ES2908026T3

ES2908026T3 - Composiciones y procedimientos para la expansión y el cultivo de células madre epiteliales

Info

Publication number: ES2908026T3
Application number: ES20156482T
Authority: ES
Inventors: Jeffrey Karp; Xiaolei Yin; Marc David Succi; Robert Langer
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc; Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc; Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2022-04-27
Anticipated expiration: 2034-03-11
Also published as: HUE057521T2; JP6764909B2; HK1219754A1; EP2970890A4; CN108865972A; PT3702443T; EP4056677A1; DK3702443T3; KR20160006167A; DK2970890T3; EP2970890B1; ZA201904258B; JP2016510999A; EP3702443A1; HUE049377T2; US10041047B2; IL241572B; JP2018174947A; US10041046B2; WO2014159356A1

Abstract

CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un trastorno del oído interno en un sujeto con necesidad de ello, en el que el CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con ácido valproico (VPA), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y en el que el tratamiento comprende la generación de tejido epitelial en el sujeto mediante la administración del CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto en una cantidad suficiente para incrementar las células madre epiteliales positivas para LGR5 presentes en el interior del oído interno mediante la administración del CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para la expansión y el cultivo de células madre epiteliales

Antecedentes de la invención

Una única capa de células epiteliales que se autorrenueva activamente y se organiza en criptas y vellosidades recubre el intestino. Se ha demostrado recientemente que la renovación del epitelio intestinal está regida por células madre intestinales (ISC) Lgr5+, que residen en la base de estas criptas (Barker et al., 2007). Las células madre Lgr5+ pueden aislarse y cultivarse in vitro para formar organoides que contienen estructuras de criptas y vellosidades que recuerdan al epitelio intestinal nativo (Sato et al., 2009). Si bien estas células madre pueden expandirse durante múltiples pases en forma de organoides, las condiciones de cultivo existentes proporcionan poco o ningún control sobre la autorrenovación y la diferenciación. Los cultivos típicos consisten en poblaciones de células heterogéneas, que incluyen células madre y células diferenciadas (Sato et al., 2009). En particular, la autorrenovación y la proliferación de células madre Lgr5+ tanto in vitro como in vivo dependen del contacto celular directo entre las células madre Lgr5+ y otro tipo de células de la cripta conocidas como células de Paneth (Snippert et al., 2010), lo que complica y limita significativamente la capacidad de controlar el destino de células madre Lgr5+ en cultivo. La incapacidad de expandir eficazmente las células madre Lgr5+ limita considerablemente la transferencia de esta biología a tratamientos, en los que son esenciales cultivos homogéneos de células madre y procesos de ampliación eficaces antes del trasplante. Además, continúa siendo una necesidad desarrollar sistemas orientados clínicamente mejorados para el trasplante de tejido epitelial expandido ex vivo en órganos receptores lesionados.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención proporciona CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un trastorno del oído interno en un sujeto con necesidad de ello, en el que el CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con ácido valproico (VPA), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. El tratamiento comprende la generación de tejido epitelial en el sujeto mediante la administración del CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto en una cantidad suficiente para incrementar las células madre epiteliales positivas para LGR5 presentes en el interior del oído interno mediante la administración del CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto.

En otro aspecto de la invención se proporciona ácido valproico (VPA), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un trastorno del oído interno en un sujeto con necesidad de ello, en el que el VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. El tratamiento comprende la generación de tejido epitelial en el sujeto mediante la administración del VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto en una cantidad suficiente para incrementar las células madre epiteliales positivas para LGR5 presentes en el interior del oído interno mediante la administración del VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto.

La divulgación también proporciona soluciones de cultivo celular. En un ejemplo, la divulgación proporciona una solución de cultivo celular que comprende un inhibidor de una proteína morfogénica ósea, un inhibidor de glucógeno sintasa quinasa-3 beta, un agente que se une al receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina y un inhibidor de histona desacetilasa. En una forma de realización, el inhibidor de glucógeno sintasa quinasa-3 beta puede ser CHIR99021, el agente que se une al receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina puede ser R-espondina 1 y el inhibidor de HDAC puede ser ácido valproico.

En otro ejemplo, la divulgación proporciona una solución de cultivo celular que comprende un inhibidor de una proteína morfogénica ósea, al menos aproximadamente 3 uM de CHIR99021 y un inhibidor de histona desacetilasa.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona una solución de cultivo celular que comprende un inhibidor de una proteína morfogénica ósea, un agente que se une al receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina, un agonista de Wnt y un inhibidor de HDAC6.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona una solución de cultivo celular que comprende un inhibidor de una proteína morfogénica ósea, R-espondina 1, cloruro de litio y un inhibidor de histona desacetilasa.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un inhibidor de histona desacetilasa que es un inhibidor de Pan-HDAC. El inhibidor de Pan-HDAC puede seleccionarse del grupo que consiste en ácido valproico, tricostatina A, ácido suberoilanilida-hidroxámico y ácido suberohidroxámico (SBHA).

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un inhibidor de histona desacetilasa que es un inhibidor de HDAC6. El inhibidor de HDAC6 se puede seleccionar del grupo que consiste en tubacina, tubastatina A y compuesto 7.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un inhibidor de una proteína morfogénica ósea que puede seleccionarse del grupo que consiste en nogina, cordina, folistatina, DAN, proteínas que comprenden un dominio de nudo de cisteína DAN, esclerostina, gastrulación retorcida, gen-1 asociado a sensibilidad uterina, factor de crecimiento del tejido conectivo, inhibina, BMP-3 y dorsomorfina.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un inhibidor de glucógeno sintasa quinasa-3 beta que puede seleccionarse del grupo que consiste en CHIR99021, LiCl, BIO-acetoxima, CHIR98014, s B 216763, SB 415286, 3F8, kenpaulona, 1-azakenpaulona, TC-G 24, TCS 2002, a R-A 014418, TCS 21311, t W s 119, BIO-acetoxima, 10Z-himenialdisina, inhibidor de GSK-3p II, inhibidor de GSK-3p I, inhibidor de GSK-3p XXVII, inhibidor de GSK-3p XXVI, péptido FRATtide, inhibidor de Cdk1/5 y bikinina.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un agente que se une al receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina que puede seleccionarse del grupo que consiste en R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 y R-espondina 4.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un agonista de Wnt que puede seleccionarse del grupo que consiste en: Wnt-1 /Int-1, Wnt-2/Irp (proteína relacionada con Int-I), Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-10b/12, Wnt-11, Wnt-16, R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3, R-espondina 4, norrina, CHIR99021, LiCl, BIO ((2'Z,3'E)-6-bromoindirrubina-3'-oxima), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, kenpaulona, 1-azakenpaulona, TC-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, 2-amino-4-[3,4-(metilendioxi)bencil-amino]-6-(3-metoxifenil)pirimidina, IQ 1, DCA, QS 11, WAY-316606, (hetero)arilpirimidinas, 10Z-himenialdisina, TCS 21311, TWS 119, inhibidor de GSK-3 iX, inhibidor de GSK-3 IV, inhibidor de GsK-3p II, inhibidor de GSK-3p I, inhibidor de GSK-3p XXVII, inhibidor de GSK-3beta XXVI, FRATtide, inhibidor de Cdk1/5, bikinina y 1-azakenpaulona.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona una solución de cultivo celular que comprende nogina, R-espondina 1, CHIR99021 y un inhibidor de Atohl. El inhibidor de Atohl puede ser un ácido nucleico inhibidor.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona una solución de cultivo celular que comprende además un factor de crecimiento epidérmico y/o un agonista de Notch. El agonista de Notch se puede seleccionar del grupo que consiste en un anticuerpo Notch1 (N1 Ab), Delta 1, similar a Delta 3, similar a Delta 4, Jagged 1, Jagged 2, péptido DSL y Delta D.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 ng/ml de EGF, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 ng/ml de nogina, de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 ng/ml de R-espondina, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 pM de CHIR99021 y de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 mM de ácido valproico.

En otro aspecto más, la divulgación proporciona sistemas de cultivo celular que comprenden soluciones de cultivo celular de la divulgación.

En un ejemplo, la divulgación proporciona un sistema de cultivo celular que comprende:

i) una célula madre epitelial o una célula progenitora epitelial o una población de células madre epiteliales o células progenitoras epiteliales;

ii) R-espondina 1;

iii) CHIR99021;

iv) un inhibidor de histona desacetilasa; y

v) opcionalmente un inhibidor de una proteína morfogénica ósea.

En otro ejemplo, la divulgación proporciona un sistema de cultivo celular que comprende:

ii) R-espondina 1;

iii) CHIR99021;

iv) un inhibidor de Atohl; y

v) opcionalmente un inhibidor de una proteína morfogénica ósea.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un sistema de cultivo celular que comprende:

ii) R-espondina 1;

iii) cloruro de litio;

iv) un inhibidor de histona desacetilasa; y

v) opcionalmente un inhibidor de una proteína morfogénica ósea.

ii) R-espondina 1;

iii) un agonista de Wnt;

iv) un inhibidor de HDAC6; y

v) opcionalmente un inhibidor de una proteína morfogénica ósea.

En otro ejemplo más, los sistemas de cultivo celular de la divulgación comprenden células madre epiteliales y poblaciones de células madre epiteliales que pueden comprender células madre positivas para LGR5.

En otro ejemplo más, la población de células madre epiteliales o células progenitoras epiteliales en el sistema de cultivo celular de la invención comprende al menos el 30%, 85%, 90%, 95% o 99% de las células del sistema.

i) un organoide tumoral;

ii) un agente que se une al receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina;

iii) un agonista de Wnt;

iv) un inhibidor de histona desacetilasa o un inhibidor de Atohl; y

v) opcionalmente un inhibidor de una proteína morfogénica ósea.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un sistema de cultivo celular que comprende una base submucosa, una capa de recubrimiento que comprende colágeno y una capa celular que comprende cualquier miembro del grupo que consiste en células madre epiteliales, un tejido aislado que comprende células madre epiteliales, y/u organoides epiteliales. El recubrimiento que comprende colágeno puede encontrarse por encima de, o rodeando, las células madre epiteliales, el tejido aislado que comprende células madre epiteliales, o los organoides epiteliales. El recubrimiento que comprende colágeno también puede encontrarse entre la base SIS y las células madre epiteliales, el tejido aislado que comprende células madre epiteliales, o los organoides epiteliales. La base submucosa puede comprender SIS y además puede comprender un factor de crecimiento epidérmico, una proteína morfogénica ósea, un agente que se une al receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina, un agonista de Wnt, Y-27632 y un inhibidor de histona desacetilasa. Este sistema de cultivo celular puede comprender además soluciones de cultivo celular de la invención, que incluyen una solución que comprende un inhibidor de una proteína morfogénica ósea, un agente que se une al receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina, un agonista de Wnt, Y-2763 y un inhibidor de histona desacetilasa.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un sistema de cultivo celular que comprende una base submucosa y células madre epiteliales, tejido aislado que comprende células madre epiteliales, u organoides epiteliales, en el que la base submucosa comprende un factor de crecimiento epidérmico, una proteína morfogénica ósea, R-espondina 1, CHIR99021, Y-27632 y un inhibidor de histona desacetilasa. Este sistema de cultivo celular puede comprender además una solución que comprende un factor de crecimiento epidérmico, un inhibidor de una proteína morfogénica ósea, R-espondina 1, CHIR99021, Y-27632 y un inhibidor de histona desacetilasa.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona procedimientos para formar organoides epiteliales a partir de células madre epiteliales aisladas.

En un ejemplo, la divulgación proporciona un procedimiento para formar organoides epiteliales a partir de células madre epiteliales aisladas con alta eficacia, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

i) incubar células madre epiteliales aisladas en presencia de nogina, R-espondina 1, CHIR99021 y un inhibidor de histona desacetilasa; y

ii) formar organoides epiteliales a partir de dichas células madre epiteliales aisladas, en el que al menos aproximadamente el 25%, 40%, 50%, 75%, 90%, de las células madre epiteliales aisladas forman organoides epiteliales.

En otro ejemplo, la divulgación proporciona un procedimiento para formar organoides epiteliales a partir de una única célula madre epitelial aislada con alta eficacia, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

i) incubar dicha única célula madre epitelial aislada en presencia de nogina, R-espondina 1, CHIR99021 y un inhibidor de histona desacetilasa; y

ii) formar organoides epiteliales a partir de dicha célula madre epitelial aislada, en el que al menos aproximadamente el 6% de las células madre epiteliales aisladas individuales forman organoides epiteliales.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un procedimiento para determinar la eficacia de un agente quimioterapéutico con respecto a un organoide tumoral, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: i) incubar un organoide tumoral en presencia de un inhibidor de una proteína morfogénica ósea, R-espondina 1, un agonista de Wnt, un inhibidor de histona desacetilasa y un agente quimioterapéutico; y

ii) medir un parámetro seleccionado del grupo que consiste en la inhibición de la viabilidad celular, la inhibición de la proliferación celular, la inhibición de la expresión génica asociada a tumores, la activación de la apoptosis y la inhibición de la supervivencia celular,

en el que la detección de un aumento en el parámetro indica la eficacia del agente quimioterapéutico con respecto a un organoide tumoral.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un procedimiento para formar una célula de Paneth en un sistema de cultivo celular que comprende incubar una célula madre epitelial en presencia de al menos un agonista de Wnt y al menos un inhibidor de Notch, cada uno en una cantidad suficiente para producir una célula de Paneth.

En un ejemplo, la célula madre epitelial puede incubarse adicionalmente en presencia de al menos un inhibidor de una proteína morfogénica ósea.

En otro ejemplo, el inhibidor de Notch es DAPT.

En otro ejemplo más, la célula madre epitelial es una célula madre positiva para LGR5.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un procedimiento para formar un enterocito en un sistema de cultivo celular que comprende incubar una célula madre epitelial en presencia de al menos un inhibidor de Wnt y al menos un inhibidor de histona desacetilasa, cada uno en una cantidad suficiente para producir un enterocito en un sistema de cultivo celular. La célula madre epitelial puede incubarse también en presencia de un factor de crecimiento epidérmico y/o un inhibidor de una proteína morfogénica ósea.

En un ejemplo, el inhibidor de Wnt puede seleccionarse del grupo que consiste en IWP-2, XAV-939, ICG-001, LGK-974, IWR-1 -endo, KY02111, Wnt-C59, DKK-1, FH-535, Box5, péptido Pen-N3, anticuerpo anti-SFRP y anticuerpo anti-LRP6.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un procedimiento para formar una célula caliciforme en un sistema de cultivo celular que comprende incubar una célula madre epitelial en presencia de al menos un inhibidor de Wnt y al menos un inhibidor de Notch, cada uno en una cantidad suficiente para producir una célula caliciforme en un sistema de cultivo celular. La célula madre epitelial puede incubarse también en presencia de un factor de crecimiento epidérmico.

En un ejemplo, el inhibidor de Notch puede seleccionarse del grupo que consiste en DAPT, RO4929097, LY450139, LY900009, LY3039478, LY411575, YO-01027, BMS-708163, BMS-906024, compuesto E, BMS-299897, SAHM1, selectivo de Abeta42 y SB 225002.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un procedimiento para formar una célula enteroendocrina en un sistema de cultivo que comprende incubar una célula madre epitelial en presencia de al menos un inhibidor de Notch y un agente que inhibe al menos uno de un receptor de tirosina quinasa, una proteína activada por mitógeno (MAP) quinasa o una quinasa regulada por señal extracelular (ERK), cada uno en una cantidad suficiente para producir una célula enteroendocrina en un sistema de cultivo celular. La célula madre epitelial puede incubarse también en presencia de un factor de crecimiento epidérmico, un agente que se une al receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina y/o un inhibidor de una proteína morfogénica ósea. La MAP quinasa puede ser una proteína activada por mitógeno quinasa quinasa (MEK).

En un ejemplo, el agente que inhibe la MAP quinasa puede seleccionarse del grupo que consiste en AS-703026, PD0325901, PD98059, selumetinib, SL-327, U0126, TAK-733 y trametinib.

En otro ejemplo, el agente que inhibe un RTK puede seleccionarse del grupo que consiste en gefitinib, AG 99, erlotinib, afatinib, lapatinib, WZ4002 y AG-18.

En otro ejemplo más, el agente que inhibe una ERK puede ser AS-703026 o PD0325901.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un procedimiento para formar células epiteliales intestinales en un sujeto con necesidad de ello que comprende administrar al sujeto un agonista de Wnt y un inhibidor de histona desacetilasa en una cantidad suficiente para formar células epiteliales intestinales en el sujeto. El agonista de Wnt puede ser CHIR99021 y el inhibidor de histona desacetilasa puede ser ácido valproico. El CHIR99021 se puede administrar en una cantidad de aproximadamente 0,1 mg/kg/día a aproximadamente 100 mg/kg/día y el ácido valproico se puede administrar en una cantidad de aproximadamente 1 mg/kg/día a aproximadamente 1000 mg/kg/día.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un procedimiento para formar células epiteliales intestinales en un sujeto con necesidad de ello que comprende administrar al sujeto un agonista de Wnt y un agonista de Notch en una cantidad suficiente para formar células epiteliales intestinales en el sujeto.

En otro ejemplo más, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar un trastorno intestinal, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto un agonista de Wnt y un inhibidor de histona desacetilasa o un agonista de Wnt y un agonista de Notch. En algunas formas de realización, el trastorno intestinal se selecciona del grupo que consiste en: enterocolitis; infecciones víricas, tales como enteritis no específica o enteritis vírica específica; diverticulitis; enterocolitis bacteriana, tal como salmonelosis, shigelosis, enterocolitis por Campylobacter o enterocolitis por Yersinia; infecciones por protozoos tales como amebiasis; infección helmíntica; y colitis seudomembranosa y complicaciones pulmonares en fibrosis quística y enfermedad pulmonar obstructiva crónica; apendicitis; gastritis atrófica; esófago de Barrett; neumonitis; cervicitis; nefritis intersticial crónica; colitis; diverticulitis colónica; conjuntivitis; dermatitis de contacto; úlceras de Curling; úlceras de Cushing; cistitis; gangrena; gingivitis; mastitis; esofagitis; pancreatitis; paniculitis; gastritis flemonosa; glomerulonefritis; y enfermedades autoinmunitarias que incluyen, pero sin limitación, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad de Addison y glomerulonefritis (por ejemplo, glomerulonefritis crescéntica, glomerulonefritis proliferativa).

