BR112017017303B1 - Método para obtenção de clones de células de alta produtividade, linhagem de células de mieloma, e, anticorpo recombinante humanizado - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE CLONES DE CÉLULAS DE ALTA PRODUTIVIDADE, LINHAGEM DE CÉLULAS DE MIELOMA, E, ANTICORPO RECOMBINANTE HUMANIZADO. É fornecido um método para a obtenção de clones de células de expressão estável de alto rendimento a partir de linhagens de células de mieloma em um meio de cultura isento de proteína. O método é usado para a produção industrial de um anticorpo recombinante e inclui três estágios: (1) adaptação a um meio de cultura isento de proteína, cultura estática de células em uma baixa densidade e redução gradual de um suplemento rico em gordura para um meio de cultura químico; (2) adaptação a um meio de cultura isento de proteína; cultura de células em uma alta densidade e uso de um sistema de fermentação por perfusão em escala laboratorial; e (3) rastreamento de clones de células de expressão estável de alto rendimento das células após a fermentação terminar. O clone celular pode ser usado para produzir um anticorpo recombinante anti-NeuGcGM3 14F7 humanizado.
Description
[001] A presente invenção refere-se à biotecnologia, especificamente a um método eficiente para selecionar clones de células estáveis de alto rendimento para serem usados em processos de fermentação por perfusão a fim de produzir anticorpos terapêuticos.
[002] Anticorpos terapêuticos constituem a principal categoria de produtos biofarmacêuticos no mercado (Walsh G, 2014, Nature Biotechnology 2014, 32: 992-1000). Vários anticorpos terapêuticos obtiveram aprovação de registro para o tratamento de câncer, doenças autoimunes e outras doenças crônicas, e dezenas de anticorpos recombinantes estão em diferentes fases de desenvolvimento clínico (Biologic Medicines in Development, Pharma Report 2013, www.phrma.org). Normalmente, os pacientes recebem centenas de miligramas de anticorpos terapêuticos em cada dose, portanto, existe atualmente uma enorme demanda de capacidade de produção em todo o mundo.
[003] Várias abordagens foram seguidas para aumentar a produtividade das linhagens de células industriais, por exemplo, sistemas de amplificação de genes, otimização do meio de cultura de células e métodos para selecionar clones de células de alta produtividade. A modificação genética e a adaptação epigenética de linhagens de células de mieloma recombinantes para produzir anticorpos terapêuticos é atualmente um campo de pesquisa muito competitivo (Barnes et al., 2000, Cytotechnology 32: 109123; Barnes et al., 2007, Biotechnol Bioeng 96: 337-349).
[004] Os processos de produção à base de fermentação por perfusão permitem culturas de células de alta densidade e potencialmente alta concentração de anticorpos na coleta da fermentação. Entretanto, a cultura de células de alta densidade de longo prazo requer clones de alta produtividade estáveis para realmente otimizar a produção de anticorpos. Foram desenvolvidos meios isentos de proteína para a produção biofarmacêutica, por exemplo, meio de cultura de células PFHMII (referência junto à Hyclone).
[005] Clones de células NS0 recombinantes produtoras de anticorpos foram adaptados com sucesso para crescer em meio isento de proteína (WO 2004/038010 A1). Entretanto, a adaptação aos meios isentos de soro e ao processo de fermentação de longo prazo em meios isentos de soro geralmente são acompanhados por uma perda de produtividade da linhagem celular (Barnes et al., 2003, Biotechnol Bioeng 81: 631-639; Barnes et al., 2004, Biotechnol Bioeng 85: 115-121). Os clones de células de alta produtividade, capazes de crescer em meio isento de proteína, podem ser recuperados a partir de linhagens de células de mieloma recombinantes instáveis para uso industrial (CN104152415A).
[006] Mas, na prática, para algumas linhagens de células de mieloma recombinantes, o processo de adaptação do meio isento de soro para o meio isento de proteína não é possível ou leva muito tempo e é acompanhado pela perda de produção de anticorpos devido ao surgimento da população de células não produtoras. A inovação no processo de seleção de clones celulares com potencial industrial é garantida.
