KR20130024904A

KR20130024904A - 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 약제 또는 방사선 감수성 평가 방법

Info

Publication number: KR20130024904A
Application number: KR1020127028550A
Authority: KR
Inventors: 마사히로 이노우에
Original assignee: 지방독립 행정법인 오사카 부립 병원 기구; 가부시키가이샤 르네상스 에너지 인베스트먼트
Priority date: 2010-05-26
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2013-03-08
Also published as: IL223248A0; WO2011149013A1

Abstract

본 발명은 생체 내에서의 암 세포의 거동을 정확하게 반영할 수 있는 신규의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 이용한 약제 또는 방사성 감수성 평가 방법을 제공하는 것이다. 개체로부터 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 우선 조제한다. 이러한 신규의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴에, 인비트로에 있어서, 약제 혹은 방사선을 적용하여, 그 증식 상태의 평가, 생사 판정 혹은 시그널 분석을 행함으로써 평가한다.

Description

암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 약제 또는 방사선 감수성 평가 방법{METHOD FOR EVALUATION OF SENSITIVITY OF CANCER-TISSUE-DERIVED CELL MASS OR AGGREGATED CANCER CELL MASS TO MEDICINAL AGENT OR RADIOACTIVE RAY}

본 발명은 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 이용한 약제 또는 방사선 감수성 평가 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 인비트로에서 암을 재구축할 수 있고, 또한 증식능을 유지하는 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 이용한 약제 또는 방사선 감수성 평가 방법에 관한 것이다.

최근, 암을 극복하기 위해서 여러 가지 연구가 거듭되어 온 결과, 조기 암의 치료 성적은 비약적으로 향상되고 있다. 그러나, 진행 암의 치료는 여전히 곤란하여, 암은 일본인 사인의 정상을 계속해서 차지하고 있다. 후생노동성에 의한 2007년 인구 동태 통계에서는 연간 34만명 이상이 암에 의해 사망하고 있다.

지금까지의 암 연구에서는, 특히 인비트로에 있어서 그 거동을 조사하는 경우는, 배양에 최적화된 조건으로 계대 배양되어 확립된 암 세포주를 이용한 실험이 주류이다. 이러한 암 세포주에는, 인간 유방암 세포주(MDF7, NCI/ADR HS578T, MDA-MB-22231/ATCC, MDA-MB-4335, MDA-N, BT-549, T-47D), 인간 자궁경부암 세포주(HeLa), 인간 폐암 세포주(A549, EKVX, HOP-62, HOP-92, NCI-H23, NCI-H226, NCI-H322M, NCI-H460, NCI-H522) 및 인간 대장암 세포주(Caco-2, COLO 205, HCC-2998, HCT-15, HCT-116, HT29, KM12, SW-620) 인간 전립선암 세포주(DU-145, PC-3, LNCaP) 등이 포함되며, 실제로 널리 연구에 이용되고 있다.

암의 환자별 진단이나 치료 실현 등을 위해서, 암 세포의 초대 배양이 유망하다고 여겨져, 연구가 진행되고 있다. 예컨대 초대 배양 세포를 이용한 CD-DST 법(Collagen gel droplet embedded drug sensitivity test) 등이 개발되어 있다. 이 인비트로의 시험법은 환자로부터의 단리 조직 혹은 세포를 콜라겐 겔의 소적 내에 포매하여, 삼차원 배양과 화상 비색 정량법을 조합시켜 검증하는 약제 감수성 시험이다(예컨대 비특허문헌 1). 그러나, 초대 배양 세포에 대해서는 배양법이 확립되어 있지 않아, 취급이 곤란하다.

암 세포 연구의 성과로서, 암을 구성하는 암 세포는 복수의 아집단으로 성립되어 있을 가능성이 있으며, 「종양 시원 세포」 혹은 「종양 줄기 세포」라고 불리는, 소집단이지만 자기 복제가 가능하고, 분화에 의해서 대다수 암 세포의 근원이 될 수 있는 아집단의 존재를 지지하는 보고가 잇달고 있다(예컨대, 비특허문헌 2 및 3). 이러한 줄기 세포는 예컨대 생체로부터 적출한 종양을 단일 세포로까지 분리하여 소트함으로써 취득할 수 있으며, 그 중 얼마가 인비트로에 있어서도 증식능을 보인다고 되어 있다(비특허문헌 4). 그러나, 이와 같이 암의 기원을 줄기 세포로 설명하는 설에는 부정적인 보고도 있어(비특허문헌 5), 가설에 지나지 않는다.

암 연구가 널리 행해지고 있는 현재 상태에서도 또한 암에 대해서는 아직 알려지지 않은 점이 많다.

비특허문헌 1 : Takamura Y 등(2002) Prediction of chemotherapeutic response by collagen gel droplet embedded culture-drug sensitivity test in human breast cancers. Int. J. Cancer, 98, 450-455 비특허문헌 2 : Vermeulen L 등(2008) Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. PNAS Vol.105 No.36 13427-13432 비특허문헌 3 : Ricci-Vitiani L 등(2007) Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature Vol.445 111-115 비특허문헌 4 : Todaro M 등(2007) Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell 1: 389-402 비특허문헌 5 : Shmelkov S V 등(2008) CD133 expression is not restricted to stem cells, and both CD133+ and CD133- metastatic colon cancer cells initiate tumors. The Journal of Clinical Investigation Vol. 118 2111-2120

본 발명의 목적은, 생체 내에서의 암 세포 거동을 인비트로에 있어서 재현할 수 있어, 생체 내에서의 효과를 정확히 검증할 수 있는, 암의 분석이나 치료의 연구를 위한 시료로서 유용한 신규의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 이용하여, 약제 감수성 시험 혹은 방사선 감수성 시험 등을 평가하는 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명자들은, 개개 암 환자의 치료 감수성 시험을 하는 것을 의도하여, 암 연구의 연구 재료로서 이용되어 온 세포주가 환자의 암과는 이질의 것일 가능성을 고려하여, 상기 과제를 해결하기 위해 연구 재료로서의 암 세포의 배양에 관해서 예의 검토를 거듭한 결과, 신규의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 조제하여, 그것을 약제 또는 방사선 감수성 평가에 이용할 수 있음을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 인비트로에 있어서도 개체에 있어서의 생체 내에서의 암 세포의 거동을 정확하게 반영할 수 있는 신규의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 이용하여, 신규의 약제 감수성 평가 또는 방사선 감수성 평가 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 환자 유래의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴에, 인비트로에서 약제를 작용시켜, 그 약제의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴에 대한 작용을 평가하는 공정을 포함하는 약제 영향의 평가 방법에 관한 것이다.

상기 작용을 평가하는 것은, 다른 농도의 약제 존재 하에서 또는 비존재 하에서의 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 증식 상태를 비교하는 것을 포함할 수 있다.

상기 작용을 평가하는 것은, 다른 농도의 약제의 존재 하에서 또는 비존재 하에서의 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴 중의 세포의 생사를 판정하는 것을 포함할 수 있다.

상기 작용을 평가하는 것은, 약제의 존재 하에서 또는 비존재 하에서의 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴 중의 세포에 있어서의 세포내 시그널 전달을 분석하는 것을 포함할 수 있다.

상기 약제는 EGF(상피 성장 인자) 또는 IGF(인슐린양 성장 인자)이며, 상기 세포내 시그널 전달의 분석이 Akt 및/또는 ERK1/2의 인산화 분석일 수 있다.

상기 약제는 EGFR(상피 성장 인자 수용체)에 대한 항체, EGFR 저해제, HER2(인간 EGFR 관련 물질 2)에 대한 항체, HER2 저해제, αIR3(인슐린양 성장 인자 I 수용체 α 중화 항체 : 마우스 모노클로널 항체) 및 IGF-IR 저해제로 이루어지는 군에서 선택되며, 상기 세포내 시그널 전달의 분석은 Akt 및/또는 ERK1/2의 인산화 분석일 수 있다.

상기 평가 방법은, 유래하는 환자에게 미치는 약제의 영향을 미리 평가하는 것일 수 있다.

상기 평가 방법에 있어서, 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 유전자를 미리 평가하여 유전자 정보를 얻어 놓고서, 이 유전자 정보에 기초하여 작용시키는 약제를 선택할 수 있다.

상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴는 냉동에 의한 보존 상태를 거친 것일 수 있다.

본 발명은 또한 환자 유래의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴에 인비트로에서 방사선을 작용시켜, 이 방사선의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴에 대한 작용을 평가하는 공정을 포함하는 방사선 영향의 평가 방법에 관한 것이다.

상기 작용을 평가하는 것이, 다른 강도에서의 방사선 하에서의 증식 상태 혹은 방사선 비존재 하에서의 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 증식 상태를 비교하는 것을 포함할 수 있다.

상기 작용을 평가하는 것이, 다른 강도에서의 방사선 하에서 혹은 방사선 비존재 하에서의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴 중의 세포의 생사를 판정하는 것을 포함할 수 있다.

상기 평가 방법이, 상기 유래하는 환자에게 미치는 방사선의 영향을 미리 평가하는 것일 수 있다.

상기 평가 방법에 있어서, 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 유전자를 미리 평가하여 유전자 정보를 얻어 놓고서, 이 유전자 정보에 기초하여 방사선 조사를 선택할 수 있다.

상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴가 냉동에 의한 보존 상태를 거친 것일 수 있다.

본 발명은 또한 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴에 인비트로에서 약제 후보 화합물을 작용시켜, 이 약제 후보 화합물의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴에 대한 작용을 평가하는 공정을 포함하는 약제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

상기 작용을 평가하는 것은, 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 약제 후보 화합물 존재 하에서의 증식 상태를 약제 후보 화합물의 비존재 하에서의 증식 상태와 비교하는 것을 포함할 수 있다.

상기 작용을 평가하는 것은, 약제 후보 화합물의 존재와 비존재 하에서의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴 중의 세포의 생사를 판정하는 것을 포함할 수 있다.

상기 작용을 평가하는 것은, 약제 후보 화합물의 존재와 비존재 하에서의 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴 중의 세포의 세포내 시그널 전달을 분석하는 것을 포함할 수 있다.

상기 약제는 EGF 또는 IGF이며, 상기 세포내 시그널 전달의 분석이 Akt 및/또는 ERK1/2의 인산화 분석일 수 있다.

상기 약제는 EGFR에 대한 항체, EGFR 저해제, HER2에 대한 항체, HER2 저해제, αIR3 및 IGF-IR 저해제로 이루어지는 군에서 선택되며, 상기 세포내 시그널 전달의 분석은 Akt 및/또는 ERK1/2의 인산화 분석일 수 있다.

상기 스크리닝 방법에 있어서, 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 유전자를 미리 평가하여 유전자 정보를 얻어 두고서, 이 유전자 정보에 기초하여 작용시키는 약제 후보 화합물을 선택할 수 있다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 이용한 약제 또는 방사선 감수성 평가 방법을 이용함으로써, 인비트로에서 생체 내와 같은 식의 거동을 미리 알 수 있어, 생체내 투여 또는 적용 전에 그 효과를 예측할 수 있다. 따라서, 획일적이지 않고, 그 환자 개개에 대응한 최적의 치료 방법을 신속하고 또 정확하게 확립하는 것이 가능하게 된다.

더욱이, 본 발명에서는, 항암제 등 후보가 되는 약제를 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴에 적용하여 그 감수성을 조사함으로써, 항암제를 스크리닝하는 것이 가능하게 된다. 개개의 환자에 대하여 또는 어떤 공통의 특징을 갖는 특정한 집단에 대하여 유효한 항암제를 효율적으로 스크리닝할 수 있다.

