KR20160006167A - 상피 줄기 세포 확장 및 배양을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

상피 줄기 세포 및 오가노이드 배양을 위한 세포 배양 용액 및 시스템, 상피 작제물의 형성 및 이식에서의 이의 용도가 기재된다. 활발히 자가-재생하고, 선와 및 융모로 조직화되는 상피 세포의 단일 층이 장을 덮는다. 장 상피의 재생이 상기 선와의 기부에 존재하는 Lgr5+ 장 줄기 세포(ISC)에 의해 유도된다는 것이 최근에 밝혀졌다(Barker et al., 2007). Lgr5+ 줄기 세포는 분리될 수 있고, 자연 장 상피를 발생 반복시키는 선와-융모 구조를 함유하는 오가노이드를 형성시키기 위해 시험관 내에서 배양될 수 있다(Sato et al., 2009).

Description

상피 줄기 세포 확장 및 배양을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR EPITHELIAL STEM CELL EXPANSION AND CULTURE}
관련 출원의 전후-참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에서 2013년 3월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 61/783,245호의 이익을 주장하며, 상기 출원의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다.
정부 지원
본 연구는 국립 치과 두개안면 연구소(National Institute of Dental and Craniofacial Research) 조성금 번호 DE013023에 의해 후원되었다. 미국 정부는 본 발명에 대한 특정한 권리를 가질 수 있다.
발명의 배경
활발히 자가-재생하고, 선와(crypt) 및 융모(villi)로 조직화되는 상피 세포의 단일 층이 장을 덮고 있다. 장 상피의 재생이 상기 선와의 기부에 존재하는 Lgr5+ 장 줄기 세포(ISC)에 의해 유도된다는 것이 최근에 밝혀졌다(Barker et al., 2007). Lgr5+ 줄기 세포는 분리될 수 있고, 자연 장 상피를 발생 반복시키는 선와-융모 구조를 함유하는 오가노이드를 형성시키기 위해 시험관 내에서 배양될 수 있다(Sato et al., 2009). 이들 줄기 세포는 오가노이드 형태로 다수의 계대배양 동안 확장될 수 있으나, 현존하는 배양 조건은 자가-재생 및 분화를 거의 조절하지 못하거나, 아예 조절하지 못한다. 통상적인 배양물은 줄기 세포 및 분화된 세포를 포함하는 이종성 세포 집단으로 구성된다(Sato et al., 2009). 특히, 시험관내 및 생체내 둘 모두에서의 Lgr5+ 줄기 세포의 자가-자생 및 증식은 Lgr5+ 줄기 세포와 호산성과립세포로 공지된 또 다른 선와 세포 유형 사이의 직접적인 세포 접촉에 좌우되며(Snippert et al., 2010), 이는 배양시 Lgr5+ 줄기 세포의 운명을 조절하는 것을 유의하게 복잡하게 하고 제한한다. Lgr5+ 줄기 세포를 효과적으로 확장할 수 없음은 상기 생물학의 치료법으로의 변용을 상당히 제한하며, 여기서 동종성 줄기 세포 배양 및 효과적인 규모 확장 과정이 이식 전에 필수적이다. 또한, 생체외 확장된 상피 조직의 손상된 수용자 기관으로의 이식을 위해 개선된 임상-지향 시스템을 개발할 필요가 있다.
발명의 개요
한 양태에서, 본 발명은 세포 배양 용액을 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명은 골 형태형성 단백질의 억제제, 글리코겐 신타제 키나제-3 베타의 억제제, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함하는 세포 배양 용액을 제공한다. 한 구체예에서, 글리코겐 신타제 키나제-3 베타의 억제제는 CHIR99021일 수 있고, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제는 R-스폰딘 1일 수 있고, HDAC 억제제는 발프로산일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 골 형태형성 단백질의 억제제, 적어도 약 3 uM의 CHIR99021 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함하는 세포 배양 용액을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 골 형태형성 단백질의 억제제, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제, Wnt 효능제 및 HDAC6 억제제를 포함하는 세포 배양 용액을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 골 형태형성 단백질의 억제제, R-스폰딘 1, 리튬 클로라이드 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함하는 세포 배양 용액을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 Pan-HDAC 억제제인 히스톤 데아세틸라제 억제제를 제공한다. Pan-HDAC 억제제는 발프로산, 트리코스타틴 A, 수베로일아닐리드 히드록삼산 및 수베로히드록삼산(SBHA)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 HDAC6 억제제인 히스톤 데아세틸라제 억제제를 제공한다. HDAC6 억제제는 투바신, 투바스타틴 A 및 화합물 7로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 노긴, 코르딘, 폴리스타틴, DAN, DAN 시스테인-노트 도메인을 포함하는 단백질, 스클레로스틴, 트위스티드 가스트룰레이션, 자궁 민감성-관련 유전자-1, 결합조직 성장 인자, 인히빈, BMP-3 및 도르소모르핀으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있는 골 형태형성 단백질의 억제제를 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 CHIR99021, LiCl, BIO-아세톡심, CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, 켄파울론, 1-아자켄파울론, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, TCS 21311, TWS 119, BIO-아세톡심, 10Z-하이메니알디신, GSK-3β 억제제 II, GSK-3β 억제제 I, GSK-3β 억제제 XXVII, GSK-3β 억제제 XXVI, FRATtide 펩티드, Cdk1/5 억제제 및 비키닌으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있는 글리코겐 신타제 키나제-3 베타의 억제제를 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4로 구성된 군으로부터 선택될 수 있는 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제를 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 Wnt-1/Int-1, Wnt-2/Irp(Int-I-관련 단백질), Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-10b/12, Wnt-11, Wnt-16, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 노린, CHIR99021, LiCl, BIO ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, 켄파울론, 1-아자켄파울론, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘, IQ 1, DCA, QS 11, WAY-316606, (헤테로)아릴피리미딘, 10Z-하이메니알디신, TCS 21311, TWS 119, GSK-3 억제제 IX, GSK-3 억제제 IV, GSK-3β 억제제 II, GSK-3β 억제제 I, GSK-3β 억제제 XXVII, GSK-3베타 억제제 XXVI, FRATtide, Cdkl/5 억제제, 비키닌, 및 1-아자켄파울론으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있는 Wnt 효능제를 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 노긴, R-스폰딘 1, CHIR99021 및 Atoh1 억제제를 포함하는 세포 배양 용액을 제공한다. Atoh1 억제제는 억제 핵산일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 표피 성장 인자 및/또는 Notch 효능제를 추가로 포함하는 세포 배양 용액을 제공한다. Notch 효능제는 Notch1 항체(N1 Ab), Delta 1, Delta-유사 3, Delta-유사 4, Jagged 1, Jagged 2, DSL 펩티드 및 Delta D로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 약 5 내지 약 500 ng/ml의 EGF, 약 5 내지 약 500 ng/ml의 노긴, 약 50 내지 약 1000 ng/ml의 R-스폰딘, 약 0.1 내지 약 10 μM의 CHIR99021 및 약 0.1 내지 약 5 mM의 발프로산을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 세포 배양 용액을 포함하는 세포 배양 시스템을 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 세포 배양 시스템을 제공한다:
i) 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포 또는 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 집단;
ii) R-스폰딘 1;
iii) CHIR99021;
iv) 히스톤 데아세틸라제 억제제; 및
v) 임의로, 골 형태형성 단백질의 억제제.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 세포 배양 시스템을 제공한다:
i) 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포 또는 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 집단;
ii) R-스폰딘 1;
iii) CHIR99021;
iv) Atoh1 억제제; 및
v) 임의로, 골 형태형성 단백질의 억제제.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 세포 배양 시스템을 제공한다:
i) 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포 또는 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 집단;
ii) R-스폰딘 1;
iii) 리튬 클로라이드;
iv) 히스톤 데아세틸라제 억제제; 및
v) 임의로, 골 형태형성 단백질의 억제제.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 세포 배양 시스템을 제공한다:
i) 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포 또는 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 집단;
ii) R-스폰딘 1;
iii) Wnt 효능제;
iv) HDAC6 억제제; 및
v) 임의로, 골 형태형성 단백질의 억제제.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 세포 배양 시스템은 LGR5 양성 줄기 세포를 포함할 수 있는 상피 줄기 세포 및 상피 줄기 세포의 집단을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 세포 배양 시스템 내의 상기 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 집단은 시스템 내의 세포의 적어도 30%, 85%, 90%, 95% 또는 99%를 구성한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 세포 배양 시스템을 제공한다:
i) 종양 오가노이드;
ii) 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제;
iii) Wnt 효능제;
iv) 히스톤 데아세틸라제 억제제 또는 Atoh1 억제제; 및
v) 임의로, 골 형태형성 단백질의 억제제.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 점막하조직 기부, 콜라겐을 포함하는 코팅 층 및 상피 줄기 세포, 상피 줄기 세포를 포함하는 분리된 조직 및/또는 상피 오가노이드로 구성된 군의 임의의 일원을 포함하는 세포 층을 포함하는 세포 배양 시스템을 제공한다. 콜라겐을 포함하는 코팅은 상피 줄기 세포, 상피 줄기 세포를 포함하는 분리된 조직 또는 상피 오가노이드의 상부에 존재하거나 이들을 둘러싸고 있을 수 있다. 콜라겐을 포함하는 코팅은 또한 SIS 기부와 상피 줄기 세포, 상피 줄기 세포를 포함하는 분리된 조직 또는 상피 오가노이드 사이에 존재할 수 있다. 점막하조직 기부는 SIS를 포함할 수 있고, 추가로 표피 성장 인자, 골 형태형성 단백질, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제, Wnt 효능제, Y-27632 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 세포 배양 시스템은 골 형태형성 단백질의 억제제, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제, Wnt 효능제, Y-2763 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함하는 용액을 포함하는 본 발명의 세포 배양 용액을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 점막하조직 기부 및 상피 줄기 세포, 상피 줄기 세포를 포함하는 분리된 조직, 또는 상피 오가노이드를 포함하는 세포 배양 시스템을 제공하며, 상기 점막하조직 기부는 표피 성장 인자, 골 형태형성 단백질, R-스폰딘 1, CHIR99021, Y-27632 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함한다. 이러한 세포 배양 시스템은 표피 성장 인자, 골 형태형성 단백질의 억제제, R-스폰딘 1, CHIR99021, Y-27632 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함하는 용액을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 분리된 상피 줄기 세포로부터 상기 오가노이드를 형성시키는 방법을 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명은,
i) 노긴, R-스폰딘 1, CHIR99021 및 히스톤 데아세틸라제 억제제의 존재하에서 분리된 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 단계; 및
ii) 상기 분리된 상피 줄기 세포로부터 상피 오가노이드를 형성시키는 단계로서, 분리된 상피 줄기 세포의 적어도 약 25%, 40%, 50%, 75%, 90%가 상피 오가노이드를 형성하는 단계를 포함하는, 고효율로 분리된 상피 줄기 세포로부터 상피 오가노이드를 형성시키는 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은,
i) 노긴, R-스폰딘 1, CHIR99021 및 히스톤 데아세틸라제 억제제의 존재하에서 단일한 분리된 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 단계; 및
ii) 상기 분리된 상피 줄기 세포로부터 상피 오가노이드를 형성시키는 단계로서, 단일한 분리된 상피 줄기 세포의 적어도 약 6%가 상피 오가노이드를 형성하는 단계를 포함하는, 고효율로 단일한 분리된 상피 줄기 세포로부터 상피 오가노이드를 형성시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은,
i) 골 형태형성 단백질의 억제제, R-스폰딘 1, Wnt 효능제, 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 화학요법제의 존재하에서 종양 오가노이드를 인큐베이션시키는 단계; 및
ii) 세포 생활력의 억제, 세포 증식의 억제, 종양 관련 유전자 발현의 억제, 아폽토시스 및 세포 생존 억제의 활성화로 구성된 군으로부터 선택된 파라미터를 측정하는 단계로서, 상기 파라미터에서의 증가를 검출하는 것이 종양 오가노이드에 관한 화학요법제의 효능을 나타내는 단계를 포함하는, 종양 오가노이드에 관한 화학요법제의 효능을 결정하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 각각 호산성과립세포를 생성시키기에 충분한 양의 적어도 하나의 Wnt 효능제 및 적어도 하나의 Notch의 억제제의 존재하에서 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 세포 배양 시스템에서 호산성과립세포를 형성시키는 방법을 제공한다.
한 구체예에서, 상피 줄기 세포는 골 형태형성 단백질의 적어도 하나의 억제제의 존재하에서 추가로 인큐베이션될 수 있다.
또 다른 구체예에서, Notch의 억제제는 DAPT이다.
또 다른 구체예에서, 상피 줄기 세포는 LGR5 양성 줄기 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 각각이 세포 배양 시스템 내에서 장세포를 생성시키기에 충분한 양의 적어도 하나의 Wnt 억제제 및 적어도 하나의 히스톤 데아세틸라제 억제제의 존재하에서 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 세포 배양 시스템에서 장세포를 형성시키는 방법을 제공한다. 상피 줄기 세포는 표피 성장 인자 및/또는 골 형태형성 단백질의 억제제의 존재하에서 추가로 인큐베이션될 수 있다.
한 구체예에서, Wnt 억제제는 IWP-2, XAV-939, ICG-001, LGK-974, IWR-1-endo, KY02111, Wnt-C59, DKK-1, FH-535, Box5, 펩티드 Pen-N3, 항-SFRP 항체, 및 항-LRP6 항체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 각각이 세포 배양 시스템에서 술잔 세포를 생성시키기에 충분한 양의 적어도 하나의 Wnt 억제제 및 적어도 하나의 Notch 억제제의 존재하에서 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 세포 배양 시스템에서 술잔 세포를 형성시키는 방법을 제공한다. 상피 줄기 세포는 표피 성장 인자의 존재하에서 추가로 인큐베이션될 수 있다.
한 구체예에서, Notch 억제제는 DAPT, RO4929097, LY450139, LY900009, LY3039478, LY411575, YO-01027, BMS-708163, BMS-906024, Compound E, BMS-299897, SAHM1, Abeta42-Selective 및 SB 225002로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 각각이 세포 배양 시스템에서 장내분비 세포를 생성시키기에 충분한 양의 Notch의 적어도 하나의 억제제 및 수용체 티로신 키나제, 미토겐-활성화 단백질(MAP) 키나제 또는 세포외 신호-조절 키나제(ERK) 중 적어도 하나를 억제하는 작용제의 존재하에서 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 배양 시스템에서 장내분비 세포를 형성시키는 방법을 제공한다. 상피 줄기 세포는 표피 성장 인자, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제 및/또는 골 형태형성 단백질의 억제제의 존재하에서 추가로 인큐베이션될 수 있다. MAP 키나제는 미토겐-활성화 단백질키나제 키나제(MEK)일 수 있다.
한 구체예에서, MAP 키나제를 억제하는 작용제는 AS-703026, PD0325901, PD98059, 셀루메티니브(Selumetinib), SL-327, U0126, TAK-733 및 트라메티니브(Trametinib)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 구체예에서, RTK를 억제하는 작용제는 제피티니브, AG 99, 에를로티니브, 아파티니브, 라파티니브, WZ4002 및 AG- 18로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 구체예에서, ERK를 억제하는 작용제는 AS-703026 또는 PD0325901일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 장 상피 세포를 형성시키기에 충분한 양의 Wnt 효능제 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 장 상피 세포를 형성시킬 필요가 있는 대상체에서 장 상피 세포를 형성시키는 방법을 제공한다. Wnt 효능제는 CHIR99021일 수 있고, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 발프로산일 수 있다. CHIR99021은 약 0.1mg/kg/일 내지 약 100mg/kg/d일의 양으로 투여될 수 있고, 발프로산은 약 1mg/kg/일 내지 약 1000mg/kg/일의 양으로 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 장 상피 세포를 형성시키기에 충분한 양의 Wnt 효능제 및 Notch 효능제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 장 상피 세포를 형성시킬 필요가 있는 대상체에서 장 상피 세포를 형성시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Wnt 효능제 및 히스톤 데아세틸라제 억제제 또는 Wnt 효능제 및 Notch 효능제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 장 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 장 장애는 소장결장염; 바이러스 감염, 예를 들어, 비특이적 장염 또는 특정 바이러스 장염; 게실염; 박테리아 소장결장염, 예를 들어, 살모넬라증, 시겔라증, 캄필로박터 소장결장염, 또는 예르시니아 소장결장염; 원생동물 감염, 예를 들어, 아메바증; 연충 감염; 및 위막성 결장염 및 낭성섬유증에서의 폐 합병증 및 만성폐쇄폐병; 충수염; 위축위염; 바레트식도; 폐렴; 자궁경부염; 만성 간질신장염; 결장염; 결장 게실염; 결막염; 접촉피부염; 컬링궤양; 쿠싱궤양; 방광염; 괴저; 치은염; 유방염; 식도염; 췌장염; 지방층염; 연조직염위염; 사구체신염; 및 염증성장질환, 궤양성 결장염, 크론병, 애디슨병 및 사구체신염(예를 들어, 초승달 사구체신염, 증식성 사구체신염)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 자가면역 질병으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 도면, 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
예로 제공되나, 기재된 특정 구체예에 대해 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아닌 하기 상세한 설명은 참조로서 본원에 포함되는 수반 도면과 관련하여 이해될 수 있다.
도 1은 생체 내에서의 Lgr5-GFP의 분산된 발현을 도시한다. 소장이 Lgr5-GFP 마우스로부터 수거되었고, 형광현미경 하에서 직접 영상화시켰다. 소장의 모든 영역이 선와에 의해 덮였으며, 이들 선와 중 대략 절반은 GFP+ 세포를 함유하였다. 축척 막대: 100 ㎛.
도 2a-2h는 Lgr5+ 줄기 세포의 증식 및 자가-재생을 촉진하는 CHIR 및 VPA의 조합을 도시한다. 도 2a는 GFP 및 ENR(EGF, 노긴 및 R-스폰딘l), ENR+VPA(ENR-V), ENR+CHIR(ENR-C) 및 ENR+VPA+CHIR(ENR-CV)의 존재하에서 6일 동안 배양된 소장 선와의 명시야 이미지를 도시한다. 아폽토시스 세포가 자가형광(적색 화살표)으로 루멘 내에 보이고, 백색 화살표는 선와의 기부에서의 특정 Lgr5-GFP를 나타낸다. 축척 막대: 100 ㎛. 도 2b는 다수의 조건에서 배양된 선와의 세포 증식 및 GFP 발현의 정량을 도시한다. 선와는 6일 동안 24웰 플레이트에서 배양되었고, Accutase를 이용하여 단일 세포로 분리되었다. 각각의 웰 내의 살아 있는 세포수가 세포 증식의 지표로서 계수되었다. Lgr5-GFP 발현이 흐름세포측정 분석에 의해 측정되었다. 오차 막대는 삼중 웰의 S.D.를 나타낸다. 실험은 3회 수행되었고, 유사한 결과를 나타내었다. 도 2c 및 2d는 표시된 바와 같은 다수의 조건하에서 7일의 배양 후의 단일 Lgr5-GFP 세포의 GFP 발현의 흐름세포측정 분석을 도시한다. 오차 막대는 삼중 웰의 S.D.를 나타낸다. 도 2e는 GFP 및 배양 9일 후의 단일 Lgr5-GFP 세포의 명시야 이미지를 도시한다. 오차 막대: 100 ㎛. 도 2f는 7일 동안 다수의 조건하에서 배양된 4,000개의 FACS 분리된 단일 Lgr5-GFP 세포의 대표 이미지를 도시하며, 도 2g는 콜로니 수의 정량을 도시한다. 오차 막대는 삼중 웰의 S.D.를 나타낸다. 도 2h는 정상 핵형을 갖는 80일 동안 CV 조건에서 배양된 세포의 중기 스프레드(spread)를 도시한다(2n=40)(달리 나타내지 않는 한, 모든 패널에서, ***P<0.001; **P<0.01; *P<0.05; NS P>0.05).
도 3a-3g는 배양 조건의 함수로서 세포 성장 및 GFP 발현을 도시한다. 도 3a 및 3b는 각 시점에서 열거된 삼중 웰로부터의 콜로니 수 및 살아 있는 단일 세포수 각각을 도시한다. 오차 막대는 S.D.를 나타낸다. 도 3a에서, 시리즈는 좌측으로부터 우측으로 0일, 2일, 4일, 6일, 8일, 및 10일이다. 도 3c는 새로이 분리된 단일 Lgr5-GFP+ 세포의 FACS 분류를 도시한다. GFPhlgh 단일 세포 집단이 수거되었다. GFP+ 세포 집단을 규정하기 위한 대표적 FACS 분석 및 게이팅(gating) 전략이 제시된다. 선와로부터 새로이 분리된 단일 세포는 2개의 구별된 GFPhlgh 및 GFPlow 집단을 나타낸 반면, 배양된 세포는 구별된 GFPhlgh 및 GFPlow 집단을 나타내지 않았고, 따라서 모든 GFP+ 세포가 분석을 위해 게이팅되었다. ENR-CV 배양된 세포가 매우 GFP 양성이었던 단일한 GFP+ 집단을 나타낸 것을 인지하라. GFP-집단은 Lgr5-세포 뿐만 아니라 Lgr5+/GFP-세포(즉, GFP 무증상 줄기 세포)를 나타내며, 이는 모든 분류되지 않은 선와 배양물에 존재하나, 분류된 단일 Lgr5-GFP 세포 배양물에는 존재하지 않는다(도 2c 참조). 전체 10,000개의 살아 있는 세포가 각각의 샘플에 대해 분석되었다. 도 3d는 CV 배양 조건에서의 Lgr5+ 줄기 세포의 자가-재생을 위한 성장인자 필요조건을 도시한다. 선와를 표시된 바와 같이 EGF, 노긴, R-스폰딘 1 및 이들의 조합물과 함께 CHIR 및 VPA의 존재하에서 6일 동안 배양하였다. E: EGF(50 ng/ml); N: 노긴(100 ng/ml); R: R-스폰딘 1(500 ng/ml); C: CHIR(3 μM); V: VPA(1 mM). 도 3e는 표시된 바와 같은 다수의 조건에서 6일 동안 배양된 선와를 도시한다. GFP 및 명시야가 제시된다. 축척 막대: 200 ㎛. 도 3f는 ENR, ENR-C 및 ENR-CV 조건하에서 배양된 결장 선와의 형태 및 Lgr5-GFP 발현을 도시한다. 도 3g는 다수의 농도의 EGF, 노긴 및 R-스폰딘 1 또는 R-스폰딘 2의 존재하에서 5일에 형성된 오가노이드의 분리된 수를 도시한다. 모든 축척 막대: 200 ㎛.
도 4a-4b는 EPHB2+ 인간 결장 줄기 세포에 대한 다수의 배양 조건의 시험을 도시한다. 선와는 표시된 바와 같이 다수의 조건하에서 6일 동안 배양되었다. GFP 및 명시야 이미지가 도 4a에 제시된다. W: Wnt3a(100 ng/ml); Ni: 니코틴아미드(10 mM); P: PGE2(0.02 μM); A: A-83-01(0.5 μM); S: SB202190(10 μM); V: 발프로산 또는 VPA(1 mM). EGF, 노긴, R-스폰딘 1, Wnt3a 및 VPA, 또는 ENR-W-V 조건을 GFP의 증가된 발현을 나타내기 위한 대조군으로 제공하였다. 축척 막대: 200 ㎛. 도 4b는 다수의 조건하에서 배양된 선와의 세포 증식 및 GFP 발현의 정량을 도시한다. 선와는 24-웰 플레이트에서 6일 동안 배양되었고, 단일 세포로 분리되었다. 각각의 웰 내의 살아 있는 세포수가 계수되었고, GFP+ 세포의 백분율이 흐름세포측정에 의해 분석되었다. 오차 막대는 삼중 웰의 S.D.를 나타낸다.