[007] Produtos biofarmacêuticos, em particular, os anticorpos terapêuticos, são moléculas complexas de glicoproteínas. Qualquer alteração no processo de produção pode introduzir variações nos atributos do produto. O conceito de comparabilidade surgiu para avaliar tais variações nos atributos do produto (Demonstração da comparabilidade de produtos biológicos humanos, incluindo produtos derivados de biotecnologia terapêutica, Center for Biologics Evaluation and Research (CBER), Center for Drug Evaluation and Research (CDER), abril de 1996. www.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ ucm122879.htm; EU Guideline on Comparability of Medicinal Products containing Biotechnology-derived Proteins as Active Substances: Quality issues (CPMP December 2003). www.emea.europa.eu/pdfs/human/bwp/ 320700en.pdf; ICH Q5E: Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their Manufacturing Process. EU: Adotado pela CMPM, 1° de dezembro de 2004, CPMP/ICH/5721/03, data de entrada em operação: Junho de 2005; MHLW: Adotado em 26 de abril de 2005, Notificação PFSB/ELD n° 0426001; FDA: Publicado no Federal Register, Vol. 70, n° 125, 30 de junho de 2005; 37861-2 www.ich.org/fileadmin/Public Web Site/ICH Products/Guidelines/Quality/Q5E/Step4/Q5E Guideline.pdf). A mudança na linhagem celular é considerada uma modificação crítica no processo de produção. Portanto, embora a seleção de linhagens de células com potencial industrial seja absolutamente necessária no desenvolvimento do processo de produção, não é óbvio que qualquer uma das linhagens de células selecionadas com as características requeridas de estabilidade e alta taxa de produção será adequada porque as variações na imunoglobulina secretada podem afetar suas propriedades biológicas. A definição de atributos de identidade de cada anticorpo específico é um pré-requisito para qualquer outro estudo de comparabilidade relacionado à modificação do processo de produção, por exemplo, escala de produção ou local de fabricação.
[008] 14F7 é um anticorpo monoclonal (mAb) específico para o antígeno associado ao tumor, o gangliosídeo N-glicolil-GM3 [GM3(Neu5Gc)] (número de patente ZL 99800261.5; Carr et al., 2000, Hybridoma 19, 241247). Este antígeno foi detectado no câncer de mama (Marquina et al., 1996, Cancer Res 56, 5165-5171; Oliva et al., 2006, Breast Cancer Res Treat 96, 115-121), melanoma (Osorio et al., 2008, Cancer BiolTher 7, 488-495), câncer de pulmão de não pequenas células (van Cruijsen et al., 2009, BMC Cancer 9, 180; Hayashi et al., 2013, Cancer Sci 104, 43-47), tumores de Wilms (Scursoni et al., 2010, Pediatr Dev Pathol 13, 18-23), tumores neuroectodérmicos (Scursoni et al., 2011, Clin Dev Immunol 245181), sarcomas e carcinomas de tireoide (Blanco et al., 2013, Journal of Biomarkers, 602417) e malignidades dos sistemas digestivo (Blanco et al., 2011, ISRN Gastroenterol 645641) e genitourinário (Blanco et al., 2011, ISRN Pathology, 953803).
[009] O mAb 14F7 é capaz de matar células tumorais que expressam o gangliosídeo independente do complemento (Carr et al., 2002, Hybrid Hybridomics 21, 463-468; Roque-Navarro et al., 2008, Mol Cancer Ther 7, 2033-2041). Uma versão humanizada deste anticorpo, obtida pela modificação de epítopos de células T humanas potenciais (Pedido de patente n° 200480017457.8; Mateo et al., 2000, Hybridoma 19, 463-471) e denominado 14F7h, reteve as propriedades de anticorpos de camundongo e anticorpos quiméricos (Fernandez-Marrero et al., 2011, Immunobiology 216, 1239-1247). O mAb 14F7h humanizado é de potencial valor para a terapia de tumores que expressam GM3(NeuGc).
[0010] Entretanto, as linhagens de células de mieloma NS0 recombinantes que expressam o anticorpo 14F7h perderam a viabilidade em culturas de células de alta densidade porque estas células expressaram o antígeno GM3(Neu5Gc) e foram mortas pelo anticorpo citotóxico secretado. Portanto, o anticorpo humanizado recombinante 14F7h foi expresso na linhagem de células de mieloma NS0 murino defectivas em glicoconjugados N-glicolilados, devido ao silenciamento da enzima ácido CMP-N- acetilneuramínico hidroxilase (Fernandez-Marrero et al., 2011, Immunobiology 216, 1239-1247). Essa linhagem celular mostrou-se ser muito difícil de se adaptar para crescer em meio isento de soro.
[0011] Na presente invenção, estabelecemos uma nova abordagem para o desenvolvimento de clones de células estáveis de alta produtividade para serem usadas no processo de produção de fermentação por perfusão. Seguindo esta abordagem, os clones de células foram recuperados a partir de uma linhagem de células de mieloma NS0 recombinantes que produz um anticorpo monoclonal anti-GM3 (NeuGc). Os atributos de identidade de tal anticorpo terapêutico também são revelados nesta invenção, que definem um fenótipo molecular para este produto biofarmacêutico.
[0012] Este procedimento compreende linhagens de células de mieloma recombinantes para as quais o processo de adaptação do meio isento de soro para o meio isento de proteína não é possível ou leva muito tempo e é acompanhado pela perda de produção de anticorpos devido ao surgimento da população de células não produtoras. A etapa inovadora chave na presente invenção é o processo de adaptação para crescer em meio isento de proteína em alta densidade celular (8-10 x 106 células/ml), o que aumenta a frequência de clones de células estáveis de alta produtividade.