도 1은 본 발명의 암 조직 유래 세포괴를 도시하는 도면이다.
도 2는 본 발명의 암 조직 유래 세포괴의 하나의 양태에서는 세포가 표면 항원 CD133, CD44, CD166 등을 발현하는 것을 도시하는 도면이다.
도 3은 인비트로의 배양 과정에 있어서의 본 발명의 암 조직 유래 세포괴의 형상 변화와 증식능을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 암 조직 유래 세포괴를 이용한, 인비트로에 있어서의 5-FU에 의한 약제 감수성 시험 결과를 도시하는 도면이다.
도 5는 본 발명의 암 조직 유래 세포괴를 마우스에게 이식하여 얻어진 종양 조직(좌측)과 암 조직 유래 세포괴에서 유래하는 생체 내에서 적출한 종양 조직(우측)을 비교한 도면이다.
도 6은 본 발명의 암 조직 유래 세포괴를 이용한, 인비트로에 있어서의 방사선 감수성 시험 결과를 도시하는 도면이다.
도 7은 여러 가지 암 조직으로부터 얻어진 본 발명의 암 조직 유래 세포괴를 도시하는 도면이다.
도 8은 유방암 조직 유래 세포괴를 이용한, 호로몬 감수성 배양 시험의 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 마우스 췌도 종양으로부터 얻어진 본 발명의 암 조직 유래 세포괴를 도시하는 도면이다.
도 10은 본 발명의 암 조직 유래 세포괴의 냉동 보존 전(좌측) 후(우측)의 상태를 비교한 도면이다.
도 11은 암 조직 유래 세포괴에서 유래하는 암 세포 응집괴를 도시하는 도면이다.
도 12는 인간 대장암 수술 검체에서 유래하는 암 세포 응집괴를 도시하는 도면이다.
도 13은 암 조직 유래 세포괴를 트립신 처리 후 동결 보존하여 융해한 후의 상태를 도시하는 도면이다.
도 14는 암 세포 응집괴를 이용한, 인비트로에 있어서의 독소루비신에 의한 약제 감수성 시험의 결과를 도시하는 도면이다.
도 15는 암 조직 유래 세포괴를 이용한, 인비트로에서의 생사 판정에 의한, 시스플라틴에 의한 약제 감수성 시험 결과를 사세포율로 나타내는 도면이다.
도 16은 암 조직 유래 세포괴를 이용한, 인비트로에서의 시그널 전달 분석에 의한, EGF 및 세툭시맵의 영향을 도시하는 도면이다.
도 17은 암 조직 유래 세포괴를 이용한, 인비트로에서의 시그널 전달 분석에 의한, IGF 및 αIR3의 영향을 도시하는 도면이다.
도 18은 암 조직 유래 세포괴를 이용한, 인비트로에서의 시그널 전달 분석에 의한, EGF 및 엘로티닙의 영향을 도시하는 도면이다.
도 19는 암 조직 유래 세포괴를 이용한, 인비트로에서의 상대적 면적에 의한, 시스플라틴 및 아드리아마이신에 의한 약제 감수성 시험의 결과를 도시하는 도면이다.
도 20은 암 조직 유래 세포괴를 이용한, 인비트로에 있어서의 방사선 감수성 시험의 결과를 상대적인 면적 또는 ATP량으로 도시하는 도면이다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴는, 개체로부터 얻어진 암 조직으로부터 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리로서 분리 처리된 분리물 또는 그 배양물이며, 인비트로에 있어서 증식능을 유지할 수 있는 것일 수 있다.

여기서, 「개체로부터 얻어진 암 조직으로부터 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리로서 분리 처리된 분리물」이란, 생체 내에서 발생한 암으로부터 얻어진 암 조직을 처리하여 얻어진 3개 이상, 바람직하게는 8개 이상의 암 세포를 포함하는 분리물을 가리킨다. 이러한 분리물에는, 단일 세포로까지 분리되어 있는 것은 포함되지 않고, 또한 단일 세포로 분리되고 나서 재구축한 구성물은 포함되지 않는다. 단, 이 분리물은 생체로부터 분리한 직후의 것뿐만 아니라, 예컨대 생리식염수 중에서 일정 시간 유지한 것이나 냉동 또는 냉장한 것도 포함한다.

개체로부터 「얻어진 암 조직」이란, 수술 등에 의해 적출함으로써 얻어지는 암 조직 외에, 주사 바늘이나 내시경으로 조직 검사용으로서 인비트로에서 취급할 수 있도록 취득된 암 조직을 가리킨다.

「개체로부터 얻어진 암 조직으로부터 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리로서 분리 처리된 분리물의 배양물」이란, 생체 내에서 발생한 암으로부터 얻어진 암 조직을 처리하여 얻어진 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리로서 분리 처리된 분리물을 인비트로에 있어서 배양함으로써 얻어지는 것을 가리킨다. 배양하는 시간은 특별히 한정되지 않고, 짧은 시간이라도 배지 중에 존재시킨 것이면 된다. 이러한 배양물은 일정 기간, 바람직하게는 3시간 이상 배양함으로써, 대략 구형 혹은 타원구형을 띠는 경우가 많다. 여기서의 배양물에는, 이러한 일정 기간 경과 후의 대략 구형 혹은 타원구형의 배양물도 거기에 이르기까지의 부정형의 배양물도 포함된다. 또한, 이러한 대략 구형 혹은 타원구형의 배양물을 더 분할하여 얻어지는 부정형, 한층더 배양에 의한 대략 구형물 혹은 타원구형물도 여기서 말하는 배양물이다.

본 발명에서 「약제」란, 암의 치료 목적으로 이용되는 것을 가리키는 것 외에, 생체 또는 세포에 자극을 줄 수 있는 모든 생리 활성 물질을 가리킨다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴가 인비트로에 있어서 「증식능을 유지할 수 있다」란, 세포 배양용의 배지에서, 온도 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터의 세포 배양 조건 하에서 적어도 10일 이상, 바람직하게는 13일 이상, 더욱 바람직하게는 30일 이상 기간 증식능을 유지할 수 있음을 말한다.

이러한 암 조직 유래 세포괴는 그대로 배양을 계속함에 의해서도 10일 이상, 바람직하게는 13일 이상, 더욱 바람직하게는 30일 이상 기간에 있어서 증식능을 유지할 수 있지만, 배양 중에 정기적으로 기계적 분할을 더 행함으로써, 실질적으로 무기한으로 증식능을 유지할 수 있다.

기계 분할은 수술용 메스, 나이프, 가위 외에, 안과 첨도 등을 이용하여 행할 수 있다. 혹은 주사기에 주사 바늘을 장착하여 배양액과 함께 암 조직 유래 세포괴를 흡인 배출하는 것을 반복함으로써 행할 수도 있다. 본 발명에 바람직하게 이용되는 것은 예컨대 1 ml 주사기와 27G의 주사 바늘이지만, 한정되지는 않는다.

여기서, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴의 배양을 위한 배지는 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는 동물 세포 배양용 배지가 이용된다. 특히 바람직하게는 줄기 세포 배양용의 무혈청 배지가 이용된다. 이러한 무혈청 배지는 줄기 세포의 배양에 이용되는 것이면 하등 한정되지는 않는다. 무혈청 배지란, 무조제 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 배지를 가리키며, 정제된 혈액 유래 성분이나 동물 조직 유래 성분(예컨대, 증식 인자)을 첨가하여 사용할 수 있다.

본 발명의 무혈청 배지는 동물 세포의 배양에 이용되는 배지를 기초 배지로 하여 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예컨대 BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지 및 이들의 조합을 들 수 있다.

이러한 무혈청 배지에 혈청 대체물을 첨가하여 본 발명의 암 조직 유래 세포괴를 배양할 수 있다. 혈청 대체물은 예컨대 알부민, 아미노산(예컨대, 비필수 아미노산), 트랜스페린, 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올 또는 3'티올글리세롤 혹은 이들의 균등물 등을 적절하게 함유하는 것일 수 있다.

본 발명의 배양 방법에서는 시판되는 혈청 대체물을 사용할 수도 있다. 이러한 시판되는 혈청 대체물로서는, 예컨대 넉아웃 혈청 리플레이스먼트(KSR), 화학적으로 규명된 지질 농축(Chemically-defined Lipid concentrated) 지방산 농축액(Gibco사 제조), 글루타맥스(Gibco사 제조)를 들 수 있다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴를 배양하기 위한 배지는 또한 비타민, 증식 인자, 사이토카인, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 등을 함유할 수 있다.

특히, EGF와 bFGF를 포함하는 무혈청 배지, 예컨대 넉아웃 혈청 리플레이스먼트(KSR, 인비트로젠사 제조)와 같은 혈청 대체물과 bFGF를 포함하는 무혈청 배지 등의 임의의 무혈청 배지를 바람직하게 사용할 수 있다. 혈청 대체물 혹은 EGF 등의 함유량은 배지 전체의 10～30% w/v인 것이 바람직하다.

이러한 배지로서는 한정되지는 않지만, 시판 제품으로서는 STEMPRO 인간 ES 세포용 무혈청 배지(Gibco)를 들 수 있다.

암 조직 유래 세포괴의 배양에 이용되는 배양기는 일반적으로 동물 세포의 배양이 가능한 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 롤러 보틀을 들 수 있다.

배양기는 세포 비접착성이며, 세포외 매트릭스(ECM) 등에 의한 세포 지지용 기질을 배지에 공존시켜 삼차원 배양하는 것이 바람직하다. 세포 지지용 기질은 암 조직 유래 세포괴의 접착을 목적으로 하는 것일 수 있다. 이러한 세포 지지용 기질로서는, 세포외 매트릭스를 이용한 매트리겔, 예컨대 콜라겐 겔이나, 젤라틴, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 라미닌, 피브로넥틴을 들 수 있다. 이러한 조건은 특히 본 발명의 암 조직 유래 세포괴를 증식시키고 싶은 경우에 적합하게 이용된다.

그 밖의 배양 조건은 적절하게 설정할 수 있으며, 예컨대 배양 온도는 한정되는 것은 아니지만 바람직하게는 약 30～40℃이다. 가장 바람직하게는 37℃이다. CO₂ 농도는 예컨대 약 1～10%, 바람직하게는 약 2～5%이다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 이러한 배지 및 배양 조건으로 배양할 수 있다. 또한 암 조직 유래 세포괴의 배양에는 그 개별적인 성질에 따라, 다른 세포와의 공배양이 바람직한 경우, 혹은 호르몬과 같은 추가의 특수한 보충물의 존재가 필요한 경우도 있을 수 있다.

구체적으로는, 공배양을 피더 세포와 함께 행하더라도 좋다. 피더 세포로서는 태아 섬유아세포 등의 스트로마 세포 등을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 한정되지는 않지만, NIH3T3 등이 바람직하다.

혹은, 특정 종류의 유방암, 자궁암, 전립선암에 대해서는 호르몬을 존재시켜 배양하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 유방암에 대한 에스트로겐, 자궁암에 대한 프로게스테론, 전립선암에 대한 테스토스테론 등이지만, 이들에 한정되지는 않으며, 각종 호르몬을 첨가하여 배양 조건을 적합하게 조정할 수 있다. 또한, 이러한 호르몬의 존재에 의해서 암 조직 유래 세포괴의 배양 후의 거동이 어떻게 변화되는지를 조사함으로써, 유래하는 환자의 암의 호르몬 의존성을 알 수 있어, 항호르몬약 치료의 유효성을 예측할 수 있을 가능성이 있다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 부유 배양으로 배양하는 것도 가능하다. 부유 배양에서는, 배지 중에 있어서, 배양기에 대하여 비접착성의 조건 하에서 암 조직 유래 세포괴를 배양한다. 이러한 부유 배양으로서는, 예컨대 배양체(胚樣體) 배양법(Keller 등, Curr. Opin. Cell Biol. 7, 862-869(1995)), SFEB법(예, Watanabe 등, Nature Neuroscience 8, 288-296(2005); 국제공개 제2005/123902호 참조)을 들 수 있다. 특별히 한정되지는 않지만, 예컨대 거의 구형을 갖는, 때에 따라서는 기저막을 갖는 안정된 암 조직 유래 세포괴를 형성할 때나 유지하는 경우에 이용될 수 있다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴에는 개체의 암 조직 유래 세포괴로부터 분리 처리한 직후의 것도 포함되며, 냉장, 냉동 보존 후의 것도 포함되고, 나아가서는 이들의 배양물도 포함된다. 배양은 바람직하게는 3시간 이상, 보다 바람직하게는 10시간 이상 36시간까지, 더욱 바람직하게는 24시간～36시간 이상 기간 행해질 수 있다.

암 조직 유래 세포괴를 구성하는 암 세포는 적어도 3개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 보다 바람직하게는 10개 이상, 더욱 바람직하게는 20개 이상, 가장 바람직하게는 50개 이상이다. 본 발명의 암 조직 유래 세포괴가 분리물인 경우에는, 바람직하게는 1000개 이하, 보다 바람직하게는, 500개 이하 정도이다. 분리물을 배양한 후의 배양물이라면, 배양에 의해서 그 수를 증가시킬 수 있다. 단, 배양물이라도 바람직하게는 1만개 이하, 보다 바람직하게는 5000개 이하이다.

본 발명에서 「암 세포」라고 할 때는 통상 이용되는 의미로 사용되며, 생체 내에 있어서, 제한 없는 분열·증식과 아포토시스로부터의 일탈이라고 하는, 정상 세포에서 보이는 질서가 흐트러진 세포를 말한다. 보다 상세하게는, 세포 증식 제어 기능을 잃었거나 매우 감약되어 있는 세포를 가리키며, 전형적으로는 80% 이상의 높은 빈도로 무한 증식 능력을 획득하고 있고, 그 대부분은 침윤 전이 능력도 구비하고 있는 경우가 많으며, 그 결과 인간을 비롯한 특히 포유동물을 죽음에 이르게 하는 악성 신생물로 자리하는 세포임을 의미한다.

본 발명에서는, 유래하는 암 조직의 종류는 특별히 한정되지 않고, 포유류를 비롯한 동물에게서 생기는, 림프종, 아종, 육종, 지방육종, 신경내분비종양, 중피종, 신경초종, 수막종, 선종, 흑색종, 백혈병, 림프성 악성종 등일 수 있는데, 특히는 포유류의 상피 세포에 생기는 암종인 것이 바람직하다. 이러한 상피 세포에 생기는 암종에는, 비소세포폐암, 간세포암, 담도암, 식도암, 위암, 결장직장암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 방광암, 인두암, 유방암, 타액선암, 신장암, 전립선암, 음순암, 항문암, 음경암, 정소암, 갑상선암, 두경부암 등이 포함된다. 포유류를 비롯한 동물에게 특별히 한정은 없지만, 원숭이나 인간을 포함하는 영장목에 속하는 동물, 마우스, 다람쥐, 래트 등의 설치목에 속하는 동물, 토끼목에 속하는 동물, 개, 고양이 등의 고양이목에 속하는 동물이 예시된다.