도 5a-5d는 단일 Lgr5-GFP 줄기 세포의 배양을 도시한다. 도 5a는 CV 조건하에서 9일 동안 배양된 단일한 분리된 Lgr5-GFP+ 세포를 도시한다. 축척 막대: 200 ㎛. 도 5b는 표시된 바와 같은 조건하에서 마트리겔 중에서 배양된 1500개의 FACS 분류된 단일 Lgr5+ 세포를 도시한다. 7일 배양물로부터의 대표적 이미지가 제시된다. 도 5c는 콜로니 수의 정량을 나타낸다. 오차 막대는 S.D. 또는 삼중 웰을 나타낸다. 도 5d는 48-웰 플레이트에 시딩된 분류된 단일한 Lgr5+ 줄기 세포를 나타낸다. 플레이팅 12시간 후에 살아 있는 세포수가 정량되었다. 콜로니 수가 7일에서 계수되었고, 콜로니-형성 효율이 정량되었다. V: VPA; C: CHIR; W: 100 ng/ml의 Wnt3a. 오차 막대는 3개의 삼중 웰의 S.D.를 나타낸다. 실험은 3x 수행되었고, 유사한 결과를 나타내었다.
도 6a-6d는 CHIR 및 VPA의 조합에 의한 Lgr5+ 줄기 세포 자가-재생의 유지를 도시한다. ENR 조건하에서 배양된 오가노이드(상부 패널) 및 ENR-CV 조건하에서 배양된 콜로니의 리소자임(도 6a), Ki67(도 6b) 및 EdU(도 6c) 염색의 동일초점 이미지가 제시된다. EdU 염색을 위해, 세포는 1시간 동안 티미딘 유사체 EdU(적색)와 함께 배양되었다. 도 6b 및 6c에서, 선와 도메인만이 ENR 조건하에서 Ki67 양성 세포를 함유하거나 EdU를 통합하는 한편(상부 패널), Ki67 또는 EdU는 CV 조건하에서 세포 응집물 전체에 걸쳐 존재한다(하부 패널). 도 6d는 표시된 바와 같은 조건하에서 6일 동안 배양된 성숙 장 상피 세포에 대한 마커의 상대적 mRNA 발현의 정량적 실시간 PCR 분석을 도시한다(장세포에 대해 장 알칼리성 포스파타제[Alpi], 술잔 세포에 대해 Mucin 2[Muc2], 장내분비 세포에 대해 크로모그라닌 A[ChgA], 호산성과립세포에 대해 리소자임[Lyz], 및 장 줄기 세포에 대해 Lgr5). ENR-CV(D40)는 40일 동안 CV 조건에서 배양된 세포를 나타낸다. 축척 막대: 50 ㎛. 도 6d에서, 시리즈는 좌측으로부터 우측으로 Alpi, Muc2, ChgA, Lyz, 및 Lgr5이다.
도 7a-7d는 CV 조건하에서 배양된 장 줄기 세포의 분화를 도시한다. 도 7a는 CV 조건으로부터 ENR 조건으로 옮겨지고, 4일 동안 배양된 세포의 분화 마커의 염색을 도시한다(장세포에 대해 Alp, 술잔 세포에 대해 Muc2(백색 화살표) 및 술잔 세포에 의해 분비된 뮤신, 장내분비 세포에 대해 ChgA 및 호산성과립세포에 대해 Lyz). 핵을 염색시키기 위해 DAPI가 사용되었고, GFP는 줄기 세포의 존재를 나타낸다. 도 7b는 다수의 조건하에서 배양된 세포로부터의 성숙 장 상피 마커의 상대적 mRNA 발현의 실시간 RT-PCR 분석을 제시한다. 세포는 6일 동안 CV 조건하에서 단일 세포로부터 먼저 배양되었다. 세포 콜로니는 이후 수거되고, 세척되고, 24웰 플레이트의 여러 웰로 재플레이팅되고, 표시된 바와 같은 다수의 조건하에서 마트리겔 중에서 4일 동안 배양되었다. ENR이 모든 조건에서 첨가되었고, ENR 단독으로 배양된 세포가 대조군으로 이용되었다. I: IWP-2(2 μM), D: DAPT(10 μM), C: CHIR(3 μM), V: VPA(1 mM). 오차 막대는 S.D.를 나타낸다. 도 7c는 다수의 조건하에서 배양된 세포의 Alp 염색을 도시한다. ID 및 CD 조건에서 세포의 명백한 형태적 변화가 있으며, 이는 술잔 세포 및 호산성과립세포와 유사하다. 축척 막대: 50 ㎛. 도 7d는 분화 마커의 면역세포화학 염색을 도시한다. CD 및 ID 조건하에서 배양된 세포가 Mucin 2(Muc2), 크로모그라닌 A(ChgA) 및 리소자임(Lyz) 염색에 사용되었다. 3차원 재구성 동일초점 이미지가 제시된다. 축척 막대: 50 ㎛.
도 8a-8f는 시험관 내에서의 Lgr5+ 줄기 세포의 조절된 분화를 도시한다. 도 8a는 ENR 조건에서 배양된 오가노이드의 염색을 도시한다. 좌측 패널은 장세포의 Alp 염색을 도시한다. 염색 전, 오가노이드는 날카로운 날로 해부 현미경 하에서 절단 개방되었고, 관강내 내용물이 제거되었다. 중간 패널은 술잔 세포(화살표) 뿐만 아니라 술잔 세포에 의해 분비된 뮤신의 Muc2 염색을 도시하고, 우측 패널은 장내분비 세포의 ChgA 염색을 도시한다. GFP+ 세포는 Lgr5+ 줄기 세포를 나타낸다. 도 8b는 분화 프로토콜의 개략도를 제공한다. 단일 Lgr5+ 줄기 세포가 4-6일 동안 CV 조건하에서 배양되어 콜로니를 형성하였다. 이후, 세포 콜로니가 수거되고, 세척되고, 새로운 마트리겔 내에 포매되고, 다수의 조건하에서 배양되었다. 도 8c는 CV 조건으로부터 ENR 조건으로 옮겨지고, 4일 동안 배양된 세포 콜로니의 형태를 도시한다(상부 패널). CV 조건에서 연속적으로 배양된 콜로니가 대조군으로 제시된다(하부 패널). 도 8d는 각각의 조건에 대한 저배율 및 고배율 이미지를 이용한 분화된 세포의 형태를 도시한다. 호산성과립세포 및 술잔 세포의 형성을 각각 반영하는, CD 및 ID 조건하에서의 대부분의 세포에 대한 형태에서의 명백한 변화를 인지하라. 도 8e는 IV 조건하에서 배양된 콜로니의 Alp 염색을 도시한다. Alp의 정상(apical)(좌측 패널) 및 균일(우측 패널) 염색이 제시된다. 도 8f는 ID 및 CD 조건하에서 배양된 콜로니의 Muc2 염색을 도시한다. 모든 축척 막대: 50 ㎛.
도 9a-9f는 CHIR 및 VPA에 대한 작용 메커니즘을 도시한다. 도 9a는 6일 동안 다수의 조건하에서 배양된 선와의 형태 및 Lgr5-GFP 발현을 도시한다. C: CHIR(3 μM); Li: LiCl(5 mM); W: Wnt3a(100 nM). 도 9b는 6일 선와 배양 동안 GFP+ 세포의 세포수 및 백분율을 도시한다. 데이터는 3개의 독립적 실험의 대표이다. 도 9c는 ENR-C(대조군) 조건 또는 HDAC 억제제와의 선와의 6일 배양을 제시한다. 도 9d는 도 9c의 GFP 백분율, 전체 살아 있는 세포수 및 세포의 상대 GFP 강도의 정량을 도시한다. 도 9e는 다수의 농도에서의 세포 증식 및 GFP 발현에 대한 VPA 및 TSA의 효과를 도시한다. 도 9f는 Wnt3a(W, 100 ng/ml) 또는 CHIR(C, 3 μM)와 조합된 니코틴아미드(Ni)의 효과를 도시한다. 다수의 조건하에서 6일 동안 배양된 선와의 GFP+ 세포의 세포수 및 백분율이 제시된다(달리 표시하지 않는 한, 모든 패널에서, 오차 막대는 S.D. 또는 삼중 웰을 나타낸다. ***P<0.001; **P<0.01; *P<0.05; NS P>0.05).
도 10은 다수의 조건에서 배양된 단일 Lgr5-GFP 세포의 형태 및 GFP 발현을 도시한다. 축척 막대: 100 ㎛.
도 11a-11d는 VPA의 메커니즘을 도시한다. 도 11a는 Notch 억제 후의 VPA 구제 GFP 발현을 도시한다. 선와는 3일 동안 DAPT(D, 5 μM) 및 다양한 농도의 VPA(V, 0.25-4 mM)를 갖거나 이들이 없는 ENR-C 조건하에서 배양되었다. 축척 막대: 200 ㎛. 도 11b 및 11c는 4일 동안 ENR(도 11b) 또는 ENR+CHIR(도 11c) 조건하에서 배양된 후, 또 다른 24시간 동안 다양한 농도로 VPA가 첨가된 선와를 도시한다. Notch1, Hes1 및 Atoh1의 발현이 실시간 RT-PCR에 의해 분석되었다. 도 11d는 배양 6일 후의 선와에서의 실시간 RT-PCR에 의한 Notch1, Hes1 및 Atoh1 발현의 분석을 도시한다. 도 11b-11c에서, 시리즈는 좌측으로부터 우측으로 0, 0.5, 1, 2, 및 3이다. 도 11d에서, 시리즈는 좌측으로부터 우측으로 ENR, ENR-V, ENR-C, 및 ENR-CV이다.
도 12a-12b는 생리학적 조건(도 12a) 및 시험관내 배양(도 12b) 하에서의 장 줄기 세포 자가-재생 및 분화에 대한 모델을 도시한다.
도 13a-13b는 마우스 내이로부터 유래된 Lgr5+ 줄기/전구 세포의 증식 및 GFP 발현을 촉진하는 CHIR 및 VPA의 조합을 도시한다. 도 13a는 출생 2일 후에 Lgr5-GFP 마우스로부터 유래된 분리된 와우 감각 상피의 명시야 및 GFP 이미지를 도시한다. 도 13b는 단일 세포로 분리되고, 11일 동안 다수의 조건하에서 배양된 분리된 와우 감각 상피를 도시한다. E: EGF; N: 노긴; R: R-스폰딘 1; C: CHIR99021, V: VPA. 축척 막대: 100 ㎛.
도 14a-14f는 마우스 내이로부터의 Lgr5+ 줄기/전구 세포의 증식 및 GFP 발현을 촉진하는 CHIR 및 VPA의 조합을 도시한다. 도 14a는 내이 상피 세포의 GFP 발현을 도시한다. 도 14b는 GFP 발현 및 세포수의 정량을 도시한다. 도 14c는 명시야 및 GFP 이미지를 도시한다. 도 14d는 표시된 바와 같은 다수의 조건하에서 내이 줄기 세포의 8일 배양의 세포수를 도시한다. 도 14e는 표시된 바와 같은 다수의 조건하에서 내이 줄기 세포의 8일 배양의 GFP 백분율을 도시한다. 도 14f는 다수의 조건하에서 배양된 Lgr5-GFP 내이 줄기 세포의 형태 및 GFP 발현을 도시한다. 모든 축척 막대: 200 ㎛.
도 15는 시험관 내 건강한 마우스 결장 조직 상의 뮤린 소장 선와의 시딩을 도시한다. 좌측 패널은 부분적으로 노출된 상피를 갖는 결장에 배치된 분리된 소장 선와를 제시한다. 백색 화살표는 시딩된 선와를 나타낸다. 우측 패널은 결장세 부착된 시딩된 선와 및 24시간 후의 이의 표면을 가로지르는 확산을 제시한다. 흑색 화살표는 좌측 패널의 백색 화살표와 동일한 위치를 나타낸다.
도 16은 시딩 48시간 후의 선와의 생착(engraftment)을 도시한다. 선와가 시딩된 마우스 결장 조직의 형광(상부 패널) 및 명시야(하부 패널) 이미지가 제시된다. 선와는 시딩 전에 DiD로 염색되었다. 백색선은 생착된 세포를 포함하는 영역을 나타낸다.
도 17은 시험관내 배양 6일 후의 선와의 생착을 도시한다. 선와가 시딩된 마우스 결장 조직의 GFP(좌측 패널), RFP(중간 패널) 및 명시야(우측 패널) 채널 이미지가 제시된다. GFP 신호는 Lgr5 세포의 존재를 나타낸다.
도 18은 생착된 선와를 지닌 TRUC 마우스로부터의 절제된 탈항 궤양성 결장염 조직의 공초점 이미지를 도시한 것이다. 선와는 시딩 전에 DiD로 염색되었다. 탈항 조직은 녹색 자가형광(green autofluorescence)을 통해 보여진다.
도 19a-19n은 평가되는 배양 시스템에서 시딩(좌측) 및 후-인큐베이션 오가노이드 성장(우측)의 개략도를 도시한 것이다. 도 19a 및 19b는 단층 성장 및 오가노이드 해리를 지지하는, 전형적인 점막하 시딩 방법(본원에서 "베어 패치"로서 언급됨)을 도시한 것이다. 도 19c 및 19d는 3-차원적 오가노이드 성장을 지지하는 GF-주입된 SIS (GF는 EGF, 노긴, R-스폰딘 1, Y-27632, 발프로산, CHIR을 포함함)를 도시한 것이다. 도 19e 및 19f는 콜라겐 오버레이(overlay)를 지닌 GF-주입된 SIS로 구성된 겔-패치를 도시한 것이다. 삽도 도 19e는 연질 겔 뿐만 아니라 SIS 기부층에 개별적으로 매입된 각각의 오가노이드를 도시한 것이다. 도 19g 및 19h는 배양 배지에 직접 첨가되는 GF를 지닌 전형적인 콜라겐 현탁액(EGF, 노긴, R-스폰딘 1, Y-27632, 발프로산, CHIR)을 도시한 것이다. 도 19i 및 19j는 겔에 임베딩되는 GF를 지닌 전형적인 콜라겐 현탁액(EGF, 노긴, R-스폰딘 1, Y-27632, 발프로산, CHIR)을 도시한 것이다. 도 19k 및 19l은 배양 배지에 첨가되는 추가의 GF가 없는 전형적인 콜라겐 현탁액을 도시한 것이다. 도 19m 및 19n은 배지에 첨가되는 추가의 GF가 없는 전형적인 마트리겔 현탁액(실험 대조군)을 도시한 것이다.
도 20a는 Lgr5+ 오가노이드로의 시딩 절차에 대한 개략도를 도시한 것이며; 패턴화된 원은 주입 성장 인자(EGF, 노긴, R-스폰딘 1, Y-27632, 발프로산 및 CHIR)를 나타낸다. 도 20b는 화살표가 성장 임베딩 인자 확산 지지체를 도시하고 있는 초기 부착 단계를 도시한 것이다. 도 20c는 두께 측정치가 도시된, 콜라겐 오버레이를 지닌 완전 배양 시스템을 도시한 것이다.
도 21a는 7 개의 배양 시스템에서의 오가노이드 성장을 비교한 것이다. 이 시리즈는 좌측에서 우측으로, 마트리겔, GF를 지닌 겔-패치, GF를 지닌 베어 패치, 콜라겐 I, 배지 GF를 지닌 콜라겐 I, GF가 임베딩된 콜라겐 I, 및 GF가 없는 베어 패치이다. 도 21b 및 도 21c는 GF를 지닌 겔-패치 시스템으로부터의 48시간에서의 대표적인 오가노이드를 나타내며, GFP+ 형광은 선와 염기에 존재하는 Lgr5+ 줄기 세포를 나타낸다(일부 중심 자가형광이 관찰됨). 24 시간(콜라겐 I (CI) 대 모두), 48 시간(GF를 지닌 베어 패치 (BPGF) 대 모두; CI 대 마트리겔 (M); GF를 지닌 CI (CIGF) 대 M, CI, GF가 임베딩된 콜라겐 I(CIEGF), 베어 패치 (BP), GF를 지닌 겔-패치 시스템(PSGF)), 72 시간 (CI 대 모두; BP, CIEGF, 및 CIGF 대 M, PS, BPGF, CI) 및 96 시간(CI 대 모두, BP, CIEGF, 및 CIGF 대 모두)에서 *=p<.05. 눈금 막대(Scale bar)(도 21b 및 21c) = 200um.
도 22는 GF를 지닌 겔-패치 시스템에서의 시딩된 오가노이드의 성공적인 성장 및 선와 팽창을 도시한 것이다. GF를 지닌 SIS 패치 시스템 상의 시딩된 오가노이드의 생체외 팽창을 묘사하는 일련의 대표적인 이미지가 보여진다. 초점이 맞이 않은 선와는 단일면 현미경으로 관찰되는 3차원에서의 성장 효과이다.
도 23a는 4mm 위 결함(gastric defect)의 생성을 보여주는 개략도를 제공한다. 결함 위 6mm 패치의 배치가 도 23b에서 보여진다. 도 23c에 나타난 바와 같이, 외측 위벽 상에 결함은 수술 후 1주일째에 대표적인 위 샘플 상에 나타난 바와 같이 보이지 않았다. 내측 위장벽에서 보아, 총 결함(화살표)은 배치되는 패치의 타입에 따라 나타내어지며, 도 23d는 GF 부재의 SIS 패치를 나타내고, 도 23e는 SIS 패치 플러스 GF를 나타내고, 도 23f는 SIS 부재의 PGSU 배킹(backing) 만을 나타낸다. GF를 지닌 SIS 패치가 위장벽 효과의 완전한 폐쇄 및 상피화(epithelialization)를 나타낸 반면, 오직 SIS에서는 결함이 여전히 부분적으로 개방된 채로 있고, SIS 부재의 PGSU에서는 완전히 개방된 채로 있었다.
도 24는 다수의 조건에서 배양된 단리된 사람 장 선와의 마커 유전자 발현의 실시간 RT-PCR 분석을 도시한 것이다. EGF, 노긴 및 R-스폰딘 1을 모든 조건에 첨가하였다. C: CHIR, Ni: 니코틴아미드, W: Wnt3a, A: A83-01, S: SB202190, P: PGE2, V: VPA, Tu: 투바스타틴 A, 선와는 새롭게 단리된 사람 소장 선와를 나타낸다. 오차 막대는 S.D.를 나타내고, n=3이다.
도 25a-25b는 사람 장의 줄기 세포에 대한 최적화 배양 조건을 도시한 것이다. 도 25a는 다수의 조건 하에 배양된 사람 장 상피 세포의 증식을 도시한 것이다. 새롭게 단리된 인간 소장 선와가 표시된 바와 같이 다수의 조건 하에 배양되었다. EGF, 노긴, R-스폰딘 1이 모든 조건 하에 존재하였다. 세포수를 시딩 후 9일째에 정량화하였다. C: CHIR, V: VPA, 0.5-1.5 mM으로 사용됨, Ni: 니코틴아미드. 도 25b는 도 15a에서와 같은 다수의 조건 하에 배양된 세포의 LGR5 발현을 도시한 것이다. VPA가 1 mM로 사용되었다.
도 26은 사람 장 줄기 세포 배양을 도시한 것이다. 세포는 사람 장 줄기 세포 배양 배지(EGF, 노긴, R-스폰딘 1, CHIR99021, VPA 및 니코틴아미드 함유)에서 배양되었다. 계대배양 후 5일째에 2차 계대배양의 세포가 도시된다. 눈금 막대: 400 ㎛.
도 27은 동물 모델 시스템에서 생체 내 7일 동안에 걸쳐 CHIR 및 VPA를 투여한 후 증가된 선와 크기를 도시한 것이다.
발명의 상세한 설명
정의
본원에서 사용되는 "항체"는 면역원 결합 능력을 지닌, 어떠한 면역글로불린 폴리펩티드, 또는 이의 단편이다.
본원에서 사용되는 "효능제(agonist)"는 표적 유전자 또는 단백질 각각의 발현 또는 활성에서의 증가를 야기하는 작용제이다. 효능제는 어떠한 형태로 그것의 동족 수용체에 결합하고 활성화시킬 수 있으며, 이는 표적 유전자 또는 단백질에 대해 이러한 생리적 효과를 직접적으로 또는 간접적으로 초래한다.
본원에서 사용되는 "억제제"는 표적 유전자 또는 단백질 각각의 발현 또는 활성에서의 감소를 야기하는 작용제이다. "길항제"는 억제제일 수 있지만, 보다 구체적으로 수용체와 결합하고, 이어서 다른 분자에 의한 결합을 감소시키거나 없애는 작용제이다.
본원에서 사용되는 "억제 핵산"은 포유동물 세포에 투여되는 경우 표적 유전자의 발현 감소를 야기하는, 이중-가닥 RNA, siRNA, shRNA, 또는 안티센스 RNA, 또는 이들의 일부, 또는 이들의 모방체이다. 전형적으로, 핵산 억제제는 표적 핵산 분자의 적어도 일부, 또는 이의 이종상동체를 포함하거나, 표적 핵산 분자의 상보적 가닥의 적어도 일부를 포함한다. 전형적으로, 표적 유전자의 발현은 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 심지어 90-100% 감소된다.
"안티-센스"는 핵산 서열의 코딩 가닥 또는 mRNA에 상보성인, 길이에 무관한 핵산 서열을 의미한다. 본원에서 사용되는 "상보성 핵산 서열"은 상보성 누클레오티드 염기 쌍을 구성된 또 다른 핵산 서열과 혼성화될 수 있는 핵산 서열이다. "혼성화하다(hybridize)"는 엄격 적합한 조거 S하에서 상보성 누클레오티드 염기들 간에 이중 가닥 분자를 형성하는 쌍을 의미한다(예를 들어, DNA에서 구아닌(G)가 사이토신(C)와 염기 쌍을 이루는 것과 같이 아데닌 (A)은 티민 (T)과 염기 쌍을 형성한다)(참조예: Wahl, G. M. 및 S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507). 일 구체예에서, 안티센스 RNA는 개개의 세포, 조직 또는 오가노이드에 도입된다. 안티-센스 핵산은 개질된 백본(backbone), 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 당해 공지되어 있는 그 밖의 개질된 백본을 함유할 수 있거나, 비-천연 누클레오사이드간 결합을 함유할 수 있다.
"siRNA"는 이중 가닥 RNA를 의미한다. 최적으로, siRNA는 길이로 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 누클레오티드이고, 그것의 3' 말단에 2 개의 염기 오버행(base overhang)을 지닌다. 이들 dsRNA는 개개의 세포 또는 배양 시스템에 도입될 수 있다. 이러한 siRNA는 mRNA 수준 또는 프로모터 활성을 하향 조절하는데 사용된다.
본원에서 사용되는 "단편"은 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 일부이다. 이러한 부분은 바람직하게는 기준 핵산 분자 또는 폴리펩티드 전장의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 함유한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개의 누클레오티드 또는 아미노산을 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "줄기 세포"는 자가-재생(self-renewal) 및 다수 세포 계통으로 분화 능력을 지닌 다능성 세포(multipotent cell)를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "상피 줄기 세포"는 상피 세포를 야기하는 세포 계통을 포함하는 다수 세포 계통에 투입되게 될 가능성이 있는 다능성 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "전구 세포"는 줄기 세포부터 유도된 계통-제한된 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "상피 전구 세포"는 상피 세포를 야기하는 세포 계통으로 제한되게 될 가능성이 있는 다능성 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "자가-재생"은 줄기 세포가 분할되어 모 세포의 것들과 구별하기 어려운, 발달 가능성을 지닌, 하나 (비대칭 분할) 또는 두 개(대칭 분할)의 딸 세포(daughter cell)를 생성하는 과정을 나타낸다. 자가-재생은 증식 및 비분화 상태의 유지 둘 모두를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "생착하다" 또는 "생착"은 조직의 기존 세포와의 접촉을 통해 생체내 대상 조직으로 줄기 또는 전구 세포가 혼입되는 과정을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "단리된"은 그것의 원래 상태에서 존재하는 것과 같이 일반적으로 그것을 수반하는 성분으로부터 다양한 정도로 자유로운 물질을 나타낸다. "단리도(Isolate)"는 원래의 공급원 또는 둘러싸고 있는 물질로부터의 분리 도를 나타낸다.
