KR20130055591A - 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴로부터 얻어지는 암 치료용 조성물과 그것을 이용한 면역요법제의 제조 방법 및 면역요법 효과 평가 방법 - Google Patents
암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴로부터 얻어지는 암 치료용 조성물과 그것을 이용한 면역요법제의 제조 방법 및 면역요법 효과 평가 방법 Download PDFInfo
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Abstract
생체 내에서의 암 세포의 거동을 정확하게 반영할 수 있는 신규의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 이용하여, 면역요법 및 면역요법의 효과 평가법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 화학 처리 또는 광선 역학 처리를 함으로써 암 치료용 조성물을 조제한다. 이 암 치료용 조성물은, 유래하는 환자에게 직접 투여하기 위한 암 백신으로서 혹은 환자 유래의 혈액으로부터 얻어진 혈액 유래 세포에 인비트로에 있어서 접촉시키기 위한 약제로서 이용할 수 있다. 또한, 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 이용하여 경시적으로 혈액 중의 킬러 T 세포의 활성을 측정함으로써 면역요법의 효과를 평가할 수도 있다.
Description
본 발명은, 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴로부터 얻어지는 암 치료용 조성물과 그것을 이용한 면역요법제의 제조 방법 및 면역요법 효과 평가 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 인비보에서 암을 재구축할 수 있고, 또 증식능을 유지하는 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 처리하여 얻어지는 암 치료용 조성물과 그것을 이용한 면역요법제의 제조 방법 및 면역요법 효과 평가 방법에 관한 것이다.
최근, 암을 극복하기 위해서 여러 가지 연구가 거듭되어 온 결과, 조기암의 치료 성적은 비약적으로 향상되고 있다. 그러나, 진행암의 치료는 여전히 곤란하여, 암은 일본인 사인의 톱을 계속해서 차지하고 있다. 일본 후생노동부에 의한 2007년 인구 동태 통계에서는 연간 34만명 이상이 암에 의해 사망하고 있다.
현재 암 치료에서는 화학 요법, 수술, 방사선 치료가 그 주류로 되어 있지만, 그 밖의 선택지로서 면역요법도 행해지고 있다.
면역요법에는, 백신을 생체에 직접 투여하여 생체의 면역 활성을 높이는 능동 면역요법과, 세포 상해성 T 림프구나 수상 세포 등의 면역 관련 세포를 일단 체외에서 활성화시키고 나서 재차 체내로 되돌리는 수법을 이용하는 수동 면역요법이 있다. 이들의 어느 방법에서나 소위 면역원으로서, 이미 보편적으로 여러 가지 종류의 암으로 발현하고 있음이 판명되어 있는 종양 항원 펩티드(예컨대 WT1 펩티드(특허문헌 1), HLA-A2 구속성 항원 펩티드(특허문헌 2)) 등을 이용할 수 있다. 한편, 이와 같이 밝혀져 있는 항원 펩티드가 아니라, 미동정 항원을 포함하는 암 조직을 이용할 수도 있다. 이러한 항원 펩티드 또는 암 조직의 처리물과 수상 세포와의 결합물 또는 융합물 등도 알려져 있다.
또한, 암 조직이나 세포를 미립자로 고정화한 뒤에 사이토카인과 혼합한 백신 등도 개시되어 있다(특허문헌 3).
본 발명의 목적은 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴로부터 얻어지는 암 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은 또한 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴로부터 면역요법제를 제조하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명자들은, 개개의 암환자에게 특이성이 높고, 또한 쓸데없는 협잡물이 적은 항원을 이용함으로써, 매우 치료 효과가 높은 암 백신 혹은 면역요법을 제공하기 위해 예의 검토를 거듭한 결과, 신규의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 이용한 암 치료용 조성물 및 면역요법제의 조제 방법을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은, 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 처리함으로써 얻어지는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 처리는 화학 처리일 수 있다.
상기 화학 처리는 효소 처리 또는 포르말린 처리일 수 있다.
상기 처리는 광선 역학 처리일 수 있다.
상기 처리는 방사선 처리일 수 있다.
상기 암 치료용 조성물은, 유래하는 환자에게 경구 투여 또는 비경구 투여하기 위한 암 백신일 수 있다.
상기 암 치료용 조성물은, 환자 유래의 혈액으로부터 얻어진 혈액 유래 세포에 인비트로에 있어서 접촉시키기 위한 것일 수 있다.
상기 혈액은 말초혈일 수 있다.
상기 혈액 유래 세포는 단구로부터 유도되는 수상 세포일 수 있다.
본 발명은 또한, 환자 유래의 혈액으로부터 회수된 혈액 유래 세포와 상기 환자 유래의 상기 어느 것에 기재한 암 치료용 조성물을 접촉시키는 공정; 및 접촉에 의해 활성화된 혈액 유래 세포를 회수하는 공정을 포함하는, 상기 환자에게 접종되기 위한 면역요법제의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 혈액은 말초혈일 수 있다.
상기 면역요법제의 제조 방법에 있어서, 상기 혈액 유래 세포는 단구이며, 또한 단구를 수상 세포로 유도하는 공정을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 면역요법의 효과를 평가하는 방법으로서, 면역요법이 실시된 환자 유래의 혈액 유래 세포를 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴와 접촉시키는 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다.
상기 면역요법의 효과를 평가하는 방법에 있어서, 상기 혈액 유래 세포의 세포 장해성을 측정하는 공정을 더 포함할 수 있다.
상기 혈액 유래 세포는 단리된 세포 상해성 T 세포일 수 있다.
상기 면역요법의 효과를 평가하는 방법에 있어서, 상기 혈액 유래 세포는 단리된 내추럴 킬러 세포이며, 상기 접촉시키는 공정이 또한 항체를 공존시킬 수 있다.
상기 면역요법의 효과를 평가하는 방법에 있어서, 면역요법이 실시된 환자가 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 이용한 면역요법이 실시된 환자이며, 그 환자 유래의 혈액 유래 세포가 면역요법이 실시되고 나서부터의 경과시간을 바꿔 회수된 복수의 시료로서 제공되는 것일 수 있다.
본 발명의 암 치료용 조성물은, 환자 개인으로부터 얻어지고, 또한 세포 이외의 쓸데없는 협잡물을 포함하지 않는다. 따라서, 그 환자 개인의 암 조직에 대한 특이성이 높고, 또한 확실하게 암을 공격하는 면역 응답을 유기할 수 있다. 또한, 인비트로로 보존이 가능하고, 또 적절하게 필요에 따라서 증식시킬 수도 있기 때문에, 환자의 상태에 따라서 언제나 조제할 수 있다. 이러한 암 치료용 조성물은 직접 투여하는 암 백신으로서도 이용할 수 있고, 또한, 생체외에 있어서, 혈액 세포를 특이적으로 활성화하는 데 적법하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서는, 이러한 암 치료용 조성물이나 암 조직 유래 세포괴 혹은 암 세포 응집괴 자체를 이용하여, 면역요법의 효과를 간이하게 조사할 수도 있다.
도 1은 본 발명에 이용되는 암 조직 유래 세포괴를 도시하는 도면이다.
도 2는 인비트로의 배양 과정에 있어서의 본 발명에 이용되는 암 조직 유래 세포괴의 형상 변화와 증식능을 도시하는 도면이다.
도 3은 본 발명에 이용되는 암 조직 유래 세포괴를 마우스에게 이식하여 얻어진 종양 조직(도면의 우측 2개)과 암 조직 유래 세포괴에서 유래하는 생체 내에서 적출한 종양 조직(도면의 좌측 2개)을 비교한 도면이다.
도 4는 여러 가지 암 조직으로부터 얻어진 본 발명에 이용되는 암 조직 유래 세포괴를 도시하는 도면이다.
도 5는 본 발명에서 이용되는 암 조직 유래 세포괴를 냉동 보존하기 전(좌측) 및 융해 24시간 후(우측)의 상태를 비교한 도면이다.
도 6은 본 발명에서 이용되는 암 세포 응집괴를 도시하는 도면이다.
도 7은 본 발명에서 이용되는 검체로부터 얻어진 암 세포 응집괴를 도시하는 도면이다.
도 8은 본 발명에서 이용되는 암 세포 응집괴를 동결하여 융해한 후의 시간 경과에 의한 변화를 도시하는 도면이다.
도 9는 본 발명에서 이용되는 미처리 암 조직 유래 세포괴와 처리한 암 조직 유래 세포괴의 플로우 사이토메트리 해석 결과를 도시하는 도면이다.
도 10은 본 발명에서 이용되는 미처리 암 조직 유래 세포괴와 처리한 암 조직 유래 세포괴의 플로우 사이토메트리 해석 결과를 도시하는 그래프이다.
도 11은 본 발명에서 이용되는 미처리 암 조직 유래 세포괴와 처리한 암 조직 유래 세포괴의 아포토시스 유도에 관련된 단백질을 웨스턴 블롯 해석한 도면이다.
도 2는 인비트로의 배양 과정에 있어서의 본 발명에 이용되는 암 조직 유래 세포괴의 형상 변화와 증식능을 도시하는 도면이다.
도 3은 본 발명에 이용되는 암 조직 유래 세포괴를 마우스에게 이식하여 얻어진 종양 조직(도면의 우측 2개)과 암 조직 유래 세포괴에서 유래하는 생체 내에서 적출한 종양 조직(도면의 좌측 2개)을 비교한 도면이다.
도 4는 여러 가지 암 조직으로부터 얻어진 본 발명에 이용되는 암 조직 유래 세포괴를 도시하는 도면이다.
도 5는 본 발명에서 이용되는 암 조직 유래 세포괴를 냉동 보존하기 전(좌측) 및 융해 24시간 후(우측)의 상태를 비교한 도면이다.
도 6은 본 발명에서 이용되는 암 세포 응집괴를 도시하는 도면이다.
도 7은 본 발명에서 이용되는 검체로부터 얻어진 암 세포 응집괴를 도시하는 도면이다.
도 8은 본 발명에서 이용되는 암 세포 응집괴를 동결하여 융해한 후의 시간 경과에 의한 변화를 도시하는 도면이다.
도 9는 본 발명에서 이용되는 미처리 암 조직 유래 세포괴와 처리한 암 조직 유래 세포괴의 플로우 사이토메트리 해석 결과를 도시하는 도면이다.
도 10은 본 발명에서 이용되는 미처리 암 조직 유래 세포괴와 처리한 암 조직 유래 세포괴의 플로우 사이토메트리 해석 결과를 도시하는 그래프이다.
도 11은 본 발명에서 이용되는 미처리 암 조직 유래 세포괴와 처리한 암 조직 유래 세포괴의 아포토시스 유도에 관련된 단백질을 웨스턴 블롯 해석한 도면이다.
