KR20140133399A - 환자유래 일차배양 암세포의 배양방법 및 일차배양 암세포를 이용하여 제작된 암 환자와 동일한 이종 이식 동물모델의 구축 방법 - Google Patents

환자유래 일차배양 암세포의 배양방법 및 일차배양 암세포를 이용하여 제작된 암 환자와 동일한 이종 이식 동물모델의 구축 방법 Download PDF

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Abstract

종양세포의 일차 배양 방법 및 이를 이용하여 제작된 암 환자와 동일한 이종 이식 동물모델의 구축에 관한 것이다. 본 발명의 암 조직을 바로 이식하지 않고 종양세포를 배양 후 이식하는 방법은, 적은 양의 세포에서 많은 양의 세포로 증식 및 유지가 가능하며, 언제든지 종양세포를 배양할 수 있는 이점이 있다. 또한, 본 발명의 이종 이식 동물모델은 항암제를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있고, 짧은 시간에 환자 맞춤형 항암제를 선별할 수 있어, 새로운 치료법을 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

환자유래 일차배양 암세포의 배양방법 및 일차배양 암세포를 이용하여 제작된 암 환자와 동일한 이종 이식 동물모델의 구축 방법{Methods for cultivation of patient derived primary cultured turmor cell (PCC) and patient-derived tumor xenograft (PDX) animal model produced by using PCC}
본 발명은 한국인의 주요 암종 중 4종의 환자 종양조직에서 암세포 일차배양을 위한 배양법의 조건 확립과 확립된 배양법을 이용하여 배양된 일차배양암세포를 면역결픽마우스에 이식하여, 본래 환자 고유의 암의 형태 및 유전학적 정보를 가진 동물모델의 제조방법에 관한 것이다.
암으로 인한 사망률은 세계적으로 사망원인의 1, 2위를 기록하고 있다. 최근 환자맞춤형 항암치료를 통해 암을 극복하고자 하는 연구가 경쟁적으로 수행되고 있다. 특히, 표적치료제는 말기암 환자의 항암제에 대한 반응률을 획기적으로 높이면서항암제 부작용을 최소화 ? 뿐만 아니라 치료제에 대한 암의 반응을 분자신호로 예측할 수 있다 측면에서 환자 맞춤형 항암치료 연구의 핵심이라 할 수 있다. 그러나, 표적치료제의 개발을 위해서는 치료제의 효능을 예측할 수 있는 전임상 자료가 필요하지만 암치료제에 대한 일반 검사(routine test)로 이용할 수 있는 효과적인 전-임상 평가 시스템이 존재하지 않는다.
한편, 현재 항암제에 대한 in vitro 평가 시스템으로 불멸화된 종양세포 주 및 조직으로부터 초기 종양세포를 이용한다. 불멸화된 종양세포를 이용하여 항암제 효과를 보는 것은 어려운 일은 아니지만, 환경 인자에 따라 종양세포의 분자적 특징 및 표현형이 쉽게 바뀌기 때문에 이를 이용하여 실제적으로 항암제에 적용하는데 문제점이 존재한다. 세포는 생존을 위하여 세포의 특성을 변화시키고 강한 생존력을 갖는 세포는 계대 배양시 계속 선택되기 때문에 본래의 종양의 특징과 많이 달라질 수 있다. 또한, 다양한 환자에게 일어나는 여러 암인자를 타겟으로 하는 새로운 항암제의 개발에 적합하지 않다. 또한, 다른 시스템으로 HRDA(histroculture drug response assay)를 임상전 단계에서 환자의 암치료제의 민감도를 미리 검사하는 적으로 사용된다. 그러나, 이것은 적은 양의 조직을 사용하기 때문에, 다양한 항암제의 검사가 불가능하며, 한번 쓴 샘플은 버려지므로, 주요한 암조직의 손실이 크다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 최근 여러 제약회사와 국가 연구소에서 환자 암조직을 이용한 PDX 모델(patient-derived xenograft)이 개발되고 있으며, 상기 모델은 화학적 민감도를 in vivo 상에서 평가하기에 적절하고, 여러 항암제 중에서 환자 개개인에 맞는 가장 적합한 치료제를 선택할 수 있는 좋은 전임상 모델이다. 또한, 암의 진행 및 전이의 과정을 이해하기 위하여, 동종 장기 내에 이식한 동물모델 또한 개발중이다. 그러나, 상기 시스템은 많은 암 표본이 필요하며, in vivo 검사 전에 암세포를 이용한 in vitro 평가에 사용할 수 없다는 단점이 존재한다.
이러한 단점을 극복하기 위하여, 본 발명자들은 암환자로부터 암 조직을 분리하여 배양 및 증식 후, 일정량의 일차배양 암세포주를 질소탱크에 유지 및 보관하였다. 이 후, 보관된 일차배양 암세포주를 다시 배양하여, 면역결핍 마우스에 이식하여 고유의 환자와 동일한 형태 및 유전정보를 지닌 동물 모델을 제작하였다.