그 중, 본 발명에서는, 특히 대장암 조직 유래, 난소암 조직 유래, 유방암 조직 유래, 폐암 조직 유래, 전립선암 조직 유래, 신장암 조직 유래, 방광암 조직 유래, 인두암 조직 유래 또는 췌장암 유래인 것이 특히 바람직하지만, 한정되지는 않는다.

대장암 조직 유래의 암 조직 유래 세포괴인 경우에는, 포함되는 암 세포는, 특별히 한정되지는 않지만, CD133을 발현하는 것도 있다.

생체 내에서 발생한 암으로부터 얻어진 암 조직의 분리 처리에는, 한정되지는 않지만, 개체로부터 얻어진 암 조직을 효소 처리하는 것이 포함된다.

효소 처리는 콜라게나아제, 트립신, 파파인, 히알루로니다아제, 씨. 히스톨리티쿰 뉴트랄 프로테아제(C. histolyticum neutral protease), 써모리신(thermolysin) 및 디스파제(dispase) 중의 1종 또는 이들의 2종 이상의 조합에 의한 처리일 수 있다. 효소 처리 조건은, 생리학적으로 허용되는 pH, 예컨대 약 6～8, 바람직하게는 약 7.2～7.6로 완충된 등장의 염 용액, 예컨대 PBS나 행크스의 평형염 용액 중에서, 예컨대 약 20～40℃, 바람직하게는 약 25～39℃에서 결합 조직을 분해하기 위해서 충분한 시간, 예컨대 약 1～180분간, 바람직하게는 30～150분간이며, 이를 위해서 충분한 농도, 예컨대 약 0.0001～5% w/v, 바람직하게는 약 0.001%～0.5% w/v일 수 있다.

한정되지는 않지만, 이 효소 처리의 조건은 콜라게나아제를 포함하는 혼합 효소로 처리하는 것이 포함된다. 예컨대, 씨. 히스톨리티쿰 뉴트랄 프로테아제, 써모리신 및 디스파아제로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 프로테아제; 및 콜라게나아제 I, 콜라게나아제 II 및 콜라게나아제 IV로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 콜라게나아제를 포함하는 혼합 효소로 처리하는 것이 포함된다. 특히 디스파아제와 콜라게나아제의 조합이 바람직하다. 효소 처리에 의해서, 간질의 콜라겐이나 피브로넥틴 등만을 소화하고, 상피의 세포-세포 사이의 접착에 관여하고 있는 단백은 소화하지 않는 것이 바람직하다.

이러한 혼합 효소에는, 한정되지는 않지만, 리베라제 브렌자임 1(등록상표) 등이 포함된다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴는, 혹은, 3개 이상의 암 세포 집합체를 포함하며, 대략 구형 혹은 타원구형을 띠는 것일 수 있다.

한정되지는 않지만, 상기 암 세포 집합체의 외주면에 존재하는 기저막양 물질을 포함하는 것도 있다.

여기서, 집합체를 형성하는 암 세포는 실질적으로 순수한 암 세포만의 집단인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 순수한 암 세포만의 집단이다. 집합체를 형성하는 암 세포는 CD133, CD44, CD166, CD117, CD24 및 ESA로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 표면 항원을 세포 표면에 갖는 경우가 많다. CD133, CD44, CD166, CD117, CD24 및 ESA는 일반적으로는 림프구 등의 백혈구, 섬유아세포, 상피 세포, 종양 세포 등의 세포에 발현하고 있는 표면 항원이다. 이들 표면 항원은 세포-세포 사이, 세포-매트릭스 사이 접착으로서의 기능 외에, 여러 가지 시그널 전달에 관여하는데, 각종 줄기 세포의 표면 마커이기도 하다.

본 발명에 있어서, 세포군이 CD133과 같은 표면 항원을 「발현한다」고 말할 때에는, 세포군 중에 존재하는 세포의 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 실질적으로 전부가 표면 항원을 보이고 있는 상태를 가리킨다.

본 명세서에 있어서, 「기저막양 물질」이란, 한정되지는 않지만, 바람직하게는, 콜라겐, 라미닌, 니도겐, 헤파란황산프로테오글리칸 등의 프로테오글리칸, 피브로넥틴 등의 당단백질 중 적어도 어느 1종을 함유하는 물질을 가리킨다. 본 발명에서는 라미닌을 함유하는 기저막양 물질인 것이 바람직하다.

라미닌은 기저막을 구성하는 고분자 당단백질이다. 라미닌의 기능은 다방면에 걸치며, 예컨대 세포 접착, 세포간 신호 전달, 정상 세포 및 암 세포의 증식 등의 세포 기능에 관여하고 있다. 라미닌은 3개의 다른 서브유닛의 각각이 디술피드 결합으로 연결된 구조를 갖고 있으며, 각각의 서브유닛이 상이한 종류에 의해서 11 종류가 발견되어 있다.

이들 중, 라미닌 5는 통상 상피 세포에서만 산생되어, 상피 세포의 기저막에의 접착이나 운동 기능을 촉진하는 활성을 갖는 성분으로서 알려져 있다. 이 라미닌 5는 α3쇄, β3쇄, γ2쇄의 각각 1가닥씩이 복합체를 형성한 구조를 지니며, 특히 γ2쇄는 LN5 고유라고 생각되고 있고, 다른 LN 분자종에는 포함되어 있지 않다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 암 세포 집합체의 외주가 이러한 기저막양 물질이 형성하는 막에 전체적으로 둘러싸인 구성을 가질 수 있다. 이러한 형태는 암 조직 유래 세포괴의 전자현미경에 의한 관찰 혹은 기저막 구성 요소의 면역 염색 또는 그 양쪽을 조합시킴으로써 해석할 수 있다.

라미닌의 존재는 예컨대 라미닌을 인식하는 항체, 예컨대 시그마-알드리치사의 마우스 라미닌 유래 래빗 항체와 암 조직 유래 세포괴를 접촉시켜 항체 항원 반응을 측정함으로써 검출할 수 있다.

또한, 라미닌의 종류까지를 특정하는 특이적인 항체를 이용하는 것도 가능하다. 예컨대, 라미닌 5의 존재는 예컨대 특히 상기한 고유의 γ2쇄 혹은 그 단편에 반응성을 갖는 항체와 암 조직 유래 세포괴를 접촉시켜 항체의 반응을 측정함으로써 검출할 수 있다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴에 있어서는, 얇은 막 형상의 기저막양 물질이 덩어리의 크기에 따라 수 ㎛ 정도, 바람직하게는 40에서 120 nm 정도 형성되어 있는 것이 바람직하지만 한정되지는 않는다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴의 사이즈는 한정되지는 않으며, 입경 또는 체적 평균 입경 8 ㎛～10 ㎛ 정도의 부정형인 것도 포함되고, 또한, 배양한 후에 크게 성장한 1 mm 입경 이상인 것도 포함된다. 바람직하게는 직경이 40 ㎛～1000 ㎛이며, 보다 바람직하게는 40 ㎛～250 ㎛, 더욱 바람직하게는 80 ㎛～200 ㎛이다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴에서는, 특히 선반형 배열, 시트형 배열, 중층 배열 및 합포상(合胞狀) 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 배열을 갖는 경우가 많지만, 특별히 한정되지는 않는다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴는, 전형적으로는 생체로부터 적출한 암 조직의 세편화물을 효소 처리하는 공정; 및 효소 처리물 중, 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리를 선별 회수하는 공정을 포함하는 방법에 의해서 조제될 수 있다.

또한, 한정되지는 않지만, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 이와 같이 하여 회수한 성분을 3시간 이상 배양하는 공정을 포함하는 방법에 의해서 조제될 수 있다.

우선, 생체로부터 적출한 암 조직은 그대로 세편화할 수도 있고, 또한, 우선 세편화 전에 동물 세포 배양용 배지에서 유지할 수 있다. 이러한 동물 세포 배양용 배지에는, 특별히 한정되지는 않지만, 둘베코 MEM(DMEM F12 등), 이글 MEM, RPMI, Ham's F12, 알파 MEM, 이스코브 개변 둘베코 등이 포함된다. 이때에, 세포 비접착성의 배양기로 부유 배양하는 것이 바람직하다.

암 조직은 또한 세편화에 앞서서 세정하는 것도 바람직하다. 이러한 세정에는, 한정되지는 않지만, 초산 완충액(초산+초산나트륨), 인산 완충액(인산+인산나트륨), 시트르산 완충액(시트르산+시트르산나트륨), 붕산 완충액, 타르타르산 완충액, 트리스 완충액, 인산 완충 생리식염수 등의 완충액 등을 이용할 수 있다. 본 발명에서는, 특히 바람직하게는, HBSS 중에서 조직을 세정할 수 있다. 세정 횟수는 1회에서 3회가 적당하다.

세편화는 세정 후의 조직을 나이프, 가위, 커터(수동, 자동) 등으로 분할함으로써 행할 수 있다. 세편화 후의 사이즈나 형태는 특별히 한정되지 않고, 랜덤하게 할 수 있지만, 바람직하게는 1 mm～5 mm 사각, 보다 바람직하게는 1 mm～2 mm 사각의 균일한 사이즈로 한다.

이어서 이와 같이 하여 얻어지는 세편화물은 효소 처리에 제공된다. 이러한 효소 처리는, 콜라게나아제, 트립신, 파파인, 히알루로니다아제, 씨. 히스톨리티쿰 뉴트랄 프로테아제, 써모리신 및 디스파제 중의 1종 또는 이들의 2종 이상의 조합에 의한 처리일 수 있다. 효소 처리 조건은 생리학적으로 허용되는 pH, 예컨대 약 6～8, 바람직하게는 약 7.2～7.6으로 완충된 등장의 염 용액, 예컨대 PBS나 행크스의 평형염 용액 중에서, 예컨대 약 20～40℃, 바람직하게는 약 25～39℃에서 결합 조직을 분해하기 위해서 충분한 시간, 예컨대 약 1～180분간, 바람직하게는 30～150분간이며, 이를 위해서 충분한 농도, 예컨대 약 0.0001～5% w/v, 바람직하게는 약 0.001%～0.5% w/v일 수 있다.

한정되지는 않지만, 이 효소 처리의 조건은 예컨대 콜라게나아제를 포함하는 혼합 효소로 처리하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, 씨. 히스톨리티쿰 뉴트랄 프로테아제, 써모리신 및 디스파아제로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 프로테아제; 및 콜라게나아제 I, 콜라게나아제 II 및 콜라게나아제 IV로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 콜라게나아제를 포함하는 혼합 효소로 처리하는 것이 포함된다. 특히 디스파아제와 콜라게나아제의 조합이 바람직하다. 효소 처리에 의해서, 간질의 콜라겐이나 피브로넥틴 등만을 소화하고, 상피의 세포-세포 사이의 접착에 관여하고 있는 단백은 소화하지 않는 것이 바람직하다.

이러한 혼합 효소에는, 한정되지는 않지만, 리베라제 블렌자임 1(등록상표) 등이 포함된다.

다음에 이와 같이 하여 얻어진 효소 처리물 중, 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리를 선별 회수하는 것이 바람직하다. 선별 회수 방법은 특별히 한정되지 않으며, 사이즈를 분류하는 당업자에게 공지된 어느 방법이나 사용할 수 있다.

사이즈의 분류 방법 중, 간편한 방법으로서는, 눈으로 확인, 위상차현미경에 의한 분별 혹은 체에 의한 것이지만, 당업자에게 이용 가능한 입자경에 의한 분별법이라면 특별히 한정되지 않는다. 체를 사용하는 경우는, 체 메쉬 사이즈(메쉬 1개의 직경) 500 ㎛를 통과하고, 20 ㎛를 통과하지 않는 성분을 회수하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 체 메쉬 사이즈(메쉬 1개의 직경) 250 ㎛를 통과하고, 또한 40 ㎛를 통과하지 않는 성분을 회수한다.

여기서, 선별의 대상이 되는 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리는 본 발명의 암 조직 유래 세포괴이며, 일정 범위의 사이즈를 갖는다. 일정 범위의 사이즈란, 체적 평균 입자경 8 ㎛～10 ㎛ 정도의 작은 것도 포함되지만, 구형에 가까운 경우는, 직경 20 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하, 바람직하게는 30 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 보다 바람직하게는 40 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하, 타원 형상인 경우에는, 장경 20 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하, 바람직하게는 30 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 보다 바람직하게는 40 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하, 부정형인 경우에는, 체적 평균 입자경 20 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하, 바람직하게는 30 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 보다 바람직하게는 40 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하이다. 체적 평균 입자경의 측정에는, 위상차현미경(IX70; 올림푸스사 제조)에 CCD 카메라를 부착한 것을 이용하여, 입도 분포 및 입자 형상을 평가함으로써 행할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 선별 회수 성분인 분리 처리물 혹은 그 배양물의 어느 것이나 본 발명의 암 조직 유래 세포괴이다. 배양물은 선별 회수 성분인 분리물이 짧은 시간 배지 중에 존재한 것이라도 좋고, 예컨대, 적어도 3시간 이상, 바람직하게는 10시간 이상 36시간까지, 보다 바람직하게는 24시간～36시간 이상 기간 배양함으로써, 대략 구형 혹은 대략 타원구형의 형상으로 된 것이라도 좋다. 배양 시간은, 36시간을 넘어, 수일 혹은 10일 이상, 13일 이상 또는 30일 이상 경과한 것이라도 좋다.