[0013] O método da presente invenção consiste em processo de três estágios: 1. Adaptação ao meio isento de proteína por uma redução gradual de um suplemento enriquecido com lipídios para meio quimicamente definido em cultura de células estacionária de baixa densidade 2. Adaptação ao meio isento de proteína em cultura de células de alta densidade usando o sistema de fermentação por perfusão em escala de laboratório 3. Seleção de clones de células estáveis de alta produtividade das células no final da fermentação
[0014] O primeiro estágio foi realizado por descongelamento da linhagem celular em meio de cultura celular isento de proteína (PFHMII) suplementado com 3-4 g/L de Realçador Celular (enriquecido em colesterol, lipídios e outros nutrientes). A concentração celular máxima (Xv) variou de 0,9 a 1,2 x 106 células/ml. A passagem em série foi realizada até Xv alcançar um valor constante. A concentração celular inicial após cada passagem foi ajustada para 0,4-0,5 x 106 células/ml. Após sete passagens, o suplemento Realçador Celular foi reduzido para 1-2 g/l e, após quatro passagens adicionais, o suplemento Realçador Celular foi completamente removido. Em seguida, as células são deixadas em crescimento em meio isento de proteína sem qualquer suplemento por mais de 60 dias. Xv atingiu valores entre 1,5 e 1,8 x 106 células/ml com cerca de 95% de viabilidade celular.
[0015] Como um segundo estágio, as células que crescem durante mais de 60 dias no meio de cultura celular PFHMII foram semeadas em um biorreator de 5 litros. Usando um dispositivo externo de perfusão, a concentração celular cresceu de 0,5x106 para 10x106 células/ml. O processo de fermentação durou 24 dias. Do dia 0 ao dia 16, a viabilidade celular foi mantida acima de 90%, mas após o dia 16, a viabilidade celular foi reduzida abaixo de 80%. A concentração de anticorpos na coleta celular foi de 30 a 40 mg/ml. As células no final da fermentação (mais de 500 horas crescendo em meio isento de proteína) foram congeladas e armazenadas em nitrogênio líquido (Banco de Células de Produção Final, EPCB).
[0016] Em uma outra modalidade da presente invenção, foram selecionados clones de células estáveis de alta produtividade a partir de células no final da fermentação. As células descongeladas do EPCB foram submetidas à clonagem celular pelo método de diluição limitante (Freshney R., 2010, Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications (6th ed.). Hoboken, N.J.: Wiley-Blackwell. pp. 208-211). O anticorpo secretado no sobrenadante de cultura celular foi medido por um método ELISA usando o anticorpo anti-idiotípico anti-14F7h 4G9 como antígeno de captura. Os sobrenadantes da cultura celular foram diluídos 1/500. Os clones que obtiveram valores de absorvância acima da mediana foram selecionados para caracterização adicional por Citometria de Fluxo (FACS). A coloração intracelular de imunoglobulina foi realizada usando um anticorpo anti-IgG humana conjugado com FITC e medida por FACS (Pluschke et al., 2011, BMC Proceedings 5, Suppl. 8: P97). A Intensidade Média de Fluorescência (MFI) e a porcentagem de células positivas foram determinadas para cada clone isolado. Surpreendentemente, mais de 80% dos clones avaliados mostraram uma subpopulação produtora de anticorpos predominante.
[0017] Os clones tendo mais de 95% da subpopulação produtora de anticorpos e IMF superior foram selecionados para estudos cinéticos em frascos com dispositivo giratório e biorreator de 5L para avaliar a concentração celular (Xv), a viabilidade celular (%), a taxa de crescimento específico (μ) e a concentração de IgG na cultura do sobrenadante de células. A concentração celular foi verificada entre 4 e 5 x106 células/ml. A viabilidade celular durante a fase de crescimento exponencial foi de cerca de 85%. A taxa de crescimento específico variou entre 0,015 - 0,025 h-1. A concentração celular foi verificada entre 70 e 120 mg/ml.
[0018] Em uma outra modalidade da presente invenção, a estabilidade de longo prazo de clones de células de alta produtividade estáveis foi avaliada através da realização de estudos cinéticos após 30, 60 e 90 dias em cultura celular contínua. Foi determinada a taxa de crescimento específico (μ) e a taxa de produção específica (qp).