환자에서 적출한 암세포에 적합한 새로운 배양법의 제시와 분리 및 저장된 암세포를 이용한 환자와 동일한 이종동물모델을 제작함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 한국인의 주요 암종인 폐암, 대장암, 위암 및 간암조직에서 분리된 암세포의 적합한 일차 배양방법 및 이에 의하여 제조된 종양세포를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 일차 배양된 종양세포를 이용한 이종동물모델 및 이의 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명은 한국인의 주요 암종인 폐암, 대장암, 위암 및 간암조직에서 분리된 암세포의 적합한 일차 배양방법 및 이에 의하여 제조된 종양세포를 제공함에 있다.
본 발명은 상기 일차배양된 종양세포를 이용한 이종동물모델 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 종양세포의 일차 배양방법, 및 일차 배양된 종양세포를 이용한 이종 이식 동물 모델의 제조방법은 암 조직을 바로 이식하지 않고 적출된 암조직을 이용하여, 일차배양 종양세포를 배양, 증식 및 저장시킨 후, 상기 종양세포를 면역 결핍 마우스에 이식할 수 있으며, 적은 양의 암 조직에서 분리된 세포를 증식시켜, 많은 양의 세포를 만들어 이를 유지 및 저장이 가능하며, 언제든지 저장된 세포를 해동하여 다시 종양세포를 배양할 수 있다는 이점이 있다. 또한, 증식 및 저장된 종양세포를 재배양하여, 면역결핍 마우스에 이식하여 환자와 동일한 형태 및 유전정보를 갖는 이종 이식 동물 모델의 제조가 가능하다. 이런 종양세포 배양법과 이종 이식 동물모델 시스템을 이용하여, 새로운 항암제를 다양한 조건에서 시험이 가능하며, 짧은 시간에 여러 항암제의 효능을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있고, 환자에게 가장 적절한 항암제를 선별할 수 있어, 환자의 치료기간 및 치료비용을 절감할 수 있다.
도 1은 환자 유래의 일차 배양한 종양세포를 이식한 이종 이식 종양 마우스 모델의 제조과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 폐암 종양세포의 일차배양 방법을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 폐암 환자 유래의 일차 배양한 폐암 종양세포를 이식한 면역결핍 마우스의 종양을 폐암환자의 폐암조직과 비교한 도이다.
도 4는 본 발명의 일차 배양한 폐암 종양세포에서 폐암 줄기세포를 분리하는 과정을 나타낸 도이다.
도 5는 일차 배양한 폐암 종양세포에서 분리된 폐암 줄기세포의 구형성 및 상기 세포를 면역결핍 마우스에 이식한 경우의 종양 형성을 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 대장암 또는 위암 종양세포의 일차배양 방법을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 대장암 환자 유래의 일차 배양한 대장암 종양세포를 이식한 면역결핍 마우스의 종양을 대장암 환자의 대장암 조직과 비교한 도이다.
도 8은 본 발명의 위암 환자 유래의 일차 배양한 위암 종양세포를 이식한 면역결핍 마우스의 종양을 위암 환자의 위암 조직과 비교한 도이다.
도 9는 본 발명이 일차 배양한 대장암 또는 위암 종양세포에서 대장암 또는 위암 줄기세포를 분리하는 과정을 나타낸 도이다.
도 10은 일차 배양한 위암 종양세포에서 분리된 위암 줄기세포의 구형성을 확인한 도이다.
도 11은 본 발명의 간암 종양세포의 일차배양 방법을 나타낸 도이다.
도 12는 간암 환자의 간암 조직을 일차 배양한 종양세포를 이종 이식한 마우스 및 이의 종양조직을 H＆G로 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 일차 배양한 간암 종양세포에서 간암 줄기세포를 분리하는 과정을 나타낸 도이다.
도 14는 일차 배양한 간암 종양세포에서 분리된 간암 줄기세포의 구형성 및 상기 세포를 면역결핍 마우스에 이식한 경우의 종양 형성을 확인한 도이다.
본 발명은
1)암환자로부터 분리된 암조직을 조각으로 절단하는 단계;
2)상기 1)단계의 절단된 암조직을 콜라게나제를 이용하여 배양하는 단계;
3)상기 2)단계의 암조직을 세척하는 단계;
4)상기 3)단계의 암조직을 콜라겐이 코팅된 배양 접시에서 1 내지 3일 동안 배양하는 단계; 및
5)상기 4)단계의 배양된 조직을 세척하고, 3 내지 7일 동안 배양한 후 계대 세포를 수득하는 단계;를 포함하는 암세포의 일차 배양 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 일차 배양된 암세포를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일차 배양 암세포는 암환자로부터 암조직을 분리하여 DMEM/F12로 헹구어, 이를 가위를 이용하여 조각으로 절단하고 콜라게나제를 처리하고, 이를 세척하여, 각 암의 종류별로 다른 종류의 배지를 포함하는 콜라겐이 코팅된 배양접시에서, 1 내지 3일 동안 배양 후, 이를 3 내지 7일 동안 계대 배양하여 계대세포를 수득하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 "암 조직" 및 "암세포"는 "종양조직" 및 "종양세포"와 동일한 개념으로 사용된다.
본 발명의 암세포의 일차 배양 방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
상기 1)단계는 일차 배양 암세포를 배양하기 위한 전처리 단계로, 암환자로부터 분리된 암조직을 DMEM/F12로 헹구고, 이를 작은 조각으로 절단한다.