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y las figuras siguientes y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Descripción detallada siguiente, que se proporciona a modo de ejemplo, pero no pretende limitar la invención a las formas de realización específicas descritas, puede entenderse junto con las figuras adjuntas, que se incorporan al presente documento como referencia.

La figura 1 representa la expresión dispersada de Lgr5-GFP in vivo. Se recogió el intestino delgado de ratones Lgr5-GFP y se tomó directamente una imagen empleando microscopía de fluorescencia. Si bien todas las regiones del intestino delgado estaban cubiertas por criptas, aproximadamente la mitad de estas criptas contenían células GFP+. Barra de escala: 100 gm.

Las figuras 2A-2H muestran la combinación de CHIR y VPA que promueve la proliferación y la autorrenovación de células madre Lgr5+. La figura 2A representa imágenes de GFP y de campo brillante de criptas del intestino delgado cultivadas durante 6 días en presencia de ENR (EGF, nogina y R-espondina 1), ENR+VPA (ENR-V), ENR+CHIR (ENR-C) y ENR+VPA+CHIR (ENR-CV). Las células apoptóticas son visibles en el lumen con autofluorescencia (flechas rojas), y las flechas blancas indican Lgr5-GFP específico en la base de las criptas. Barra de escala: 100 gm. La figura 2b representa la cuantificación de la proliferación celular y la expresión de GFP de criptas cultivadas en múltiples condiciones. Las criptas se cultivaron en placas de 24 pocillos durante 6 días y se disociaron en células individuales utilizando Accutase. Se realizó un recuento del número de células vivas en cada pocillo como indicador de la proliferación celular. La expresión de Lgr5-GFP se midió mediante análisis por citometría de flujo. Las barras de error indican S.D. de pocillos triplicados. Los experimentos se realizaron 3 veces y mostraron resultados similares. Las figuras 2C y 2D representan el análisis por citometría de flujo de la expresión de GFP de células Lgr5-GFP individuales después de 7 días de cultivo en múltiples condiciones tal como se indican. Las barras de error indican S.D. de pocillos triplicados. La figura 2E representa imágenes de GFP y de campo brillante de células Lgr5-GFP individuales después de 9 días de cultivo. Barra de escala: 100 pm. La figura 2F representa imágenes representativas de 4.000 células Lgr5-GFP aisladas por FACS cultivadas en múltiples condiciones durante 7 días y la figura 2G representa la cuantificación del número de colonias. Las barras de error indican S.D. de pocillos triplicados. La figura 2H representa la propagación de metafase de una célula cultivada en la condición CV durante 80 días que tiene un cariotipo normal (2n = 40). (A menos que se indique lo contrario, en todos los paneles: ***P < 0,001; **P < 0,01; *P < 0,05; NS P > 0,05).

Las figuras 3A-3G representan el crecimiento celular y la expresión de GFP en función de las condiciones de cultivo. Las figuras 3A y 3B representan el número de colonias y el número de células individuales vivas, respectivamente, a partir de pocillos triplicados enumerados en cada punto temporal. Las barras de error indican S.D. En la figura 3A, las series son, de izquierda a derecha, Día 0, Día 2, Día 4, Día 6, Día 8 y Día 10. La figura 3C representa la clasificación por FACS de células Lgr5-GFP+ individuales recién aisladas. Se recolectó una población de células individuales de GFPalta. Se muestra un análisis por FACS representativo y la estrategia de selección de poblaciones (gating) para definir la población de células GFP+. Las células individuales recién aisladas de las criptas mostraron dos poblaciones GFPalta y GFPbaja discriminadas, mientras que las células cultivadas no mostraron poblaciones GFPalta y GFPbaja discriminadas, por lo que seleccionaron todas las poblaciones de células GFP+ para su análisis. Cabe indicar que las células cultivadas en ENR-CV mostraron una única población de GFP+ que fue altamente positiva para g Fp . La población de GFP- representa células Lgr5- así como células Lgr5+/GFP- (es decir, células madre silenciadas para GFP), estando presente en todos los cultivos de criptas sin clasificar, pero no en cultivos de células Lgr5-GFP individuales clasificadas (véase la figura 2C). Se analizaron un total de 10.000 células vivas para cada muestra. La figura 3D representa requisitos del factor de crecimiento para la autorrenovación de células madre Lgr5+ en la condición de cultivo CV. Las criptas se cultivaron durante 6 días en presencia de CHIR y VPA, con EGF, nogina, R-espondina 1 y sus combinaciones, tal como se indican. E: EGF (50 ng/ml); N: nogina (100 ng/ml); R: R-espondina 1 (500 ng/ml); C: CHIR (3 pM); V: VPA (1 mM). La figura 3E representa criptas cultivadas durante 6 días en múltiples condiciones tal como se indican. Se muestran imágenes de GFP y de campo brillante. Barras de escala: 200 pm. La figura 3F representa la morfología y la expresión de Lgr5-GFP de criptas de colon cultivadas en condiciones ENR, ENR-C y ENR-CV. La figura 3G representa el número de organoides aislados formados el día 5 en presencia de EGF, nogina y R-espondina 1 o R-espondina 2 a múltiples concentraciones. Todas las barras de escala: 200 pm.

Las figuras 4A-4B representan ensayos de múltiples condiciones de cultivo para células madre colónicas humanas EPHB2+. Las criptas se cultivaron durante 6 días en múltiples condiciones tal como se indican. En la figura 4A se muestran imágenes de GFP y de campo brillante. W: Wnt3a (100 ng/ml); Ni: nicotinamida (10 mM); P: PGE2 (0,02 pM); A: A-83-01 (0,5 pM); S: SB202190 (10 pM); V: ácido valproico o VPA (1 mM). La condición EGF, nogina, R-espondina 1, Wnt3a y VPA, o ENR-W-V sirve como control para mostrar una mayor expresión de GFP. Barras de escala: 200 pm. La figura 4B representa la cuantificación de la proliferación celular y la expresión de GFP de criptas cultivadas en múltiples condiciones. Las criptas se cultivaron durante 6 días en placas de 24 pocillos y se disociaron en células individuales. Se realizó un recuento del número de células vivas en cada pocillo y se analizó el porcentaje de células GFP+ mediante citometría de flujo. Las barras de error indican S.D. de pocillos triplicados.

Las figuras 5A-5D representan un cultivo de células madre individuales Lgr5-GFP. La figura 5A representa células Lgr5-GFP+ aisladas individuales cultivadas durante 9 días en la condición CV. Barras de escala: 200 pm. La figura 5B representa 1500 células Lgr5+ individuales clasificadas por FACS cultivadas en Matrigel en las condiciones tal como se indican. Se muestran imágenes representativas de los cultivos del día 7. La figura 5C indica la cuantificación del número de colonias. Las barras de error indican S.D. de pocillos triplicados. La figura 5D muestra células madre Lgr5+ individuales clasificadas sembradas en placas de 48 pocillos. Se cuantificó el número de células viables 12 horas después de la siembra. Se realizaron recuentos del número de colonias el día 7 y se cuantificó la eficacia de formación de colonias. V: VPA; C: CHIR; W: Wnt3a a 100 ng/ml. Las barras de error indican S.D. de 3 pocillos triplicados. Los experimentos se realizaron 3 veces y mostraron resultados similares.

Las figuras 6A-6D representan el mantenimiento de la autorrenovación de células madre Lgr5+ mediante la combinación de CHIR y VPA. Se muestran imágenes confocales de la tinción con lisozima (figura 6A), Ki67 (figura 6B) y EdU (figura 6C) de organoides cultivados en la condición ENR (paneles superiores) y colonias cultivadas en la condición ENR-CV (paneles inferiores). Para la tinción con EdU, las células se cultivaron con el análogo de timidina EdU (rojo) durante 1 hora. En las figuras 6B y 6C, solo los dominios de la cripta contienen células positivas para Ki67 o incorporan EdU en la condición ENR (paneles superiores) mientras que Ki67 o EdU están presentes en todos los agregados celulares en la condición CV (paneles inferiores). La figura 6D representa el análisis cuantitativo por PCR en tiempo real de la expresión relativa de ARNm de marcadores para células epiteliales intestinales maduras cultivadas durante 6 días en las condiciones indicadas (fosfatasa alcalina intestinal [Alpi] para enterocitos, mucina 2 [Muc2] para células caliciformes, cromogranina A [ChgA] para células enteroendocrinas, lisozima [Lyz] para células de Paneth y Lgr5 para células madre intestinales). ENR-CV (D40) indica células que se cultivaron en la condición CV durante 40 días. Barras de escala: 50 pm. En la figura 6D, las series son, de izquierda a derecha, Alpi, Muc2, ChgA, Lyz y Lgr5.

Las figuras 7A-7D representan la diferenciación de células madre intestinales cultivadas en la condición CV. La figura 7A representa la tinción de marcadores de diferenciación (Alp para enterocitos, Muc2 para células caliciformes (flechas blancas) y mucina segregada por células caliciformes, ChgA para células enteroendocrinas y Lyz para células de Paneth) de células transferidas de la condición CV a la condición ENR y cultivadas durante 4 dias. Se utilizó DAPI para teñir núcleos y GFP indica la presencia de células madre. La figura 7B muestra el análisis por RT-PCR en tiempo real de la expresión relativa de ARNm de marcadores epiteliales intestinales maduros de células cultivadas en múltiples condiciones. Las células se cultivaron inicialmente a partir de células individuales en la condición CV durante 6 días. Las colonias celulares se recolectaron, se lavaron y se volvieron a sembrar en varios pocillos de placas de 24 pocillos y se cultivaron durante 4 días en Matrigel en múltiples condiciones tal como se indican. Se añadió ENR en todas las condiciones y las células cultivadas con ENR solo se utilizaron como controles. I: IWP-2 (2 gM), D: DAPT (10 gM), C: CHIR (3 gM), V: VPA (1 mM). Las barras de error indican S.D. La figura 7C representa la tinción con Alp de células cultivadas en múltiples condiciones. Existe un cambio evidente en la morfología de células en las condiciones ID y CD, que se asemejan a células caliciformes y células de Paneth. Barras de escala: 50 gm. La figura 7D representa la tinción inmunocitoquímica de marcadores de diferenciación. Las células cultivadas en condiciones CD e ID se utilizaron para la tinción con mucina 2 (Muc2), cromogranina A (ChgA) y lisozima (Lyz). Se muestran imágenes confocales reconstruidas tridimensionales. Barras de escala: 50 gm.

Las figuras 8A-8F representan la diferenciación controlada de células madre Lgr5+ in vitro. La figura 8A representa la tinción de organoides cultivados en la condición ENR. El panel de la izquierda muestra la tinción con Alp de enterocitos. Antes de la tinción, el organoide se abrió mediante corte bajo un microscopio de disección utilizando una cuchilla afilada y se retiró el contenido luminal. El panel central muestra la tinción con Muc2 de células caliciformes (flechas), así como la mucina segregada por células caliciformes, y el panel derecho representa la tinción con ChgA de células enteroendocrinas. Las células GFP+ indican células madre Lgr5+. La figura 8B proporciona un esquema del protocolo de diferenciación. Se cultivaron células madre Lgr5+ individuales en la condición CV durante 4-6 días para formar colonias. Las colonias celulares se recolectaron, se lavaron, se embebieron en Matrigel fresco y se cultivaron en múltiples condiciones. La figura 8C representa la morfología de colonias celulares transferidas de la condición CV a la condición ENR y cultivadas durante 4 días (paneles superiores). Las colonias cultivadas de forma continua en la condición CV se muestran como control (paneles inferiores). La figura 8D representa la morfología de células diferenciadas con imágenes de aumento bajo y alto para cada condición. Cabe señalar el cambio evidente en la morfología para la mayor parte de las células en las condiciones CD e ID, que refleja la formación de células de Paneth y células caliciformes, respectivamente. La figura 8E representa la tinción con A1p de colonias cultivadas en la condición IV. Se muestran tinciones apicales (panel izquierdo) y homogéneas (panel derecho) de Alp. La figura 8F representa la tinción con Muc2 de colonias cultivadas en condiciones ID y CD. Todas las barras de escala: 50 gm.

Las figuras 9A-9F representan un mecanismo de acción para CHIR y VPA. La figura 9A representa la morfología y la expresión de Lgr5-GFP de criptas cultivadas en múltiples condiciones durante 6 días. C: CHIR (3 gM); Li: LiCl (5 mM); W: Wnt3a (100 nM). La figura 9B representa el número de células y el porcentaje de células GFP+ para cultivos de criptas de 6 días. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. La figura 9C muestra cultivos de criptas de 6 días en la condición ENR-C (control) o junto con inhibidores de HDAC. La figura 9D representa la cuantificación del porcentaje de GFP, el número total de células vivas y la intensidad relativa de GFP de células de la figura 9C. La figura 9E representa los efectos de VPA y TSA sobre la proliferación celular y la expresión de GFP a múltiples concentraciones. La figura 9F representa los efectos de nicotinamida (Ni) en combinación con Wnt3a (W, 100 ng/ml) o CHIR (C, 3 gM). Se muestran el número de células y el porcentaje de células GFP+ de criptas cultivadas durante 6 días en múltiples condiciones. (A menos que se indique lo contrario, en todos los paneles: las barras de error indican S.D. de pocillos triplicados. ***P < 0,001; **P < 0,01; *P < 0,05; NS P > 0,05).

La figura 10 representa la morfología y la expresión de GFP de células Lgr5-GFP individuales cultivadas en múltiples condiciones. Barras de escala: 100 gm.

Las figuras 11A-11D representan el mecanismo de VPA. La figura 11A representa VPA que rescata la expresión de GFP después de la inhibición de Notch. Las criptas se cultivaron en la condición ENR-C con o sin DAPT (D, 5 gM) y una concentración variable de VPA (V, 0,25-4 mM) durante 3 días. Barras de escala: 200 gm. Las figuras 11B y 11C representan criptas cultivadas en la condición ENR (figura 11B) o ENR+CHIR (figura 11C) durante 4 días, operación seguida de la adición de VPA a diferentes concentraciones durante otras 24 horas. La expresión de Notch1, Hes1 y AtohI se analizó por RT-PCR en tiempo real. La figura 11D representa el análisis de la expresión de Notch1, Hes1 y Atohl por RT-PCR en tiempo real en criptas después de 6 días de cultivo. En la figura 11B-11C, las series son, de izquierda a derecha, 0, 0,5, 1,2 y 3. En la figura 11D, las series son, de izquierda a derecha, ENR, ENR-V, ENR-C y ENR-CV.

Las figuras 12A-12B representan un modelo para la autorrenovación y la diferenciación de células madre intestinales (figura 12A) en condiciones fisiológicas y (figura 12B) cultivo in vitro.

Las figuras 13A-13B representan la combinación de CHIR y VPA que promueve la proliferación y la expresión de GFP de células madre/progenitoras Lgr5+ derivadas del oído interno de ratón. La figura 13A representa imágenes de campo brillante y de GFP del epitelio sensorial de la cóclea aislado derivado de un ratón Lgr5-GFP el día 2 posterior a su nacimiento. La figura 13B representa el epitelio sensorial de la cóclea aislado disociado en células individuales y cultivado en múltiples condiciones durante 11 días. E: EGF; N: nogina; R: R-espondina 1; C: CHIR99021, V: VPA. Barras de escala: 100 gm.

Las figuras 14A-14F representan la combinación de CHIR y VPA que promueve la proliferación y la expresión de GFP de células madre/progenitoras Lgr5+ del oído interno de ratón. La figura 14A representa la expresión de GFP de células epiteliales del oído interno. La figura 14B representa la cuantificación de la expresión de GFP y el número de células. La figura 14C representa imágenes de campo brillante y de GFP. La figura 14D representa el número de células de cultivos de 8 días de células madre del oído interno en múltiples condiciones tal como se indican. La figura 14E representa el porcentaje de GFP de cultivos de 8 días de células madre del oído interno en múltiples condiciones tal como se indican. La figura 14F representa la morfología y la expresión de GFP de células madre de oído interno Lgr5-GFP cultivadas en múltiples condiciones. Todas las barras de escala: 200 gm.

La figura 15 representa la siembra de criptas murinas del intestino delgado en tejido sano de colon de ratón in vitro. El panel izquierdo muestra criptas del intestino delgado aisladas dispuestas en el colon con epitelio parcialmente denudado. Las flechas blancas indican las criptas sembradas. El panel derecho muestra criptas sembradas unidas al colon y que se extienden por toda su superficie después de 24 horas. Las flechas negras indican la misma ubicación que las flechas blancas en el panel izquierdo.

La figura 16 representa el injerto de criptas 48 horas después de la siembra. Se muestran imágenes fluorescentes (panel superior) y de campo brillante (panel inferior) de tejido de colon de ratón sembrado con criptas. Las criptas se tiñeron con DiD antes de la siembra. Las líneas blancas indican regiones que incluyen células injertadas.

La figura 17 representa el injerto de criptas después de 6 días de cultivo in vitro. Se muestran imágenes de canal de GFP (panel izquierdo), de RFP (panel central) y de campo brillante (panel derecho) de tejido de colon de ratón sembrado con criptas. La señal de GFP indica la presencia de células Lgr5.

La figura 18 representa una imagen confocal de tejido de colitis ulcerosa prolapsada extirpado del ratón TRUC con criptas injertadas. Las criptas se tiñeron con DiD antes de la siembra. El tejido prolapsado se muestra mediante autofluorescencia verde.