배양은 배지 중에서 장기간 그대로 행하는 것도 가능하지만, 바람직하게는, 배양 도중에 정기적으로 기계적 분할을 함으로써, 실질적으로 무한하게 증식능을 유지시킬 수도 있다.

본 발명에 있어서는, 이러한 암 조직 유래 세포괴가 복수 개 존재하는 조성물을 용이하게 얻을 수 있으며, 이러한 암 조직 유래 세포괴의 실질적으로 순수한 집합체는 각종 응용에 있어서 매우 유용하다. 이러한 암 조직 유래 세포괴의 복수 개의 집합체의 조성물은 예컨대 암 조직 유래 세포괴를 5개 이상, 바람직하게는 10개 이상, 바람직하게는 50개 이상 거의 순수한 형태로 포함하는 것이다. 암 조직 유래 세포괴의 복수 개의 집합체가 순수하다고 하는 경우에는, 조성물에 있어서, 조직에 유래하는 다른 세포를 조성물 내에 포함하지 않는다고 하는 의미이다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴는, 예컨대 직경 100 마이크로미터의 암 조직 유래 세포괴 10개 이하(세포 1000개 이하에 상당)라도, 이종 동물에의 이식에 있어서의 정착도가 높다. 따라서, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴는, 마우스를 비롯한 암 모델 동물의 간편한 작성에 유용하며, 보다 엄밀한 암 조직의 검증, 약제 감수성의 평가 혹은 방사선 치료를 비롯한 치료 양태의 평가가 가능하게 된다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 냉동 보존하는 것이 가능하며, 통상의 보존 상태에 있어서 그 증식능을 유지할 수 있다.

본 발명의 암 세포 응집괴는, 암 조직 유래 세포괴 또는 개체로부터 얻어지는 암 조직을 단일 세포화한 후에 그 단일 세포화물 중의 개개의 세포끼리 또는 완전히 개개의 세포로까지는 분리되지 않은 몇 개 세포의 집합끼리 또는 개개의 세포와 완전히 개개의 세포로까지는 분리되지 않은 몇 개의 세포가 전체적으로 세포수 3개 이상으로 응집함으로써 형성되는 응집물 또는 그 배양물이며, 인비트로에 있어서 증식능을 유지할 수 있는 것이다.

여기서, 「암 조직 유래 세포괴 또는 개체로부터 얻어지는 암 조직을 단일 세포화한다」란, 암 조직 유래 세포괴 또는 얻어진 암 조직의 적어도 일부를 인비트로에 있어서 단일 세포로까지 분리시키는 처리를 실시하는 것을 말한다. 따라서, 전형적으로는, 이러한 처리 후에, 개개의 단일 세포로까지 분리한 세포가 존재하는 중에, 얼마의 세포가 개개로까지는 분리되지 않는 상태로 혼재하는 경우도 있으며, 이러한 경우라도 본 명세서에서 말하는 「단일 세포화한다」에 해당한다. 이때에 혼재하는 개개로까지는 분리되지 않는 상태인 것에는 세포수 10개까지의 집합체, 바람직하게는 세포수 2～3개의 집합체가 포함된다.

「세포수 3개 이상으로 응집」이란, 생체 내에서 발생한 암으로부터 얻어진 암 조직 또는 본 발명자들이 알아낸 암 조직 유래 세포괴를 단일 세포화 처리하여 얻어진 개개의 세포끼리 또는 개개로까지는 분리되지 않은 몇 개 세포의 집합체끼리 또는 이들의 조합끼리가 적어도 3개 혹은 그 이상의 복수의 세포를 포함하도록 모인 상태를 가리킨다.

암 조직 유래 세포괴 또는 생체 내에서 발생한 암으로부터 얻어진 암 조직을 단일 세포화 처리에 제공하는 경우는, 한정되지는 않지만, 개체로부터 얻어진 암 조직을 효소 처리하는 것이 포함된다.

효소 처리는 전형적으로는 트립신, 디스파아제 및 경우에 따라 콜라게나아제, 파파인, 히알루로니다아제, 씨. 히스톨리티쿰 뉴트랄 프로테아제, 써모리신, 및 디스파제 중의 1종 또는 이들의 2종 이상의 조합에 의한 처리일 수 있다. 효소 처리 조건은, 생리학적으로 허용되는 pH, 예컨대 약 6～8, 바람직하게는 약 7.2～7.6으로 완충된 등장의 염 용액, 예컨대 PBS나 행크스의 평형염 용액 중에서, 예컨대 약 20～40℃, 바람직하게는 약 25～39℃에서 결합 조직을 분해하기 위해 충분한 시간, 예컨대 약 1～180분간, 바람직하게는 30～150분간이며, 이를 위해서 충분한 농도, 예컨대 약 0.0001～5% w/v, 바람직하게는 약 0.001%～0.5% w/v일 수 있다.

한정되지는 않지만, 이 효소 처리는 전형적으로는 트립신 또는 디스파아제 처리 단독이라도 좋다.

단일 세포화 처리 후에는 통상 개개로 분리된 세포를 얻을 수 있다. 단, 개개로까지 완전히 분리되지 않는 세포도 포함된다.

이러한 세포는 이대로 응집시키더라도 좋지만, 예컨대 세포 응집을 촉진시키는 약제 혹은 세포사를 억제하는 약제를 가하여 처리할 수도 있다. 이러한 약제로서는, ROCK 저해제나 카스파아제 저해제 등의 세포사에 관련된 효소의 저해제가 포함된다.

ROCK란, Rho-associated coiled-coil 키나아제(ROCK : GenBank 수탁번호: NM_005406)를 말하며, Rho GTPase의 주된 이펙터 분자의 하나로, 다양한 생리 현상을 제어하고 있다는 것이 알려져 있다(Rho 결합 키나아제라고도 함). ROCK 저해제로서는 예컨대 Y27632 등이 예시된다. 그 밖에, Fasudil(HA1077), H-1152, Wf-536(이들은 전부 와코쥰야쿠고교주식회사에서 입수할 수 있음)와 이들의 유도체 및 ROCK에 대한 안티센스 핵산, RNA 간섭 유도성 핵산이나 이들을 포함하는 벡터를 들 수 있다.

트립신 처리(예컨대 한정되지는 않지만, 0.25% 트립신-EDTA, 37℃ 5분간 처리)를 비롯한 효소 처리에 의해서 단일 세포 또는 10개 이하 세포의 집합으로까지 분리한 처리물을, 응집에 앞서서, 96 웰 배양 플레이트에 저밀도(예컨대 500개/0.32 ㎠, 배지 용량 0.15 ml 정도)로 파종한다. 유지 배양액 중에 즉각 혹은 수일 배양한 후에, ROCK 저해제를 1～100 μM 정도, 바람직하게는 10 μM 정도 농도 첨가할 수 있다.

이러한 응집물을 인비트로에 있어서 배양할 수 있다. 배양하는 시간은 특별히 한정되지 않고, 짧은 시간이라도 배지 중에 존재시킨 것이면 된다. 이러한 배양물은 일정 기간 바람직하게는 3시간 이상 배양함으로써, 대략 구형 혹은 타원구형을 띠는 경우가 많다. 여기서의 배양물에는, 이러한 일정 기간 경과 후의 대략 구형 혹은 타원구형의 배양물도, 거기에 이르기까지의 부정형의 배양물도 포함된다. 또한, 이러한 대략 구형 혹은 타원구형의 배양물을 더욱 분할하여 얻어지는 부정형, 한층더 배양에 의한 대략 구형물 혹은 타원구형물도 여기서 말하는 배양물이다.

본 발명의 암 세포 응집괴가 인비트로에 있어서 「증식능을 유지할 수 있다」란, 세포 배양용 배지에 있어서, 온도 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터의 세포 배양 조건 하에서, 적어도 10일 이상, 바람직하게는 13일 이상, 더욱 바람직하게는 30일 이상 기간 증식능을 유지할 수 있는 것을 말한다.

이러한 암 세포 응집괴는 그대로 배양을 계속함에 의해서도 10일 이상, 바람직하게는 13일 이상, 더욱 바람직하게는 30일 이상 기간에 있어서 증식능을 유지할 수 있지만, 배양 중에 정기적으로 기계적 분할을 더 행함으로써, 또는 단세포화 처리와 응집을 더 행함으로써 실질적으로 무기한으로 증식능을 유지할 수 있다.

여기서, 본 발명의 암 세포 응집괴의 배양을 위한 배지는 암 조직 유래 세포괴의 배양을 위한 배지와 마찬가지다.

본 발명의 암 세포 응집괴는 이러한 배지 및 배양 조건으로 배양할 수 있다. 또한 암 세포 응집괴의 배양에는, 그 개별 성질에 따라서, 다른 세포와의 공배양이 바람직한 경우, 혹은 호르몬과 같은 추가의 특수한 보충물의 존재가 필요한 경우도 있을 수 있다.

구체적으로는, 공배양을 피더 세포와 함께 행하더라도 좋다. 피더 세포로서는, 태아 섬유아세포 등의 스트로마 세포 등을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 한정되지는 않지만, NIH3T3 등이 바람직하다.

혹은, 특정 종류의 유방암, 자궁암, 전립선암에 대해서는 암 조직 유래 세포괴의 경우와 마찬가지로, 호르몬을 존재시켜 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명의 암 세포 응집괴는 또한 암 조직 유래 세포괴와 마찬가지로 부유 배양으로 배양하는 것도 가능하다.

암 세포 응집괴를 구성하는 암 세포는 적어도 3개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 보다 바람직하게는 10개 이상, 더욱 바람직하게는 20개 이상이며, 그 수에 있어서 특별히 상한은 없다. 본 발명의 암 세포 응집괴가 분리물인 경우에는, 바람직하게는 1000개 이하, 보다 바람직하게는 500개 이하 정도이다. 분리물을 배양한 후의 배양물이라면, 배양에 의해서 그 수를 증가시키는 것이 가능하다. 단, 배양물만이라도 바람직하게는 1만개 이하, 보다 바람직하게는 5000개 이하이다.

본 발명의 암 세포 응집괴의 사이즈는 한정되지는 않으며, 입경 또는 체적 평균 입경 8 ㎛～10 ㎛ 정도의 부정형인 것도 포함되고, 또한, 배양한 후에 크게 성장한 1 mm 입경 이상인 것도 포함된다. 바람직하게는 직경이 40 ㎛～1000 ㎛이며, 보다 바람직하게는 40 ㎛～250 ㎛, 더욱 바람직하게는 80 ㎛～200 ㎛이다.

본 발명의 암 세포 응집괴에서는, 특히 선반형 배열, 시트형 배열, 중층 배열 및 합포상 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 배열을 갖는 경우가 많지만, 특별히 한정되지는 않는다.

본 발명의 암 세포 응집괴는 전형적으로는 생체로부터 적출한 암 조직을 단일 세포화하는 공정; 및 이 단일 세포화물 중의 세포끼리를 세포수 3개 이상으로 응집시키는 공정을 포함하는 방법에 의해서 조제될 수 있다.

또한, 한정되지는 않지만, 본 발명의 암 세포 응집괴는 응집된 성분을 3시간 이상 배양하는 공정을 포함하는 방법에 의해서 조제될 수 있다.

우선, 본 발명의 암 세포 응집괴가 암 조직 유래 세포괴로부터 얻어지는 경우에는 그대로 효소 처리에 제공하는데, 생체로부터 적출한 암 조직은 그대로 효소 처리에 제공함으로써 단일 세포화할 수도 있는 한편, 효소 처리에 앞서서 세편화하는 것이 바람직하다. 세편화 전에 동물 세포 배양용 배지로 유지할 수 있다. 이러한 동물 세포 배양용 배지에는, 특별히 한정되지는 않지만, 둘베코 MEM(DMEM F12 등), 이글 MEM, RPMI, Ham's F12, 알파 MEM, 이스코브 개변 둘베코 등이 포함된다. 이때에, 세포 비접착성의 배양기로 부유 배양하는 것이 바람직하다.

세편화는 세정 후의 조직을 나이프, 가위, 커터(수동, 자동) 등으로 분할함으로써 행할 수 있다. 세편화 후의 사이즈나 형태는 특별히 한정되지 않고, 랜덤하게 행할 수 있는데, 바람직하게는 1 mm～5 mm 사각, 보다 바람직하게는 1 mm～2 mm 사각의 균일한 사이즈로 한다.

이어서 이와 같이 하여 얻어지는 세편화물은 효소 처리에 제공된다. 이러한 효소 처리는 상술한 대로 주로 트립신 처리일 수 있다. 효소 처리 조건은 20℃～45℃, 수분에서 수시간일 수 있다.

이어서 이와 같이 하여 얻어진 단일 세포화물 중의 세포끼리가 세포수 3개 이상으로 응집하도록 한다. 응집에 앞서서, 바람직하게는 단일 세포화물에 신속하게 ROCK 저해제를 첨가할 수 있다.

