ES2825723T3

ES2825723T3 - Método para utilizar células directoras para la activación y diferenciación de células madre/progenitoras específicas

Info

Publication number: ES2825723T3
Application number: ES10799518T
Authority: ES
Inventors: Yael Porat
Original assignee: Biogencell Ltd
Current assignee: Biogencell Ltd
Priority date: 2009-07-13
Filing date: 2010-07-13
Publication date: 2021-05-17
Anticipated expiration: 2030-07-13
Also published as: EP2454363A2; CA2767970C; WO2011007348A3; DK2454363T3; US20110143437A1; SG177651A1; CA2767970A1; EP2454363A4; WO2011007348A2; EP2454363B1; IN2012DN01275A; US9670460B2; US20140242053A1; US8709802B2

Abstract

Un método in vitro para generar una población de células precursoras/progenitoras específicas de linaje (LSP) que comprende las etapas: a) obtener una población de células dendríticas, en donde las células dendríticas se derivan de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), b) activar la población de células dendríticas que se obtiene en la etapa (a) mediante la incubación durante 0,5 horas hasta 3 días en un medio que comprende al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en IL-10, IL-12, IL-18, TGF beta, bFGF y VEGF para producir una población de células activadas, en donde la población de células activadas comprende células que tienen una mayor expresión de CD141, c) obtener una población de PBMC y enriquecer a favor de las células madre/progenitoras mediante la selección negativa de células que expresan CD8 y CD56 para producir una población de células madre/progenitoras enriquecida, y d) cultivar conjuntamente la población de células madre/progenitoras enriquecida que se obtiene en la etapa (c) con la población de células activadas que se obtiene en la etapa (b) para formar una población de células combinada, donde las células de la etapa (b) inducen en la población combinada al menos un proceso seleccionado del grupo que consiste en: diferenciación, expansión, activación, secreción de una molécula, y expresión de un marcador en las células cultivadas conjuntamente, lo que genera de esta manera una población de células LSP.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para utilizar células directoras para la activación y diferenciación de células madre/progenitoras específicas Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a células madre. Específicamente, la presente invención se refiere a un método in vitro para generar una población de células precursoras/progenitoras específicas de linaje (LSP).

Antecedentes

Basado en su presentación de epítopos antigénicos y secreción de diversas citocinas y quimiocinas que inician y/o mejoran muchos tipos de células, las células presentadoras de antígeno (APC) y las células dendríticas (DC) son conocidas por su capacidad para alterar y dirigir diferentes respuestas inmunológicas y por lo tanto inducen un fenómeno de plasticidad de las células B y T. De manera similar a las células progenitoras multipotenciales, las APC y DC pueden ubicarse en diferentes tejidos tales como los ganglios linfáticos y la médula ósea (BM) o en la circulación. De la misma manera, las DC en diferentes etapas de madurez pueden encontrarse en una diversidad de tejidos. Las siguientes referencias pueden ser de interés:

1. Publicación PCT WO 08/140316 de Meers

2. Publicación de solicitud de patente de los EE. UU. 2008/0206286 de Yu

3. Publicación de solicitud de patente de los EE. UU. 2008/0226612 de Treves y otros

4. Publicación de solicitud de patente de los EE. UU. 2008/0292601 de Song

5. Publicación de solicitud de patente de los EE. UU. 2009/0131346 de Sorio

6. Publicación de solicitud de patente de los EE. UU. 2010/0143311 de Mizukamiy otros

7. Publicación de solicitud de patente de los EE. UU. 2009/0004157 de Kalinski

8. Wallet M.A. (2005), "Immunoregulation of Dendritic Cells", Clinical Medicine & Research 3:166-175

9. Cox K. (2005) "Plasmacytoid dendritic cells (PDC) are the major DC subset innately producing cytokines in human lymph nodes", J. Leukoc. Biol. 78:1142-1152

10. Kim R. (2006), "Functional Role of Immature Dendritic Cells in Impaired Immunity and Solid Tumors and Their Targeted Strategies for Provoking Tumor Immunity", Clin. Exp. Immunol. 146:189-196

11. McKenna K. (2005), "Plasmacytoid Dendrritic Cells: linking Innate and Adaptive Immunity", J.Virol 79:17-27 12. Dzionek A., (2000), "BDCA-2, BDCA-3, and BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood", J.Immunol. 165:6037-6046

13. Stem Cell Information, (2007), "The Adult Stem Cell", The National Institute of Health, http://stemcells.nih.gov/info/scireport/chapter4.asp

14. Kollet O. (2002), "Human CD34+CXCR4-sorted cells harbor intracellular CXCR4, which can be functionally expressed and provide NOD/SCID repopulation", Blood 100:2778-2786

15. Kanamaru F. (2004), "Expression of membranebound and soluble receptor activator of NFkappaB ligand (RANKL) in human T cells", Immunol Lett. 94:23946

16. Badorff C. (2003), "Transdifferentiation of Blood-Derived Human Adult Endothelial Progenitor Cells into Functionally Active Cardiomyocytes", Circulation 107:1024-1032

17. Nagasawa, T. (2008), "New niches for B cells", Nat Immunol 9:345

18. Sapoznikov, A. (2008), "Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches", Nat Immunol 9:388

19. Stier, S. (2005), "Osteopontin is a hematopoietic stem cell niche component that negatively regulates stem cell pool size", J Exp Med 201:1781

20. Kohara, H. (2007), "Development of plasmacytoid dendritic cells in bone marrow stromal cell niches requires CXCL12-CXCR4 chemokine signaling", Blood 110:4153

21. Cheng, P. (2007), "Regulation of dendritic-cell differentiation by bone marrow stroma via different Notch ligands", Blood 109:507

22. Dubois, B. (1998), "Critical role of IL-12 in dendritic cell-induced differentiation of naive B lymphocytes", J Immunol 161:2223

23. Mahnke, K. (2002), "Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells", Immunol Cell Biol 80:477

24. Tang, H. (2006), "Endothelial stroma programs hematopoietic stem cells to differentiate into regulatory dendritic cells through IL-10". Blood 108:1189

25. Satthapom, S. (2001), "Dendritic cells (I): Biological functions", J R Coll Surg Edinb 46:9

26. Romani, N. (1994), "Proliferating dendritic cell progenitors in human blood", J Exp Med 180:83

27. Zhou, L. (1996), "CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells", Proc Natl Acad Sci U S A 93: 2588

28. Watanabe, S. (2003), "The duration of signaling through CD40 directs biological ability of dendritic cells to induce antitumor immunity", J Immunol 171:5828

29. Sozzani, S. (2007), "Dendritic cell-endothelial cell cross-talk in angiogenesis", Trends Immunol 28:385 30. Naldini, A. (2006), "Cutting edge: IL-1beta mediates the proangiogenic activity of osteopontin-activated human monocytes", J Immunol 177:4267

31. Conejo-García, J. R. (2004), "Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A", Nat Med 10:950

32. Patente de los EE. UU. 5969 105 (1999) de Feng Y y otros, (1997), Stem cell factor agonists. Solicitud Núm.

08/955,848

33. La publicación de solicitud de patente de los EE. UU. 2007/0269867 (2007) de Ghosh SK y otros, (2004), Marcadores de proteínas asociados con la diferenciación de células madre de la médula ósea en células dendríticas progenitoras tempranas.

34. La patente de los EE. UU. 6 479 286 (2002) de Nelson EL y otros, (1999) Métodos y composiciones para producir células dendríticas a partir de poblaciones expandidas de monocitos y para activar células T.

35. La publicación PCT WO 98/053048 de Nelson y otros

36. La patente de los EE. UU. 7 030 228 (2006) de Schmitz y otros, (2000) Fragmentos de unión a antígenos específicos para células dendríticas, composiciones y métodos de uso de estos, antígenos reconocidos por ellos y células obtenidas por ellos.

37. Wang Q y otros (2001), "Dendritic cells support hematopoiesis of bone marrow cells", Transplantation, 72(5); 891-899. Este documento describe un método para cultivar células dendríticas conjuntamente con células madre CD34+.

Resumen de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas. En condiciones normales, las células presentadoras de antígeno (APC) y específicamente las células dendríticas (DC) se usan para la activación, dirección y alteración de la respuesta del sistema inmunológico. Para algunas aplicaciones de la presente invención, se usan métodos para usar las APC y específicamente las DC para dirigir la activación y/o efectuar la diferenciación de células derivadas de tejido (TDC). En el contexto de esta solicitud, en la descripción y en las reivindicaciones, "células derivadas de tejido (TDC)" significa una población que contiene células madre/progenitoras y otras células tales como células maduras, las TDC que se han derivado de una población original células en un tejido mediante (a) el aislamiento de al menos una primera subpoblación de la población a partir de una segunda subpoblación de la población, y (b) aumentando la proporción de células madre/progenitoras en la primera subpoblación de células. Como se describe en la presente descripción, esta población seleccionada de t Dc actúa, típicamente, sobre células presentadoras de antígenos, específicamente células dendríticas. Las APC, típicamente células dendríticas, son ejemplos de una población de células directoras (DCP) (definida más abajo) y se usan en la activación, dirección y alteración de las TDC, por ejemplo, células madre/progenitoras adultas multipotentes (MASPC), células efectoras antes de su diferenciación terminal, y células madre embrionarias. Como resultado, se genera una población específica de células (por ejemplo, precursores/progenitores específicos de linaje (LSP)), moléculas solubles de estas que pueden ser eficaces en la regeneración de tejidos, inmunidad al cáncer, inhibición de trastornos de autoinmunidad e inflamación crónica, mejora del injerto celular, y homeostasis.

A modo de definición, una "población de células directoras (DCP)" es una población de células que comprende células presentadoras de antígeno (APC) y/o células dendríticas (DC) que se cultivan en condiciones específicas. La DCP se usa típicamente para dirigir la activación y/o expansión y/o diferenciación de células.

En la presente descripción se describen métodos para cultivar, enriquecer, y usar una DCP para cultivarse junto con TDC (por ejemplo, una población rica en MASPC y/o subpoblaciones de esta). Tal cultivo conjunto de la d Cp con la TDC induce la activación, y/o proliferación, y/o expansión, y/o diferenciación, y/o inducción de la actividad bioquímica, etcétera, de la TDC para fines terapéuticos, de diagnóstico y de investigación. Para algunas aplicaciones, el cultivo conjunto de la DCP con la TDC induce la activación y/o proliferación, y/o expansión, y/o diferenciación, y/o inducción de la actividad bioquímica, etcétera, de la DCP para fines terapéuticos, diagnósticos y de investigación. Típicamente, el producto del cultivo conjunto entre la DCP y la TDC está enriquecido. Para algunas aplicaciones, una subpoblación del cultivo conjunto se enriquece y/o purifica en cualquier etapa del procedimiento de cultivo conjunto, por ejemplo, al final del cultivo conjunto. Adicionalmente, para algunas aplicaciones, estas subpoblaciones pueden administrarse a un paciente y/o almacenarse en un banco para uso futuro.

"Expansión", en el contexto de esta solicitud, en la descripción y en las reivindicaciones, significa aumentar la proporción de un tipo de célula dado con respecto a otros tipos de células, dentro de una población más grande de células, por ejemplo, en cultivo. El aumento en la proporción del tipo de célula dado con respecto a otros tipos de células, resulta de (a) la proliferación del tipo de célula o (b) la muerte de otros tipos de células en la población más grande, (c) la diferenciación y desdiferenciación del tipo de célula o cualquiera de los otros tipos de células en la población, o (d) una combinación de cualquiera de (a), (b) y/o (c).

Como se muestra en los datos experimentales mostrados en la presente descripción, las TDC son una población de células que puede sufrir diferenciación en una LSP cuando actúa sobre las DCP. Por ejemplo, se muestra que una TDC de MASPC enriquecida se diferencia en un LSP de células progenitoras endoteliales (EPC). Adicionalmente, como se muestra en los datos experimentales presentados en la presente descripción, las TDC, por ejemplo, que contienen MASPC enriquecidas, además pueden experimentar expansión en cultivo, produciendo de esta manera una población de células con una proporción aumentada de MASPC, que puede diferenciarse posteriormente en una LSP. En última instancia, para algunas aplicaciones, la LSP contiene una población de células precursoras y/o maduras de un linaje dado e incluye una subpoblación que comprende MASPC. Para otras aplicaciones, la LSP contiene una población de células precursoras y/o maduras de un linaje dado y no incluye una subpoblación que comprende MASPC.

Un ejemplo de tal LSP que se describe en la presente descripción y se muestra en los datos experimentales es una población específica de linaje que contiene una población de células que demuestran una actividad citotóxica aumentada hacia las células cancerosas. Las TDC, que incluyen MASPC y las células efectoras tales como las células T y/o las células asesinas naturales, son activadas por las DCP para producir una población progenitora de células anticancerígenas específica de linaje (LSP-aCCP). La LSP-aCCP contiene una población de células efectoras activadas maduras, así como también una población de células precursoras que se dirigen a diferenciarse finalmente en células efectoras maduras activadas. De tal manera, la LSP-aCCP contiene células que están disponibles para uso inmediato contra el cáncer (LSP que contiene células de efecto activado), así como también una subpoblación de células latentes (LSP que contiene MASPC) que pueden reponer las células efectoras maduras activadas mediante la diferenciación en las células efectoras maduras activadas en una etapa posterior.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un método in vitro para generar una población de células precursoras/progenitoras (LSP) específicas de linaje que comprende las etapas:

a) obtener una población de células dendríticas, en donde las células dendríticas se derivan de células mononucleares de sangre periférica (PBMC),

b) activar la población de células dendríticas que se obtiene en la etapa (a) mediante la incubación durante 0,5 horas hasta 3 días en un medio que comprende al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en IL-10, IL-12, IL-18, TGF beta, bFGF y VEGF para producir una población de células activadas, en donde la población de células activadas comprende células que tienen una mayor expresión de CD141,

c) obtener una población de PBMC y enriquecer a favor de las células madre/progenitoras mediante la selección negativa de células que expresan CD8 y CD56 para producir una población de células madre/progenitoras enriquecida, y

d) cultivar conjuntamente la población de células madre/progenitoras enriquecida que se obtiene en la etapa (c) con la población de células activadas que se obtiene en la etapa (b) para formar una población de células combinada, donde las células de la etapa (b) inducen en la población combinada al menos un proceso seleccionado del grupo que consiste en: diferenciación, expansión, activación, secreción de una molécula, y expresión de un marcador en las células cultivadas conjuntamente, lo que genera de esta manera una población de células LSP.

En algunas aplicaciones, incubar las células presentadoras de antígeno incluye incubar las células presentadoras de antígeno en un medio que incluye al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en: CpG OND, IL-10, IL-12, IL-18, IL-27, Alfa-1 Antitripsina, Ligando Flt3, IFN alfa (IFNa), IFN beta (IFNp), Prostaglandina E2 (PGE-2), IL-4, TGF beta (TGFp), y VEGF.

En algunas aplicaciones, inducir el al menos un proceso incluye generar una población precursora/progenitora específica de linaje (LSP), y el método incluye, además, administrar a un paciente una o más composiciones seleccionadas del grupo que consiste en: la población precursora/progenitora específica de linaje y componentes solubles de la población precursora/progenitora específica de linaje.

En algunas aplicaciones, inducir el al menos un proceso incluye inducir la diferenciación de la población enriquecida de células madre/progenitoras e inducir la expansión de la población de células madre/progenitoras enriquecida.

En algunas aplicaciones, inducir el al menos un proceso incluye inducir el al menos un proceso en al menos un tipo de células seleccionadas del grupo que consiste en: las células presentadoras de antígeno y las células madre/progenitoras.

En algunas aplicaciones, la población de células presentadoras de antígeno incluye células dendríticas, y la obtención de la población de células presentadoras de antígeno incluye la obtención de la población de células presentadoras de antígeno, que incluye las células dendríticas, y las células presentadoras de antígeno dirigen al menos un proceso.

En algunas aplicaciones, el método incluye activar la población enriquecida de células madre/progenitoras durante la exposición de la población enriquecida de células madre/progenitoras a la población activada de células presentadoras de antígenos.

En algunas aplicaciones, inducir la expresión del marcador incluye aumentar una proporción de células que tienen al menos una característica seleccionada del grupo que consiste en: expresión de CD34, expresión de CD184, y coexpresión de CD34 y CD184.

En algunas aplicaciones, inducir el al menos un proceso incluye generar una población de células precursoras/progenitoras específicas de linaje (LSP) y:

al menos 2,5 % de la población de células LSP expresa uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD31, CD133, CD144, CD202b, factor von Willebrand (vWF), CD102, CD105, CD106, CD109, CD114 CDw145, CD201, CD299, y CD309,

al menos algunas del al menos 2,5 % de las células de la población expresan CD309 y CD202b,

al menos algunas del al menos 2,5 % de las células de la población expresan CD31 y VEGFR1, y

al menos algunas de al menos el 2,5 % de las células de la población captan Ac-LDL y expresan lectina Ulex, al menos 2,5 % de la población de células LSP expresa uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD7, CD31, CD33, CD34, CD90, CD105, CD115, CD117, CDw123, CD124, CD157, CD164, CD172a, CD173, CD175, CD175, CD178, CD184, CD191, CD202b, CD292, y Stro-1, y

la población de células LSP secreta una o más moléculas seleccionadas del grupo que consiste en: G-CSF, SDF-1/CXCR4, IL-8, IL-10, IFN alfa (IFNa), IFN beta (IFNp), IFN gamma (IFNy), TGF beta (TGFp), FGF básico (b-FGF), IL-12, IL-18 y IL-27.

En algunas aplicaciones,

la activación de la población de células presentadoras de antígeno incluye:

separar las células presentadoras de antígeno de la sangre, y

posteriormente, incubar las células presentadoras de antígeno durante un período de 0,5 horas hasta 14 días antes de exponer la población enriquecida de células madre/progenitoras a la población de células presentadoras de antígeno,

después de la separación, las células presentadoras de antígeno son una subpoblación de una población más grande, y el método incluye, además, aumentar una proporción de las células presentadoras de antígeno en la población más grande antes de la incubación.

En algunas aplicaciones, la incubación incluye incubar las células presentadoras de antígeno durante un período de 0,5 horas hasta 3 días.

En algunas aplicaciones, aumentar la proporción de células presentadoras de antígeno incluye aumentar la proporción a menos del 15 % de la población más grande.

De acuerdo con las reivindicaciones, la activación incluye aumentar la expresión de CD141 por parte de las células presentadoras de antígeno.

En algunas aplicaciones, la activación incluye aumentar la expresión de CD304 por parte de las células presentadoras de antígeno.

De acuerdo con las reivindicaciones, incubar las células presentadoras de antígeno incluye incubar las células presentadoras de antígeno durante 0,5 horas hasta 3 días en un medio que incluye al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en: IL-10, IL-12, IL-18, TGF beta, bFGF, y VEGF.

En algunas aplicaciones, incubar las células presentadoras de antígeno incluye incubar las células presentadoras de antígeno en un medio que incluye al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en: IL-10, FGF beta, bFGF, y VEGF, e inducir al menos un proceso incluye aumentar una proporción de células que tienen al menos una característica seleccionada del grupo que consiste en: captación de AC-LDl combinada con expresión de lectina Ulex, expresión de CD31, expresión de CD133, expresión de CD144, expresión de CD202b (Tie-2), expresión de VEGR1, expresión del factor von Willebrand (vWF), expresión de CD102, expresión de CD105, expresión de CD106, expresión de CD109, expresión de CD114, expresión de CDw145, expresión de CD201, expresión de CD299, y expresión de CD309 (VEGFR-2; KDR), VEGFR1, coexpresión de VEGFR1 y CD31, y coexpresión de CD309 y CD202b.

En algunas aplicaciones, la población de células madre/progenitoras incluye una población de células madre/progenitoras adultas multipotentes y el enriquecimiento de la población de células madre/progenitoras incluye el enriquecimiento de la población de células madre/progenitoras adultas multipotentes.

En algunas aplicaciones, el método incluye obtener la población de células madre/progenitoras adultas multipotentes a partir de la sangre.

De acuerdo con las reivindicaciones, el método comprende, además, la etapa de:

i) obtener una población de células enriquecidas de células efectoras inmunitarias, y

ii) cultivar conjuntamente la población de células efectoras inmunitarias enriquecidas de la etapa (i) con la población de células activadas de la etapa (b), antes de realizar la etapa (d)

en donde en la etapa (d), el cultivo conjunto de las células madre/progenitoras enriquecidas con la población de células activadas incluye exponer el cultivo conjunto de la población de células activadas y las células efectoras a la población de células madre/progenitoras enriquecida.

En algunas aplicaciones, la creación de la población precursora/progenitora específica de linaje incluye la creación de una población precursora/progenitora específica de linaje que tiene un aumento porcentual de la actividad citotóxica de entre 150 % y 180 %.

Además, en la presente descripción se describe un método que incluye administrar a un paciente una o más composiciones seleccionadas del grupo que consiste en: la población específica de linaje y componentes solubles de la población específica de linaje.

En algunas aplicaciones, administrar la población específica de linaje al paciente incluye tratar el cáncer del paciente. En algunas aplicaciones, la creación de la población precursora/progenitora específica de linaje incluye la creación de una población precursora/progenitora específica de linaje que tiene al menos un 10 % de células en la población que expresan uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD86, CD3, CD8, CD4, y CD56.