Las figuras 19A-19N representan un esquema de siembra (izquierda) y crecimiento de organoides post-incubación (derecha) en sistemas de cultivo evaluados. Las figuras 19A y 19B representan un procedimiento típico de siembra en submucosa (denominado en el presente documento "parche desnudo"), que apoya el crecimiento de monocapa y la disociación de organoides. Las figuras 19C y 19D representan SIS infundida con Gf (los GF incluyen EGF, nogina, R-espondina 1, Y-27632, ácido valproico, CHIR) para apoyar el crecimiento de organoides tridimensionales. Las figuras 19E y 19F representan un parche de gel compuesto por SIS infundida con GF con un revestimiento de colágeno. La figura 19E, recuadro, representa cada organoide encerrado individualmente en un gel blando, así como una capa base de SIS. Las figuras 19G y 19H representan una suspensión de colágeno típica con GF (EGF, nogina, R-espondina 1, Y-27632, ácido valproico, CHIR) añadidos directamente a los medios de cultivo. Las figuras 19I y 19J representan una suspensión de colágeno típica con GF (EGF, nogina, R-espondina 1, Y-27632, ácido valproico, CHIR) embebidos en el gel. Las figuras 19K y 19L representan una suspensión de colágeno típica sin GF adicionales añadidos a los medios de cultivo. Las figuras 19M y 19N representan una suspensión típica de Matrigel sin GF adicionales añadidos a los medios (control experimental).

La figura 20A representa un esquema del procedimiento de siembra con organoides Lgr5+; los círculos estampados representan factores de crecimiento infundidos (EGF, nogina, R-espondina 1, Y-27632, ácido valproico y CHIR). La figura 20B representa una fase de adherencia inicial con flechas que representan el soporte de difusión del factor embebido de crecimiento. La figura 20C representa un sistema de cultivo completo con revestimiento de colágeno, representadas medidas del espesor.

La figura 21A proporciona una comparación del crecimiento de organoides en 7 sistemas de cultivo. Las series son, de izquierda a derecha, Matrigel, parche de gel con GF, parche desnudo con GF, colágeno I, colágeno I con GF en el medio, colágeno I con GF embebidos y parche desnudo sin GF. La figura 21B y la figura 21C muestran un organoide representativo a las 48 horas del sistema de parche de gel con GF, con fluorescencia GFP+ que indica células madre Lgr5+ presentes en las bases de la cripta (se observa algo de autofluorescencia central). * = p < 0,05 a las 24 horas (colágeno I (CI) frente a todos), 48 horas (parche desnudo con GF (BPGF) frente a todos; CI frente a Matrigel (M); CI con GF (CIGF) frente a M, CI, colágeno I con GF embebidos (CIEGF), parche desnudo (BP), sistema de parche de gel con Gf (pSg F)), 72 horas (CI frente a todos; BP, CIEGF y CIGF frente a M, PS, BPGF, C i) y 96 horas (CI frente a todos, BP, CIEGF y CIGF frente a todos). Barra de escala (figuras 21B y 21C) = 200 um.

La figura 22 representa el crecimiento exitoso y la expansión de cripta de un organoide sembrado en el parche de gel con el sistema GF. Se muestra una secuencia representativa de imágenes que representan la expansión ex vivo de un organoide sembrado en el sistema de parche de SIS con GF. Las criptas fuera de foco son un efecto del crecimiento en 3 dimensiones visto en microscopía de plano único.

La figura 23A proporciona un esquema que muestra la creación de un defecto gástrico de 4 mm. La colocación de un parche de 6 mm sobre el defecto se muestra en la figura 23B. Tal como se muestra en la figura 23C, no había ningún defecto visible en la pared gástrica externa, tal como se indica en una muestra de estómago representativa 1 semana después de la operación. Los defectos grandes (flechas), vistos desde la pared gástrica interna, se muestran según el tipo de parche colocado: la figura 23D muestra el parche de SIS sin GF, la figura 23E muestra el parche de SIS más GF y la figura 23F muestra solo el soporte de PGSU, sin SIS. El parche de SIS con GF mostró cierre completo y epitelización del efecto de pared gástrica, mientras que los defectos permanecieron parcialmente abiertos en SIS sola y completamente abiertos en PGSU sin SIS.

La figura 24 representa el análisis por RT-PCR en tiempo real de la expresión de gen marcador de criptas intestinales humanas aisladas cultivadas en múltiples condiciones. Se añadieron EGF, nogina y R-espondina 1 a todas las condiciones. C: CHIR, Ni: nicotinamida, W: Wnt3a, A: A83-01, S: SB202190, P: PGE2, V: VPA, Tu: tubastatina A, Cripta indica criptas del intestino delgado humano recién aisladas. Las barras de error indican S.D., n = 3.

Las figuras 25A-25B representan condiciones de cultivo optimizadas para células madre intestinales humanas. La figura 25A representa la proliferación de células epiteliales intestinales humanas cultivadas en múltiples condiciones. Se cultivaron criptas de intestino delgado humano recién aisladas en múltiples condiciones tal como se indican. Había presencia de EGF, nogina, R-espondina 1 en todas las condiciones. El número de células se cuantificó el día 9 después de la siembra. C: CHIR, V: VPA, utilizado a 0,5-1,5 mM, Ni: nicotinamida. La figura 25B representa la expresión de LGR5 de células cultivadas en múltiples condiciones como en la figura 15A. Se utilizó VPA a 1 mM.

La figura 26 representa el cultivo de células madre intestinales humanas. Las células se cultivaron en medios de cultivo de células madre intestinales humanas (que contenían EGF, nogina, R-espondina 1, CHIR99021, VPA y nicotinamida). Se muestran las células del pase 2 el día 5 después del pase. Barras de escala: 400 pm.

La figura 27 representa el tamaño aumentado de la cripta después de la administración de CHIR y VPA a lo largo del transcurso de 7 días in vivo en un sistema de modelo animal.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Tal como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo" es cualquier polipéptido de inmunoglobulina, o fragmento del mismo, que tiene capacidad de unión a inmunógeno.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "agonista" es un agente que causa un aumento en la expresión o la actividad de un gen o una proteína diana, respectivamente. Un agonista puede unirse y activar su receptor específico de alguna forma, lo que directa o indirectamente provoca este efecto fisiológico en el gen o la proteína diana.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "inhibidor" es un agente que causa una disminución en la expresión o la actividad de un gen o una proteína diana, respectivamente. Un "antagonista" puede ser un inhibidor, pero es más específicamente un agente que se une a un receptor y que a su vez reduce o elimina la unión de otras moléculas.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "ácido nucleico inhibidor" es un ARN bicatenario, ARNip, ARNsh o ARN antisentido, o una porción del mismo, o un mimético del mismo, que cuando se administra a una célula de mamífero da como resultado una disminución en la expresión de un gen diana. Típicamente, un inhibidor de ácido nucleico comprende al menos una porción de una molécula de ácido nucleico diana, o un ortólogo de la misma, o comprende al menos una porción de la cadena complementaria de una molécula de ácido nucleico diana. Típicamente, la expresión de un gen diana se reduce en un 10%, 25%, 50%, 75%, o incluso un 90-100%.

Por "antisentido" se entiende una secuencia de ácido nucleico, independientemente de su longitud, que es complementaria a la cadena codificante o ARNm de una secuencia de ácido nucleico. Tal como se indica en el presente documento, una "secuencia de ácido nucleico complementaria" es una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse con otra secuencia de ácido nucleico compuesta por pares de bases de nucleótidos complementarios. Por "hibridarse" se entiende emparejarse para formar una molécula bicatenaria entre bases de nucleótidos complementarias (por ejemplo, la adenina (A) forma un par de bases con timina (T), al igual que la guanina (G) con citosina (C) en el ADN) en condiciones adecuadas de rigurosidad. (Véanse, por ejemplo, Wahl, G. M. y S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507). En una forma de realización, se introduce un ARN antisentido en una célula, tejido u organoide individual. El ácido nucleico antisentido puede contener un esqueleto modificado, por ejemplo, fosforotioato, fosforoditioato u otros esqueletos modificados conocidos en la técnica, o puede contener enlaces internucleosídicos no naturales.

Por "ARNip" se entiende un ARN bicatenario. Óptimamente, un ARNip tiene 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24 nucleótidos de longitud y presenta un voladizo de 2 bases en su extremo 3'. Estos ARNbc pueden introducirse en una célula individual o en un sistema de cultivo. Dichos ARNip se utilizan para regular a la baja los niveles de ARNm o la actividad del promotor.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "fragmento" es una porción de un polipéptido o una molécula de ácido nucleico. Esta porción contiene, preferentemente, al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de la longitud total de la molécula de ácido nucleico o el polipéptido de referencia. Un fragmento puede contener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 nucleótidos o aminoácidos. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "célula madre" se refiere a una célula multipotente que tiene la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en múltiples linajes celulares.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "célula madre epitelial" se refiere a una célula multipotente que tiene el potencial de comprometerse en múltiples linajes celulares, incluidos linajes celulares que dan como resultado células epiteliales.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "célula progenitora" se refiere a una célula restringida en linaje derivada de una célula madre.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "célula progenitora epitelial" se refiere a una célula multipotente que tiene el potencial de restringirse a linajes celulares que dan como resultado células epiteliales. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "autorrenovación" se refiere al proceso por el que una célula madre se divide para generar una (división asimétrica) o dos (división simétrica) células hijas con potenciales de desarrollo que son indistinguibles de los de la célula madre. La autorrenovación implica tanto la proliferación como el mantenimiento de un estado no diferenciado.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "injertar" o "injerto" se refiere al proceso de incorporación de células madre o progenitoras en un tejido de interés in vivo por medio del contacto con las células existentes del tejido. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aislado" se refiere a un material que está desprovisto en diversos grados de los componentes que normalmente lo acompañan cuando se encuentra en su estado nativo. "Aislado" denota un grado de separación de la fuente original o su entorno.

Tal como se utiliza en el presente documento, una "población" de células es cualquier cantidad de células superior a 1, pero preferentemente es al menos 1 x 103 células, al menos 1 x 104 células, al menos 1 x 105 células, al menos 1 x 106 células, al menos 1 x 107 células, al menos 1 x 108 células, al menos 1 x 109 células o al menos 1 x 1010 células. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "organoide" u "organoide epitelial" se refiere a una agrupación o un agregado celular que se asemeja a un órgano, o a parte de un órgano, y posee tipos de células relevantes para ese órgano particular.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "sujeto" es un vertebrado, incluidos cualquier miembro de la clase de los mamíferos.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluidos, pero sin limitación, ser humano, ratón, rata, oveja, mono, cabra, conejo, hámster, caballo, vaca o cerdo.

Un "mamífero no humano", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier mamífero que no sea un ser humano.

Tal como se utiliza en el presente documento, "aumento" se refiere a un aumento de al menos el 5%, por ejemplo, el 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100% o más, por ejemplo, en comparación con el nivel de una referencia.

Tal como se utiliza en el presente documento, "aumentos" también significa aumentos de al menos 1 vez, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000 veces o más, por ejemplo, en comparación con el nivel de un patrón de referencia.

Tal como se utiliza en el presente documento, "disminución" se refiere a una disminución de al menos el 5%, por ejemplo, el 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 o 100%, por ejemplo, en comparación con el nivel de referencia.

Tal como se utiliza en el presente documento, "disminuciones" también significa disminuciones de al menos 1 vez, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000 veces o más, por ejemplo, en comparación con el nivel de una referencia.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "referencia" significa un patrón o una condición de control (por ejemplo, sin tratar con un agente de ensayo o combinación de agentes de ensayo).

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "eliminar" significa disminuir a un nivel que es indetectable.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sinergia" o "efecto sinérgico" es un efecto que es superior a la suma de cada uno de los efectos tomados por separado; un efecto superior al aditivo.

Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "tratar", "que trata", "tratamiento" y similares se refieren a reducir o mejorar un trastorno y/o síntomas asociados con el mismo. Se apreciará que, aunque no está excluido, tratar un trastorno o una afección no requiere que el trastorno, la afección o los síntomas asociados con los mismos se eliminen por completo.

En la presente divulgación, "comprende", "que comprende", "que contiene" y "que tiene" y similares pueden tener el significado que se les atribuye en la ley de patentes de Estados Unidos y pueden significar "incluye", "que incluye" y similares; "que consiste esencialmente en" o "consiste esencialmente" también tiene el significado atribuido en la ley de patentes de Estados Unidos y el término es abierto, lo que permite la presencia de más de lo que se indica siempre que las características básicas o novedosas de lo que se indica no cambien por la presencia de más de lo que se indica, pero excluye formas de realización de la técnica anterior.

Otras definiciones aparecen en el contexto a lo largo de la presente descripción. A menos que se definan de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones.

Procedimientos y composiciones

I. Soluciones y sistemas de cultivo celular

Se han descubierto ahora soluciones y sistemas de cultivo celular para promover cultivos de células madre epiteliales homogéneas, la formación eficaz de organoides epiteliales y la ampliación de los mismos para su uso en trasplantes.

Las soluciones de cultivo celular que comprenden un inhibidor de una proteína morfogénica ósea, un inhibidor de glucógeno sintasa quinasa-3 beta (GSK3 p), un agente que se une al receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina (LGR5) y un inhibidor de histona desacetilasa se pueden utilizar para formar colonias de células epiteliales a partir de células madre epiteliales aisladas. En formas de realización específicas, al menos aproximadamente el 25%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 90% a aproximadamente el 100% de células madre epiteliales aisladas forman colonias de células epiteliales en presencia de esta solución de cultivo celular. Además, al menos aproximadamente el 6% de las células madre epiteliales aisladas individuales forman colonias de células epiteliales en presencia de esta solución de cultivo celular. Las combinaciones de 1,6-[[2-[[4-(2,4-diclorofenil)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]amino]-3-piridincarbonitrilo "CHIR99021" (Ring et al., 2003), un inhibidor de glucógeno sintasa quinasa-3 beta y ácido valproico, un inhibidor de histona desacetilasa, tienen efectos sinérgicos sobre la eficacia de formación de colonias.

Las proteínas morfogénicas óseas (BMP) son miembros de la superfamilia TGF-beta y comprenden metaloproteasas implicadas en el patrón embrionario entre diversas especies, así como la señalización celular postembrionaria. Los inhibidores de BMP incluyen, por ejemplo, agentes que se unen a una molécula de BMP para formar un complejo en el que la actividad de BMP se reduce o se elimina, por ejemplo, evitando o inhibiendo la unión de la molécula de BMP a un receptor de BMP. Alternativamente, el inhibidor es un agente que actúa como un antagonista o agonista inverso. Este tipo de inhibidor se une a un receptor de BMP y evita la unión de un BMP al receptor. Un ejemplo de este último agente es un anticuerpo que se une a un receptor de BMP y evita la unión de BMP al receptor unido al anticuerpo. Los inhibidores de BMP son bien conocidos en la técnica (Rider et al., 2010) y pueden incluir, pero sin limitación, nogina, cordina, folistatina (Schneyer et al., 1994), DAN, proteínas que comprenden un dominio de nudo de cisteína DAN (incluidas Cerberus y Gremlin), esclerostina, gastrulación retorcida, gen-1 asociado a sensibilidad uterina, factor de crecimiento del tejido conectivo (Abreu et al., 2002), inhibina (Wiater y Vale, 2003), BMP-3 (Gamer et al., 2005), dorsomorfina (Yu et al., 2008) y derivados, incluidos d Mh 1 (Hao et al., 2010) y Ld N-193189 (Cuny et al., 2008).

La glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK3) es una serina-treonina quinasa dirigida por prolina que se identificó inicialmente como una glucógeno sintasa fosforilante e inactivadora que tiene dos isoformas conocidas, alfa (GSK3A) y beta (GSK-3p). Los agonistas de Wnt que comprenden inhibidores de GSK-3p son bien conocidos en la ticnica e incluyen, pero sin limitación, 1,6-[[2-[[4-(2,4-diclorofenil)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]amino]-3-piridincarbonitrilo "CHIR99021" (Ring et al., 2003), LiCl (Klein et al., 1996), BIO-acetoxima ((2'Z,3'e )-6-bromoindirrubina-3'-oxima) (Meijer et al., 2003), N6-[2-[[4-(2,4-diclorofenil)-5-(1 H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]-3-nitro-2,6-piridindiamina "CHIR98014" (Ring et al., 2003), 3-(2,4-diclorofenil)-4-(1 -metil-1 H-indol-3-il)-1 H-pirrol-2,5-diona "Sb 216763" tambiin conocida como inhibidor de Gs K-3 IV (Coghlan et al., 2000), 3-[(3-cloro-4-hidroxifenil)amino]-4-(2-nitrofenil)-1H-pirrol-2,5-diona "SB 415286" (Coghlan et al., 2000), 5-etil-7,8-dimetoxi-1H-pirrolo[3,4-c]-isoquinolina-1,3-(2H)-diona "3F8" (Zhong et al., 2009), 9-bromo-7,12-dihidro-indolo[3,2-d][1]benzazepin 6(5H)-ona "kenpaulona" (Schultz et al., 1999; Zaharevitz et al., 1999), 9-bromo-7,12-dihidropirido[3',2':2,3]azepino[4,5-b]indol-6(5H)-ona "1-azakenpaulona" (Schultz et al., 1999; Zaharevitz et al., 1999), N-(3-cloro-4-metilfenil)-5-(4-nitrofenil)-1,3,4-oxadiazol-2-amina "TC-G 24" (Khanfar et al., 2010), 2-metil-5-[3-[4-(metilsulfinil)fenil]-5-benzofuranil]-1,3,4-oxadiazol "TCS 2002" (Saitoh et al., 2009), N-[(4-metoxifenil)metil]-N'-(5-nitro-2-tiazolil)urea "AR-A 014418" (Bhat et al., 2003), 3-[5-[4-(2-hidroxi-2-metil-1-oxopropil)-1-piperazinil]-2-(trifluorometil)fenil]-4-(1 H-indol-3-il)-1 H-pirrol-2,5-diona "TCS 21311" (Thoma et al., 2011), 3-[[6-(3-aminofenil)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi]-fenol "TWS 119" (Ding et al., 2003), ((2'Z,3'£)-6-bromoindirrubina-3'-acetoxima) "BIO-acetoxima" también conocida como inhibidor de GSK-3 IX (Meijer et al., 2003), 4-(2-amino-4-oxo-2-imidazolin-5-iliden)-2-bromo-4,5,6,7-tetrahidropirrolo[2,3-c]azepin-8-ona "10Z-himenialdisina" (Breton et al., 1997), 2-[(3-yodofenil)metilsulfanil]-5-piridin-4-il-1,3,4-oxadiazol, también conocido como inhibidor de GSK-3p II (Wada, 2009), 4-bencil-2-metil-1,2,4-tiadiazolidin-3,5-diona, también conocida como inhibidor de GSK-3p I (Wada, 2009), 3-amino-6-(4-((4-metilpiperazin-1-il)sulfonil)fenil)-N-(piridin-3-il)pirazina-2-carboxamida, HCl, también conocido como inhibidor de GsK-3p XXVII (publicación de patente de Estados Unidos N° 2006/0173014), 4,5-bis(1 -metil-1 H-indol-3-il)-1,2-dihidropirazol-3-ona, también conocido como inhibidor de GSK-3p XXVI (Chen et al., 2011), péptido FRATtide SQPETRTGDDDPHRLLQQLVLSGNLIKEAVRRLHSRRLQ (SEQ ID NO: 1) (Bax et al., 2001), 3-amino-1H-pirazolo[3,4-b]quinoxalina "inhibidor de Cdk1/5 " (Andreani et al., 1996, 2000; Katoh et al. ., 2011) y ácido 4-((5-bromo-2-piridinil)amino)-4-oxobutanoico "bikinina" (De Rybel et al., 2009). Preferentemente, el inhibidor de GSK-3p es CHIR99021.

El receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina (receptor LGR5) es conocido por su expresión restringida de criptas y el marcado de células madre en múltiples tejidos adultos y cánceres. Los agentes que se unen al receptor LGR5 incluyen, pero sin limitación, R-espondinas (Kim et al., 2006; Nam et al., 2006), tales como R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3 y R-espondina 4. Preferentemente, el agente que se une al receptor LGR5 es R-espondina 1.

En formas de realización alternativas, el cloruro de litio (LiCl) puede sustituirse por CHIR99021 o al menos aproximadamente 3 pM de CHIR99021 pueden sustituirse por R-espondina 1.

Las histonas son proteínas nucleares que se unen al ADN y forman nucleosomas. Están directamente implicadas tanto en el empaquetamiento del ADN en los cromosomas como en la regulación de la transcripción. La acetilación/desacetilación de histonas es uno de los principales factores en la regulación de la dinámica estructural de la cromatina durante la transcripción. Los inhibidores de histona desacetilasa, que reducen o eliminan la desacetilación de histona, son bien conocidos en la técnica y pueden incluir, pero sin limitación, inhibidores de Pan-HDAC, tales como ácido valproico, tricostatina A, ácido suberoilanilida-hidroxámico y ácido suberohidroxámico (SBHA), e inhibidores de HDAC6, tales como tubacina, tubastatina A y compuesto 7.

En ejemplos alternativos, un inhibidor de Atohl puede aumentar, o sustituirse por, un inhibidor de histona desacetilasa. Los inhibidores de Atoh1 incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos inhibidores que causan una disminución o la eliminación en la expresión de Atoh1. Los ácidos nucleicos inhibidores que se dirigen a Atohl son conocidos en la técnica (Shi et al., 2010).

Las soluciones de cultivo celular pueden incluir opcionalmente un factor de crecimiento epidérmico y/o un agonista de Notch. El factor de crecimiento epidérmico es una molécula de señalización celular implicada en diversas funciones celulares que incluyen la proliferación, la diferenciación, la motilidad y la supervivencia celular, y en el desarrollo de tejidos. Las proteínas Notch son receptores transmembrana de un solo paso que regulan las decisiones del destino celular durante el desarrollo. Un agonista de Notch incluye, por ejemplo, un agente que aumenta la actividad de Notch en una célula. Los agonistas de Notch son bien conocidos en la técnica y pueden incluir, entre otros, un anticuerpo Notch1 (N1 Ab), Delta 1, similar a Delta 3, similar a Delta 4, Jagged 1, Jagged 2, péptido Ds L y Delta D.

En ejemplos específicos, la solución de cultivo celular comprende de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 ng/ml de EGF, de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 ng/ml de nogina, de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 ng/ml de R-espondina, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 pM de CHIR99021 y de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 mM de ácido valproico.

En otros ejemplos, se prefiere la combinación de un agonista de Wnt y un inhibidor de HDAC6 en la solución de cultivo celular. En consecuencia, una solución de cultivo celular puede comprender un inhibidor de una proteína morfogénica ósea, R-espondina 1, un agonista de Wnt y un inhibidor de HDAC6.

Las proteínas Wnt son moléculas de señalización extracelular implicadas en el control del desarrollo embrionario. Los agonistas de Wnt son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, Wnt-1/Int-1 (Nusse et al., 1982), Wnt-2/Irp (proteína relacionada con Int-I) (Wainwright et al., 1988), Wnt-2b/13 (Katoh et al., 1996), Wnt-3/Int-4 (Katoh et al., 2001), Wnt-3a (Saitoh et al., 2001), Wnt-4 (Smolich et al., 1993), Wnt-5a (Burrus et al., 1995), Wnt-5b (Burrus et al., 1995), Wnt-6 (Burrus et al., 1995), Wnt-7a (Smolich et al., 1993), Wnt-7b (Burrus et al., 1995), Wnt-8a/8d (Saitoh et al., 2001), Wnt-8b (Lako et al., 1998), Wnt-9a/14 (Bergstein et al., 1997), Wnt-9b/14b/15 (Bergstein et al., 1997), Wnt-10a (Wang et al., 1996), Wnt-10b/12 (Wang et al., 1996), Wnt-11 (Lako et al., 1998), Wnt-16 (Bergstein et al., 1997; Fear et al., 2000), R-espondina 1, R-espondina 2, R-espondina 3, R-espondina 4, norrina (Planutis et al., 2007), CHIR99021, LiCl, BIO ((2'Z,3'E)-6-bromoindirrubina-3'-oxima), CHIR98014, SB 216763, SB 415286, 3F8, kenpaulona, 1-azakenpaulona, t C-G 24, TCS 2002, AR-A 014418, 2-amino-4-[3,4-(metilendioxi)bencil-amino]-6-(3-metoxifenil)pirimidina (Liu et al., 2005), 2-[2-(4-acetilfenil)diazenil]-2-(3,4-dihidro-3,3-dimetil-1(2H)-isoquinolinilideno)acetamida "IQ 1" (Miyabayashi et al., 2007), ácido (3a,5p,12a,20R)-3,12-dihidroxicolan-24-oico "DCA" (Pai et al., 2004), (2S)-2-[2-(indan-5-iloxi)-9-(1,1'-bifenil-4-il)metil)-9H-purin-6-ilamino]-3-fenil-propan-1-ol "QS 11" (Zhang et al., 2007), piperidinil-difenilsulfonil-sulfonamida 1 "WAY-316606" (Bodine et al., 2009), (hetero)arilpirimidinas (Gilbert et al., 2010), 10Z-himenialdisina, TCS 21311, TWS 119, inhibidor de GSK-3p II, inhibidor de GSK-3p I, inhibidor de GSK-3p XXVII, FRATtide, inhibidor de Cdk1/5 y bikinina.

Los sistemas de cultivo celular comprenden una solución de cultivo celular de la divulgación y un organoide epitelial, células madre epiteliales o células progenitoras epiteliales, o una población de células madre epiteliales o células progenitoras epiteliales. Los organoides epiteliales son conocidos en la técnica (Yao et al., 2010; Lukacs et al., 2010). Las células madre epiteliales incluyen, entre otras, células madre del intestino, del estómago, del pulmón, del páncreas y del colon. Las células madre epiteliales también incluyen células madre positivas para LGR5, derivadas de fuentes que incluyen, pero sin limitación, intestino, oído interno, cerebro, riñón, hígado, retina, estómago, páncreas, mama, folículo piloso, ovario, médula suprarrenal, piel, timo, papilas gustativas, glándulas mamarias, carcinomas y tumores. Las células madre epiteliales también incluyen precursores inactivos de células madre positivas para LGR5 que expresan LGR5 (Buczacki et al., 2013). Una población de células madre epiteliales o células progenitoras epiteliales en un sistema de cultivo celular puede comprender, por ejemplo, al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de las células del sistema. Preferentemente, la población de células madre epiteliales o células progenitoras epiteliales se mantiene durante pases repetidos.

En ejemplos específicos, las células madre epiteliales humanas pueden cultivarse en presencia de componentes adicionales que incluyen nicotinamida o un inhibidor de HDAC específico de Sirt1 tal como EX527.

En ejemplos específicos, se pueden cultivar células madre epiteliales derivadas del oído interno en presencia de un agonista de Wnt, un inhibidor de histona desacetilasa, un factor de crecimiento epidérmico, un factor de crecimiento de fibroblastos básico y, opcionalmente, una proteína morfogénica ósea.

Los sistemas de cultivo celular pueden comprender componentes adicionales, que incluyen, pero sin limitación, una base submucosa y un recubrimiento que comprende colágeno para formar constructos de tejido tridimensionales adecuados para el trasplante. El recubrimiento de colágeno puede revestir y/o rodear el tejido epitelial o el tipo de célula seleccionados, así como colocarse entre el tejido epitelial o el tipo de célula seleccionado y la base submucosa. El tejido epitelial o los tipos de células seleccionados incluyen, pero sin limitación, células madre epiteliales, tejido aislado que comprende células madre epiteliales u organoides epiteliales.

La submucosa del intestino delgado (SIS) es un andamiaje común, biocompatible y clínicamente utilizado (de la Fuente et al., 2003; Ueno et al., 2007; Schultz et al., 2002; Kehoe et al., 2012). Los andamiajes basados en submucosas experimentan una rápida neovascularización, granulación, biodegradación y generalmente están bien conservados en términos de composición de proteínas entre especies. Se prepara un sistema de cultivo mejorado basado en submucosas para constructos de tejido tridimensionales sembrando la submucosa con un tipo de célula epitelial preseleccionada y facilitando el crecimiento con un revestimiento de colágeno. Variar la composición de SIS con este revestimiento facilita la adhesión celular y el crecimiento en la SIS, lo que da como resultado la expansión tridimensional de las células adheridas a la submucosa en organoides epiteliales grandes. Los andamiajes de matriz de tejidos derivados de animales (por ejemplo, estómago, vejiga, submucosa alimentaria, respiratoria, genital y la membrana basal hepática) de vertebrados de sangre caliente son intercambiables con la SIS y, por lo tanto, se encuentran dentro del alcance de la presente divulgación.

Los constructos de tejidos se pueden cultivar en presencia de soluciones de cultivo celular conocidas en la técnica o soluciones de cultivo celular descritas anteriormente en el presente documento. Por ejemplo, los constructos de tejido pueden cultivarse en presencia de una solución de cultivo celular que comprende un inhibidor de una proteína morfogenética ósea, R-espondina 1, CHIR99021 y un inhibidor de histona desacetilasa. Además, la base submucosa puede contener combinaciones similares de moléculas pequeñas y/o factores de crecimiento, que incluyen, pero sin limitación, factor de crecimiento epidérmico, una proteína morfogénica ósea, R-espondina 1, CHIR99021, Y-27632 y un inhibidor de histona desacetilasa.

En ejemplos alternativos, se proporcionan sistemas de cultivo de células epiteliales desprovistos de colágeno, en los que la base submucosa contiene combinaciones de moléculas pequeñas y/o factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico, una proteína morfogénica ósea, R-espondina 1, CHIR99021, Y-27632 y un inhibidor de histona desacetilasa. Los constructos de tejido desprovistos de colágeno se pueden cultivar en presencia de soluciones de cultivo celular conocidas en la técnica o tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

II Procedimientos que emplean soluciones y sistemas de cultivo celular

Las soluciones y los sistemas de cultivo celular de la divulgación se pueden utilizar para formar organoides epiteliales a partir de células madre epiteliales aisladas con alta eficacia. En una forma de realización específica, la incubación de células madre epiteliales aisladas en presencia de nogina, R-espondina 1, CHIR99021 y un inhibidor de histona desacetilasa (por ejemplo, ácido valproico) forma colonias de células epiteliales con una eficacia de al menos aproximadamente el 25%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%. En otra forma de realización específica, las células madre epiteliales aisladas individuales incubadas en presencia de nogina, R-espondina 1, CHIR99021 y un inhibidor de histona desacetilasa forman colonias de células epiteliales con una eficacia de al menos aproximadamente el 6% a aproximadamente el 100%.

Las células madre epiteliales mantenidas dentro de las soluciones y sistemas de cultivo celular de la invención pueden dirigirse subsiguientemente a rutas de diferenciación específicas, incluidas aquellas que dan como resultado la formación de células de Paneth, enterocitos, células caliciformes y células enteroendocrinas.

Se ha demostrado que las células de Paneth son un constituyente importante del nicho de células madre Lgr5+ dentro de las criptas intestinales que proporcionan señales esenciales para el mantenimiento de células madre (Sato et al., 2011b; Yilmaz et al., 2012). La incubación en primer lugar de células madre epiteliales en presencia de una solución de cultivo celular que comprende un inhibidor de un BMP, R-espondina 1, CHIR99021 y un inhibidor de histona desacetilasa (por ejemplo, ácido valproico) y subsiguientemente la incubación adicional de las células madre epiteliales en presencia de al menos un agonista de Wnt y al menos un inhibidor de Notch (por ejemplo, DAPT) produce células de Paneth. Asimismo, la subsiguiente incubación adicional de una célula madre epitelial en presencia de al menos un inhibidor de Wnt y al menos un inhibidor de histona desacetilasa produce enterocitos; y la subsiguiente incubación adicional de una célula madre epitelial en presencia de al menos un inhibidor de Wnt y al menos un inhibidor de Notch produce células caliciformes. El inhibidor de Wnt puede ser, pero sin limitación, N-(6-metil-2-benzotiazolil)-2-[(3,4,6,7-tetrahidro-4-oxo-3-feniltieno[3,2-d]pirimidin-2-il)tio]-acetamida ("IWP-2") (Chen, Dodge et al. 2009). El inhibidor de Notch puede ser, pero sin limitación, éster butílico de N-[N-(3,5-difluorofenacetil)-L-alanil]-S-fenilglicina ("DAPT" o "LY-374973") (Dovey, John et al., 2001), N1-[(7S)-6,7-dihidro-6-oxo-5H-dibenzo[b,d]azepin-7-il]-2,2-dimetil-N3-(2,2,3,3,3-pentafluoropropil)- ("RO4929097", propanodiamida) (He, Luistro et al. 2011), (S)-2-hidroxi-3-metil-N-((S)-1-((S)-3-metil-2-oxo-2,3,4,5-tetrahidro-1 H-benzo[d]azepin-1 -ilamino)-1 -oxopropan-2-il)butanamida ("LY450139") (Lanz, Hosley et al. 2004), N-[(1 S)-2-[[(7S)-6,7-dihidro-5-metil-6-oxo-5H-dibenzo[b,d]azepin-7-il]amino]-1 -metil-2-oxoetil]-2-hidroxi-3-metil-, (2S)- ("LY900009", butanamida) (Selleckchem: N° de catálogo S7168), N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-dihidro-5-(2-hidroxietil)-6-oxo-5H-pirido[3,2-a][3]benzazepin-7-il]amino]-1-metil-2-oxoetil]-4,4,4-trifluoro- ("LY3039478", butanamida) Selleckchem: N° de catálogo S7169, N-[(1S)-2-[[((SS)-6,7-dihidro-5-metil-6-oxo-5H-dibenzo[b,d]azepin-7-il]amino]-1-metil-2-oxoetil]-3,5-difluoro-a-hidroxi-, (aS)- ("LY411575", bencenoacetamida) (Wehner, Cizelsky et al.

2014), 7-(S)-[N'(3,5-difluorofenilacetil)-L-alaninil]amino-5-metil-5,7-dihidro-6H-dibenzo[b,d]azepin-6-ona ("YO-01027" (DBZ)) (Milano, McKay et al. 2004), (2R)-2-(N-(2-fluoro-4-(1,2,4-oxadiazol-3-il)bencil)-4-clorofenilsulfonamido)-5,5,5-trifluoropentanamida ("BMS-708163") (Saito, Fu et al. 2014), (2R,3S)-N-[(3S)-1-metil-2-oxo-5-fenil-2,3-dihidro-1H-1,4-benzodiazepin-3-il]-2,3-bis(3,3,3-trifluoropropil)succinamida ("BMS-906024") (Huang, Greer et al. 2009), (S,S)-2-[2-(3,5-difluorofenil)-acetilamino]-N-(1-metil-2-oxo-5-fenil-2,3-dihidro-1 H-benzo[e][1,4]diazepin-3-il)-propionamida ("compuesto E") (Milano, McKay et al. 2004), ácido 2-[(1R)-1-[[(4-clorofenil)sulfonil](2,5-difluorofenil)amino]etil-5-fluorobencenobutanoico ("BMS-299897") (Anderson, Holtz et al. 2005), SAHM1 Número de catálogo de Calbiochem: 491002, (selectiva de Abeta42) Número de catálogo de Calbiochem: 565792, y W-(2-bromofenil)-W-(2-hidroxi-4-nitrofenil)urea ("SB 225002") (Bakshi, Jin et al. 2009).