본원에서 사용되는 세포 "군집"은 1 초과의 어떠한 수의 세포이나, 바람직하게는 적어도 1X103개의 세포, 적어도 1X104개의 세포, 적어도 1X105개의 세포, 적어도 1X106개의 세포, 적어도 1X107개의 세포, 적어도 1X108개의 세포, 적어도 1X109개의 세포, 또는 적어도 1X1010개의 세포이다.
본원에서 사용되는 용어 "오가노이드" 또는 "상피 오가노이드"는 기관 또는 기관의 일부와 유사하고, 그러한 특정 기관에 관한 세포 타입을 지닌 세포 클러스터 또는 응집체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 "대상체"는 포유동물류의 어떠한 일원을 포함하는 척추동물이다.
본원에서 사용되는 "포유동물"은 사람, 마우스, 래트, 양, 원숭이, 염소, 토끼, 햄스터, 말, 소 또는 돼지를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아닌 어떠한 포유동물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "비-인간 포유동물"은 사람이 아닌 어떠한 포유동물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "증가하는"은 예를 들어, 비고의 수준과 비교하여 적어도 5%, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100% 또는 그 초과 만큼 증가하는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "증가한다"는 또한 예를 들어, 비고 표준의 수준과 비교하여, 적어도 1-배, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000-배 또는 그 초과로 증가하는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "감소하는"은 예를 들어, 비고의 수준과 비교하여 적어도 5%, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100% 만큼 감소하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "감소한다"는 또한 예를 들어, 비고의 수준과 비교하여 적어도 1-배, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000-배 또는 그 초과로 감소하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "비고"는 표준 또는 대조군 조건(예를 들어, 시험 작용제 또는 시험 작용제의 조합물로 처리되지 않음)을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "제거하다"는 탐지가능하지 않은 수준으로 감소시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "상승작용" 또는 "상승작용 효과"는 개별적으로 취한 각각의 효과의 합보다 더 큰, 즉, 부가 효과보다 더 큰 효과이다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다," "치료하는," "치료," 등은 이와 관련된 장애 및/또는 증상을 감소시키거나 개선시키는 것을 나타낸다. 배제되는 것은 아니지만, 장애 또는 질환을 치료하는 것은 이와 관련된 장애, 질환 또는 증상이 완전히 제거되어야 할 필요는 없는 것으로 이해해야 할 것이다.
본 기재에서, "포함하다(comprise)", "포함하는(comprising)", "함유하는" 및 "지니는" 등은 미국 특허법에서 이들에 대해 기술된 의미를 가질 수 있으며, "포함하다(includes)," 및 "포함하는(including)" 등을 의미할 수 있고; "~를 필수적으로 포함하는" 또는 "필수적으로 구성되는" 등은 미국 특허법에 기술되어 있는 의미를 지니고, 이 용어는 개방형이어서, 언급되는 것의 기본 또는 신규의 특징이, 종래 기술의 구체예를 제외하고 언급되는 것 이상의 존재에 의해 변경되지 않는 한, 언급되는 것 이상의 존재를 허용한다.
그 밖의 정의가 본 기재 전반의 문맥에 보인다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자들에 의해 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 분쟁이 있을 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 조정할 것이다.
본 발명의 방법 및 조성물
I. 세포 배양액 및 시스템
균질한 상피 줄기 세포 배양물, 효과적인 상피 오가노이드 형성 및 이를 이식에 사용하기 위한 규모-확장을 조장하기 위한 세포 배양액 및 시스템이 이제 발견되었다.
골 형태형성 단백질의 억제제, 글리코겐 신타제 키나제-3 베타 (GSK3 β)의 억제제, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5 (LGR5)에 결합하는 작용제 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함하는 세포 배양액이 분리된 상피 줄기 세포로부터 상피 세포 콜로니를 형성시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 적어도 약 25%, 약 40%, 약 50%, 약 75%, 약 90% 내지 약 100%)의 분리된 상피 줄기 세포가 이러한 세포 배양액의 존재 하에 상피 세포 콜로니를 형성한다. 또한, 적어도 약 6%>의 단일 분리된 상피 줄기 세포가 이러한 세포 배양액의 존재 하에 상피 세포 콜로니를 형성한다. 1,6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카보니트릴"CHIR99021" (Ring 등, 2003), 글리코겐 신타제 키나제-3 베타 및 발프로산의 억제제, 히스톤 데아세틸라제 억제제의 조합물은, 콜로니 형성 효율에 상승작용 효과를 갖는다.
골 형태형성 단백질(BMP)은 TGF-베타 수퍼패밀리(superfamily)의 일원이고, 다양한 종 중 배아 패턴닝 뿐만 아니라 후-배아 세포 신호전달에 연루된 메탈로프로테아제를 포함한다. BMP의 억제제는 예를 들어, BMP 분자에 결합하여, 예를 들어, BMP 분자의 BMP 수용체로의 결합을 방지하거나 억제함으로써 BMP 활성이 감소되거나 제거되는, 착물을 형성하는 작용제를 포함한다. 대안적으로, 억제제는 길항제 또는 역효능제로서 작용하는 작용제이다. 이러한 타입의 억제제는 BMP 수용체에 결합하고, BMP의 그러한 수용체에 대한 결합을 방지한다. 후자의 작용제의 예는 BMP 수용체에 결합하고, BMP의 항체-결합된 수용체로의 결합을 방지하는 항체이다. BMP의 억제제는 당해 널리 공지되어 있으며(Rider 등, 2010), 노긴, 코르딘, 폴리스타틴 (Schneyer 등, 1994), DAN, DAN 시스테인-노트 도메인을 포함하는 단백질 (Cerberus 및 Gremlin 포함), 스클레로스틴, 트위스티드 가스트룰레이션, 자궁 민감성-관련 유전자-1, 결합조직 성장 인자 (Abreu 등, 2002), 인히빈 (Wiater and Vale, 2003), BMP-3 (Gamer 등, 2005), 도르소모르핀 (Yu 등, 2008), 및 DMH1 (Hao 등, 2010) 및 LDN-193189 (Cuny 등, 2008)을 포함하는 유도체를 포함할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아닌다.
글리코겐 신타제 키나제-3 (GSK3)는 초기에 두 개의 공지된 아이소형(isoform)인, 알파 (GSK3A) 및 베타 (GSK-3β)를 지닌 포스포릴화 및 불활성화 글리코켄 신타제로서 확인된 프롤린-유도된 세린-트레오닌 키나제이다. GSK-3β 억제제를 포함하는 Wnt 효능제는 당해 널리 공지되어 있으며, 1,6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카보니트릴"CHIR99021" (Ring 등, 2003), LiCl (Klein 등, 1996), BlO-아세톡심 ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심) (Meijer 등, 2003), N6-[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]-3-니트로-2,6-피리딘디아민 "CHIR98014" (Ring 등, 2003), 3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 "SB 216763"(GSK-3 억제제 TV로서 알려져 있음) (Coghlan 등, 2000), 3-[(3-클로로-4-하이드록시페닐)아미노]-4-(2-니트로페닐)-1H-피롤-2,5-디온 "SB 415286" (Coghlan 등, 2000), 5-에틸-7,8-디메톡시-1H-피롤로[3,4-c]-이소퀴놀린-1,3-(2H)-디온 "3F8" (Zhong 등, 2009), 9-브로모-7,12-디하이드로-인돌로[3,2-d][1]벤즈아제핀-6(5H)-온 "켄파울론" (Schultz 등,1999; Zaharevitz 등, 1999), 9-브로모-7,12-디하이드로-피리도[3',2':2,3]아제피노[4,5-b]인돌-6(5H)-온 "1-아자켄파울론" (Schultz 등, 1999; Zaharevitz 등, 1999), N-(3-클로로-4-메틸페닐)-5-(4-니트로페닐)-1,3,4-옥사디아졸-2-아민 "TC-G 24" (Khanfar 등, 2010), 2-메틸-5-[3-[4-(메틸설프밀)페닐]-5-벤조푸라닐]-1,3,4-옥사디아졸 "TCS 2002" (Saitoh 등, 2009), N-[(4-메톡시페닐)메틸]-N'-(5-니트로-2-티아졸릴)우레아 "AR-A 014418" (Bhat 등, 2003), 3-[5-[4-(2-하이드록시-2-메틸-1-옥소프로필)-1-피페라지닐]-2-(트리플루오로메틸)페닐]-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온 "TCS 21311" (Thoma 등, 2011), 3-[[6-(3-아미노페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]옥시]-페놀 "TWS 119" (Ding 등, 2003), ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-아세톡심) "BlO-아세톡심" (GSK-3 억제제 IX로서 알려져 있음) (Meijer 등, 2003), 4-(2-아미노-4-옥소-2-이미다졸린-5-일리덴)-2-브로모-4,5,6,7-테트라히드로피롤로[2,3-c]아제핀-8-온 "10Z-하이메니알디신(Hymenialdisine)" (Breton 등, 1997), 2-[(3-아이오도페닐)메틸술파닐]-5-피리딘-4-일-1,3,4-옥사디아졸 (GSK-3 억제제 II로서 알려져 있음) (Wada, 2009), 4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온 (GSK-3 억제제 I로서 알려져 있음) (Wada, 2009), 3-아미노-6-(4-((4-메틸피페라진-1-일)술포닐)페닐)-N-(피리딘-3-일)피라진-2-카르복사미드, HC1 (GSK-3β 억제제 XXVII로서 알려져 있음) (미국 특허 공개 제2006/0173014호), 4,5-비스(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1,2-디하이드로피라졸-3-온 (GSK-3β 억제제 XXVI로서 알려져 있음) (Chen et al, 2011), FRAT타이드 펩티드 SQPETRTGDDDPHRLLQQLVLSGNLIKEAVRRLHSRRLQ (SEQ ID NO: 1) (Bax 등, 2001), 3-아미노-1H-피라졸로[3,4-b]퀴녹살린 "Cdkl/5 억제제" (Andreani 등, 1996, 2000; Katoh 등, 2011) 및 4-((5-브로모-2-피리딘일)아미노)-4-옥소부탄산 "비키닌" (De Rybel 등, 2009)을 포함할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, GSK-3의 억제제는 CHIR99021이다.
류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5 (LGR5 수용체)는 그것의 제한된 선와 발현, 및 여러 성인 조직 및 암에서 줄기 세포의 마킹(marking)으로 알려져 있다. LGR5 수용체에 결합하는 작용제는 R-스폰딘 (Kim 등, 2006; Nam 등, 2006), 예컨대 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, LGR5 수용체에 결합하는 작용제는 R-스폰딘 1이다.
대안적 구체예에서, 리튬 클로라이드 (LiCl)가 CHIR99021를 대신할 수 있거나 적어도 약 3 uM CHIR99021가 R-스폰딘 1를 대신할 수 있다.
히스톤은 DNA를 결합하여 누클레오솜을 형성시키는 핵 단백질이다. 이들은 DNA의 염색체로의 패키징 및 전사 조절 둘 모두에 직접적으로 관련된다. 히스톤 아세틸화/탈아세틸화는 전사 동안 크로마틴 구조적 역동성을 조절함에 있어서 주요 인자이다. 히스톤 탈아세틸화를 감소시키거나 제거하는 히스톤 데아세틸라제 억제제는 당해 널리 공지되어 있으며, Pan-HDAC 억제제, 예컨대 발프로산, 트리코스타틴 A, 수베로일아닐리드 히드록삼산 및 수베로히드록삼산 (SBHA), 및 HDAC6 억제제, 예컨대 투바신, 투바스타틴 A 및 화합물 7을 포함할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
대안적 구체예에서, Atoh1 억제제는 히스톤 데아세틸라제 억제제를 증가시키거나 히스톤 데아세틸라제 억제제를 대신할 수 있다. Atoh1 억제제는 예를 들어, Atoh1의 발현에서의 감소 또는 제거를 야기하는 억제 핵산을 포함한다. Atoh1을 표적으로 하는 억제 핵산은 당해 공지되어 있다(Shi 등, 2010).
세포 배양액은 임의로 표피 성장 인자 및/또는 노치(Notch) 효능제를 포함할 수 있다. 표피 성장 인자는 세포 증식, 분화, 운동성 및 생존을 포함하는 여러 세포 기능, 및 조직 발달과 관련된 세포 신호전달 분자이다. 노치 단백질은 발달 동안 세포 운명 결정을 조절하는 일회 통과 경막 수용체이다. 노치 효능제는 예를 들어, 세포 내 노치 활성을 증가시키는 작용제를 포함한다. 노치 효능제는 당해 널리 공지되어 있으며, 노치1 항체 (N1 Ab), 델타 1, 델타-유사 3, 델타-유사 4, 자기드(Jagged) 1, 자기드 2, DSL 펩티드 및 델타 D를 포함할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
특정 구체예에서, 세포 배양액은 약 5 내지 약 500 ng/ml EGF, 약 5 내지 약 500 ng/ml 노긴, 약 50 내지 약 1000 ng/ml R-스폰딘, 약 0.1 내지 약 10 μΜ CHIR99021 및 약 0.1 내지 약 5 mM 발프로산을 포함한다.
그 밖의 구체예에서, 세포 배양액 중 Wnt 효능제와 HDAC6 억제제의 조합물이 바람직하다. 따라서, 세포 배양액은 골 형태형성 단백질의 억제제, R-스폰딘 1, Wnt 효능제 및 HDAC6 억제제를 포함할 수 있다.
Wnt 단백질은 배아 발달의 조절에 관련된 세포외 신호전달 분자이다. Wnt 효능제는 당해 널리 공지되어 있으며, Wnt-l/Int-l(Nusse 등, 1982), Wnt-2/Irp (Int-I-관련 단백질) (Wainwright 등, 1988), Wnt-2b/13 (Katoh 등, 1996), Wnt-3/Int-4 (Katoh 등, 2001), Wnt-3a (Saitoh 등, 2001), Wnt-4 (Smolich 등, 1993), Wnt-5a (Burrus 등, 1995), Wnt-5b (Burrus 등, 1995), Wnt-6 (Burrus 등, 1995), Wnt-7a (Smolich 등, 1993), Wnt-7b (Burrus 등, 1995), Wnt-8a/8d (Saitoh 등, 2001), Wnt-8b (Lako 등, 1998), Wnt-9a/14 (Bergstein 등, 1997), Wnt-9b/14b/15 (Bergstein 등, 1997), Wnt-lOa (Wang 등, 1996), Wnt-10b/12 (Wang 등, 1996), Wnt-11 (Lako 등, 1998), Wnt-16 (Bergstein 등, 1997; Fear 등, 2000), R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 노린 (Planutis 등, 2007), CHIR99021, LiCl, BIO ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, 켄파울론, 1-아자켄파울론, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘 (Liu 등, 2005), 2-[2-(4-아세틸페닐)디아제닐]-2-(3,4-디하이드로-3,3-디메틸-l(2H)-이소퀴놀리닐리덴)아세트아미드 "IQ 1" (Miyabayashi 등, 2007), (3a,5,12a,20R)-3,12-디하이드로옥시콜란-24-오익 산 "DCA" (Pai 등, 2004), (25)-2-[2-(인단-5-일옥시)-9-(1,1'-바이페닐-4-일)메틸)-9H-푸린-6-일아미노]-3-페닐-프로판-1-올 "QS 11" (Zhang 등, 2007), 피페리디닐 디페닐술포닐 설폰아미드 1 "WAY-316606" (Bodine 등, 2009), (헤테로)아릴피리미딘 (Gilbert 등, 2010), 1OZ-하이메니알디신, TCS 21311, TWS 119, GSK-3 억제제 II, GSK-3 억제제 I, GSK-3 억제제 XXVII, FRAT타이드, CdK1/5 억제제 및 비키닌을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
세포 배양 시스템은 본 발명의 세포 배양액 및 상피 오가노이드, 상피 줄기세포 또는 상피 전구 세포, 또는 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 군집 포함한다. 상피 오가노이드는 당해 공지되어 있다(Yao 등, 2010; Lukacs 등, 2010). 상피 줄기 세포는 장, 위, 폐, 췌장, 및 결장의 줄기 세포를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 상피 줄기 세포는 또한 장, 내이, 뇌, 신장, 간, 망막, 위, 췌장, 유방, 모낭, 난소, 부신수질, 피부, 흉선, 미뢰, 유선, 암종 및 종양을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아닌 소스(source)로부터 유래된 LGR5 양성 줄기 세포를 포함한다. 상피 줄기 세포는 또한 LGR5를 발현시키는 LGR5 양성 줄기 세포의 정지성(quiescent) 전구체를 포함한다 (Buczacki 등, 2013). 세포 배양 시스템 중 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 군집은 예를 들어, 시스템 중 적어도 10%, 20%, 30%>, 40%>, 50%>, 60%>, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 군집은 반복되는 계대배양 동안에 유지된다.
특정 구체예에서, 사람 상피 줄기 세포는 니코틴아미드 또는 Sirtl 특정 HDAC 억제제, 예컨대 EX527를 포함하는 추가의 성분의 존재 하에 배양될 수 있다.
특정 구체예에서, 내이로부터 유래된 상피 줄기 세포는 Wnt 효능제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 표피 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic Fibroblast Growth Factor) 및 임의로, 골 형태형성 단백질의 존재 하에 배양될 수 있다.
세포 배양 시스템은 이식에 적합한 3-차원 조직 구성물을 형성하기 위해 콜라겐을 포함하는 피막 및 점막하조직 기부를 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌, 추가의 성분을 포함할 수 있다. 콜라겐 피막은 선택된 상피 조직 또는 세포 타입 위에 씌워지고/거나 선택된 상피 조직 또는 세포 타입을 둘러쌀 수 있고, 뿐만 아니라 선택된 상피 조직 또는 세포 타입과 점막하조직 기부 사이에 배치될 수 있다. 선택된 상피 조직 또는 세포 타입은 상피 줄기 세포, 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직, 또는 상피 오가노이드를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
소장 점막하조직(SIS)은 일반적인 생체적합성이고, 임상적으로 이용되는 스캐폴드(scaffold)이다(de la Fuente 등, 2003; Ueno 등, 2007; Schultz 등, 2002; Kehoe 등, 2012). 점막하-기반 스캐폴드는 빠른 혈관신생, 과립화, 생분해가 일어나고, 일반적으로 종간 단백질 조성과 관련하여 잘 보존된다. 3-차원 조직 구성물을 위한 개선된 점막하-기반 배양 시스템은 사전선택된 상피 세포 타입으로 점막하를 시딩하고, 콜라겐-기반 오버레이로 성장을 촉진시킴으로써 제조된다. 이러한 오버레이로 SIS의 조성을 달리함으로써 SIS에 대한 세포 부착 및 성장을 촉진시키고, 이는 점막하-부차된 세포의 큰 상피 오가노이드로의 3-차원 팽창을 야기한다. 온혈 척추동물로부터의 동물-유래된 조직 매트릭스 스캐폴드(예를 들어, 위, 방광, 소화, 호흡, 성기 점막하, 및 간 기저막)는 SIS와 상호교환가능하며, 이에 따라 본 발명의 범위 내에 있다.
조직 구성물은 당해 공지된 세포 배양액 또는 상기 본원에서 기술된 본 발명의 세포 배양액 중에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 조직 구성물은 골 형태형성 단백질의 억제제, R-스폰딘 1, CHIR99021 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함하는 세포 배양액의 존재 하에 배양될 수 있다. 추가로, 점막하조직 기부는 소분자, 및/또는 성장 인자, 에컨대 표피 성장 인자, 골 형태형성 단백질, R-스폰딘 1, CHIR99021, Y-27632 및 히스톤 데아세틸라제 억제제의 유사한 조합물을 함유할 수 있다.
대안적 구체예에서, 점막하조직 기부가, 소분자 및/또는 성장 인자, 예컨대, 표피 성장 인자, 골 형태형성 단백질, R-스폰딘 1, CHIR99021, Y-27632 및 히스톤 데아세틸라제 억제제의 조합물을 함유하는, 콜라겐-비함유 상피 세포 배양 시스템이 제공된다. 콜라겐-비함유 조직 구성물은 당해 공지되어 있거나 상기 본원에서 기술되는 것과 같은 세포 배양액의 존재 하에 배양될 수 있다.
II. 세포 배양액 및 세포 배양 시스템을 이용하는 방법
본 발명의 세포 배양액 및 시스템은 분리된 상피 줄기 세포로부터 고효율로 상피 오가노이드를 형성시키는데 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 노긴, R-스폰딘 1, CHIR99021 및 히스톤 데아세틸라제 억제제 (예를 들어, 발프로산)의 존재 하에서의 분리된 상피 줄기 세포의 인큐베이션은 적어도 약 25%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 효율로 상피 세포 콜로니를 형성시킨다. 또 다른 특정 구체에에서, 노긴, R-스폰딘 1, CHIR99021 및 히스톤 데아세틸라제 억제제의 존재 하에서 인큐베이션된 단일 분리된 상피 줄기 세포는 적어도 약 6% 내지 약 100%의 효율로 상피 세포 콜로니를 형성시킨다.
본 발명의 세포 배양액 및 시스템 내에서 유지된 상피 줄기 세포는 이후 호산성과립세포, 장세포, 술잔 세포 및 장내분비 세포의 형성을 야기하는 것들을 포함하는 특정 분화 경로로 유도될 수 있다.