En algunas aplicaciones, el proceso seleccionado incluye la activación, y al menos el 5 % de las células mantienen la expresión de uno o más marcadores durante al menos 8 días después de la activación.

En algunas aplicaciones, la obtención de células presentadoras de antígeno incluye obtener una población de al menos 50 000 células presentadoras de antígeno, y al menos el 5 % de las células presentadoras de antígeno expresan uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD1c, CD1b, cD1e, CD11c, CD40, CD49d, c D53, CD68, CD74, CD80, CD83, CD85, CD86, CDw123, CD172b, CD180, CD141, CD206, CD208, CD209, CD218, CD258, CD301, CD303, y CD304.

En algunas aplicaciones, exponer la población de células madre/progenitoras enriquecida a la población de células presentadoras de antígeno incluye, antes de inducir al menos un proceso, generar una población heterogénea de células, y:

la población de células presentadoras de antígeno es al menos 2,5 % de las células en la población heterogénea, la población de células madre/progenitoras enriquecidas es al menos el 1 % de las células en la población de células heterogénea, y al menos el 1 % de las células en la población heterogénea de células expresan uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD7, CD31, CD33, CD34, CD90, CD105, CD115, CD117, CDw123, CD124, CD157, CD164, CD172a, CD173, CD175, CD175, CD178, CD184, CD191, CD202b, CD292, y Stro-1.

En algunas aplicaciones, el método incluye después de la generación de la población heterogénea, congelar la población heterogénea.

En algunas aplicaciones, generar la población heterogénea incluye generar una población heterogénea en donde:

al menos el 5 % de las células presentadoras de antígeno expresan uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD1c, CD86, CD141, CD303, y CD304, y

el al menos 1 % de las células de la población heterogénea de células que expresan uno o más marcadores expresan uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD31, CD34, y CD184.

el al menos 5 % de las células presentadoras de antígeno expresan al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en: CD141, CD303, CD304, y CD86, y

al menos 2,5 % de la población de células madre/progenitoras enriquecidas expresa CD34 y CD184 o coexpresa CD34 y CD184.

En algunas aplicaciones, generar la población heterogénea incluye generar una población heterogénea:

el al menos 1 % de las células en la población heterogénea de células que expresan uno o más marcadores expresan CD34 y son CD45Dim/-.

En algunas aplicaciones, inducir el al menos un proceso incluye generar una población de al menos 1 millón de células precursoras/progenitoras específicas de linaje, en donde:

un primer subconjunto de la población incluye al menos 5 % del al menos 1 millón de células, y expresa uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD1c, CD1b, CD1e, CD11c, CD40, CD49d, CD53, CD68, CD74, CD80, CD83, CD85, CD86, CDw123, CD172b, CD180, CD141, CD206, CD208, CD209, CD218, CD258, CD301, CD303 y CD304,

un segundo subconjunto de la población incluye al menos 2,5 % del al menos 1 millón de células, y expresa uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD7, CD31, CD33, CD34, CD90, CD105, CD115, CD117, CDw123, CD124, CD157, CD164, CD172a, CD173, CD175, CD175, CD178, CD184, CD191, CD202b, CD292, CD309, VEGFR1, y Stro-1, y

las células de la población secretan una o más moléculas seleccionadas del grupo que consiste en: G-CSF, SDF-1/CXCR4, IL-8, IL-10, IFN alfa (IFNa), IFN beta (IFNp), IFN gamma (IFNy), TGF beta (TGFp), FGF básico (b-FGF), IL-12, IL-18 e IL-27.

En algunas aplicaciones, generar la población incluye generar una población en la que una parte de las células del segundo subconjunto expresan CD309 y CD202b.

En algunas aplicaciones, generar la población incluye generar una población en la que una parte de las células del segundo subconjunto expresan CD31 y VEGFR1.

En algunas aplicaciones, generar la población incluye generar una población en la que una parte de las células del segundo subconjunto capta Ac-LDL y expresa lectina Ulex.

En algunas aplicaciones, generar la población incluye generar una población en la que:

el primer subconjunto expresa uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD141, CD86, y CD304, y el segundo subconjunto expresa uno o más marcadores que expresan uno o más marcadores seleccionados del grupo: CD34 y CD184.

En algunas aplicaciones, el método incluye después de la generación de la población, congelar la población.

un primer subconjunto de la población incluye al menos 10 % del al menos 1 millón de células, y expresa uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD141, CD303, CD304, y CD86,

un segundo subconjunto de la población incluye al menos 10 % del al menos 1 millón de células, y expresa uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD34 y CD184,

un tercer subconjunto de la población incluye al menos 10 % del al menos 1 millón de células y expresa uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD31, CD133, CD144, CD202b, factor von Willebrand (vWF), CD102, CD105, CD106, CD109, CD114 CDw145, CD201, CD299, y CD309,

al menos algunas células de la población incluyen al menos 2,5 % del al menos 1 millón de células y expresan CD309 y CD202b,

al menos algunas células de la población incluyen al menos 5 % del al menos 1 millón de células, y expresa CD31 y VEGFR1, y

al menos algunas células de la población captan Ac-LDL y expresan lectina Ulex.

Además, en la presente descripción se describe una composición de materia, que incluye una población heterogénea de células, la población heterogénea de células que incluye:

(a) una población de al menos 50000 células presentadoras de antígeno; y

(b) una población de células madre/progenitoras enriquecidas,

la población de células presentadoras de antígeno es al menos 2,5 % de las células en la población heterogénea, al menos 5 % de las células presentadoras de antígeno expresan uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD1c, CD1b, CDle, CD11c, CD40, CD49d, CD53, CD68, CD74, CD80, CD83, CD85, CD86, CDw123, CD172b, CD180, CD141, CD206, CD208, CD209, CD218, CD258, CD301, CD303, y CD304,

la población de células madre/progenitoras enriquecidas es al menos el 1 % de las células en la población de células heterogénea, y al menos el 1 % de las células en la población heterogénea de células expresan uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD7, CD31, CD33, CD34, CD90, CD105, CD115, CD117, CDw123, CD124, CD157, CD164, CD172a, CD173, CD175, CD175, CD178, CD184, CD191, CD202b, CD292, y Stro-1.

En algunas aplicaciones, al menos 5 % de las células presentadoras de antígeno expresan uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD1c, CD86, CD141, CD303, y CD304, y

En algunas aplicaciones, al menos 5 % de las células presentadoras de antígeno expresan al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en: CD141, CD303, CD304, y CD86, y al menos 2,5 % de la población de células madre/progenitoras enriquecidas expresan CD34 y CD184.

En algunas aplicaciones, al menos 5 % de las células presentadoras de antígeno expresan al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en: CD141, CD303, CD304, y CD86, y

En algunas aplicaciones, la población de células madre/progenitoras enriquecidas incluye una población de células madre/progenitoras adultas multipotentes enriquecidas.

En algunas aplicaciones, la composición de la materia está congelada.

Aún se describe con más detalle una composición de materia, que incluye una población de al menos 1 millón de células precursoras/progenitoras específicas de linaje,

un primer subconjunto de la población incluye al menos 5 % del al menos 1 millón de células, y expresa uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD1c, CD1b, CD1e, CD11c, CD40, CD49d, CD53, CD68, CD74, CD80, CD83, CD85, CD86, CDw123, CD172b, CD180, CD141, CD206, CD208, CD209, CD218, CD258, CD301, CD303 y CD304, un segundo subconjunto de la población incluye al menos 2,5 % de al menos 1 millón de células, y expresa uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD7, CD31, CD33, CD34, CD90, CD105, CD115, CD117, CDw123, CD124, CD157, CD164, CD172a, CD173, CD175, CD175, CD178, CD184, CD191, CD202b, CD292, CD309, VEGFR1, y Stro-1, y las células de la población secretan una o más moléculas seleccionadas del grupo que consiste en: G-CSF, SDF-1/CXCR4, IL-8, IL-10, IFN alfa (IFNa), IFN beta (IFNp), IFN gamma (IFNy), TGF beta (TGFp), FGF básico (b-FGF), IL-12, IL-18 e IL-27.

En algunas aplicaciones, una parte de las células del segundo subconjunto expresan CD309 y CD202b.

En algunas aplicaciones, una parte de las células del segundo subconjunto expresan CD31 y VEGFR1.

En algunas aplicaciones, una parte de las células del segundo subconjunto capta Ac-LDL y expresa lectina Ulex.

En algunas aplicaciones, el primer subconjunto expresa uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD141, CD86, y CD304, y

el segundo subconjunto expresa uno o más marcadores que expresan uno o más marcadores seleccionados del grupo: CD34 y CD184.

En algunas aplicaciones, la composición de la materia está congelada.

Además, en la presente descripción se describe una composición de materia, que incluye una población de al menos 1 millón de células precursoras/progenitoras específicas de linaje,

al menos algunas células de la población incluyen al menos el 2,5 % del al menos 1 millón de células, y expresa CD309 y CD202b, al menos algunas células de la población incluyen al menos 5 % del al menos 1 millón de células, y expresa CD31 y VEGFR1, y

En algunas aplicaciones, la composición de la materia está congelada.

Además, en la presente descripción se describe un método que incluye:

obtener una población de células presentadoras de antígeno;

enriquecer una población de células madre/progenitoras dentro de una población más grande de células; y generar una población de células precursoras/progenitoras específicas de linaje (LSP), mediante la exposición de la población de células presentadoras de antígeno a la población de células madre/progenitoras enriquecidas; al menos 2,5 % de la población de células LSP expresa uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD31, CD133, CD144, CD202b, factor von Willebrand (vWF), CD102, CD105, CD106, CD109, CD114 CDw145, CD201, CD299, y CD309,

la población de células LSP secreta una o más moléculas seleccionadas del grupo que consiste en: G-CSF, SDF-1/CXCR4, IL-8, IL-10, IFN alfa (IFNa), IFN beta (IFNp), IFN gamma (IFNy), TGF beta (TGFp), FGF básico (b-FGF), IL-12, IL-18 e IL-27.

Además, en la presente descripción se describe además un método que incluye:

obtener una población de células presentadoras de antígeno;

enriquecer una población de células madre/progenitoras dentro de una población más grande de células; y generar una población de células precursoras/progenitoras específicas de linaje (LSP), mediante la exposición de la población activada de células presentadoras de antígeno a la población de células madre/progenitoras enriquecidas;

al menos 10 % de la población de células LSP expresa uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en: CD31, CD133, CD144, CD202b, factor von-Willebrand (vWF), CD102, CD105, CD106, CD109, CD114 CDw145, CD201, CD299, VEGFR1, y CD309, y

al menos 10 % de la población de células LSP capta Ac-LDL y expresa lectina Ulex.

En algunas aplicaciones, al menos 10 % de la población de células LSP capta Ac-LDL y expresa lectina Ulex, una primera porción de células de la población de células LSP expresa CD309 y cD202b, y una segunda porción de células de la población de células LSP expresa CD31 y VEGFR1.

La presente invención se entenderá mejor a partir de la siguiente descripción detallada de sus modalidades, tomada junto con los dibujos, en los que:

Descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-B son gráficos que representan el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) y de una DCP (población de células directoras) que se obtiene a partir de las PBMC, de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención;

Las Figuras 2A-B son gráficos que representan el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de PBMC y de las DCP, generadas a partir de PBMC, de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención;

Las Figuras 3A-B son gráficos que representan el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de la activación de DCP, generadas de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención;

Las Figuras 4A-B son gráficos que representan el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de PBMC y de una población de TDC (células derivadas de tejido) enriquecida, generada de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención;

La Figura 5 es una fotomicrografía de una población de MASPC (células madre/progenitoras adultas multipotentes) rica en EPC (células progenitoras endoteliales), generada de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención;

Las Figuras 6A-B son fotomicrografías de DCP y TDC cultivadas conjuntamente, y de las LSP (precursores específicos de linaje) resultante, cultivo de MASPC ricas en EPC, de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención;

La Figura 7 es un gráfico que representa el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de una LSP, cultivo de MASPC ricas en EPC, generada de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención;

La Figura 8 es una fotomicrografía que muestra la formación de tubos en una LSP, MASPC ricas en EPC, de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención;

Las Figuras 9A-B son gráficos que representan el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de una población expandida de MASPC y de una población expandida de DCP, generadas de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención;

La Figura 10 es una fotomicrografía que muestra colonias generadas por CFU (unidades formadoras de colonias) en una población expandida de MASPC, de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención; y

Las Figuras 11A-B son gráficos que representan un análisis de la función de reacción de linfocitos citotóxicos (CTL) de LSP-aCCP (población específica de linaje rica en precursores de células anticancerígenas) y grupo de control de PBMC en los días 4 (Figura 11A) y 7-8 (Figura 11B), generado de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención.

Descripción detallada de las modalidades

Para algunas aplicaciones, las células presentadoras de antígeno (APC) y/o las células dendríticas (DC) se cultivan en condiciones específicas para formar una población de células directoras (DCP) que se usa para dirigir la activación y/o expansión y/o diferenciación de células, de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención. Inicialmente, las DCP se cultivan durante un período de entre 0,5 horas y 30 días, por ejemplo, entre 2 horas y 14 días. Después del cultivo inicial de APC y/o DC para crear la DCP, la DCP típicamente se cultiva conjuntamente con células derivadas de tejido (TDC), por ejemplo, células madre/progenitoras adultas multipotentes (MASPC) o una población de células que contienen MASPC, para generar finalmente precursores/progenitores específicos de linaje (LSP) a partir de estas. Para algunas aplicaciones, las DCP se cultivan conjuntamente con MASPC y, posteriormente, otras células TDC pueden añadirse posteriormente al cultivo conjunto de DCP y MASPC. Cabe señalar que para algunas aplicaciones, la DCP se estimula antes del cultivo conjunto con las TDC. El estímulo de las DCP, para algunas aplicaciones, se realiza mediante el cultivo inicial de la DCP con MASPC, después de lo cual, puede añadirse TDC adicional al cultivo conjunto. Para algunas aplicaciones, la DCP se cultiva conjuntamente junto con MASPC y otras TDC que pueden incluir o no, MASPC. Para otras aplicaciones, después del cultivo inicial de APC y/o DC para crear la DCP, después la DCP se cultivan conjuntamente con MASPC y otras TDC.

Para algunas aplicaciones, la APC y/o la DCP se cultivan inicialmente en medio de cultivo acondicionado que se genera a partir del cultivo de células madre, por ejemplo, MASPC. Esto puede ir seguido del cultivo conjunto de APC y/o DCP con células madre, por ejemplo, MASPC, como se describe en la presente descripción. Alternativamente, la APC y/o la DCP preparadas de esta manera se usan con fines terapéuticos, de diagnóstico, o de investigación después del cultivo en medio acondicionado, sin cultivo conjunto con células madre.

Para algunas aplicaciones, las células madre, por ejemplo, MASPC, se cultivan en medio de cultivo acondicionado que se genera a partir del cultivo de APC y/o d Cp . Esto puede ir seguido del cultivo conjunto de APC y/o DCP con las células madre, por ejemplo, MASPC, que se han cultivado en el medio de cultivo acondicionado. Alternativamente, las células madre se usan con fines terapéuticos, de diagnóstico, o de investigación después del cultivo en medio acondicionado, sin cultivo conjunto con células madre.

Para algunas aplicaciones, la DCP se cultiva conjuntamente con TDC para obtener las MASPC.

En cualquier aplicación, durante el cultivo conjunto de la DCP con la TDC, la DCP induce la activación de la TDC (por ejemplo, proliferación, diferenciación, inducción de actividad enzimática e inducción de actividad bioquímica, por ejemplo, la secreción de moléculas específicas y/o la expresión de marcadores específicos, por ejemplo, marcadores moleculares, intracelulares y/o de membrana, etcétera). Se observa que "inducir" un proceso, como se usa en la presente descripción, incluye provocar un aumento en el proceso o iniciar el proceso. Típicamente, esta activación se usa como herramienta terapéutica, de diagnóstico, y de investigación. Para algunas aplicaciones, el medio de cultivo que se deriva del cultivo conjunto de la DCP con la TDC se administra a un paciente (por ejemplo, mediante inyección) con fines terapéuticos.

En algunas aplicaciones, el método incluye derivar la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC, de al menos una fuente seleccionada del grupo que consiste en: hueso, ganglio linfático, bazo, vasos sanguíneos, mucosa, tejido del SNC, tejido del SNP, tejido cardiaco, tejido hepático, tejido uterino, tejido adiposo, tejido linfático, tejido pancreático, tejido renal, tejido pulmonar, tejido retiniano, tejido embrionario, tejido fetal, sangre del cordón umbilical, tejido del cordón umbilical, tejido placentario, tejido neonatal, tejido adulto, médula ósea, sangre movilizada, sangre periférica, células mononucleares de sangre periférica, células de la piel, y tejido vegetal.

Típicamente, la DCP y la TDC, por ejemplo, MASPC, son autólogas con respecto al paciente. Para otras aplicaciones, la DCP y la TDC, por ejemplo, Ma s Pc , son alogénicas con respecto al paciente. Para aún otras aplicaciones, la DCP y la TDC, por ejemplo, MASPC, son xenogénicos con respecto al paciente.

En algunas aplicaciones, el método incluye derivar la DCP y la TDC, por ejemplo, MASPC, de al menos una fuente seleccionada del grupo que consiste en: tejido fresco y tejido congelado.

Para algunas aplicaciones, el cultivo conjunto de la DCP con la MASPC induce la generación de células terapéuticas tolerogénicas que posteriormente pueden implantarse en un aceptor alogénico o autólogo. Estas células tolerogénicas facilitan el injerto mejorado de tejidos y/o células autólogos y/o alogénicos. Para algunas aplicaciones, las células tolerogénicas se generan mediante el cultivo de la DCP durante un período de entre 0,5 días y 120 días.

Para algunas aplicaciones, el cultivo conjunto de la DCP con la MASPC induce la generación de células terapéuticas tolerogénicas que posteriormente pueden implantarse en un aceptor alogénico o autólogo. Estas células tolerogénicas facilitan el injerto mejorado de tejidos y/o células autólogos y/o alogénicos. Para algunas aplicaciones, las células tolerogénicas se generan mediante el cultivo de la DCP durante un período de entre 0,5 horas y 48 horas.

Para algunas aplicaciones, con el fin de crear estas células tolerogénicas, la DCP se estimula mediante el cultivo conjunto de la DCP con antígenos autoinmunitarios autólogos y/o antígenos derivados de tejidos afectados por inflamación crónica. Durante el cultivo, la DCP se estimula cuando las células DCP engullen los antígenos autoinmunitarios y, posteriormente, presentan estos antígenos en la superficie de cada célula de la DCP. Después, la DCP estimulada se cultiva conjuntamente con TDC, por ejemplo, una población de células que incluye células inmunitarias maduras y MASPC, para inducir la activación de estas. Durante el cultivo conjunto, la DCP presenta los antígenos autoinmunitarios a las células inmunitarias maduras de la TDC y/o la MASPC, para generar una LSP, por ejemplo, células tolerogénicas usadas para tratar trastornos autoinmunitarios e inflamación crónica. Las células inmunitarias maduras en la LSP son activadas de esta manera por la DCP estimulada para funcionar inmediatamente como células tolerogénicas. Adicionalmente, las MASPC en la LSP solamente se estimulan por la DCP estimulada para diferenciarse en una etapa posterior en las mismas células inmunitarias maduras que funcionan como células tolerogénicas. Por lo tanto, la LSP comprende una población de células que comprende (1) una primera subpoblación de células que se activan inmediatamente (es decir, las células inmunitarias tolerogénicas maduras de la LSP en esta aplicación particular de la presente invención), y (2) una segunda subpoblación de células que comprende precursores/progenitores que se diferencian en una etapa posterior en las células activas (es decir, MASPC).

Para algunas aplicaciones, se usan antígenos cancerosos y/o células cancerosas para estimular o activar la DCP. Después, la DCP activada se cultiva conjuntamente con la TDC y MASPC y presenta los antígenos a la TDC. Este cultivo conjunto induce la generación de números terapéuticos de células autólogas reactivas y/o alogénicas antitumorales, como se describe en la presente descripción más abajo y se muestra en los datos experimentales.

Típicamente, la DCP induce la expansión, o el enriquecimiento de las células cultivadas conjuntamente con ella. Adicionalmente, la DCP dirige la t Dc , por ejemplo, MASPC y otras células maduras de la TDC, hacia la generación de una LSP durante 2-3 etapas de cultivo:

• Primero, la APC y/o DC se cultivan en condiciones específicas para crear la DCP. Estas condiciones incluyen el cultivo de APC y/o DC en diversas condiciones ambientales, cultivo en medios que contienen determinados factores, cultivo en medios acondicionados, cultivo conjunto con tejidos diana, con fracciones extraídas de estos y/o con mezclas de citocinas convenientes. Típicamente, tal cultivo estimula y/o activa la DCP;

• Después de la generación, estimulación y/o activación de la DCP, puede realizarse una, o una combinación, de las siguientes dos etapas:

(1) La MASPC se cultiva conjuntamente junto con la DCP activada y se activa de esta manera en respuesta a (a) condiciones ambientales específicas, (b) interacciones célula-célula con la DCP estimulada, y (c) factores de activación adicionales, por ejemplo, factores de crecimiento y citocinas. Típicamente, la activación se expresa mediante proliferación, diferenciación y/o inducción de actividad bioquímica, etcétera, de MASPC; y/o

(2) Otras TDC (por ejemplo, células que no son MASPC, tales como células maduras de un tipo celular particular) se añaden al cultivo y se activan de esta manera como se describió anteriormente en la presente descripción con respecto a la activación de la MASPC.

