CN104152415B - 获得高产稳定表达重组抗体的骨髓瘤细胞株的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获得适用于灌流发酵生产工艺的高产稳定表达细胞株的方法。本发明的方法由五个阶段组成：高产稳定表达细胞株的获得、工业规模细胞株生产力的评价、纯化的单克隆抗体的特性分析、不同工业规模的产品特性评价、不同发酵时期的产品特性评价。这种方法的细胞株是从重组NS0骨髓瘤细胞系中获得的，该重组NS0骨髓瘤细胞系用于生产治疗癌症的抗EGFR单克隆抗体。这种方法获得的细胞株在不同的发酵规模、不同发酵运行时间的条件下保持了本身的生长特性、高表达特性和表达产物特征的一致性，适用于不同的工业规模下商业化生产治疗性抗体。本发明的方法克服了哺乳动物细胞系在灌流发酵工艺中产量降低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种获得高产稳定表达细胞株的方法，该方法获得的细胞株在灌流发酵工艺中具有优越生产性能，可在不同的工业规模中生产治疗性抗体。
背景技术
目前治疗性抗体药物是生物制药的一个重要类别，一些治疗性抗体已经被批准注册用于治疗癌症、自身免疫性疾病和其他慢性疾病，几十种重组抗体正处于临床开发的不同阶段(Reichert JM,MAbs 2012,May-June,4(3):413-5；Reichert JM,Dhimolea E,Drug DiscoveryToday 2012,Sept,17(17-18):954-63；Biologic Medicines in Development,Phrma Report2013,www.phrma.com)。通常患者每次剂量需要数百毫克的治疗性抗体，因此目前的产能需求巨大。
重组治疗性抗体是一种复杂的糖蛋白，不得不通过哺乳动物细胞培养生产(Wurm FM.Nat Biotechnology 2004,22:1393-1398；Barnes L,Dickson A,CurrOpinBiotechnol 2006,17:381-386)。对生物制药行业来说哺乳动物细胞的大规模培养遭遇了诸多挑战，虽然重组抗体在理化特性方面已经取得了巨大的进步，但是治疗性抗体分子的特性由工艺过程决定的观念仍然被普遍接受。生产工艺的任何变化，例如发酵规模、细胞培养基、细胞传代次数等，都可能会影响产品的性能(Demonstration of comparability of human biological products,including therapeutic biotechnology-derived products,Center for Biologics Evaluation andResearch(CBER),Center for Drug Evaluation and Research(CDER)April 1996.www.fda.gov；EU Guideline on Comparability of Medicinal Products containingBiotechnology-derived Proteins as Active Substances:Quality issues(CPMP December2003)www.emea.europa.eu；ICH Q5E:Comparability of Biotechnological/BiologicalProducts Subject to Changes in their Manufacturing Process.EU:Adopted by CMPM,December 1,2004,CPMP/ICH/5721/03,date for coming into operation:June 2005；MHLW:Adopted 26April 2005,PFSB/ELD Notification No.0426001；FDA:Published in the FederalRegister,Vol.70,No.125,June 30,2005；37861-2.www.ich.org)。