상기 2)단계는 절단된 암조직을 배양하는 단계로, 절단된 암조직의 조각들을 60분 내지 120분 동안, 바람직하게는 90분 동안 30℃ 내지 45℃, 바람직하게는 37℃에서 0.05% 내지 0.15%, 바람직하게는 0.1%의 콜라게나제를 처리하여 배양한다. 상기 콜라게나제는 타입 Ⅳ 콜라게나제인 것이 바람직하다.
상기 3)단계는 암조직을 세척하는 단계로, 콜라게나제에서 배양된 조직을 DMEM/F12를 이용하여 세척한다.
상기 4)단계는 암조직을 콜라겐이 코팅된 배양 접시에서 1 내지 3일 동안 배양하는 단계이다.
상기 암이 폐암인 경우, 배양 접시 내의 배양 배지는 5 내지 15%의 FBS가 포함된 BEGM(0bronchiolar epithelial basal medium) 배양 배지가 바람직하다.
상기 암이 대장암 또는 위암인 경우, REGM(Renal Epithelial cell Medium) 배양 배지에서 배양한다.
상기 암이 간암인 경우, 배양배지는 FBS 및 HGF(hepatocyte growth factor)를 포함하는 HCM 배양 배지가 바람직하다.
제 5)단계는 배양된 조직을 계대 배양하는 단계로, 최종적으로 계대 세포를 수득하는 단계이다. 상기 배양은 3 내지 7일 동안 배양하는 것이 바람직하고, 배양배지의 경우, 상기 4)단계의 배양배지와 동일한 것을 사용한다.
상기 방법에 의하여 수득된 계대 배양 세포를 일차 배양 암세포라고 하고, 상기 일차 배양 암세포는 환자 유래의 암세포로서 적은 양의 암 조직에서 분리된 세포를 증식시켜, 많은 양의 세포를 만들어 이를 유지 및 저장이 가능하며, 언제든지 저장된 세포를 해동하여 다시 종양세포를 배양할 수 있다는 이점이 있다.
또한, 본 발명은 일차 배양 암세포를 마트리젤이 코팅된 접시 또는 저 부착 접시(low attachment dish)에서 10 내지 18일 동안 구(sphere)형성이 될 때까지 배양하는 것을 특징으로 하는, 암 줄기세포의 배양 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 배양방법에 의해 배양된 암 줄기세포를 제공한다.
상기 암세포가 폐암세포인 경우, BEGM(0bronchiolar epithelial basal medium)에 5 내지 15%의 BSA(bovine serum albumin; 소혈청알부민), ROCK 저해제(Rho-assoicated kinase inhibitor), B27 및 N2를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 것이 바람직하다.
상기 암세포가 대장암세포 또는 위암 세포인 경우, REGM(Renal Epithelial cell Medium)에 5 내지 15%의 BSA, 가스트린, ROCK 저해제, B27 및 N2를 포함하는 배양배지에서 배양하는 것이 바람직하다.
상기 암세포가 간암세포인 경우, HCM(Hepatocyte Culture Medium)에 5 내지 15%의 BSA, 간세포성장인자(hepatocyte growth factor), ROCK 저해제, B27 및 N2를 포함하는, 배양 배지에서 배양하는 것이 바람직하다.
상기 Rock 저해제는 구(sphere) 내의 세포자살(apotosis)를 저해시키며 구(sphere)를 형성한다.
또한, 본 발명은
1)상기 일차배양 암세포 또는 암 줄기세포를 마트리젤과 혼합하여, 면역결핍 마우스에 주입하는 단계;
2)제 1)단계의 주입 2 내지 6개월 후, 면역결핍 마우스의 종양을 분리하는 단계;및
3)상기 종양을 졸레틸(Zoletil) 및 럼펌(Rumpum)과 혼합하여 누드마우스에 주입하는 단계를 포함하는, 환자 유래 종양세포 이종 이식 동물모델의 제조방법을 제공한다.
제1)단계는 면역결핍 마우스에 일차배양 암세포 1×104 내지 1×106 바람직하게는 1×105 개의 암세포를 피하조직, 꼬리 정맥혈 및 다리 안쪽에 마트리젤 또는 PBS를 이용하여 이식하는 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 마우스의 등의 피하조직에 주입할 수 있다. 상기 암세포가 주입된 면역결핍 마우스를 환자 유래 이종 이식 동물 모델로 사용할 수 있다.
제2)단계는 주입 2 내지 6개월 후, 면역결핍 마우스의 종양을 분리하는 단계로, 종양 형성기간은 각 암의 종류에 따라 다소 차이가 있다. 폐암의 경우 4개월 내지 6개월 정도 걸리며, 위암, 대장암, 간암의 경우 3개월이 소요된다.
제3)단계는 면역결핍 마우스의 종양을 누드마우스에 주입하는 단계로, 졸레틸 및 럼펌을 혼합하여 주입할 수 있고, 복막 내 주입이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 2)단계 및 3)단계를 반복함으로써, 여러 대에 걸쳐, 누드마우스를 계대하여 동물 모델을 유지시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 상기의 방법으로 제조된 환자 유래 이종 이식 동물모델을 제공한다.