Para algunas aplicaciones, las etapas (1) y (2) pueden ocurrir secuencialmente o simultáneamente. Para aplicaciones en las que se aplican las etapas (1) y (2), debe tenerse en cuenta que pueden añadirse TDC y/o MASPC adicionales al cultivo conjunto después de la etapa (2) o simultáneamente con en la misma. Finalmente, después de las etapas (1) y (2), se genera una población que comprende una población de TDC activadas ricas en MASPC. Cabe señalar que, para algunas aplicaciones, solo se realiza la etapa (1) sin realizar la etapa (2).

Como resultado de las etapas de cultivo enumeradas anteriormente, pueden usarse cantidades terapéuticas de células enriquecidas en LSP autólogas y/o alogénicas y/o moléculas solubles de estas para la regeneración de tejidos, rejuvenecimiento, y tratamientos anticancerosos. Además, las combinaciones de células descritas en la presente descripción pueden usarse como herramientas de diagnóstico, así como también de investigación para explorar las funciones aún desconocidas de las células dendríticas más allá de su función tradicionalmente atribuida como reguladoras del sistema inmunológico.

En el contexto de la presente solicitud de patente y en las reivindicaciones, una población de células directoras (DCP) es una población de al menos 50 000 células que puede caracterizarse por expresar uno o más de los marcadores celulares: CD1c, CD1b, CD1e, CD11c, CD40, CD49d, CD53, CD68, CD74, CD80, CD83, CD85, CD86, CDw123, CD141, CD172b, CD180, CD206, CD208, CD209, CD218, CD258, CD301, CD303 y CD304.

Típicamente, después del cultivo conjunto de una población de TDC rica en MASPC mediante la DCP activado:

(1) al menos 5 %, por ejemplo, al menos 10 %, de la población resultante de TDC rica en MASPC dirigida por DCP expresa:

(a) uno o más de los siguientes marcadores coestimuladores: CD1c, CD1b, CD1e, CD11c, CD40, CD49d, CD53, CD68, CD74, CD80, CD83, CD85, CD86, CDw123, CD172b, CD180, CD141, CD206, CD208, CD209, CD218, CD258, CD301, CD303 y CD304,

y (b) uno o más de los siguientes marcadores de células madre/progenitoras CD7, CD31, CD33, CD34, CD90, CD105, CD115, CD117, CDw123, CD124, CD157, CD164, CD172a, CD173, CD175, CD175, CD178, CD184, CD191, CD202b, CD292, y Stro-1; y

(2) la población resultante de TDC rica en MASPC dirigida por DCP secreta una o más de las siguientes moléculas específicas: G-CSF, SDF-1/CXCR4, IL-8, y/o IL-10, IFN alfa (IFNa), IFN beta (IFNp), IFN gamma (IFNy), TGF beta (TGFp), FGF básico (b-FGF), IL-12, IL-18, e IL-27.

De acuerdo con las reivindicaciones, una DCP se genera a partir de una fuente hematopoyética que se deriva de células mononucleares de sangre periférica (PBMC).

Los métodos descritos en esta solicitud de patente describen el uso de APC y DC, tomados del tejido fuente descrito anteriormente en la presente descripción, para dirigir selectivamente células madre/progenitoras a poblaciones de células LSP enriquecidas. Los métodos descritos en la presente descripción incluyen etapas de cultivo secuenciales en los que las APC se activan primero para generar la DCP que dirige específicamente la expansión y/o diferenciación de las TDC, que incluyen, pero no se limitan a MASPC en la segunda y/o tercera etapa/s para generar MASPC y/o poblaciones enriquecidas con LSP adecuadas para usar como herramientas terapéuticas y/o de diagnóstico y/o investigación.

Para algunas aplicaciones, el método incluye:

(1) recolectar una muestra de sangre periférica de un donante y/o paciente, aislar y/o enriquecer células mononucleares de la muestra de sangre periférica, separar poblaciones de: (a) células APC ricas en DC, (b) TDC que comprenden células maduras de un tipo de célula particular (por ejemplo, células efectoras tales como monocitos, células T y/o células B y/o células NK), y (c) TDC que comprende MASPC de la fracción de células mononucleares, y

(2) cultivar estas células en condiciones que causarán que las células progenitoras mesenquimales y/o hematopoyéticas y/o precursoras de las células efectoras presentes en la mezcla de células (específicamente en la MASPC) se diferencien y se expandan en poblaciones enriquecidas con LSP, mediante el uso de técnicas descritas en la presente descripción tales como la activación de las poblaciones de células con DCP y posteriormente cultivar las células activadas por DCP en condiciones de cultivo específicas. Dado que el número de DCP y LSP en la circulación es típicamente inferior a 0,1 %, el procedimiento enumerado anteriormente se realiza ex vivo para expandir suficientemente las poblaciones de células de DCP y LSP. Después de esta etapa de expansión, las células pueden implantarse en un paciente.

El proceso de expansión y/o diferenciación en LSP específicos puede usarse como una herramienta de diagnóstico que permite la detección de anomalías o condiciones patológicas de un paciente. La patología de un paciente puede indicarse si los procedimientos de expansión y/o diferenciación realizados en la sangre que se extrae de un paciente (a) no producen una LSP, mientras que los mismos procedimientos producirían una LSP a partir de células que se extraen de un voluntario sano, o (b) no producen una LSP que sea similar a una LSP producida a partir de células que se extraen de un voluntario sano.

Además, el proceso de expansión dirigida y/o diferenciación en LSP específicos por la DCP puede usarse como una herramienta de investigación para descubrir, definir, y/o alterar los mecanismos responsables de las etapas específicas de activación y/o diferenciación y/o maduración de una población de células tomada de un paciente.

Los siguientes representan los métodos para usar con la sangre que se extrae del paciente. Cabe señalar que los siguientes métodos pueden usarse de forma independiente o en combinación:

(1) Aislamiento de células dendríticas de la sangre de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección positiva de células, que incluye, pero no se limita a, la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD1a, CD141, CD304, CD303, CDw123, CD172b, CD180, CD141, CD206, CD208, c D209, CD218, CD258, CD301, CD80 y CD86) a una población de células conveniente;

(2) Enriquecimiento de células dendríticas de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección negativa de células, que incluye, pero no se limita a, la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD20, CD3, CD14, CD56, CD97 and CD235) a una población de células no conveniente;

(3) Enriquecimiento de células dendríticas de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección positiva de células basadas en características bioquímicas de las células que incluyen, pero no se limitan a la producción de citocinas específicas (tales como IFN, v Eg F, IL-10 e IL-12);

(4) Aislamiento de células dendríticas inmaduras de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección positiva de células que incluyen, pero no se limitan a la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD141, CD303, CD301, CD86 y CD304) a una población de células conveniente;

(5) Enriquecimiento de células dendríticas inmaduras de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección negativa de células, que incluyen, pero no se limitan a la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD20, CD3, CD14, CD56, CD97 y CD235) a una población de células no conveniente;

(6) Enriquecimiento de células dendríticas inmaduras de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección positiva de células, que incluyen, pero no se limitan a la selección basada en las características bioquímicas de las células, tales como la adhesión celular a una superficie plástica;

(7) Aislamiento de células dendríticas plasmacitoides de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección positiva de células, que incluyen, pero no se limitan a la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD303 y CD304) a una población de células conveniente;

(8) Enriquecimiento de células dendríticas plasmacitoides de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección negativa de células, que incluyen, pero no se limitan a la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD20, CD3, CD14, CD56, CD97 y CD235) a una población de células no conveniente;

(9) Aislamiento de células dendríticas mieloides basado en metodologías publicadas y/o comerciales para la selección positiva de células que incluye, pero no se limita a la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD1c y CD141) a una población de células conveniente;

(10) Enriquecimiento de células dendríticas mieloides de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección negativa de células, que incluye, pero no se limita a la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD20, CD3, CD14, CD56, CD97 y CD235) a una población de células no conveniente; (11) Aislamiento de células presentadoras de antígeno basado en metodologías publicadas y/o comerciales para la selección positiva de células que incluye, pero no se limita a la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD1a-e y CD13) a una población de células conveniente; y/o

(12) Enriquecimiento de células presentadoras de antígeno basado en metodologías publicadas y/o comerciales para la selección negativa de células, que incluye, pero no se limita a la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD20, CD3, CD14, c D56, CD97 y CD235) a una población de células no conveniente.

Cabe señalar que las células dendríticas maduras pueden aislarse, además, y aplicarse a un cultivo conjunto dado.

Los métodos enumerados anteriormente pueden usarse independientemente o en combinación con los siguientes métodos para usar con sangre extraída, que incluyen:

(1) Aislamiento de células madre/progenitoras adultas multipotentes (MASPC) a partir de TDC (en la presente descripción, TDC rica en MASPC) de acuerdo con las metodologías publicadas y/o comerciales para la selección positiva de células, que incluye, pero no se limita a la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD184 y CD254) a una población de células conveniente;

(2) Aislamiento de TDC rica en MASPC de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección positiva de células basadas en características bioquímicas de las células que incluyen, pero no se limitan a la capacidad de expulsar tintes lipofílicos y la tinción fluorescente de ALDH;

(3) Enriquecimiento de TDC rica en MASPC de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección negativa de células, que incluyen, pero no se limitan a la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD38, CD20, CD3, CD14, CD56, CD97 y CD235) a una población de células no conveniente;

(4) Aislamiento de células mesenquimales de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección positiva de células que incluyen, pero no se limitan a la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD105, Stro-1 y CD271) a una población de células conveniente;

(5) Enriquecimiento de células mesenquimales de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección negativa de células, que incluyen, pero no se limitan a la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD38, CD20, CD3, CD14, CD56, CD97 y CD235) a una población de células no conveniente;

(6) Aislamiento de células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSC) de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección positiva de células, que incluyen, pero no se limitan a la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD7, CD31, CD34, CD115, CD117, CDw123, CD124, CD133, CD164, CD175, CD175, CD184, CD191, y CD202b) a una población de células conveniente; y/o

(7) Enriquecimiento de HSC de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección negativa de células, que incluyen, pero no se limitan a la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD38, CD20, CD3, CD14, CD56, CD97 y CD235) a una población de células no conveniente.

(1) Aislamiento de células derivadas de tejido (TDC) convenientes, tales como células T y/o células B y/o células NK de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección positiva de células, que incluyen, pero no se limitan a la selección basada en la unión de anticuerpos específicos (tales como CD3, CD8, CD20 y CD56) a una población de células conveniente;

(2) Enriquecimiento de la TDC conveniente, tales como células T y/o células B y/o células NK de acuerdo con metodologías publicadas y/o comerciales para la selección negativa de células, que incluyen, pero no se limitan a la selección basada en la unión de anticuerpos específicos a una población de células no conveniente;

(3) Aislamiento de células efectoras basado en metodologías publicadas y/o comerciales para la selección positiva de células que incluye, pero no se limita a la selección basada en la unión de epítopos específicos (tales como anticuerpos dirigidos contra un epítopo de cáncer conveniente) a una población de células conveniente; y/o

(4) Enriquecimiento de células efectoras basado en metodologías publicadas y/o comerciales para la selección negativa de células, que incluye, pero no se limita a la selección basada en la unión de epítopos específicos (tales como anticuerpos específicos para células que expresan epítopos autoinmunitarios tales como, por ejemplo, células que expresan actividad anti-MBP) a una población de células no conveniente.

Para algunas aplicaciones, realizar el aislamiento y/o enriquecimiento de APC y/o DC y/o subpoblaciones de estas incluye, pero no se limita a cultivar las células DCP durante un período que dura entre 0,5 horas y 14 días, por ejemplo, entre 2 horas y 7 días o entre 3 días y 14 días.

Para algunas aplicaciones, realizar el aislamiento y/o enriquecimiento de APC y/o DC y/o subpoblaciones de estas incluye cultivar las células DCP en condiciones que mejoran la tolerancia, que incluyen, pero no se limitan al cultivo en presencia de IL-10, Alfa-1 Antitripsina y/o TGFp, prostaglandina E2 (PGE-2) y/o lL-4.

Para algunas aplicaciones, las fracciones de sangre extraídas, que incluyen a modo de ilustración y no de limitación DCP y MASPC, pueden cultivarse conjuntamente con tejido diana o componentes de este para generar LSP.

Para algunas aplicaciones, el medio acondicionado de cultivos de fracciones de sangre extraídas, que incluyen a modo de ilustración y no de limitación DCP, puede cultivarse conjuntamente con tejido diana o componentes de este para generar LSP. Debe entenderse que el medio acondicionado mencionado puede usarse inmediatamente (es decir, fresco) o después de la conservación (por ejemplo, mediante congelación).

Para algunas aplicaciones, el medio acondicionado de cultivos de fracciones de sangre extraídas, que incluyen a modo de ilustración y no de limitación DCP y MASPC, puede cultivarse conjuntamente con tejido diana o componentes de este para generar LSP. Debe entenderse que el medio acondicionado mencionado puede usarse inmediatamente (es decir, fresco) o después de la conservación (por ejemplo, mediante congelación).

Para algunas aplicaciones, aplicar el aislamiento y/o enriquecimiento de MASPC y/o subpoblaciones de esta, incluye expandir el porcentaje y/o número de MASPC en una población resultante mediante el cultivo conjunto de MASPC con las células DCP durante un período que dura entre 2 horas y 7 días.

Para algunas aplicaciones, aplicar el aislamiento y/o enriquecimiento de MASPC y subpoblaciones de estas, incluye expandir el porcentaje y/o número de MASPC en una población resultante mediante el cultivo conjunto de MASPC con las células DCP durante un período que dura entre 3 días y 120 días.

Para algunas aplicaciones, aplicar el aislamiento y/o enriquecimiento de MASPC y/o subpoblaciones de estas, incluye expandir el porcentaje y/o número de MASPC en una población resultante mediante el cultivo conjunto de MASPC con las células DCP durante un período que dura entre 2 horas y 120 días.

Para algunas aplicaciones, la TDC, por ejemplo, MASPC, se cultiva conjuntamente con células DCP durante un período que dura entre 2 horas y 7 días para generar y aumentar la proporción y el número de una LSP resultante dada.

Para algunas aplicaciones, la TDC, por ejemplo, MASPC, se cultiva conjuntamente con células DCP durante un período que dura entre 3 horas y 120 días para generar y aumentar la proporción y el número de una LSP resultante dada.

Para algunas aplicaciones, la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC, se cultivan en condiciones, que incluyen, pero no se limitan al cultivo en presencia de menos del 5 % de suero, por ejemplo, 0 % de suero, durante 2-60 días, seguido del cultivo de células en presencia de suero mayor o igual al 5 % entre 1 y 60 días.

En algunas aplicaciones, la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC, se cultivan en condiciones, que incluyen, pero no se limitan a cultivar las células en presencia de suero mayor o igual al 5 % entre 1 y 60 días, seguido por el cultivo de las células en presencia de menos del 5 % de suero entre 2-60 días.

Para algunas aplicaciones, la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC, se cultivan en condiciones, que incluyen, pero no se limitan a cultivar en presencia de condiciones hipóxicas durante 2-96 horas antes y/o después de cultivar las células en presencia de condiciones no hipóxicas entre 1 y 60 días.

Para algunas aplicaciones, la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC, se cultivan en condiciones, que incluyen, pero no se limitan a cultivar en presencia de condiciones de hipotermia (por ejemplo, menor o igual a 26 grados C) durante 2-96 horas, antes y/o después de cultivar las células en presencia de condiciones no hipotérmicas entre 1 y 60 días.

Para algunas aplicaciones, la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC, se cultivan en condiciones, que incluyen, pero no se limitan a cultivar en presencia de condiciones de hipertermia (por ejemplo, mayor o igual a 41 grados C) 2-96 horas antes y/o después de cultivar las células en presencia de condiciones sin hipertermia entre 1 y 60 días.

Para algunas aplicaciones, la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC, se cultivan en condiciones que incluyen, pero no se limitan a cultivar en presencia de menos del 3 % de CO2 entre 2-48 horas antes y/o después de cultivar las células en presencia de CO2 superior o igual al 5 % entre 1 y 14 días.

Para algunas aplicaciones, la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC, se cultivan en condiciones que inducen la maduración, que incluyen, pero no se limitan a cultivar en presencia de moléculas que mejoran el crecimiento, activación, diferenciación, y/o direccionamiento. Típicamente, tales moléculas se presentan a las células como moléculas solubles y/o agregadas en el medio de cultivo. Alternativa o adicionalmente, estas moléculas se presentan a las células como moléculas inmovilizadas que incluyen, pero no se limitan a moléculas que están inmovilizadas en partículas portadoras (por ejemplo, matrices biodegradables y extractos de tejido) y/o moléculas unidas a la superficie de la placa de cultivo.

Para algunas aplicaciones, la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC, se cultivan en condiciones que inducen la maduración, que incluyen pero no se limitan a cultivar las células en presencia de una o más de las siguientes moléculas de activación: CpG OND, IL-10, IL-12, IL-18, IL-27, Alfa-1 Antitripsina, Ligando Flt3, IFNa, IFNp, IFNy, Prostaglandina E2 (PGE-2), IL-4, b-FGF, y/o TGFp.

Para algunas aplicaciones, la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC se cultivan en una superficie que incluye a modo de ilustración y no de limitación uno o más de los siguientes factores potenciadores del crecimiento: colágeno, fibronectina, albúmina, plasma y/o suero.

En algunas aplicaciones, la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC se cultivan en condiciones específicas que imitan las condiciones presentes en el tejido in vivo. Por ejemplo, las células se cultivan en un medio que comprende uno o más de los siguientes factores derivados de tejido a modo de ilustración y no de limitación: anticuerpos, citocinas, factores de crecimiento, matriz extracelular derivada de tejido y/u otras moléculas, tales como: anti-CD34, anti-Tie-2, anti-CD133, anti-CD117, LIF, EPO, IGF, b-FGF, M-CSF, GM-CSF, TGF alpha, TGF beta, VEGF, BHA, BDNF, NGF, NT3, NT4/5, GDNF, S-100, CNTF, EGF, NGF3, CFN, ADMIF, Alfa-1 antitripsina, estrógeno, cortisona, dexametasona, o cualquier otra molécula de la familia de los esteroides, prolactina, un adrenocorticoide, glutamato, serotonina, acetilcolina, NO, ácido retinoico (RA), heparina, insulina, forskolina, una estatina, o un fármaco antidiabético (por ejemplo, una tiazolidinediona tal como rosiglitazona), NO, MCDB-201, selenito de sodio, ácido linoleico, ácido ascórbico, transferrina, 5-azacitidina, PDGF, VEGF, cardiotrofina, y/o trombina.

Debe apreciarse que los factores de estimulación particulares descritos en la presente descripción son a modo de ilustración y no de limitación, y el alcance de la presente invención incluye el uso de otros factores de estimulación. Según sea apropiado, estos factores pueden utilizarse en una concentración de entre aproximadamente 10 pg/mL y aproximadamente 100 ug/mL (o equivalentes molares).

Para algunas aplicaciones, la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC se cultivan en una o más de las siguientes condiciones inductoras de la maduración, que incluyen, pero no se limitan a cultivar en presencia de uno o más anticuerpos, por ejemplo, anti-CD4, anti-CD 19, anti-CD38, anti-CD220, anti-CD221, y/o anti-CD222.

Para algunas aplicaciones, el método para cultivar la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC incluye cultivar las células con uno o más de los siguientes componentes específicos inductores de activación que se extraen de un tejido diana que incluye, pero no se limitan a: fracciones celulares, elementos de membrana específicos extraídos, receptores específicos extraídos y/o moléculas antigénicas específicas extraídas.

Para algunas aplicaciones, la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC se cultivan conjuntamente con un tejido diana en condiciones de activación específicas. Para algunas aplicaciones, el tejido diana está en contacto directo con la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC. Alternativamente, el tejido diana se separa de la DCP y/o de la TDC, por ejemplo, MASPC mediante una membrana semipermeable.

Un tejido diana, en el contexto de la presente solicitud de patente y en las reivindicaciones, es típicamente, pero no necesariamente, un tejido que representa un estado final conveniente de las células progenitoras en el cultivo. Alternativa o adicionalmente, un tejido diana es un tejido que se obtiene de tejido dañado (por ejemplo, de tejido de piel quemada, tejido infectado con cáncer, tejido infectado por enfermedad autoinmunitaria, tejido infectado por inflamación crónica, etcétera). En algunas de tales aplicaciones, las células cultivadas conjuntamente con el tejido dañado son dirigidas a través de la DCP para diferenciarse en células sanas del tejido para curar el tejido dañado después de la administración.

Según sea apropiado, el tejido diana puede ser autólogo, singénico, alogénico, o xenogénico con respecto al tejido fuente a partir del cual se produjeron las DCP, TDC, y/o MASPC cultivadas. Alternativa o adicionalmente, la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC se cultivan en un medio acondicionado elaborado mediante el uso del tejido diana que es autólogo, singénico, alogénico, o xenogénico con respecto al tejido fuente del que se cultivó la DCP y/o se produjeron las TDC, por ejemplo, MASPC.