호산성과립세포는 줄기 세포 유지를 위해 필수적인 신호를 제공하는 장 선와 내의 Lgr5+ 줄기 세포 틈새의 중요 성분인 것으로 나타났다(Sato 등, 201lb; Yilmaz 등, 2012). BMP의 억제제, R-스폰딘 1, CHIR99021 및 히스톤 데아세틸라제 억제제(예를 들어, 발프로산)를 포함하는 세포 배양액의 존재 하에서의 상피 줄기 세포의 첫번째 인큐베이션 및 이후 적어도 하나의 Wnt 효능제 및 노치의 적어도 하나의 억제제(예를 들어, DAPT)의 존재 하에서의 상피 줄기 세포의 추가의 인큐베이션이 호산성과립세포를 생성한다. 유사하게, 적어도 하나의 Wnt 억제제 및 적어도 하나의 히스톤 데아세틸라제 억제제의 존재 하에서의 상피 줄기 세포의 추가의 인큐베이션이 장세포를 생성하고; 이후, 적어도 하나의 Wnt 억제제 및 적어도 하나의 노치 억제제의 존재 하에서의 상피 줄기 세포의 추가의 인큐베이션이 술잔 세포를 생성한다. Wnt 억제제는 N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라히드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드 ("IWP-2") (Chen, Dodge 등 2009)를 포함할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 노치 억제제는 N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르 ("DAPT" 또는 "LY-374973") (Dovey, John et al 2001), N1-[(7S)-6,7-디하이드로-6-옥소-5H-디벤즈[b,d]아제핀-7-일]-2,2-디메틸-N3-(2,2,3,3,3-펜타플루오로프로필)-("RO4929097", 프로판디아미드) (He, Luistro 등 2011), (S)-2-하이드록시-3-메틸-N-((S)-1-((S)-3-메틸-2-옥소-2,3,4,5-테트라히드로-1H-벤조[d]아제핀-1-일아미노)-1-옥소프로판-2-일)부탄아미드 ("LY450139") (Lanz, Hosley 등 2004), N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-디하이드로-5-메틸-6-옥소-5H-디벤즈[b,d]아제핀-7-일]아미노]-1-메틸-2-옥소에틸]-2-하이드록시-3-메틸-, (2S)-("LY900009", 부탄아미드) (Selleckchem:카달로그 번호 S7168), N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-디하이드로-5-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-5H-피리도[3,2-a][3]벤즈아제핀-7-일]아미노]-1-메틸-2-옥소에틸]-4,4,4-트리플루오로-("LY3039478", 부탄아미드) Selleckchem: 카달로그 번호 S7169, N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-디하이드로-5-메틸-6-옥소-5H-디벤즈[b,d]아제핀-7-일]아미노]-1-메틸-2-옥소에틸]-3,5-디플루오로-α-하이드록시-, (αS)-("LY411575", 벤젠아세트아미드) (Wehner, Cizelsky 등 2014), 7-(S)-[N'(3,5-디플루오로페닐아세틸)-L-알라니닐]아미노-5-메틸-5,7-디하이드로-6H-디벤즈[b,d]아제핀-6-온 ("YO-01027" (DBZ)) (Milano, McKay 등 2004), (2R)-2-(N-(2-플루오로-4-(1,2,4-옥사디아졸-3-일)벤질)-4-클로로페닐설폰아미도)-5,5,5-트리플루오로펜탄아미드 ("BMS-708163") (Saito, Fu 등 2014), (2R,3S)-N-[(3S)-1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디하이드로-1H-1,4-벤조디아제핀-3-일]-2,3-비스(3,3,3-트리플루오로프로필)석신아미드 ("BMS-906024") (Huang, Greer 등 2009), (S,S)-2-[2-(3,5-디플루오로페닐)-아세틸아미노]-N-(1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디하이드로-1H-벤조[e][1,4]디아제핀-3-일)-프로피온아미드 ("화합물 E") (Milano, McKay 등 2004), 2-[(lR)-1-[[(4-클로로페닐)술포닐](2,5-디플루오로페닐)아미노]에틸-5-플루오로벤젠부탄산 ("BMS-299897") (Anderson, Holtz 등 2005), SAHM1 Calbiochem Catalogue Number: 491002, (Abeta42-Selective) Calbiochem Catalogue Number: 565792, 및 N-(2-브로모페닐)-N'-(2-하이드록시-4-니트로페닐)우레아("SB 225002") (Bakshi, Jin 등 2009)를 포함할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
이후, 적어도, 적어도 하나의 노치 억제제 및 적어도 하나의 수용체 티로신 키나제 (RTK), 미토겐-활성화 단백질(MAP) 키나제(또한, MAPK/ERK로서 지칭됨), 또는 세포외 신호-조절 키나제 (ERK)(또한, MAPK/ERK로서 지칭됨)을 억제하는 작용제의 존재 하에서의 상피 줄기 세포 추가의 인큐베이션은 장내분비 세포를 생성한다. MAP 키나제는 미토겐-활성화 단백질키나제 키나제를 포함할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니며, MAP 키나제를 억제하는 작용제는 N-[(2S)-2,3-디하이드록시프로필]-3-[(2-플루오로-4-아이오도페닐)아미노]-4-피리딘카르복사미드 ("AS-703026") (Kim, Kong 등 2010), N-[(2R)-2,3-디하이드록시프로폭시]-3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-아이오도페닐)아미노]-벤즈아미드 ("PD0325901") (Thompson and Lyons 2005), 5-(2-페닐-피라졸로[1,5-a]피리딘-3-일)-1H-피라졸로[3,4-c]피리다진-3-일아민 ("FR 180204") (Ohori, Kinoshita 등 2005), 2-(2-아미노-3-메톡시페닐)-4H-크로멘-4-온 ("PD98059") (Alessi, Cuenda 등 1995), 6-(4-브로모-2-클로로페닐아미노)-7-플루오로-N-(2-하이드록시에톡시)-3-메틸-3H-벤조[d]이미다졸-5-카르복사미드 ("셀루메티니브") (Huynh, Soo 등 2007), (Z)-3-아미노-3-(4-아미노페닐티오)-2-(2-(트리플루오로메틸)페닐)아크릴로니트릴 ("SL-327") (Chen, Operana 등 2005), (2Z,3Z)-2,3-비스(아미노(2-아미노페닐티오)메틸렌)석시노니트릴,에탄올("U0126") (Favata, Horiuchi et al. 1998), (R)-3-(2,3-디하이드록시프로필)-6-플루오로-5-(2-플루오로-4-아이오도페닐아미노)-8-메틸피리도[2,3-d]피리미딘-4,7(3H,8H)-디온 ("TAK-733") (Dong, Dougan 등 2011) 및 N-(3-(3-사이클로프로필-5-(2-플루오로-4-아이오도페닐아미노)-6,8-디메틸-2,4,7-트리옥소-3,4,6,7-테트라히드로피리도[4,3-d]피리미딘-1(2H)-일)페닐)아세트아미드 ("트라메티니브") (Gilmartin, Bleam 등 2011)를 포함할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. RTK를 억제하는 작용제는 N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-4-퀴나졸린아민 ("제피티니브") (Ciardiello 2000), (E)-2-시아노-3-(3,4-디하이드록시페닐)-2-프로펜아미드("AG 99") (Gazit, Yaish 등 1989), 4-[[(2S)-2-(3-클로로페닐)-2-하이드록시에틸] 아미노]-3-[7-메틸-5-(4-모르폴리닐)-1H-벤즈이미다졸-2-일]-2(1H)-피리디논("BMS 536924") (Huang, Greer 등 2009), 5-(2-페닐-피라졸로[1,5-a]피리딘-3-일)-1H-피라졸로[3,4-c]피리다진-3-올 ("FR 180209") (Anastassiadis, Duong-Ly 등 2013), N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민 하이드로클로라이드 ("에를로티니브") (Kuiper, Heideman 등 2014), (S,E)-N-(4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-(테트라히드로푸란-3-일옥시)퀴나졸린-6-일)-4-(디메틸아미노)부트-2-엔아미드 ("아파티니브") (Minkovsky and Berezov 2008), N-(4-(3-플루오로벤질옥시)-3-클로로페닐)-6-(5-((2-(메틸술포닐)에틸아미노)메틸)푸란-2-일)퀴나졸린-4-아민,디4-메틸벤젠설포네이트 ("라파티니브") (Xia, Mullin 등 2002), N-(3-(5-클로로-2-(2-메톡시-4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐아미노)피리미딘-4-일옥시)페닐)아크릴아미드 ("WZ4002") (Sakuma, Yamazaki 등 2012) 및 2-[(3,4-디하이드록시페닐)메틸렌]-("AG-18", 프로판디니트릴) (Gazit, Yaish 등 1989)를 포함할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 세포 배양 용액 및 시스템은 재생 목적을 위한 이식 가능한 상피를 포함하는 3차원 조직 작제물을 형성시키기 위해 추가적으로 사용될 수 있다. 이러한 조직 작제물은 당해 분야에 공지된 방법에 따라 숙주에 이식될 수 있다[Lloyd 등 2006; Gupta 등 2006; Yui 등 2012]. 치료에 대해 민감한 조직은 질환, 손상, 외상, 자가면역 반응에 의해, 또는 바이러스 또는 박테리아 감염에 의해 손상될 수 있는 조직을 포함하는 모든 손상된 조직을 포함한다. 이미지-유도 기술을 포함하는 최소 침습 이식 기술들이 사용될 수 있다. 조직 작제물은 손상된 조직에 주입되거나 직접적으로 이식될 수 있으며, 여기서, 이러한 것은 신체에서 이의 위치에 따라, 증식하고 결국 요구되는 세포 타입으로 분화할 수 있다. 조직 작제물은 결장 관장을 통해 직접적으로 이식되거나 주입될 수 있다. 미소화(micronization)는 상부 창자 적용을 위한 경구 전달 이전에 이용될 수 있다. 이에 따라, 회복을 위해 특히 매우 적합한 손상된 조직은 결장, 소장, 췌장, 식도 및 위 계(gastric system)의 조직들을 포함한다. 당업자는 조직 작제물의 적절한 투약량이 치료될 특정 병태를 위한 것임을 인식할 것이다.
본 발명의 세포 배양 용액 및 시스템은 추가적으로, 생체 내에서 화학요법제, 또는 화학요법제들의 조합물의 효능을 예측하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 여러 환자들이 다중 약물로 치료되기 때문에 임상적 셋팅(clinical setting)에서 사용하는 것과 특히 관련이 있다.
종양 오가노이드는 본 발명의 배양 용액에서 단리된 종양 세포 집괴 또는 단일 세포를 배양시킴으로써 당해 분야에 공지된 방법에 따라 형성될 수 있다[Sato 등, 2011a]. 이러한 배양물은 전립선암, 유방암, 위암, 췌장암, 폐암, 뇌암, 결장암, 장암 및 방광암을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 다양한 암들에 대한 임상적 모델로서 사용될 수 있다.
종양 오가노이드는 본 발명의 세포 배양 용액(예를 들어, BMP의 억제제, R-스폰딘 1, Wnt 효능제, 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함함) 및 화학요법제(들)의 존재 하에 인큐베이션될 수 있다. 다음에, 관련 파라미터가 측정되고 평가된다. 관련 파라미터는 세포 생활력의 억제, 세포 증식의 억제, 종양 관련 유전자 발현의 억제, 아폽토시스의 활성 및 세포 생존의 억제를 포함한다. 기준물(예를 들어, 대조군)과 비교하여 파라미터의 증가를 검출하는 것은 종양 오가노이드에 대한 화학요법제의 효능을 지시하는 것으로서, 이는 생체 내에서 화학요법제(들)의 효능을 예측한다.
일반적으로, 화학요법제는 종양 오가노이드를 포함하는 세포 배양 시스템과 함께, 생리학적 효과를 형성시키기에 충분한 기간 동안 그리고 치료될 것으로 추정되는 투약량 범위에서 인큐베이션된다. 인큐베이션 시간은 약 1시간 내지 24시간의 범위일 수 있거나, 필요한 경우에 수일 또는 심지어 수주 동안 연장될 수 있다. 인큐베이션 조건들은 통상적으로, 본 발명의 배양 용액을 사용하고 약 37℃의 온도를 유지하는 것을 포함한다.
화학요법제는 대상체에서 암을 치유하거나, 완화시키거나, 치료하거나, 예방하기 위한 이의 능력에 대해 평가되는 임의의 물질로서, 화학적 화합물, 생물학적 제제, 단백질, 펩티드, 핵산, 지질, 다당류, 보충제, 및 항체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
종양 관련 유전자 발현의 억제는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 대조군에 대한 종양 관련 유전자 발현의 억제는 마이크로칩 분석, RT-PCR, 인시튜 혼성화, 형광 인시튜 혼성화 또는 노던 분석(Northern analysis)에 의해 검출될 수 있다. 대조군에 대한 종양 관련 단백질 발현의 억제는 정량적 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 면역형광법, 효소-연결 면역흡착 검정, 아미노산 서열 분석, 형광 활성화 세포 분류 또는 단백질 농도 검정에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 위암 유전자 스크리닝 검정은 안지오텐신, 아포리포단백질 E, 아포리포단백질 A-I, 세룰로플라스민, 프로트롬빈, 피브로넥틴, 비타민 D-결합 단백질, 겔솔린, 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 H3, 키니노겐-1, 혈청 파라옥소나제/아릴에스테라제 1, 알파-1-안티키모트립신 및 트랜스티레틴에 대한 유전자 발현의 변화를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
아폽토시스의 활성화는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 대조군에 대한 세포 사멸의 증가는 락테이트 탈수소효소 방출, 카스파제 활성, 안넥신 V 염색, 포스파티딜세린 염색 또는 TUNEL 검정에 의해 검출될 수 있다. 특정 검정은 세포 사멸 과정에서의 비교적 늦은 사건, 예를 들어 락테이트 탈수소효소 방출을 검출한다. 카스파제 활성화는 만성 독성 및 세포 사멸의 공통적인 특징이다. 카스파제 활성은 형광 분광법에 의해 독성 공격후에 비교적 빨리(30분 내지 4시간) 측정될 수 있으며, 이에 따라 고처리량 스크리닝 기술에 적합하다. 세포의 아폽토시스 또는 괴사를 모니터링하기 위해 통상적으로 사용되는 다른 마커 및 검정은 병이 난 세포의 혈청 막의 외부 첨판 상에 포스파티딜세린의 존재, 안넥신 V 염색, 및 말단 데옥시누클레오티딜트랜스퍼라제 닉-단부 라벨링 검정(TUNEL)을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
세포 생활력의 억제는 트립판 블루, 4,6-디아미노페닐인돌(DAPI), 및 프로피디움 요오다이드와 같은 생 염료를 사용하여 살아있는 세포 및 죽은 세포의 차등 카운팅(differential counting)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다.
세포 증식의 억제는 브로모데옥시우리딘 도입에 의한 DNA의 정량화, 삼중 티미딘(3H-티미딘)의 측정, 프로피디움 요오다이드 염색, 테트라졸륨 염 또는 알라마블루(AlamarBlue) 환원을 통한 세포내 대사 분석, 및 세포내 ATP 농도의 정량화를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다. 추가 방법은 분광 분석을 통한 용해된 세포의 전체 핵산 함량의 직접 측정; 항-cdc6-펩티드 항체, 항-인간 mRNA-결합 단백질 HuR 항체 (항-HuR 항체), D 시클린 및 시클린-의존적 키나제 억제제에 대한 항체로의 형광 태그화; Ki-67 항원 검출; 정량적 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 면역형광법, 효소-연결 면역흡착 검정, 아미노산 서열 분석, 형광 활성화 세포 분류 또는 단백질 농도 검정을 통한 단백질 함량 측정을 포함한다. 상기 방법을 이용하는 상업적으로 입수 가능한 키트는 ChromaTide™ 누클레오티드 라벨링, 카복시플루오레세인 디아세테이트의 숙신이미딜 에스테르, ABSOLUTE-S™ SBIP 세포 증식 검정 키트, Vybrant Dil 세포-라벨링 용액, CyQUANT 세포 증식 검정 키트, Vybrant™ MTT 세포 증식 검정 키트, 및 FluoReporter™ 블루 형광 핵산 검정 키트를 포함한다.
세포 생존의 억제는 클론원성 검정을 포함하는, 당해 분야에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다.
III. 생체 내에서 상피 세포의 확대 또는 상피 조직의 성장을 증진시키는 방법
장, 위, 폐, 췌장 및 결장의 줄기 세포를 포함하는 상피 줄기 세포, 및 특히 장, 내이, 뇌, 신장, 간, 망막, 위, 췌장, 유방, 모낭, 난소, 부신수질, 피부, 흉선, 미뢰, 및 유선 내에 존재하는 LGR5 양성 줄기 세포는 대상체에 Wnt 효능제 및 히스톤 데아세틸라제 억제제 또는 Wnt 효능제 및 노치 효능제(Notch agonist)의 투여를 통해 생체 내에서 확대될 수 있다. 이러한 조합물은 상피 세포의 확대를 증진시켜, 생체 내에서 상피 조직의 성장을 야기시킨다.
특정 구체예에서, 장 상피 세포는 대상체에 Wnt 효능제, 예를 들어, CHIR99021 및 히스톤 데아세틸라제 억제제, 예를 들어, 발프로산, 또는 Wnt 효능제, 예를 들어, CHIR99021 및 노치 효능제의 투여 후, 생체 내에서 형성될 수 있다.
일부 구체예에서, 이러한 조합물, 예를 들어, CHIR99021 및 발프로산은 소장결장염; 바이러스 감염, 예를 들어 비특이적 장염 또는 특정 바이러스 장염; 게실염; 박테리아 소장결장염, 예를 들어 살모넬라증, 시겔라증, 캄필로박터 소장결장염, 또는 예르시니아 소장결장염; 원생동물 감염 예를 들어 아메바증; 연충 감염; 및 위막성 결장염 낭포성 섬유증 및 만성폐쇄폐병에서의 폐 합병증; 충수염; 위축위염; 바레트식도; 폐렴; 자궁경부염; 만성 간질신장염; 결장염; 결장 게실염; 결막염; 접촉피부염; 컬링궤양; 쿠싱궤양; 방광염; 괴저; 치은염; 유방염; 식도염; 췌장염; 지방층염; 연조직염위염; 사구체신염; 및 염증성장질환, 궤양성 결장염, 크론병, 애디슨병 및 사구체신염 (예를 들어, 초승달 사구체신염, 증식성 사구체신염)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 자가면역 질병을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 대상체에서의 장 질병을 치료할 수 있다.
투여되는 투약량은 수용체의 성별, 성별, 건강, 및 체중, 병행치료의 종류, 임의의 경우에 치료 횟수 및 요망되는 효과의 특성에 의존적일 것이다. 본 발명의 조성물의 투여를 위한 투여 범위는 요망되는 효과를 형성시키기에 충분히 큰 용량이다. 이러한 용량은 부작용, 예를 들어 원치 않는 교차 반응, 과민성 반응, 등을 야기시킬 정도 크지 않아야 한다. 일반적으로, 투약량은 환자에서 질환의 증상 및 크기에 따라 달라질 것이다. 반대 징후(Counter indication), 임의의 경우에, 면역 내성, 및 다른 변수들은 또한 적절한 투약량에 영향을 미칠 것이다. 예를 들어, 환자의 연령, 체중, 성별, 종, 일반적인 건강/상태와, 치료될 병태, 치료 기간, 적합한 동물 모델 (예를 들어, 설치류, 마우스)에서 포함되는 활성 성분의 LD50와 같은 인자 및 다른 공지된 인자들을 고려하여, 이러한 투약량은 마이크로그램 내지 밀리그램의 수준, 예를 들어 0.5 내지 500 mg/kg 정도, 또는 다른 적합한 양일 수 있거나, 예를 들어, 통상적인 시험 동물(예를 들어, 마우스)의 평균 체중 및 여기에 투여될 투약량(예를 들어, 100 마이크로그램)을 고려하여, 본원의 실시예로부터 계산될 수 있으며, 이에 따라, 당업자는 과도한 실험 없이 투약량을 결정할 수 있다. 특히, 인간 대상체에서, CHIR99021은 약 O.1mg/kg/일 내지 약 1OOmg/kg/일의 양으로 투여되며, 발프로산의 양은 약 1mg/kg/일 내지 약 1OOOmg/kg/일의 양으로 투여된다. 특정 구체예에서, 발프로산의 양은 15 내지 40 mg/kg/일이다.
CHIR99021 및 발프로산의 약제 조성물은 이들의 의도된 목적을 달성하는 임의의 수단에 의해 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 국소, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복막내, 경피, 직장 또는 협측 경로에 의할 수 있다. 대안적으로, 또는 동시에, 투여는 경구 경로에 의할 수 있다. 상기 설명으로부터, 변형 및 개질이 다양한 사용 및 조건으로 채택하도록 하기 위해 본원에 기술된 본 발명으로 이루어질 수 있다는 것이 명백할 것이다. 본 발명에서 사용하기 위한 방법 및 물질들이 본원에서 기술된다. 그밖에, 당해 분야에 공지된 적합한 방법 및 물질들이 또한 사용될 수 있다. 물질들, 방법들, 및 실시예들은 단지 예시적인 것으로서, 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 이러한 구체예는 또한, 하기 특허청구범위 내에 속한다. 본원의 변수의 임의의 정의에서 구성요소들의 목록의 인용은 임의의 단일 구성요소 또는 나열된 구성요소들의 조합 (또는 하위조합)으로서 그러한 변수의 정의들을 포함한다. 본원의 구체예의 인용은 임의의 단일 구체예로서 또는 임의의 다른 구체예 또는 이의 부분과 조합하여 그러한 구체예를 포함한다. 모든 공개문, 특허 출원, 특허, 시퀀스, 데이타베이스 엔트리, 및 본원에 언급된 다른 참조문헌은 전문이 참고로 포함된다.
본 발명의 예시적 구체예는 또한 하기 넘버링된 항 중 어느 한 항에 의해 기재될 수 있다:
1. 각각이 세포 배양 시스템 내에서 장세포를 생성시키기에 충분한 양의 적어도 하나의 Wnt 억제제 및 적어도 하나의 히스톤 데아세틸라제 억제제의 존재하에서 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 세포 배양 시스템에서 장세포를 형성시키는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 Pan-HDAC 억제제인 방법.
3. 제 2항에 있어서, Pan-HDAC 억제제가 발프로산, 트리코스타틴 A, 수베로일아닐리드 히드록삼산 및 SBHA로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 HDAC6 억제제인 방법.
5. 제 4항에 있어서, HDAC6 억제제가 투바신, 투바스타틴 A 및 화합물 7로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
6. 제 1항에 있어서, Wnt 억제제가 IWP-2, XAV-939, ICG-001, LGK-974, IWR-1-endo, KY02111, Wnt-C59, DKK-1, FH-535, Box5, 펩티드 Pen-N3, 항-SFRP 항체, 및 항-LRP6 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
7. 제 1항에 있어서, 골 형태형성 단백질의 억제제의 존재하에서 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
8. 제 7항에 있어서, 골 형태형성 단백질이 노긴, 코르딘, 폴리스타틴, DAN, DAN 시스테인-노트 도메인을 포함하는 단백질, 스클레로스틴, 트위스티드 가스트룰레이션, 자궁 민감성-관련 유전자-1, 결합조직 성장 인자, 인히빈, BMP-3, 및 도르소모르핀으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
9. 제 1항에 있어서, 표피 성장 인자의 존재하에서 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
10. 각각이 세포 배양 시스템에서 술잔 세포를 생성시키기에 충분한 양의 적어도 하나의 Wnt 억제제 및 적어도 하나의 Notch 억제제의 존재하에서 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 세포 배양 시스템에서 술잔 세포를 형성시키는 방법.
11. 제 10항에 있어서, Notch 억제제가 DAPT, RO4929097, LY450139, LY900009, LY3039478, LY411575, YO-01027, BMS-708163, BMS-906024, 화합물 E, BMS-299897, SAHM1, Abeta42-Selective 및 SB 225002로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
12. 제 10항에 있어서, Wnt 억제제가 IWP-2, XAV-939, ICG-001, LGK-974, IWR-1-endo, KY02111, Wnt-C59, DKK-1, FH-535, Box5, 펩티드 Pen-N3, 항-SFRP 항체, 항-LRP6 항체, 및 항-APC 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
13. 제 10항에 있어서, 표피 성장 인자의 존재하에서 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
14. 각각이 세포 배양 시스템에서 장내분비 세포를 생성시키기에 충분한 양의 Notch의 적어도 하나의 억제제 및 수용체 티로신 키나제, 미토겐-활성화 단백질(MAP) 키나제 또는 세포외 신호-조절 키나제(ERK) 중 적어도 하나를 억제하는 작용제의 존재하에서 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 배양 시스템에서 장내분비 세포를 형성시키는 방법.
15. 제 14항에 있어서, Notch 억제제가 DAPT, RO4929097, LY450139, LY900009, LY3039478, LY411575, YO-01027, BMS-708163, BMS-906024, 화합물 E, BMS-299897, SAHM1, Abeta42-Selective 및 SB 225002로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
16. 제 14항에 있어서, MAP 키나제가 미토겐-활성화 단백질키나제 키나제(MEK)인 방법.
17. 제 14항에 있어서, MAP 키나제를 억제하는 작용제가 AS-703026, PD0325901, PD98059, 셀루메티니브(Selumetinib), SL-327, U0126, TAK-733 및 트라메티니브(Trametinib)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
18. 제 14항에 있어서, RTK를 억제하는 작용제가 제피티니브(Gefitinib), AG 99, 에를로티니브(Erlotinib), 아파티니브(Afatinib), 라파티니브(Lapatinib), WZ4002 및 AG-18로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
19. 제 14항에 있어서, ERK를 억제하는 작용제가 AS-703026 또는 PD0325901인 방법.
20. 제 14항에 있어서, 골 형태형성 단백질의 억제제의 존재하에서 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
21. 제 20항에 있어서, 골 형태형성 단백질이 노긴, 코르딘, 폴리스타틴, DAN, DAN 시스테인-노트 도메인을 포함하는 단백질, 스클레로스틴, 트위스티드 가스트룰레이션, 자궁 민감성-관련 유전자-1, 결합조직 성장 인자, 인히빈, BMP-3, 및 도르소모르핀으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
22. 제 14항에 있어서, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제의 존재하에서 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
23. 제 22항에 있어서, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제가 R-스폰딘 1 , R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
24. 제 14항에 있어서, 표피 성장 인자의 존재하에서 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
25. 대상체에서 장 상피 세포를 형성시키기에 충분한 양의 Wnt 효능제 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 장 상피 세포를 형성시킬 필요가 있는 대상체에서 장 상피 세포를 형성시키는 방법.
