JP6509745B2 - 標的細胞の選択的富化のための方法、組成物、キット、及びシステム - Google Patents

標的細胞の選択的富化のための方法、組成物、キット、及びシステム Download PDF

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Description

相互参照
本出願は、２０１３年１月２５日付で出願された米国仮特許出願第６１／７５６，９９３号の利益を主張し、また２０１３年２月４日付で出願された米国仮特許出願第６１／７６０，６２６号の利益を主張し、これらの出願は参照により本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによりＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１４年１月２２日に作成され、４３３８２７０１６０１Ｓｅｑｌｉｓｔ．ｔｘｔと名付けられ、１１キロバイトのサイズである。新規事項は追加されていない。
細胞の不均一集団に由来する富化された細胞の亜集団は、多くの臨床及び研究適用に必要とされることが多い。細胞の亜集団の多くは、血液を含む体液に存在する。血液から細胞の亜集団を単離し、調査することは、採血が低侵襲性であることから魅力的な選択肢である。血液中に見出される有用な細胞亜集団の例として、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）、癌幹細胞（ＣＳＣｓ）、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）、及び血管内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）が挙げられる。
生命科学における最近の開発は、細胞の完全性を損なわずに不均一集団から迅速かつ効率的に細胞亜集団を単離し、特性評価し、富化する方法及びシステムに対する必要性を強調してきた。しかしながら、この分野に関する重要な問題は、有意義な研究を行うために十分な量で希少な標的細胞亜集団を捕捉及び富化できないことであった。標的細胞亜集団を単離するための現在の検出方法は、矛盾する知見若しくは限られた試料を導く抗体、マトリクスを侵入する細胞の能力、又は複雑なマイクロ流体デバイスの使用に依存することが多い。例えば、細胞亜集団を単離する現在利用可能な方法は、親和性精製又は同定用の抗体に頼っている。抗体に対する依存性は、細胞が常に同じ細胞表面抗原を発現するわけではないことから問題となり得る。実際、研究は転移能を有するＣＴＣｓ及びＣＳＣｓがＥｐＣＡＭ発現を減少することを示す。更に、ＣＴＣｓ及びＣＳＣｓ等の細胞亜集団は、経時的に変化可能な多様な分子表現型を有し得る。したがって、抗体マーカーに頼らない特定の細胞亜集団に対する捕捉、検出、及び富化の方法が多様な適用において有用であろう。
本発明の態様は、標的細胞亜集団の富化、同定、単離、及び／又は培養に関する。例えば、本発明は、不均一細胞集団から標的細胞亜集団を捕捉及び富化する方法であって、細胞の不均一集団に由来する細胞と基材とを接触させること、及び細胞の標的亜集団の富化を可能とするのに十分な時間に亘って富化培地中で細胞をインキュベートし、細胞の標的亜集団をそれらの物理的及び動態学的特性に基づいて単離することを含む方法を提供する。
また、本発明は、不均一細胞集団から細胞の標的亜集団を捕捉、富化、及び同定する方法であって、不均一細胞集団に由来する細胞と基材とを接触させること、細胞の標的亜集団の富化を可能とするのに十分な時間に亘って富化培地中で細胞の標的亜集団をインキュベートすること、標的細胞亜集団の画像を経時的に得るための器具を使用すること、及び画像の分析を行うためのソフトウェアを使用することであって、ここで、上記ソフトウェアは、細胞の物理的及び動態学的特性に基づいて自動的に細胞を分類することができる、ソフトウェアを使用することを含む方法を提供する。或る実施形態では、ソフトウェアは、物理的特性に基づくパラメーターを統合し、ここで、上記パラメーターは、全体的な細胞サイズ、細胞の外形サイズ、細胞形状、細胞運動、細胞核サイズ、及び細胞分裂を含む群から選択される。或る実施形態では、ソフトウェアは細胞の蛍光標識を検出する。
また、本発明は、ヒト被験体からＣＴＣｓを捕捉及び富化する方法であって、ヒトから採血すること、血液中に含有される細胞を基材と接触させること、ＣＴＣｓの富化を可能とするのに十分な時間に亘って培地中で細胞をインキュベートすること、及びＣＴＣｓの画像分析及びＣＴＣｓの分類を自動的に行う器具を使用することであって、ここで、癌患者に対する治療を指示するために上記分類が使用される、器具を使用することを含む方法を提供する。
上述のいずれかの方法の実施において、標的細胞亜集団は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）、癌幹細胞（ＣＳＣｓ）、固形腫瘍に由来する細胞、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）、初代神経細胞、胎児細胞、幹細胞、成人幹細胞、免疫細胞、初代肝細胞、初代心筋細胞、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）、癌細胞及び上皮前駆細胞からなる群から選択され得る。
上述のいずれかの方法の実施において、不均一細胞集団は、体液、又はその派生物で構成され得る。或る実施形態では、不均一細胞集団は、体液、又はその派生物、及び標識することができる異なる供給源に由来する細胞で構成される。或る実施形態では、標的細胞亜集団に由来する１又は複数の細胞を単離し、培養する。
上述のいずれかの方法の実施において、基材を、ＧＯＬ基材、ＧＥＬ基材及び細胞を含む群から選択することができる。或る実施形態では、基材の構成を、単層、二層、中間層（複数の場合がある）及び逆位構成を含む群から選択する。
上述のいずれかの方法の実施において、富化培地を、平板培養培地、Ｒ型長期成長培地、ＤＦ型長期成長培地、Ｄ型長期成長培地、ＭＥＦ−順化培地、及びそれらの任意の組み合せを含む群から選択する。或る実施形態では、１又は複数の個々の細胞を顕微操作を使用して単離する。
上述の方法の或る実施形態では、標的細胞集団に由来する１又は複数の細胞を顕微操作を使用して単離する。
本発明の上述の方法のいずれかを、様々な臨床適用において使用することができる。或る実施形態では、本発発明の方法を使用して患者をモニターし、癌の存在を調査する。或る実施形態では、再発基準で連続的な血液検査を行って癌の再発見込みを予測する。或る実施形態では、単離した細胞を、培養して薬理学的アッセイに使用し、癌患者に対する治療の最良の形態を決定してもよい。或る実施形態では単離した細胞を増殖させて細胞培養物を作製する。或る実施形態では、細胞培養物を癌の研究に使用する。或る実施形態では、細胞の分類は、癌患者の診断、予後、又はセラノシスを指示する。或る実施形態では、上記方法は、ネットワークにより分類に関連するデータを伝送することを含む。
また、本発明は、１又は複数のプロセッサによる遂行に際し、上述の方法のいずれかを実行するコードを含むコンピュータ可読媒体を提供する。
また、本発明は、請求項１０に記載の方法を実行するシステムであって、試料に関連するデータセットを記憶する記憶メモリ、記憶メモリに通信可能に連結されたプロセッサ及び、データセットを含むシステムを提供する。
また、本発明は、生体試料に由来する不均一細胞集団から標的細胞亜集団の選択的富化のための方法であって、不均一細胞集団と基材を接触させること、及び上記標的細胞亜集団の成長を可能とするのに十分な条件下で上記不均一細胞集団をインキュベートすることであって、ここで、上記条件は、陽圧条件及び／又は低酸素条件下で上記不均一細胞集団をインキュベートすることを含み、上記インキュベートが結果として上記標的細胞亜集団の選択的富化を生じる、インキュベートすることを含む方法を提供する。
或る実施形態では、上記方法は、標的細胞亜集団のメンバーによる１又は複数の形態学的特徴及び／又は動態学的特性の提示によって、標的細胞亜集団のメンバーを同定することを更に含み、ここで、１又は複数の形態学的特徴及び／又は動態学的特性は、コロニー形成、増殖、非標的細胞の表面積と比較して大きな表面積、非標的細胞の基材への付着と比較した基材への付着の増加、急速な細胞分裂及び多核細胞化からなる群から選択される。或る実施形態では、同定は、抗体又はポリヌクレオチドマーカーの使用を含まない。
或る実施形態では、標的細胞亜集団は、初代細胞を含む。或る実施形態では、標的細胞亜集団は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）、癌幹細胞（ＣＳＣｓ）、固形腫瘍に由来する細胞、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）、初代神経細胞、胎児細胞、幹細胞、成人幹細胞、免疫細胞、初代肝細胞、初代心筋細胞、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）、癌細胞及び上皮前駆細胞からなる群から選択される細胞を含む。或る実施形態では、標的細胞亜集団のメンバーは、ＣＴＣ又はＣＳＣである。或る実施形態では、ＣＴＣは転移性ＣＴＣである。或る実施形態では、ＣＴＣは生存ＣＴＣである。或る実施形態では、ＣＴＣは、急性白血病細胞、急性ｔ細胞白血病細胞、急性リンパ性白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、骨髄芽球性白血病細胞、前骨髄球性白血病細胞、骨髄単球性白血病細胞、単球性白血病細胞、赤白血病細胞、慢性白血病細胞、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病細胞、慢性リンパ球性白血病細胞、真性多血症細胞、リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症細胞、重鎖病細胞、肉腫細胞、線維肉腫細胞、粘液肉腫細胞、脂肪肉腫細胞、軟骨肉腫細胞、骨肉腫細胞、リンパ管肉腫細胞、中皮腫細胞、ユーイング腫瘍細胞、平滑筋肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞、結腸癌細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、去勢抵抗性前立腺癌細胞、扁平上皮癌細胞、基底細胞癌細胞、腺癌細胞、汗腺癌細胞、皮脂腺癌細胞、乳頭癌細胞、乳頭腺癌細胞、嚢胞腺癌細胞、髄様癌細胞、気管支細胞、腎細胞癌細胞、肝癌細胞、胆管癌細胞、絨毛癌細胞、セミノーマ細胞、胚性癌腫細胞、ウィルムス腫瘍細胞、子宮頸癌細胞、子宮癌細胞、精巣腫瘍細胞、肺癌細胞、小細胞肺癌細胞、膀胱癌細胞、上皮癌細胞、神経膠腫細胞、頭蓋咽頭腫細胞、上衣腫細胞、松果体腫細胞、血管芽腫細胞、聴神経腫細胞、乏突起神経膠腫細胞、髄膜腫細胞、黒色腫細胞、神経芽腫細胞、網膜芽腫細胞、子宮内膜癌細胞、非小細胞肺癌細胞、頭頸部癌細胞、又は腎臓癌細胞である。或る実施形態では、非標的初代細胞亜集団は、白血球、老化上皮細胞、線維芽細胞、非生存細胞、又は断片化した細胞を含む。
或る実施形態では、生体試料は体液又はその派生物を含む。或る実施形態では、体液は、血液、血漿、血清、リンパ、唾液、尿、汗、又は腹水から選択される。或る実施形態では、標的細胞亜集団のメンバーは、体液又はその派生物１ｍｌ当たり１個以下の標的細胞の濃度で存在する。或る実施形態では、標的細胞亜集団のメンバーは、体液又はその派生物１ｍｌ当たり０．８個以下の標的細胞の濃度で存在する。或る実施形態では、標的細胞亜集団のメンバーは、体液又はその派生物１ｍｌ当たり０．６個以下の標的細胞の濃度で存在する。或る実施形態では、生体試料は固形組織試料を含む。
或る実施形態では、基材はコーティングを含み、ここで、コーティングは、ＧＯＬ基材、ＧＥＬ基材、１又は複数のフィーダー細胞層、及びそれらの任意の組み合せからなる群から選択される。或る実施形態では、基材の構成は、単層構成、二層構成、中間層（複数の場合がある）構成、及び逆位構成からなる群から選択される。
或る実施形態では、上記方法は、標的細胞亜集団のメンバーを個別に単離することを更に含む。或る実施形態では、上記方法は、標的細胞亜集団のメンバーを個別に単離し、培養することを含む。或る実施形態では、単離は、顕微操作器具の使用を含む。
或る実施形態では、上記方法は、標的細胞亜集団のメンバーを２週間に亘って細胞培養物として培養することを含む。
或る実施形態では、低酸素条件は、１０％未満のＯ２レベルの下で培養することを含む。或る実施形態では、Ｏ２レベルは１％である。
或る実施形態では、陽圧条件は、１４．７ＰＳＩＡを超える加圧条件下で上記メンバーを培養することを含む。或る実施形態では、陽圧条件は、１５ＰＳＩＡ以上の加圧条件下で上記メンバーを培養することを含む。或る実施形態では、陽圧条件は、１５．７ＰＳＩＡ以上の加圧条件下で上記メンバーを培養することを含む。或る実施形態では、陽圧条件は、１６．７ＰＳＩＡ以上の加圧条件下で上記メンバーを培養することを含む。或る実施形態では、陽圧条件は、１９．７ＰＳＩＡの加圧条件下で上記メンバーを培養することを含む。
或る実施形態では、条件は、平板培養培地、Ｒ型長期成長培地、ＤＦ型長期成長培地、Ｄ型長期成長培地、ＭＥＦ−順化培地、及びそれらの任意の組み合せからなる群から選択される細胞培養培地中で標的細胞亜集団のメンバーを培養することを含む。或る実施形態では、条件は、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、プロゲステロン、ジヒドロテストステロン、及び／又はそれらの任意の組み合せを含む細胞培養培地中で標的細胞亜集団のメンバーを培養することを更に含む。
或る実施形態では、条件は、細胞の表面張力を調節する化合物を含む細胞培養培地中で上記メンバーを培養することを含む。或る実施形態では、上記化合物はＲｈｏキナーゼ阻害剤である。或る実施形態では、化合物は、
Figure 0006509745
からなる群から選択される。
或る実施形態では、条件は、上記メンバーにおいて低酸素誘導因子の発現を増加する薬剤と共に上記メンバーを培養することを含む。或る実施形態では、低酸素誘導因子は、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）、低酸素誘導因子−１β（ＨＩＦ−１β）、低酸素誘導因子２α（ＨＩＦ−２α）、低酸素誘導因子−２β（ＨＩＦ−２β）、低酸素誘導因子−３α（ＨＩＦ−３α）、及び低酸素誘導因子−３β（ＨＩＦ−３β）、又はそれらの任意の組み合せを含む。或る実施形態では、低酸素誘導因子は、ＨＩＦ−１αを含む。或る実施形態では、低酸素誘導因子の発現を増加する薬剤はベクターを含み、ここで、ベクターは低酸素誘導因子をコードするポリヌクレオチドを含む。或る実施形態では、ベクターは発現ベクターである。或る実施形態では、低酸素誘導因子は、配列番号１に対して少なくとも７０％以上の相同性を含むアミノ酸配列を含む。
或る実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２に対して少なくとも７０％以上の相同性又は相補性を含む。
上述のいずれかの方法の実施において、上記方法は、細胞培養培地をフィーダー細胞と接触することを含んでもよい。或る実施形態では、フィーダー細胞は、培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＬＭＶＥＣ）、及びマウス肺線維芽細胞（ＭＥＦ）からなる群から選択される。
本明細書に記載される方法のいずれかの或る実施形態では、上記方法は、標的細胞亜集団のメンバーをシーケンシングすることを含む。或る実施形態では、上記方法は、標的細胞亜集団のメンバーにおける１又は複数の遺伝子の発現を特定することを含む。或る実施形態では、上記方法は、標的細胞亜集団のメンバーにおける１又は複数のタンパク質の発現を特定することを含む。
或る実施形態では、同定は、メンバーの画像を得ること、及びそのメンバーを標的細胞亜集団に属するものとして自動的に分類するためのコンピュータ可読媒体を使用することを含む。或る実施形態では、コンピュータ可読媒体は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）、癌幹細胞（ＣＳＣｓ）、固形腫瘍に由来する細胞、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）、初代神経細胞、胎児細胞、幹細胞、成人幹細胞、免疫細胞、初代肝細胞、初代心筋細胞、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）、癌細胞及び上皮前駆細胞を自動的に分類するように構成される。或る実施形態では、コンピュータ可読媒体は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）、癌幹細胞（ＣＳＣｓ）、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）、及び血管内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）を自動的に分類するように構成される。或る実施形態では、コンピュータ可読媒体は、細胞の標的亜集団の物理的特性に基づくパラメーターを統合するように構成され、ここで、上記パラメーターは、からなる群から選択される。或る実施形態では、コンピュータ可読媒体は細胞の蛍光標識を検出するように構成される。
また、本発明は、癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法であって、被験体に由来する生体試料中の標的細胞の検出に際して、被験体に抗癌剤を投与することを含み、ここで、上記標的細胞が本明細書に記載される方法によって検出される、癌を治療する方法を提供する。
また、本発明は、抗がん剤の投与を必要とする被験体に抗がん剤を投与する方法であって、複数の時間点で被験体に抗がん剤を投与すること、投与の少なくとも第１及び第２の時間点で被験体から得られた生体試料に由来する標的細胞を分析することであって、ここで、上記分析が先行する請求項のいずれか１つに記載の方法を含む、分析すること、分析に基づいて投与のために抗凝集剤の用量を調整すること及び／又は異なる抗凝集剤を選択することを含む方法を提供する。
また、本発明は、転移性癌を発症していない被験体において転移性癌の発症見込みの増加を検出する方法であって、本明細書に記載される方法を使用して被験体に由来する不均一細胞集団から標的細胞亜集団を単離すること、標的細胞亜集団を検出すること、及び検出に際して、被験体を転移性癌を発症する見込みが増加していると指定することを含む方法を提供する。
また、本発明は、抗癌治療法を開発する方法であって、本明細書に記載される方法を使用して標的細胞亜集団を培養すること、標的細胞亜集団と試験薬剤を接触させること、標的細胞亜集団の生存能及び／又は成長をアッセイすること、並びに標的細胞亜集団の生存能及び／又は成長が、試験薬剤と接触していない標的細胞亜集団と比較して減少される場合に、試験薬剤を抗癌治療法として選択することを含む方法を提供する。
また、本発明は、個別化された疾患治療法を必要とする患者に対して個別化された疾患治療法を選択する方法であって、本明細書に記載される方法を使用して標的細胞亜集団を培養すること、標的細胞亜集団のメンバーに由来する核酸をシーケンシングして標的細胞亜集団のメンバーの遺伝子プロファイルを作製すること、及び標的細胞亜集団のメンバーの遺伝子プロファイルに基づいて被験体に対して個別化された疾患治療法を選択することを含む方法を提供する。或る実施形態では、上記方法は、被験体に個別化された疾患治療法を提案することを更に含む。或る実施形態では、個別化された疾患治療法は、個別化された癌治療法である。
また、本発明は、閉鎖環境チャンバを備えた細胞培養インキュベータを提供し、ここで、細胞培養インキュベータは（ｉ）閉鎖環境チャンバの気体組成、（ｉｉ）閉鎖環境チャンバの使用者によって制御される大気圧、及び（ｉｉｉ）閉鎖環境チャンバの内部周囲温度を維持するように構成される。或る実施形態では、細胞培養インキュベータは１又は複数の制御ユニットを備え、ここで、１又は複数の制御ユニットは、気体組成、使用者によって制御される大気圧、及び内部周囲温度の少なくとも１つを維持するように構成される。或る実施形態では、１又は複数の制御ユニットは、気体組成、使用者によって制御される大気圧、及び内部周囲温度の少なくとも２つを維持するように構成される。或る実施形態では、１又は複数の制御ユニットは、気体組成、使用者によって制御される大気圧、及び内部周囲温度を維持するように構成される。或る実施形態では、気体組成、使用者によって制御される大気圧、及び内部周囲温度の少なくとも１つを、非標的初代細胞亜集団と比較して標的初代細胞亜集団の選択的増殖用に構成する。或る実施形態では、選択的増殖は、非標的初代細胞亜集団の増殖と比較して２倍の標的初代細胞亜集団の増殖の増加により証明される。或る実施形態では、気体組成、使用者によって制御される大気圧、及び内部周囲温度の少なくとも１つを、非標的初代細胞亜集団と比較して標的初代細胞亜集団の選択的付着用に構成する。或る実施形態では、選択的付着は、非標的初代細胞亜集団の付着と比較して２倍の標的初代細胞亜集団の付着の増加により証明される。或る実施形態では、気体組成、使用者によって制御される大気圧、及び内部周囲温度の少なくとも１つを、非標的初代細胞亜集団のコロニー形成と比較して、標的初代細胞の選択的コロニー形成を促進するように構成する。或る実施形態では、選択的コロニー形成は、非標的初代細胞亜集団のコロニー形成と比較して２倍の標的初代細胞亜集団のコロニー形成の増加により証明される。或る実施形態では、コロニー形成は二次元及び／又は三次元のコロニー形成である。
或る実施形態では、標的初代細胞亜集団は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）、癌幹細胞（ＣＳＣｓ）、固形腫瘍に由来する細胞、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）、初代神経細胞、胎児細胞、幹細胞、成人幹細胞、免疫細胞、初代肝細胞、初代心筋細胞、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）、癌細胞及び上皮前駆細胞からなる群から選択される。或る実施形態では、標的初代細胞亜集団は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）、癌幹細胞（ＣＳＣｓ）、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）、及び血管内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）から選択される。或る実施形態では、標的初代細胞亜集団は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）、癌幹細胞（ＣＳＣｓ）、固形腫瘍に由来する細胞、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）、初代神経細胞、初代胎児細胞、初代肝細胞、初代心筋細胞、及び血管内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）からなる群から選択される。或る実施形態では、標的初代細胞亜集団は、ＣＴＣｓ及びＣＳＣｓからなる群から選択される。或る実施形態では、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、急性白血病細胞、急性ｔ細胞白血病細胞、急性リンパ性白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、骨髄芽球性白血病細胞、前骨髄球性白血病細胞、骨髄単球性白血病細胞、単球性白血病細胞、赤白血病細胞、慢性白血病細胞、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病細胞、慢性リンパ球性白血病細胞、真性多血症細胞、リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症細胞、重鎖病細胞、肉腫細胞、線維肉腫細胞、粘液肉腫細胞、脂肪肉腫細胞、軟骨肉腫細胞、骨肉腫細胞、リンパ管肉腫細胞、中皮腫細胞、ユーイング腫瘍細胞、平滑筋肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞、結腸癌細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、去勢抵抗性前立腺癌細胞、扁平上皮癌細胞、基底細胞癌細胞、腺癌細胞、汗腺癌細胞、皮脂腺癌細胞、乳頭癌細胞、乳頭腺癌細胞、嚢胞腺癌細胞、髄様癌細胞、気管支細胞、腎細胞癌細胞、肝癌細胞、胆管癌細胞、絨毛癌細胞、セミノーマ細胞、胚性癌腫細胞、ウィルムス腫瘍細胞、子宮頸癌細胞、子宮癌細胞、精巣腫瘍細胞、肺癌細胞、小細胞肺癌細胞、膀胱癌細胞、上皮癌細胞、神経膠腫細胞、頭蓋咽頭腫細胞、上衣腫細胞、松果体腫細胞、血管芽腫細胞、聴神経腫細胞、乏突起神経膠腫細胞、髄膜腫細胞、黒色腫細胞、神経芽腫細胞、網膜芽腫細胞、子宮内膜癌細胞、非小細胞肺癌細胞、頭頸部癌細胞、又は腎臓癌細胞である。或る実施形態では、非標的初代細胞亜集団は、白血球、老化上皮細胞、線維芽細胞、非生存細胞、又は断片化した細胞を含む。
或る実施形態では、気体組成は、０．１％〜２０％のＯ２レベルを含む。或る実施形態では、細胞培養インキュベータは、５％以下の閉鎖環境チャンバのＯ２レベルを維持する。或る実施形態では、細胞培養インキュベータは、２％以下の閉鎖環境チャンバのＯ２レベルを維持する。或る実施形態では、細胞培養インキュベータは、１％以下の閉鎖環境チャンバのＯ２レベルを維持する。
或る実施形態では、細胞培養インキュベータは、閉鎖環境チャンバの使用者によって制御される大気圧を１５．７ＰＳＩＡ以上に維持する。或る実施形態では、細胞培養インキュベータは、閉鎖環境チャンバの使用者によって制御される大気圧を１６．７ＰＳＩＡ以上に維持する。或る実施形態では、細胞培養インキュベータは、閉鎖環境チャンバの使用者によって制御される大気圧を１９．７ＡＰＳＩＡに維持する。或る実施形態では、細胞培養インキュベータは、インレット気圧を制御することにより大気圧を維持する。
或る実施形態では、細胞培養インキュベータは、１又は複数のユーザーインターフェースを備える。或る実施形態では、１又は複数のユーザーインターフェースは、使用者が気体組成を制御できるように構成される。或る実施形態では、１又は複数のユーザーインターフェースは、使用者がＯ２レベルを制御できるように構成される。或る実施形態では、１又は複数のユーザーインターフェースは、使用者が大気圧を制御できるように構成される。或る実施形態では、１又は複数のユーザーインターフェースは、使用者に気体組成の表示を提供するように構成される。或る実施形態では、１又は複数のユーザーインターフェースは、使用者にＯ２レベルの表示を提供するように構成される。或る実施形態では、１又は複数のユーザーインターフェースは、使用者に大気圧の表示を提供するように構成される。或る実施形態では、細胞培養インキュベータは、（ｉｖ）閉鎖環境チャンバの内部湿度を維持するように構成される。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは棚を備える。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは圧力センサを備える。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバはＯ２センサを備える。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは酸素除去触媒を備える。
或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは、滅菌ユニットを備える。或る実施形態では、滅菌ユニットは、ＵＶ滅菌ユニットである。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは、加圧ドアを備える。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは、使用者によって制御されるＯ２レベルと±０．５％よりも大きく異なる閉鎖環境チャンバのＯ２レベルの検出に際して、検出可能なアラームを提供するセンサを備える。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは、使用者によって制御される大気圧と±０．５％よりも大きく異なる閉鎖環境チャンバの大気圧の検出に際して、検出可能なアラームを提供するセンサを備える。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは、閉鎖環境チャンバの大気圧レベルを表示するユーザーディスプレイを備える。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは、閉鎖環境チャンバのＯ２レベルを表示するユーザーディスプレイを備える。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは、閉鎖環境チャンバのＣＯ２レベルを表示するユーザーディスプレイを備える。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは、閉鎖環境チャンバの温度レベルを表示するユーザーディスプレイを備える。
或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは、６立法フィート以下の空間を占める。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは、３．５立法フィート以下の空間を占める。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは、２立法フィート以下の空間を占める。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは、１．５立法フィート以下の空間を占める。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは、１立法フィート以下の空間を占める。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバは、１立法フィート未満の空間を占める。
或る実施形態では、細胞培養インキュベータは、閉鎖環境チャンバ内に細胞画像化システムを更に備える。或る実施形態では、細胞画像化システムは顕微鏡を備える。或る実施形態では、顕微鏡は倒立顕微鏡である。或る実施形態では、細胞画像化システムは顕微操作器具を備え、ここで、顕微操作器具は、標的細胞の単離を可能とするように構成される。或る実施形態では、細胞画像化システムは、制御可能にコンピュータシステムに連結され、ここで、コンピュータシステムは、本明細書に記載されるコンピュータ可読媒体を備える。或る実施形態では、細胞画像化システムは、生存細胞の画像化用に構成される。或る実施形態では、細胞画像化システムは、ハイコンテントスクリーニング分析用に構成される。
また、本発明は、細胞培養基材を備えた細胞培養プレートを提供し、ここで、基材は基材への標的細胞の付着を促進するように選択され、ここで、標的細胞は付着性の生存細胞であり、基材は細胞外マトリクスタンパク質を含む。或る実施形態では、細胞培養プレートは、標的細胞が基材に付着される場合に標的細胞の長期培養を促進するように構成される。或る実施形態では、標的細胞は初代細胞である。或る実施形態では、初代細胞は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、癌幹細胞（ＣＳＣ）、固形腫瘍に由来する細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、初代神経細胞、胎児細胞、幹細胞、成人幹細胞、免疫細胞、初代肝細胞、初代心筋細胞、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、癌細胞及び上皮前駆細胞からなる群から選択される。或る実施形態では、初代細胞は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、癌幹細胞（ＣＳＣ）、固形腫瘍に由来する細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、初代神経細胞、初代胎児細胞、初代肝細胞、初代心筋細胞、及び血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）からなる群から選択される。或る実施形態では、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、急性白血病細胞、急性ｔ細胞白血病細胞、急性リンパ性白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、骨髄芽球性白血病細胞、前骨髄球性白血病細胞、骨髄単球性白血病細胞、単球性白血病細胞、赤白血病細胞、慢性白血病細胞、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病細胞、慢性リンパ球性白血病細胞、真性多血症細胞、リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症細胞、重鎖病細胞、肉腫細胞、線維肉腫細胞、粘液肉腫細胞、脂肪肉腫細胞、軟骨肉腫細胞、骨肉腫細胞、リンパ管肉腫細胞、中皮腫細胞、ユーイング腫瘍細胞、平滑筋肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞、結腸癌細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、去勢抵抗性前立腺癌細胞、扁平上皮癌細胞、基底細胞癌細胞、腺癌細胞、汗腺癌細胞、皮脂腺癌細胞、乳頭癌細胞、乳頭腺癌細胞、嚢胞腺癌細胞、髄様癌細胞、気管支細胞、腎細胞癌細胞、肝癌細胞、胆管癌細胞、絨毛癌細胞、セミノーマ細胞、胚性癌腫細胞、ウィルムス腫瘍細胞、子宮頸癌細胞、子宮癌細胞、精巣腫瘍細胞、肺癌細胞、小細胞肺癌細胞、膀胱癌細胞、上皮癌細胞、神経膠腫細胞、頭蓋咽頭腫細胞、上衣腫細胞、松果体腫細胞、血管芽腫細胞、聴神経腫細胞、乏突起神経膠腫細胞、髄膜腫細胞、黒色腫細胞、神経芽腫細胞、網膜芽腫細胞、子宮内膜癌細胞、非小細胞肺癌細胞、頭頸部癌細胞、又は腎臓癌細胞である。或る実施形態では、非標的初代細胞亜集団は、白血球、老化上皮細胞、線維芽細胞、非生存細胞、又は断片化した細胞を含む。或る実施形態では、基材は正に帯電した分子を更に含む。或る実施形態では、正に帯電した分子は、ポリ−オルニチンである。