Para algunas aplicaciones, el tejido diana se cultiva conjuntamente con la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC en el medio acondicionado. Se observa que la fuente del tejido diana puede ser, además, tejido de tejido embrionario, tejido fetal, sangre del cordón umbilical, tejido del cordón umbilical, tejido placentario, tejido neonatal, tejidos adultos tales como médula ósea, sangre movilizada, sangre periférica, células mononucleares de sangre periférica, ganglios linfáticos, bazo, hígado, útero, tejido adiposo, células cutáneas, páncreas, riñón, pulmón, retina, SNC, sistema nervioso periférico, mucosa, tejido cardíaco y tejido vegetal, un cadáver y/o puede estar liofilizado, fresco, o en conservación.

Para algunas aplicaciones, después de la estimulación por la DCP, la MASPC dirigida por las DCP resultante (es decir, la LSP) expresa moléculas coestimuladoras tales como CD11c, CD40, CD80 y CD86 y secreta moléculas específicas tales como G-CSF, SDF-1/CXCR4, IL-8, IL-10.

Para algunas aplicaciones, después del cultivo conjunto y la activación de las TDC, por ejemplo, MASPC, con DCP estimulada, la LSP resultante se evalúa para verificar que se ha diferenciado y/o expandido en una forma conveniente. La caracterización de las células diferenciadas se realiza de acuerdo con las características fenotípicas, genotípicas y fisiológicas de las células. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, las células se caracterizan mediante la evaluación de la actividad funcional/fisiológica de estas, además de o en lugar de evaluar la presencia o ausencia de determinados marcadores celulares. El inventor plantea la hipótesis de que la evaluación de la actividad funcional/fisiológica de las células LSP aumenta la probabilidad de que el producto que se obtiene y se designa para usar in vivo funcione como se esperaba.

Para algunas aplicaciones, la LSP y/o moléculas solubles de esta se usan como un producto celular terapéutico (por ejemplo, para la terapia del cáncer, para la mejora del injerto de tejido alogénico, para la regeneración de tejidos y/o función del tejido, para la ingeniería de tejidos, para el reemplazo de tejido, para el tratamiento de autoinmunidad, alergia, inflamación crónica y/u otros trastornos inmunológicos), como una herramienta de investigación (por ejemplo, para la investigación de la transducción de señales o para el cribado de factores de crecimiento), y/o como una herramienta de diagnóstico.

Cuando las LSP se usan como un producto celular terapéutico, típicamente se administran a un paciente. Una vez administradas, las células progenitoras maduran en un tipo celular conveniente dado (por ejemplo, células endoteliales, células retinianas, etcétera). Para algunas aplicaciones, se administra un producto celular terapéutico a un paciente alogénico distinto del humano del que se obtuvieron las TDC.

Para algunas aplicaciones, las LSP se evalúan para una o más de las siguientes características fisiológicas que incluyen, pero no se limitan a: reacciones enzimáticas, secreción de factores (por ejemplo, citocinas), capacidad de migración, inducción de migración de células madre y/o generación de colonias celulares.

Para algunas aplicaciones, las LSP se transfectan con un gen y después se administran a un paciente.

En algunas aplicaciones, el método incluye identificar la LSP como adecuado para uso terapéutico en respuesta a una evaluación de que la LSP incluye al menos 5 millones de células LSP específicas, por ejemplo, 5 millones de células.

En algunas aplicaciones, el método incluye identificar la LSP como adecuada para uso terapéutico en respuesta a una evaluación de que al menos el 2,0 % de las células de la LSP demuestran una característica seleccionada del grupo que consiste en: una morfología conveniente, un marcador celular conveniente, un componente celular conveniente, una enzima conveniente, un receptor conveniente, una característica genotípica conveniente, y una característica fisiológica conveniente.

Cabe señalar que las indicaciones descritas anteriormente en la presente descripción son solo ejemplos de los usos terapéuticos de una LSP, que comprenden el trasplante de LSP (tal como LSP rica en EPC o una LSP-aCCP) a una vecindad de tejido o un espacio de un sujeto seleccionado del grupo que consiste en: tejido de un nervio periférico del sujeto, tejido de un nervio del sistema nervioso central del sujeto, un nervio óptico del sujeto, tejido coroideo del sujeto, tejido retiniano del sujeto, espacio subretiniano del sujeto, tejido corneal de un sujeto, tejido renal del sujeto, tejido pancreático del sujeto, tejido pulmonar y alveolar del sujeto, tejido de un hueso dañado del sujeto, tejido de un hueso fracturado del sujeto, tejido inflamado del sujeto, tejido infectado del sujeto, tejido contuso del sujeto, tejido dañado, ulcerado o herido de una piel, tejido cerebral del sujeto, tejido de una extremidad del sujeto, tejido de un injerto de piel y/o tejido de una extremidad amputada del sujeto.

En algunas aplicaciones, las células cultivadas pueden usarse como herramienta de diagnóstico. Para algunas aplicaciones, un producto de cualquier etapa dada en los procesos descritos en la presente descripción se usa como herramienta de diagnóstico.

Puede indicarse la patología de un paciente si un procedimiento in vitro realizado con sangre extraída del paciente no produce una DCP, mientras que el mismo procedimiento produciría una DCP a partir de células que se extraen de un voluntario sano.

Alternativa o adicionalmente, puede indicarse la patología a un paciente si un procedimiento de estimulación in vitro realizado en una DCP autóloga y/o cultivo conjunto de DCP y TDC no produce una LSP conveniente, cuando el mismo procedimiento produciría el número conveniente de una LSP conveniente a partir de DCP y/o cultivo conjunto de DCP y TDC de un voluntario sano.

Alternativa o adicionalmente, puede indicarse la patología de un paciente si uno o más protocolos in vitro usados para evaluar una DCP no producen los mismos resultados que una DCP originada a partir de un voluntario sano.

Además, alternativa o adicionalmente, puede indicarse la patología de un paciente si uno o más protocolos in vitro usados para evaluar una LSP no producen los mismos resultados como los de una LSP originada a partir de un voluntario sano.

Además, alternativa o adicionalmente, puede indicarse una patología de un paciente si uno o más protocolos usados para evaluar una LSP después de la implantación en un paciente no funcionan como se esperaba (es decir, no funcionan como lo haría una LSP si se implantaran en un animal o voluntario humano sano).

Para algunas aplicaciones, las células cultivadas se usan como herramientas de investigación. En tales aplicaciones, el donante de células de mamífero puede ser humano o no humano, según sea apropiado.

En algunas aplicaciones, estimular la DCP y la TDC, por ejemplo, MASPC, incluye dirigir la DCP, TDC y/o MASPC para que se diferencien en una clase de LSP conveniente previamente designada.

Para algunas aplicaciones, se hace un esfuerzo para minimizar el tiempo que transcurre desde la recolección de células del donante de células hasta que se usan las LSP (por ejemplo, para la administración a un paciente). Alternativamente, las células se conservan en uno o más puntos del proceso. Por ejemplo, la DCP y/o la TDC, por ejemplo, MASPC pueden congelarse antes de la estimulación de estas que genera LSP. En otro ejemplo, la DCP y/o TDC y/o MASPC se estimulan para generar la LSP conveniente, y después se congelan las LSP. En cualquiera de estos casos, las células congeladas pueden almacenarse y/o transportarse, para su posterior descongelación y uso.

A modo de ilustración y no de limitación, se observa que determinadas aplicaciones son adecuadas para la comercialización a gran escala, que incluye la congelación y el transporte, tal como (a) la generación de depósitos de DCP, TDC y/o MASPC, y/o moléculas solubles de estas (b) generación de depósitos de LSP, para posible uso posterior. Otras aplicaciones que utilizan la administración de células autólogas y/o alogénicas (tales como daño posterior a un accidente cerebrovascular agudo, lesión de la médula espinal, regeneración de tejidos, y rejuvenecimiento de tejidos) pueden beneficiarse de la disponibilidad de células almacenadas. "Transporte", en este contexto, significa el transporte a un sitio remoto, por ejemplo, un sitio a más de 10 km o 100 km de un sitio donde primero se crearon las DCP y/o TDC y/o MASPC y/o LSP.

Un ejemplo de tal LSP que se describe en la presente descripción y se muestra en los datos experimentales es una población específica de linaje que contiene una población de células que demuestran una actividad citotóxica aumentada hacia las células cancerosas. Las células derivadas de tejido (TDC), que incluye las MASPC y las células efectoras tales como las células T y/o las células asesinas naturales, se activan mediante la DCP para producir una población progenitora de células anticancerosas específica de linaje (LSP-aCCP). La LSP-aCCP contiene una población de células efectoras maduras activadas, así como también una población de células precursoras que se dirigen a diferenciarse eventualmente en células efectoras maduras activadas. De tal manera, la LSP-aCCP contiene células que están disponibles para uso anticanceroso inmediato, así como también una subpoblación de células latentes que pueden reponer las células efectoras maduras activadas mediante la diferenciación en células efectoras maduras activadas en una etapa posterior. La LSP-aCCP puede producirse, tratarse y/o administrarse a un paciente, mediante el uso de cualquiera de las técnicas descritas en la presente descripción.

Otro ejemplo de tal LSP que se describe en la presente descripción y se muestra en los datos experimentales, es una población específica de linaje que contiene una población de células que incluyen progenitores/precursores endoteliales (EPC). Las células derivadas de tejido (TDC), que incluye la MASPC, se activan mediante la DCP para producir una LSP rica en EPC. La LSP rica en EPC contiene una población de EPC, así como también una población de células que se dirigen a diferenciarse eventualmente en EPC (es decir, MASPC adicionales que aún no se han diferenciado). De tal manera, la LSP rica en EPC contiene células que están disponibles inmediatamente como EPC, así como también una subpoblación de células latentes que pueden reponer las EPC mediante la diferenciación en células EPC en una etapa posterior (es decir, MASPC). Por lo tanto, la LSP que se crea comprende una población MASPC rica en EPC.

Métodos usados para algunas aplicaciones de la presente invención

A continuación, se describen una serie de protocolos que pueden usarse por separado o en combinación, según sea apropiado, de acuerdo con las aplicaciones de la presente invención. Debe apreciarse que los valores numéricos se proporcionan a modo de ilustración y no de limitación. Típicamente, pero no necesariamente, cada valor mostrado es un ejemplo seleccionado de un intervalo de valores que está dentro del 20 % del valor mostrado. De manera similar, aunque determinadas etapas se describen con un alto nivel de especificidad, un experto en la técnica apreciará que pueden realizarse otras etapas, mutatis mutandis.

1. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, la generación de una suspensión unicelular de células derivadas de tejido (TDC) se realiza mediante el uso de uno o más de los siguientes protocolos:

Ejemplo 1.1: Extracción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

Recibir la bolsa de sangre y esterilizarla con alcohol al 70 %.

Cargar las células sanguíneas en un gradiente de Ficoll.

Centrifugar los tubos durante 20 minutos a 1050 g a temperatura ambiente (TA), sin freno.

Recolectar la mayor parte del plasma de la capa superior.

Recolectar la fracción de glóbulos blancos de cada tubo.

Transferir las células recolectadas a un tubo nuevo de 50 mL, ajustar el volumen a 30 mL por tubo mediante el uso de PBS.

Centrifugar los tubos durante 15 minutos a 580 g, TA, y desechar el sobrenadante.

Contar las células suspendidas, posiblemente en un hemocitómetro, evaluar las células viables mediante el uso de azul tripán.

Volver a suspender en medio de cultivo que comprende, por ejemplo, X-vivo 15 (TM) y Biotarget-1 (TM).

Ejemplo 1.2: Extracción de células del cordón umbilical

Tomar 10 cm de cordón umbilical.

Lavar bien con PBS estéril.

Identificar la vena grande del cordón, y cerrar un extremo de la vena mediante el uso de pinzas.

Lavar dos veces con 30 mL de PBS estéril.

Llenar la vena con colagenasa al 0,15 % (aproximadamente 5 mL de solución de colagenasa al 0,15 %).

Cerrar el segundo extremo de la vena mediante el uso de pinzas.

Incubar a 37 grados C durante 15 minutos.

Lavar el lado exterior del cordón con etanol al 70 %.

Desatar las pinzas de un extremo y recolectar la suspensión celular.

Centrifugar durante 10 minutos a 580 g, 21 grados C.

Volver a suspender en medio de cultivo que comprende, por ejemplo, X-vivo 15 (TM) y Biotarget-1 (TM), suero autólogo al 10 %, heparina 5 UI/ml, y uno o más factores de crecimiento.

Ejemplo 1.3: Extracción de células de la médula ósea

Obtener una aspiración de médula ósea en la sala de operaciones.

Suspender 1:4 en PBS estéril.

Cargar las células en un gradiente de Ficoll.

Recolectar la mayor parte de la capa superior.

Recolectar las células de la fracción de interfase.

Pasar la suspensión a través de una malla de 200 um (micrómetros).

2. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, el aislamiento de las células convenientes se realiza mediante el uso de uno o más de los siguientes protocolos:

Ejemplo 2.1: Aislamiento de Células Madre y Progenitoras Hematopoyéticas

Aislamiento de células madre y progenitoras hematopoyéticas mediante el uso de un kit comercial de selección positiva (tal como el "CD34 MultiSort Kit" de Miltenyi Biotec. 130-056-701; http://www.miltenyibiotec.com/download/datasheets/84/DS130-056-701 .pdf o alternativo).

Ejemplo 2.2: Enriquecimiento de Células Madre y Progenitoras Hematopoyéticas

Aislamiento de células madre y progenitoras hematopoyéticas mediante el uso de un kit comercial de selección negativa (tal como "Kit humano de Depleción de Células de Linaje" de Miltenyi Biotec. 130-092-211; http://www.miltenyibiotec.com/download/datasheets/724/DS130-092-211.pdf o alternativa).

Ejemplo 2.3: Enriquecimiento de Células Madre y Progenitoras No Hematopoyéticas

Aislamiento de células madre y progenitoras no hematopoyéticas mediante el uso de anticuerpos comerciales para la selección positiva tales como CD105, Stro-1 y CD271 ("Microperlas de CD105 humano" de Miltenyi Biotec. 130-051 201; http://www.miltenyibiotec.com/download/datasheets/65/DS130-051-201.pdf o alternativa).

Ejemplo 2.4: Aislamiento de Células Madre y Progenitoras

Aislamiento de células madre y progenitoras mediante el uso de una selección positiva basada en perlas magnéticas con un panel de anticuerpos que incluyen CD34, CD184 y CD254. El aislamiento se realiza mediante el uso de los procedimientos publicados para la selección negativa de poblaciones celulares.

Preparar una solución que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2, albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5 % y EDTA 2 mM. Mantener el tampón frío (2-8 grados C).

Contar las células suspendidas, posiblemente en un hemocitómetro; evaluar las células viables mediante el uso de azul tripán.

Centrifugar la suspensión celular 300 g 10 minutos, TA. Eliminar el sobrenadante completamente con pipeta.

Volver a suspender el sedimento celular en 300 ul (microlitros) de tampón.

Añadir 100 ul (microlitros) de bloqueador de FcR.

Añadir perlas magnéticas etiquetadas con anticuerpos contra CD34, CD184, y CD254.

Incubar 15 minutos a 4-8 grados C.

Lavar las células mediante la adición de 10 mL de tampón y centrifugar a 300 g durante 10 minutos, TA. Eliminar el sobrenadante completamente con pipeta.

Volver a suspender el sedimento celular en 500 ul (microlitros) de tampón.

Cargar las células en el tubo/columna de separación.

Eliminar con pipeta la fracción de células no unidas.

Separar el tubo/columna de separación del campo magnético

Volver a suspender el sedimento celular en el medio.

Las células están listas para usar.

Ejemplo 2.5: Aislamiento de células efectoras

Aislamiento de células CD8 positivas, TCR negativas mediante el uso de un procedimiento de selección negativa y positiva basado en perlas magnéticas. La depleción de las células positivas para TCR es seguido del aislamiento de las células CD8. El aislamiento se realiza mediante el uso de procedimientos publicados para la selección negativa y positiva de poblaciones celulares, de acuerdo con el siguiente protocolo (mostrado a modo de ilustración y no de limitación).

Protocolo:

a. Preparar una solución que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2, albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5 % y EDTA 2 mM. Mantener el tampón frío (2-8 grados C).

b. Contar las células suspendidas, posiblemente en un hemocitómetro, evaluar las células viables mediante el uso de azul tripán.

c. Centrifugar la suspensión celular 300 g 10 minutos, TA. Eliminar el sobrenadante completamente con pipeta. d. Volver a suspender el sedimento celular en 300 ul (microlitros) de tampón.

e. Añadir 100 ul (microlitros) de bloqueador de FcR.

f. Añadir perlas magnéticas etiquetadas con anticuerpos contra TCR alfa, TCR beta, TCR gamma, y TCR delta. g. Incubar 15 minutos a 4-8 grados C.

h. Lavar las células mediante la adición de 10 mL de tampón y centrifugar a 300 g durante 10 minutos, TA. Eliminar el sobrenadante completamente con pipeta.

i. Volver a suspender el sedimento celular en 500 ul (microlitros) de tampón.

j. Cargar las células en el tubo/columna de separación.

k. Recolectar la fracción de células no unidas.

l. Lavar las células mediante la adición de 10 mL de tampón y centrifugar a 300 g durante 10 minutos, TA. Eliminar el sobrenadante completamente con pipeta.

m. Contar las células suspendidas, posiblemente en un hemocitómetro, evaluar las células viables mediante el uso de azul tripán.

n. Centrifugar la suspensión celular 300 g 10 minutos, TA. Eliminar el sobrenadante completamente con pipeta. o. Volver a suspender el sedimento celular en 300 ul (microlitros) de tampón.

p. Añadir 100 ul (microlitros) de bloqueador de FcR.

q. Añadir perlas magnéticas etiquetadas con anticuerpos contra CD8.

r. Incubar 15 minutos a 4-8 grados C.

s. Lavar las células mediante la adición de 10 mL de tampón y centrifugar a 300 g durante 10 minutos, TA. Eliminar el sobrenadante completamente con pipeta.

t. Volver a suspender el sedimento celular en 500 ul (microlitros) de tampón.

u. Cargar las células en el tubo/columna de separación.

v. Eliminar con pipeta la fracción de células no unidas.

w. Separar el tubo/columna de separación del campo magnético.

x. Lavar las células mediante la adición de 10 mL de tampón y centrifugar a 300 g durante 10 minutos, TA. Eliminar el sobrenadante completamente con pipeta.

y. Contar las células suspendidas, posiblemente en un hemocitómetro, evaluar las células viables mediante el uso de azul tripán.

z. Volver a suspender el sedimento celular en el medio.

aa Las células están listas para usar.

Ejemplo 2.6: Aislamiento de Células Madre y Progenitoras

Aislamiento de células madre y progenitoras mediante selección negativa basada en perlas magnéticas con un panel de anticuerpos que incluye CD8, CD56 y CD20. El aislamiento se realiza mediante el uso de procedimientos publicados para la selección negativa de poblaciones celulares, de acuerdo con el siguiente protocolo (mostrado a modo de ilustración y no de limitación).

Protocolo:

e. Añadir 100 ul (microlitros) de bloqueador de FcR.

f. Añadir perlas magnéticas etiquetadas con anticuerpos específicos contra el marcador conveniente.

g. Incubar 15 minutos a 4-8 grados C.

i. Volver a suspender el sedimento celular en 500 ul (microlitros) de tampón.

j. Cargar las células en el tubo/columna de separación.

k. Recolectar la fracción de células no unidas.

n. Volver a suspender el sedimento celular en el medio.

o. Las células están listas para usar.

Para este ejemplo particular, los marcadores convenientes contra los cuales se aplican los anticuerpos en la etapa f, son CD20, CD8 y CD56.

3. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, el aislamiento y/o enriquecimiento de células presentadoras de antígeno (APC) y/o células dendríticas (DC) se realiza mediante el uso de uno o más de los siguientes protocolos:

Ejemplo 3.1: Aislamiento de DC inmaduras

Aislamiento de DC inmaduras basado en BCDA-3 (CD141) y BDCA-4 (CD304) mediante el uso de un kit comercial (tal como "Kit humano para Aislamiento de Células Dendríticas de la Sangre"; Miltenyi Biotec Cat. no. 130-091-379; http://www.miltenyibiotec.com/download/datasheets/295/DS130-091-379.pdf o alternativo).

Ejemplo 3.2: Enriquecimiento de DC

Enriquecimiento de DC basado en la depleción de células no DC mediante el uso de perlas magnéticas con un panel de anticuerpos que incluyen CD20, CD3, CD14, CD56, CD97 y CD235. El enriquecimiento se realiza mediante el uso de los procedimientos publicados para la selección negativa de poblaciones celulares, de acuerdo con el protocolo listado en el Ejemplo 2.6.