상기 동물 모델은 환자와 동일한 형태 및 유전정보를 갖는 이종 이식 동물 모델이며, 이를 이용하여 새로운 항암제를 다양한 조건에서 시험이 가능하며, 짧은 시간에 여러 항암제의 효능을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있고, 환자에게 가장 적절한 항암제를 선별할 수 있어, 환자의 치료기간 및 치료비용을 절감할 수 있다.
또한, 본 발명은
1)상기 환자 유래 종양세포 이종 이식 동물모델에 항암제를 투여하는 단계; 및
2)상기 1)단계의 동물모델에서 종양세포의 성장 또는 전이를 측정하여 항암제의 치료 효능을 결정하는 단계를 포함하는, 환자 유래 종양세포 이종 이식 동물모델을 이용한 항암제의 치료 효능 분석 방법을 제공한다.
상기 1)단계는 종양이 유발된 동물에 항암제를 투여하는 단계로, 마우스를 이용하는 경우, 종양이 유발된 마우스의 꼬리 정맥에 항암제를 투여할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 2)단계는 항암제의 치료 효능을 결정하는 단계로, 종양의 종류에 따라 관련 유전자의 발현 정도 또는 미세혈관 밀도를 측정하여 항암제의 치료 효능을 분석할 수 있다. 종양세포의 성장 또는 전이는 육안으로 관찰할 수 있고 또는 캘리퍼스와 같은 도구를 이용하여 측정할 수 있다. 종양세포의 추가적인 성장 또는 전이가 억제되는 경우 분석대상의 항암제는 항암제로서 효능을 갖는다고 결정할 수 있다.
또한, 본 발명은
1)상기 환자 유래 종양세포 이종 이식 동물모델에 항암제 후보 물질을 투여하는 단계; 및
2)상기 1)단계의 동물모델에서 종양세포의 성장 또는 전이를 측정하여 항암제 후보물질의 치료 효능을 결정하는 단계;를 포함하는, 환자 유래 종양세포 이종 이식 동물모델을 이용한 항암제의 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 1)단계는 종양이 유발된 동물에 항암제 후보물질을 투여하는 단계로, 마우스를 이용하는 경우, 종양이 유발된 마우스의 꼬리 정맥에 항암제를 투여할 수 있다.
상기 "항암제 후보물질"이란 종양세포의 성장 또는 전이에 대하여 억제 활성을 가지는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 후보물질은 화학물질, 펩타이드, 단백질, 항체 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 후보물질은 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)이다. 후보물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입가능하다. 후보물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, 1-비드 1-화합물 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.
상기 2)단계는 항암제 후보물질의 치료 효능을 결정하는 단계로, 종양의 종류에 따라 관련 유전자의 발현 정도 또는 미세혈관 밀도를 측정하여 항암제 후보물질의 치료 효능을 분석할 수 있다. 상기 관련 유전자는 당업계에 널리 공지되어 있다. 종양세포의 성장 또는 전이는 육안으로 관찰할 수 있고 또는 캘리퍼스와 같은 도구를 이용하여 측정할 수 있다. 종양세포의 추가적인 성장 또는 전이가 억제되는 경우 분석대상의 항암제 후보물질은 항암제로서 효능을 갖는다고 결정할 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 정확히 설명하는 하나의 예시일 뿐, 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되지 않는다.
[ 실시예 1]환자 유래 폐암 세포의 일차 배양 및 일차 배양 종양세포로부터 폐암 줄기세포 분리, 및 이종 이식 마우스 모델의 제조
1. 환자 유래의 폐암 세포의 일차 배양 및 상기 일차 배양 폐암세포를 이용한 이종 이식 마우스 모델의 제조
1-1. 환자 유래의 폐암 세포의 일차 배양
대한민국 서울 아산병원의 IRB(Institutional Review Board) 및 ACC(Institutional Review Board and Animal Care Committee)로부터 승인을 받아 실험을 진행하였다. 인간 폐 시료를 4명의 환자(표 1)로부터 수술을 진행하는 동안 절제된 시료로부터 수득하였다. DMEM/F12로 상기 시료를 혼합하여 가위로 절제하고, 1mg/mL의 타입Ⅳ 콜라게나제(Singma Chemical Co. st. Louis, MO, USA)를 가하여 1시간 동안 조직을 배양하였다. 이 후, 조직을 DMEM/F12로 세척한 후, 10% FBS(Sigma Chemical CO)를 포함하는 BEGM(bronchiolar epithelial basal medium; Lonza, Walkersville, MD, USA; BPE(bovine pituitary Extract), hEGF, GA-1000, insulin 및 Triiodothyronine-SingleQuts Kit) 배양액에서 폐암세포를 일차배양을 수행하였고, 이 후, 조직을 세척한 후 배지를 교체하여 3 내지 7일 동안 배양한 후, 계대 세포를 수득하여, 일차 배양 폐암세포를 수득하였다.
1-2. 환자 유래 일차 배양 폐암세포를 이용한 이종 이식 마우스 모델의 제조.