また、本発明は、第１の細胞培養基材、及び少なくとも第２の細胞培養基材を備えた細胞培養プレートを提供し、ここで、第１の細胞培養基材は、第１の標的細胞亜集団の長期培養を促進するように構成され、ここで、少なくとも第２の細胞培養基材は、第２の標的細胞亜集団の長期培養を促進するように構成される。或る実施形態では、細胞培養プレートは少なくとも２つのウェルを備え、ここで、２つのウェルの第１は第１の細胞培養基材を備え、ここで、少なくとも２つのウェルの第２は、少なくとも第２の細胞培養基材を備える。或る実施形態では、第１の標的細胞亜集団及び／又は少なくとも第２の細胞培養亜集団は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）、癌幹細胞（ＣＳＣｓ）、固形腫瘍に由来する細胞、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）、初代神経細胞、胎児細胞、幹細胞、成人幹細胞、免疫細胞、初代肝細胞、初代心筋細胞、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）、癌細胞及び上皮前駆細胞からなる群から選択される。或る実施形態では、第１の標的細胞亜集団及び／又は少なくとも第２の細胞培養亜集団は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）、癌幹細胞（ＣＳＣｓ）、固形腫瘍に由来する細胞、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）、初代神経細胞、初代胎児細胞、初代肝細胞、初代心筋細胞、及び血管内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）からなる群から選択される。或る実施形態では、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、急性白血病細胞、急性ｔ細胞白血病細胞、急性リンパ性白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、骨髄芽球性白血病細胞、前骨髄球性白血病細胞、骨髄単球性白血病細胞、単球性白血病細胞、赤白血病細胞、慢性白血病細胞、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病細胞、慢性リンパ球性白血病細胞、真性多血症細胞、リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症細胞、重鎖病細胞、肉腫細胞、線維肉腫細胞、粘液肉腫細胞、脂肪肉腫細胞、軟骨肉腫細胞、骨肉腫細胞、リンパ管肉腫細胞、中皮腫細胞、ユーイング腫瘍細胞、平滑筋肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞、結腸癌細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、去勢抵抗性前立腺癌細胞、扁平上皮癌細胞、基底細胞癌細胞、腺癌細胞、汗腺癌細胞、皮脂腺癌細胞、乳頭癌細胞、乳頭腺癌細胞、嚢胞腺癌細胞、髄様癌細胞、気管支細胞、腎細胞癌細胞、肝癌細胞、胆管癌細胞、絨毛癌細胞、セミノーマ細胞、胚性癌腫細胞、ウィルムス腫瘍細胞、子宮頸癌細胞、子宮癌細胞、精巣腫瘍細胞、肺癌細胞、小細胞肺癌細胞、膀胱癌細胞、上皮癌細胞、神経膠腫細胞、頭蓋咽頭腫細胞、上衣腫細胞、松果体腫細胞、血管芽腫細胞、聴神経腫細胞、乏突起神経膠腫細胞、髄膜腫細胞、黒色腫細胞、神経芽腫細胞、網膜芽腫細胞、子宮内膜癌細胞、非小細胞肺癌細胞、頭頸部癌細胞、又は腎臓癌細胞である。或る実施形態では、非標的初代細胞亜集団は、白血球、老化上皮細胞、線維芽細胞、非生存細胞、又は断片化した細胞を含む。或る実施形態では、基材は、ＧＯＬ基材、ＧＥＬ基材、１又は複数のフィーダー細胞層、又はそれらの任意の組み合せを含む。或る実施形態では、細胞培養プレートは、１ウェル、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、１０５６ウェル、１５３６ウェル、又は３４５６ウェルを備える。或る実施形態では、第１の標的細胞亜集団は、転移性去勢抵抗性前立腺癌を含み、第１の基材は、アンドロゲン及び／又はアンドロゲン模倣物を含む。
また、本発明はキットを提供する。或る実施形態では、キットは、本明細書に記載される細胞培養インキュベータと、標的細胞亜集団の培養における使用に関する指示書とを含む。或る実施形態では、指示書は、インキュベータの閉鎖環境チャンバ内を１５．７ＰＳＩＡ以上の大気圧に維持する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、インキュベータの閉鎖環境チャンバ内を１６．７ＰＳＩＡ以上の大気圧に維持する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、インキュベータの閉鎖環境チャンバ内を１９．７ＰＳＩＡ以上の大気圧に維持する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、インキュベータの閉鎖環境チャンバ内を１０％以下のＯ２レベルに維持する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、インキュベータの閉鎖環境チャンバ内を５％以下のＯ２レベルに維持する指示を含む。或る実施形態では、指示書は、インキュベータの閉鎖環境チャンバ内を２％以下のＯ２レベルに維持する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、インキュベータの閉鎖環境チャンバ内を１％以下のＯ２レベルに維持する指示文を含む。
また、本発明は、先行する請求項のいずれかに記載される基材を備えた細胞培養プレートと、標的細胞亜集団を培養するためのプレートの使用に関する指示書とを含むキットを提供する。或る実施形態では、指示書は、１０％以下のＯ２レベルで標的細胞亜集団を培養する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、５％以下のＯ２レベルで標的細胞亜集団を培養する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、２％以下のＯ２レベルで標的細胞亜集団を培養する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、１％以下のＯ２レベルで標的細胞亜集団を培養する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、１５．７ＰＳＩＡ以上の大気圧で標的細胞亜集団を培養する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、１６．７ＰＳＩＡ以上の大気圧で標的細胞亜集団を培養する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、１９．７ＰＳＩＡ以上の大気圧で標的細胞亜集団を培養する指示文を含む。
また、本発明は、好適な包装に細胞の表面張力を調節する化合物と、標的細胞亜集団の培養における使用のための化合物を含む細胞培養培地の調製に関する指示書とを含むキットを提供する。或る実施形態では、化合物はＲｈｏキナーゼ阻害剤である。或る実施形態では、化合物は、
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からなる群から選択される。
また、本発明は、先行する請求項のいずれかに記載される細胞培養培地と、標的細胞亜集団を培養するための細胞培養の使用に関する指示書とを含むキットを提供する。或る実施形態では、指示書は、１０％以下のＯ２レベルで標的細胞亜集団を培養する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、５％以下のＯ２レベルで標的細胞亜集団を培養する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、２％以下のＯ２レベルで標的細胞亜集団を培養する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、１％以下のＯ２レベルで標的細胞亜集団を培養する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、１５．７ＰＳＩＡ以上の大気圧で標的細胞亜集団を培養する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、１６．７ＰＳＩＡ以上の大気圧で標的細胞亜集団を培養する指示文を含む。或る実施形態では、指示書は、１９．７ＰＳＩＡ以上の大気圧で標的細胞亜集団を培養する指示文を含む。
また、本発明は、上記メンバーにおいて低酸素誘導因子の発現を増加する薬剤と、標的細胞亜集団を培養するための薬剤の使用に関する指示書とを含むキットを提供する。或る実施形態では、低酸素誘導因子の発現を増加する薬剤はベクターを含み、ここで、ベクターは、低酸素誘導因子をコードするポリヌクレオチドを含む。或る実施形態では、ベクターは発現ベクターである。或る実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２に対して少なくとも７０％以上の相同性又は相補性を含む。
或る実施形態では、低酸素誘導因子は、配列番号１に対して少なくとも７０％以上の相同性を含むアミノ酸配列を含む。
また、本発明は、１又は複数のプロセッサによる遂行に際して、本明細書に記載される方法によって記載されるような同定工程を実行するコードを含むコンピュータ可読媒体を提供する。例えば、本発明は、１又は複数の初代細胞の画像データを受け取るに際して、以下の工程、すなわち、画像データから１又は複数の初代細胞のサイズを決定する工程、及びそのサイズが腫瘍に由来しない細胞よりも少なくとも１．５倍大きい場合にその初代細胞を腫瘍に由来すると分類する工程であって、ここで、１又は複数の初代細胞が生体試料から得られ、ここで、１又は複数の初代細胞を標的細胞亜集団の成長を可能とするのに十分な条件下で培養し、ここで、その条件が陽圧条件及び／又は低酸素条件下で１又は複数の初代細胞をインキュベートすることを含む工程を実行するコードを含むコンピュータ可読媒体を提供する。或る実施形態では、コンピュータ可読媒体は、分類に際して、生体試料が腫瘍細胞を含むと同定する工程を実行する。或る実施形態では、コンピュータ可読媒体は、そのサイズが腫瘍に由来しない細胞の少なくとも２倍以上である場合に初代細胞を腫瘍に由来すると分類する工程を実行する。或る実施形態では、サイズは、少なくとも２０μｍの直径を含む。或る実施形態では、サイズは、少なくとも９００μｍ２の表面積を含む。
また、本発明は、生体試料から得られた１又は複数の初代細胞の画像データを受け取るに際して、以下の工程、すなわち、画像データから固体又は半固体の基材に付着した三次元コロニーの存在又は不在を検出する工程、及び三次元コロニーの存在の検出に際して、生体試料が腫瘍細胞を含んでいると分類する工程であって、ここで、１又は複数の初代細胞を標的細胞亜集団の成長を可能とするのに十分な条件下で培養し、ここで、上記条件が陽圧条件及び／又は低酸素条件下で１又は複数の初代細胞をインキュベートすることを含む工程を実行するコードを含むコンピュータ可読媒体を提供する。
また、本発明は、生体試料から得られた１又は複数の初代細胞の画像データを受け取るに際して、以下の工程、すなわち、画像データから複数の核を含む初代細胞の存在又は不在を検出する工程、及び複数の核含む初代細胞の存在の検出に際して、生体試料が腫瘍細胞を含んでいると分類する工程であって、ここで、１又は複数の初代細胞を標的細胞亜集団の成長を可能とするのに十分な条件下で培養し、ここで、上記条件が陽圧条件及び／又は低酸素条件下で１又は複数の初代細胞をインキュベートすることを含む工程を実行するコードを含むコンピュータ可読媒体を提供する。或る実施形態では、コンピュータ可読媒体は、複数の核を含む初代細胞を腫瘍細胞と同定するように構成される。
また、本発明は、生体試料から得られた１又は複数の初代細胞の画像データを受け取るに際して、以下の工程、すなわち、画像データから負の正味表面電荷を含む初代細胞の存在又は不在を検出する工程、及び負の正味表面電荷を含む初代細胞の存在の検出に際して、生体試料が腫瘍細胞を含んでいると分類する工程であって、ここで、負の正味表面電荷が、非腫瘍細胞の正電荷を有する固体又は半固体の基材に対する付着と比較した、初代細胞の正電荷を有する固体又は半固体の基材に対する付着の増加によって証明される工程を実行するコードを含むコンピュータ可読媒体を提供する。或る実施形態では、正電荷を有する固体又は半固体の基材は、細胞外マトリクスタンパク質を含む。或る実施形態では、細胞外マトリクスタンパク質は、ポリ−ｌ−オルニチンである。
また、本発明は、生体試料から得られた１又は複数の初代細胞の画像データを受け取るに際して、以下の工程、すなわち、画像データから急速に分裂する細胞の存在又は不在を検出する工程、及び急速に分裂する細胞の存在の検出に際して、生体試料が腫瘍細胞を含んでいると分類する工程であって、ここで、１又は複数の初代細胞を標的細胞亜集団の成長を可能とするのに十分な条件下で培養し、上記条件が陽圧条件及び／又は低酸素条件下で１又は複数の初代細胞をインキュベートすることを含む工程を実行するコードを含むコンピュータ可読媒体を提供する。或る実施形態では、コンピュータ可読媒体は急速に分裂する細胞を腫瘍細胞と同定するように構成される。或る実施形態では、画像データは、第１及び第２の時間点で得られた画像データを含む。或る実施形態では、第１及び第２の時間点は、３日以下の間隔であり、ここで、急速に分裂する細胞の存在は、第１と第２の時間点の間の細胞培養密度の２倍以上の増加により証明される。或る実施形態では、第１及び第２の時間点は２日以下の間隔である。或る実施形態では、急速に分裂する細胞の存在は、第１と第２の時間点の間の細胞培養密度の３０倍以上の増加により証明される。或る実施形態では、コンピュータ可読媒体は、腫瘍開始細胞として腫瘍細胞を分類するように構成される。
コンピュータ可読媒体の上述の実施形態のいずれかでは、生体試料は流体試料である。或る実施形態では、流体試料は血液試料である。或る実施形態では、血液試料は全血試料である。或る実施形態では、生体試料は固形組織試料である。或る実施形態では、陽圧条件及び／又は低酸素条件は、先行する請求項のいずれかにより記載される通りである。
また、本発明は、試料に関連するデータセットを記憶する記憶メモリ、記憶メモリに通信可能に連結されたプロセッサであって、ここで、プロセッサが本明細書に記載されるコンピュータ可読媒体を備える、プロセッサ、及びデータセットを備えたコンピュータシステムを提供する。或る実施形態では、コンピュータシステムは、データセットを受け取るように構成されたコンピュータ、及びシステムからコンピュータにデータセットを転送するように構成されたネットワークを更に備える。
また、本発明は、細胞から画像データを産生するように構成された顕微鏡、及びその顕微鏡から画像データを受け取るように構成されたコンピュータシステムであって、ここで、顕微鏡が本明細書に記載されるコンピュータ可読媒体を備える、コンピュータシステムを備える細胞画像化システムを提供する。或る実施形態では、上記顕微鏡はステージを備え、ここで、ステージは、本明細書に記載される細胞培養プレートを保持するように構成される。或る実施形態では、細胞画像化システムは、生存細胞画像化用に構成される。或る実施形態では、細胞画像化システムは、ハイコンテントスクリーニング分析用に構成される。或る実施形態では、細胞画像化システムは環境チャンバを備え、ここで、環境チャンバは、（ｉ）環境チャンバの気体組成、（ｉｉ）閉鎖環境チャンバの大気圧、及び（ｉｉｉ）閉鎖環境チャンバの内部周囲温度の少なくとも１つを維持するように構成される。或る実施形態では、環境チャンバは、気体組成、大気圧、及び内部周囲温度の少なくとも２つを維持するように構成される。或る実施形態では、気体組成は１％〜２０％のＯ２レベルを含む。或る実施形態では、気体組成は５％以下のＯ２レベルを含む。或る実施形態では、気体組成は２％以下のＯ２レベルを含む。或る実施形態では、気体組成は１％以下のＯ２レベルを含む。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバの大気圧は１５．７ＰＳＩＡ以上である。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバの大気圧は１６．７ＰＳＩＡ以上である。或る実施形態では、閉鎖環境チャンバの大気圧は１９．７ＰＳＩＡである。
また、本発明は、本明細書で記載される細胞培養インキュベータ、並びに（ｉ）細胞培養プレート、（ｉｉ）細胞培養培地、及び（ｉｉｉ）細胞画像化システムの少なくとも１つを備えた標的細胞集団を培養するためのシステムを提供する。或る実施形態では、上記システムは、細胞培養プレート、細胞培養培地、及び細胞画像化システムの少なくとも２つを備える。或る実施形態では、細胞培養プレートは本明細書に記載される細胞培養プレートである。或る実施形態では、細胞培養培地は、平板培養培地、Ｒ型長期成長培地、ＤＦ型長期成長培地、Ｄ型長期成長培地、ＭＥＦ−順化培地、及びそれらの任意の組み合せを含む。或る実施形態では、細胞画像化システムは、本明細書に記載される通りである。
参照による援用
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、各々個別の出版物、特許、又は特許出願が具体的且つ個別に参照により援用されると示される場合と同じ程度に参照により本明細書に援用される。
本発明の新規な性質は、添付の特許請求の範囲において具体的に述べられる。本発明の性質及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される実例となる実施形態を記述する下記の詳細な説明及び添付の図面に対する参照により得られるであろう。
本発明の例示的方法を示す図である。 本発明の例示的方法のワークフローを示す図である。 本発明の例示的方法のワークフローを示す図である。 フィコール試薬を使用して単核細胞層を分離するための血液試料の密度に基づく遠心分離の概要を説明する図である。 標的細胞亜集団を播種し、基材に付着することができるプロセスを説明する図である。 種々の基材の構成を説明する図である。 「逆位」層構成を有する基材における標的細胞亜集団の培養例を示す図である。 本発明のインキュベータの例を示す図である。 標的細胞亜集団のサブセットの増殖を経時的に説明する図である。 分析ソフトウェアにより作成された仮想グリッド座標システムを示す図である。 ミトコンドリアマーカー又は細胞付着分子に対して蛍光標識された抗体を使用して検出を増強するため、標的細胞亜集団をどのように標識化できるのかを説明する図である。 ソフトウェア円滑化のためのシステムを示す図である。 単一細胞を選択及び注入するモーター駆動型のマイクロマニピュレーターを示す図である。 自動化細胞培養システムの構成を示す図である。 本発明の細胞培養システムの例を示す図である。 癌細胞でスパイクした血液由来の細胞の生細胞撮影を示し、その細胞は基材上に播種されていた。 富化した標的細胞亜集団の画像を示す図である。 生細胞画像のソフトウェア支援分析を示す図である。 本発明の細胞培養インキュベータの例を示す図である。 前立腺癌を伴うヒト被験体から単離されたＣＴＣｓの顕微鏡写真を示す図である。 抗癌剤感受性試験による結果を示す図である。
発明の詳細な説明
本出願を通して、本発明の様々な実施形態が範囲フォーマットで提示される場合がある。範囲フォーマットの記載は、単に便宜上及び簡潔のためにすぎず、本発明の範囲の変更の余地のない限定と解釈されるべきではないことが理解される。したがって、範囲の記載は、具体的に開示される全ての可能性のある部分範囲、並びにその範囲内の個々の数字を有するものとする。例えば、１〜６等の範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の具体的に開示される部分範囲、また同じく、その範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５及び６を有するものとする。これはその範囲の幅にかかわらず適用される。
一般的な技術
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当該技術分野の技術に含まれる、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、遺伝学及び組換えＤＮＡの従来技術を採用する。例えば、参照により本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、及びＣＵＬＴＵＲＥ ＯＦ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬＳ：Ａ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＢＡＳＩＣ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ ＡＮＤ ＳＰＥＣＩＡＬＩＺＥＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（２０１０）を参照されたい。
定義
本明細書及び特許請求の範囲で使用される「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」の単数形は、別段の明確な指示がない限り、複数の参照を含む。例えば、「一つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）」は、その混合物を含む、複数の細胞を含む。
「抗癌剤」の用語は、一般的には、１又は複数の癌細胞と接触して、直接的又は間接的に癌細胞の増殖を阻害、停止及び／若しくは低減する、並びに／又は癌細胞を殺傷する任意の薬剤を指すことができる。１又は複数の抗癌剤を、何の抗癌剤（複数の場合がある）がその癌細胞に最も望ましい効果（複数の場合がある）を有するかを決定する目的で１又は複数の癌細胞と接触させることができる。
抗癌剤は、抗癌特性を決定する目的で１又は複数の癌細胞と接触させてもよい。「抗癌剤」の句が単数名詞、例えば、「一つの抗癌剤」又は「その抗癌剤」として記載されていたとしても、「抗癌剤」の句は、１又は複数の抗癌剤を指すものとして判断され得る。
抗癌剤は、抗癌効果を有すると仮定され得る薬剤を含むことができる。すなわち、抗癌剤は、抗癌特性が未知であるか、又は十分に特性評価されていない薬剤を含むことができる。抗癌剤を、その薬剤が任意の抗癌特性を有するかどうかを決定する目的で１又は複数の癌細胞と接触させてもよい。
抗癌剤は、癌細胞に影響を及ぼすと当該技術分野で既知の薬剤であってもよい。抗癌剤の幾つかの非限定的な例として、ホルモン除去剤、抗アンドロゲン剤／抗アンドロゲン、分化剤、抗新生物剤、キナーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、免疫剤、インターフェロン型製剤、挿入剤、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生体応答調節剤、有糸分裂阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、再吸収抑制剤、モノクローナル抗体、接着分子、成長因子、アポトーシス促進剤、アンチセンス剤、ビタミンＤ類似体、ＲＮＡｉ製剤、修飾ペプチド、酵素阻害剤、治療の副作用を改善する製剤、遺伝子治療剤及びそれらの任意の組み合せが挙げられる。
抗癌剤は、ホルモン除去剤（例えば、デスロレリン、ロイプロリド、ゴセレリン及び／又はトリプトレリン）であってもよい。ホルモン除去剤は、抗アンドロゲン剤（例えば、ビカルタミド、フルタミド、スピロノラクトン、酢酸シプロテロン、フィナステリド、デュタステリド、アビラテロン、及び／又はニルタミド）であってもよい。ホルモン除去剤は、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）であってもよい。
抗癌剤は、分化剤（例えば、ポリアミン阻害剤；カルシトリオール、ドキセルカルシフェロール、エルゴカルシフェロール、２２−オキサカルシトリオール、ジヒドロタキステロール、パリカルシトール、及びセオカルシトール等のビタミンＤ及びその類似体；ＲＡＭＢＡＳ等のビタミンＡ代謝の阻害剤、例えばリアロゾール、ＡＴＲＡ等のビタミンＡ代謝産物；レチノイン酸；レチノイド；短鎖脂肪酸；フェニルブチレート；及び非ステロイド系抗炎症剤）であってもよい。
抗癌剤は、抗新生物剤であってもよい。抗新生物剤の非限定的な例として、チューブリン相互作用剤、トポイソメラーゼ阻害剤及び製剤、アシトレチン、アルストニン、アモナフィド、アムフェチニル、アムサクリン、アンキノマイシン、抗ネオプラストン、グリシン酸アフィジコリン、アスパラギナーゼ、バッカリン、バトラシリン、ベンフルロン、ベンゾトリプト、ブロモフォスファミド、カラセミド、塩酸カルメチゾール、クロルスルファキノキサロン、クランフェヌール、クラビリデノン、クリスナトール、クラデルム、シタラビン、シトシチン、ダカルバジン、ダテリプチニウム、ジヘマトポルフィリンエーテル、ジヒドロレンペロン、ジナリン、ジスタマイシン、ドセタキセル、エリプラビン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エルゴタミン、エトポシド、エトレチナート、フェンレチニド、硝酸ガリウム、ゲンクワダフニン、ヘキサデシルホスホコリン、ＨＤＡＣ阻害剤、ホモハリントニン、ヒドロキシ尿素、イルモフォシン、イソグルタミン、イソトレチノイン、ロイコレグリン、ロニダミン、メルバロン、メロシアニン誘導体、メチルアニリノアクリジン、ミナクチビン、ミトナフィド、ミトキドン、ミトキサントロン、モピダモール、モトレチニド、Ｎ−（レチノイル）アミノ酸、Ｎ−アシル化−デヒドロアラニン、ナファザトロム、ノコダゾール誘導体、オクレオチド、オキザノシン、パクリタキセル、パンクラチスタチン、パゼリプチン、ピロキサントロン、ポリヘマトポルフィリン、ポリプレン酸、プロビマン、プロカルバジン、プログルミド、ラゾキサン、レテリプチン、スパトール、スピロシクロプロパン誘導体、スピロゲルマニウム、ストリポルジノン、スーパーオキシドジスムターゼ、テニポシド、サリブラスチン、トコトリエノール、トポテカン、ウクライン、硫酸ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビネストラミド、ビノレルビン、ビントリプトール、ビンゾリジン、及びウィタノリドが挙げられる。
抗癌剤は、キナーゼ阻害剤であってもよい。キナーゼ阻害剤の非限定的な例として、ｐ３８阻害剤；ＣＤＫ阻害剤；ＴＮＦ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤；セレコキシブ、ロフェコキシブ、パレコキシブ、バルデコキシブ及びエトリコキシブを含むＣＯＸ−２阻害剤；ＳＯＤ模擬体；及びαｖβ３阻害剤が挙げられる。
抗癌剤は、代謝拮抗剤であってもよい。代謝拮抗剤の非限定的な例として、
５−ＦＵ−フィブリノーゲン、アカンサス葉酸、アミノチアジアゾール、ブレキナールナトリウム、カルモフール、シクロペンチルシトシン、リン酸ステアリン酸シタラビン、シタラビン複合体、デザグアニン、ジデオキシシチジン、ジデオキシグアノシン、ジドックス、ドキシフルリジン、ファザラビン、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、５−フルオロウラシル、Ｎ−（２’−フラニジル）−５−フルオロウラシル、必須アミノ酸の阻害剤、イソプロピルピロリジン、メトベンザプリム、メトトレキサート、ノルスペルミジン、オルニチン脱炭酸阻害剤、ペントスタチン、ピリトレキシム、プリカマイシン、チオグアニン、チアゾフリン、トリメトレキサート、チロシンキナーゼ阻害薬、及びウリシチンが挙げられる。
抗癌剤は、アルキル化剤であってもよい。アルキル化剤の非限定的な例として、アルド−ホスファミド類似体、アルトレタミン、アナキシロン、ベストラブシル、ブドチタン、カルボプラチン、カルムスチン、クロルアンブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シプラタート、ジフェニルスピロムスチン、二白金細胞増殖抑制剤、エルムスチン、リン酸エラムスチンナトリウム、フォテムスチン、ヘプスルファム、イフォスファミド、イプロプラチン、ロムスチン、マフォスファミド、ミトラクトール、オキサリプラチン、プレドニムスチン、ラニムスチン、セムスチン、スピロムスチン、タウロムスチン、テモゾロミド、テロキシロン、テトラプラチン、及びトリメラモールが挙げられる。
抗癌剤は、抗生物質であってもよい。抗生物質の非限定的な例として、アクラルビシン、アクチノマイシンＤ、アクチノプラノン、アドリアマイシン、アエロプリシニン誘導体、アムルビシン、アントラサイクリン、アジノマイシン−Ａ、ビスカベリン、硫酸ブレオマイシン、ブリオスタチン−１、カリケマイシン、クロモキシマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジトリサルビシンＢ、ドキソルビシン、ドキソルビシン−フィブリノーゲン、エルサミシン−Ａ、エピルビシン、エルブスタチン、エソルビシン、エスペラミシン−Ａ１、エスペラミシン−Ａ１ｂ、フォストリエシン、グリドバクチン、グレガチン−Ａ、グリンカマイシン、ヘルビマイシン、イダルビシン、イルジン、カズサマイシン、ケサリロジン、メノガリル、マイトマイシン、ネオエナクチン、オキサリシン、オキサウノマイシン、ペプロマイシン、ピラチン、ピラルビシン、ポロスラマイシン、ピリンダニシンＡ、ラパマイシン、リゾキシン、ロドルビシン、シバノミシン、シウェンマイシン、ソランギシン−Ａ、スパルソマイシン、タリソマイシン、テルペンテシン、スラジン、トリクロザリンＡ、及びゾルビシンが挙げられる。
抗癌剤はステロイド、コルチコステロイド、又はグルココルチコイドであってもよい。ステロイドの非限定的な例として、エプレレノン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、及びデキサメタゾンが挙げられる。
抗癌剤は酵素阻害剤であってもよい。酵素阻害剤は、イミダゾール、及びアゾール、並びに／又は抗真菌剤（例えば、ケトコナゾール）であってもよい。
抗癌剤は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、抗ガン活性を有する場合がある。モノクローナル抗体の非限定的な例として、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブ、チウキセタン、トシツモマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、及びオファツムマブが挙げられ得る。
抗癌剤は、アンチセンス剤であってもよい。アンチセンス剤の幾つかの非限定的な例として、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（商標）（オブリメルセン）、Ａｆｆｉｎｉｔａｋ（ＩＳＩＳ ３５２１）、ＩＳＩＳ １１２９８９（ＯＧＸ ０１１）、ＩＳＩＳ ２３７２２、ＡＰ １２００９、ＧＥＭ ２３１、ＧＥＭ ２４０、ＩＧＦ−１Ｒ／ＡＳ ＯＤＮ、ＭＧ９８、ＬＥｒａｆＡＯＮ、Ｋｉ−６７アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＧＴＩ−２０４０、ＩＳＩＳ ２５０３、及びＡＰＩ １０１４が挙げられ得る。
抗癌剤は、ペプチド及び／又は改変ペプチドであってもよい。ペプチド又は改変ペプチドは、リガンドであってもよい。ペプチド及び／又は改変ペプチドは、阻害剤であってもよい。ペプチド及び／又は改変ペプチドは、ワクチンであってもよい。ペプチド及び／又は改変ペプチドは、免疫応答を惹起することができる。免疫応答は、癌細胞に対するＴ細胞応答であってもよい。ペプチド及び／又は改変ペプチドは、抗癌活性を有してもよい。
抗癌剤は、抗ガン活性を有するＲＮＡｉ治療剤であってもよい。
抗癌剤は、癌治療の副作用を改善する薬剤であってもよい。治療の副作用を改善する薬剤は、利尿剤、止痛剤、鎮痛剤、抗炎症剤、エプレレノン、プレドニゾン、プロトンポンプ阻害剤、Ｈ２受容体拮抗薬、脂質低下薬、抗吸収薬、抗精神病薬、及び／又はデキサメタゾンであってもよい。
抗癌剤の他の非限定的な例として、アセマンナン、アクラルビシン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アルトレタミン、アミフォスチン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンセスチム、ベキサロテン、ブロクスウリジン、カペシタビン、セルモロイキン、セトロレリックス、クラドリビン、クロトリマゾール、ダクリズマブ、デクスラゾキサン、ジラゼプ、ドコサノール、ドキシフルリジン、ブロモクリプチン、カルムスチン、シタラビン、ジクロフェナック、エデルフォシン、エドレコロマブ、エフロルニチン、エミテフール、エキセメスタン、エクシスリンド（ｅｘｉｓｕｌｉｎｄ）、ファドロゾール、エリスロポエチン、フィルグラスチム、フィナステリド、リン酸フルダラビン、フォルメスタン、フォテムスチン、硝酸ガリウム、ゲムシタビン、グリコピン、ヘプタプラチン、イバンドロン酸、イミキモド、イオベングアン、イリノテカン、イルソグラジン、ランレオチド、レフルノミド、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レトロゾール、リアロゾール、ロバプラチン、ロニダミン、マソプロコール、メラルソプロール、メトクロプラミド、ミフェプリストン、ミルテフォシン、ミリモスチム、ミトグアゾン、ミトラクトール、モルグラモスチン、ナファレリン、ナルトグラスチン、ネダプラチン、ニルタミド、ノスカピン、オプレルベキン、オサテロン、オキサリプラチン、パミドロン酸、ペガスパルガーゼ、ポリ硫酸ペントサンナトリウム、ペントスタチン、ピシバニール、ピラルビシン、ポルフィマーナトリウム、ラロキシフェン、ラルチトレキセド、ラスブリケース、リツキシマブ、ロムルチド、サルグラモスチン、シゾフィラン、ソブゾキサン、ソネルミン、スラミン、タソネルミン、タザロテン、テガフール、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド、テトラクロロデカオキシド、サリドマイド、トロンボポエチン、チマルファシン、チロトロピンアルファ、トポテカン、トレミフェン、トラスツズマブ、トレオスルファン、トレチノイン、トリロスタン、トリメトレキサート、ウベニメックス、バルルビシン、ベルテポルフィン及びビノレルビンが挙げられる。
「生体試料」の用語は、一般的には、生物学的実体から単離された試料又は部分を指す。生体試料は全体の性質を指してもよく、例えば、限定されないが、体液、分離された腫瘍検体、培養細胞、及びそれらの任意の組み合せが挙げられる。生体試料の例は、限定されないが、血液、血清、血漿、鼻腔スワブ又は鼻咽頭洗浄液、唾液、尿、胃液、脊髄液、涙、便、粘液、汗、耳垢、油、腺分泌物、脳脊髄液、組織、精液、膣分泌液、腫瘍組織由来の間質液、眼液、脊髄液、咽頭スワブ、息、髪、爪、皮膚、生検、腫瘍、胎盤液、羊水、臍帯血、リンパ液、腔液、喀痰、膿、細菌叢、胎便、母乳及び／又は他の排泄物が挙げられ得る。上記試料は、鼻咽頭洗浄液を含んでもよい。被験体の組織試料の例として、限定されないが、結合組織、筋肉組織、神経組織、上皮組織、軟骨、癌性試料（例えば、腫瘍試料）又は骨が挙げられ得る。上記試料は、ヒト又は動物から提供されてもよい。上記試料は、哺乳動物、脊椎動物、例えば、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物又はペットから提供されてもよい。上記試料を生体又は死体から採取してもよい。上記試料は被験体から採取した新鮮なものであってもよく、前加工、保存、及び／又は輸送の何らかの形態を経たものであってもよい。