본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 개체로부터 얻어진 암 조직으로부터 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리로서 분리 처리된 분리물 또는 그 배양물이며, 인비트로에 있어서 증식능을 유지할 수 있는 것일 수 있다.
여기서, 「개체로부터 얻어진 암 조직으로부터 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리로서 분리 처리된 분리물」이란, 생체 내에서 발생한 암으로부터 얻어진 암 조직을 처리하여 얻어진 3개 이상, 바람직하게는 8개 이상의 암 세포를 포함하는 분리물을 가리킨다. 이러한 분리물에는 단일 세포로까지 분리되어 있는 것은 포함되지 않고, 또한 단일 세포로 분리되고 나서 재구축한 구성물은 포함되지 않는다. 단, 이 분리물은 생체로부터 분리한 직후의 것뿐만이 아니라, 예컨대 생리식염수 속에서 일정 시간 유지한 것이나 냉동 또는 냉장한 것도 포함한다.
개체로부터 「얻어진 암 조직」이란, 수술 등에 의해 적출함으로써 얻어지는 암 조직 외에, 주사 바늘이나 내시경으로 조직 검사용으로서 인비트로로 취급할 수 있도록 취득된 암 조직을 가리킨다.
「개체로부터 얻어진 암 조직으로부터 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리로서 분리 처리된 분리물의 배양물」이란, 생체 내에서 발생한 암으로부터 얻어진 암 조직을 처리하여 얻어진 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리로서 분리 처리된 분리물을 인비트로에 있어서 배양함으로써 얻어지는 것을 가리킨다. 배양하는 시간은 특별히 한정되지 않고, 짧은 시간이라도 배지 속에 존재시킨 것이면 된다. 이러한 배양물은 일정 기간 바람직하게는 3시간 이상 배양함으로써, 대략 구형 혹은 타원구형을 띠는 경우가 많다. 여기서의 배양물에는, 이러한 일정 기간 경과 후의 대략 구형 혹은 타원구형의 배양물도, 거기에 이르기까지의 부정형의 배양물도 포함된다. 또한, 이러한 대략 구형 혹은 타원구형의 배양물을 더욱 분할하여 얻어지는 부정형, 한층더 배양에 의한 대략 구형물 혹은 타원구형물도 여기서 말하는 배양물이다. 암 조직 유래 세포괴에 포함되는 세포는 순수한 암 세포만의 집단인 것이 바람직하다.
본 발명의 암 조직 유래 세포괴가 인비트로에 있어서 「증식능을 유지할 수 있다」란, 온도 37℃, 5% CO2 인큐베이터의 세포 배양 조건 하에서, 적어도 10일 이상, 바람직하게는 13일 이상, 더욱 바람직하게는 30일 이상의 기간 증식능을 유지할 수 있음을 말한다.
이러한 암 조직 유래 세포괴는, 그대로 배양을 계속하여도 10일 이상, 바람직하게는 13일 이상, 더욱 바람직하게는 30일 이상의 기간에 있어서 증식능을 유지할 수 있지만, 또한, 배양 중에 정기적으로 기계적 분할을 행함으로써 실질적으로 무기한으로 증식능을 유지할 수 있다.
기계 분할은 수술용 메스, 나이프, 가위 외에, 안과 첨도(尖刀) 등을 이용하여 행할 수 있다. 혹은 주사기에 주사 바늘을 장착하여 배양액와 함께 암 조직 유래 세포괴를 흡인 배출하는 것을 반복함으로써 행할 수 있다. 본 발명에 바람직하게 이용되는 것은 예컨대 1 ml 주사기와 27 G의 주사 바늘이지만, 한정되지는 않는다.
여기서, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴의 배양을 위한 배지는, 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는 동물 세포 배양용 배지가 이용된다. 특히 바람직하게는 줄기 세포 배양용의 무혈청 배지가 이용된다. 이러한 무혈청 배지는 줄기 세포의 배양에 이용되는 것이라면 하등 한정되지는 않는다. 무혈청 배지란, 무조제 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 배지를 가리키며, 정제된 혈액 유래 성분이나 동물 조직 유래 성분(예컨대, 증식 인자)을 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 무혈청 배지는 동물 세포의 배양에 이용되는 배지를 기초 배지로 하여 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예컨대 BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, 글래스고(Glasgow) MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, 이글(Eagle) MEM 배지, α MEM 배지, DMEM 배지, RPMI 1640 배지, 피셔(Fischer's) 배지 및 이들의 조합을 들 수 있다.
이러한 무혈청 배지에 혈청 대체물을 첨가하여 본 발명의 암 조직 유래 세포괴를 배양할 수 있다. 혈청 대체물은 예컨대 알부민, 아미노산(예컨대, 비필수 아미노산), 트랜스페린, 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올 또는 3'티올글리세롤 혹은 이들의 균등물 등을 적절하게 함유하는 것일 수 있다.
본 발명의 배양 방법에서는 시판되는 혈청 대체물을 사용할 수도 있다. 이러한 시판되는 혈청 대체물로서는, 예컨대 넉아웃 혈청 리플레이스먼트(KSR), 화학적 규명된 지질 농축된(Chemically-defined Lipid concentrated) 지방산 농축액(Gibco사 제조), 글루타맥스(Gibco사 제조)를 들 수 있다.
본 발명의 암 조직 유래 세포괴를 배양하기 위한 배지는 또한 비타민, 증식 인자, 사이토카인, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 등을 함유할 수 있다.
특히, EGF와 bFGF를 포함하는 무혈청 배지, 예컨대 넉아웃 혈청 리플레이스먼트(KSR, 인비트로사 제조)와 같은 혈청 대체물과 bFGF를 포함하는 무혈청 배지 등의 임의의 무혈청 배지를 바람직하게 사용할 수 있다. 혈청 대체물 혹은 EGF 등의 함유량은 배지 전체의 10∼30% w/v인 것이 바람직하다.
이러한 배지는 한정되지는 않지만, 시판 제품으로서는 STEMPRO 인간 ES 세포용 무혈청 배지(Gibco)를 들 수 있다.
암 조직 유래 세포괴의 배양에 이용되는 배양기는 일반적으로 동물 세포의 배양이 가능한 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샤알레, 튜브, 트레이, 배양 백 , 롤러 보틀을 들 수 있다.
배양기는 세포 비접착성이며, 세포외 매트릭스(ECM) 등에 의한 세포 지지용 기질을 배지에 공존시켜 삼차원 배양하는 것이 바람직하다. 세포 지지용 기질은 암 조직 유래 세포괴의 접착을 목적으로 하는 것일 수 있다. 이러한 세포 지지용 기질로서는, 세포외 매트릭스를 이용한 매트리겔, 예컨대, 콜라겐 겔이나, 젤라틴, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 라미닌, 피브로넥틴을 들 수 있다. 이러한 조건은 특히 본 발명의 암 조직 유래 세포괴를 증식시키고 싶은 경우에 적합하게 이용된다.
그 밖의 배양 조건은 적절하게 설정할 수 있으며, 예컨대 배양 온도는 한정되는 것은 아니지만 바람직하게는 약 30∼40℃이다. 가장 바람직하게는 37℃이다. CO2 농도는 예컨대 약 1∼10%, 바람직하게는 약 2∼5%이다.
본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 이러한 배지 및 배양 조건으로 배양할 수 있다. 또한 암 조직 유래 세포괴의 배양에는 그 개별 성질에 따라, 다른 세포와의 공배양이 바람직한 경우, 혹은 호르몬과 같은 추가의 특수한 보충물의 존재가 필요한 경우도 있을 수 있다.
구체적으로는, 공배양을 피더 세포와 함께 행하더라도 좋다. 피더 세포로서는, 태아 섬유아세포 등의 스트로마 세포 등을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 한정되지는 않지만, NIH3T3 등이 바람직하다.
혹은, 특정 종류의 유방암, 자궁암, 전립선암에 대해서는 호르몬을 존재시켜 배양하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 유방암에 대한 에스트로겐, 자궁암에 대한 프로게스테론, 전립선암에 대한 테스토스테론 등이지만, 이들에 한정되지 않고, 각종 호르몬을 첨가하여, 배양 조건을 적합하게 조정할 수 있다. 또한, 이러한 호르몬의 존재에 의해서, 암 조직 유래 세포괴의 배양 후의 거동, 예컨대 생사 상태 또는 증식 상태가 어떻게 변화되는지를 조사함으로써, 유래하는 환자의 암의 호르몬 의존성을 알아, 항호르몬 약물 치료의 유효성을 예측할 수 있을 가능성이 있다.
본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 부유 배양으로 배양하는 것도 가능하다. 부유 배양에서는, 배지 속에서, 배양기에 대하여 비접착성 조건 하에서 암 조직 유래 세포괴를 배양한다. 이러한 부유 배양으로서는, 예컨대 배양체 배양법(Keller 등, Curr. Opin. Cell Biol. 7, 862-869(1995)), SFEB법(예, Watanabe 등, Nature Neuroscience 8, 288-296 (2005); 국제공개 제2005/123902호 참조)을 들 수 있다. 특별히 한정되지는 않지만, 예컨대 거의 구형을 갖는, 때에 따라서는 기저막양 물질을 갖는 안정된 암 조직 유래 세포괴를 형성할 때나 유지하는 경우에 이용될 수 있다.
본 발명의 암 조직 유래 세포괴에는 개체의 암 조직 유래 세포괴로부터 분리 처리한 직후의 것도 포함되며, 냉장, 냉동 보존 후의 것도 포함되고, 나아가서는 이들의 배양물도 포함된다. 배양은 바람직하게는 3시간 이상, 보다 바람직하게는 적어도 10시간 이상 36시간까지, 더욱 바람직하게는 적어도 24시간∼36시간 기간 이루어질 수 있다.
암 조직 유래 세포괴를 구성하는 암 세포는 적어도 3개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 보다 바람직하게는 10개 이상, 더욱 바람직하게는 20개 이상, 가장 바람직하게는 50개 이상이다. 본 발명의 암 조직 유래 세포괴가 분리물인 경우에는, 바람직하게는 1000개 이하, 보다 바람직하게는 500개 이하 정도이다. 분리물을 배양한 후의 배양물이라면, 배양에 의해서 그 수를 증가시키는 것이 가능하다. 단, 배양물이라도 바람직하게는 1만개 이하, 보다 바람직하게는 5000개 이하이다.