哺乳动物细胞大规模培养生产治疗性抗体必须在无血清培养基中进行。无蛋白培养基已经用于生物制品的生产，例如生产重组抗体的NS0细胞株已成功地在无蛋白培养基PFHMII中生长(WO 2004/038010 A1)。然而，适应无血清培养基和在无血清培养基中长时间发酵通常伴随着细胞系生产力的损失(Barnes L,et al.,Biotechnol Bioeng 2004,81:631-639)。灌流发酵生产工艺具有高密度培养及获得高浓度抗体收获液的潜能，然而这种长时间的高密度细胞培养需要稳定的高表达细胞株来真正地优化抗体的生产。
专利ZL95118826.7描述了一种获得针对表皮生长因子受体(EGFR)的嵌合抗体和人源化抗体的方法，及其在诊断和治疗由这些受体表达的肿瘤疾病中的应用。在本发明中，我们在专利ZL95118826.7中小鼠骨髓瘤NS0细胞的转染克隆基础上，建立了一种获得适用于灌流发酵生产工艺的稳定高表达细胞株的方法。这种方法得到的细胞株是从重组NS0骨髓瘤细胞系中获得的，该重组NS0骨髓瘤细胞系用于生产治疗癌症的抗EGFR单克隆抗体。这种稳定的高表达细胞株在不同的工业规模、不同发酵时间的条件下保持了本身的生长性能、高表达特性和表达产物特征的一致性，适用于不同工业规模下生产治疗性抗体。
发明内容
本发明的生产过程弥补了灌流发酵工艺中哺乳动物细胞系产量降低的缺陷。本发明的方法由以下五个阶段组成：
1、稳定高表达细胞株的识别；
2、工业规模细胞株生产力的评估；
3、纯化的单克隆抗体的特性分析；
4、不同工业规模的产品特性评价；
5、不同发酵时期的产物产品特性评价。
在采用有限稀释方法获得细胞克隆后第一步是(Freshney,R.Ian(2010).Culture ofanimal cells:(6th ed.).Hoboken,N.J.:Wiley-Blackwell.pp.208–211.ISBN 9780470528129；Davis,edited by John M(2011).Oxford:Wiley-Blackwell.pp.239–240.ISBN 978047066658-6)，采用抗人IgG抗体偶联FITC对细胞内免疫球蛋白进行染色，再经流式细胞术检测(Pluschke et al.,BMC Proceedings 2011,5(Suppl 8):P97)，检测每个克隆的平均荧光强度(MFI)和阳性细胞百分比，取阳性细胞比例超过60％的克隆作为备选克隆，从备选克隆中识别出阳性细胞比例超过90％且细胞内免疫球蛋白染色平均荧光强度大于103的细胞克隆为性能较好的细胞克隆。取上述备选细胞克隆连续培养，培养过程中随时应用流式细胞术快速监测备选克隆的胞内免疫球蛋白，若阳性细胞比例低于60％，则该备选克隆停止下一步试验；10天和90天后，阳性细胞比例仍然超过60％的克隆则转入转瓶中进行动力学试验及特性分析，条件为100rpm，37℃，5％CO2细胞培养7-8天，流式细胞仪上显示出具有单峰细胞群且平均荧光强度高于103的细胞克隆，动力学评价中产品比生成速率值(qp)高于3×10-7μg/cell/h，此种克隆生长和生产性能均较好；选择较好性能的细胞克隆再在工业生产中进行生产率评估。
在1000L和2500L发酵罐中，采用上述选好的细胞克隆进行发酵生产，灌流发酵工艺中采用90％以上存活率的细胞接种，运行参数为37℃，5％CO2，恒定的氧分压和葡萄糖浓度，细胞灌流浓度保持在(10-20)×106cell/mL，灌流速率升高到0.8VVD，细胞培养90天后终止灌流工艺。发酵运行过程中监测存活细胞数和抗体浓度。目标抗体浓度为200μg/ml以上。
发酵的下游工艺是通过基于两个主要分离色谱步骤的标准纯化步骤来进行的：蛋白A亲和层析与离子交换色谱。抗体纯化工艺的目标平均产量大约为200mg/L-300mg/L，纯度大于95％。
采用的参考品来自于纯化的抗体，经如下的分析技术进行进一步的特性分析：
为了检测任何显著的差异，在不同发酵规模(1000L和2500L)中进行产品特性的评价(一级结构的分析如质谱分子量数据、，、肽图、电荷异质性、糖基化修饰；生物学活性的检测如亲和力；高级结构分析如色氨酸荧光、超速离心等测定)。不同工业规模下产品特性的保持是重新筛选的高产克隆的验收标准。