「体液」は、被験体に由来する流体又は分泌物を指す場合がある。体液の例として、例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿、胃液、脊髄液、涙、粘液、汗、油、腺分泌物、脳脊髄液、精液、膣分泌液、腫瘍組織由来の間質液、眼液、脊髄液、胎盤液、羊水、臍帯血、リンパ液、腔液、胎便、母乳、骨髄、胸膜液、リンパ液及び／又は他の排泄物が挙げられる。体液は、複雑で不均一細胞集団を含むことができ、ＣＴＣｓ、ＣＳＣｓ、ＨＳＣｓ及び／又はＥＰＣｓ等の細胞種を含有してもよい。場合によっては、体液は、１種より多い体液の混合物であってもよい。
「癌」の用語は、一般的には、細胞の制御されていない、異常な成長を特徴とする疾患を指す。場合によっては、癌は拡散する可能性がある。本明細書に記載されるように、「癌」は新生物又は腫瘍を包含し得る。
「癌幹細胞（ＣＳＣｓ）」は、一般的には、自己再生できる癌細胞のサブセットを指す。ＣＳＣｓは、一般的には、その持続的成長を担う少数の腫瘍を含み、新たな腫瘍をもたらすことによって転移を担う場合がある。ＣＳＣｓは、同じ腫瘍に由来する他の細胞と異なる細胞マーカーを発現することができ、治療耐性に寄与し得る。
「細胞亜集団」の用語は、一般的には、より大きく不均一細胞集団に見出され得る同様の種類の細胞の分類を指す。細胞亜集団の非限定的な例として、前癌細胞、幹細胞、胎児幹細胞、未分化幹細胞、胎児細胞、骨髄細胞、前駆細胞、泡沫細胞、間葉細胞、上皮細胞、上皮前駆細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）、子宮内膜細胞、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）、トロホブラスト、癌細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）、癌幹細胞（ＣＳＣｓ）、赤血球、白血球、免疫系細胞、及び結合組織細胞、並びにそれらの任意の組み合せが挙げられ得る。
「循環腫瘍細胞」（ＣＴＣｓ）は、一般的には、血液血管構造及び／又はリンパ系を循環できる原発腫瘍に起因する癌細胞を指す。
細胞を「培養すること」及び「インキュベートすること」の用語は、本明細書では同義的に使用され、一般的には、細胞を制御された条件下で成長させるプロセスを指す。上記条件は、培養される細胞の種類に応じて変化し得る。
本明細書で使用される「初代細胞」の用語は、一般的には、生体組織（例えば、生検）により得られ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長（例えば、培養）用に樹立された細胞を指す。
「細胞形態学」又は「形態学的特性」の用語は、サイズ、形状、又は特定の特徴の存在若しくは不在等の細胞の観察可能な物理的特性を指すため使用され得る。
血管内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）は、一般的には、内皮細胞に分化する能力を有する細胞の集団を指す。
富化の用語は、一般的には、細胞の混合物中に存在する細胞の総数に対する、存在する標的細胞亜集団の細胞数の比率を増加することを指す。富化は、例えば、標的細胞亜集団を捕捉することにより、又は標的細胞亜集団の増殖（すなわち、繁殖）により、又はそれらの組み合せにより生じ得る。
造血幹細胞（ＨＳＣｓ）は、一般的には、異なる血液細胞種をもたらすことができる多能性幹細胞を指す。
不均一細胞集団は、一般的には、２以上の細胞種の混合物を指す。不均一細胞集団の例として、体液、生物標本、分離された腫瘍標本、培養細胞、及びそれらの任意の組み合せが挙げられ得る。
ヒト血清は、一般的には、ヒトに由来する体液を指し、それにより、遺伝物質の大半が除去され、体液は、主に、例えば、水、酵素、代謝産物、成長因子、シグナル伝達ペプチド及び他の宿主に生来的なタンパク質を含む。ヒト血清の供給源の或る非限定的な例として、末梢血から採取した血清、間質液、細胞内液、及び／又は細胞透過液が挙げられる。
細胞の動態学的特性は、一般的には、細胞が経時的に運動、侵入、及び／又は分裂する能力を指す。
本明細書で使用される顕微操作は、一般的には、単一細胞を取り扱う任意の方法を記載する。典型的な顕微操作システムとして、例えば、ジョイスティック操作が付加された倒立顕微鏡、電動顕微操作プラットフォーム、マイクロピペッター又はレーザ捕獲顕微解剖が挙げられ得る。
「富化培地」及び「細胞培養培地」の用語は、本明細書で同義的に使用され、一般的には、標的細胞亜集団の富化が達成され得るように、細胞に栄養を供給するため使用することができる、その中に細胞を浸漬し、インキュベートする溶液を指す。富化培地は、細胞分裂を増強することができる具体的な上流リガンドに基づくシグナル伝達キューを含有してもよい。富化培地の正確な組成は、捕捉され、富化される細胞の種類に応じて変化し得る。
被験体は、一般的には生物を指す。被験体は、動物であってもよい。動物の例として、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル及びチンパンジー等の実験動物、イヌ及びネコ等の家畜、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の農業用動物、及びクマ、パンダ、ライオン、トラ、ヒョウ、ゾウ、シマウマ、キリン、ゴリラ、イルカ、及びクジラ等の野生動物が挙げられる。
本明細書で使用される「基材」は、一般的には、不均一細胞集団からの標的細胞亜集団の富化、回復、捕捉及び／又は増殖を高めることができる基材を指す。上記基材の正確な組成を、具体的な種類の標的亜集団の細胞の富化について適合できる。上記基材は、単層又は多層を含んでもよい。
「ベクター」の用語は、一般的には、自己複製し得るか、それをし得ない核酸分子を指し、これは、挿入された核酸分子を宿主細胞へと及び／又は宿主細胞間を輸送する。上記用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡの細胞への挿入に対して主に機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製に主に機能するベクターの複製、並びにＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳に機能する発現ベクターを含む。また、１より多い上記機能を提供するベクターも含まれる。
「発現ベクター」の用語は、一般的には、適切な宿主細胞に導入された場合に、ポリペプチド（複数の場合がある）に転写され翻訳され得るポリヌクレオチドを指す。「発現ベクター」は、通常、所望の発現産物を生じるように機能できる発現ベクターを含む好適な宿主細胞を含意する。
腫瘍の用語は、一般的には、異常な細胞成長及び分裂の結果生じる異常な組織質量を指す。腫瘍は癌性の場合がある。
治療若しくは治療する、軽減する若しくは改善するという用語は、一般的には同義的に使用され、治療利益を達成するため、既存の疾患、障害、若しくは状態の治癒若しくはその重症度を軽減するため、及び／又は予防利益を達成するため、疾患、障害若しくは状態の発症の可能性若しくは発生の重症度の阻止若しくは軽減のため物質を投与することを意味する場合がある。
本明細書で使用される治療効果又は治療利益は、一般的には、ヒト又は他の動物における疾患の治癒、緩和、改善、又は予防、或いはヒト又は動物の身体又は精神的な健康を増強することを含むがそれらに限定されない、生理学的効果を指す。治療利益は、治療される根底にある障害の治療、又は被験体がなおも根底にある障害に苦しめられる可能性があるにもかかわらず、被験体において改善が観察されるように、根底にある障害と関連する生理学的症状の１又は複数の治療を意味する場合がある。
「制御可能に連結された」の用語は、一般的には、「制御可能に連結された」と記載される２以上の成分が、それらの意図される方式で機能することを可能とする関係での並列を指す。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」の用語は、本明細書では同義的に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はその類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、また、既知又は未知の任意の機能を果たしてもよい。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子フラグメントのコーディング領域又は非コーディング領域、連鎖分析から規定される遺伝子座（単数の場合がある）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列のＤＮＡ、任意の配列のＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体等の改変ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリマーの集合前又はその後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識化成分との複合等による重合化の後に更に改変されてもよい。
総括
本発明は、不均一細胞集団から１又は複数の標的細胞亜集団を検出し、単離し、捕捉し、富化し、培養し、及び／又は特性評価することができる方法、装置、組成物、及びキット、また同様にそれらの適用を提供する。標的細胞亜集団は、任意の種類の生存細胞を含み得る。生存細胞は、付着特性を備え得る。付着特性は、例えば、細胞外マトリクス、他の細胞等の固体又は半固体の表面、又は本明細書に記載される基材に付着する細胞の能力により証明され得る。付着特性を有する細胞は、１又は複数の接着分子を発現し得る。接着分子の例として、例えば、とりわけ、セレクチン、インテグリン、カドヘリン、シンデカン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ｃｄ１３３、ｃｄ４４、ｃｄ１６６が挙げられ得る。接着分子の発現は、遺伝子発現研究、免疫組織化学、免疫ブロッティング等を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の手段により判定することができる。標的細胞亜集団は、任意の種類の初代細胞を含んでもよい。初代細胞は、例えば、とりわけ、初代ニューロン、初代グリア、初代心筋細胞、初代肝細胞、初代肺細胞、初代軟骨細胞、初代内皮細胞、初代線維芽細胞、初代胃腸細胞、初代免疫細胞、初代ケラチノサイト、初代骨芽細胞、初代膵臓細胞、初代前立腺細胞、初代腎細胞、初代網膜細胞、初代筋細胞、初代セルトリ細胞、胎児細胞等の哺乳動物の初代細胞であってもよい。標的細胞亜集団は、高い増殖特性及び再生特性を有する。標的細胞亜集団の或る非限定的な例として、例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）、癌幹細胞（ＣＳＣｓ）、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）、血管内皮前駆体細胞（ＥＰＣｓ）、胎児細胞、幹細胞、免疫細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、癌細胞、白血球、成人幹細胞、初代細胞（例えば、本明細書に記載される初代細胞）、固形腫瘍に由来する細胞、及び／又は上皮前駆細胞が挙げられる。或る実施形態では、標的細胞亜集団は、ＣＴＣｓ、ＣＳＣｓ、ＥＰＣｓ、幹細胞、上皮細胞及び癌細胞から選択される。標的細胞亜集団は、ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓを含んでもよい。ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓは、腫瘍開始細胞であってもよい。ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓは、転移性細胞であってもよい。標的細胞亜集団が固形腫瘍に由来する細胞を含む場合では、細胞は、固形腫瘍の形態のままであってもよい（例えば、本明細書に記載される方法、装置、組成物、及びキットを固形腫瘍生検を培養する目的に使用することができる）。或る実施形態では、標的細胞亜集団は、不死化細胞株由来の細胞を含まない。或る実施形態では、標的細胞亜集団は、白血球を含まない。標的細胞亜集団は、初代標的細胞亜集団であってもよい。
本明細書の例証は、主に血液からの細胞亜集団の単離及び富化によるものであるが、本発明は、任意の不均一細胞集団からの細胞亜集団の単離及び富化に容易に適用できることが更に認識されるであろう。かかる例として、体液、体液の混合物、分離された腫瘍試料、固形組織試料（例えば、固形腫瘍試料）、細胞培養物、又はそれらの任意の組み合せが挙げられ得る。更に、体液、分離された腫瘍試料、及び細胞培養物は、１若しくは複数の被験体に由来してもよく、又はそれらの組み合せであってもよい。
図１は、本開示による方法の例を示す。図１は、本発明の実施形態による標的細胞亜集団の捕捉及び富化のための例示的プロセス１００を示す。プロセス１００は、被験体１０５から試料１１０を得ること、試料１１５の１又は複数の成分を分離して不均一細胞集団を得ること、不均一細胞集団を基材１２０と接触させること（例えば、不均一細胞集団を基材上に播種すること、不均一細細胞集団を標的細胞亜集団の成長を十分可能とする条件下でインキュベートすることであって、ここで、標的細胞亜集団の成長を十分可能とする上記条件が装置１３０の富化培地１２５と共にインキュベートすることを含み得る、インキュベートすること、時間１３５に亘って試料をインキュベートすることであって、ここで、時間１３５は細胞分裂が起こるのに十分である、インキュベートすること、を含む。細胞を画像化システム１４０（例えば、顕微鏡）を使用してモニターしてもよい。画像化システムを用いるモニタリングによるデータを分析ソフトウェア１４５を使用して加工することができる。分析ソフトウェア１４５は、結果１５０のアウトプットを作成できる。細胞及び／又は結果１５０を疾患状態１５５の診断、予後又はモニタリングに使用して、被験体１６０の治療計画を指示することができ及び／又は研究１６５に使用できる。
図２Ａ及び図２Ｂは、本発明の例示的方法のワークフローを示す。例示的方法は、被験体、例えば、ヒト被験体に由来する生体試料を得る工程２１０を含むことができる。或る実施形態では、生体試料は体液試料（例えば、血液試料）である。例示的方法は、血液から全ての有核細胞を単離するため血液試料のフィコールに基づく遠心分離の後の工程２２０を含むことができる。その後、有核細胞を、基材上に直接播種してもよい。例示的方法は、通例の培養条件で細胞を培養する後の工程２３０を含むことができる。工程２３０は、急速に増殖する癌細胞を同定するためにタイムラプス撮影を含んでもよい。例示的方法は、タイムラプス撮影画像を分析するためのソフトウェア（例えば、コンピュータ可読媒体）を使用する後の任意工程２４０を含んでもよい。分析は、癌細胞増殖速度を測定することを含んでもよい。例示的方法は、更なる分子／細胞分析及び／又は画像化のため、急速に増殖する細胞を単離する及び／又は急速に増殖する細胞を成長させる工程２５０を更に含んでもよい。単離は、顕微操作器具の使用を含んでもよい。或る実施形態では、更なる分子分析及び細胞分析は、エキソームシーケンシング及び／又はトランスクリプトーム分析を含む。例示的方法は、例えば、新たなバイオマーカー及び／又は１若しくは複数の癌治療のための治療標的の同定に有用な可能性がある。
被験体の例
被験体１０５（図１に示される）は、一般的には生体である。被験体は、１又は複数の標的細胞亜集団を含むことができる。被験体が標的細胞亜集団を含むかどうかわからない場合がある。或る実施形態では、本開示の方法及び装置は、被験体が１又は複数の標的細胞亜集団を含むかどうかを決定するために使用されてもよい。例えば、被験体を、１又は複数の標的細胞亜集団の存在又は不在についてスクリーニングしてもよい。
被験体は、癌を有する被験体、癌から回復段階にある被験体、癌に対する治療を行っている被験体、癌のスクリーニングを行っている被験体、癌を有することが疑われる被験体、癌の存在について試験されている（例えばスクリーニングされている）被験体、癌を有しない被験体、自己免疫疾患を有する被験体、自己免疫疾患を有することが疑われる被験体、骨髄移植用に細胞を提供する被験体、骨髄細胞を受ける被験体、心血管疾患を有する被験体、心臓発作又は脳卒中を経験した被験体、将来心臓発作又は脳卒中を経験することが疑われる被験体、創傷治癒の治療を行っている被験体、創傷治癒に対する治療を必要とし得る被験体、及びそれらの任意の組み合せであってもよい。上記被験体は、任意疾患を有するか、又はそれを有することが疑われるものであってもよいと理解される。
癌は、例えば、腫瘍、急性白血病、急性ｔ細胞白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、又は慢性リンパ性白血病、真性多血症等の白血病、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫又は非ホジキンリンパ腫等のリンパ腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、リンパ管肉腫等の癌腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、去勢抵抗性前立腺癌を含む前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支、癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、子宮内膜癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、又は腎臓癌であってもよい。
自己免疫疾患は、個体自身の組織から生じそれを対象とする疾患又は障害、又はその共分離若しくは兆候若しくはそれから生じる状態であってもよい。自己免疫疾患又は障害の例として、限定されないが、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、関節炎、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性の血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性の高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫蕁麻疹、軸索及び神経ニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素疾患、先天性心臓ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ疾患、混合性クリオグロブリン血症、神経障害、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維筋痛症、線維化性肺胞炎、ジャイアント細胞動脈炎（側頭動脈炎）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎（ＧＰＡ）、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節リポタンパク質、封入体筋炎、インスリン依存性糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、Ｉ型糖尿病、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ミュシャ−ハーバーマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌性小児自己免疫神経精神障害）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリーロンバーグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（周辺部ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン性皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ−ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、小水疱水疱性の皮膚病、白斑、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
心血管疾患（ＣＶＤ）は、心臓及び全身の欠陥構造に関与する多くの障害によって現れ得る。或る非限定的な例として、動脈瘤、狭心症、アテローム性動脈硬化症、脳血管障害（例えば、脳卒中）、脳血管疾患、うっ血性心不全、冠動脈疾患、心筋梗塞、及び末梢血管疾患が挙げられ得る。
被験体は、本明細書に開示されるいずれの疾患も伴わない健康な被験体であってもよい。
生体試料の例
生体試料１１０（図１に示される）は、被験体から取得され得る。１又は複数の試料を被験体から１又は複数の時間点で被験体から取得してもよい。単一の試料を被験体から一度し採取することができる。複数の試料を或る期間に亘って被験体から採取することができる。
生体試料の例を本明細書に記載する。生体試料１１０は、例えば、任意の体液、生体標本、固形組織試料、細胞培養物、細胞の不均一集団、又はそれらの任意の組み合せであってもよい。上記試料の供給源は既知であってもよい。上記試料の供給源は不明であってもよい。試料が採取される被験体の同一性は、試料の同一性と関連してもよい。被験体の同一性の関連は、介護者により入手できる。
生体試料は体液試料を含んでもよい。体液試料の例を本明細書に記載する。或る実施形態では、体液試料は血液である。血液（例えば、末梢血）を、当業者に既知の任意の手段、例えば、静脈穿刺、動脈穿刺及び／又は臍帯からの単離により被験体から得ることができる。生体試料の容量は、例えば、およそ１ｍＬ〜１０ｍＬの間、およそ５ｍＬ〜２０ｍＬの間、又はおよそ１５ｍＬ〜３５ｍＬの間の容量範囲であってもよい。試料容量は、およそ４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、８ｍＬ、９ｍＬ、１０ｍＬ、１２ｍＬ、１５ｍＬ、１７ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ又は３５ｍＬの容量であってもよいが、他の容量も考慮される。より大量の血液試料を採取することができ、その大量の試料の一部を使用することができる。
生体試料１１０を、同じ被験体又は異なる被験体に由来する１又は複数の生体試料（例えば、細胞）と混合してもよい。生体試料１１０は、例えば、１又は複数の細胞によりスパイクされてもよい。試料への細胞のスパイキングは、陽性対照若しくは陰性対照を提供することができ、及び／又は標的細胞亜集団の富化を改善し得る。一例に過ぎないが、生体試料１１０を不死化細胞株に由来する細胞でスパイクすることができる。不死化細胞株は、癌（例えば、ヒト癌）に由来するものであってもよい。腫瘍又は癌細胞株の例は、例えば、ＡＴＣＣ、国立癌研究所、及び他の供給源を通して利用可能である。既知の不死化細胞株を使用して試料をスパイクすることができる。試料をスパイクするのに使用できる既知の不死化細胞株の或る非限定的な例として、ＨｅＬａ、ＬｎＣＡＰ、Ｆ４７Ｄ、ＴＨＰ−１、Ｕ８７、ＳＨＳＹ５Ｙ、Ｓａｏｓ０２、Ｖｅｒｏ、ＤＵ１４５、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８、ＰＣ３、ＧＨ３、ＰＣ１２、ＭＣ３Ｔ３、２９３−Ｔ、ＨＬ−６０、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＳＷ６２０、ＵＡＣＣ−６２、ＨＣＣ２９９８、ＵＡＣＣ−２５７、ＳＮ１２Ｃ、ＣＡＫＩ−１、ＡＣＨＮ、ＬＯＸＩＭＶＩ、ＥＫＶＸ、Ａ５４９、７８６−０、Ｈｓ−５７８−Ｔ、ＲＰＭＩ−８２２６、ＳＲ Ｍ１４、Ａ４９８、ＯＶＣＡＲ−４、ＮＣＩ−ＡＤＲ−ＲＥＳ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＯＰ−９２、ＤＵ−１４５、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨＴ−２９、ＩＧＲＯＶ−１、ＳＦ２９５、ＴＫ１０、ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＳＫ−ＯＶ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｔ４７Ｄ、ＳＮＢ７５、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＨＯＰ−６２、ＲＸＦ３９３、ＣＯＬＯ−２０５、ＳＦ２６８、Ｕ０３１、ＨＣＴ−１５、ＢＴ−５４９、Ｕ２５１、ＯＶＣＡＲ−５、ＳＦ５３９、Ｍａｌｍｅ−３Ｍ、ＫＭ１２、ＨＣＴ−１１６、ＳＮＢ１９、ＯＶＣＡＲ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＭＯＬＴ−４、ＯＶＣＡＲ−８、Ｋ−５６２が挙げられ得る。
生体試料１１０を、１又は複数の印をつけた細胞でスパイクすることができる。本明細書で使用される「印をつけた細胞」の用語は、一般的には、検出可能な標識を含む細胞を指す。印をつけた細胞は、対照として作用することができる。例えば、印をつけた細胞を使用して、細胞捕捉の有効性、細胞増殖の有効性を判定することができ、細胞増殖の速度を決定することができ、又はそれらの任意の組み合せをすることができる。印をつけた細胞は、遺伝子又はタンパク質を発現する形質転換細胞であってもよい。印をつけた細胞は、印をつけた抗体に結合し得る細胞表面抗原を発現する細胞であってもよい。
検出可能な標識の或る非限定的な例として、例えば、染料、蛍光マーカー、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）等）、生物発光タンパク質（例えばルシフェラーゼ）、タグ付けしたタンパク質、放射性分子、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、蛍光複合分子（例えば、デキストラン、β−ガラクトシダーゼ）、及び／又は細胞株若しくは動物に対する遺伝的変更（例えばｃｒｅ−ｌｏｘリコンビナーゼ系、ＦＬＰリコンビナーゼ等）が挙げられる。
或る実施形態では、試料を追加の細胞でスパイクしない。
試料の任意の分離
試料１１５の１又は複数の成分を分離する工程（図１に示される）は、その本来の試料の濃度に対して１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、２，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、１，０００，０００倍、２，０００，０００倍、５，０００，０００倍、１０，０００，０００倍、２０，０００，０００倍、５０，０００，０００倍、１００，０００，０００倍、２００，０００，０００倍、５００，０００，０００倍、１，０００，０００，０００倍、２，０００，０００，０００倍、又は５，０００，０００，０００倍の因数で標的細胞亜集団の濃度を増加することができる。また、試料１１５の１又は複数の成分を分離する工程は、本来の試料の容量を減少することにより（例えば、流体の除去により）細胞亜集団の濃度を増加することができる。一例に過ぎないが、亜集団の細胞を含む１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、５０ｍＬ、又は１００ｍＬの総容量より多い体液試料（例えば、血液試料）を、それぞれ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、５ｍＬ、又は１０ｍＬ未満の総容量の溶液へと濃縮することができる。
標的亜集団細胞を含む試料の穏やかな取り扱いを使用して細胞に対するいかなる機械的損傷も軽減する。穏やかな取り扱いは、試料中の少数の亜集団細胞及び／又は核酸若しくは巨大分子の完全性を保護するはたらきをし得る。標的細胞亜集団の完全性は、後の富化工程に重要な可能性がある。
原試料が体液（例えば、全血）である場合の例では、試料１１５の１又は複数の成分を分離する工程は、参照により本明細書に援用されるＦｕｓｓ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００９）Ｃｈａｐｔｅｒ ７：Ｕｎｉｔ７．１に記載されるフィコール試薬の使用を含むことができる。図３は、フィコール試薬（例えば、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ）を使用して血液成分を分離する例示的方法３００を示す。例示的方法３００は、フィコール試薬３１０の最上部に全血試料３０５を重ねることを含む。例示的方法は、全血／フィコール試料を密度に基づく遠心分離３３５に供することを更に含む。遠心分離は、全血／フィコール試料を異なる層、すなわち（１）赤血球を含む無核細胞層３１５、（２）フィコール試薬層３２０、（３）例えば、白血球（ＷＢＣｓ）及び他の有核細胞（例えば、ＣＴＣｓ、ＣＳＣｓ、ＨＳＣｓ、ＥＰＣｓ等）を含む有核細胞層３２５、並びに（４）血漿層３３０への分離を生じることができる。標的細胞亜集団の捕捉のため、有核細胞層を単離し、基材３４０に暴露することができる。
また、試料１１５の１又は複数の成分を分離する工程は、１又は複数のサイズに基づく分離技術を使用して達成され得る。サイズに基づく分離技術の或る非限定的な例として、サイズに基づく分離モジュール、例えば、濾過モジュール、篩、マトリクス、障害からの側方変異等の使用を含んでもよい。サイズに基づく分離は、血液から赤血球及び血小板を除去することができる（例えば、参照により本明細書に援用される、国際公開第２００４／１１３８７７号）。障害物又はギャップのネットワークを使用して粒子を分離することができる（例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００４０１４４６５１号）。或る実施形態では、亜集団細胞の分離及び／又は富化は、サイズに基づく分離モジュールを含まない。
サイズに基づく分離モジュールは、ギャップのネットワークを形成する障害物の１又は複数のアレイを含んでもよい。その障害物は、粒子の流体力学的サイズに基づいて異なる方向又はアウトレットへとギャップのアレイ／ネットワークを流れるように粒子を向けるため構成することができる。例えば、所定のサイズ（例えば、８ミクロンより大きい）を有する有核細胞を含む血液試料を他の血液成分と別のアウトレットへと向けることができる。
ギャップ、障害物、及び障害物の連続する各列の間の周期におけるオフセットを調整することにより所定のサイズより小さい又は大きい細胞を分離するようにアレイを構成することができる。障害物又は障害物の間のギャップは、長さ１０ミクロン、２０ミクロン、５０ミクロン、７０ミクロン、１００ミクロン、１２０ミクロン、１５０ミクロン、１７０ミクロン、又は２００ミクロン以下、又は長さ約２ミクロン、４ミクロン、６ミクロン、８ミクロン又は１０ミクロンである。サイズに基づく分離のためのアレイは、１０、２０、５０、１００、２００、５００、又は１０００よりも多い列に配置された１００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００又は１００，０００よりも多い障害物を含むことができる。障害物の第１列の障害物は、前の列の障害物の５０％以下の周期の前の（すなわち、上流の）障害物の列からのオフセットとなり得る。障害物の第１列の障害物は、前の列の障害物の４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％又は１０％以下の周期前の障害物の列からのオフセットとなり得る。第１列の障害物と第２列の障害物の間の距離は、１０ミクロン、２０ミクロン、５０ミクロン、７０ミクロン、１００ミクロン、１２０ミクロン、１５０ミクロン、１７０ミクロン又は２００ミクロン以下であってもよい。特定のオフセットは、持続的（例えば、複数の列に対して繰り返す）又は非連続的であってもよい。分離モジュールは、互いに連続するように流動的に連結された複数の別々のアレイの障害物を含むことができる。障害物の各アレイは、持続的なオフセットを有してもよい。しかしながら、後の（すなわち、下流の）アレイの障害物は、各々、前（すなわち、上流）のオフセットとは異なるオフセットを有する。後のアレイの障害物は、前のアレイの障害物よりも小さいオフセットを有する。これにより、細胞が障害物のアレイを通過していくにしたがって、分離プロセスを精密化することを可能にする。複数のアレイを連続して又は並列に（例えば、２、４、６、８、１０、２０、３０、４０、５０より多い）流体連結することができる。流体連結する分離モジュール（例えば、アレイ）は、並行して、１時間当たり少なくとも１ｍＬ、２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、２０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ又は５００ｍＬが富化モジュールを流れることができるように、又は１時間当たり少なくとも１００万個、５００万個、１０００万個又は５０００万個の細胞がソートされるか、装置を流れることができるように、試料のハイスループット分析を可能とする。
障害物を平坦な基材に連結して、ギャップのアレイを形成することができる。障害物は、前の障害物列に関して水平にシフトした各々の連続する列によって二次元のアレイを形成することができ、ここで、障害物のアレイを、第１の方向で所定のサイズよりも小さい流体力学的サイズを有する成分及び、第２の方向で所定のサイズよりも大きい流体力学的サイズを有する別の成分を対象とすることができる。一例に過ぎないが、除核細胞からの上皮細胞又は循環腫瘍細胞の富化において、所定のサイズの障害のアレイは、約６μｍ〜１２μｍ又は６μｍ〜８μｍであってもよい。障害物のアレイへの試料の流れは、アレイの見通し線に関して小さい角度（すなわち、流れ角）で並べることができる。上記アレイを注入ポンプに連結して障害物を通して試料を灌流してもよい。本明細書に記載されるサイズに基づく分離モジュールの流動条件は、最小限の損傷でアレイにより亜集団細胞をソートするようにすることができる。これにより、無傷の細胞及び無傷の核の下流分析をより効率的且つ確実にすることができる。
試料１１５の１又は複数の成分を分離する工程は、１又は複数の細胞の動態学的特性を選択的に阻害する１又は複数の捕捉技術の使用を含むことができる。補足技術を使用して、１又は複数の他の分離技術及び／又は富化技術と共に使用することができる。補足技術は、親和性精製を含んでもよい。標的細胞亜集団を陽性選択に基づいて、例えば、捕捉試薬に対する標的細胞亜集団の親和性に基づいて、富化することができる。