La subsiguiente incubación adicional de una célula madre epitelial en presencia de al menos un inhibidor de Notch y un agente que inhibe al menos uno de un receptor de tirosina quinasa (RTK), una proteína activada por mitógeno (MAP) quinasa, también denominada MAPK/ERK, o una quinasa regulada por señal extracelular (ERK), también denominada MAPK/ERK, produce células enteroendocrinas. La MAP quinasa puede ser, pero sin limitación, proteína activada por mitógeno quinasa quinasa y el agente que inhibe una MAP quinasa puede ser, pero sin limitación, N-[(2S)-2,3-dihidroxipropil]-3-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]-4-piridincarboxamida ("AS-703026") (Kim, Kong et al. 2010), N-[(2R)-2,3-dihidroxipropoxi]-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]-benzamida ("PD0325901") (Thompson y Lyons 2005), 5-(2-fenil-pirazolo[1,5-a]piridin-3-il)-1 H-pirazolo[3,4-c]piridazin-3-ilamina ("FR 180204") (Ohori, Kinoshita et al. 2005), 2-(2-amino-3-metoxifenil)-4H-cromen-4-ona ("PD98059") (Alessi, Cuenda et al. 1995), 6-(4-bromo-2-clorofenilamino)-7-fluoro-N-(2-hidroxietoxi)-3-metil-3H-benzo[d]imidazol-5-carboxamida ("Selumetinib") (Huynh, Soo et al.2007), (Z)-3-amino-3-(4-aminofeniltio)-2-(2-(trifluorometil)fenil)acrilonitrilo ("SL-327") (Chen, Operana et al. 2005), (2Z,3Z)-2,3-bis(amino(2-aminofeniltio)metilen)succinonitrilo, etanol ("U0126") (Favata, Horiuchi et al. 1998), (R)-3-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-5-(2-fluoro-4-yodofenilamino)-8-metilpirido[2,3-d]pirimidina-4,7(3H,8H)-diona ("TAK-733") (Dong, Dougan et al.2011) y N-(3-(3-ciclopropil-5-(2-fluoro-4-yodofenilamino)-6,8-dimetil-2,4,7-trioxo-3,4,6,7-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-1(2H)-il)fenil)acetamida ("Trametinib") (Gilmartin, Bleam et al. 2011). El agente que inhibe un RTK puede ser, pero sin limitación, N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6-[3-(4-morfolinil)propoxi]-4-quinazolinamina ("Gefitinib") (Ciardiello 2000), (£)-2-ciano-3-(3,4-dihidroxifenil)-2-propenamida ("AG 99") (Gazit, Yaish et al. 1989), 4-[[(2S)-2-(3-clorofenil)-2-hidroxietil]amino]-3-[7-metil-5-(4-morfolinil)-1 H-bencimidazol-2-il]-2(1 H)-piridinona ("Bm S 536924") (Huang, Greer et al. .2009), 5-(2-fenil-pirazolo[1,5-a]piridin-3-il)-1 H-pirazolo[3,4-c]piridazin-3-ol ("FR 180209") (Anastassiadis, Duong-Ly et al. 2013), clorhidrato de N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4-amina ("Erlotinib") (Kuiper, Heideman et al. 2014), (S,E)-N-(4-(3-cloro-4-fluorofenilamino)-7-(tetrahidrofurano-3-iloxi)quinazolin-6-il)-4-(dimetilamino)but-2-enamida ("Afatinib") (Minkovsky y Berezov 2008), N-(4-(3-fluorobenciloxi)-3-clorofenil)-6-(5-((2-(metilsulfonil)etilamino)metil)furan-2-il)quinazolin-4-amina, di-4-metilbencenosulfonato ("Lapatinib") (Xia, Mullin et al. 2002), N-(3-(5-cloro-2-(2-metoxi-4-(4-metilpiperazin-1il)fenilamino)pirimidin-4-iloxi)fenil)acrilamida ("WZ4002") (Sakuma, Yamazaki et al. 2012) y 2-[(3,4-dihidroxifenil)metilen]-("AG-18", propanodinitrilo) (Gazit, Yaish et al. 1989).

Las soluciones y los sistemas de cultivo celular de la divulgación se pueden utilizar adicionalmente para formar constructos de tejido tridimensionales que comprenden epitelio trasplantable con fines regenerativos. Dichos constructos de tejido se pueden trasplantar a huéspedes según procedimientos conocidos en la técnica (Lloyd et al.

2006; Gupta et al. 2006; Yui et al. 2012). Los tejidos susceptibles de tratamiento incluyen todos los tejidos dañados, incluidos los que pueden haber sido dañados por enfermedad, lesión, traumatismo, una reacción autoinmunitaria o por una infección vírica o bacteriana. Se pueden emplear técnicas de trasplante mínimamente invasivas, incluida la tecnología guiada por imágenes. Los constructos de tejido pueden inyectarse o implantarse directamente en el tejido dañado, en el que pueden multiplicarse y eventualmente diferenciarse en el tipo de célula requerido, según su ubicación en el cuerpo. Los constructos de tejido pueden implantarse o inyectarse directamente mediante enema colónico. Se puede emplear micronización antes del suministro por vía oral para aplicaciones del intestino superior. En consecuencia, los tejidos dañados particularmente adecuados para la reparación incluyen tejidos del colon, del intestino delgado, del páncreas, del esófago y del sistema gástrico. El experto sabrá cuál será la dosis apropiada de constructos de tejido para una afección particular que haya que tratar.

Las soluciones y los sistemas de cultivo celular de la divulgación se pueden utilizar adicionalmente para predecir la eficacia de un agente quimioterapéutico, o combinaciones de agentes quimioterapéuticos, in vivo. Dichos procedimientos son particularmente relevantes para su uso en entornos clínicos, ya que muchos pacientes son tratados con múltiples fármacos.

Pueden formarse organoides tumorales según procedimientos conocidos en la técnica cultivando agregados de células tumorales aislados o células individuales en soluciones de cultivo de la invención (Sato et al., 2011 a). Dichos cultivos se pueden utilizar como modelos clínicos para varios tipos de cáncer, que incluyen, pero sin limitación, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer de colon, cáncer intestinal y cáncer de vejiga.

Pueden incubarse organoides tumorales en presencia de una solución de cultivo celular de la invención (que comprende, por ejemplo, un inhibidor de un BMP, R-espondina 1, un agonista de Wnt, un inhibidor de histona desacetilasa) y un agente o agentes quimioterapéuticos. A continuación, se mide y se evalúa un parámetro relevante. Los parámetros relevantes incluyen la inhibición de la viabilidad celular, la inhibición de la proliferación celular, la inhibición de la expresión génica asociada a tumores, la activación de la apoptosis y la inhibición de la supervivencia celular. La detección de un aumento en el parámetro en comparación con una referencia (por ejemplo, control) indica la eficacia del agente quimioterapéutico con respecto al organoide tumoral, que es predictivo de la eficacia del agente o agentes quimioterapéuticos in vivo.

En general, los agentes quimioterapéuticos se incuban con el sistema de cultivo celular que comprende organoides tumorales en un intervalo de dosificación estimado como terapéutico y durante un periodo de tiempo suficiente para producir un efecto fisiológico. El tiempo de incubación puede variar entre aproximadamente 1 hora a 24 horas, o puede prolongarse según sea necesario durante varios días o incluso semanas. Las condiciones de incubación implican típicamente el uso de soluciones de cultivo de la invención y el mantenimiento de temperaturas de aproximadamente 37 2C.

Un agente quimioterapéutico es cualquier sustancia que se evalúa por su capacidad para curar, mitigar, tratar o prevenir el cáncer en un sujeto e incluye, pero sin limitación, un compuesto químico, un agente biológico, una proteína, un péptido, un ácido nucleico, un lípido, un polisacárido, un suplemento y un anticuerpo.

La inhibición de la expresión génica asociada a tumores se puede determinar según procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la inhibición de la expresión génica asociada a tumores con respecto a un control se puede detectar mediante análisis de microchip, RT-PCR, hibridación in situ, hibridación fluorescente in situ o análisis Northern. La inhibición de la expresión de proteínas asociada a tumores con respecto a un control puede detectarse mediante inmunotransferencia Western cuantitativa, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, análisis de secuencia de aminoácidos, clasificación de células activadas por fluorescencia o ensayos de concentración de proteínas. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo de cribado de genes de cáncer gástrico para identificar cambios en la expresión génica de angiotensina, apolipoproteína E, apolipoproteína A-I, ceruloplasmina, protrombina, fibronectina, proteína de unión a vitamina D, gelsolina, cadena pesada H3 de inhibidor de inter-alfa-tripsina, quininógeno-1, paraoxonasa/arilesterasa 1 en suero, alfa-1-anticimotripsina y transtirretina.

La activación de la apoptosis se puede determinar según procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden detectarse aumentos en la muerte celular con respecto a un control mediante liberación de lactato deshidrogenasa, actividad de caspasa, tinción con anexina V, tinción con fosfatidilserina o ensayo TUNEL. Determinados ensayos detectan eventos relativamente tardíos en el proceso de muerte celular, tales como la liberación de lactato deshidrogenasa. La activación de caspasa es una característica común de toxicidad crónica y muerte celular. La actividad de caspasa se puede medir de forma relativamente rápida después de un insulto tóxico (30 minutos a 4 horas) mediante espectroscopia de fluorescencia, prestándose así a técnicas de cribado de alto rendimiento. Otros marcadores y ensayos comúnmente utilizados para controlar la apoptosis o la necrosis de células pueden incluir, pero sin limitación, la presencia de fosfatidilserina en la valva externa de la membrana plasmática de las células afectadas, la tinción con anexina V y el ensayo de marcado de final de corte de desoxinucleotidiltransferasa terminal (TUNEL).

La inhibición de la viabilidad celular se puede determinar según procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen, pero sin limitación, el recuento diferencial de células viables y muertas utilizando colorantes vitales, tales como azul de tripano, 4,6-diaminofenilindol (DAPI) y yoduro de propidio.

La inhibición de la proliferación celular puede determinarse según procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen, pero sin limitación, la cuantificación de ADN mediante la incorporación de bromodesoxiuridina, la medición de timidina tritiada (3H-timidina), la tinción con yoduro de propidio, el análisis metabólico intracelular mediante sal de tetrazolio o la reducción de AlamarBlue y la cuantificación de la concentración de ATP intracelular. Otros procedimientos incluyen la medición directa del contenido total de ácidos nucleicos de células lisadas mediante análisis espectrofotométrico; marcado fluorescente con anticuerpo anti-péptido cdc6, anticuerpo anti-proteína de unión a ARNm humano HuR (anticuerpo anti-HuR), anticuerpos contra ciclinas D e inhibidores de quinasa dependientes de ciclina; detección de antígeno Ki-67; medición del contenido de proteínas mediante inmunotransferencia Western cuantitativa, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, ensayo de inmunosorción ligado a enzima, análisis de secuencia de aminoácidos, clasificación celular activada por fluorescencia o ensayos de concentración de proteínas. Los kits disponibles comercialmente que emplean los procedimientos anteriores incluyen el marcado de nucleótidos con ChromaTide™, el éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína, el kit de ensayo de proliferación celular ABSOLUTE-S™ SBIP, la solución de marcado celular Vybrant Dil, el kit de ensayo de proliferación celular CyQUANT, el kit de ensayo de proliferación celular Vybrant™ MTT, el kit de ensayo de proliferación celular Vybrant™ MTT y el kit de ensayo de ácido nucleico fluorométrico FluoReporter™ Blue.

La supresión de la supervivencia celular puede determinarse según procedimientos conocidos en la técnica, incluidos ensayos clonogénicos.

III. Procedimientos para promover la expansión de células epiteliales o el crecimiento de tejidos epiteliales in vivo

Las células madre epiteliales, incluidas células madre del intestino, el estómago, los pulmones, el páncreas y el colon y, en particular, las células madre positivas para LGR5 presentes en el intestino, el oído interno, el cerebro, el riñón, el hígado, la retina, el estómago, el páncreas, la mama, el folículo piloso, el ovario, la médula suprarrenal, la piel, el timo, las papilas gustativas y las glándulas mamarias pueden expandirse in vivo mediante la administración de un agonista de Wnt y un inhibidor de histona desacetilasa o un agonista de Wnt y un agonista de Notch a un sujeto. Estas combinaciones promueven la expansión de las células epiteliales dando como resultado el crecimiento de tejidos epiteliales in vivo.

En formas de realización específicas, las células epiteliales intestinales pueden formarse in vivo después de la administración de un agonista de Wnt, por ejemplo, CHIR99021 y un inhibidor de histona desacetilasa, por ejemplo, ácido valproico, o un agonista de Wnt, por ejemplo, CHIR99021 y un agonista de Notch a un sujeto.

En algunas formas de realización, estas combinaciones, por ejemplo, CHIR99021 y ácido valproico, pueden tratar trastornos intestinales en un sujeto, que incluyen, pero sin limitación, enterocolitis; infecciones víricas, tales como enteritis no específica o enteritis vírica específica; diverticulitis; enterocolitis bacterianas, tales como salmonelosis, shigelosis, enterocolitis por Campylobacter o enterocolitis por Yersinia; infecciones por protozoos tales como la amebiasis; infección helmíntica; y colitis seudomembranosa y complicaciones pulmonares en fibrosis quística y enfermedad pulmonar obstructiva crónica; apendicitis; gastritis atrófica; esófago de Barrett; neumonitis; cervicitis; nefritis intersticial crónica; colitis; diverticulitis colónica; conjuntivitis; dermatitis de contacto; úlceras de Curling; úlceras de Cushing; cistitis; gangrena; gingivitis; mastitis; esofagitis; pancreatitis; paniculitis; gastritis flemonosa; glomerulonefritis; y enfermedades autoinmunitarias que incluyen, pero sin limitación, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad de Addison y glomerulonefritis (por ejemplo, glomerulonefritis crescéntica, glomerulonefritis proliferativa).

La dosis administrada dependerá de la edad, el sexo, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento concurrente, si existe alguno, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. Los intervalos de dosis para la administración de las composiciones de la presente invención son aquellos que sean lo suficientemente grandes como para producir el efecto deseado. Las dosis no deberán ser tan grandes como para causar efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas y similares. En general, la dosificación variará con la condición del paciente y la magnitud de la enfermedad. Las contraindicaciones, si existe alguna, la tolerancia inmunitaria y otras variables también afectarán a la dosis adecuada. Por ejemplo, teniendo en cuenta factores tales como la edad, el peso, el sexo, la especie, el estado/salud general del paciente, la afección que hay que tratar, el momento de los tratamientos, la DL50 del ingrediente activo involucrado en un modelo animal adecuado (por ejemplo, roedores, ratones) y otros factores conocidos; y dichas dosis pueden ser del orden de microgramos a miligramos, tal como del orden de 0,5 a 500 mg/kg, u otra cantidad adecuada, o pueden calcularse a partir de los ejemplos del presente documento, por ejemplo, considerando el peso promedio de un animal de ensayo típico (tales como ratones) y las dosis administradas a los mismos (por ejemplo, 100 microgramos), y por lo tanto el experto en la técnica puede determinar las dosis sin una experimentación excesiva. En particular, en sujetos humanos, el CHIR99021 se administra en una cantidad de aproximadamente 0,1 mg/kg/día a aproximadamente 100 mg/kg/día y el ácido valproico se administra en una cantidad de aproximadamente 1 mg/kg/día a aproximadamente 1000 mg/kg/día. En formas de realización específicas, la cantidad de ácido valproico es de 15-40 mg/kg/día.

Las composiciones farmacéuticas de CHIR99021 y ácido valproico se pueden administrar de forma concomitante o secuencial por cualquier medio que logre su propósito previsto. Por ejemplo, la administración puede ser por vía tópica, parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, rectal o bucal. Alternativamente, o simultáneamente, la administración puede ser por vía oral. A partir de la descripción anterior, será evidente que pueden realizarse variaciones y modificaciones a la invención descrita en el presente documento para adoptarla a diversos usos y condiciones. En el presente documento se describen procedimientos y materiales para su uso en la presente invención; también pueden utilizarse otros procedimientos y materiales adecuados conocidos en la técnica. Los materiales, los procedimientos y los ejemplos son solo ilustrativos.

La invención se describe adicionalmente en los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Ejemplo 1: La autorrenovación de células madre intestinales Lgr5+ se mantiene utilizando una combinación de moléculas pequeñas

La autorrenovación y la diferenciación de ISC se controlan mediante la regulación coordinada de varias rutas de señalización (Crosnier, Stamataki y Lewis, 2006; Scoville, Sato, He y Li, 2008; van der Flier y Clevers, 2009). En este estudio, se identificaron moléculas pequeñas que se dirigen a rutas de señalización relevantes para mantener el estado de autorrenovación de células madre Lgr5+ y para controlar su diferenciación independientemente de las señales proporcionadas por otros tipos de células.

Se aislaron criptas y células Lgr5-GFP individuales tal como se ha descrito anteriormente (Sato et al., 2009). En resumen, se recogió la mitad proximal del intestino delgado, se abrió longitudinalmente y se lavó con PBS frío para eliminar el contenido luminal. Después se cortó el tejido en trozos de 2-4 mm con tijeras y se lavó adicionalmente 5 10 veces con PBS frío pipeteando hacia arriba y hacia abajo utilizando una pipeta de 10 ml. Los fragmentos de tejido se incubaron con EDTA 2 mM en PBS durante 30 minutos sobre hielo. Después de retirar el EDTA, los fragmentos de tejido se lavaron con PBS para liberar criptas. Se recogieron fracciones de sobrenadante enriquecidas en criptas, se pasaron a través de un filtro de células de 70 gm y se centrifugaron a 300 g durante 5 minutos. El sedimento celular se resuspendió con medios de cultivo celular sin factores de crecimiento y se centrifugó a 150 g para eliminar células individuales. Las criptas se cultivaron o se utilizaron para el aislamiento de células individuales. Para obtener células individuales, las criptas se incubaron en medio de cultivo durante 45 minutos a 37 °C y se trituraron con una pipeta de vidrio. Las células disociadas se pasaron a través de un filtro de células de 20 gm, se tiñeron negativamente con yoduro de propidio y las células viables con alto contenido de GFP se clasificaron por citometría de flujo (FACS Aria, BD) tal como se ha descrito anteriormente (Sato et al., 2009). Se embebieron criptas del intestino delgado aisladas de ratones Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 en Matrigel y se cultivaron en condiciones de cultivo convencionales en presencia de EGF, nogina y R-espondina 1 (denominados colectivamente como ENR) produciendo organoides con criptas y dominios similares a vellosidades y células GFP+ en las puntas de las criptas, según informes anteriores (Sato et al., 2009). Las criptas o las células individuales aisladas se cultivaron tal como se ha descrito anteriormente (Sato et al., 2009) con una modificación mínima. En resumen, las criptas o las células individuales se atraparon en Matrigel y se sembraron en el centro de pocillos de una placa de 24 pocillos. Después de la polimerización de Matrigel (factor de crecimiento reducido; BD Bioscience), se añadieron 500 gl de medio de cultivo (Advanced DMEM/F12 (Life Technologies)) que contenía factores de crecimiento que incluían EGF (50 ng/ml, Life Technologies), nogina (100 ng/ml, Peprotech) y R-espondina 1 (500 ng/ml, R&D) y moléculas pequeñas que incluían CHIR99021 (3 gM, Stemgent) y ácido valproico (1 mM, Sigma-Aldrich). Para comparar las diferentes condiciones de cultivo, se añadieron moléculas pequeñas o factores de crecimiento a las criptas recién aisladas inmediatamente después de sembrarlas en Matrigel para someter a prueba su capacidad para minimizar la diferenciación potencial de las ISC dentro de las criptas y mantener así cultivos de criptas. Los medios de cultivo celular se cambiaron cada dos días. Para el cultivo de células individuales, las células se embebieron en Matrigel que contenía péptido Jagged-1 (1 gM; AnaSpec) y se añadió Y-27632 (10 gM; Tocris) durante los primeros 2 días. Las células se sometieron a pases o bien como colonias celulares tal como se ha descrito anteriormente (Sato et al., 2009) o bien como células individuales. Para el pase de células individuales se eliminó el medio de cultivo celular y se añadió Accutase (Life Technologies). Después de una incubación a 37 °C durante 10-20 minutos, las colonias celulares se disociaron en células individuales mediante pipeteo. Las células se lavaron, se embebieron en Matrigel nuevo y se sembraron en placas de 24 pocillos. Las células cultivadas en la condición CV se sometieron a pases cada 6 días a una relación de división 1:20. Aproximadamente la mitad de las criptas cultivadas contenían células GFP+, lo que es coherente con la expresión de GFP in vivo de ratones Lgr5-GFP (figura 1).