여기서, 응집에 의해 얻어지는 3개 이상의 암 세포를 포함하는 응집물은 본 발명의 암 세포 응집괴이며, 일정 범위의 사이즈를 갖는다. 일정 범위의 사이즈란, 체적 평균 입자경 8 ㎛～10 ㎛ 정도의 작은 것도 포함되는데, 구형에 가까운 경우는, 직경 20 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하, 바람직하게는 30 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 보다 바람직하게는 40 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하, 타원 형상인 경우에는, 장경 20 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하, 바람직하게는 30 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 보다 바람직하게는 40 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하, 부정형인 경우에는, 체적 평균 입자경 20 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하, 바람직하게는 30 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 보다 바람직하게는 40 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하이다. 체적 평균 입자경의 측정에는 위상차현미경(IX70; 올림푸스사 제조)에 CCD 카메라를 부착한 것을 이용하여, 입도 분포 및 입자 형상을 평가함으로써 행할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 응집물 또는 그 배양물의 어느 것이나 본 발명의 암 세포 응집괴이다. 배양물은, 선별 회수 성분인 분리물을, 짧은 시간에 배지 중에 존재한 것이라도 좋고, 예컨대 적어도 3시간 이상, 바람직하게는 10시간 이상 36시간까지, 보다 바람직하게는 24시간～36시간 이상 기간 배양함으로써, 대략 구형 혹은 대략 타원구형의 형상으로 된 것이라도 좋다. 배양 시간은 36시간을 넘어, 수일 혹은 10일 이상, 13일 이상 또는 30일 이상 경과한 것이라도 좋다.

배양은 배지 중에서 장기간 그대로 행하는 것도 가능하지만, 바람직하게는 배양 도중에 정기적으로 기계적 분할을 행함으로써, 실질적으로 무한하게 증식능을 유지시킬 수도 있다.

또한, 본 발명의 암 세포 응집괴는 예컨대 직경 100 마이크로미터의 암 세포 응집괴 10개 이하(세포 1000개 이하에 상당)라도, 이종 동물에의 이식에 있어서의 정착도가 높다. 따라서, 본 발명의 암 세포 응집괴는 마우스를 비롯한 암 모델 동물의 간편한 작성에 유용하며, 보다 엄밀한 암 조직의 검증, 약제 감수성의 평가 혹은 방사선 치료를 비롯한 치료 양태의 평가가 가능하게 된다.

본 발명의 암 세포 응집괴는 또한 냉동 보존하는 것이 가능하며, 통상의 보존 상태에서 있어서 그 증식능을 유지할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴는, 인비트로에 있어서, 생체 내의 암 조직과 같은 거동을 보여, 안정적으로 배양할 수 있으며, 게다가 증식능을 유지한다. 특히 이러한 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴가 복수 개 존재하는 집합체인 형태는 본 발명에서 매우 간단히 조제할 수 있어, 유용하다.

따라서, 예컨대 얻어진 암 조직 유래의 종양이 감수성을 갖는 기존 약제의 종류의 특정 혹은 방사선에의 감수성 유무를 환자마다 개별적으로 확인하는 데 유용하다. 약제 혹은 방사선 감수성은 공지된 모든 방법을 사용할 수 있으며, 한정되지는 않는다.

구체적으로는, 약제 감수성은 인비트로에 있어서 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 다른 농도의 약제 존재 하에서 또는 비존재 하에서 배양하고, 이들의 증식율 혹은 생존율을 측정하여 비교함으로써 행할 수 있다. 이러한 측정에는, 예컨대 피험 약제 첨가에서부터 수시간 후, 혹은 수일 후의 생존 세포수를 대조예와 함께 눈으로 확인하여 관찰하는 것, CCD 카메라 촬영 후에 화상 해석하는 것, 혹은 각각의 세포에 포함되는 단백질 결합성 색소(예컨대, 술포로다민 B)에 의한 염색에 의해 단백량으로서 비색 측정하는 것 등이 포함된다.

혹은, 약제 감수성은 인비트로에 있어서 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 약제 존재 하에서 또는 비존재 하에서 배양하여 세포내 시그널 전달을 분석함으로써 조사할 수 있다.

혹은, 약제 감수성은 인비트로에 있어서 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 약제 존재 하에서 또는 비존재 하에서 배양하여 각각의 ATP량을 측정함으로써 조사할 수 있다.

세포내 시그널 전달의 분석은, 한정되지는 않지만, 세포에 있어서의 Akt 및/또는 ERK1/2의 인산화 유무나 정도를 분석하는 것이다. Akt는 세린/트레오닌 키나아제이며, 자신도 인산화됨으로써 활성화된다. 한편, 세포외 시그널 제어 키나아제(ERK)는 마이토겐 활성화 프로테인 키나아제 패밀리에 속한다. AKT 및 ERK는 암 세포의 증식과 생존에 관여한다.

이러한 Akt 및/또는 ERK1/2의 인산화 유무나 정도를 분석하는 구체적인 방법으로서는, 세포의 시그널 전달 경로 중, 이들 효소의 상류에 위치하고 있는 것이 알려져 있는 수용체를 자극하고, 그 후에 Akt 및/또는 ERK1/2의 인산화 유무나 정도를 검출하는 것을 들 수 있다. 예컨대, 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 상피 성장 인자(EGF), EGFR 항체 또는 EGFR 저해제 등의 존재 하에서 배양하고, 그 후에 세포 용해 처리를 하여, 용해 처리물을 예컨대 웨스턴 블롯으로 행할 수 있다. 혹은 또 EGFR과 구조가 유사한 HER2에 대한 항체 존재 하에서 배양하고, 그 후 같은 식으로 웨스턴 블롯 분석할 수 있다.

이와 같이 하여, 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴가 유래하는 환자에게 미치는 약제의 영향을 투약 전에 조사하는 것이 가능하게 된다.

이러한 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴는 또한 미지의 약제의 스크리닝에 유용하다. 이러한 미지의 약제 감수성도 또한 인비트로에 있어서의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 증식율의 측정, 축소율의 측정, 세포의 생사 판정 또는 세포내 시그널 전달의 분석, ATP량 측정에 의해서 이루어질 수 있다. 증식율의 측정에는 예컨대 피험 약제 첨가 후, 수시간 후, 혹은 수일 후의 생존 세포수를 대조예와 함께 눈으로 확인하여 관찰하는 것, CCD 카메라 촬영 후에 화상 해석하는 것, 혹은 각각의 세포에 포함되는 단백질 결합성 색소 술포로다민 B에 의한 염색에 의해 단백량으로서 비색 측정하는 것, SD(숙시닐 데히드로게나제) 활성을 측정하는 것 등이 포함된다.

모든 인간 배양 세포의 피험 화합물 감수성 측정 데이터, 즉 세포 증식을 50% 저해하는 농도(GI₅₀), 외관상 세포 증식을 억제하는 농도(TGI) 및 세포수를 뿌려 넣을 때의 50%로 감소시키는 농도(LC₅₀) 등을 계산하여 정보 처리를 하는 것도 가능하다. GI₅₀, TGI, LC₅₀ 값은 각각 시험된 암 세포 응집괴 고유의 수치를 얻을 수 있다. 그 전체 평균 GI₅₀, TGI, LC₅₀ 값을 구하여, 이 평균치와 개개의 세포에서의 Log GI₅₀ 값과의 차를 구하고, 이들을 평균 Log GI₅₀ 값을 기준으로 하여, 절대치화하여 양과 음으로 표기한다. 양의 값이 큰 경우일수록 감수성이 높은 약제라고 판단할 수 있다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 이용한 방사선 감수성 시험에서는, X선, 코발트의 방사성 동위체를 선원으로 하는 감마선, 전자선을 직선형 가속 장치로 가속한 입자선이나, 사이클로트론 등에 의해 추출되는 알파선 등의 중입자선 등을 단독으로 이용하거나 혹은 방사선 증감제와의 병용으로 이용하는 공지된 시험이 포함된다.

방사선 감수성 시험에서는, 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 방사선에 폭로하거나 또는 폭로하지 않고서 배양하고, 이들의 증식율, 축소율, 생존율, ATP량을 측정하여 비교함으로써 이루어질 수 있다. 이러한 측정에는, 예컨대 방사선 조사에서부터 수시간 후 혹은 수일 후의 생존 세포수를 대조예와 함께 눈으로 확인하여 관찰하는 것, CCD 카메라 촬영 후에 화상 해석하는 것, 혹은 각각의 세포에 포함되는 단백질 결합성 색소(예컨대, 술포로다민 B)에 의한 염색에 의해 단백량으로서 비색 측정하는 것 등이 포함된다.

이와 같이 하여, 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴가 유래하는 환자에게 미치는 방사선의 영향을 방사선 조사 전에 조사하는 것이 가능하게 된다.

이러한 약제 감수성 시험 또는 방사선 감수성 시험에 이용하는 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴는 냉동에 의한 보존을 거친 것이라도 좋다.

이러한 냉동 보존이 가능하다면, 또한, 유래하는 환자의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 유전자 정보 또는 환자의 그 밖의 유전자 정보를 미리 수집하여, 그 정보에 기초한 약제 선택, 방사선 조사의 가부를 검토할 수도 있게 된다.

본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 얻어진 암 조직 유래의 종양이 감수성을 갖는 약제 종류의 특정 혹은 방사선에의 감수성 유무를 환자마다 개별적으로 확인할 수 있다.

여기서 유전자 정보란, 유전자 발현량을 검지한 결과라도 좋고, 메틸화 등의 수식 변화의 상황 등을 조사한 결과라도 좋다. 유전자 발현량의 측정은 그 유전자의 전사 산물인 mRNA의 발현 혹은 발현 레벨, 또는 마찬가지로 상기 유전자의 번역 산물인 단백질 또는 단백질 단편의 존재 혹은 존재량을 검출하거나 함으로써 이루어질 수 있다. 유전자의 전사 산물은 노던 블롯법, RT-PCR법, 인시츄(in situ) 하이브리다이제이션법, DNA 마이크로 어레이 등의 특정 유전자의 발현을 특이적으로 검출하는 공지된 방법에 따라서 검출하거나 혹은 측정할 수 있다. 혹은 약제나 방사선의 평가 방법에 있어서, 유전자를 평가하는 공정이 있더라도 좋으며, 그 공정은 상기 유전자 발현량을 검지하는 것이더라도 좋다. 유전자 발현량의 측정은 그 유전자의 전사 산물인 mRNA의 발현 혹은 발현 레벨 또는 마찬가지로 상기 유전자의 번역 산물인 단백질 또는 단백질의 단편의 존재 혹은 존재량을 검출하거나 함으로써 이루어질 수 있다. 이러한 유전자 정보는 예컨대 암의 조기 진단용의 바이오 마커로서 유용할 수 있다.

더욱이, 이러한 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴는 또한 특정 분자의 분석 혹은 세포내 시그널 전달의 상황 파악 등에 유용하다. 이 특정 분자의 분석이나 세포내 시그널 전달의 파악이란, 전형적으로는 암종 특유, 병태 특유 혹은 개개 환자 특유의 특정 분자의 발현 상황의 파악이나 세포내 시그널 전달의 파악이다. 즉, 암종에 따라, 병태에 따라, 혹은 개개 환자에 따라, 단수 또는 복수의 특정 분자의 유전자나 단백질의 발현을 정성적 또는 정량적으로 분석하는 것, 세포내 시그널 전달에 있어서의 유전자나 단백질의 발현이나, 예컨대 단백질의 인산화 등의 전사 후의 RNA 프로세싱이나 단백질 수식 상황을 분석하는 것, 약제 투여의 유무로 이들 특정 분자의 발현 상황이나 세포내 시그널 전달이 어떻게 변화되는지를 개개의 샘플마다 분석하는 것, 이들 분석 결과를 약제 투여의 효과 예측에 적용시키는 것 등의 응용을 가리킨다. 여기서, 특정 분자는 기지의 분자라도 좋고, 그 분자와 약제 투여나 방사선 조사 효과와의 관계가 이미 해명되어 있는 분자라도 좋다. 그러나, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 이용하여 지금까지 전혀 알려져 있지 않은 분자를 알아내고, 해석하여 같은 식으로 응용하는 것도 가능하다. 이러한 특정 분자는 예컨대 암의 조기 진단용 바이오 마커로서 유용할 수 있다.

이러한 특정 분자에는 또한 마이크로 RNA와 같은 저분자 물질도 포함된다. 마이크로 RNA는 세포 내에 존재하며, 단백에의 번역이 이루어지지 않는 길이 22 염기 정도의 1본쇄 RNA이고, 인간 게놈 상에 있어서 존재하여 유전자 제어를 하고 있다고 추측했다. 따라서, 개개의 암 조직 유래 세포괴에 특유의 마이크로 RNA 존재의 검출이나 지금까지 동정되어 있지 않은 새로운 마이크로 RNA의 발견은 암 유전자의 활성화나 억제 해명에 많은 기여를 할 것이 예상된다. 이러한 마이크로 RNA는 예컨대 암의 조기 진단용 바이오 마커로서 유용할 수 있다.

실시예

이하에 실시예에 의해서 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 한편, 각 예 중의 부 및 %는 모두 중량 기준이다. 이하에 특별히 규정이 없는 배양 조건은 전부 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터 조건 하이다. 원심 분리 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 4℃, 1000 rpm, 5분이다.

(실시예 1)

(인간 대장암 마우스 이식 종양으로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)

인간 대장암 마우스 이식 종양을 다음과 같이 이종 이식법으로 제작했다.