26. 제 25항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
27. 제 25항에 있어서, Wnt 효능제가 Wnt-1/Int-1, Wnt-2/Irp(Int-I-관련 단백질), Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-10b/12, Wnt-11, Wnt-16, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 노린, CHIR99021, LiCl, BIO ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, 켄파울론, 1-아자켄파울론, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘, IQ 1, DCA, QS 11, WAY-316606, (헤테로)아릴피리미딘, 10Z-하이메니알디신, TCS 21311, TWS 119, GSK-3 억제제 IX, GSK-3 억제제 IV, GSK-3β 억제제 II, GSK-3β 억제제 I, GSK-3β 억제제 XXVII, GSK-3베타 억제제 XXVI, FRATtide, Cdk1/5 억제제, 비키닌, 및 1-아자켄파울론으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
28. 제 25항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 Pan-HDAC 억제제인 방법.
29. 제 28항에 있어서, Pan-HDAC 억제제가 발프로산, 트리코스타틴 A, 수베로일아닐리드 히드록삼산 및 SBHA로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
30. 제 25항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 HDAC6 억제제인 방법.
31. 제 30항에 있어서, HDAC6 억제제가 투바신, 투바스타틴 A 및 화합물 7로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
32. 제 25항에 있어서, Wnt 효능제가 CHIR99021이고, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 발프로산인 방법.
33. 제 32항에 있어서, CHIR99021이 약 0.1mg/kg/일 내지 약 100mg/kg/일의 양으로 투여되고, 발프로산이 약 1mg/kg/일 내지 약 1000mg/kg/일의 양으로 투여되는 방법.
34. 상피 조직 내에서 상피 줄기 세포를 증가시킴으로써 대상체에서 상피 조직을 발생시키기에 충분한 양의 Wnt 효능제 및 히스톤 데아세틸라제 억제제 또는 Wnt 효능제 및 Notch 효능제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 상피 조직을 발생시킬 필요가 있는 대상체에서 상피 조직을 발생시키는 방법.
35. 제 34항에 있어서, 상피 줄기 세포가 장, 내이, 뇌, 신장, 간, 망막, 위, 췌장, 유방, 모낭, 난소, 부신수질, 피부, 흉선, 미뢰 또는 유선 내에 존재하는 LGR5 양성 줄기 세포인 방법.
36. 대상체에서 장 상피 세포를 형성시키기에 충분한 양의 Wnt 효능제 및 Notch 효능제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 장 상피 세포를 형성시킬 필요가 있는 대상체에서 장 상피 세포를 형성시키는 방법.
35. 제 34항 또는 제 36항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
36. 제 34항 또는 제 36항에 있어서, Wnt 효능제가 Wnt-1/Int-1, Wnt-2/Irp(Int-I-관련 단백질), Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-10b/12, Wnt-11, Wnt-16, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 노린, CHIR99021, LiCl, BIO ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, 켄파울론, 1-아자켄파울론, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘, IQ 1, DCA, QS 11, WAY-316606, (헤테로)아릴피리미딘, 10Z-하이메니알디신, TCS 21311, TWS 119, GSK-3 억제제 IX, GSK-3 억제제 IV, GSK-3β 억제제 II, GSK-3β 억제제 I, GSK-3β 억제제 XXVII, GSK-3베타 억제제 XXVI, FRATtide, Cdk1/5 억제제, 비키닌, 및 1-아자켄파울론으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
37. 제 34항 또는 제 36항에 있어서, Notch 효능제가 Notch1 항체(N1 Ab), Delta 1, Delta-유사 3, Delta-유사 4, Jagged 1, Jagged 2, DSL 펩티드 및 Delta D인 방법.
38. Wnt 효능제 및 히스톤 데아세틸라제 억제제 또는 Wnt 효능제 및 Notch를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 장 장애를 치료하는 방법.
39. 제 38항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
40. 제 38항에 있어서, Wnt 효능제가 Wnt-1/Int-1, Wnt-2/Irp(Int-I-관련 단백질), Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-10b/12, Wnt-11, Wnt-16, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 노린, CHIR99021, LiCl, BIO ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, 켄파울론, 1-아자켄파울론, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘, IQ 1, DCA, QS 11, WAY-316606, (헤테로)아릴피리미딘, 10Z-하이메니알디신, TCS 21311, TWS 119, GSK-3 억제제 IX, GSK-3 억제제 IV, GSK-3β 억제제 II, GSK-3β 억제제 I, GSK-3β 억제제 XXVII, GSK-3베타 억제제 XXVI, FRATtide, Cdk1/5 억제제, 비키닌, 및 1-아자켄파울론으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
41. 제 38항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 Pan-HDAC 억제제인 방법.
42. 제 41항에 있어서, Pan-HDAC 억제제가 발프로산, 트리코스타틴 A, 수베로일아닐리드 히드록삼산 및 SBHA로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
43. 제 38항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 HDAC6 억제제인 방법.
44. 제 43항에 있어서, HDAC6 억제제가 투바신, 투바스타틴 A 및 화합물 7로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
45. 제 38항에 있어서, Wnt 효능제가 CHIR99021이고, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 발프로산인 방법.
46. 제 45항에 있어서, CHIR99021이 약 0.1mg/kg/일 내지 약 100mg/kg/일의 양으로 투여되고, 발프로산이 약 1mg/kg/일 내지 약 1000mg/kg/일의 양으로 투여되는 방법.
47. 제 38항에 있어서, Notch 효능제가 Notch1 항체(N1 Ab), Delta 1, Delta-유사 3, Delta-유사 4, Jagged 1, Jagged 2, DSL 펩티드 및 Delta D인 방법.
48. 제 38항 내지 제 47항 중 어느 한 항에 있어서, 장 장애가 소장결장염; 바이러스 감염, 예를 들어, 비특이적 장염 또는 특정 바이러스 장염; 게실염; 박테리아 소장결장염, 예를 들어, 살모넬라증, 시겔라증, 캄필로박터 소장결장염, 또는 예르시니아 소장결장염; 원생동물 감염, 예를 들어, 아메바증; 연충 감염; 및 위막성 결장염 및 낭성섬유증에서의 폐 합병증 및 만성폐쇄폐병; 충수염; 위축위염; 바레트식도; 폐렴; 자궁경부염; 만성 간질신장염; 결장염; 결장 게실염; 결막염; 접촉피부염; 컬링궤양; 쿠싱궤양; 방광염; 괴저; 치은염; 유방염; 식도염; 췌장염; 지방층염; 연조직염위염; 사구체신염; 및 염증성장질환, 궤양성 결장염, 크론병, 애디슨병 및 사구체신염(예를 들어, 초승달 사구체신염, 증식성 사구체신염)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 자가면역 질병으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기재되며, 하기 실시예는 청구항에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.
실시예
실시예 1 : Lgr5 + 장 줄기 세포의 자기 재생은 소분자들의 조합을 사용하여 유지된다
ISC의 자기-재생 및 분화는 수 개의 신호전달 경로의 통합된 조절(coordinated regulation)에 의해 제어된다[Crosnier, Stamataki, & Lewis, 2006; Scoville, Sato, He, & Li, 2008; van der Flier & Clevers, 2009]. 이러한 연구에서, Lgr5+ 줄기 세포의 자기-재생 상태를 유지시키고 다른 세포 타입에 의해 제공된 신호(cue)와 독립적으로 이들의 분화를 제어하기 위해 관련된 신호전달 경로를 타겟화하는 소분자들을 식별하였다.
선와 및 단일 Lgr5-GFP 세포를 이전에 기술된 바와 같이 단리하였다[Sato 등, 2009]. 간단하게, 소장의 근위 절반을 수확하고, 종방향으로 개방시키고, 차가운 PBS로 세척하여 관강내 함유물을 제거하였다. 조직을 이후에 가위로 2 내지 4 mm 조각으로 절단하고, 10-ml 피펫을 이용하여 피펫팅 업 및 다운에 의해 차가운 PBS로 5 내지 10회 추가로 세척하였다. 조직 단편을 얼음 상에서 30분 동안 PBS 중의 2 mM EDTA와 함께 인큐베이션하였다. EDTA의 제거 후에, 조직 단편을 PBS로 세척하여 선와를 배출하였다. 선와에 풍부한 상청액 분획들을 모으고, 70 ㎛ 세포 여과기로 통과시키고, 5분 동안 300g으로 원심분리하였다. 세포 펠렛을 성장 인자 없는 세포 배양 배지로 재현탁시키고, 150 g로 원심분리하여 단일 세포를 제거하였다. 이후에, 선와를 배양하거나 단일 세포 단리를 위해 사용하였다. 단일 세포를 얻기 위하여, 선와를 37℃에서 45분 동안 배양 배지에서 인큐베이션하고, 유리 피펫으로 분쇄하였다. 해리된 세포들을 20 ㎛ 세포 여과기로 통과시키고, 프로피듐 요오다이드로 음성 염색시키고, 단일의 살아있는 GFP-고 세포를 이전에 기술된 바와 같이 유동세포 분석법 (FACS Aria, BD)에 의해 분류하였다[Sato 등, 2009]. Lgr5 -EGFP-ires-CreERT2 마우스로부터 단리된 소장 선와를 마트리겔에 엠베딩하고, 종래 리포트(Sato 등, 2009)와 일치하는, 선와 및 선와 첨단에서 빌루스-유사 도메인 및 GFP+ 세포를 갖는 오가노이드를 야기시키는, EGF, 노긴 및 R-스폰딘 1 (총괄적으로, ENR로서 지칭됨)의 존재 하에 통상적인 배양 조건 하에서 배양하였다. 단리된 선와 또는 단일 세포를 최소 변형된 종래에 기술된 바와 같이 배양하였다[Sato 등, 2009]. 간단하게, 선와 또는 단일 세포를 마트리겔에 가두고, 24-웰 플레이트에서 웰의 중심에 플레이팅하였다. 마트리겔의 중합 후에(감소된 성장 인자; BD Bioscience), EGF (50 ng/ml, Life Technologies), 노긴 (100 ng/ml, Peprotech) 및 R-스폰딘 1 (500 ng/ml, R&D)을 포함하는 성장 인자 및 CHIR99021 (3 μΜ, Stemgent) 및 발프로산 (1 mM, Sigma- Aldrich)을 포함한 소분자를 함유한 500 ㎕의 배양 배지(Advanced DMEM/F12 (Life Technologies))를 첨가하였다. 상이한 배양 조건을 비교하기 위하여, 마트리겔에 플레이팅한 직후 소분자 또는 성장 인자를 새로이 단리된 선와에 첨가하여 선와 내에서의 ISC의 잠재적인 분화를 최소화하고 이에 따라 선와 배양을 지속시키는 능력을 시험하였다. 세포 배양 배지를 2일에 한번씩 교체하였다. 단일 세포 배양을 위하여, 세포를 Jagged-1 펩티드 (1 μΜ; AnaSpec)를 함유한 마트리겔에 엠베딩하고, Y-27632 (10 μΜ; Tocris)를 첫 2일 동안 첨가하였다. 세포를 종래에 기술된[Sato 등, 2009] 바와 같은 세포 콜로니으로서, 또는 단일 세포로서 계대시켰다. 단일 세포 계대를 위하여, 세포 배양 배지를 제거하고, Accutase (Life Technologies)를 첨가하였다. 37℃에서 10 내지 20분 동안 인큐베이션한 후에, 세포 콜로니를 피펫팅에 의해 단일 세포로 해리시켰다. 세포를 이후에 세척하고, 새로운 마트리겔에 엠베딩하고, 24-웰 플레이트에 플레이팅하였다. CV 조건에서 배양된 세포를 1:20 분할 비로 6일 마다 계대시켰다. 배양된 선와의 대략 절반은 GFP+ 세포를 함유하였으며, 이는 Lgr5-GFP 마우스의 생체내 GFP 발현과 일치한다(도 1).
ENR 조건에서 사용되는 성장 인자는 필수적이지만 적절치 않은 신호를 제공하여 Lgr5+ 줄기 세포의 자기-재생을 지속시킨다. 장 줄기 세포의 자기-재생 상태를 유지시키기 위해 필수적인 인자를 식별하기 위하여, Wnt, Notch, 및 BMP와 같은 ISC의 신호전달 경로를 조절하는 선택된 소분자를 ENR 조건 하에서, Lgr5-GFP 리포터를 사용하여 시험하였다. CHIR99021 (본원에서 CHIR 또는 C로서 지칭됨), Wnt 신호전달 경로를 활성화시키는 GSK3β 억제제는 배양물 중에서 오가노이드의 평균 크기 및 세포 수를 정량화함으로써 지시된 바와 같이, 선와 세포의 증식을 증진시켰다[도 2a, 2b 및 3a, 3b]. CHIR은 배양물에서 GFP+ 세포의 백분율 및 상대적 GFP 세기를 증가시켰는데, 이는 줄기 세포의 증가된 자기-재생을 지시한다(도 2a 및 2b). 특히, 대다수의 GFP 음성 세포는 오가노이드에 여전히 존재하였으며(도 2a), 이는 줄기 세포 자기-재생의 불충분한 유지의 결과 또는 선와에서 더욱 성숙한 GFP 음성 세포의 증식을 증진시키는 결과일 것이다. 발프로산 (VPA 또는 V), 히스톤 데아세틸라제 억제제는 또한, GFP 음성 세포의 최소 존재와 함께, GFP+ 오가노이드의 GFP 발현을 현저하게 증가시켰다(도 2a). 흥미롭게도, CHIR 및 VPA가 조합될 때(CV), GFP+ 오가노이드에서 거의 순수한 GFP+ 세포와 함께(도 2a), 세포 증식 뿐만 아니라 배양물에서 GFP 발현 세포의 백분율 및 상대적 GFP 세기는 현저하게 증가하였으며(도 2a 및 2b), 이는 이러한 배양 조건에서 분화된 세포의 최소 분화 또는 증식, 및 줄기 세포의 증가된 자기-재생을 지시한다.
CV 조건에서 GFP+ 세포는 새로이 단리된 단일 세포와 일치하는 단일 GFP-고 집단을 나타내었으며(도 3c), 이는 종래에 보고된[Sato 등, 2009] 바와 같이 Lgr5+ 줄기 세포 집단을 나타낸다. 특히, CV 조건에서, R-스폰딘 1 및 노긴은 Lgr5+ 줄기 세포의 자기-재생을 유지시키기 위해 여전히 요구되었으며, EGF는 선와의 증식을 증진시키면서, 이는 Lgr5+ 세포의 유지에 영향을 미치지 않으면서 배양물로부터 제거될 수 있다[도 3d]. CHIR 농도의 증가는 Wnt/β-카테닌 신호전달을 증가시키기 위해 R-스폰딘 1의 역할과 일치하는, GFP 발현을 증진시키기 위해 R-스폰딘 1의 필요를 추가로 제거하였다(도 3e). 또한, VPA 또는 CHIR+VPA는 또한 콜로니로부터 Lgr5+ 줄기 세포의 GFP 발현을 증진시켰다(도 3f). 또한, R-스폰딘 2는 R-스폰딘 1과 비교하여 ENR 조건에서 오가노이드 형성을 증진시키는데 있어서 보다 낮은 농도에서 보다 양호한 효능을 나타내었다(도 3g). 본 발명자들은 또한, 거의 비분화된 상태에서 인간 EPHB2+ 결장 줄기 세포 또는 결장 선와를 유지시키기 위해 이전에 나타낸 배양 조건들을 시험하였지만[Jung 등, 2011 ; Sato 등, 2011a], 소장 Lgr5-GFP 줄기 세포에 대한 유사한 효과를 달성하는데 실패하였으며(도 4a 및 4b), 이는 이러한 인자가 EPHB2+ 결장 줄기 세포 대 Lgr5+ 줄기 세포 상에서 상이한 메카니즘을 통해 작용할 수 있음을 시사한다.
성숙한 세포 타입 및 GFP 음성 줄기 세포(선와가 모자이크 GFP 발현 패턴을 나타냄을 고려함)의 부재 하에 CHIR 및 VPA의 증식 및 Lgr5+ 자기-재생 효과를 추가로 확인하기 위하여, 단일 GFP-고 세포를 FACS 분류에 의해 단리하였고(도 3c), ENR 및 CHIR 또는 VPA의 존재 하에, 또는 두 가지 화합물 모두의 존재 하에(CV 조건), 마트리겔에서 배양하였다. 단일 줄기 세포의 아노이키스를 억제하는 Rho 키나제 억제제 Y-27632(Watanabe 등, 2007)를 종래에 기술된(Sato 등, 2009) 바와 같이 첫 2일 동안 첨가하였다. 7일 배양 후에, GFP+ 줄기 세포를 함유한 콜로니는 자발적으로 형성하였다. 선와 배양물과 유사하게, CHIR은 세포 증식을 현저하게 증가시켰으며, 이는 단지 GFP 발현을 중간 정도로 증가시켰으며, VPA는 최소 전증식성 효과를 갖는 GFP 발현을 증진시켰다. CV 조건에 대하여, 세포 증식은 현저하게 증가하였으며, 배양물 중 세포의 97% 초과는 GFP+ 세포이었다(도 2c-2e, 및 5a). 선와 배양물과 비교하여, 순수한 단일 Lgr5+ 줄기 세포가 CHIR에서 배양될 때에, 형성된 오가노이드가 다수의 GFP 음성 세포를 함유하였다는 것이 주목할 만하며, 이는 줄기 세포가 이러한 조건에서 분화되며, 이에 따라 다른 인자가 Lgr5+ 줄기 세포의 자기-재생 상태를 유지시키기 위해 요구됨을 지시한다.
단리된 단일 Lgr5-GFP+ 세포를 표준 ENR 조건에서 배양할 때에, 몇몇 세포들은 오가노이드로 성장하였는데, 이는 종래 리포트(Sato 등, 2009)와 일치하고 차선의 배양 조건에 기인한 것일 것이다. CHIR이 배양물(ENR-C)에 첨가되었을 때, 콜로니-형성 효능은 20 내지 50배까지 현저하게 증가하였으며(도 2f, 2g 및 5b, 5c), 100 ng/ml에서 첨가될 때에 Wnt3A의 첨가에 대한 유사한 반응을 제공한다[도 2f, 및 Sato 등, 2011b]. 이에 대한 뚜렷한 대조에서, VPA는 CHIR의 부재 하에 결정-형성 효능을 단지 약간 증가시켰다[ENR-V, 도 2f, 2g 및 5b, 5c). 놀랍게도, 단리된 단일 Lgr5-GFP+ 줄기 세포를 CHIR 및 VPA 둘 모두의 존재 하에 배양하였을 때, 상승작용 효과 및 콜로니로 성장된 전체 세포 집단의 ~25% 내지 40%가 존재하였다(도 2f). 이는 Lgr5+ 줄기 세포에 대해 보고된 가장 효율적인 콜로니 형성을 나타내는 것으로 사료된다.
표 1: 도 2g에서의 콜로니 형성에 대한 콜로니 수
Figure pct00001
표 2: 도 5c에 콜로니 형성 효능에 대한 결장 수
Figure pct00002
FACS를 통해 분류된 세포의 일부가 전-아포프토틱 상태 하에 있고 통상적으로 12시간 내에 사멸하는 것을 고려하여(Sato 등, 2011b), 간 세포를 시딩 후 12시간에 수작업으로 카운팅하였다. 간 세포의 90% 초과는 CHIR 및 VPA 둘 모두가 배양 배지에 존재하였을 때에 오가노이드로 성장하였다(도 5d).
표 3: 도 5d에서 콜로니 형성 효능
Figure pct00003
또한, CV 조건에서 배양된 세포는 새로이 단리된 Lgr5-GFP+ 세포와 유사한 콜로니-형성 효능으로, 그리고 증식 능력의 손실 없이 10 계대 초과 동안 단일 세포로서 계대될 수 있으며, 이러한 것은 정상 핵형(2n=40) (도 2h)을 나타내었다. 이러한 결과는 CHIR 및 VPA가 Lgr5+ 줄기 세포의 자기-재생을 유지시키기 위해 표준 ENR 조건에서 존재하지 않는 신호를 제공함을 시사한다.
종래에 보고된 바와 같이, ENR 조건에서의 세포는 모든 장 상피 세포 타입을 함유한 선와-빌루스 구조를 갖는 오가노이드로 성장하였으며, 이는 알칼리 포스파타제 (Alp) 양성 장세포, 무신 2 (Muc2) 양성 술잔 세포, 크로모그라닌 A (ChgA) 양성 장내분비 세포, 리소자임 (Lyz) 양성 호산성과립세포 및 Lgr5-GFP+ 줄기 세포의 염색에 의해 확인하였다. Lgr5+ 줄기 세포는 단지 선와의 첨단에 잔류한다(도 6a 및 7a). Ki67 및 EdU 염색은 증식 세포가 단지 선와 도메인 내에 존재함을 나타낸다(도 6b 및 6c). 그러나, CV 조건에서, GFP+ 줄기 세포는 호산성과립세포의 최소 존재(도 6a)와 함께 그리고 다른 세포 타입의 존재 없이 전체 콜로니 전반에 걸쳐 존재하였다. ENR 배양물과 비교하여, CV 조건에서 Ki67 또는 EdU 양성 증식 세포는 세포 콜로니 전반에 걸쳐 존재하였다(도 6b 및 6c). 이는 정량적 실시간 PCR로 확인되었으며, 이에 의해 CV 조건에서 세포는 ENR 조건에서의 세포와 비교하여 최소 수준의 Alpi (장세포), Muc2 (술잔 세포), ChgA (장내분비 세포), 중간 수준의 리소자임 (호산성과립세포) 및 고수준의 Lgr5 (ISC)를 발현시켰다(도 6d). 이러한 발현 패턴을 다수의 계대에 걸쳐 유지시켰으며, Lgr5 발현 수준을 유지시켰다(도 6d).
CHIR은 단독으로 장세포 분화를 감소시키지만, 호산성 과립 세포 분화를 동시에 증가시켰으며(도 6d), 이는 종래 보고서(Farin 등, 2012)와 일치하였다. VPA가 단독으로 분비 분화를 감소시키고(도 6d) 보다 높은 분율의 GFP+ 줄기 세포을 유지시키기 위해 도움을 주지만, 줄기 세포의 분화를 억제하는 것이 충분치 않다. 실제로, 단리된 단일 줄기 세포가 VP A의 존재 하에 그러나 CHIR 또는 Wnt 신호전달을 증진시키는 다른 제제 없이 배양되었을 때에, 이의 생존은 Wnt가 존재하였을 때 보다 훨씬 낮다. Wnt 경로가 IWP-2에 의해 차단될 때에, VPA 단독은 줄기 세포의 자기-재생을 유지시키지 못할 수 있다(도 7b, 7c에서 IV 조건). CHIR 및 VPA의 조합은 장세포 및 분비 분화 둘 모두를 억제하였고 Lgr5+ 줄기 세포의 자기-재생 프로그램을 유지시켰다(도 6d). 이러한 결과는, CHIR 또는 VPA 단독이 Lgr5+ 줄기 세포의 자기-재생을 유지시키기에 충분치 않음을 시사하지만, CHIR 또는 다른 Wnt 활성제와 조합할 때 상승 효과를 나타낸다.
요약하면, 두 개의 소분자, CHIR 및 VPA는 호산성 과립세포와 직접 접촉 없이 또는 이의 부재 하에 Lgr5+ 줄기 세포 자기-재생을 지지할 수 있다. 특히, 이러한 소분자는 단일 줄기 세포로부터 콜로니 형성을 크게 개선시킬 수 있는데, 이는 통상적으로 호산성 과립세포에 의해 제공된 필수적인 니치 신호를 제공함을 지시한다.