Para este ejemplo particular, los marcadores convenientes contra los cuales se aplican los anticuerpos en la etapa f, son CD20, CD3, CD14, CD56, CD97 y CD235.uuu

Ejemplo 3.3: Enriquecimiento de APC y DC

Enriquecimiento de DC basado en la adhesión a la superficie plástica

Volver a suspender el sedimento celular a una concentración de 2-20 millones/mL en PBS (o medio sin suero). Hacer flotar en la superficie de plástico de una placa de Petri con 5 mL de células suspendidas.

Incubar durante 2 horas a 37 grados C.

Aspirar las células no adherentes y eliminar el sobrenadante completamente.

Añadir 5 mL de PBS frío y recolectar las células adherentes mediante un raspado suave.

Volver a suspender el sedimento celular en el medio.

Las células están listas para usar.

Ejemplo 3.4: Aislamiento de DC inmaduras

Enriquecimiento de DC basado en la selección positiva de células DC mediante el uso de perlas magnéticas con al menos uno de los siguientes anticuerpos: CD1a, CD1c, CD11c, CD141, CD304, CD303, CDw123, CD172b, CD180, CD141, CD206, CD208, CD209, CD218, CD258, CD301, CD80, y CD86. El aislamiento se realiza mediante el uso de procedimientos publicados para la selección positiva de poblaciones celulares, de acuerdo con el siguiente protocolo (mostrado a modo de ilustración y no de limitación).

Protocolo:

e. Añadir 100 ul (microlitros) de bloqueador de FcR.

g. Incubar 15 minutos a 4-8 grados C.

i. Volver a suspender el sedimento celular en 500 ul (microlitros) de tampón.

j. Cargar las células en el tubo/columna de separación.

k. Recolectar la fracción celular no unida (selección negativa).

l. Recolectar células de selección positivas: Retirar la columna del separador y colocarla en el tubo de DC. m. Añadir rápidamente 5 mL de medio (tal como, por ejemplo, X-VIVO15 IL-10), sacar todas las células de la columna mediante el uso del émbolo de jeringa.

n. Lavar las células mediante la adición de 10 mL de tampón y centrifugar a 300 g durante 10 minutos, TA. Eliminar el sobrenadante completamente con pipeta.

o. Contar las células suspendidas, posiblemente en un hemocitómetro, evaluar las células viables mediante el uso de azul tripán.

p. Volver a suspender el sedimento celular en el medio.

q. Las células están listas para usar.

Para este ejemplo particular, los marcadores convenientes contra los cuales se aplican los anticuerpos en la etapa f, son CD20, CD3, CD14, CD56, CD97 y CD235.

Ejemplo 3.5: Aislamiento de DC plasmacitoide inmaduras

Aislamiento de DC mediante el uso de un kit comercial (tal como "Kit de aislamiento de células dendríticas plasmacitoide humano" de Miltenyi Biotec. 130-092-207; http://www.miltenyibiotec.com/download/datasheets/619/DS130-092-207.pdf o alternativo).

Ejemplo 3.6: Aislamiento de DC mieloide inmadura

Aislamiento de DC mieloides inmaduras mediante el uso de un kit comercial (tal como "CD1c (BDCA-1)+ Kit de aislamiento de células dendríticas humanas" de Miltenyi Biotec. 130-090-506; http://www.miltenyibiotec.com/download/datasheets/150/DS130-090-506.pdf o alternativo).

4. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, el recubrimiento de la superficie del cultivo de tejidos se realiza mediante el uso de uno o más de los siguientes protocolos:

Ejemplo 4.1j. Recubrimiento de una placa de Petri con 25 ug (microgramos)/mL de fibronectina

Preparar hasta siete días antes, o el día de la preparación celular.

Preparar 50 mL de solución de fibronectina de 25 ug (microgramos)/mL en PBS.

Llenar cada placa con 0,5-2,5 mL de fibronectina 25 ug (microgramos)/mL.

Incubar a 37 grados C durante al menos 30 minutos.

Recolectar la solución de fibronectina.

Lavar la placa de Petri dos veces en PBS.

Secar la placa de Petri.

Mantener los frascos secos a temperatura ambiente.

Los frascos secos pueden guardarse durante una semana a temperatura ambiente (TA).

Ejemplo 4.2: Recubrimiento de frascos T75 con 20 ng por mL de IL-3

Preparar 20 mL de solución de IL-3 a 20 ng por mL en PBS.

Llenar cada frasco con 2-5 mL de solución de IL-3.

Incubar a 37 grados C durante 0,5 horas.

Recolectar la solución.

Lavar el frasco dos veces en 10 mL de PBS.

Mantener los frascos secos a temperatura ambiente hasta su uso.

Ejemplo 4.3: Recubrimiento de placas de Petri con IL-320 ng por mL e IGF 20 ng por mL

Preparar 20 mL de solución de IL-3 a 20 ng por mL e IGF a 20 ng por mL en PBS.

Llenar cada placa de Petri con 0,5-2,5 mL de solución de IL-3 e IGF.

Incubar a 37 grados C durante 0,5 horas.

Recolectar la solución.

Lavar el frasco dos veces en 10 mL de PBS.

Mantener los frascos secos a temperatura ambiente hasta su uso.

5. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, la preparación de suero se realiza mediante el uso del siguiente protocolo:

El suero puede obtenerse directamente o prepararse a partir de plasma.

Ejemplo 5.1: Preparación de suero a partir de plasma humano:

Tomar 100 mL de sangre sin diluir.

Centrifugar a 1100 g (2500 rpm) durante 10 minutos.

Transferir la capa superior (plasma) a un tubo nuevo de 50 mL.

Añadir 25-75 ul (microlitro) de CaCl2-2H2O 0,8-0,24 M por cada 1 mL de plasma.

Incubar durante 0,5-3 horas a 37 grados C.

Centrifugar el plasma coagulado durante 5 minutos a 2500 g.

Recolectar el suero en un tubo nuevo, evitar que se coagule.

Hacer alícuotas del suero recolectado y guardarlas a -20 grados C hasta su uso.

6. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, la preparación del medio se realiza mediante el uso de uno o más de los siguientes protocolos:

El medio debe contener, típicamente, 1-20 % de suero autólogo y/o 1-20 % de medio acondicionado.

Ejemplo 6.1: Aditivos de medios para la generación, activación, y expansión de células madre/progenitoras adultas multipotentes MASPC

El medio puede contener uno o más aditivos, tales como LIF, EPO, TPO, IGF, insulina, IL-10, IL-3, IL-4, Alfa-1 Antitripsina, Flt3-L, b-FGF, M-CSF, GM-CSF, TGF beta, TNF alfa, VEGF, estrógeno, progesterona, prostaglandina, cortisona, cortisol, dexametasona, o cualquier otra molécula de la familia de los esteroides, prolactina, una hormona adrenocorticoide, ACTH, glutamato, Ckit-L, CpG ODN, NO, Heparina, insulina, IFN alfa, IFN beta, o cualquier otro agente inmunorregulador, PDGF, trombina, y/o Rosiglitazona en diversas concentraciones, que oscilan, típicamente, entre aproximadamente 100 pg/mL y aproximadamente 100 ug (microgramos)/mL (o equivalentes molares).

Ejemplo 6.2: Aditivos de medios para la generación de precursores/progenitores específicos de linaje (LSP) El medio puede contener uno o más aditivos, tales como LIF, EPO, IGF, b-FGF, M-CSF, GM-CSF, TGF alfa (TGFa), TGF beta (TGFp), VEGF, BHA, BDNF, NGF, EGF, NT3, NT4/5, GDNF, S-100, CNTF, NGF3, CFN, ADMIF, estrógeno, progesterona, prostaglandina, cortisona, cortisol, dexametasona, o cualquier otra molécula de la familia de los esteroides, prolactina, una hormona adrenocorticoide, ACTH, glutamato, serotonina, acetilcolina, NO, ácido retinoico (RA) o cualquier otro derivado de la vitamina D, Alfa-1 Antitripsina, Heparina, insulina, forskolina, Simvastatina, MCDB-201, MCT-165, acetato de glatiramer, IFN alfa, IFN beta o cualquier otro agente inmunorregulador, selenito de sodio, ácido linoleico, ácido ascórbico, transferrina, 5-azacitidina, PDGF, VEGF, cardiotrofina y trombinanor Rosiglitazona en diversas concentraciones, que oscilan, típicamente, entre aproximadamente 10 pg/mL y aproximadamente 100 ug/mL (o equivalentes molares).

Típicamente, el medio no debe usarse más de 10 días a partir de su fecha de preparación.

Ejemplo 6.3: Medio de crecimiento para el mejoramiento de DCP

Medio sin suero (por ejemplo, X-vivo 15 (TM) y Biotarget-1 (TM))

Heparina 5-25 UI/mL

Insulina 2,5-25 ng/mL

IL-102,5-50 ng/mL

IL-35-20 ng/mL

IGF 10-100 ng/mL

b-FGF 5-50 ng/mL

Para algunos de los experimentos descritos en la presente descripción, los medios se prepararon mediante el uso de combinaciones de dos o más de los componentes enumerados en este ejemplo.

Ejemplo 6.4: Medio de crecimiento para el mejoramiento de DCP

Medio sin suero (por ejemplo, X-vivo 15 (TM) y Biotarget-1 (TM))

suero autólogo 1-10 %

Heparina 5-25 UI/mL

IL-102,5-50 ng/mL

IL-4 100-1000 UI/mL

GM-CSF 50-250 ng/mL

VEGF 0,5-20 ng/mL

b-FGF 2,5-50 ng/mL

Ejemplo 6.5: Medio de crecimiento para el mejoramiento de DCP

Medio sin suero (por ejemplo, X-vivo 15 (TM) y Biotarget-1 (TM))

suero autólogo 1-10 %

Heparina 5-25 UI/mL

IL-4 100-1000 UI/mL

GM-CSF 50-250 ng/mL

TGF beta 10-100 ng/mL

TNF alfa 10-100 ng/mL

VEGF 2-20 ng/mL

b-FGF 5-50 ng/mL

Ejemplo 6.6: Medio de crecimiento para el mejoramiento de DCP

Medio sin suero (por ejemplo, X-vivo 15 (TM) y Biotarget-1 (TM))

suero autólogo 1-10 %

Heparina 5-25 UI/mL

IL-4 100-1000 UI/mL

Alfa-1 Antitripsina 250-1000 ng/mL,

TGF beta 10-100 ng/mL

TNF alfa 10-100 ng/mL

Ejemplo 6.7: Medio de crecimiento para el mejoramiento de MASPC

Medio sin suero (por ejemplo, X-vivo 15 (TM) y Biotarget-1 (TM))

suero autólogo 1-10 %

Heparina 5 UI/mL

IL-1050-250 ng/mL

Insulina 50-250 ng/mL

IGF 10-100 ng/mL

Flt3-L 10-100 ng/mL

b-FGF 5-50 ng/mL

Ejemplo 6.8: Medio de crecimiento para el mejoramiento de MASPC

Medio sin suero (por ejemplo, X-vivo 15 (TM) y Biotarget-1 (TM))

suero autólogo 5-20 %

Heparina 5-25 UI/mL

IL-1050-250 ng/mL

IL-450-250 UI/mL

Insulina 250-1000 ng/mL

IGF 10-100 ng/mL

TNF alfa 10-100 ng/mL

Ejemplo 6.9: Medio de crecimiento para el mejoramiento de LSP-EPC

Medio sin suero (por ejemplo, X-vivo 15 (TM) y Biotarget-1 (TM))

suero autólogo 5-20 %

Heparina 5-25 UI/mL

IL-1050-250 ng/mL

IL-450-250 UI/mL

Insulina 50-250 ng/mL

IGF 10-100 ng/mL

b-FGF 10-100 ng/mL

VEGF 2-20 ng/mL

Ejemplo 6.10: Medio de crecimiento el mejoramiento de los precursores celulares potenciadores de la tolerancia a LSP (TECP)

Medio sin suero (por ejemplo, X-vivo 15 (TM) y Biotarget-1 (TM))

suero autólogo 5-20 %

Heparina 5-25 UI/mL

TGF beta 10-100 ng/mL

IL-1050-250 ng/mL

b-FGF 10-100 ng/mL

VEGF 2-20 ng/mL

Ejemplo 6.11: Medio de crecimiento para el mejoramiento de los precursores de células LSP anticancerosas (aCCP) Medio sin suero (por ejemplo, X-vivo 15 (TM) y Biotarget-1 (TM))

suero autólogo 5-20 %

Heparina 5-25 UI/mL

IL-450-250 UI/mL

b-FGF 10-100 ng/mL

VEGF 2-20 ng/mL

SCP-1 5-50 ug(microgramos)/mL (o antígenos asociados a tumor alternativos)

Ejemplo 6.12: Medio de crecimiento para el mejoramiento de los precursores de células LSP anticancerosas (aCCP) Medio sin suero (por ejemplo, X-vivo 15 (TM) y Biotarget-1 (TM))

suero autólogo 1-20 %

Heparina 5-25 UI/mL

IL-120,5-50 ng/mL

IL-182,5-50 ng/mL

IL-275-100 ng/mL

SCP-1 5-50 ug(microgramos)/mL (o antígenos asociados a tumor alternativos)

Ejemplo 6.13: Medio de crecimiento para el mejoramiento de precursores de células LSP que mejoran el injerto (ECP) Medio sin suero (por ejemplo, X-vivo 15 (TM) y Biotarget-1 (TM))

suero autólogo 5-20 %

Heparina 5-25 UI/mL

IL-10 10-250 ng/mL

TGF beta 10-100 ng/mL

b-FGF 2-20 ng/mL

Ejemplo 6.14: Medio de crecimiento para el mejoramiento de precursores de células neuronales (NCP)

Medio sin suero (por ejemplo, X-vivo 15 (TM) y Biotarget-1 (TM))

suero autólogo 10 %

Heparina 5-25 UI/mL

b-FGF 20 ng/mL

NGF 50 ng/mL

BDNF 25 ng/mL

IL-10 10-250 ng/mL

TGF beta 10-100 ng/mL

IGF 10-100 ng/mL

Insulina 1-20 ug (microgramos)/mL

Ejemplo 6.15: Medio de crecimiento para el mejoramiento de precursores de células musculares (MCP)

Medio sin suero (por ejemplo, X-vivo 15 ™ )

suero autólogo 10 %

b-FGF 20 ng/mL

IFN beta 20 ng/mL

Heparina 5-25 UI/mL

MCDB-201 10 %

H²O²1-4 %

Insulina 2 ug (microgramos)/mL

Transferrina 2-20 ug (microgramos)/mL

Selenito de Sodio 10-50 ng/mL

Dexametasona 1-50 nM

Ácido linoleico 0,4-10 ug (microgramos)/mL

Ácido ascórbico 0,1 mM

7. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, la preparación del medio acondicionado se realizó mediante el uso del siguiente procedimiento:

Ejemplo 7.1: Preparación de 100 mL de medio de cultivo enriquecido que contiene 1-20 % de medio acondicionado autólogo.

Descongelar 10 mL de medio acondicionado en una incubadora.

Cuando esté descongelado, añadirlo al medio de cultivo mediante el uso de una pipeta.

8. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, el cultivo de células para producir una DCP y/o MASPC activada se realiza mediante el uso de uno o más de los siguientes procedimientos:

Ejemplo 8.1: Incubación de DCP

Incubar APC y/o DC inmaduras a una concentración de 0,5-10 millones por mL durante 2-24 horas a 37 grados C, CO2 5 %.

Recolectar todo el medio acondicionado en tubos.

Centrifugar a 300 g durante 10 minutos, a temperatura ambiente.

Conservar el medio acondicionado en recipientes nuevos estériles.

Ejemplo 8.2: Incubación de células en condiciones hipóxicas

Para algunas aplicaciones, puede obtenerse una mayor expansión y/o activación mediante la exposición del cultivo celular a la falta de oxígeno, por ejemplo, 0,1-5 % o 5-15 % de oxígeno (hipoxia), durante 2-12 horas o 12-96 horas. Esto se hace, típicamente, una o más veces, en diferentes puntos durante el cultivo celular.

Incubar las células inmaduras a una concentración de 1-10 millones por mL en una incubadora que controla el oxígeno. Fijar la presión de oxígeno al 0,1 %, y mantener en este nivel durante 48 horas.

Retirar las células de la incubadora y examinar la viabilidad del cultivo mediante el uso de azul tripán.

Establecer la presión de oxígeno de la incubadora a 20 %.

Volver a insertar las células en la incubadora y continuar la incubación durante el resto del período. Este procedimiento puede repetirse, por ejemplo, durante el período de cultivo y/o dentro de las 24, 48 o 72 horas antes de la terminación del cultivo.

Ejemplo 8.3: Incubación de DCP en condiciones hipóxicas

Incubar APC y DC inmaduras a una concentración de 0,5-10 millones de células por mL durante 4-10 días en una incubadora que controla el oxígeno.

Los días 1,4 y 8 aplicar la condición hipóxica mediante el ajuste de la presión de oxígeno a 0,1 % y mantener en este nivel durante 24 horas.

Establecer la presión de oxígeno de la incubadora a 20 %.

Volver a insertar las células en la incubadora y continuar la incubación durante el resto del período.

Ejemplo 8.4: Recolección de células adherentes, y/o desprendidas, y/o flotantes

Para algunas aplicaciones, puede lograrse una mayor expansión y diferenciación de las células volviendo a sembrar las células recolectadas en placas nuevas revestidas previamente en medio de cultivo.

Recolectar todo el medio acondicionado y las células flotantes en tubos.

Centrifugar a 300 g durante 10 minutos, a temperatura ambiente.

Conservar el medio acondicionado en recipientes nuevos estériles.

Añadir las células a todas las otras células recolectadas de la placa de cultivo.

Lavar cuidadosamente la superficie de las placas de cultivo de tejidos mediante el uso de pipeta con PBS frío para desprender las células adherentes.

Recolectar las células lavadas y añadirlas a los tubos.

Añadir 5 mL de PBS frío.

Desprender las células adherentes restantes mediante el uso de movimientos suaves con un raspador de células. Recolectar las células desprendidas y añadirlas a los tubos.

Opcionalmente, añadir 5 mL de EDTA a cada frasco e incubar a 37 grados C durante 5 minutos.

Recolectar las células desprendidas y añadirlas a los tubos. Centrifugar los tubos durante 5 minutos a 450 g, TA. Desechar completamente el sobrenadante.

Volver a suspender los sedimentos celulares en medio fresco.

Continuar el cultivo de las células y realizar todas las demás actividades (por ejemplo, cambio del medio, inspección visual, y/o citometría de flujo), según corresponda, como se describe en la presente descripción.

Este procedimiento puede realizarse semanalmente durante el período de cultivo y/o dentro de las 24, 48, o 72 horas antes de terminar el cultivo.

Ejemplo 8.5: Cultivo conjunto de DCP y células madre/progenitoras con células madre/progenitoras multipotentes (Ma SPC) para generar MASPC activadas.

Para la mayoría de las aplicaciones, puede lograrse una mayor expansión y diferenciación de MASPC mediante el cultivo conjunto de DCP y células madre/progenitoras como se describe más abajo en la presente descripción: Contar las células DCP recolectadas y las células madre/progenitoras aisladas posiblemente en un hemocitómetro, evaluar las células viables mediante el uso de azul tripán.

Mezclar DCP y MASPC en relaciones que típicamente oscilan entre 1:5 a 1:50, por ejemplo, añadir 1 millón de células DCP a 10 millones de MASPC aisladas.

Incubar las células de la población de células mixta a una concentración de 1,5 a 10 millones de células por mL. Continuar el cultivo y/o la cosecha según corresponda, de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente descripción.

Recolectar el medio acondicionado en tubos de 0,5 mL, 5 mL, 15 mL o tubos de 50 mL.

Centrifugar el medio acondicionado recolectado a 450 g durante 10 minutos, a temperatura ambiente.

Conservar el medio acondicionado en recipientes nuevos estériles.

Ejemplo 8.6: Cultivo conjunto de MASPC y TDC activadas para generar LSP

De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, el cultivo de células para producir una LSP se realiza mediante el uso de uno o más de los siguientes procedimientos:

Mezclar la suspensión de células individuales de TDC preparada de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente descripción con MASPC en relaciones que, típicamente, oscilan entre 1:2 y 1:50, por ejemplo, añadir 1 millón de células MASPC a 5 millones de TDC.

Continuar el cultivo y/o la cosecha según corresponda, de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente descripción.

9. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, la extracción de piezas de tejido para cultivo conjunto se realiza mediante el uso de uno o más de los siguientes procedimientos:

Ejemplo 9.1: Extracción de piezas de tejido para cultivo conjunto

Disección de vasos sanguíneos autólogos (también pueden usarse otros tejidos humanos o no humanos):

Anestesiar la pierna de la que se tomarán muestras de los vasos sanguíneos, mediante el uso de reactivos anestésicos.

Mediante el uso de tijeras esterilizadas, cortar la piel y exponer la dermis interna.

Con un segundo juego de tijeras esterilizadas, cortar la dermis y exponer los vasos sanguíneos.

Cortar trozos pequeños, de 0,2-1 cm de largo, de los vasos sanguíneos, y colocarlos en un recipiente precargado con 50 mL de medio de crecimiento de cultivo frío (tal como X-vivo 15).

Mediante el uso de unas pinzas y unas tijeras, limpiar las secciones de tejido.

Mediante el uso de fórceps y bisturí, cortar cada vaso sanguíneo a lo largo de su longitud y exponer la capa interna de células endoteliales.