상기 실시예 1-1에서 배양한 배양 세포주를 6 내지 8주령의 NOD-SCID 마우스(Charles River Laboratiries, Wilmington, MA, USA)에 이식하였다. 보다 구체적으로, 1×106의 환자 유래 일차 배양 종양세포들을 100㎕ 마트리젤(BD Bioscences, San Jose, CA, USA)에서 재 부유시켰고, 이를 NOD/SCID 마우스 등 피하 층(subcutaneous layer of back)에 주입하였다. 종양 크기가 1cm3을 넘었을 때인 2 내지 3개월 후에, Zoletil(Virbac, Virvac laboratories BP 27-06511 carros, France; 40mg/kg) 및 Rumpum(bayer, Korea, South Korea; 5mg/kg)을 혼합하여 마우스의 복막 내 주입(intra-peritoneal injection)하였다. 이 후, 종양을 수술적으로 잘라내었다.
환자 유래 일차 배양세포를 이용한 이종 이식 마우스 모델 제조 과정을 개략적으로 도 1에 나타내었고, 본 발명의 폐암 환자 유래 일차 배양세포 제조과정을 도 2에 나타내었다.
1-3. 종양의 형태( morphology ) 및 면역표현형( immunophenotype ) 평가
환자의 폐암 종양조직 및 이식된 종양조직을 형태학적으로 비교하였다. 상기 종양조직을 H＆E 염색하여, 병리학적 형태의 결정, 분화 점수화(differentiation grading) 및 종양의 구조(architecture)를 평가하였다. 구체적으로는, 조직을 차가운 2%의 포름알데히드에 4시간 동안 고정시키고, 56℃로 파라핀(paraffin)에 끼워넣었다. PE(paraffin embedded)블록을 4 ㎛로 절단하고, H＆E(Hematoxylin and eosin)으로 염색하였다. 두 명의 병리학자가 WHO 폐암 분류에 따라 병리학적 진단 및 점수화(grading)를 수행하였다. 상기 시료의 암을 소세포폐암(small cell lung cancer; SCLC) 및 비소세포폐암(non-small cell lung cancer; NSCLC)으로 분류하였다. NSCLC는 추가적으로 선암(adenocarcinoma), 편평상피암(squamous cell carcinoma) 및 선편평세포암(adenosquamous cell carcinoma)을 포함하는 다양한 조직병리학적 병명으로 분류하였다. 이식하기 전의 환자의 폐암 종양조직에 대한 프로파일을 하기의 표 1에 나타내었다.
나이 성별 조직학적 진단 분화(Differentiation)
환자번호 1 45 남자 선암 중간정도로 분화(moderately diffentiated)
환자번호 2 41 남자 선암 낮은정도로 분화(pooly differentiated)
환자번호 3 62 여자 선편평세포암 -
환자번호 4 68 여자 소세포성암 -
또한, 환자의 종양 및 이식된 종양 사이의 비교를 위하여, 면역표현형 평가를 수행하였다. 자동화 면역화학적 염색 장비(automatic immunohistochemical staining devive; Benchmark XT, Ventana Medical System, Tucson, AZ, USA)를 통하여 포르말린에 고정된 파라핀에 끼워넣어진 조직 부위(formalin-fixed paraffin-embedded tissue section)에 대해 조직학적 염색을 수행하였다. 요약하면, 4㎛의 두꺼운 전체 조직 부위를 poly-L-lysine을 코팅한 부착 슬라이드에 옮겼고, 74℃에서 30분 동안 건조하였다. 자동염색기에서 pH 8.0의 에틸렌 디아민테트라아세트 산 내에 조직을 1시간 동안 가열하여 엡피톱(epitope)을 회복(retrieval)시켰다. 항-사이토케라틴 7(anti-cytokeratin 7; CK7; 1:400 희석; DAKO, Glostrup, Denmark) 및 항-사이토케라틴 20(CK20:200 희석; DAKO)을 상피 조직의 마커로서 사용하였고, 항-상피 성장 인자 수용체(EGFR; 1:100 희석; Zymed, city, CA, USA) 및 항-티로이드 전사 인자-1(thyroid transcription factor-1; TTF-1; 1:200 희석; Novocastra, Newcastle, UK)을 선암에 대한 마커로 사용하였고, 항-크로모그래닌(chromogranin; 1:200 희석; DAKO) 및 항-시냅토피신(synaptophysin; 1:100 희석; Neomarkers, California, USA) 및 CD56(1:25 희석화; Zymed)을 소세포암의 마커로 사용하였다. 상기 일차항체와 조직을 배양한 후, 이차항체로 추가적으로 배양하였다, 이 후, UltraView Universal DAB kit(Ventana Medical System, Inc)로 시각화하였다. 핵은 Harris hematoxylin으로 대조염색하였다. 하기의 표 2에 환자의 각 항체에 대한 반응을 나타내었다. 또한, 환자번호 1의 종양조직을 이종 이식한 마우스(도 3의 왼쪽 윗쪽 사진), 환자번호 1의 종양조직과 이종 이식한 마우스를 조직염색(H&E; Hematoxylin and eosin)한 결과(도 3의 왼쪽 아랫쪽 사진) 및 항-CK7, 항-CK20, 항-EGFR 및 항-TTF1으로 염색한 결과(도 3의 오른쪽)를 도 3에 나타내었다.