標的細胞亜集団を捕捉試薬、例えば、捕捉抗体の親和性に基づいて富化することができる。例えば、標的細胞亜集団を陽性選択試薬に対する親和性に基づいて富化することができる。陽性選択試薬は、陽性選択抗体、例えば、非標的細胞亜集団と比べて標的細胞亜集団において選択的に発現されるペプチドに対する抗体であってもよい。上記ペプチドは、細胞表面ペプチドであってもよく、そうでなくてもよい。陽性選択抗体の例として、限定されないが、とりわけ、上皮細胞付着分子（ＥＰＣＡＭ）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）、ＣＫ１９、サイトケラチン８、１８、Ｔｗｉｓｔ、ＥＧＦＲ、ＣＤ１３３、ビタミンが挙げられる。したがって、或る場合には、標的細胞亜集団（例えば、ＣＴＣｓ）をＥＰＣＡＭ抗体を使用して富化することができる。捕捉試薬（例えば、抗体）を固体又は半固体の支持体、例えば、ウェル、ビーズ、磁性ビーズ、チャンバに複合することができる。一例に過ぎないが、陽性選択による標的細胞亜集団の富化は、標的細胞が陽性選択抗体に結合するように、その上に陽性選択抗体が固定化される固体又は半固体の相と生体試料とを接触させることを含むことができる。上記方法は、試料の結合していない画分を除去すること（例えば、１又は複数の洗浄工程により）を更に含むことができる。上記方法は、結合した画分を採取することを更に含むことができる。標的細胞亜集団の富化は、その上に陽性選択試薬が固定化される固体又は半固体相の使用を必要としない場合がある。例えば、陽性選択試薬（例えば、陽性選択抗体）に対する親和性を介する富化は、フローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣＳソーティングの使用を含むことができる。或る実施形態では、標的細胞亜集団を、例えば、検出可能に標識化したＥｐＣＡＭ抗体で標識化して、ＥｐＣＡＭ＋細胞のＦＡＣＳに基づく捕捉により富化する。
標的細胞亜集団を陰性選択に基づいて、例えば、捕捉試薬、例えば捕捉抗体に対する非標的細胞亜集団の親和性に基づいて富化することができる。標的細胞亜集団は、非標的細胞亜集団と比べて補捉抗体に対してより低い親和性を有することができる。例えば、捕捉抗体は、非標的細胞亜集団において典型的に発現されるが、標的細胞亜集団においては典型的には発現されないペプチドに対する抗体であってもよい。例えば、捕捉抗体は、白血球、単球、及び／又はマクロファージにおいて選択的に発現されるペプチドに対する抗体であってもよい。陰性選択に使用することができる捕捉抗体の例として、とりわけ、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗線維芽細胞表面タンパク質抗体が挙げられ得る。一例に過ぎないが、陰性選択による標的細胞亜集団の富化は、非標的細胞が陰性選択抗体に結合するように、その上に陰性選択抗体が固定化される固体又は半固体の相と生体試料とを接触させることを含むことができる。上記方法は、生体試料の結合していない画分を採取することを更に含むことができる。標的細胞亜集団の富化は、その上に陰性選択試薬が固定化される固体又は半固体の相の使用を必要としない場合がある。例えば、陰性選択試薬（例えば、陰性選択抗体）に対する親和性を介する富化は、フローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣＳソーティングの使用を含むことができる。或る実施形態では、標的細胞亜集団を、例えば、検出可能に標識化した陰性選択抗体（例えば、ＣＤ４５抗体）で標識化し、ＣＤ４５−細胞のＦＡＣＳに基づく捕捉によって富化する。
捕捉技術は、１又は複数の捕捉分子の使用を含んでもよい。捕捉分子は、１又は複数の分析物（例えば、目的の細胞又は目的ではない細胞）の捕捉のため構成された装置であってもよい。或る一つの非限定的な例では、親和性に基づく分離分子は、細胞を補捉することができるか、又は試料の流れを可能とするように適合された障害のアレイを含むことができ、ここで、障害は、１又は複数の目的の細胞集団（例えば、標的細胞亜集団細胞、上皮細胞、有核細胞、ＣＴＣｓ、ＣＳＣｓ等）又は目的ではない分析物（例えば、一例として、白血球等の非標的細胞）に選択的に結合することができる表面結合部分を含むことができる。結合部分を障害に連結することができる。結合部分は、例えば、タンパク質（例えば、リガンド／受容体）、保持された細胞、抗体等においてハイブリダイズ可能な対応する部分を有する核酸を含むことができる。
捕捉技術は、かかる細胞又は目的ではない細胞の磁気特性又は磁位に基づいて細胞を分離及び／又は富化するため磁場を利用することができる。例えば、わずかに反磁性の（すなわち、磁場に忌避される）場合がある赤血球を、ヘモグロビンのメトヘモグロビンへの脱酸素により常磁性体（すなわち、磁場により引きつけられる）とすることができる。この磁気特性は、赤血球の物理的又は化学的処理により達成され得る。よって、目的の細胞を含む血液試料について、最初に赤血球における磁気特性を誘導し、その後、試料を磁場に通すことにより、目的の細胞から赤血球を分離することによって、目的の細胞を赤血球から分離することができる。磁場は均一であってもよく、不均一であってもよい。
標的細胞亜集団の選択的付着及び成長のためのｉｎ ｖｉｔｒｏシステム
本明細書に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏシステムは、標的細胞亜集団の選択的付着を促進することができる。標的細胞亜集団は、生存能を維持することができ、細胞の増大を経る。ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムを、例えば、標的細胞亜集団の付着及び成長を選択的に促進する条件を提供することにより標的細胞亜集団の選択的な付着及び成長を促進するように構成することができる。上記条件は、生理学的に関連のある条件（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ環境条件に似た環境条件）であってもよい。
基材の例
基材１２０（図１に示され、本明細書では「「本発明の基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、「本発明の基材（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」又は単に「基材」と同義に参照される）は、細胞の不均一な集団を含む試料から標的細胞亜集団を捕捉することができる。本発明の基材は、非標的細胞亜集団（例えば、付着性ではない、及び／又は非生存細胞）と比べて、標的細胞亜集団（例えば、付着性の、及び／又は生存細胞）の選択的な付着及び成長を促進することができる。例えば、基材は、他の種類の細胞と比べて、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）、癌細胞（ＣＳＣｓ）、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）、初代細胞、胎児細胞、幹細胞、免疫細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、癌細胞、白血球、成人幹細胞、及び／又は上皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）の選択的な付着及び成長を促進することができる。本発明の基材を、特定の種類の標的細胞亜集団の選択的な付着及び成長を促進するように構成することができる。基材は、他の種類の細胞と比べて、ＣＴＣｓ、ＣＳＣｓ、ＥＰＣｓ、幹細胞、上皮細胞、初代細胞又は癌細胞の選択的な付着及び成長を促進することができる。基材は、他の種類の細胞と比べて、ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓの選択的な付着及び成長を促進することができる。したがって、本発明の基材は、標的細胞亜集団を更に富化する場合がある。本発明の基材は、標的細胞亜集団／非標的細胞亜集団の比率を、本来の比率に対して少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、２，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、１，０００，０００倍、２，０００，０００倍、５，０００，０００倍、１０，０００，０００倍、２０，０００，０００倍、５０，０００，０００倍、１００，０００，０００倍、２００，０００，０００倍、５００，０００，０００倍、１，０００，０００，０００倍、２，０００，０００，０００倍、又は５，０００，０００，０００倍の因数で富化することができる。
基材を、標的細胞亜集団が１又は複数の明確に異なる形態学的特性をとることを可能とするように構成することができる。或る一つの非限定的な例では、１又は複数の明確に異なる形態学的特性の採用は、標的細胞亜集団を非標的細胞亜集団とは明確に異なるようにすることができる。そのようにして、基材は、１又は複数の形態学的特性に基づいて、細胞亜集団の不均一な集団から標的細胞亜集団の選択を可能とすることができる。
一例に過ぎないが、本発明の基材上に播種した後、非標的細胞亜集団の表面積と比べて大きな表面積により、ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓを他の細胞亜集団とは形態学的に明確に異なるようになる場合がある。一例に過ぎないが、本発明の基材上に播種してから約２０分〜１時間後にＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓは、基材に接触する前の細胞の直径の少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５０倍超と想定される直径で基材上に拡散する。本発明の基材と接触した後のＣＴＣ及び／又はＣＳＣの直径は、約２０μｍ以上、２５μｍ以上、３０μｍ以上、３５μｍ以上、４０μｍ以上、４５μｍ以上、５０μｍ以上、５５μｍ以上、６０μｍ以上、６５μｍ以上、７０μｍ以上、７５μｍ以上、８０μｍ以上、８５μｍ以上、９０μｍ以上、９５μｍ以上、１００μｍ以上、又は１００μｍ超であってもよい。したがって、本発明は、不均一細胞集団と本発明の基材とを接触させること、標的細胞亜集団（例えば、ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓ）の成長を可能とするのに十分な条件下で不均一細胞集団をインキュベートすること、及び標的細胞亜集団のメンバーが大きな直径を呈する場合に標的細胞亜集団のメンバーを同定することの方法を提供する。
或る実施形態では、ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓは、基材上に播種した後、非常に大きな表面積を伴う細胞質を特徴とする、「パンケーキ」様の形状を想定する。ＣＴＣ及び／又はＣＳＣの細胞質の表面積は、ＣＴＣ及び／又はＣＳＣの核の表面積よりも大きい場合がある。例えば、ＣＴＣ及び／又はＣＳＣの細胞質の表面積は、核の表面積の２倍〜４倍であってもよい。対照的に、非ＣＴＣ又は非ＣＳＣの細胞の表面積はその核の表面積の２倍未満であってもよい。本発明の基材上に播種した後のＣＴＣ及び／又はＣＳＣの表面積は、非ＣＴＣ又は非ＣＳＣの細胞の表面積の少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又は１００倍以上であってもよい。本発明の基材上に播種した後のＣＴＣ及び／又はＣＳＣの表面積は、少なくとも９００μｍ２、１０００μｍ２、１１００μｍ２、１２００μｍ２、１３００μｍ２、１４００μｍ２、１５００μｍ２、１６００μｍ２、１７００μｍ２、１８００μｍ２、１９００μｍ２、２０００μｍ２、２１００μｍ２、２２００μｍ２、２３００μｍ２、２４００μｍ２、２５００μｍ２、２６００μｍ２、２７００μｍ２、２８００μｍ２、２９００μｍ２、３０００μｍ２、３１００μｍ２、３２００μｍ２、３３００μｍ２、３４００μｍ２、３５００μｍ２、３６００μｍ２、３７００μｍ２、３８００μｍ２、３９００μｍ２、４０００μｍ２、４５００μｍ２、５０００μｍ２、５５００μｍ２、６０００μｍ２、６５００μｍ２、７０００μｍ２、７５００μｍ２、８０００μｍ２、８５００μｍ２、９０００μｍ２、９５００μｍ２、１００００μｍ２、又は１００００μｍ２超であってもよい。対照的に、本発明の基材上に播種した後の非ＣＴＣ又は非ＣＳＣの細胞の表面積は、約５００μｍ２〜７００μｍ２である。大きさの相違は、基材に細胞が付着するまで検出できない場合がある。したがって、本発明は、不均一細胞集団と本発明の基材とを接触させること、標的細胞亜集団（例えば、ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓ）の成長を可能とするのに十分な条件下で不均一細胞集団をインキュベートすること、及び標的細胞亜集団のメンバーが非標的細胞の表面積よりも大きな表面積を呈する場合に標的細胞亜集団のメンバーを同定することの方法を提供する。
ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓは、上記基材上に播種した後に１つの細胞当たり複数の核を呈する場合がある。ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０超の核を呈する。対照的に、非ＣＴＣ又は非ＣＳＣの細胞は一般的には１つの細胞当たり１つの核を呈する。したがって、本発明は、不均一細胞集団と本発明の基材とを接触させること、標的細胞亜集団（例えば、ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓ）の成長を可能とするのに十分な条件下で不均一細胞集団をインキュベートすること、及び標的細胞亜集団のメンバーが１つの細胞当たり１より多い核を呈する場合に標的細胞亜集団のメンバーを同定することの方法を提供する。
本発明の基材は、形態学的特性に基づいてＥＰＣｓを同定することを可能とし得る。ＥＰＣｓは、基材と接触すると紡錘体様の外観を形成し得る。基材と接触するＥＰＣの幅は、ＥＰＣの長さの少なくとも２倍〜５倍小さくてもよい。したがって、本発明は、不均一細胞集団と本発明の基材とを接触させること、標的細胞亜集団（例えば、ＥＰＣｓ）の成長を可能とするのに十分な条件下で不均一細胞集団をインキュベートすること、及び標的細胞亜集団のメンバーが標的細胞亜集団のメンバーの長さよりも少なくとも２倍〜５倍小さい幅を呈する場合に標的細胞亜集団のメンバーを同定することの方法を提供する。
本発明の基材は、ＨＳＣｓを形態学的特性に基づいて同定されることを可能とし得る。ＨＳＣｓは、本発明の基材と接触すると丸い、緻密な外観を形成する。場合によっては、基材と接触しているＨＣＳｓの直径は、２０μｍを超えない場合がある。場合によっては、播種後のＨＳＣｓの直径は、培養培地に懸濁した場合にＨＳＣｓの直径の２倍を超えない。したがって、本発明は、不均一細胞集団と本発明の基材とを接触させること、標的細胞亜集団（例えば、ＨＳＣｓ）の成長を可能とするのに十分な条件下で不均一細胞集団をインキュベートすること、及びメンバーが、基材への付着前の細胞の直径の２倍を超えない播種後直径を呈する場合に標的細胞亜集団のメンバーを同定することの方法を提供する。
標的細胞亜集団が１又は複数の異なる動態学的性質をとれるように上記基材を構成することができる。或る非限定的な例として、１又は複数の異なる動態学的性質の採用は、標的細胞亜集団が非標的細胞亜集団と異なるようにすることを可能とし得る。そのため、基材は、１又は複数の動態学的特性に基づいて、細胞亜集団の不均一な集団から標的細胞亜集団の選択を可能とすることができる。
動態学的性質の例として、細胞増殖速度が挙げられ得る。例えば、異なる速度で不均一集団の細胞における異なる細胞亜集団の増殖を促進するように基材を構成することができる。例えば、不均一集団の細胞（複数の細胞亜集団、例えば、非癌性細胞、ＣＴＣｓ、ＣＳＣｓ及び白血球を含む）を本発明の基材上に播種してもよい。不均一集団の細胞を増殖に十分な時間に亘りインキュベートする場合、異なる細胞亜集団は異なる速度で増殖を経る場合がある。例えば、非癌性細胞は増殖しない場合がある。他の例として、ＣＴＣｓは各々のサブコロニーが異なる速度で増殖を経る、サブコロニーを形成する可能性がある。ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓの異なる速度の増殖は、非癌性細胞の増殖速度よりもより速い場合がある。したがって、本発明は、不均一細胞集団と本発明の基材とを接触させること、標的細胞亜集団（例えば、ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓ）の成長を可能とするのに十分な条件下で不均一細胞集団をインキュベートすること、及び標的細胞亜集団のメンバーが急速な細胞分裂を呈する場合に標的細胞亜集団のメンバーを同定することの方法を提供する。急速な細胞分裂は、本発明の基材上に播種して３日以内に細胞培養密度の３０倍の増加により証明され得る。急速な細胞分裂は、本発明の基材上に播種して５日以内に細胞培養密度の１００倍の増加により証明され得る。急速な細胞分裂は、本発明の基材上に播種して１０日以内に細胞培養密度の１００倍の増加により証明され得る。急速な細胞分裂は、非標的細胞亜集団の増殖と比較して、標的細胞亜集団の増殖２倍以上の増加により証明され得る。
また、動態学的性質の例としてコロニー形成も挙げられ得る。細胞コロニーは、固体培地の表面又はその内部での細胞成長のクラスターであってもよい。コロニーは、単一の細胞に起因することができる。クラスター内の細胞は、互いの頂部で成長し得る。非標的細胞亜集団の感知できる程度のコロニー形成を伴わずに標的細胞亜集団のコロニー形成を促進するように基材を構成することができる。例えば、本発明の基材上に播種するに際して、白血球は増殖するがコロニーを形成しない場合がある。ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓは、本発明の基材上に播種した際にコロニー形成を経る場合がある。コロニーは、三次元コロニーの場合がある。三次元コロニーは、互いの頂部でＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓを成長させることにより形成され得る。対照的に、非ＣＴＣ又は非ＣＳＣ細胞は、一般的には三次元コロニーを形成しない。したがって、本発明は、不均一細胞集団と本発明の基材とを接触させること、標的細胞亜集団（例えば、ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓ）の成長を可能とするのに十分な条件下で不均一細胞集団をインキュベートすること、及び標的細胞亜集団のメンバーが三次元コロニー形成を呈する場合に標的細胞亜集団のメンバーを同定することの方法を提供する。
図４は、標的細胞亜集団４１５が本発明の基材４０５上に播種され、基材上で１又は複数の異なる形態学的特性及び／又は動態学的性質を採用する例示的方法４００を図解する。フィコールに基づく密度分離による単核層は、基材と接触させることができる。パネル４２０は、基材４０５とインキュベートした細胞の不均一集団を含む試料４１０を説明する。この説明では、細胞の不均一集団は、標的細胞亜集団４１５、白血球４２５及び他の細胞４２７を含む。
パネル４３０は、白血球４２５又は他の細胞４２７よりも高い親和性で基材４０５に付着する標的細胞亜集団４１５を説明する。基材４０５に付着しない細胞を、例えば培地４３３又は他の物質で洗浄することにより除去することができる。
パネル４４０は、基材４０５上で増大し、細胞分裂周期を開始する標的細胞亜集団４１５に由来する細胞を示す。捕捉された白血球４２５は分裂し得るが、白血球４２５は一般的には標的細胞亜集団４１５と同じような増大する形態学又は動態学的特性を有しない。パネル４５０は、異なる速度で１又は複数の細胞分裂周期を経た捕捉された標的細胞亜集団４１５を示す。標的細胞亜集団４１５は、基材上にコロニーを形成する可能性がある。捕捉した白血球４２５は増殖し得るが、白血球は一般的には基材４０５上にコロニーを形成しない。コロニーに存在せず、基材４０５に付着していない細胞は、培地４３３又は他の物質で洗浄され得る。
基材構成の例
本発明の基材の多くの構成が本発明に包含される。図５は、捕捉した標的細胞亜集団５０５により説明される基材構成の種々の例を説明する。パネル５１０は、本発明の基材の「単層」構成の例を示し、結合表面層５１５が唯一の層である。パネル５２０は、結合表面層５１５に隣接する基底層５３０を含む本発明の基材の「二層」構成の例を示す。パネル５４０は、基底層５３０、１又は複数の中間層５５０、及び結合表面層５１５を含む本発明の基材の「中間層」構成の例を示す。パネル５６０は、２つの基底層５３０、結合表面層５１５、及びフィーディング層５７０を含む本発明の基材の「逆位」構成の例を示す。逆位構成は、外層が互いに向かい合い、２つの基材間の距離は０．１ｍｍ〜２０ｍｍ程度、１ｍｍ〜１０ｍｍ程度、又は１ｍｍ〜５ｍｍ程度の範囲であってもよく、およそ０．１ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、１０ｍｍ、１２ｍｍ、１５ｍｍ、１７ｍｍ、又は２０ｍｍであってもよい、半密封チャンバ作成することができる。
基底層の例
基底層５３０は、プラスチック、ガラス、ゼラチン、基底膜、ポリアクリルアミド又はそれらの組み合せを含む成分で作製され得る。基底膜を含む成分の例として、限定されないが、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、エンタクチン、及びペルレカンが挙げられる。基底層は、硬度を有するように構成され得る。場合によっては、基底層の硬度は、脳組織等の軟組織の硬度を疑似する。かかる場合では、基底層の硬度は、０．０２キロパスカル（ｋＰａ）〜２０ｋＰａ、０．０５ｋＰａ〜１．５ｋＰａ、又は０．１ｋＰａ〜１．０ｋＰａである。場合によっては、基底層の硬度は骨組織の硬度を疑似する。かかる場合では、硬度は３０ｋＰａ〜１５０ｋＰａ、４０ｋＰａ〜１２５ｋＰａ、又は５０ｋＰａ〜１００ｋＰａであってもよい。場合によっては、基底層の材料は、器具として構成されてもよい。かかる商業的に利用可能な機器の例として、顕微鏡スライド、培養プレート／皿、ペトリ皿、顕微鏡カバースリップ、密閉した培養皿、及びマルチウェル培養皿（例えば、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｓｅｒｔｓ（商標））が挙げられる。
結合表面層の例
結合表面層５１５は、例えば細胞単相、細胞内成分（例えば、細胞溶解物から得られる）、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）と関連する生体材料、ゼラチンの１若しくは複数、又はそれらの任意の組み合せを含むことができる。
結合表面層は、細胞単相を含むことができる。細胞単相は、全体に又は部分的に、哺乳動物の培養細胞を含むことができる。哺乳動物の培養細胞は、哺乳動物の細胞株を含むことができる。哺乳動物の細胞株は、例えば、上皮の性質であってもよく、血管、静脈、若しくは毛細血管の起源であってもよい。哺乳動物の培養細胞の非限定的な例として、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦｓ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及びヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＬＭＶＥＣ）が挙げられる。細胞株を、初代供給源又は不死化細胞株から得ることができる。場合によっては、細胞の単層を紫外線又はＸ線の供給源により照射し、細胞の老化を引き起こしてもよい（例えば、単層細胞の更なる増殖を停止するため）。場合によっては、細胞単層は、１又は複数の異なる細胞種（例えば、異なる系統又は異なる細胞株に起因する細胞）の混合物を含有してもよい。異なる細胞種を共に共培養してもよい。一つの非限定的な例は、細胞単層を形成するように混合されたトランスジェニックマウス胚線維芽細胞と共培養された初代ヒト血管内皮細胞の組み合せである。
結合表面層は、細胞内成分の混合物を含むことができる。細胞内成分の混合物を得るための一つの方法は、細胞を溶解し（例えば、細胞原形質膜を破壊すること）、細胞質成分を採取することによる。溶解した細胞は、初代であってもよく、不死化されていてもよい。更に、溶解した細胞は、単独培養又は共培養のいずれに由来してもよい。それから溶解物を得る細胞株の例として、限定されないが、ＭＥＦｓ、ＨＵＶＥＣ及びＨＬＭＶＥＣの細胞が挙げられる。細胞溶解物を、過剰量の溶液を除去することによりそれら組成を濃縮してもよい。過剰量の溶液は、遠心分離、膜による透析、気体で補助する蒸発、又はそれらの任意の組み合せを含む、当業者に既知の種々の方法で除去され得る。
結合表面層は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）又は結合部分と関連する生体材料を含むことができる。かかるＥＣＭと関連する生体材料として、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、レチクリン、吸湿性分子（グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコカリックス）、ウシ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、及びポリ−オルニチン（例えば、ポリ−Ｌ−オルニチン）が挙げられ得る。或る実施形態では、ＥＣＭと関連する生体材料は正電荷を帯びる（例えば、ポリ−オルニチン）。また、ＥＣＭと関連する生体材料の商業的に入手可能な供給源も存在し、商業的に入手可能な供給源の一例は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。結合部分の例は本明細書に記載される。
結合表面層は、ゼラチンを含んでもよい。ゼラチンは、動物の供給源に由来する。例えば、ゼラチンは、ブタ及び／又はウシのゼラチンであってもよい。場合によっては、結合表面層は、コラーゲンと混合したゼラチン（例えば、ブタゼラチン）を含むことができる。場合によっては、ゼラチンを、１又は複数の細胞単層、細胞内成分、結合部分、ＥＣＭと関連する生体材料、又はそれらの任意の組み合せと直接混合して結合表面層を作製することができる。場合によっては、結合表面層は、商業的に入手可能な製品（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；Ｖｉｔａ−Ａｓｓａｙ（商標）（ニューヨーク州のＶｉｔａｔｅｘ））を含むことができる。場合によっては、結合表面層は、血清を含むことができる。
任意の中間層（複数の場合がある）の例
基材が「中間層」構成５４０である場合、基材は１又は複数の中間層を有することができる。「中間層」構成５４０では、基底層５３０と結合表面層５１５の間に１又は複数の中間層５５０が存在してもよい。サンドイッチの中間層（複数の場合がある）は、１又は複数の細胞の単層であってもよい。単相の細胞は、様々な起源であってもよい。中間層の或る一つの非限定的な例は、基底層上でマウス胚線維芽細胞のコンフルエントな単相を成長させた後、別の細胞層である結合表面層をコンフルエントなマウス胚線維芽細胞の頂部で成長させることにより作製される。
フィーダー層の例
「逆位」構成を有する基材５６０は、フィーダー層５７０を含むことができる。フィーダー層５７０は、基底層に隣接し得る。フィーダー層は、結合表面層から分離され得る。或る実施形態では、標的細胞亜集団５０５は、フィーダー層５７０と比較して結合表面層５１５に優先的に結合する。フィーダー層５７０は、フィーダー細胞の単層を含み得る。単層の細胞は任意の起源であってもよい。フィーダー細胞の例は、本明細書に記載される。フィーダー細胞の或る一つの非限定的例は、ヒト血管内皮細胞又はマウス胚線維芽細胞の単層を基底層上で成長させることにより作製される。
「逆位層」基材の例を図６に示す。「逆位層」基材の例は、組織培養プラスチック及び／又はガラスを含む２つの基底層、結合基材（例えば、ＥＣＭと関連する生体材料）を含む結合表面層、及びフィーダー細胞の単層を含むフィーダー層を含む。また、図６は、逆位層基材上に播種した後の標的細胞の形態学的及び運動の特性の例を示す。播種から３０分以内に標的細胞は結合表面層への付着を呈する場合がある。播種から２時間以内に標的細胞は細胞拡散を呈する場合がある。２４時間〜７２時間以内に標的細胞は細胞分裂を呈し、標的細胞のコロニーを生じる場合がある。
本明細書において「ＧＯＬ基材」と呼ばれる本発明の基材の例示的実施形態は、ゼラチン、ＥＣＭと関連する生体材料、及び血清を含むことができる。ゼラチンはブタゼラチンであってもよい。ＥＣＭと関連する生体材料は、ポリ−オルニチン（例えば、ポリ−Ｌ−オルニチン）であってもよい。血清は、ウシ胎仔血清であってもよい。或る実施形態では、ＧＯＬ基材はブタゼラチン、ポリ−オルニチン、ウシ胎仔血清を含む。例えば、ＧＯＬ基材は、０．０１％〜１０％のブタゼラチン、０．００１ｍｇ／ｍｌ〜０．５ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−オルニチン、及び０．５％〜２０％のウシ胎仔血清を含むことができる。或る一つの実施形態では、ＧＯＬ基材は、約０．１％のブタゼラチン、およそ０．０５ｍｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−オルニチン塩酸塩、及びおよそ５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む。
本明細書で「ＧＥＬ基材」と呼ばれる本発明の基底層（ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ）の別の例は、ゼラチン及び１又は複数のＥＣＭと関連する生体材料を含むことができる。ＧＥＬ基材は、例えば、ゼラチン、及び２以上のＥＣＭと関連する生体材料を含むことができる。ＧＥＬ基材は、ゼラチン及び３以上のＥＣＭと関連する生体材料を含むことができる。ＧＥＬ基材は、例えば、ゼラチン及びコラーゲンを含むことができる。ＧＥＬ基材は、ゼラチン、コラーゲン、及び／又はラミンを含むことができる。ＧＥＬ基材は、ゼラチン、コラーゲン、ラミン、及び／又はフィブロネクチンを含むことができる。或る実施形態では、ＧＥＬ基材は、０．０１％〜１０％のブタゼラチン、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌのコラーゲン、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌのラミニン、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチンを含むことができる。或る一つの実施形態では、ＧＥＬ基材は、約０．１％のブタゼラチン、及び１又は複数の以下のタンパク質、すなわち、およそ０．１ｍｇ／ｍＬのコラーゲン（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃ７７７４）、およそ０．１ｍｇ／ｍＬのラミニン（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｌ２０２０）、及び／又はおよそ０．１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチン（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｆ０８９５）を含む。
本発明の基材を、本明細書に記載の１又は複数の層の接合により調製することができる。層の接合は、頂部の単層、基底層又は中間層における細胞の成長によって完成され得る。また、層の接合は、正味の正電荷、正味の負電荷、又は正味の中性電荷のいずれかの表面により表面を前処理することにより完成され得る。複合の手順は、化学部分、リンカー、タンパク質フラグメント、ヌクレオチドフラグメント、又はそれらの任意の組み合せにより支援され得る。
当業者が認識するように、基材の正確な構成及び組成を特定の標的細胞亜集団の富化のために調整することができる。基材の組成は、患者のタイプ、癌の種類、癌のステージ、患者の病歴、並びに患者の腫瘍（複数の場合がある）の遺伝子解析及びプロテオーム解析に基づいて変化し得る。
標的細胞亜集団の成長に適した環境条件
分析に十分な標的亜集団細胞のメンバー、例えば、ＣＴＣｓ又はＣＳＣｓ等を提供する挑戦の一つは、長期間、細胞生存能を維持できないことである。したがって、本発明は、標的細胞亜集団の長期間のｉｎ ｖｉｔｒｏでの生存能及び増大を促進する培養方法を提供する。培養方法は、標的細胞亜集団の成長に適した環境条件において標的細胞亜集団をインキュベートすることを含むことができる。したがって、本発明は、閉鎖環境チャンバを含む細胞培養インキュベータも提供し、そのインキュベータは、標的細胞亜集団の成長に適した環境条件を維持するように構成される。環境条件は、ｉｎ ｖｉｖｏ血管構造系を疑似するように構成され得る。本明細書に記載される１又は複数の環境条件下での標的細胞亜集団のインキュベーションは、非標的細胞亜集団と比較して基材への標的細胞亜集団の付着を高めることができる。本明細書に記載される１又は複数の環境条件下での標的細胞亜集団のインキュベーションは、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超の標的細胞亜集団の基材への付着をもたらすことができる。本明細書に記載される１又は複数の環境条件下での標的細胞亜集団のインキュベーションは、標的細胞亜集団の生存能を促進する。例えば、標的細胞亜集団は、本明細書に記載される１又は複数の環境条件下でのインキュベーションにより、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、又は１２週間超に亘る培養で生存し得る。本明細書に記載される１又は複数の環境条件下での標的細胞亜集団のインキュベーションは、少なくとも１週間の培養において少なくとも１５％、２０％、２５％％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超の生存する標的細胞亜集団を生じることができる。本明細書に記載される１又は複数の環境条件下での標的細胞亜集団のインキュベーションは、少なくとも２週間の培養において少なくとも１５％、２０％、２５％％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超の生存する標的細胞亜集団を生じることができる。本明細書に記載される１又は複数の環境条件下での標的細胞亜集団のインキュベーションは、少なくとも４週間の培養において少なくとも１５％、２０％、２５％％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超の生存する標的細胞亜集団を生じることができる。本明細書に記載される１又は複数の環境条件下での標的細胞亜集団のインキュベーションは、無期限の培養において少なくとも１５％、２０％、２５％％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超の生存する標的細胞亜集団を生じることができる。