Mediante el uso de unas pinzas y un bisturí, cortar pequeñas piezas de hasta 0,1 cmA2 del tejido.

Debe entenderse que, si bien esta técnica está de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, el alcance de la presente invención también incluye extraer un vaso sanguíneo del paciente. Por ejemplo, puede hacerse una incisión sobre la vena safena para facilitar la disección de una porción distal de 1 cm de la vena. Las venas tributarias de esta se unen y se seccionan. Se atan los extremos distales y proximales de la porción de 1 cm de la vena safena y se extrae la vena.

Usar el tejido disecado para el cultivo conjunto directo y/o indirecto con células y/o para generar medio acondicionado. Ejemplo 9.2j. Recuperación de antígeno/epítopo a partir de tejido diana embebido en parafina

La recuperación de antígeno/epítopo a partir de tejido diana embebido en parafina se realiza mediante el uso de métodos publicados o comerciales (tal como se describe en http://www.abcam.com/ps/pdfprotocols/ihc_p.pdf o alternativo).

Ejemplo 9.3: Generación de medio acondicionado

Colocar las piezas disecadas en recipientes de cultivo, por ejemplo, en placas de Petri, o tubos de 50 mL.

Opcionalmente, llenar con medio de cultivo celular que contenga 0,1-3 ug (microgramos)/mL o 3-100 ug (microgramos)/mL de reactivo apoptótico (tal como valinomicina, etopósido o estaurosporina), hasta que todas las piezas estén cubiertas.

Cambiar el medio de cultivo cada 2-4 días.

Recolectar este medio en tubos de 0,5 mL, 5 mL, 15 mL o 50 mL.

Recolectar el medio acondicionado en recipientes estériles nuevos.

Ejemplo 9.4: Generación de medio acondicionado

El medio acondicionado se prepara como parte de la etapa de cultivo (por ejemplo, cultivo de células de una lista de DCP, TDC, MASPC o cultivo conjunto de estas).

En cualquier etapa durante y al final del período de cultivo, se recolecta el medio acondicionado.

Recolectar este medio en tubos de 15 mL o tubos de 50 mL.

Recolectar el medio acondicionado en recipientes estériles nuevos.

10. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, el cultivo conjunto de piezas de tejido o medio acondicionado con DCP para activar específicamente la DCP se realiza mediante el uso de uno o más de los siguientes protocolos:

Ejemplo 10.1: Cultivo conjunto directo de piezas de tejido con DCP en placa de Petri.

Colocar las piezas disecadas en recipientes de cultivo, por ejemplo, en una placa de Petri.

Centrifugar la suspensión de DCP cosechada durante 15 minutos a 450 g, 21 grados C, eliminar el sobrenadante con pipeta.

Mezclar el sedimento celular suavemente y volver a suspender las células.

Volver a suspender el sedimento a 0,5-10 millones de células por mL.

Llenar la placa de Petri con 3 mL de medio enriquecido y añadir la suspensión de DCP.

Incubar a 37 grados C, CO25 % durante 2-24 horas.

Recolectar en tubos el medio de cultivo que contenga células DCP activadas flotantes.

Lavar cuidadosamente la superficie de la placa de cultivo mediante el uso de pipeta con PBS frío para separar las células adherentes.

Recolectar las células lavadas en los tubos.

Centrifugar los tubos durante 5 minutos a 450 g, temperatura ambiente.

Volver a suspender los sedimentos en medio de cultivo.

Ejemplo 10.2: Cultivo conjunto directo de piezas de tejido con DCP y MASPC en placa de Petri.

Mezclar el sedimento celular suavemente y volver a suspender las células.

Volver a suspender el sedimento a 0,5-10 millones de células por ml.

Incubar a 37 grados C, CO25 % durante 2-48 horas.

Recolectar las células lavadas en los tubos.

Centrifugar los tubos durante 5 minutos a 450 g, temperatura ambiente.

Volver a suspender los sedimentos en medio de cultivo fresco sin agentes apoptóticos.

Añadir MASPC al medio.

Añadir células a una concentración de 0,5 a 10 millones de células por mL.

Ejemplo 10.3: Cultivo de células en presencia de medio acondicionado derivado de un cultivo de vasos sanguíneos. Centrifugar las células durante 15 minutos a 500 g, 21 grados C.

Desechar el sobrenadante.

Mezclar el sedimento celular suavemente y volver a suspender las células a 5-50 millones/mL en medio autólogo que contenga suero autólogo al 1-20 % y/o medio acondicionado al 1-20 %.

Sembrar las células a una concentración de 1-10 millones de células por mL.

Incubar los frascos a 37 grados C, CO25 %.

Después de los primeros tres días de cultivo, las células no adherentes pueden eliminarse del cultivo.

Ejemplo 10.4: Cultivo conjunto directo de vasos sanguíneos autólogos disecados y células MASPC.

Colocar las piezas de tejido disecados en placas de cultivo.

Añadir MASPC y TDC al cultivo.

Cada 2-4 días, el medio acondicionado puede recolectarse y conservarse de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente descripción.

Cambiar el medio de cultivo con el medio de cultivo apropiado preparado de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente descripción.

Con unas pinzas, retirar los trozos de tejido después de 2-4 días de cultivo conjunto.

Continuar el cultivo y la cosecha según corresponda, de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente descripción.

11. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, los cambios del medio en cultivos en crecimiento en curso se realizan mediante el uso del siguiente protocolo:

El cambio del medio en cultivos en crecimiento en curso debe realizarse cada 2-4 días.

Ejemplo 11.1: Cambio del medio de crecimiento en cultivos.

Recolectar el medio que contenga células no adherentes en tubos de 0,5 mL, 5 mL y 50 mL.

Llenar cada placa de cultivo con medio de cultivo fresco enriquecido con medio acondicionado. Típicamente, para un frasco T75, llenar 10 mL de medio de crecimiento fresco.

Centrifugar los tubos durante 10 minutos a 450 g, TA; eliminar el sobrenadante completamente con pipeta.

Mezclar el sedimento celular suavemente y volver a suspender las células en 10 mL de medio de crecimiento fresco enriquecido con medio de acondicionamiento.

Retornar la suspensión celular a la placa de cultivo.

12. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, la recolección del producto celular se realiza mediante el uso del siguiente protocolo:

Ejemplo 12.1: Cosecha de LSP

Recolectar el medio de cultivo que contiene células flotantes en tubos.

Lavar cuidadosamente la superficie del frasco mediante el uso de pipeta con PBS frío para desprender las células adherentes.

Recolectar las células lavadas en los tubos.

Añadir 5 mL de PBS frío.

Recolectar las células desprendidas y añadirlas a los tubos

Centrifugar los tubos durante 5 minutos a 450 g, temperatura ambiente.

Volver a suspender los sedimentos celulares en 2-5 mL de PBS.

13. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, la conservación celular se realiza mediante el uso de uno o más de los siguientes protocolos:

El producto celular puede mantenerse en medio de conservación o congelar en tampón de congelación hasta su uso para trasplante en un paciente y/o para diagnóstico y/o investigación. Para algunas aplicaciones, los productos celulares se congelan en un coágulo blanco.

Ejemplo 13.1: Criopreservación de células (DC y/o MASPC y/o LSP)

Preparar un tampón de congelación libre de suero que contenga DMSO al 10 %, como medio de congelación de células sin suero para la criopreservación de células de mamíferos (05-065-1, Biological Industries, Israel) o una alternativa.

No conservar las células si la viabilidad es inferior al 70 %.

Suspender el producto celular en tampón de congelación y congelar a -80 °C o en nitrógeno líquido.

Ejemplo 13.2: Criopreservación de células (DC yo MASPC y/o LSP)

Preparar tampón de congelación que contenga suero autólogo humano al 90 % y DMSO al 10 %.

No conservar las células si la viabilidad es inferior al 70 %.

Ejemplo 13.3: Conservación de producto celular durante un período corto

Preparar el medio de conservación, que incluye el medio de crecimiento, que contenga entre 1-20 % de suero autólogo, con pocos o ningún otro aditivo.

No conservar las células si la viabilidad es inferior al 70 %.

Mantener el medio de conservación con producto celular a 2-12 grados C.

14. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, la recolección y conservación del medio acondicionado se realiza mediante el uso del siguiente protocolo:

El medio acondicionado puede conservarse hasta su uso para la preparación del medio de crecimiento o para la aplicación terapéutica.

El medio acondicionado debe recolectarse en condiciones estériles.

Centrifugar el medio acondicionado recolectado durante 10 minutos a 450 g, 21 grados C.

Recolectar el sobrenadante en recipientes estériles nuevos.

Filtrar el sobrenadante a través de una membrana de 22 um (micrómetros).

Hacer alícuotas de medio acondicionado en tubos estériles de 0,5-10 mL y/o tubos estériles de 50 mL, marcados previamente con los detalles del donante.

Mantener a (-20) -(-80) grados C hasta su uso.

15. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, la tinción para FACS se realiza mediante el uso del siguiente protocolo:

El protocolo de tinción celular para el análisis por FACS puede realizarse mediante el uso de protocolos comunes tales como los "protocolos de tinción para FACS" I y II (http://users.path.ox.ac.uk/~scobbold/tig/facsprot.html)

Ejemplo 15.1: Tinción de población Endotelial enriquecida con LSP.

Protocolo de tinción para FACS con anticuerpos contra:

16. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, la tinción por inmunohistoquímica (IHC) se realiza mediante el uso del siguiente protocolo:

El protocolo de tinción celular para IHC y/o análisis de inmunofluorescencia puede realizarse mediante el uso de protocolos comunes tales como "Protocolo de doble tinción de inmunofluorescencia - Enfoque paralelo" (http://www.ihcworld.com/_protocols/general_IHC/immunofl_double_parallel.htm)

Ejemplo 16.1: Protocolo de tinción IHC para LSP Endotelial

17. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, se realiza un ensayo de formación de tubos mediante el uso del siguiente protocolo:

La formación de tubos se evaluó mediante el uso del kit de ensayo de angiogénesis in vitro ECM625 (Chemicon).

El patrón angiogénico y la formación de tubos vasculares se puntuaron numéricamente como describen Porat Y. y otros, 2006 (Br J Haematol. 2006; 135:703-714).

18. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, la secreción de citocinas de las células recolectadas se evalúa mediante el uso del siguiente protocolo de ensayo de inanición:

Cultivar 0,5-1 millón de células por mL durante la noche en placas de 24 pocillos en medio sin suero (por ejemplo, X-vivo 15).

Recolectar el sobrenadante del ensayo de inanición (SAS) y centrifugar a 450 g durante 5 minutos.

Transferir el sobrenadante a un tubo Eppendorf y congelar a -80 grados C hasta que esté listo para evaluar la secreción de citocinas.

Ejemplo 18.1: Matriz de anticuerpos de citocina

La detección de un panel de citocinas secretadas se realiza mediante el uso de kits comercialmente semicuantitativos tales como RayBio® "Matriz 1 de Anticuerpos Humanos de Angiogenesis" (Cat# AAH-ANG-1; http://www.raybiotech.com/manual/human_manual.pdf) and/or RayBio® "Matriz 1 Anticuerpos de Factores de Crecimiento Humano" (Cat# AAH-GF-1) y/o Milliplex Inmunoensayo Citocina Humana /Quimiocina (Cat.# MPXHCYTO-60K-07; http://www.millipore.com/catalogue/item/mpxhcyto-60k). De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, la capacidad de DCP de fagocitosis y presentación de antígenos se evalúa mediante el uso del siguiente protocolo:

La detección semicuantitativa de la fagocitosis de partículas teñidas se realiza mediante un procedimiento comercial tal como el "Ensayo de Fagocitosis de 96-Pocillos CytoSelect™" (Cell Biolabs cat. CBA-224; http://www.ceNbiolabs.com/send.php?mainID=661)

19. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, la capacidad de las células madre y progenitoras para formar colonias de células se evalúa mediante el uso del siguiente protocolo:

La detección de un panel de tipos de colonias se realiza mediante el uso de un procedimiento comercial tal como "Procedimiento para el Ensayo de Células Formadoras de Colonias Humanas (CFC) Mediante el Uso de Medios basados en Metilcelulosa" (R&D system Inc. Cat. # HSC001, HSC002, HSC003, HSC004 and HSC005; http://www.mdsystems.com/DAM_public/5664.pdf).

20. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, la capacidad de migración de las células madre y progenitoras se evalúa mediante el uso del siguiente protocolo:

La detección cuantitativa de células migratorias se realiza mediante un procedimiento comercial tal como "Un ensayo cuantitativo de migración celular mediante el uso de insertos de cultivo celular ThinCert™" (Greiner Bio-One; http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/ThinCert/492en_Protocol_Migration_Assay.pdf).

21. De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, la capacidad de injerto de células madre y progenitoras en un tejido se evalúa mediante el uso del siguiente protocolo:

La detección de metaloproteinasas-9 (MMP-9) se realiza mediante el uso de un procedimiento comercial tal como "Kit de ensayo SensoLyte Plus™ 520 MMP-9 *Selectividad mejorada y Fluorimétrica*" (AnaSpec, Inc; http://www.anaspec.com/pdfs/72017.pdf).

Ensayo de reacción de linfocitos citotóxicos (CTL)

De acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención, se realiza un ensayo de reacción de linfocitos citotóxicos (CTL) mediante el uso del siguiente protocolo (típicamente, el CTL se realiza para evaluar la reacción citotóxica de la LSP-aCCP):

Etapa 1: preparación de las células diana para el direccionamiento por LSP-aCCP en el CTL

Recolectar las células diana (K562 (línea celular) o PBMC de un donante no relacionado o cualquier otra célula) del frasco en un tubo de 50 mL.

Lavar el frasco con 5-10 mL de PBS y añadir al tubo de 50 mL.

Centrifugar las células 7 minutos, 300 g, 21 grados C, acelerar 9, frenar 5.

Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente el sedimento celular.

Añadir 10 mL de PBS mediante el lavado del tubo y resuspender suavemente las células (posiblemente mediante pipeteo).

Centrifugar las células 7 minutos, 300 g, 21 grados C, acelerar 9, frenar 5.

Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente el sedimento celular.

Añadir 3-5 mL de PBS (según el tamaño del sedimento celular).

Tomar muestras de células para contar en azul tripán.

Calcular el volumen de 3 millones de células diana.

Transferir 3 millones de células diana a un tubo de 15 mL.

Centrifugar las células 7 minutos 300 g, 21 grados C, acelerar 9, frenar 5.

Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente el sedimento celular.

Añadir 1 mL de PBS.

Resuspender las células suavemente volviendo a pipetear. Evitar generar burbujas.

Preparar una dilución intermedia fresca de CFSE 50 uM (microMolar) {1:100 de la reserva de 5 mM (cat#65-0850-84 -eBioscience, conservada a -20 grados C)}.

Añadir 5 ul de CFSE diluido a las células (concentración final 0,25 uM).

Incubar los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz.

Después de la incubación, añadir 3 mL de medio CTL (RPMI FCS al 15 %) por 3 millones de células.

(Nota: se necesita suero para detener la reacción de unión a CFSE; use al menos 10 % de suero en el medio CTL). Centrifugar las células 7 minutos 300 g, 21 grados C, acelerar 9, frenar 5.

Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente el sedimento celular.

Añadir 2-3 mL de medio CTL para el lavado del tubo y resuspender suavemente las células (posiblemente por pipeteo). Centrifugar las células 7 minutos 300 g, 21 grados C, acelerar 9, frenar 5.

Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente el sedimento celular.

Añadir 2-3 mL de medio CTL para el lavado del tubo y resuspender suavemente las células (posiblemente por pipeteo). Incubar las células en un tubo sin tapa a 37 grados C en CO2 durante 30-60 minutos.

Centrifugar las células 7 minutos 300 g, 21 grados C, acelerar 9, frenar 5.

Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente el sedimento celular.

Añadir 2 mL de PBS.

Centrifugar las células 7 minutos 300 g, 21 grados C, acelerar 9, frenar 5.

Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente el sedimento celular.

Calcular el volumen necesario de medio CTL para obtener una concentración de células diana de 0,5 millones de células/mL (de manera que una alícuota de 100 ul contenga 50000 células diana teñidas por tubo).

Resuspender las células en el medio CTL.

Etapa 2: Mezcla de Células Diana y Efectoras

Determinar la concentración celular total de células efectoras de la LSP-aCCP.

Añadir 100 ul de células diana (K562) a todos los tubos FACS experimentales.

En esta prueba se examinarán varias relaciones de células diana/efectoras tales como 1:0,1:0,5, 1:1, 1:5, 1:10, 1:50, 1:100.

Añadir células efectoras suspendidas en medio CTL, hasta 100 ul por tubo.

Ajustar el volumen de cada muestra a 400 ul.

Incubar 4 horas en 37 grados C, CO²5%.

20 minutos antes de que termine la incubación, preparar los tubos de control:

Tubo de células diana viables (preparado a partir de la etapa 1) teñido con CFSE células efectoras (1:10) teñido doblemente con 7-AAD.

Tubo de células diana viables teñidas con CFSE, teñidas doblemente con 7-AAD.

Tubo de células diana muertas teñidas con CFSE, teñidas doblemente con 7-AAD.

Nota: calibrar todos los tubos de control en t=0.

Usar 0,1 millones de células diana para cada control.

Ajustar el volumen de cada control a 200 ul.

Añadir 5 ul de 7-AAD a los tubos de muestra.

Incubar en hielo durante 15 minutos protegido de la luz.

Configurar el portal de salida y compensación de FACS según las células de control.

Etapa 3: Preparación del control de células muertas:

Añadir 5 ul de TritonX-100 100 % o NP-40 a las células diana teñidas con CFSE (de la etapa 1).

Incubar 5 minutos a TA.

Añadir 3 mL de PBS.

Centrifugar las células 7 minutos, 300 g, 21 grados C, acelerar 9, frenar 5.

Resuspender las células en 200 ul de medio CTL.

Preparación del medio CTL (bueno para el crecimiento de K562):

Preparar el medio CTL de acuerdo con la siguiente tabla:

Datos experimentales

Los experimentos descritos en la presente descripción más abajo se realizaron por el inventor de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención y mediante el uso de las técnicas descritas anteriormente en la presente descripción.

Ejemplo Experimental 1: Aislamiento de DCP

En este conjunto de experimentos, se generaron poblaciones de células directoras (DCP), que tienen una población enriquecida de células dendríticas (DC), a partir de PBMC. Primero, se extrajo sangre periférica de diez donantes humanos para usar en diez experimentos respectivos. Las PBMC se obtuvieron mediante procesamiento preliminar de la sangre periférica, mediante el uso de gradiente de densidad Ficoll, de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia al Ejemplo 1.1, extracción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Después, se aislaron células dendríticas plasmacitoides y mieloides a partir de las PBMC mediante el uso de procedimientos basados en marcadores celulares de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a los Ejemplos 3.1, y 3.4. Es posible (aunque no se incluye en este ejemplo experimental) aislar las células dendríticas a partir de las PBMC mediante el uso de procedimientos basados en marcadores celulares de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a los Ejemplos 3.2, 3.3, 3.5, o 3.6. La población de células enriquecida con DCP obtenida se clasificó adicionalmente mediante inmunotinción y análisis por FACS basado en antígenos de superficie celular de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia al Ejemplo 15, para determinar el enriquecimiento de la DCP. Los resultados del enriquecimiento incluyen un porcentaje aumentado de las células que expresan los marcadores CD141, CD304 y CD86 (del 24,8 % en las Pb MC al 54,2 % en la DCP; datos no mostrados). Además de los ejemplos experimentales y los datos mostrados en la presente descripción, los inventores de la presente solicitud realizaron experimentos independientes adicionales (por lo tanto, colectivamente, se incluyen los experimentos descritos específicamente en la presente descripción, se realizaron un total de 42 ejemplos independientes). Los datos recolectados de los 42 experimentos independientes muestran un porcentaje aumentado de células DC que expresan los marcadores CD141 y CD304, desde el 7,5 % en las PBMC hasta el 43,3 % en las DCP; el porcentaje de CD141 aumentó de 4,6+/-0,5 % en PBMC a 21,7+/-1,9 % en DPC, p<0,001; y el porcentaje de CD304 aumentó de 2,9+/-0,5 % en las PBMC a 21,6+/-2,0 % en la DPC, p<0,001.

Las Figuras 1A-B son gráficos que representan el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) y de las DCP (población de células directoras) que se obtienen a partir de las PBMC, de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención.

La Figura 1A representa el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de las PBMC que muestra un porcentaje típico de CD mieloides CD141+ (en el eje X) y CD plasmacitoides CD304+ (en el eje Y) en las PBMC. Típicamente, el porcentaje de DC que expresan estos marcadores en las PBMC originales es muy bajo (en esta muestra, 7,4 % de CD141 y 0,9 % de CD304).

La Figura 1B representa el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de la DCP que se obtiene a partir de las PBMC. Los resultados muestran el enriquecimiento de CD mieloide CD141+ (en el eje X) y CD plasmacitoide CD304+ (en el eje Y) en la DCP en comparación con las PBMC. Típicamente, hay poca o ninguna expresión cruzada de estos marcadores en una población de DC en reposo. Se logró el aislamiento de dos poblaciones celulares diferentes que resultó en 30 % de CD141 y 31,8 % de CD304.