실시예 2: CHIR 및 VPA에서 배양 후 Lgr5 + 줄기 세포는 다분화능을 유지한다
장 줄기 세포는 자기-재생 능력을 가질 뿐만 아니라 네 가지의 주요 세포 타입, 즉 장세포, 술잔 세포, 장내분비 세포 및 호산성 과립세포를 포함하는 장 상피에서 모든 세포 타입으로 분화한다. CV 조건에서 배양된 Lgr5+ 줄기 세포의 분화 능력을 시험하기 위하여, Lgr5+ 줄기 세포를 성숙한 세포 타입의 장으로 자발적으로 분화시킬 수 있는 ENR 조건으로 세포 콜로니를 옮겼다. 예상되는 바와 같이, CHIR 및 VPA의 회수 후에, 오가노이드의 모폴로지는 선와-빌루스 구조 및 선와 첨단에서의 Lgr5+ 줄기 세포를 갖는, ENR 조건에서 배양된 오가노이드의 통상적인 모폴로지로 변경되었다.(도 7a 및 8a). 분화 마커 Alpi, Muc2, 및 ChgA의 mRNA 발현은 상승하였으며, 세포는 유사한 수준의 리소자임을 발현시켰다(도 7b에서 ENR 및 CV와 비교함). 이러한 마커에 대한 면역세포화학 염색은 배양물에서 분화된 세포 타입의 존재를 확인하였다(도 7a).
실시예 3: 장 줄기 세포의 분화는 조절된다
다음으로, 시험관 내에서 고순도 Lgr5+ 줄기 세포를 확장시키는 능력과 함께, Lgr5+ 줄기 세포의 성숙한 세포 타입으로의 분화를 유도하는 것이 시도되었다. Wnt 및 Notch가 ISC의 분화를 조절하는 주요 신호전달 경로들 중 두 개이기 때문에, Wnt 경로 억제제 IWP-2 (또는 I) 및 Notch 억제제 DAPT (또는 D)를 사용하여 배양된 Lgr5+ 줄기 세포의 분화를 유도하였다. ENR 조건에서의 세포가 모든 상피 세포 타입을 함유한 오가노이드로 자발적으로 분화하기 때문에, ENR은 분화 배양물에 포함되었다. 6일 동안 CV 조건에서 단일 줄기 세포의 배양 이후에, 세포 콜로니를 수확하고 여러 웰로 옮기고, 단일 또는 다수의 억제제의 존재 하에 배양하였다(도 8b). 도 7b에 도시된 바와 같이, CV를 IWP-2 또는 DAPT로 대체하는 것은 ISC 마커 Lgr5 발현을 감소시키고 분화 마커 Alpi, Muc2, ChgA 및 리소자임의 발현을 유도하였다. 특히, VPA의 존재(예를 들어, R과 V, I와 IV, C와 CV, 또는 D와 DV의 비교)는 Muc2, ChgA 및 리소자임의 보다 낮은 수준의 발현을 야기시켰지만, Alpi는 그러하지 않았는데, 이는 VPA가 분비 세포 리니지 분화를 특이적으로 억제함을 지시한다. 대안적으로, IWP-2로의 Wnt 억제는 중간 정도로 상승된 Muc2 및 ChgA 발현 및 완전히 파괴된 리소자임 및 Lgr5 발현과 함께, Alpi 발현을 우선적으로 유도하였다. 이는 Wnt 신호전달이 엄격함(sternness)을 유지하고 분화를 억제하기 위해 요구지만, 또한 호산성과립세포 분화를 위해 요구되는 것을 지시한다. Notch 억제제 DAPT는 Muc2, ChgA 및 리소자임를 포함하는 분비 세포 타입의 마커를 크게 상승시켰는데, 이는 Notch 억제가 분비 세포 분화를 유도한다는 점에서 종래 리포트와 일치한다[Milano 등, 2004; VanDussen 등, 2012; Wong 등, 2004]. 또한, IWP-2 및 VPA의 조합은 아마도 두 가지 억제제 모두의 효과를 조합함으로써, 장세포 분화를 특이적으로 유도하였으며, 여기서 IWP-2는 Lgr5+ 줄기 세포 분화를 유지하면서, VPA는 Lgr5+ 줄기 세포의 분비 세포 타입으로의 분화를 억제하였다. 유사하게, DAPT 및 CHIR의 조합은 주로 호산성과립세포 분화를 유도하였으며, IWP-2 및 DAPT의 조합은 주로 술잔 세포 분화를 유도하였다. 이러한 조건은 또한 각 분화된 세포 타입의 모폴로지를 닮은 명확한 모폴로지 변화를 유도하였다(도 7c 및 8d). 장세포, 순잔 세포 및 호산성과립세포 마커의 염색은 상기 관찰을 확인하였다(도 7c, 7d 및 8e, 8f). IWP-2 또는 CHIR의 존재는 ChgA 발현에 현저하게 영향을 미치지 않았는데, 이는 술잔 세포 및 호산성과립세포와 비교하여, 장내분비 세포의 분화가 Wnt 억제 또는 활성화를 엄격하게 요구하지 않음을 지시한다.
실시예 4: CHIR 및 VPA의 반응을 매개하는 메카니즘을 시험한다
CHIR은 Wnt/β-카테인 신호전달 경로를 활성화시키는 고-특이적 GSK3 억제제이고(Bain 등, 2007), 배아 줄기 세포의 자기-재생 상태를 유지시키기 위해 사용되었다(Ying 등, 2008). CHIR의 효과가 Wnt 경로의 활성화를 통한 것임을 확인하기 위하여, 리튬 및 Wnt3a를 포함한 다른 Wnt 경로 활성제의 효과를 시험하였다. CHIR을 LiCl 또는 Wnt3a로 대체하는 것은 선와 증식을 증가시켰으며, 이는 ENR 조건과 비교하여 증가된 콜로니 크기 및 세포 수에 의해 지시된다(도 9a 및 9b). 이러한 조건들에서의 콜로니는 종래에 도시된 바와 같이 낭포-유사 구조를 나타내었다(도 9a)(Sato 등, 2011b). 유사하게, pan-HDAC 억제제 및 타입-특이적 억제제를 포함한 다른 HDAC 억제제의 효과를 시험하였다. pan-HDAC 억제제 TSA, 뿐만 아니라 HDAC6 특이적 억제제 투바스타틴 A 및 화합물 7은 GFP 발현을 VPA로 증진시키는 유사한 효과를 나타내었다(도 9c 및 9d). SBHA 및 부티레이트를 포함하는 다른 pan-HDAC 억제제, 뿐만 아니라 클래스 I (CI-994, MS275, 도 9c 및 9d), 클래스 Ila (MC1568, 도 9c 및 9d) 및 클래스 III (니코틴아미드, 도 9f) HDAC 억제제는 GFP 발현을 증진시키기 위한 효과를 나타내지 않거나 단지 중간 정도의 효과를 나타내었다(도 9c 내지 9f). TSA 및 VPA는 보다 높은 농도에서 현저한 증식 억제 효과를 나타내었지만, 두 가지 농도 모두에서 GFP 발현을 유지하였다(도 9e). 중요하게, 니코틴아미드, 인간 결정 선와의 배양(Jung 등, 2011 ; Sato 등, 2011a)에서 사용되는 시르투인(Sirtuin) 패밀리 HDAC 억제제 (클래스 III)는 CHIR 또는 Wnt3a와 조합될 때 GFP 발현 또는 세포 증식을 증진시키지 못하였으며(도 9f), 이는 VPA와는 상이한 메카니즘을 통해 작용함을 지시한다. 또한, 단일 Lgr5+ 줄기 세포가 TSA or 투바스타틴 A와 함께 CHIR을 사용하거나 Wnt3a, BIO 또는 LiCl과 VPA를 사용하여 배양되었을 때, 세포는 CV 조건과 유사한 콜로니-형성 효능, 콜로니 모폴로지, 및 GFP 발현을 나타내었다(도 10).
이전의 보고서는 Notch 경로 활성화가 분비 세포 분화를 억제하고 줄기 세포의 자가 재생을 유지하는데 필요함을 나타내었고, 이는 VPA 치료의 효과와 일치한다. VPA가 그 효과를 발휘하기 위해 Notch 경로의 엘리먼트를 표적으로 하는지를 평가하였다. 먼저, VPA의 첨가에 의한 Notch 억제의 구제를 시험하였다. γ-세크레타제 억제제 DAPT로의 처리는 손상된 세포 증식 및 GFP 발현을 발생시켰는데, 이는 VPA에 의해 용량 의존적 방식으로 구제되었다 (도 11a). 이는 VPA가 NICD 형성의 다운스트림에 작용하여 리간드-수용체 매개된 Notch 활성화의 요건을 회피할 수 있었음을 시사한다.
VPA는 암 세포주에서 Notch 경로를 활성화시키는 것이 이전에 확인되었다 (Greenblatt et al., 2007; Stockhausen et al., 2005). Notch 경로의 활성화에 대한 VPA의 효과를 조사하기 위해 ENR 또는 ENRC 조건에서 배양된 세포를 VPA로 처리하고 Notch 경로 유전자의 발현에 대해 분석하였다. 그러나, VPA를 ENR 또는 ENR-C에 24시간 동안 첨가하는 것은 Notch의 다운스트림 표적 유전자인 Notch1 또는 Hes1의 발현을 적당하게 감소시키는 것이 확인되었다 (도 11b 및 11c). 추가로, VPA 및 CHIR로 24시간 또는 6일 동안 처리된 세포에서 음성 Notch 표적 Atoh1 (Mathl)의 뚜렷한 감소가 관찰되었다 (도 11b-11d). Atoh1은 분비 세포 계통으로의 ISC의 분화에 필수적인 것으로 나타났다 (van Es et al., 2010; Yang et al., 2001). 장 줄기 세포는 Atoh1 결핍에 의해 유도된 호산성과립세포 제거 이후에 생체내 및 시험관내 둘 모두에서 여전히 기능성이다 (Durand et al., 2012; Kim et al., 2012). CHIR 또는 CHIR+VPA 처리 후에 Atoh1 억제는 장 줄기 세포의 자가-재생 프로그램을 유지하는데 도움이 될 것이다.
따라서, Lgr5+ 장 줄기 세포의 자가-재생의 제어 및 시험관내 장 상피에서 분화된 세포 유형으로의 이들의 분화는 이제 생체내 장 상피 생물학을 밀접하게 모방하는 성장 인자 및 소분자 억제제의 조합물의 이용을 통해 달성되었다 (도 12a 및 12b). 생리학적 조건 하에(도 12a), ISC의 자가-재생 및 분화는 Wnt 및 Notch 경로의 협동으로 제어된다. 두 경로 모두의 활성화 (Wnt On, 및 Notch On으로 표시됨)는 ISC를 분화되지 않은 자가-재생 상태로 유지한다. Notch 경로의 비활성화 (Notch Off)는 분비 세포 유형의 사양을 발생시키고 추가로 Wnt 경로의 비활성화 (Wnt Off)는 술잔 세포 분화를 발생시킨다. Notch의 부재 하에 Wnt 경로의 연속적인 활성화는 호산성과립세포 분화를 발생시킨다. Wnt 경로는 장내분비 세포 분화에 대해 강한 의존성이 없다. 대안적으로, 연속적인 Notch 활성화 및 Wnt 비활성화는 장세포 분화를 발생시킨다. Lgr5+ 줄기 세포가 시험관내 배양될 때 (도 12b), CHIR99021은 Wnt 경로를 활성화시키고 장세포 분화를 억제하는 한편, VPA는 단독으로 또는 CHIR과 함께 분비 세포 사양을 억제한다. CHIR 및 VPA의 조합물은 ISC를 분화되지 않은 자가-재생 상태로 유지한다. DAPT로의 Notch 경로의 억제는 분비 세포 유형의 사양을 발생시키고 추가로 CHIR의 첨가는 호산성과립세포 분화를 발생시키는 한편, Wnt 경로 억제제 IWP-2의 첨가는 술잔 세포 분화를 발생시킨다. 대안적으로, 분화를 유도하고 분비 세포 사양을 억제하는 IWP-2 및 VPA의 조합물은 장세포 분화를 발생시킨다.
실시예 5: 내이에서 유래된 Lgr5 -양성 줄기 세포의 증식은 CHIR 및 VPA의 존재 하에 증가한다
내이에서 코르티의 포유동물 기관의 감각 유모 세포는 손상시에 재생되지 않는다. Li 등 (2003)은 성체 타원낭 감각 상피가 줄기 세포의 특징적인 기능을 나타내는 세포를 함유함을 발견하였다. 이러한 내이 줄기 세포는 EGF, bFGF 및 IGF-1의 존재 하에 현탁 구체로서 시험관내에서 배양될 수 있다 (Li et al., 2003). 이후에, 유사분열-후 지지 세포가 배양액에서 분열하여 새로운 유모 세포로 전환분화하는 능력을 보유함이 발견되었는데 (Patricia et al., 2006, Nature), 이는 이러한 지지 세포가 내이 줄기 세포일 수 있음을 시사한다. 정제된 와우 지지 세포는 배아 귀주위 중간엽 공급자 세포 상에서 EGF, bFGF의 존재 하에 시험관내 배양될 수 있다 (Patricia et al., 2006). Shi 등은 지지 세포의 서브세트가 신생 및 성체 뮤린 와우에서 성체 줄기 세포에 대한 마커인 Lgr5를 발현시킴을 발견하였다 (Shi et al., 2012). 중요하게는, Lgr5-양성 세포가 분리될 수 있고, 단일-세포 현탁액에서, EGF, bFGF 및 IGF-1의 존재 하에 배양될 수 있으며, Lgr5-음성 세포에 비해 향상된 자가-재생능을 나타낸다. 이전의 내이 줄기 세포 배양액은, 아마도 세포에 대한 불충분한 성장 환경으로 인해, 단지 총 세포의 약 0.068% (Li et al., 2003) 또는 분류된 Lgr5-양성 세포의 2%만이 구체를 형성할 수 있는 현탁 배양 방법을 이용하였다 (Shi et al., 2012). 본원에 기재된 대로, 이제 내이 줄기 세포에 대한 고도로 효율적인 시험관내 배양 시스템이 개발되었다.
P1 내지 P2 Lgr5-GFP 마우스에서 분리된 마우스 와우는 도 13a에 도시된 Lgr5-양성 세포를 함유하였다. Lgr5+ 소장 줄기 세포 배양에 이용되는 동일한 배양 조건 (EGF, 노긴, R-스폰딘1, 또는 "ENR")이 먼저 확립되었다. 도 13b에 도시된 대로, EGF, 노긴 및 R-스폰딘1의 조합물은 EGF 단독에 비해 단일 와우 상피 줄기 세포로부터 집락-형성 효율을 증가시켰다. 예상한 대로, CHIR 및 VPA의 조합물은 집락-형성 효율, 세포 증식 및 세포의 GFP 발현을 크게 증가시켰지만, CHIR 단독은 그렇지 못했다. 놀랍게도, ENR-CV 조합물로부터 노긴의 제거 ("ER-CV" 조건)는 도 13b에서 명시야 및 GFP 이미지에 의해 도시된 바와 같이, 약간 높은 집락-형성 효율 및 높은 GFP 발현 수준을 발생시켰다. 이러한 결과는 R-스폰딘1 또는 CHIR에 의한 Wnt 경로 활성화가 내이 줄기 세포의 증식을 촉진시키고 CHIR 및 VPA의 조합물이 내이 줄기 세포의 증식 및 자가-재생을 크게 촉진시킴을 나타낸다.
EGF, bFGF 및 IGF-1을 포함하는 분열촉진 성장 인자가 종래에 현탁 배양 시스템에 이용되었고 분리된 내이 줄기 세포의 구체 형성을 촉진하는 것으로 나타났다 (Li et al., 2003; Shi et al., 2011). 이어서, CHIR 및 VPA의 효과를 표 1에 기재된 이러한 성장 인자의 존재 하에 시험하였다.
표 4: 세포 배양 용액
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Lgr5-GFP 마우스로부터 코르티의 분리된 기관을 아큐타제를 이용하여 단일 세포로 분리시키고 마트리겔에서 8일 동안 가용성 인자 및 소분자의 여러 조합으로 배양시켰다. 생성된 배양액을 단일 세포로 추가로 분리시키고 FACS를 이용하여 분석하였다. 이전의 결과와 일관되게, CHIR 및 VPA의 첨가는 세포 증식 (9-20배) 및 GFP+ 세포의 백분율로서 표시되는 GFP 발현 (60배) 및 GFP+ 세포의 상대 GFP 세기 (2배)를 크게 증가시켰으나, CHIR 또는 VPA 단독은 그렇지 못했다 (도 14a 및 14b). 또한, EGF, bFGF 및 IGF-1의 조합물 (EFI로 명명됨)은 ENR 조건에 비해 세포 증식 및 GFP 발현을 개선시켰다 (도 14a-14c).
CHIR 및 VPA와 조합된 개별적인 성장 인자의 효과를 추가로 조사하기 위해, 분열촉진 성장 인자 (EGF, bFGF 및 IGF-1) 뿐만 아니라 Wnt 효능제 R-스폰딘 1을 포함하는 성장 인자를 CHIR 및 VPA와 함께 시험하였다. EGF를 CV 조건에 첨가하는 것은 배양액 중 증가된 세포 수에 의해 나타난 바와 같이 세포 증식을 크게 증가시켰다. IGF-1 또는 R-스폰딘 1이 아닌 bFGF를 EGF+CV에 첨가하는 것은 세포 증식 및 GFP 발현을 더 증가시켰다 (도 14d). 비록 IGF-1 또는 R-스폰딘 1을 EGF+bFGF 조합물에 첨가하는 것이 GFP 발현을 약간 증가시켰으나 (도 14e), 본 발명자들은 이들이 배양된 세포의 증식 및 GFP 발현을 유지하는데 필수적이지 않음을 발견하였다 (도 14f).
실시예 6: Lgr5-양성 장 줄기 세포는 이식가능한 선와를 형성한다
장 줄기 세포를 이식할 가능성을 조사하기 위해, 소장 선와의 생착을 건강한 결장 조직 상에서 시험관내 시험하였다. 결장 조직을 야생형 마우스로부터 회수하고 길이 방향으로 개방시켰다. 1 cm 단편을 제거하고 PBS로 세척하였다. 수술용 블레이드로 긁어내어 상피 층을 제거하고 조직을 24 웰 플레이트에 배치시켰다. Lgr5-GFP 마우스에서 분리된 소장 선와를 DiD 막 염료로 염색하고 어드밴스드 DMEM/F12 (Invitrogen), 2 mM GlutaMax (Invitrogen), 10 mM Hepes (Invitrogen),100 U/ml 페니실린/100 ug/ml 스트렙토마이신 (Invitrogen), lx N2 보충물 (Invitrogen), lx B27 보충물 (Invitrogen), 50 ng/ml EGF (Peprotech), 500 ng/ml R-스폰딘 1 (R&D Systems), 10 μM Y-27632 (Rho 키나제 억제제, Sigma-Aldrich; 및 100 ng/ml 노긴 (Peprotech)을 함유하는 5-10 ㎕의 선와 배양 배지 내 결장 조직 상에 배치시켰다. 조직을 가습된 환경에서 37℃로 30-60분 동안 추가로 인큐베이션시켜 선와의 부착을 허용하였다. 그 후 선와 배양 배지를 웰에 첨가하고 선와를 7일 동안 더 배양하였다. 시딩된 선와는 결장에 부착되었고 24시간 후에 확산되었다 (도 15). 형광 이미지는 48시간 후에 결장에 생착된 선와를 나타내었고 (도 16) 적어도 1주일 동안 Lgr5-GFP 발현을 유지하였다 (도 17).
소장 선와의 생착 능력을 추가로 시험하기 위해, 자연 궤양성 결장염을 나타내고 인간 질환을 모방하는 TRUC 마우스 모델을 이용하였다. 탈출 조직을 TRUC 마우스로부터 절제하고 PBS로 세척하고 24 웰 플레이트에 배치시켰다. 소장 선와를 DiD로 염새하고 탈출 조직 상에 배치시켰다. 이어서 조직을 가습된 환경에서 37℃로 30-60분 동안 인큐베이션시켜 선와의 부착을 허용하였다. 선와 배양 배지를 웰에 첨가하였다. 탈출 조직 및 선와를 2일 동안 추가로 시험관내 배양하였다. 예상대로, 선와는 탈출 조직에 생착되었다 (도 17).
실시예 7: 소장 오가노이드에 대한 패치 배양 시스템은 3차원 생리학적 환경을 모방한다
점막하 스캐폴드 상에서 대규모 구성된 3차원 세포 구조 (예컨대, 오가노이드)의 성장을 뒷받침할 수 있는 시험관내 배양 시스템이 이제 개발되었다. 하기 기재된 대로, 선별된 세포 유형을 갖는 점막하층을 시딩하고 독특한 콜라겐-기반 오버레이를 이용하여 성장을 촉진함에 의해 3차원 조직 작제물을 위한 개선된 소장 점막하조직("SIS")-기반 배양 시스템이 제조되었다. 초기에 중합-전 점성 유체인 이러한 오버레이를 이용하여 시딩된 초기 세포 또는 오가노이드 (세포로부터 계대배양됨)를 코팅할 뿐만 아니라 콜라겐 잔기에서 세포를 감싸는 SIS 기재를 코팅한다 (도 19e 및 19f). 중합 후에, 세포막 뿐만 아니라 SIS와 접촉하는 위치를 유지하기 위해 액체를 응고시키고 오가노이드 확장을 촉진시킨다. 이제, 이러한 오버레이를 지닌 SIS의 조성을 다양하게 하는 것이 세포 부착 및 성장을 촉진시킴이 발견되었다. 이는, 생체내와 대조적으로, 시험관내 조직 성숙화를 촉진시킬 것이다. 이는 부착된 세포의 큰 내생-형 오가노이드로의 3차원 확장이 이식 전에 달성된다는 점에서 다른 점막하-기반 및 유사한 합성 시스템에 비해 독특한 개선이다.
추가로, 점막하에서 겔 층을 사용하지 않고 마트리겔과 유사한 속도로 3차원 오가노이드 성장을 지지하는 방법이 또한 발견되었다. 이러한 시스템은 척추동물 SIS 및 SIS 패치 상에 시딩된 선별된 세포를 포함한다. 이러한 겔-비함유 배양 시스템을 지지하기 위해 세포 시딩 전에 선별된 생물활성 작용제를 패치에 주입시킨 다 (도 19c 및 19d).
패치 배양 시스템을 개발하기 위해, 주입된 성장 인자와 함께 SIS 기재 및 콜라겐 오버레이의 다양한 조합 (도 19e 및 19f)이 연구되었다. 이는 강성 (SIS)에서 연질 (콜라겐) 매트릭스로의 전이를 갖는 더 많은 생리학적 조직 경계면의 생성을 허용하였다. 콜라겐 잔기로 코팅된 시딩된 세포 및 오가노이드에 마트리겔에 의해 제공된 것과 유사한 3차원 환경이 제공됨이 확인되었다. 이와 같이, 이러한 시스템은 3차원 오가노이드 작제물을 배양하는데 마트리겔을 대신하기에 적합하다. 시딩된 세포 또는 오가노이드의 대부분이 세포막의 절반 아래에서 SIS에 모두 부착되지만 또한 막의 비-부착된 영역에서 중합된 콜라겐에 의해 포위된다 (도 19e, 삽입). 따라서, 각각의 세포막은, 이것이 SIS이든 콜라겐이든 간에, 매트릭스 형태로 기능적으로 감싸진다. 일부 예에서, 다양한 생물활성 작용제가 적용되어 SIS 단독을 넘어 세포 및 오가노이드 시딩, 성장, 및 분화를 지지한다 (도 19f). 출원인은 장 줄기 세포 배양에 특이적인 생체분자의 주입을 기재하고 있으나, 생체분자는 췌장, 유방, 간, 및 위 조직을 포함하는 다양한 조직으로부터의 다른 시딩된 세포의 성장을 돕도록 재단될 수 있음이 명백하다. 따라서, 조직-특이적 생체분자는 다음으로부터 선택될 수 있다: 항바이러스제, 항균제, 항생제, 아미노산, 펩티드, 단백질, 당단백질, 지단백질, 항체, 스테로이드 화합물, 항생제, 항진균제, 사이토카인, 비타민, 탄수화물, 지질, 세포외 매트릭스, 세포외 매트릭스 성분, 화학요법제, 세포독성제, 성장 인자, 항-거부제, 진통제, 항-염증제, 바이러스 벡터, 단백질 합성 보조-인자, 호르몬, 내분비 조직, 합성기, 효소, 실질 세포를 지닌 폴리머-세포 스캐폴딩 작용제, 혈관형성 약물, 소분자, 나노입자, 콜라겐 격자, 항원성 작용제, 세포골격 작용제, 핵산, 세포 유인물질.