[0019] Em mais uma outra modalidade da presente invenção, foram determinados os atributos de identidade da imunoglobulina secretada por clones de células estáveis de alta produtividade selecionados. A revelação de tais atributos de identidade define operacionalmente o fenótipo molecular deste anticorpo terapêutico 14F7h:
[0020] Em mais uma outra modalidade da presente invenção, a atividade antitumoral IN VITRO e IN VIVO do anticorpo recombinante 14F7h foi avaliada. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1: Adaptação celular ao meio PFHM-II em diferentes concentrações de Realçador Celular 5. Figura 2: A fermentação é executada em um biorreator de 5L usando as células adaptadas ao meio PFHM-II sem Realçador Celular 5. Figura 3: Valores de absorção do ELISA de reconhecimento. A linha preta é a mediana dos resultados. Foram utilizados 1 μg/ml de T1h e hR3 purificados como controles negativos. Clones selecionados 35D8, 35D6, 31E7, 31C7, 23E9, 23C2, 73F4, 73E5, 72G5, 72F6, 72D3 (cor cinza), clones descartados 35F7, 33E8, 23E4, 22D8, 21E6, 21C5, 73C4, 72D9, 71F2, 62E7, 61E3 (cor preta). Figura 4: As células selecionadas foram analisadas por citometria de fluxo e a porcentagem da subpopulação de células de alta produtividade foi determinada. A linhagem de células de mieloma NS0 foi usada como controle negativo e a linhagem de células de mieloma NS0 recombinantes que expressa o anticorpo hR3 foi usada como controle positivo. Clones selecionados 31E7, 23E9, 33E8, 35D6, 23C2, 72F6, 73F4, 72G5 (cor cinza), clones descartados 72D3, 73E5 (cor preta). Figura 5: O valor de MFI da subpopulação de células de alta produtividade foi determinado. A linhagem de células de mieloma que expressa os anticorpos hR3 e T1h foi usada como controles positivos (cor cinza claro). Clones selecionados 31E7, 35D6, 72G5 (cor cinza); clones descartados 23E9, 33E8, 72D3, 73E5, 23C2, 72F6, 73F4 (cor preta). Figura 6: As curvas de crescimento dos clones avaliados, a viabilidade celular e a integral das células viáveis a partir de estudos cinéticos em garrafas de cultivo giratórias e biorreator de 5L são plotadas (eixo y) versus tempo (eixo x). Figura 7: Análise comparativa da taxa máxima de crescimento específico e concentrações máximas de IgG entre clones selecionados que crescem em garrafas de cultivo giratórias e biorreatores de 5L. Figura 8: Reconhecimento do gangliosídeo NeuGcGM3 pelo anticorpo 14F7h produzido pelos diferentes clones selecionados. Os sobrenadantes foram retirados do biorreator de 5L. O anticorpo anti-EGFR foi usado como controle negativo, o anticorpo 14F7h produzido pela célula parental foi usado como controle positivo. Figura 9: Concentração intracelular de IgG medida por citometria de fluxo em diferentes etapas do processo de seleção. Figura 10: Estudos cinéticos comparativos entre células parentais e o clone 31E7 realizados em biorreator de 5L. Xv: concentração de células viáveis; SXv: integral de células viáveis; IgG: concentração máxima de anticorpo. Figura 11: Estudos cinéticos para avaliar a estabilidade do clone 31E7 foram realizados aos 30, 60 e 90 dias após o descongelamento celular. Concentração celular (Xv), viabilidade celular (%), integral de células viáveis (SXv), concentração de IgG, taxa máxima de crescimento (μ) e taxa de produção específica (QP) foram medidas. Figura 12: Teor de IgG intracelular medido por citometria de fluxo em amostras do estudo de estabilidade do clone 31E7. Figura 13: Espectro de massa desconvolucionado da Cadeia Leve de 14F7h em seus estados nativo (painel superior) e deglicosilado (painel inferior, usando PNGase F) para que as amostras sejam reduzidas/alquiladas. Condições convencionais de LC-MS foram usadas com uma coluna C8 para separação/dessalinização da amostra e um sistema de tampão de acetonitrila/ácido fórmico para a execução. A figura inserida corresponde à ampliação da região do pico principal. Figura 14: Espectro de massa desconvolucionado da Cadeia Pesada de 14F7h em seus estados nativo (painel superior) e deglicosilado (painel inferior, usando PNGase F) para que as amostras sejam reduzidas/alquiladas. Condições convencionais de LC-MS foram usadas com uma coluna C8 para separação/dessalinização da amostra e um sistema de tampão de acetonitrila/ácido fórmico para a execução. A figura inserida corresponde à ampliação da região do pico principal. Figura 15: Espectro de massa desconvolucionado da molécula inteira de 14F7h em seus estados nativo (painel superior) e deglicosilado (painel inferior, usando PNGase F). Condições convencionais de LC-MS foram usadas com uma coluna C8 para separação/dessalinização da amostra e um sistema de tampão de acetonitrila/ácido fórmico para a execução. A figura inserida corresponde à ampliação da região do pico principal. Figura 16: Perfil de mapeamento de peptídeo de 14F7h obtido após digestão com tripsina e separação por HPLC de fase reversa usando uma coluna C4 e um sistema de tampão convencional Acetonitrila/TFA. Figura 17: Análise espectral de dicroísmo circular de 14F7 na região de UV distante (205-260nm) obtida a 25°C usando uma cuveta de comprimento de percurso de 2 mm. O espectro foi obtido com uma concentração de amostra de 0,6 mg/ml. Figura 18: Emissão de fluorescência do Triptofano, usando um equipamento Varioskan Flash, lida entre 310 e 390 nm e obtida após excitar a molécula de 14F7h a 280 nm. Foi utilizado um formato de placa de 96 poços, com 200 uL por poço e uma concentração de amostra de 0,2 mg/ml. Figura 19: Perfil de glicosilação de glicanos marcados com 2- AB isolados de 14F7h e separados usando HPLC de fase normal com detecção fluorescente (Ex: 330 nm / Em: 420 nm). As linhas tracejadas quadradas mostram uma ampliação dos picos menores. Figura 20: Parâmetros de glicosilação de amostras diferentes (N = 3) de 14F7h usados para estudar intervalos de variação para o perfil de glicosilação. Figura 21: Perfil de troca de cátions fraca de 14F7h usando uma coluna Propac-WCX10, obtido a 280 nm. Foram injetados 30 ug de amostra. Figura 22: Perfil de SEC-HPLC de 14F7 usando uma coluna TSK-G3000sxl, obtida a 280 nm. Figura 23: Curva dose-resposta do citômetro de fluxo (% positiva vs log da concentração de 14F7h (ug/ml)) usando células alvo L1210 para diferentes amostras de anticorpos testados em dias diferentes. Figura 24: Efeito citotóxico induzido por mAb 14F7h em células de mieloma de camundongo X63. (A) Propriedades de ligação de mAb 14F7h. As células X63 foram marcadas com 10 μg/ml do anticorpo seguido por um anticorpo anti-IgG humana de coelho conjugado com FITC. O mAb herceptin (anti-Her-2 humana) foi usado como controle negativo. (B) As células X63 foram tratadas com 100 μg/ml de mAb 14F7h. A viabilidade celular após 6 horas de incubação a 37°C foi avaliada por absorção de iodeto de propídio (PI) e análise de citometria de fluxo. A citotoxicidade é expressa como porcentagem de células marcadas com PI. O mAb herceptin foi usado como controle negativo. Figura 25: Efeito antitumoral in vivo de mAb 14F7h em um modelo de mieloma de camundongo. (A) Cronograma de administração de mAb. As células de mieloma de camundongo X63 (0,2 x 106) foram inoculadas por via subcutânea no dia 0 em camundongos BALB/c e os anticorpos foram administrados por via intravenosa (300 μg) nos dias 2 a 5. (B) Curvas de Kaplan-Meier de sobrevida sem tumor até o dia 106. O mAb para T1h humanizado (anti-CD6 humana) foi usado como controle negativo. A análise estatística foi realizada com o teste log-rank.
[0021] Os seguintes exemplos destinam-se a ilustrar a invenção, mas não limitando seu escopo de forma alguma. Não são fornecidas descrições detalhadas de métodos do estado da técnica. Exemplo 1: Adaptação ao meio isento de proteína por uma redução gradual de um suplemento enriquecido com lipídios para meio quimicamente definido em cultura de células estacionária de baixa densidade.
[0022] A linhagem celular 14F7htb58 foi adaptada ao crescimento em meio de cultura de células PFHMII sem o suplemento Realçador Celular 5. O processo de redução do suplemento Realçador Celular 5 foi realizado em frascos T de 75 cm2, em agitador (80 rpm) a 36,5°C e 5% de CO2. A cada intervalo de 48 a 72 horas, a concentração de células viáveis e a porcentagem de viabilidade celular foram determinadas. A concentração celular foi ajustada para 0,4-0,5 x 106 células/ml em cada passagem da cultura.
[0023] As células congeladas 14F7hb58 foram descongeladas em PFHMII suplementado com 3,5 g/L de Realçador Celular 5. Após o descongelamento, a viabilidade celular era de 75%, e depois aumentou até mais de 90% (Figura 1). Durante o processo de adaptação, foram realizadas passagens de cultura em série para manter uma concentração máxima de células viáveis na faixa de 0,9-1,8 x 106 células/ml, com porcentagens de viabilidade celular superiores a 90%. Após onze passagens da cultura, a concentração de Realçador Celular 5 foi reduzida a zero, com 95% de viabilidade celular e 1,2-1,8 x 106 células/ml. O processo de adaptação ao meio de cultura celular PFHMII sem lipídios e colesterol levou aproximadamente 60 dias. Exemplo 2: Adaptação ao meio isento de proteína em cultura de células de alta densidade usando o sistema de fermentação por perfusão em escala de laboratório.
[0024] Células 14F7ht58 adaptadas ao crescimento em meio de cultura celular PFHMII isento de proteína foram inoculadas em um fermentador de 5L em uma concentração de 0,4 a 0,5 x 106 células/ml. Os parâmetros de operação do fermentador foram: pH 6,9-7,0; 105 RPM; 40% de oxigênio dissolvido; 36,5-37,0°C; volume de trabalho 3,5 L. A viabilidade celular e a concentração celular foram monitoradas diariamente pelo método de exclusão de azul de tripano (Sigma) usando uma câmara Neubauer. A operação do fermentador no modo de perfusão foi realizada após a concentração celular atingir o valor de 2,5 x 106 células/ml. Um cartucho de fibra oca foi empregado para o modo de perfusão e uma taxa de diluição de 0,3-0,7 VVD foi usada.