分析に十分な標的亜集団細胞のメンバー、例えば、ＣＴＣｓ又はＣＳＣｓ等を提供する別の挑戦は、長期の培養で標的細胞亜集団を増大できないことである。本発明の方法を利用することにより、標的細胞亜集団を、１週間、２週間、３週間、４週間、８週間、１２週間、又は１２週間超に亘る培養で増大し得る。本発明の方法を利用することにより、基材亜集団に付着した後に少なくとも１５％、２０％、２５％％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９５％超の標的細胞亜集団を、１週間、２週間、３週間、４週間、８週間、１２週間、又は１２週間超に亘る培養で増大し得る。本発明の方法を利用することにより、標的細胞亜集団を無期限に生存させ得る、及び／又は増大させ得る。或る実施形態では、上記培養方法は、成長に適した環境条件において標的細胞亜集団をインキュベートすることを含む。場合によっては、標的細胞亜集団は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、又は１００超の倍加周期に亘り増大することができる。
標的細胞亜集団に適した環境条件は、規定の内部周囲温度を含む閉鎖環境チャンバにおいて培養することを含む。閉鎖環境チャンバは、細胞培養インキュベータの内部チャンバであってもよい。閉鎖環境チャンバの内部周囲温度は、摂氏およそ３４度〜およそ４２度であってもよく、摂氏およそ３４度、３５度、３６度、３７度、３８度、３９度、４０度、４１度、又は４２度を含む。したがって、本発明の細胞培養インキュベータは、閉鎖環境チャンバを含み、そのインキュベータは、閉鎖環境チャンバの内部周囲温度を維持するように構成される。
標的細胞亜集団の成長に適した環境条件は、内部気体組成を含む閉鎖環境チャンバにおいて培養することを含むことができる。閉鎖環境チャンバの気体組成は、規定のＯ２レベルを含むことができる。規定のＯ２レベルは、無視できる量のＯ２から約２０％Ｏ２以下の範囲（例えば、内部気体組成の約２０％を占めるＯ２）であってもよく、およそ０％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％のＯ２を含む。規定のＯ２レベルを標的細胞亜集団の培養のため低酸素環境を提供するように構成することができる。或る実施形態では、規定のＯ２レベルは、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、０．１％以下である。場合によっては、閉鎖環境チャンバのＯ２レベルは、０．５％〜２％の範囲である。閉鎖環境チャンバのＯ２レベルは約１％であってもよい。
気体組成は、規定のＣＯ２レベルを含むことができる。例えば、標的細胞亜集団を、約１％〜約１５％ＣＯ２の間、およそ１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％のＣＯ２レベルを含む閉鎖環境チャンバにおいて成長させることができる。閉鎖環境チャンバのＣＯ２レベルは、約２％〜１０％であってもよい。閉鎖環境チャンバのＣＯ２レベルは、約３％〜８％であってもよい。閉鎖環境チャンバのＣＯ２レベルは、約５％であってもよい。
気体組成は、窒素ガスレベルを含むことができる。窒素ガスレベルは、約５０％〜９９．５％であってもよく、およそ５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．５％超を含む。窒素ガスレベルは、約９０％〜９９％、約９２％〜９８％、約９３％〜９６％、又は約９４％であってもよい。或る実施形態では、窒素ガスレベル約９３％〜９４％である。或る特定の場合では、標的細胞亜集団を約１％Ｏ２、５％ＣＯ２、及び９４％窒素ガスを有する環境において成長させる。特定の場合、標的細胞亜集団を約２％Ｏ２、５％ＣＯ２、及び９３％窒素ガスを有する環境において成長させる。
標的細胞亜集団の成長に適した環境条件は、加圧条件下で培養することを含むことができる。例えば、標的細胞亜集団の成長に適した環境条件は、規定の大気圧を含む閉鎖環境チャンバにおいて培養することを含むことができる。閉鎖環境チャンバの規定の大気圧を、使用者によって設定することができる。例えば、閉鎖環境チャンバの規定の大気圧を、ヒト血管構造系の毛細血管に存在する平均圧と等しい又はそれより大きい力を生じるように設定することができる。閉鎖環境チャンバの規定の大気圧は、１５ＰＳＩＡ以上であってもよく、１５．７ＰＳＩＡ以上であってもよく、１６．７ＰＳＩＡ以上であってもよく、１７．７ＰＳＩＡ以上であってもよく、１８．７ＰＳＩＡ以上であってもよく、又は１９．７ＰＳＩＡ以上であってもよい。閉鎖環境チャンバの規定の大気圧は、約１５．７ＰＳＩＡ〜１９．７ＰＳＩＡ、約１５．７ＰＳＩＡ〜１８．７ＰＳＩＡ、約１５．７ＰＳＩＡ〜１７．７ＰＳＩＡ、又は約１６．７ＰＳＩＡであってもよい。インキュベーション条件は、増殖される細胞の種類に応じて変化し得る。
標的細胞亜集団の成長に適した環境条件は、加圧環境チャンバで低酸素条件において成長させることを含む。場合によっては、標的細胞亜集団を規定の気体組成、規定の内部周囲温度、及び規定の内部大気圧を含む閉鎖環境チャンバにおいて成長させることができる。特定の場合には、規定の気体組成は１％Ｏ２、５％ＣＯ２、９４％及び窒素ガスであり、規定の内部大気圧は１６．７ＰＳＩＡであり、規定の内部周囲温度は約３７℃である。
標的細胞亜集団を嫌気性細胞の成長用に構成された環境チャンバにおいてインキュベートすることができる。かかる環境チャンバとして、Ｓｈｅｌ ＬａｂｓによるＢａｃｔｒｏｎ（商標）嫌気チャンバ（ｗｗｗ．ｓｈｅｌｌａｂ．ｃｏｍ）が挙げられ得る。
したがって、本発明は、標的細胞亜集団の成長に適した環境条件を提供するように構成された細胞培養インキュベータを提供する。細胞培養インキュベータは、閉鎖環境チャンバ内の規定の気体組成、規定の内部周囲温度、及び規定の内部大気圧を維持するように構成され得る。また、細胞培養インキュベータは、閉鎖環境チャンバ内で規定の内部湿度を維持するように構成され得る。例示的な規定の内部周囲温度、規定の内部大気圧、及び規定の気体組成は本明細書に記載される。細胞培養インキュベータは、１又は複数の制御ユニットを含むことができる。１又は複数の制御ユニットは、規定の気体組成、規定の内部周囲温度、及び／又は規定の内部大気圧の１又は複数を維持するように構成され得る。規定の気体組成、規定の内部周囲温度、及び規定の内部大気圧のいずれか１つを使用者によって制御することができる。場合によっては、規定の内部大気圧は使用者によって制御される。細胞培養インキュベータは、ユーザーインターフェースを含むことができる。ユーザーインターフェースは、規定の気体組成、規定の内部周囲温度、及び規定の内部大気圧のいずれか１つを制御するように構成され得る。
細胞培養インキュベータを１又は複数の気体タンクに制御可能に連結することができる。１又は複数の気体タンクは、ＣＯ２タンク、窒素ガスタンク、酸素ガスタンク、規定の混合物又は１若しくは複数の気体を含む気体タンク、又はそれらの任意の組み合せを含むことができる。細胞培養インキュベータを、加圧ポンプ及び／又は加圧センサ（例えば、圧力ゲージ）により１又は複数の気体タンクに制御可能に連結することができる。加圧ポンプ及び／又は圧力センサを、細胞培養インキュベータの閉鎖環境チャンバへの１又は複数の気体タンクからの制御された気流を維持するように構成することができる。１又は複数のタンクからの制御された気流は、設定されたインレット圧力、閉鎖環境チャンバの所望の内部気体組成及び／又は内部大気圧を維持するように構成された１又は複数のタンクの設定インレット圧力を有することができる。
細胞培養インキュベータは、１又は複数のセンサを含むことができる。１又は複数のセンサを、規定の気体組成、規定の内部周囲温度、及び／又は規定の内部大気圧からの気体組成、内部周囲温度、及び／又は内部大気圧の１又は複数の偏差に際して検出可能なアラームを提供するように構成することができる。例えば、１又は複数のセンサは、検出されたＯ２レベルが規定のＯ２レベルから±０．５％より大きく異なる場合に閉鎖環境チャンバのＯ２レベルの検出に際して検出可能なアラームを提供することができる。１又は複数のセンサは、検出された内部大気圧が規定の大気圧から±０．５％より大きく異なる場合に閉鎖環境チャンバの内部大気圧の検出に際して検出可能なアラームを提供することができる。１又は複数のセンサは、検出された内部周囲温度が規定の内部周囲温度から±０．５％より大きく異なる場合に閉鎖環境チャンバの内部周囲温度の検出に際して検出可能なアラームを提供することができる。
細胞培養インキュベータは、酸素除去触媒を含むことができる。酸素除去触媒は、１又は複数の気体タンクに制御可能に連結されていてもよく、又は連結されていなくてもよい。当該技術分野で既知の、或いは本明細書に記載される任意の酸素除去触媒を使用してもよい。例示的な酸素除去触媒は、例えば、ＢＡＳＦから商業的に入手可能である。例示的な酸素除去触媒は、参照により本明細書に援用される、米国特許第７，７３５，６７０号及び第４，０３４，０６２号、並びに米国特許出願公開第２００９００４１６４６号に記載される。
本発明の細胞培養インキュベータを、インキュベータの閉鎖環境チャンバが小さい体積の空間を占めるように構成することができる。例えば、インキュベータの閉鎖環境チャンバは、３．５立法フィート以下の空間、２２立法フィート以下の空間、１．５立法フィート以下の空間、又は１立法フィート以下の空間を占めることができる。或る実施形態では、細胞培養インキュベータの閉鎖環境チャンバは、１立法フィート未満の空間を占め、例えば、０．５フィート×０．５フィート×０．５フィートの空間を占める。細胞培養インキュベータを、３．５立法フィート以下の空間、２２立法フィート以下の空間、１．５立法フィート以下の空間、又は１立法フィート以下の空間を占めるように構成することができる。或る実施形態では、細胞培養インキュベータは、１立法フィート未満の空間を占める、例えば、０．５フィート×０．５フィート×０．５フィートの空間を占める。
図７Ａは、本発明の細胞培養インキュベータ７００の例を示す。インキュベータ７００は、加圧ドアを含むことができる。或る実施形態では、インキュベータは、外部加圧ドア及び内部加圧ドアを含む。外部加圧ドア及び／又は内部加圧ドアは、例えば、二重壁ドアであってもよい。二重壁ドアは、圧力密封ラッチを有することができる。外部加圧ドアは、ドアに一体型圧力センサを含んでもよい。インキュベータ７００は、ドアエントリを含むことができる。ドアエントリは、閉鎖環境チャンバへの入り口を提供することができる。ドアエントリの開口の寸法は、加圧ドアよりも小さくてもよい。ドアエントリはゴムガスケットを含むことができる。ゴムガスケットは、加圧シールを作り出すことができる。細胞培養インキュベータは、一体型圧力センサを含むことができる。一体型圧力センサは、マニホルド圧力センサであってもよい。一体型圧力センサは、水による又はシリコンによる圧力センサであってもよい。インキュベータ７００は、滅菌ユニットを含むことができる。滅菌ユニットは、ＵＶによる滅菌ユニットであってもよい。ＵＶによる滅菌ユニットを、インキュベータの閉鎖環境チャンバの全空間に対して紫外線を供給するように構成することができる。インキュベータ７００は、ＣＯ２センサを含むことができる。ＣＯ２センサを、閉鎖環境チャンバの規定のＣＯ２レベルから＋／−０．５％偏差の際の検出アラームを提供するように構成することができる。インキュベータ７００は、閉鎖環境チャンバを含むことができる。閉鎖環境チャンバによって占められる容積は、１立法フィート以下であってもよい。閉鎖環境チャンバは、棚を備えることができる。棚は、閉鎖環境チャンバから取り除けるものであってもよい。棚は、金属材料を含むことができる。金属材料は、ステンレス鋼、銅、又は他の好適な金属であってもよい。インキュベータ７００は、水分湿気トレイを備えることができる。水分湿気トレイは、閉鎖環境チャンバの無菌状態を高めることができる。水分湿気トレイを湿度センサ／調節器に直接つないでもよい。インキュベータ７００は、エアジャケットを備えることができる。エアジャケットは、最適温度及び適切な気体調節を維持することができる。エアジャケットは、物理的に異なるコンパートメントであってもよい。エアジャケットは、電気制御装置及び配電盤を収容してもよい。インキュベータ７００は、酸素除去触媒、及びインキュベータ内の酸素レベルを調節するセンサを含むことができる。
インキュベータ７００は、加熱素子及び／又は温度制御を含むことができる。加熱素子及び／又は温度制御は、低音ファンによる加熱素子を含むことができる。低音ファンによる加熱素子は、エアジャケットコンパートメントへの加熱した空気の一定の流れを分配することができる。その後、パッシブ加熱は、均一に分配された一定の方式で内部チャンバを温めることができる。インキュベータは、規定のガス組成及び内部大気圧を提供するように構成された加圧ポンプ及び調整器を含むことができる。電動式ポンプは、規定の気体混合物を分配してチャンバ圧及び気体組成レベル（例えば、１％酸素、５％ＣＯ２、９４％Ｎ２）を維持することができる。インキュベータは、ユーザーインターフェースを含むことができる。使用者は、ユーザーインターフェースを使用して気体レベル及び圧力を設定することができる。ユーザーインターフェースを、直接制御のためセンサ及びポンプに統合することができる。加圧ポンプ及び調節器は、１又は複数の気体インレットを含むことができる。より多くの気体インレットの１つを、閉鎖環境チャンバへの任意の気体の流れを可能とするように構成することができる。例えば、１又は複数の気体インレットを酸素タンクに接続することができる。１又は複数の気体インレットをＣＯ２タンクに接続することができる。１又は複数の気体インレットを窒素タンクに接続することができる。或る実施形態では、インキュベータは、酸素タンクに接続された気体インレット、ＣＯ２タンクに接続された気体インレット、及び窒素タンクに接続された気体インレットを含む。１又は複数の気体インレットを特注の気体混合物を含有するタンクに接続することができる。或る実施形態では、使用者は、気体インレットのいずれか及び／又は各々を通る気流を制御することができる。気体インレットのいずれか１つを流量計に接続してもよい。流量計は、流入する気圧を調節することができる。細胞培養インキュベータは、湿度制御ユニット／センサを含むことができる。湿度制御ユニット／センサは、水分湿気トレイに直接に接続されていてもよく、そうでなくてもよい。
本明細書に記載される具体的な環境条件において標的細胞亜集団をインキュベートすることにより、標的細胞亜集団（例えば、ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓ）の生存能及び増殖を高めることができる。様々な組織及び臓器のｉｎ ｖｉｖｏ微小環境は、新たな癌の成長に対して影響を受けやすい特有の圧力、硬度、及び／又は気体組成を有することができる。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明の培養方法は、本明細書に記載される特定の硬度を有する本発明の基材上で標的細胞亜集団を成長すること、本明細書に記載される外部圧力を印加すること、及び本明細書に記載される気体条件（例えば、Ｏ２、ＣＯ２条件）を設定することの組み合せによりｉｎ ｖｉｖｏ微小環境を真似ることができる。本明細書に記載される環境条件は、細胞接着及び後の細胞分裂を促進する遺伝子及びタンパク質の発現を調節することができる。例えば、低酸素条件（例えば、１％Ｏ２）は、増殖するＣＴＣｓにおいて高発現することが示されている、低酸素誘導因子Ｉ（ＨＩＦ−１）の発現を誘導することができる。
理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載される環境条件は、標的細胞亜集団（例えば、ＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓ）の内部の張力又は硬度を調整する可能性がある。一例に過ぎないが、ＣＴＣの張力又は硬度に関して、ＣＴＣ硬度の増加は、血管構造系に見出される剪断力に耐える防御能力を与える可能性がある。逆を言えば、その全体的な硬度を減少する組織に結合するＣＴＣは、より転移しやすい可能性がある。本明細書に記載される環境条件は、細胞張力を低減することができ、それにより、細胞サイズの増加、付着細胞の強度の減少、及び／又は細胞動態学的特性の増加を導くことができる。癌の成長を促進し得る細胞張力及び／又は基材硬度は、ＣＴＣの癌の種類に依存し得る。したがって、本明細書に記載される環境条件は、標的とされるＣＴＣ（複数の場合がある）の種類に応じて調節され得る。
細胞培養培地の例
本発明は、１又は複数の細胞培養培地１２５（図１に示され、本明細書において「富化培地」とも呼ばれる）を具体的な富化標的細胞亜集団に対して提供することができる。例えば、他の種類の細胞と比べて、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）、癌幹細胞（ＣＳＣｓ）、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）、胎児細胞、幹細胞、免疫細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、癌細胞、白血球、成人幹細胞、及び／又は上皮前駆細胞の成長を選択的に促進するように細胞培養培地を処方することができる。特定の実施形態では、細胞培養培地は、他の種類の細胞と比べて、ＣＴＣｓ、ＣＳＣｓ、ＥＰＣｓ、幹細胞、上皮細胞、又は癌細胞の選択的な成長を促進する。細胞培養培地は、本発明の培地中の培養前の本来の比率に対して、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、２，０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、１，０００，０００倍、２，０００，０００倍、５，０００，０００倍、１０，０００，０００倍、２０，０００，０００倍、５０，０００，０００倍、１００，０００，０００倍、２００，０００，０００倍、５００，０００，０００倍、１，０００，０００，０００倍、２，０００，０００，０００、又は５，０００，０００，０００倍の因数で標的細胞亜集団及び／又は非標的細胞集団の比率を富化し得る。
図８は、標的細胞亜集団の増殖を促進するように処方された富化培地８０５の例示的な実施形態８００を示し、この説明において標的細胞亜集団はＣＴＣｓ８１５である。富化培地８０５の組成を、富化のため標的とされる細胞の種類に対して適合することができる。細胞を富化するのに使用される富化培地８０５の１又は複数の処方が存在する可能性があり、富化培地は、一連の細胞富化の間に変更されてもよい。富化培地８０５は、基材８１０と接触していてもよい。或る一つの非限定的な例では、富化培地の処方は、癌の種類、癌のステージ、患者の病歴、並びに患者の腫瘍（複数の場合がある）の遺伝子分析及びプロテオーム分析に対して適合される。細胞の不均一集団（複数の細胞亜集団、例えば、非癌性細胞８２５、ＣＴＣｓ８１５、及び白血球８２０を含む）を基材８１０上に播種してもよい。細胞を富化培地８０５中で増殖８３０に十分な期間に亘りインキュベートする場合、細胞亜集団は、異なる速度の増殖を経ることができる。或る一つの例では、非癌性細胞８２５は増殖しない場合があり、ＣＴＣｓ８１５は異なる速度（例えば、８４０、８４５、８５０、及び８５５を比較）で増殖を経るサブコロニーを形成する場合があり、白血球は、増殖を経る場合があるがコロニー８２０を形成しない。或る実施形態では、富化培地は、明らかな非標的細胞亜集団のコロニー形成を伴わずに標的細胞亜集団のコロニー形成を促進するように処方される。細胞コロニーは、固体培地の表面又はその内部で成長する細胞のクラスターであってもよい。コロニーは、単一の細胞に起因してもよい。ＣＴＣｓ８１５は、それらの増殖速度に基づいて分類されてもよい。ＣＴＣ８１５分類体系の一例は、非分裂８５０、低速分裂８４０、中間速度分裂８５５、及び高速分裂８４５として示される。培地中での細胞の増殖能力に基づく細胞の分類は、ＣＴＣｓの転移特性に関係する可能性がある。或る実施形態では、富化培地、基材、及び圧力条件は、相乗的にはたらいて標的細胞の富化を向上する。
細胞培養培地は、商業的に入手可能な細胞培養培地を含むことができる。本発明における使用に適した商業的に入手可能な細胞培養培地の例として、限定されないが、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ−１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｆ１０ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ、培地１９９、Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、ＩＭＤＭ、ＳｅｎｓｉＣｅｌｌ（商標）培地、Ｆｌｕｏｒｏｂｒｉｔｅ（商標） ＤＭＥＭ培地が挙げられる。
細胞培養培地８０５は、基材への細胞付着を促進し、長期の細胞生存能力を保証するために特定の添加剤と共に主な栄養源から構成され得る。主な栄養源は、哺乳動物起源、又は哺乳動物起源の混合物に由来してもよい。或る哺乳動物栄養源として、限定されないが、仔ウシ、ウマ、ヤギ、マウス、ラット、及び／又はヒトに由来する血清が挙げられる。或る実施形態では、１又は複数の動物の血清を混合する。ウシ胎仔血清及びヒト血清を、ウシ胎仔血清に対するヒト血清の比率をおよそ１：１、１．５：１、又はおよそ２：１として共に混合することができる。添加され得る添加剤として、イオン、元素、カルシウム、グルタミン酸塩、マグネシウム、亜鉛、鉄、カリウム、ナトリウム、アミノ酸、ビタミン、グルコース、成長因子、ホルモン、組織抽出物、タンパク質、小分子、又はそれらの任意の組み合せが挙げられる。或る実施形態では、培養培地は、細胞培養物、血液血漿、又はそれらの任意の組み合せから採取された培養培地で補充されてもよく、又はそれらで作製されてもよい。場合によっては、１より多い種類の富化培地を使用してもよい。アミノ酸の例として、例えば、フェニルアラニン、バリン、スレオニン、トリプトファン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、リジン、及びヒスチジン等の必須アミノ酸、例えば、アルギニン、システイン、グリシン、グルタミン、プロリン、セリン、チロシン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の他のアミノ酸が挙げられる。細胞培養培地に含まれ得る成長因子の例として、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、脳由来トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）が挙げられる。細胞培養培地に含まれ得るホルモンの例として、限定されないが、例えば、インスリン等のペプチドホルモン、例えば、ヒドロコルチゾン、プロゲステロン、テストステロン、エストロゲン、ジヒドロテストステロン等のステロイドホルモンが挙げられる。組織抽出物の例として、例えば、下垂体抽出物が挙げられる。小分子添加剤の例として、例えば、ピルビン酸ナトリウム、エンドセリン−１、トランスフェリン、コレステロール等が挙げられる。
或る実施形態では、細胞培養培地は、ＲＰＭＩ−１６４０（例えば、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＲ１１４５）、およそ２０％のウシ胎仔血清、およそ０．２ｇ／Ｌ〜１．０ｇ／ＬのＬ−グルタミン、およそ２ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌの高グルコース、およそ２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、及びおよそ２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの１５６３０１０６）を含む。
細胞培養培地は、平板培養培地であってもよい。平板培養培地は、Ｆ１２培地（例えば、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＮ６６５８）、およそ５ｇ／Ｌ又はおよそ１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／ＬのＤ−（＋）−グルコース（例えば、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＧ７０２１）、１×又は任意に０．１×〜２×最小必須培地（ＭＥＭ）、およそ１０ｍＭ又は１０ｍＭ〜２５ｍＭのＬ−グルタミン（例えば、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＧ７５１３）、およそ１０ｍＭ又は１０ｍＭ〜２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの１５６３０１０６）、及びおよそ２０％哺乳動物の血清（例えば、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）胎仔血清、ウシ（ｃａｌｆ）胎仔血清、ウマ血清、ヒト血清、ヒト血漿等）を含むことができる。
細胞培養培地はＲ型長期成長培地であってもよい。Ｒ型長期成長培地は、ＲＰＭＩ−１６４０系培地（例えば、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＲ４１３０）、およそ５ｇ／Ｌ又はおよそ１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／ＬのＤ−（＋）−グルコース（例えば、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＧ７０２１）、およそ１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（例えば、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＭ７１４５）、およそ１×ＲＰＭＩビタミン（例えば、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＲ７２５６）、およそ１０ｍＭ又はおよそ１ｍＭ〜２０ｍＭのＬ−グルタミン（例えば、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＧ７５１３）、およそ２０％又は５％〜５０％の哺乳動物の血清（例えば、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）胎仔血清、ウシ（ｃａｌｆ）胎仔血清、ウマ血清、ヒト血清、ヒト血漿等）を含んでもよい。Ｒ型長期成長培地のｐＨをおよそ７．２に調整してもよいが、ｐＨはおよそ６〜８の範囲であってもよい。任意のＲ型長期成長培地の栄養補助剤として、５μｇ／ｍＬ又はおよそ１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬのインスリン（例えば、組換えヒトインスリン（ｒｈインスリン））、５０μｇ／ｍＬ又はおよそ１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、５ｎｇ／ｍＬ又はおよそ１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）（例えば、組換えヒト（ｒｈＥＧＦ））、０．７５単位／ｍＬのヘパリン硫酸、１μｇ／ｍＬ又はおよそ０．５μｇ／ｍＬ〜２μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンヘミスクシネート、１５ｎｇ／ｍＬ又はおよそ５ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬのインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）（例えば、ｒｈＩＧＦ−１）、１単位／ｍＬ又はおよそ１単位／ｍＬ〜１０単位／ｍＬのペニシリン、１μｇ／ｍＬ又はおよそ１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、およそ０．１ｎｇ／ｍＬ〜２５ｎｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ、又はそれらの任意の組み合せが挙げられ得る。
細胞培養培地は、ＤＦ型長期成長培地であってもよい。ＤＦ型長期成長培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの５１４４５Ｃ）、５ｇ／Ｌ又はおよそ１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／ＬのＤ−（＋）−グルコース（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＧ７０２１）、およそ１×ＭＥＭの非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＭ７１４５）、１０ｍＭ又はおよそ１ｍＭ〜２０ｍＭのＬ−グルタミン（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ７５１３）、及び２０％又はおよそ５％〜５０％の哺乳動物の血清（例えば、（例えば、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）胎仔血清、ウシ（ｃａｌｆ）胎仔血清、ウマ血清ヒト血清、ヒト血漿等）を含んでもよい。ＤＦ型長期成長培地のｐＨをおよそ７．２に調整することができるが、ｐＨはおよそ６〜８の範囲であってもよい。任意のＤＦ型長期成長培地の栄養補助剤として、およそ１０ｍＭ又は１０ｍＭ〜２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの１５６３０１０６）、５μｇ／ｍＬ又はおよそ１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬのインスリン（例えば、組換えヒトインスリン（ｒｈインスリン））、５０μｇ／ｍＬ又はおよそ１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬアスコルビン酸、５ｎｇ／ｍＬ又はおよそ１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）（例えば、組換えヒト（ｒｈＥＧＦ））、０．７５単位／ｍＬのヘパリン硫酸、１μｇ／ｍＬ又はおよそ０．５μｇ／ｍＬ〜２μｇ／ｍＬヒドロコルチゾンヘミスクシネート、１５ｎｇ／ｍＬ又はおよそ５ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）（例えば、ｒｈＩＧＦ−１）、１単位／ｍＬ又はおよそ１単位／ｍＬ〜１０単位／ｍＬのペニシリン、１μｇ／ｍＬ又はおよそ１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、およそ０．１ｎｇ／ｍＬ〜２５ｎｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ、又はそれらの任意の組み合せが挙げられ得る。
細胞培養培地は、Ｄ型長期成長培地であってもよい。Ｄ型長期成長培地は、ＤＭＥＭ培地、高グルコース（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＤ６４２９）、５ｇ／Ｌ又はおよそ１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／ＬのＤ−（＋）−グルコース（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＧ７０２１）、およそ１×ＭＥＭの非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＭ７１４５）、１０ｍＭ又はおよそ１ｍＭ〜２０ｍＭのＬ−グルタミン（例えば、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＧ７５１３）、及び２０％又はおよそ５％〜５０％哺乳動物の血清（例えば、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）胎仔血清、ウシ（ｃａｌｆ）胎仔血清、ウマ血清、ヒト血清、ヒト血漿等）を含んでもよい。Ｄ型長期成長培地のｐＨをおよそ７．２に調整することができるが、ｐＨはおよそ６〜８の範囲であってもよい。任意のＤ型長期成長培地の栄養補助剤として、１０ｍＭ又は１０ｍＭ〜２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの１５６３０１０６）、５μｇ／ｍＬ又はおよそ１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬのインスリン（例えば、組換えヒトインスリン（ｒｈインスリン））、５０μｇ／ｍＬ又はおよそ１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、５ｎｇ／ｍＬ又はおよそ１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）（例えば、組換えヒト（ｒｈＥＧＦ））、０．７５単位／ｍＬのヘパリン硫酸、１μｇ／ｍＬ又はおよそ０．５μｇ／ｍＬ〜２μｇ／ｍＬヒドロコルチゾンヘミスクシネート、１５ｎｇ／ｍＬ又はおよそ５ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬのインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）（例えば、ｒｈＩＧＦ−１）、１単位／ｍＬ又はおよそ１単位／ｍＬ〜１０単位／ｍＬのペニシリン、１μｇ／ｍＬ又はおよそ１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよそ０．１ｎｇ／ｍＬ〜２５ｎｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ又はそれらの任意の組み合せが挙げられ得る。
細胞培養培地を順化細胞株に対する培地に暴露することにより予め順化することができる。順化細胞株の例として、本明細書に記載されるフィーダー細胞のいずれかを挙げることができる。例えば、細胞培養培地は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）順化培地であってもよい。ＭＥＦ順化培地は、ＤＭＥＭ培地、高グルコース（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＤ６４２９）、５ｇ／Ｌ又はおよそ１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／ＬのＤ−（＋）−グルコース（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＧ７０２１）、およそ１×ＭＥＭの非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＭ７１４５）、１０ｍＭ又はおよそ１ｍＭ〜２０ｍＭのＬ−グルタミン（例えば、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＧ７５１３）、１０ｍＭ又は１０ｍＭ〜２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの１５６３０１０６）、およそ１０％の哺乳動物の血清（例えば、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）胎仔血清、ウシ（ｃａｌｆ）胎仔血清、ウマ血清、ヒト血清、ヒト血漿等）を含むことができる。ＭＥＦ培地は、ＭＥＦ細胞の存在下で培養された後に「順化」となり得る。或る実施形態では、ＭＥＦ細胞を最低４８時間に亘り、細胞培養密度が少なくとも７０％まで培養する。