항체 발현의 의미 환자번호 1 환자번호 2 환자번호 3 환자번호 4
CK 7 폐 일차 선암(Lung primary adenocarcinoma) 양성 양성 양성 -
CK 20 비-폐 일차 선암(non-lung primary adenocarcinoma 음성 음성 - -
p63 편평상피암 - - 양성(focal) -
TTF-1 페 일차 암 양성 양성 양성 -
EGFR 돌연변이 양성 음성 양성 -
CD56 신경내분비 암 - - - 양성
Synaptophysin 신경내분비 암 - - - 양성
Chromogranin 신경내분비 암 - - - 음성
도 3에 나타난 바와 같이, 면역결핍 마우스에 환자번호 1로부터 유래한 종양세포를 일차 배양한 폐암세포가 성공적으로 이종 이식됨을 확인하였고, 환자번호 1의 종양조직과 이종 이식한 마우스 사이에 조직 형태적인 특성이 변함이 없음을 확인하였다.
또한, 상기 양 조직 사이는 동일한 마커를 발현하고 있어, 환자의 종양조직의 특성을 일차 배양 폐암세포가 이종 이식된 마우스의 종양조직에서 동일하게 유지하고 있음을 확인하였다.
1-4. 유전자 돌연변이 프로파일 비교를 통한 종양의 지노타이핑( genotyping )
환자 유래의 일차 배양한 폐암세포가 이종 이식 마우스 모델에서 유전적으로 동일성을 유지하는지 확인하기 위하여, 환자번호 1 내지 4의 종양조직, 일차 배양한 폐암세포(환자번호 1 내지 4에서 유래) 및 이종 이식한 종양(환자번호 1 내지 4)조직으로부터 DNA 시료를 추출하였고, 암 유전자 돌연변이 프로파일링을 "OncoMap system"을 이용하여 분석하였다. Dana-Farber Cancer Institute에서 개발된 41개 종양-관련 유전자(KRAS, TP53, STK11, EGFR 및 BRAF)에서 440개의 부위를 포함하는 지노타이핑 패널을 이용하였다. 상기 시스템을 이용하여 상기 종양조직 및 세포의 유전형을 결정하였다. 환자번호 1 내지 4의 종양조직(PLT), 일차 배양한 폐암세포(PC) 및 이종 이식한 종양(XT)조직에서 EGFR 및 STX11의 유전자의 돌연변이 프로파일을 표 3에 나타내었다.
환자 ID
 유전자 돌연변이
EGFR STK11
환자번호 1

 PT(폐암환자) wt P281L
PCC(일차배양폐암세포) wt P281L
XT(종양 이식 모델) wt P281L
환자번호 2

 PT E746-A750Δ wt
PCC E746-A750Δ wt
XT E746-A750Δ wt
환자번호 3

 PT E746-A750Δ wt
PCC E746-A750Δ wt
XT E746-A750Δ wt
환자번호 4

 PT wt wt
PCC wt wt
XT wt wt
표 3에 나타난 바와 같이, 환자번호 1 내지 4의 종양조직(PLT), 일차 배양한 폐암세포(PC) 및 이종 이식한 종양(XT)조직에서 돌연변이가 일치하는 것을 확인하여, 일차 배양 폐암세포 및 이종 이식한 종양조직은 원래의 환자의 종양과 일치됨을 확인하였다.
2.일차 배양 폐암세포에서 폐암 줄기세포 배양 및 이를 이용한 이종 이식 마우스 마우스 모델의 제조
2-1.일차 배양 폐암세포에서 폐암 줄기세포 배양.
실시예 1-1에서 배양된 일차 배양 폐암세포를 이용하여 폐암 줄기세포를 배양하였다.
보다 구체적으로, 환자의 폐암 조직에서 분리한 폐암 상피 종양 세포의 성장과 부착을 위하여, 일차 배양 폐암 세포 1×105를 BEGM(bronchiolar epithelial basal medium; Lonza, Walkersville, MD, USA; BPE(bovine pituitary Extract), hEGF, GA-1000, insulin 및 Triiodothyronine-SingleQuts Kit) 배양액에 10uM Rock inhibotor, 1 X B27 및 1 X N2를 가하여 마트리젤(Matrigel)로 코팅된 접시를 이용하여, 폐암 줄기세포를 Sphere cell(구세포)가 형성될 때까지 배양하였다.
2-2.환자 유래 폐암 줄기세포를 이용한 이종 이식 마우스 모델의 제조
실시예 1의 1-1과 같은 방법으로 폐암 줄기세포를 이용하여 이종 이식 마우스 모델을 제조하였다.
2-3. 결론
일차 배양 폐암세포에서 폐암 줄기세포를 배양하는 방법을 도 4에 나타내었고, 폐암 줄기세포의 구형성(sphere)을 확인한 결과 및 이를 면역 결핍 마우스에 이식한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 환자 유래의 폐암 줄기세포가 마우스에 성공적으로 이식됨을 확인하였고, 환자의 종양조직과 이종 이식한 마우스 사이에 조직 형태학적인 특성이 변화가 없는 것을 확인하였다.
[ 실시예 2]환자 유래 대장암 및 위암 조직으로부터 일차 세포 배양, 일차 배양 종양세포로부터 대장암 또는 위암 줄기세포 분리, 및 이종 이식 마우스 모델의 제조.