[0025] Durante o processo de fermentação, a viabilidade celular manteve-se em 90% até 384 horas, e depois reduziu-se para 80%. A concentração de anticorpo estava na faixa de 30 a 40 mg/L. A concentração celular máxima alcançada foi de 9x106 células/ml quando uma taxa de diluição de 0,7 VVD foi usada (Figura 2). As células foram retiradas no final do processo de fermentação e semeadas em frascos com aplicador de esfera em uma concentração de 0,8x106 células/ml, após 72 horas em cultura, as células foram congeladas a 12x106 células/frasco (Banco de Células de Produção Final, EPC). Após o descongelamento, a viabilidade celular era de 90% e após 96 horas em cultura, a viabilidade celular era de 97%. Exemplo 3: Seleção de clones de células estáveis de alta produtividade das células no final da fermentação.
[0026] As células descongeladas do EPC foram clonadas para uma única célula por poço em placas de 96 poços usando o método de diluição limitante e meio de cultura celular DMEM-F12 1:1 suplementado com 5 a 10% de soro fetal bovino. As placas de cultura foram incubadas a 36,5°C em atmosfera de CO2 5%. A eficiência de clonagem foi inferior a 2%. Vinte dias após a clonagem celular, os sobrenadantes de cultura foram retirados para avaliar a concentração de IgG por ELISA tipo sanduíche. O anticorpo anti- idiotípico 4G9 (3 ug/ml) foi usado como antígeno de captura e um anticorpo anti-cadeia pesada humana de cabra acoplado à fosfatase alcalina como uma sonda. Todas as amostras foram diluídas 1/500, e a mediana da absorbância do sobrenadante foi determinada. Os clones com valores de absorbância superiores ao valor médio foram selecionados (23C2, 23E9, 31C7, 31E7, 35D6, 35D8, 72D3, 72F6, 72G5, 73E5, 73F4) (Figura 3). Os clones selecionados foram expandidos para placas de 24 poços em meio de cultura celular DMEM-F12 1:1 suplementado com 5 a 10% de soro fetal bovino. Uma expansão celular adicional em frascos de cultura T foi realizada utilizando meio de cultura celular PFHMII, em agitador (80 rpm) a 36,5°C e CO2 5%.
[0027] O teor de IgG intracelular foi determinado por citometria de fluxo (FACS) em clones selecionados. Um anticorpo anti-IgG humana acoplado a FITC (iso-tiocianato de fluoresceína) (Sigma) diluído 1:200 foi usado como sonda. Para determinar a porcentagem de marcação, 4x105 células/amostra foram analisadas. Clones tendo mais de 95% da subpopulação de células de alta produtividade foram selecionados (Figura 4). Outro critério de seleção foi a Intensidade Mediana de Fluorescência (FMI) normalizada e os clones 35D6, 72G5 e 31E7 foram selecionados (Figura 5).
[0028] Tais clones foram expandidos em garrafas de cultivo giratórias e estudos cinéticos foram realizados também no biorreator de 5L (36,5 a 37°C, 100 a 105 RPM, pH <7 e oxigênio dissolvido superior a 40%). O clone 31E7 mostrou a maior concentração celular em garrafas de cultivo giratórias e no biorreator de 5L, com valores de 5x106 células/ml e 4x106 células/ml, respectivamente. A integral de células viáveis forneceu resultados similares, valores de 4,5 x 108 células/ml * h em garrafas de cultivo giratórias e 2,5 x 108 células/ml * h no biorreator de 5L, esses valores foram de 1,3 a 1,4 maiores que os obtidos para células parentais (Figura 6). A viabilidade celular foi superior a 85% na fase exponencial de crescimento para todos os clones avaliados (Figura 6). O clone 31E7 mostrou a maior taxa de crescimento específico (> 0,025 h-1) tanto em garrafas de cultivo giratórias quanto em biorreator de 5L. A concentração de anticorpos entre 50 e 70 mg/L foi encontrada para todos os clones no biorreator de 5L, porém o clone 31E7 mostrou maior concentração de anticorpos em garrafas de cultivo giratórias (Figuras 7A e 7B).
[0029] As amostras foram retiradas dos estudos cinéticos realizados no biorreator de 5L para avaliar a atividade biológica do anticorpo secretado. Foi realizado um ELISA tipo sanduíche. Placas Polysorp foram revestidas com solução do gangliosídeo NeuGcGM3 em metanol (10 μg/ml). Como anticorpo secundário, foi utilizado um anticorpo anti-cadeia pesada humana de cabra acoplado à fosfatase alcalina. Todas as amostras foram ajustadas para 1 μg/ml de concentração de anticorpo e diluídas 1/10 no teste ELISA. Todas as amostras testadas mostraram reconhecimento do antígeno gangliosídeo, enquanto os clones 31E7 e 35D6 mostraram valores entre 70 e 80% em relação ao controle positivo (Figura 8).
[0030] O teor de IgG intracelular evoluiu ao longo do processo de adaptação fenotípica e clonagem. As células parentais 14F7htB58 crescendo em PFHMII mais Realçador Celular 5 mostraram uma distribuição bimodal devido à existência de uma subpopulação de células não produtoras. Após a adaptação para crescer em altas densidades em meio PFHMII, as células 14F7htB58 foram enriquecidas na subpopulação de células produtoras (distribuição unimodal), no entanto, para o clone 31E7, obteve-se um pico único mais estreito sugerindo uma subpopulação de células mais homogênea (Figura 9). De fato, o clone 31E7 tem maior concentração celular máxima, integral de células viáveis e taxa de produção de anticorpos do que as células parentais (Figura 10) Exemplo 4: Estudos de estabilidade de longo prazo de clones de células de alta produtividade.