본 발명에서 「암 세포」라고 할 때는 통상 이용되는 의미로 사용되며, 생체 내에서, 제한 없는 분열·증식과 아포토시스로부터의 일탈과 같은 정상 세포에서 보이는 질서가 흐트러진 세포를 말한다. 보다 상세하게는, 세포 증식 제어 기능을 잃었거나 매우 감약되어 있는 세포를 가리키며, 전형적으로는 80% 이상이 높은 빈도로 무한 증식 능력을 획득하고 있어, 그 대부분은 침윤 전이 능력도 구비하고 있는 경우가 많아, 그 결과 인간을 비롯한 특히 포유동물을 죽음에 이르게 하는 악성 신생물로 자리하는 세포임을 의미한다.
본 발명에서는, 유래하는 암 조직의 종류는 특별히 한정되지 않고, 포유류를 비롯한 동물에게서 생기는, 림프종, 아종, 육종, 지방육종, 신경내분비종양, 중피종, 신경초종, 수막종, 선종, 흑색종, 백혈병, 림프성 악성종 등일 수 있는데, 특히는 포유류의 상피 세포에 생기는 암종인 것이 바람직하다. 이러한 상피 세포에 생기는 암종에는, 비소세포폐암, 간세포암, 담도암, 식도암, 위암, 결장직장암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 방광암, 인두암, 유방암, 타액선암, 신장암, 전립선암, 음순암, 항문암, 음경암, 정소암, 갑상선암, 두경부암 등이 포함된다. 포유류를 비롯한 동물에게 특별히 한정은 없지만, 원숭이나 인간을 포함하는 영장목에 속하는 동물, 마우스, 다람쥐, 래트 등의 설치목에 속하는 동물, 토끼목에 속하는 동물, 개, 고양이 등의 고양이목에 속하는 동물이 예시된다.
그 중, 본 발명에서는, 특히 대장암 조직 유래, 난소암 조직 유래, 유방암 조직 유래, 폐암 조직 유래, 전립선암 조직 유래, 신장암 조직 유래, 방광암 조직 유래, 인두암 조직 유래 또는 췌장암 유래인 것이 특히 바람직하지만, 한정되지는 않는다.
대장암 조직 유래의 암 조직 유래 세포괴인 경우에는, 포함되는 암 세포는, 특별히 한정되지는 않지만, CD133을 발현하는 경우도 있다.
생체 내에서 발생한 암으로부터 얻어진 암 조직의 분리 처리에는, 한정되지는 않지만, 개체로부터 얻어진 암 조직을 효소 처리하는 것이 포함된다.
효소 처리는 콜라게나아제, 트립신, 파파인, 히알루로니다아제, C. 히스톨리티쿰 뉴트랄 프로테아제(histolyticum neutral protease), 써모리신(thermolysin) 및 디스파제(dispase) 중의 1종 또는 이들의 2종 이상의 조합에 의한 처리일 수 있다. 효소 처리 조건은, 생리학적으로 허용되는 pH, 예컨대 약 6∼8, 바람직하게는 약 7.2∼7.6으로 완충된 등장의 염 용액, 예컨대 PBS나 행크스의 평형염 용액 중에서, 예컨대 약 20∼40℃, 바람직하게는 약 25∼39℃에서 결합 조직을 분해하기 위해서 충분한 시간, 예컨대 약 1∼180분간, 바람직하게는 30∼150분간이며, 이 때문에 충분한 농도, 예컨대 약 0.0001∼5% w/v, 바람직하게는 약 0.001%∼0.5% w/v일 수 있다.
한정되지는 않지만, 이 효소 처리의 조건은 콜라게나아제를 포함하는 혼합 효소로 처리하는 것이 포함된다. 예컨대, C. 히스톨리티쿰 뉴트랄 프로테아제, 써모리신 및 디스파제로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 프로테아제; 및 콜라게나아제 I, 콜라게나아제 II 및 콜라게나아제 IV로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 콜라게나아제를 포함하는 혼합 효소로 처리하는 것이 포함된다.
이러한 혼합 효소에는, 한정되지는 않지만, 리베라제 블렌자임 1(등록상표) 등이 포함된다.
본 발명의 암 조직 유래 세포괴는, 혹은 3개 이상의 암 세포 집합체를 포함하며, 대략 구형 혹은 타원구형을 띠는 것일 수 있다.
한정되지는 않지만, 상기 암 세포 집합체의 외주면에 존재하는 기저막양 물질을 포함하는 경우도 있다.
여기서, 특별히 한정되지는 않지만, 집합체를 형성하는 암 세포는, CD133, CD44, CD166, CD117, CD24 및 ESA로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 표면 항원을 세포 표면에 갖는 경우가 많다. CD133, CD44, CD166, CD117, CD24 및 ESA는 일반적으로는 림프구 등의 백혈구, 섬유아세포, 상피 세포, 종양 세포 등의 세포에 발현하고 있는 표면 항원이다. 이들 표면 항원은 세포-세포 사이, 세포-매트릭스 사이 접착으로서의 기능 외에, 여러 가지 시그널 전달에 관련되지만, 각종 줄기 세포의 표면 마커이기도 하다.
본 발명에 있어서, 세포군이 CD133과 같은 표면 항원을 「발현한다」고 할 때에는, 세포군 속에 존재하는 세포의 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 실질적으로 전부가 표면 항원을 보이고 있는 상태를 가리킨다.
본 명세서에 있어서, 「기저막양 물질」이란, 한정되지는 않지만, 바람직하게는, 콜라겐, 라미닌, 니도겐, 헤파란황산프로테오글리칸 등의 프로테오글리칸, 피브로넥틴 등의 당단백질 중 적어도 어느 1종을 함유하는 물질을 가리킨다. 본 발명에서는 라미닌을 함유하는 기저막양 물질인 것이 바람직하다.
라미닌은 기저막을 구성하는 고분자 당단백질이다. 라미닌의 기능은 다방면에 걸치며, 예컨대 세포 접착, 세포간 신호 전달, 정상 세포 및 암 세포의 증식 등의 세포 기능에 관여하고 있다. 라미닌은 3가지의 상이한 서브유닛의 각각이 디술피드 결합으로 연결된 구조를 갖고 있으며, 각각의 서브유닛의 상이한 종류에 따라 11 종류가 발견되어 있다.
이들 중, 라미닌 5는 통상 상피 세포에서만 산생되어, 상피 세포의 기저막에의 접착이나 운동 기능을 촉진하는 활성을 갖는 성분으로서 알려져 있다. 이 라미닌 5는 α3쇄, β3쇄, γ2쇄의 각각 1가닥씩이 복합체를 형성한 구조를 지니고, 특히 γ2쇄는 LN5 고유라고 생각되며, 다른 LN 분자종에는 포함되어 있지 않다.
본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 암 세포 집합체의 외주가 이러한 기저막양 물질이 형성하는 막에 전체적으로 둘러싸인 구성을 지닐 수 있다. 이러한 형태는 암 조직 유래 세포괴의 전자현미경에 의한 관찰 혹은 기저막 구성 요소의 면역 염색 또는 그 양쪽을 조합시킴으로써 해석할 수 있다. 여기서, 암 세포의 집합체는, 순수히 암 세포 이외의 세포를 포함하지 않는 집합체인 것이 바람직하다.
라미닌의 존재는, 예컨대 라미닌을 인식하는 항체, 예컨대 시그마-알드리치사의 마우스 라미닌 유래 래빗 항체와 암 조직 유래 세포괴를 접촉시켜 항체 항원 반응을 측정함으로써 검출할 수 있다.
또한, 라미닌의 종류까지를 특정하는 특이적인 항체를 이용하는 것도 가능하다. 예컨대, 라미닌 5의 존재는, 예컨대 특히 상기한 고유의 γ2쇄 혹은 그 단편에 반응성을 갖는 항체와 암 조직 유래 세포괴를 접촉시켜, 항체의 반응을 측정함으로써 검출할 수 있다.
본 발명의 암 조직 유래 세포괴에 있어서는, 얇은 막 형상의 기저막양 물질이 덩어리의 크기에 따라, 수 ㎛ 정도, 바람직하게는 40에서 120 nm 정도 형성되어 있는 것이 바람직하지만 한정되지는 않는다.
본 발명의 암 조직 유래 세포괴의 사이즈는 한정되지는 않으며, 입경 또는 체적 평균 입경 8 ㎛∼10 ㎛ 정도의 부정형인 것도 포함되고, 또한, 배양한 후에 크게 성장한 1 mm 입경 이상인 것도 포함된다. 바람직하게는, 직경이 40 ㎛∼1000 ㎛이며, 보다 바람직하게는 40 ㎛∼250 ㎛, 더욱 바람직하게는 80 ㎛∼200 ㎛이다.
본 발명의 암 조직 유래 세포괴에서는, 특히 선반형 배열, 시트형 배열, 중층 배열 및 합포상(合胞狀) 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 배열을 갖는 경우가 많지만, 특별히 한정되지는 않는다.
본 발명의 암 조직 유래 세포괴는, 전형적으로는 생체로부터 적출한 암 조직의 세편화물을 효소 처리하는 공정; 및 효소 처리물 중, 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리를 선별 회수하는 공정을 포함하는 방법에 의해서 조제될 수 있다.
또한, 한정되지는 않지만, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 이와 같이 하여 회수한 성분을 3시간 이상 배양하는 공정을 포함하는 방법에 의해서 조제될 수 있다.
우선, 생체로부터 적출한 암 조직은 그대로 세편화할 수도 있으며, 또한, 우선, 세편화 전에 동물 세포 배양용 배지에서 유지할 수 있다. 이러한 동물 세포 배양용 배지에는, 특별히 한정되지는 않지만, 둘베코 MEM(DMEM F12 등), 이글 MEM, RPMI, Ham's F12, 알파 MEM, 이스코브 개변 둘베코 등이 포함된다. 이때에, 세포 비접착성의 배양기로 부유 배양하는 것이 바람직하다.
암 조직은 또한 세편화에 앞서서 세정하는 것도 바람직하다. 이러한 세정에는, 한정되지는 않지만, 초산 완충액(초산+초산나트륨), 인산 완충액(인산+인산나트륨), 시트르산 완충액(시트르산+시트르산나트륨), 붕산 완충액, 타르타르산 완충액, 트리스 완충액, 인산 완충 생리식염수 등의 완충액 등을 이용할 수 있다. 본 발명에서는, 특히 바람직하게는, HBSS 속에서 조직을 세정할 수 있다. 세정 횟수는 1회에서 3회가 적당하다.
세편화는 세정 후의 조직을 나이프, 가위, 커터(수동, 자동) 등으로 분할함으로써 행할 수 있다. 세편화 후의 사이즈나 형태는 특별히 한정되지 않고, 랜덤하게 행할 수 있는데, 바람직하게는 1 mm∼5 mm 사각, 보다 바람직하게는 1 mm∼2 mm 사각의 균일한 사이즈로 한다.