1-1 환자 유래 대장암 및 위암 조직으로부터 일차 세포 배양
대장암 환자(성별:남자; 나이:81; 종양 종류:MA; 등급: PD) 및 위암 환자의 종양조직을 절제하여 실시예 1의 1-1과 동일하게 처리한 후, 배지 조성물(REGM(Lonza)를 이용함) 배지만 달리하여 대장암 또는 위암세포를 배양하였다. 구체적으로 REGM(Lonza) 배지를 이용하였다. 상기 대장암 또는 위암세포를 배양하는 방법을 도 6에 나타내었다.
1-2. 환자 유래 일차 배양 대장암 또는 위암세포를 이용한 이종 이식 마우스 모델의 제조.
실시예 1의 1-2와 같은 방법으로 NOD-SCID 마우스에 일차 배양 대장암 및 위암세포를 이식하였다.
1-3. 종양의 형태( morphology ) 및 면역표현형( immunophenotype ) 평가
실시예 1의 1-3과 같은 방법으로, 환자의 종양조직 및 이식된 종양조직 형태학적 및 면역표현형 평가를 수행하였다. 대장암 환자(도 7) 또는 위암 환자(도 8)의 종양조직과 이를 이종 이식한 마우스의 종양조직을 조직염색(H＆E; Hematoxylin and eosin)한 결과 및 항-P-CEA, 항-CK7, 항-CK20 및 항-EGFR으로 면역염색한 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 일차 배양 대장암 세포가 이식된 이종 이식 마우스 모델의 종양조직은 환자의 종양조직과 동일한 형태학 및 면역 표현형적 특성이 유지됨을 확인하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 일차 배양 위암 세포가 이식된 이종 이식 마우스 모델의 종양조직은 환자의 조양조직과 동일한 형태학 및 면역 표현형적 특성이 유지됨을 확인하였다.
2.환자 유래 대장암 또는 위암 일차 배양 세포로부터 대장암 또는 위암 줄기세포의 분리, 및 상기 세포를 이용한 이종 이식 마우스 모델의 제조.
2-1 환자 유래 대장암 또는 위암 일차 배양 세포로부터 대장암 또는 위암 줄기세포의 분리
상기에서 배양된 일차 배양 대장암 또는 위암세포를 10%의 BSA를 포함하는 REGM, 10μM의 가스트린(Gastrin), 10μM의 Rock 저해제, 1×B27 및 1×N2를 포함하는 배지 조성물을 이용하여 마트리젤로 코팅된 접시에서 세포가 구형성이 일어날 때까지 배양하였다. 이의 과정을 도 9에 나타내었고, 암 줄기세포의 특징 중 하나인 구 형성(sphere)을 확인한 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 구 형성이 상기 배양조건에서 일어나는 것을 확인하였다.
[ 실시예 3]환자 유래 간암조직으로부터 간암세포 일차 배양 및 일차 배양 간암세포로부터 줄기세포의 분리, 및 이종 이식 마우스 모델의 제조
1-1. 환자 유래 간암조직으로 간암세포 일차 배양
간암 환자의 암조직을 절제하여 실시예 1의 1-1과 같은 방법으로 처리한 후, 배지 조성물을 달리하여 간암세포를 배양하였다.
보다 구체적으로, 절제된 간암 환자의 암조직을 10% FBS를 포함하는 HCM(Lonza)에 HGF를 첨가하여 일차배양을 수행하였고, 이의 과정을 도 11에 나타내었다.
1-2. 일차배양한 간암세포를 이용하여 이종 이식 마우스 모델을 제조
실시예 1의 1-2와 같은 방법으로 NOD-SCID 마우스에 일차 배양 간암세포를 이식하였다.
1-3. 조직형태학적 분석
실시예 1의 1-3과 동일한 방법으로 이종 이식 마우스의 종양조직을 절제하여 염색한 후, 이를 분석하였다. 마우스에 간암세포를 이식한 결과 및 조직을 염색한 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 마우스에 일차 배양 간암세포가 성공적으로 이식되었음을 확인하였고, 일차 배양 간암 세포가 이종 이식된 마우스의 종양조직은 간암인 것을 확인하여, 이종 이식된 경우 조직학적 특성이 유지됨을 확인하였다.
2-1. 간암 줄기세포의 배양 및 이를 이용한 이종 이식 마우스 모델 제조
실시예 3의 1-1에서 배양한 일차 배양 간암세포를 HCM(Lonza), 5ng/ml의 간세포성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 10μM의 Rock 저해제(Rock inhibitor), 1×B27 및 1×N2를 포함하는 배지 조성물을 이용하여 저 부착성 접시(Low attachment dish)에서 배양하였고, 이를 이용하여 이종 이식 마우스 모델을 제조하였다. 간암 줄기세포 배양 방법을 도 13에 나타내었고, 간암 줄기세포 3000세포를 면역 결핍 마우스에 이식한 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이, 상기 배양방법으로 구형성이 일어남을 확인하여 간암 줄기세포를 유도할 수 있음을 확인하였고(도 14에 윗부분), 환자와 유사한 형태를 지닌 마우스 종양이 형성됨(도 14의 아랫 부분)을 확인하였다.