우선, 무균 조작 하에서 인간 종양(대장암)의 수술 적출 표본을 약 2 mm 입방으로 세절한다. 이어서 중증 면역 부전 마우스(누드 마우스, 바람직하게는 NOD/SCID 마우스)의 등 부위에 약 5 mm의 작은 절개를 가하여 피하 조직을 박리한다. 준비한 종양편을 피하에 삽입한 후, 피부 봉합 클립으로 절개부를 봉합한다. 일부의 이식 종양은 약 14일 뒤부터 3개월 후에 피하 종양으로서 관찰된다.

얻어진 대장암 마우스를 SPF(specific pathogen free) 사육 조건에서 사육하여, 종양이 1 cm 크기로 된 시점에서 종양을 적출하여, 20 ml의 DMEM(Gibco; 11965-092)+1% Pen Strep(Gibco; 15140-022)(모두 최종 농도로서 100 units/ml 페니실린, 100 ㎍/ml)을 넣은 50 ml 원심 분리용 튜브(IWAKI; 2345-050)에 회수했다.

이어서 20 ml HBSS(Gibco; 14025-092)를 넣어, 전도 혼화에 의해 종양을 세정했다. 이어서 새로운 HBSS를 20 ml 넣어, 이 조작을 2회 반복하고, 종양 조직을 10 cm 조직 배양용 디쉬(조직 배양 디쉬)(IWAKI; 3020-100)로 옮겼다. 이 배양 다쉬 상에서 수술용 나이프를 이용하여 괴사 조직을 제거했다.

괴사 조직을 제거한 종양편을 HBSS 30 ml를 넣은 새로운 10 cm 디쉬로 옮겼다. 이어서, 수술용 나이프를 이용하여 종양편을 약 2 mm 사각으로 세편화했다.

HBSS마다 종양 세편을 새로운 50 ml 원심 분리용 튜브로 옮긴 후, 원심 분리를 하여 상청을 버리고, 20 ml HBSS로 전도 혼화에 의해 세정했다.

원심 분리 및 세정을 반복했다. 그 후, 20 ml의 DMEM+1% Pen Strep+0.28 U/ml(최종 농도) Blendzyme 1 (Roche; 11988417001)를 넣어 혼화했다. 이것을 100 ml의 삼각 플라스크로 옮겨, 37℃ 항온조 내에서 스터러를 저속으로 회전하면서 2시간 리베라제 블렌자임 1(로쉐 다이아그노스틱스사 제조)로 처리했다.

이어서, 효소 처리물을 50 ml 원심 분리용 튜브에 회수하여 원심 분리하여 상청을 버리고 20 ml HBSS를 넣어 혼화했다. 스테인리스 메쉬(500 ㎛)에 통과시키고, 필터를 통과한 성분을 50 ml 원심 분리용 튜브에 회수하여, 더욱 원심 분리 조작을 했다. 상청을 버리고, 1 mg/ml DNaseI 용액(Roche; 1284932)(10 mg/ml 스톡 100 μl+PBS 900 μl)을 넣어 혼화하여, 4℃에서 5분 정치하고, 또한 20 ml HBSS를 가하여 혼화한 후, 원심 분리하여 상청을 버렸다. 20 ml HBSS와 혼화한 후, 500-250-100 ㎛로 단계적으로 체에 거르고, 이어서 40 ㎛ 셀 스트레이너(BD; 352340)에 통과시켰다. HBSS 30 ml를 넣은 10 cm 조직 배양용 디쉬(조직 배양 디쉬)에 셀 스트레이너를 침지하여 가볍게 흔들어, 단세포, 40 ㎛ 이하의 소세포괴 및 부스러기를 제거했다. HBSS 30 ml를 넣은 별도의 10 cm 조직 배양용 디쉬(조직 배양 디쉬)로 셀 스트레이터를 옮겨, 셀 스트레이너에 포착된 세포괴를 피펫팅에 의해 회수했다.

또한, 상기와 같은 원심 분리 조작을 수회 행하여 얻어진 성분에 4 ml StemPro hESC SFM(Gibco; A10007-01)+8 ng/ml bFGF(Invitrogen; 13256-029)+0.1 mM 2-머캅토에탄올(Wako; 137-06862)+1% PenStrep+25 ㎍/ml 앰포테리신(Amphotericin) B(Wako; 541-01961)를 넣어 혼화하여, 6 cm 비처리된(non-treated) 디쉬(EIKEN CHEMICAL; AG2000)로 옮겼다.

이것을 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터(산요사 제조 MCO-17AIC)로 36시간 배양했다.

이 결과, 도 1에 도시하는 것과 같이, 시간 경과와 함께, 부정형에서 가지런해진 구형으로 변화되고, 적어도 3～6시간 후에는 대략 구형이며, 24시간 후에는 완전히 가지런해진 구형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.

(실시예 2)

(인간 대장암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)

대장암 수술 검체를 이용한 것 이외에는 실시예 1과 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 도 7에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 구형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.

(실시예 3)

(인간 난소암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)

난소암 수술 검체를 이용한 것 이외에는 실시예 2와 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 도 7에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 구형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.

(실시예 4)

(인간 췌장암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)

췌장암 수술 검체를 이용한 것 이외에는 실시예 2와 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 도 7에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 구형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.

(실시예 5)

(인간 소세포암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)

폐암의 일종인 소세포암 수술 검체를 이용한 것 이외에는 실시예 2와 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 도 7에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 구형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.

(실시예 6)

(인간 신장암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)

신장암 수술 검체를 이용한 것 이외에는 실시예 2와 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 도 7에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 구형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.

(실시예 7)

(인간 방광암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)

방광암 수술 검체를 이용한 것 이외에는 실시예 2와 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 도 7에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 구형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.

(실시예 8)

(인간 유방암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)

유방암 수술 검체를 이용한 것 이외에는 실시예 2와 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 도 7에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 구형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.

(실시예 9)

(인간 전립선암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)

전립선암 수술 검체를 이용한 것 이외에는 실시예 2와 같은 식으로 하여 조직 유래 세포괴를 취득했다. 배양 배지에 10^-8 몰/L 농도의 디히드로테스토스테론(DHT)을 첨가하여 실시예 1과 같은 식으로 배양했다. 이 결과, 도 7에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 구형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.

(실시예 10)

(인간 인두암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)

인두암 수술 검체를 이용한 것 이외에는 실시예 2와 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 도 7에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 구형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.

(실시예 11)

(유방암 유래 암 조직 유래 세포괴의 호르몬 감수성 시험)

실시예 8과 같은 배지 조건에서 에스트라디올의 유무로 복수의 환자로부터 얻어진 유방암 조직 유래 세포괴의 상태가 어떻게 다른지를 조사했다. 그 결과, 도 8에 도시하는 것과 같이, 에스트라디올의 첨가로 증식이 촉진되는 증례(症例)와, 에스트라디올에 반응하지 않는 증례가 있음을 알 수 있었다. 유래하는 환자의 호르몬 요법을 행할 때의 감수성 시험으로서 응용할 수 있음을 알 수 있었다.

(실시예 12)

(마우스 췌도 종양으로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)

RipTag는 래트 인슐린 프로모터의 지배 하에 SV40-T 항원을 강제 발현시킨 트랜스제닉 마우스로, 췌도에 종양이 발생한다. RipTag 마우스의 췌도 종양을 이용한 것 이외에는 실시예 2와 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 구형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다(도 9).

(실시예 13)

실시예 2에서 얻어지고, 도 7에 도시하는 배양 중의 암 조직 유래 세포괴를 배양 후 24시간에 배지와 함께 5 ml 추출하고, 1000 rpm, 4℃에서 원심 분리하여 상청을 버렸다. 회수한 암 조직 유래 세포괴를 셀뱅커(BLC-1, 미쓰비시가가쿠메디슨사 제조)에 현탁하고, 또한, 10 μM의 Y27632(와코쥰야쿠고교사 제조)를 가하여, 냉동 보존 튜브(Cryogenic vials 2.0 ml, Nalge Nunc사 제조)로 옮겨, -80℃ 딥프리저에서 보존했다.

보존 후 7일 경과 후, 37℃의 워터 버스로 단시간 복온(復溫)했다. 이것을 PBS에 현탁하고, 또한 1000 rpm, 4℃에서 원심 분리하여 상청을 버렸다. 얻어진 침전물을 StemPro(인비트로사 제조)에 현탁하여 배양했다. 도 10에 도시하는 것과 같이, 융해 후 24시간의 세포 상태는 양호했다.

또한, 얻어진 암 조직 유래 세포괴의 생존을 약 1000개의 세포를 포함하는 덩어리로서 NOD-SCID 마우스에게 이식함으로써 확인했다.

(실시예 14)

(암 조직 유래 세포괴로부터의 암 세포 응집괴의 조제)

실시예 2와 같은 방법으로 얻어진 암 조직 유래 세포괴를 이용하여 이하의 처리를 했다. 우선, 24 웰 플레이트(미처리의 디쉬) 중앙에 콜라겐 겔(Cell Matrix type I-A : 5x DMEM : 겔 재구성용 완충액=7:2:1) 50 μL/well을 깔았다. 37℃, 30분 정치하여 콜라겐 겔을 고화시켰다. 부유 배양의 암 조직 유래 세포괴를 (웰당 100개), 1.5 mL 튜브로 회수한다. 이것을 5초 정도 원심 분리하여 상청을 제거했다. 암 조직 유래 세포괴를 콜라게나아제 겔(웰당 30 μL)로 현탁하여, 미리 고화시킨 겔 위에 30 μL씩 얹었다. 37℃, 30분 정치하여 고화시키고, StemPro(EGF 50 ng/mL) 600 μL/웰씩 넣었다. 2～3일에 한 번 배지를 교환하면서 10일간 배양했다.

이어서, 배지를 1 mL/웰의 DMEM(Gibco; 11965-092, 콜라게나아제 IV 200 mg/mL 포함함)로 교환하여, 37℃, 5시간 정도 배양했다.

배양 후, 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮겨 원심 분리(약 5초)하여 상청을 제거하고, 1 mL의 PBS를 가하여 현탁하고, 원심 분리(치비탄, 약 5초) 후 상청 제거를 2회 반복했다. 트립신/EDTA(0.05%)를 1 mL 가하여 현탁하고, 37℃에서 8분 정치했다. 수회 현탁하여 암 조직 유래 세포괴와 비슷한 큰 덩어리가 없어졌음을 확인했다. 이것을 15 mL 튜브로 옮겨, 2 mL의 DMEM(Gibco; 11965-092)을 가하여 현탁했다.

이어서, 현탁액을 원심 분리(1000 rpm, 5분)하여 상청을 제거했다. 2 mL의 StemPro(EGF 50 ng/mL, Y-27632 10 μM)로 현탁하여, φ35 mm 비처리 디쉬(Iwaki : 1000-035)로 옮겼다. 이것을 37℃에서 하룻밤 배양했다.

12시간 경과 후, 직경 40 ㎛ 정도의 암 조직 유래 세포괴의 형성을 확인했다. 배지를 StemPro(EGF 50 ng/mL)로 교환했다.

이 결과, 도 11에 도시하는 것과 같이, 4일 후에는 완전히 가지런해진 구형상의 암 세포 응집괴를 얻을 수 있었다.

(실시예 15)

(인간 대장암 수술 검체로부터의 암 세포 응집괴의 조제)

대장암 수술 검체를 이용한 것 이외에는 실시예 14와 같은 식으로 하여 암 세포 응집괴를 취득했다. 이 결과, 도 12에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 구형상의 암 세포 응집괴를 얻을 수 있었다.

(실시예 16)

실시예 2와 같은 방법으로 얻어진 암 조직 유래 세포괴의 세포 보존을 행했다. 암 조직 유래 세포괴를 실시예 14와 같은 방법으로 트립신 처리하여 단세포화 처리를 했다. 동결 보존액은 셀뱅커 1(쥬지필드사)에 Y-27632를 첨가한 것을 이용했다.

단세포화하여 10일간 동결 보존한 것을 그 후 37℃의 워터 버스로 단시간 복온했다. 이것을 PBS에 현탁하고, 또한 1000 rpm, 4℃에서 원심 분리하여 상청을 버렸다. 얻어진 침전물을 StemPro(인비트로사 제조)에 현탁하여 배양했다. 도 13에 도시하는 것과 같이, 융해 후 24시간의 세포 상태는 양호하며, 융해 후에 암 조직 유래 세포괴를 재형성했다.

(비교예 1)

인간 대장암 수술 검체를 이용하여, 문헌에 기재한 방법(Todaro M 등(2007) Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell 1:389-402)에 따라서 단세포로까지 처리한 시료를 조제했다. 그러나, 단세포 처리하여 선별한 CD133 양성 세포는 인비트로에서의 증식이 보이지 않았다.

실시예 등에 있어서의 평가 항목은 하기와 같은 식으로 하여 측정했다.

<표면 항원의 동정>

실시예 1에서 얻어진 암 조직 유래 세포괴를 트립신·EDTA를 이용하여 단세포로 분산시켰다. 이들 세포를 형광으로 표지한 표면 항원 특이적 항체와 반응시킨 후, 플로우 사이토메트리법에 의해 해석했다. 이 결과, 도 2에 도시하는 것과 같이, 표면 항원을 균일하게 동시에 발현하는 세포의 존재가 인정되었다.