本明細書に記載される細胞培養培地のいずれかにおいて、細胞張力を調整する小分子及び薬物を栄養補助剤として添加して細胞の生存能及び増大を高めてもよい。例えば、ｒｈｏキナーゼは、繊維状アクチン（Ｆ−アクチン）（２つのタンパク質が、通常、アクトミオシン束又はフィラメントと呼ばれる）に結合する細胞骨格関連タンパク質であるミオシンＩＩに対するその作用により、細胞の収縮機構を調整するのに重要である。アクトミオシン束は骨格筋に見出される主要な収縮機構である。富化培地中のｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在により、細胞張力を減少することができ、細胞のサイズ、付着細胞強度の減少、及び細胞動態学的特性の増加をもたらし、より柔らかい（例えば、１０００Ｐａ〜２０００Ｐａ）と記載され得る基材表面弾性を真似ることができる。かかる商業的に入手可能な化合物／薬物として、ブレビスタチン（Ｓｔｒａｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．２００３）、ＭＬ−７及び９（Ｓａｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．１９８７）、Ｙ−２７６２３（Ｉｓｈｉｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｙ−２７６３２，ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅｓ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７（５）：９７６−８３）、カリキュリンＡ（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．１９８８）、並びに細胞骨格及びその上流の調節因子（ＲｈｏキナーゼＩ及びＩＩ、ミオシン軽鎖キナーゼであるＬＩＭキナーゼ）により生み出される細胞内の力を制御する等価物が挙げられる。上述の参考文献はいずれもその全体が参照により本明細書に援用される。
ブレビスタチンの構造は以下の通りである。
Figure 0006509745
ＭＬ−７の構造は以下の通りである。
Figure 0006509745
ＭＬ−９の構造は以下の通りである。
Figure 0006509745
Ｙ２７６２３の構造は以下の通りである。
Figure 0006509745
カリキュリンＡの構造は以下の通りである。
Figure 0006509745
かかる細胞張力調節補助剤は、中間径フィラメント、微小管及びアクトミオシンフィラメントに影響を及ぼすことができる。本明細書に記載される小分子／薬物は、圧力及び／又は低酸素環境条件によって調整される遺伝子及びタンパク質の発現を調整することができる。或る実施形態では、本明細書に記載される小分子及び／又は薬物による富化培地の補充を、本明細書に記載される圧力及び／又は低酸素条件に代えて使用することができ、標的細胞亜集団を正常酸素条件及び正常大気圧の下で培養することを可能とする。
上述の方法のいずれかは、細胞内で低酸素誘導因子の発現を増加する薬剤と共に培養することを含むことができる。低酸素誘導因子は、一般的には、低酸素閑居条件によって活性化される転写因子を指す。低酸素誘導因子の例として、限定されないが、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）、低酸素誘導因子−１β（ＨＩＦ−１β）、低酸素誘導因子２α（ＨＩＦ−２α）、低酸素誘導因子−２β（ＨＩＦ−２β）、低酸素誘導因子−３α（ＨＩＦ−３α）、及び低酸素誘導因子−３β（ＨＩＦ−３β）が挙げられる。特定の実施形態では、上記薬剤は、ＨＩＦ−１αの発現を増加する。上記薬剤は、低酸素誘導因子をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、上記薬剤は、本明細書に記載される低酸素誘導因子のいずれかに対するコーディング配列を含むことができる。コーディング配列は、ＨＩＦ−１αポリペプチドをコードすることができる。ＨＩＦ−１αポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
ＨＩＦ−１αのコーディング配列は、配列番号２に対して少なくとも７０％の相同性又は相補性を有するポリヌクレオチド配列を含むことができる。
薬剤は、低酸素誘導因子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターであってもよい。ベクターは、任意のプラスミド、ウイルス、ウイルスベクター、又は核酸の挿入又は取込みによって操作され得る当該技術分野で既知の他のビヒクルを含むことができる。例えば、遺伝子操作の目的で「クローニングベクター」を採用することができる。別の例として、挿入したポリヌクレオチドを転写又は翻訳するために「発現ベクター」を採用することができる。
ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイル、又はロタウイルスのゲノム、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）又はウシパピローマウイルスに基づくものであってもよい（Ｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９（１９８４）；Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｄ．，１９８２；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：４８６（１９８１）。発現に有用な追加のウイルスベクターとして、ノーウォークウイルス、コロナウイルス、パラミクソ及びラブドウイルス、トガウイルス（例えば、シンドビスウイルス及びセムリキ森林ウイルス）、パルボウイルス、及び水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）が挙げられる。
また、ベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）系ベクター（米国特許第５，５６１，０６３号）を含むことができる。腸管の細胞へ遺伝子を効率的に輸送するベクターが開発されている（例えば、米国特許第５，８２１，２３５号、第５，７８６，３４０号、及び第６，１１０，４５６号を参照されたい）。
ベクターは、一般的には、細胞内に増殖のための複製起点を含む。本明細書に述べられる、ベクター内に存在する発現制御因子を含む制御因子を、転写及び翻訳を容易にするために含めることができる。
好適な転写又は翻訳制御配列として、限定されないが、複製領域、プロモーター、エンハンサ―、リプレッサー結合領域、転写開始部位、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、並びに転写及び翻訳の終結部位が挙げられる。
本明細書で使用される「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、プロモーターの（３’方向の）下流に位置するコーディング領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。プロモーターは、構成的又は誘導性であってもよい。一般的に、プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端に結合され、上流（５’方向）に伸びてバックグラウンドを上回って検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小の塩基又は因子を含む。プロモーター配列内に転写開始部位、また同じくＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインが存在する。真核生物プロモーターは、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含む場合がある。
プロモーターの選択は、ベクターを導入する宿主細胞に大きく依存する。動物細胞については、様々なロバストなプロモーター、ウイルス及び非ウイルスプロモーターが当該技術分野で既知である。非限定的な代表的ウイルスプロモーターとして、ＣＭＶ、ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期のプロモーター、様々な種類のアデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）及びアデノ随伴ウイルスのプロモーターが挙げられる。また、かかる対照配列が宿主細胞系と互換性がある限り、所望の軽鎖又は重鎖遺伝子と正常に関連するプロモーターを利用することが可能であり、またそれが望ましいことが多い。
他の真核生物に好適なプロモーター配列として、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、又はエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼ等の他の糖分解酵素のプロモーターが挙げられる。成長条件により制御される転写の追加的な利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素及び上述のグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース及びガラクトースの利用に関与する酵素のプロモーター領域である。
ベクターを、形質移入、ウイルス形質導入等の当該技術分野で既知の任意の手段によって培養細胞中に導入することができる。形質移入の方法は、物質の取込みを可能とするため細胞膜に一時的に孔又は「穴」をあけることを含むことができる。形質移入を、例えば、リン酸カルシウムを使用して、エレクトロポレーションにより、光学形質移入により、インペルフェクションにより、流体力学輸送により、遺伝子銃により、マグネットアシストトランスフェクションにより、カチオン性脂質と、細胞膜と融合してそれらの積荷を内部に置くリポソームを製造するための材料とを混合することにより、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミン等のカチオン性ポリマーの使用により行うことができる。
標的細胞の同定
本明細書に記載される基材、細胞培地、環境条件、及び／又は細胞培養方法は、標的細胞亜集団が１又は複数の異なる形態学的特性及び／又は動態学的性質をとることを可能とする。異なる形態学的特性及び／又は動態学的性質のいずれかを標的細胞亜集団のメンバーを区別及び／又は同定するために使用することができる。形態学的特性及び／又は動態学的性質の例は本明細書に記載される。したがって、本発明は、本発明の基材上への播種に際して、本明細書に記載される細胞培養培地における培養に際して、及び／又は本明細書に記載される環境条件下での培養に際して、標的細胞によって採用される１又は複数の異なる形態学的特性及び／又は動態学的性質の提示に基づいて標的細胞亜集団のメンバーを同定及び／又は選択する方法を提供する。
標的細胞亜集団のメンバーの同定及び／又は選択のかかる方法は、標的細胞同定のための陽性選択抗体の使用に対する必要性をなくすことができる。したがって、或る実施形態では、標的細胞亜集団のメンバーの同定及び／又は選択の方法は、陽性選択抗体の使用を含まない。しかしながら、標的細胞亜集団のメンバーの同定及び／又は選択の方法は、場合によっては、陽性選択抗体の使用を含む。例えば、標的細胞亜集団のメンバーの同定及び／又は選択の方法は、前記メンバーが１又は複数の異なる形態学的特性及び／又は動態学的性質を提示する場合に、及び／又は前記メンバーが陽性選択抗体で検出可能に標識化される場合、前記メンバーを同定することを含むことができる。
本明細書に記載される標的細胞亜集団のメンバーの同定及び／又は選択の方法は、標的細胞同定のための陰性選択抗体の使用に対する必要性をなくすことができる。したがって、或る実施形態では、標的細胞亜集団のメンバーの同定及び／又は選択の方法は、陰性選択抗体の使用を含まない。しかしながら、標的細胞亜集団のメンバーの同定及び／又は選択の方法は、場合によっては、陰性選択抗体の使用を含むことができる。例えば、標的細胞亜集団のメンバーの同定及び／又は選択の方法は、前記メンバーが１又は複数の異なる形態学的特性及び／又は動態学的性質を提示する場合に、及び／又は前記メンバーが陰性選択抗体で検出可能に標識化されない場合、前記メンバーを同定することを含むことができる。
コンピュータ可読媒体
また、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの方法を実行するように構成されるコンピュータによる遂行可能なコードを含むコンピュータ可読媒体を提供する。上記コンピュータ可読媒体は、標的細胞亜集団の半自動化又は自動化された同定、列挙、及び／又は分類のための方法を実行することができる。標的細胞亜集団の同定、列挙、及び／又は分類は、本明細書に記載される条件下での培養に際して細胞がとる１又は複数の形態学的特性及び／又は動態学的特性に基づいてもよい。標的細胞亜集団の同定、列挙、及び／又は分類は、本明細書に記載される本発明の基材上への播種に際して細胞がとる１又は複数の形態学的特性及び／又は動態学的特性に基づいてもよい。細胞の１又は複数の形態学的特性及び／又は動態学的特性は、経時的に評価されてもよい。例えば、細胞の１又は複数の形態学的特性及び／又は動態学的特性は、図９に示される座標システム９００において経時的に評価されてもよい。上記ソフトウェアは、培養皿又はウェル９１０中の基材上に検出された標的細胞亜集団の場所を参照するため仮想の座標システム９２０を作るように構成される。仮想座標システムは使用者が規定した原点（「原点」）９３０に培養皿を並べることにより伝播され、計測可能なベクター象限で作製された仮想グリッド９２０が９００の上に置かれる。最も好ましい実施形態では、仮想座標システムを画像取得システムにより使用して、培養皿の表面全体に亘って自動化タイムラプス取込みを促進する。使用されている標準サイズの培養皿及び／又はウェルの幾つかの例として、１０ｍｍ、３５ｍｍ、６０ｍｍ、及び１００ｍｍ、並びに高度なマルチウェルプレート（例えば、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、１０５６ウェル、１５３６ウェル、又は３４５６ウェル）のウェルが挙げられるが、他のサイズの培養皿も考慮される。或る一つの実施形態では、操作者は、特定の目的の具体的なコロニーの場所に立ち戻ることができ、細胞をマイクロマニピュレーター及びトランスジェクタの使用により採取することができる。個別の細胞を、標的化生体医学研究における使用のために捕捉してもよく、又は更なる培養実験のために回収して使用することができる。
コンピュータ可読媒体は、自動的に画像を取込み、再結合し、再編成し、及び／又は最適化するために座標システム９００を使用してもよい。例えば、コンピュータ可読媒体は、任意の数の近傍領域を含む画像をスティッチしてもよい。この自動化スティッチングプロセスは、所与の時間点について単一のスティッチした画像を作成することができる。場合によっては、スティッチした画像は、およそ２５〜およそ２００の画像を包含することができる。スティッチした画像は、それによって画像を圧縮してファイルサイズを減少する初期化プロセスを経る場合がある。コントラストに基づくフィルタをスティッチした画像に適用することができる。
コンピュータ可読媒体は、細胞の総数、生存及び非生存細胞の数、活発に分裂している細胞の数及びセルコロニーの数、生存細胞と非生存細胞の比率、分裂細胞と非分裂細胞の比率を決定することができる。患者のＣＴＣｓの攻撃性又は悪性度を特定するためにかかる分析を使用することができる。例えば、急速に分裂する細胞を「攻撃的」、例えば、転移性のクラスのＣＴＣｓとすることができる。
同定及び分類パラメーター
コンピュータ可読媒体は、標的細胞亜集団を同定し、特性評価するため、本明細書に記載される細胞の形態学的特性及び／又は動態学的特性のいずれかを使用するソフトウェアを含むことができる。例えば、コンピュータ可読媒体は、標的細胞亜集団を同定し、分類するために下記パラメーター、すなわち、細胞サイズ、細胞形状、細胞運動、核サイズ及び細胞分裂速度を使用してもよい。上記ソフトウェアは、標的細胞亜集団を分類するためにかかるパラメーターをアルゴリズムへと統合することができる。上記ソフトウェアは、周期的にパラメーターを加工することができ、例えば、マルチコアコンピュータチップを使用して順次に又は接線方向のいずれかに加工することができる。使用者は、前記パラメーターの各々に対して異なる重み付けをしてもよい。
細胞検出の向上
或る実施形態では、標的細胞亜集団の可視化は、細胞透過性色素及び／又は細胞付着タンパク質に対する抗体の使用により増強され得る。細胞透過性蛍光色素を、全般的な細胞及び核の形状、大きさ、及び数を特定するための分析ソフトウェアを支援するために使用してもよい。当業者に既知の幾つかの細胞透過性色素が存在する。或る非限定的な例として、カルシウム系色素（例えば、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣａｌｃｉｕｍ−Ｇｒｅｅｎ−１ ＡＭ）又は蛍光複合でキストランが挙げられる。
また、ミトコンドリアの可視化により分析ソフトウェアを支援してもよい。ミトコンドリア特異的抗体又は浸透性色素（例えば、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（商標））を使用して、標的細胞亜集団の検出を増強してもよい。更に、所与の細胞亜集団又はコロニーに関してミトコンドリアが全くないこと又は過剰なミトコンドリアを下位分類の追加的なパラメーターとして使用することができるが、当業者であれば検出を支援するために使用され得る他の細胞透過性蛍光色素が存在し得ることを認識するであろう。
細胞付着分子等の細胞表面分子に対する抗体を使用して、標的細胞亜集団の検出を増強することもできる。標的細胞亜集団に印をつける既知のバイオマーカーにより分析ソフトウェアを支援することができる。検出部分に複合化された標的化抗体を使用して検出を向上することができ、具体的なバイオマーカーの存在に基づいて下位分類することができる。ＣＴＣｓに対する既知のバイオマーカーとして、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、及びＣＤ１３３が挙げられるが、当業者であれば同定された他のバイオマーカーが存在することを認識するであろう。非評定細胞亜集団において発現されるが、一般的には発現されない既知のバイオマーカー、又は標的細胞亜集団においてはより低レベルで発現する既知のバイオマーカーの使用により、分析ソフトウェアを支援することができる。非標的細胞に対して選択的である既知のバイオマーカーとして、とりわけ、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ３４、及び線維芽細胞表面タンパク質が挙げられる。
図１０は、細胞の検出を増強したそのような一例である（図をカラー画像から採用した）。パネルＡは、本発明の方法を使用して培養した標識化癌細胞を示し、細胞のミトコンドリアをＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒで標識化する。パネルＢは、細胞付着タンパク質であるパキシリンに対する蛍光複合抗体で標識化した癌細胞を示す。
コンピュータシステム
また、本発明は、本開示の方法を実行するように構成されるコンピュータシステムを提供する。上記システムは、本明細書に記載される方法を実行するようにプログラムされたコンピュータサーバー（「サーバー」）を含むことができる。図１１は、使用者が細胞の画像を検出、分析及び加工することが可能なように適合されたシステム１１００を示す。システム１１００は、本明細書に記載される例示的方法を実行するようにプログラムされた中央コンピュータサーバー１１０１を含む。サーバー１１０１は、シングルコアプロセッサ、マルチコアプロセッサ、又は複数の並行処理用プロセッサであってもよい、中央処理装置（ＣＰＵ、「プロセッサ」とも呼ぶ）１１０５を含む。また、サーバー１１０１は、メモリ１１１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置１１１５（例えば、ハードディスク）、１又は複数の他のシステムと通信するための通信用インターフェース１１２０（例えば、ネットワークアダプタ）、並びにキャッシュ、他のメモリ、データ記憶装置、及び／又は電子ディスプレイアダプタを含み得る周辺機器１１２５を含む。メモリ１１１０、記憶装置１１１５、インターフェース１１２０、及び周辺機器１１２５は、マザーボード等の通信バス（実線）を通じてプロセッサ１１０５と通信状態にある。記憶装置１１１５は、データを記憶するためのデータ記憶装置であってもよい。サーバー１１０１、通信インターフェース１１２０の支援によりコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１１３０に制御可能に連結される。ネットワーク１１３０は、インターネット、イントラネット及び／又はエクストラネット、インターネット、テレコミュニケーション、若しくはデータネットワークと通信状態にあるイントラネット及び／又はエクストラネットであってもよい。ネットワーク１１３０は、場合によっては、サーバー１１０１の支援により、サーバー１１０１に連結されたデバイスをクライアント又はサーバーとして振る舞うことを可能とし得る。顕微鏡及びマイクロマニピュレーターは、周辺機器１１２５又はリモートコンピュータシステム１１４０であってもよい。
記憶装置１１１５は、個々の画像、タイムラプス画像、個々の細胞に関するデータ、細胞コロニー、又は本発明と関連する任意の態様のデータ等のファイルを記憶することができる。データ記憶装置１１１５は、仮想グリッドにおいて細胞の場所に関係するデータと連結されてもよい。
サーバーは、ネットワーク１１３０を通じて１又は複数のリモートコンピュータシステムと通信することができる。１又は複数のリモートコンピュータシステムは、例えば、パーソナルコンピュータ、ラップトップ、タブレット、電話、スマートフォン、又はパーソナルデジタルアシスタントであってもよい。
或る状況では、システム１１００は、単一のサーバー１１０１を含む。他の状況では上記システムは、イントラネット、エクストラネット及び／又はインターネットを通じて互いに通信状態にある複数のサーバーを含む。
サーバー１１０１を、細胞増殖情報、例えば、細胞のサイズ、形態学、形状、遊走能、増殖能力、動態学的特性、及び／又は潜在的な関連性の他の情報等を記憶するように適合することができる。かかる情報を、記憶装置１１１５又はサーバー１１０１に記憶することができ、かかるデータをネットワークを通じて伝送することができる。
本明細書に記載される方法を、サーバー１１０１の電子記憶場所上に保存された機械（例えば、コンピュータプロセッサ）コンピュータ可読媒体（又はソフトウェア）、例えば、メモリ１１１０又は電子記憶装置１１１５等により実行することができる。使用中、コードをプロセッサ１１０５により遂行することができる。場合によっては、コードを記憶装置１１１５から受け取って、プロセッサ１１０５による容易なアクセスのためメモリ１１１０上に記憶することができる。或る状況では、電子記憶装置１１１５を排除することができ、機械により遂行可能な指示をメモリ１１１０上に記憶する。代替的には、コードを第２のコンピュータシステム１１４０上で遂行することができる。
サーバー１１０１等の本明細書で提供されるシステム及び方法の態様は、プログラミングにおいて具体化され得る。技術の様々な態様を、典型的には機械（又はプロセッサ）実行可能コード及び／又は機械可読媒体（例えば、コンピュータ可読媒体）の型で運搬されるか、又はそれに具現化される関連データの形態の「製品」又は「製造品」と考えてもよい。機械遂行可能コードを、メモリ（例えば、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）又はハードディスクのような電子記憶装置上に記憶することができる。「記憶」型媒体は、ソフトウェアプログラミングについて随時に非一時的記憶を提供し得る、コンピュータ、プロセッサ等の有形メモリ、又は様々な半導体メモリ、テープデバイス、ディスドライブ等のその関連するモジュールのいずれか又はそれらの全てを含むことができる。ソフトウェアの全部又は一部は、時には、インターネット又は様々な他の電気通信網を通じて通信され得る。かかる通信は、例えば、１つのコンピュータ又はプロセッサから別のコンピュータ又はプロセッサへの、例えば、管理サーバー又はホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへのソフトのローディングを可能とし得る。そのため、ソフトウェア要素を運搬し得る別の種類の媒体として、有線及び光固定電話網、並びに様々なエアリンクを通じて周辺デバイス間の物理的インターフェースを越えて使用されるような光波、電波、及び電磁波が挙げられる。有線若しくは無線、光リンク等のかかる電波を輸送する物理的要素もまた、ソフトウェアを運搬する媒体とされ得る。本明細書で使用される、非一時的に制限されない限り、コンピュータ又は機械「可読媒体」等の有形「記憶」媒体の用語は、遂行のためプロセッサに対する支持の供給に関与する任意の媒体を指す。
したがって、コンピュータ遂行可能コード等の機械可読媒体は、多くの形態をとってもよく、限定されないが、有形記憶媒体、搬送波媒体、又は物理的伝送媒体が挙げられる。非揮発性記憶媒体として、例えば、任意のコンピュータ（複数の場合がある）等におけるいずれかの記憶デバイス等の光学又は磁気ディスクが挙げられ得、かかるものをシステムの実行に使用してもよい。有形伝送媒体として、同軸ケーブル、銅線、及び光ファイバ（コンピュータシステム内のバスを備えたワイヤを含む）が挙げられ得る。搬送波媒体は、電気信号若しくは電磁信号、又は無線周波数（ＲＦ）及び赤外線（ＩＲ）データ通信の間に生成されるもの等の音波若しくは光波の形態をとり得る。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態として、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、他の任意の光媒体、パンチカード、ペーパーテーム、穴のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、その他のメモリチップ若しくはカートリッジ、搬送波輸送データ若しくは指示、ケーブル、又はかかる搬送波を搬送するリンク、又はコンピュータがプログラミングコード及び／若しくはデータを読み取ることができる他の任意の媒体が挙げられる。コンピュータ可読媒体のこれらの形態の多くは、遂行のためプロセッサに１又は複数の指示の１また複数の配列を輸送するのに関与してもよい。
細胞モニタリングの結果を、グラフィカルユーザーインターフェース等のユーザーインターフェースの支援により使用者に提示することができる。
細胞画像化システム
また、本発明は細胞画像化システムを提供する。細胞画像化システムは、細胞集団の細胞に対応する画像データを作成するように構成されてもよい。細胞画像化システムは、初代細胞に対応する画像データを作成するように構成されてもよい。細胞画像化システムは、標的細胞亜集団のハイコンテント分析用に構成されてもよい。
細胞画像化システムは、顕微鏡を備えてもよい。顕微鏡は、システムハードウェアを備えてもよい。システムハードウェアは、顕微鏡制御のためのハードウェアを備えてもよい。例示的な顕微鏡ハードウェア制御は、オープンソースのｊａｖａベースの画像取込みソフトウェア、μＭａｎａｇｅｒ（参照により本明細書に援用される、Ａｒｔｈｕｒ Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）、参照により本明細書に援用される、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ Ｕｓｉｎｇ μＭａｎａｇｅｒ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４．２０．１−１４．２０．１７）に加えて開発される。カスタムドライバ及びスクリプトを以下の顕微鏡に必須の周辺機器、すなわち、画像取込みカメラ、カメラシャッター、電動リニアエンコードＸＹステージ、ピエゾ駆動Ｚ軸ステッパ、及び近赤外に基づくオートフォーカスのいずれかを制御するために使用することができる。
顕微鏡は倒立顕微鏡であってもよい。倒立顕微鏡は、カスタマイズされた環境チャンバを備えてもよい。特注の環境チャンバは、培養細胞の生存能を維持するのに適した環境条件（例えば、温度、ＣＯ２、酸素、圧力）を提供するように構成されてもよい。環境条件は、標的細胞亜集団の成長に適した本明細書に記載されるいずれかの条件であってもよい。カスタマイズされた環境チャンバは、温度、ＣＯ２、及び酸素レベルを例えば０．１％の精度で調節する。顕微鏡は、蛍光能を有する５倍、１０倍、２０倍、４０倍のノンオイル対物レンズを備えることができるが、他の対物レンズも考慮される。倒立顕微鏡は、細胞の検出のためコントラストを高めるため位相シフトした変更フィルタを有する、電動式ステージ及び明視野光源を有するハードウェアに基づくオートフォーカシングを備えてもよい。光源は、ハロゲン、キセノン、水銀、固体レーザ、又は発光ダイオードであってもよい。
細胞画像化システムは、コンピュータシステムを更に備えてもよい。コンピュータシステムは、本明細書に記載されるようなものであってもよい。或る実施形態では、コンピュータシステムは、本明細書に記載されるコンピュータ可読媒体を備える。
本明細書に記載されるいずれかの方法では、標的細胞亜集団のメンバーは、例えば、顕微操作を使用して採取され得るか、印付けられ得る。顕微操作を、電動式マイクロマニピュレーター及びトランスジェクタ又はレーザ顕微解剖を含む、当該技術分野で既知の任意の技術を使用して行うことができる。使用者は、特定のコロニー又は特定の目的の細胞の場所に立ち戻ることができる。これにより、例えば、使用者が単一細胞レベルで標的化された生物医学研究のため、更なる培養実験用の細胞を回収するため、又は化学感受性試験を行うため、個別に細胞を捕得ることを可能とする。したがって、細胞画像化システムは、マイクロマニピュレーターを更に備えることができる。
電動式マイクロマニピュレーター及びトランスジェクタの例を図１２に示す。パネルＡは、単一細胞選択を示し、電動式マイクロマニピュレーター（矢印）の注入針／選択針が癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）に由来する細胞のコロニーから単一の癌細胞を単離する。パネルＢは、蛍光複合デキストランを伴う単一の細胞の注入を示し、白色矢印は、注入されていない癌細胞を指す（カラー画像から適合させた画像）。
図１３は、自動化細胞培養及び／又はハイコンテント分析用に構成された細胞画像化システム１３００の例を示す。システム１３００は、明視野であってもよく、位相に基づく光学顕微鏡に対して照明を供給することができる光源１３０５を含む。光源１３０５は、フィラメント又は発光ダイオード（ＬＥＤ）に基づいてもよい。また、システム１３００は、タレット１３１０による位相差リングを含むことができる。或る例では、タレットは、電動化され、互換性の位相差リングを適切な対物レンズ１３４５と対にすることができる。
システム１３００は、集光器１３１５を含んでもよい。場合によっては、集光器１３１５は、場合によって細胞のコントラストを改善することができる光源を集中するために使用してもよい。また、システムは、細胞セレクタ（例えば、細胞ピッカー）１３２０を含んでもよい。或る例では、細胞セレクタは、単一の細胞を選択することができる（例えば、マイクロマニピュレーターに基づく細胞選択針又はレーザ支援微小解剖手段）。
システム１３００は、液体ディスペンサ１３２５を備えてもよい。液体ディスペンサ１３２５を培地の輸送又は転送を操作するための機構として使用することができる。液体ディスペンサは、シリンジに基づくものであってもよい。液体ディスペンサ１３２５は、マルチウェルプレート（例えば、１ウェル、２ウェル、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、９６ウェルのプレート等）へと液体を分配するため、１又は複数の分配口（例えば、１、２、６、１２、２４、９６等）を備えることができる。場合によっては、液体ディスペンサは、自動化液体分配能力を有するアドオンモジュール式であってもよい（例えば、エッペンドルフのｅｐＭｏｔｉｏｎ，ＧＥ’ｓ ＩＮ ＣＥＬＬ Ａｎａｌｙｚｅｒ６０００）、
システム１３００は、プレートローダー１３３０を備えてもよい。プレートローダー１３３０は、最小で１、２、３、４、５、６、１０、１５、２０、２５、又は３０のプレートを保持する能力を有することができる電動式プレートコンテナを備えてもよい。プレートローダーは、追加のプレートの収容力を可能とするモジュール構成を有することができる。場合によっては、プレートローダーは、ロボット制御でプレートを操作し、例えば、画像化のため顕微鏡のＸ−Ｙステージにプレートを置くことができる（例えば、ＡＳＩのロボットプレートローダー）。
システム１３００は、Ｘ−Ｙステージ１３３５を備えてもよい。Ｘ−Ｙステージ１３３５は、正確な動きのためにリニアエンコーダーを含んでもよい。Ｘ−Ｙステージ１３３５は、単一のプレートを保持することができるステージで構成されてもよい（例えば、ＡＳＩ ＭＳ−２０００フラットトップＸＹＺ自動化ステージ）。Ｘ−Ｙステージ１３３５は、１、２、３、４、５、６又はそれより多いプレートを同時に保持する能力を有する大きなフォーマットステージで構成されてもよい。
システム１３００は、Ｚ−ステッパ１３４０を備えることができる。Ｚ−ステッパは、例えば、多平面画像化に使用され得る、電動式、ピアゾ駆動のＺ軸制御であってもよい。
システム１３００は、１又は複数の対物レンズを備えることができる。対物レンズは、およそ、１倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍及び／又は１００倍であってもよい。場合によっては、対物レンズ１３４５は、電動式対物レンズタレットに取り付けられる。対物レンズ１３４５は、位相対物レンズであってもよい。対物レンズ１３４５は、明視野及び蛍光画像化の両方に適した顕微鏡対物レンズ（例えば、Ｚｅｉｓｓ Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ対物レンズ）であってもよい。或る実施形態では、対物レンズ１３４５は、ハードウェアに基づくオートフォーカスシステム（例えば、ＮｉｋｏｎのＰｅｒｆｅｃｔ Ｆｏｃｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ）と互換性でなくてはならない。