同时，产品特性(肽图，弱阳离子交换属性，糖基化特征)的保持还在不同灌流发酵的运行时间从细胞培养的收获液中获得的产品中进行了评价。不同发酵时间的产品特性的保持是重新筛选的高产克隆的验收标准。
附图说明
图1：不稳定克隆流式细胞仪测定的细胞内免疫球蛋白。
图2：稳定的高生产克隆内流式细胞仪测定的细胞内免疫球蛋白。
图3：转瓶内的动力学研究。
图4：1000L生物反应器中灌流发酵的运行。
图5：2500L生物反应器中灌流发酵的运行。
图6：尼妥珠单抗完整分子的质谱图，方框内是放大图。
图7：尼妥珠单抗完整分子去糖基化的质谱图，方框内是放大图。
图8：尼妥珠单抗的肽图图谱。
图9：不同生产规模的完整抗体分子的基质辅助激光解析电离分析数据。误差线对应数据的置信区间(α＝0.05)。1000L规模N＝3，2500L规模N＝5。
图10：不同规模生产的抗体分子的重链去糖基化和糖基化的基质辅助激光解析电离分析数据。误差条对应数据的置信区间(α＝0.05)。1000L规模N＝3，2500L规模N＝5。
图11：不同规模生产的抗体分子的轻链处理前后的基质辅助激光解析电离分析数据。误差条对应数据的置信区间(α＝0.05)。1000L规模N＝3，2500L规模N＝5。
图12：不同发酵规模的尼妥珠单抗批次分析超速离心分析的分子量(MW)。误差条对应数据的标准偏差，每个规模N＝3。
图13：2500L和1000L发酵规模获得的尼妥珠单抗产品的肽图图谱。
图14：不同细胞培养时期的产品的弱离子交换峰值的相对百分比高度。横坐标显示细胞自安培瓶解冻的总培养时间。点的每个垂直线对应一个批次产品的数据。
图15：不同细胞培养时期产品的糖基化组成的百分比(G0F：：岩藻糖化无半乳糖，G1F：岩藻糖化单半乳糖)，横坐标显示细胞自安瓿解冻的总培养时间。
图16：不同细胞培养时间的产品的糖基化结构百分比(G2F：岩藻糖化二半乳糖，Sial：水杨酸盐化)。横坐标显示细胞自安瓿解冻的总培养时间。
图17：不同细胞培养时间的产品的糖基化结构百分比(Fuc：岩藻糖化)。横坐标显示细胞自安瓿解冻的总培养时间。
具体实施方式
实施例1：稳定高表达细胞株的识别
有限稀释表达抗EGFR人源化抗体hR3的NS0骨髓瘤细胞系，再细胞克隆后，如ZL95118826.7和前文所述，获得两种不同类型的克隆，大多数克隆呈现不稳定的表型，在培养基中随着时间而失去表达重组抗体的生产力。当用流式细胞仪评估细胞内免疫球蛋白时，这些不稳定的克隆显示出两个细胞亚群：表达抗体的细胞亚群和不表达抗体的细胞亚群，选取其中一个典型的不稳定细胞克隆，表达的和不表达抗体的细胞亚群进行图示比较，如图1A和1B所示，显示培养10天和90天后不稳定细胞克隆的IgG细胞内染色，随着培养的继续进行，不表达抗体的细胞亚群(未染色)比例增加(21.1％至31.5％)，表达抗体的细胞亚群(阳性染色)的平均荧光强度降低(0.5×103到0.2×103)。相反，鉴别出的稳定高表达细胞克隆，例如典型克隆(代号2025/M031212)，显示了培养过程中的均是表达抗体的同质细胞群，图2A和2B显示培养10天和90天后克隆2025/M031212的IgG细胞内染色，90％以上细胞群体在培养10天和90天后阳性染色，显示平均荧光强度(1.4×103)没有任何变化。从图1和图2中可知，图1中不稳定表达的细胞亚群的生产率分别为75.8％(t＝10天)和60.3％(t＝90天)，图2中稳定表达的细胞亚群的生产率分别为94.2％(t＝10天)和93.5％(t＝90天)，t＝10天时，图1中高表达的细胞亚群的荧光强度集中在10e2-10e3，图2中高表达的细胞亚群的荧光强度集中在10e3-10e4；t＝90天时，图2中高表达的细胞亚群的荧光强度集中在10e2-10e3，图2中高表达的细胞亚群的荧光强度集中在10e3-10e4；从上述数据可知，图2中选取的稳定的细胞克隆在培养10天和90天后均表现出较高的生产率，高于90％以上，明显高于图1选取的不稳定的细胞克隆，其荧光强度也明显高于图1选取的不稳定的细胞克隆；因此，通过上述方法，可以识别出稳定的高表达的细胞克隆。