<기저막양 물질의 확인>

실시예 1에서 얻어진 암 조직 유래 세포괴를 온도 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터의 배양 조건 하에서, STEMPRO 인간 ES 세포용 무혈청 배지(Gibco) 1 ㏄로 3일간 배양을 했다. 이것을 포르말린 고정 후 파라핀 포매하고, 얇게 잘라 항라미닌 항체 염색(시그마-알드리치사 제조, 마우스 라미닌 유래 래빗 항체)을 제조원의 지시서에 따라서 행한 바, 암 조직 유래 세포괴의 외주 및 외주에 가까운 세포의 세포질 내에 라미닌의 항원성이 관찰되었다. 이에 따라, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 암 세포 집합체의 주변을 라미닌이 둘러싸고 있음이 판명되었다. 한편, 수술 검체 처리 후 24시간에는 라미닌의 발현은 확인할 수 없었다.

<저산소의 검지>

피모니다졸을 이용한 저산소 검지의 예

니트로이미다졸계 화합물 피모니다졸은 산소 비존재 하에서는 단백이나 핵산과 부가물(Adduct)을 형성하는 특성을 갖는다. 저산소 하에서 피모니다졸 처리된 조직의 저산소 영역은 피모니다졸을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 인식할 수 있다. 암 조직에서는 혈관으로부터 약 100 마이크로미터 멀어지면 저산소 영역이 출현하는데, 실시예 1에서 얻어진 암 조직 유래 세포괴에서도 외연으로부터 약 100 마이크로미터를 경계로 하여 내부는 저산소 영역으로, 광범위한 세포사가 관찰되었다.

<인비트로에서의 증식능의 평가>

인비트로에 있어서의 암 조직 유래 세포괴의 증식능은 다음과 같이 하여 검증했다. 실시예 1에서 얻어진 암 조직 유래 세포괴를 콜라겐 겔(CellMatrix type IA(Nitta Gelatin) : 5x DMEM(Gibco; 12100-038) : 겔 재구성용 완충액(50 mM NaOH, 260 mM NaHCO3, 200 mM HEPES)=7:2:1)에 ×10개씩 포매하여, 온도 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터의 배양 조건 하에서, STEMPRO 인간 ES 세포용 무혈청 배지(Gibco) 1 ㏄로 배양을 했다. 정기적으로 세포의 상태를 관찰하여, CCD 카메라를 장착한 위상차현미경(배율 40배)으로 크기를 측정했다. 그 결과, 도 3에 도시하는 것과 같이, 기계적 분할 없이 적어도 13일간 증식능을 유지할 수 있었다. 또한, 13일째에 기계적 분할을 행한 바, 적어도 13일간 증식능을 더 유지하고 있음이 확인되었다. 한편, 기계적 분할은 직경 500 마이크로미터의 암 조직 유래 세포괴를 안과 첨도로 4 분할함으로써 행했다.

<세포수의 확인>

실시예 1과 같은 방법으로, 100에서부터 250 ㎛의 암 조직 유래 세포괴를 트립신 0. 25%, EDTA 2.6 mM로 3분간 처리하여, 약 30회 피펫팅으로 기계적으로 분해했다. 이것을 96 웰 배양 플레이트 1 웰에 1개의 비율로 세포가 들어가도록 희석하여 분주했다. 단세포화되어 있지 않은 세포괴에 대해서는 구성하는 세포수를 카운트하여 기록했다. 그 후 배양(위와 같은 조건)하여 각 웰의 세포수 증가를 기록하고, 30일간 배양 관찰했다. 그 결과, 3개의 세포가 있으면, 세포괴로까지 성장할 수 있는 것도 있음이 확인되었다.

<약제 감수성 시험>

DNA 합성에 필요한 대사 과정인 티미딜산 합성 효소와 결합하여 DNA 합성을 저해하는 것이 알려져 있는 5-FU를 이용하여, 실시예 2의 시료에 의한 약제 감수성시험을 했다. 시험은 암 조직 유래 세포괴를 콜라겐 겔(CellMatrix type IA(Nitta Gelatin) : 5x DMEM(Gibco; 12100-038) : 겔 재구성용 완충액(50 mM NaOH, 260 mM NaHCO3, 200 mM HEPES)=7:2:1)에 ×10개씩 포매하여, 온도 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터의 배양 조건 하에서, STEMPRO 인간 ES 세포용 무혈청 배지(Gibco) 1 ㏄로 배양을 했다. 또한 5-FU를 0.01 ㎍/ml, 0.1 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 100 ㎍/ml의 농도로 적용하여 각각 배양 0일째와 8일째의 상태를 비교 평가했다. 그 결과를 도 4에 도시한다. 암 조직 유래 세포괴의 면적에 관한 증대율에 대해서, 약제 비적용 배양에서의 면적에 관한 증대율을 1로 하여 상대적으로 표기했다. 도 4에 있어서, 5-FU의 농도 의존적으로, 배양 8일째에 있어서의 암 세포 증식이 억제되고 있어, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴가 약제 감수성 시험에서 유용하다는 것이 실제로 증명되었다.

<이종 동물에의 이식 시험>

실시예 2에서 얻어진 본 발명의 3일간 배양한 직경 약 100 마이크로미터의 암 조직 유래 세포괴 ×10개를 Matrigel(BD사)에 현탁하여, NOD-SCID 마우스의 등 부위 피하에 투여 이식했다. 종양 형성의 평가는 경시적으로 종양의 사이즈를 계측함으로써 행했다. 그 결과, 본 발명의 실시예 2의 암 조직 유래 세포괴를 이식한 마우스 개체에는 현저한 종양 형성이 인정되고, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴가 높은 종양 형성능을 지님이 확인되었다. 이 조직을 해석하면, 마우스에게 이식하여 형성된 종양과 생체 내에 존재하고 있었던 종양에서 유사한 조직형이 얻어지고 있음을 알 수 있다(도 5).

<방사선 조사 시험>

실시예 2에서 얻어진 본 발명에서 사용한 직경 약 100 마이크로미터의 암 조직 유래 세포괴를 콜라겐 겔(CellMatrix type IA(Nitta Gelatin) : 5x DMEM(Gibco; 12100-038) : 겔 재구성용 완충액(50 mM NaOH, 260 mM NaHCO3, 200 mM HEPES)=7:2:1)에 포매하고, 온도 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터의 배양 조건 하에서, STEMPRO 인간 ES 세포용 무혈청 배지(Gibco) 1 cc로 ×10개씩 접종하여 배양을 했다. 이것에 코발트의 방사성 동위체를 선원으로 하는 감마선을 조사하여, 덩어리의 상황을 확인했다. 그 결과를 도 6에 도시한다. 도 6에 있어서, 조사선량 의존적으로, 배양 8일째까지에 있어서의 암 세포 증식이 억제되고 있어, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴가 방사선 조사 시험에서 유용하다는 것이 실제로 증명되었다.

<약제 감수성 시험>

종양 세포의 DNA의 염기쌍 사이에 삽입하여, DNA 폴리메라아제, RNA 폴리메라아제, 토포이소메라아제 II 반응을 저해하여, DNA, RNA 쌍방의 생합성을 억제함으로써 항종양 효과를 발휘하는 것이 알려져 있는 독소루비신을 이용하여, 실시예 12의 시료에 의한 약제 감수성 시험을 했다. 시험은 암 세포 응집괴를 콜라겐 겔(CellMatrix type IA(Nitta Gelatin) : 5x DMEM(Gibco; 12100-038) : 겔 재구성용 완충액(50 mM NaOH, 260 mM NaHCO3, 200 mM HEPES)=7:2:1)에 ×10개씩 포매하여, 온도 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터의 배양 조건 하에서, STEMPRO 인간 ES 세포용 무혈청 배지(Gibco) 1 ㏄로 배양을 했다. 또한 독소루비신을 0.1 μM, 1 μM, 10 μM의 농도로 적용하여, 각각 배양 0일째와 8일째의 상태를 비교 평가했다. 그 결과를 도 14에 도시한다. 암 세포 응집괴의 면적에 관한 증대율에 대해서, 약제 비적용 배양에서의 면적에 관한 증대율을 1로 하여 상대적으로 표기했다. 도 14에 있어서, 독소루비신의 농도 의존적으로, 배양 8일째에 있어서의 암 세포 증식이 억제되고 있어, 본 발명의 암 세포 응집괴가 약제 감수성 시험에서 유용하다는 것이 실제로 증명되었다.

<약제 감수성 시험>

실시예 7에서 얻어진 본 발명에서 사용한 직경 약 100 마이크로미터의 암 조직 유래 세포괴를 DNA 가교에 의해 세포사를 유도하는 백금계 항암제 시스플라틴을 이용하여 약제 감수성 시험을 했다. 시험은, 암 조직 유래 세포괴를 매트리겔(Matrigel(BD) : 5x DMEM(Gibco; 12100-038) : 겔 재구성용 완충액(50 mM NaOH, 260 mM NaHCO3, 200 mM HEPES)=7:2:1)에 ×5개씩 포매하여, 온도 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터의 배양 조건 하에서, STEMPRO 인간 ES 세포용 무혈청 배지(Gibco) 1 ㏄로 48시간 배양을 했다. 그 후, 위상차현미경, 프로피듐 요오드화물(PI), 칼세인(Calcein), 훽스트(Hoechst)33342로 염색하여, CTOS의 형상, 세포사, 세포의 대사 활동, 핵을 조사했다. 그 결과를 도 15에 도시한다. 도 15에 있어서, 배양 48시간 후에 있어서의 농도 의존적인 시스플라틴에 의한 암 세포사가 확인되었다. 본 발명의 암 조직 유래 세포괴가 약제 감수성 시험에서 약제 특이적으로 반응하여, PI 염색을 이용한 단시간의 세포사 검출에 매우 유용하다는 것이 실제로 증명되었다.

<약제 감수성 시험>

실시예 2와 같은 식으로 하여 복수의 환자로부터 얻어진 직경 약 100 마이크로미터의 암 조직 유래 세포괴를 EGF 및 세툭시맵에의 세포 응답 평가에 이용했다. 세툭시맵은 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 결합하여, EGFR의 기능을 저해하는 모노클로널 항체이다. 항암제로서 임상적으로 사용되고 있다. 암 조직 유래 세포괴를 1%의 BSA를 첨가한 DMEM/F12로 밤새 배양하고, 이어서, 10 ng/ml의 EGF(Sigma-Aldlich사 제조) 또는 10 ㎍/ml 세툭시맵(아비탁스, 브리스톨-마이어스 주식회사 제조) 또는 그 양쪽을 배지에 첨가하여 15분간 배양했다. 이어서, 이와 같이 배양한 암 조직 유래 세포괴를 각각 RIPA 버퍼로 용해하고, 용해 처리물을 웨스턴 블롯법 분석에 제공하여, Akt 및 ERK1/2의 인산화 상황을 조사했다. 그 결과, EGF 자극에 의한 세포내 시그널의 활성화는 각 종양 사이에서 다르다는 것이 명확하게 되었다(도 16). 세툭시맵에 의해 인산화가 억제된 샘플의 환자에 대해서는 세툭시맵의 효과가 예상된다.

<약제 감수성 시험>

실시예 2와 같은 식으로 하여, 복수의 환자로부터 얻어진 직경 약 100 마이크로미터의 암 조직 유래 세포괴를 IGF 및 αIR3에의 세포 응답 평가에 이용했다. αIR3은 인슐린양 성장 인자 수용체(IGF-IR)에 결합하여, IGF-IR의 작용을 저해하는 모노클로널 항체이다. 암 조직 유래 세포괴를 1%의 BSA를 첨가한 DMEM/F12로 하룻밤 배양하고, 이어서, 1 ㎍/ml의 αIR3(머크사 제조)의 존재 또는 비존재 하에서 1시간 처리하고, 100 ng/ml의 IGF-I(R&D사 제조)의 존재 또는 비존재 하에서 15분간 배양했다. 이어서, 이와 같이 배양한 암 조직 유래 세포괴를 각각 RIPA 버퍼로 용해하고, 용해 처리물을 웨스턴 블롯법 분석에 제공하여, Akt 및 ERK1/2의 인산화 상황을 조사했다. 그 결과, AKT의 활성화 패턴으로서 3개의 카테고리로 나눌 수 있음을 알 수 있었다. 감수성 패턴(IGF 자극에 반응하여 인산화되고, αIR3에 의해서 탈인산의 결과를 얻을 수 있음), 저항성 패턴(IGF 자극에 반응하여 인산화되지만, αIR3에 의해서 탈인산의 결과를 얻을 수 없음) 및 독립 패턴(IGF 자극에도 αIR3에도 반응하지 않음)의 3가지이다(도 17). 이 3가지의 패턴과 대응하는 암 조직 유래 세포괴의 성장이 관련되어 있음을 알 수 있었다.