이어서 이와 같이 하여 얻어지는 세편화물은 효소 처리에 제공된다. 이러한 효소 처리는 콜라게나아제, 트립신, 파파인, 히알루로니다아제, C. 히스톨리티쿰 뉴트랄 프로테아제, 써모리신 및 디스파제 중의 1종 또는 이들의 2종 이상의 조합에 의한 처리일 수 있다. 효소 처리 조건은, 생리학적으로 허용되는 pH, 예컨대 약 6∼8, 바람직하게는 약 7.2∼7.6으로 완충된 등장의 염 용액, 예컨대 PBS나 행크스의 평형염 용액 중에서, 예컨대 약 20∼40℃, 바람직하게는 약 25∼39℃에서 결합 조직을 분해하기 위해서 충분한 시간, 예컨대 약 1∼180분간, 바람직하게는 30∼150분간이며, 이 때문에 충분한 농도, 예컨대 약 0.0001∼5% w/v, 바람직하게는 약 0.001%∼0.5% w/v일 수 있다.
한정되지는 않지만, 이 효소 처리의 조건은 예컨대 콜라게나아제를 포함하는 혼합 효소로 처리하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, C. 히스톨리티쿰 뉴트랄 프로테아제, 써모리신 및 디스파제로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 프로테아제; 및 콜라게나아제 I, 콜라게나아제 II 및 콜라게나아제 IV로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 콜라게나아제를 포함하는 혼합 효소로 처리하는 것이 포함된다.
이러한 혼합 효소에는, 한정되지는 않지만, 리베라제 블렌자임 1(등록상표) 등이 포함된다.
이어서 이와 같이 하여 얻어진 효소 처리물 중, 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리를 선별 회수하는 것이 바람직하다. 선별 회수 방법은 특별히 한정되지 않고, 사이즈를 분류하는 당업자에게 공지된 어느 방법이나 사용할 수 있다.
사이즈를 분류하는 방법은, 간편한 방법으로서는, 눈으로 확인, 위상차현미경에 의한 분별 혹은 체로 분별하는데, 당업자에게 이용 가능한 입자 직경에 의한 분별법이라면 특별히 한정되지 않는다. 체를 사용하는 경우는, 체 메쉬 사이즈 20 ㎛를 통과하고, 또 500 ㎛를 통과하지 않는 성분을 회수하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 체 메쉬 사이즈 40 ㎛를 통과하고, 또 250 ㎛를 통과하지 않는 성분을 회수한다.
여기서, 선별 대상이 되는 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리는 본 발명의 암 조직 유래 세포괴이며, 일정 범위의 사이즈를 갖는다. 일정 범위의 사이즈란, 체적 평균 입자 직경 8 ㎛∼10 ㎛ 정도의 작은 것도 포함되는데, 구형에 가까운 경우는, 직경 20 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하, 바람직하게는 30 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 보다 바람직하게는 40 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하, 타원 형상인 경우에는, 장경 20 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하, 바람직하게는 30 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 보다 바람직하게는 40 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하, 부정형인 경우에는, 체적 평균 입자 직경 20 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하, 바람직하게는 30 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 보다 바람직하게는 40 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하이다. 체적 평균 입자 직경의 측정에는 위상차현미경(IX70; 올림푸스사 제조)에 CCD 카메라를 부착한 것을 이용하여 입도 분포 및 입자 형상을 평가함으로써 행할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 선별 회수 성분인 분리 처리물 혹은 그 배양물의 어느 것이나 본 발명의 암 조직 유래 세포괴이다. 배양물은, 선별 회수 성분인 분리물을 짧은 시간에 배지 속에 존재한 것이라도 좋고, 예컨대, 적어도 3시간 이상, 바람직하게는 10시간 이상 36시간까지, 보다 바람직하게는 24시간∼36시간 기간 배양함으로써, 대략 구형 혹은 대략 타원구형의 형상으로 된 것이라도 좋다. 배양 시간은 36시간을 넘어 수일, 혹은 10일 이상, 13일 이상 또는 30일 이상 경과한 것이라도 좋다.
배양은 배지 속에서 장기간 그대로 행하는 것도 가능하지만, 바람직하게는, 배양 도중에 정기적으로 기계적 분할을 행함으로써 실질적으로 무한하게 증식능을 유지시킬 수도 있다.
본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 예컨대 직경 100 마이크로미터의 암 조직 유래 세포괴 10개 이하(세포 1000개 이하에 상당)라도, 이종 동물에의 이식에 있어서의 정착도가 높다. 따라서, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 마우스를 비롯한 암 모델 동물의 간편한 작성에 유용하며, 보다 엄밀한 암 조직의 검증, 약제 감수성의 평가 혹은 방사선 치료를 비롯한 치료 양태의 평가가 가능하게 된다.
본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 냉동 보존하는 것이 가능하며, 통상의 보존 상태에 있어서 그 증식능을 유지할 수 있다.
본 발명의 암 세포 응집괴는, 암 조직 유래 세포괴 또는 개체로부터 얻어지는 암 조직을 단일 세포화한 후에 그 단일 세포화물 중의 개개의 세포끼리 또는 완전히 개개의 세포로까지는 분리되지 않은 몇 개의 세포의 집합끼리, 또는 개개의 세포와 완전히 개개의 세포로까지는 분리되지 않은 몇 개의 세포가 전체로서 세포수 3개 이상으로 응집함으로써 형성되는 응집물 또는 그 배양물이며, 인비트로에 있어서 증식능을 유지할 수 있는 것이다.
여기서, 「암 조직 유래 세포괴 또는 개체로부터 얻어지는 암 조직을 단일 세포화한다」란, 암 조직 유래 세포괴 또는 얻어진 암 조직의 적어도 일부를 인비트로에 있어서 단일 세포로까지 분리시키는 처리를 실시하는 것을 말한다. 따라서, 전형적으로는, 이러한 처리 후에, 개개의 단일 세포로까지 분리한 세포가 존재하는 중에, 얼마의 세포가 개개로까지는 분리되지 않는 상태에서 혼재하는 경우도 있으며, 이러한 경우라도, 본 명세서에서 말하는 「단일 세포화한다」에 해당한다. 이때에 혼재하는 개개로까지는 분리되지 않는 상태인 것에는, 세포수 10개까지의 집합체, 바람직하게는 세포수 2∼3개의 집합체가 포함된다.
「세포수 3개 이상으로 응집」이란, 생체 내에서 발생한 암으로부터 얻어진 암 조직 또는 본 발명자들이 발견한 암 조직 유래 세포괴를 단일 세포화 처리하여 얻어진 개개의 세포끼리 또는 개개로까지는 분리되지 않은 몇 개의 세포의 집합체끼리 또는 이들의 조합끼리가 적어도 3개 혹은 그 이상의 복수의 세포를 포함하도록 모인 상태를 가리킨다.
암 조직 유래 세포괴 또는 생체 내에서 발생한 암으로부터 얻어진 암 조직을 단일 세포화 처리에 제공하는 경우는, 한정되지는 않지만, 개체로부터 얻어진 암 조직을 효소 처리하는 것이 포함된다.
효소 처리는 전형적으로는 트립신, 디스파아제 및 경우에 따라 콜라게나아제, 파파인, 히알루로니다아제, C. 히스톨리티쿰 뉴트랄 프로테아제, 써모리신 및 디스파제 중의 1종 또는 이들의 2종 이상의 조합에 의한 처리일 수 있다. 효소 처리 조건은, 생리학적으로 허용되는 pH, 예컨대 약 6∼8, 바람직하게는 약 7.2∼7.6으로 완충된 등장의 염 용액, 예컨대 PBS나 행크스의 평형염 용액 중에서, 예컨대 약 20∼40℃, 바람직하게는 약 25∼39℃에서 결합 조직을 분해하기 위해서 충분한 시간, 예컨대 약 1∼180분간, 바람직하게는 30∼150분간이며, 이 때문에 충분한 농도, 예컨대 약 0.0001∼5% w/v, 바람직하게는 약 0.001%∼0.5% w/v일 수 있다.
한정되지는 않지만, 이 효소 처리는 전형적으로는 트립신 또는 디스파아제 처리 단독이라도 좋다.
단일 세포화 처리 후에는 통상 개개로 분리된 세포를 얻을 수 있다. 단, 개개로까지 완전히 분리되지 않는 세포도 포함된다.
이러한 세포는 이대로 응집시키더라도 좋지만, 바람직하게는 예컨대 단일 세포화 처리 후 즉각 ROCK 저해제를 존재시켜 응집시킨다.
ROCK란, Rho-associated coiled-coil 키나아제(ROCK : GenBank 수탁번호 NM_005406)이며, Rho GTPase의 주된 이펙터 분자의 하나로, 다양한 생리 현상을 제어하고 있는 것이 알려져 있다(Rho 결합 키나아제라고도 함). ROCK 저해제로서는 예컨대 Y27632 등이 예시된다. 그 밖에, Fasudil(HA1077), H-1152, Wf-536(이들은 전부 와코쥰야쿠고교사로부터 입수할 수 있음) 및 이들의 유도체, 및 ROCK에 대한 안티센스 핵산, RNA 간섭 유도성 핵산이나 이들을 포함하는 벡터를 들 수 있다.
트립신 처리(예컨대 한정되지는 않지만, 0.25% 트립신-EDTA, 37℃ 5분간 처리)에 의해서 단일 세포 또는 10개 이하 세포의 집합으로까지 분리한 처리물을 응집에 앞서서 96 웰 배양 플레이트에 저밀도(예컨대 500개/0.32 ㎠, 배지 용량 0.15 ml 정도)로 파종한다. 유지 배양액 속에 곧바로 혹은 수일 배양 후에, ROCK 저해제를 1∼100 μM 정도, 바람직하게는 10 μM 정도의 농도로 첨가할 수 있다.
이러한 응집물을 인비트로에 있어서 배양할 수 있다. 배양하는 시간은 특별히 한정되지 않고, 짧은 시간이라도 배지 속에 존재시킨 것이면 된다. 이러한 배양물은 일정 기간 바람직하게는 3시간 이상 배양함으로써, 대략 구형 혹은 타원구형을 띠는 경우가 많다. 여기서의 배양물에는, 이러한 일정 기간 경과 후의 대략 구형 혹은 타원구형의 배양물도, 거기에 이를 때까지의 부정형의 배양물도 포함된다. 또한, 이러한 대략 구형 혹은 타원구형의 배양물을 더욱 분할하여 얻어지는 부정형, 추가의 배양에 의한 대략 구형물 혹은 타원구형물도 여기서 말하는 배양물이다.