[0031] A estabilidade da produção de anticorpos pelo clone 31E7 foi avaliada durante 90 dias em cultura celular. Estudos cinéticos em garrafas de cultivo giratórias foram realizados aos 30, 60 e 90 dias após o descongelamento celular. Amostras foram realizadas para realizar estudos de citometria de fluxo. Não foram encontradas diferenças entre as células com diferentes tempos na cultura celular. A concentração celular máxima variou de 3,5 a 4,5 x 106 células/ml, a viabilidade celular foi superior a 90% e a concentração de anticorpos variou de 50 a 80 mg/L (Figura 10). A taxa específica de crescimento (μ) manteve-se superior a 0,025 h-1, enquanto a taxa específica de produção (QP) foi superior a 0,18 pg/célula * h (Figura 11). Após 90 dias na cultura celular, o clone 31E7 mostrou um pico único estreito no mesmo FMI representativo de uma população celular homogênea de alta produtividade (Figura 12). Exemplo 5: Atributos de identidade da imunoglobulina secretada pelo clone 31E7 da célula estável de alta produtividade selecionada.
[0032] Vários atributos de identidade são definidos para cobrir as propriedades moleculares básicas que mais tarde permitirão avaliar a qualidade da molécula e monitorar a consistência do produto, bem como a estabilidade da linhagem celular. A estrutura primária é estudada pela determinação da massa da molécula inteira, e suas cadeias individuais, pela análise de LC-ESI-MS da amostra reduzida/alquilada das pontes nativas e pontes de dissulfeto (glicosilada e deglosilada). Ver a Tabela 1 para um resumo dos resultados e Figuras 13, 14, 15. Além disso, o mapeamento de peptídeos da molécula é usado para monitorar sua estrutura de primeira ordem e exclui ainda qualquer possível truncamento da modificação pós-traducional ou mudanças de sequência (Figura 16). Tabela 1. Massas da molécula completa e suas cadeias com e sem glicosilação.
a: Considerando a falta de K na região C-terminal de ambas as cadeias pesadas b: Reduzida com ditiotreitol e alquilada com ácido iodoacético c: Considerando a falta de K na região C-terminal e modificação com ácido iodoacético d: Considerando modificação com ácido iodoacético
[0033] As estruturas de ordem superior são testadas em dois níveis usando espectros de CD de UV distante para a análise de estruturas secundárias (produzindo o perfil mostrado na Figura 17) e as propriedades de Fluorescência Intrínseca que permitem detectar diferenças na conformação e na estabilidade da proteína (Weichel et al, 2008, BioProcess International, Junho). A Figura 18 mostra os resultados obtidos para este último teste. Neste caso, o máximo de emissão foi obtido em 333 nm e o valor da Razão de Absorbância 330 nm/350 nm foi de 1,23.
[0034] A glicosilação, sendo a principal modificação pós-traducional ocorrendo em moléculas de anticorpos para IgG1 humana, é estudada por perfil de HPLC de fase normal. A Figura 19 mostra os resultados obtidos para três amostras diferentes, e seus parâmetros de glicosilação são mostrados na Tabela 2 (Montesino et al, 2012, Biologicals 40:288-298). O comportamento e a dispersão destes parâmetros de glicosilação são mostrados na Figura 20. Tabela 2 Parâmetros de glicosilação de diferentes amostras (N = 3) de 14F7h usados para estudar variações do perfil de glicosilação. G0F%, G1F%, G2F%: % de agalactose, monogalactose e glicanos fucosilados digalactosilados, Fuc%: % de glicanos fucosilados, Sial%: % de glicanos sialilados
[0035] A heterogeneidade da molécula é definida por dois métodos ortogonais. Em primeiro lugar, a Troca de Cátions Fraca (WCX) é usada para detectar as diferentes espécies carregadas, permitindo detectar truncamentos de produtos, desamidações, algumas variantes de glicosilação, etc. Para os anticorpos, os resultados deste método monitoram principalmente o truncamento de lisina C-terminal, uma modificação comum encontrada em moléculas hIgG1 (Dionex Application Note 127, http://www.dionex-france.com /library/literature/application notes updates/ AN127 LPN1047.pdf). Os perfis obtidos para diferentes amostras são mostrados na Figura 21 e a Tabela 3 mostra o resultado de sua integração. Além disso, a Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC) é usada para monitorar o estado de agregação da molécula. A Figura 22 mostra os perfis obtidos de diferentes amostras e a Tabela 4 mostra o resultado de suas análises. Tabela 3. Resultados de integração de WCX-HPLC (porcentagem de pico principal) para diferentes amostras de 14F7h. Tabela 4. Resultados de integração de SEC-HPLC (porcentagem de pico principal) para diferentes amostras de 14F7h.