<약제 감수성 시험>

실시예 5와 같은 식으로 하여, 복수의 폐암 환자로부터 얻어진 직경 약 100 마이크로미터의 암 조직 유래 세포괴를 약제에의 세포 응답 평가에 이용했다. 각각의 시료의 엘로티닙에의 세포 응답에 관해서 조사했다. 엘로티닙은 상피 성장 인자 수용체(EGFR)의 작용을 저해하는 EGFR 저해제이다. 항암제로서 임상적으로 사용되고 있다. 각각의 암 조직 유래 세포괴를 1%의 BSA를 첨가한 DMEM/F12로 밤새 배양하고, 이어서 10 ng/ml의 EGF(Sigma-Aldlich사 제조) 또는 10 ㎍/ml 엘로티닙(주가이세이야쿠사 제조) 또는 그 양쪽을 배지에 첨가하여 24시간 배양한 후, 배지로 2회 세정하고, 또한 10 ng/ml의 EGF(Sigma-Aldlich사 제조) 또는 10 ㎍/ml 엘로티닙(주가이세이야쿠사 제조)을 넣어 7일간 배양했다. 이어서, 이와 같이 배양한 암 조직 유래 세포괴를 각각 RIPA 버퍼로 용해하고, 용해 처리물을 웨스턴 블롯법 분석에 제공하여, EGFR의 발현이나 인산화 상황, Akt이나 그 인산화 상황 및 ERK1/2의 인산화 상황을 조사했다. 그 결과, EGF 자극에 의한 세포내 시그널의 활성화는 각 종양 사이에서 다르다는 것이 명확하게 되었다(도 18). 엘로티닙 감수성 환자의 경우에는, EGF의 자극 없이 EGFR의 인산화와 그것에 동반하는 경로의 하류의 활성화가 일어나고 있는 경우가 많다. 또한, 엘로티닙에 의한 AKT의 인산화가 저해되고 있다(도 18 상단 A). 한편, 엘로티닙에 내성인 환자에게 있어서는, EGF 자극 없이는 과잉 경로의 활성화가 일어나고 있지 않거나, 엘로티닙의 존재에 의해서도 AKT의 인산화 저해가 발생하기 어려운 상태임이 시사되었다(도 18 하단 B).

<약제 감수성 시험>

실시예 7과 같은 방법으로 얻어진 방광 편평상피암(BC44)과 방광 이행상피암(BC45)에 관해서, 시스플라틴(CDDP)과 아드리아마이신(DXR)의 인비트로 CTOS 감수성 시험을 했다. 시험은, 암 조직 유래 세포괴를 매트리겔(Matrigel(GFR) : 5x DMEM(Gibco; 12100-038) : 겔 재구성용 완충액(50 mM NaOH, 260 mM NaHCO3, 200 mM HEPES)=7:2:1)에 ×5개씩 포매하여, 온도 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터의 배양 조건 하에서 STEMPRO 인간 ES 세포용 무혈청 배지(Gibco) 1 ㏄로 시스플라틴 또는 아드리아마이신의 존재 하에서 24시간 배양했다. 그 후, 시스플라틴 또는 아드리아마이신의 존재 하에서 2번 배지로 세정하여 7일간 배양했다. 7일째에 암 조직 유래 세포괴의 생존 상황을, 받아들인 화상의 면적으로 검출했다. 세포의 ATP량은 Celltiter-Glo(등록상표) 루미네센트 세포 생존율 분석(Promega, G7570)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 측정했다. CellTiter-Glo 시약의 첨가 전에, 매트리겔 GFR을 0.2 mg/mL 콜라게나아제 타입 4 용액(Worthington, CLS4)에 의해서 소화하여, 암 조직 유래 세포괴를 방출시켰다. 도 19에 이 결과를 도시한다. 도 19에 있어서, 횡축은 약제 농도를 나타내고, 종축은 암 조직 유래 세포괴의 면적에 관한 증대율에 대해서, 약제 비적용 배양에서의 면적에 관한 증대율을 1로 하여 상대적으로 표기한 면적이다. BC45(이행상피암)가 양쪽 약제에 감수성인데 대하여, BC44(편평상피암)는 저항성이다. 이 경향은 임상에 있어서의 양 조직형의 약제 감수성을 반영하고 있다.

<방사선 조사 시험>

실시예 2와 같은 식으로 하여 얻어진 본 발명의 폐암의 암 조직 유래 세포괴(8가지 예) 및 자궁경부암(2가지 예)을 사용한 직경 약 100 마이크로미터의 암 조직 유래 세포괴를 콜라겐 겔(CellMatrix type IA(Nitta Gelatin) : 5x DMEM(Gibco; 12100-038) : 겔 재구성용 완충액(50 mM NaOH, 260 mM NaHCO3, 200 mM HEPES)=7:2:1)에 포매하고, 온도 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터의 배양 조건 하에서 STEMPRO 인간 ES 세포용 무혈청 배지(Gibco) 1 ㏄로 ×10개씩 접종하여 배양을 했다. 이것에 코발트의 방사성 동위체를 선원으로 하는 감마선을 조사하여, 덩어리의 상황을, 방사선 비조사에서의 면적에 관한 증대율을 1로 하여 상대적으로 표기한 면적과 상대적 ATP량으로 검출했다. 세포의 ATP량은 Celltiter-Glo(등록상표) 루미네센트 세포 생존율 분석(Promega, G7570)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 측정했다. CellTiter-Glo 시약의 첨가 전에, 매트리겔 GFR을 0.2 mg/mL 콜라게나아제 타입 4 용액(Worthington, CLS4)에 의해서 소화하여, 암 조직 유래 세포괴를 방출시켰다. 도 20에 이 결과를 도시한다. 도 20의 횡축은 방사선량. 종축은 상대적인 CTOS 면적(A, C) 혹은 조사 전의 면적으로 보정한 상대적인 ATP량(B). 증례에 따라 감수성에 차가 있음을 알 수 있다. C는 A 중의 LC10(감수성)과 mLC5(내성)을 뽑아낸 것. 아래의 패널은 5 Gy 조사시의 gH2AX 단백량을 웨스턴 블로팅으로 타임코스를 관찰한 것을 나타낸다. 내성의 mLC5는 감수성의 LC10과 비교하여 조기에 gH2AX가 소실되고 있다. 내성 예에서는 방사선에 의한 DNA의 손상이 신속하게 수복되는 것을 반영하고 있다고 생각된다. gH2AX의 타임코스에 의한 효과 예측은 단기간에 결과가 나오기 때문에, 임상 응용에 있어서 유용하다.

산업상 이용가능성

본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴는, 인비트로에 있어서, 폭넓은 용도로 사용할 수 있다. 그리고, 배양에 의해서 증식시킬 수 있어, 미량 검체로부터의 암 세포 증식을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 약제 감수성 시험 혹은 방사선 감수성 시험에 널리 이용할 수 있으며, 더구나 간이한 종양 형성 동물의 작성에 이용하는 것이 가능하다. 이 때문에, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 현재 일반적으로는 시행착오적 혹은 칵테일요법적으로 이용되는 제암제나 방사선 치료에 대해서 비약적인 개선을 가져올 수 있다. 즉, 그와 같은 요법을 행하기 전에, 환자 각각으로부터 얻어지는 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴로, 미리 약제나 방사선 치료의 효과를 예측할 수 있어, 효과가 있는 약제만을 환자에게 투여하는 것이 가능하게 된다. 또한, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴는 주사 바늘로 채취하거나 배양할 수 있는 크기이기도 하기 때문에, 수술하기 전의 환자로부터 얻는 것도 가능하여, 환자에게 주는 부담이 적은 상태로 제암제나 방사선 치료의 효과를 예측할 수도 있다. 본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴는 또한 아직 알려지지 않은 약제의 항암제로서의 선택을 위한 스크리닝에 사용할 수도 있다.

Claims

개체로부터 얻어진 암 조직으로부터 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리로서 분리 처리된 분리물의 배양물로서, 대략 구형 혹은 타원구형을 띠고, 인비트로에 있어서 증식능을 유지할 수 있으며, 암 세포 이외의 세포를 실질적으로 포함하지 않는 암 조직 유래 세포괴 또는 상기 암 조직 유래 세포괴로부터 얻어지는 암 세포 응집괴를 복수 포함하고, 암 세포 이외의 세포를 실질적으로 포함하지 않는 조성물에, 인비트로에서 약제를 작용시켜, 그 약제의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴에 대한 작용을 평가하는 공정을 포함하는 약제 영향의 평가 방법.
제1항에 있어서, 상기 작용을 평가하는 것이, 다른 농도의 약제 존재 하에서 또는 비존재 하에서의 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 증식 상태를 비교하는 것을 포함하는 평가 방법.
제1항에 있어서, 상기 작용을 평가하는 것이, 다른 농도의 약제 존재 하에서 또는 비존재 하에서의 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴 중의 세포의 생사를 판정하는 것을 포함하는 평가 방법.
제1항에 있어서, 상기 작용을 평가하는 것이, 약제의 존재 하에서 또는 비존재 하에서의 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴 중의 세포에 있어서의 세포내 시그널 전달을 분석하는 것을 포함하는 평가 방법.
제4항에 있어서, 상기 약제가 EGF 또는 IGF이며, 상기 세포내 시그널 전달의 분석이 Akt 및/또는 ERK1/2의 인산화 분석인 평가 방법.
제4항에 있어서, 상기 약제가 EGFR에 대한 항체, EGFR 저해제, HER2에 대한 항체, HER2 저해제, αIR3 및 IGF-IR 저해제로 이루어지는 군에서 선택되며, 상기 세포내 시그널 전달의 분석이 Akt 및/또는 ERK1/2의 인산화 분석인 평가 방법.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 평가 방법이, 유래하는 환자에의 약제의 영향을 미리 평가하는 것인 평가 방법.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 유전자를 미리 평가하여 유전자 정보를 얻어 놓고서, 이 유전자 정보에 기초하여 작용시키는 약제를 선택하는 평가 방법.
제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴가 냉동에 의한 보존 상태를 거친 것인 평가 방법.
개체로부터 얻어진 암 조직으로부터 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리로서 분리 처리된 분리물의 배양물로서, 대략 구형 혹은 타원구형을 띠고, 인비트로에 있어서 증식능을 유지할 수 있으며, 암 세포 이외의 세포를 실질적으로 포함하지 않는 암 조직 유래 세포괴 또는 상기 암 조직 유래 세포괴로부터 얻어지는 암 세포 응집괴를 복수 포함하고, 암 세포 이외의 세포를 실질적으로 포함하지 않는 조성물에, 인비트로에서 방사선을 작용시켜, 이 방사선의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴에 대한 작용을 평가하는 공정을 포함하는 방사선 영향의 평가 방법.
제10항에 있어서, 상기 작용을 평가하는 것이, 다른 강도에서의 방사선 하에서의 증식 상태 혹은 방사선 비존재 하에서의 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 증식 상태를 비교하는 것을 포함하는 평가 방법.
제10항에 있어서, 상기 작용을 평가하는 것이, 다른 강도에서의 방사선 하에서 혹은 방사선 비존재 하에서의 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴 중의 세포의 생사를 판정하는 것을 포함하는 평가 방법.
제10항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 평가 방법이, 유래하는 환자에의 방사선의 영향을 미리 평가하는 것인 평가 방법.
제10항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 유전자를 미리 평가하여 유전자 정보를 얻어 놓고서, 이 유전자 정보에 기초하여 방사선 조사를 선택하는 평가 방법.
제10항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴가 냉동에 의한 보존 상태를 거친 것인 평가 방법.
개체로부터 얻어진 암 조직으로부터 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리로서 분리 처리된 분리물의 배양물로서, 대략 구형 혹은 타원구형을 띠고, 인비트로에 있어서 증식능을 유지할 수 있으며, 암 세포 이외의 세포를 실질적으로 포함하지 않는 암 조직 유래 세포괴 또는 상기 암 조직 유래 세포괴로부터 얻어지는 암 세포 응집괴를 복수 포함하고, 암 세포 이외의 세포를 실질적으로 포함하지 않는 조성물에, 인비트로에서 약제 후보 화합물을 작용시켜, 이 약제 후보 화합물의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴에 대한 작용을 평가하는 공정을 포함하는 약제의 스크리닝 방법.
제16항에 있어서, 상기 작용을 평가하는 것이, 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 약제 후보 화합물 존재 하에서의 증식 상태를 약제 후보 화합물의 비존재 하에서의 증식 상태와 비교하는 것을 포함하는 스크리닝 방법.
제16항에 있어서, 상기 작용을 평가하는 것이, 약제 후보 화합물의 존재와 비존재 하에서의 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴 중의 세포의 생사를 판정하는 것을 포함하는 스크리닝 방법.
제16항에 있어서, 상기 작용을 평가하는 것이, 약제 후보 화합물의 존재와 비존재 하에서의 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴 중의 세포의 세포내 시그널 전달을 분석하는 것을 포함하는 스크리닝 방법.
제19항에 있어서, 상기 약제가 EGF 또는 IGF이며, 상기 세포내 시그널 전달의 분석이 Akt 및/또는 ERK1/2의 인산화 분석인 스크리닝 방법.
제19항에 있어서, 상기 약제가 EGFR에 대한 항체, EGFR 저해제, HER2에 대한 항체, HER2 저해제, αIR3 및 IGF-IR 저해제로 이루어지는 군에서 선택되며, 상기 세포내 시그널 전달의 분석이 Akt 및/또는 ERK1/2의 인산화 분석인 스크리닝 방법.
제16항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 유전자를 미리 평가하여 유전자 정보를 얻어 놓고서, 이 유전자 정보에 기초하여 작용시키는 약제 후보 화합물을 선택하는 스크리닝 방법.
제16항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴가 냉동에 의한 보존 상태를 거친 것인 스크리닝 방법.