본 발명의 암 세포 응집괴가 인비트로에 있어서 「증식능을 유지할 수 있다」란, 온도 37℃, 5% CO2 인큐베이터의 세포 배양 조건 하에서, 적어도 10일 이상, 바람직하게는 13일 이상, 더욱 바람직하게는 30일 이상 기간 증식능을 유지할 수 있음을 말한다.
이러한 암 세포 응집괴는, 그대로 배양을 계속하여도 10일 이상, 바람직하게는 13일 이상, 더욱 바람직하게는 30일 이상 기간에 있어서 증식능을 유지할 수 있지만, 배양 중에 정기적으로 기계적 분할을 더 행함으로써, 또는 단세포화 처리와 응집을 더 행함으로써 실질적으로 무기한으로 증식능을 유지할 수 있다.
여기서, 본 발명의 암 세포 응집괴의 배양을 위한 배지는 암 조직 유래 세포괴의 배양을 위한 배지와 마찬가지다.
본 발명의 암 세포 응집괴는 이러한 배지 및 배양 조건으로 배양할 수 있다. 또한 암 세포 응집괴의 배양에는, 그 개별의 성질에 따라, 다른 세포와의 공배양이 바람직한 경우, 혹은 호르몬과 같은 추가의 특수한 보충물의 존재가 필요한 경우도 있을 수 있다.
구체적으로는, 공배양을 피더 세포와 함께 행하더라도 좋다. 피더 세포로서는 태아 섬유아세포 등의 스트로마 세포 등을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 한정되지는 않지만, NIH3T3 등이 바람직하다.
혹은, 특정 종류의 유방암, 자궁암, 전립선암에 대해서는, 암 조직 유래 세포괴의 경우와 마찬가지로, 호르몬을 존재시켜 배양하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 유방암에 대한 에스트로겐, 자궁암에 대한 프로게스테론, 전립선암에 대한 테스토스테론 등인데, 이들에 한정되지 않고, 각종 호르몬를 첨가하여 배양 조건을 적합하게 조정할 수 있다. 또한, 이러한 호르몬의 존재에 의해서, 암 세포 응집괴의 배양 후의 거동, 예컨대 생사 상태 또는 증식 상태가 어떻게 변화되는지를 조사함으로써, 유래하는 환자의 암의 호르몬 의존성을 알아, 항호르몬약 치료의 유효성을 예측할 수 있을 가능성이 있다.
본 발명의 암 세포 응집괴는 또한 암 조직 유래 세포괴와 마찬가지로, 부유 배양으로 배양하는 것도 가능하다.
암 세포 응집괴를 구성하는 암 세포는 적어도 3개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 보다 바람직하게는 10개 이상, 더욱 바람직하게는 20개 이상이며, 그 수에 있어서 특별히 상한은 없다. 본 발명의 암 세포 응집괴가 분리물인 경우에는, 바람직하게는 1000개 이하, 보다 바람직하게는 500개 이하 정도이다. 분리물을 배양한 후의 배양물이라면, 배양에 의해서 그 수를 증가시키는 것이 가능하다. 단, 배양물이라도 바람직하게는 1만개 이하, 보다 바람직하게는 5000개 이하이다.
본 발명의 암 세포 응집괴의 사이즈는 한정되지는 않으며, 입경 또는 체적 평균 입경 8 ㎛∼10 ㎛ 정도의 부정형인 것도 포함되고, 또한, 배양한 후에 크게 성장한 1 mm 입경 이상인 것도 포함된다. 바람직하게는 직경이 40 ㎛∼1000 ㎛이며, 보다 바람직하게는 40 ㎛∼250 ㎛, 더욱 바람직하게는 80 ㎛∼200 ㎛이다.
본 발명의 암 세포 응집괴에서는, 특히 선반형 배열, 시트형 배열, 중층 배열 및 합포상 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 배열을 갖는 경우가 많은데, 특별히 한정되지는 않는다.
본 발명의 암 세포 응집괴는, 전형적으로는, 생체로부터 적출한 암 조직을 단일 세포화하는 공정; 및 이 단일 세포화물 중의 세포끼리를 세포수 3개 이상으로 응집시키는 공정을 포함하는 방법에 의해서 조제될 수 있다.
또한, 한정되지는 않지만, 본 발명의 암 세포 응집괴는 응집한 성분을 3시간 이상 배양하는 공정을 포함하는 방법에 의해서 조제될 수 있다.
우선, 본 발명의 암 세포 응집괴가 암 조직 유래 세포괴로부터 얻어지는 경우에는, 그대로 효소 처리에 제공하지만, 생체로부터 적출한 암 조직은 그대로 효소 처리에 제공함으로써 단일 세포화할 수도 있는 한편, 효소 처리에 앞서서 세편화하는 것이 바람직하다. 세편화 전에, 동물 세포 배양용 배지에서 유지할 수 있다. 이러한 동물 세포 배양용 배지에는, 특별히 한정되지는 않지만, 둘베코 MEM(DMEM F12 등), 이글 MEM, RPMI, Ham's F12, 알파 MEM, 이스코브 개변 둘베코 등이 포함된다. 이 때에, 세포 비접착성의 배양기로 부유 배양하는 것이 바람직하다.
암 조직은 또한 세편화에 앞서서 세정하는 것도 바람직하다. 이러한 세정에는, 한정되지는 않지만, 초산 완충액(초산+초산나트륨), 인산 완충액(인산+인산나트륨), 시트르산 완충액(시트르산+시트르산나트륨), 붕산 완충액, 타르타르산 완충액, 트리스 완충액, 인산 완충 생리식염수 등의 완충액 등을 이용할 수 있다. 본 발명에서는, 특히 바람직하게는 HBSS 중에서 조직의 세정을 행할 수 있다. 세정 횟수는 1회부터 3회가 적당하다.
세편화는 세정 후의 조직을 나이프, 가위, 커터(수동, 자동) 등으로 분할함으로써 행할 수 있다. 세편화 후의 사이즈나 형태는 특별히 한정되지 않고, 랜덤하게 행할 수 있는데, 바람직하게는 1 mm∼5 mm 사각, 보다 바람직하게는 1 mm∼2 mm 사각의 균일한 사이즈로 한다.
이어서 이와 같이 하여 얻어지는 세편화물은 효소 처리에 제공한다. 이러한 효소 처리는, 상술한 대로, 주로 트립신 처리일 수 있다. 효소 처리 조건은 20℃∼45℃, 수분에서 수시간일 수 있다.
이어서 이와 같이 하여 얻어진 단일 세포화물 중의 세포끼리가 세포수 3개 이상으로 응집하도록 한다. 응집에 앞서서, 바람직하게는 단일 세포화물에 신속하게 ROCK 저해제를 첨가할 수 있다.
여기서, 응집에 의해 얻어지는 3개 이상의 암 세포를 포함하는 응집물은 본 발명의 암 세포 응집괴이며, 일정 범위의 사이즈를 갖는다. 일정 범위의 사이즈란, 체적 평균 입자 직경 8 ㎛∼10 ㎛ 정도의 작은 것도 포함되는데, 구형에 가까운 경우는, 직경 20 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하, 바람직하게는 30 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 보다 바람직하게는 40 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하, 타원 형상인 경우에는, 장경 20 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하, 바람직하게는 30 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 보다 바람직하게는 40 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하, 부정형인 경우에는, 체적 평균 입자 직경 20 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하, 바람직하게는 30 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 보다 바람직하게는 40 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하이다. 체적 평균 입자 직경의 측정에는 위상차현미경(IX70; 올림푸스사 제조)에 CCD 카메라를 부착한 것을 이용하여 입도 분포 및 입자 형상을 평가함으로써 행할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 응집물 또는 그 배양물의 어느 것이나 본 발명의 암 세포 응집괴이다. 배양물은, 선별 회수 성분인 분리물을 짧은 시간에 배지 중에 존재시킨 것이라도 좋고, 예컨대 적어도 3시간 이상, 바람직하게는 10시간 이상 36시간까지, 보다 바람직하게는 24시간∼36시간 기간 배양함으로써, 대략 구형 혹은 대략 타원구형의 형상으로 된 것이라도 좋다. 배양 시간은 36시간을 넘어 수일 혹은 10일 이상, 13일 이상 또는 30일 이상 경과한 것이라도 좋다.
배양은 배지 중에서 장기간 그대로 행하는 것도 가능하지만, 바람직하게는 배양 도중에 정기적으로 기계적 분할을 행함으로써, 실질적으로 무한하게 증식능을 유지시킬 수도 있다.
더욱이, 본 발명의 암 세포 응집괴는, 예컨대 직경 100 마이크로미터의 암 세포 응집괴 10개 이하(세포 1000개 이하에 상당)라도, 이종 동물에의 이식에 있어서의 정착도가 높다. 따라서, 본 발명의 암 세포 응집괴는 마우스를 비롯한 암 모델 동물의 간편한 작성에 유용하며, 보다 엄밀한 암 조직의 검증, 약제 감수성의 평가 혹은 방사선 치료를 비롯한 치료 양태의 평가가 가능하게 된다.
본 발명의 암 세포 응집괴는 냉동 보존하는 것이 가능하며, 통상의 보존 상태에 있어서 그 증식능을 유지할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴는, 인비트로에 있어서, 생체 내의 암 조직과 같은 거동을 보이고, 안정적으로 배양할 수 있으며, 더구나 증식능을 유지한다.
이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴는, 인비트로에 있어서, 생체 내의 암 조직과 같은 거동을 보이고, 안정적으로 배양할 수 있으며, 더구나 증식능을 유지한다. 또한, 생체 유래의 암 세포 이외의 세포나 결합 조직 등, 암 세포 이외의 쓸데없는 협잡물의 비율이 매우 적거나 거의 없다. 따라서, 면역요법에 매우 적합하게 이용된다.
본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴는 냉동 보존하는 것이 가능하며, 통상의 보존 상태에 있어서 그 증식능을 유지할 수 있다. 따라서, 면역요법의 효과를 경시적으로 측정하는 데에도 적합하게 이용할 수 있다.
암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 면역요법에 이용하는 구체적인 양태로서는, 예컨대 이들을 화학 처리하여 암 치료용 조성물을 조제하는 경우가 있다. 여기서, 화학 처리에는 포르말린 처리, 효소 처리 등을 들 수 있다. 혹은 광선 역학적인 처리를 실시함으로써, 암 치료용 조성물을 조제할 수 있다. 이러한 광선 역학적인 처리에는 방사선 조사 처리나 자외선 조사 처리를 들 수 있다.