システム１３００は、オートフォーカスシステム１３５０を含むことができるものであってもよい。オートフォーカスシステム１３５０は、ハードウェアに基づく画像オートフォーカシング（例えば、ＮｉｋｏｎのＰｅｒｆｅｃｔ Ｆｏｃｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用することができる。
システム１３００は、フィルタ１３５５を含むことができるものであってもよい。フィルタ１３５５は、照明フィルタであってもよい。フィルタ１３５５は、二色性であってもよい。二色性の鏡を蛍光画像化に対して適切な励起フィルタ及び発光フィルタと共に使用することができ、互換性波長は、例えば、およそ３６０ｎｍ、４８８ｎｍ、及び５６８ｎｍであってもよい。
システム１３００は、カメラ１３６０を備えることができる。カメラ１３６０は、電荷結合素子（ＣＣＤ）又は相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）であってもよい。カメラ１３６０は、蛍光、明視野又は両方と互換性であってもよい。カメラ１３６０は、液冷式であってもよい。カメラ１３６０は、広視野であってもよい。カメラ１３６０は、広角撮像センサであってもよい。また、カメラ１３６０は、裏面照明基づく画像センサを備えてもよい。カメラ１３６０は、情報を伝送する能力を備えてもよい。情報を伝送する能力は、既知の高速転送法（例えば、ファイヤワイヤ又はＵＳＢ３．０ポート）であってもよい。
システム１３００は、環境チャンバ１３６５を含むことができる。環境チャンバ１３６５は、密閉され、光制御された（例えば、暗）環境を備えることができる。環境チャンバ１３６５は、エアロックシステムを使用してもよい。場合によっては、エアロックシステムの使用を、実験を進めながら１又は複数のプレートへのアクセスが必要な場合に使用することができる。また、環境チャンバ１３００は、加圧環境を支持する能力を備えることもできる。場合によっては、加圧環境は、標準的な大気圧に対しておよそ１ＰＳＩ、２ＰＳＩ、３ＰＳＩ、４ＰＳＩ、５ＰＳＩ、６ＰＳＩ、７ＰＳＩ、８ＰＳＩ、９ＰＳＩ、１０ＰＳＩ、１１ＰＳＩ、１２ＰＳＩ、１３ＰＳＩ、１４ＰＳＩ、１５ＰＳＩであってもよい（例えば、標準的な大気圧は１４．７ＰＳＩＡ）。或る実施形態では、環境チャンバ１３６５は、滅菌又は清掃プロトコルを支持するように構築される。或る実施形態では、環境チャンバは、除湿、加熱、真空加圧制御及び／又はそれらの任意の組み合せを備えてもよい。
システム１３００は、マニピュレーター１３７０を備えてもよい。マニピュレーター１３７０を細胞セレクタ１３２０を制御するために使用してもよい。マニピュレーター１３７０は、使用者（例えば、ジョイスティック）により制御されてもよく、又はソフトウェアによって制御されてもよい。マニピュレーターは、単一細胞の操作用に機械的であってもよく、また圧力ハブであってもよい。（例えば、エッペンドルフトランスジェクタ、マニピュレーター、Ｃｅｌｌ ＴＲＡＭ ＶＡＲＩＯ（商標））
システム１３００は、液体操作モジュール１３７５を備えてもよい。液体操作モジュール１３７５を液体（例えば、媒体、廃棄媒体）用の貯蔵槽として使用することができる。液体操作モジュール１３７５を１又は複数の液体を支持するために使用することができる。液体操作モジュール１３７５は、場合によっては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び／又は２０の溶液を支持することができる。或る実施形態では、液体操作モジュール１３７５は、自動化滅菌キャピラリを備えることができる。
システム１３００は、調湿制御装置１３８０を備えることができる。調湿制御装置１３８０を使用して除湿することができる。場合によっては、除湿は、画像化を増強し、内部電子回路の寿命を延ばす場合がある。
システム１３００は、加熱素子１３８５を備えることができる。加熱素子１３８５は、環境チャンバ１３６５の内容物を温めるために使用され得る。或る実施形態では、環境チャンバの内容物を、摂氏およそ２６度、２７度、２８度、２９度、３０度、３１度、３２度、３３度、３４度、３５度、３６度、３７度、３８度、３９度、４０度、４１度、４２度、４３度、４４度、又は４５度まで加熱し得る。或る実施形態では、加熱素子１３８５は、自動化フィードバックにより温度を制御することができる一体型温度システムを備える。
システム１３００は、気体インレット１３９０を備えることができる。気体インレット１３９０は、一体型気体制御及び個別の気体ラインに対するサポート（例えば、二重弁サポート）を備えることができる。場合によっては、気体インレット１３９０は窒素、二酸化炭素及び／又は酸素等の大気ガスのレベルを制御することができる。
システム１３００は、加圧真空ポンプ１３９２を備えることができる。加圧真空ポンプ１３９２は、圧力ゲージ及び／又は一体型圧力センサ若しくはマニホルドを備えることができる。加圧真空ポンプ１３９２は、大気圧に対しておよそ１ＰＳＩ、２ＰＳＩ、３ＰＳＩ、４ＰＳＩ、５ＰＳＩ、６ＰＳＩ、７ＰＳＩ、８ＰＳＩ、９ＰＳＩ又は１０ＰＳＩの圧力を供給する能力を有し得る。或る実施形態では、加圧真空ポンプ１３９２は、１０立法フィート〜１８立法フィートの推定されるおよその体積に対して圧力を供給することができる。
システム１３００は、蛍光光源１３９４を備えることができるものであってもよい。蛍光光源１３９４は、キセノンであってもよい。蛍光光源１３９４は、水銀系ランプによるものであってもよい。蛍光光源１３９４は、固体状態、又はレーザダイオード系照明光源によるものであってもよい。
システム１３００は、データ記憶１３９６を備えることができる。データ記憶１３９５用のシステムは、任意の数の記憶タイプの媒体を備えることができ、それらは、コンピュータ、プロセッサ等の任意の若しくは全ての有形記憶、又は様々な半導体メモリ、磁気テープドライブ、ディスクドライブ等のその関連するモジュールを含むことができ、これらはソフトウェアプログラミングに対していつでも非一時的記憶を提供し得る。また、データ記憶用システムは、例えば、インターネット又は様々な他の電気通信網を通す、任意の数のデータ通信タイプを備えることができる。ローカルデバイス間で物理的インターフェースを越えて、有線及び固定電話網により、並びに様々なエアリンクに亘って使用されるように、データを光学的、電気的、及び／又は電磁波により伝送してもよい。有線又は無線等、光リンク等のかかる波を搬送する物理的要素は、データ記憶用システムの一部であってもよい。非一時的に制限されない限り、コンピュータ又は機械「可読媒体」等の本明細書で使用される有形データ記憶媒体の用語は、遂行用プロセッサに対する支持の供給に関与する任意の媒体を指す。したがって、データ記憶は多くの形態をとる可能性があり、限定されないが、有形の記憶媒体、搬送波媒体、又は物理的伝送媒体が挙げられる。不揮発性記憶媒体として、例えば、任意のコンピュータ（複数の場合がある）における記憶装置のいずれか等の光学ディスク又は磁気ディスクが挙げられ得、それらは上記システムを実行するために使用され得る。有形の伝送媒体として、同軸ケーブル、銅線、及び光ファイバ（コンピュータシステム内のバスを萎えたワイヤを含む）が挙げられ得る。搬送波伝送媒体は、電気信号若しくは電磁信号の形態、又は無線周波数（ＲＦ）及び赤外線（ＩＲ）データ通信中に生じるもののような音波若しくは光波の形態をとってもよい。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態として、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、他の任意の光媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンによる任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップ又はカートリッジ、データ又は指示を伝送する搬送波、ケーブル、若しくはかかる搬送波を伝送するリンク、又はそれからコンピュータがプログラミングコード及び／若しくはデータを読み取る可能性がある任意の他の媒体が挙げられる。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、記憶のためのデータ搬送に関与し得る。或る実施形態では、データ保存用のシステムは、マルチコアプロセッサであってもよい。
システム１３００は、機器アクセスドア１３９８を備えることができる。機器アクセスドア１３９８は、プレートローダー１３３０及び／又は環境チャンバ１３６５へのエントリのポートを提供し得る。機器アクセスドア１３９８は、エアロックシステムを統合してもよい。
システム１３００は、本明細書に記載される本発明のハイスループットの使用のためのプラットフォームを提供することができる。例えば、システム１３００は、顕微鏡を備えてもよい。顕微鏡は、倒立顕微鏡であってもよい。顕微鏡は、生存細胞の画像化及び／又はハイコンテント分析用に構成され得る。ハイコンテント、生存細胞画像化のため構成された顕微鏡は、幾つかの販売業者、例えば、とりわけ、ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｃｙｔａｔｉｏｎ（商標））、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（Ｌｉｇｈｔｓｈｅｅｔ Ｚ．１ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＰｒｉｍｏＶｅｒｔ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＬＬＣ（ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ ＸＬＳ Ｗｉｄｅｆｉｅｌｄ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ＣｌｏｎｅＳｅｌｅｃｔ（商標） Ｉｍａｇｅｒ）、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＣｅｌｌＡＳＩＣ（商標））、Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｉｏｓｔａｔｉｏｎ ＣＴ）を通じて商業的に入手可能である。ハイスループットの顕微鏡及び画像化システムの例は、参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００４０１５２１８８号に記載される。
キット
また、本発明は、本発明の１又は複数の方法を実施するのに有用なキット及び／又は細胞培養システムを提供する。キット及び／又は細胞培養システムは、（ｉ）本明細書に記載される基材を含む細胞培養プレート、（ｉｉ）本明細書に記載される細胞培養培地、若しくはその成分、（ｉｉｉ）本明細書に記載される細胞培養インキュベータ、（ｉｖ）本明細書に記載される細胞画像化システム、及び／又は（ｖ）本明細書に記載される基材、若しくはその成分の組み合せを含むことができる。また、キットは、標的細胞亜集団の培養及び／又は同定のための細胞培養プレート、細胞培養培地、インキュベータ、及び画像化システムの１又は複数の使用に関する指示書を含んでもよい。上記指示書は、標的細胞亜集団の成長に適した環境条件における指示培養を含んでもよい。環境条件は本明細書に記載される。例えば、指示書は、陽圧条件下で標的細胞を培養するための指示文を含んでもよい。圧力条件の例は、本明細書に記載される。例えば、指示書は、低酸素条件下で標的細胞を培養する指示文を含んでもよい。低酸素条件の例は本明細書に記載される。
細胞培養システム１４００の実施形態の例を図１４に示す。細胞培養システム１４００は、本明細書に記載される細胞インキュベータ１４１０を備えることができ、インキュベータ１４１０は、標的細胞亜集団の成長に適した１又は複数の環境条件を提供するように構成される。細胞インキュベータは、本明細書に記載される顕微鏡（示されていない）を備えてもよい。顕微鏡は、標的細胞亜集団の１又は複数のメンバーを画像化するために構成されてもよい。顕微鏡は、顕微鏡の閉鎖環境チャンバ内にあってもよい。顕微鏡は、コンピュータシステム１４２０に制御可能に連結されてもよい。コンピュータシステムは、例えば、画像表示用のモニター及びキーボードを備えることができる。細胞培養システム１４００は、標的細胞の同定のためのソフトウェアを含むコンピュータ可読媒体１４３０を含むことができる。コンピュータ可読媒体１４３０は、コンピュータシステム１４２０に統合されてもよい。上記システムは、本明細書に記載される基材１４４０を備えることができる。基材を標的細胞亜集団の選択的な付着及び／又は成長を促進するように構成することができる。上記システムは、本明細書に記載される細胞培養培地１４５０を備えることができる。
本発明の使用例
本発明の実用的な適用が幾つか存在する。希少な標的亜集団の細胞を富化する能力は、基礎研究、医療、医学研究、薬物及び生物製剤の開発及び発見、ハイスループットスクリーニング、抗体開発、並びにワクチン開発に使用される商品として価値を有する。ＣＴＣｓ、ＣＳＣｓ、ＨＳＣｓ及びＥＰＣｓは、血液中を循環する細胞の例であるが、実用的な実験目的又は医療目的に十分な量で単離及び富化することが困難であった。本発明の方法、キット及び／又はシステムのいずれかの使用により、試料１ｍｌ当たり１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、又は１個の濃度の標的細胞、又は試料１ｍｌ当たり平均１個未満の標的細胞の濃度で標的細胞が試料中に存在する場合に体液試料又はその派生物からの標的細胞の単離及び富化を可能とする。例えば、本発明の方法、キット、及び／又はシステムのいずれかは、標的細胞が、試料１ｍｌ当たり約０．８個の標的細胞（例えば、２０ｍｌの血液中に１６個の標的細胞）、又は血液１ｍｌ当たり０．６個の標的細胞（例えば、２０ｍｌの血液中に１２個の標的細胞）の濃度で試料中に存在する場合に、体液試料又はその派生物から標的細胞亜集団の単離及び富化を可能とする。本発明の別の適用では、変化する機能的特性を有する培養した標的細胞亜集団は、高度に標的化されたバイオマーカーの開発用プラットフォームを提供することができる。ゲノム分析、プロテオーム分析、及び代謝分析をこれらの培養細胞に行うことができ、これらの希少な細胞の商業的に入手可能な供給源を作製する能力は、癌治療法の開発（例えば、創薬）、癌クチン、癌スクリーニング及び診断、個別化抗体の開発、造血幹細胞の移植、臓器移植、並びに心臓血管疾患の治療に使用される新規なバイオマーカーの同定に重要である。
個別化医療
標的細胞亜集団を個別化医療に使用することができる。ＣＴＣｓ及びＣＳＣｓの例では、細胞を化学感受性試験に使用することにより、培養したＣＴＣｓについて、また、所与の薬物の有効性を決定するための細胞生存能及び細胞分裂速度の計測を含むＣＴＣｓに対する化学療法薬物の効果の決定に対して標準的及び探索の化学療法計画を試験することができる。本発明の別の適用は、患者が治療を経るにつれて患者のＣＴＣ集団の連続的なモニタリングによって、行われる所与の癌治療に対する患者の反応をモニターすることである。血液試料を、治療の前、その間、及びその後に定期的に分析することができ、結果として、治療法に対する陽性反応はＣＴＣ生存能の減少及びより遅い分裂速度を生じるであろう。
本発明の別の適用は、現在寛解期にある患者をモニターして癌再発の可能性を調査することである。ＣＴＣｓに関する彼らの血液の連続的な検査を、癌の再発の可能性又はその見込みを決定するために定期的に行うことができる。場合によっては、連続的な検査は、再発のより早期の検出をもたらす。
薬物輸送／ハイスループットスクリーニング
本開示の別の適用は、ハイコンテントスクリーニング分析（例えば、ハイスループット創薬）のため、また基礎研究用の直接研究プラットフォームとしてである。特定の細胞の種類に対する薬物の効能について有意義な研究を行うためには、細胞の大量供給が必要とされる。更に、異なる種類の細胞に対する異なる薬物処理の有効性を比較することは、大量の細胞を必要とする。本開示は、科学者に細胞種を単離するプロセスを自動化又は一部自動化を可能とする基礎研究用の研究プラットフォームを提供し、それにより、ハイスループットな実験を可能とする。かかる研究プラットフォームは、創薬プラットフォームとしての実用性を有し得る。したがって、本発明は、（ａ）本明細書に記載される方法を使用して標的細胞亜集団を培養すること、（ｂ）前記標的細胞亜集団と試験薬剤を接触させること、（ｃ）前記標的細胞亜集団の生存能及び／又は成長をアッセイすること、並びに（ｄ）前記アッセイに基づいて前記試験薬剤を抗癌治療法として選択することを含む、抗癌治療法を開発する方法を提供する。或る実施形態では、標的細胞亜集団はＣＴＣｓ及び／又はＣＳＣｓを含む。或る実施形態では、複数の試験薬剤を標的細胞亜集団に適用する。（例えば、併用療法を試験する）。或る実施形態では、標的細胞亜集団をマルチウェルプレートで培養する。或る実施形態では、マルチウェルプレートは、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェル、又は３４５６ウェルを備える。或る実施形態では、上記方法は、前記標的細胞亜集団と複数の試験薬剤を接触することを含み、各試験薬剤はマルチウェルプレートの単一のウェルに適用される。或る実施形態では、上記方法は、マルチセルプレートのウェルを同時にアッセイすることを含む。或る実施形態では、試験薬剤は、その薬剤が標的細胞亜集団の生存能、増大又は成長を低減する場合、抗癌治療法として選択される。
被験体の治療
本明細書に記載される発明は、被験体を治療するために医療専門家に使用され得るデータを提供することができる。好ましい実施形態では、細胞の分類は、被験体の治療を対象とすることができる。被験体の治療として、診断、予後又はセラノシスが挙げられ得る。診断は、被験体の状態を決定することを含む。診断は、１つの時間点又は継続的に行われ得る。例えば、被験体を癌と診断することができる。別の例では、寛解期にある癌患者を日常的にスクリーニングして、癌の再発が起きたかどうかを特定してもよい。予後は、被験体の疾患の転帰、回復の可能性、又はどのようにして疾患が進行するかを決定することを含むことができる。例えば、特定の種類のＣＴＣｓを同定することにより、予後が基づく情報を提供することができる。セラノシスは、治療的処置を決定することを含むことができる。例えば、被験体の癌の治療的処置は、化学療法、放射線照射、薬物治療、治療なし、又はそれらの任意の組み合せで構成され得る。被験体を、被験体が治療を経る前、その間、及びその後のＣＴＣ集団を測定するため、例えば、連続的な血液検査によりモニターしてもよい。治療法に対する陽性反応は、ＣＴＣの生存能の減少及びより遅い分裂速度をもたらすであろう。
癌被験体から単離され分類されたＣＴＣｓの場合では、ＣＴＣｓの存在又は不在は、癌の診断を支援又は形成し得る。疾患の予後は、被験体の血液中に存在するＣＴＣｓの種類により支援され得る。存在するＣＴＣｓの種類の知識に基づいてセラノシスを支援することができる。また、成功する見込みが最も高い化学療法剤等の様々な治療の成功する可能性を検定するために単離したＣＴＣｓを使用することによりセラノシスを支援してもよい。
場合によっては、標的細胞（例えば、単離されたＣＴＣｓ）は、標的細胞中の１又は複数のバイオマーカーの存在又は不在を検出することにより特徴づけることができる。或る実施形態では、１又は複数のバイオマーカーの存在又は不在は、疾患の治療を必要とする被験体から単離された標的細胞から単離された核酸をシーケンシングすることにより決定することができる。シーケンシングを、シーケンシングした標的細胞の遺伝子プロファイルを作製するために使用することができる。標的細胞の遺伝子プロファイルを被験体について個別化治療を選択するために使用することができる。例えば、かかる方法を癌治療を必要とする被験体の個別化された癌治療を選択するために使用してもよい。或る実施形態では、核酸を、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、ＣＴＣｓから単離し、また正常細胞から単離してもよい。或る実施形態では、核酸はＤＮＡである。或る実施形態では、腫瘍試料及び正常細胞に由来するＤＮＡを使用して被験体に特異的な腫瘍ＤＮＡライブラリ及び／又は正常ＤＮＡライブラリを調製する。ＤＮＡライブラリを、シーケンシングプラットフォームによりシーケンシングに使用することができる。シーケンシングプラットフォームは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）プラットフォームであってもよい。或る実施形態では、上記方法は、ＮＧＳ技術を使用して核酸ライブラリをシーケンシングすることを更に含む。
シーケンシングは、当該技術分野でよく知られている古典的なサンガーシーケンシング法によりなされ得る。また、シーケンシングは、ハイスループットシステムを使用してなされ得、その幾つかは、成長する鎖への組込の直後又はその際にシーケンシングされたヌクレオチドの検出、例えば、リアルタイム又は実質的にリアルタイムの配列の検出を可能とする。場合によっては、ハイスループットシーケンシングは、１時間当たり少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００又は少なくとも５００，０００の配列の読み取りを生じ、各読み取りは、１つの読み取り当たり少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０又は少なくとも１５０の塩基である。シーケンシングをゲノムＤＮＡ又はテンプレートとしてのＲＮＡ転写産物に由来するｃＤＮＡを使用して行うことができる。
或る実施形態では、ハイスループットシーケンシングは、合成による一分子シーケンシング（ｔｈｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＳＭＳＳ）法等のＨｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）により利用可能な技術の使用を含む。ＳＭＳＳは、２４時間以下で全ヒトゲノムをシーケンシングすることを可能とすることから、独特である。また、この迅速なシーケンシング法は、実質的にリアルタイム又はリアルタイムで配列中のＳＮＰ／ヌクレオチドの検出も可能とする。最終的に、ＳＭＳＳは、ＭＩＰ技術のように、ハイブリダイゼーション前に予備増幅工程を必要としないことから強力である。実際、ＳＭＳＳは、いかなる増幅も必要としない。ＳＭＳＳは、参照により本明細書に援用される、米国出願公開第２００６００２４７１１号、同第２００６００２４６７８号、同第２００６００１２７９３号、同第２００６００１２７８４号及び同第２００５０１００９３２号に記載される。
或る実施形態では、ハイスループットシーケンシングは、機器のＣＣＤカメラにより記録されるシーケンシング反応によって生じる化学発光シグナルを発信する光ファイバプレートを含むＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅ装置等の４５４ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（コネチカット州ブランフォード）により利用可能な技術の使用を含む。この光ファイバの使用により、４．５時間の間に最低２０００万の塩基対の検出を可能とする。
ビーズ増幅の後に光ファイバ検出を使用する方法は、参照により本明細書に援用されるＭａｒｇｕｉｌｅｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．「Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｉｃｏｌｉｔｒｅ ｒｅａｃｔｏｒｓ」，Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０３９５９、同じく、米国特許出願第２００２００１２９３０号、同第２００３００６８６２９号、同第２００３０１００１０２号、同第２００３０１４８３４４号、同第２００４０２４８１６１号、同第２００５００７９５１０号、同第２００５０１２４０２２号、及び同第２００６００７８９０９号に記載される。
或る実施形態では、標的細胞の遺伝子材料の配列分析は、ライゲーション機構（縮重ライゲーション）による４色のシーケンシングを含んでもよく、これは、４つのポジションの内の１つにアンカープライマーをハイブリダイズすることを含む。その後、蛍光染料で標識化された縮重九量体の集団に対するアンカープライマーの酵素によるライゲーション反応を行う。任意の所与の周期において、使用される九量体の集団が、その位置の１つの同一性が九量体に結合するフルオロフォアの同一性と相関するように構築される。ライゲースがクエリー位置での相補性について区別する限り、蛍光シグナルは塩基の同一性の推論を可能とする。ライゲーション及び４色の画像化を行った後、アンカープライマーと九量体の複合体を取り除いて新たな周期が始まる。ライゲーション後の配列情報を画像化する方法は当該技術分野で既知である。
薬物スクリーニングの適用として、本発明は、循環腫瘍細胞の「結合」又は付着特性を特異的に阻害する新たな種類の薬物の選択的スクリーニングを可能とする。ＣＴＣｓの他の細胞の種類、組織及び基材への結合能力を阻害することにより、研究者が癌の転移が起こらないようにする新たな薬物を創薬することを可能とする。具体的な薬物標的として、インテグリン、パキシリン、タリン、及びＥ−カドヘリンが挙げられる。
本発明の別の態様では、被験体のＨＳＣｓを彼らのＣＴＣｓと並行して培養することができる。いずれの細胞種も末梢血、リンパ液、及び骨髄から共に単離することができる。ＨＳＣｓの増殖及びヒト免疫系（ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、及びＢ細胞）を含むそれらのリンパ系統への後の分化は、これらの細胞を、同じ被験体から単離されたＣＴＣｓに暴露することにより、例えば、ＣＴＣ培養物において見出された最も激しく成長する癌コロニーにＨＳＣｓを暴露することにより、上記細胞の「細胞リプログラミング」を可能とすることができる。ＣＴＣｓ、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで最も激しく分裂するＣＴＣｓに対して被験体の免疫細胞を共培養することにより、これを達成することができる。これらの免疫細胞の導入により、研究者は、ＣＴＣコロニーを認識して破壊するそれらの能力を観察できるであろう。ＣＴＣ成長の攪乱又はＣＴＣコロニーの全体的な排除に明らかに有効である培養免疫細胞を、培養で増大することができる。かかる増大した免疫細胞を癌に対する治療薬として被験体に再導入することができる。かかる増大した免疫細胞を癌の治療薬として被験体に再導入することができる。
本明細書において、本発明は、不均一細胞集団に由来する標的細胞亜集団の検出及び富化のための新たなアプローチを提供する。不均一細胞集団を有し、標的細胞亜集団の富化が必要な場合にはいつでも上記方法を適用することができる。
上記の記載は、実例であり制限ではない。本開示を検討するにあたり、本発明の多くの変種が当業者に明らかとなるであろう。単なる例示として、主に、体液に由来するＣＴＣｓ、ＣＳＣｓ、ＨＳＣｓ及びＥＰＣｓを含む標的細胞亜集団の富化に関して本発明を説明するが、本発明はそれらに制限されない。
［実施例］
［実施例１］：本発明の基材例の調製：
基材調製：０．１％ブタゼラチンの基層を０．１ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−オルニチン（例えば、ポリ−Ｌ−オルニチン塩酸塩又はポリ−Ｌ−オルニチン臭化水素酸塩）で前処理した。前処理の後、基層をおよそ０．１ｍｇ／ｍｌ〜およそ１．０ｍｇ／ｍｌのＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、及びラミニンで処理した。
［実施例２］：循環乳癌細胞の基材に対する結合親和性：
全血試料をＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌細胞でスパイクした。スパイクした血液試料を本明細書に記載されるフィコールに基づく密度遠心分離に供した。有核細胞画分を基材上に播種し、３７℃、２％Ｏ２、及び１６．７ＰＳＩＡで培養した。白血球細胞（ＷＢＣｓ）を蛍光標識した抗ＣＤ４５抗体で可視化した。図１５は、標識化ＷＢＣｓ（パネルＡ）及び基材に付着した循環乳癌細胞（パネルＢ）を示す。付着した乳癌細胞は形態学によりＷＢＣｓ（小さい矢印）と容易に区別できる。
［実施例３］：ＧＯＬ及びＧＥＬ基材を使用する細胞培養プレートの調製：
ＧＯＬ基材を０．１％ブタゼラチン、０．０５ｍｇ／ｍＬポリ−Ｌ−オルニチン塩酸塩、及び５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）として調製する。ＧＥＬ基材を０．１％ブタゼラチン、及び１又は複数の０．１ｍｇ／ｍＬコラーゲン（例えば、ＳｉｇｍａＣ７７７４）、０．１ｍｇ／ｍＬラミニン（例えば、ＳｉｇｍａＬ２０２０）、及び０．１ｍｇ／ｍＬフィブロネクチン（例えば、ＳｉｇｍａＦ０８９５）として調製する。細胞培養プレートをＧＯＬ基材又はＧＥＬ基材で被覆し、基材が３７℃で４時間以上に亘りウェルの表面全体を被覆することを確実にする。基材溶液をウェルから除去する。ウェルを滅菌蒸留水で２回洗浄した。１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を各ウェルに添加した。その後、細胞培養プレートを室温でおよそ４時間以上に亘ってＵＶ滅菌する。
［実施例４］：フィーダー細胞を含む基材の調製：
ＧＯＬ基材を調製し、実施例３に記載されるように組織培養プレートに被覆する。マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦｓ）をＧＯＬ被覆プレートに播種し、約４８時間に亘り培養するか、細胞が約７０％培養密度になるまで培養する。別の実施形態では、ＭＥＦｓをＭｉｌｌｉｃｅｌｌインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で培養し、ここで、インサートをＧＯＬ基材で処理した組織培養プレートのウェルへと挿入する。ＭＥＦｓを細胞が７０％以上の培養密度になるまで培養する（例えば、およそ４８時間）。
［実施例５］：ＣＴＣ亜集団培養プロトコル：
２０ｍｌの末梢血をヒト被験体から採取した。末梢血有核細胞（ＰＢＮＣ）を、本明細書に記載されるフィコールに基づく密度遠心分離により精製した後、下記プロトコルに従って播種した。ポリ−Ｌ−オルニチンを含み、基材硬度を与えるゼラチン−寒天混合物で補足したコラーゲン系基材で被覆した細胞培養プレートの各ウェルに平板培養培地（例えば、６ウェルプレートの１ウェル当たり２ｍＬ、又は１２ウェルプレートの１ウェル当たり１ｍＬ）を添加した。３００μＬのＰＢＮＣ溶液（２ｍＬの平板培養培地に再懸濁した２０ｍＬの末梢血から得た）を６ウェルプレートの各ウェルに添加した（１２ウェルプレートについては１５０μＬ）。そのプレートを摂氏３７度、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。最初の播種から１時間後に細胞培養プレートを数回軽く叩いてゆるく付着した細胞（例えば、白血球）を除去し、その細胞培養培地を予め温めておいた平板培養培地と交換した。その後、そのプレートを、５％ＣＯ２、２％Ｏ２、及び９３％Ｎ２を含む加圧インキュベータにおいて、１６．７ＰＳＩＡ、摂氏３７度で２４時間以上インキュベートした。２４時間経過後に細胞培養プレートを数回軽く叩いてゆるく付着した細胞を除去し、予め温めておいた長期成長培地と培地を交換した。細胞を５％ＣＯ２、２％Ｏ２、及び９３％Ｎ２を含む加圧インキュベータにおいて１６．７ＰＳＩＡ、摂氏３７度でインキュベートした。７２時間毎におよそ３分の１から半分の長期成長培地を予め温めておいた新しい培地と置換した。このプロトコルを使用して、ＣＴＣｓを検出し、培養中に樹立することに成功した。
［実施例６］：フィーダー細胞を使用するＣＴＣ亜集団培養プロトコル：
癌を伴うヒト被験体に由来するＣＴＣ細胞でスパイクしたＰＢＮＣｓをＧＯＬ基材上へのフィコールに基づく密度遠心分離を使用して精製した。新たに単離した細胞を平板培養培地に再懸濁した。６ウェル又は１２ウェルの標準サイズの培養プレートを使用した。その培養プレートを放射線照射した又は放射線照射していないＭＥＦ細胞で、ＭＥＦ細胞が少なくともおよそ７０％の培養密度に達するまで、最低４８時間に亘り前処理した。ＭＥＦ富化培養培地を平板培養培地と交換した。ＭＥＦ順化培養培地を保持した。末梢血有核細胞（ＰＢＮＣ）溶液を２０ｍＬの末梢血を使用して作製し、遠心沈殿し、２ｍＬの平板培養培地に再懸濁した。ＰＢＮＣ溶液を培養皿の各ウェルに添加し、細胞を摂氏３７度、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。最初の播種から１時間後、培養プレートを数回軽く叩いてゆるく付着した細胞を除去し、培地を以前に保持したＭＥＦ順化培養培地と交換した。そのプレートを以下：１６．７ＰＳＩＡ、摂氏３７度、５％ＣＯ２、２％Ｏ２、及び９３％Ｎ２で最低４８時間の条件のもと、加圧インキュベータでインキュベートした。４８時間経過後、およそ３分の１から半分のＭＥＦ順化培地を予め温めておいたＲ型長期成長培地と交換した。その後、細胞を以下：１６．７ＰＳＩＡ、摂氏３７度、５％ＣＯ２、２％Ｏ２、及び９３％Ｎ２で最低４８時間の条件のもと、加圧インキュベータで再びインキュベートした。再度、半分から３分の１の培地を新しい、予め温めておいたＲ型長期成長培地と置換した。７２時間毎に、およそ半分から３分の１のＲ型長期成長培地を予め温めておいた新しい培地と置換した。このプロトコルを使用して富化したＣＴＣを図１６に示す。パネルＡは、倍率１０倍のもとで患者から単離されたＣＴＣｓを示し、パネルＢは、倍率２０倍のもとで同じＣＴＣ細胞を示す。パネルＣは、倍率２０倍の多核化ＣＴＣ細胞を示す。単一細胞内の１以上の核の存在は、癌と関連することが多い間違った細胞周期制御を示す可能性がある。これらの結果は、かかる培養条件が、非標的細胞亜集団（例えば、ＷＢＣｓ）に対して、標的細胞亜集団（例えば、ＣＴＣｓ）の選択的増加を促進することを実証する。かかる選択的増殖は、ＷＢＣｓと比較して２倍を上回るＣＴＣ増殖の増加により証明された。
［実施例７］：画像分析のためのコンピュータ可読媒体の使用：
ＩｍａｇｅＪ（参照により本明細書で援用される、Ｃｏｌｌｉｎｓ（２００７）ＩｍａｇｅＪ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４３：Ｓ２５−Ｓ３０）を使用してソフトウェアパッケージの例を開発し、細胞増殖の検出及び測定のための新たなプラグインを作成する。ＩｍａｇｅＪ用の押ボタン式ＪＡＶＡベースプラグインは、所与の画像シリーズについて細胞数及び細胞分裂速度を自動的に検出及び測定する。グラフィカルユーザーインターフェースベースのプラグインは、使用者の入力及びバッチ処理能力を支持する。上記ソフトウェアは、細胞総数を生じるために順次実行される４つの異なるスクリプト（又は処理）を含む。