시작을 위해, 선와는 종래 방법에 따라 분리되었다 (Sato et al., 2009, Yui et al., 2012). 뮤린 소장을 분리하고, 길이 방향으로 절개하고, 빙냉 PBS로 세척하여 내강 내용물을 깨끗하게 하였다. 단편을 2 mm 조각으로 절단하고, 50 ml의 팔콘 튜브로 옮기고, 10 ml 피펫을 이용하여 50 ml의 빙냉 PBS로 부드럽게 세척하였다. 상청액을 제거하고, 상청액이 맑아질 때까지 공정을 계속하였다. 단편을 2 mM EDTA를 함유하는 PBS에서 45분 동안 4℃에서 인큐베이션시켜 선와를 방출시켰다. 상청액을 제거하고, 단편을 50 ml의 PBS를 이용하여 위아래로 피펫팅하였다. 상청액이 선와 분획을 함유하는 것으로 확인되면, 현탁액을 70 ㎛ 세포 스트레이너를 통해 여과시키고 원심분리기에서 300g로 5분 동안 회전시켰다. 선와를 10 ml의 빙냉 기초 배양 배지 (어드밴스드 DMEM/F12 (Invitrogen) 2 mM GlutaMax (Invitrogen), 10mM Hepes (Invitrogen) 및 100 U/ml 페니실린/ 100 ug/ml 스트렙토마이신 (Invitrogen) 함유)에 재현탁시키고 15 ml의 팔콘 튜브로 옮겼다. PBS 세척을 반복하고, 선와를 200g로 2분 동안 회전시켜 단일 세포를 제거하였다. 선와를 계수하고 마트리겔 또는 콜라겐 I (100ul 10x PBS, 4.9㎕ NaOH, 684㎕ H20 및 211 ㎕ 콜라겐 타입 I (래트 꼬리 고농도 9.49 mg/ml; BD Biosciences)로 구성됨)을 지닌 48 웰 플레이트에 웰 당 1000 선와의 농도로 플레이팅하였고, 각각의 웰은 200 ㎕의 매트릭스를 함유한다. 선택된 겔 생성물의 중합 이후, 어드밴스드 DMEM/F12 (Invitrogen), 2 mM GlutaMax (Invitrogen), 10 mM Hepes (Invitrogen), 100 U/ml 페니실린/100 ug/ml 스트렙토마이신 (Invitrogen), 1x N2 보충물 (Invitrogen), 1x B27 보충물 (Invitrogen), 50 ng/ml EGF (Peprotech), 500 ng/ml R-스폰딘 1 (R&D Systems), 10 μΜ Y-27632 (Rho 키나제 억제제, Sigma-Aldrich; 및 100 ng/ml 노긴 (Peprotech)을 함유하는 500 ㎕의 1x 표준 선와 배양 배지 (혈청 비함유)를 첨가하였다. 패치에 시딩하기 전 4-5일 동안 세포를 성장시켰고, 배지는 하루 걸러 교환하였다. 처음 48시간 동안 Y-27632만을 배양 배지에 포함시켰다.
배양액에서 4-5일 후 Lgr5+ 오가노이드를 종래 기재된 변형된 프로토콜을 이용하여 계대시켰다 (Sato et al., 2009). 배양 배지를 마트리겔로부터 제거하였고, 이는 이후에 p1000 피펫을 이용하여 수동으로 파괴된 후 BSA 코팅된 15 ml의 팔콘 튜브로 옮겨졌다. 콜라겐 겔을 콜라게나제 타입 XI를 함유하는 DMEM에서 37℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨 다음 BSA 코팅된 15 ml의 팔콘 튜브로 옮겼다. 기초 배지를 첨가하고 대부분의 오가노이드가 단일-선와가 될 때까지 도립 현미경으로 자주 검사하면서 오가노이드를 부드럽게 붕괴시켰다. 오가노이드를 10ml의 기초 배지로 세척하고 200g에서 2분 동안 원심분리시켰다. 펠렛을 선와 배양 배지에 500 ㎕ 당 500 단일-선와 오가노이드의 농도로 재현탁시켰다.
패치를 생성하고 표준 48-웰 플레이트의 웰 내부의 시딩을 위해 제조하였다 (웰 당 하나의 패치, 내강면을 위로). SIS를 각 웰의 바닥을 덮기에 요망되는 길이로 절단하였다 (48 웰 플레이트에 대해 약 1cm). SIS의 분리는 이전에 기술되었다 (Badylak et al., 1989). 뭉툭한 집게를 이용하여, 각각의 SIS 세그먼트를 웰의 바닥으로 옮기고 내강면이 위를 향하게 하여, 전체 직경으로 조심스럽게 확산시켰다. 배향은 외견상 표면 위에 선와의 무세포 잔해를 가시화하기 위해 도립 현미경 하에서의 분석에 의해 확인되었다. 필요한 순응도 및 강도에 따라서, 여러 층의 SIS가 적층되어 함께 결합할 수 있다. 이러한 경우에, 각각의 세그먼트는 요망되는 수의 세그먼트를 위해 다른 세그먼트의 위에 확산되며 패치는 집게로 부드럽게 가압되어 5% CO2, 37℃에서 5분 동안 공기 건조될 수 있다. 시딩 전에, 각각의 패치 세그먼트는 24시간 동안 수동 증발에 의해 탈수되었고 농축된 선와 배양 배지 및 임의로, 하기 기재된 소분자와 함께 주입되었다. 구체적으로, 패치의 각각의 세그먼트는 48 웰 플레이트의 웰에 배치되고, 내강면이 위를 향하도록, 확산되며, 100 ㎕의 농축된 인자 (EGF, 노긴, R-스폰딘 1, Y-27632, 발프로산 및 CHIR)가 5% CO2, 37℃에서 24시간 인큐베이션 동안 침착되었다.
개별적인 500 ㎕의 단일-선와 오가노이드 샘플을 패치 기재를 함유하는 웰에 침착시키고 5% CO2 및 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다 (도 20a). 시딩된 패치를 배양 배지에 24시간 동안 유지시켜 단단한 부착을 허용하고 패치에 임베딩된 성장 인자로부터 영양적 지원을 획득하였다 (도 20b).
일부 샘플에서, 얇은 콜라겐 겔 잔기(겔-패치로 명명됨)가 패치/오가노이드 복합체의 위에 코팅되어 각각의 오가노이드에 대한 최소이지만, 기능적 3차원 환경을 제공하였다. 세포 표면에서 수득된 물리적 및 화학적 단서는 생리학적 형태를 복제하기 위해 3차원 세포 구조 증식을 향상시킨다 (Seidi, A., et al., 2011). 콜라겐 I 매트릭스 (20-40 ㎕)는 레버리지 표면 장력을 해결하여 겔이 패치를 넘어 확산되는 것을 방지하기 위해, 시딩된 패치 상에 적층되었고 (도 20c) 웰 플레이트는 5% CO2, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션되었다. 선와 배양 배지 (500 ㎕)는 각 웰에 침착되었고 하루 걸러 교환되었다.
일부 샘플에서, 패치는 처음 24시간 동안 오가노이드의 부착을 촉진하는 지를 조사하기 위해 시딩 전에 성장 인자에서 인큐베이션되었다. 따라서, GF-주입된 (EGF, 노긴, R-스폰딘 1, Y-27632, 발프로산 및 CHIR 포함) 대 비-주입된 패치 (PBS 중 SIS)가 시딩되었다. 이러한 검정에서, 비-주입된 패치는 배지 성장 인자의 오가노이드도 박탈하기 위해 배양 배지 대신에 기초 배지를 이용하였다.
장 오가노이드의 성장은 7개의 분리된 시스템에서 오가노이드 당 선와의 수를 정량함에 의해 평가되었다: 마트리겔 (대조군), 주입된 성장 인자 (본원에서 GF로 언급되고, EGF, 노긴, R-스폰딘 1, Y-27632, 발프로산 및 CHIR을 포함함)를 갖는 겔-패치 시스템, 주입된 GF는 있지만 콜라겐 오버레이는 없는 베어 패치, 콜라겐 I 겔 단독, 배양 배지에 GF가 직접 첨가된 콜라겐 I 겔 (EGF, 노긴, R-스폰딘 1, Y-27632, 발프로산 및 CHIR 포함), 겔 자체에 GF가 임베딩된 콜라겐 I 겔 (EGF, 노긴, R-스폰딘 1, Y-27632, 발프로산 및 CHIR 포함), 및 콜라겐 오버레이 또는 주입된 GF가 없는 베어 패치. 배지에 GF 및 소분자가 직접 첨가된 콜라겐 I 그룹 외에, 모든 배양 배지는 각 시스템 간에 표준이었고, 하루 걸러 교환되었으며, EGF, 노긴, R-스폰딘 1, Y-27632 (처음 48시간만)를 포함하였다. 표준 선와 배양 배지는 상기에 기재되어 있다.
실험을 96시간 동안 수행하였고 오가노이드 성장의 매일 정량을 오가노이드 당 선와의 수를 시각적으로 검사함에 의해 문서화하였다. GF를 갖는 겔-패치 시스템은 마트리겔 대조군과 유사한 수준으로 오가노이드 성장을 지지할 수 있었다 (도 19). GF가 없는 베어 패치는 측정가능한 오가노이드 성장을 지지할 수 없었다. 정밀 검사시에, 베어 SIS 패치는 3차원 오가노이드와 반대로 시트에서 Lgr5+ 세포를 성장시킨 것으로 나타났다. 그러나, 주입된 GF (EGF, 노긴, R-스폰딘 1, Y-27632, 발프로산 및 CHIR)를 지닌 베어 패치는 겔-패치 시스템 및 마트리겔 둘 모두에서 동등한 수준으로 오가노이드 성장을 지지하였다. 이는, 충분한 GF 지원시, 겔-비함유 배양 시스템이 마트리겔과 동등한 수준으로 단기 3차원 오가노이드 성장을 지속시킬 수 있음을 나타낸다. 콜라겐 I 단독은 적당한 오가노이드 성장을 촉진한 반면, GF가 주입된 SIS는 콜라겐의 3차원 성장 촉진 효과에 대한 유력한 대안이다. 게다가, 동일한 GF (EGF, 노긴, R-스폰딘 1, Y-27632, 발프로산 및 CHIR)가 콜라겐 I 겔 배양의 배양 배지에 직접 첨가되었을 때, 오가노이드 성장 속도는 낮게 유지되었다. 추가로, 콜라겐 I 겔이 시딩 전에 상기 언급된 겔에 직접 임베딩된 GF와 함께 제조되었을 때, 오가노이드 성장 속도는 낮게 유지되었다. GFP 신호는 겔-패치 시스템을 통틀어 유지되었다 (도 21b 및 21c의 대표적인 예). 베어 패치 (콜라겐 오버레이 또는 GF가 없는 SIS)가 구조화된 오가노이드 성장을 지원하지 못했다는 관찰은 3차원 구조를 촉진하기 위한 충분한 물리적 및 화학적 단서의 중요성을 재확인시켜 준다.
SIS 또는 콜라겐 단독이 세포 시딩을 위한 기재 골격으로서 문헌에서 이용되었고, 이는 세포 단층을 형성하였다 (Baumert et al. 2007; Campodonico et al. 2004; Feil, G., et al. 2006; Zhang, Y., et al. 2000). 대조적으로, 이러한 두 매트릭스의 계면에서 세포를 성장시키는 것은 단층 성장에 비해 3차원 오가노이드 성장을 지지한다. 이는 생리학적 환경을 더욱 밀접하게 모방하여, 가속되고 구조화된 성장을 가능케 한다. 중요하게는, 이러한 결과는 마트리겔에 대한 양호한 대안인 소장 오가노이드에 대한 패치 배양 시스템을 기재하고 있다. 동물 모델에서 마트리겔-기반 이식은 생체적합성 문제를 포함하여 가장 중요한, 인간 모델로의 이동에 있어 상당한 장벽과 부닥쳤다. 3차원 세포-기반 구조를 성장시키는 것은 종종 두꺼운 매트릭스 겔의 임베딩을 요구한다. 패치 배양 시스템은 이러한 요구사항을 극복하는 한편, 필적할 만한 결과를 제공한다. 마트리겔을 내인성 세포외 매트릭스 물질 및 특이적 생물활성 성장 인자의 조합물로 대체하는 것은 생체적합성 문제를 회피하는 한편, 3차원 오가노이드의 생체외 성장을 유지한다. 초기 시드로부터 3차원, 생체외 오가노이드 확장의 타임랩스 이미지는 도 22에서 증명된다.
시딩 전에 성장 인자에서 패치를 인큐베이션하는 것이 처음 24시간 동안 오가노이드의 부착을 촉진시키는 지를 평가하였다. 시딩 효율은 성장 인자 주입된 패치 (EGF, 노긴, R-스폰딘 1, Y-27632, 발프로산 및 CHIR 포함) 대 비-처리된 패치 (PBS에 저장됨)에서 비교되었다. 검정은 세포를 성장 인자가 없는 배지에서 단독으로 배양할 때 (기초 배지 단독) 4 및 12시간에 배지 세척 후 남아 있는 오가노이드의 백분율을 측정함에 의해 수행되었다. SIS가 생략되고 오가노이드가 플라스틱 콜라겐-코팅된 및 콜라겐 코팅되지 않은 웰에 직접 시딩되었을 때, 모든 오가노이드의 분리는 24시간 내에 발생하였다. 그러나, SIS 패치는 구조 및 GFP 발현 둘 모두에 있어서, 24시간에 대부분의 오가노이드를 유지하였다. 세포를 성장 인자 주입된 패치 (EGF, 노긴, R-스폰딘 1, Y-27632, 발프로산 및 CHIR 포함)에 시딩했을 때 부착에서의 개선이 관찰되었다. 따라서, 성장 인자 주입은 또한 세포 생착에 대한 갭을 해소하면서 배양 동안 그리고 이식 후에 적당한 영양 및 인자를 제공하는데 유용할 수 있다.
실시예 8: 이식된 패치는 생체내 성장-촉진 특성을 나타낸다
생체내 점막 치유 특성을 평가하기 위해 패치 시스템의 무세포, 겔-비함유 변동을 시험하였다. 점막 결함의 래트 수술 모델을 설계하여 생체내 이식 패치의 성장-촉진 특성을 시험하였다. 이식 패치는 SIS의 일부를, 내강면이 위를 향하게 하여, 6 mm의 원형 폴리(글리세롤 세바케이트)우레탄 (PGSU) 백킹 상에 조심스럽게 확산시킴에 의해 어셈블링되었다. 패치를 5% CO2, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켜 PGSU 및 SIS의 결합을 가능케 하였다. 도 23에 도시된 대로, 펀치 생검을 통해 위 벽에 4 mm 결함을 생성하였다. 무세포 패치 (직경 6 mm)를 외부 위 벽에 배치하여, 선택된 물질로 결함을 조심스럽게 덮었다. 패치는 봉합 및 인근 결합 조직을 이용하여 적합화된 Graham 패치 방법 (So, et al., 1996)에 의해 고정되었다. a) PGSU-백킹된 SIS 패치 (GF 없음), b) 주입된 GF를 갖는 PGSU-백킹된 SIS 패치 (EGF, 노긴, R-스폰딘 1, Y-27632, 발프로산 및 CHIR) 및 c) PGSU 백킹 단독 (SIS 없음)을 포함하는 무세포 패치의 세 가지 변형이 이용되었다. 아무 시점에 임의의 래트에서 복막염을 관찰하였다. 기계적으로-유도된 위벽 결함에 대한 이식 일 주일 후에, 결함을 함유하는 위 조직 및 패치 임플란트를 회수하여 조직의 조직학적 검사를 수행하였다.
변형된 패치의 이식이 점막 치유 정도의 차이를 나타낼 것이라는 가설을 세웠다. 결함이 상피화되고 페쇄되었기 때문에, 육안 검사는 GF를 지닌 SIS 패치에서 현저한 이점을 보여 주었다. GF가 없는 SIS 패치에서 상피화 없는 부분적 폐쇄가 관찰되었고, PGSU 단독(대조군) 패치에서 페쇄 또는 상피화는 관찰되지 않았다. 조직학적 검사는 GF가 있고 GF가 없는 SIS 패치 둘 모두에서 가벼운 염증을 나타내었으나, 위 내용물 누출은 없었다. PGSU-단독 패치의 조직학적 검사는 중간 염증 뿐만 아니라 아마도 위 내용물의 누출에 반응한 거대 세포의 존재를 나타내었다. 따라서, 본원에 기재된 패치 배양 시스템은 패치가 단단하고 낮은 높이 프로파일을 제공하는 작은 공간 (예컨대, 장 내강, 혈관 공간)에서의 방해 가능성이 적으므로, 증가된 번역 가능성을 지니며, 배양 디시에서 환자로 직접 이식가능하다.
실시예 9: 인간 소장 선와/줄기 세포의 배양
인간 소장 선와를 실시예 1에 기재된 바와 같이 절제된 정상 소장 견본으로부터 분리하고 배양하였다. ENR (EGF, 노긴, R-스폰딘 1) 조건에 첨가된 CHIR99021 및 VPA 또는 투바스타틴 A의 조합물을 포함하는, 마우스 소장 줄기 세포/선와의 배양에 이용된 동일한 세포 배양 용액을 인간 장 줄기 세포/선와에 대한 공개된 세포 배양액과 비교하였다 (Jung et al., 2011 ; Sato et al., 2011). 구체적으로 자가-재생 또는 분화 상태를 결정함에 의해, RT-PCR을 이용하여 배양액에서 상피 줄기 세포의 유지를 평가하였다. LGR5를 줄기 세포 마커로서 이용하였고 ALPI, MUC2, CHGA 및 LYZ를 분화 마커로서 이용하였다. 배양액 중 세포 수를 계수하고 집락의 형태 및 크기를 관찰함에 의해 세포 성장을 평가하였다.
마우스 장 줄기 세포 배양액과 유사하게, CHIR+VPA 또는 CHIR+투바스타틴 A의 조합물은 줄기 세포 마커 LGR5의 발현을 크게 촉진시켰는데, 이는 배양된 세포가 줄기 세포에서 풍부해졌음을 시사한다 (도 24). 현저하게는, CHIR 및 VPA 또는 CHIR 및 투바스타틴 A를 함유하는 배양 조건은 LGR5 발현을 촉진함에 있어서 공개된 조건을 능가하였다 (도 24). 추가로, A83-01 (ALK4,5,7, Tgf-β 억제제), SB202190 (p38 억제제) 및 니코틴아미드 (비타민 B 유도체)를 포함하는, 배양 배지에 개선을 보여주는 개별적인 성분을 시험하였다. 10 mM 니코틴아미드는 CHIR+VPA 조건에 첨가될 때, 배양액에서의 증가된 세포 수에 의해 지시된 바와 와 같이 인간 소장 선와의 증식을 증가시켰고 (도 25a), LGR5 발현에는 큰 영향을 주지 않는 것이 (도 25b) 확인되었다. A83-01 및 SB202190 (AS)의 조합물은 세포의 증식을 증가시키는 한편 (도 25a), 이들은 LGR5의 발현을 크게 감소시켰다 (도 25b). 또한, 낮은 농도의 VPA (0.5 mM, 마우스 배양에 이용된 것에 비해 (1-2 mM))는 인간 소장 선와의 세포 증식을 증가시켰다 (도 25a). 총괄적으로, EGF, 노긴, R-스폰딘1, CHIR, VPA (0.5 mM) 및 니코틴아미드 또는 EX527을 함유하는 배양 조건이 인간 장 줄기 세포에 대한 최적 배양 조건이었음이 확인되었다. 이러한 조건에서, 분리된 소장 선와는 마우스 소장 줄기 세포와 유사한 집락으로 성장한다 (도 26).
실시예 10:
장 상피 세포에 대한 CHIR 및 VPA의 생체내 효과를 시험하기 위해, CHIR99021 (100 ㎕ DMSO 중 30 mg/Kg) 및 VPA (100 ㎕ 물 중 200 mg/Kg)를 위관을 통해 4-6주령 암컷 Lgr5-GFP 마우스에 투여하였다. 대조 마우스에게 100 ㎕ DMSO 및 100 ㎕ 물의 혼합물을 제공하였다. 7일 동안 48시간 마다 약물을 투여하였다 (0일, 2일, 4일 및 6일에). 7일에, 마우스를 희생시키고 장 조직을 수집하였다. 소장을 PBS로 추가 세척하고, 4% PFA로 12시간 동안 고정시키고, 파라핀에 임베딩하고, 표준 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 프로토콜을 이용하여 염색하였다. 도립 현미경 (EVOS, Advanced Microscopy Group)을 이용하여 이미지를 획득하였다. CHIR 및 VPA의 생체내 투여는 7일에 걸쳐 3회 투여 후에 선와의 크기를 증가시켰다 (도 27).
참고문헌
본 명세서에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 각각의 독립적 특허 및 간행물이 특별히 개별적으로 참조로서 포함되는 것으로 지정되는 것과 동일한 정도로 참조로서 본원에 포함된다.
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기타 구체예
본 발명은 이의 상세한 설명과 함께 기재되었으나, 전술한 기재는 예시를 위한 것으로, 첨부된 청구항의 범위에 의해 규정되는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 다른 양태, 장점 및 변형이 하기 청구항의 범위 내에 속한다.

Claims (107)

  1. 골 형태형성 단백질의 억제제, 글리코겐 신타제 키나제-3 베타의 억제제, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함하는 세포 배양 용액.
  2. 골 형태형성 단백질의 억제제, 적어도 약 3 uM의 CHIR99021 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함하는 세포 배양 용액.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 Pan-HDAC 억제제인 세포 배양 용액.
  4. 제 3항에 있어서, Pan-HDAC 억제제가 발프로산, 트리코스타틴 A, 수베로일아닐리드 히드록삼산 및 수베로히드록삼산(SBHA)으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 용액.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 HDAC6 억제제인 세포 배양 용액.
  6. 제 5항에 있어서, HDAC6 억제제가 투바신(Tubacin), 투바스타틴 A(Tubastatin A) 및 화합물 7(Compound 7)로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 용액.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 골 형태형성 단백질의 억제제가 노긴(Noggin), 코르딘(Chordin), 폴리스타틴(Follistatin), DAN, DAN 시스테인-노트 도메인을 포함하는 단백질, 스클레로스틴(Sclerostin), 트위스티드 가스트룰레이션(Twisted Gastrulation), 자궁 민감성-관련 유전자-1, 결합조직 성장 인자, 인히빈(Inhibin), BMP-3 및 도르소모르핀(Dorsomorphin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 용액.
  8. 제 1항에 있어서, 글리코겐 신타제 키나제-3 베타의 억제제가 CHIR99021, LiCl, BIO-아세톡심(BIO-아세톡심), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, 켄파울론(Kenpaullone), 1-아자켄파울론, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, TCS 21311, TWS 119, BIO-아세톡심, 10Z-하이메니알디신(10Z-Hymenialdisine), GSK-3β 억제제 II, GSK-3β 억제제 I, GSK-3β 억제제 XXVII, GSK-3β 억제제 XXVI, FRATtide 펩티드, Cdk1/5 억제제 및 비키닌(Bikinin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 용액.
  9. 제 1항에 있어서, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제가 R-스폰딘 1(R-spondin 1), R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 용액.