La Tabla I es una tabla que representa el enriquecimiento de DC mieloides y DC plasmacitoides en las DCP en comparación con las PBMC siguiendo los procedimientos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a las Figuras 1A-B. Como se muestra, los porcentajes de CD141 (DC mieloide) y CD304 (DC plasmacitoides) aumentaron en la DCP en comparación con las PBMC, a partir de las cuales se generó la DCP. El Factor de Enriquecimiento que se muestra en la tabla I se determinó dividiendo el porcentaje de células que tienen una característica dada en la DCP por el porcentaje de células que tienen esa característica en las PBMc [enriquecimiento = % en DCP/ % en PBm C].

Tabla I

Las Figuras 2A-B son gráficos que representan el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de PBMC y de las DCP generadas a partir de las PBMC, de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención. Además de una población enriquecida de DC, la DCP contiene, además, una población enriquecida de células madre/progenitoras. Las Figuras 2A-B muestran el enriquecimiento de células madre/progenitoras en las DCP que se generaron a partir de PBMC en seis muestras obtenidas del conjunto de experimentos descritos anteriormente en la presente descripción en las Figuras 1A-B. Después de la generación de las DCP, las células madre/progenitoras se clasificaron mediante inmunotinción y análisis por FACS para determinar el enriquecimiento de las células madre/progenitoras en la DCP.

Además de los ejemplos experimentales y los datos mostrados en la presente descripción, los inventores de la presente solicitud realizaron experimentos independientes adicionales (por lo tanto, colectivamente, que incluyen los experimentos descritos específicamente en la presente descripción, se realizaron un total de 39 ejemplos independientes). Los datos recolectados de los 39 experimentos independientes muestran un mayor porcentaje de células madre/progenitoras que expresan CD34 y son CD45Dim/- de 1,4+/-0,2 % en las PBMC a 3,2+/-0,6 % en las DCP p<0,005. La Figura 2A representa el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de las PBMC que muestra una cantidad típica de células madre/progenitoras en las PBMC como se determina mediante la expresión tanto de CD34 como de CD45Dim/-.

La Figura 2B representa el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de la DCP que se obtiene a partir de las PBMC. Los resultados muestran el enriquecimiento de células madre/progenitoras que expresan CD34 y son CD45Dim/- en la DCP en comparación con las PBMC.

La Tabla II es una tabla que representa el enriquecimiento de células madre/progenitoras que son CD34 positivas y CD45Dim/- en la DCP en comparación con las PBMC siguiendo los procedimientos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a las Figuras 2A-B. Como se muestra, los porcentajes de células que expresan CD34 y son CD45Dim/- aumentaron en la DCP en comparación con las PBMC, a partir de las cuales se generó la DCP. El Factor de Enriquecimiento que se muestra en la Tabla II se determinó dividiendo el porcentaje de células que tienen una característica dada en la DCP por el porcentaje de células que tienen esa característica en las PBMc [enriquecimiento= % en DCP/ % en PBMC].

Ejemplo Experimental 2: Activación de DCP

En este conjunto de experimentos, las DCP, que tienen una población enriquecida de células dendríticas (DC), se generaron a partir de PBMC, como se describió en el Ejemplo 1. Después, se separaron las células dendríticas (DC) plasmacitoides y mieloides de las PBMC mediante el uso de un procedimiento basado en marcadores celulares de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia al enriquecimiento de DC. La DCP obtenida se activó adicionalmente mediante la incubación de la DCP en un medio que contenía al menos un 10 % de suero autólogo, Heparina 5 UI/ml con o sin IL-10 20-50 ng/ml y VEGF 1-20 ng/ml durante 0,5 horas a 3 días de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a los Ejemplos 5.1, 6.4, y 8.1. Es posible (aunque no se incluye en este ejemplo experimental) activar células dendríticas de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a los Ejemplos 6.3, 6.5, 8.2, u 8.3. La DCP se clasificó mediante inmunotinción y análisis por fAc S basado en antígenos de superficie celular para determinar la activación de la DCP. La activación de las CD se determinó mediante el aumento de los porcentajes de células CD141 positivas dentro de la población y el aumento de la intensidad de CD 141 en las células que expresan CD 141.

Además de los ejemplos experimentales y los datos mostrados en la presente descripción, los inventores de la presente solicitud realizaron experimentos independientes adicionales (por lo tanto, colectivamente, que incluye los experimentos descritos específicamente en la presente descripción, se realizaron un total de 24 ejemplos independientes). Los datos recolectados de los 24 experimentos independientes muestran que los porcentajes de células activadas aumentaron de 6,6+/-1,4 % en la población recién aislada a 27,9+/-2,7 % en la población activada posteriormente p<0,001.

Se hace referencia a las Figuras 3A-B. La Figura 3A representa el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de la DCP enriquecida con DC antes de la activación, que muestra un porcentaje típico de DC mieloides que expresan CD141 y de DC plasmacitoides que expresan CD303 presentes en la DCP.

La Figura 3B representa el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de la DCP enriquecida con DC después de la activación, que muestra un porcentaje típico de De mieloides que expresan CD141 y de DC plasmacitoides que expresan CD303 presentes en la DCP.

Ejemplo Experimental 3: Enriquecimiento de MASPC derivada de TDC

En este conjunto de experimentos, se aisló una población de TDC a partir de las PBMC y se enriqueció mediante la depleción de las células que expresan CD8 y c D56 como se describió anteriormente en la presente descripción con referencia al método, "Aislamiento de células madre y progenitoras". Primero, se recolectaron muestras de sangre periférica de nueve donantes humanos para usar en nueve experimentos respectivos. Las PBMC se aislaron de las muestras de sangre periférica mediante el uso de un gradiente de densidad Ficoll, de la manera descrita en el Ejemplo Experimental 1. Después, se generaron las TDC convenientes a partir de las PBMC y se enriquecieron mediante la unión de anticuerpos específicos a poblaciones de células no convenientes que expresan CD8 y CD56 (células T y células NK, respectivamente), y estas células se eliminaron posteriormente de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia al Ejemplo 2.6.

Es posible (aunque no se incluye en este ejemplo experimental) trabajar de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia al Ejemplo 2.4.

Además de los ejemplos experimentales y los datos mostrados en la presente descripción, los inventores de la presente solicitud realizaron experimentos independientes adicionales (por lo tanto, colectivamente, que incluyen los experimentos descritos específicamente en la presente descripción, se realizaron un total de 43 ejemplos independientes). Los datos recolectados de los 43 experimentos independientes muestran un porcentaje reducido de TDC que expresa los marcadores CD8 y CD56 en la TDC en comparación con su porcentaje en las PBMC originales; el porcentaje de CD8 disminuyó de 22,8+/-1,1 % en las PBMC a 2,9+/-0,4 % en las TDC, p<0,0001; el porcentaje de c D56 disminuyó de 21,1+/-1,6 % en las PBMC a 8,5+/-1,4 % en las TDC, p<0,0001.

Las Figuras 4A-B son gráficos que representan el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de las PBMC y de una población de TDC (células derivadas de tejido) enriquecida, generada de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención.

La Figura 4A representa el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de las PBMC, que muestra un porcentaje típico de células T que expresan CD8 y de células NK que expresan CD56 presentes en las PBMC.

La Figura 4B representa el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de la población de TDC enriquecida que se obtiene por la depleción de las células que expresan CD8 y CD56 a partir de las PBMC. Los resultados muestran la depleción de las células que expresan c D8 y CD56 en la t Dc en comparación con las PBMC a partir de las que se obtuvieron las TDC.

La Tabla III es una tabla que representa el enriquecimiento de la TDC, logrado por la depleción de CD8 y células que expresan CD56 de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a las Figuras 3A-B. Como se muestra, los porcentajes de CD8 (células T) y CD56 (células NK) disminuyeron en la TDC en comparación con las PBMC, de las cuales se obtuvo la TDC. El enriquecimiento en este conjunto de experimentos resulta de la depleción de poblaciones seleccionadas a partir de células de la TDC. El Factor de Enriquecimiento mostrado en la Tabla III se determinó dividiendo el porcentaje de células que tienen una característica dada en la TDC por el porcentaje de células que tienen esa característica en las PBMC [enriquecimiento= % en TDC/ % en PBMC].

Tabla III

Ejemplo Experimental 4: Caracterización de LSP de MASPC rica en EPC - Análisis morfológico

En este conjunto de experimentos, se cultivó DCP conjuntamente con TDC para generar una población de precursores específicos de linaje (LSP). La LSP generada en este conjunto de experimentos fue una MASPC rica en células progenitoras endoteliales (EPC). Primero, se generó una DCP a partir de PBMC humanas mediante el uso de los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción en los Ejemplos Experimentales 1 y 2. Después, la DCP aislada se mantuvo y se activó en un medio para potenciar la DCP mediante el uso de los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción en el Ejemplo Experimental 2. Después, la DCP activada se cultivó conjuntamente con TDC de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente con referencia al cultivo conjunto de MASPC activada y TDC para generar LSP de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a los Ejemplos 6.9 y 8.5.

Es posible (aunque no se incluye en este ejemplo experimental) trabajar de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a los Ejemplos 6.7, 6.8, y 8.6.

La DCP y la TDC se sembraron en placas plásticas de cultivo de tejidos recubiertas con suero o plasma. Las células se mantuvieron en un medio que contenía al menos un 10 % de suero autólogo, Heparina 5 UI/mL con o sin IL-1020 50 ng/mL y VEGF 1-20 ng/mL. El medio se cambió cada 2-3 días. Otros datos experimentales muestran que las células se mantuvieron en un medio que contenía al menos un 10 % de suero autólogo, Heparina 5-25 UI/mL con o sin IL-10 1-50 ng/mL y VEGF 1-20 ng/mL (datos no mostrados).

Se hace referencia a las Figuras 5 y 6A-B.

La Figura 5 es una fotomicrografía representativa de una población de células madre/progenitoras adultas multipotentes (MASPC) rica en células progenitoras endoteliales (EPC), generada de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención. La Figura 5 muestra la morfología de una población de células progenitoras endoteliales (EPC) generada por el cultivo conjunto de DCP y TDC derivadas de PBMC humanas activadas como se describió anteriormente en la presente descripción. Como se muestra, las células alargadas y en forma de huso se observan típicamente en cultivos de MASPC ricas en EPC.

La Figura 6A es una fotomicrografía de DCP y TDC cultivadas conjuntamente, cultivadas de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente en la presente descripción. Las imágenes se obtuvieron a partir de un aumento x200 de DCP-TDC cultivadas.

La Figura 6B es una fotomicrografía de una LSP (precursores específicos de linaje) de cultivo de MASPC ricas en EPC, resultante del cultivo conjunto de DCP y TDC descrito en la Figura 5A. Las imágenes se obtuvieron a partir de un aumento x200 de MASPC ricas en EPC cultivada.

Ejemplo Experimental 5: Caracterización de LSP de MASPC rica en EPC - marcadores de superficie y actividad fisiológica

En este conjunto de experimentos, se generó una LSP de MASPC ricas en EPC a partir del cultivo conjunto de una DCP derivada de PBMC humanas junto con TDC, como se describe anteriormente en la presente descripción con referencia a los Ejemplos Experimentales 1, 2, 3, y 4. La presencia de células progenitoras endoteliales (EPC) en el cultivo se evaluó después en el día 3-4 de cultivo y se determinó mediante análisis por FACS mediante tinción conjunta con anticuerpo marcado con FITC contra lectina Ulex y Lipoproteína de Baja Densidad Acetilada (Dil-Ac-LDL) Ac-LDL marcada con 1,1'-dioctadecil - 3,3,3',3'-tetrametil-indocarbocianina perclorato. La tinción por FACS se realizó de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia al Ejemplo 15.

La Figura 7 representa el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de LSP típica de MASPC ricas en EPC, que muestra (en el área cerrada) el porcentaje de EPC que se tiñó positivamente tanto para la captación de Dil-Ac-LDL como para la unión de FITC-Ulex-lectina.

La Tabla IV es una tabla que representa el promedio de los resultados de inmunotinción por citometría de flujo obtenidos de seis experimentos independientes que se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a la Figura 7. Como se muestra en la Tabla IV, el cultivo conjunto de DCP y TDC típicamente produce una MASPC rica en EPC que tiene al menos un 80 % de viabilidad (88,8 % como se muestra en la tabla), al menos 1 % de CD141 (2,9 %, como se muestra en la tabla), al menos 5 % de CD304 (28,9 %, como se muestra en la tabla), al menos 7,5 % de células madre/progenitoras hematopoyéticas (27 %, como se muestra en la tabla) y al menos 20 % de EPC (36,9 %, como se muestra en la tabla).

Además de los ejemplos experimentales y los datos mostrados en la presente descripción, los inventores de la presente solicitud realizaron experimentos independientes adicionales (por lo tanto, colectivamente, que incluyen los experimentos descritos específicamente en la presente descripción, se realizaron un total de 16 ejemplos independientes). Los datos recopilados de los experimentos independientes muestran rendimientos de LSP de MASPC rica en EPC con 89,3+/-1,9 % de viabilidad (n=16) 3,7+/-1,4 % CD141 (n=10), 22,5+/-3,2 % CD304 (n=16), 16,8+/-4,1 % de células madre/progenitoras hematopoyéticas que coexpresan c D34 y D184 (n=11) y 28,5+/-3,6 % de EPC que coexpresan lectina Ulex y captación de Ac-LDL (n=11).

Tabla IV

Ejemplo Experimental 6: Caracterización de LSP de MASPC rica en EPC - nuevas combinaciones de marcadores de superficie

En este conjunto de experimentos, se generó una LSP de MASPC rica en EPC a partir del cultivo conjunto de una DCP derivada de PBMC humana junto con TDC, como se describió anteriormente en la presente descripción con referencia a los Ejemplos Experimentales 1, 2, 3, y 4. Después, se evaluó la presencia de células progenitoras endoteliales (EPC) en el cultivo el día 3-4 de cultivo y se determinó mediante análisis por FACS mediante tinción conjunta con CD31 (PECAM-1) y VEGFR1 (receptor 1 del factor de crecimiento de endotelio vascular). Se realizó tinción adicional para identificar células que coexpresan CD309 (VEGFR2, KDR) y CD202b (Tie-2).

Resultados que representan la inmunotinción por citometría de flujo promedio obtenidos de experimentos independientes que se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a los Ejemplos Experimentales 1, 2, 3, y 4 y al protocolo de tinción para FACS (Ejemplo 15).

El cultivo conjunto de DCP y TDC típicamente produce una LSP de MASPC rica en EPC que tiene, al menos un 2,5 % de células que coexpresan CD309 (VEGFR2, KDR) y CD202b (Tie-2), (en promedio, el porcentaje de células que coexpresa CD309 y CD202b fue 7,4+/-3,0 %), y al menos al menos 5 % de células que coexpresan CD31 y VEGFR¹, 9,2+/-2,5 % (en promedio, el porcentaje de células que coexpresan CD31 y VEGFR1 fue 7,4+/-3,0 %).

Ejemplo Experimental 7: Caracterización de LSP de MASPC rica en EPC - generación de novo de moléculas solubles

En este conjunto de experimentos, se generó una LSP de MASPC rica en EPC a partir del cultivo conjunto de TDC junto con una DCP derivada de PBMC humanas, de acuerdo con las etapas descritas en los Ejemplos Experimentales 1, 2, 3, y 4. Después, las LSP de MASPC ricas en EPC se sembraron en placas plásticas de cultivo de tejido de 24 pocillos a una concentración de 0,5 a 2,0 millones/mL. Las células se mantuvieron en condiciones de inanición en un medio sin suero (por ejemplo, X-vivo 15 (TM) o Biotarget-1 (TM)) sin ningún aditivo durante 18-48 horas. La secreción de moléculas solubles en el sobrenadante del ensayo de inanición (SAS) se midió mediante el inmunoensayo Milliplex Citocina/Quimiocina Humana, Milipore Billerica, MA, EE. UU. Los procedimientos se realizaron de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a los ejemplos 18 y 19.

Los resultados obtenidos de experimentos independientes que se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente en la presente descripción, muestran que el cultivo conjunto de DCP y TDC típicamente produce una MASPC rica en e Pc que secreta IL-86929+/-314 pg/mL (n=6), IL-105,7+/-3,4 pg/mL (n=6), v Eg F 2,3+/-1 pg/mL (n=5) y FGF básico 5,2+/-0,9 pg/mL (n=6). Sin embargo, las Ls P de MASPC ricas en EPC no secretan el factor proinflamatorio Interferón-gamma (IFNy).

Ejemplo Experimental 8: Caracterización de LSP de MASPC rica en EPC - potencial angiogénico

En este conjunto de experimentos, se generó una LSP de MASPC rica en EPC a partir del cultivo conjunto de TDC junto con una DCP derivada de PBMC humanas, de acuerdo con las etapas descritas en los Ejemplos Experimentales 1, 2, 3, y 4. Después, las células se sembraron en un gel de matriz extracelular de metilcelulosa y el patrón angiogénico y la formación del tubo vascular de las células se examinaron microscópicamente en los días 1-14 de cultivo de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia al Ejemplo 17.

La Figura 8 es una fotomicrografía que muestra la formación de tubos en MASPC rica en EPC, generada de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención. La Figura 8 muestra la formación típica de tubos en la LSP de MASPC rica en EPC. Como se muestra, se observaron polígonos de capilares semicerrados y cerrados y estructuras capilares complejas en forma de malla y se registraron como grado 4.

Ejemplo Experimental 9: Caracterización de LSP ricas en MASPC - marcadores de superficie

En este conjunto de experimentos, la expansión y activación de MASPC y de DC se logró mediante el cultivo conjunto de una DCP derivada de PBMC humana activada junto con una población de TDC rica en MASPC, de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención como se describe anteriormente en la presente descripción con referencia a los Ejemplos Experimentales 1, 2, 3, y 4. El cultivo conjunto de DCP-TDC se sembró después en placas plásticas de cultivo de tejido recubiertas de suero o plasma. Las células se mantuvieron en un medio que contenía al menos un 5 % de suero autólogo, IL-10 20-50 ng/mL, VEGF 1-10 ng/mL y Heparina 5 UI/mL. Otros datos experimentales muestran que las células se mantuvieron en un medio que contenía al menos un 5 % de suero autólogo, que contenía Heparina 5-25 UI/mL, IL-10 1-50 ng/mL, y VEGF 1-10 ng/mL. La presencia de DC mieloides y DC plasmacitoides y células madre/progenitoras en el cultivo se evaluó el día 3-4 de cultivo mediante el examen de la expresión de antígenos de superficie celular específicos de CD141, CD304, CD34 y CD184 mediante citometría de flujo. Las células se tiñeron con anticuerpos contra CD34, CD304, CD141 y CD184 como se describe anteriormente en la presente descripción con referencia al protocolo de tinción por FACS (Ejemplo 15).

Además de los ejemplos experimentales y los datos mostrados en la presente descripción, los inventores de la presente solicitud realizaron experimentos independientes adicionales (por lo tanto, colectivamente, que incluyen los experimentos descritos específicamente en la presente descripción, se realizaron un total de 21 ejemplos independientes). Los datos recolectados de los 21 experimentos independientes muestran rendimientos de una LSP rica en MASPC que tiene 91,3+/-1,4 % de viabilidad, CD141 3,0+/-1,1 %, CD304 17,1+/- 2,4 % y células madre/progenitoras hematopoiéticas que coexpresan CD34 y D184 17,7+/-2,3 %.

Algunos datos experimentales de los 18 experimentos muestran que las células se mantuvieron en un medio que contenía al menos un 10 % de suero autólogo, Heparina 5-25 UI/mL con o sin IL-10 1-50 ng/mL, y VEGF 1-20 ng/mL.

Los datos recolectados de los 18 experimentos independientes muestran rendimientos de una LSP rica en MASPC que tiene 96,7+/-0,4 % de viabilidad, CD141 1,6+/-0,6 %, CD304 27,4+/-3,2 % y células madre/progenitoras hematopoiéticas que coexpresan CD34 y D184 19,8+/-4,3 %.

Se hace referencia a las Figuras 9A-B, que son gráficos que representan el análisis de inmunotinción por citometría de flujo de una población expandida de MASPC y de una población expandida de DC generada por el cultivo conjunto de una DCP derivada de PBMC humanas activadas junto con una población de TDC rica en MASPC, de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención. En esta aplicación de la presente invención, la LSP comprende una LSP y una DCP ricas en MASPC. La Figura 9A muestra el porcentaje de células madre/progenitoras que coexpresan CD34 y CD184 en un cultivo típico de MASPC expandido (es decir, la LSP rica en MASPC). La Figura 9B muestra los porcentajes de DCP (de LSP rica en MASPC) que tienen células que expresan principalmente CD304 y células que expresan CD141.

La Tabla V es una tabla que representa los resultados del promedio de inmunotinción por citometría de flujo obtenidos a partir de siete experimentos independientes que se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a las Figuras 9A-B. Como se muestra en la Tabla VI, el cultivo conjunto de DCP y TDC, típicamente, produce una población expandida de DC y de células madre/progenitoras que tienen al menos 80 % de viabilidad (89,4 %, como se muestra en la tabla), al menos 1 % de CD141 (6,2 %, como se muestra en la tabla), al menos 5 % de CD304 (16,4 %, como se muestra en la tabla) y al menos 7,5 % de células madre/progenitoras hematopoyéticas (27,6 %, como se muestra en la tabla).