上記ソフトウェアプログラムは、下記５つのパラメーター（１）細胞全体のサイズ、（２）細胞の形状、（３）細胞の運動、（４）細胞核のサイズ、（５）細胞分裂速度の１又は任意の組み合せを細胞分類アルゴリズムへと統合するソフトウェアの使用により、増殖性細胞を同定する。上記ソフトウェアの同定は、上述の５つのパラメーターを通して循環する。上記パラメーターをマルチコアコンピュータチップの使用により順次及び／又は接線的に処理する。上記ソフトウェアプログラムは、細胞分裂速度に基づき転移能に従って細胞を下位分類する（例えば、ＣＴＣｓを所定の転移能があると分類する）。上記ソフトウェアプログラムは、使用者が５つのパラメーターの各々に対して異なる重みを割り当てることを可能とするユーザーインターフェースを含む。
上記ソフトウェアプログラムは、各取得時間における正確な場所又は位置を特定することにより所与の集団の生存細胞の割合を同定する。上記ソフトウェアは、単一細胞の形状及び運動を測定する。細胞形状、変形能、及び運動のパラメーターを、細胞が生存しているかどうかを決定するために使用する。逆に言えば、形態学的変化を経ない、又は運動を呈さない細胞は生存していないと考えられる。
上記ソフトウェアプログラムは、所与の時間点で、張り付けられた各画像について所与の細胞又は細胞コロニーの全体的な表面積を算出することにより細胞分裂速度を測定することができる。全画像取得工程の間、その本来の表面積の少なくとも４倍の表面積変化を呈する単一の増殖性細胞は、活発に分裂しているとすることができる。サイズ増加を呈する細胞又は細胞コロニーを、前記細胞の核を数えることによって更に分析してそれらの正確な数を決定することができる。
生細胞画像化及び分裂癌細胞のソフトウェア分析の例を図１７に示す。本明細書で記載される（例えば、実施例２及び実施例６）細胞スパイキング実験から得られた乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）を１時間、２４時間、７２時間に画像化した。播種から１時間後、２４時間後、及び７２時間後に画像化された乳癌細胞の生画像をパネルＡに示す。パネルＡ中の白色矢印は、基材に付着した白血球を指し、パネルＡ中の黒色矢印は基材に付着した乳癌細胞を指す。パネルＢは、ビニングおよび分散フィルタの適用後のパネルＡと同じ画像を示す。パネルＣでは、所与の細胞コロニーの総表面積（元のカラー画像から適合させた白黒画像）を提供するため、画像を自動的に閾値化し、セグメント化した。パネルＤは、細胞核の閾値−セグメンテーションを示す。パネルＥは、パネルＤで閾値化した細胞核の計数を示す。
［実施例８］：転移性去勢抵抗性前立腺癌を伴うヒト被験体から単離されたＣＴＣｓの長期培養及び分子特性評価：
後期の転移性去勢抵抗性前立腺癌（ステージ３より上、腺癌）を伴う６０名の被験体を採用する。採用した被験体の大半は、骨への転移（最も一般的に前立腺癌と関連する）が確認された６５歳以上の白人男性である。更に、１０名の健康な成人ボランティア（男性５名、女性５名）を対照被験体として上記研究に採用する。
各被験体からＢＤによる２つのＣＰＴ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ（クエン酸ナトリウムを含む細胞調製チューブ）に２０ｍＬの新鮮な末梢血を採取する。血液採取の２時間以内に試料を１５００ｇで２０分間遠心分離する。有核細胞画分を単離し、ポリ−Ｌ−オルニチンを含み、基材硬度を与えるゼラチン−寒天混合物で補足したコラーゲン系基材で被覆した１２ウェルプレートに直接播種する。約２ｍＬの各々の有核細胞画分（ＷＢＣｓ及びＣＴＣｓを含有する）を無血清ＲＰＭＩ系培養培地（ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、プロゲステロン、及びジヒドロテストステロンで補足）で希釈し、１２ウェル全てに均等に分配する。
その後、新たに播種した細胞を細胞培養インキュベータに移す。細胞培養インキュベータは、カスタマイズされた気体混合物を１６．７ＰＳＩＡの一定の圧力で輸送しつつ、完全に閉鎖され、滅菌された環境において湿度及び温度（摂氏３７度）を維持する。上記気体混合物は、１％酸素、５％二酸化炭素、及び９４％窒素を含み、同時に過剰な酸素を除去するため混合金属触媒により酸素レベルを維持する。
新たに播種した細胞を１時間インキュベートして、基材上に有核細胞が付着するのを可能とする。ＷＢＣｓは基材にゆるく付着し、容易に脱離して細胞の播種から１時間後に行われる培地交換により各ウェルから除去される。また、培地交換は、非生存細胞及び膜フラグメントも除去する。ＷＢＣ含有画分を遠心分離して凍結し、被験体内部対照細胞とする。残りの基材に結合した細胞は、懸濁液中又は最初に結合した際のこれらの細胞の球状の外観とは対照的に、基材に堅く結合し、細胞膜分極を呈し拡がる。上記プロトコルのこの時点で、培養プレートの半分のウェルを、１：２０００の濃度で培養培地に直接添加されるＡｌｅｘａフルオロフォア（５６８ｎｍ）に直接複合した抗体を使用してＥｐＣＡＭ発現細胞に対してプローブする。ＥｐＣＡＭ＋細胞を、初代細胞培養インキュベータ内に完全に収容される蛍光顕微鏡（図１８に示される）を使用して技術者により各ウェルにおいて数える。その後、ＥｐＣＡＭスコアリングが完了した後、抗体含有培養培地を新しい培養培地に交換して細胞増殖研究を続ける。予備データは、１ウェル当たり平均１〜２のＥｐＣＡＭ＋細胞が存在することを示し、訓練された技術者による迅速な計数を可能とする。細胞播種及びＥｐＣＡＭスコアリングの完了からおよそ１．５時間後、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭｉｌｌｉｃｅｌｌインサートシステム（ＣＴＣ培養培地を使用し、予め４８時間調製した、５０％培養密度のＨＵＶＥＣ又はＨＬＭＶＥＣ細胞株）上で成長させたフィーダー細胞の単層を各ウェルにフィットさせ、細胞−細胞シグナル伝達キュー及び成長因子を提供して、ＣＴＣ増殖を促進しながら、２つの培養物を可能性のある細胞汚染から物理的に分離する。その後、培地の蒸発に対抗するため２４時間毎に添加される新しい培養培地と共に、細胞を７２時間インキュベートする。培養３日後に細胞プレートを技術者により再度検査し、明視野顕微鏡（位相光学）を使用して細胞コロニーについてスキャンする。成長細胞を含有するウェルを、ＷＢＣｓの表面露出抗原（抗ＣＤ４５）、単球／マクロファージ（抗ＣＤ１４）、血管内皮前駆細胞（抗ＣＤ３４）、及び線維芽細胞（抗線維芽細胞表面タンパク質）を同定する規定の波長（Ａｌｅｘａ４８８ｎｍ）の蛍光プローブに直接複合したカクテル陰性選択抗体に対してプローブする。これらの対照マーカーに陰性の細胞コロニーを含有するプレートウェルを抗ＥｐＣＡＭ、抗ＰＳＡ、及び抗アンドロゲン受容体に対して順にプローブし、前立腺がん関連マーカーの存在を特定する。
前立腺がんマーカーに対して陽性の細胞コロニー及び／又は試験した全てのマーカーに対して陰性であるが７日間で最低５０％の培養密度に達する細胞コロニーをＣＴＣ細胞とて同定し、全エキソームシーケンシング及び包括的トランスクリプトーム分析のため選択した。全エキソームシーケンシング及び包括的トランスクリプトーム分析をＰｅｒｓｏｎａｌｉｓ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州メンローパーク）により行った。最低５０％の細胞培養密度まで成長させたＣＴＣ培養物は、次世代シーケンシングプラットフォームを使用するこれらの分析セットを行うのに十分なＤＮＡ含有量（１μｇ〜２μｇ）を提供した。これらの細胞から作成されたデータを使用して、新規なバイオマーカー研究に使用される培養において急速に分裂するＣＴＣｓの包括的な分子プロファイルを提供しながら、前立腺関連突然変異を確認した。１μｇ未満のＤＮＡを含む可能性のある残りの被験体試料は、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）の後、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）による遺伝子コピー数分析を経た。その後、アンドロゲン受容体の増幅、Ｍｙｃ遺伝子増幅、腫瘍抑制遺伝子ＰＴＥＮの欠失、並びにＴＭＰＲＳＳ２とＥＴＳ転写因子であるＥＲＧ及びＥＴＶ１とを含む遺伝子融合について試験した。
［実施例９］：バイオマーカー非依存性選択及びヒト被験体由来ＣＴＣｓの培養：
多様な転移性癌に由来する末梢血試料を、前立腺癌（２）、乳癌（４）、肺癌（４）、黒色腫（２）、大腸癌（２）、食道癌（２）、及び膵臓がん（２）を伴うヒト被験体から取得した。登録の主な決定因子として確認された転移巣により、患者の選択基準を幅広く維持した。血液の加工及びＣＴＣ培養方法を、実施例８に記載されるように行った。１８の試料中１０がＥｐＣＡＭ＋、サイトケラチン＋、ＣＤ４５−細胞を含有したのに対し、１８の試料中８が生存ＣＴＣコロニーを提示した。図１９は、前立腺癌患者の全血から捕捉した培養物中のＣＴＣｓの顕微鏡写真を示す。パネルＡは、ＥＰＣＡＭ及びサイトケラチン８、１８に対して陽性の前立腺癌ＣＴＣの明視野及び蛍光画像を示す。パネルＢは、転移性前立腺癌を伴う患者に由来する急速に成長するＣＴＣ培養物を示す。その患者は、骨転移が確認されたステージＩＶの腺癌を有した。パネルＢに示される細胞培養物は、ＥｐＣＡＭの発現が低いか又は発現を呈さず、ＣＤ４５に陰性であり、播種から５日未満で１００％培養密度に達する速い細胞分裂速度を呈した。これらのコロニー内の個別の細胞は、サイズ及び形状が異なり、また高い膜ラフリング活性を呈した。更に、細胞は、一斉に分裂する複数の近辺の細胞と同調的に分裂することが明らかとなった。分裂細胞は、四方八方の上方に延びることが多く、「泡立った」外観をとる。このＣＴＣ培養は、全エキソームシーケンシング及びトランスクリプトーム分析を経る１０の試料の一部としてＰｅｒｓｏｎａｌｉｓによる本発明者らの遺伝子特性研究に含まれる。
［実施例１０］：血液中でスパイクしたＣＴＣｓの抗癌剤感受性試験
スパイクした血液に由来する癌細胞を本明細書に記載されるように単離し、富化し、培養した（例えば、実施例２及び実施例６を参照されたい）。細胞をＲｈｏキナーゼ阻害剤であるＹ−２７６３２（本明細書において参照により援用されるＩｓｈｉｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｙ−２７６３２，ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅｓ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７（５）：９７６−８３）で処理した。抗癌剤感受性試験の結果を図２０に示す。パネルＡは、Ｙ−２７６３２処理前の単一細胞を示す。パネルＢは、Ｙ−２７６３２の添加の際の細胞の画像を示す。上記細胞の形質膜は、薬物処理の２分後（パネルＣに示す）及び５分後（パネルＤに示す）に際して縮んだ。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、記載したが、かかる実施形態は、単なる例として提供されるに過ぎないことが当業者に明らかであろう。ここで、本発明から解離することなく、多数の変化、変更及び置換が当業者に対して起こるであろう。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替物が本発明の実施において採用され得ることが理解される。下記特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造、並びにそれらの等価物がそれにより包含されることを意図する。
本発明は一態様において、以下を提供する。
[項目１]
生体試料に由来する不均一細胞集団からの標的細胞亜集団の選択的富化のための方法であって、（ａ）前記不均一細胞集団と基材とを接触させる工程、並びに（ｂ）前記標的細胞集団の成長を可能とするのに十分な条件下で前記不均一細胞集団をインキュベートする工程であって、前記条件は、陽圧条件及び／又は低酸素条件下で前記不均一細胞集団をインキュベートすることを含み、前記インキュベートが結果として前記標的細胞亜集団の選択的富化を生じる工程、を含む前記方法。
[項目２]
前記標的細胞亜集団の前記メンバーによって１又は複数の形態学的特徴及び／又は動態学的特性の表示の際に前記標的細胞亜集団のメンバーを同定する工程を更に含み、前記１又は複数の形態学的特徴及び／又は動態学的特性がコロニー形成、増殖、非標的細胞の表面積と比べて大きな表面積、非標的細胞の前記基材に対する付着と比べて前記基材への付着の増加、急速な細胞分裂、及び多核細胞化からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
[項目３]
前記標的細胞亜集団が初代細胞を含む、項目１又は２に記載の方法。
[項目４]
前記標的細胞亜集団が、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）、癌幹細胞（ＣＳＣｓ）、固形腫瘍に由来する細胞、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）、初代神経細胞、胎児細胞、初代肝細胞、初代心筋細胞、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）、及び上皮前駆細胞からなる群から選択される細胞を含む、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
[項目５]
前記標的細胞亜集団がＣＴＣｓ又はＣＳＣｓを含む、項目４に記載の方法。
[項目６]
前記ＣＴＣｓが転移性ＣＴＣを含む、項目５に記載の方法。
[項目７]
前記ＣＴＣｓが生存ＣＴＣを含む、項目５に記載の方法。
[項目８]
前記ＣＴＣｓが、急性白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、急性リンパ性白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、骨髄芽球性白血病細胞、前骨髄球性白血病細胞、骨髄単球性白血病細胞、単球性白血病細胞、赤白血病細胞、慢性白血病細胞、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病細胞、慢性リンパ球性白血病細胞、真性多血症細胞、リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症細胞、重鎖病細胞、肉腫細胞、線維肉腫細胞、粘液肉腫細胞、脂肪肉腫細胞、軟骨肉腫細胞、骨肉腫細胞、リンパ管肉腫細胞、中皮腫細胞、ユーイング腫瘍細胞、平滑筋肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞、結腸癌細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、去勢抵抗性前立腺癌細胞、扁平上皮癌細胞、基底細胞癌細胞、腺癌細胞、汗腺癌細胞、皮脂腺癌細胞、乳頭癌細胞、乳頭腺癌細胞、嚢胞腺癌細胞、髄様癌細胞、気管支細胞、腎細胞癌細胞、肝癌細胞、胆管癌細胞、絨毛癌細胞、セミノーマ細胞、胚性癌腫細胞、ウィルムス腫瘍細胞、子宮頸癌細胞、子宮癌細胞、精巣腫瘍細胞、肺癌細胞、小細胞肺癌細胞、膀胱癌細胞、上皮癌細胞、神経膠腫細胞、頭蓋咽頭腫細胞、上衣腫細胞、松果体腫細胞、血管芽腫細胞、聴神経腫細胞、乏突起神経膠腫細胞、髄膜腫細胞、黒色腫細胞、神経芽細胞、網膜芽腫細胞、子宮内膜癌細胞、非小細胞肺癌細胞、頭頸部癌細胞、又は腎臓癌細胞を含む、項目５に記載の方法。 [項目９]
前記同定が抗体又はポリヌクレオチドマーカーの使用を含まない、項目１〜８のいずれかに記載の方法。
[項目１０]
前記生体試料が体液、又はその派生物を含む、項目１〜９のいずれかに記載の方法。
[項目１１]
前記体液が、血液、血漿、血清、リンパ、唾液、尿、汗、又は腹水から選択される、項目１０に記載の方法。
[項目１２]
前記標的細胞亜集団の前記メンバーが前記体液又はその派生物１ｍｌ当たり１個以下の標的細胞の濃度で存在する、項目１０又は１１に記載の方法。
[項目１３]
前記標的細胞亜集団の前記メンバーが前記体液又はその派生物１ｍｌ当たり０．８個以下の標的細胞の濃度で存在する、項目１１に記載の方法。
[項目１４]
前記標的細胞亜集団の前記メンバーが前記体液又はその派生物１ｍｌ当たり０．６個以下の標的細胞の濃度で存在する、項目１１に記載の方法。
[項目１５]
前記生体試料が固体組織試料を含む、項目１〜１４のいずれかに記載の方法。
[項目１６]
前記基材がコーティングを含み、前記コーティングがＧＯＬ基材、ＧＥＬ基材、１又は複数の層のフィーダー細胞、及びそれらの任意の組み合せからなる群から選択される、項目１〜１５のいずれかに記載の方法。
[項目１７]
前記基材の構成が、単層構成、二層構成、中間層構成（複数の場合がある）、及び逆位構成からなる群から選択される、項目１〜１６のいずれかに記載の方法。
[項目１８]
前記標的細胞亜集団の前記メンバーを個別に単離及び培養することを更に含む、項目１〜１７のいずれかに記載の方法。
[項目１９]
前記標的細胞亜集団の前記メンバーを単離することを更に含む、項目１〜１８のいずれかに記載の方法。
[項目２０]
前記単離が顕微操作器具の使用を含む、項目１９に記載の方法。
[項目２１]
前記標的細胞亜集団の前記メンバーを２週間を超えて細胞培養物として培養することを含む、項目１〜２０のいずれかに記載の方法。
[項目２２]
前記低酸素条件が１０％未満のＯ ２ レベルの下で培養することを含む、項目１〜２１のいずれかに記載の方法。
[項目２３]
前記Ｏ ２ レベルが１％である、項目２２に記載の方法。
[項目２４]
前記陽圧条件が、１４．７ＰＳＩＡを超える加圧条件下で前記メンバーを培養することを含む、項目１〜２３のいずれかに記載の方法。
[項目２５]
前記陽圧条件が、１５ＰＳＩＡ以上の加圧条件下で前記メンバーを培養することを含む、項目２４のいずれかに記載の方法。
[項目２６]
前記陽圧条件が、１５．７ＰＳＩＡ以上の加圧条件下で前記メンバーを培養することを含む、項目２４に記載の方法。
[項目２７]
前記陽圧条件が１６．７ＰＳＩＡ以上の加圧条件下で前記メンバーを培養することを含む、項目２４に記載の方法。
[項目２８]
前記陽圧条件が１９．７ＰＳＩＡの加圧条件下で前記メンバー培養することを含む、項目２４に記載の方法。
[項目２９]
前記条件が、平板培養培地、Ｒ型長期成長培地、ＤＦ型長期成長培地、Ｄ型長期成長培地、ＭＥＦ−順化培地、及びそれらの任意の組み合せからなる群から選択される細胞培養培地中で前記標的細胞亜集団の前記メンバーを培養することを更に含む、項目１〜２８のいずれかに記載の方法。
[項目３０]
前記条件が、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、プロゲステロン、ジヒドロテストステロン及び／又はそれらの任意の組み合せを含む細胞培養培地中で前記標的細胞亜集団の前記メンバーを培養することを更に含む、項目１〜２９のいずれかに記載の方法。
[項目３１]
前記条件が、細胞の表面張力を調節する化合物を含む細胞培養培地中で前記メンバーを培養することを含む、項目１〜３０のいずれかに記載の方法。
[項目３２]
前記化合物がＲｈｏキナーゼ阻害剤である、項目３１に記載の方法。
[項目３３]
前記化合物が
Figure 0006509745
からなる群から選択される、項目３１に記載の方法。
[項目３４]
前記条件が、前記メンバーにおいて低酸素誘導因子の発現を増加する薬剤と共に前記メンバーを培養することを含む、項目１〜３３のいずれかに記載の方法。
[項目３５]
前記低酸素誘導因子が、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）、低酸素誘導因子−１β（ＨＩＦ−１β）、低酸素誘導因子２α（ＨＩＦ−２α）、低酸素誘導因子−２β（ＨＩＦ−２β）、低酸素誘導因子−３α（ＨＩＦ−３α）、低酸素誘導因子−３β（ＨＩＦ−３β）、又はそれらの任意の組み合せを含む、項目３４に記載の方法。
[項目３６]
前記低酸素誘導因子がＨＩＦ−１αを含む、項目３５に記載の方法。
[項目３７]
前記低酸素誘導因子の発現を増加する薬剤がベクターを含み、前記ベクターが前記低酸素誘導因子をコードするポリヌクレオチドを含む、項目３４〜３６のいずれかに記載の方法。
[項目３８]
前記ベクターが発現ベクターである、項目３７に記載の方法。
[項目３９]
前記低酸素誘導因子が配列番号１に対して少なくとも７０％以上の相同性を含むアミノ酸配列を含む、項目３７に記載の方法。
[項目４０]
前記ポリヌクレオチドが配列番号２に対して少なくとも７０％以上の相同性又は相補性を含む、項目３７に記載の方法。
[項目４１]
前記細胞培養培地とフィーダー細胞とを接触させることを含む、項目１〜４０のいずれかに記載の方法。
[項目４２]
前記フィーダー細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＬＭＶＥＣ）、及びマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）からなる群から選択される、項目４１に記載の方法。
[項目４３]
前記標的細胞亜集団の前記メンバーをシーケンシングすることを更に含む、項目１〜４２のいずれかに記載の方法。
[項目４４]
前記標的細胞亜集団の前記メンバーにおける１又は複数の遺伝子の発現を特定することを更に含む、項目１〜４３のいずれかに記載の方法。
[項目４５]
前記標的細胞亜集団の前記メンバーにおける１又は複数のタンパク質の発現を特定することを更に含む、項目１〜４４のいずれかに記載の方法。
[項目４６]
前記同定が、
（ａ）前記メンバーの画像を得ること、及び
（ｂ）コンピュータ可読媒体を使用して前記メンバーが前記標的細胞亜集団に属すると自動的に分類すること、を含む、項目１〜４５のいずれかに記載の方法。
[項目４７]
前記コンピュータ可読媒体が、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）、癌幹細胞（ＣＳＣｓ）、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）、及び血管内皮前駆細胞（ＥＰＣｓ）を自動的に分類するように構成される、項目４６に記載の方法。
[項目４８]
前記コンピュータ可読媒体が前記標的亜集団の細胞の物理的特性に基づいてパラメーターを統合するように構成され、前記パラメーターが細胞の外形サイズ、細胞形状、細胞運動、細胞核サイズ、及び細胞分裂からなる群から選択される、項目４６に記載の方法。
[項目４９]
前記コンピュータ可読媒体が細胞の蛍光標識を検出するように構成される、項目４６に記載の方法。
[項目５０]
治療を必要とする被験体において癌を治療する方法であって、
前記被験体に由来する生体試料における標的細胞の検出に際して、前記被験体に抗がん剤を投与することを含み、前記標的細胞が項目１〜４９のいずれかの方法により検出される、治療を必要とする、被験体において癌を治療する方法。
[項目５１]
抗がん剤をそれを必要とする患者に投与する方法であって、
（ａ）前記抗がん剤を複数の時間点で前記被験体に投与すること、
（ｂ）前記投与の少なくとも第１及び第２の時間点で前記被験体から得られた生体試料に由来する標的細胞を分析することであって、前記分析が項目１〜５０のいずれかの方法を含み（ｃ）前記分析に基づいて、投与のため前記抗凝集剤の用量を調整すること、及び／又は異なる抗凝集剤を選択すること、を含む前記方法。
[項目５２]
転移性癌を発症していない被験体において前記転移性癌の発症見込みの増加を検出する方法であって、（ａ）項目１〜５１のいずれかに記載の方法を使用して前記被験体に由来する不均一細胞集団から標的細胞亜集団を単離すること、（ｂ）前記標的細胞亜集団を検出すること、及び（ｃ）前記検出に際し、前記被験体を前記転移性癌の発症見込みが増加していることを示すこと、を含む前記方法。
[項目５３]
個別化された疾患治療法をそれを必要とする被験体に対して選択する方法であって、（ａ）項目１〜４９のいずれかに記載の方法を使用して前記被験体に由来する標的細胞亜集団を培養すること、（ｂ）前記標的細胞亜集団のメンバーに由来する核酸をシーケンシングして前記標的細胞亜集団の前記メンバーの遺伝子プロファイルを作成すること、及び（ｃ）前記標的細胞亜集団の前記メンバーの前記遺伝子プロファイルに基づいて前記被験体に対して個別化された疾患治療法を選択することを含む前記方法。
[項目５４]
（ｄ）前記個別化された疾患治療法を前記被験体に提案することを更に含む、項目５３に記載の方法。
[項目５５]
前記個別化された疾患治療法が個別化された癌治療法である、項目５３に記載の方法。
[項目５６]
閉鎖環境チャンバを備えた細胞培養インキュベータであって、
前記細胞培養インキュベータが（ｉ）前記閉鎖環境チャンバの気体組成、（ｉｉ）前記閉鎖環境チャンバの使用者によって制御される大気圧、及び（ｉｉｉ）前記閉鎖環境チャンバの内部周囲温度、を維持するように構成される、細胞培養インキュベータ。
[項目５７]
細胞培養基材を備えた細胞培養プレートであって、前記基材が標的細胞の前記基材への付着を促進するために選択され、前記標的細胞が付着性の生存細胞であり、前記基材が細胞外マトリクスタンパク質を含む、細胞培養プレート。
[項目５８]
キットであって、
（ａ）項目１〜５７に記載の細胞培養インキュベータと、
（ｂ）前記インキュベータの閉鎖環境チャンバ内で１５．７ＰＳＩＡ以上の大気圧を維持する指示文を含む、標的細胞亜集団の培養における使用に関する指示書とを含むキット。
[項目５９]
キットであって、
（ａ）項目１〜５８に記載の細胞培養インキュベータと、
（ｂ）標的細胞亜集団の培養における使用に関する指示書であって、前記インキュベータの閉鎖環境チャンバ内で１０％以下のＯ ２ レベルを維持する指示文を含む前記指示書とを含むキット。
[項目６０]
キットであって、
（ａ）項目１〜５９に記載の基材を含む細胞培養プレートと、
（ｂ）前記標的細胞亜集団を１０％以下のＯ ２ レベルで培養する指示文を含む、標的細胞亜集団を培養するための前記プレートの使用に関する指示書とを含むキット。
[項目６１]
キットであって、
（ａ）項目１〜６０に記載の基材を含む細胞培養プレートと、
（ｂ）前記標的細胞亜集団を１５．７ＰＳＩＡ以上の大気圧で培養する指示文を含む、標的細胞亜集団を培養するための前記プレートの使用に関する指示書とを含むキット。
[項目６２]
キットであって、
（ａ）項目１〜６１のいずれかに記載の細胞培養培地と、
（ｂ）１０％以下のＯ２レベルで前記標的細胞亜集団を培養する指示文を含む、標的細胞亜集団を培養するための前記細胞培養物の使用に関する指示書とを含むキット。
[項目６３]
キットであって、
（ａ）項目１〜６２のいずれかに記載の細胞培養培地と、
（ｂ）前記標的細胞亜集団を１５．７ＰＳＩＡ以上の大気圧で培養する指示文を含む、標的細胞亜集団を培養するための前記細胞培養培地の使用に関する指示書とを含むキット。
[項目６４]
キットであって、
（ａ）前記メンバーにおいて低酸素誘導性因子の発現を増加する薬剤と、
（ｂ）標的細胞亜集団を培養するための前記薬剤の使用に関する指示書と
を含むキット。
[項目６５]
コンピュータ可読媒体であって、１又は複数の初代細胞の画像データを受け取る際に、下記の工程、（ａ）前記画像データから前記１又は複数の初代細胞のサイズを決定する工程、及び（ｂ）前記サイズが腫瘍に起因しない細胞よりも少なくとも１．５倍大きい場合に初代細胞が腫瘍に起因すると分類する工程を実行するコードを含み、
前記１又は複数の初代細胞が生体細胞から得られ、前記１又は複数の初代細胞を前記標的細胞亜集団の成長が十分可能な条件下で培養し、前記条件が陽圧条件及び／又は低酸素条件下で前記１又は複数の初代細胞をインキュベートする、前記コンピュータ可読媒体。
[項目６６]
コンピュータ可読媒体であって、生体試料から得られた１又は複数の初代細胞の画像データを受け取る際に、下記の工程、（ａ）前記画像データから平滑な固体又は半固体の基材に付着した三次元コロニーの存在又は不在を検出する工程、及び（ｂ）前記三次元コロニーの存在を検出する際に、前記生体試料が腫瘍細胞を含むと分類する工程を実行するコードを含み、
前記１又は複数の初代細胞を、前記標的細胞亜集団の成長を可能とするのに十分な条件下で培養し、前記条件が陽圧条件及び／又は低酸素条件下で前記１又は複数の初代細胞をインキュベートすることを含む、前記コンピュータ可読媒体。
[項目６７]
コンピュータ可読媒体であって、生体試料から得られた１又は複数の初代細胞の画像データを受け取る際に、下記の工程、（ａ）前記画像データから複数の核を含む初代細胞の存在又は不在を検出する工程、及び（ｂ）前記複数の核の存在を検出する際に、前記生体試料を腫瘍細胞を含むと分類する工程を実行するコードを含み、
前記１又は複数の初代細胞を前記標的細胞亜集団の成長を可能とするのに十分な条件下で培養し、前記条件が陽圧条件及び／又は低酸素条件下で前記１又は複数の初代細胞をインキュベートすることを含む、前記コンピュータ可読媒体。
[項目６８]
コンピュータ可読媒体であって、生体試料から得られた１又は複数の初代細胞の画像データを受け取る際に、下記の工程、（ａ）前記画像データから負の正味表面電荷を含む初代細胞の存在又は不在を検出する工程、及び（ｂ）負の正味表面電荷を含む前記初代細胞の存在を検出する際に、前記生体試料が腫瘍細胞を含むと分類する工程を実行するコードを含み、
前記正味の負の表面電荷が、非腫瘍細胞の前記正電荷固体又は半固体の基材への付着と比べた前記初代細胞の正電荷固体又は半固体の基材への付着性の増加により証明される、前記コンピュータ可読媒体。
[項目６９]
コンピュータ可読媒体であって、生体試料から得られた１又は複数の初代細胞の画像データを受け取る際に、下記の工程、（ａ）前記画像データから急速に分裂する細胞の存在又は不在を検出する工程、及び（ｂ）前記急速に分裂する細胞の存在を検出するに際し、前記生体試料が腫瘍細胞を含むと分類する工程を実行するコードを含み、
前記１又は複数の初代細胞を、前記標的細胞亜集団の成長を可能とするのに十分な条件下で培養し、前記条件が陽圧条件及び／又は低酸素条件下で前記１又は複数の初代細胞をインキュベートすることを含む、前記コンピュータ可読媒体。
[項目７０]
コンピュータシステムであって、
（ａ）試料に関連するデータセットを記憶する記憶メモリと、
（ｃ）前記記憶メモリに通信可能に連結されたプロセッサであって、項目１〜６９のいずれかに記載のコンピュータ可読媒体を含む前記プロセッサと、（ｃ）前記データセットとを含む前記コンピュータシステム。
[項目７１]
細胞画像化システムであって、
（ａ）細胞からの画像データを作成するように構成された顕微鏡と、
（ｂ）前記顕微鏡から画像データを受け取るように構成されたコンピュータシステムであって、前記顕微鏡が項目１〜７０のいずれかに記載のコンピュータ可読媒体を含む前記コンピュータシステムと、を含む前記細胞画像化システム。
[項目７２]
標的細胞集団を培養するシステムであって、
（ａ）項目１〜７１のいずれかに記載の細胞培養インキュベータと、
（ｂ）少なくとも１つの（ｉ）細胞培養プレート、（ｉｉ）細胞培養培地、及び（ｉｉｉ）細胞画像化システムと、を含む前記システム。

Claims (14)

  1. 生体試料に由来する不均一細胞集団からの循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）の選択的富化のための方法であって、
    前記不均一細胞集団と基材を接触させる工程と、
    前記ＣＴＣｓの成長を可能とするのに十分な条件下で前記不均一細胞集団をインキュベートする工程であって、前記条件は、大気圧より約２ＰＳＩ高い陽圧条件かつ５％酸素を超えない低酸素条件下で前記不均一細胞集団をインキュベートすることを含み、前記インキュベートが結果として前記ＣＴＣｓの選択的富化を生じる工程、を含む前記方法。
  2. 前記ＣＴＣｓのメンバーの１又は複数の形態学的特徴及び／又は動態学的特性が表示される際に、前記ＣＴＣｓのメンバーを同定する工程を更に含み、前記１又は複数の形態学的特徴及び／又は動態学的特性がコロニー形成、増殖、非ＣＴＣ細胞の表面積と比べて大きな表面積、非ＣＴＣ細胞の基材に対する付着と比べて増加した基材への付着、急速な細胞分裂、及び多核細胞化からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記同定が抗体又はポリヌクレオチドマーカーの使用を含まない、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 前記生体試料が体液、又はその派生物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記基材がコーティングを含み、前記コーティングがゼラチンと血清を含むＧＯＬ基材、ゼラチン及び細胞外マトリクス（ＥＣＭ）と関連する１又は複数の生体材料を含むＧＥＬ基材、１又は複数の層のフィーダー細胞、及びそれらの任意の組み合せからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記基材の構成が、単層構成、二層構成、中間層構成（複数の場合がある）、及び逆位構成からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ＣＴＣｓを個別に単離及び培養することを更に含む、請求項２に記載の方法。
  8. 前記ＣＴＣｓを２週間を超えて細胞培養物として培養することを含む、請求項２に記載の方法。
  9. 前記条件が、細胞の表面張力を調節する化合物を含む細胞培養培地中で培養することを含み、前記化合物がＲｈｏキナーゼ阻害剤を含む、請求項２に記載の方法。
  10. 前記化合物が
    Figure 0006509745
    からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記同定が、
    （ａ）前記メンバーの画像を得ること、及び
    （ｂ）コンピュータ可読媒体を使用して前記メンバーが前記ＣＴＣｓに属すると自動的に分類すること、を含む、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記コンピュータ可読媒体が前記ＣＴＣｓの物理的特性に基づいたパラメーターを統合するように構成され、前記パラメーターが細胞の外形サイズ、細胞形状、細胞運動、細胞核サイズ、及び細胞分裂からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記コンピュータ可読媒体が細胞の蛍光標識を検出するように構成される、請求項１１に記載の方法。
  14. 抗癌治療法を開発する方法であって、
    （ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法を用いて、ＣＴＣを培養すること、
    （ｂ）ＣＴＣと試験薬剤を接触させること、
    （ｃ）ＣＴＣの生存能及び／又は成長をアッセイすること、および
    （ｄ）ＣＴＣの生存能及び／又は成長が、試験薬剤と接触していないＣＴＣと比較して減少される場合に、試験薬剤を抗癌治療法として選択することを含む方法。
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