[0036] Finalmente, a função da molécula é avaliada principalmente ao estudar sua capacidade de reconhecer seu antígeno nas células alvo medido pela Citometria de Fluxo. A Figura 23 mostra os resultados da curva dose- resposta obtidos usando diferentes amostras, e a Tabela 5 mostra a EC50 calculada a partir delas. Tabela 5. Resultados de EC50 para diferentes testes de curva dose-resposta do citômetro de fluxo (% positiva vs log da concentração de 14F7h (ug/ml)) usando células alvo L1210 para diferentes amostras de anticorpos testados em dias diferentes. Exemplo 6: Avaliação do efeito antitumoral in vitro e in vivo.
[0037] A expressão de antígeno por células de mieloma de camundongo X63 foi medida por citometria de fluxo. 100% das células de mieloma de camundongo X63 foram marcadas por mAb 14F7h (Figura 24A). As células X63 foram incubadas com 10 ug/ml do anticorpo seguido de um anticorpo anti-IgG humana de coelho conjugado com FITC. O mAb herceptina (Her-2 anti-humano) foi usado como controle negativo.
[0038] Foi avaliado o efeito citotóxico in vitro induzido pelo mAb 14F7h em células de mieloma de camundongo X63. As células X63 foram tratadas com 100 μg/ml de mAb 14F7h. A viabilidade celular após 6 horas de incubação a 37°C foi avaliada por absorção de iodeto de propídio (PI) e análise de citometria de fluxo. A citotoxicidade é expressa como porcentagem de células marcadas com PI. Mais de 50% das células tumorais estavam mortas após o tratamento (Figura 24B). O mAb herceptin foi usado como controle negativo.
[0039] Para avaliar o efeito antitumoral IN VIVO do mAb 14F7h no modelo de mieloma de camundongo X63, foram inoculadas subcutaneamente 0,2 x 106 células tumorais X63 no dia 0 para os camundongos BALB/c e os anticorpos foram administrados por via intravenosa (300 ug) nos dias 2 a 5 (Figura 25A). Curvas de Kaplan-Meier de sobrevida sem tumor até o dia 106 são mostradas na Figura 25B. Um aumento estatisticamente significativo da sobrevida livre de tumor foi obtido em 60% dos camundongos tratados com mAb 14F7h que ainda estavam vivos após o tempo de acompanhamento. O mAb T1h humanizado (CD6 anti-humano) foi usado como controle negativo. A análise estatística foi realizada com o teste log-rank.
Claims (4)
1. Método para obtenção de clones de células de alta produtividade estáveis a partir de linhagens de células de mieloma NS0 recombinante em meio isento de proteínas produzindo anticorpo anti- NeuGcGM3 humanizado 14F7h para fins industriais, caracterizado pelo fato de que compreende três estágios: II. colocar as linhagens de células de mieloma em um meio de suplemento enriquecido com lipídios sem proteína e realizar uma redução gradual do suplemento enriquecido com lipídios até que o suplemento enriquecido com lipídios seja removido e, em seguida, cultivar as linhagens de células, em que a densidade celular é de cerca de 1,5 - 1,8x106 células/ml, produzindo assim linhagens de células de mieloma adaptadas a meio livre de proteína, III. colocar as linhagens de células de mieloma adaptadas ao meio sem proteína em um sistema de fermentação de perfusão, em que a densidade celular é de cerca de 5-10x106 células/ml, e IV. . selecionar clones de células produtoras estáveis a partir de linhas celulares no final da fermentação do estágio II.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro estágio compreende as seguintes etapas: I. adaptar as linhagens de células de mieloma para crescer em meio sem proteína, em que o suplemento enriquecido com lipídios está em uma concentração de cerca de + 3,5 g/L, realizando passagens em série até que a concentração máxima de células atinja um intervalo entre 0,9 - 1,2 x 106, II. adaptar as linhagens de células de mieloma da etapa I para crescer em meio livre de proteínas, em que o suplemento enriquecido com lipídios está em uma concentração de cerca de + 1 g/L, realizando passagens em série até que a concentração celular máxima alcance um intervalo entre 0,9 - 1,2 x 106, e III. cultivar as linhagens de células de mieloma da etapa II em meio sem proteína sem qualquer suplemento por 60 dias.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o estágio II compreende as seguintes etapas: I. manter as linhagens de células de mieloma adaptadas ao meio livre de proteínas no sistema de fermentação de perfusão em biorreator de 5L por mais de 21 dias, em que o meio é adaptado a uma densidade celular de 5 - 10x106 células/ml, e II. congelar as linhagens de células de mieloma após a fermentação e armazenar em nitrogênio líquido.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o estágio III compreende as seguintes etapas: I. submeter as linhagens de células de mieloma do Estágio II à clonagem de células por um método de diluição limitante, II. detectar clones secretores de anticorpos, III. quantificar uma subpopulação de células produtoras de anticorpos em clones selecionados, e IV. selecionar clones por taxa de crescimento específica e taxa de produção específica.
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