Los factores de crecimiento utilizados en la condición ENR proporcionan señales esenciales, pero no adecuadas, para mantener la autorrenovación de células madre Lgr5+. Para identificar factores esenciales para mantener el estado de autorrenovación de las células madre intestinales, se sometieron a prueba moléculas pequeñas seleccionadas que modulan las rutas de señalización de las ISC, tales como Wnt, Notch y BMP, en la condición ENR, utilizando el reportero Lgr5-GFP. El CHIR99021 (denominado en el presente documento CHIR o C), un inhibidor de GSK3p que activa la ruta de señalización de Wnt, promovió la proliferación de células de cripta, tal como se indica cuantificando el tamaño promedio de los organoides y el número de células presentes en el cultivo (figuras 2A, 2B y 3A, 3B). El CHIR aumentó el porcentaje y la intensidad relativa de GFP de células GFP+ en el cultivo, lo que indica un aumento en la autorrenovación de células madre (figuras 2A y 2B). En particular, aún existía un gran número de células negativas para GFP en los organoides (figura 2A), lo que probablemente era el resultado del mantenimiento insuficiente de la autorrenovación de células madre o el resultado de promover la proliferación de células negativas a GFP más maduras en las criptas. El ácido valproico (VPA o V), un inhibidor de histona desacetilasa, también aumentó significativamente la expresión de GFP de organoides GFP+, con una presencia mínima de células negativas para GFP (figura 2A). Curiosamente, cuando se combinaron CHIR y VPA (CV), la proliferación celular, así como el porcentaje y la intensidad relativa de GFP de células que expresan GFP en el cultivo aumentaron significativamente (figuras 2A y 2B), con células GFP+ casi puras en organoides GFP+ (figura 2A), lo que indica una diferenciación o una proliferación mínima de células diferenciadas y un aumento de la autorrenovación de células madre en esta condición de cultivo.

Las células GFP+ en la condición CV mostraron una única población con un alto índice de GFP que correspondía al de células individuales recién aisladas (figura 3C), representando la población de células madre Lgr5+ tal como se informó anteriormente (Sato et al., 2009). En particular, en la condición CV, se necesitaron aún R-espondina 1 y nogina para mantener la autorrenovación de células madre Lgr5+, mientras que EGF promovió la proliferación de criptas, por lo que podía eliminarse del cultivo sin afectar al mantenimiento de células Lgr5+ (figura 3D). El aumento de la concentración de CHIR eliminó adicionalmente la necesidad de R-espondina 1 para promover la expresión de GFP (figura 3E), de forma coherente con el papel de R-espondina 1 para aumentar la señalización de Wnt/p-catenina. Además, VPA o CHIR+VPA también promovieron la expresión de GFP de células madre Lgr5+ del colon (figura 3F). Además, la R-espondina 2 mostró una mejor eficacia a concentraciones más bajas para promover la formación de organoides en la condición ENR en comparación con R-espondina 1 (figura 3G). También sometimos a prueba condiciones de cultivo que previamente demostraron mantener células madre colónicas EPHB2 o criptas colónicas humanas en un estado en gran medida indiferenciado (Jung et al., 2011; Sato et al., 2011a) pero no lograron efectos similares sobre células madre Lgr5-GFP del intestino delgado (figuras 4A y 4B), lo que sugiere que estos factores pueden actuar a través de diferentes mecanismos en células madre colónicas EPHB2+ con respecto a células madre Lgr5+.

Para confirmar adicionalmente la proliferación y los efectos de autorrenovación de Lgr5+ de CHIR y VPA en ausencia de tipos de células maduras y células madre negativas para GFP (dado que las criptas muestran un patrón de expresión de GFP en mosaico), se aislaron células con alto índice de GFP individuales mediante clasificación por FACS (figura 3C) y se cultivaron en Matrigel en presencia de ENR y CHIR o VPA, o en presencia de ambos compuestos (condición CV). El inhibidor de Rho quinasa Y-27632, que inhibe la anoikis de células madre individuales (Watanabe et al., 2007), se añadió durante los primeros dos días tal como se ha descrito anteriormente (Sato et al., 2009). Después de un cultivo de 7 días, se formaron espontáneamente colonias que contenían células madre GFP+. De forma similar a los cultivos de criptas, el CHIR aumentó significativamente la proliferación celular mientras que solo aumentó moderadamente la expresión de GFP, mientras que VPA promovió la expresión de GFP con un efecto pro-proliferativo mínimo. Para la condición CV, la proliferación celular aumentó significativamente y más del 97% de las células del cultivo fueron células GFP+ (figuras 2C-2E y 5A). Debe indicarse que, en comparación con los cultivos de criptas, en los que se cultivaron células madre Lgr5+ individuales puras en CHIR, los organoides que se formaron contenían grandes cantidades de células negativas para GFP, lo que indica que las células madre se diferenciaron en esta condición y, por lo tanto, se requirieron otros factores para mantener el estado de autorrenovación de células madre Lgr5+.

Cuando se cultivaron células Lgr5-GFP+ individuales aisladas en la condición ENR estándar, pocas células crecieron en organoides, lo que es coherente con informes anteriores (Sato et al., 2009) y probablemente es debido a condiciones de cultivo subóptimas. Cuando se añadió CHIR al cultivo (ENR-C), la eficacia de formación de colonias aumentó significativamente en 20-50 veces (figuras 2F, 2G y 5B, 5C), proporcionando una respuesta similar a la adición de Wnt3A cuando se añadió a 100 ng/ml (figura 2F y Sato et al., 2011b). En marcado contraste con esto, el VPA solo aumentó débilmente la eficacia de formación de colonias en ausencia de CHIR (ENR-V, figuras 2F, 2G y 5B, 5C). Sorprendentemente, cuando se cultivaron células madre Lgr5-GFP+ individuales aisladas en presencia de CHIR y VPA, se produjo un efecto sinérgico y ~25%-40% de la población celular total creció en colonias (figura 2F). Se cree que esto representa la formación de colonias más eficaz que se ha informado para células madre Lgr5+.

Tabla 1: Número de colonias para la formación de colonias en la figura 2G

Tabla 2: Número de colonias para la eficacia de formación de colonias en la figura 5C

Dado que una parte de las células que se clasificaron mediante FACS se encontraba en un estado proapoptótico y generalmente morían dentro de un periodo de 12 horas (Sato et al., 2011 b), las células vivas se contaron manualmente 12 horas después de la siembra. Más del 90% de las células vivas crecieron en organoides cuando estaban presentes tanto CHIR como VPA en los medios de cultivo (figura 5D).

Tabla 3: Eficacia de formación de colonias en la figura 5D

Además, las células cultivadas en la condición CV pudieron someterse a pases como células individuales durante más de 10 pases con una eficacia de formación de colonias similar a la de células Lgr5-GFP+ recién aisladas, y sin pérdida de capacidad proliferativa, y mostraron un cariotipo normal (2n = 40) (figura 2H). Estos resultados sugieren que CHIR y VPA proporcionan señales que no están presentes en la condición ENR estándar para mantener la autorrenovación de células madre Lgr5+.

Tal como se ha informado anteriormente, las células en la condición ENR crecieron en organoides con estructura de cripta-vellosidad que contenía todos los tipos de células epiteliales intestinales, lo que se confirmó mediante tinción de enterocitos positivos para fosfatasa alcalina (Alp), células caliciformes positivas para mucina 2 (Muc2), células enteroendocrinas positivas para cromogranina A (ChgA), células de Paneth positivas para lisozima (Lyz) y células madre Lgr5-GFP+. Las células madre Lgr5+ solo residen en las puntas de las criptas (figuras 6A y 7A). La tinción con Ki67 y EdU reveló que las células proliferativas solo existían dentro de los dominios de la cripta (figuras 6B y 6C). En la condición CV, sin embargo, las células madre GFP+ estaban presentes a lo largo de toda la colonia con una presencia mínima de células de Paneth (figura 6A) y sin la presencia de otros tipos de células. En comparación con el cultivo ENR, las células proliferativas positivas positivas para Ki67 o EdU en la condición CV existían a lo largo de toda la colonia celular (figuras 6B y 6C). Esto se confirmó con PCR cuantitativa en tiempo real, mediante la cual las células en la condición CV expresaron niveles mínimos de Alpi (enterocitos), Muc2 (células caliciformes), ChgA (células enteroendocrinas), niveles moderados de lisozima (células de Paneth) y niveles altos de Lgr5 (ISC) en comparación con células en la condición ENR (figuras 6D). Este patrón de expresión se mantuvo a lo largo de múltiples pases, y el nivel de expresión de Lgr5 se mantuvo (figura 6D).

El CHIR solo reduce la diferenciación a enterocitos, pero al mismo tiempo aumentó la diferenciación a células de Paneth (figura 6D), lo que es coherente con el informe anterior (Farin et al., 2012). Aunque el VPA solo disminuyó la diferenciación a secretoras (figura 6D) y ayudó a mantener una mayor fracción de células madre GFP+, no es suficiente para suprimir la diferenciación de las células madre. De hecho, cuando las células madre aisladas se cultivaron en presencia de VPA pero sin CHIR u otros agentes que promueven la señalización de Wnt, su supervivencia fue mucho menor que cuando el Wnt estaba presente. Cuando la ruta de Wnt está bloqueada por IWP-2, el VPA solo no puede mantener la autorrenovación de las células madre (la condición IV en las figuras 7B, 7C). La combinación de CHIR y VPA suprimió la diferenciación a enterocitos y secretoras y mantuvo el programa de autorrenovación de células madre Lgr5+ (figura 6D). Estos resultados sugieren que CHIR o VPA solo no es suficiente para mantener la autorrenovación de células madre Lgr5+, pero muestra efectos sinérgicos cuando se combina con CHIR u otros activadores de Wnt.

En resumen, dos moléculas pequeñas, CHIR y VPA, pueden apoyar la autorrenovación de las células madre Lgr5+ sin contacto directo con las células de Paneth o en ausencia de las mismas. En particular, estas moléculas pequeñas pueden mejorar en gran medida la formación de colonias a partir de células madre individuales, lo que indica que proporcionan señales de nicho esenciales que se proporcionan típicamente por células de Paneth.

Ejemplo 2: Las células madre Lgr5+ continúan siendo multipotentes después del cultivo en CHIR y VPA

Las células madre intestinales tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en todos los tipos de células en el epitelio del intestino, incluidos los cuatro tipos de células principales: enterocitos, células caliciformes, células enteroendocrinas y células de Paneth. Para someter a prueba la capacidad de diferenciación de células madre Lgr5+ cultivadas en la condición CV, las colonias celulares se transfirieron a la condición ENR que permite que las células madre Lgr5+ se diferencien espontáneamente en los tipos de células maduras del intestino. Como se esperaba, después de retirar CHIR y VPA, la morfología de los organoides cambió a la morfología típica de los organoides cultivados en condiciones ENR, con estructura de cripta-vellosidades y células madre Lgr5+ en las puntas de las criptas (figuras 7A y 8A). La expresión de ARNm de los marcadores de diferenciación Alpi, Muc2 y ChgA aumentó y las células expresaron un nivel similar de lisozima (comparando ENR y CV en la figura 7B). La tinción inmunocitoquímica para estos marcadores confirmó la existencia de tipos celulares diferenciados en el cultivo (figura 7A).

Ejemplo 3: Se controla la diferenciación de células madre intestinales

A continuación, con la capacidad de expandir células madre Lgr5+ de alta pureza in vitro, se intentó direccionar la diferenciación de células madre Lgr5+ hacia tipos de células maduras. Como Wnt y Notch son dos de las principales rutas de señalización que controlan la diferenciación de ISC, se utilizaron el inhibidor de la ruta de Wnt IWP-2 (también I) y el inhibidor de Notch DAPT (también D) para inducir la diferenciación de células madre Lgr5+ cultivadas. Debido a que las células en la condición ENR se diferencian espontáneamente en organoides que contienen todos los tipos de células epiteliales, se incluyó ENR en los cultivos de diferenciación. Después del cultivo de células madre individuales en la condición CV durante 6 días, las colonias celulares se recolectaron y se transfirieron a varios pocillos y se cultivaron en presencia de inhibidores individuales o múltiples (figura 8B). Tal como se muestra en la figura 7B, la sustitución de CV por IWP-2 o DAPT disminuyó la expresión del marcador de ISC Lgr5 y la expresión inducida de los marcadores de diferenciación Alpi, Muc2, ChgA y lisozima. En particular, la presencia de VPA (por ejemplo, comparando entre R y V, I y IV, C y CV, o D y DV) causó un menor nivel de expresión de Muc2, ChgA y lisozima, pero no Alpi, lo que indica que el VPA suprimió específicamente la diferenciación al linaje de células secretoras. Alternativamente, la inhibición de Wnt con IWP-2 indujo preferentemente la expresión de Alpi, con una expresión de Muc2 y ChgA moderadamente elevada y abolió completamente la expresión de lisozima y Lgr5. Esto indica que se requiere una señalización de Wnt para mantener la similitud con células madre y suprimir la diferenciación, pero también se requiere para la diferenciación a células de Paneth. El inhibidor de Notch DAPT elevó significativamente los marcadores de tipos de células secretoras, incluidos Muc2, ChgA y lisozima, lo que es coherente con informes anteriores de que la inhibición de Notch induce la diferenciación a células secretoras (Milano et al., 2004; VanDussen et al., 2012; Wong et al., 2004). Además, la combinación de IWP-2 y VPA indujo específicamente la diferenciación a enterocitos, presumiblemente combinando los efectos de ambos inhibidores, en la que IWP-2 indujo la diferenciación de células madre Lgr5+ mientras que VPA suprimió la diferenciación de células madre Lgr5+ hacia tipos de células secretoras. De forma similar, la combinación de DAPT y CHIR indujo principalmente la diferenciación a células de Paneth, y la combinación de IWP-2 y DAPT indujo principalmente la diferenciación a células caliciformes. Estas condiciones también indujeron cambios morfológicos evidentes que se parecían a la morfología de cada tipo de célula diferenciada (figuras 7C y 8D). La tinción de marcadores de enterocitos, células caliciformes y células de Paneth confirmó las observaciones anteriores (figuras 7C, 7D y 8E, 8F). La presencia de IWP-2 o CHIR no influyó significativamente en la expresión de ChgA, lo que indica que, en comparación con las células caliciformes y las células de Paneth, la diferenciación a las células enteroendocrinas no requiere estrictamente la inhibición o la activación de Wnt.

Ejemplo 4: Se examina el mecanismo que media la respuesta de CHIR y VPA

El CHIR es un inhibidor de GSK3 altamente específico que activa la ruta de señalización de Wnt/p-catenina (Bain et al., 2007), y se ha utilizado para mantener el estado de autorrenovación de células madre embrionarias (Ying et al., 2008). Para confirmar que el efecto de CHIR fue a través de la activación de la ruta de Wnt, se sometieron a prueba los efectos de otros activadores de la ruta de Wnt, incluidos litio y Wnt3a. El reemplazo de CHIR por LiCl o Wnt3a aumentó la proliferación de criptas, indicada por el mayor tamaño de las colonias y una mayor cantidad de células en comparación con la condición ENR (figuras 9A y 9B). Las colonias en estas condiciones mostraron estructuras similares a quistes (figura 9A), tal como se mostró anteriormente (Sato et al., 2011b). De forma similar, se sometieron a prueba los efectos de otros inhibidores de HDAC, incluidos inhibidores de pan-HDAC e inhibidores de tipo específico. El inhibidor de pan-HDAC TSA, así como el inhibidor específico de HDAC6 tubastatina A y el compuesto 7 mostraron un efecto similar en promover la expresión de GFP con VPA (figuras 9C y 9D). Mientras que otros inhibidores pan-HDAC que incluyen Sb HA y butirato, así como inhibidores de HDAC de clase I (CI-994, MS275, figura 9C y 9D), clase IIa (MC1568, figura 9C y 9D) y clase III (nicotinamida, figura 9F), mostraron efectos nulos o solo moderados en promover la expresión de GFP (figura 9C-9F), TSA y VPA mostraron un marcado efecto de inhibición de la proliferación a una concentración más alta, pero mantuvieron la expresión de GFP en ambas concentraciones (figura 9E). Cabe destacar que la nicotinamida, un inhibidor de HDAC de la familia Sirtuin (clase III) que se utilizó en el cultivo de criptas de colon humano (Jung et al., 2011; Sato et al., 2011 a), no promovió la expresión de GFP ni la proliferación celular cuando se combinó con CHIR o Wnt3a (figura 9F), lo que indica que actúa a través de mecanismos diferentes que el VPA. Además, cuando se cultivaron células madre Lgr5+ individuales utilizando CHIR con TSA o tubastatina A, o VPA con Wnt3a, BIO o LiCl, las células mostraron una eficacia similar en la formación de colonias, la morfología de las colonias y la expresión de GFP a la de la condición CV (figura 10).