Tabla V

Ejemplo Experimental 10: Enriquecimiento de células MASPC que coexpresan CD34 y CD184 durante la generación de cultivos de LSP ricas en MASPC

En este conjunto de experimentos, se generó una población expandida y activada de MASPC a partir del cultivo conjunto de TDC junto con una DCP derivada de PBMC humana para generar una LSP rica en MASPC, como se describió anteriormente en la presente descripción con referencia al Ejemplo Experimental 9. El porcentaje de células que coexpresan CD34 y CD184, típico de la LSP rica en MASPC, se analizó antes y al final del cultivo de las células.

Los resultados de 16 experimentos independientes que comparan el porcentaje de células que coexpresan CD34 y CD184 antes y al final del período de cultivo muestran el enriquecimiento de esta subpoblación específica. El porcentaje de células que coexpresan CD34 y CD184 aumentó de al menos 2,5 % (en promedio, el porcentaje de células que coexpresan CD34 y CD184 fue de 7,3+/-2,3 %) antes del cultivo, a al menos un 5 % (en promedio, el porcentaje de células que coexpresan CD34 y CD184 fue 14,4+/-2,9 %) al final del período de cultivo.

Ejemplo Experimental 11: Caracterización de LSP rica en MASPC - Potencial clonogénico

En este conjunto de experimentos, se generó una población expandida y activada de MASPC a partir del cultivo conjunto de TDC junto con una DCP derivada de PBMC humana como se describió anteriormente en la presente descripción con referencia al Ejemplo Experimental 9. Las células se sembraron en un gel de matriz extracelular de metilcelulosa y se examinó microscópicamente la capacidad de las células para la proliferación y la formación de colonias en los días 1-21 de cultivo de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia al Ejemplo 20.

Los resultados de 16 experimentos independientes muestran que el cultivo conjunto de DCP y TDC típicamente produce LSP de MASPC rica en EPC y LSP rica en MASPC que tiene células formadoras de colonias (CFC), capaces de generar una variedad de tipos de colonias celulares, a una frecuencia de 73,4+/-14,1 por 100 000 células sembradas.

Se hace referencia a la Figura 10, que es una fotomicrografía que muestra la proliferación y formación de colonias en una población expandida y activada de LSP rica en MASPC generada mediante cultivo conjunto de una DCP derivada de PBMC humana activada junto con una población de TDC rica en MASPC, de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención. La Figura 9 muestra colonias típicas en la población expandida y activada de MASPC. Generalmente, las células madre/progenitoras únicas que son capaces de proliferar generan colonias de células a corto y largo plazo.

Ejemplo Experimental 12: Caracterización de LSP ricas en MASPC generadas a partir de células depositadas en bancos de células

En otro conjunto de experimentos, se generó una población expandida y activada de MASPC a partir de PBMC conservadas mediante el cultivo conjunto de TDC rica en MASPC descongeladas junto con una DCP derivada de PBMC humana descongelada como se describió anteriormente en la presente descripción con referencia al Ejemplo Experimental 9. La PBMC se obtuvo mediante procesamiento preliminar de la sangre periférica mediante el uso de un gradiente de densidad Ficoll, de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a la extracción de PBMC Ejemplo 1.1. Las PBMC se congelaron en medio de congelación libre de suero a una concentración de 2-15 millones/mL durante un período de 2-8 semanas, de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a la criopreservación de células (DC y/o MASPC y/o LSP).

Como resultado del cultivo conjunto de TDC rica en MASPC descongelada junto con una DCP derivada de PBMC humana descongelada, así como también con DCP derivada del coágulo blanco de sangre humana descongelada, se generó una población expandida y activada de MASPC. Este procedimiento, típicamente, produce una población LSP de LSP y d Cp ricas en MASPC similar a la descrita en los Ejemplos Experimentales 9 y 10, caracterizada por 82,7 % de viabilidad, CD304 10 %, CD86 11,7 % y células que coexpresan CD184 y CD34 10,4 %.

Además de los ejemplos experimentales y los datos mostrados en la presente descripción, los inventores de la presente solicitud realizaron experimentos independientes adicionales (por lo tanto, colectivamente, que incluyen los experimentos descritos específicamente en la presente descripción, se realizaron un total de 3 ejemplos independientes). Los datos recolectados de los 3 experimentos independientes muestran rendimientos de l Sp ricas en MASPC que tienen 90,9 % de viabilidad, 8,9 % de CD304 y 8,0 % de células madre/progenitoras hematopoyéticas que coexpresan CD34 y CD184, y 7,5 % de EPC que coexpresan lectina Ulex y captación de Ac-LDL y una frecuencia de CFC de 36,9 por 100000 células sembradas.

Ejemplo Experimental 13: Efecto de la activación de DCP sobre la generación de LSP ricas en MASPC

En este conjunto de experimentos, se generó una población expandida y activada de MASPC a partir del cultivo conjunto de TDC junto con una DCP derivada de PBMC humana, como se describe en los Ejemplos Experimentales 1, 2, 3, y 4. Después, se realizó una comparación entre el cultivo conjunto de TDC junto con (a) DCP que se activó durante 3-4 horas, y (b) DCP que se activó durante 21-22 horas. Otros experimentos muestran que se realizó una comparación entre el cultivo conjunto de TDC junto con (a) DCP que se activó durante 0,5-24 horas, y (b) DCP que se activó durante 21-22 horas (datos no mostrados).

La Tabla VI es una tabla que representa el promedio de los resultados de inmunotinción por citometría de flujo obtenidos de dos experimentos independientes que se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente en la presente descripción. Como se muestra en la Tabla VII, el cultivo conjunto de TDC junto con DCP activada durante 3-4 horas o durante 21-22 horas, típicamente, produce poblaciones expandidas similares de DC y de células madre/progenitoras que tienen:

al menos 80 % de viabilidad (94,2 % para el grupo DCP de 3-4 horas y 94,8 % para el grupo DCP de 21-22 horas, como se muestra en la tabla),

al menos 1 % de CD86 (33,1 % para el grupo DCP de 3-4 horas y 34,2 % para el grupo DCP de 21-22 horas como se muestra en la tabla),

al menos un 5 % de CD304 (17,6 % para el grupo DCP de 3-4 horas y 19,4 % para el grupo DCP de 21-22 horas, como se muestra en la tabla), y

al menos 7,5 % de células madre/progenitoras hematopoyéticas (31,0 % para el grupo de DCP de 3-4 horas y 30,0 % para el grupo de DCP de 21 a 22 horas, como se muestra en la tabla).

Tabla VI

Experimento para generar una LSP-aCCP

Ejemplo Experimental 1 de LSP-aCCP: Procedimiento para aislar DCP de PBMC

En este conjunto de experimentos, se generaron poblaciones de células directoras (DCP), que tienen una población enriquecida de células dendríticas (DC), a partir de PBMC. En primer lugar, se extrajo sangre periférica de donantes humanos para usar en experimentos individuales. Las PBMC se obtuvieron a través del procesamiento preliminar de la sangre periférica mediante el uso de gradiente de densidad Ficoll, de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia al Ejemplo 1.1, extracción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), después se aislaron células dendríticas mieloides DC a partir de las PBMC mediante el uso de un procedimiento basado en marcadores celulares de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a los Ejemplos 3.4, y 3.1. Es posible (aunque no se incluye en este ejemplo experimental) aislar las células dendríticas a partir de las PBMC mediante el uso de procedimientos basados en marcadores celulares de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a los Ejemplos 3.2, 3.3, 3.5, o 3.6. La población de células enriquecida con DCP obtenida se clasificó adicionalmente mediante inmunotinción y análisis por FACS basado en antígenos de superficie celular para determinar el enriquecimiento de DCP. La tinción por FACS se realizó de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia al Ejemplo 15.

Los resultados del aislamiento muestran un porcentaje aumentado de los marcadores CD141 y CD86. Los porcentajes de células que expresan CD141 aumentaron del 1,9 % en la población original de PBMC al 10,6 % en la DCP, lo que refleja un factor de enriquecimiento promedio de 5,6; los porcentajes de CD86 aumentaron del 22,9 % en la población original de PBMC al 71,9 % en la DCP, lo que refleja un factor de enriquecimiento promedio de 3,4. [Enriquecimiento = % en DCP/ % en PBMC]

Tabla VII

Ejemplo Experimental 2 de LSP-aCCP: Procedimiento para activar la DCP aislada

En este conjunto de experimentos, se generaron las DCP, que tenían una población enriquecida de células dendríticas (DC), a partir de PBMC. Después, se separaron las células dendríticas mieloides (DC) de las PBMC mediante el uso de un procedimiento basado en marcadores celulares como se describe anteriormente en la presente descripción con referencia al enriquecimiento de DC en el "Ejemplo Experimental 1 de LSP-aCCP". La DCP obtenida se activó adicionalmente mediante la incubación de la DCP en un medio que contenía al menos un 10 % de suero autólogo, Heparina 5-25 UI/mL con o sin IL-120,5-50 ng/mL durante 0,5 horas a 14 días, de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a los Ejemplos 6.12 y 8.1. Es posible (aunque no se incluye en este ejemplo experimental) activar células dendríticas de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la presente descripción con referencia a los Ejemplos 8.2 y 8.3. La DCP se clasificó mediante inmunotinción y análisis por FACS basado en antígenos de superficie celular para determinar la activación de la DCP. La activación de las CD se determinó mediante el aumento de los porcentajes de células CD141 positivas dentro de la población y el aumento de la intensidad de CD141 en las células que expresan CD141. El porcentaje de CD141 de alta intensidad aumentó del 6,2 % antes de la activación al 27,2 % después de la activación.

En este conjunto de experimentos, se aisló una población de células efectoras de TDC a partir de las PBMC y se enriqueció con células que expresan CD8 y CD56, como se describió anteriormente en la presente descripción con referencia al método, "Aislamiento de Células Madre y Progenitoras" (específicamente el Ejemplo 2.5). Como anteriormente, las muestras de sangre periférica se recolectaron de donantes humanos para usar en experimentos individuales. Las PBMC se aislaron como se describió anteriormente en la presente descripción con referencia al enriquecimiento de DC en el "Ejemplo Experimental 1 de LSP-aCCP". Después, se generaron las TDC convenientes a partir de las PBMC y se enriquecieron mediante la unión de anticuerpos específicos a las poblaciones de células convenientes que expresan CD8 y CD56 (células T y células NK, respectivamente), y estas células se enriquecieron posteriormente.

Los porcentajes de células que expresan CD8 aumentaron del 23,7 % en la población original de PBMC al 72,5 % en la TDC, lo que refleja un factor de enriquecimiento promedio de 3,3; los porcentajes de CD56 aumentaron del 26,2 % en la población original de PBMC al 48,9 % en la TDC, lo que refleja un factor de enriquecimiento promedio de 2,2.

Ejemplo Experimental 4 de LSP-aCCP: Aislamiento de TDC-MASPC a partir de PBMC

En el mismo conjunto de experimentos, se aisló una población de TDC-MASPC a partir de las PBMC y se enriqueció mediante la depleción de las células que expresan CD8 y CD56 como se describió anteriormente en la presente descripción con referencia al método, "Aislamiento de Células Madre y Progenitoras" (específicamente el Ejemplo 2.6). Primero, se recolectaron muestras de sangre periférica de donantes humanos para usar en experimentos individuales. Las PBMC se aislaron como se describió anteriormente en la presente descripción con referencia al enriquecimiento de DC en el "Ejemplo Experimental 1 de LSP-aCCP". Después, se generaron las TDC-MASPC convenientes a partir de las PBMC y se enriquecieron mediante la unión de anticuerpos específicos a poblaciones de células no convenientes que expresan CD8 y CD56 (células T y células NK, respectivamente), y estas células se eliminaron posteriormente (específicamente el Ejemplo 2.6).

Se usaron los porcentajes de células que coexpresan CD34 y CD45 de baja intensidad para evaluar el enriquecimiento de TDC-MASPC. Los porcentajes de células que coexpresan CD34 y CD45 de baja intensidad aumentaron desde el 0,8 % en la población original de PBMC hasta el 1,2 % en la TDC-MASPC que refleja y promedia un factor de enriquecimiento de 2,1.

Ejemplo Experimental 5 de LSP-aCCP: Generación y Expansión y activación de LSP-aCCP

En este conjunto de experimentos, la expansión y activación de (progenitores de células anticancerosas específicas de linaje) LSP-aCCP se logró mediante dos etapas de cultivo secuenciales. En la primera etapa, la activación de las células efectoras de TDC se logró mediante el cultivo conjunto de DCP derivadas de PBMC humanas activadas con las células efectoras de TDC. Las células se mantuvieron en un medio que contenía al menos 5 % de suero autólogo, Heparina 5-25 UI/mL e IL-12 0,5-50 ng/mL con o sin IL-18 5-50 ng/mL e IL-27 1-25 ng/mL durante 2 horas - 14 días (específicamente los Ejemplos 6.11, 8.5 y 8.6).

Las células efectoras (DT) de DCP-TDC cultivadas conjuntamente y activadas resultantes se cultivan conjuntamente con la TDC-MASPC en una segunda etapa para promover una mayor expansión y activación de las células efectoras (DT) de DCP-TDC cultivadas conjuntamente. Esta etapa de cultivo conjunto de la DT con la TDC-MASPC eventualmente crea la LSP-aCCP potencialmente terapéutica. Las células DT-TDC-MASPC se activaron adicionalmente manteniéndolas en un medio que contenía al menos 5 % de suero autólogo, Heparina 5-25 UI/mL con o sin IL-120,5-50 ng/mL, IL-185-50 ng/mL e IL-27 1-25 ng/mL durante 2 horas -14 días. El cultivo conjunto DT-TDC-MASPC se sembró en placas plásticas de cultivo de tejidos (específicamente en los Ejemplos 6.11, 8.5 y 8.6). Como resultado del cultivo conjunto, se generó un rendimiento potencialmente terapéutico de LSP-aCCP altamente viable, con un promedio de 0,4 millones de células por 1 mL de sangre el día 4 y 0,3 millones de células por 1 mL de sangre el día 5 (es decir, aproximadamente 150-200 millones de células por bolsa de sangre de 450 mL) que exhibieron una alta viabilidad de >90 % (viabilidad promedio del 94,4 % el día 4 y 93,8 % el día 7-8).

La LSP-aCCP resultante se evaluó adicionalmente el día 4 y los días 7-8 de cultivo mediante el examen de la expresión de antígenos de superficie celular específicos de CD141, CD86, CD3, CD8, CD56, CD4, y la coexpresión de CD34 y CD184 por citometría de flujo. Las células se tiñeron con anticuerpos contra CD34, CD86, CD141, CD3, CD8, CD56, CD4 y CD184 como se describió anteriormente en la presente descripción con referencia al protocolo de tinción para FACS con anticuerpos.

Al aplicar estos anticuerpos, se encontró que la LSP-aCCP expresaba CD141 (2,3 % el día 4 y 1,9 % los días 7-8), CD86 (24,4 % el día 4 y 20,5 % los días 7-8), CD3 (67,0 % el día 4 y 68,8 % los días 7-8), CD8 (21,8 % el día 4 y 20,7 % los días 7-8) y CD56 (16 % el día 4 y 14 % los días 7-8). El porcentaje de MASPC que coexpresa CD34 y CD184 fue 4,8 % el día 4 y 6,5 % los días 7-8.

Por lo tanto, se generó una población de células que contiene células que están disponibles para uso inmediato contra el cáncer (LSP que contiene células de efecto activado), así como también una subpoblación de células latentes (LSP que contiene MASPC) que pueden reponer las células efectoras maduras activadas mediante la diferenciación en células efectoras maduras activadas en una etapa posterior.

Ejemplo Experimental 6 de LSP-aCCP: Ensayo CTL

En este conjunto de experimentos, se generó una LSP-aCCP a partir del cultivo conjunto de DT junto con una TDC-MASPC derivada de las PBMC humanas. Las células se evaluaron para determinar su actividad citotóxica funcional en un ensayo de linfocitos citotóxicos (CTL) de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención en la sección "Ensayo de reacción de linfocitos citotóxicos (CTL)" (específicamente el Ejemplo 23). Se añadió una gama de LSP-aCCP o un grupo de control cultivado de concentraciones de PBMC con respecto a un número fijo de la línea de células leucémica k 562 diana creando una relación en serie de células efectoras LSP-aCCP con respecto a las células diana.

Las Figuras 11A-B son gráficos que representan un análisis de la función de reacción de linfocitos citotóxicos (CTL) del grupo de control LSP-aCCP y PBMC en los días 4 (Figura 11A) y 7-8 (Figura 11B), generados de acuerdo con algunas aplicaciones de la presente invención. Los gráficos de las Figuras 11A-B muestran una actividad citotóxica significativamente mayor en el grupo LSP-aCCP en comparación con el grupo de control de PBMC tanto en el día 4 como en el 7-8, como lo representa el mayor número de células muertas, que está representado por el mayor porcentaje de tinción para 7-AAD. Las células con membranas comprometidas se tiñeron con 7-AAD, mientras que las células vivas con membranas celulares intactas permanecieron oscuras y sin teñirse con 7-AAD. Por lo tanto, en promedio, las LSP-aCCP muestran un aumento porcentual en la actividad citotóxica en comparación con las PBMC del 150 %, (p<0,01) el día 4 y del 180 % (p<0,005) el día 7-8, por lo tanto, un aumento porcentual de entre el 150 % y el 180 %.

Típicamente, al menos el 2 % de las células de la LSP-aCCP expresan uno o más de los siguientes marcadores CD86, c D3, CD8, CD4, y CD56 durante un período de al menos 8 días después de la activación de las células efectoras y/o MASPC para generar la LSP-aCCP.

Ahora se hace referencia a las Figuras 1A-B, 2A-B, 3A-B, 4A-B, 5, 6A-B, 7, 8, 9A-B, y 10. Cabe señalar que estas figuras muestran datos que son idénticos a los presentados en la Solicitud de Patente Provisional de los EE. UU.

61/224,942 de Porat, titulada, "Métodos para usar células presentadoras de antígeno y células dendríticas para dirigir la diferenciación y la activación de células madre/progenitoras," presentada el 13 de julio de 2009.

Para algunas aplicaciones, las técnicas descritas en la presente descripción se practican en combinación con las técnicas descritas en una o más de las referencias citadas en la presente solicitud de patente.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Un método in vitro para generar una población de células precursoras/progenitoras específicas de linaje (LSP) que comprende las etapas:

a) obtener una población de células dendríticas, en donde las células dendríticas se derivan de células mononucleares de sangre periférica (PBMC),

b) activar la población de células dendríticas que se obtiene en la etapa (a) mediante la incubación durante 0,5 horas hasta 3 días en un medio que comprende al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en IL-10, IL-12, IL-18, TGF beta, bFGF y VEGF para producir una población de células activadas, en donde la población de células activadas comprende células que tienen una mayor expresión de CD141, c) obtener una población de PBMC y enriquecer a favor de las células madre/progenitoras mediante la selección negativa de células que expresan CD8 y CD56 para producir una población de células madre/progenitoras enriquecida, y

d) cultivar conjuntamente la población de células madre/progenitoras enriquecida que se obtiene en la etapa (c) con la población de células activadas que se obtiene en la etapa (b) para formar una población de células combinada, donde las células de la etapa (b) inducen en la población combinada al menos un proceso seleccionado del grupo que consiste en: diferenciación, expansión, activación, secreción de una molécula, y expresión de un marcador en las células cultivadas conjuntamente, lo que genera de esta manera una población de células LSP.
2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la población de células activadas de la etapa (b) comprende células que tienen una expresión aumentada de CD141 y CD304.
3. Un método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde la población enriquecida de células madre/progenitoras comprende una población enriquecida de células madre/progenitoras adultas multipotentes (MASPC).
4. Un método de conformidad con la reivindicación 3, en donde la relación de siembra de la población de células activadas de la etapa (b) con respecto a las células madre/progenitoras adultas multipotentes en la etapa (d) está en el intervalo de 1:5 a 1:50.
5. Un método de conformidad con la reivindicación 1 a 2, en donde la población de células LSP comprende una población de células madre/progenitoras adultas multipotentes rica en células progenitoras endoteliales (MASPC rica en EPC).
6. Un método in vitro de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que además comprende la etapa de:

i) obtener una población de células enriquecidas de células efectoras inmunitarias, y

ii) cultivar conjuntamente la población de células efectoras inmunitarias enriquecidas de la etapa (i) con la población de células activadas de la etapa (b), antes de realizar la etapa (d) en donde en la etapa (d), el cultivo conjunto de las células madre/progenitoras enriquecidas con la población de células activadas incluye exponer el cultivo conjunto de la población de células activadas y las células efectoras a la población de células madre/progenitoras enriquecida.
7. Un método de conformidad con la reivindicación 6, en donde las células efectoras comprenden células T y/o células asesinas naturales.
8. Un método de conformidad con la reivindicación 6 o 7, en donde dicha población de células enriquecida en células efectoras inmunitarias se obtiene a partir de una población de PBMC.
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde la población de células LSP es una población progenitora de células anticancerosas (aCCP).