上述结果在转瓶中经动力学研究进一步得到了验证。图3A与图1为同一不稳定细胞克隆，图3A显示了培养10天和90天后不稳定细胞克隆的生长率和生产能力，虽然生长率没有差异，但是免疫球蛋白的生产能力在培养90天后降低，而且，从图3A中可以直观看出，IgG水平在10天与90天时差异较大，说明不同培养时间，培养上清中IgG水平变化较大，细胞克隆不够稳定。图3B与图2为同一稳定细胞克隆，图3B中稳定高表达细胞克隆却有不同的表现，培养10天和90天，免疫球蛋白IgG的生长率和生产能力均没有差异，说明不同培养时间，培养上清中IgG水平基本无变化，细胞克隆足够稳定，将这种稳定高表达的细胞克隆，定义为2025/M031212。再培养10天后，克隆2025/M031212的特定生产率(比生长率qp)为(3.2±0.3)×10-7μg/cell/h，几乎是不稳定克隆的两倍(1.8±0.2×10-7μg/cell/h)。
实施例2：工业规模上细胞克隆的高生产力
克隆2025/M031212在1000L生物反应器进行灌流发酵。图4显示了发酵过程中的一些参数：实心方块表示活细胞浓度Xv，每日灌流浓度稳定在2×107cell/mL；空心圆表示发酵运行中IgG达到90％以上的存活率。封闭的三角形表示罐内葡萄糖浓度高于1g/L，实心圆表示灌流的新鲜培养基)。在以上技术条件下生产力(空心方块)达到180至240mg/L/day。
在2500L生物反应器中也进行了克隆2025/M031212的生产力评价。图5显示了在发酵过程中的参数：实心方块表示活细胞浓度Xv，细胞浓度达2×107cell/mL；空心圆表示发酵运行中IgG达到85％以上的存活率。封闭的三角形表示罐内葡萄糖浓度在1g/L以上，存在于新鲜的培养基流中，介质供应为0.8VVD(实心圆)，在这种技术下生产力(空心方块)达到150至250mg/L/day。
实施例3：纯化的单克隆抗体的理化特性
对发酵生产规模中获得的产品进行结构确证，这些包含分子基本特性的结果用来评价细胞系表达预期特性分子的稳定性。通过液质联用仪分析其天然和二硫键还原/烷基化的样品，确定整个分子及其单链的质量。将样品进行去糖基化反应(相对于糖基化的对照样品)得到了质谱分子量发生改变的结果。
尼妥珠单抗完整抗体分子的质谱图见图6，常规LC-MS条件下用C4柱对样品分离/脱盐，乙腈/甲酸缓冲液体系运行。尼妥珠单抗完整分子去糖基化的质谱图见图7，常规LC-MS条件下用C4柱对样品分离/脱盐，乙腈/甲酸缓冲液体系运行。本次试验采用同一批参考品。糖基化和非糖基化的完整抗体分子及其轻重链的分子量见表1。
表1.糖基化和非糖基化的完整分子及其轻重链的分子量
a‐轻链的理论值是指包括全部轻链及碘乙酸烷基化后半胱氨酸残基的分子量。
b‐全重链的理论值是在重链N端焦谷氨酸修饰和包含末端赖氨酸残基的整个重链(包含去糖基化引起的天冬酰胺变成天冬氨酸，以及烷基化的半胱氨酸)的分子量。
c-全重链的理论值是在重链N端焦谷氨酸修饰和包含末端赖氨酸残基的整个重链(包含半胱氨酸烷基化)的分子量.
d-全分子量的理论值假设全分子无糖基化(包含去糖基化引起的天冬酰胺变成天冬氨酸)，一条重链N末端焦谷氨酸修饰，重链末端无赖氨酸残基，抗体由二硫键连接。
e-考虑到全分子无糖基化，修饰一条重链上位点1的焦谷氨酸及二硫键连接的所有半胱氨酸，重链末端无赖氨酸残基。
通过LC-MS/MS分析，不同的内切蛋白酶(此实施例中使用胰蛋白酶和Glu-C)用来酶切该分子，验证了抗体的整个氨基酸序列，与ZL 95118826.7的序列一致。
通过分子的肽图用来监测蛋白质一级结构见图8，使用C4柱和常规的乙腈/TFA缓冲系统进行胰蛋白酶消化和反相HPLC分离。
最后，作为测量生物活性的一种替代方法，采用表面等离子体共振(BiaCore)测定抗体结合抗原的亲和力。表2表示尼妥珠单抗的动力学常数，数据来自两个不同的试验，给出对比的公布的结果。
表2、尼妥珠单抗的动力学常数
| 检测数据 | Ka(1/Ms) | Kd(1/s) | KD(M) |
| 2013/05/23 | 1.969*104 | 0.001720 | 8.737*10-8 |
| 2013/06/20 | 1.386*105 | 0.002811 | 2.027*10-8 |
| 公布数据* | 5.2*104 | 0.0011 | 2.1*10-8 |