Claims (19)

1)암환자로부터 분리된 암조직을 조각으로 절단하는 단계;
2)상기 1)단계의 절단된 암조직을 콜라게나제를 이용하여 배양하는 단계;
3)상기 2)단계의 암조직을 세척하는 단계;
4)상기 3)단계의 암조직을 콜라겐이 코팅된 배양 접시에서 1 내지 3일 동안 배양하는 단계; 및
5)상기 4)단계의 배양된 조직을 세척하고, 3 내지 7일 동안 배양한 후 계대 세포를 수득하는 단계;를 포함하는 암세포의 일차 배양 방법.
제 1항에 있어서, 상기 암이 폐암인 경우, 상기 4)단계 및 5)단계의 배양은 5 내지 15%의 FBS가 포함된 BEGM(0bronchiolar epithelial basal medium) 배양 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 암세포의 일차 배양 방법.
제 1항에 있어서, 상기 암이 대장암 또는 위암인 경우, 상기 4)단계 및 5)단계의 배양은 REGM(Renal Epithelial cell Medium) 배양 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 암세포의 일차 배양 방법.
제 1항에 있어서, 상기 암이 간암인 경우, 상기 4)단계 및 5)단계의 배양은 FBS 및 HGF(hepatocyte growth factor)를 포함하는 HCM 배양 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 암세포의 일차 배양 방법.
제 1항에 있어서, 상기 제 1)단계의 환자로부터 분리된 암조직을 DEME/F12로 헹구는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암세포의 일차 배양 방법.
제 1항에 있어서, 상기 제3)단계는 DMEM/F12를 이용하여 암조직을 세척하는 것을 특징으로 하는, 암세포의 일차 배양 방법.
제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항의 방법에 의하여 배양된 일차 배양 암세포.
제 7항의 일차 배양 암세포를 마트리젤이 코팅된 접시 또는 저 부착 접시(low attachment dish)에서 10 내지 18일 동안 구(sphere)형성이 될 때까지 배양하는 것을 특징으로 하는, 암 줄기세포의 배양 방법.
제 8항에 있어서, 상기 암세포가 폐암세포인 경우, BEGM(0bronchiolar epithelial basal medium)에 5 내지 15%의 BSA(bovine serum albumin; 소혈청알부민), ROCK 저해제(Rho-assoicated kinase inhibitor), B27 및 N2를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 암 줄기세포의 배양 방법.
제 8항에 있어서, 상기 암세포가 대장암세포 또는 위암 세포인 경우, REGM(Renal Epithelial cell Medium)에 5 내지 15%의 BSA, 가스트린, ROCK 저해제, B27 및 N2를 포함하는 배양배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 암 줄기세포의 배양 방법.
제 8항에 있어서, 상기 암세포가 간암세포인 경우, HCM(Hepatocyte Culture Medium)에 5 내지 15%의 BSA, 간세포성장인자(hepatocyte growth factor), ROCK 저해제, B27 및 N2를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 암 줄기세포의 배양방법.
제8항 내지 제11항의 어느 한 항에 의하여 배양된 암 줄기세포.
1)제 7항의 일차 배양 암세포 또는 제12항의 암 줄기세포를 마트리젤 또는 PBS와 혼합하여, 면역결핍 마우스에 주입하는 단계;
2)제 1)단계의 주입 2 내지 6개월 후, 면역결핍 마우스의 종양을 분리하는 단계;및
3)상기 종양을 졸레틸(Zoletil) 및 럼펌(Rumpum)과 혼합하여 누드마우스에 주입하는 단계를 포함하는, 환자 유래 종양세포 이종 이식 동물모델의 제조방법.
제 13항에 있어서, 상기 1)단계에 있어서, 1×104 내지 1×106 개의 암세포를 면역결핍 마우스에 주입하는 것을 특징으로 하는, 환자 유래 종양세포 이종 이식 동물모델의 제조방법.
제 13항에 있어서, 상기 1)단계의 주입은, 면역 결핍 마우스의 등의 피하층(subcutaneous layer of back)에 주입하는 것을 특징으로 하는, 환자 유래 종양세포 이종 이식 동물 모델 제조방법.
제 13항에 있어서, 상기 3)단계의 주입은, 복막 내로 주입하는 것을 특징으로 하는, 환자 유래 종양세포 이종 이식 동물 모델 제조방법.
제 13항 내지 16항의 어느 한 항의 방법으로 제조된 환자 유래 종양세포 이종 이식 동물 모델.
1)제 17항의 환자 유래 종양세포 이종 이식 동물모델에 항암제를 투여하는 단계; 및
2)상기 1)단계의 동물모델에서 종양세포의 성장 또는 전이를 측정하여 항암제의 치료 효능을 결정하는 단계를 포함하는, 환자 유래 종양세포 이종 이식 동물모델을 이용한 항암제의 치료 효능 분석 방법.
1)제 17항의 환자 유래 종양세포 이종 이식 동물모델에 항암제 후보 물질을 투여하는 단계; 및
2)상기 1)단계의 동물모델에서 종양세포의 성장 또는 전이를 측정하여 항암제 후보물질의 치료 효능을 결정하는 단계;를 포함하는, 환자 유래 종양세포 이종 이식 동물모델을 이용한 항암제의 스크리닝 방법.







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