果を評価するために、０．２×１０６のＸ６３腫瘍細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに０日目に皮下に接種し、抗体を２〜５日目で静脈内（３００μｇ）に投与した（図２５Ａ）。１０６日目まで無腫瘍生存のカプラン−マイヤー曲線を図２５Ｂに示されている。腫瘍のない生存率の統計的に有意な増加が得られ、１４Ｆ７ｈ ｍＡｂで処置したマウスの６０％は追跡調査時間後に生存していた。ヒト化Ｔ１Ｈモノクローナル抗体（抗ヒトＣＤ６）を陰性対照として使用した。統計解析は、ログランク検定を用いて行った。
Claims (10)
- 以下の三つの段階を含む、産業目的のための組換え抗体を産生する、タンパク質を含まない培地中での骨髄腫細胞株からの安定した高産生細胞クローンを得るための方法：
Ｉ． 低密度静止細胞培養における合成培地への脂質強化サプリメントの段階的減少によるタンパク質フリー培地への適応、
ＩＩ． 実験室スケールでの灌流発酵システムを用いた高密度細胞培養における無タンパク質培地への適応、
ＩＩＩ．発酵終了時の細胞からの安定した高産生細胞クローンの選択。 - 前記第１段階は、以下のステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法：
Ｉ． ３．５ｇ／ＬのＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ入りのＰＦＨＭＩＩ細胞培養培地中で増殖への適応；Ｘｖが一定値に達するまでの連続継代が行われる、
ＩＩ． １ｇ／ＬのＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ入りのＰＦＨＭＩＩ細胞培養培地中で増殖への適応；Ｘｖが一定値に達するまでの連続継代が行われる、
ＩＩＩ．ＰＦＨＭＩＩ細胞培養培地中で増殖する適応；細胞は、６０日間の任意のサプリメントなしのタンパク質フリー培地中で増殖させる。 - 前記第２段階は、以下のステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法：
Ｉ． ２１日間超、５Ｌバイオリアクターにおける灌流発酵システムを用いて、ＰＦＨＭＩＩ細胞培養培地中での、高細胞密度（５〜１０ｘ１０６細胞／ｍｌ）増殖への適応、
ＩＩ． 発酵終了時の細胞は凍結され、液体窒素中に貯蔵（End Production Cell Bank,EPCB）。 - 前記第三段階は、以下のステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法：
Ｉ． 解凍細胞を限界希釈法により細胞クローニングする、
ＩＩ． 捕獲抗原として抗イディオタイプ抗体を用いた高感度かつ特異的ＥＬＩＳＡ法によって、抗体分泌クローンを検出する、
ＩＩＩ．細胞内免疫染色を用いてＦＡＣＳによって選択されたクローンにおける抗体産生細胞亜集団の定量、
ＩＶ． 高い比増殖速度（μ）および特定の生産速度（ＱＰ）を有するクローンを選択するための動力学的（kinetic）研究。 - 前記骨髄腫細胞株がＮＳ０細胞株である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記骨髄腫細胞株ＮＳ０細胞株は、ヒト化組換え抗体である抗ＮｅｕＧｃＧＭ３ １４Ｆ７ｈをコードする配列を含有する請求項５に記載の方法。
- 請求項６に記載の方法によって得られた細胞株によって分泌される、ヒト化組換え抗体である抗ＮｅｕＧｃＧＭ３ １４Ｆ７ｈ。
- 前記細胞系が、クローンＢ５８−３１Ｅ７である、請求項７に記載のヒト化組換え抗体である抗ＮｅｕＧｃＧＭ３ １４Ｆ７ｈ。
- 以下の分子表現型を有する、請求項８に記載のヒト化組換え抗体である抗ＮｅｕＧｃＧＭ３ １４Ｆ７ｈ：
- インビトロおよびインビボで抗腫瘍活性を有する、請求項９に記載のヒト化組換え抗体である抗ＮｅｕＧｃＧＭ３ １４Ｆ７ｈ。
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