예컨대, 효소 처리하는 경우에 있어서는, 일단 형성된 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 트립신 처리(예컨대 37℃ 60분)하여, 완전히 단일 세포로까지 분리하고, 잠시 이 상태로 방치한다. 이에 따라 단일 세포로까지 분리된 세포는 아포토시스를 일으켜 사멸하지만, 이 세포에 포함되어 있었던 펩티드 등은 항원 제시 세포의 표적이 될 수 있다.
예컨대, 방사선 처리하는 경우에는, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴의 아포토시스를 재촉할 수 있는 양까지의 방사선을 조사하여 세포의 아포토시스를 재촉한다.
이와 같이 하여 얻어진 암 치료용 조성물을 환자에게 직접 투여한다. 투여 방법은 경구라도 좋지만, 바람직하게는 주사 등의 비경구 투여이다. 면역성 증강을 위해, 면역 아쥬반트와 함께 투여하는 것도 바람직하다. 장을 통한 흡수를 동반하지 않고서 조성물이 대상에 흡수되는 모든 형식의 투여가 포함된다. 예시적인 비경구 투여에는 근육내 투여, 정맥내 투여, 복강내 투여, 종양내 투여, 안내 투여 또는 관절내 투여 등이 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
투여할 때의 제제는, 일정량의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴 또는 그 분해물을 분산제(예컨대, 폴리솔베이트 80, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 폴리에틸렌글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산나트륨 등), 보존제(예컨대, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤질알코올, 클로로부탄올, 페놀 등), 등장화제(예컨대, 염화나트륨, 글리세린, D-만니톨, 글루코오스 등) 등과 함께 수성 용제(예컨대, 주사용 증류수, 생리적 식염수, 링거액 등) 혹은 유성 용제(예컨대, 올리브유, 참깨유, 면실유, 옥수수유 등의 식물유, 프로필렌글리콜 등) 등에 용해, 현탁 혹은 유화함으로써 제조된다. 이때, 원하는 바에 따라 용해 보조제(예컨대, 살리실산나트륨, 초산나트륨 등), 안정제(예컨대, 인간 혈청 알부민 등), 무통화제(예컨대, 벤질알코올 등) 등의 첨가물을 이용하더라도 좋다. 추가로 필요에 따라 항산화제, 착색제 등이나 다른 첨가제를 함유시켜도 좋다.
또한, 「약학적으로 허용되는 담체」를 이용할 수도 있다. 이러한 물질로서는 액상 제제에 있어서의 용제, 용해 보조제, 현탁화제, 등장화제, 완충제, 무통화제 등을 들 수 있다. 또한, 필요에 따라서 방부제, 항산화제, 흡착제, 겔화제 등의 제제 첨가물을 통상의 방법에 따라 이용할 수도 있다.
「항산화제」의 바람직한 예로서는 예컨대 아황산염, 아스코르빈산 등을 들 수 있다. 「등장화제」의 바람직한 예로서는 예컨대 글루코오스, 염화나트륨, 글리세린, D-만니톨 등을 들 수 있다.
「용해 보조제」의 바람직한 예로서는 예컨대 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, D-만니톨, 안식향산벤질, 에탄올, 트리스아미노메탄, 콜레스테롤, 트리에탄올아민, 탄산나트륨, 시트르산나트륨 등을 들 수 있다.
「용제」의 바람직한 예로서는 예컨대 주사용수, 알코올, 프로필렌글리콜, 매크로골 등이 이용된다.
「현탁화제」의 바람직한 예로서는 예컨대 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 친수성 고분자 등을 예시할 수 있다.
「계면활성제」로서는 예컨대 라우릴황산나트륨, 라우릴아미노프로피온산, 레시틴, 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 모노스테아린산글리세린 등을 들 수 있다.
「무통화제」의 바람직한 예로서는 예컨대 벤질알코올 등을 들 수 있다.
「보존제」의 바람직한 예로서는 예컨대 파라옥시안식향산에스테르류, 클로로부탄올, 벤질알코올, 펜에틸알코올, 데히드로초산, 소르브산 등을 들 수 있다.
혹은 이와 같이 하여 얻어진 암 치료용 조성물을 환자로부터 채취한 혈액에 포함되는 혈액 유래 세포와 함께 인큐베이트하여, 그 결과 활성화된 혈액 유래 세포를 재차 환자의 체내로 되돌릴 수도 있다. 혹은, 인간 T 세포는 인비트로로 전술한 수상 세포와 함께 배양되고, 그리고 계속해서 인비트로로 활성화된 T 세포는 그것이 필요한 암환자에게 투여된다.
이때, 혈액에 포함되는 혈액 유래 세포를 단리하기 위해서는 예컨대 채혈한 혈액으로부터 자기비드법 등의 공지의 방법을 이용할 수 있다.
보다 구체적으로는, 예컨대 혈액에 포함되는 혈액 유래 세포는 T 림프구이며, 세포 상해성 T 림프구를 유도하는 방법으로서, 적어도 주요 조직 적합 항원(MHC) 클래스 I과 보조 자극 분자를 발현하는 세포(예컨대 수상 세포)를 본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴와 접촉시키고, 그 후, 림프구와 공배양하는 것이 가능하다. 또는, 림프구와의 공배양은 수상 세포와 본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴 혹은 이들을 처리한 조성물을 접촉시키면서 행하는 것이 가능하다.
체내로 되돌리는 경우의 투여 방법은 바람직하게는 주사 등의 비경구 투여이다. 장을 통한 흡수를 동반하지 않고서 조성물이 대상에 흡수되는 모든 형식의 투여가 포함된다. 예시적인 비경구 투여에는 근육내 투여, 정맥내 투여, 복강내 투여, 종양내 투여, 안내 투여 또는 관절내 투여 등이 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴는 면역요법이 실시된 환자의 면역요법 효과 평가 방법에 이용할 수 있다.
즉, 이 평가 방법에 있어서는, 면역요법이 실시된 환자 유래의 혈액 유래 세포를 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴와 접촉시킨다. 여기서, 전형적으로는 이 혈액 유래 세포의 세포 장해성을 측정함으로써 평가가 가능하다. 바람직하게는, 혈액 유래 세포는 단리된 세포 상해성 T 세포이다. 혹은, 만일 면역요법이 항체를 이용한 요법인 경우라면, 내추럴 킬러 세포이다. 항체를 이용한 요법을 평가하는 경우에는, 또한 이 접촉 공정에 있어서 치료에 이용한 항체를 공존시키는 것이 바람직하다.
보다 상세하게는, 예컨대 51-크롬을 실은 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 표적으로서 이용하여 인비트로 세포 장해 활성에 관해서 측정을 하는 것이 가능하다.
면역요법이 실시된 환자가 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 이용한 면역요법이 실시된 환자이고, 이 환자 유래의 혈액 유래 세포가, 면역요법이 실시되고나서의 경과 시간을 여러 가지로 변경하여 회수된 복수의 시료로서 제공되는 것도 바람직하다.
특히 본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴는 냉장 또는 냉동 보존한 후에 있어서도 그 증식능과 생존이 양호하게 유지되기 때문에, 필요할 때에 필요한 만큼만 면역요법 효과를 측정할 수 있다.
실시예
이하에, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다. 한편, 각 예 중의 부 및 %는 모두 중량 기준이다. 이하에 특별히 규정이 없는 배양 조건은 전부 37℃ 5% CO2 인큐베이터 조건 하이다. 원심 분리 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 4℃, 1000 rpm, 5분이다.
(실시예 1)
(마우스 대장암 이식 종양으로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)
마우스 대장암 이식 종양을 다음과 같이 이종 이식법으로 제작했다.
우선, 무균 조작 하에서 인간 종양(대장암)의 수술 적출 표본을 약 2 mm 입방으로 세절한다. 이어서 중증 면역 부전 마우스(누드 마우스, 바람직하게는 NOD/SCID 마우스)의 등부위에 약 5 mm의 소절개를 가하여 피하 조직을 박리한다. 준비한 종양편을 피하에 삽입한 후, 피부 봉합 클립으로 절개부를 봉합한다. 일부의 이식 종양은 약 14일 후부터 3개월 후에 피하 종양으로서 관찰된다.
얻어진 대장암 마우스를 SPF(specific pathogen free) 사육 조건으로 사육하여 종양이 1 cm 크기로 된 시점에서 종양을 적출하여, 20 ml의 DMEM(Gibco; 11965-092)+1% Pen Strep(Gibco; 15140-022)(모두 최종 농도로서 100 units/ml 페니실린, 100 ㎍/ml)을 넣은 50 ml 원심 분리용 튜브(IWAKI; 2345-050)에 회수했다.
이어서 20 ml HBSS(Gibco; 14025-092)를 넣어, 전도 혼화에 의해 종양을 세정했다. 이어서 새로운 HBSS를 20 ml 넣어, 이 조작을 2회 반복하고, 종양 조직을 10 cm 조직 배양용 디쉬(조직 배양 디쉬)(IWAKI; 3020-100)로 옮겼다. 이 배양 디쉬 상에서 수술용 나이프를 이용하여 괴사 조직을 제거했다.
괴사 조직을 제거한 종양편을 HBSS 30 ml를 넣은 새로운 10 cm 디쉬로 옮겼다. 이어서, 수술용 나이프를 이용하여 종양편을 약 2 mm 사각으로 세편화했다.
HBSS마다 종양 세편을 새로운 50 ml 원심 분리용 튜브로 옮긴 후, 원심 분리를 하여 상청을 버리고, 20 ml HBSS로 전도 혼화에 의해 세정했다.
원심 분리 및 세정을 반복했다. 그 후, 20 ml의 DMEM+1% Pen Strep+0.28 U/ml(최종 농도) Blendzyme 1(Roche; 11988417001)을 넣어 혼화했다. 이것을 100 ml의 삼각 플라스크로 옮겨, 37℃ 항온조 내에서, 스터러를 저속으로 회전하면서 2시간, 리베라제 블렌자임 1(로쉐 다이아그노스틱스사 제조)로 처리했다.