注：公布数据*参见文献：Talavera A.,et al.Nimotuzumab,an AntitumorAntibody that Targets the EpidermalGrowth Factor Receptor,Blocks Ligand Bindingwhile Permittingthe Active Receptor Conformation.Cancer Res 2009；69:(14).July15,2009
实施例4：不同工业规模上产品特性一致性
在两种不同的生产规模下评价该细胞株产生特性一致的产物的能力。
图9，10，11显示在两个规模的生产批次间，完整抗体分子、还原的有糖基化或去糖基的质谱数据具有可比性；假设摩擦比为1.48，采用分析超速离心法分析，图12显示分析超速离心测定的分子量在1000L和2500L规模的不同批次间的结果是相似的。这种可比性的结果也可以通过肽图分析来体现，用胰蛋白酶消化蛋白质，反相HPLC(C4)分离方法，常规乙腈/TFA缓冲体系，如图13所示。
实施例5：不同发酵时间的产物产品特性的一致性
由于灌流发酵系统具有可长时间发酵的优点，但长时间培养导致细胞的衰老可能影响其代谢和稳定性，因此，生产规模下不同发酵培养时间的细胞产物特征的保持性是高产稳定细胞株的验收的指标之一。
在不同培养时间下评价该细胞株产生特性一致的产物的能力，见图14～17。
图14显示离子交换色谱法分析产物的异质性(Raquel Montesino,et al.,Biologicals 40(2012)288-298)和图15，16，17的标记寡糖正相HPLC分析的糖基化修饰没有观察到变化趋势。
Claims (4)
1.一种获得高产稳定表达重组抗体的骨髓瘤细胞的方法，所述方法用于工业规模中生产治疗抗体，其特征在于，所述的方法包括五个阶段：
(1)高产稳定表达细胞株的获得，其通过下述方法，识别出稳定的高表达的细胞克隆：
有限稀释表达抗EGFR人源化抗体hR3的NS0骨髓瘤细胞系，再细胞克隆后，获得两种不同类型的克隆，大多数克隆呈现不稳定的表型，在培养基中随着时间而失去表达重组抗体的生产力，用流式细胞仪评估细胞内免疫球蛋白时，这些不稳定的克隆显示出两个细胞亚群：表达抗体的细胞亚群和不表达抗体的细胞亚群，选取其中一个典型的不稳定细胞克隆，显示培养10天和90天后不稳定细胞克隆的IgG细胞内染色，随着培养的继续进行，不表达抗体的细胞亚群比例增加21.1％至31.5％，表达抗体的细胞亚群的平均荧光强度降低0.5×103到0.2×103；鉴别出的稳定高表达细胞克隆，显示了培养过程中的均是表达抗体的同质细胞群，90％以上细胞群体在培养10天和90天后阳性染色，显示平均荧光强度1.4×103没有任何变化；
(2)工业规模上细胞克隆产量的评价；
(3)纯化的单克隆抗体的特性分析；
(4)不同工业规模上产品特性的评价；
(5)不同发酵时间的产物产品特性的评价。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段(2)包括以下步骤：
(1)在1000L工业规模灌流发酵运行90天，通过测量90％以上活力的活细胞浓度和最大值高于200μg/ml时免疫球蛋白浓度评价所选克隆的生产能力；
(2)在2500L工业规模灌流发酵运行90天，通过测量90％以上活力的活细胞浓度和最大值高于200μg/ml时免疫球蛋白浓度评价所选克隆的生产能力。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段(3)包括以下步骤：
(1)采用蛋白A-亲和层析和离子交换层析从发酵收获液中纯化抗体，所述抗体的平均产量为200mg/L–300mg/L，纯度大于95％；
(2)使用下列分析技术对参考品进行特性分析：质谱法测定氨基酸序列及翻译后修饰，质谱法检测分子量，高压液相法分析肽图图谱及糖基化组成，弱阳离子交换色谱法测定电荷异质性，表面等离子体共振法测定亲和性，分析超速离心法分析沉降系数及分子量。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段(4)包括以下步骤：
(1)评价1000L和2500L发酵规模的产品样品的肽图图谱、电荷异质性和糖基化修饰；
(2)与参考品进行可比性分析，显示无显著差异。
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