  10. 제 1항에 있어서, 글리코겐 신타제 키나제-3 베타의 억제제가 CHIR99021로 구성된 군으로부터 선택되고, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제가 R-스폰딘 1이고, HDAC 억제제가 발프로산인 세포 배양 용액.
  11. 노긴, R-스폰딘 1, CHIR99021 및 Atoh1 억제제를 포함하는 세포 배양 용액.
  12. 제 11항에 있어서, Atoh1 억제제가 억제 핵산인 세포 배양 용액.
  13. 제 1항, 제2항 또는 제 11항에 있어서, 표피 성장 인자를 추가로 포함하는 세포 배양 용액.
  14. 제 1항, 제 2항 또는 제 11항에 있어서, Notch1 항체(N1 Ab), Delta 1, Delta-유사 3, Delta-유사 4, Jagged 1, Jagged 2, DSL 펩티드 및 Delta D로 구성된 군으로부터 선택되는 Notch 효능제를 추가로 포함하는 세포 배양 용액.
  15. 약 5 내지 약 500 ng/ml의 EGF, 약 5 내지 약 500 ng/ml의 노긴, 약 50 내지 약 1000 ng/ml의 R-스폰딘, 약 0.1 내지 약 10 μM의 CHIR99021 및 약 0.1 내지 약 5 mM의 발프로산을 포함하는 세포 배양 용액.
  16. 골 형태형성 단백질의 억제제, R-스폰딘 1, 리튬 클로라이드 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함하는 세포 배양 용액.
  17. 제 16항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 Pan-HDAC 억제제인 세포 배양 용액.
  18. 제 17항에 있어서, Pan-HDAC 억제제가 발프로산, 트리코스타틴 A, 수베로일아닐리드 히드록삼산 및 SBHA로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포 배양 용액.
  19. 제 16항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 HDAC6 억제제인 세포 배양 용액.
  20. 제 19항에 있어서, HDAC6 억제제가 투바신, 투바스타틴 A 및 화합물 7로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 용액.
  21. 제 16항에 있어서, 골 형태형성 단백질의 억제제가 노긴, 코르딘, 폴리스타틴, DAN, DAN 시스테인-노트 도메인을 포함하는 단백질, 스클레로스틴, 트위스티드 가스트룰레이션, 자궁 민감성-관련 유전자-1, 결합조직 성장 인자, 인히빈, BMP-3, 및 도르소모르핀으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 용액.
  22. 제 16항에 있어서, 표피 성장 인자를 추가로 포함하는 세포 배양 용액.
  23. 제 16항에 있어서, Notch1 항체(N1 Ab), Delta 1, Delta-유사 3, Delta-유사 4, Jagged 1, Jagged 2, DSL 펩티드 및 Delta D로 구성된 군으로부터 선택되는 Notch 효능제를 추가로 포함하는 세포 배양 용액.
  24. 골 형태형성 단백질의 억제제, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제, Wnt 효능제 및 HDAC6 억제제를 포함하는 세포 배양 용액.
  25. 제 24항에 있어서, Wnt 효능제가 Wnt-1/Int-1, Wnt-2/Irp(Int-I-관련 단백질), Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-10b/12, Wnt-11, Wnt-16, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 노린(Norrin), CHIR99021, LiCl, BIO ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, 켄파울론, 1-아자켄파울론, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘, IQ 1, DCA, QS 11, WAY-316606, (헤테로)아릴피리미딘, 10Z-하이메니알디신, TCS 21311, TWS 119, GSK-3 억제제 IX, GSK-3 억제제 IV, GSK-3β 억제제 II, GSK-3β 억제제 I, GSK-3β 억제제 XXVII, GSK-3베타 억제제 XXVI, FRATtide, Cdk1/5 억제제, 비키닌, 및 1-아자켄파울론으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 용액.
  26. 제 24항에 있어서, HDAC6 억제제가 투바신, 투바스타틴 A 및 화합물 7로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 용액.
  27. 제 24항에 있어서, 골 형태형성 단백질의 억제제가 노긴, 코르딘, 폴리스타틴, DAN, DAN 시스테인-노트 도메인을 포함하는 단백질, 스클레로스틴, 트위스티드 가스트룰레이션, 자궁 민감성-관련 유전자-1, 결합조직 성장 인자, 인히빈, BMP-3, 및 도르소모르핀으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 용액.
  28. 제 24항에 있어서, 표피 성장 인자를 추가로 포함하는 세포 배양 용액.
  29. 제 24항에 있어서, Notch1 항체(N1 Ab), Delta 1, Delta-유사 3, Delta-유사 4, Jagged 1, Jagged 2, DSL 펩티드 및 Delta D로 구성된 군으로부터 선택되는 Notch를 추가로 포함하는 세포 배양 용액.
  30. i) 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포 또는 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 집단;
    ii) R-스폰딘 1;
    iii) CHIR99021;
    iv) 히스톤 데아세틸라제 억제제; 및
    v) 임의로, 골 형태형성 단백질의 억제제를 포함하는, 세포 배양 시스템.
  31. 제 30항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 Pan-HDAC 억제제인 세포 배양 시스템.
  32. 제 31항에 있어서, Pan-HDAC 억제제가 발프로산, 트리코스타틴 A, 수베로일아닐리드 히드록삼산 및 SBHA로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 시스템.
  33. 제 31항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 HDAC6 억제제인 세포 배양 시스템.
  34. 제 33항에 있어서, HDAC6 억제제가 투바신, 투바스타틴 A 및 화합물 7로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 시스템.
  35. 제 30항에 있어서, 골 형태형성 단백질의 억제제가 노긴, 코르딘, 폴리스타틴, DAN, DAN 시스테인-노트 도메인을 포함하는 단백질, 스클레로스틴, 트위스티드 가스트룰레이션, 자궁 민감성-관련 유전자-1, 결합조직 성장 인자, 인히빈, BMP-3, 및 도르소모르핀으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 시스템.
  36. 제 30항에 있어서, 표피 성장 인자를 추가로 포함하는 세포 배양 시스템.
  37. 제 30항에 있어서, Notch1 항체(N1 Ab), Delta 1, Delta-유사 3, Delta-유사 4, Jagged 1, Jagged 2, DSL 펩티드 및 Delta D로 구성된 군으로부터 선택되는 Notch 효능제를 추가로 포함하는 세포 배양 시스템.
  38. i) 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포 또는 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 집단;
    ii) R-스폰딘 1;
    iii) CHIR99021;
    iv) Atoh1 억제제; 및
    v) 임의로, 골 형태형성 단백질의 억제제를 포함하는, 세포 배양 시스템.
  39. 제 38항에 있어서, Atoh1 억제제가 억제 핵산인 세포 배양 시스템.
  40. 제 38항에 있어서, 골 형태형성 단백질의 억제제가 노긴, 코르딘, 폴리스타틴, DAN, DAN 시스테인-노트 도메인을 포함하는 단백질, 스클레로스틴, 트위스티드 가스트룰레이션, 자궁 민감성-관련 유전자-1, 결합조직 성장 인자, 인히빈, BMP-3, 및 도르소모르핀으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 시스템.
  41. 제 38항에 있어서, 표피 성장 인자를 추가로 포함하는 세포 배양 시스템.
  42. 제 38항에 있어서, Notch1 항체(N1 Ab), Delta 1, Delta-유사 3, Delta-유사 4, Jagged 1, Jagged 2, DSL 펩티드 및 Delta D로 구성된 군으로부터 선택되는 Notch 효능제를 추가로 포함하는 세포 배양 시스템.
  43. i) 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포 또는 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 집단;
    ii) R-스폰딘 1;
    iii) 리튬 클로라이드;
    iv) 히스톤 데아세틸라제 억제제; 및
    v) 임의로, 골 형태형성 단백질의 억제제를 포함하는, 세포 배양 시스템.
  44. 제 43항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 Pan-HDAC 억제제인 세포 배양 시스템.
  45. 제 44항에 있어서, Pan-HDAC 억제제가 발프로산, 트리코스타틴 A, 수베로일아닐리드 히드록삼산 및 SBHA로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 시스템.
  46. 제 43항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 HDAC6 억제제인 세포 배양 시스템.
  47. 제 46항에 있어서, HDAC6 억제제가 투바신, 투바스타틴 A 및 화합물 7로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 시스템.
  48. 제 43항에 있어서, 골 형태형성 단백질의 억제제가 노긴, 코르딘, 폴리스타틴, DAN, DAN 시스테인-노트 도메인을 포함하는 단백질, 스클레로스틴, 트위스티드 가스트룰레이션, 자궁 민감성-관련 유전자-1, 결합조직 성장 인자, 인히빈, BMP-3, 및 도르소모르핀으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 시스템.
  49. 제 43항에 있어서, 표피 성장 인자를 추가로 포함하는 세포 배양 시스템.
  50. 제 43항에 있어서, Notch1 항체(N1 Ab), Delta 1, Delta-유사 3, Delta-유사 4, Jagged 1, Jagged 2, DSL 펩티드 및 Delta D로 구성된 군으로부터 선택되는 Notch 효능제를 추가로 포함하는 세포 배양 시스템.
  51. i) 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포 또는 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 집단;
    ii) R-스폰딘 1;
    iii) Wnt 효능제;
    iv) HDAC6 억제제; 및
    v) 임의로, 골 형태형성 단백질의 억제제를 포함하는, 세포 배양 시스템.
  52. 제 51항에 있어서, Wnt 효능제가 Wnt-1/Int-1, Wnt-2/Irp(Int-I-관련 단백질), Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-10b/12, Wnt-11, Wnt-16, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 노린, CHIR99021, LiCl, BIO ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, 켄파울론, 1-아자켄파울론, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘, IQ 1, DCA, QS 11, WAY-316606, (헤테로)아릴피리미딘, 10Z-하이메니알디신, TCS 21311, TWS 119, GSK-3 억제제 IX, GSK-3 억제제 IV, GSK-3β 억제제 II, GSK-3β 억제제 I, GSK-3β 억제제 XXVII, GSK-3베타 억제제 XXVI, FRATtide, Cdk1/5 억제제, 비키닌, 및 1-아자켄파울론으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 시스템.
  53. 제 51항에 있어서, HDAC6 억제제가 투바신, 투바스타틴 A 및 화합물 7로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 시스템.
  54. 제 51항에 있어서, 골 형태형성 단백질의 억제제가 노긴, 코르딘, 폴리스타틴, DAN, DAN 시스테인-노트 도메인을 포함하는 단백질, 스클레로스틴, 트위스티드 가스트룰레이션, 자궁 민감성-관련 유전자-1, 결합조직 성장 인자, 인히빈, BMP-3, 및 도르소모르핀으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 시스템.
  55. 제 51항에 있어서, 표피 성장 인자를 추가로 포함하는 세포 배양 시스템.
  56. 제 51항에 있어서, Notch1 항체(N1 Ab), Delta 1, Delta-유사 3, Delta-유사 4, Jagged 1, Jagged 2, DSL 펩티드 및 Delta D로 구성된 군으로부터 선택되는 Notch 효능제로 구성되는 군으로부터 선택되는 Notch 효능제를 추가로 포함하는 세포 배양 시스템.
  57. 제 30항, 제 38항, 제 43항 또는 제 51항에 있어서, 상피 줄기 세포가 LGR5 양성 줄기 세포인 세포 배양 시스템.
  58. 제 30항, 제 38항, 제 43항 또는 제 51항에 있어서, 상피 줄기 세포의 집단이 LGR5 양성 줄기 세포의 집단인 세포 배양 시스템.
  59. 제 30항, 제 38항, 제 43항 또는 제 51항에 있어서, 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 집단이 시스템 내의 세포의 적어도 30%를 구성하는 세포 배양 시스템.
  60. 제 30항, 제 38항, 제 43항 또는 제 51항에 있어서, 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 집단이 시스템 내의 세포의 적어도 85%를 구성하는 세포 배양 시스템.
  61. 제 30항, 제 38항, 제 43항 또는 제 51항에 있어서, 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 집단이 시스템 내의 세포의 적어도 90%를 구성하는 세포 배양 시스템.
  62. 제 30항, 제 38항, 제 43항 또는 제 51항에 있어서, 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 집단이 시스템 내의 세포의 적어도 95%를 구성하는 세포 배양 시스템.
  63. 제 30항, 제 38항, 제 43항 또는 제 51항에 있어서, 상피 줄기 세포 또는 상피 전구 세포의 집단이 시스템 내의 세포의 적어도 99%를 구성하는 세포 배양 시스템.
  64. i) 종양 오가노이드;
    ii) 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제;
    iii) Wnt 효능제;
    iv) 히스톤 데아세틸라제 억제제 또는 Atoh1 억제제; 및
    v) 임의로, 골 형태형성 단백질의 억제제를 포함하는, 세포 배양 시스템.
  65. 제 64항에 있어서, Wnt 효능제가 Wnt-1/Int-1, Wnt-2/Irp(Int-I-관련 단백질), Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-1Ob/12, Wnt-11, Wnt-16, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 노린, CHIR99021, LiCl, BIO ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, 켄파울론, 1-아자켄파울론, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘, IQ 1, DCA, QS 11, WAY-316606, (헤테로)아릴피리미딘, 10Z-하이메니알디신, TCS 21311, TWS 119, GSK-3 억제제 IX,_GSK-3 억제제 IV, GSK-3β 억제제 II, GSK-3β 억제제 I, GSK-3β 억제제 XXVII, GSK-3베타 억제제 XXVI, FRATtide, Cdk1/5 억제제, 비키닌, 및 1-아자켄파울론으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 시스템.
  66. 제 64항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 HDAC6 억제제인 세포 배양 시스템.
  67. 제 66항에 있어서, HDAC6 억제제가 투바신, 투바스타틴 A 및 화합물 7로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 시스템.
  68. i) 노긴, R-스폰딘 1, CHIR99021 및 히스톤 데아세틸라제 억제제의 존재하에서 분리된 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 단계; 및 ii) 상기 분리된 상피 줄기 세포로부터 상피 오가노이드를 형성시키는 단계로서, 분리된 상피 줄기 세포의 적어도 약 25%가 상피 오가노이드를 형성하는 단계를 포함하는, 고효율로 분리된 상피 줄기 세포로부터 상피 오가노이드를 형성시키는 방법.
  69. 제 68항에 있어서, 분리된 상피 줄기 세포의 적어도 약 40%가 상피 오가노이드를 형성하는 방법.
  70. 제 68항에 있어서, 분리된 상피 줄기 세포의 적어도 약 50%가 상피 오가노이드를 형성하는 방법.
  71. 제 68항에 있어서, 분리된 상피 줄기 세포의 적어도 약 75%가 상피 오가노이드를 형성하는 방법.
  72. 제 68항에 있어서, 분리된 상피 줄기 세포의 적어도 약 90%가 상피 오가노이드를 형성하는 방법.
  73. 제 68항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 Pan-HDAC 억제제인 방법.
  74. 제 73항에 있어서, Pan-HDAC 억제제가 발프로산, 트리코스타틴 A, 수베로일아닐리드 히드록삼산 및 SBHA로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  75. 제 68항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 HDAC6 억제제인 방법.
  76. 제 75항에 있어서, HDAC6 억제제가 투바신, 투바스타틴 A 및 화합물 7로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  77. 제 68항에 있어서, 표피 성장 인자의 존재하에서 분리된 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  78. 제 68항에 있어서, Notch1 항체(N1 Ab), Delta 1, Delta-유사 3, Delta-유사 4, Jagged 1, Jagged 2, DSL 펩티드 및 Delta D로 구성되는 군으로부터 선택된 Notch 효능제의 존재하에서 분리된 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  79. 제 68항에 있어서, 콜라겐 또는 소장 점막하조직(SIS)의 존재하에서 오가노이드를 형성시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  80. i) 노긴, R-스폰딘 1, CHIR99021 및 히스톤 데아세틸라제 억제제의 존재하에서 단일한 분리된 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 단계; 및 ii) 상기 분리된 상피 줄기 세포로부터 상피 오가노이드를 형성시키는 단계로서, 단일한 분리된 상피 줄기 세포의 적어도 약 6%가 상피 오가노이드를 형성하는 단계를 포함하는, 고효율로 단일한 분리된 상피 줄기 세포로부터 상피 오가노이드를 형성시키는 방법.
  81. i) 골 형태형성 단백질의 억제제, R-스폰딘 1, Wnt 효능제, 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 화학요법제의 존재하에서 종양 오가노이드를 인큐베이션시키는 단계; 및
    ii) 세포 생활력의 억제, 세포 증식의 억제, 종양 관련 유전자 발현의 억제, 아폽토시스 및 세포 생존 억제의 활성화로 구성된 군으로부터 선택된 파라미터를 측정하는 단계로서, 상기 파라미터에서의 증가를 검출하는 것이 종양 오가노이드에 관한 화학요법제의 효능을 나타내는 단계를 포함하는, 종양 오가노이드에 관한 화학요법제의 효능을 결정하는 방법.
  82. 제 81항에 있어서, Wnt 효능제가 Wnt-1/Int-1, Wnt-2/Irp(Int-I-관련 단백질), Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-10b/12, Wnt-11, Wnt-16, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 노린, CHIR99021, LiCl, BIO ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, 켄파울론, 1-아자켄파울론, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘, IQ 1, DCA, QS 11, WAY-316606, (헤테로)아릴피리미딘, 10Z-하이메니알디신, TCS 21311, TWS 119, GSK-3 억제제 IX,_GSK-3 억제제 IV, GSK-3β 억제제 II, GSK-3β 억제제 I, GSK-3β 억제제 XXVII, GSK-3베타 억제제 XXVI, FRATtide, Cdk1/5 억제제, 비키닌, 및 1-아자켄파울론으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  83. 제 81항에 있어서, 골 형태형성 단백질의 억제제가 노긴, 코르딘, 폴리스타틴, DAN, DAN 시스테인-노트 도메인을 포함하는 단백질, 스클레로스틴, 트위스티드 가스트룰레이션, 자궁 민감성-관련 유전자-1, 결합조직 성장 인자, 인히빈, BMP-3, 및 도르소모르핀으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  84. 제 81항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 Pan-HDAC 억제제인 방법.
  85. 제 84항에 있어서, Pan-HDAC 억제제가 발프로산, 트리코스타틴 A, 수베로일아닐리드 히드록삼산 및 SBHA로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  86. 제 81항에 있어서, 히스톤 데아세틸라제 억제제가 HDAC6 억제제인 방법.
  87. 제 86항에 있어서, HDAC6 억제제가 투바신, 투바스타틴 A 및 화합물 7로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  88. 제 81항에 있어서, 표피 성장 인자의 존재하에서 종양 오가노이드를 인큐베이션시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  89. 제 81항에 있어서, Notch1 항체(N1 Ab), Delta 1, Delta-유사 3, Delta-유사 4, Jagged 1, Jagged 2, DSL 펩티드 및 Delta D로 구성되는 군으로부터 선택되는 Notch 효능제의 존재하에서 종양 오가노이드를 인큐베이션시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  90. 각각 호산성과립세포를 생성시키기에 충분한 양의 적어도 하나의 Wnt 효능제 및 적어도 하나의 Notch의 억제제의 존재하에서 상피 줄기 세포를 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 세포 배양 시스템에서 호산성과립세포를 형성시키는 방법.
  91. 제 90항에 있어서, Notch의 억제제가 DAPT인 방법.
  92. 제 90항에 있어서, Wnt 효능제가 Wnt-1/Int-1, Wnt-2/Irp(Int-I-관련 단백질), Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-10b/12, Wnt-11, Wnt-16, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 노린, CHIR99021, LiCl, BIO ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, 켄파울론, 1-아자켄파울론, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘, IQ 1, DCA, QS 11, WAY-316606, (헤테로)아릴피리미딘, 10Z-하이메니알디신, TCS 21311, TWS 119, GSK-3 억제제 IX, GSK-3 억제제 IV, GSK-3β 억제제 II, GSK-3β 억제제 I, GSK-3β 억제제 XXVII, GSK-3베타 억제제 XXVI, FRATtide, Cdk1/5 억제제, 비키닌, 및 1-아자켄파울론으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  93. 제 90항에 있어서, 상피 줄기 세포가 적어도 하나의 골 형태형성 단백질의 억제제의 존재하에서 인큐베이션되는 방법.
  94. 제 93항에 있어서, 골 형태형성 단백질의 억제제가 노긴, 코르딘, 폴리스타틴, DAN, DAN 시스테인-노트 도메인을 포함하는 단백질, 스클레로스틴, 트위스티드 가스트룰레이션, 자궁 민감성-관련 유전자-1, 결합조직 성장 인자, 인히빈, BMP-3, 및 도르소모르핀으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  95. 제 90항에 있어서, 상피 줄기 세포가 LGR5 양성 줄기 세포인 방법.
  96. 점막하조직 기부, 콜라겐을 포함하는 코팅 층 및 상피 줄기 세포, 상피 줄기 세포를 포함하는 분리된 조직 및/또는 상피 오가노이드로 구성된 군의 임의의 일원을 포함하는 세포 층을 포함하는 세포 배양 시스템.
  97. 제 96항에 있어서, 콜라겐을 포함하는 코팅이 상피 줄기 세포, 상피 줄기 세포를 포함하는 분리된 조직 또는 상피 오가노이드의 상부에 존재하는 세포 배양 시스템.
  98. 제 96항에 있어서, 콜라겐을 포함하는 코팅이 상피 줄기 세포, 상피 줄기 세포를 포함하는 분리된 조직, 또는 상피 오가노이드를 둘러싸는 세포 배양 시스템.
  99. 제 96항에 있어서, 콜라겐을 포함하는 코팅이 SIS 기부와 상피 줄기 세포, 상피 줄기 세포를 포함하는 분리된 조직 또는 상피 오가노이드 사이에 존재하는 세포 배양 시스템.
  100. 제 96항에 있어서, 점막하조직 기부가 SIS를 포함하는 세포 배양 시스템.
  101. 제 96항에 있어서, 골 형태형성 단백질의 억제제, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제, Wnt 효능제, (1R,4r)-4-((R)-1-아미노에틸)-N-(피리딘-4-일) 사이클로헥산카르복사미드 디하이드로클로라이드("Y-27632") 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함하는 용액을 추가로 포함하는 세포 배양 시스템.
  102. 제 96항에 있어서, 점막하조직 기부가 표피 성장 인자, 골 형태형성 단백질의 억제제, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제, Wnt 효능제, Y-27632 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함하는 세포 배양 시스템.
  103. 제 101항 또는 제 102항에 있어서, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 결합 수용체 5에 결합하는 작용제가 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 시스템.
  104. 제 101항 또는 제 102항에 있어서, Wnt 효능제가 Wnt-1/Int-1, Wnt-2/Irp(Int-I-관련 단백질), Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-10b/12, Wnt-11, Wnt-16, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4, 노린, CHIR99021, LiCl, BIO ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, 켄파울론, 1-아자켄파울론, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘, IQ 1, DCA, QS 11, WAY-316606, (헤테로)아릴피리미딘, 10Z-하이메니알디신, TCS 21311, TWS 119, GSK-3 억제제 IX,_GSK-3 억제제 IV, GSK-3β 억제제 II, GSK-3β 억제제 I, GSK-3β 억제제 XXVII, GSK-3베타 억제제 XXVI, FRATtide, Cdk1/5 억제제, 비키닌, 및 1-아자켄파울론으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 배양 시스템.
  105. 점막하조직 기부 및 상피 줄기 세포, 상피 줄기 세포를 포함하는 분리된 조직, 또는 상피 오가노이드를 포함하는 세포 배양 시스템으로서, 상기 점막하조직 기부가 표피 성장 인자, 골 형태형성 단백질, R-스폰딘 1, CHIR99021, Y-27632 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함하는 세포 배양 시스템.
  106. 제 105항에 있어서, 표피 성장 인자, 골 형태형성 단백질의 억제제, R-스폰딘 1, CHIR99021, Y-27632 및 히스톤 데아세틸라제 억제제를 포함하는 용액을 추가로 포함하는 세포 배양 시스템.
  107. 제 105항에 있어서, 점막하조직 기부가 SIS를 포함하는 세포 배양 시스템.
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