이어서, 효소 처리물을 50 ml 원심 분리용 튜브에 회수하여 원심 분리하여, 상청을 버리고, 20 ml HBSS를 넣어 혼화했다. 스테인리스 메쉬(500 ㎛)에 통과시키고, 필터를 통과한 성분을 50 ml 원심 분리용 튜브에 회수하고, 원심 분리 조작을 더 실시했다. 상청을 버리고, 1 mg/ml DNaseI 용액(Roche; 1284932)(10 mg/ml 스톡100 μl+PBS 900 μl)을 넣어 혼화하여, 4℃에서 5분 정치하고, 또한 20 ml HBSS를 가하여 혼화한 후, 원심 분리를 하여 상청을 버렸다. 20 ml HBSS와 혼화한 후, 500-250-100 ㎛로 단계적으로 체에 거르고, 이어서 40 ㎛ 셀 스트레이너(BD; 352340)에 통과시켰다. HBSS 30 ml를 넣은 10 cm 조직 배양용 디쉬(조직 배양 디쉬)에 셀 스트레이너를 침지하여 가볍게 흔들어, 단세포, 40 ㎛ 이하의 소세포괴 및 부스러기를 제거했다. HBSS 30 ml를 넣은 별도의 10 cm 조직 배양용 디쉬(조직 배양 디쉬)에 셀 스트레이너를 옮기고, 셀 스트레이너에 포착된 세포괴를 피펫팅에 의해 회수했다.
또한, 상기와 같은 원심 분리 조작을 수회 행하여, 얻어진 성분에 4 ml StemPro hESC SFM(Gibco; A10007-01)+8 ng/ml bFGF(Invitrogen; 13256-029)+0.1 mM 2-머캅토에탄올(Wako; 137-06862)+1% PenStrep+25 ㎍/ml 앰포테리신(Amphotericin) B(Wako; 541-01961)를 넣어 혼화하여, 6cm 비처리 디쉬(non-treated dish)(EIKEN CHEMICAL; AG2000)로 옮겼다.
이것을 37℃에서 5% CO2 인큐베이터(산요사 제조 MCO-17 AIC)에서 36시간 배양했다.
이 결과, 도 1에 도시하는 것과 같이, 시간의 경과와 함께, 부정형에서 가지런해진 구형으로 변화되고, 적어도 3∼6시간 후에는 대략 구형이며, 24시간 후에는 완전히 가지런해진 구형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.
(실시예 2)
(인간 대장암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)
대장암 수술 검체를 이용한 것 이외에는, 실시예 1과 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 도 4에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 공 형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.
(실시예 3)
(인간 난소암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)
난소암 수술 검체를 이용한 것 이외에는, 실시예 2와 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 도 4에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 구형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.
(실시예 4)
(인간 췌장암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)
췌장암 수술 검체를 이용한 것 이외에는, 실시예 2와 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 도 4에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 공 형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.
(실시예 5)
(인간 소세포암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)
폐암의 일종인 소세포암 수술 검체를 이용한 것 이외에는, 실시예 2와 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 도 4에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 공 형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.
(실시예 6)
(인간 신장암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)
신장암 수술 검체를 이용한 것 이외에는, 실시예 2와 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 도 4에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 공 형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.
(실시예 7)
(인간 방광암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)
방광암 수술 검체를 이용한 것 이외에는, 실시예 2와 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 도 4에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 공 형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.
(실시예 8)
(인간 유방암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)
유방암 수술 검체를 이용한 것 이외에는, 실시예 2와 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 도 4에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 공 형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.
(실시예 9)
(인간 전립선암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)
전립선암 수술 검체를 이용한 것 이외에는, 실시예 2와 같은 식으로 하여 조직 유래 세포괴를 취득했다. 배양 배지에 10-8 몰/L 농도의 디히드로테스토스테론(DHT)을 첨가하여 실시예 1과 같은 식으로 배양했다. 이 결과, 도 4에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 공 형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.
(실시예 10)
(인간 인두암 수술 검체로부터의 암 조직 유래 세포괴의 조제)
인두암 수술 검체를 이용한 것 이외에는, 실시예 2와 같은 식으로 하여 암 조직 유래 세포괴를 취득했다. 이 결과, 도 4에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 공 형상의 암 조직 유래 세포괴를 얻을 수 있었다.
(실시예 11)
실시예 2에서 얻어지고, 도 4에 도시하는 배양 중의 암 조직 유래 세포괴를 배양 후 24시간에 배지와 함께 5 ml 빼내어, 1000 rpm, 4℃에서 원심 분리하여 상청을 버렸다. 회수한 암 조직 유래 세포괴를 셀 뱅커(BLC-1, 미쓰비시가가쿠메디슨사 제조)에 현탁하고, 또한, 10 μM의 Y27632(와코쥰야쿠고교사 제조)를 가하고, 냉동 보존 튜브(Cryogenic vials 2.0 ml, Nalge Nunc사 제조)로 옮겨, -80℃ 딥프리저에서 보존했다.
보존 후 7일 경과 후, 37℃의 워터 배스에서 단시간 다시 따뜻하게 했다. 이것을 PBS에 현탁하고, 또한 1000 rpm, 4℃에서 원심 분리하여 상청을 버렸다. 얻어진 침전물을 StemPro(인비트로사 제조)에 현탁하여 배양했다. 도 5에 도시하는 것과 같이, 융해 후 24시간의 세포 상태는 양호했다.
또한, 얻어진 암 조직 유래 세포괴의 생존을 약 1000개의 세포를 포함하는 덩어리로서 NOD-SCID 마우스에게 이식함으로써 확인했다.
(실시예 12)
(암 조직 유래 세포괴로부터의 암 세포 응집괴의 조제)
실시예 2와 같은 방법으로 얻어진 암 조직 유래 세포괴를 이용하여 이하의 처리를 실시했다. 우선, 24 웰 플레이트(미처리의 디쉬) 중앙에 콜라겐 겔(Cell Matrix type I-A : 5xDMEM : 겔 재구성용 완충액=7:2:1) 50 μL/well을 깔았다. 37℃, 30분 정치하여 콜라겐 겔을 고화시켰다. 부유 배양의 암 조직 유래 세포괴를(웰당 100개), 1.5 mL 튜브에 회수한다. 이것을 5초 정도 원심 분리하여 상청을 제거했다. 암 조직 유래 세포괴를 콜라게나아제 겔(웰당 30 μL)로 현탁하고, 미리 고화시킨 겔 위에 30 μL씩 얹었다. 37℃, 30분 정치하여 고화시키고, StemPro(EGF 50 ng/mL) 600 μL/웰씩 넣었다. 2∼3일에 한 번 배지를 교환하면서 10일간 배양했다.
이어서, 배지를 1 mL/well의 DMEM(Gibco; 11965-092, 콜라게나아제 IV 200 mg/mL 포함함)로 교환하여, 37℃, 5시간 정도 배양했다.
배양 후, 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮겨, 원심 분리(약 5초)하여 상청을 제거하고, 1 mL의 PBS를 가하여 현탁하여, 원심 분리(치비탄, 약 5초) 후 상청 제거를 2회 반복했다. 트립신(Trypsin)/EDTA(0.05%)를 1 mL 가하여 현탁하고, 37℃에서 8분 정치했다. 수회 현탁하여 암 조직 유래 세포괴와 같은 큰 덩어리가 없어졌음을 확인했다. 이것을 15 mL 튜브로 옮기고, 2 mL의 DMEM(Gibco; 11965-092)를 가하여 현탁했다.
이어서, 현탁액을 원심 분리(1000 rpm, 5분)하여 상청을 제거했다. 2 mL의 StemPro(EGF 50 ng/mL, Y-27632 10 μM)로 현탁하여, φ35 mm 비처리 디쉬(Iwaki: 1000-035)로 옮겼다. 이것을 37℃에서 밤새 배양했다.
12시간 경과 후, 직경 40 ㎛ 정도의 암 조직 유래 세포괴 형성을 확인했다. 배지를 StemPro(EGF 50 ng/mL)로 교환했다.
이 결과, 도 6에 도시하는 것과 같이, 4일 후에는 완전히 가지런해진 공 형상의 암 세포 응집괴를 얻을 수 있었다.
(실시예 13)
(인간 대장암 수술 검체로부터의 암 세포 응집괴의 조제)
대장암 수술 검체를 이용한 것 이외에는, 실시예 12와 같은 식으로 하여 암 세포 응집괴를 취득했다. 이 결과, 도 7에 도시하는 것과 같이, 적어도 12시간 후에는 도 1과 같은 거의 공 형상의 암 세포 응집괴를 얻을 수 있었다.
(실시예 14)
실시예 2와 같은 방법으로 얻어진 암 조직 유래 세포괴의 세포 보존을 행했다. 암 조직 유래 세포괴를 실시예 14와 같은 방법으로 트립신 처리하여 단세포화 처리를 했다. 동결 보존액은 셀 뱅커 1(쥬지필드사)에 Y-27632를 첨가한 것을 이용했다.
단세포화하여 10일간 동결 보존한 것을 그 후 37℃의 워터 배스에서 단시간 다시 따뜻하게 했다. 이것을 PBS에 현탁하고, 또한 1000 rpm, 4℃에서 원심 분리하여 상청을 버렸다. 얻어진 침전물을 StemPro(인비트로사 제조)에 현탁하여 배양했다. 도 8에 도시하는 것과 같이, 융해 후 24시간의 세포 상태는 양호하고, 융해 후에 암 조직 유래 세포괴를 재형성했다.
(실시예 15)
본 발명의 암 조직 유래 세포괴를 이용한 면역요법을 검토한다. 실시예 2 및 12과 같은 식으로 하여 얻어진 암 조직 유래 세포괴와 암 세포 응집괴를 각각 트립신 처리한다(37℃ 5분). 얻어진 처리물은 단일 세포를 많이 포함하며, 이것을 24시간 방치하면, 세포가 사멸한다. 실시예 2에서 얻어진 암 조직 유래 세포괴를 트립신 처리(37℃ 5분)한 후, 아넥신(Annexin)-V와 PI에 의한 이중 염색을 플로우 사이토미터로 해석했다. 미처리의 암 조직 유래 세포괴에 대해서는 24시간 배양하여, 해석 직전에 트립신에 의해 분해했다(완전한(intact) CTOS). 분해한 암 조직 유래 세포괴에 대해서는, 암 조직 유래 세포괴를 우선 단세포로까지 분리하여 배양한 후, 해석했다(분리된(dissociated) CTOS). 이 결과를 도 9에 도시한다. 또한 이 염색 결과의 비율을 그래프화했다(도 10). 아넥신(Annexin)-V와 PI로 이중 염색된 것을 흑, 아넥신(Annexin)-V로 단독으로 염색된 것을 회색, 양자 모두 염색되지 않은 것을 백으로 나타내고 있다. 이 결과, 처리한 암 조직 유래 세포괴에서는 순조롭게 아포토시스가 진행되고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 카스파제(caspase)-3, 절단된 카스파제-3(cl-casp-3)과 PARP의 웨스턴블로팅으로 아포토시스의 유도를 확인했다(도 11). 배양은 도 11에 표시한 시간 행하고, 그 후 해석했다.