Informes anteriores han demostrado que se requiere la activación de la ruta de Notch para inhibir la diferenciación a células secretoras y mantener la autorrenovación de células madre, lo que es coherente con los efectos del tratamiento con VPA. Se evaluó si el VPA se dirige a elementos de la ruta de Notch para ejercer sus efectos. En primer lugar, se sometió a prueba el rescate de la inhibición de Notch mediante la adición de VPA. El tratamiento con el inhibidor de ysecretasa DAPT condujo a una proliferación celular y a una expresión de GFP deficientes, lo que se rescató por medio de VPA de una forma dependiente de la dosis (figura 11 A). Esto sugiere que el VPA actúa posteriormente a la formación de NICD y podría eludir el requisito de activación de Notch mediada por ligando-receptor.

Se ha demostrado anteriormente que el VPA activa la ruta de Notch en líneas celulares cancerosas (Greenblatt et al., 2007; Stockhausen et al., 2005). Para investigar el efecto de VPA sobre la activación de la ruta de Notch, las células cultivadas en condiciones ENR o ENRC se trataron con VPA y se analizaron para determinar la expresión de genes de la ruta de Notch. Sin embargo, se determinó que la adición de VPA a ENR o ENR-C durante 24 horas disminuyó moderadamente la expresión de Notch1 o Hes1, que es un gen diana posterior a Notch (figuras 11B y 11C). Además, se observó una disminución pronunciada de la diana de Notch negativa Atohl (Math1) en células tratadas con VPA y CHIR durante 24 horas o 6 días (figuras 11B-11D). Se ha demostrado que Atohl es esencial para la diferenciación de ISC hacia el linaje de células secretoras (van Es et al., 2010; Yang et al., 2001). Las células madre intestinales continúan siendo funcionales tanto in vivo como in vitro después de la ablación de células de Paneth inducida mediante deficiencia de Atohl (Durand et al., 2012; Kim et al., 2012). La inhibición de Atohl después del tratamiento con CHIR o CHIR+VPA ayudaría a mantener el programa de autorrenovación de las células madre intestinales.

En consecuencia, el control de la autorrenovación de células madre intestinales Lgr5+ y su diferenciación hacia tipos celulares diferenciados en el epitelio intestinal in vitro se ha logrado ahora mediante el uso de una combinación de factores de crecimiento e inhibidores de moléculas pequeñas, que imita estrechamente la biología epitelial del intestino in vivo (figuras 12A y 12B). En condiciones fisiológicas (figura 12A), la autorrenovación y la diferenciación de las ISC se controlan mediante la cooperación de las rutas de Wnt y de Notch. La activación de ambas rutas (indicada por Wnt On y Notch On) mantiene a las ISC en un estado indiferenciado de autorrenovación. La desactivación de la ruta de Notch (Notch Off) conduce a la especificación de tipos de células secretoras y la desactivación adicional de la ruta de Wnt (Wnt Off) conduce a la diferenciación a células caliciformes. La activación continua de la ruta de Wnt en ausencia de Notch conduce a la diferenciación a células de Paneth. No existe una fuerte dependencia de la ruta de Wnt para la diferenciación a células enteroendocrinas. Alternativamente, la activación de Notch y la desactivación de Wnt de forma continua conduce a la diferenciación a células de enterocitos. Cuando las células madre Lgr5+ se cultivan in vitro (figura 12B), el CHIR99021 activa la ruta de Wnt e inhibe la diferenciación a enterocitos mientras que VPA solo o junto con CHIR suprime la especificación de células secretoras. La combinación de CHIR y VPA mantiene a las ISC en un estado indiferenciado de autorrenovación. La inhibición de la ruta de Notch con DAPT conduce a la especificación de tipos de células secretoras y la adición adicional de CHIR conduce a la diferenciación a células de Paneth, mientras que la adición del inhibidor de la ruta de Wnt IWP-2 conduce a la diferenciación a células caliciformes. Alternativamente, la combinación de IWP-2 y VPA, que induce la diferenciación y suprime la especificación de células secretoras, conduce a la diferenciación a enterocitos.

Ejemplo 5: La proliferación de células madre positivas para Lgr5 derivadas del oído interno aumenta en presencia de c HiR y VPA

Las células ciliadas sensoriales del órgano de Corti del oído interno de mamíferos no se regeneran después del daño. Li et. al., 2003, encontraron que el epitelio sensorial utricular adulto contiene células que presentan los rasgos característicos de células madre. Estas células madre del oído interno pueden cultivarse in vitro como esferas en suspensión en presencia de EGF, bFGF e IGF-1 (Li et al., 2003). Más tarde, se descubrió que las células de apoyo postmitóticas conservan la capacidad de dividirse y transdiferenciarse en nuevas células ciliadas en cultivo (Patricia et al., 2006, Nature), lo que sugiere que estas células de apoyo pueden ser células madre del oído interno. Las células de apoyo cocleares purificadas pueden cultivarse in vitro en presencia de EGF, bFGF en células alimentadoras mesenquimales perióticas embrionarias. (Patricia et al., 2006). Shi et al. descubrieron que un subconjunto de células de apoyo de la cóclea murina de recién nacidos y adultos expresa Lgr5, un marcador de células madre adultas (Shi et al., 2012). Es importante destacar que células positivas para Lgr5 pueden aislarse y cultivarse en una suspensión de células individuales, en presencia de EGF, bFGF e IGF-1, y mostrar una capacidad de autorrenovación mejorada en comparación con células negativas para Lgr5. Los cultivos previos de células madre del oído interno utilizaron un procedimiento de cultivo en suspensión en el que solo aproximadamente el 0,068% de las células totales (Li et al., 2003) o el 2% de las células positivas para Lgr5 clasificadas pudieron formar esferas (Shi et al., 2012), probablemente debido al entorno de crecimiento inadecuado para las células. Tal como se describe en el presente documento, se ha desarrollado ahora un sistema de cultivo in vitro altamente eficaz para células madre del oído interno.

La cóclea de ratón aislada de ratones Lgr5-GFP P1 a P2 contenían células positivas para Lgr5 tal como se muestra en la figura 13A. Se estableció en primer lugar la misma condición de cultivo (EGF, nogina, R-espondina 1 o "ENR") que se utilizó en los cultivos de células madre del intestino delgado Lgr5+. Tal como se muestra en la figura 13B, la combinación de EGF, nogina y R-espondina 1 aumentó la eficacia de formación de colonias a partir de células madre epiteliales cocleares individuales en comparación con EGF solo. Tal como se esperaba, la combinación de CHIR y VPA, pero no CHIR solo, aumentó significativamente la eficacia de formación de colonias, la proliferación celular y la expresión de GFP de las células. Sorprendentemente, la eliminación de nogina de la combinación ENR-CV (la condición "ER-CV") dio como resultado una eficacia de formación de colonias ligeramente mayor y un mayor nivel de expresión de GFP, tal como se muestra en las imágenes de campo brillante y de GFP de la figura 13B. Estos resultados indican que la activación de la ruta de Wnt por medio de R-espondina 1 o CHIR promueve la proliferación de células madre del oído interno y la combinación de CHIR y VPA promueve significativamente la proliferación y la autorrenovación de células madre del oído interno.

Se utilizaron previamente factores de crecimiento mitogénicos que incluyen EGF, bFGF e IGF-1 en el sistema de cultivo en suspensión y se demostró que promueven la formación de esferas de células madre del oído interno aisladas (Li et al., 2003; Shi et al., 2011). A continuación, se sometieron a prueba los efectos de CHIR y VPA en presencia de estos factores de crecimiento tal como se describe en la tabla 1.

Tabla 4: Soluciones de cultivo celular

Se disociaron órganos de Corti aislados de ratones Lgr5-GFP en células individuales utilizando Accutase y se cultivaron en múltiples combinaciones de factores solubles y moléculas pequeñas en Matrigel durante 8 días. Los cultivos resultantes se disociaron adicionalmente en células individuales y se analizaron utilizando FACS. De forma coherente con resultados anteriores, la adición de CHIR y VPA, pero no CHIR o VPA solos, aumentó significativamente la proliferación celular (9-20 veces) y la expresión de GFP tal como se muestra por medio del porcentaje de células GFP+ (60 veces) y la intensidad relativa de GFP de células GFP+ (2 veces) (figuras 14A y 14B). Además, la combinación de EGF, bFGF e IGF-1 (designada como EFI) mejoró la proliferación celular y la expresión de GFP en comparación con la condición ENR (figura 14A-14C).

Para investigar adicionalmente los efectos de factores de crecimiento individuales cuando se combinan con CHIR y VPA, se sometieron a prueba factores de crecimiento que incluyen factores de crecimiento mitogénicos (EGF, bFGF e IGF-1), así como el agonista de Wnt R-espondina 1 en combinación con CHIR y VPA. La adición de EGF a la condición CV aumentó significativamente la proliferación celular tal como se indica mediante el aumento de la cantidad de células en el cultivo. La adición de bFGF, pero no IGF-1 o R-espondina 1, a EGF+CV aumentó aún más la proliferación celular y la expresión de GFP (figura 14D). Aunque la adición de IGF-1 o R-espondina 1 a la combinación EGF+bFGF aumentó ligeramente la expresión de GFP (figura 14E), descubrimos que no son esenciales para mantener la proliferación y la expresión de GFP de las células cultivadas (figura 14F).

Ejemplo 6: Las células madre intestinales positivas para Lgr5 forman criptas trasplantables

Para examinar el potencial de trasplante de células madre intestinales, se sometió a prueba el injerto de criptas del intestino delgado en tejido de colon sano in vitro. Se recogió tejido de colon de ratones de tipo silvestre y se abrió longitudinalmente. Se retiró un fragmento de 1 cm y se lavó con PBS. La capa epitelial se eliminó raspando con una cuchilla quirúrgica y el tejido se dispuso en una placa de 24 pocillos. Las criptas del intestino delgado aisladas de ratones Lgr5-GFP se tiñeron con un colorante de membrana DiD y se dispusieron sobre el tejido de colon dentro de 5-10 gl de medio de cultivo de criptas que contenía DMEM/F12 avanzado (Invitrogen), GlutaMax 2 mM (Invitrogen), Hepes 10 mM (Invitrogen), 100 U/ml de penicilina/100 ug/ml de estreptomicina (Invitrogen), 1x suplemento N2 (Invitrogen), 1x suplemento B27 (Invitrogen), 50 ng/ml de EGF (Peprotech), 500 ng/ml de R-espondina 1 (R&D Systems), 10 gM de Y-27632 (inhibidor de Rho quinasa, Sigma-Aldrich) y 100 ng/ml de nogina (Peprotech). El tejido se incubó posteriormente a 37 °C durante 30-60 minutos en un entorno humidificado para permitir la adherencia de las criptas. Después se añadieron medios de cultivo de criptas a los pocillos y las criptas se cultivaron durante 7 días adicionales. Las criptas sembradas se unieron al colon y se extendieron en 24 horas (figura 15). La imagen fluorescente mostró criptas injertadas en el colon en 48 horas (figura 16) y mantuvieron la expresión de Lgr5-GFP durante al menos una semana (figura 17).

Para someter adicionalmente a prueba la capacidad de injerto de las criptas del intestino delgado, se utilizó un modelo de ratón TRUC que muestra colitis ulcerosa espontánea e imita la condición humana. Se extirpó tejido prolapsado de ratón TRUC y se lavó con PBS y se dispuso en una placa de 24 pocillos. Las criptas del intestino delgado se tiñeron con DiD y se dispusieron sobre el tejido prolapsado. El tejido se incubó a 37 °C durante 30-60 min en un entorno humidificado para permitir la adherencia de las criptas. Se añadieron medios de cultivo de criptas a los pocillos. El tejido prolapsado y las criptas se cultivaron adicionalmente in vitro durante 2 días. Tal como se esperaba, las criptas se injertaron en el tejido prolapsado (figura 17).

Ejemplo 7: Los sistemas de cultivo de parches para organoides del intestino delgado imitan el entorno fisiológico tridimensional

Ahora se ha desarrollado un sistema de cultivo in vitro capaz de apoyar el crecimiento de estructuras celulares tridimensionales organizadas a gran escala (por ejemplo, organoides) en un andamiaje de submucosa. Tal como se describe a continuación, se preparó un sistema de cultivo mejorado basado en la submucosa del intestino delgado ("SIS") para constructos de tejido tridimensionales sembrando la submucosa con un tipo de célula preseleccionada y facilitando el crecimiento con un revestimiento único basado en colágeno. Este revestimiento, inicialmente una prepolimerización de fluido viscoso, se utiliza para recubrir células u organoides sembrados en etapa temprana (subcultivados a partir de células), así como para recubrir la base de SIS para encerrar las células en un residuo de colágeno (figura 19E y 19F). Después de la polimerización, el líquido se solidifica para mantener su posición en contacto con las membranas celulares y la SIS y promueve la expansión de organoides. Ahora se ha descubierto que variando la composición de SIS con este revestimiento se facilita la adhesión y el crecimiento celular. Esto facilitará la maduración del tejido in vitro, al contrario que in vivo. Esto representa una mejora única sobre otros sistemas sintéticos basados en submucosas y similares en el sentido de que la expansión tridimensional de las células adheridas en organoides grandes de tipo endógeno se logra antes del trasplante.

Además, también se ha descubierto un procedimiento para apoyar el crecimiento de organoides tridimensionales en la submucosa a tasas comparables a Matrigel sin el uso de capas de gel. Este sistema está compuesto por SIS y células preseleccionadas de vertebrado, sembradas en el parche de SIS. Los agentes bioactivos preseleccionados se infunden en el parche antes de la siembra de células para apoyar este sistema de cultivo sin gel (figuras 19C y 19D).

Para desarrollar el sistema de cultivo en parche, se exploraron combinaciones variables de una base SIS y un revestimiento de colágeno con factores de crecimiento infundidos (figuras 19E y 19F). Esto permitió la creación de una interfaz de tejido más fisiológica con una transición de matriz rígida (SIS) a matriz blanda (colágeno). Se determinó que las células sembradas y los organoides recubiertos con un residuo de colágeno se proporcionan con un entorno tridimensional similar al proporcionado por el Matrigel. Como tal, este sistema es un reemplazo adecuado para Matrigel en el cultivo de constructos organoides tridimensionales. La mayor parte de las células o los organoides sembrados están adheridos a la SIS en la mitad inferior de las membranas celulares, pero también están envueltos por colágeno polimerizado en regiones no adheridas de la membrana (figura 19E, recuadro). Por lo tanto, cada membrana celular está encerrada funcionalmente en una forma de matriz, ya sea SIS o colágeno. En algunas muestras, se empleó una diversidad de agentes bioactivos para apoyar la siembra, el crecimiento y la diferenciación de células y organoides más allá de la SIS sola (figura 19F). Si bien los solicitantes describen una infusión de biomoléculas específicas para el cultivo de células madre intestinales, se declara que las biomoléculas se pueden adaptar para ayudar en el crecimiento de otras células sembradas a partir de diferentes tejidos, incluidos tejidos de páncreas, de mama, de hígado y de estómago. En consecuencia, pueden seleccionarse biomoléculas específicas de tejidos de entre los siguientes: agente antivírico, agente antimicrobiano, agente antibiótico, aminoácido, péptido, proteína, glicoproteína, lipoproteína, anticuerpo, compuesto esteroideo, antibiótico, antimicótico, citocina, vitamina, carbohidrato, lípido, matriz extracelular, componente de matriz extracelular, agente quimioterapéutico, agente citotóxico, factor de crecimiento, agente antirrechazo, analgésico, agente antiinflamatorio, vector vírico, cofactor de síntesis de proteínas, hormona, tejido endocrino, sintetizador, enzima, agente de andamiaje de células poliméricas con células parenquimales, fármaco angiogénico, molécula pequeña, nanopartículas, red de colágeno, agente antigénico, agente citoesquelético, ácido nucleico, atrayente celular.

Para comenzar, las criptas se aislaron según procedimientos anteriores (Sato et al., 2009, Yui et al., 2012). Se aisló intestino delgado murino, se hizo una incisión longitudinalmente y se lavó con PBS helado para eliminar el contenido luminal. Los fragmentos se cortaron en piezas de 2 mm, se transfirieron a un tubo de Falcon de 50 ml y se lavaron suavemente en 50 ml de PBS helado utilizando una pipeta de 10 ml. Se retiró el sobrenadante y se continuó el proceso hasta que se eliminó el sobrenadante. Los fragmentos se incubaron durante 45 minutos a 4 °C en PBS que contenía EDTA 2 mM para liberar criptas. El sobrenadante se eliminó y los fragmentos se pipetearon hacia arriba y hacia abajo con 50 ml de PBS. Una vez que se confirmó que el sobrenadante contenía la fracción de criptas, la suspensión se filtró a través de un filtro de células de 70 pm y se centrifugó en una centrífuga a 300 g durante 5 minutos. Las criptas se resuspendieron en 10 ml de medio de cultivo basal helado (que contenía DMEM/F12 avanzado (Invitrogen) GlutaMax 2 mM (Invitrogen), Hepes 10 mM (Invitrogen) y 100 U/ml de penicilina/100 ug/ml de estreptomicina (Invitrogen)) y se transfirieron a un tubo de Falcon de 15 ml. Se repitió el lavado con PBS y las criptas se centrifugaron a 200 g durante 2 minutos para eliminar células individuales. Se realizó un recuento de las criptas y se sembraron en una placa de 48 pocillos con Matrigel o colágeno I (que consiste en 100 pl de 10x PBS, 4,9 pl de NaOH, 684 pl de H2O y 211 pl de colágeno tipo I (cola de rata de alta concentración, 9,49 mg/ml; BD Biosciences) a una concentración de 1000 criptas por pocillo, conteniendo cada pocillo 200 pl de matriz. Después de la polimerización del producto de gel elegido, se añadieron 500 pl de medio de cultivo de cripta estándar 1x (desprovisto de suero), que contenía DMEM/F12 avanzado (Invitrogen), GlutaMax 2 mM (Invitrogen), Hepes 10 mM (Invitrogen), 100 U/ml de penicilina/100 ug/ml de estreptomicina (Invitrogen), 1x suplemento N2 (Invitrogen), 1x suplemento B27 (Invitrogen), 50 ng/ml de EGF (Peprotech), 500 ng/ml de R-espondina 1 (R&D Systems), 10 pM de Y-27632 (inhibidor de Rho quinasa, Sigma-Aldrich) y 100 ng/ml de nogina (Peprotech). Las células se cultivaron durante 4-5 días antes de sembrarlas en el parche, cambiando medios cada dos días. El Y-27632 solo se incluyó en los medios de cultivo durante las primeras 48 horas.