이어서, 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴 트립신 처리물을 증류수 2 ml에 현탁하고, 이것에 0.22 미크론의 구멍 직경을 갖는 필터를 통과시켜 제균한 20 mg/ml 농도의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(이후 「EDC」라고 약기함) 용액을 0.8 mg/ml가 되도록 첨가한다. 이것을 25℃에서 15분간 보존하고, 또한 무균의 2 ml의 0.1 M 글리신 용액을 첨가한다. 25℃에서 30분간 보존 후, 생리식염수를 가하여 백신용 원료액을 조제한다.
이와 같이 하여 얻어진 백신용 원료액과 아쥬반트로서 시판되고 있는 TiterMax Gold(CytRX, Atlanta, Norcross, GA)를 혼합하여 종양 백신으로 한다.
얻어진 백신을, 유래하는 암환자에게 재발 방지 조치로서 혹은 재발 후의 치료로서 1 ml 주사한다. 7일 후 또 주사를 한다. 정기적으로 모니터하여, 암의 재발이 없음을 또는 재발 후의 종양의 크기를 확인함으로써 치료의 효과를 조사한다.
(실시예 16)
면역요법이 실시된 대장암 환자에 대해서 정기적으로 모니터하여 면역요법의 효과를 평가한다. 구체적으로는, 일반적 면역요법(예컨대 WT1 펩티드 요법)을 실시한 환자의 혈액을 채취하여, 그 세포 장해성 T 세포를 CD8 양성을 표적으로 하여 회수한다. 환자 유래의 CD8 양성 T 세포가 본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 장해할 수 있는지를 검토한다. 실시예 2와 같은 식으로 하여 얻어진 상기 환자의 대장암 유래의 암 조직 유래 세포괴를 50 ml들이의 원심 튜브에 모아, 100 μCi의 크롬 51을 가하여 37℃에서 2시간 인큐베이트한다. 그 후 10% 인간 AB 혈청을 포함하는 AIM-V 배지로 3회 세정하여, 96 구멍 V 바닥 플레이트 1 구멍당 100 μl씩 첨가한다. 이것에 10% 인간 AB 혈청을 포함하는 AIM-V 배지로 현탁된 105개의 CD8 양성 T 세포(면역요법 기간의 복수 회에 걸쳐 채취된 것)를 각각 첨가하여, 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 4시간 배양한다. 배양 후, 장해를 받은 종양 세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크롬 51의 양을 측정함으로써, 면역요법을 받은 환자의 CD8 양성 T 세포의 세포 장해 활성을 산출할 수 있다.
실시예 등에 있어서의 평가 항목은 하기와 같이 하여 측정했다.
<기저막양 물질의 확인>
실시예 1에서 얻어진 암 조직 유래 세포괴를 온도 37℃, 5% CO2 인큐베이터의 배양 조건 하에서, STEMPRO 인간 ES 세포용 무혈청 배지(Gibco) 1 cc로 3일간 배양을 했다. 이것을 포르말린 고정 후 파라핀 포매하고, 얇게 잘라 항라미닌 항체 염색(시그마-알드리치사 제조, 마우스 라미닌 유래 래빗 항체)을 제조원의 지시서에 따라서 행한 바, 암 조직 유래 세포괴의 외주 및 외주에 가까운 세포의 세포질 내에 라미닌의 항원성이 관찰되었다. 이에 따라, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴는 암 세포 집합체의 주변을 라미닌이 둘러싸고 있음이 판명되었다. 한편, 수술 검체 처리 후 24시간에는 라미닌의 발현은 확인할 수 없었다.
<저산소의 검지>
피모니다졸을 이용한 저산소 검지의 예
니트로이미다졸계 화합물 피모니다졸은 산소 비존재 하에서는 단백이나 핵산과 부가물(Adduct)을 형성하는 특성을 갖는다. 저산소 하에서 피모니다졸 처리된 조직의 저산소 영역은 피모니다졸을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 인식할 수 있다. 암 조직에서는 혈관으로부터 약 100 마이크로미터 떨어지면 저산소 영역이 출현하는데, 실시예 1에서 얻어진 암 조직 유래 세포괴에서도 외연부에서 약 100 마이크로미터를 경계로 하여 내부는 저산소 영역이며, 광범위한 세포사가 관찰되었다.
<인비트로에서의 증식능의 평가>
인비트로에 있어서의 암 조직 유래 세포괴의 증식능은 다음과 같이 하여 검증했다. 실시예 1에서 얻어진 암 조직 유래 세포괴를 콜라겐 겔(CellMatrix type IA(Nitta Gelatin) : 5x DMEM(Gibco; 12100-038) : 겔 재구성용 완충액(50 mM NaOH, 260 mM NaHCO3, 200 mM HEPES)=7:2:1)에 ×10개씩 포매하여, 온도 37℃, 5% CO2 인큐베이터의 배양 조건 하에서, STEMPRO 인간 ES 세포용 무혈청 배지(Gibco) 1 cc로 배양을 했다. 정기적으로 세포의 상태를 관찰하여, CCD 카메라를 장착한 위상차현미경(배율 40배)으로 크기를 측정했다. 그 결과, 기계적 분할 없이, 적어도 13일간 증식능을 유지할 수 있었다. 또한, 13일째에 기계적 분할을 행한 바, 또한 적어도 13일간 증식능을 더 유지하고 있음이 확인되었다(도 2). 한편, 기계적 분할은 직경 500 마이크로미터의 암 조직 유래 세포괴를 안과용 첨도로 4 분할함으로써 행했다.
<세포수의 확인>
실시예 1과 같은 방법으로, 100에서부터 250 ㎛의 암 조직 유래 세포괴를 트립신 0.25%, EDTA 2.6 mM로 3분간 처리하여, 약 30회 피펫팅으로 기계적으로 분해했다. 이것을 96 웰 배양 플레이트 1 웰에 1개의 비율로 세포가 들어가도록 희석하여 분주했다. 단세포화되어 있지 않은 세포괴에 대해서는 구성하는 세포수를 카운트하여 기록했다. 그 후 배양(위와 같은 조건)하고, 각 웰의 세포수의 증가를 기록하여 30일간 배양 관찰했다. 그 결과, 8개의 세포가 있으면, 세포괴가 성장할 수 있음이 확인되었다.
<이종 동물에의 이식 시험>
실시예 2에서 얻어진 본 발명의 3일간 배양한 직경 약 100 마이크로미터의 암 조직 유래 세포괴 ×10개를 Matrigel(BD사)에 현탁하여, NOD-SCID 마우스의 등 피하에 투여 이식했다. 종양 형성의 평가는 경시적으로 종양의 사이즈를 계측함으로써 행했다. 그 결과, 본 발명의 실시예 2의 암 조직 유래 세포괴를 이식한 마우스 개체에는 현저한 종양 형성이 인정되고, 본 발명의 암 조직 유래 세포괴가 높은 종양 형성능을 갖는 것이 확인되었다. 이 조직을 해석하면, 마우스에게 이식하여 형성된 종양과, 생체 내에 존재하고 있었던 종양에서 유사한 조직형이 얻어지고 있음을 알 수 있었다(도 3).
산업상 이용가능성
본 발명의 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴는, 인비트로에 있어서, 배양 가능한 상태로 동결 보존하는 것이 가능하고, 특히 면역요법의 용도로, 항원 펩티드 제공을 위해 사용할 수 있다. 또한, 면역요법의 효과를 측정하기 위한 평가의 툴로서도 이용할 수 있다.
Claims (18)
- 개체로부터 얻어진 암 조직으로부터 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리로서 분리 처리된 분리물의 배양물로서, 대략 구형 혹은 타원구형을 띠고, 인비트로에 있어서 증식능을 유지할 수 있으며, 암 세포 이외의 세포를 실질적으로 포함하지 않는 암 조직 유래 세포괴를 복수 포함하고, 배양물로서도 암 세포 이외의 세포를 실질적으로 포함하지 않는 배양물을 처리함으로써 얻어지는 암 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 처리가 화학 처리인 암 치료용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 화학 처리가 효소 처리 또는 포르말린 처리인 암 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 처리가 광선 역학 처리인 암 치료용 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 처리가 방사선 처리인 암 치료용 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 유래하는 환자에게 경구 투여 또는 비경구 투여하기 위한 암 백신인 암 치료용 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 환자 유래의 혈액으로부터 얻어진 혈액 유래 세포에 인비트로에 있어서 접촉시키기 위한 것인 암 치료용 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 혈액이 말초혈인 암 치료용 조성물.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 혈액 유래 세포가 단구로부터 유도되는 수상 세포인 암 치료용 조성물.
- 환자 유래의 혈액으로부터 회수된 혈액 유래 세포와 상기 환자 유래의 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 기재한 암 치료용 조성물을 접촉시키는 공정; 및 접촉에 의해 활성화된 혈액 유래 세포를 회수하는 공정을 포함하는 상기 환자에게 접종되기 위한 면역요법제의 제조 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 혈액이 말초혈인 면역요법제의 제조 방법.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 혈액 유래 세포가 단구이며, 단구를 수상 세포로 유도하는 공정을 더 포함하는 면역요법제의 제조 방법.
- 면역요법의 효과를 평가하는 방법으로서,
개체로부터 얻어진 암 조직으로부터 3개 이상의 암 세포를 포함하는 덩어리로서 분리 처리된 분리물의 배양물로서, 대략 구형 혹은 타원구형을 띠고, 인비트로에 있어서 증식능을 유지할 수 있으며, 암 세포 이외의 세포를 실질적으로 포함하지 않는 암 조직 유래 세포괴를 복수 포함하고, 배양물로서도 암 세포 이외의 세포를 실질적으로 포함하지 않는 배양물과, 면역요법이 실시된 환자 유래의 혈액 유래 세포를 접촉시키는 공정을 포함하는 면역요법 효과 평가 방법. - 제13항에 있어서, 상기 혈액 유래 세포의 세포 장해성을 측정하는 공정을 더 포함하는 면역요법 효과 평가 방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 혈액 유래 세포가 단리된 세포 상해성 T 세포인 면역요법 효과 평가 방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 혈액 유래 세포가 단리된 내추럴 킬러 세포이며, 상기 접촉시키는 공정이 또한 항체를 공존시키는 면역요법 효과 평가 방법.
- 제13항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 면역요법이 실시된 환자가 암 조직 유래 세포괴 또는 암 세포 응집괴를 이용한 면역요법이 실시된 환자이며, 상기 환자 유래의 혈액 유래 세포가 면역요법이 실시되고나서의 경과 시간을 변경하여 회수한 복수의 시료로서 제공되는 것인 면역요법 효과 평가 방법.
- 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 10개 이상의 상기 암 세포 응집괴를 포함하는 배양물을 처리함으로써 얻어지는 암 치료용 조성물.
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