Después de 4-5 días en cultivo, los organoides Lgr5+ se sometieron a pases utilizando un protocolo modificado descrito anteriormente (Sato et al., 2009). Los medios de cultivo se retiraron del Matrigel, que después se rompió manualmente con una pipeta p1000 y posteriormente se transfirió a un tubo de Falcon de 15 ml recubierto con BSA. Los geles de colágeno se incubaron en DMEM que contenía colagenasa tipo XI a 37 °C durante 5 minutos y después se transfirieron a un tubo de Falcon de 15 ml recubierto con BSA. Se añadieron medios basales y los organoides se alteraron suavemente con una inspección frecuente por microscopía invertida hasta que la mayor parte de los organoides fueran criptas individuales. Los organoides se lavaron en 10 ml de medio basal y se centrifugaron a 200 g durante 2 minutos. El sedimento se resuspendió en medio de cultivo de criptas a una concentración de 500 organoides de cripta individual por 500 pl.

Se generaron parches y se prepararon para la siembra dentro de los pocillos de una placa estándar de 48 pocillos (un parche por pocillo, con el lado luminal hacia arriba). La SIS se cortó a la longitud deseada para cubrir el fondo de cada pocillo (~1 cm para una placa de 48 pocillos). El aislamiento de SIS se ha descrito previamente (Badylak et al., 1989). Utilizando pinzas romas, cada segmento de SIS se transfirió al fondo de un pocillo y se extendió cuidadosamente hasta su diámetro completo, con el lado luminal hacia arriba. La orientación se confirmó mediante análisis con microscopía invertida para visualizar los restos acelulares de criptas en la superficie superficial. Dependiendo del cumplimiento y la resistencia requerida, se pueden superponer y unir entre sí múltiples capas de SIS. En este caso, cada segmento se puede extender uno sobre la parte superior del otro para lograr la cantidad deseada de segmentos y el parche se comprime suavemente con pinzas y se deja secar en aire al 5% de CO2, 37 °C durante 5 minutos. Antes de la siembra, cada segmento del parche se deshidrató mediante evaporación pasiva durante 24 horas y se infundió con medios de cultivo de criptas concentrados y, opcionalmente, moléculas pequeñas tal como se describe a continuación. Específicamente, cada segmento del parche se colocó y se extendió, con el lado luminal hacia arriba, en el pocillo de una placa de 48 pocillos y se depositaron 100 pl de factores concentrados (EGF, nogina, R-espondina 1, Y-27632, ácido valproico y c HiR) para una incubación de 24 horas al 5% de CO2, 37 °C.

Se depositaron muestras individuales de organoides de una sola cripta de 500 pl en un pocillo que contenía una base de parche y se incubaron durante 24 horas al 5% de CO2 y 37 °C (figura 20A). Los parches sembrados se mantuvieron en medios de cultivo durante 24 horas para permitir una adherencia firme y obtener soporte nutricional de los factores de crecimiento embebidos en el parche (figura 20B).

En algunas muestras, la parte superior del complejo parche/organoide se recubrió con un residuo fino de gel de colágeno (denominado parche de gel) para proporcionar un entorno tridimensional mínimo pero funcional para cada organoide. Las señales físicas y químicas obtenidas de la superficie celular mejoran la proliferación de la estructura celular tridimensional con el fin de replicar la morfología fisiológica (Seidi, A., et al., 2011). Se dispuso en capas matriz de colágeno I (20-40 pl) sobre parches sembrados, teniendo cuidado de aprovechar la tensión superficial para evitar que el gel se propagara fuera del parche (figura 20C) y la placa de pocillos se incubó al 5% de CO2, 37 °C, durante 30 minutos. Se depositó medio de cultivo de criptas (500 pl) en cada pocillo y se cambió cada dos días.

En algunas muestras, el parche se incubó en factores de crecimiento antes de la siembra para examinar si facilitaría la adherencia de organoides en las primeras 24 horas. En consecuencia, se sembraron parches infundidos con GF (que incluían EGF, nogina, R-espondina 1, Y-27632, ácido valproico y CHIR) frente a parches sin infundir (SIS en PBS). En este ensayo, los parches sin infundir utilizaron medios basales en lugar de medios de cultivo para privar también a los organoides de factores de crecimiento en medios.

El crecimiento de los organoides intestinales se evaluó cuantificando el número de criptas por organoide en 7 sistemas separados: Matrigel (control), el sistema de parches de gel con factores de crecimiento infundidos (denominados en el presente documento GF, y que incluían EGF, nogina, R-espondina 1, Y-27632, ácido valproico y CHIR), el parche desnudo con GF infundidos pero sin revestimiento de colágeno, gel de colágeno I solo, gel de colágeno I con GF añadidos directamente a los medios de cultivo (que incluían EGF, nogina, R-espondina 1, Y-27632, ácido valproico y CHIR), gel de colágeno I con GF embebidos en el gel (que incluían EGF, nogina, R-espondina 1, Y-27632, ácido valproico y CHIR), y el parche desnudo sin revestimiento de colágeno ni GF infundidos. Además del grupo de colágeno I con GF y moléculas pequeñas añadidas directamente a los medios, todos los medios de cultivo fueron estándar entre cada sistema, se cambiaron cada dos días e incluyeron EGF, nogina, R-espondina 1, Y-27632 (primeras 48 horas solamente). Los medios de cultivo de criptas estándar se han descrito anteriormente.

El experimento se realizó a lo largo de un periodo de 96 horas y se documentó la cuantificación diaria del crecimiento de organoides mediante inspección visual del número de criptas por organoide. El sistema de parche de gel con GF fue capaz de apoyar el crecimiento de organoides a niveles comparables a los controles de Matrigel (figura 19). El parche desnudo, sin GF, no fue capaz de apoyar un crecimiento de organoides medible. Tras una inspección más profunda, el parche de SIS desnudo parecía que hacía crecer células Lgr5+ en láminas en lugar de organoides tridimensionales. No obstante, el parche desnudo con GF infundidos (EGF, nogina, R-espondina 1, Y-27632, ácido valproico y CHIR) apoyó el crecimiento de organoides a la par con el sistema de parches de gel y Matrigel. Esto indica que, con suficiente apoyo de GF, un sistema de cultivo desprovisto de gel es capaz de mantener un crecimiento de organoides tridimensionales a corto plazo a la par que con Matrigel. Mientras que el colágeno I solo facilita el crecimiento moderado de organoides, la SIS infundida con GF es un sustituto viable para el efecto promotor del crecimiento tridimensional del colágeno. Además, cuando los mismos GF (EGF, nogina, R-espondina 1, Y-27632, ácido valproico y CHIR) se añadieron directamente a los medios de cultivo del cultivo en gel de colágeno I, las tasas de crecimiento de organoides se mantuvieron bajas. Además, cuando el gel de colágeno I se preparó con los GF mencionados anteriormente embebidos directamente en el gel antes de la siembra, las tasas de crecimiento de organoides se mantuvieron bajas. La señal de GFP se mantuvo en todo el sistema de parche de gel (ejemplo representativo en las figuras 21B y 21C). La observación de que el parche desnudo (SIS sin un revestimiento de colágeno ni GF) no pudo apoyar el crecimiento de organoides estructurado reafirma la importancia de suficientes señales físicas y químicas para promover estructuras tridimensionales.

Se ha utilizado SIS o colágeno solo en la literatura como un andamiaje base para la siembra de células, dando como resultado la formación de monocapas celulares (Baumert et al. 2007; Campodonico et al. 2004; Feil, G., et al. 2006; Zhang, Y., et al. 2000). Por el contrario, las células en crecimiento en la interfaz de estas dos matrices favorecen el crecimiento de organoides tridimensionales con respecto al crecimiento en monocapas. Esto imita el entorno fisiológico más estrechamente, lo que permite un crecimiento acelerado y estructurado. Es importante destacar que estos resultados describen un sistema de cultivo en parche para organoides del intestino delgado que es una alternativa superior al Matrigel. El trasplante basado en Matrigel en modelos animales ha encontrado barreras significativas para avanzar hacia un modelo humano, el más crítico, incluidos problemas de biocompatibilidad. El crecimiento de una estructura celular tridimensional a menudo requiere la inclusión de un gel de matriz espeso. El sistema de cultivo de parches supera este requerimiento a la vez que proporciona resultados comparables. Reemplazar el Matrigel por una combinación de materiales de matriz extracelular endógenos y factores de crecimiento bioactivos específicos evita problemas de biocompatibilidad a la vez que mantiene el crecimiento exógeno de organoides tridimensionales. En la figura 22 se muestra una imagen de lapso temporal de expansión de organoides tridimensionales ex vivo a partir de una semilla inicial.

Se evaluó si la incubación del parche en los factores de crecimiento antes de la siembra facilita la adherencia de los organoides en las primeras 24 horas. La eficacia de la siembra se comparó en parches infundidos con factor de crecimiento (que incluía EGF, nogina, R-espondina 1, Y-27632, ácido valproico y CHIR) frente a parches no tratados (almacenados en PBS). El ensayo se realizó midiendo el porcentaje de organoides retenidos después del lavado de los medios a las 4 y 12 horas cuando las células se cultivan únicamente en medios desprovistos de factores de crecimiento (solo medios basales). Cuando se omitió la SIS y los organoides se sembraron directamente en pocillos de plástico recubiertos con colágeno y no recubiertos con colágeno, la disociación de todos los organoides tuvo lugar dentro un periodo de 24 horas. Sin embargo, los parches de SIS mantuvieron la mayor parte de los organoides a las 24 horas, tanto en estructura como en expresión de GFP. Se observó una mejora en la adherencia cuando las células se sembraron en parches infundidos con factor de crecimiento (que incluía EGF, nogina, R-espondina 1, Y-27632, ácido valproico y CHIR). Por lo tanto, la infusión de factor de crecimiento también puede ser útil para proporcionar una nutrición y factores adecuados durante el cultivo y después del trasplante, mientras se cierra la brecha con el injerto celular.

Ejemplo 8: Un parche implantado muestra propiedades promotoras del crecimiento in vivo

Las variaciones acelulares sin gel del sistema de parche se sometieron a prueba para evaluar las propiedades curativas de la mucosa in vivo. Se diseñó un modelo quirúrgico de rata de defectos de mucosa para someter a prueba las propiedades promotoras del crecimiento del parche de implante in vivo. El parche de implante se ensambló extendiendo cuidadosamente una porción de SIS, con el lado luminal orientado hacia arriba, a lo largo de apoyos circulares de 6 mm de poli(sebacato de glicerol)-uretano (PGSU). El parche se incubó al 5% de CO2, 37 °C durante 30 minutos para permitir la unión de PGSU y SIS. Se creó un defecto de 4 mm en la pared gástrica mediante biopsia por punción, tal como se muestra en la figura 23. Se dispusieron parches acelulares (6 mm de diámetro) a lo largo de la pared gástrica externa, cubriendo cuidadosamente el defecto con el material elegido. El parche se aseguró mediante un procedimiento de parche de Graham adaptado (S0, et al., 1996) utilizando suturas y tejido conectivo cercano. Se aplicaron tres variantes de parches acelulares, que incluían a) parche de SIS apoyado en PGSU (sin GF), b) parche de SIS apoyado en PGSU con GF infundidos (EGF, nogina, R-espondina 1, Y-27632, ácido valproico y CHIR) y c) únicamente apoyo de PGSU (sin SIS). En ningún momento se observó peritonitis en ninguna rata. Una semana después del implante sobre defectos de la pared gástrica inducidos mecánicamente, el tejido gástrico que contiene el defecto y los implantes de parche se recogieron para realizar un examen histológico del tejido.

Se planteó la hipótesis de que variaciones de implante del parche mostrarían diversos grados de curación de la mucosa. El examen general mostró un beneficio significativo en el parche de SIS con GF, ya que el defecto se epitelizó y se cerró. Se observó un cierre parcial sin epitelización en parches de SIS sin GF, y no se observó cierre o epitelización en los parches de PGSU solo (control). El examen histológico reveló una inflamación leve en el parche de SIS tanto con como sin GF, pero sin fuga de contenido estomacal. El examen histológico del parche de PGSU solo mostró una inflamación moderada, así como la presencia de células gigantes, que probablemente responden a la fuga de contenido estomacal. En consecuencia, los sistemas de cultivo en parche descritos en el presente documento son trasplantables desde la placa de cultivo directamente al paciente, con un mayor potencial de traslación, ya que el parche es rígido y es menos probable que obstruya en espacios pequeños (por ejemplo, la luz intestinal, los espacios vasculares) dado su perfil de baja altura.

Ejemplo 9: Cultivo de criptas/células madre del intestino delgado humano

Se aislaron criptas del intestino delgado humano a partir de una muestra de intestino delgado normal resecada y se cultivaron tal como se describe en el ejemplo 1. Las mismas soluciones de cultivo celular utilizadas en el cultivo de criptas/células madre del intestino delgado de ratón, que comprenden una combinación de CHIR99021 y VPA o tubastatina A añadida a la condición ENR (EGF, nogina, R-espondina 1), se compararon con las soluciones de cultivo celular publicadas para criptas/células madre intestinales humanas (Jung et al., 2011; Sato et al., 2011). Se utilizó RT-PCR para evaluar el mantenimiento de células madre epiteliales en el cultivo, específicamente mediante la determinación del estado de autorrenovación o de diferenciación. Se utilizó LGR5 como marcador de células madre y se utilizaron ALPI, MUC2, CHGA y LYZcomo marcadores de diferenciación. El crecimiento celular se evaluó mediante un recuento del número de células presentes en los cultivos y observando la morfología y el tamaño de las colonias.

De forma similar al cultivo de células madre intestinales de ratón, la combinación de CHIR+VPA o CHIR+tubastatina A promovió significativamente la expresión del marcador de células madre LGR5, lo que sugiere que las células cultivadas se enriquecieron en células madre (figura 24). En particular, la condición de cultivo que contiene CHIR y VPA o CHIR y tubastatina A superó las condiciones publicadas en la promoción de la expresión de LGR5 (figura 24). Además, se sometieron a prueba componentes individuales que muestran una mejora en los medios de cultivo, incluidos A83-01 (ALK4,5,7, inhibidor de Tgf-p), SB202190 (inhibidor de p38) y nicotinamida (derivado de vitamina B). Se determinó que la nicotinamida 10 mM aumentaba la proliferación de criptas del intestino delgado humano cuando se añadía a la condición CHIR+VPA, tal como se indica por medio del aumento del número de células presentes en el cultivo (figura 25A), sin un gran efecto sobre la expresión de LGR5 (figura 25B). Si bien la combinación de A83-01 y SB202190 (AS) aumentó la proliferación de células (figura 25A), redujo significativamente la expresión de LGR5 (figura 25B). Además, una menor concentración de VPA (0,5 mM, en comparación con la utilizada en cultivos de ratón (1-2 mM)) aumentó la proliferación celular de criptas del intestino delgado humano (figura 25A). En conjunto, se determinó que la condición de cultivo que contenía EGF, nogina, R-espondina 1, CHIR, VPA (0,5 mM) y nicotinamida o EX527 era una condición de cultivo óptima para células madre intestinales humanas. En esta condición, las criptas aisladas del intestino delgado crecen en colonias comparables a las células madre del intestino delgado de ratón (figura 26).

Ejemplo 10

Para someter a prueba el efecto in vivo de CHIR y VPA sobre células epiteliales intestinales, se administraron CHIR99021 (30 mg/kg en 100 gl de DMSO) y VPA (200 mg/kg en 100 gl de agua) a ratones Lgr5-GFP hembra de 4 6 semanas de edad mediante sonda. Los ratones de control recibieron una mezcla de 100 gl de DMSO y 100 gl de agua. Los fármacos se administraron cada 48 horas durante 7 días (el día 0, el día 2, el día 4 y el día 6). El día 7 se sacrificaron los ratones y se recogió el tejido intestinal. El intestino delgado se lavó adicionalmente con PBS, se fijó con PFA al 4% durante 12 horas, se embebió en parafina y se tiñó utilizando el protocolo estándar de tinción con hematoxilina y eosina (H&E). Las imágenes se tomaron utilizando un microscopio invertido (EVOS, Advanced Microscopy Group). La administración in vivo de CHIR y VPA aumentó el tamaño de las criptas después de 3 administraciones a lo largo del transcurso de 7 días (figura 27).

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Claims

REIVINDICACIONES

1. CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un trastorno del oído interno en un sujeto con necesidad de ello,

en el que el CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con ácido valproico (VPA), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

y en el que el tratamiento comprende la generación de tejido epitelial en el sujeto mediante la administración del CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto en una cantidad suficiente para incrementar las células madre epiteliales positivas para LGR5 presentes en el interior del oído interno mediante la administración del CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto.

2. CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según la reivindicación 1, en el que el tratamiento aumenta la proliferación de células madre del oído interno en el sujeto.

3. CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el sujeto es un ser humano.

4. CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administran de forma concomitante.

5. CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está presente como sal sódica de VPA.

6. Ácido valproico (VPA), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un trastorno del oído interno en un sujeto con necesidad de ello,

en el que el VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra en combinación con CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

y en el que el tratamiento comprende la generación de tejido epitelial en el sujeto mediante la administración del VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto en una cantidad suficiente para incrementar las células madre epiteliales positivas para LGR5 presentes en el interior del oído interno mediante la administración del VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el CHIR99021, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, al sujeto.

7. VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según la reivindicación 6, en el que el tratamiento aumenta la proliferación de células madre del oído interno en el sujeto.

8. VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que el sujeto es un ser humano.

9. VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el VPA y el CHIR99021 se administran de forma concomitante.

10. VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el VPA, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, está presente como sal sódica de VPA.